CN103450360B - Cd40的抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种特异性结合CD40(优选为人类CD40)且具有作为CD40激动剂功能的抗体及其抗原结合部分。本发明也涉及人类抗‑CD40抗体及其抗原结合部分。本发明也涉及嵌合性、双特异性、衍生化的单链抗体或融合蛋白质的部份。本发明也涉及衍生自人类抗‑CD40抗体的分离的重链与轻链免疫球蛋白及编码这些免疫球蛋白的核酸分子。本发明也涉及制造人类抗‑CD40抗体的方法，包含这些抗体的组合物，及使用所述抗体与组合物进行诊断与治疗的方法。本发明也提供一种使用编码包含人类抗‑CD40抗体的重链和/或轻链免疫球蛋白分子的核酸分子进行的基因疗法。本发明也涉及一种含有本发明核酸分子的转基因动物。

Description

CD40的抗体
本申请是申请日为2002年11月8日、申请号为02824570.9、发明名称为“CD40的抗体”的发明专利申请的分案申请。
本申请主张2001年11月9日申请的美国临时申请60/348,980的权益。
现有技术
CD40抗原为属于肿瘤坏死因子受体(TNF-R)家族的50kDa细胞表面糖蛋白(Stamenkovic等人的EMBO J.8：1403-10(1989))。CD40表达于许多正常及肿瘤细胞类型中，包括B淋巴细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、胸腺表皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、及平滑肌细胞(Paulie S.等人的Cancer Immunol.Immunother.20：23-8(1985)；BanchereauJ.等人的Adv.Exp.Med.&Biol.378：79-83(1995)；Alderson M.R.等人的J.ofExp.Med.178：669-74(1993)；Ruggiero G.等人的J.of Immunol.156：3737-46(1996)；Hollenbaugh D.等人的J.of Exp.Med.182：33-40(1995)；Yellin M.J.等人的J.ofLeukocyte Biol.58：209-16(1995)；及Lazaar A.L.等人的J.of Immunol.161：3120-7(1998))。CD40表达在所有B-淋巴瘤及70％的所有实体瘤中。虽然为组成型表达，但CD40仍可在抗原呈递细胞中利用成熟信号(如：LPS、IL-1β、IFN-γ及GM-CSF)增量调节其表达。
CD40活化作用在调节体液与细胞免疫反应上扮演重要角色。没有CD40活化作用的抗原呈递，会造成耐受性，而CD40信号可以逆转此类耐受性，增强所有抗原呈递细胞(APCs)的抗原呈递作用，帮助分泌辅助细胞因子及趋化因子，提高共同刺激分子表达与信号传递，及刺激免疫细胞的溶胞活性。
CD40在B细胞增殖作用、成熟及分类转型上扮演关键角色(Foy T.M.等人的Ann.Rev.of Immunol.14：591-617(1996))。CD40信号传递途径中断时，造成血清免疫球蛋白同种型异常分布、缺乏CD4+T细胞初始化、及第二体液反应缺陷。例如：X-连锁的过多-IgM综合征 是一种与人类CD40L基因的突变相关的疾病，且其特征为患者没有能力产生IgM同种型以外的抗体，这表示有效的免疫反应需要CD40与CD40L之间的生产性相互作用。
CD40与CD40L的关联性造成CD40细胞质结构域与TRAFs(TNF-R相关因子)的结合(Lee H.H.等人的Proc.Natl.Acad.Sci.USA96：1421-6(1999)；Pullen S.S.等人的Biochemistry37：11836-45(1998)；Grammar A.C.等人的J of lmmunol.161：1183-93(1998)；Ishida T.K.等人的Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：9437-42(1996)；Pullen S.S.等人的J.of Biol.Chem.274：14246-54(1999))。与TRAFs的相互作用最后可同时活化NFκB与Jun/AP1途径(Tsukamoto N.等人的Proc.Natl.Acad.Sci.USA96：1234-9(1999)；Sutherland C.L.等人的J.of Immunol.162：4720-30(1999))。依细胞类型而定，此信号传递会加强细胞因子的分泌，如：IL-6(Jeppson J.D.等人的J.of Immunol.161：1738-42(1998)；Uejima Y.等人的Int.Arch.of Allergy&Immunol.110：225-32，(1996))、IL-8(Gruss H.J.等人的Blood84：2305-14(1994)；von Leoprechting A.等人的CancerRes.59：1287-94(1999)；Denfeld R.W.等人的Europ.J.of Immunol.26：2329-34(1996))、IL-12(Cella M.等人的J.of Exp.Med.184：747-52(1996)；Ferlin W.G.等人的Europ.J.ofImmunol.28：525-31(1998)；Armant M.等人的Europ.J.of Immunol.26：1430-4(1996)；Koch F.等人的J.ofExp.Med.184：741-6(1996)；Seguin R.与L.H.Kasper的J.ofInfect.Diseases179：467-74(1999)；Chaussabel D.等人的Infection & Immunity67：1929-34(1999))、IL-15(Kuniyoshi J.S.等人的Cellular Immunol.193：48-58(1999))及趋化因子(MIP1α、MIP1β、RANTES，等等)(McDyer J.F.等人的J.of Immunol.162：3711-7(1999)；Schaniel C.等人的J.of Exp.Med.188：451-63(1998)；Altenburg A.等人的J.ofImmunol.162：4140-7(1999)；Deckers J.G.等人的J.of the Am.Society ofNephrology9：1187-93(1998))；提高I与II类MHC 的表达(Santos-Argumedo L.等人的Cellular Immunol.156：272-85(1994))，及提高粘着分子的表达(例如：ICAM)(Lee H.H.等人的Proc.Natl.Acad.Sci.USA.96：1421-6(1999)；GroussonJ.等人的Archives ofDermatol.Res.290：325-30(1998)；Katada Y.等人的Europ.J.of lmmunol.26：192-200(1996)；Mayumi M.等人的J.of Allergy&Clin.Immunol.96：1136-44(1995)；Flores-RomoL.等人的Immunol.79：445-51(1993))及提高共同刺激分子的表达(例如：B7)(Roy M.等人的Europ.J.of Immunol.25：596-603(1995)；Jones K.W.与C.J.Hackett的CellularImmunol.174：42-53(1996)；Caux C.等人的Journal of Exp.Med.180：1263-72(1994)；KienerP.A.等人的J.of Immunol.155：4917-25(1995))。由CD40参与作用诱发的细胞因子可加强T细胞存活及活化。
除了加强细胞功能与免疫功能外，CD40活化作用的影响还包括：趋化因子与细胞因子的细胞募集作用与分化作用；活化单核细胞；提高溶胞性T淋巴细胞(CTL)与天然杀伤(NK)细胞的溶胞活性；诱发CD40阳性肿瘤中的细胞凋亡；加强CD40阳性肿瘤的免疫原性；及产生肿瘤特异性抗体。CD40活化作用在细胞介导的免疫反应中的角色也已完全确认且已说明于：Grewal等人的Ann.Rev.of Immunol.16：111-35(1998)；Mackey等人的J.ofLeukocyte Biol.63：418-28(1998)；及Noelle R.J.，Agents&Actions-Suppl.49：17-22，1998)。
使用交叉初始化模型系统的试验显示，APCs的CD40活化作用可替代溶胞性T淋巴细胞(CTL)的形成过程中所需的辅助T细胞(Bennett等人的Nature393：478-480(1998))。由缺乏CD40L小鼠的证据可见，辅助T细胞初始化时，显然需要CD40信号传递。(Grewal I.S.等人的Science273：1864-7(1996)；Grewal I.S.等人的Nature378：617-20(1995))。CD40活化作用使可产生耐受性的带抗原的B细胞转化成有能力的APCs(Buhlmann J.E.等人的Immunity2：645-53(1995))。CD40活化作用诱发脊索祖先血细胞成熟及分化成树突细胞(Flores-Romo L.等人的J.of Exp.Med.185：341-9(1997)；Mackey M.F.等人的J.ofImmunol.161：2094-8(1998))。CD40活化作用也诱发单核细胞分化成功能性树突细胞(Brossart P.等人的Blood92：4238-47(1998))。此外，CD40活化作用通过APC-CD40诱发的细胞因子加强NK细胞的溶胞活性(Carbone E.等人的J.of Exp.Med.185：2053-60(1997)；Martin-Fontecha A.等人的J.of Immunol.162：5910-6(1999))。此类观察结果显示，CD40通过诱发APCs成熟、分泌辅助细胞因子、增量调节共同刺激分子及加强效应子功能而在开始及加强免疫反应的过程中扮演基本角色。
CD40信号传递作用在体液与细胞毒性免疫反应的开始与成熟过程中的关键角色使得此系统成为加强免疫的理想目标。此类加强作用对产生针对肿瘤抗原的有效免疫反应特别重要，此类肿瘤抗原通常通过活化的APCs的交叉初始化而呈递给免疫系统。(HuangA.Y.等人的Ciba Foundation Symp.187：229-44(1994)；Toes R.E.M.等人的Seminars inImmunol.10：443-8(1998)；Albert M.L.等人的Nature392：86-9(1998)；Bennett S.R.等人的J.of Exp.Med.186：65-70(1997))。
有几个工作小组已证实CD40活化作用于体外及体内对于抗肿瘤反应的有效性(Toes R.E.M.等人的Seminars in Immunol.10：443-8(1998))。其中有两个小组使用由病毒转化的细胞的肾细胞癌瘤与皮下肿瘤的肺转移模型，已分别证明CD40活化作用可逆转对肿瘤特异性抗原的耐受性，造成T细胞的有效抗肿瘤初始化(prime)(Sotomayor E.M.等人的Nature Medicine5：780-787(1999)；Diehl L.等人的Nature Medicine5：774-9(1999))。在SCID小鼠体内的人类乳腺癌细胞株模型中，CD40L与抗-CD40抗体处理也证明其在没有免疫细胞下的抗肿瘤活性(Hirano A.等人的Blood93：2999-3007(1999))。近来也在小鼠模型中证实抗-CD40抗体对CD40的活化作用可根除CD40+与CD40-淋巴瘤。(French R.R.等人的Nature Medicine5：548-53(1999))。此外，过去由Glennie等人进行的试验得到的结论为：抗-CD40抗体产生的信号传递活性在活体内诱发清除肿瘤的效果比可募集效应子的 其它抗表面标记抗体更有效(Tutt A.L.等人的J.of Immunol.161：3176-85(1998))。当于活体内测试抗-CD40抗体对抗CD40+肿瘤细胞的活性时，同样也观察到大多数，但非所有抗肿瘤活性均与CD40信号传递相关，而非与ADCC相关(Funakoshi S.等人的J.of Immunotherapywith Emphasis on Tumor Immunol.19：93-101(1996))。另一项试验中，使用多种试剂离体处理骨髓树突细胞，并测试其活体内抗肿瘤活性。此类试验证实，受CD40L刺激的DCs为可提供抗肿瘤反应的最成熟且最有效的细胞。
CD40在抗肿瘤免疫性中的基本角色已在野生型与CD40-/-小鼠对肿瘤疫苗反应的比较结果中证实。此类试验显示，CD40-/-小鼠无法达到正常小鼠所出现的肿瘤免疫性(Mackey M.F.等人的Cancer Research57：2569-74(1997))。另一项试验中，从带肿瘤的小鼠取得的脾细胞用肿瘤细胞离体刺激，及使用活化性抗-CD40抗体处理，其显示具有加强的肿瘤特异性CTL活性(Donepudi M.等人的Cancer Immunol.Immunother.48：153-164(1999))。此类试验证实，CD40在抗肿瘤免疫性中均占有重要地位，不论CD40阳性或阴性肿瘤。由于CD40表达于淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤、大多数鼻咽、膀胱、卵巢及肝的癌瘤，及有些乳腺癌与及结肠直肠癌中，因此CD40的活化作用可以有很广泛临床用途。
抗-CD40活化性单克隆抗体可经多种重要机制根除肿瘤。其中主要为活化宿主树突细胞，以加强肿瘤抗原加工与呈递，并加强CD40阳性肿瘤细胞本身的抗原呈递或免疫原性，以活化肿瘤特异性CD4+与CD8+淋巴细胞。其它抗肿瘤活性可受CD40信号传递的其它免疫-加强效应介导(产生趋化因子与细胞因子，募集与活化单核细胞，及加强CTL与NK溶胞活性)，及通过诱发细胞凋亡或刺激针对ADCC的体液反应而直接消灭CD40+肿瘤。凋亡及死亡的肿瘤细胞可成为肿瘤特异性抗原的重要来源，这些抗原被CD40活化的APCs处理及呈递。
因此极需要医疗性的临床用相关抗-CD40激动剂抗体。
附图简述
图1抗体可变结构域蛋白质序列与种系（GL）序列的比对（CDRs用下划线表示；相对种系的突变用黑体/阴影表示）。图1A-1H显示所分离的抗-CD40单克隆抗体轻链与重链可变结构域的预测的氨基酸序列与相应轻链与重链基因的种系氨基酸序列的序列比对。克隆与种系序列之间的差异以阴影表示。种系CDR1、CDR2、与CDR3序列以下划线表示。重链序列的比对中，CDR3区域的明显插入片段以种系序列中的短折线(-)表示，CDR3区域的明显删除位置则以克隆序列中的短折线(-)表示。
图1A:Vκ=A3/A19及J=Jκ1基因种系氨基酸序列，以及所预测的mAbs3.1.1与7.1.2的κ-轻链可变区氨基酸序列；
图1B:来自克隆15.1.1的预测的κ-轻链可变区氨基酸序列与种系氨基酸序列(Vκ=A3/A19与J=Jκ2);
图1C:来自mAbs10.8.3与21.4.1的预测的κ-轻链可变区氨基酸序列及种系氨基酸序列(Vκ=L5(DP5)与J=Jκ4);
图1D:来自mAb3.1.1的预测的重链可变区氨基酸序列与种系氨基酸序列(VH=3-30+(DP-49)，D=D4+DIR3与J=JH6);
图1E:来自mAb7.1.2的预测的重链可变区氨基酸序列与种系氨基酸序列(VH=3-30+(DP-49)，D=DIR5+DI-26与J=JH6)；
图1F:来自mAb10.8.3的预测的重链氨基酸序列与种系氨基酸序列(VH=4.35(VIV-4)，D=DIR3与J=JH6);
图1G:来自mAb15.1.1的预测的重链可变区氨基酸序列与种系氨基酸序列(VH=4-59(DP-71)，D=D4-23与J=JH4);及
图1H:来自mAb21.4.1的预测的重链可变区氨基酸序列与种系氨基酸序列(VH=1-02(DP-75)，D=DLR1与J=JH4)。
图2抗体可变结构域蛋白质序列与种系（GL）序列的比对（CDRs用下划线表示；相对种系的突变用黑体/阴影表示）。图2A-2H显示所分离的抗-CD40单克隆抗体中的轻链与重链可变结构域的氨基酸序列与相应轻链与重链基因的种系氨基酸序列的比对。克隆与种系序列之间的差异以黑体表示。种系CDR1、CDR2、与CDR3序列以下划线表示。在重链序列的比对中，CDR3区域中的明显插入片段以种系序列中的短折线(-)表示，CDR3区域的明显删除位置则以克隆序列中的短折线(-)表示。
图2A：来自mAbs22.1.1、23.5.1与23.29.1的预测的κ-轻链氨基酸序列及种系氨基酸序列(Vκ＝A3/A19与J＝Jκ1)；
图2B：来自mAb21.2.1的预测的κ-轻链氨基酸序列与种系氨基酸序列(Vκ＝A3/A19与J＝Jκ3)；
图2C：来自mAbs23.28.1、23.28.1L-C92A与24.2.1的预测的κ-轻链氨基酸序列及种系氨基酸序列(Vκ＝A27与J＝Jκ3)；
图2D：来自mAb21.2.1的预测的重链氨基酸序列与种系氨基酸序列(VH＝3-30+，D＝DIR3+D6-19与J＝JH4)；
图2E：来自mAbs22.1.1、22.1.1H-C109A的预测的重链氨基酸序列及种系氨基酸序列(VH＝3-30+，D＝D1-1与J＝JH6)；
图2F：来自mAb23.5.1的预测的重链氨基酸序列与种系氨基酸序列(VH＝3-30+，D＝D4-17与J＝JH6)；
图2G：来自mAb23.29.1的预测的重链氨基酸序列与种系氨基酸序列(VH＝3-30.3，D＝D4-17与J＝JH6)；及
图2H：来自mAb23.28.1、23.28.1H-D16E与24.2.1的预测的重链氨基酸序列及种系氨基酸序列(VH＝4-59，D＝DIR1+D4-17与J＝JH5)。
图3为剂量-反应曲线，其说明本发明抗-CD40抗体(21.4.1)加强人类树突细胞产生IL-12p40的能力。
图4为剂量-反应曲线，其说明本发明抗-CD40抗体(21.4.1)加强人类树突细胞产生IL-12p70的能力。
图5说明本发明抗-CD40抗体(21.4.1)提高Jy刺激性细胞的免疫原性及加强CTL对抗Jy目标细胞的活性的能力。
图6为肿瘤生长抑制曲线，其说明经本发明抗-CD40抗体(21.4.1)处理的SCID-米色小鼠中CD40阳性Daudi肿瘤的生长降低结果。
图7为肿瘤生长抑制曲线，其说明经本发明抗-CD40抗体(21.4.1)及人类树突细胞与T细胞处理的SCID-米色小鼠中CD40阴性K562肿瘤的生长降低结果。
图8说明经不同浓度抗-CD40激动剂mAb23.29.1处理的SCID小鼠中CD40阴性K562肿瘤的生长抑制结果。
图9显示经不同浓度抗-CD40激动剂mAb3.1.1处理的SCID小鼠中CD40阴性K562肿瘤的生长抑制结果。
图10显示于T细胞与树突细胞存在或不存在下经抗-CD40激动剂mAb处理的SCID小鼠中CD40阳性Raji肿瘤的生长抑制结果。
图11显示经抗-CD40激动剂抗体处理的SCID小鼠中CD40阳性Raji肿瘤的生长抑制结果。
图12显示经抗-CD40激动剂抗体处理的SCID-米色小鼠中BT474乳腺癌细胞的生长抑制结果。
图13显示经抗-CD40激动剂抗体处理的SCID-米色小鼠中PC-3前列腺肿瘤的生长抑制结果。
图14为经静脉接受Daudi肿瘤细胞注射(iv)并经抗-CD40激动剂抗体处理的SCID-米色小鼠的存活曲线。
图15为针对还原(R)与未还原(NR)人类CD40的抗-CD40激动剂抗体的蛋白质印迹分析。
图16为小鼠与人类CD40的D1-D4结构域的比对。
图17为小鼠与人类CD40氨基酸的比对，其中显示嵌合体的融合位置。
图18为嵌合性CD40构建体图式。
发明概述
本发明提供一种可与CD40结合且可作为CD40激动剂的分离的抗体或其抗原结合部分。
本发明提供一种组合物，其包含抗-CD40抗体、或其抗原结合部分，及药物可接受的载体。该组合物可进一步包含另一种成分，如：抗肿瘤剂或显象剂。本发明也提供诊断及医疗方法。
本发明提供一种分离的细胞系，如：可产生抗-CD40抗体或其抗原结合部分的杂交瘤。
本发明也提供一种编码抗-CD40抗体的重链和/或轻链或其抗原结合部分的核酸分子。
本发明提供包含该核酸分子的载体与宿主细胞，及重组产生该核酸分子所编码多肽的方法。
本发明也提供一种表达抗-CD40抗体的重链和/或轻链，或其抗原结合部分的非人类转基因动物。
本发明也提供一种使用有效量的编码该抗-CD40抗体的重链和/或轻链或其抗原结合部分的核酸分子治疗有此需要的个体的方法。
本发明的详细说明
定义与一般技术
除非另有说明，否则本文中所使用的科学与技术术语应具有那些本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非本文中另有要求，否则单数术语应包括复数，且复数术语应包括单数。通常，本文中所描述的细胞及组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学及蛋白质与核酸化学，及杂交法所涉及的命名法与其技术均是本领域已知且常用的。
本发明的方法与技术通常依据本领域已知的传统方法进行，且说明于本说明书所摘录和讨论的多种一般性及较专业性参考书中，除非另有说明。参见例如：Sambrook等人的Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))及Ausubel等人的Current Protocols in Molecular Biology(Greene Publishing Associates (1992))，及Harlow与Lane的Antibodies：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.(1990))，其内容已以引用的方式并入本文中。酶反应与纯化技术是根据制造商的说明书进行，通常可依本领域已知的方法或依本文说明的方法进行。与本文中描述的分析化学、合成有机化学、及医学与医药化学相关的命名法，及实验方法与技术是本领域已知且常用的。化学合成法、化学分析法、医药制法、调配法与传送法，及患者的治疗法均采用标准技术。
除非另有说明，否则下列术语具有如下定义：
″多肽″一词包含天然或人造蛋白质、蛋白质片段及蛋白质序列的多肽类似物。多肽可为单体或聚合体。
″分离的蛋白质″、″分离的多肽″或″分离的抗体″一词指该蛋白质、多肽或抗体的衍生来源基本(1)未与其天然状态下所伴随出现的天然联结成分联结，(2)不含来自相同物种的其它蛋白质，(3)由不同物种的细胞表达，或(4)不会天然发生。因此，若该多肽是经化学合成或于不同于其天然细胞来源的细胞系统中合成时，则该多肽可认为是与其天然联结成分″分离″的。蛋白质也可使用本领域已知的蛋白质纯化技术分离，而使其实质上不含天然联结成分。
分离的抗体的实例包括已经使用CD40进行亲和性纯化的抗-CD40抗体，于活体外使用杂交瘤或其它细胞系合成的抗-CD40抗体，及衍生自转基因小鼠的人类抗-CD40抗体。
蛋白质或多肽为″实质上纯的″、″实质上均质″或″实质上已纯化″是指该样品中至少约60至75％为单一种类的多肽。多肽或蛋白质可为单体或多聚体。实质上纯的多肽或蛋白质典型地构成约50％、60％、70％、80％或90％W/W蛋白质样品，更常为约95％，优选为纯度99％以上。蛋白质纯度或均质性可依本领域已知的多种方法判定，如：由蛋白质样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后，使用本领域已知的染料为凝胶染色，检查单一多肽条带。为了有些目的，可能使用HPLC或其它本领域已知的手段提供较高分辨率的纯化。
本文所使用″多肽片段″一词指删除氨基末端和/或羧基末端，但其余氨基酸序列仍与该天然序列的相应位置相同的多肽。有些实施方案中，片段长度至少为5、6、8或10个氨基酸。其它实施方案中，片段至少为14个、至少20个、至少50个、至少70、80、90、100、150或200个氨基酸。
本文中所使用″多肽类似物″一词指这样一种多肽，其包含的节段实质上与氨基酸序列的一部分相同且具有下列性质：(1)在适宜结合条件下，与CD40特异性结合，(2)有能力活化CD40，(3)有能力增量调 节细胞表面分子(如：ICAM、MHC-II、B7-1、B7-2、CD71、CD23与CD83)的表达，或(4)有能力加强分泌细胞因子，如：IFN-β1、IL-2、IL-8、IL-12、IL-15、IL-18与IL-23。典型地，多肽类似物相对于天然序列，包含保守性氨基酸取代(或插入或删除)。类似物典型地长为至少20或25个氨基酸，优选为至少50、60、70、80、90、100、150或200个氨基酸或更长，且经常长达天然多肽的全长度。
优选氨基酸取代为：(1)降低对蛋白质水解作用的敏感性，(2)降低对氧化作用的敏感性，(3)改变形成蛋白质复合物的结合亲合性，及(4)赋与或修改此类类似物的其它生理化学或功能性质。类似物可包括序列不同于天然肽序列的多种突变蛋白质。例如：可在天然序列中(优选为形成分子间接触的结构域外围的多肽部份中)进行单一或多重氨基酸取代(优选为保守性氨基酸取代)。保守性氨基酸取代实质上不应改变亲本序列的结构特性(例如：替代的氨基酸不应有打破亲本序列螺旋或瓦解亲本序列特有的二级结构的倾向)。本领域已知的多肽二级与三级结构实例说明于Creighton编辑的Proteins，Structuresand Molecular Principles(W.H.Freeman and Company，New York(1984))；C.Branden与J.Tooze编辑的Introduction to Protein Structure(Garland Publishing，New York，N.Y.(1991))；及Thornton等人的Nature354：105(1991)，其内容已以引用的方式并入本文中。
非肽类似物具有类似肽模板的性质，因此常于制药界中用为药物。此类类型的非肽化合物称为″肽模拟物″。Fauchere的J.Adv.Drug Res.15：29(1986)；Veber与Freidinger的TINS，p.392(1985)；及Evans等人的J.Med.Chem.30：1229(1987)，其内容已以引用的方式并入本文中。此类化合物经常藉助于计算机化分子建模开发出来。肽模拟物在结构上类似具有医疗用途的肽，可用于产生同等医疗效力或预防效力。通常，肽模拟物在结构上类似模范多肽(也即具有所需生化性质或医药活性的多肽)，如：人类抗体，但其中一个或多个肽联结可选地利用本领域已知的方法，被选自下列的联结置换：-CH2NH-、 -CH2S-、-CH2-CH2-、-CH＝CH-(顺式与反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-、与-CH2SO-。一致序列中一个或多个氨基酸用相同种类型的D-氨基酸(例如：以D-赖氨酸置换L-赖氨酸)进行系统性取代时，可产生更稳定的肽。此外，包含一致序列或实质上相同一致序列变化的受限定的肽可依本领域已知的方法产生(Rizo与Gierasch的Ann.Rev.Biochem.61：387(1992)，其内容已以引用的方式并入本文中)；例如：添加可以形成分子内二硫键而使肽环化的内部半胱氨酸残基。
″抗体″指完全抗体或其抗原结合部分，所述抗原结合部分会与完整抗体竞争特鼻性结合。其一般说明参见Fundamental Immunology，第7章(Paul，W.编辑，第2版，RavenPress，N.Y.(1989))(其内容已以引用的方式完全并入本文中，供所有目的用)。抗原结合部分可利用重组DNA技术或酶性或化学性裂解完整抗体而产生。抗原结合部分包括：Fab、Fab′、F(ab′)2、Fd、Fv、dAb、与补体决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、嵌合抗体、双重抗体(diabodies)与多肽，所述多肽包含足以赋与特异性抗原与多肽的结合性的抗体的至少一部份。
从N-末端至C-末端，轻链与重链可变结构域均包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3与FR4区。各结构域的氨基酸分配是根据Kabat的″Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1987and1991))，或Chothia与Lesk的J.Mol.Biol.196：901-917(1987)；Chothia等人的Nature342：878-883(1989)中的定义。
本文中以数字表示的抗体是指得自相同编号的杂交瘤的单克隆抗体。例如：单克隆抗体3.1.1得自杂交瘤3.1.1。
本文中所使用Fd片段指该由VH与CH1结构域组成的抗体片段；Fv片段由抗体的单臂中VL与VH结构域组成；及dAb片段(Ward等人的Nature341：544-546(1989))由VH结构域组成。
有些实施方案中，抗体为单链抗体(scFv)，其中VL与VH结构域经由合成的连接体配对形成单价分子，该连接体使所述结构域得以形成单一蛋白质链。(Bird等人的Science242：423-426(1988)与Huston 等人的Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5879-5883(1988))。有些实施方案中，抗体为双重抗体(diabodies)，也即VH与VL结构域均表达在单一多肽链上的二价抗体，但其中使用的连接体太短，无法在同一条链上两个结构域之间形成配对，以致迫使结构域必需与另一条链上的互补结构域配对，从而创造出两个抗原结合位置。(参见例如：Holliger P.等人的Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448(1993)，及Poljak R.J.等人的Structure2：1121-1123(1994))。有些实施方案中，可将来自本发明抗体的一个或多个CDRs，经由共价性或非共价性方式引进分子中，形成可特异性结合CD40的免疫粘附素。此类实施方案中，CDR(s)可作为较大多肽链的一部分引进，可与另一条多肽链共价联结，或可以非共价性方式引进。
具有一个或多个结合位置的实施方案中，此类结合位置可相同或相异。
本文所使用″人类抗体″一词指其中所有可变性及恒定性结构域序列均为人类序列的任何抗体。此类抗体可依下文中说明的多种方式制备。
本文所使用″嵌合抗体″一词指包含来自两种或多种不同抗体的区段的抗体。在一项实施方案中，一个或多个CDRs衍生自人类抗-CD40抗体。另一项实施方案中，所有CDRs均衍生自人类抗-CD40抗体。另一项实施方案中，于嵌合抗体中组合来自一种以上人类抗-CD40抗体的CDRs。例如：嵌合抗体可包含来自第一种人类抗-CD40抗体中轻链的CDR1、来自第二种人类抗-CD40抗体中轻链的CDR2、与来自第三种人类抗-CD40抗体中轻链的CDR3与CDR3，且来自重链的CDRs可衍生自一种或多种其它抗-CD40抗体。此外，构架区可衍生自相同抗-CD40抗体或衍生自一个或多个不同人体。
本文所使用″活化型抗体″(本文中也称为″激动剂抗体″)指该抗体当加至表达CD40的细胞、组织或生物体中时，可使一种或多种CD40活性提高至少约20％。有些实施方案中，抗体活化CD40活性达至少40％、50％、60％、70％、80％、85％。有些实施方案中，于CD40L的存在下添加 活化型抗体。有些实施方案中，使用全血表面分子增量调节分析法测定活化型抗体的活性。参见实例VII。另一项实施方案中，使用树突细胞分析法测定IL-12的释出，来测定活化型抗体的活性。参见实例VIII。另一项实施方案中，使用活体内肿瘤模型测定活化型抗体的活性。参见实例X。
抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物很容易由本领域普通技术人员依据本说明书的教示制备。片段或类似物的优选氨基-与羧基-末端出现在功能性结构域的临界处。结构性与功能性结构域可经由比对核苷酸和/或氨基酸序列数据与已公开或专有的序列数据库来判别。优选采用计算机化比对法来判别序列基元或预测出现在其它已知结构和/或功能的蛋白质中的蛋白质构象结构域。可采用已知方法判别折叠成已知三维结构的蛋白质序列。参见Bowie等人的Science253：164(1991)。
本文所使用″表面胞质团共振(surface plasmon resonance)″指可经由检测生物感应器基质中蛋白质浓度的变化，来分析实时生物特异性相互作用的光学现象，例如：使用BIAcore系统进行(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden and Piscataway，N.J.)。进一步的说明可参见Jonsson U.等人的Ann.Biol.Clin.51：19-26(1993)；JonssonU.等人的Biotechniques11：620-627(1991)；Jonsson B.等人的J.Mol.Recognit.8：125-131(1995)；及Johnsson B.等人的Anal.Biochem.198：268-277(1991)。
″KD″一词指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。
″表位″一词包括任何可特异性结合免疫球蛋白或T-细胞受体的蛋白质决定簇。表位决定簇通常由化学活性表面分子群组成，如：氨基酸或糖侧链，且通常具有特定三维结构特性，及特定电荷特性。当抗体的平衡解离常数≤1μM，优选为≤100nM，最优选为≤10nM时，可认为抗体与抗原特异性结合。
本文所采用的20种常见氨基酸与其缩写是依其常见用法。参见 Immunology-A Synthesis(第二版，E.S.Golub与D.R.Gren编辑， Sinauer Associates，Sunderland，Mass.(1991))，其内容已以引用的方式并入本文中。
″多核苷酸″一词在本文中指至少长10个碱基的聚合型核苷酸，其可为核糖核苷酸或脱氧核苷酸或此两种型式核苷酸的修饰型。此术语包括单链与双链。
本文所采用的″分离的多核苷酸″一词指基因组、cDNA或合成的多核苷酸，或其某些组合，″分离的多核苷酸″基本(1)不与天然发现的″分离的多核苷酸″相关联的多核苷酸的全部或部份结合，(2)与原本非天然联结的多核苷酸进行可操作性连接，或(3)不会在天然界中以较大序列的一部份出现。
本文所使用″寡核苷酸″一词包括利用天然与非天然寡核苷酸键共同联结的天然与经修饰的核苷酸。寡核苷酸为多核苷酸子序列，通常长度包含200个碱基或更少。优选寡核苷酸为长10至60个碱基，最优选为长12、13、14、15、16、17、18、19、或20至40个碱基。寡核苷酸通常为单链，例如：引物与探针，但寡核苷酸也可为双链，例如：用于构建基因突变体时。本发明寡核苷酸可为有义或反义寡核苷酸。
本文所使用″天然核苷酸″一词包括脱氧核糖核苷酸与核糖核苷酸。本文所使用″经修饰的核苷酸″一词包括具有经修饰或经取代糖基等等的核苷酸。″寡核苷酸联结″在本文中包括这样一些寡核苷酸联结，如：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、硫代苯氨基磷酸酯、苯氨基磷酸酯、氨基磷酸酯，等等。参见例如：LaPlanche等人的Nucl.Acids Res.14：9081(1986)；Stec等人的J.Am.Chem.Soc.106：6077(1984)；Stein等人的Nucl.Acids Res.16：3209(1988)；Zon等人的Anti-Cancer Drug Design6：539(1991)；Zon等人的Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approach，pp.87-108(F.Eckstein编辑，Oxford University Press，Oxford England)(1991))；美国专利No.5,151,510；Uhlmann与Peyman的Chemical Reviews90：543(1990)，其内容已以引用的方式并入本文 中。若需要时，寡核苷酸可包括检测标记。
″可操作性连接″序列包括紧邻目标基因的表达控制序列及具有反向作用或与目标基因具有一段距离的表达控制序列。本文中所使用″表达控制序列″指其连接的编码序列为了进行表达及处理而必需的多核苷酸序列。表达控制序列包括适当的转录开始、终止、启动子与增强子序列；有效的RNA处理信号如：剪接与聚腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；加强翻译效率的序列(也即Kozak一致序列)；加强蛋白质稳定性的序列；及若需要时，促进蛋白质分泌的序列。此类控制序列的性质差异依宿主生物体而定；在原核生物中，此类控制序列通常包括启动子、核糖体结合位置、及转录终止序列；在真核生物中，此类控制序列通常包括启动子与转录终止序列。″控制序列″一词应至少包括所有为了表达与加工处理所必要的成分，也可包括其它有益的成分，例如：前导序列与融合对象序列(fusion partnersequence)。
本文所使用″载体″一词指可运送与其连接的另一种核酸的核酸分子。有些实施方案中，载体为质粒，也即环形双链DNA，其中可连接其它DNA节段。有些实施方案中，载体为病毒载体，其中外加的DNA节段可连接至病毒基因组中。有些实施方案中，载体可于其所引入的宿主细胞中(例如：具有细菌性复制起点的细菌性载体与游离型哺乳动物载体)进行自主性复制。其它实施方案中，载体(例如：非游离型哺乳动物载体)可于引进宿主细胞中后整合入宿主细胞的基因组中，藉以与宿主基因组一起复制。此外，某些载体可指导其所操纵性联结的基因表达。此类载体在本文中称为″重组表达载体″(或简称″表达载体″)。
本文所使用″重组宿主细胞″(或简称″宿主细胞″)一词指其中已引进重组表达载体的细胞。应了解，″重组宿主细胞″与″宿主细胞″不仅指特定的某个体细胞，也指此类细胞的子代。由于某些修饰可能因突变或环境影响而发生在下一代中，此类子代事实上不一定与母细胞相同，但仍包括在本文所使用的″宿主细胞″一词的范围内。
″选择性杂交″在本文中指可检测到的特异性结合。根据本发明多核苷酸、寡核苷酸与其片段可于尽可能降低与非特异性核酸产生可检 测到的结合作用的杂交及洗涤条件下，与核酸链进行选择性杂交。″高严格性″或″高度严格″条件可用于达到本领域已知且将于本文中讨论的选择性杂交条件。″高严格性″或″高度严格″条件的一项实例为由多核苷酸与另一种多核苷酸孵育，其中一种多核苷酸可固定在固体表面上(如：膜)，于杂交缓冲液中(6X SSPE或SSC、50％甲酰胺、5XDenhardt′s试剂、0.5％SDS、100μg/ml变性鲑鱼精子DNA片段)，于42℃杂交温度下培养12-16小时后，随后于55℃下，使用洗涤缓冲液(1XSSC、0.5％SDS)洗涤2次。也参见如上述Sambrook等人的文献，pp.9.50-9.55。
核酸序列说明中的″序列同一性百分比″一词指两种序列进行最大相关性比对时，为相同的残基。序列同一性比较的长度至少约9个核苷酸，通常至少约18个核苷酸，更通常至少约24个核苷酸，典型为至少约28个核苷酸，更典型为至少约32个核苷酸，优选为至少约36、48或更多个核苷酸。本领域已知有多种不同算法可用于测量核苷酸序列同一性。例如：可使用FASTA、Gap或Bestfit比对多核苷酸序列，其是威斯康星州麦迪逊市遗传计算机小组(GCG)的Wisconsin Package10.0版程序。FASTA包括例如：FASTA2与FASTA3程序，提供疑问序列(query sequence)与搜寻序列(search sequence)之间最优重迭区的排列及同一性百分比(Pearson，Methods Enzymol.183：63-98(1990)；Pearson，Methods Mol.Biol.132：185-219(2000)；Pearson，Methods Enzymol.266：227-258(1996)；Pearson，J.Mol.Biol.276：71-84(1998)；其内容已以引用的方式并入本文中)。除非另有说明，否则特定程序或算法使用默认参数。例如：核酸序列之间的序列同一性百分比可使用FASTA，以其默认参数测定(字长为6，计分矩阵中使用NOPAM因子)或使用GCG6.1版所提供的Gap，以其默认参数测定，其内容已以引用的方式并入本文中。
除非另有说明，否则所提及的核苷酸序列包含其互补链。因此，应了解，所提及的具有特定序列的核酸应包含其具有互补序列的互补 链。
分子生物学领域中，研究者可互换使用″序列同一性百分比″、″序列相似性百分比″及″序列同源性百分比″等术语。本申请案中，此类术语仅用在核酸序列时具有相同含义。
当提及核酸或其片段时，″实质相似性″或″实质序列相似性″指当经过适当插入或删除后，与另一种核酸(或其互补链)进行最优比对时，依任何已知的序列同一性算法(如：上述FASTA、BLAST或Gap)测定的核苷酸序列同一性为至少约85％，优选为至少约90％，更优选为至少约95％、96％、97％、98％或99％。
应用在多肽上时，″实质同一性″一词指当经过最适比对后，如：采用GAP或BESTFIT程序，使用默认缺口值测定两种肽序列之间具有至少70、75或80％序列同一性，优选为至少90或95％序列同一性，更优选为至少97、98或99％序列同一性。优选的，不相同的残基位置的差异最好为保守性氨基酸取代。″保守性氨基酸取代″指其中氨基酸残基被另一种具有化学性质(例如：电荷或亲水性)类似的侧链R基的氨基酸残基取代。通常，保守性氨基酸取代实质上不会改变蛋白质的功能性质。若其中两种或多种氨基酸序列的差异在于保守性取代时，可使序列同一性百分比或相似度上调，以校正取代作用的保守性质。参见例如：Pearson，Methods Mol.Biol.243：307-31(1994)。具有相似化学性质的侧链的氨基酸基团实例包括：1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、与异亮氨酸；2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸与苏氨酸；3)含酰胺侧链：天冬酰胺与谷氨酰胺；4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸、与色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸、与组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸与谷氨酸；及7)含硫侧链：半胱氨酸与甲硫氨酸。优选保守性氨基酸取基组为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸、及天冬酰胺-谷氨酰胺。
或者，保守性置换为在Gonnet等人的Science256：1443-45(1992)(其内容已以引用的方式并入本文中)所揭示的PAM250对数-近 似值矩阵中得到正值的任何变化。″适度保守性″置换为在PAM250对数-近似值矩阵中得到非负值的任何变化。
多肽的序列相似性(也称为序列同一性)典型地是使用序列分析软件测定。蛋白质分析软件依据不同取代、删除及其它修饰(包括保守性氨基酸取代)指定的相似性测定值，将相似的序列配对。例如：GCG包含的程序如：″Gap″与″Bestfit″可利用默认参数来确定极相关的多肽之间的序列同源性或序列同一性(如：来自不同生物品种的同源肽)或野生型蛋白质与其突变蛋白质之间的序列同源性或序列同一性。参见例如：6.1版GCG。多肽序列也可利用FASTA(6.1版GCG程序)，使用默认参数或推荐参数进行比对。FASTA(例如：FASTA2与FASTA3)提供疑问序列与搜寻序列之间最优重迭区的比对及序列同一性百分比(Pearson，Methods Enzymol.183：63-98(1990)；Pearson，Methods Mol.Biol.132：185-219(2000))。当用本发明序列与含有大量来自不同生物体的序列的数据库进行比对时，另一项优选算法为计算机程序BLAST，尤指blastp或tblastn，其使用默认参数测定。参见例如：Altschul等人的J.Mol.Biol.215：403-410(1990)；Altschul等人的Nucleics Acids Res.25：3389-402(1997)；其内容已以引用的方式并入本文中。
用于比对同源性的多肽序列长度通常为至少约16个氨基酸残基，通常至少约20个残基，更通常为至少约24个残基，典型为至少约28个残基，优选为超过约35个残基。当搜寻含有来自大量多种不同生物体的序列的数据库时，最好比对氨基酸序列。
本文所使用″标记″或″标记的″术语指将另一种分子整合入抗体中。一项实施方案中，标记为可检测的标记，例如：整合入放射性标记的氨基酸或附接在生物素化部份的多肽上，其可利用标记的抗生物素蛋白检测(例如：含荧光标记的链霉抗生物素或可使用光学或比色法检测的酶活性)。另一项实施方案中，标记可为医疗性的，例如：药物缀合物或毒素。本领域已知有多种标记多肽与糖蛋白的方法可以使用。多肽的标记实例包括(但不限于)下列：放射性同位素或放射性核素(例 如：3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、荧光标记(例如：FITC、罗丹明、镧系无机发光材料)、酶标记(例如：辣根过氧化酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光标记、生物素基团、可由第二报导体识别的预定多肽表位(例如：亮氨酸拉链型配对序列，第二抗体的结合位置、金属结合性结构域、表位标签)，磁性试剂，如：钆螯合物、毒素如百日咳毒素、紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌素D、溴乙啶、吐根碱、丝裂霉素、鬼臼亚乙苷、丹特赛(tenoposide)、长春花新碱、长春花碱、秋水仙素、阿霉素、道诺红菌素、dihydroxy anthracin dione、mitoxantrone、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睪酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔与嘌罗霉素及其类似物或同源物。有些实施方案中，标记是利用不同长度的间隔臂连接的，以降低潜在的空间位阻。
患者一词包括人类及动物受试者。
本说明书与权利要求全文中，″包括″或其变体如″包含″意指包括所述实体或一群实体，但不排除任何其它实体或实体群。
人类抗-CD40抗体与其表征
人类抗体可避免某些与具有非-人类(例如：啮齿类动物)可变区或恒定区的抗体相关的问题。此类问题包括抗体的快速清除或对抗抗体的免疫反应。因此，在一项实施方案中，本发明提供人源化的抗-CD40抗体。另一项实施方案中，本发明提供人类抗-CD40抗体。有些实施方案中，人类抗-CD40抗体是由其基因组中包含人类免疫球蛋白基因的啮齿类动物经免疫接种而产生人类抗体。人类抗-CD40抗体应可使原本对非人类单克隆抗体或非人类衍生的单克隆抗体(Mabs)的免疫原性及过敏反应降至最低，因此可提高所施用抗体的效力与安全性。完全人类抗体应可用在治疗慢性及复发的人类疾病上以提供实质优点，如：可能需要重复施用抗体的发炎与癌症上。
本发明提供11种活化型人类抗-CD40单克隆抗体(mAbs)及产生此类抗体的杂交瘤细胞系。表A列出编码全长重链与轻链(包括前导序列)的核酸、推导的相应的全长氨基酸序列、及重链与轻链可变区的核 苷酸与推导的氨基酸序列的序列号(SEQ ID NOS：)。
表A
本发明进一步提供人类抗-CD40mAb23.25.1及产生该抗体的杂交瘤细胞系。
本发明进一步提供某些上述人类抗-CD40mAbs的重链和/或轻链变体，其包含一个或多个氨基酸取代。本发明提供mAb3.1.1.的两种重链变体。其中一种中，残基78上的丙氨酸换成苏氨酸。第二种变体中，残基78上的丙氨酸换成苏氨酸，且残基88与97上的缬氨酸换成丙氨酸。本发明也提供mAb3.1.1的一种轻链变体，其中残基4上的亮氨酸与残基83上的亮氨酸分别换成甲硫氨酸与缬氨酸。重链或轻链变体分别与野生型轻链或重链的组合称为突变链。因此，含野生型轻链与其中残基78上的丙氨酸突变成苏氨酸的重链的抗体即指定为3.1.1H-A78T。然而，本发明其它实施方案中，包括含3.1.1的重链与轻链变体的任何组合的抗体。
此外，本发明提供mAb22.1.1的重链变体，其中残基109上的半胱氨酸换成丙氨酸。包含该重链变体与22.1.1轻链的单克隆抗体指定为mAb22.1.1H-C109A。本发明并提供mAb23.28.1.的两种重链变体及一种轻链变体。其中一种重链变体中，残基16上的天冬氨酸换 成谷氨酸。包含该重链变体与23.28.1轻链的mAb指定为23.28.1H-D16E。本发明也包括23.28.1轻链变体，其中残基92上的半胱氨酸换成丙氨酸。包含23.28.1重链与此轻链变体的mAb抗体指定为23.28.1L C92A。本发明也提供含有23.28.1重链变体与23.28.1轻链变体的mAbs。
由杂交瘤23.29.1产生的轻链于恒定区中残基174含有一处突变。由此杂交瘤产生的轻链中，此位置原有的赖氨酸改为精氨酸。因此，本发明也提供含有残基174上原有赖氨酸的23.29.1轻链，及含有23.29.1重链与轻链变体的mAb，称为23.29.1L-R174K。
在一项优选实施方案中，抗-CD40抗体为3.1.1、3.1.1H-A78T、3.1.1H-A78T-V88A-V97A、3.1.1L-L4M-L83V、7.1.2、10.8.3、15.1.1、21.4.1、21.2.1、22.1.1、22.1.1H-C109A、23.5.1、23.25.1、23.28.1、23.28.1H-D16E、23.28.1L-C92A、23.29.1、23.29.1L-R174K与24.2.1。有些实施方案中，抗-CD40抗体包括一条轻链，该轻链包含选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO：8、16、24、32、40、48、56、64、72、80、88、94、100或102或其可变区，或由选自下列核酸序列所编码：SEQ ID NO.7、15、23、31、39、47、55、63、71、79、87、93、99或101。有些实施方案中，抗-CD40抗体包含一条轻链，其至少包含来自上列抗体之一的CDR2、上列氨基酸序列之一(如图1A-1C与2A-2C所示)或由上列核酸序列之一编码。另一项实施方案中，轻链还包含分别独立选自轻链可变区的CDR1与CDR3，其中该轻链可变区包含不超过10个来自种系VκA3/A19、L5或A27基因编码的氨基酸序列中的氨基酸，或包含分别独立选自下列的CDR1与CDR3之一的CDR1与CDR3：(1)选自下列的抗体：3.1.1、3.1.1L-L4M-L83V、7.1.2、10.8.3、15.1.1、21.4.1、21.2.1、22.1.1、23.5.1、23.25.1、23.28.1、23.28.1L-C92A、23.29.1、23.29.1L-R174K或24.2.1；(2)氨基酸序列SEQ ID NO：4、12、20、28、36、44、52、60、68、76、84、94、100或102，或(3)由下列核酸序列编码：SEQ ID NO：3、11、19、27、35、43、51、59、67、75、83、93、99或101。
另一项优选实施方案中，抗-CD40抗体包含一条重链，该重链包含选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO：6、14、22、30、38、46、54、62、70、78或86或其可变区，或由选自下列的核酸序列编码：SEQ ID NOS：5、13、21、29、37、45、53、61、69、77或85。有些实施方案中，抗-CD40抗体包含一条重链，其中该重链至少包含上列抗体之一的CDR3，上列氨基酸序列之一(如：图1A-1C与2A-2C所示)或由上列核酸序列之一编码。另一项实施方案中，重链还包含独立选自重链可变区的CDR1与CDR2，其中该重链可变区包含不超过18个来自种系VH3-30+，4-59、1-02、4.35或3-30.3基因所编码的氨基酸序列中的氨基酸，或包含独立选自下列的CDR1与CDR2中之一的CDR1与CDR2：(1)选自下列的抗体：3.1.1、3.1.1H-A78T、3.1.1H-A78T-V88A-V97A、7.1.2、10.8.3、15.1.1、21.4.1、21.2.1、22.1.1、22.1.1H-C109A、23.5.1、23.25.1、23.28.1、23.28.1H-D16E、23.29.1与24.2.1；(2)氨基酸序列SEQ ID NO：2、10、18、26、34、42、50、58、66、74、82、90、92、96或98；或(3)由下列核酸序列编码：SEQ ID NO：1、9、17、25、33、41、49、57、65、73、81、89、91、95或97。另一项实施方案中，抗-CD40抗体包含如上述定义的重链与轻链。
本文所使用抗体3.1.1H-A78T与3.1.1相同，但其中重链中残基78的丙氨酸改为苏氨酸。同样地，抗体3.1.1H-A78T-V88A-V97A的重链中，残基78改为A，残基88与97的缬氨酸改为丙氨酸。抗体3.1.1L-L4M-L83V与3.1.1相同，但其中轻链上残基4的亮氨酸改为甲硫氨酸，残基83上的亮氨酸改为缬氨酸。抗体22.1.1H-C109A与22.1.1相同，但其中重链上残基109的半胱氨酸改为丙氨酸。抗体23.28.1H-D16E与23.28.1L-C92A与23.28.1相同，但其中重链上残基16的天冬氨酸改为谷氨酸，轻链上残基92的半胱氨酸改为丙氨酸。抗体23.29.1L-R174K与23.29.1相同，但其中轻链上残基174的精氨酸改为赖氨酸。
抗-CD40抗体类型与亚型
抗-CD40抗体类型与亚型可由本领域已知的任何方式确定。通常， 抗体类型与亚型可使用特异于特定抗体类型与亚型的抗体确定。此类抗体可购买得到。类型与亚型可使用ELISA、或蛋白质印迹分析法及其它技术确定。或者，类型与亚型可经由分析抗体的重链和/或轻链的所有或一部份恒定结构域的序列后，将其氨基酸序列与来自多种不同已知免疫球蛋白类型与亚型的氨基酸序列比较，并确定该抗体之类型与亚型。
有些实施方案中，抗-CD40抗体为单克隆抗体。该抗-CD40抗体可为IgG、IgM、IgE、IgA或IgD分子。优选实施方案中，抗-CD40抗体为IgG，且为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型。另一项优选实施方案中，抗-CD40抗体为IgG2亚型。
物种与分子选择性
本发明另一方面，抗-CD40抗体显示物种与分子选择性。有些实施方案中，抗-CD40抗体与灵长类及人类CD40结合。有些实施方案中，抗-CD40抗体与人类、猕猴或恒河猴CD40结合。其它实施方案中，抗-CD40抗体不与小鼠、大鼠、狗或兔子CD40结合。依据本说明书的教导，即可采用本领域已知的方法判断抗-CD40抗体的物种选择性。例如：可采用蛋白质印迹分析法、FACS、ELISA或RIA确定物种选择性。(参见例如：实施例IV)。
有些实施方案中，抗-CD40抗体对CD40的选择性比对RANK(核因子-κB的受体活化物)、4-1BB(CD137)、TNFR-1(肿瘤坏死因子受体-1)及TNFR-2(肿瘤坏死因子受体-2)的选择性高100倍以上。有些实施方案中，抗-CD40抗体对CD40以外的任何其它蛋白质不具有任何明显的特异性结合。可采用本领域已知的方法，依本说明书的教导，确定抗-CD40抗体对CD40的选择性。例如：可采用蛋白质印迹分析法、FACS、ELISA或RIA确定选择性(参见例如：实施例V)。
抗-CD40抗体所识别的CD40表位的鉴定法
此外，本发明提供与CD40结合的人类抗-CD40单克隆抗体，其会与选自下列人类抗-CD40抗体交叉竞争结合和/或结合相同表位和/或结合CD40时具有相同的KD：抗体3.1.1、3.1.1H-A78T、 3.1.1H-A78T-V88A-V97A、3.1.1L-L4M-L83V、7.1.2、10.8.3、15.1.1、21.4.1、21.2.1、22.1.1、22.1.1H-C109A、23.5.1、23.25.1、23.28.1、23.28.1H-D16E、23.28.IL-C92A、23.29.1、23.29.1L-R174K或24.2.1；或人类抗-CD40抗体，其中所包含的重链可变区具有下列氨基酸序列SEQ ID NO：2、10、18、26、34、42、50、58、66、74、82、90、92、96或98；或人类抗-CD40抗体，其中所包含的轻链可变区具有下列氨基酸序列SEQ ID NO：4、12、20、28、36、44、52、60、68、76、84、94、100或102。
可采用本领域已知的任何方法确定抗体是否会与抗-CD40抗体的结合相同的表位或与抗-CD40抗体交叉竞争结合。在一项实施方案中，可使本发明抗-CD40抗体于饱和条件下与CD40结合，然后测定试验抗体与CD40结合的能力。若试验抗体可与抗-CD40抗体在相同的时间内结合CD40，则该试验抗体结合相同的表位、重叠表位、或与人类抗-CD40抗体结合的表位非常临近的表位。此实验可采用ELISA、FACS或表面胞质团共振法进行(参见例如：实施例VI)。优选实施方案中，该实验是采用表面胞质团共振法进行。更优选实施方案中，是采用BIAcore。
抗-CD40抗体与CD40的结合亲和性
本发明有些实施方案中，抗-CD40抗体以极高亲和性与CD40结合。有些实施方案中，抗-CD40抗体与CD40结合的KD为2x10-8M或更低。另一项优选实施方案中，抗体与CD40结合的KD为2x10-9、2x10-10、4.0x10-11M，或更低。甚至更优选实施方案中，抗体与CD40结合的KD为2.5x10-12M，或更低。有些实施方案中，抗体与CD40结合的KD实质上与选自下列抗体的KD相同：3.1.1、3.1.1H-A78T、3.1.1H-A78T-V88A-V97A、3.1.1L-L4M-L83V、7.1.2、10.8.3、15.1.1、21.4.1、21.2.1、22.1.1、22.1.1H-C109A、23.5.1、23.25.1、23.28.1、23.28.1H-D16E、23.28.1L-C92A、23.29.1、23.29.1L-R174K或24.2.1。另一项优选实施方案中，抗体与CD40结合的KD实质上与包含来自下列抗体中轻链的CDR2和/或重链的CDR3的抗体KD相同：3.1.1、 3.1.1H-A78T、3.1.1H-A78T-V88A-V97A、3.1.1L-L4M-L83V、7.1.2、10.8.3、15.1.1、21.4.1、21.2.1、22.1.1、22.1.1H-C109A、23.5.1、23.25.1、23.28.1、23.28.1H-D16E、23.28.1L-C92A、23.29.1、23.29.1L-R174K和24.2.1。另一项优选实施方案中，抗体与CD40结合的KD实质上与包含具有下列氨基酸序列SEQ ID NO：2、10、18、26、34、42、50、58、66、74、82、90、92、96或98的重链可变区，或包含具有下列氨基酸序列SEQ ID NO：4、12、20、28、36、44、52、60、68、76、84、94、100或102的轻链可变区的抗体的KD相同。另一项优选实施方案中，抗体与CD40结合的KD实质上与包含具有下列氨基酸序列SEQ ID NO：4、12、20、28、36、44、52、60、68、76、84、94、100或102的轻链可变区的CDR2或包含具有下列氨基酸序列SEQ IDNO：2、10、18、26、34、42、50、58、66、74、82、90、92、96或98的重链可变区的CDR3的抗体的KD相同。
有些实施方案中，抗-CD40抗体的解离速率低。有些实施方案中，抗-CD40抗体的Koff为2.0x10-4，或更低。有些实施方案中，Koff为2.0x10-7或更低。有些实施方案中，Koff实质上与本文所述的抗体相同，包括选自下列的抗体：3.1.1、3.1.1H-A78T、3.1.1H-A78T-V88A-V97A、3.1.1L-L4M-L83V、7.1.2、10.8.3、15.1.1、21.4.1、21.2.1、22.1.1、22.1.1H-C109A、23.5.1、23.25.1、23.28.1、23.28.1H-D16E、23.28.1L-C92A、23.29.1、23.29.1L-R174K和24.2.1。有些实施方案中，抗体与CD40结合的Koff实质上与包含来自下列抗体中重链的CDR3或轻链的CDR2的抗体Koff相同：3.1.1、3.1.1H-A78T、3.1.1H-A78T-V88A-V97A、3.1.1L-L4M-L83V、7.1.2、10.8.3、15.1.1、21.4.1、21.2.1、22.1.1、22.1.1H-C109A、23.5.1、23.25.1、23.28.1、23.28.1H-D16E、23.28.IL-C92A、23.29.1、23.29.1L-R174K和24.2.1。有些实施方案中，抗体与CD40结合的Koff实质上与包含具有下列氨基酸序列SEQ ID NO：2、10、18、26、34、42、50、58、66、74、82、90、92、96或98的重链可变区，或包含具有下列氨基酸序列SEQ IDNO：4、12、20、28、36、44、52、60、68、76、84、94、100或102的轻 链可变区的抗体的Koff相同。另一项优选实施方案中，抗体与CD40结合的Koff实质上与包含具有下列氨基酸序列SEQ I DNO：4、12、20、28、36、44、52、60、68、76、84、94、100或102的轻链可变区的CDR2或包含具有下列氨基酸序列SEQ ID NO：6、14、22、30、38、46、54、62、70、78、86、90、92、96或98的重链可变区的CDR3的抗体的Koff相同。
抗-CD40抗体与CD40的结合亲和性及解离速率可采用本领域已知的方法确定。结合亲和性可采用竞争性ELISAs、RIAs或表面胞质团共振法进行，如：BIAcore。也可采用表面胞质团共振法测定解离速率。优选为采用表面胞质团共振法测定结合亲和性及解离速率。更优选为采用BIAcoreTM测定结合亲和性及解离速率。参见例如：实施例XIV。
轻链与重链基因利用
本发明抗-CD40抗体可包含人类κ-或人类λ-轻链或其衍生的氨基酸序列。有些实施方案包含κ-轻链，该轻链可变结构域(VL)由人类A3/A19(DPK-15)、L5(DP5)或A27(DPK-22)VK基因部分编码。
有些实施方案中，抗-CD40抗体的VL包含相对于种系氨基酸序列的一个或多个氨基酸取代。有些实施方案中，抗-CD40抗体的VL包含相对于种系氨基酸序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代。有些实施方案中，那些种系氨基酸取代中的一个或多个出现在轻链的CDR区中。有些实施方案中，相对于种系的氨基酸取代位置与抗体3.1.1、3.1.1L-L4M-L83V、7.1.2、10.8.3、15.1.1、21.4.1、21.2.1、22.1.1、23.5.1、23.25.1、23.28.1、23.28.1L-C92A、23.29.1、23.29.1L-R174K和24.2.1的任何一个或多个VL中相对于种系的一个或多个取代位置相同。例如：抗-CD40抗体的VL可包含抗体21.4.1中相对于种系的一个或多个氨基酸取代，及抗体10.8.3中的其它相对于种系的氨基酸取代，其中，所述抗体10.8.3与抗体21.4.1使用相同的VK基因。有些实施方案中，氨基酸变化出现在一个或多个相同位置，但涉及不同于参考抗体的突变。
有些实施方案中，相对于种系，出现氨基酸变化的位置与下列任 一种抗体3.1.1、3.1.1L-L4M-L83V、7.1.2、10.8.3、15.1.1、21.4.1、21.2.1、22.1.1、23.5.1、23.25.1、23.28.1、23.28.1L-C92A、23.29.1、23.29.1L-R174K与24.2.1的VL中的一个或多个变化位置相同，但此类变化可能表示在此类位置上相对于参考抗体中氨基酸的保守性氨基酸取代。例如：若其中一种抗体在特定位置相对于种系发生了改变并且为谷氨酸时，则可在该位置上以天冬氨酸进行保守性取代。同样地，若相对于种系，氨基酸取代为丝氨酸时，则可在该位置上以苏氨酸保守性取代丝氨酸。保守性氨基酸取代已于上文中讨论。
有些实施方案中，人类抗-CD40抗体的轻链包含的氨基酸序列与抗体3.1.1(SEQ.ID NO：4)、3.1.1L-L4M-L83V(SEQ ID NO：94)、7.1.2(SEQ.ID NO：12)、10.8.3(SEQ.IDNO：20)、15.1.1(SEQ.ID NO：28)、21.4.1(SEQ.ID NO：)、21.2.1(SEQ.ID NO：36)、21.4.1(SEQ ID NO：44)、22.1.1(SEQ.ID NO：52)、23.5.1(SEQ.ID NO：60)、23.28.1(SEQ.ID NO：68)、23.28.1L-C92A(SEQ.ID NO：100)、23.29.1(SEQ.ID NO：76)、23.29.1L-R174K(SEQ IDNO：102)或24.2.1(SEQ.ID NO：84)的VL的氨基酸序列，或具有至多1、2、3、4、6、8或10个保守性氨基酸取代和/或总共至多3个非保守性氨基酸取代的所述氨基酸序列相同，。
有些实施方案中，抗-CD40抗体的轻链至少包含轻链CDR2，且也可包含如本文中说明的种系序列的CDR1与CDR3区。另一项实施方案中，轻链可包含独立选自下列抗体的CDR1与CDR2：3.1.1、3.1.1L-L4M-L83V、7.1.2、10.8.3、15.1.1、21.4.1、21.2.1、22.1.1、23.5.1、23.25.1、23.28.1、23.28.1L-C92A、23.29.1与24.2.1，或各具有8个以下，6个以下，4个以下，或3个以下保守性氨基酸取代和/或共有3个或更少个非保守性氨基酸取代的CDR区。其它实施方案中，抗-CD40抗体的轻链至少包含轻链CDR2，也可包含CDR1与CDR3区，所述CDR1和CDR3独立选自具有包含选自SEQ ID NOS：4、12、20、28、36、44、52、60、68、76、84、94或100的氨基酸序列的轻链可变区的抗体中的CDR1与CDR3，或由选自SEQ ID NOS：3、11、19、27、35、43、51、59、67、75、83、93或99的核酸分子编码。
在重链方面，有些实施方案中，重链氨基酸序列的可变区是部分由人类VH3-30+、VH4-59、VH1-02、VH4.35或VH3-30.3基因编码。有些实施方案中，抗-CD40抗体的VH包含相对于种系氨基酸序列的一个或多个氨基酸取代、删除或插入(添加)。有些实施方案中，重链的可变结构域包含相对于种系氨基酸序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个突变。有些实施方案中，突变为相对于种系氨基酸序列的非保守性取代。有些实施方案中，突变位在重链的CDR区中。有些实施方案中，氨基酸的变化位置与下列抗体的任一种或多种VH中相对于种系的一处或多处突变位置相同：3.1.1、3.1.1H-A78T、3.1.1H-A78T-V88A-V97A、7.1.2、10.8.3、15.1.1、21.4.1、21.2.1、22.1.1、22.1.1H-C109A、23.5.1、23.25.1、23.28.1、23.28.1H-D16E、23.29.1与24.2.1。其它实施方案中，氨基酸变化与参考抗体发生在一个或多个相同位置，但涉及不同的突变。
有些实施方案中，重链包含下列抗体的可变结构域(VH)的氨基酸序列：抗体3.1.1(SEQ ID NO：2)、3.1.1H-A78T(SEQ ID NO：90)、3.1.1H-A78T-V88A-V97A(SEQ ID NO：92)、7.1.2(SEQ ID NO：10)、10.8.3(SEQ ID NO：18)、15.1.1(SEQ ID NO：26)、21.2.1(SEQ IDNO：34)、21.4.1(SEQ ID NO：42)、22.1.1(SEQ ID NO：50)、22.1.1H-C109A(SEQ ID NO：96)、23.5.1(SEQ ID NO：58)、23.28.1(SEQ ID NO：66)、23.28.1H-C48G(SEQ ID NO：98)、23.29.1(SEQ ID NO：74)与24.2.1(SEQ ID NO：82)，或包含具有至多1、2、3、4、6、8或10个保守性氨基酸取代和/或总共至多3个非保守性氨基酸取代的上述氨基酸序列。
有些实施方案中，重链包含下列抗体的重链CDR1、CDR2与CDR3区：抗体3.1.1、3.1.1H-A78T、3.1.1H-A78T-V88A-V97A、7.1.2、10.8.3、15.1.1、21.4.1、21.2.1、22.1.1、22.1.1H-C109A、23.5.1、23.25.1、23.28.1、23.28.1H-D16E、23.29.1与24.2.1(如图1D-1H或2D-2H所示)，或各含有8个以下，6个以下，4个以下，或3个以 下保守性氨基酸取代和/或共有3个或更少个非保守性氨基酸取代的上述CDR区。
有些实施方案中，重链包含CDR3，且也可包含如上述的种系序列的CDR1与CDR2区，或可包含抗体的CDR1与CDR2，其独立选自包含选自下列抗体的重链的抗体：3.1.1、3.1.1H-A78T、3.1.1H-A78T-V88A-V97A、7.1.2、10.8.3、15.1.1、21.4.1、21.2.1、22.1.1、22.1.1H-C109A、23.5.1、23.25.1、23.28.1、23.28.1H-D16E、23.29.1与24.2.1。另一项实施方案中，重链包含CDR3，且也可包含CDR1与CDR2区，其是分别选自包含选自下列氨基酸序列SEQ IDNOS：2、10、18、26、34、42、50、58、66、74、82、90、92、96或98(如图1D-1H或图2D-2H所示)的重链可变区的CDR1与CDR2区，或是由选自下列的核酸序列编码：SEQ ID NOS：1、9、17、25、33、41、49、57、65、73、81、89、91、95或97。另一项实施方案中，抗体包含如上述的重链及如上述的轻链。
有一种可进行的氨基酸取代为改变抗体中一个或多个半胱氨酸(其可以是化学反应性的)为另一种残基，如(但不限于)：丙氨酸或丝氨酸。在一项实施方案中，半胱氨酸取代发生于抗体的可变结构域的构架区中或恒定结构域中。另一项实施方案中，半胱氨酸在抗体的非典型区(non-canonical region)。另一种可进行的氨基酸取代为改变抗体中任何可能进行蛋白质水解的位置，特别是那些位于可变结构域的构架区中、抗体的恒定结构域中、或抗体的非典型区中的位置。半胱氨酸残基取代及去除蛋白质水解位置可降低抗体产物中出现任何不均质性的危险性，并因此提高其均质性。另一种可进行的氨基酸取代为通过改变可能形成去酰胺化位置的天冬酰胺-甘氨酸对中一个或两个残基，以消去成对的天冬酰胺-甘氨酸。此过程最好在抗体的构架区中、恒定结构域或非典型区中进行。
抗-CD40抗体对CD40的活化作用
本发明另一方面涉及的抗-CD40抗体为一种活化型抗体，也即CD40激动剂。活化型抗体可扩大或取代CD40L对CD40的效应。有些 实施方案中，活化型抗体基本上为CD40L的模拟物，且与CD40L竞争结合CD40。有些实施方案中，抗体不会与CD40L竞争结合CD40，但会扩大CD40L结合CD40的效应。有些实施方案中，于CD40L存在或不存在下，抗-CD40抗体均会活化CD40。
抗-CD40抗体于活体内抑制肿瘤生长
根据有些实施方案，本发明提供一种可于活体外抑制肿瘤细胞增生或于活体内抑制肿瘤生长的抗-CD40抗体。
有些实施方案中，抗体抑制肿瘤生长至少达50％、55％、60％、65％、70％、75％。有些实施方案中，抗体抑制肿瘤生长达75％。在一项实施方案中，在初次接受抗体处理后14天即可检测到抑制肿瘤生长的情形。其它实施方案中，在初次接受抗体处理后7天即可检测到抑制肿瘤生长的情形。有些实施方案中，由另一种抗肿瘤剂与抗-CD40抗体一起施用给动物。有些实施方案中，抗肿瘤剂可进一步抑制肿瘤生长。有些实施方案中，抗肿瘤剂为阿霉素或紫杉醇。有些实施方案中，共同施用抗肿瘤剂与抗-CD40抗体时，可在初次处理后22-24天期间，相对于未处理的动物抑制肿瘤生长达至少50％。
抗-CD40抗体诱发细胞凋亡
本发明另一方面提供一种可诱发CD40阳性细胞死亡的抗-CD40抗体。有些实施方案中，抗体可于活体内或于活体外引起CD40阳性细胞的细胞凋亡。
加强细胞表面分子的表达
有些实施方案中，抗-CD40抗体加强B细胞表面分子的表达，包括(但不限于)：ICAM、MHC-II、B7-2、CD71、CD23与CD83。有些实施方案中，在全血B-细胞表面分子增量调节分析法中，1μg/ml抗体可加强ICAM表达至少2倍，更优选为至少4倍。有些实施方案中，在全血B-细胞表面分子增量调节分析法中，1μg/ml抗体可加强MHC-II表达至少2倍，或更优选为至少3倍。有些实施方案中，在全血B-细胞表面分子增量调节分析法中，1μg/ml抗体可加强CD23表达至少2倍，或更优选为至少5倍。参见例如：实施例VII，表25。
有些实施方案中，抗-CD40抗体可加强树突细胞表面分子的表达，包括(但不限于)：MHC-II、ICAM、B7-2、CD83与B7-1。有些实施方案中，增量调节的范围类似B细胞所观察到的增量调节范围。参见例如：下文中表25与26。有些实施方案中，相对于如：B7-2与MHC-II等细胞表面分子的B细胞表达，抗体优先增量调节此类分子的树突细胞表面分子表达。参见例如：表27。
加强细胞的细胞因子分泌
有些实施方案中，抗体加强细胞分泌细胞因子，包括(但不限于)：IL-8、IL-12、IL-15、IL-18与IL-23。
有些实施方案中，抗体加强树突细胞与附着性单核细胞的细胞因子分泌。有些实施方案中，进一步由LPS、IFN-γ或IL-1β中一种或多种共同刺激下，加强产生细胞因子。本发明另一方面，抗体与LPS共同刺激作用可在树突细胞分析法中加强IL-12p70生产，EC50为约0.48μg/ml。有些实施方案中，抗体在树突细胞中加强IL-12p40生产，EC50为约0.21μg/ml。(参见例如：实施例VIII)。
有些实施方案中，抗体在同种异基因的T细胞/树突细胞分析法中加强IFN-γ分泌，其说明于实例VIII中。有些实施方案中，抗体在同种异型的T细胞/树突细胞分析法中加强IFN-γ分泌，其EC50约0.3μg/ml。有些实施方案中，抗体在同种异型的T细胞/树突细胞分析法中加强IFN-γ分泌，其EC50约0.2μg/ml。在一项实施方案中，抗体在同种异型的T细胞/树突细胞分析法中加强IFN-γ分泌，其EC50约0.03μg/ml。
生产抗体的方法及产生抗体的细胞系
免疫法
有些实施方案中，人类抗体是由其基因组中包含部份或所有人类免疫球蛋白重链与轻链座位的非人类动物接种CD40抗原后产生。优选实施方案中，该非人类动物为XenoMouseTM动物。
XenoMouseTM小鼠为经过基因工程处理的小鼠品种，其中包含人类免疫球蛋白重链与轻链座位的大型片段，且无法产生小鼠抗体。参见 例如：Green等人的NatureGenetics7：13-21(1994)及美国专利5,916,771、5,939,598、5,985,615、5,998,209、6,075,181、6,091,001、6,114,598、6,130,364、6,162,963及6,150,584。也参见WO91/10741、WO94/02602、WO96/34096、WO96/33735、WO98/16654、WO98/24893、WO98/50433、WO99/45031、WO99/53049、WO00/09560与WO00/037504。
本发明另一方面提供一种由非人类、非小鼠动物制造抗-CD40抗体的方法，其是对包含人类免疫球蛋白座位的该非人类转基因动物接种CD40抗原。此类动物可采用上述文献中所说明的方法制造。此类文献中揭示的方法可依美国专利5,994,619所述进行修正。优选实施方案中，非人类动物为大鼠、绵羊、猪、山羊、牛或马。
XenoMouseTM小鼠可产生类似成年人类的完整人类抗体，并产生抗原特异性人类抗体。有些实施方案中，XenoMouseTM小鼠经由引进人类重链座位与κ-轻链座位的百万碱基大小的种系构型的酵母人造染色体(YAC)片段而含有约80％人类抗体V基因库。参见Mendez等人的Nature Genetics15：146-156(1997)、Green与Jakobovits的J.Exp.Med.188：483-495(1998)、及WO98/24893，其内容已以引用的方式并入本文中。
有些实施方案中，包含人类免疫球蛋白基因的非人类动物为含有人类免疫球蛋白″迷你座位(minilocus)″的动物。迷你座位法中，通过包含来自Ig座位的单个基因来模仿外源性Ig座位。因此，在构建体中形成一个或多个VH基因、一个或多个DH基因、一个或多个JH基因、μ-恒定结构域、及第二恒定结构域(优选为γ-恒定结构域)，以嵌入动物体中。此方法说明于美国专利Nos.5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016、5,770,429、5,789,650、5,814,318、5,591,669、5,612,205、5,721,367、5,789,215、及5,643,763，其内容已以引用的方式并入本文中。
迷你座位法的优点为可快速产生含有Ig座位部份的构建体并引入动物体中。然而，迷你座位法的潜在缺点为可能没有足够的免疫球 蛋白多样性来支持B-细胞完全发育，因此抗体的产量可能较低。
本发明另一方面，本发明提供一种制造人源化抗-CD40抗体的方法。有些实施方案中，依下文中说明的方法，于可以产生抗体的条件下给非人类动物接种CD40抗原。自动物体中分离出产生抗体的细胞，与骨髓瘤融合，产生杂交瘤，并分离出编码目的抗-CD40抗体的重链与轻链的核酸。此类核酸随后采用本领域已知的技术和下文中说明的方法进行处理，并降低非人类序列的含量，即，使抗体人源化，以降低在人体中的免疫反应。
有些实施方案中，CD40抗原为分离的及/或纯化的CD40。优选实施方案中，CD40抗原为人类CD40。有些实施方案中，CD40抗原为CD40的片段。有些实施方案中，CD40片段为CD40的细胞外结构域。有些实施方案中，CD40片段包含CD40的至少一个表位。其它实施方案中，CD40抗原为在其表面上表达或过度表达CD40或其免疫原性片段的细胞。有些实施方案中，CD40抗原为CD40融合蛋白质。
动物的免疫法可采用本领域已知的任何方法进行。参见例如：Harlow与Lane的Antibodies：A Laboratory Manual，New York：Cold Spring Harbor Press，1990。非人类动物如：小鼠、大鼠、绵羊、猪、山羊、牛与马的免疫法是本领域已知的。参见例如：Harlow与Lane的如上述文献，及美国专利5,994,619。优选实施方案中，CD40抗原是与佐剂一起给药以刺激免疫反应。佐剂实例包括完全或不完全弗氏佐剂、RIBI(胞壁酰二肽)或ISCOM(免疫刺激性复合物)。此类佐剂可将多肽螯合于局部位点中，以保护多肽免于快速分散，或可包含会刺激宿主分泌巨噬细胞的趋化性因子及其它免疫系统的成分的物质。优选的，若施用多肽时，免疫方案将包括在数周内施用两次或多次多肽。
实例I说明抗-CD40单克隆抗体的制法。
抗体与产生抗体的细胞系的制法
动物接种CD40抗原后，可自动物体内得到抗体和/或产生抗体的细胞。有些实施方案中，利用抽血法或杀死动物后，得到含抗-CD40 抗体的血清。自动物体得到的血清即可使用，或者从血清中得到免疫球蛋白部分，或自血清中纯化得到抗-CD40抗体。本领域普通技术人员知道依此方法得到的血清或免疫球蛋白将为多克隆抗体。使用由血清制备的多克隆抗体的缺点为所得到的抗体量会受到限制，且多克隆抗体呈现不一致的性质。
有些实施方案中，产生抗体的永生化细胞系是由经免疫的动物体中分离出的细胞制备的。免疫接种后，杀死动物，取淋巴节和/或脾脏B细胞进行永生化处理。细胞永生化的方法包括(但不限于)利用癌基因转移细胞，用致癌病毒转染细胞，于可选拔永生化细胞的条件下培养，经过致癌性化合物及诱变化合物处理，与永生化细胞(例如：骨髓瘤细胞)融合，去除肿瘤抑制基因的活性。参见例如：Harlow与Lane的如上述文献。若使用骨髓瘤细胞进行融合时，该骨髓瘤细胞最好不分泌免疫球蛋白多肽(非分泌性细胞系)。使用CD40、其部份或表达CD40的细胞筛选永生化细胞。优选实施方案中，初次筛选是利用酶联免疫分析法(ELISA)或放射性免疫分析法进行。ELISA筛选法的一项实例提供于WO00/37504中，其内容已以引用的方式并入本文中。
选取产生抗-CD40抗体的细胞，例如：杂交瘤，进行克隆，再进一步筛选所需的特性，包括生长良好、抗体产量高、及具有所需抗体特性，其将说明于下文中。杂交瘤可于同基因动物体活体内，在缺乏免疫系统的动物中，例如：裸鼠，或于活体外的细胞培养物中进行扩增。杂交瘤的筛选、克隆及扩增方法是本领域普通技术人员熟知的。
优选实施方案中，经免疫接种的动物为可表达人类免疫球蛋白基因的非人类动物，其中脾脏B细胞与来自与该非人类动物相同物种的骨髓瘤细胞系融合。更优选实施方案中，该经免疫接种的动物为XENOMOUSETM动物且骨髓瘤细胞系为非分泌性小鼠骨髓瘤。甚至更优选实施方案中，骨髓瘤细胞系为P3-X63-AG8.653。参见例如：实施例I。
本发明另一方面提供可产生人类抗-CD40抗体的杂交瘤。优选实施方案中，该杂交瘤为如上述的小鼠杂交瘤。其它实施方案中，杂交瘤 于非人类、非小鼠物种如：大鼠、绵羊、猪、山羊、牛或马体内产生。另一项实施方案中，杂交瘤为人类杂交瘤。
制造抗体的核酸、载体、宿主细胞与重组法
核酸
本发明也包括编码抗-CD40抗体的核酸分子。有些实施方案中，编码抗-CD40免疫球蛋白的重链与轻链的核酸分子不同。其它实施方案中，编码抗-CD40免疫球蛋白的重链与轻链的核酸分子相同。
有些实施方案中，编码轻链中可变结构域的核酸分子包含人类A3/A19(DPK-15)、L5(DP5)或A27(DPK-22)Vκ基因序列或其所衍生的序列。有些实施方案中，核酸分子包含A3/A19Vκ基因及Jκ1、Jκ2或Jκ3基因的核苷酸序列或其所衍生的序列。有些实施方案中，核酸分子包含L5Vκ基因及Jκ4基因的核苷酸序列。有些实施方案中，核酸分子包含A27Vκ基因及Jκ3基因的核苷酸序列。
有些实施方案中，编码轻链的核酸分子所编码的氨基酸序列包含相对于种系氨基酸序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个突变。有些实施方案中，核酸分子包含的核苷酸序列所编码的VL氨基酸序列包含相对于种系序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个非保守性氨基酸取代和/或1、2或3个非保守性取代。可于CDR区、构架区、或恒定结构域进行取代。
有些实施方案中，编码轻链(VL)的可变结构域的核酸分子所编码的VL氨基酸序列相对于种系序列，包含一个或多个突变，此类突变与下列抗体之一的VL中的突变相同：3.1.1、3.1.1L-L4M-L83V、7.1.2、10.8.3、15.1.1、21.4.1、21.2.1、22.1.1、23.5.1、23.25.1、23.28.1、23.28.1L-C92A、23.29.1及24.2.1。有些实施方案中，该核酸分子编码至少3个相对于种系序列的氨基酸突变，所述氨基酸突变可发现于下列抗体之一的VL中：3.1.1、3.1.1L-L4M-L83V、7.1.2、10.8.3、15.1.1、21.4.1、21.2.1、22.1.1、23.5.1、23.25.1、23.28.1、23.28.1L-C92A、23.29.1与24.2.1。
有些实施方案中，核酸分子所包含的核苷酸序列编码下列单克隆 抗体的VL氨基酸序列，或其一部份：3.1.1(SEQ ID NO：4)、3.1.1L-L4M-L83V(SEQ ID NO：94)、7.1.2(SEQID NO：12)、10.8.3(SEQ ID NO：20)、15.1.1(SEQ ID NO：28)、21.2.1(SEQ ID NO：36)、2.1.4.1(SEQ ID NO：44)、22.1.1(SEQ ID NO：52)、23.5.1(SEQ ID NO：60)、23.28.1(SEQID NO：68)、23.28.1L-C92A(SEQ ID NO：100)、23.29.1(SEQ ID NO：76)或24.2.1(SEQ IDNO：84)。有些实施方案中，该部份至少包含CDR3区。有些实施方案中，核酸编码该抗体的轻链CDRs的氨基酸序列。有些实施方案中，该部份为包含CDR1-CDR3的连续部份。
有些实施方案中，核酸分子所包含的核苷酸序列编码SEQ ID NOS：4、12、20、28、36、44、52、60、68、76、84、94或100氨基酸序列，或缺乏信号序列的该序列。有些优选实施方案中，核酸分子包含核苷酸序列SEQ ID NOS：3、11、19、27、35、43、51、59、67、75、83、93或99，或其一部份，该序列可选地缺乏信号序列。
有些实施方案中，该部份编码VL区。有些实施方案中，该部份至少编码CDR2区。有些实施方案中，核酸编码该抗体的轻链CDRs的氨基酸序列。有些实施方案中，该部份编码CDR1-CDR3的连续区。
有些实施方案中，核酸分子所编码的VL氨基酸序列与抗体3.1.1、3.1.1L-L4M-L83V、7.1.2、10.8.3、15.1.1、21.4.1、21.2.1、22.1.1、23.5.1、23.25.1、23.28.1、23.28.1L-C92A、23.29.1或24.2.1中任一种的VL氨基酸序列，或与SEQ ID NOS：4、12、20、28、36、44、52、60、68、76、84、94或100中任一种的VL氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性。本发明的核酸分子所包括的核酸在高度严格条件(如上述)下与编码SEQ ID NOS：4、12、20、28、36、44、52、60、68、76、84、94或100的氨基酸序列的核酸杂交，或与具有SEQ ID NOS：3、11、19、27、35、43、51、59、67、75、83、93或99的核酸序列杂交。
另一项实施方案中，核酸编码抗体3.1.1、3.1.1L-L4M-L83V、7.1.2、10.8.3、15.1.1、21.4.1、21.2.1、22.1.1、23.5.1、23.25.1、 23.28.1、23.28.1L-C92A、23.29.1、23.29.1L-R174K或24.2.1的全长轻链，或编码包含SEQ ID NOS：8、16、24、32、40、48、56、64、72、80、88、94、100或102的氨基酸序列的轻链，或编码包含如本文所述突变的轻链。此外，核酸可包含核苷酸序列SEQ ID NOS：7、15、23、31、39、47、55、63、71、79或87，或编码包含如本文所述突变的轻链的核酸分子。
另一项优选实施方案中，核酸分子所编码的重链(VH)的可变结构域包含人类3-30+、4-59、1-02、4.35或3-30.3VH基因序列或其衍生的序列。多种实施方案中，核酸分子包含人类3-30+VH基因、D4(DIR3)基因及人类JH6基因；人类3-30+VH基因、人类D1-26(DIR5)基因及人类JH6基因；人类4.35VH基因、人类DIR3基因、及人类JH6基因；人类4-59VH基因、人类D4-23基因及人类JH4基因；人类1-02VH基因、人类DLR1基因与人类JH4基因；人类3-30+VH基因、人类D6-19(DIR3)基因及人类JH4基因；人类3-30+VH基因、人类D1-1基因及人类JH6基因；人类3-30+VH基因、人类D4-17基因及人类JH6基因；人类3-30.3VH基因、人类D4-17基因及人类JH6基因；人类4-59VH基因、人类D4-17(DIR1)基因及人类JH5基因，或衍生自此类人类基因的序列。
有些实施方案中，核酸分子所编码的氨基酸序列相对于人类V、D或J基因的种系氨基酸序列，包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个突变。有些实施方案中，该突变出现在VH区中。有些实施方案中，该突变出现在CDR区中。
有些实施方案中，相对于种系序列，核酸分子编码一个或多个氨基酸突变，此类突变与出现在单克隆抗体3.1.1、3.1.1H-A78T、3.1.1H-A78T-V88A-V97A、7.1.2、10.8.3、15.1.1、21.4.1、21.2.1、22.1.1、22.1.1H-C109A、23.5.1、23.25.1、23.28.1、23.28.1H-D16E、23.29.1或24.2.1的VH中的氨基酸突变相同。有些实施方案中，相对于种系序列，核酸编码至少3个氨基酸突变，此类突变与出现在上列单克隆抗体之一中的至少3个氨基酸突变相同。
有些实施方案中，核酸分子所包含的核苷酸序列编码抗体3.1.1 (SEQ ID NO：2)、3.1.1H-A78T(SEQ ID NO：90)、3.1.1H-A78T-V88A-V97A(SEQ ID NO：92)、7.1.2(SEQ IDNO：10)、10.8.3(SEQ ID NO：18)、15.1.1(SEQ ID NO：26)、21.2.1(SEQ ID NO：34)、21.4.1(SEQ ID NO：42)、22.1.1(SEQ ID NO：50)、22.1.1H-C109A(SEQ ID NO：96)、23.5.1(SEQ IDNO：58)、23.28.1(SEQ ID NO：66)、23.28.1H-D16E(SEQ ID NO：98)、23.29.1(SEQ ID NO：74)或24.2.1(SEQ ID NO：82)的至少一部份VH氨基酸序列，或具有保守性氨基酸取代和/或共3个或更少个非保守性氨基酸取代的该等序列。不同的实施方案中，序列编码一个或多个CDR区，优选为CDR3区，所有3个CDR区，包括CDR1-CDR3的连续部份，或整个VH区，其中含或不含信号序列。
有些实施方案中，核酸分子所包含的核苷酸序列编码SEQ ID NOS：2、10、18、26、34、42、50、58、66、74、82、90、92、96或98的氨基酸序列，或缺乏信号序列的该序列。优选实施方案中，核酸分子包含核苷酸序列SEQ ID NO：1、9、17、25、33、41、49、57、65、73、81、89、91、95或97，或缺乏信号序列的该序列的至少一部份。有些实施方案中，该部份编码VH区(含或不含信号序列)、CDR3区、所有3个CDR区、或包括CDR1-CDR3的连续区域。
有些实施方案中，核酸分子所编码的VH氨基酸序列与图1A-1C或2A-2C所示的VH氨基酸序列或与SEQ ID NOS：2、10、18、26、34、42、50、58、66、74、82、90、92、96或98中任一种的VH氨基酸序列呈至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性。本发明的核酸分子所包括的核酸在高度严格条件(如上述)下与编码SEQ ID NOS：2、10、18、26、34、42、50、58、66、74、82、90、92、96、或98的氨基酸序列的核酸序列杂交，或与核酸序列SEQ IDNOS：1、9、17、25、33、41、49、57、65、73、81、89、91、95、或97杂交。本发明的核酸分子包括可于高度严格条件(如上述)下与编码前述VH的核酸序列杂交的核酸。
另一项实施方案中，核酸编码抗体3.1.1、3.1.1H-A78T、 3.1.1H-A78T-V88A-V97A、7.1.2、10.8.3、15.1.1、21.4.1、21.2.1、22.1.1、22.1.1H-C109A、23.5.1、23.25.1、23.28.1、23.28.1H-D16E、23.29.1与24.2.1的全长重链，或具有氨基酸序列SEQ ID NOS：6、14、22、30、38、46、54、62、70、78或86的重链，或包含如本文所讨论的突变的重链。此外，核酸可包含核苷酸序列SEQ ID NOS：5、13、21、29、37、45、53、61、69、77、85或89，或编码包含如本文所讨论的突变的重链的核酸分子。
编码抗-CD40抗体或其一部份的重链或整个轻链的核酸分子可自任何可产生此类抗体的来源分离。不同的实施方案中，核酸分子是自已接种CD40免疫处理的动物的B细胞分离出的，或自衍生自此类B细胞的可表达抗-CD40抗体的永生化细胞中分离出的。分离编码抗体的mRNA的方法是本领域已知的。参见例如：Sambrook等人的文献。mRNA可用于制造cDNA，用于聚合酶链式反应(PCR)或抗体基因的cDNA克隆法。优选实施方案中，核酸分子分离自杂交瘤，该杂交瘤含有来自非人类转基因动物体中产生人类免疫球蛋白的细胞作为其融合对象之一。甚至更优选的实施方案中，产生人类免疫球蛋白的细胞是自XenoMouseTM动物中分离出的。另一项实施方案中，产生人类免疫球蛋白的细胞是来自如上述的非人类、非小鼠的转基因动物。另一项实施方案中，核酸分离自非人类、非转基因动物。分离自非人类、非转基因动物的核酸分子可用于例如人源化抗体。
有些实施方案中，编码本发明抗-CD40抗体的重链的核酸可包含编码本发明VH结构域的核苷酸序列，该核苷酸序列按读码区与任何来源的编码重链恒定结构域的核苷酸序列连接。同样地，编码本发明抗-CD40抗体的轻链的核酸分子可包含编码本发明VL结构域的核苷酸序列，该核苷酸序列按读码区与任何来源的编码轻链恒定结构域的核苷酸序列连接。
本发明另一方面，编码重链(VH)与轻链(VL)的可变结构域的核酸分子″转化″成全长抗体基因。在一项实施方案中，编码VH或VL结构域的核酸分子经由插入已分别编码重链恒定或轻链恒定结构域的表达载 体中而转化成全长抗体基因，因此VH节段与载体内的CH节段操纵性连接，且VL节段与载体内的CL节段操纵性连接。另一项实施方案中，编码VH和/或VL结构域的核酸分子经由标准分子生物技术，连接编码VH和/或VL结构域的核酸分子与编码CH和/或CL结构域的核酸分子而转化成全长抗体基因。人类重链与轻链免疫球蛋白恒定结构域基因的核酸序列是本领域已知的。参见例如：Kabat等人的Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH出版，No.91-3242，1991。编码全长重链和/或轻链的核酸分子随后可由其所引入的细胞表达，并分离出抗-CD40抗体。
核酸分子可用于重组表达大量抗-CD40抗体。核酸分子也可用于产生嵌合抗体、双特异性抗体、单链抗体、免疫粘附素、双重抗体、突变抗体及抗体衍生物，其将说明于下文中。若核酸分子衍生自非人类、非转基因动物时，该核酸分子可用于进行抗体人源化处理，其也说明于下文中。
另一项实施方案中，使用本发明核酸分子作为特异性抗体序列的探针或PCR引物。例如：核酸可用作诊断法的探针或作为扩增可使用的DNA区的PCR引物，以用于分离其它编码抗-CD40抗体的可变结构域的核酸分子。有些实施方案中，核酸分子为寡核苷酸。有些实施方案中，寡核苷酸来自目标抗体的重链与轻链的高度可变区。有些实施方案中，寡核苷酸编码抗体3.1.1、3.1.1H-A78T、3.1.1H-A78T-V88A-V97A、3.1.1L-L4M-L83V、7.1.2、10.8.3、15.1.1、21.4.1、21.2.1、22.1.1、22.1.1H-C109A、23.5.1、23.25.1、23.28.1、23.28.1H-D16E、23.28.1L-C92A、23.29.1、或24.2.1中一个或多个CDRs的所有或一部份。
载体
本发明提供的载体包含可编码本发明抗-CD40抗体的重链或其抗原结合部分的核酸分子。本发明也提供包含可编码此类抗体的轻链或其抗原结合部分的核酸分子的载体。本发明还提供包含编码融合蛋白质、修饰抗体、抗体片段及其探针的核酸分子的载体。
有些实施方案中，本发明抗-CD40抗体或其抗原结合部分的表达是通过编码部份或全长轻链与重链的DNAs(其制法已说明于上文中)插入表达载体中，从而该基因与必要的表达控制序列(如：转录与翻译控制序列)操纵性连接来实现的。表达载体包括：质粒、反转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、植物病毒如：花椰菜花叶病毒、烟草花叶病毒、粘粒、YACs、EBV衍生的基因副体，等等。抗体基因连接至载体中，使载体内的转录与翻译控制序列进行其调节抗体基因的转录与翻译的功能。所选用的表达载体与表达控制序列应与所使用的表达宿主细胞兼容。抗体轻链基因与抗体重链基因可插入分开的载体中。优选实施方案中，此两种基因均插入同一个表达载体中。抗体基因利用标准方法插入表达载体中(例如：于抗体基因片段与载体的互补限制性酶切位点上连接，或若没有限制性酶切位点时，则以平末端连接)。
方便的载体可编码功能完整的人类CH或CL免疫球蛋白序列，其经过处理而具有适当的限制性酶切位点，因此任何VH或VL序列很容易插入及表达，此点已如上述说明。此类载体中，通常在所插入J区的剪接供体位置与人类C结构域前的剪接受体位置之间进行剪接，且也在人类CH外显子内的剪接区进行。聚腺苷化反应与转录终止反应是在编码区下游的天然染色体位置进行。重组表达载体也可编码信号肽，促进宿主细胞分泌抗体链。可克隆抗体链基因至载体中，使信号肽按读码框与免疫球蛋白链的氨基末端连接。信号肽可为免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来自非免疫球蛋白蛋白质的信号肽)。
除了抗体链基因外，本发明重组表达载体还可带有可控制抗体链基因在宿主细胞中表达的调节序列。本领域技术人员应了解，表达载体的设计，包括调节序列的选择可根据所选用的用来转化的宿主细胞、所需蛋白质的表达程度等等因素而定。哺乳动物宿主细胞表达的优选调节序列包括可于哺乳动物细胞中指导蛋白质高度表达的病毒元件，如衍生自下列病毒的启动子和/或增强子：反转录病毒LTRs、巨细胞病毒(CMV)(如：CMV启动子/增强子)。猿猴病毒40(SV40)(如：SV40启动子和/或增强子)、腺病毒(例如：腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))， 多瘤病毒与哺乳动物强启动子，如：天然免疫球蛋白与肌动蛋白启动子。涉及病毒调节元件及其序列的进一步说明可参见例如：美国专利No.5,168,062、美国专利No.4,510,245及美国专利No.4,968,615。于植物中表达抗体的方法包括启动子与载体的说明，及植物的转化均是本领域已知。参见例如：美国专利6,517,529，其内容已以引用的方式并入本文中。于细菌细胞或真菌细胞(例如：酵母细胞)中表达多肽的方法也是本领域已知的方法。
除了抗体链基因与调节序列外，本发明的重组表达载体可包含其它序列，如：调节载体在宿主细胞中复制的序列(例如：复制起点)及选择性标记基因。选择性标记基因有助于选择已引进载体的宿主细胞(参见美国专利Nos.4,399,216、4,634,665与5,179,017)。例如：选择性标记基因通常在已引进该载体的宿主细胞上赋与药物抗性，如：G418、潮霉素或氨甲蝶呤。优选的选择性标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于dhfr-宿主细胞中氨甲蝶呤筛选/扩增)，neo基因(用于G418选择)，及谷氨酸合成酶基因。
非杂交瘤宿主细胞及重组产生蛋白质的方法
编码抗-CD40抗体的核酸分子及包含此类核酸分子的载体可用于转染适宜的哺乳动物、植物、细菌或酵母宿主细胞。转化法可为任何已知可引进多核苷酸至宿主细胞中的方法。将异源多核苷酸引进至哺乳动物细胞中的方法是本领域已知的，且包括葡聚糖介导的转染法、磷酸钙沉淀法、polybrene介导的转染法、原生质体融合法、电穿孔法、于脂质体中包囊多核苷酸、及直接显微注射DNA至细胞核中。此外，可利用病毒载体将核酸分子引进哺乳动物细胞中。细胞转化法是本领域已知。参见例如：美国专利Nos.4,399,216、4,912,040、4,740,461、及4,959,455(该专利的内容已以引用的方式并入本文中)。植物细胞转化法是本领域已知，包括例如：农杆菌介导的转化法、生物弹果转化法(biolistictransformation)、直接注射法、电穿孔法与病毒转化法。细胞与酵母细胞的转化法是本领域已知。
可用作表达宿主的哺乳动物细胞系是本领域已知，且包括来自美 国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection(ATCC))的多种永生化细胞系。其中包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO、SP2细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人类肝细胞瘤细胞(例如：Hep G2)、A549细胞、及多种其它细胞系。特别优选的细胞系是经测定为高度表达的细胞系。其它可使用的细胞系为昆虫细胞系，如：Sf9细胞。当将编码重组表达载体的抗体基因引进哺乳动物宿主细胞中时，培养宿主细胞一段充分时间，使抗体足以在宿主细胞中表达，以产生抗体，或更优选者，分泌抗体至宿主细胞所生长的培养基中。采用标准蛋白质纯化法，自培养基中回收抗体。植物宿主细胞包括例如：烟草(Nicotiana)、鼠耳芥(Arabidopsis)、浮萍(duckweed)、玉米、小麦、马铃薯，等等。细菌性宿主细胞包括大肠杆菌(E.coli)与链霉菌属(Streptomyces species)。酵母宿主细胞包括栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)与巴斯德毕赤酵母(Pichi a pastoris)。
此外，可采用许多已知技术加强生产细胞系表达本发明抗体(或其所衍生的其它部份)。例如：谷氨酰胺合成酶基因表达系统(GS系统)为常用于在某些条件下加强表达的方法。涉及GS系统的所有或部份内容已讨论于欧洲专利Nos.0216846、0256055、及0323997中，及欧洲专利申请No.89303964.4中。
由不同细胞系或转基因动物表达的抗体似乎具有彼此不同的糖基化反应。然而，所有由本文所提供的核酸分子编码的抗体或包含本文所提供的氨基酸序列的抗体，均成为本发明的一部份，而不管其糖基化反应如何。
转基因动物与植物
本发明抗-CD40抗体也可由转基因法产生，即，经转基因法将所需的免疫球蛋白重链与轻链序列转入哺乳动物或植物体中，并产生可回收形式的抗体。使用哺乳动物进行转基因生产时，抗-CD40抗体可由山羊、奶牛或其它哺乳动物的乳汁中产生及回收。参见例如：美国专利Nos.5,827,690、5,756,687、5,750,172、及5,741,957。有些 实施方案中，包含人类免疫球蛋白座位的非人类转基因动物接受如上述CD40或其免疫原性部份免疫接种。于植物中制造抗体的方法说明于例如：美国专利6,046,037与US5,959,177中。
有些实施方案中，非人类转基因动物或植物的制法为采用标准转基因技术，将编码本发明抗-CD40抗体的一种或多种核酸分子引进动物或植物体内。参见如上述的Hogan与美国专利6,417,429的文献。用于制造转基因动物的转基因细胞可为胚胎干细胞或体细胞。转基因的非人类生物体可为嵌合性、非嵌合性、杂合子及非嵌合性纯合子。参见例如：Hogan等人的Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual第2版，Cold SpringHarbor Press(1999)：Jackson等人的Mouse Genetics and Transgenics：A Practical Approach，Oxford University Press(2000)；及Pinkert的 Transgenic Animal Technology：A Laboratory Handbook，AcademicPress(1999).有些实施方案中，转基因的非人类动物被编码所需重链和/或轻链的导向构建体定向打断(disruption)与置换。优选实施方案中，转基因动物包含及表达编码特异性结合CD40(优选人类CD40)的重链与轻链的核酸分子。有些实施方案中，转基因动物包含编码经修饰的抗体(如：单链抗体、嵌合抗体或人源化抗体)的核酸分子。抗-CD40抗体可于任何转基因动物体内制造。优选实施方案中，非人类动物为小鼠、大鼠、绵羊、猪、山羊、牛或马。非人类转基因动物以血液、乳汁、尿液、唾液、眼泪、黏液及其它体液表达所编码的多肽。
噬菌体展示文库
本发明提供一种制造抗-CD40抗体或其抗原结合部分的方法，其包括的步骤为于噬菌体中合成人类抗体文库，使用CD40或其一部份筛选该文库，分离与CD40结合的噬菌体，由该噬菌体得到抗体。例如：一种制备供噬菌体展示技术用的抗体文库的方法包括的步骤为使用CD40或其抗原性部份对包含人类免疫球蛋白座位的非人类动物进行免疫接种，产生免疫反应，自已免疫的动物体中提取产生抗体的细胞，自所提取的细胞中分离出RNA，此RNA经反转录产生cDNA，使用引物 扩增cDNA，并将cDNA插入噬菌体展示载体中，从而使抗体表达在噬菌体上。依此方式即可得到本发明的重组抗-CD40抗体。
本发明的重组抗-CD40人类抗体可通过筛选重组组合抗体文库而分离出。该文库最好为scFv噬菌体展示文库，其是使用由B细胞中所分离的mRNA制成的人类VL与VHcDNAs产生的。制备及筛选此类文库的方法是本领域已知。市面上有供应用于产生噬菌体展示文库的试剂盒(例如：Pharmacia Recombinant Phage Antibody System，产品编号27-9400-01；及Stratagene SurfZAPTM噬菌体展示试剂盒，产品编号240612)。也可采用其它方法与试剂来产生及筛选抗体展示文库(参见例如：美国专利No.5,223,409；PCT公告案Nos.WO92/18619、WO91/17271、WO92/20791、WO92/15679、WO93/01288、WO92/01047、WO92/09690；Fuchs等人的Bio/Technology9：1370-1372(1991)；Hay等人的Hum.Antibod.Hybridomas3：81-85(1992)；Huse等人的Science246：1275-1281(1989)；McCafferty等人的Nature348：552-554(1990)；Griffiths等人的EMBOJ.12：725-734(1993)；Hawkins等人的J.Mol.Biol.226：889-896(1992)；Clackson等人的Nature352：624-628(1991)；Gram等人的Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：3576-3580(1992)；Garrad等人的Bio/Technology9：1373-1377(1991)；Hoogenboom等人的Nuc.Acid Res.19：4133-4137(1991)；和Barbas等人的Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：7978-7982(1991)。
一项实施方案中，要分离具有所需特性的人类抗-CD40抗体时，先使用本文所说明的人类抗-CD40抗体，采用PCT公告案No.WO93/06213说明的表位印记方法(epitopeimprinting method)，来选择对CD40具有相似结合活性的人类重链与轻链序列。此方法所使用的抗体文库最好为依PCT公告案No.WO92/01047、McCafferty等人的Nature348：552-554(1990)；及Griffiths等人的EMBO J.12：725-734(1993)所述的方法制备及筛选的scFv文库。scFv抗体文库最好使用人类CD40作为抗原进行筛选。
一旦选出初步的人类VL与VH结构域后，即进行″混合与配对″实验，其中根据CD40结合性筛选初步选择的VL与VH节段的不同配对，以选择优选的VL/VH组合。此外，为了进一步改善抗体的品质，优选的VL/VH配对的VL与VH节段可进行随机突变，最好在VL和/或VH的CDR3区中进行，其过程类似于在天然免疫反应期间，负责抗体的亲和性成熟作用的活体内体细胞突变过程。此活体外亲和性成熟作用可使用分别与VHCDR3或VLCDR3互补的PCR引物扩增VH与VL结构域来完成，该引物的某些位置已用4种核苷酸碱基的随机混合物进行了″掺杂(spiked)″，因此所得的PCR产物所编码的VH与VL节段中已将随机突变引进VH和/或VLCDR3区中。此类随机突变VH与VL节段可再度筛选其与CD40的结合性。
自重组免疫球蛋白展示文库中筛选及分离本发明抗-CD40抗体后，可自展示群(例如：来自噬菌体基因组)中回收编码所选抗体的核酸，并采用标准重组DNA技术亚克隆至其它表达载体中。若需要时，核酸可再经处理形成下文将说明的本发明其它抗体形式。经筛选组合文库而分离出的重组人类抗体要进行表达时，克隆编码抗体的DNA至重组表达载体中，并引入如上述哺乳动物宿主细胞中。
分类转型
本发明另一方面提供一种转化抗-CD40抗体之类型或亚型成为另一种类型或亚型的方法。有些实施方案中，编码VL或VH但不包括任何编码CL或CH的核酸序列的核酸分子是采用本领域已知的方法分离。该核酸分子随后可与来自所需免疫球蛋白类型或亚型的编码CL或CH的核酸序列操纵性连接。此过程可使用如上述包含CL或CH链的载体或核酸分子完成。例如：原来为IgM的抗-CD40抗体可转型成IgG。此外，分类转型法可用于转化一种IgG亚型成为另一种亚型，例如：由IgG1形成IgG2。另一种产生含有所需同种型的本发明抗体的方法包括的步骤为分离编码抗-CD40抗体的重链的核酸及编码抗-CD40抗体的轻链的核酸，分离编码VH区的序列，连接VH序列与编码所需同种型的重链恒定结构域的序列，于细胞中表达轻链基因与重链构建体，及收集含 有所需同种型的抗-CD40抗体。
去免疫性的(deimmunized)抗体
制造降低免疫原性的抗体的另一种方法为去除抗体的免疫性。本发明另一方面，可使用说明于例如：PCT公告案Nos.WO98/52976与WO00/34317(其内容已以引用的方式完全并入本文中)的技术去除抗体的免疫性。
突变抗体
另一项实施方案中，可使用核酸分子、载体及宿主细胞制造突变抗-CD40抗体。该抗体可于重链和/或轻链的可变结构域中突变，例如：改变抗体的结合性。例如：可在一个或多个CDR区进行突变，以提高或降低抗体对CD40的KD，提高或降低Koff，或改变抗体的结合特异性。定点诱变法的技术是本领域已知。参见例如：Sambrook等人与Ausubel等人的上述文献。优选实施方案中，是在抗-CD40抗体的可变结构域中相对于种系待改变的氨基酸残基上进行突变。另一项实施方案中，是在单克隆抗体3.1.1、3.1.1H-A78T、3.1.1H-A78T-V88A-V97A、3.1.1L-L4M-L83V、7.1.2、10.8.3、15.1.1、21.4.1、21.2.1、22.1.1、22.1.1H-C109A、23.5.1、23.25.1、23.28.1、23.28.1H-D16E、23.28.1L-C92A、23.29.1、23.29.1L-R174K与24.2.1的可变结构域的CDR区或构架区中，或在恒定结构域中，相对于种系待发生改变的氨基酸残基上进行一个或多个突变。另一项实施方案中，是在选自SEQ ID NOS：4、12、20、28、36、44、52、60、68、76、84、94、100、102、2、10、18、26、34、42、50、58、66、74、82、90、92、96、98、100或102的氨基酸序列，或其核酸序列为SEQ ID NOS：3、11、19、27、35、43、51、59、67、75、83、93、99、101、1、9、17、25、33、41、49、57、65、73、81、89、91、95、97、99或101的可变结构域的CDR区或构架区中，相对于种系待改变的氨基酸残基上进行一个或多个突变。
一项实施方案中，构架区经过突变，以致所形成的构架区具有相应于种系基因的氨基酸序列。突变可在构架区或恒定结构域中进行， 以延长抗-CD40抗体的半衰期。参见例如：PCT公告案No.WO00/09560，其内容已以引用的方式并入本文中。也可在构架区或恒定结构域进行突变，以改变抗体的免疫原性，提供与另一个分子进行共价或非共价结合的位置，或改变如：补体固定性、FcR结合性及ADCC等性质。根据本发明，单一抗体可于构架区、恒定结构域及可变区中任一处或多处进行突变。
有些实施方案中，相对于突变前的抗-CD40抗体，突变的抗-CD40抗体的VH或VL结构域有1至18个(包括此两数之间的任何数目)氨基酸突变。上述任一个突变均可能出现在一个或多个CDR区中。此外，任何突变均可能为保守性氨基酸取代。有些实施方案中，恒定结构域中的氨基酸变化不超过5、4、3、2或1个。
经修饰的抗体
另一项实施方案中，所制造的融合抗体或免疫粘附素可包含本发明抗-CD40抗体的全长或一部份，并与另一种多肽连接。优选实施方案中，只有抗-CD40抗体的可变结构域与多肽连接。另一项优选实施方案中，抗-CD40抗体的VH结构域与第一多肽连接，而抗-CD40抗体的VL结构域则与第二多肽连接，其中第二多肽与第一多肽组合的方式使得VH与VL结构域得以相互作用，形成抗体结合位置。另一项优选实施方案中，VH结构域与VL结构域相隔一个连接体，以使VH与VL结构域得以相互作用(参见下文中″单链抗体″的说明)。随后使VH-连接体-VL抗体连接目的多肽。此融合抗体适用于使多肽导向至CD40-表达细胞或组织。该多肽可为治疗剂，如：毒素、生长因子或其它调节性蛋白质，或可为诊断剂，如：容易目视检查的酶，如：辣根过氧化酶。此外，可形成这样的融合抗体，其中两个(或更多个)单链抗体互相连接。其适用于在单一多肽链上制造出双价或多价抗体或用于制造双特异性抗体。
制造单链抗体时，使(scFv)VH-与VL-编码DNA片段与编码弹性连接体的另一个片段(例如：编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3的片段)操纵性连接，因此VH与VL序列可呈连续性单链蛋白质表达，其中VL与VH结 构域是利用该弹性连接体连接的。参见例如：Bird等人的Science242：423-426(1988)；Huston等人的Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5879-5883(1988)；McCafferty等人的Nature348：552-554(1990)。若使用单一VH与VL时，单链抗体可为单价，若使用两条VH与VL时，单链抗体可为双价，若使用两条以上的VH与VL时，单链抗体则为多价。可产生特异性结合CD40与另一个分子的双特异性或多价抗体。
其它实施方案中，可使用编码抗-CD40抗体的核酸分子制备其它经修饰的抗体。例如：″κ-体(kappa bodies)″(I11等人的ProteinEng.10：949-57(1997))，″迷你体(Minibodies)″(Martin等人的EMBO J.13：5303-9(1994))，″双重抗体(diabodies)″(Holliger等人的Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448(1993))，或″Janusins″(Traunecker等人的EMBO J.10：3655-3659(1991)及Traunecker等人的Int.J.Cancer(Suppl.)7：51-52(1992))均可使用标准生物技术，依本说明书的教导制备。
双特异性抗体或抗原结合性片段可依多种方法制造，包括杂交瘤融合法或Fab′片段连接法。参见例如：Songsivilai与Lachmann的Clin.Exp.Immunol.79：315-321(1990)，Kostelny等人的J.Immunol.148：1547-1553(1992)。此外，双特异性抗体可形成″双重抗体″或″Janusins″。有些实施方案中，双特异性抗体结合CD40的两个不同表位。有些实施方案中，双特异性抗体具有来自单克隆抗体3.1.1、3.1.1H-A78T、3.1.1H-A78T-V88A-V97A、3.1.1L-L4M-L83V、7.1.2、10.8.3、15.1.1、21.4.1、21.2.1、22.1.1、22.1.1H-C109A、23.5.1、23.25.1、23.28.1、23.28.1H-D16E、23.28.1L-C92A、23.29.1、23.29.1L-R174K与24.2.1的第一条重链及第一条轻链，及其它抗体重链与轻链。有些实施方案中，所述其它轻链与重链也可来自上述单克隆抗体，但不同于第一条重链与轻链。
有些实施方案中，上述经修饰的抗体是使用来自本文所提供的人类抗CD40单克隆抗体、该单克隆抗体的氨基酸序列或由编码该单克隆 抗体的核酸序列所编码的重链或轻链中一个或多个可变结构域或CDR区制备。
经衍生化及标记的抗体
本发明抗-CD40抗体或其抗原结合部分可经过衍生化或连接至另一种分子(例如：另一种肽或蛋白质)。通常，抗体或其一部份经过衍生化后，使得CD40结合性不受衍生化反应或标记的负面影响。因此，本发明抗体及抗体部份应包括本文所说明的人类抗-CD40抗体的完整型与修饰型。例如：本发明抗体及抗体部份可功能性连接(利用化学偶联法、基因融合法、非共价连接法或其它方法)至一个或多个其它分子实体，如：另一种抗体(例如：双特异性抗体或双重抗体)、检测剂、细胞毒性剂、药剂、和/或可介导抗体或抗体部份与另一种分子(如：链霉抗生物素核心区或聚组氨酸标签)结合的蛋白质或肽。
有一种经衍生化的抗体是由两个或多个抗体(同一种或不同种抗体，例如：形成双特异性抗体)交联产生的。适宜的交联物包括那些具有两个由适当间隔物分隔的独立反应基的杂双功能性交联物(例如：间-马来酰亚氨基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚氨酯)或同双功能性交联物(例如：二琥珀酰亚氨基辛二酸酯)。此类连接体可自Pierce Chemical Company(Rockford，I11.)取得。
另一种经衍生化的抗体为有标记的抗体。适用于衍生化本发明抗体或抗原结合部分的检测剂包括荧光化合物，其包括荧光素、荧光素异硫氰酸、罗丹明、5-二甲氨-1-萘磺酰氯、藻红蛋白、镧系无机发光材料，等等。抗体可使用适用于检测的酶标记，如：辣根过氧化酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶，等等。当使用可检测的酶标记抗体时，可添加其它可用于产生供识别的反应产物的酶进行检测。例如：当含有辣根过氧化酶制剂时，添加过氧化氢及二氨基联苯胺则产生可检测的有色反应产物。也可使用生物素标记抗体，并间接测定抗生物素蛋白或链霉抗生物素的结合性来检测。也可使用预先测定的多肽表位标记抗体，使用第二报导子(例如：亮氨酸拉链型配对序列、第二抗体的结合位置、金属结合性结构域、表位标签) 识别该多肽表位。有些实施方案中，标记物是利用各种不同长度的间隔臂连接，以降低可能的空间位阻。
也可使用放射性标记的氨基酸标记抗-CD40抗体。放射性标记物可用于诊断及医疗用途。例如：放射性标记物可用于利用X-射线或其它诊断技术检测表达CD40的肿瘤。此外，放射性标记物可用于医疗上，作为癌细胞或肿瘤的毒素。多肽的标记物实例包括(但不限于)下列放射性同位素或放射性核素：3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、 131I。
抗-CD40抗体也可经化学基团衍生化，如：聚乙二醇(PEG)、甲基或乙基、或碳水化合物基团。此类基团适用于改善抗体的生物特性，例如：延长血清半衰期或提高组织结合性。
药物组合物与试剂盒
本发明也涉及一种组合物，其包含人类抗-CD40激动剂抗体，供治疗需要刺激免疫力的个体。此类组合物适用于为哺乳动物(包括人类)治疗、预防、降低感染的频率或严重性，包括病毒与细菌感染，治疗过度增生性病变，包括癌症与癌症前的病症，治疗遗传性免疫缺乏病症，如：过多-IgM综合征，及治疗原发性或综合性免疫缺乏病症，包括出现嗜中性白血球减少症。可使用激动剂抗-CD40抗体疗法治疗的个体包括任何需要加强免疫力的个体，包括(但不限于)免疫力受抑制(例如：因化疗法所致)的老年人及个人。
可使用本发明激动剂抗-CD40抗体治疗的过度增生性病变可涉及任何组织或器官，包括(但不限于)脑、肺、鳞状细胞、膀胱、胃、胰、乳房、头、颈、肝、肾、卵巢、前列腺、结肠直肠、食道、妇科、咽喉、或甲状腺等癌症，黑色素瘤、淋巴瘤、白血病或多发性骨髓瘤。特别的，本发明的人类激动剂抗-CD40抗体适用于治疗乳房、前列腺、结肠与肺的癌瘤。
治疗法涉及施用一种或多种本发明激动剂抗-CD40单克隆抗体或其抗原结合性片段，可单独投药或并用药物可接受的载体投药。本文所使用″药物可接受的载体″是指任何及所有溶剂、分散介质、包衣、 抗细菌剂与抗真菌剂、等渗剂与延迟吸收剂等等生理上可兼容的物质。药物可接受的载体的一些实例为水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇，等等，及其组合。在许多情况下，组合物中最好包含等渗剂，例如：糖类、多元醇(如：甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠。药物上可接受的物质的其它实例为湿化剂或少量辅助物质，如：湿化剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其可加强抗体的保存期限或有效性。
本发明激动剂抗-CD40抗体与包含它们的组合物可与一种或多种其它治疗剂、诊断剂或预防剂组合投药。其它治疗剂包括其它抗肿瘤药、抗肿瘤剂、抗血管生成剂或化疗剂。所述其它制剂可包括在同一组合物中或可分开投药。有些实施方案中，可使用一种或多种本发明激动剂抗-CD40抗体作为疫苗或作为疫苗的佐剂。
本发明组合物可呈多种不同种形式，例如：液体、半固体、及固体剂型，如：液体溶液(例如：注射液与输液)、分散液或悬浮液、片剂、丸剂、粉剂、脂质体与栓剂。优选形式依投药模式及医疗用途而定。典型的优选组合物呈注射液或输液形式，如：类似那些用于人体被动免疫法的组合物。优选投药模型为肠外的(例如：静脉内、皮下、腹膜内、肌内)。优选实施方案中，经静脉内输液或注射法施用抗体。另一项优选实施方案中，经肌内或皮下注射法施用抗体。
医疗性组合物典型地必需无菌且于制造及储存的条件下稳定。组合物可调配成溶液、微乳液、分散液、脂质体、或其它适宜高药物浓度的有序结构。无菌注射液的制法为：将所需量的抗-CD40抗体，依需要与一种或多种前述成分一起加至适当溶剂中，然后进行过滤杀菌。通常，分散液的制法为：添加活性化合物至含有基本分散介质及前述所需其它成分的无菌介质中。用于制备无菌注射液的无菌粉剂的优选制法为真空干燥法及冷冻干燥法，产生活性成分粉末与来自前述经无菌过滤的溶液中的任何其它所需成分。溶液的适当流动性可利用下述方式来维持，例如：使用包衣，如卵磷脂，若为分散液时，则维持所需粒子大小，及使用表面活性剂。组合物中包含延缓吸收剂(例如：单硬脂酸盐及明胶)时，可延缓注射组合物的吸收。
本发明抗体可依本领域已知的多种方法投药，但对许多医疗用途而言，优选投药途径/模型仍为皮下、肌内、或静脉内输液。本领域技术人员应了解，投药途径/模型将依所需结果而定。
某些实施方案中，抗体组合物活性化合物可使用可防止抗体快速释出的载体制备，如：控释制剂，包括植入物、经皮式贴剂、及微包囊的传送系统。可使用生物可降解的生物兼容性聚合物，如：乙烯基乙酸乙酸酯、聚酸酐、聚二醇酸、胶原、聚原酸酯、及聚乳酸。此类制剂的多种制法已有专利权或是本领域技术人员熟知的。参见例如： Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems(J.R.Robinson编辑，MarcelDekker，Inc.，New York，1978)。
某些实施方案中，本发明抗-CD40抗体可经口投药，例如：使用惰性稀释剂或可同化的可食性载体投药。化合物(若需要时可使用其它成分)也可包埋在硬式或软式明胶囊中，压缩成片剂，或直接加至患者的饮食中。经口投药时，抗-CD40抗体可添加入赋形剂，呈可食入的片剂、口腔片剂、药片、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、扁片，等等形式使用。采用肠外途径以外的方式施用本发明化合物时，可能必需以防止其失去活性的物质包覆化合物或与化合物共同投药。
其它活性化合物也可加至组合物中。某些实施方案中，本发明抗-CD40抗体与一种或多种其它治疗剂共同调配和/或共同投药。此类药剂包括(但不限于)：结合其它目标的抗体(例如：结合一种或多种生长因子或细胞因子或其细胞表面受体的抗体，如：抗-CTL4-抗体)、抗肿瘤药、抗肿瘤剂、化疗剂、可活化CD40的肽类似物、可溶性CD40L、一种或多种可活化CD40的化学剂，和/或本领域已知可加强对抗肿瘤细胞的免疫反应的制剂(例如：IFN-β1、IL-2、IL-8、IL-12、IL-15、IL-18、IL-23、IFN-γ及GM-CSF)。此类组合疗法可能需要较低剂量的抗-CD40抗体及共同投药的药剂，因此可避免产生与各种单一疗法相关的毒性或并发症。
本发明激动剂抗-CD40抗体及包含它们的组合物也可与其它治疗方案组合进行，特别是与放射疗法组合进行。
本发明组合物可包括″治疗有效量″或预防有效量″的本发明抗体或其抗原结合部分。″治疗有效量″是指在使用剂量及必要的时间期内，可达到所需医疗结果的用量。抗体或抗体部份的治疗有效量可依多项因素变化如：疾病状态、个体的年龄、性别与体重，及抗体或抗体部份于个体内诱发所需反应的能力。治疗有效量也指其中抗体或抗体部份的有利的医疗效应超过任何毒性或有害效应时的用量。″预防有效量″是指在使用剂量及必要的时间期内，可达到所需预防结果的用量。典型地，由于个体是在发病前或疾病早期使用预防剂量，预防有效量将低于治疗有效量。
剂量方案可以调整，以提供最适的所需反应(例如：医疗性或预防性反应)。例如：可施用单一大丸剂，在一段时间内施用数次分开的小剂量，或可随医疗情形的紧迫程度，按比例降低或提高剂量。特别有利的作法为将肠外施用的组合物调配成方便投药且剂量均一的单位剂型。本文所使用的单位剂型是指适宜作为待治疗的哺乳动物个体的单位剂量的物理性分离单位；各单位包括经计算可产生所需医疗效果的预定量活性化合物以及所需的医药载体。本发明明确的单位剂型直接依下列而定：(a)抗-CD40抗体或其部份的独特性质及所要达到的特定医疗或预防效果，及(b)制备此类抗体的技艺本身受到个体治疗敏感性的限制。
本发明抗体或抗体部份的治疗或预防有效量的实例为0.025至50mg/kg，更优选为0.1至50mg/kg，更优选为0.1-25、0.1至10或0.1至3mg/kg。应注意，此剂量可以随所要减轻的病症类型与严重性而定。也应了解，对任何特定患者而言，特定的剂量方案应随时间，依个体需要及投药者或监督组合物投药者的专业判断来调整，且本文所指示的剂量范围仅供示例，并无意限制所申请专利权的组合物的范围或实施。
本发明另一方面提供一种试剂盒，其包含本发明抗-CD40抗体或抗体部份，或含此类抗体的组合物。除了抗体或组合物外，试剂盒中可另包含诊断剂或治疗剂。试剂盒中也可包含指示其诊断或医疗方法 的说明书。优选实施方案中，试剂盒包括抗体或含该抗体的组合物，及可用于下文所述方法的诊断剂。另一项优选实施方案中，试剂盒包括抗体或含该抗体的组合物，一种或多种可用于下文所述方法的治疗剂。
本发明也涉及于哺乳动物体内抑制异常细胞生长的组合物，其包含一定量的本发明抗体与一定量的化疗剂的组合，其中一定量的化合物、盐、溶剂化物、或前药，与一定量的化疗剂一起可有效抑制异常细胞生长。本领域已知有许多种化疗剂。有些实施方案中，化疗剂是选自下列：有丝分裂抑制剂、烷化剂、抗代谢物、插入性抗生素、生长因子抑制剂、细胞循环抑制剂、酶、拓朴异构溶合物抑制剂、生物反应修饰剂、抗激素剂，例如：抗雄激素及抗血管生成剂。
抗血管生成剂，如：MMP-2(基质金属蛋白酶2)抑制剂、MMP-9(基质金属蛋白酶9)抑制剂及COX-II(环氧酶II)抑制剂可与本发明的抗-CD40抗体组合使用。适用的COX-II抑制剂实例包括CELEBREXTM(艾克希(alecoxib))、伐地考昔与罗非考昔。适用的基质金属蛋白酶抑制剂说明于WO96/33172(1996年10月24日公告)、WO96/27583(1996年3月7日公告)、欧洲专利申请案No.97304971.1(1997年7月8日申请)、欧洲专利申请案No.99308617.2(1999年10月29日申请)、WO98/07697(1998年2月26日公告)、WO98/03516(1998年1月29日公告)、WO98/34918(1998年8月13日公告)、WO98/34915(1998年8月13日公告)、WO98/33768(1998年8月6日公告)、WO98/30566(1998年7月16日公告)、欧洲专利公告案606,046(1994年7月13日公告)、欧洲专利公告案931,788(1999年7月28日公告)、WO90/05719(1990年5月31日公告)、WO99/52910(1999年10月21日公告)、WO99/52889(1999年10月21日公告)、WO99/29667(1999年6月17日公告)、PCT国际申请案No.PCT/IB98/01113(1998年7月21日申请)、欧洲专利申请案No.99302232.1(1999年3月25日申请)、英国专利申请案No.9912961.1(1999年6月3日申请)、美国临时申请案No.60/148,464(1999年8月12日申请)、美国专利 5,863,949(1999年1月26日发证)、美国专利5,861,510(1999年1月19日发证)、及欧洲专利公告案780,386(1997年6月25日公告)，其内容已以引用的方式完全并入本文中。优选MMP抑制剂为那些经证实不会造成关节痛的。更优选为那些可相对于其它基质金属蛋白酶(也即MMP-1、MMP-3、MMP-4、MMP-5、MMP-6、MMP-7、MMP-8、MMP-10、MMP-11、MMP-12、及MMP-13)而选择性抑制MMP-2和/或MMP-9的。有些适用于本发明的MMP抑制剂的特定实例为AG-3340、RO32-3555、RS13-0830及下列化合物：3-[[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰基]-(1-羟基氨基甲酰基-环戊基)-氨基]-丙酸；3-侧挂-3-[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰氨基]-8-氧杂-双环[3.2.1]辛烷-3-羧酸羟基酰胺；(2R，3R)1-[4-(2-氯-4-氟-苯甲氧基)-苯磺酰基]-3-羟基-3-甲基-哌啶-2-羧酸羟基酰胺；4-[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰基氨基]-四氢-吡喃-4-羧酸羟基酰胺；3-[[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰基]-(1-羟基氨基甲酰基-环丁基)-氨基]-丙酸；4-[4-(4-氯-苯氧基)-苯磺酰基氨基]-四氢-吡喃-4-羧酸羟基酰胺；(R)3-[4-(4-氯-苯氧基)-苯磺酰基氨基]-四氢-吡喃-3-羧酸羟基酰胺；(2R，3R)1-[4-(4-氟-2-甲基-苯甲氧基)-苯磺酰基]-3-羟基-3-甲基-哌啶-2-羧酸羟基酰胺；3-[[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰基]-(1-羟基氨基甲酰基-1-甲基-乙基)-氨基]-丙酸；3-[[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰基]-(4-羟基氨基甲酰基-四氢-吡喃-4-基)-氨基]-丙酸；3-侧挂-3-[4-(4-氯-苯氧基)-苯磺酰基氨基]-8-氧杂-双环[3.2.1]辛烷-3-羧酸羟基酰胺；3-桥环-3-[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰基氨基]-8-氧杂-双环[3.2.1]辛烷-3-羧酸羟基酰胺；及(R)3-[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰基氨基]-四氢-呋喃-3-羧酸羟基酰胺；及该化合物的药物可接受的盐及溶剂化物。
本发明化合物也可与信号转导抑制剂并用，如：可抑制EGF-R(表皮生长因子受体)反应的制剂，如：EGF-R抗体、EGF抗体、及作为EGF-R抑制剂的分子；VEGF(血管内皮生长因子)抑制剂，如：VEGF受体与可抑制VEGF的分子；及erbB2受体抑制剂，如：可结合erbB2受体的有机分子或抗体，例如：HERCEPTINTM(Genentech，Inc.)。EGF-R抑制 剂说明于例如：WO95/19970(1995年7月27日公告)、WO98/14451(1998年4月9日公告)、WO98/02434(1998年1月22日公告)及美国专利5,747,498(1998年5月5日发证)，且此类物质可如本文所说明用于本发明。EGFR-抑制剂包括(但不限于)：单克隆抗体C225与抗-EGFR22Mab(ImClone SystemsIncorporated)、ABX-EGF(Abgenix/Cell Genesys)、EMD-7200(Merck KgaA)、EMD-5590(Merck KgaA)、MDX-447/H-477(Medarex Inc.及Merck KgaA)，及化合物ZD-1834、ZD-1838及ZD-1839(AstraZeneca)、PKI-166(Novartis)、PKI-166/CGP-75166(Novartis)、PTK787(Novartis)、CP701(Cephalon)、来氟米特(Pharmacia/Sugen)，CI-1033(Warner LambertParke Davis)、CI-1033/PD183,805(Warner Lambert Parke Davis)、CL-387,785(Wyeth-Ayerst)、BBR-1611(Boehringer Mannheim GmbH/Roche)、Naamidine A(Bristol MyersSquibb)、RC-3940-II(Pharmacia)、BIBX-1382(Boehringer Ingelheim)、OLX-103(Merck&Co.)，VRCTC-310(Ventech Research)、EGF融合毒素(Seragen Inc.)、DAB-389(Seragen/Lilgand)、ZM-252808(Imperial Cancer Research Fund)、RG-50864(INSERM)，LFM-A12(Parker Hughes Cancer Center)、WHI-P97(Parker Hughes Cancer Center)、GW-282974(Glaxo)、KT-8391(Kyowa Hakko)及EGF-R疫苗(York Medica l/Centro de ImmunologiaMolecular(CIM))。此类及其它EGF-R-抑制剂均可用于本发明。
VEGF抑制剂，例如：SU-5416与SU-6668(Sugen Inc.)、SH-268(Schering)、与NX-1838(NeXstar)也可与本发明化合物组合使用。VEGF抑制剂已说明于例如：WO99/24440(1999年5月20日公告)、PCT国际申请案PCT/IB99/00797(1999年5月3日申请)、WO95/21613(1995年8月17日公告)、WO99/61422(1999年12月2日公告)、美国专利5,834,504(1998年11月10日发证)、WO98/50356(1998年11月12日公告)、美国专利5,883,113(1999年3月16日发证)、美国专利5,886,020(1999年3月23日发证)、美国专利5,792,783 (1998年8月11日发证)、WO99/10349(1999年3月4日公告)、WO97/32856(1997年9月12日公告)、WO97/22596(1997年6月26日公告)、WO98/54093(1998年12月3日公告)、WO98/02438(1998年1月22日公告)、WO99/16755(1999年4月8日公告)及WO98/02437(1998年1月22日公告)，其内容已以引用的方式完全并入本文中。有些适用于本发明的其它特异性VEGF抑制剂实例为IM862(Cytran Inc.)；抗VEGF单克隆抗体(Genentech Inc.)；及angiozyme，是一种来自Ribozymeand Chiron的合成核糖酶。此类及其它VEGF抑制剂均可如本文所说明用于本发明中。本发明化合物也可与ErbB2受体抑制剂，如：GW-282974(Glaxo Wellcome plc)，及单克隆抗体AR-209(Aronex Pharmaceuticals Inc.)及2B-1(Chiron)组合使用，例如：那些说明于WO98/02434(1998年1月22日公告)、WO99/35146(1999年6月15日公告)、WO99/35132(1999年6月15日公告)、WO98/02437(1998年1月22日公告)、WO97/13760(1997年4月17日公告)、WO95/19970(1995年6月27日公告)、美国专利5,587,458((1996年12月24日发证)、及美国专利5,877,305((1999年3月2日发证)中的，其内容已以引用的方式完全并入本文中。适用于本发明的ErbB2受体抑制剂也说明于1999年1月27日申请的美国临时申请案No.60/117,341、1999年1月27日申请的美国临时申请案No.60/117,346，此二者的内容已以引用的方式完全并入本文中。erbB2受体抑制剂化合物及上述PCT申请案、美国专利、与美国临时申请案所说明的物质，及其它可抑制erbB2受体的化合物与物质均可根据本发明与本发明化合物组合使用。
抗-残留剂(anti-survival agents)包括抗IGF-IR抗体与抗整合蛋白制剂，如：抗-整合蛋白抗体。
诊断法与用途
本发明另一方面提供一种诊断法。抗-CD40抗体可用于活体外或活体内检测生物样品中的CD40。一项实施方案中，本发明提供一种为有需要的个体诊断表达CD40的肿瘤的存在或位置的方法，其包括的步 骤为将抗体注射至该个体内，测定抗体的结合位置来判断CD40的表达，并与正常参考个体或标准物的表达比较，诊断肿瘤的存在或位置。
抗-CD40抗体可用于传统的免疫分析法中，包括(但不限于)：ELISA、RIA、FACS、组织免疫组织化学法、蛋白质印迹法、或免疫沉淀法。本发明抗-CD40抗体可用于检测来自人体的CD4。本发明另一项实施方案中，抗-CD40抗体可用于检测来自古老世界的灵长类动物如：猕猴与恒河猴、黑猩猩与猿的CD40。本发明提供一种检测生物样品中CD40的方法，其包括的步骤为将生物样品与本发明抗-CD40抗体接触，并检测结合的抗体。在一项实施方案中，在抗-CD40抗体上直接标记可检测的标记物。另一项实施方案中，抗-CD40抗体(第一抗体)未标记，可结合抗-CD40抗体的第二抗体或其它分子则有标记。本领域技术人员已知，所选用的第二抗体应特异性结合第一抗体的特定物种与类型。例如：若抗-CD40抗体为人类IgG时，则第二抗体可为抗人类-IgG。其它可结合抗体的分子包括(但不限于)：蛋白质A与蛋白质G，此二者均可自商品取得，例如：来自Pierce Chemical Co.。
抗体或第二抗体的适宜标记物已揭示于上述文献中，且包括多种酶、辅基、荧光材料、发光材料及放射活性材料。适宜酶的实例包括辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或乙酰胆碱酯酶；适宜的辅基复合物实例包括链霉抗生物素/生物素及抗生物素蛋白/生物素；适宜荧光材料实例包括伞形酮、荧光素、荧光异硫氰酸、罗丹明、二氯三唑基氨荧光素、丹磺酰氯、或藻红蛋白；发光材料实例包括鲁米诺；及适宜的放射活性材料实例包括125I、131I、35S或3H。
其它实施方案中，生物样品中CD40的分析法可利用标记可检测的物质的CD40标准物与未标记的抗-CD40抗体进行竞争免疫分析法测定。此分析法中，组合生物样品、有标记的CD40标准物及抗-CD40抗体，并测定有标记的CD40标准物与未标记的抗体的结合量。生物样品中CD40含量会与结合抗-CD40抗体的有标记的CD40标准物含量呈反比。
上文所揭示免疫分析法可用于多种目的。例如：可使用抗-CD40 抗体来检测细胞培养物中细胞中的CD40。优选实施方案中，使用抗-CD40抗体测定经过多种不同化合物处理的细胞表面上的CD40含量。此方法可用于判别化合物是否适用于活化或抑制CD40。根据本发明，可使用试验化合物处理一个细胞样品一段时间，而另一个样品则保留不处理。若要测定CD40总量时，则溶解细胞，使用上述一种免疫分析法测定CD40总量。比较处理组与未处理组的CD40总量，确定试验化合物的效力。
测定CD40总量的优选免疫分析法为ELISA或蛋白质印迹分析法。若要测定细胞表面的CD40含量时，则不溶解细胞，并使用上述一种免疫分析法测定细胞表面的CD40含量。测量细胞表面CD40含量的优选免疫分析法包括的步骤为在细胞表面蛋白质上标记可检测的标记物，如：生物素或125I，使CD40与抗-CD40抗体进行免疫沉淀后，检测有标记的CD40。另一项测定CD40位置(例如：细胞表面含量)的优选免疫分析法为采用免疫组织化学法。如：ELISA、RIA、蛋白质印迹法、免疫组织化学法、以整合型膜蛋白质标记细胞表面的方法，及免疫沉淀法均是本领域已知的。参见例如：Harlow与Lane的上述文献。此外，免疫分析法可放大规模，用于高通量筛选，以测试大量化合物是否可活化或抑制CD40。
本发明抗-CD40抗体也可用于测定组织或衍生自组织的细胞中的CD40含量。有些实施方案中，组织为疾病组织。有些实施方案中，组织为肿瘤或其活检组织样品。该方法的有些实施方案中，组织或其活检组织样品是自患者体内切下的。该组织或其活检组织样品则用于免疫分析法中，采用上述方法来测定例如：CD40总量、细胞表面CD40含量、或CD40位置。
上述诊断法可用于测定肿瘤是否表达大量CD40，此点可作为该肿瘤是否为抗-CD40抗体的治疗目标的指针。此外，同样的方法也可检测肿瘤中细胞死亡，以追踪抗-CD40抗体的治疗效力。诊断法也可用于测定组织或细胞是否表达不足量CD40或活化CD40，因此可决定其是否为可接受活化型抗-CD40抗体、CD40L和/或其它用于提高CD40 含量或活性的治疗剂治疗的候选目标。
本发明抗体也可用于活体内来判别表达CD40的组织与器官。有些实施方案中，使用抗-CD40抗体来判别表达CD40的肿瘤。使用本发明人类抗-CD40抗体的一项优点为其可于活体内安全使用，不会在投药时对抗体引发免疫反应，此点不同于非人类来源的抗体或人源化抗体。
本方法包括的步骤为施用已标记可检测物的抗-CD40抗体或含此抗体的组合物给需要此种诊断试验法的患者，使患者接受显影分析法，以测定表达CD40的组织位置。显影法是医学领域已知的，其包括(但不限于)X-射线分析法、磁共振显影法(MRI)或计算机断层摄影(CE)。抗体上可标记适宜于活体内显影的任何试剂，例如：反差试剂(contrast agent)，如：钡，其可用于X-射线分析法，或磁反差试剂，如：钆螯合剂，其可用于MRI或CE。其它标记试剂包括(但不限于)放射性同位素，如：99Tc。另一项实施方案中，抗-CD40抗体没有标记，且是经施用第二抗体或其它可检测且可结合抗-CD40抗体的分子来显影。一项实施方案中，活检组织样品得自患者体内，以确定目标组织是否表达CD40。
医疗用途
本发明另一方面提供使用本发明抗-CD40抗体的医疗法。
本发明人类激动剂抗-CD40抗体可施用于表达交叉反应的CD40的人类或非人类哺乳动物。施用抗体于此类非人类哺乳动物(也即灵长类、猕猴或恒河猴)是供兽医学用途或作为人类疾病的动物模型。此类动物模型适用于评估本发明抗体的医疗效力。
有些实施方案中，抗-CD40抗体施用于患有原发性和/或复合性免疫缺乏症的患者，包括出现过多IgM综合征的依赖CD40的免疫缺乏症、一般多变性免疫缺乏症、Bruton′s血丙种球蛋白缺乏症、IgG亚型缺乏症及X-连锁的SCID(一般γ-链突变)。有些实施方案中，所施用的抗-CD40抗体用来治疗免疫抑制的患者，例如：因化疗法所致，或患有免疫虚弱症者，包括任何获得性免疫缺乏症，如：HIV。有些实 施方案中，施用抗-CD40抗体来加强老年人的免疫力。有些实施方案中，施用抗-CD40抗体来治疗患有细菌性、病毒性、真菌性、或寄生性感染的患者。有些实施方案中，本发明人类激动剂抗-CD40抗体可预防性施用于那些因年龄、疾病、或身体一般状况不佳而容易感染的个体，以预防或降低感染次数或严重性。
有些实施方案中，施用抗-CD40抗体给患有过度增生性病变的患者。
有些实施方案中，施用抗-CD40抗体来治疗患有肿瘤的个体。有些实施方案中，该肿瘤为CD40阳性。有些实施方案中，该肿瘤为CD40阴性。肿瘤可为实体瘤，或非实体瘤，如：淋巴瘤。有些实施方案中，抗-CD40抗体施用于患有癌性肿瘤的患者。有些实施方案中，抗体可抑制癌细胞增生，抑制或预防肿瘤重量或体积增加，和/或降低肿瘤重量或体积。
可接受本发明抗-CD40抗体或抗体部份治疗的患者包括(但不限于)经诊断患有下列疾病的患者：脑癌、肺癌、骨癌、胰癌、皮肤癌、头与颈癌、皮肤或眼内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区癌、胃癌、结肠直肠癌、结肠癌、乳腺癌、妇科肿瘤(例如：子宫肉瘤、面神经管癌瘤、子宫内膜癌瘤、子宫颈癌瘤、阴道癌瘤、或外阴癌瘤)、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌(例如：甲状腺癌、甲状旁腺癌或肾上腺癌)、软组织肉瘤、白血病、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、幼儿的实体瘤、何杰金病(Hodgkin′sdisease)、淋巴细胞性淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、膀胱癌、肝癌、肾癌、肾或输尿管癌(例如：肾细胞癌瘤、肾盂癌瘤)、或中枢神经系统的癌瘤(例如：原发性CNS淋巴瘤、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤或脑下垂体腺瘤)、神经胶质瘤或纤维肉瘤。
抗体可一天施用3次至每6个月施用1次，且最好经口、黏膜、口腔、鼻内、吸入、静脉内、皮下、肌内、肠外、肿瘤内、穿皮式或局部途径投药。抗体也可利用微型泵连续投药。在抗体导致肿瘤或癌停止生长或降低重量或体积的情况下，抗体的投药时间通常维持消失 为止。抗体剂量范围通常为0.025至50mg/kg，更优选为0.1至50mg/kg，更优选为0.1-20mg/kg、0.1-10mg/kg，0.1-5mg/kg或甚至更优选为0.1-2mg/kg。抗体也可预防性投药。
有些实施方案中，抗-CD40抗体作为包括另一种或多种抗细胞增生性药物或分子的治疗方案的一部份投药给患有过度增生性病变的患者，如：癌症或肿瘤。抗肿瘤剂实例包括(但不限于)：有丝分裂抑制剂、烷化剂、抗代谢物、插入性试剂、生长因子抑制剂、细胞循环抑制剂、酶、拓朴异构酶抑制剂、生物反应修饰剂、抗激素剂、激酶抑制剂、基质金属蛋白酶抑制剂、遗传治疗剂与抗雄激素。更优选实施方案中，抗-CD40抗体与抗肿瘤药一起投药，如：多柔比星或紫杉醇。有些优选实施方案中，抗-CD40疗法是与放射疗法、化疗法、光动能疗法、外科手术或其它免疫疗法一起进行。有些实施方案中，抗-CD40抗体与一种或多种其它抗体一起投药。例如：抗-CD40抗体可与已知可抑制肿瘤或癌细胞增生的抗体一起投药。此类抗体包括(但不限于)：抑制CTLA4、erbB2受体、EGF-R、IGF-1R、CD20或VEGF的抗体。
有些实施方案中，抗-CD40抗体上标记一种放射性标记物、免疫毒素或毒素、或为包含毒性肽的融合蛋白质。抗-CD40抗体或抗-CD40抗体融合蛋白质可引导该放射性标记物、免疫毒素、毒素、或毒性肽到达肿瘤或癌细胞。优选实施方案中，待抗-CD40抗体与细胞表面上CD40结合后，放射性标记物、免疫毒素、毒素、或毒性肽即被肿瘤或癌细胞内化。
本发明另一方面，抗-CD40抗体可用于医疗上，以诱发患者特定细胞的细胞凋亡。许多情况下，待细胞凋亡的目标细胞为癌或肿瘤细胞。因此，本发明提供一种诱发细胞凋亡的方法，其是对有此需要的患者施用抗-CD40抗体。
本发明另一方面提供一种对患者施用活化型抗-CD40抗体的方法，以提高CD40活性。抗-CD40抗体与其它一种或多种可提高CD40活性的因子共同投药。此类因子包括CD40L，和/或可活化CD40的CD40L类似物。
有些实施方案中，抗-CD40抗体与一种或多种免疫增强剂共同投药，其包括(但不限于)：IFN-β1、IL-2、IL-8、IL-12、IL-15、IL-18、IL-23、IFN-γ、及GM-CSF。
有些实施方案中，本发明人类激动剂抗-CD40抗体用作加强疫苗效力的佐剂。当依此方式使用时，抗-CD-40抗体会活化抗原呈递细胞上的CD40，包括B细胞、树突细胞与单核细胞，并加强产生免疫调节分子，如：细胞因子与趋化因子。抗体的免疫刺激性效应可加强已免疫接种的个体对疫苗抗原的免疫反应。
本发明另一方面提供一种产生用于癌症或树突细胞免疫疗法的树突细胞疫苗的方法。根据本方法，使取自癌症患者的树突细胞与肿瘤溶胞物或均浆液、经照射法或其它方法杀死的肿瘤细胞、或肿瘤特异性抗原(例如：个体独特型肽)及1-10μg/ml抗-CD40抗体一起培养1-5天。再度将经肿瘤抗原脉冲处理的树突细胞注射至患者体内，以刺激抗肿瘤免疫反应，特别是抗肿瘤CTL反应。本方法所使用衍生自单核细胞的树突细胞可经由外周血液样品于IL-4与GM-CSF中培养后制得。树突细胞也可自患者的骨髓经过磁纯化法或筛检CD34阳性细胞，然后于IL-4与GM-CSF中培养后得到。
基因疗法
本发明的核酸分子可利用基因疗法施用于有此需要的患者。该疗法可于活体内或离体进行。优选实施方案中，可对患者施用编码重链与轻链的核酸分子。更优选实施方案中，所施用的核酸分子稳定整合入B细胞的染色体中，因为此类细胞已专一化生产抗体。优选实施方案中，前体B细胞离体转染或感染，然后再次转入至有此需要的患者体内。另一项实施方案中，前体B细胞或其它细胞于活体内使用已知可感染目标细胞类型的病毒进行感染。用于基因疗法的典型载体包括脂质体、质粒与病毒载体。病毒载体实例为反转录病毒、腺病毒与腺伴随病毒。于活体内或离体感染后，自接受处理的患者体内取样，采用本领域已知或本文曾讨论的任何免疫分析法追踪抗体表达程度。
优选实施方案中，基因疗法包括的步骤为施用编码抗-CD40抗体 的重链或其抗原结合部分的分离核酸分子并表达该核酸分子。另一项实施方案中，基因疗法包括的步骤为施用编码抗-CD40抗体的轻链或其抗原结合部分的分离核酸分子并表达该核酸分子。更优选方法中，基因疗法包括的步骤为施用编码本发明抗-CD40抗体的重链或其抗原结合部分的分离核酸分子及编码其轻链或其抗原结合部分的分离核酸分子并表达该核酸分子。基因疗法也包括的步骤为施用另一种抗癌剂，如：紫杉醇或多柔比星。
为了进一步了解本发明，因此出示下列实施例。这些实施例仅仅是说明性的，而不应被解释为限制本发明的范围。
实施例I
生产抗-CD40抗体的杂交瘤的形成法
依下列方法制备、选择及分析本发明抗体：
免疫法与杂交瘤形成法
取8-10周大的XenoMiceTM小鼠经腹膜内或在其后爪上接种CD40-IgG融合蛋白质(10μg/剂/只)或接种300.19-CD40细胞(10x106个细胞/剂/只)，其是一种于细胞膜上表达人类CD40的转染细胞系。在3-8周内，重复此剂量5-7次。进行融合前4天，为小鼠注射最后一剂含于PBS中的人类CD40的细胞外结构域。使来自经免疫接种的小鼠的脾与淋巴节的淋巴细胞与非分泌性骨髓瘤P3-X63-Ag8.653细胞系融合，依过去文献的说明，对融合的细胞进行HAT选择(Galfre与Milstein的Methods Enzymol.73：3-46，1981)。回收一组均分泌CD40特异性人类IgG2K抗体的杂交瘤。其中选出11株杂交瘤进一步研究，且指定为3.1.1、7.1.2、10.8.3、15.1.1、21.4.1、21.2.1、22.1.1、23.5.1、23.25.1、23.29.1及24.2.1。
申请人依据布达佩斯条约，于2001年8月6日，将3.1.1、7.1.2、10.8.3、15.1.1及21.4.1保藏在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection(ATCC)，10801University Boulevard，Manassas，VA20110-2209)。于2002年7月16日，将杂交瘤21.2.1、 22.1.1、23.5.1、23.25.1、23.28.1、23.29.1与24.2.1保藏在ATCC。所述杂交瘤的保藏编号如下：
实施例II
根据本发明制备的抗-CD40-抗体的序列
为了分析根据本发明所产生抗体的结构，我们自生产抗-CD40单克隆抗体的杂交瘤中克隆出编码重链与轻链片段的核酸。克隆与序列分析方法如下：
自已如实施例I所述经免疫接种人类CD40的XenoMouseTM小鼠所衍生的约2X105个杂交瘤细胞中，使用Fast-Track试剂盒(Invitrogen)分离出聚(A)+mRNA。随后进行PCT产生随机引物化的(random primed)的cDNA。采用人类VH或人类VK家族的特异性可变区引物(Marks等人的″Oligonucleotide primers for polymerase chain reactionamplification of human immunoglobulin variable genes and design of family-specific oligonucleotide probes.″Eur.J.Immunol.21：985-991(1991))或通用的人类VH引物，MG-30，CAGGTGCAGCTGGAGCAGTCIGG(SEQ ID NO：118)，与特异于人类Cj2恒 定区的引物，MG-40d，5′-GCTGAGGGAGTAGAGTCCTGAGGA-3′(SEQ ID NO：119)或CK恒定区(hKP2；如前述Green等人，1994的文献)。因此得到来自产生抗CD40的杂交瘤中编码人类重链与κ-轻链转录本的核酸分子，其方法为对采用上述引物从聚(A+)RNA所产生的PCR产物进行直接测序。也采用TA克隆试剂盒(Invitrogen)克隆PCR产物至pCRII中，使用Prism染料-终止子序列分析试剂盒(dye-terminator sequencing kits)及ABI377测序仪分析两链的序列。采用MacVector和Geneworks软件程序，与″V BASE sequence directory″(Tomlinson等人，MRCCentre for Protein Engineering，Cambridge，UK.)排列比对，分析所有序列。
此外，对单克隆抗体3.1.1、7.1.2、10.8.3、15.1.1、21.4.1、21.2.1、22.1.1、23.5.1、23.28.1、23.29.1与24.2.1进行全长DNA克隆与测序。对于此类测序，采用QIAGENRNeasy RNA分离试剂盒(QIAGEN)，自约4X106个杂交瘤细胞中分离RNA。使用寡-dT(18)及Advantage RT/PCR试剂盒(Clonetech)，对mRNA进行反转录。使用VBase设计正向扩增引物，其中包括限制性酶切位点、最适当Kozak序列、ATG起始位点及重链的一部份信号序列。表1列出了用于分析抗体克隆序列的正向扩增引物。
表1
采用相同方法来设计引物，其中包括3′编码序列、IgG2恒定区的终止密码子(5′-TTCTCTGATCAGAATTCCTATCA TTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3′)(SEQ ID NO：125)及限制性酶切位点。
也采用相同方法设计κ-链的ATG起始位点周围的引物：(5′-CTTCAAGCTTACCCGGGCCACCATGAGGCTCCCTGCTCAGC-3′)(SEQ ID NO：126)。在ATG起始位置的5′端添加最适Kozak序列(CCGCCACC)。此引物是用于PCR中，以克隆下列抗体克隆的轻链：3.1.1、7.1.2、10.8.3、15.1.1、21.4.1、21.2.1、22.1.1、23.5.1与23.29.1。使用第二正向扩增引物5′-TCTTCAAGCTTGCCCGGGCCCGCCACC ATGGAAACCCCAGCGCAG-3′(SEQ ID NO.134)来克隆克隆23.28.1与24.2.1.的轻链。也使用相同方法设计κ-恒定区的终止密码子周围的引物(5′-TTCTTTGATCAGAATTCTCACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGC-3′)(SEQ ID NO：127)。采用AdvantageHigh Fidelity PCR试剂盒(Clonetech)，使用此引物对扩增cDNAs。依标准技术(例如：引物步移法(primer walking)，使用染料-终止子测序试剂盒及ABI测序仪器，直接分析PCR产物的序列。将PCR产物克隆至哺乳动物表达载体中，分析克隆的序列，以确认体细胞突变。每株克隆均至少进行3次反应，以确认其两链的序列。
基因利用分析
表2列出了根据本发明选择的抗体杂交瘤克隆证实的基因利用情况。
表2
重链与轻链基因利用情况
序列与突变分析法
应了解，基因利用分析仅提供抗体结构的有限概况。由于XenoMouseTM动物中的B-细胞随机产生V-D-J重链或V-Jκ轻链转录本，因此会出现许多二级反应，包括(但不限于)体细胞超突变、删除、N-添加、与CDR3延伸。参见例如：Mendez等人的Nature Genetics15：146-156(1997)及国际专利公告案WO98/24893。因此，为了进一步检测抗体结构，由得自克隆的cDNAs预测抗体的氨基酸序列。表A提供各核苷酸的序列代号及已测序的抗体所预测的氨基酸序列。
表3-7提供抗体3.1.1(表3)、7.1.2(表4)、10.8.3(表5)、15.1.1(表6)与21.4.1(表7)中重链与κ-轻链的核苷酸与预测的氨基酸序列。
表8-13提供抗体21.2.1(表8)、22.1.1(表9)、23.5.1(表10)、 23.28.1(表11)、23.29.1(表12)及24.2.1(表13)的重链与κ-轻链的可变结构域的核苷酸与预测的氨基酸序列。
来自已分析全长序列的单克隆抗体23.28.1的DNA序列不同于PCR初产物中VH区的测序所得的DNA序列之处只在于一对碱基(C换成G)，以致天然重链的残基16由D换成E。
表14-19提供抗体21.2.1(表14)、22.1.1(表15)、23.5.1(表16)、23.28.1(表17)、23.29.1(表18)与24.2.1(表19)的重链与κ-轻链的核苷酸与预测的氨基酸序列。表中，信号肽序列(或其编码碱基)以下划线表示。
申请人产生两种突变抗体22.1.1与23.28.1。抗体22.1.1的重链中位置109的半胱氨酸残基突变成丙氨酸残基。此突变的克隆称为22.1.1H-C019A。抗体23.28.1的轻链中位置92的半胱氨酸残基也突变成丙氨酸残基。此突变的克隆称为23.28.1L-C92A。
进行特定残基的诱变法时，是设计引物，并根据制造商的指示，使用QuickChange定点诱变试剂盒(Stratagene)进行的。以自动测序法确认突变，取已突变的插入片段亚克隆至表达载体中。
表20提供抗体22.1.1H-C109A中突变重链的核苷酸与氨基酸序列。表21提供抗体23.28.1中突变轻链的核苷酸与氨基酸序列。突变的DNA密码子以斜体字表示。突变的氨基酸残基以粗字体表示。
表3：抗体3.1.1的DNA和蛋白质序列
表4：抗体7.1.2的DNA和蛋白质序列
表5：抗体10.8.3的DNA和蛋白质序列
表6：抗体15.1.1的DNA和蛋白质序列
表7：抗体21.4.1的DNA和蛋白质序列
表8：抗体21.2.1的成熟可变结构域的DNA和蛋白质序列
表9：抗体22.1.1的成熟可变结构域的DNA和蛋白质序列
表10：抗体23.5.1的成熟可变结构域的DNA和蛋白质序列
表11：抗体23.28.1的成熟可变结构域的DNA和蛋白质序列
表12：抗体23.29.1的成熟可变结构域的DNA和蛋白质序列
表13：抗体24.2.1的成熟可变结构域的DNA和蛋白质序列
表14：抗体21.2.1的DNA和蛋白质序列
表15：抗体22.1.1的DNA和蛋白质序列
表16：抗体23.5.1的DNA和蛋白质序列
表17：抗体23.28.1的DNA和蛋白质序列
表18：抗体23.29.1的DNA和蛋白质序列
表19：抗体24.2.1的DNA和蛋白质序列
表20：抗体22。1。1H-C109A的成熟可变结构域的DNA和蛋白质序列
表21：抗体23.28.1L-C92A的成熟可变结构域的DNA和蛋白质序列
实施例III
重链与轻链氨基酸取代的分析
图1D-1H及2D-2H提供单克隆抗体3.1.1、7.1.2、10.8.3、15.1.1、21.4.1、21.2.1、22.1.1、22.1.1H-C109A、23.5.1、23.28.1、23.28.1H-D16E、23.29.1与24.2.1抗体的预测的重链可变结构域氨基酸序列与其相应基因的种系氨基酸序列之间的序列比对。大多数重链CDR3区含有氨基酸插入。
抗体21.4.1的VH结构域中使用的DLR1基因编码两个半胱氨酸(Cys)残基。质谱分析法与同源性模型证明两个Cys残基利用二硫键连接，此二硫键连接不会瓦解抗体结构。
图1A-1C与2A-2C提供单克隆抗体3.1.1、7.1.2、10.8.3、15.1.1、21.4.1、21.2.1、22.1.1、23.5.1、23.28.1、23.28.1L-C92A、23.29.1与24.2.1克隆中预测的轻链可变氨基酸序列与其相应基因的种系氨基酸序列之间的序列比对。此类抗体的轻链衍生自3种不同Vκ基因。此11种抗体中有7种使用A3/A19Vκ基因，其中6种的CDR1区中有两处突变。此外，此7种使用A3/A19Vκ基因的抗体中有5种也使用J κ1基因；所有此类抗体中，第一个衍生自Jκ1基因的氨基酸均一致由W换成R。
应了解，上述许多氨基酸取代或插入出现在极邻近CDR处或在CDR中。此类取代似乎对抗体与CD40分子的结合性有一些影响，此外，此类取代对抗体的亲和性将有显著影响。
实施例IV
本发明抗体的物种交叉反应性
申请人进行FACS分析法来测定本发明抗体对来自不同物种(特别是某些古老世界的猴类)的CD40的结合性与亲和性。取人类与猴子全血的等分试样与逐渐提高浓度的本文所例举的抗-CD40抗体或与作为阴性对照组的抗钥孔血蓝蛋白(KLH)抗体，于冰上培养1小时。然后于冰上，使样品与抗人类IgG2-缀合RPE(藻红蛋白)培养30分钟。采用细胞流式计测定CD19/CD20阳性B细胞从而测定结合性，并使用 CellQuest软件分析荧光强度(F12-H)相对于细胞数(Counts)的直方图。根据荧光强度平均值相对于抗体浓度的值，预估各抗体的结合性(KD)。测定一段细胞浓度范围内结合性的变化，来控制抗体的消耗情形。
测试抗体3.1.1、7.1.2、10.8.3、15.1.1与21.4.1与人类、恒河猴、与猕猴B细胞的结合性。也测试抗体21.2.1、22.1.1、23.5.1、23.25.1、23.28.1、23.29.1与24.2.1与人类及恒河猴B细胞的结合性。
申请人观察到与猴细胞结合的最高信号及最高结合浓度的一半值相对于人类B细胞的相应参数的因子为2以内。使用小鼠、大鼠、兔子、及狗的血液进行的类似实验则未观察到结合性。
实施例V
抗体对CD40的选择性
申请人进一步进行另一种活体外分析法来测定本发明抗体对CD40的选择性。
CD40选择性ELISA：材料与方法
在96孔FluroNUNC板(Nunc登录号475515)上涂覆4种抗原：CD40/Ig、CD44/Ig、RANK/Ig、4-1BB/Ig、TNFR-1/Ig及TNFR-2/Ig(于实验室内产生的抗原)，依1μg/ml的浓度，于0.1M碳酸氢钠缓冲液，pH9.6中(100μl/孔)，4℃下培养一夜。然后以PBST(PBS+0.1％Tween-20)洗涤3次，以PBST+0.5％BSA(150μl/孔)封闭培养板。培养板于室温下保持1小时后，以PBST洗涤3次。随后，将实施例I所产生的抗-CD40抗体稀释成1μg/ml，添加稀释的抗体至培养板中。培养板于室温下培养1小时后，以PBST洗涤3次。然后以稀释1∶4000的抗人类IgG2-HRP(Southern Biotech登录号9070-05)(100ml/孔)处理含有实施例I所产生抗体的孔。也使用稀释至1∶5000的抗人类IgG(Jackson登录号209-035-088)处理其中一排孔，每孔添加100μl，以对培养板涂覆进行标准化。也使用稀释至0.05μg/ml的抗人类CD40-HRP(Pharmingen登录号345815/Custom HRP缀合物)处理其中一 排孔作为阳性对照组。培养板于室温下培养1小时后，以PBST洗涤3次。添加TMB底物(K&P Labs)，每孔100μl，培养5-10分钟。然后使用Spectra-MaxTM读板器读取培养板的数据。其结果显示，抗体对CD40的选择性比其对RANK、4-1BB、TNFR-1与TNFR-2的选择性至少高出100倍，其中CD4特异性信号(减去背景的CD40信号)比对其它分子的相应信号高出至少100倍。
实施例VI
表位分类试验
证明本发明抗体对CD40有选择性后，采用BIAcore与FACS进行竞争结合分析法。
BIAcore竞争试验
进行BIAcore竞争试验来确定本发明人类抗-CD40抗体是否结合在CD40分子上的相同或不同位置。
此类实验是使用BIAcore2000仪器，依据制造商的指示进行。使蛋白质-A固定在BIAcore的感应芯片表面上。使饱和浓度的包含CD40的细胞外结构域的CD40-Ig结合在感应芯片上。然后用本发明第一人类激动剂抗-CD40抗体、市售抗-CD40抗体或CD40L与已结合在感应芯片上的CD40于饱和条件下结合。然后测定本发明第二人类激动剂抗-CD40抗体与第一抗体、市售抗体或CD40L竞争结合CD40的能力。此技术可以将抗体分成不同结合群。与CD40结合则表示可识别独立的表位。没有结合则表示所识别的表位相同或重迭。
FACS试验
进行FACS试验来确定本发明人类抗-CD40抗体是否结合在CD40分子上的相同或不同位置，并确定其在CD40分子上的结合位置是否与市售抗-CD40抗体EA5(Alexis登录号ANC-300-050)、LOB7/6(SerotecMCA/590PE)与5C3(Pharmingen#555458(未标记)及555460(标记PE用于FACS))的结合位置相同或不同。
使用标记PE的EA5或标记PE的LOB7/6抗体与已经过本发明抗-CD40抗体处理的树突细胞进行对比染色，于冰上孵育30分钟。经 过洗涤后，于B-D细胞计数器(calibercytometer)上分析细胞染色度。市售抗体商品的结合性下降时，表示其所结合的表位与试验抗体相同或重迭。
BIAcore与FACS的竞争结合分析法显示，由mAb21.4.1抗体识别的表位与由EA5抗体识别的表位重迭，但未与市售LOB7/6抗体商品所识别的表位重迭，其与CD40L的结合位置也未重迭。其余抗体所识别的表位则与结合CD40L的位置重迭。
表22总结说明此类表位分类试验的结果。
表22
本发明某些抗-CD40抗体的BIAcore竞争表位分类试验结果
实施例VII
抗-CD40抗体对表面分子的增量调节试验
申请人进行全血分析法来测定本发明人类抗-CD40抗体是否增量调节B细胞上表面分子的表达。
取人类或灵长类全血，使用RPMI培养基稀释1∶1，与不同浓度的CD40激动剂抗体或对照组培养24小时。使用市售标记萤光色素的抗体试剂为细胞的HLA-DR、ICAM、B7-1、B7-2、CD19/CD20、CD40、CD23及CD71染色30分钟(于冰上，黑暗中进行)。然后于FACS-Caliber(Becton-Dickinson)上分析细胞。于CD19或CD20阳性细胞上筛选(gating)以判别B-细胞，并对该筛选确定活化标记物。
使用本发明申请专利权的一种抗-CD40抗体(21.4.1)所得荧光中值(≤1μg/ml抗体)的最高增加倍数及平均EC50值示于表23中。
表23
本发明抗-CD40抗体对B-细胞表面分子的增量调节结果
最大增加倍数 EC50(ng/nl)
平均值+/-St.Dev. 平均值+/-St.Dev.
MHCII 4.50+/-0.52 3.85+/-0.35
CD71 2.30+/-0.77 0.73+/-0.28
ICAM 4.52+/-2.42 15.3+/-7.3
CD23 69.9+/-25.8 19.0+/-4.4
B7-2 2.74+/-0.14 16.0+/-21.9
申请人也进行实验来确定本发明人类抗-CD40抗体是否增量调节单核细胞所衍生树突细胞的表面分子的表达。
单核细胞所衍生树突细胞的制法
自正常志愿者人体收集外周血液。使用Sigma Accuspin试管(St.Louis，MO)分离单核细胞，以RPMI培养基(Gibco BRL，Rockville，MD)洗涤，置入含有完全RPMI培养基(含有100U/ml青霉素/链霉素、10mM HEPES缓冲液、2mM谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸；均来自Gibco BRL)；及10％胎牛血清(Hyclone，Logan，Utah)的组织培养烧瓶中，浓 度为5x106个细胞/ml。于37℃(5％CO2)下培养3小时后，排除未附着细胞，使用选择管柱(R&D systems，Minneapolis，MN)分离T细胞。附着的细胞经RPMI培养基洗涤，于补充10ng/ml IL-4(R&Dsystems)与100ng/ml GM-CSF(R&D systems)的完全RPMI培养基中培养7天。然后分离未附着的细胞，洗涤后，作为衍生自单核细胞的树突细胞(mDCs)，供所有实验使用。其余附着细胞则使用胰蛋白酶/EDTA除去，用于使用附着的单核细胞的实验中。
为了测定本发明抗-CD40抗体是否增量调节细胞表面标记的表达，使单核细胞衍生的树突细胞与不同浓度的激动剂抗体培养48-72小时，然后使用市售标记萤光色素的抗体试剂对HLA-DR、ICAM、B7-1、B7-2、CD40与CD83染色(于冰上，黑暗中进行30分钟)。然后于FACS-Caliber(Becton-Dickinson)上分析细胞。
使用本发明申请专利权的抗-CD40抗体(21.4.1)所得荧光中值(≤1μg/ml抗体)的最高增加倍数及平均EC50值示于表24中。
表24
本发明抗-CD40抗体对树突细胞表面分子的增量调节结果
最大增加倍数 EC50(ng/ml)
平均值+/-St.Dev. 平均值+/-St.Dev.
MHCII 7.7+/-5.6 252+/-353
CD83 36.3+/-42.2 233+/-262
ICAM 10.4+/-4.8 241+/-140
B7-2 21.9+/-9.4 71.4+/-44.4
使用B细胞与mDCs，及本发明抗-CD40抗体与其它标记进行类似实验。依上述测定B细胞表面分子(MHC-II，ICAM，B7-1，B7-2与CD23)的表达，但其中改用1μg/ml抗-CD40抗体。此实验结果示于表25。72小时后，依上述测定树突细胞表面分子(MHC-II，ICAM，B7-1，B7-2与CD83)的表达，但其中改用1μg/ml抗-CD40抗体。此实验结果示 于表26。表25-26显示其中间值强度+/-标准偏差的提高倍数。
表25
本发明抗-CD40抗体对B-细胞表面分子的增量调节结果
表26
本发明抗-CD40抗体对树突细胞表面分子的增量调节结果
表27以树突细胞的细胞表面分子表达平均提高倍数与B细胞上的表达平均提高倍数的比例来比较树突细胞与B细胞中细胞表面分子增量调节表达的结果。
表27
树突细胞与B细胞上表面分子增量调节表达的比较结果
实施例VIII
细胞因子分泌的加强作用
进行单核细胞衍生的树突细胞分析法，来确定本发明人类抗-CD40抗体是否加强分泌IL-12p40、IL-12p70与IL-8。
如上述制备单核细胞衍生的树突细胞及附着的单核细胞。细胞于本发明抗-CD40抗体(21.4.1)的存在下培养或使用抗钥孔血蓝蛋白(KLH)抗体为阴性对照进行培养。24小时后，以ELISA(R&D systems)测定上清液中的细胞因子。有些试验中(见表28)，经抗体处理的单核细胞衍生的树突细胞也接受100ng/ml LPS(Sigma)、1000U/ml IFNγ(R&D systems)或25ng/ml IL-1βR&D systems共同刺激。
抗-CD40抗体在单核细胞衍生的树突细胞与附着性单核细胞中均加强产生IL-12p40、IL-12p70与IL-8。LPS的存在进一步加强产生IL-12p40与IL-12p70。与同种型对照抗体(抗-KLH)培养的树突细胞的上清液中仅检测到最少量的细胞因子。其代表性结果示于表28及图3与4中。表28总结说明树突细胞或附着性单核细胞经1μg/ml本发明 抗-CD40抗体(21.4.1)+/-100ng/ml LPS处理后所产生的主要细胞因子。如图3所示，抗-CD40抗体加强人类树突细胞产生IL-12p40。图4说明人类树突细胞在抗体与100ng/ml LPS的存在下加强产生IL-12p70。
表28
本发明抗-CD40抗体对分泌IL-12p40、IL-12p70与IL-8的加强作用
ND＝未确定
使用多种本发明抗-CD40抗体进行类似实验。依上述制备单核细胞衍生的树突细胞，于不同浓度抗-CD40抗体的存在下培养，并使用100ng/ml LPS(Sigma)共同刺激。24小时后，以ELISA(R&D systems)测定上清液中的IL-12p70，并确定各抗体EC50。实验结果示于表29。
表29
于树突细胞中对分泌IL-12p70的加强作用
也在同种异基因T-细胞/树突细胞分析法中，测试本发明抗-CD40抗体加强T细胞分泌IFN-γ的能力。为了进行本分析法，自健康志愿者的外周血液分离出T细胞与单核细胞。依上述方法，使单核细胞分化成树突细胞。取自个体的1x105个T细胞与来自不同个体的1x105个树突细胞，于本发明抗-CD40抗体的存在下或于对照抗体的存在下培养。培养4天后，以ELISA法分析上清液中IFN-γ的分泌。此分析法的结果示于表30。
表30
本发明抗-CD40抗体对分泌IFN-γ的加强作用
实施例IX
本发明抗-CD40抗体诱导炎性细胞因子
依Wing等人述于Therapeutic.Immunol.2：183-90(1995)的全血细胞因子释出分析法测试抗体10.8.3、15.1.1、21.4.1与3.1.1，以判断抗体在1、10与100μg/ml浓度下是否可诱发炎性细胞因子。由10位正常捐血者的血液中发现，在指定浓度下的抗体并未显著释出TNF-α、IL-1β、IFN-γ或IL-6。
实施例X
本发明抗-CD40抗体对细胞系Jy的免疫原性的加强作用
于RPMI培养基中培养CD40阳性JIYOYE细胞(ATCCCCL87)(″Jy细胞″)并维持。JIYOYE细胞是与本发明抗-CD40抗体(21.4.1)或与同种型相应抗体(抗-KLH)，于完全RPMI培养基中培养24小时。然后洗涤细胞，以25mg丝裂霉素C(Sigma)/7ml培养基培养60分钟。此类细胞再与分离的人类T细胞，依1∶100的比例，于37℃(5％CO2)下培养6天。然后收集T细胞，洗涤，相对于标记新鲜铬51(New England Nuclear，Boston，MA)的JIYOYE细胞测定CTL活性程度。CTL比活性的计算法为比溶胞率％＝(溶胞Jy(cpm)-自发性溶胞(cpm))/(总溶胞(cpm)-自发性溶胞(cpm))。
如图5所示，本发明抗-CD40抗体(21.4.1)显著加强经抗体处理的Jy细胞的免疫原性。
实施例XI
动物肿瘤模型
为了进一步探讨本发明制造的抗-CD40抗体的抗肿瘤活性，申请人设计了一种SCID-米色小鼠模型，来测试抗体于活体内对肿瘤生长的影响。
SCID-米色小鼠来自Charles River，使用前先使小鼠适应一周。取肿瘤细胞(Daudi细胞(ATCC CCL213)、CD40(-)K562细胞(ATCC CCL243)与CD40(+)Raji细胞(ATCCCCL86)、BT474乳腺癌细胞(ATCC HTB20)或PC-3前列腺细胞(ATCC CRL1435))经皮下注射，浓度为1x107 个细胞/只动物。有些例子中，将来自同一人类供体的T细胞(5x105个)与树突细胞(1x105个)与肿瘤细胞一起注射。也在即将注射肿瘤(仅注射一次)之前，经腹膜内注射本发明抗-CD40抗体或同种型相应的对照抗体(抗-KLH)。然后测定肿瘤生长。具体的实验说明于下文中。
在一项实验中，在即将注射肿瘤(仅注射一次)之前，经腹膜内注射本发明抗-CD40抗体(21.4.1)或同种型相应的对照抗体(抗-KLH)，剂量为10mg/kg。经皮下注射肿瘤细胞(Daudi细胞)，浓度为1x107个细胞/只动物。使用测径器，于植入后17、19、20、21、25、26、27与28天时，在人类T细胞与树突细胞的存在下测量肿瘤的生长。如图6所示，抗-CD40抗体抑制肿瘤生长达约[60]％。
另一项实验中，在即将注射肿瘤(仅注射一次)之前，经腹膜内注射本发明抗-CD40抗体(21.4.1)，或同种型相应的对照抗体(抗-KLH)，剂量为0.1mg/kg、1mg/kg或10mg/kg。经皮下注射肿瘤细胞(K562细胞)，浓度为1x107个细胞/只动物。此实验中，将来自同一位人类供体的T细胞(5x105个)与树突细胞(1x105个)与肿瘤细胞一起注射。使用测径器，于植入后17、19、20、21、25、26、27与28天时测量肿瘤的生长。如图7所示，抗-CD40抗体抑制肿瘤生长达60-85％。
另一项实验中，在即将注射肿瘤(仅注射一次)之前，经腹膜内注射本发明抗-CD40抗体(21.4.1、23.29.1或3.1.1)，或同种型相应的对照抗体(抗-KLH)。同种型相应的对照抗体与抗体21.4.1的注射剂量为1mg/ml。抗体23.29.1与3.1.1的注射剂量为1、0.1、0.01、0.001或0.0001mg/kg。经皮下注射肿瘤细胞(K562细胞)，浓度为1x107个细胞/只动物。此实验中，将来自同一位人类供体的T细胞(5x105个)与树突细胞(1x105个)与肿瘤细胞一起注射。使用测径器，于植入后28天时测量肿瘤的生长。此实验结果示于图8与9中。图中每一点表示来自单个动物的测定值。
另一项实验中，在即将注射肿瘤(仅注射一次)之前，经腹膜内注射本发明抗-CD40抗体(21.4.1)，或同种型相应的对照抗体(抗-KLH)。抗体剂量为1、0.1、0.01、0.001或0.0001mg/kg。经皮下注射肿瘤 细胞(Raji细胞)，浓度为1x107个细胞/只动物。此某些动物中，将来自同一位人类供体的T细胞(5x105个)与树突细胞(1x105个)与肿瘤细胞一起注射。使用测径器，于植入后28天时测量肿瘤的生长。此实验结果示于图10中。图中每一点表示来自单个动物的测定值。
另一项实验中，在即将注射肿瘤(仅注射一次)之前，经腹膜内注射本发明抗-CD40抗体(21.4.1、23.28.1、3.1.1或23.5.1)，或同种型相应的对照抗体(抗-KLH)。抗体的注射剂量为1或0.1mg/kg。经皮下注射肿瘤细胞(Raji细胞)，浓度为1x107个细胞/只动物。使用测径器，于植入后28天时测量肿瘤的生长。此实验结果示于图11中。图中每一点表示来自单个动物的测定值。
另一项实验中，在即将注射肿瘤(仅注射一次)之前，经腹膜内注射本发明抗-CD40抗体(21.4.1、23.29.1或3.1.1)，或同种型相应的对照抗体(抗-KLH)。抗体的注射剂量为1mg/kg。经皮下注射肿瘤细胞(BT474乳腺癌细胞)，浓度为1x107个细胞/只动物。将来自同一位人类供体的T细胞(5x105个)与树突细胞(1x105个)与肿瘤细胞一起注射。使用测径器，于植入后39天时测量肿瘤的生长。如图12所示，所有抗体均抑制乳腺癌肿瘤生长。图中每一点表示来自单个动物的测定值。
另一项实验中，在即将注射肿瘤(仅注射一次)之前，经腹膜内注射本发明抗-CD40抗体(3.1.1)，或同种型相应的对照抗体(抗-KLH)。抗体的注射剂量为1mg/kg。经皮下注射肿瘤细胞(PC-3前列腺细胞)，浓度为1x107个细胞/只动物。使用测径器，于植入后41天时测量肿瘤的生长。如图13所示，抗-CD40抗体抑制前列腺肿瘤生长达约60％。图中每一点表示来自单个动物的测定值。
实施例XII
经注射Daudi肿瘤细胞及经本发明抗-CD40抗体处理的SCID-米色小鼠的存活性
另一项实验中，在即将注射肿瘤之前，经腹膜内注射本发明抗-CD40抗体，或同种型相应的对照抗体(仅注射一次)。抗体的注射剂量 为1或0.1mg/ml。经静脉内注射肿瘤细胞(Daudi细胞)，剂量为5x106个细胞/只动物。然后追踪动物的存活。如图14所示，所有试验的抗-CD40抗体均可使接受肿瘤注射的小鼠延长存活至少6天。
表31列出实施例XI所述不同实体瘤模型中，抗-CD40抗体的ED50。表31综合说明有些本发明抗-CD40抗体于SCID小鼠体内的活体内抗肿瘤活性。此外，表中出示抗-CD40抗体在实施例XII所述Daudi全身肿瘤模型中的ED50。
表31
本发明抗-CD40抗体于SCID小鼠中使用不同活体内肿瘤模型的ED 50
ND＝未作
实施例XIII
以BIAcore测定完全人类抗-CD40抗体的亲和常数(K D )
采用BIAcore3000仪器，依制造商的指示，由表面胞质团共振法测定纯化抗体的亲和性。
生物感应器生物特异性相互作用分析仪器(The Biosensor biospecificinteraction analysis instrument(BIAcore))使用表 面胞质团共振法来测定CM5感应芯片上的分子相互作用。测定分子与感应芯片的葡聚糖面的相互作用所引致的两种介质(玻璃与羧甲基化葡聚糖)之间折射率的变化，作为自由反射单位(arbitrary reflectanceunits)(RU)的变化，此点已详细说明于制造商的用途说明中。
感应芯片上流体室的羧甲基化葡聚糖表面是经0.05M N-羟基琥珀酰亚胺，于0.2MN-乙基-N′-(二甲氨丙基)碳二亚胺的媒介下衍生化7分钟而活化。CD40-Ig融合蛋白质(述于实施例I)含于10mM乙酸钠，pH3.5中，浓度5μg/ml，手动注射至流体室中，注射速度为5μl/分钟，且经共价固定于含有所需量RU的流体室表面上。使用1M乙醇胺盐酸盐，pH8.5，去除未反应的N-羟基琥珀酰亚胺酯的活性。固定后，注射5次各5μl50mM NaOH，直到达到稳定基线为止，以清除流体室中任何未反应或结合不良的物质。流体室2为高密度表面，经表面处理后，测得约300RU，及流体室3为低密度表面，测得约150RU。流体室1为活化的空白表面，在固定期间注射35μl10mM乙酸钠缓冲液替代抗原。流体室4含有约450RU的固定化CTLA4-Ig，是一种不相关的抗原对照。
制备一系列稀释的各抗体，其半对数(half log)浓度范围为100μg/ml至0.1μg/ml。流速设定在5μl/分钟，每种浓度的样品取25μl注射至感应芯片上，，每种浓度抗体注射之间注射5μl50mM NaOH。采用BIA分析软件3.0分析数据。
在逆向动力实验(reverse orientation kinetic experiments)中，抗体21.4.1是依上述方法固定在感应芯片表面上。使用抗-KHL作为对照抗体表面。抗原CD40-Ig融合蛋白质的注射浓度范围为100μg/ml至0.1μg/ml。
表32列出本发明代表性抗-CD40抗体的亲和性测定值：
表32
本发明抗-CD40抗体的亲和性测定值
抗体 Kon(1/Ms) Koff(1/s) KD(M)
3.1.1 1.12x106 3.31x10-5 3.95x10-11
10.8.3 2.22x105 4.48x10-7 2.23x10-12
15.1.1 8.30x104 2.83x10-7 4.05x10-12
21.4.1 8.26x104 2.23x10-5 3.48x10-10
22.1.1 9.55x105 1.55x10-4 2.79x10-10
23.25.1 3.83x105 1.65x10-7 7.78x10-12
23.28.1 7.30x105 8.11x10-5 1.61x10-10
23.29.1 3.54x105 3.90x10-5 7.04x10-11
实施例XIV
抗-CD40抗体的表位作图
使用蛋白质A纯化的CD40-人类IgG1Fc融合抗原进行结合性分析法。由Pfizer克隆人类CD40-IgG1Fc融合蛋白质。此人类CD40IgG1融合蛋白质于哺乳动物细胞系中表达，经蛋白质A柱纯化。由SDS/PAGE分析融合抗原的纯度。
CD40的结构为典型I型跨膜蛋白质。成熟分子由277个氨基酸组成。CD40的细胞外结构域由4个类-TNFR的富含半胱氨酸的结构域组成。参见例如：Neismith与Sprang的TIBS23：74-79(1998)；van Kooten与Banchereau的J.Leukocyte Biol.67：2-17(2000)；Stamenkovic等人的EMBOJ.8：1403-1410(1989)。
抗-CD40抗体与还原或来还原的人类CD40的结合性
由于CD40的细胞外结构域是由4个富含半胱氨酸的结构域组成，因此分子内键合被还原剂瓦解时，会改变抗体反应性。为了测定被还原剂瓦解的分子内键合是否会改变本发明所选用抗-CD40抗体的反应性，将纯化的CD40-hIgG加至在未还原(NR)或已还原(R)条件下的SDS/PAGE(4-20％凝胶)上。依Laemmli的方法，使用微型凝胶系统进行SDS/PAGE。将分离的蛋白质转移至硝基纤维素膜上。使用含5％(w/v)脱脂奶粉的PBS封闭膜至少1小时后，才显色，使用各抗体为探针探 测1小时。使用HRP-缀合的山羊抗人类免疫球蛋白(稀释1∶8,000；Sigma，登录号A-8667)检测抗-CD40抗体。使用加强的Chemiluminescence(Amersham Bioscience)，依据制造商的指示对膜显色。
然后使用4种本发明抗-CD40抗体：21.4.1、23.25.1、23.29.1与24.2.1(1μg/ml)为探针，然后以HRP缀合的山羊抗人类IgG(稀释1∶8000)为探针，进行蛋白质印迹法。此实验结果示于图15。此结果显示，抗体21.4.1、23.25.1、23.29.1与24.2.1会结合未还原的CD40，但不结合已还原的CD40。因此，抗体识别空间表位。
抗-CD40抗体与删除人类CD40结构域的蛋白质的结合性：
CD40的细胞外区域包括4个类TNFR-重复结构域(称为D1-D4)。参见例如：Neismith与Sprang的TIBS23：74-79(1998)；van Kooten与Banchereau的J.Leukocyte Biol.67：2-17(2000)；Stamenkovic等人的EMBO J.8：1403-1410(1989)。图16显示小鼠与人类CD40结构域D1-D4的氨基酸序列。为了探讨CD40分子中不同区域对表位呈递的贡献，构建数种删除结构域的突变体。
为了制造人类CD40删除构建体，采用序列特异性引物进行PCR，由人类B细胞(CD19+)cDNA(多重组织cDNA组，登录号K1428-1，Clontech)扩增人类CD40的整个细胞外结构域(氨基酸1-193)，并在C-末端添加6XHis-标签。使用人类CD405′引物5′-GCAAGCTTCACCAATGGTTCGTCTGCCTCTGCAGTG-3′(SEQ ID NO：135)与不同3′引物的组合来克隆全长及截短的CD40分子。用于克隆人类CD40的全长细胞外结构域的3′引物为：5′-TCAGTGATGGTGATGGTGATGTCTCAGCCGATCCTGGGGACCA-3′(SEQ ID NO：136)。用于克隆人类CD40的D1-D3结构域的3′引物为：5′-TCAGTGATGGTGATGGTGATGTGGGCAGGGCTCGCGATGGTAT-3′(SEQ ID NO：137)。用于克隆人类CD40的D1-D2结构域的3′引物为：5′-TCAGTGATGGTGATGGTGATGACAGGTGCAGATGGTGTCTGTT-3′(SEQ ID NO：138)。所有此类截短的CD40cDNA的构建体形成后，则于293F细胞系 中，使用pCR3.1载体(Invitrogen)进行表达。CD40-6XHis融合蛋白质经镍柱洗脱纯化。
此4种删除突变体的氨基酸序列示于表33。
表33
CD40His-标签融合蛋白质
为了表达此类人类CD40删除构建体，将构建体克隆至pCR3.1载体中(Invitrogen)，于多种不同的稳定转染及瞬时转染的293F细胞系中分析其表达。取来自瞬时转染的293F细胞系的上清液，以ELISA与蛋白质印迹法分析其与抗体21.4.1、23.25.1、23.29.1及24.2.1的结合性。
取来自经不同CD40构建体转染的293F细胞的上清液进行ELISA分析法。在ELISA分析板上涂覆已于ELISA分析板涂覆缓冲液中稀释至1μg/ml的山羊抗人类CD40多克隆抗体(R&D，登录号AF632)或山羊抗小鼠CD40多克隆抗体(R&D登录号AF440)。使用生物素化的山羊抗人类CD40(R&D登录号BAF632)、山羊抗小鼠CD40(R&D登录号BAF440)、或HRP-缀合抗His(C末端)抗体(Invitrogen，登录号46-0707)检测，以确认CD40构建体于293F细胞中的表达。使用稀释至1：2000的HRP缀合山羊抗人类IgG(FC特异性Caltag H10507)检测抗CD40人类抗体的结合性。其结果示于表34，其显示，mAbs21.4.1、23.28.1与23.29.1所识别的大多数(若非全部)表位位于CD40的D1-D2区中，而mAb24.2.1的表位至少部份位于结构域D3-D4中。使用人类CD40-兔子Fc融合蛋白质作为对照组，以确认抗体结合性的特异性。
表34
ELISA：抗体与CD40删除突变体的结合性
也使用蛋白质印迹分析法分析CD40删除构建体。其结果示于表35。ELISA结果显示，抗体21.4.1、23.25.1、23.29.1与24.2.1的结合位置涉及结构域D1-D3。其结果也显示抗体21.4.1、23.25.1与23.29.1的结合位置涉及结构域D1-D2，且抗体24.2.1的结合位置涉及结构域D3。
表35
蛋白质印迹分析法：抗体与CD40删除突变体的结合性
抗-CD40抗体与小鼠CD40的结合性：
确定抗体21.4.1、23.25.1、23.29.1与24.2.1结合小鼠CD40的能力。
此实验中，由小鼠B细胞cDNA扩增小鼠CD40。克隆小鼠CD40(D1-D3)-6xHis融合蛋白质至pCR3.1中，其利用CMV启动子驱动转录作用。用于克隆小鼠CD40的细胞外结构域的5′引物为：5′-TGCAAGCTTCACCATGGTGTCTTTGCCTCGGCTGTG-3′。用于克隆小鼠CD40的D1-D3结构域的3′引物为：5′-GTCCTCGAGTCAGTGATGGTGATGGTGATGTGGGCAGGGATGACAGAC-3′。用小鼠与人类cDNA构建体瞬时转染至293F细胞中。采用ELISA法，使用针对小鼠与人类CD40的多克隆抗体、抗His抗体与抗-CD40抗体21.4.1、23.25.1、23.29.1及24.2.1检测重组CD40的表达。此类实验结果示于表36。此实验显示，所有抗体均特异性针对人类CD40，并未与小鼠CD40交叉反应。
表36
小鼠与人类CD40的交叉反应性
抗-CD40抗体与人类/小鼠嵌合性CD40的结合性
由于抗体21.4.1、23.25.1、23.29.1及24.2.1不会结合小鼠CD40，因此构筑人类/小鼠嵌合性CD40蛋白质，以更确定地对此类抗体的表位的进行作图。
为了构建人类与鼠类CD40嵌合性蛋白质的按读码框的融合体，使用人类与小鼠CD40两种cDNA上相同位置上的CD40结构域边界处唯一的限制性酶切位点。使用结构域1的末端(核苷酸244，氨基酸64)EcoRI限制性酶切位点，及结构域2的末端(核苷酸330，氨基酸94)BanI限制性酶切位点，产生不同cDNA构建体(图17)。
采用PCR扩增不同CD40结构域，并连接。此方法可以将小鼠CD40的各种不同结构域换成来自人类CD40的同源性结构域。所得构建体示于图18。
然后利用ELISA测定抗体21.4.1、23.25.1、23.29.1与24.2.1是否可以结合小鼠/人类嵌合性CD40蛋白质。实验结果示于表37。由表37可见，mAbs21.4.1与23.25.1可识别的表位部份位于D1，部份位于D2；mAb23.29.1所识别的表位大部份(若非全部)位于D2；及mAb24.2.1所识别的表位位于D2及D3。
表37
与嵌合性CD40蛋白质结合的抗体
本说明书所摘录的所有公开案与专利申请案的内容已以引用的方式并入本文中，该引用的程度就如同已特定地及个别地将各个公开案或专利申请案的内容以引用的方式并入本文中一般。虽然上述本发明已利用实施例详细说明，供进一步了解，但本领域技术人员应了解，可依据本发明的教导，在不偏离本发明精神或范围内，进行某些改变与修改。

Claims (19)

1.一种特异性结合及活化CD40的人单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体的重链的CDR1、CDR2与CDR3的氨基酸序列和所述抗体的轻链的CDR1、CDR2与CDR3的氨基酸序列是分别地，ATCC保藏编号为PTA-3600的单克隆抗体3.1.1的重链CDR1、CDR2与CDR3的氨基酸序列和轻链的CDR1、CDR2与CDR3的氨基酸序列。
2.根据权利要求1的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述重链的可变区氨基酸序列和所述轻链的可变区氨基酸序列选自下列：
a)分别地，ATCC保藏编号为PTA-3600的3.1.1的重链可变区的氨基酸序列和轻链可变区的氨基酸序列；
b)分别地，3.1.1H-A78T的重链可变区的氨基酸序列和轻链可变区的氨基酸序列，其中所述3.1.1H-A78T的重链和轻链氨基酸序列与3.1.1的重链和轻链氨基酸序列相同，除了在重链序列的残基78上的丙氨酸换成苏氨酸；
c)分别地，3.1.1H-A78T-V88A-V97A的重链可变区的氨基酸序列和轻链可变区的氨基酸序列，其中所述3.1.1H-A78T-V88A-V97A的重链和轻链氨基酸序列与3.1.1重链和轻链氨基酸序列相同，除了在重链序列的残基78上的丙氨酸换成苏氨酸、残基88上的缬氨酸换成丙氨酸并且残基97上的缬氨酸换成丙氨酸；
d)分别地，3.1.1L-L4M-L83V的重链可变区的氨基酸序列和轻链可变区的氨基酸序列，其中所述3.1.1L-L4M-L83V的重链和轻链氨基酸序列与3.1.1的重链和轻链氨基酸序列相同，除了在轻链序列的残基4上的亮氨酸换成甲硫氨酸、残基83上的亮氨酸换成缬氨酸；
e)分别地，3.1.1H-A78T/3.1.1L-L4M-L83V的重链可变区的氨基酸序列和轻链可变区的氨基酸序列，其中所述3.1.1H-A78T/3.1.1L-L4M-L83V的重链和轻链氨基酸序列与3.1.1重链和轻链氨基酸序列相同，除了在重链序列的残基78上的丙氨酸换成苏氨酸、在轻链序列的残基4上的亮氨酸换成甲硫氨酸、残基83上的亮氨酸换成缬氨酸；和
f)分别地，3.1.1H-A78T-V88A-V97A/3.1.1L-L4M-L83V的重链可变区的氨基酸序列和轻链可变区的氨基酸序列，其中所述3.1.1H-A78T-V88A-V97A/3.1.1L-L4M-L83V与3.1.1重链和轻链氨基酸序列相同，除了在重链序列的残基78上的丙氨酸换成苏氨酸、残基88上的缬氨酸换成丙氨酸并且残基97上的缬氨酸换成丙氨酸，在轻链序列的残基4上的亮氨酸换成甲硫氨酸、残基83上的亮氨酸换成缬氨酸。
3.单克隆抗体，其中所述抗体的重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列为：
a)分别地，ATCC保藏编号为PTA-3600的3.1.1的重链的氨基酸序列和轻链的氨基酸序列；
b)分别地，3.1.1H-A78T的重链的氨基酸序列和轻链的氨基酸序列，其中所述3.1.1H-A78T的重链和轻链氨基酸序列与3.1.1的重链和轻链氨基酸序列相同，除了在重链序列的残基78上的丙氨酸换成苏氨酸；
c)分别地，3.1.1H-A78T-V88A-V97A的重链的氨基酸序列和轻链的氨基酸序列，3.1.1H-A78T-V88A-V97A具有与3.1.1相同的重链和轻链氨基酸序列除了在重链序列的残基78上的丙氨酸换成苏氨酸，残基88上的缬氨酸换成丙氨酸并且残基97上的缬氨酸换成丙氨酸；
d)分别地，3.1.1L-L4M-L83V的重链的氨基酸序列和轻链的氨基酸序列，其中所述3.1.1L-L4M-L83V的重链和轻链氨基酸序列与3.1.1的重链和轻链氨基酸序列相同，除了在轻链序列的残基4上的亮氨酸换成甲硫氨酸、残基83上的亮氨酸换成缬氨酸；
e)分别地，3.1.1H-A78T/3.1.1L-L4M-L83V的重链的氨基酸序列和轻链的氨基酸序列，其中所述3.1.1H-A78T/3.1.1L-L4M-L83V与3.1.1的重链和轻链氨基酸序列相同，除了在重链序列的残基78上的丙氨酸换成苏氨酸、在轻链序列的残基4上的亮氨酸换成甲硫氨酸、残基83上的亮氨酸换成缬氨酸；和
f)分别地，3.1.1H-A78T-V88A-V97A/3.1.1L-L4M-L83V的重链的氨基酸序列和轻链的氨基酸序列，其中所述3.1.1H-A78T-V88A-V97A/3.1.1L-L4M-L83V与3.1.1的重链和轻链氨基酸序列相同，除了在重链序列的残基78上的丙氨酸换成苏氨酸、残基88上的缬氨酸换成丙氨酸并且残基97上的缬氨酸换成丙氨酸，在轻链序列的残基4上的亮氨酸换成甲硫氨酸、残基83上的亮氨酸换成缬氨酸。
4.一种特异性结合及活化CD40的人单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体的重链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列是SEQ ID NO：2的CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列以及所述抗体的轻链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列是SEQ ID NO：4的CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列。
5.权利要求4的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体的重链可变结构域氨基酸序列和轻链可变结构域氨基酸序列选自：
a)分别地，SEQ ID NO：2的氨基酸序列，以及SEQ ID NO：4的氨基酸序列；
b)分别地，SEQ ID NO：2的氨基酸序列，以及SEQ ID NO：94的氨基酸序列；
c)分别地，SEQ ID NO：90的氨基酸序列，以及SEQ ID NO：4的氨基酸序列；
d)分别地，SEQ ID NO：90的氨基酸序列，以及SEQ ID NO：94的氨基酸序列；
e)分别地，SEQ ID NO：92的氨基酸序列，以及SEQ ID NO：4的氨基酸序列；和
f)分别地，SEQ ID NO：92的氨基酸序列，以及SEQ ID NO：94的氨基酸序列。
6.单克隆抗体，其中所述抗体的重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列分别为氨基酸序列SEQ ID NO:6与氨基酸序列SEQ ID NO:8,其中两个氨基酸序列都不具有信号序列。
7.单克隆抗体，其中所述抗体的重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列分别为：
a)SEQ ID NO:6所示的不具有信号序列的氨基酸序列，其中成熟序列中残基78从丙氨酸变成了苏氨酸，成熟序列中残基88从缬氨酸变成了丙氨酸，并且成熟序列中残基97从缬氨酸变成了丙氨酸，和
b)SEQ ID NO:8所示的不具有信号序列的氨基酸序列，其中成熟序列中残基4从亮氨酸变成了甲硫氨酸，并且成熟序列中残基83从亮氨酸变成了缬氨酸。
8.根据权利要求1－7中任一项的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗体或其抗原结合部分具有至少一种选自下列的性质:
a)不与小鼠、大鼠、狗和/或兔子B细胞结合；
b)会与人类、猕猴和/或恒河猴B细胞结合；
c)其对CD40的选择性比其对核因子κ-B受体激活剂、4-1BB、肿瘤坏死因子受体-1及肿瘤坏死因子受体-2的选择性高出至少100倍；
d)其与CD40结合的KD为4x10-10M或以下；
e)其与CD40的Koff为2x10-4s-1或以下；
f)于活体内，于人类T细胞和/或人类树突细胞的存在下抑制肿瘤生长；
g)于没有人类免疫细胞下，抑制CD40-阳性肿瘤生长；
h)提高人类B-细胞表面上ICAM、MHC-II、B7-2、CD71、CD23和/或CD71的表达；
i)提高人类树突细胞分泌IL-12p40、IL-12p70和/或IL-8；
j)提高人类树突细胞表面上ICAM、MHC-II、B7-2和/或CD83的表达；
k)在同种异基因刺激作用期间，提高人类T细胞的干扰素-γ的表达；
l)可于人类CD40L的存在下与人类CD40结合；及
m)会与CD40的细胞外结构域的结构域1、结构域2或结构域3中所含的人类CD40的表位结合。
9.根据权利要求1、2、4和5中任一项的抗原结合部分，其是一种Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段或单链抗体。
10.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-9中任意一项的单克隆抗体或抗原结合部分，以及药物可接受的载体。
11.根据权利要求1-9中任意一项的单克隆抗体或抗原结合部分在制备药物中的用途，其中所述药物用于治疗人类受试者中的乳腺癌、甲状腺癌、慢性白血病或非何杰金氏淋巴瘤。
12.根据权利要求1-9中任意一项的单克隆抗体或抗原结合部分在制备药物中的用途，其中所述药物用于增强人类受试者中的免疫反应。
13.根据权利要求1-9中任意一项的单克隆抗体或抗原结合部分在制备药物中的用途，其中所述药物用于治疗人类受试者CD40阴性肿瘤。
14.一种分离的细胞系，其产生根据权利要求1-9中任意一项的单克隆抗体或抗原结合部分。
15.一种分离的核酸分子，其包含编码根据权利要求1-9中任意一项的单克隆抗体或抗原结合部分的重链或其抗原结合部分的核苷酸序列，以及编码根据权利要求1-9中任意一项的单克隆抗体或抗原结合部分的轻链或其抗原结合部分的核酸序列。
16.根据权利要求15的分离的核酸分子，其中该核酸分子包含：
选自下列的重链核苷酸序列：SEQ ID NOS:1、5、89和91；和选自下列的轻链核苷酸序列：SEQ ID NOS:3、7和93，或如果存在，不具有编码信号序列的核苷酸序列的所述序列。
17.一种载体，其包含编码根据权利要求1－9中任意一项的抗体或抗原结合部分的重链或其抗原结合部分的核酸序列以及编码根据权利要求1－9中任意一项的抗体或抗原结合部分的轻链或其抗原结合部分的核酸序列，其中该载体任选地包含与所述核酸序列之一或两者可操纵性连接的表达控制序列。
18.一种宿主细胞，其包含编码根据权利要求1－9中任意一项的抗体或抗原结合部分的重链或其抗原结合部分的核酸序列以及编码根据权利要求1－9中任意一项的抗体或抗原结合部分的轻链或其抗原结合部分的核酸序列；或根据权利要求17的载体。
19.一种制造特异性结合并活化CD40的抗体或其抗原结合部分的方法，其包括使根据权利要求18的宿主细胞或根据权利要求14的细胞系于适当条件下培养，并回收该抗体或抗原结合部分。
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