HU229829B1 - Antibodies to cd40 - Google Patents

Antibodies to cd40 Download PDF

Info

Publication number
HU229829B1
HU229829B1 HU0402247A HUP0402247A HU229829B1 HU 229829 B1 HU229829 B1 HU 229829B1 HU 0402247 A HU0402247 A HU 0402247A HU P0402247 A HUP0402247 A HU P0402247A HU 229829 B1 HU229829 B1 HU 229829B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
antibody
antibodies
human
sequence
amino acid
Prior art date
Application number
HU0402247A
Other languages
English (en)
Inventor
Vahe Bedian
Ronald P Gladue
Jose Corvalan
Xiao-Chi Jia
Xiao Feng
Original Assignee
Pfizer Prod Inc
Amgen Fremont Inc Fremont
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=23370387&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU229829(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Pfizer Prod Inc, Amgen Fremont Inc Fremont filed Critical Pfizer Prod Inc
Publication of HUP0402247A2 publication Critical patent/HUP0402247A2/hu
Publication of HUP0402247A3 publication Critical patent/HUP0402247A3/hu
Publication of HU229829B1 publication Critical patent/HU229829B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
    • A61N5/00—Radiation therapy
    • A61N5/06—Radiation therapy using light
    • A61N5/0613—Apparatus adapted for a specific treatment
    • A61N5/062—Photodynamic therapy, i.e. excitation of an agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
    • A61N5/00—Radiation therapy
    • A61N5/10—X-ray therapy; Gamma-ray therapy; Particle-irradiation therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/117—Nucleic acids having immunomodulatory properties, e.g. containing CpG-motifs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

A CD40 antigén egy 5Ö kDa-os sejtfelszíni glíkoprotein. amely a tumor nekrózis faktor receptor (WF-Rj családba tartozik: [St&menkovíc és mtsai: EMBG Journal 8, 1403-1410 Ü989)L A CD40 számos normál és tumor sejttípusban expresszálódik, beleértve a B-limfoeitákat. a dendrites sejteket, a monocitákat, a makroíágokat, a tímuszos epitélíumot, az endoteliáiis sejteket, a fibrobfesztokat és a simaizom sejteket [Faulie, 8. és másai: Cancer Immunot Immunother. 20. 23-8 (1985); Alderson, M. R. és mxsai: J. Exp. Med. 128. 669-74 (1993): Ruggiero, G. ésmtsai: J. of Immunot 156, 3737-3746 (19961; Hollenbaugh D, és mtsai: j, Exp. Med. 182, 33-40 Π9951: Yellm, M.J. és mtsai: J. Leukocyte Biot 58, 209-216 (1995): Lazaar A. L. és mtsai: J. of ímmtmol: 161, .3120-7 Í1998|, A GD4Ö az összes limfómában és a szolid tumorok 70%-áfean expresszálódik. Bar konstitutív© expresszálódik, a CB4Ö felerősödik az antigént; prezentáló sejtekben az érési szignálokkal, azaz például az LPS-szei, az Ínterleukin-IBva.l, az ΪΡΝγ-val és a granuiocíta makrofág telepserkento faktorral.
A CD40 aktiválás kritikus szerepet játszik a humorálls és cellulórís immunválaszok szabályozásában. A CD40 aktiválás nélküli antigén prezentáció toleranciába vezethet, mág a CD4Ö szignál képes visszafordítani az ilyen toleranciát, fokozza, az összes antigént prezentáló sejt (ARC) antigén prezentációját, segítő citokinek és kemokinek szekréciójához vezet, fokozza a knsíim uláeiós estpresszioí és jelátvitelt*. és stimulálja az immunsejtek cítolkikus aktivitását.
A CD4Ö kritikus szerepet játszik a B-sejtek szaporodásában. érésében és osztály-váltásában [Foy T.M. és mtsai; Annusb Revfow of Immunofogy 14, 591-617 (1996)). A €D40 jelátviteli hfoszintézis üt abnormális szérum immunglobulin izotípus •eloszlást, a CD4+ T-sejt beindítás hiányát és a szekunder humorális válaszok hibáit eredményezi. Például az X-kapcsolt hiper-IgM tünetegyütíes a humán CD40L génben levő mutációhoz kapcsolódik, es ezt az jellemzi, hogy az érintett egyebek csak IgM izotípusü ellenanyagokat képesek termelni, jelezve ezzel, hogy a €D40 és a €D40k kozott produktív kölcsönhatásra \ac ^zurseg eg\ effektn 'mmunváJaszno”.
A CD4Ö-nek a CD4ÖL által való bekapcsolása vezet a €040 citoplazmatikus doniénje és a TRAF-ok (TNF-R-rel asszociálódó faktorok) asszoeiálódásához [Lee H.H. és mtsai; Proceedings of the Manonal Academy of Sciences, USA 96, 1421-6 [1999]; Mfen S. S. és mtsai; Bfochemístry 37, 11836-45 (1998); Grammar A, és mtsai: J. of immunoi. 161, 1183-93 (1998); ísbída, T. K. és mtsai: Proceedings of the Radonul Academy of Sciences, USA 93, 9437-42 (1996); Pulién S.S. és mtsai: Journal of Biologícal Cbemístry 274, 14246-54 (1999)]. A TRAF-okkal való kölcsönhatás mind az HFtS, mind a. Jun/ABl bioszimézís utak aktiválásában tetőzhet |Tsukamoto Fh és mtsai; Proceedings of the National Academy of Sciences, VSA 96, 1234-9 (1999);
Sutberland, C. L, és mtsai; V. of Immunoi. 162, 4720-30 (1999)j, A sejttípustól függően ez a jelátvitel a cífcokinek fokozott szekréciójához: vezet, azaz például az ínterfcokm-6 [deppscn J.D. és mtsai; J. of Immunoi, 161, 1738-42 (1998);: Vejlma ¥ és mtsai;
*·»** V <· •· *:
♦ ♦· (
·* >
♦ *
** löt. Arab. of Alfergy & Immunok 1 I.Q, 225-32 (1996); ínterfeukin8 [Gruss X. 3. és mtsai: Bfood 84, 2305-14 (1993y wn Leoprechting A. és mtsai: Caacer Research 59, 1287-94 (1999); Denfeld R. W. és mtsai: Eur. J. Immunoi. 26, 2329-34 (1996),, az az ínterlenkin~12 {Cella hh és mtsai: dó Exp. IfeeL 184, 747-752 (19969 Feriin W. G. és misak Eur, d. Immunoi. 28, 525-31 (ImOSk Armant: kk és mtsak Búr. J. Immunoi 26, 1430-4 (1996); Koch F. és mtsai: J. Exp. Med. 184, 741-6 (1996); Seguin R. és k,FL Kasper: d,. Infect. Di.s. 179, 467-74 (1999(:. Chaussafeel D. és mtsai: Infectíon and Immunity 67, 1929-34 (1999)], mtefoeukin15 jKuniyoshí J. S. és mtsai: Cellular Immunoi 193, 48-58 (1999)] és kemökmek (SfiPM ΜΙΡΙβ, RANTBS és mások) fklcDyer 3.F.. és mtsai: 3, of Immunoi 1.69, 3711-7 (1999): Sehamel és mtsai: d. Bxp. Med.. 1.88,. 451-63 (1998); Altehhurg, A. és mtsai: d. oi Immunok 169,. 4140-7 (1999); Deckers »J, G, és mtsai: d. Am. Soc. Nephrok 9, 1187-93 [1998)] szekrécióját fokozza, valammf fokozza az MXC les és δ-es osztály expresszióját [Santos-Argumedo 1. és mtsai:. Cellular Immunoi,. 156, 2 TESS (1994)(, és fokozza, a tapadási molekulák (azaz például az: ICÁM): expresszióját [Lee H,H, és mtsai:: Froceedlngs of the National Academy oí Sciences, USA 96, 1421-6 (19999 Grousson 3. és mtsai: Árehives of Dermatoi, Rés. 299., 325-330 (1998); Kaíada V. és mtsai: Eur. 3. Immunok 26, 192-209 (1996); Mavumi M. és mtsai: d, Ategv Clín. Immunoi.. 96, 1136-44 (1995); Elores-Romoóh. és mtsai: Immunok 79, 445-451 (1993|, valamint a ko-stimuláciés molekulák (azaz például a BT) expresszióját (Rov M. és mtsai: Búr. d, Immunok 25, 596-603 (1995); Jones W. W. és C, 3. Eacketi: Cellular immunok 174, 4253 (1996); Gaux C> és mtsai: 3. Bxp. Med. 13Ö, 1263-72 (1994);:
I *'·» ·Χ < «««--» Λ, * « * * '« * * ♦ * ;* ♦ · χ· -« * ♦♦·* Χλ· .+4 χ>+φ
Kieaer Ρ.Α. és mtsai: d. of Immunot 155, 4917-25 (1995)]. A CD4Ö bekapcsolásával indukált, eifcokínek fokozzák & T-sejtek túlélését és aktiválását.
A eeSuláris és immunfunkelők fokozása mellett a CD4Ö aktiválás hatásai kosé tartozik: a sejtek összegyűjtése és differenciálása fcemokirtekkel és oitekínekkel; a tnonoeíták aktiválása, a ekolífikus T-Kmfociták (CTL) és természetes ölősejtek CNK) fokozott cítolitikus aktivitása, az apoptózis indukálása CD40 pozitív tumorokban: a CD4Ö pozitív tumorok immunogemtásának fokozása; és tomor-specifikus ellenanyag termelése. A CD40 szerepe a sejtek által végrehajtott immunválaszban szintén ki van dolgozva, a szakirodalomban össze van foglalva (Grewatl és mtsai: Aonual Revíevv of fmmunolögy 16, 111-35 (1996); Mackey és mtsai: d. 1-eukoeyte Biot 63, 418-28 (1998); Hoelle R.J.: Agents 8s Aetions - Suppl. 49. 17-22 (1998)1.
A kereszt-inditásos modellrendszerrel végzett vizsgálatok azt mutatták, hogy az APC-k CB40 aktiválása helyettesíteni tudja a cítolitikus 7-límfocíta (CTL) generálásának segítő 7~sejt szűkségleretét (Benneit és mtsai: Natúré 393, 478-48Ö (1998)]. A CD4ÖL defíciens egerekkel kapott bizonyítékok azt mutatják, hogy világosan szükség van. a CD40 jelátvitelre a segítő T-sejlek beindításakor [Grewal I.S. és mtsai.: Science 273, 1864-7 (1996); Grewal,. I.S. és mtsai: Natúré 378, 617-20 (1995)]:.. A GD4Ö aktiválás az egyébkéné éolerogén antigén-hordozó δ-sejteket kompetens APC-kké alakítja, át (Bubim,ann ,d,B. és mtsai; Im.muniéy 2, 645-53 (1995)]. A CD40 indukálás indukálja a zsinór vér elődsejtek dendrites sejtekké való érését és differenciálódásáé [Ffores-Romo !·. és mtsai: J, Bxp. >fcd. 185, 341-9 (1997); Mackey ML F. és mtsai; d, of tmm;uttöl. 161, 2094-9 (1998)). A CD4Ö aktiválás emellett indukálja a monocüák funkcionális dendrit sejtekké történő differenciálódását (Brossait. P. és mtsai: Blood 92, 4238-4? (1998)), Emellett a CD4ö aktiválás fokozza az NK sejtek citolitikus aktivitását az APC-CD40 által indukált oitokineken keresztül fCarbone S. és Húsár J. Exp. Med.
185., 2Q53-6Ö (1997); Martín-Ponteeha. A,. és rotsai: di cf Immunok 162, 5910-6 (1999)1 Ezek a megbgyelések azt mutatják, hogy a CD40 esszenciális szerepet játszik az immunválaszok indukálásában és fokozásában, az APC érésének indakutasával, a segítő citokinek szekréciójával, a ko-stimuláiő molekulák felerősítésével, és az eífokfor funkciók fokozásával.
A CD40 jelátvitel kritikus szerepe a Immorális és citotoxíkus immunválaszok iniciálásában és. érésében ezt a rendszert az immunfokozás ideális célpontjává teszi. Az ilyen fokozás különösen fontos leket a tumor antigének ellen hatékony immunválaszok kiváltásában, melyeket az immunrendszer általában az aktivált APC-k kereszt-mdításával mutat be (Buang A. ¥. és mtsai: Ciha Foundation Symp. 187, 229-44 (1994): Toes R,E:.kh és mtsai: Serainars ín immunoi.. .10, 443-8 (1998): Albert. M.X, és mtsai: Natúré 392, 86-9 (1998): Benned. S.R. és mtsai: Jí Emu Med. 186, 65-70 (1997)].
Számos csoport demonstrálta a CD4Ö aktiválás hatékonyságát a tnmorellenes válaszokra m. fetm és in fom (Toes RJBLM, és mtsai: Semínars in Immunoi. 10. 443-8 (199811. Vesesejt karcinóma tüdő áttétes modelljével és virálisan transzformált sejtek szubkntán tumorjaival két csoport luggeáenul demonstrálta, hogy a CD40 aktiválása képes visszafordítani a tumor-specifikus antigének elleni toleranciát, amely T-sej tek hatékony tumorellenes indítását eredményezi (Sotomayor E.M. és mtsai: Natúré
Medícine 5, 786-787 ö.999k Díebl L, és mtsab híature Medicine 5, 774-9 11:999)1... Az immunsejtefe távoilétében is leírtak: tumoréilenes aktivitást CD4Ö1 és mtí-CD4ö ellenanyag kezeléssel humán emlőrák vonalban, SC1D egerekben |Hirano és mtsai: Bfeod 93, 2999-3007 (10990. A CD40 anti-€O4G ellenanyaggal való aktiválásáról nemrég mutatták ki, hogy egérmodehekhen eltörli a. €D4Ö* és C©4G-Í»fómat (Frencfe R.B:, és. mfcsai: Batee Medícine 5, 548-53 (1999)]. Emellett Glennie és munkatársai korábbi vizsgálatai arra a következtetésre jutottak, hogy az antiCD40 ellenanyagokkal való jeláiadásí aktivitás hatékonyabb az In vivő tumor kiürülés indufcálásában, mint más, elektorok gyűjtésére képes anti-sejtfelszíni markor ellenanyagok (Tuti A. L, és mtsai; J. of Immunot 151, 3176-85 (1998)1, Ezekkel a megagyűlésekkel összhangban, ha anttCD4ö ellenanyagoknak m rivo vizsgáljuk a CD9O tumérsejtek elleni aktivitását, akkor a legtöbb, de nem az összes tumoricid aktivitás asszocíálödik a Cö4ö jelén méhez, de az ABCC-hez nem fFunakoshi S. és mtsai: ÓL Immunorber Emphasis Tumor Immunoi,. 19, 93-101 (19969. Egy másik vizsgálatban csontvelő dendrites sejteket kezeltek: ex Geo, számos különböző szerrel, és vizsgálták in vivő tumorellenes hatását. Ezek a vizsgálatok azt demonstrálták, hogy a CD40L-lel stimulált DC-k a legérettebb és leghatékonyabb sejtek, amelyek tűm őrei lenes választ váltanák ki,
A CD4Ö esszenciális szerepét is demonstrálták a tumnrellenes immunitásban, összehasonktva a vad-típusu és CB4Ö-/egerek tumor vakcinákra adott válaszát. Ezek a vizsgálatok azt mutatják, hogy a CD4Ö-/· egerek nem képesek elérni a normál egerekben megfigyelt tumor immunitást jMaekey M, F., és mtsai:: Cancer Research 57. 2569-74 (1997)]. Egy másik vizsgálatban a ** ti «.
* « tumorhordozó egerekbe! származó s^pi.eaocitákat stimuláltak tumorsejtekkel és ex vívó aktiváld aoti-CD4ö ellenanyagokkal kezelték éket, és kimutatták róluk, hogy fokozott lumor-speeifitat CTL aktivitással rendelkeznek (Donepudi M. és mtsak Cancer Immunok Immunother, 48, 153-164 (1999)1 Ebek a vizsgálatok azt demonstrálják, hogy a CD4Ö kritikus. pozíciót foglal el a tumorefienes: Immunitásban·,. mind. a CD40 pozitív, mind a CD40 negatív tumorokban. Mivel a CD40 expresszálődik limfómákban, leukémiákban, többszörös mielőmában, a legtöbb nasopharynx-, hólyag-, petefészek- és máj-kareindmában, valamint néhány emlő és kölerektáfe rákban, a CD40 aktiválásának széles klinikai alkalmazása lehet.
Az antí-CDAO aktiváló monoöonálís ellenanyagok hozzájárulhatnak a tumor kiirtásához, különböző fontos mechanizmusokkal, Ezek közül a legelső a gazda dendrites sejtek aktiválása a fokozott tumor antigén processzáláshoz és prezentáláshoz, valamint; a CD4Ö pozitív tumorsejtek fokozott antigén prezentációjához vagy immtmogenitásához, ami a tumor-specifikus €D4 és CD 8* iímfoeiták .aktiválásához vezet., A további tumorehenes aktivitást a CD40 jelátvitel más immunfökozö hatásaival (kemokinek és eitofcínek termelése, monoeiták összegyűjtése és aktiválása és fokozok; CTL és NK cifoluikus aktivitási valamint a CD4Ö* tumorok közvetlen elpusztítása apoptózis iodekáiásával, vagy az ADCC-hez vezető humorális válasz stimulálásával lehet közvetíteni, Az apoptetikos és pusztuló tumorsejtek is a tumor-specifikus antigének fontos forrásaivá válnak, melyeket, a CD4Ö~nel aktivált AFC-k processzálnak és mutatnak be.
Ennek megfelelően komoly szükség van terápiás, klínikailag releváns aníi~CD4Ö agooista ellenanyagokra.
*·
Á2 alábbiakban részletesen .ismertetjük a mellékelt ábrákat
Az 1Ά-- 1H, ábrák az Izolált anti-€D40 monoMonália ellenanyag· könnyű lánca és nehéz lánca variábilis doménjei megjósolt amínosav szekvenciáinak a megfelelő könnyű lánc és nehéz lánc gének csíravonal aminosav szekvenciáival való illesztése látható. A klánok és a csiravonal szekvencia közötti különbségeket árnyékolással jelöljük. A csiravonal ODRI. CDR2 és CDR3 szekvenciák alá vannak hűzva. A nehéz lánc szekvenciák: illesztésekor a CDR3 régióba történő, szemmel látható inszerciókat kötőjellel (-) jelezzük a csíravonal szekvenciáhanj a CDR3 régióból történő szemmel látható deleoiókat a klón szekvenciájában jelöljük kötőjellel <-).
IÁ. ábra: A 3.3,3 és 7'. 1.3 monoklonális ellenanyagok variábilis régiói megjósolt kappa könnyű lánc amínosav szekvenciái a Vk «Α3/Α19 és J«Jk1 gén csiravonal amínosav szekvenciákkal.
IB. ábra: A 15.1.1 monokionáSs ellenanyag variábilis regiója megjósolt kappa könnyű lánc amínosav szekvenciája, és a csíravonal amínosav szekvencia (W “A3/Ai9: és dKJte2).
IC. ábra: A 10,8,3 és 21.4.1 monokionális ellenanyagok variábilis régiói megjósolt kappa. könnyű lánc amínosav szekvenciái, és a csiravonal amínosav szekvencia (Vk ML5 (DPS) és
ID, ábra: A 3,1.1 monoklonáKs ellenanyag variábilis régiója megjósolt, nehéz lánc amínosav szekvenciája. és a csíravonal amínosav szekvencia (Vjr^S-SG^fDP-APj, Ö-D4-VDIR.3 és 3=3η6);:
IE. ábra: A 7,1.2 monoklonális ellenanyag variábilis régiója megjósolt nehéz lánc amínosav szekvenciája, és a csiravonal aminosav szekvencia (¥s~3-3Üv(öP-49j, D~DIR5+DI -26 és
IF, ábra: A 10.83 monoktoális ellenanyag variábilis régiója megjósolt nehéz lánc aminosav szekvenciája^ és a csíravonal aminosav szekvencia (Vh=4,35 (VIV-4), D=DÍR3 és 3~ Jobb
IG, ábra; A 15.1.1 monoklonáhs ellenanyag variábilis régiója megjósolt nehéz lánc aminosav szekvenciája, és a csíravonal aminosav szekvencia (VhM-SÖ íDP-71j, D~D4~23 és J=4h4| és
18. ábra; A 21,4..1 m.onoklonálls ellenanyag variábilis: régiója megjőseit nehéz lánc aminosav szekvenciája, és a csíravonal aminosav szekvencia (MM 432 (DP-75K BriKRl és
A 2Á-2H, ábrán az izolált anti-GD40 monoklonálís ellenanyag könnyű lánca és nehéz lánca ‘variábilis doménjei megjósolt aminosav szekvenciáinak a megfelelő könnyű lánc és nehéz lánc gének csiravonál aminosav szekvenciáival való illesztése látható. A klánok és a. csiravonal, szekvencia közötti különbségeket vastagitássai jelöljük:. A csaavonal ODRI., CDR2 és CDR3 szekvenciák alá vannak húzva. A nehéz lánc szekvenciák illesztésekor a CDR3 régióba történő, szemmel látható ínszerciékat kötőjellel (··) jelezzük a csíravonal szekvenciában.,, a CDR3 régióból történő szemmel látható deléciökat a klón szekvenciájában jelöljük kötöj ellel R.
2A. ábra; A 22.1.1. 23.5.1 és 23.29.1 monoklcnális ellenanyagok variábilis régiói megjósolt kappa könnyű lánc aminosav szekvenciái és a Vk =á3/A10 és JMvl csiravonal aminosav szekvencia.
-χ· Λ
ΦΦ #·♦·***ΦΦ
2δ, ábra: A 21,2,1 monokionális ellenanyag variábilis régiója megjósolt kappa könnyű lánc aminosav szekvenciája, és a csíravonal amínosav szekvencia (Vk =A3/A19: és
2C, ábra.: A 23.28,1, 23.28.1L--C92A és 24/2.1 monokionális ellenanyagok variábilis régiói ínegjósált kappa könnyű lánc aminosav szekvenciái, és a csíravonal amínosav szekvencia (Vk -A27 és J~Jk2).
2D. ábra; A 21,2.1 monokionális ellenanyag variábilis régiója megjósolt nehéz lánc amínosav szekvenciája, és a csíravonal amínosav szekvencia (¥h=3-30+,: B~ DIB3+D6-19: és
2E. ábra; A 22.1.1, 22.1.IH-C139A monokionális ellenanyag variábilis régiója megjósolt nenéz lánc amínosav szekvenciája, és a csíravonal amínosav szekvencia (Vh-3~3ö+, D~D 1-1 és
2F, ábra: A 23.5.1 monokionális ellenanyag variábilis régiója megjósolt nehéz lánc amínosav szekvenciája, és a esíravona! amínosav szekvencia (¥«=3-3O+, D=D4~ 1.7 és 3::::Jh6);
2G, ábra: A 23,29.1 monokionális ellenanyag variábilis régiója megjósolt nehéz lánc amínosav szekvenciája, és a csí.rs.von.ai amínosav szekvencia (Vh~3~3ö,.3s D=D4-17 és JnJkó);
2K. ábra: A 23,23,1, 23,28liK-OlbS és 24.2,1 monokionális ellenanyag variábilis régiója megjósolt nehéz lánc amínosav szekvenciája, és a csíravonal amínosav szekvencia. (V:-{=4-59, D=D1K1+D4-17 és 3«Ja5),
A 3, ábra egy dózis-hatás görbe, amely illusztrálja egy találmány szerint CD4Ű ellenanyagnak (21,4,1( azt a képességét,, hogy fokozza a humán dendrites sejtek IL-12p40 termelését.
-*·« <· ♦ * ί: :, «, *·*· ♦
Α 4. ábra egy dózis-hatás görbe, amely illusztrálja egy találmány szerint CD4G ellenanyagnak (21.4.1) azt a képességét, hogy fokozza a humán dendrites sejtek IL-12p7ö termelését.
Az 5. ábra egy grafikon, amely illusztrálja egy találmány szerint CD40 ellenanyagnak (21.4,1) azt a képességét, hogy fokozza a dy stímnlátor sejtek immunogenítását és fokozza, a. dy célsejtek elleni CTL aktivitást.
A 6. ábra egy tumomövekedés gátlás! görbe, amely illusztrálja a CD40 pozitív Daudi tumorok csökkent növekedését SCÍDbézs egerekben, melyeket egy találmány szerinti CD40 ellenanyaggal. <21.4.,.1) kezeltünk.
A 7. ábra egy tumomövekedés gátlás! görbe, amely illusztrálja a CD40 negatív K5Ö2 tumorok csökkent növekedését SC1Dbézs egerekben, melyeket egy találmány szerinti CD40 ellenanyaggal (21,4.1) és humán dendrites sejtekkel valamint Tsejtekkel kezeltünk.
A 8, ábra mutatja a CD4Ö negatív K562: tumorok növekedésének gátlását SCID egerekben, különböző koncentrációjú
23.29.1 monokionális ellenanyag anti-CD40 agonistával,
A. 9. ábra mutatja a C.D4Ö negatív K562 tumorok növekedésének gátlását SCID egerekben, különbőz© koncentrációjú
3.1.1 monoklenális ellenanyag anü~€D4ö agonistával,
A 20. ábra mutatja a ÜD4Ö pozitív Raji tumorok növekedésének gátlását T-sejtek és dendrites sejtek jelenlétében SCID egerekben, egy and-CD4Ö agonísfa monokfooátís ellenanyaggal.
A 11, ábra mutatja a CD4Ö pozitív Raji tumorok növekedésének gátlását SCID egerekben, anti-CD4ö agonista monokionáli s ellenanyagokkal.
*
-X *·* **
A 1.2. ábra mutatja a BT 474 emlőrák sejtek növekedésének: gátlását SCiD-bézs egerekben» anti-CD4ö agonista ellenanyagokkal·
A 13. ábra mutatja a PC-3 prosztata tumorok növekedésének: gátlását SÓID-bézs egerekben, anh~CD4ö agomsta ellenanyagokkal..
A 14„. ábra 'Daudi tumorsejíekkei intravénásán (iv) injekciózott és anti CD40 agonista ellenanyagokkal kezelt SCID-bézs egerek túlélési görbéje.
A 15. ábra csökkent (Rj és nem-csökkent (MR) temán CD40 elleni anti-CD40 ellenanyagok Western biot elemzése.
A 16. ábra az egér és a humán CD40 Dl 04 dortiénjeinek illesztése.
A 17. ábra az egér és a humán CD4Q aminosav szekvenciák illesztése, mutatja a karórák fúziós helyeinek a elhelyezkedését.
A 18. ábra a kanéra CÖ4Ö konstrukciók sematikus diagramja.
A találmány tárgya egy izolált ellenanyag, vagy annak antigén-kötő része, amely kötődik a CD4Ö-hez és CD40 agonistakéní hat.
A találmány tárgya egy aufi.~CD4ö ellenanyagot, vagy annak antigén-kötő részét tartalmazd készítmény, egy gyógyászaéöag elfogadható hordozóval együtt,. A készliniény tartalmazhat még egy másik komponenst, azaz például a tumorellenes szert vagy egy képalkotó szert, A találmány rárgyát képezik továbbá diagnosztikai és terápiás módszerek is,
A találmány tárgya egy Izolált sejtvonal> azaz például hibddöma, amely antl-CD4ö ellenanyagot, vagy annak antigén-kötő részét termeli..
r>
* *
A találmány tárgyát képezik továbbá, egy antí-CD4Ö ellenanyag nehéz táncát és/vagy könnyű láncát, vagy azok antigénkötő részei kódold nukleinsav molekulák.
A találmány tárgyát képezik továbbá a nukleinsav molekulákat tartalmazó vektorok és gazdasejtek, valamint a nukleinsav molekulák által kódolt poipeptídek rekombináns módszerekkel való előállítást módszerei.
A találmány tárgyát képezik továbbá nem-humán transzgeníkus állatok, melyek evpresszálják egy mithCDAÖ ellenanyag nehéz .láncát: és/vagy könnyű láncát, vagy annak -antigén-kötő részét.
A találmány tárgya továbbá, eljárás egy ilyen kezelésre szoruló beteg kezelésére egy anti-CO40 ellenanyag nehéz láncát és/vagy könnyű láncát, vagy annak, antigén-kobá részét kódoló nukleinsav molekula hatásos mennyiségével,
Hacsak máshol másként nem definiáljuk, akkor a találmányban használt tudományos és technikai kifejezések értelme az, amit a szakterületen átlagos jártassággal rendelkező szakember általában ért alatta. Továbbá, hacsak a szövegkörnyezet másként nem igényli, az egyesszámhan megadott kifejezések jelentenek: többesszámot, is, és fordítva. A sejt- és szövettenyészetnek, a molekuláris biológiának, az immunológiának, a mikrobiológiának, a genetikának valamint a fehérje- és nukleinsavkémiának és hibridizációnak, valamint ezek technikájának a leírásban használt nevezéktana a szakterületen jól ismert és általánosan használt.
A találmány szerinti eljárásokat és technikákat általában a szakterületen jól ismert hagyományos módszerekkel, valamint az idézett általános és speei&ns referenciákban, és a találmány lei*χ· <.-<.·** • ♦ « *
-Κ * « Φ * * X ·♦ * .♦ ί.♦ ιίrásában tárgyalt műdön, hajtjuk végre [Samferook és mtsai: Moleeular Clonáng; A. Laboratory: Manuál; 2 . kiadás, Cold Spdág Harkov Press, Goid Spring Barbor, O. ;(Í989); Current Protocols in Mniecnlar Biofogy, szerk.: Ausubel és mtsai Greene Publísbing és 'Wüey-I'ntemdence: Bew York (1992); .Hariow és mtsai .plntibodies: A Láberatory Manna·, Goid Spríng Harbor baboratnry Press, Chld Spring' Harbor, New York (1990), amely publik.á.ciökat a továbbiakban referenciakent kezelünk). Az enzimreakciókat és a tisztítási technikákat a gyártó utasításai szerint hajtjuk végre, a szakirodalomban általánosan használt, vagy az alábbiakban ismertetett módon. Az analitikai kémia, a szintetikus szerves kémia, valamint az orvosi és gyógyszerészeti kémia, és ezek; laboratóriumi eljárásaiban használt nevezéktana a szaktíírűfcten jól ismert, és általánosan használt. Standard technikákat használunk a kémiai szintézisben, a kémiai analitikában, a gyégyszer-form teázásban és a. gyógyszerek beadásában, valamint a betegek kezelésében.
Az alábbi szakkíf^ezéseknek, hacsak az eltérést külön nem jelezzük, az érteimét az alábbiakban adjuk meg:
A ^pökpepüeT szakkifejezés jelentése természetes vagy mesterséges fehérje, fehérje feagmens, vagy egy fehérjeszekvencía polipeptid analógja, Ggy polipeptid lehet monomer vagy polimer.
Az „izolált fehérje”, „izolált pelipeptid” vagy „izolált elfenattyagf szakktejezes jelentése olyan fehérje, poltpepíid vagy ellenanyag, amely eredete, vagy a származás forrása révén (!) nem kapcsolódik olyan, természetes körülmények között hozzá kapcsolódó komponensekhez, melyek természetes állapotában kísérik, (2) mentes ugyanannak a tájnak más fehérjéitől, (3) egy másik faj sejtjében expresszálódik, vagy' (4) nem fordul elő a
Γ5:
Χ· ·* χ.
α.. '·, * *· , C <·*
természetben. Tehát egy kémiailag szintetizált, vagy egy olyan ceüuiáris rendszerben, amely eltér attól a sejttől, amelyből eredetileg származik, szintetizált polipeptid a természetes körülmények között hozzá kapcsolódó komponensektől „izolálü polipepiid. Egy fehérjét izolálással lényegében mentesíthetünk a hozzá, természetes körülmények között kapcsolódó komponensektől, a szakterületen jói ismert fehérjetisztitásí technikák használatával.
Az. izolált ellenanyagok közé tartozik egy antÍ-ÜD4Ö eSenanyag, melyet. CD40 használatával affinitás-tisztítottunk, egy olyan anfcí~€D4ö ellenanyag, melyet egy hiferidóma vagy más sejtvonal in ohm szintetizált, és egy transzgenikus egérből származó humán anti-CD4ö ellenanyag
Egy fehérje vagy polipeptid «lényegében tiszták „lényegében homológ*, vagy „lényegében tisztítottá ha egy mintának legalább körülbelül 60-75%-a egyetlen fajta polipeptid. A polipeptid vagy fehérje lehet monomer vagy mulümer..Egy lényegében tiszta poipepiid vagy fehérje egy fehérjemintának körülbelül 50, 60, 70, 80 vagy 90 tomegszazafekát teszi ki. gyakrabban. körülbelül 95%-ái, és előnyösen több mmt 99%-os tisztaságié. A feherje Tisztaságát vagy homogenitását számos, a szakterületen ismert módon lehet jelezni, példán! egy fehérjeminta polískniamíd géfelektroferézieévei, és a gélnek egy, a szakterületen jól ismert festékkel való festésével egyetlen polipeptid esik láthatóvá tételével. Bizonyos célokra nagyobb felbontást biztosit a BIPbC vagy más, a szakterületen a tisztításra Ismert módszer.
A „polipeptid fragmens szakkifejezés jelentése a továbbiakban egy olyan polipeptid, amely N-termínális és/vagy C-terminális deléciót szenvedett, de a megmaradt aminosavak a terme•<s *·* * '·;♦ r í szelheti elforduló szekvenciában levő pozíciókkal azonos pozíciókban vannak., Néhány megvalósítási mód szerint a iragmcnaek legalább 14, legalább 20, legalább 50, vagy legalább 7G, SÖ, 90,
100. 1 SS vagy 200 amimosavfeő! állnak.
A ^polipeptid analóg* szakkifejezés jelentése a továbbiakban olyan polipeptíd, amely olyan szegmeost tartalmaz, amely lényegében azonos egy aminosav szekvencia egy részével, és az alábbi tulajdonságok közöl legalább eggyel rendelkezik: (!) menetelő körülmények kozott specifikusan kötődik CD4Ö~hez, (2) képes a CD4Ö-el aktúalni, 13) képes felerősíteni, egy sejtfelszíni molekula, azaz példán! ICÁM, MHC-It B7-1, B7-2, CD71, CD23 és CDS8 expresszióját, vagy (4) képes fokozni citokinek, azaz például IFNβΐ, ínterfeukín-2, interkukin-8, az interleukm-12. interleukín15, interleukín-IS; és interleukm-23 expresszióját, Á polipén tid analógok tipikus esetben tartalmaznak egy konzervatív aminosav helyettesítést (vagy mszercfoz vagy delécíőt), a természetben előforduló szekvenciához viszonyítva. Az analógok, általában 2025 amfeosavből állnak., előnyösen legalább 50, 60. 70. 80, 90,. löt), 150 vagy 200 aminosavből vagy többől, és gyakran lehetnek olyan hossznak is, mint egy természetben előforduló pobpeptíd.
Azokat az aminosav helyettesítéseket részesítjük előnyben, melyek: ;!< csökkentik a proteolízisre való érzékenységet, (2l csökkentik az oxidációra való érzékenységet, (3) a íehérjekomplexek kialakítására való aSmuást megváltoztatják, és (4) az ilyen analógoknak más rtlkokémlaí vagy funkcionális tulajdonságokat biztosítanak, vagy azokat módosítják. Az amafogok közé tartoznak egy szekvencia különböző muteiníei, melyeknek szekvenciája eltér a természetben előforduló peptid-szekvenciától. Például a természetben előforduló szekvenciában egy vagy több aminosav .*»♦ V
helyettesíthető (előnyösen terarotir amínosav helyettesítések; előnyösen a pepiid in termo] ekuláris kontaktusán képező domén(ek)en tóval).. Eg\ konzervatív aminosav helyettesítésnek nem szakad lényegesen megváltoztatni a kiindulási. szekvencia szerkezeti jellemzőit (azaz példán! egy helyettesítő aminosavnak netn szabad hajlamosnak lennie arra, hogy megtörjön egy, a kiindulási szekvenciában levő hélixet, vagy tönkretegyen, más típusú szekunder struktúrákat, melyek a kiindulási szekvenciát jeilemzikb A. polipeplidek szekunder és tercier struktúráira példákat a szakirodalomban adnak meg (Proteins, Strneíures and klolecular Prindples, szerkó Creigbtorg W'.tí. Freeman and Company, Wew York (1984): Introductíon. to Protein Structure, szerk.: C. Branden ős d,. Tooze, öariand Rfehábing,. New York 1NLY, (1991); Thornton és mtsaí: Ifeture 354,. 105 (19911; amely publikációkat a továbbiakban referenciaként kezelünk].
A. nem-pepiid analógokat elterjedjen használják: a. gyógyszeriparban; olyan gyógyszerekként, melyeknek tulajdonságai analógok a templát pepiid tulajdonságaival. Az; ilyen típusú nempeptld vegyüléteket „pepiid ndrnetikumoknald vágj? „peptidomímetifcumokuak” nevezik: (Fauchere: J, Adv. Drag Rés. 15, 29 (19861; Vefeer és Freídinger: TINS. 392. oldal (1985); Evans és rntsai: J, Medicina! Chern, 30. 1229 (1987}; amely publikációkat a továbbiakban referenciaként kezelünk]. Az ilyen vegyületeket gyakran számítógépes molekulamodellezéssel fejlesztik ki. A terápiásán hasznos pepiid ekre strukturálisan hasonló peptidomimetíkumok ekvivalens terápiás vagy profiiaktikus hatás létrehozására alkalmasak. A peptláomlmetikumak általában szerkezetileg hasonlítanak egy paradigma pohpeptidro: (azaz egy olyan polipeptídre, amely a kívánt biokémiai tulajdonságokkal vagy farmakoléIS giai aktivitással rendelkezik^, azaz például egy zusaz címanyagra, de bennük egy vagy több pepüdkoiést adott esetben egy, az alábbi csoportból választható kötés helyettesítünk: -CHzNRn, -CtfeS-, CKz-CH,;-, -CH=CH- (dsz és transz), -COCH?-, CB(OH)Cffe·- és -CIÍ2-SO·-, a szakterületen jól ismert módszerekkel· Egy konszenzus szekvencia egy vágj' több aminosavának szisztematikus helyettesítése egy azonos típusú Daminosawal (azaz például D-Szín L-iizín helyetti szintén használható stabilabb pephdek előállítására, Emellett egy konszenzus szekvenciát vagy lényegében azonos konszenzus szekvencia variánst tartalmazó korlátozott peptídek is efóálkthafök a szakterületen ismert módszerekkel pizo és Gierasch: Annin Bevt Biochem.,. 61, 33“ Π9921, amely publikációt a továbbiakban referenciaként, kezelünk); például belső d szteincsoportok hozzáadásával:, melyek képesek a. pepiidet ciklizáló intramolekuláris díszulfid-hidakat létrehozni
Az .ellenanyag5 szátóufejezes jelentése egy teljes ellenanyag, vagy annak antigén-kötő része, amely az intakt ellenanyaggal verseng a specifikus kötődésért [Fundamental Immunology, '7. fejezet, szerk,: Paul, W,, Savén Press, K,Y. (1939|: amely publikációt a tov a hutákban referenciaként kezelünk!. Az antigén-kötő részeket eloátóbmm κ rekombináns DNS technikákkal, vagy az intakt ebenanyagok enzimes vagy kémiai hatótásóai. Az antigénkötő részek közé tartozik, többek között, a Fáb, Fáb, Ffe.b*);, Fel, Fv, dAb, valamint a komplementaritást meghatározó régió ICDRj fragmensek, az egyláncü ellenanyagok (οοΡν), a tóméra ellenanyagok, a diatestek és az olyan polipeptidek, melyek egy ellenanyagnak legalább egy olyan részét tartalmazzák, amely elegendő
►*·*·* :«·
- Χ« ahhoz, hogy a polipeptidnek specifikus antigén-kótő tulajdonságot biztosítson.
Az N-terminálfotői a C-termí:nálísíg mind a könnyö Íme mind a nehéz lánc doméoek tartalmazzák: az FR1, ODRI* FR2,: CDR2, FR3, CDR2 és FR4 régiókat. Az amínosavafonak az egyes doménekfeez való hozzárendelése Kábát vagy üfeoihia dehnielóival van összhangban [Rabat: Sequences of Rroteins of Immunofogieal Interest, National Inshtute of Health., Bethesda, Md, (19871 és (1991): Chothia & kesfc: Journal of Mofceular Bíofogy 196, 901-917 (1.9871; Chofhia. és mtsai: Natúré 372, 878-883 (1989)).
A továbbiakban, egy ellenanyag, amelyre egy számmal: hivatkozunk, egy monoklonális ellenanyag, melyet az azonos számú híbridömáből nyertünk ki. Például a 3,1.1 monoklonális ellenanyagot a 3,1.1 hibridómából állítjuk elő.
A továbbiakban az Fd Iragmens jelentése egy olyan ellenanyag. fragmens, amely Va és Cn doménekhől áll;. egy Fv fragmens egy ellenanyag egyetlen karjának 97 és ¥h doménjelt tartalmazza; és egy dAh fragmens [Ward és mtsai: Natúré 341. 544-546 (1989)) egy Va domént tartalmaz.
Néhány megvalósítási mód szerint az ellenanyag egy egyláncú ellenanyag: (scFv), melyben egy Va és egy Ve dómén párosodik, monovalens molekulákat képezve egy szintetikus Knfeeren keresztül, és ez lehetővé teszi, hogy egyetlen fehérjeláncként állítsuk elő [Bírd és mtsai: Science 242, 423-426 (1988); Hasion és mtsai: Proeeedings oi the National Academy of Sciences, USA 85, 5879-5883 (1988)], Néhány megvalósítási mód szerint az ellenanyagok diatestek,, azaz bivalens efenanyagok, melyekben a % és Vr doniének egyetlen polipeptid láncon expresszálödnak, de
olyan linker van bennük, amely túl rőted ahhoz, hogy lehetővé tegye a párosodási: az azonos láncban levő két donién között, ezzel arra késztetve a doméneket, hogy egy másik lánc komplementer •dóm énjeivel párosodjanak, és ezzel két antigén-kötő helyet hoznak létre polliger F, és mtsai: Proceedings of ebe National Ácademy of Sciences, ÜSA 90, 6444-6448 (1993): Palink R. J. és mtsai: Structure 2, 1121-1123 (1994)]. Néhány megvnlősitási mód szerint egy találmány szerinti ellenanyag egy vagy több komplementaritást meghatározó régima beépíthető a molekulába, akár kovalens, akár nem-kovalens festéssel, ezzel immwadhezinné alakítva át, amely specifikusan kötődik a CD4Ö-hez.. Bzefeben a megvalósítási módokban a korn plementaritást meghatározó régiók egy nagyobb polipeptid lánc részeként építhetők be, kovalens kötéssel kapcsolhatók egy másik polipeptid lánchoz, vagy nem-kovalens kötéssel ís beépíthetők.
Néhány, egy vagy több kötőhelyet tartalmazó; megvalósítási módban a kötőhelyek lehetnek azonosak, vagy lehetnek eltérőek.
A. továbbiakban a „humán ellenanyag szakkifejezés jelentése bármilyen ellenanyag, melyben az összes variábilis és konstans szekvencia humán szekvencia. Bzeket az ellenanyagokat számos különböző módszerrel elő lehet állítani
A okiméra ellenanyag’ szakkifejezés jelentése a továbbiakban olyan ellenanyag, amely két vagy több különböző ellenanyagból származó régiókat tartalmaz. Az egyik megvalósítási mód szerint egy vagy több komplementaritást meghatározó régió a humán; anti--0040 eken anyagból származik. Ogy másik megvalósítási mód szerint az összes komplementaritást meghatározó régió egy humán aoti-CBáO ellenanyagból származik. Bgy másik megvalósítási mód szerint egynél több humán aníi-CD40 ellenanyagböl származó komplementaritást meghatározó régió kombinálódik egy kiméra ellenanyagban, Például egy tóméra ellenanyag tartalmazhat egy CDRl -et egy első humán anti-CÍMÖ ellenanyag könnyű láncából, egy CDR2 -Í egy második humán anuCD4Ö ellenanyag könnyű láncából, és egy CBR3~at egy harmadik humán ann--CD40 ellenanyag könnyű láncából, és a nehéz láncból származó komplementaritást meghatározó régiók származhatnak egy vagy több más anti-QMÖ ellenanyagból. Emellett, a keretrégiók származhatnak az egyik előzőkben említett anri-CD4G ellenanyagból, vagy egy vagy több más humánból.
Az. „aktiváló ellenanyag” (melyet a továbbiakban „agooísía ellenanyagnak” is nevezünk/ szakkifejezés jelentése egy olyan ellenanyag, amely egy CD4ö-et eypresszáfé sejthez, szövethez, vagy szervezethez hozzáadva legalább körülbelül 20%-kal fokoz egy vagy több ÜD40 aktivitást. Néhány megvalósítási mód szerint az az ellenanyag legalább 40, 50, 60, 70, 80, 85%-kal aktiválja a CD40 aktivitását. Néhány megvalósítási mód. szerint az aktiváló ellenanyagot CD40L jelenlétében adjuk hozzá. Néhány megvalósítási mód szerint az aktiváló ellenanyag aktivitását egy teljes vér sejtfelszíni molekula felerősítő esszé alkalmazásával mérjük,. Lásd a 7. példát. Egy másik megvalósítási mód szerint az aktiváló ellenanyag aktivitását az ínterleukin-12 felszabadulásának mérésére beállított dendrites-sejt esszével mérjük. Lásd a 8. példát, Egy másik megvalósítási mód szerint az aktiváló ellenanyag aktivitását egy in. vivő tumor modell alkalmazásával mérjük. Lásd a. 10. példát,
Az ellenanyagok immunglobulin molekulák fragmensert vagy analógjai a szakterületen jártas szakember könnyen elő tudja állítani, ennek a leírásnak a kitanítását követve. A fragmensek vagy analógok előnyben részesített W-terminálisai és Ctermínábsai a fenkcionális doniének határ árhoz kezei fenteteak: elő. A szerkezrki és funkcionális domének ügy azcmssíthatők, ha. nukieodd és/vagy aminosav szekvenciájukat pohUkns, vagy magántulajdonban levő ssekvencíaradatbázísokkal: hasonlíguk össze. Blönyösen számítógépes összehasonlító módszereket használunk, hogy azonosítsuk azokat a szekvencia-motíyumokat vagy a megjósolt fehérje-kon form áció bömértekeú melyek más, ismert szerkezetű és/vagy funkciójú fehérjékben fordulnak: elő. Az ismert háromdimenziós struktúrájú fehérjeszekvenciák azonosítási módszerei ismertek [Böwie és mtsak Science 253, 164 (1991)].
A. sej [felszíni pfestnon rezonancia” szakkifejezés jelentése a továbbiakban egy olyan optikai jelenség, amely tehetővé teszi .a. valós idejű bíspedKkus köicsönhatások elemzését, a fehérje- koncentráció egy bfeszenzor mátrixon való változásának kimutatásával, például egy SlAcore rendszer basznSatával «Paarmacia Biosensor AB, Uppsala, Svédország és Piscataway, \ew Jersey). A többi leírást a szakirodalomban találhatjuk meg ponsson U. és mtsak Ann. Bioi. Clin. 51, 19-26 (1993); Jonsson O. éS; mtsaű Biotechrűques 11, 629-627 (1991); Jonsson B. és mtsak J. Mól. Reccgnit. 8, 125-131 (1995); Jöhnsson B. és mtsai; Analvtieal Bioehemistrv 198, 268-277 (1991U,
A „kn” szakkifejezés jelenté se egy ad ott ellen anyag-antigén kölcsönhatás egyensúlyi dísszoeiádős állandója.
Az „epitop” szakkifejezés jelentése bármilyen, fehérje determináns. amely képes arra, hogy specifikusan kötődjön egy' immunglobulinhoz vagy T-sejt. receptorhoz. Az; epitop determinánsok általában molekulák, azaz például ammosavák vagy
2S.
XV cukor oldaSáucok kémiailag aktív felszíni csoportjai, és általában specifikus háronidímenziös szerkezeti jellemzőik vannak, valamint specifikus töltési jellemzőik, Egy ellenanyagról akkor mondjuk,, hogy specifikusan kötődik egy antigénhez, ha az disszociáción egyensúlyi állandó < 1 pmol/l, előnyösen < 100 nM, és legelőnyösebben < lö n.M.
A továbbiakban a húsz hagyományos aminosav, és azok rövidítései a hagyományos alkalmazásokat követik (immúnology - A Syuthesis, 2. kiadás, szerk.t E.S. Golub és D.R. Gren, Sin auer Associates, Sunderlan<. Mass. (1991b amely publikációt a továbbiakban referenciaként kezelünk]
A „pofinukleotid” szakkifejezés jelentése a továbbiakban legalább 10 bázisból álló polinukleotidok polimer formája.,, legyenek azok rihooukleotidok, dezozirihonukleotidok, vagy bármelyik típusú nukleotíd módosított formája. Á szakkifejezés vonatkozik az egyszálu és a kétszálú formákra is,
Az „Izolált polinukleotid szakkifejezés jelentése a továbbiakban genomíálís, cDNS vagv szintetikus eredetű, polinukleotid;, vagy ezek kombinációja, amely „izolált polinukleotid”1 eredete folytán (1) nem asszocialődik egy olyan polinukleotkldal. vagy annak egy részével, amefoel az „izolált polinukleotid” együtt található a természetben, vagy (2) működés szempontjából egy olyan pohnukiestidhoz kapcsolódik, amelyhez a természetben nem kapcsolódik, vagv {31 a természetben nem fordul elő egy nagyobb szekvencia részeként.
Az „oligonnkleofid” szakkifejezés jelentése a továbbiakban természetben előforduló és módosított, uukleotidokat jelent, melyeket a természetben előfordulói,; illetve a természetben elő nem forduló kötések kapcsolják össze. Az oligenukteoíidok olyan #$ »*♦ *4$ ί* ,Λ ··*. *· pohnukleotid alcsoportok:, melyek általában 2ÖÖ vagy kevesebb bázist tartalmaznak. Az oligonukleotidok előnyösen 10-60 bázist tartalmaznak, legelőm δ sebben 1:2, 13, 14·, 15, 16, 17, 10, 1.9 vagy 20-40 bázist tartalmaznak.. Az oigonukleotidok általában cgyláncuak, például primerek és próbák; bár az: ohgnrmkieotidök lehetnek kéfozálúák, például egy génmutáns készítése során, A találmány szerinti: oligonukleotidok lehetnek: értelmes vagy andszensz oügonukleotídok,
A „természetben előforduló nukleotidok” szakkifejezés jelentése a. továbbiakban dezoxiribonuldeotidok és ríbonukleotidok. A „módosított nukleoíidok* szakkifejezés jelentése a továbbiakban módosított vagy helyettesített cukorcsopsríokaí és hasonlókat tartalmazó nukleotidok. Az Bolígonnkleotíd kötés” szakkifejezés jelentése a továbbiakban az olyan oügonukleotid kötések, mint például a feszforotíoáf-, foszferodítioáb·, foszforoszetenoát-, foszíarodiszelenoáti, feszforoaníiotioát-, feszferaniladát-, Ibszforamiditát és feasonlók |La Flancbe és mtsai: Rncleic Aeids Research 14, 9Ö81 fi986);: Stec és mtsai: Journal of the American Chemical Society 106. 6077 (1984); Steln és mtsai: Nueleic Adós Research 16, 3209 (1988); Zon és mtsai: Anti-Cancer Drug Design 6, 539 (1991); Zon és mtsai: OHgouaefeoodes and Analogues: A PractícaJ Approach, 87-108. oldal, szerk,: F. Ecksteúy Oxford Dniversity Press, Öxfor, Nagy-Britarmia. (199 1 j; 5,151,510 számú Amerikai Egyesült Alamok-befi szabadalmi leírás: Dhlmann és Peyman:: Chemical Revíews 90. 543 (1990), amely publikációkat a továbbiakban referenciaként kezelünk!. Egy oligonukleotid szükség esetén a kimutatáshoz tartalmazhat egy jelölésű
Λ V
Ά „-működés szempontjából kapcsolt” szekvenciák kozó tartalmaznak mind az olyan expressziös kontrol szekvenciák, amelyek egybefuggonek a számunkra érdekes génnel, és az olyan expressziős kontroll szekvenciák, melyek transz módon, vagy távolról hatnak, a számunkra érdekes gént szabályozva. Az „enpressziös kontroll szekvencia” szakkifejezés jelentése a továbbiakban olyan poiinukleotid szekvencia, amely szükséges ahhoz, hogy befolyásoljuk azoknak a kódoló szekvenciáknak az expresszálásál és processzálását, melyekhez hozzá vannak ligáivá. Az expresszlós kontroll szekvenciák közé tartoznak a. megfeleld transzkripciós inioiátor. a terminátor, a promoter és fokozó szekvenciák; a hatékony RNS processzáló szignálok, azaz például az illesztő és políadenilezési szignálok; a citoplazmatikus mRNS-t. stabilizáld szekvenciák; a transzláció hatékonyságát fokozó szekvenciák (azaz például a Kozok konszenzus szekvenciáké a fehérje stabilitását fokozó szekvenciák; és ha szükséges, akkor a fehérje szekrécióját fokozd szekvenciák, Az ilyen kontrol szekvenciák; természete eltérő, a gazdaszervezettől függően; a prokariötákban az ilyen kontroll szekvenciák közé tartoznak a promoterek, a rlboszőmális kötőhelyek és a transzkripciós terminációs szekvenciák; az eukariótákfean általában az ilyen kontroll szekvenciák közé tartoznak' a promoterek és a uanszkrípmcs ermtrsciós szekvenciák. A „kontroll szekvenciák” szakkifejezés jelentése a továhbiakfcan minim un az összes olyan komponens, melyeknek a jelenléte esszenciális az expressziéhez és processzáláshoz, és ide tartozhatnak további komponensek is, melyeknek a jelenléte előnyös, például a vezérszekvenciák és a fúziós pariner szekvenciák:.
• *· »:* :♦:«.*$· * *·«· * *· * ·« ♦. ♦.». te » « » ·» ·· Κ- ·« .»
-X .ί ♦ * Μ « # χ.
»«. ***
A „vektor’ szakkifejezés jelentése a továbbiakban egy olyan nukleinsav molekula, amely képes egy másik, hozzá kötődé nukteotidot transzportálni. Néhány megvalósítási mód szerint a vektor egy piazmid, azaz egy cirkuláris kétszálű DNS hurok, melybe további DNS szegmensek ligálhatók, Néhány megvalósítási mód szerint a vektorok képesek az autonóm replikádéra egy gazdasejtben, amelybe bejuttattuk őket (azaz például a bakteriális replifcációa origóval rendelkező bakteriális vektorok, vagy az episzomáiis vektorok). Más megvalósítási módok szerint a vektorok (azaz például a nem-episzomáhs emlős vektorok) egy gazdasejt genomjába integrálhatok, a gazdasejtbe való bejuttatás után, és ezáltal a gazdaszervezet genomjávál együtt replikalódnak. Emellett néhány vektor képes vezérelni a hozzájuk működés szempontjából kapcsolt gének expresszióját. Az Ilyen vektorokat a. továbbiakban „rekombináns expresszíős vektoroknak” (vagy egyszerűen „expressziős vektoroknak”) nevezzük.
A „rekomblnáns gazdasejt” (vagy egyszerűen „gazd&sejR jelen tése a. továbbiakban egy olyan. sejt, amelybe egy rekombánáns expresszios vektort juttattak be. Az nyilvánvaló, hogy a „tekombináns gazdasejt” és a .„gazdasejf szakkifejezés nemcsak az adott sejtet jelenti, hanem az ilyen sejt utódait is. Mivel bizonyos módosítások előfordulhatnak a későbbi generációkban, mutáció vagy környezeti: befolyások hatására, az ilyen utódok esetleg nem azonosak a kiindulási sejttel, de mégis a. „gazdasejtnek” a leírás szerinti érteimébe tartoznak.
A. „szelektíve hihridixáT szakfofojezés az alábbiakban azt jelenti, hogy khnufathatöan és specifikusak kötődik. A találmány szerinti pohnukleotídok, oligonukleotídok és azok feagmensei szelektíve hibriáizálódnak oukleinsav szálakhoz olyan, hibridizációs » « * * .♦ *.« χ φ .·* : U : ϊ: :;:
«X ,S.M. χ,χ* és mosási körülmények között, amelyek: minimalizálják az aspecifikus nukleinsavakhoz való, kimutatható kötődés elfogadható mennyiségét. „Nagyon szigorú” vagy „nagy szigorúsága” körülmények használhatók a szelektív hibridizációs· körülmények elérésére, amint az a szakterületen ismert, és az alább:ia.kban tárgyaljuk. A „nagyon szigorú” vagy „nagy sságorúságű” körülmények egyik példája egy polinukleotid ínkubálása egy másik poiínnkleotiddaí, ahol az egyik goknukleotíd: egy szilárd területre, azaz. például egy membránra lehet: rögzítve, egy hibridizációs pufférben (6X SSFE vagy SSC, 5frió íormamid, 5X Denh&rdt reagens, ü,5% SDS, ÍÖG pg/ml denaturált, fragmeníált lazacsperma
DNSk 42 CC hibridizációs hőmérsékleten, 12-16 óra hosszat, mmd. kétszer mosva 55 Ό-οη,.. mosó púkét (IX SSC, 0,5% 8DS1 használatával [Sambrook és mísak Moleeular Cloning; A haberatory Manu.ak 2. kiadás, 9.50-9.55. oldal; Cold Sprmg Karbor Press., Coki Spring Harhor, N.Y. (1989)].
A „százalékos szekvencia azonosság” szakkifejezés a nukleínsav szekvenciák szövegkörnyezetében a két szekvenciában azokat a csoportokat jelenti, amelyek ugyanazok, ha a maximális megfelelés céljából egymás mellé illesztjük őket. A szekvenciaazonossági összehasonlítás hossza legalább kilenc nuklcotid, általában legalább körülbelül 18 nuöeoöd, még gyakrabban legalább 24 nokleoíid, tipikus esetben legalább körülbelül 28 nukleotid, még tipikusahhan legalább körülbelül 32 nukleotid, és előnyösen legalább körülbelül 36, 48 vagy több nukleotid. A szakterületen számos különböző algoritmus ismert, melyek használhatók a nukleotid szekvencia azonosság mérésére. Λ polínukleotid szekvenciák Összehasenhthatők: például a FASYA, Gap vagy Bestht prógramokkal, melyek a Wisconsin Fackage Version * ·* «.
, £ «Φ** ) > ·φ φ^ • * *« χ φ ♦ * X Φ „ * ·!» # * » μ *Λ «.«» φφ
10.,0-ban találhatok. (Genetics Computer Group· (GCG), Madison, Wiseorssinj,. A FASTA, amely tartalmazza például a 'FASTA2 és FÁ.STA3 programokat. a vizsgált és a kereső szekvenciák közötti legjobb átfedés illeszkedését és százalékos szekvencia azonosságát biztosítja (Pearson; Methoás in Enzymology 183, 63-98 (199ÖI;. Pearson: Meihods Mát Biot 132, 1SS-219 (2000); Pearson: Methods in Bxtzymology 266, 227-258 (1996); Pearson: Journal of Moiecular Biotogy 276, 71-84 (1998); amely publikációkat a továbbiakban referenciaként kezelünk). Hacsak másként nem specifikáljuk, akkor az adott program vagy algoritmus alapparamétereit használjuk. Például a nukleinsav szekvenciák közötti százalékos szekvencia-azonosságot meg lehet határozni FASTA-val, az alap-paraméterek alkalmazásával (szóhossz 6 és az értékelő mátrixhoz a TOPÁM faktor), vagy a Gap használatával, a GCG Version 6.1-ben megadott alap -párarn éterekkel, amely publikációt a továbbiakban referenciaként kezelünk.
Ha egy nukfeotid szekvenciára hivatkozunk, akkor az magában foglalja a komplementjét is, hacsak másként nem specifikáljuk. Tehát ha egy adott szekveneiájű nukleinsavra hivatkozunk, akkor nyilvánvaló, hogy ez vonatkozik a komplementer szálára is, annak komplementer szekvenciájával».
A molekuláris biológiai szakterületen a kutatók a „százalékos szekvencia-azonosság”, „százalékos szekvencia hasonlóság” és „százalékos szekvencia homológia” szakkifejezéseket egymással felcserélhetően használják. Ebben a leírásban ezeknek a szakkifejezéseknek csak. a nukleinsav szekvenciákra vonatkoztatva van azonos jelentésük,
A „lényegi hasonlóság* vágy „lényegi szekvencia-hasonló ság’ szakkifejezések, ha egy cukiéin savra, vagy annak frag29
* mensére használjuk, akkor azt jelenük, hogy ha egy másik Bükiéin savval (vagy annak komplementer szálával) optimálisan egymáshoz illesztjük, a megfelelő nukleinsav inszerciékkal vagy deíéeiökkal, akkor a nukleond bázisoknak legalább körülbelül 85%-ában, előnyösen legalább körülbelül 90%-ában, előnyösebben legalább körülbelül 95%-ában, 9S%~ában, 97%-ában 985%ában vagy 99%-ában nukleotíd szekvencia azonosság van, melyet a szekvenma-azonosság bármelyik jel ismert algoritmusával, azaz például a. FASTA, BLAST vagy Gap algoritmussal lehet mérni, amint azt az előzőkben tárgyaltuk.
Ha. pohpeptídefere alkalmazzuk, akkor a „lényegi azonosság” szakkifejezés azt jelenti, hogy két peptid-szekvencia, ha optimálisan egymáshoz van illesztve, például a GAP vagy BBSTF1T programokkal, az alap súlyozást használva, akkor legalább 7Öt 75 vagy 80 százalékos szekvencia-azonosságot mutat, előnyösen legalább 90-95%-os szekvencia-azonosságot, és előnyösebben legalább 97, 98 vagy 99%-os szekvencia azonosságot, Az egyes pozíciókban eltérő csoportok előnyösen konzervatív aminosav helyettesítésekben térnek el. A „konzervatív aminosav helyettesítés’ egy olyan helyettesítés, melynek során egy aminosav csoportot egy olyan másik aminosav csoporttal helyettesítünk, melynek oldallánca <R csoport) hasonló kémiai tulajdonságokkal, rendelkezik (azaz például töltés vagy hidrofobításj. Egy konzervatív aminosav helyettesítés általában nem változtatja meg egy fehérje ínnkcio-naks tulajdonságait. Azokban az esetekben, ahol két vagy több aminosav szekvencia egymástól konzervatív helyettesítésekben tér el, a százalékos szekvencia azonosságot, vagy a hasonlóságmértékét felfelé korrigálhatjuk, begy fígyetembe vegyük a helyettesítés konzervatív természetét, A szakterületen jártas szakember *»· * X- ♦
V :í ♦ ♦ * * * X X »* * * !<·* « Ί *
X·
X.
számára az ilyen korr^alás módszerei jól ismertek (lásd például kearsom Méürnds klek Bioi, 243, 307-31 (1994)|, A hasonló kémiai tulajdonságokkal rendelkező oldaSáncokat tartalmazó amínosav csoportok a következők: 1) alifás oldalláncok: glicin, alankp valin, ieucin és izolencin; 2) feifós-bidroxi öiöaiiáneofc szerin és treonin; 3) amid-tartalmú oldalláncúk: aszparagin és glntamim 4| arcmás oldalláncúk: fenilaianin, urozin és tríptofán; 5) házíkns oldaSáneok: Iizin, anginái és hisztidín; 6) savas, oldalláncok; aszparagínsav és giutaminsav; és 7) kéntartalmú oldalláncok: eiszéein és metinnin. Az előnyben részesített konzervatív amínosav helyettesítési csoportok a kővetkezők: valin-lencm-izoleucin, fenilalanin-firozin, iixin-arginins alanin-valin, giutamátaszpartát és aszparagm-glutamin.
Egy másik változat szerint azt nevezzük konzervatív helyettesítésnek, ahol bármilyen változásnak pozitív értéke van a Gonnet és munkatársai, által publikált PAM250 log-valőszínúség mátrixban (Gonnet és mtsai: Science 256, 1443-1445 (1992), amely publikációi a továbbiakban referenciaként kezelőnk]. Azt nevezzük „közepesen konzervatív* helyettesítésnek, ahol bármilyen változásnak nem-negatív értéke- van a PAM25Ö log-valószínüség mátrixban,
A polípepfideknél a szekvencia-hasonlóságot, melyet szekvencia azonosságnak is neveznek, tipikus esetben szekvenciaelemzési programmal mérik, A fehérjét elemző program: a hasonló szekvenciákat illeszti egymáshoz, a. különböző helyettesítésekhez,, deléciókhoz és más módosításokhoz, beleértve a konzervatív aminosav bclyettesítéseket is, hozzárendelt értékeket használva. Például a GCG tartalmazza a „Gap” és JSesífiÜ programokat, melyek az alap paraméterekkel használhatok az egymással szoros rokon.« S« * ,, ’ « » x . ,» « ,
X ·» » , ·» x χ •K ·* »· k· Φ Φ χ **♦ · ··» »» Λ** aSágban levő polipeptídek, azaz például a különböző fajokból szervezetekből szármázd homológ polipeptidek, vagy egy vad-típusú tekerje és annak egy muteinje közötti szekvencia-homolégía. vagy szekvencia-azonosság meghatározására pástí példán! GCG Version 6,1 p A polípeptid szekvenciákat a FASTA íez egy program a GCG Version 6.1 -ben) használatával is össze lehet hasonlítani,, az alap, vagy javasolt paraméterek használatával, A FASTA (azaz például a .FASTA2 és FASTA3| megadja az illesztést és a százalékos szekvencia-azonosságot a vizsgált és a keresd szekvenciák legjobb átfedésénél |Pearson: Methods in knzymology 183. 63-98 (1990); Pearsom Methods Moh Bioi 182, 186-219 (2000) |. Ha egy találmány szerinti szekvenciát egy különböző: szervezetekből, származó nagyszámú szekvenciát tartalmazó adatbázissal akarjuk összehasonlítani, akkor egy másik előnyben részesített algoritmus a. BfAST számitógépes program, főleg a piasíp vagy blastn, az alap-paraméterek használatával (lásd például Altschul és mtsai; Journal of Bfolecular Biology 215, 403-410 (1990); Altschul és másai: Nuclcic Aeíds Research 26, 3389-402 i 1997); amely publikációkat a továbbiakban reterenciaként kezelünk).
A homolőgia kereséséhez összehasonlított poüpeptíd szekvenciák hossza legalább körülbelül 16 amínosav, általában legalább körülbelül 20 amínosav, még általánosabban legalább körülbelül 24 csoport, tipikus esetben legalább körülbelül 28 csoport, és előnyösen több mint körülbelül 35 csoport. 8& nagyszámú, különböző szervezetekből származó szekvenciákat tartalmazó adatbázist vizsgálunk át, akkor az az előnyös, ha az amínosav szekvenciákat hasonlítjuk össze.
A továbbiakban, a ..jelölés” vág}? .jelzett” szakkifejezés azt. jelenti, hogy egy másik molekulát építünk az ellenanyagba. Az egyik * »
megvalósítási mód szerint a jelölés egy ^mutatható markén, azaz például egy radioaktív izotóppal jelzett aminossv beépítése, vagy jelzett avidinnel Idmutatíiató hiotinil egységek kapcsolása egy polípeptidhez (amit azután optikai vagy koiorimeíriás módszerrel ki lehet mutatni). Egy másik megvalósítási mád szerint a jelölés vagy a markor lehet terápiás, azaz például egy gyógyszer konjugáium vagy toxín. A szakterületen a poiipeptidek: és glikoprotemek jelölésére különböző módszerek ismertek és használhatók. A polipeptidek jelölésére használt jelölések közé tartoznak, anélkül, hagy ezekre korlátoznánk magunkat, a következők: a radioaktív izotópok vagy raáfomddidok (azaz például 3ö, 2<k W, 35Sf We, íUln, mh ~3% a iuoresxcencia jelölések (azaz például a FTC,: rodarnlrp lantanid foszforok], enzimes jelölések (azaz például tormaperoxidáz, p-gaiakéozídáz, lueiforáz, a.lkalíkus foszíátáz), kemilumdneszcems markerek, hiotinil csoportok:, előre meghatározott polipeptid epitopok, melyeket egy szekunder ellenanyag felismer (azaz például leuein cippzár-pár szokrren cíá.k, kötőhelyek szekunder ekenanyagokhoz, íémkötő domének, epitop jelölések), mágneses szerek, azaz például gadölínium kelátok, toxinok, azaz például szamárköhögés torán, taxok cytochalasin B, gramicidin l>, etídiumhrornid, emetin, mitorfocin. etoposi.de, íenopöside, rácristxne, vinhiastme^ kolchicin, doxorubícin, daunorubicin, dihidroxi antracin dión, rrűtoxantrone, mithramicin., aktinomicin D, I -dehidroteszíoszteron, glükokortikoidok, prokain, tetrakain, Írnokain, propranofol. és pummícm, valamint ezek analógjai vagy homológjai. Néhány megvalósítási mód szerint a jelöléseket különböző hosszúságú karokon, keresztül kapcsoljuk, hogy csökkentsük a potenciális térbeli gátlást.
A páciens szakkifejezés jelenthet embert és állatot is.
φ -* * ·♦♦ η» * ** ♦
*«·*.
« :ϊ:
Ebben a. leírásban és fénypontokban a „tartalmaz*, vagy „tartalmazó* kifejezés egy megadott egész számod vagy egész számok egy csoportját jelenti, de nem zár id semmilyen más egész számot vagy egész számok csoportját.
A teás ellenanyagok elkerülnek számos óban problémát, melyek a nem-humán (azaz példán! rágcsáló) variábilis és/vagy konstans régiókat tartalmazó eBenanyagokfeoz kötődnek. Ilyen probléma például az ellenanyagok gyors kiürülése, vagy az ellenanyag elleni immunválasz, Ezért, az egyik megvalósítási mád szerint a találmány tárgyát humanizált anti-€B40 ellenanyagok képezik. Egy másik megvalósítási mód szerint a találmány tárgyát humán antí-CD40 ellenanyagok képezik. Néhány megvalósítási mád szerint a humán anti-CDAÖ ellenanyagot úgy állítjuk elő, hogy egy olyan rágcsálót Immunfeálnnk, melynek genomja humán immunglobulin géneket tartalmaz, és így a rágcsáló iramán ellenanyagokat termek A humán antí -CD40 ellenanyagoktól az várható, hogy minimalizálák azokat az immunogén és allergiás válaszokat, melyek a nem-humán vagy nem-humán -derívatizáit monoklonális ellenanyagokra (Mab-ok) jellemzők, és ezzel fokozzák a beadott ellenanyagok hatékonyságát és biztonságosságát. A teljesen humán ellenanyagok használatától az várható, hogy lényeges előnyöket biztosít a. krónikus és újból előforduló humán betegségek kezelésében, mint amilyen például a gyulladás és a rák, melyeknek kezelése ellenanyagok ismételt beadását Igényli
A találmány tárgyát tizene^ aktiváló hum^án. anéi-CD4Ö monoklonális ellenanyag ímAb), valamint az ezeket termelő híbridőma sejtvonalak képezik. Az A táblázatban megadjuk a teljes hosszúságú nehéz láncokat és könnyű láncokat (beleértve a vezérszekvenciákat isi kódoló nuklelnsavak szefcveneia-azonosftőít, (a.
* X » * szekvencia sorszámát), a teljes hosszúságú, kikövetkeztetett aminosav szekvenciákat, valamint a nehéz lánc és könnyű lánc variabilis régink nukieoiid és kikövetkeztetett aminosav szekvenciáját.
A Táblázat
HUM> 1 ANTII 2D40 £ 1LENAT 1YAG
1 Mono- s kloná- SZEKV.E 1NC1A-? tZONCh SORSI BITÓK 0 IÁM A:) λ SZERVENCD
lís Variábilis régió Teljes hosszúságú
ellen- Nehéz Könnyű Nehéz Kön nyíl
anyag DNS í Fehérje DNS _ Fe- hérje DNS Fe- hérje DNS Fe- hérje
311 f i 2 3 4 í 3 6 7 8
7.,1.2 9 i 10 11 12 | 13 14 15 16
10.8.3 17 : 18 19 20 | 21 22 28 24
151.1 25 ( 26 27 28 ί 29 30 31 32
21.21 33 : 34 35 36 j 37 38 39 40
21.4,1 41 ; 42 43 44 1 45 46 47 48 |
2211 49 50 51 52 ; 53 54 55 56
23.,5,. 1 57 ; 58 59 60 ί 61 62 63 64
23.281 55 66 67 68 | 69 70 71 72
23.291 73 ; 79 75 76 Γ 77 78 79 80
24.21 81 | 82 83 84 | 85· 86 87 88
A találmány tárgsát képezi továbbá a 23.35.1 humán anöCD4Ö ellenanyag, valamint az ezt termelő híbrídőma sejtwnai.
A találmány tárgyát képezik továbbá néhány , az előzőkben felsorolt humán aníí-GOAÖ monoklonális ellenanyag olyan nehéz lánc és/vagy könnyű, lánc variánsai, melyek egy vagy több amino35 »* * * -* -S « φ * .♦ * * » » « **·»♦ -♦:«. φ>
sav helyettesítést tartalmaznak, A találmány tárgyát képezi a 3.1.1 monoklonáils ellenanyag két nehéz lánc variánsa. Az egyikben a 78-as pozícióban levő alanin helyett treonin van. A másikban a. 78-as pozícióban levő alanin helyett treonin van, és a 88-as valamint a 97-es pozidöban levő valínok helyett alanin van. A találmány tárgyát, képezi: továbbá a 3,1,1 monoklonális eSenanyagnak egy könnyű lánc variánsa, melyben a 4-es pozícióban levő teuan valamint a 83-as pozícióban levő leudn helyett metionm iietve valin van. Ha egy nehéz lánc vagy könnyű lánc variánst kombinálunk: egy vad-tipnsü nehéz lánccal vagy könnyű lánccal, akkor ezt a mutáns lánccal jelezzük. Azaz, ha egy ellenanyag tartalmaz eg\ vad-típusú könnyű láncot és a nehéz lánc a 78-as pozícióban tartalmazza az alanin-treonin mutációt, akkor ennek a jelölése 3:,1.1H-A787.. Azmiban a találmány más megvalósítási mödj:ai szexist egy nehéz lánc variáns, és a 3.1,1 könnyű lánc variáns bármilyen. kombinációját. tartalmazó ellenanyagok is a. találmány oltalmi körébe tartoznak,
Emellett, a találmány tárgyat képezi a 2:2.32 monoklonális ellenanyag: nehéz láncának egy variánsa, melyben a 109-es pozícióban levő ciszteint alaninra cseréltük, Egy monoklonális ellenanyagnak: a neve, mely a nehéz lánc variánst és a 22.12 könnyű láncot tartalmazza, 2:2.12 H--C1Ö9A. A találmány tárgyát képezi továbbá két könnyű lánc variáns és a 23.28:. 1 könnyű lánc egy variánsa. .Az egyik nehéz lánc variánsban a 16-os pozícióban levő aszgaraginsavat glutaminsavra cseréltük. A nehéz lánc variánst és a 23.28.1 könnyű láncot tartalmazó monoklonális ellenanyag jelzése 23,282 H-DI6E, A találmány tárgyát képezi továbbá egy
23.28.1 könnyű lánc variáns, melyben a 9:2-es pozícióban levő ciszteint alariinra cseréltük. A 23,28.1 nehéz láncot és a könnyű ♦ ΦΦ «Φν* * ♦ * ί **
Φ * * * ♦
3S «'* ζ, η lánc variánst tartalmazó monoklonális ellenanyag jelölése 23.28.1
L C92.A. A találmány tárgyát képezik továbbá azok a mmakkmális ellenanyagok is, melyekben bármelyik 23.28.1 nehéz lánc variáns a 23,28,1 könnyű lánc variánssal van kombinálva.
A 23.29.1 hibridóma által termelt könnyű lánc egy mutációt tartalmaz a konstans régióban, a. 174-es pozícióban, A hibridóma által termelt könnyű láncban ebben a póridéban a.kanonikus Úrin helyett arglnin van., Ennek megfelelően, a találmány tárgyát képed egy 23.29,1 könnyű lánc, melyben a kanoníkos hzin van. a 174-es pozícióban, és egy olyan monoklonális ellenanyag, jele 23.29. ILR174K, amely a 23,29.1 nehéz láncot és a könnyű lánc variánst tartalmazza.
Az- egyik előnyben részesített megvalósítási mód szerint az anti-CD40 ellenanyag a 3.1,1, 333H-A78T, a. 3.L1-A78T-W8AV97Á, a 33 3b~L4M~L38V. a 73.2, 10.8.3, 15,0, 21.4,1. 21.2.1, 223 3, 22.13H-CÍ09A, 23.5.1, 23.25,1, 23,283, 23.283hi~Dl.6E,
23.. 283,~C92A, 23.293, 23.293L-R174E és a 24.23. Néhány megvalósítási mód szerint az antÍ-CB4Ö ellenanyag tartalmaz egy könnyű láncot, melynek: aminossv szekvenciáját a következő amino sav szekvenciák közöl választhatjuk ki: 8., 16,, 24., 32,, 40.,
48., 56., 64.., 72:,, 8ö.s 88., 94., WÖ; vagy 182, száma szekvencia, vágj’ ezek variábilis régiója, vagy melyeket az alább csoportból választható rmklemsav szekvencia kódok 7,, 1.5., :23., 31., 39,, 47.,
55., 63,, 71., 79.. 87., 93.. 99. vagy 101. számú szekvencia. Néhány megvalósítási mód szerint az antí-CD40 ellenanyag tartalmaz egy könnyű láncot, amely a felsorolt címanyagoknak legalább a CDE2 régióját, az előzőkben megadott amioasav szekvenciák közül az egyiket (amint az az 1A-1C, és a 2A-2C. ábrákon látható) tartalmazza, vagy az egyik előzőkben említett nuklemsav ·» ♦
*4* Λ szekvencia kódolja. Más megvalósítási módok szerint a könnyű lánc tartalmaz még egy CöRl és CDR3 régiót, melyek egymástól függetlenül választhatók egy olyan könnyű lánc variábilis régióbők amely maximum tíz aminosavat tartalmaz; a csiravonal VK A3/A29, bő vagy A27 gén által kódolt aminosav szekvenciából, vagy tartalmaz egy CDE1 és CDR3 régiót, melyek egymástól függetlenül választhatók 1) az alábbi csoportból választható ellenanyagok egyik CQRI-éból vagy CDR3-mábóI; 3.1,1, 3.1.IL-L4M-L83V,. 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 12.28,1, 23,28,1bC92Á.: 23.29.1, 23.29.18--01711 vagy 24,2.1; 2) a következő aminosav szekvenciák közűi: 4., 12., 20., 28., 36., 44., 52.. 60., 68., 76.,
84., 94., 100. vagy 102. számú szekvencia, vagy 3) az alábbiak közül választhatömnkleínsav szekvencia kódolja; 3., 1.1.., 19., 27.
35., 43., 51., 59., 67.. 75., 83., 93., 99. vagy löl., számú szekvencia.
Egy másik előnyben részesített megvalósítási mód szerint az ami-CD40 ellenanyag tartalmaz egy nehéz láncot, amely a következő csoportból választható aminosav szekvenciát tartalmazza; 6,s
14., 22., 30., 38., 46., 54., 62., 7ö„, 78. vagy 86. számú szekvencia, vagy ezek variábilis régiója, vagy az alábbi csoportból választható nukleinsav szekvencia kódolja; 5., 13., 21., 29,, 37., 45., 53.,
61., 69., 77. vagy 85. számú szekvencia. Néhány megvalósítási mód szerint az and- W40 ellenanyag tartalmaz egy nehéz láncok amely az előzőkben felsorolt ellenanyagok egyikéből legalább a CDR3-at, az előzőkben felsorolt aminosav szekvenciák közül az egyiket (amint az az 1 A-C. és 2A-C. ábrákon látható) tartalmazza, vágj az előzőkben felsorolt nukleinsav szekvenciák közül az egyik kódolja. Egv másik megvalósítási mód szerint a nehéz lánc tartalmaz még CDRl-et és CDR2M, melyek egymástól függetlenül
£ választhatók egy maximum. tizennyolc aminosavat tartalmazó nehéz lánc variábilis régióból, melynek aminosav szekvenciáját a Vn 3-30/, 4-59, 1-82, 4,35 vagy 3-30.3 csíravonal gén kódolja, vagy egy C1DR1 -et. és CDR2-t tartalmaz, melyeket egymástól függetlenül 1) a következő ellenanyagok egy CÖlkl-éből és GÖR2-jébóÍ választunk ki: 3,1.1, 333H-A78T, 33,3:H~A78T-¥88A-V97A, 7.1.2, 10.8,3, 15,1.1, 21.43, 21.2J, 223 3, 22.1.1&-C109A,
23.53., 23.253-, 23.283, 23.283H-D16G, 23.293 és 24.23.; 2| lehet a 2., 10., 18., 26,, 34., 42., 50., 58., 66,, 74., 82., 90., 92., 96, vagy 98. számú aminosav szekvencia, vagy 3) az 1., 9,, 17.,
26., 33., 41., 49., 57... 65., 73., 81., 89., 91,, 95. vagy 97. számú nukleoné szekvencia, kódolhatja,. Egy másik megvalósítási mód szerint az anti-CD4i3 ellenanyag tartalmaz egy előzőkben definiált nehéz láncot és könnyű láncot.
A tnv’ábbiakban, a 33.1Β-Α78-Ϊ ellenanyag azonos a 3.1.1 ellenanyaggal, azzal az eltéréssel, hogy a. nehéz lánc 78-as aminosav csoportja alanin helyett treonin. Hasonlóképpen, a 3-..I.4H-Á7BTY88A-V79A ellenanyagban a 78-as csoportot A-ra. cseréltük, és a nehéz láncban a 88-as valamint a 97-es aminosav csoportot valinrői alaninra cseréltük. A 3.1. Ib-L4M-L83¥ ellenanyag ugyanaz, mint a 33,1, azzal az eltéréssel, hogy a 4-es pozícióban lencin helyett metioninosoport van, és a könniü. láncban Λ S3-as pozí dóban leucin helyett vslín van. A 22.13.H~C1.O9A ugyanaz, mint a
223.. 1., azzal az eltéréssel, hogy a nehéz láncban a 109-es pozícióban eiszteín helyett alanin van. A. 23,28.1 H-DÍ 6E és 23.28,1LC92A ellenanyagok azonosak a 23.283 ellenanyaggal, azzal az eltéréssel, hogy a nehéz lánc 16-os csoportját aszpartátról glutamátra cseréltük, és a könnyű lánc 92-es csoportját, clszteinről alaninra cseréltük: ki. A 23,29..IL-R174K ellenanyag azonos a
X
3$ *· * * ·♦;
» * φ.
23.29.1-gyei azzal a különbséghet hogy a könnyű lánc 174-es pozíciójában. argjnin helyett lkán található.
Az anh-CÖ4Ö ellenanyagok osztályát és alosztályát a szakterületen ismert bármelyik módszerrel meg lehet határozni. Általában egy ellenanyag osztályát és alosztályát olyan ellenanyagokkal lehet meghatározni, amelyek az ellenanyagok egy bizonyos osztályára és alosztályára specifikusak. Az ifyen ellenanyagok kereskedelmi forgalomban vannak. Az osztályt és alosztályt EMSA-val vagy Western hlottal, vagy más technikákkal lehet meghatározni Egy másik változat szerint az osztályt és alosztályt az ellenanyag nehéz és/vagy könnyű lánca konstans doménjeinek, vagy azok egy részének szekvenálásával lehet meghatározni, majd aminosav szekvenciájukat az immunglobulinok különböző osztályainak vagy alosztályainak aminosav szekvenciáihoz lehet hasnnOank és ennek alapján meghatározni az ellenanyagok osztályát és aló sz tárnát.
Néhány megvalósítási mód szerint az ant.i~C.D40 ellenanyag egy monoklonálls ellenanyag, Az anti-CD40 ellenanyag: lehet IgG. IgM,. IgE,. igA vagy IgD molekula. Egr előnyben részesített megvalósítási mód szerint az antí-CíMÖ ellenanyag IgG, és az ígGI? lgG2, lgG3 vagy ígG4 alosztályba tartozik. Egy másik előnyben részesített megvalósítási mód szerint az anti-CB40 ellenanyagok az lgö2 alosztályba tartoznak.
A találmány egy másik aspektusa szerint az anti-CD40 ellenanyagok mind faj-, mind molekula-·szelektivitást mutatnak. Néhány megvalósítási mód szerint az anti~CD4ö ellenanyag a főemlős és humán CD4ö-hez kötődik. Néhány megvalósítási mód szerint az anti-CD4Ö ellenanyag kötődik a humán, cynomolgus vagy rhesus CD40-hez. Más megvalósítási módok szerint az antí-CE>40
X ·.♦·
*.í a * » φ
* * ellenanyag: nem kötődik az egér, patkány, kutya vagy nyúl CD40hoz. A leírás kkanííása alapján a szakterületen jól ismert módszerekkel meg lehet határozni az anti-CD4G ellenanyag fej-szelektivitását, A feji-szelektivitást például Western blattal, FACS-szal. EUSA-val vagy RlA-val lehet meghatározni pásti például a 4. példát).
Néhány megvalósítási mód szerint az antÍ-CB40 ellenanyagnak a €D40-re vonatkozó szelektivitása több mint IGO-szor nagyobb, mint a RANK-ra (a sejtmag faktor-kappa B receptor aktivátora'h a TNFR-1-.re (tumor nekrőzis faktor receptor-1) és a 7NFR2-re (tumor nekrozís faktor receptor-2). Néhány megvalósítási mód szerint az anti-CÍMG ellenanyag nem mutat semmilyen észrevehető: specifikus kötődést egyetlen, CD4ő-től eltérő fehérjéhez. Az anö--CD4ö ellenanyagnak a CD40-re vonatkozó szelektivitását a szakterületen jól Ismert módszerekkel lehet meghatározni, a leírás kitanítása alapján, A szelektivitást például Western blottal, FAC8-szaf, BOSA-val vagy RIA-val lehet meghatározni (lásd például az 5, elfenaziyag,által,,felismert.CD40„ellenanyagok .azonosítása
A találmány tárgya továbbá egy humán antl~CD40 ellenanyag, amely kötődik a GB40~hez, és verseng, és/vagy ugyanahhoz az epitophoz kötődik, és/vagy ugyanazzal a. Kb-vel kötődik a CD4Ö-hez, mint egy humán antí-CD40 ellenanyag, melyet a következő csoportból lehet kiválasztani: 3.1,1» 3.1/1H-A78T, a 3,1,1A78T-W8A--W7A, a S.iJldWM W, a 7/1.2, IMA IS4.J, 21,4/1». 21,2/1, 22.1.1» 22X1H-C1Ö9A, 23.5.1, 23.25.1» 23.23.1, 23.28.1H-D1ŐK 23,28,IL-C92A, 23.29/1» 23.29.1V.R.174IC és a :24.,.2,1; vagy egy olyan, humán anti-CD4Ö ellenanyag, amely tartalmaz egy olyan nehéz lánc variábilis régiót amelynek az amínesav szekvenciáin a következő csoportból választható: 2,, ICL, 18., 26..
34., 42., 50.,,: 58.,, €6., 74,,, 82;., 90., 92., 96. vagy 98. számú amínosav szekvencia, vagy egy olyan humán antí-CB4Ö ellenanyag, amely olyan könnyű lánc variábilis régiót tartalmaz, amelynek az aminosav szekvenciája a következő csoportból választható:: 4., 12.,
20., 26, 36., 44., 52.,, 60., 68., 76, 84., 94., ÍÖÖ. vagy 102. számú aminosav szekvencia.
A szakterületen ismert bármelyik módszerrel azt is meg lehet határozni, hogy egy ellenanyag ugyanahhoz az: epitophoz kötődike, vagy verseng-e a kötődésért egy antnCD4Ö ellenanyaggal, Az egyik megvalósítási mód szerint hagyjuk, hogy a találmány szerinti. anti-CD40 ellenanyag telítési körülmények közön kötődjön a €D4Ö-hez, majd mérjük, hogy a vizsgált ellenanyag: mennyire képes kötődni a CB4ö~hez, Ha a vizsgált ellenanyag képes ugyanakkor megkötni a CD4Ö ellenanyagot, mint az antl-CO4ö ellenanyag, akkor a vizsgált ellenanyag egy másik: epitophoz kötődik, nem ahhoz, amelyikhez az anti-CÖ4ö ellenanyag. Ha azonban a vizsgált ellenanyag nem: képes ugyanakkor kötődni a €D40-hez, akkor az ellenanyag ugyanahhoz az epitophoz, egy átfedő epitophoz, vagy egy olyan epitophoz kötődik, amely a humán &néí-ÜD4Ö ellenanyag által kötött epitop szoros közelségében van. Ezt a kísérteiét elvégezheti ük BLISA-vak EIA-val, FACS-szal vagy felszíni plasmon rezonanciával (lásd például a 6. példát). Egy előnyben részesített megvalósítási mód szerint a kísérletet felszíni plasmon rezonanciával hajijuk végre. Egy még inkább előnyben részesített megvalósítási mód szerint BIAeore-t használunk.
* # *· ¥ á *· x A * $ * » * φ 4? «£*.» W *.„* dk %,?
A találmány néh ány megvalósítási módja szerint az antí-
CD4Ö ellenanyag, nagy affinitással kötődik a CD40-hez. Néhány
megvalósítási mód sze: rínt az antí-CD4Ö ellenanyag a. CDAÖ-feez
2>; ΙΟ”8 M, vagy kisebb í ía-vel kötődik. Egy másik előnyben részest-
2* lOX 4,öxlCH* m, vs így kisebb Ke-vel kötődik. Egy még ennél is
inkább előnyben része; slfcett megvalósítási mód szerint az ellena-
Néhány megvalósítási 2 nőd szerint az ellenanyag a CB4ö~hez lé-
nyegében ugyanakkora t Ko-vel kötődik, mint az az ellenanyag.
10.8.3. 1.5.1.....1, 24.4.1 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1,
23.25.1, 23.28,1, 2< k28,lH-D15E, 23.28,10-092¾ 23.29.1,
23.29.1L-R174IC és a 2 4.2.1. Egy másik előnyben részesített meg-
xalósítási möd szerint az ellenanyag a Ü.B4Ö-hez lényegében
ugyanazzal á Ks-vel k ötödik, mint egy olyan ellenanyag, amely
egy, az alábbi csonorth ól választható ellenanyag, könnyű láncának
CDR2-jét és/vagy neh ez láncának CDR3-át tartalmazza: 3.1,1,
3.IXH-A78T, a 3X4- A7ST-W8A-V97A, a 3Xlb-MMX38¥, a
7.1,2, 10.8,3, 15.1. L 21.4.1, 21.2.4, 22,1.1, 22.Í.1H-C109A..
nyag. amely egy olya a nehéz lánc variábilis régiót tarkáim az.
amelynek az amínosm ; szekvenciája a kővetkező csoportból vá-
iaszíhatö: 2., 10., 18., 26,, 34., 42», Sö», 53.., 66,., 74., 82., 9Ö<,
92., 96. vagy 98. szán tu amincsav szekvencia, vagy amely olyan
könnyű láncot tartalmaz, amelynek az aminosav szekvenciája, a következő csoportból választhatói 4., 12., 20., 28,, 36., 44., 52.,
60., 68., 76., 04,, 94., 100. vagy 102. számú aminosav szekvencia. Egy másik előnyben részesített megvalósítási mód szerint az ellenanyag' lényegében ugyanazzal: a Kn~vcl kötődik a CD4Ödtez, mint egy olyan ellenanyag, amely egy, az alábbi csoportból választhat© aminosav szekvenciával, rendelkező könnyű lánc variábilis rég® CDR2uét tartalmazza: 4„ 12.. 20.,. 28,, 36., 44,. 52., 60., 60., 76., 04.. 94., löö, vágy 102. számú aminosav szekvencia, vagy egy az alábbi csoportból választható aminosav szekvenciával rendelkező nehéz lánc variábilis régió CDR3-át tartalmazza.: 2., M,, IS,, 26,,
34., 42., 56., 50:.. 66., 74.., 02., 90., 92., 96. vagy 98, számú aminosav szekvencia.
Néhány megvalósítási mód szerint az antl~CB40 ellenanyagnak alacsony a dlsszocláciös sebessége. Néhány megvalósítási mód szerint az anít~6D4ö eOenanyag !£< értéke 2,0^10·^ vagy alacsonyabb. Néhány megvalósítási mód szerint Bűt értéke 2x1 Ö~7' vagy alacsonyabb. Néhány megvalósítási mód szerint a köír lényegében ugyanakkora, mint egy itt ismertetett ellenanyagnak, beleértve az alábbi csoportból választható ellenanyagot: 3.1,1, 3,1.1HA78T, 3.1.1-A75T-980A-V97A, 3.1,1L-L4M-188V, 7.1.2, 10.8.3,
15.1.1. 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1 JN-ClOOá, 23,5.1, 23,25,1,
23.28.1, 28.28.1ΜΠ6Β, 23.28.1Í-C92A, 23.29.1, 23.29.11R174R és 24.2.1. Néhány megvalósítási mód szerint az ellenanyag lényegében ugyan akkora Ivó értékkel kötődik a €D4G~bez, mint egy olyan eáenanyag, amely az alábbi csoportba tartozó aminosav szekvenciával rendelkező nehéz lánc variábilis régiót tartalmaz.: 2,,
10., 18., 26., 34,, 42,, SOt, 58., 66., 74., 82., 98., 92., 96. vagy 98. számú aminosav szekvencia, vagy amely olyan könnyű lánc varia44
κ· *
bilis- régiói tartalmaz, amelynek az aminosav szekvenciája a követválaszthatö; 4.„ 12., 20., 28., 36., 44., 52.
68., 76-, 8494., 100. vagy 102. száméi aminosav szekvencia. Egy másik előnyben részesített megvalósítási mód szerint az ellenanyag lényegében ugyanakkora lőe értékkel kötődik a CD40-hez, mint egy olyan ellenanyag, amely az alábbi csoportba tartozó aminosav szekvenciával rendelkező könnyű lánc variábilis régió €DR2-t tartalmaz: 4,s 12., 20,, 28., 36., 44., 52., 60., 68., 76., 84.,
94., 1ÖÖ. vagy 102. számú aminosav szekvencia, vagy’ egy olyan ellenanyag, amely az alábbi csoportba tartozó aminosav szökvén ólával rendelkező nehéz lánc variábilis régió ;CSE3~aé tartalmaz;
6., 14,, 2X, 30-, 38, 46., 54., 62., 76., 73., 86., 90., 92., 96. vagy 98. számú szekvencia
Egy :an.tí-CD40 ellenanyag kötési affinitását és őisszociáciős sebességét bármelyik, a szakterületen Ismert módszerrel meg lehet határozni. A kötési affinitást mérhetjük kompetmv ELISAval, RIA-val, vagy felszíni plusmon rezonanciával, azaz például BIÁcore-ral. A disszociádös sebesség is mérhető felszíni plasmon rezonanciával. Előnyösen a kötési affinitást és a disszodádős sebességet is felszíni plastnon rezonanciával lehet mérni. Még előnyösebben a kötési affinitást és disszocíáoiős sebességet BIÁcore;m~mel lehet mérni, lásd például a 14. példát.
A könnyű lánc,és a nebéz.i^n.gpoalkainazása
Egy találmány szerint anfi-CB40 ellenanyag tartalmazhat egy humán kappa vagy humán lamhda. könnyű láncét, vagy egy abból származtatható aminosav szekvenciát. Néhány, kappa könnyű láncot tartalmazó megvalósítási mód szerint a könnyű *· oo lánc variábilis domént |%) részben egy humán A3/AT9 (DRk-15f LS 1ÖP5): vagy A27 (DPK-22Í ¥s. gén kódosa,
Néhány megvalósítási mód szerint az antkCIMO ellenanyag Wje egy \ag\’ több amínosav helyettesítést tartalmaz a csíravonal aminosav szekvenciához viszonyítva. Néhány megvalósítási mód szerint az anb~Oö4Ö elfenanyag '%Je 1, 2, 3, 4, S:, 6:, 7, 8, 9 vagy 10 aminosav hőivel msitést tartalmaz a csíravonal aminosav szekvenciához viszonyítva. Néhány megvalósítási mód szerint az említett esiravonal helyettesítések közül egy vagy több a könnyű lánc: komplementaritást meghatározó régióiban van. Néhány megvalósítási mód szerint a csíravonalhoz viszonyított aminosav helyettesítések egy vagy több ugyanazon pozícióban vannak, mint a 3,1... 1, a. 3.1.1L-L4M-L38V', a 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1. 21.4.1, 21.2,1, 22X1,
23.5.1, 23.25.1, 23.28,1, 23.28. 1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L~ R17411 és a 24,2.1 ellenanyagok Vt-jébe-n a csiravonalhoz viszonyított helyettesítések. Például az anti-CD49 ellenanyag Vt-je a
21.4,1 ellenanyagban a csiravonalhoz· viszonyítva egy vagy’ több aminosav helyettesítést tartalmazhat, valamint tartalmazhat más aminosav helyettesítéseket is a 10.8,3 ellenanyagban a csíravonalhoz viszonyítva, amely ugyanazt a gént használja, mint a 21,.4,1 ellenanyag. Néhány megvalósítási mód szerint az aminosav hely értesítések egy vagy több azonos pozícióban vannak, de a referencia ellenanyagtól eltérő mutációt is tartalmaznak.
Néhány megvalósítási mód szerint a csíravonalhoz viszonyított amioosav cserék egy va^ több ugyanazon, pozícióban fordulnak elő, mint a 3.1.1, 3.1.1L-L4M-L38V, 7.1.2. 10:.8.3,
15.1.1, 21.4,1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5,1, 23,25.1, 23.28.1, 23.28.1L092A. 28.29,1, 23.29.1b-Rί74R és 24.2.1 ellenanyagok %-jében, de a változások lehetnek konzervatív aminosav helyettesítések, a
referencia ellenanyag aminosavához vis^önyitotx ilyen pozíclö(k)ban. Például ha ezeknek az eSenanyagoknak: egy adott pozíciója a csíravonalhoz viszonyítva megváltozott, és giutamái:, akkor ezt a pozíciót konzervatív módon, aszpartátra eseréáhegük. Hasonló módon, ha egy csíravooalhoz viszonyítva megváltoztatott aminosav helyettesítés; szerin, akkor ezt az adott pozícióban konzervatív módon treordnra lehet cseréim. Á konzervatív aminosav helyettesítéseket az előzőkben tárgyaltuk.
Néhány megvalósítási mód szerint a humán aníí-CDdO ellenanyag könnyű lánca olyan aminosav szekvenciát tartalmaz, amely azonos a 3.1.1(4. számú szekvencia) , a 3.1.1L-L4.M-L38V (94, számú szekvencia), a 7.1.2 (12., számú szekvencia), 10.8.3 (20, számú szekvencia), 15.1.1 (28, számú szekvencia), 21,4.1 (44..
számú szekvencia), 21.2.1 (36. számú, szekvencia), 22.1.1 (52, számú szekvencia). 23.5,1 (60. számú szekvencia), 23.28.1 (68. számú szekvencia), 23.28.1L-C92A (100. számú szkk\enda).
23,29.1 (76. számú szekvencia), 23,29.1L-R174K (102. számú szekvencia) vagy 24,2.1 (84, számú szekvencia): VRe aminosav szekvenciájával, vagy az említett szekvencia maximum 1,2,3.4,6,8 vagy 10 konzervatív aminosav helyettesítéseket, és/vagy maximum összesen 3 nem-konzervaíiv aminosav helyettesítést
Néhány megvalósítási mód szerint az anri~CD4ö ellenanyag könnyű lánca legalább a könnyű lánc CDR2-1 tartaimazza, és tartalmazhatja egy csíravonal szekvencia. CD.R1 és CDR3 régióját, az itt ismertetett módon. Rgy másik megvalósítási mód szerint a könnyű lánc tartalmazhatja egy, az alábbi csoportból függetlenül választható ellenanyag CDR-ét és CDROJéfc 3,1,1, a 3,1,XL~L4M~ L38V, a 7,1.2, 10,8.3, 15.1,1, 21,4.1, 21,2.1, 22.1.1, 23.5.1,
23.25.1, 2328.1, 2328.1L-C92A, 23.292, 23292 L-R174K és a
2422., vagy olyan CBR régiókat, amelyek 8-nál kevesebb, ó-nál kevesebb, 4-néi kevesebb, vagy 3--nái kevesebb konzervatív aminosav helyettesítést, és/vagy összesen három vagy kevesebb nemkonzervativ aminosav helyettesítést tartalmaznak, Más· megvalósítási módok szerint az anti-CD40 ellenanyag könnyű lánca tartalmazza legalább a könnyű lánc CDR2-régiót, és tartalmazhatja a CDRi és CDR3 régiókat Is, melyek egymástól függetlenül választhatók egy olyan elles anyag CDR1 és CBR3 régióiból, amely ellenanyag könnyű lánc variábilis régiója a következő csoportból választható aminosav szekvenciát tartalmazza; <, 12,, 26,,: 28,, 36., 44.,,
52., 69., 68.., 76.84., 94, vagy KX>< aminosav szekvencia, vagy egy olyan nukleinsav molekula kódolja, melyet az alábbi csoporthői választhatunk: 3., 11.., 19.., 27. 35., 43..,, 51..., 59., 67., 75.,
53., 93, vagy 99, számú szekvencia.
Ami a nehéz láncot iöeti, néhány megvalósítási mód szerint a nvhéz lánc aminosav szekvencia variábilis régióját részben egy humán Vh 3 30*» % 4-59, %? 1-Ö2, V» 4.35 vagy Vh 3-30.3 gén kódolja. Néhány megvalósítási mód szerint az and-CD40 ellenanyag %-ja a osíravooal aminosav szekvenciához viszonyítva egy \ agy több aminosav helyettesítést, deléeiőí vagy lőszereiét (addícáó) mrtalmaz. Néhány megvalósítási mód szerint a nehéz lánc variábilis doménje L 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 vagy 18 mutációt tartalmaz a csíravonal aminosav szekvenciához viszonyítva. Néhány megvalósítási, mód szerint a. mutációik) nemkonzervatív helyettesítések, a csíravonaí aminosav :s®ekvenc iájához viszonyítva. Néhány megvalósítási mód szerint a mutáció a nehéz lánc CDR régióiban vannak. Néhány megvalósítási mód szerint az aminosar-változtatásokat egy vagy több ugyanazon pori··
4$ *;«: Φ* ·*·»'♦:<
* Φ χ- »
Φ Φ * *
Φ Φ' Φ * «Χ.Φ.Φ *φ •Φ ΦΦ >.·». χ cióban hajtjuk végre, mint az alábbi ellenanyagok; 3,1.1, 3.1.1HA78T, a 3,l.l-A78T-V88Á~y97Aí 7.1.2, 10,8.3, 15.1,1, 21.4J,
21.2.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23,25.1, 23.28.1, 23.28,1H-D161S,
23.29.1, és 24.2.1 egy vagy több Vn-jában a cskavonalhoz viszony kon mutáció pozíciója. Más megvalósítási módok szerint az aminosav cserék egy vagy több azonos pozícióban vannak, de a referencia ellenanyagtól eltérő mutációk is vannak.
Néhány megvalósítási mód .szerint a nehéz lánc a 3,1.1 (2, számú szekvencia)» 3.1.1B-A78T (99, számú szekvenciái, 3.1.1A787-V88A-V97A (92. számú szekvencia), 7.1.2 (10. számú szekvencia), 10,8,3 (18. számú szekvencia), 13.1.1 (26. számú szekvencia), 21.2.1 (34. számú szekvencia), 21.4.1 (42. számú szekvencia). 22.1.1 (50. számú szekvencia) 22.1.1H-C109A (96. számú szekvencia), 23,5.1 (58. számú szekvencia), 23,28.1 (66. számú szekvencia)». 23,28.10-0168 (98. számú szekvencia), 23.29,1 (74. számú szekvencia), és 24.2.1 (82, számú szekvencia) variábilis dómén (V«) egy amínosav szekvenciáját tartalmazza, vagy az említett amínosav szekvencia maximum 1, 2, 3» 4» 6,. 8 vagy lö konzervatív amínosav helyettesítést, és/vagy maximum 3 nem-kcnzervaíív amínosav helyettesítést tartalmaz.
Néhány megvalósítási mód szerint a nehéz lánc tartalmazza a 3,1.1. 33.JH-A78T, 3,l,i-A78T~V88A-V97A, 7.1.2, 19.8,3,
15.1. h 21,4,1, 21.2,1, 22.1.1, 22J..1H-C169A, 23.5.1, 23.25.1,
23.28.1. 23.28,1H-D16E, 23.29.1, és 24,2.1 ellenanyag- C»l, CDR2 és CDR3 régiéit (amint az az ID- IH. vagy a 2O-2H, ábrákon látható), vagy az említett komplementaritást meghatározó régiók 8-nál kevesebb, 6-nál kevesebb, 4-nél kevesebb, vagy 3~oál kevesebb konzervatív amínosav helyettesítést, és/vagy összesen
Φ * * * -X » · * *· * » « » χ· Φ * * * w φ .φ X * * X <- φ « Φ ο * * ·
ΦΦΦΓ-Φ. φφ· ** *·-·* ** bárom vagy kevesebb nem-ksnzervativ ammosav helyettesítést tartalmaznak.
Néhány megvalósítási mód szerint a nehéz lánc tartalmaz eg\ CDR3 régiót es tartalmazhatja egy csíravonal szekvencia CDR1 és CDR2 régióját is, az előzékben ismertetett módon, vagy tartalmazhatja. egy ellenanyag CDR1 és CDR2 régióját, amelyeket egymástól függetlenül választunk egy olyan efenanyagbők amely az alábbi csoportból választott ellenanyag nehéz láncát tartalmazza-. 3,1.1» 3.1.IN-A78T, a 3.1.1-A78T-V88A-W7A,. 7.1.2». 10.8.3,
15.1.1, 21.4,1, 21.2,1, 22.1.1, 22.1. IH-C109A, 23,5.1» 23.25.1,
23.28.1, 23.28,1H~D16S, 23.29.1, és 24.2,1. Egy másik megvalósítási. mód szerint a nehéz lánc tartalmaz egy CDES-ai, és tártálmazhatja a CDR1 és CDR2 régiókat is, melyeket egymásról függetlenül választunk ki egy olyan nehéz lánc variábilis régió CDR1 és CDR2 régiójából, melynek arnínosav szekvenciája a 2., 10., 18.»
26., 84,,, 42.» 50.» 58.» 66., 74., 82,» 90,,, 92:.,., 96. vagy 98. számú aminosav szekvenciák közül választható jamint az az ID-IB.» vagy a 2D-2H. ábrákon látható), vagy-, az alábbiak közül választható nukleinsav szekvencia kódolja: 1.» 9., 17., 25,„ 33.» 41.,, 49..,
57., 55., 73., 81.» 89., 91.» 95. vagy 97. számú nukleinsav szekvencia. Egy másik megvalósítóm mód szerint az ellenanyag tartalmaz egy előzőkben tárgyalt nehéz láncot, valamint egy előzőkben tárgyalt könnyű láncot.
Az elvégezhető aminosav helyettesítések egyik típusa az ellenanyag egy vagy tóbb ciszteincsoportjának, amely kémiailag: reakrióképes lehet, egy másik csoportra, azaz: például,, anélkül, hogy’ ezekre korlátoznánk magunkat, alaninra vágj szerinre való cseréje. Az egyik: megvalósítási mód szerint a risztéin belyettesttést egy ellenanyag variábilis dómén vagy egy konstans dómén keretreφψ X X-.* *
SS ψ:>· χ * giójában hajijuk végre. Egy másik megvalósítási mód szerint a eisztein az edeumiyagnak egy nem-kanonikus régiójában van. Az elvégezhető aminosav helyettesítések egy másik típusa az elenanyag bármelyik potenciális proteoiitikus helyének a megváltoztatása, főleg annak, amely a variábilis dómén egy keretregíéjábary egy ellenanyag konstans domépjeben, vagy az ellenanyag: nem-kanonikus régiójában található. A ciszíeincsoportok helyettesítése és a pröteelííikns helyek eltávolítása csökkentheti az ellenanyag termék bármilyen heterogenitását, és ezzel növeli a homogenitását. Az. aminesav helyettesítések egy másik típusa a potenciális dezamidálási helyeket képezd aszparagln-giícin párok eliminálása, bármelyik, vagy mindkét csoport megváltoztatásával.. Ezt előnyösen az ellenanyag keretrégiójában, konstans dóménjében vagy nem-kanonikus régióiban hajtjuk végre,
ACD40,akiMása,anh-CD4Q..elgnanyaggal
A találmány tárgya továbbá egy anti-CD4Ö ellenanyag, amely egy aktiváló ellenanyag, azaz egy CD40 ágonista. Egy aktiváló ellenanyag felerősíti vagy helyettesíti a CD40L €B4Ö~re gyakorolt hatásait, Néhány megvalósítási mód szerint az aktiváló ellenanyag lényegében a CB4Ö1 egy utánzója (mímicj, és a. CD40L-lel verseng a CD4ö~hez való kötődésért. Néhány megvalósítási mód szerint az ellenanyag nem verseng a CEMOL-lel a CO4Ö-hez való kötődésért, hanem felerősíti a CD40L CB40~bez való kötődésének hatását. Néhány megvalósítási mód szerint az anthCÖ4Ö ellenanyag aktiválja. a CÖ4Ö~eh CD40b jelenlétében vagy távolétéhen...
A tumomővekedés g;
rmo anu-uj .nv, *· »
.53
Néhány megvalósítási mód szerint a találmány tárgyát egy olyan. anri-GíMÖ ellenanyag képezi, amely in ohro gátolja a tumorsejtek szaporodását vagy in rioo gátolja a tumornövekedést.
Néhány megvalósítási mód szerint az ellenanyag legalább 50, 55, 60, 65, 70 vagy 75%-ban gátolja a tumor növekedését. Néhány megvalósítási mód szerint, ai ellenanyag 75%-ban gátolja a tumornövekedést. Az egyik megvalósítási mód szerint a tumornövekedés gátlása az ellenanyaggal végzett kezelés megkezdése után 14 nappal mutatható kL Más megvalósítási módok szerint a tumornővekedés gátlása az ellenanyaggal végzett kezelés megkezdése után 7 nappal mutatható ki. Néhány megvalósítási: mód. szerint az állatoknak az: anri-€D4Gi ellenanyaggal együtt más antineoplasztikus szert is beadunk. Néhány megvalósítási mód szerint az antineoplasztikus szer továhh gátolja a fumomóvekedést. Néhány megvalósítási mód szerint az antineoplasztikus szer ahriamiom vagy taxol. Néhány megvalósítási mód szerint egy anöneoplasztikus szer és az anti-CD4Ö ellenanyag együttes beadása legalább 50%-bao gátolja a tumornövetedést, 22-24 nappal a kezelés megkezdése után, egy kezeletlen állatban kapott tumonoövekedéshez hasonlítva.
Az apoptőzls indukciója antí- CD40 ellen anyagokkal
A találmány tárgya továbbá egy olyan antí~CD40 ellenanyag.
amely a CD40 pozitív sejtek sejtpusztulását okozza, Néhány megvalósítási mód szerint az ellenanyag a C tőzisát ót .w vagy m. vám okozza, pozitív sejtek apopA sejtfelszíni molekulák expressziójának fokozást ί 5 *·♦:
Néhány megvalósítási mód szerint az sntí-CBáÖ ellenanyag fokozza a B-sejtek felszínén fevő molekulák expressziőjád beleértve, artélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az ICA, MHC-1L B7-2. CD7X, CD23 és CD38 molekulákat. Néhány megvalósítási mód szerint I pg/ ml ellenanyag legalább kétszeresre, vagy jobban , előnyösen legalább négyszeresre fokozza, az ICÁM expresszióját egy teljes vér B-sejt-felszíni molekula felerősítési esszében. Néhány megvalósítási mód szerint 1 pg/ml ellenanyag az MHC--II espressziőját egy teljes vér B~ sejt-felszíni molekula felerősítési esszében legalább kétszeresre, vagy előnyösebben legalább háromszorosra fokozza. Néhány megvalósítási mód szerint 1 ag/ml ellenanyag a CD23 expresszipját egy teljes vér B-sejt-felszíni molekula felerősítési esszében legalább kétszeresre, vagy előnyösebben legalább ötszörösre fokozza, (lásd például a 27. táblázatot).
Néhány megvalósítási mód szerint az antí-CD4Ö ellenanyag fokozza a dendrites sejtfelszíni molekulák, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az MHC-H-t, az ICAM-ot. a B7-2-U a CD83-at és a B7-I-et, expresszióját. Néhány megvalósítási mód szerint a felerősítés mértéke hasonlít a B-sejteknéi magágyéit felerősítéshez (lásd például a 25. és 26. táblázatot, infoa). Néhány megvalósítási mód szerint az ellenanyag előszeretettel erősíti fel a dendrites sejtfelszíni molekulák, azaz például a B7-2 és az MHC-II expresszioját, ezeknek a molekuláknak a. B-sejtekben való expresszlőjával összehasonlítva (lásd: a 27. táblázatot).
A celluláris eitokinek szekréciójának fokozása
Néhány megvalósítási mód szerint az ellenanyag fokozza a eitokinek celluiáris szekrécióját, beleértve, anélkül, hogy ezekre ♦··*· φ * korlátoznánk magunkat, az íntsrfeukki~8~at, az interteukm-12-t, interieukin-15-öt, interienfcm- 18-at és inierieukm-23~ab
Néhány megvalósítási mód szerint az ellenanyag a dendrites sejtek és a tapadó monoeíták eltolón, szekrécióját fokozza. Néhány megvalósítási mód szerint a. cítekin-termelést tovább fokozza az EPS, IFNy vagy ínterleukin- 1β közül eggyel vagy többel végzett kostimuláció, A találmány egy további megvalósítási módja szerint az ellenanyag EPS ko~sümuláeiöval fokozza az fh~12pW termelését egy dendrites sejt-esszében, ennek EC50 értéke körülbelül 0.48 ag/mi. Néhány megvalósítási mód szerint az ellenanyag az IL12p70 termelését a dendrites sejtekben körülbelül 0,21 pg/ml ECsc értékkel fokozza (lásd például 8. példa).
Néhány megvalósítási mód szerint az ellenanyag az IPNy szekréciójáé T-sejtekkel fokozza, egy áiogén T-sejé/dendrites sejt esszében, a, 8. példában ismertetett módom Néhány megvalósítási mód szerint az ellenanyag az IFWy szekréciójáé egy állagén Tsdt/dendrites sejt esszében körülbelül 0,3 pg/nil ECsq értékkel fokozza. Néhány megvalósítási mód szerint, az ellenanyag egy altegén T-sejt/dendrites sejt esszében az IFNv szekréciót körülbelül 0,2 ag/tnl ECso értékkel fokozza. Mz egyik megvalósítási mód szerint az ellenanyag egy állagén T-sejt/dendrites sejt esszében az IFNy szekréciót: körülbelül 0,03 pg/mi ECso értékkel fokozza.
tás ellenanyagok és ellenanyagot termelő sejtek előállítására tteara
Immunizálás
Néhány megvalósítási mód. szerint a humán ellenanyagokat úgy állítjuk elő, bog}.' egy nem-humán állatot, amely genomjában a barnán ímmutrgtebulin nehéz lánc és könnyű lánc lőkuszokat tartalmazza egy CD40 antigénnel immunizálunk. Egy előnyben része** :«« * * » * * ·♦ »» *: < * * * » * * * * ♦ ««* *·* Φ* ·«*' *« élteit megvalósítási mád szerint a nem-humán állat egy Xenotóeuse^ álak
A Xenoklouse^^ egerek biotechnológiai módszerekkel megváltoztatott egerek, melyek a humán immunglobulin nehéz lánc és könnyű lánc lokuszok nagy fagmenseit tartalmazzák, és az egér ellenanyag termelésében defciensek; (Green és misak Natúré Genetics 7, 13-21 (1994): 5,:916,771, 5,939,598,
5,985,615, 5,998,209, 6,075,181, 6,09 LOO1, 6,119,598,
6230,364, 6,162,963 és 6,150,584 számú Amerikai Egyesült Állam ok-bek szabadalmi leírás. Lásd még a WO 90/10741. WO 94/02602, WO 96/34096, WO 96/33735, WO 98/16654, WO 98/24983, WO 98/50433, WO 99/45031, WO 99/33049, WO 00/09560 és W0 00/037504 szánni szabadalmi leírás,.
Egy másik szememből a találmány tárgya eljárás amiCD40 ellenanyagok, előállítására nem-humán, nem-egér állatokból, olyan, nem-humán iranszgeníkus állatokat immunizálva egy CO9Ö: antigénnel, melyek humán immunglobulin lőkuszekat tartalmaznak, Az ilyen álatokat az előzőkben idézett dokumentumokban ismertetett módszerekkel lehet előállítani. Az ebben a leírásban ismertetett e|:árásokat az 5,994,609: számú Amerikai Egyesült Áfemok-bell szabadalmi leírásban ismertetett módon lehet módosítani. Egy előnyben részesített megyalősitási mód szerint a nem-humán állatok lehetnek patkányok, birkák, sertések, kecskék, szmvasmarhák vagy lovak.
A. XenoMnusé™ egerek: a. teljesen humán ellenanyagok feioőít-szerú humán repertoárját termelik, és ^antigén-specíSrus humán ellenanyagokat termelnek. Néhány megvalósítási mód szerint a XbnoMousé^ egerek a humán ellenanyag ¥' gén repertoárnak körülbelül 80%-át tartalmazzák., a humán nehéz
X» «* ή·*·#·’* .
*· · φ X- Φ -* > * φ « » »· -X $ * * :*·« «»:4ι **:
ane íokuí es itappa zok egy megabázis m a humamzak mramgtote.meretu, csrravonm konhguraetöju eleszto mesterséges nromcszöma (YAC) fragmensek bejuttatásával [Mendez és mtsai: Natúré Genetics 15. 146-156 (1997); Green és dakohovits: d, Bxp, Med. 186, 483-495 (1993); WO 98/24893 számú szabadalmi leírás, amely publikációkat a továbbiakban referenciaként kezelünk).
Néhány megvalósítási mód szerint a humán immunglobulinokat tartalmazó nem-humán.
lin ...minílökuszt’' tartalmazó állatok, A. minilökusz megközelítési mód szerint egy exogén lg lókuszt az lg lökuszböl származó egyes gének bevitelével utánzunk, Azaz egy vagy több % gént, egy vagy több Dh gént, egy vagy több Ja gént egy mu. konstans dornént és egy második konstans domént (előnyösen egy gamma. konstans domént) viszünk be egy konstrukcióba, amelyet azután egy állatba juttatunk be. Ezt a megközelítést többek kozott az 5,545,307,
5,545,.806, 5,569,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,046, 5,770,429, 5,789,650, 5,814,348, 5,591,669, 5,612,205, 5,721,367, 5,789,215 és 5,643,763 számú Amerikai Egyesült Allamok-beíi szabadalmi leírásban ismertetik,, amely publikációkat a továbbiakban referenciaként kezelünk.
A minilé amellyel az lg lókusz részeit tartalmazó konstrukciókat elő lehet állítani, és állatokba bejuttatni. Azonban a minilőkusz megközelítési mód egy potenciális hátránya az, hogy esetleg nincs elegendő immunglobulin diverzitás a B-sejtek teljes kifejlődésének támogatására, azaz alacsonyabb lehet az ehenanvag-termelés.
A találmány tárgya továbbá eljárás humanizált: antí-CD40 elmegkőzeíitési mód egyik onye az a gyorsaság.
lenanyagok előállítására. Néhány megvalósítási mód szerint a nem-humán állatokat egy CD4Ö antigénnel immunizáljuk, az ♦ *· ♦*<* Φ » * φ *· »” ♦ S .χ * ·ϊ *·:*
4» alábbiakban ismertetett módon, olyan körülmények között, amelyek tehetővé teszik az ellenanyag-termelést. Az ellenanyagot termelő sejteket izoláljuk az állatokból, mielőmákkal fúzión áltatjuk a hibridómák előállítása céljából, és egy számunkra érdekes antí-CD40 ellenanyag nehéz láncát és könnyű láncát kódoló nuklemsavak&l izolálunk. Ezeket a nukleinsavakat azután, biotechnológiai módszerekkel megváltoztatjuk, a szakterületen jártas szakember számára ismert, és az alábbiakban ismertetett módszereket alkalmazva, hogy csökkentsük a nem-humán szekvencia mennyiségét., azaz humanizáljuk az ellenanyagot., azzal a céllal, hogy csökkentsük az immunválaszt: az: emberekben.
Néhány megvalósítási mód szexiül a CD40 antigén izolált és'vagy tisztított CD40. Egy előny ben részesített megvalósítási mód szerint a CD40 antigén egy humán CD40. Néhány megvalósítási mód szerint a CD40 antigén a GD4Ö egy feagmense. Néhány megvalósítási mód szerint a 0340 fe&gmens a CD4Ö extraeeluláris döntésije. Néhány megvalósítási mód szerint a CD4Ö feagmens a. CD4Ö-nek legalább egy epxtopját tartalmazza, Más megvalósítási módok szerint a GD40 antigén, egy olyan; sejt, amely a CD40-et vagy annak fragmensét a felszínén expresszálfa vagy túfeqpresszálja. Néhány megválősíMsi mód szerint a CD4Ö antigén egy CD4Ö Fúziós fehérje.
Az állatokat a szakterületen ismert bármelyik módszerrel immunizálhatjuk parknv és rntsai: ^Anhbodies: A baboratory Manual 2, kiadás. Gold Spring Bar bor bafcoratory Press, Cold Spring Harbor. New York (1990)1, A nem-humán állatok, azaz például egerek, patkányok, birkák, kecskék, sertések szarvasmarhák és lovak immunizálási módszerei a szakterületen jól ismertek: (j:Bartew és rntsai; „Antíbodies; A Laboratory Manual, 2, kiadás.
*:*· •Φ 9 » *·
Φ *' * * ΦΦ φ:
•V ·*
Cold boring Harbor Laboraiory Press, Cold Spring Harbor, New York (1990); 5,994,619 számú Amerikai Egyesült Ailamok-beli szabadalmi kávás). Egy előnyben részesített megvalósítási mód szerint a CB4Ü antigént egy adjuvánssal adjuk foe, hogy stimuláljuk az immunválaszt Az adjuvánsok közé tartozik például, a komplett vagy inkomplett Preund féle adjuváns, a RIS1 jmuramil dipeptidek) vagy az ISCOM. {ímmunsdmulálő komplexek). Az ilyen adj;uvánsok.: meg tudják védeni a pobpepüder a gyors diszperziótok egy helyi lerakódásban megkötve, vagy tartalmazhatnák olyan anyagokat, amelyek stimulálják a gazdaszervezetei, hogy szexretálja azokat a faktorokat. amelyek a rnakrofágokra, és az immunrendszer más komponenseire kemotaktikusak, Ha egy pollpeptidet beadunk, akkor az immunizálási terv előnyösen magában foglalja a polipeptid kétszeri vagy többszöri beadását., több hétre kiterjesztve.
Áz 1. példában egy and-€B4Ö monoklonális ellenanyagok előállítását ttjuk le.
fása
Miután egy állatot egy €D4Ü antigénnel immunizáltunk, az állatból ellenanyagok és/vagy ellenanyagot termelő sejtek állíthatok elő, Néhány megvalósítási mód szerint az anti-CB40: ellenanyagot tartalmazó szérumot egy állatból, úgy álltjuk elő, hogy megvéreztetjük vagy leöljük. A szérumot használhatjuk az; állatból kinyert módon, immunglobulin frakciót kaphatunk a szérumból, vagy az anti-CD40 ellenanyagot tisztíthatjuk a szérumból, A szakterületen jártas szakember számára jól ismert, hogy az így kapott szérum vagy immunglobulinok poliklonálísak
S> * « ♦ K » * *· * uk V \> X V lesznek. A szérumból előállított polüdonális ellen anyagok használatának hátránya, hogy a kapható ellenanyagok mennyisége korlátozott, és a políklönálís ellenanyag tulajdonságai heterogének.
héhány .megvalósítási mód szerint az ellenanyagokat termetek órökéletüvé tett sejfvonalakat az immutrizált állatokból izolált sejtekből állítjuk elő. Az immunizálás után az állatokat leöljük, és a nyirokcsomó és/vagy lép δ-sejteket örökéletűvé tesszük. A sejtek űrökélelőve tételének módszerei köze tartozik, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, hogy onkogénekkel transzformáljuk, onkogén vírusokkal fertőzzük őket, majd olyan körülmények között tenyésztjük ókét, amelyek az örökéletúvé tett sejteket szelektálják, karcinogén vagy muíagén vegyüietekkel kezeljük, egy immort&tízált sejttel, azaz például egy mielőma. sejttel fűzi ónál tarjuk, egy tumor szuppresszor génnel inaktiváljuk /Harlow és mtsai; „Anühodies: A baborafory Bíanual, 2. kiadás. Coki Spring Harbor hahoratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1990)]. 8a a mielőma sejtekkel való fúziót használjuk, akkor az az előnyős, ha a mielőma sejtek nem szekretáfeak im munglohuhn polipeptidet (nem-szeferetálő sejtvonalj. Az örökéletüvé tett sejteket ÜD4ö~nel, annak egy részével, vagy egy CD40et expresszálö sejttel vizsgáljuk át. Egy előnyben részesített megvalósítási tnöd szerint a kiindulási szűrővizsgálatot egy enzimhez kötött immunszorbens vizsgálattal (ELISA) vagy radioim.munesszéve! hajtjuk végre. Az ELISA szűrővizsgálat egyik példáját a Wö 00/37504 számú .Amerikai Egyesült Allamok-beh szabadalmi leírásban ismertetik, amely publikációt a továbbiakban referenciaként kezelünk.
S
-* *
Az anti~CD40 ellenanyagot termelő sejteket, azaz például hibridőmákat szelektáljuk, klónozzuk, majd tovább vizsgáljuk, vannak-e kívánt jellemzőik, beleértve az erőteljes növekedést, a magas ellenanyag-termelést és a kívánt ellenanyag jellemzőket, amint azt az alábbiakban részletesen ismertetjük, A. hibridőmákat szaporíthatjuk in tw szingemkns állatokban., olyan állatokban, amelyekben nincs immunrendszer, ilyen például a pucér egér, vagy in yitro, sejttenyészetekben. A hibridőmák: szelekciója, klónozása és szaporítása a szakterületen átlagos jártassággal rendelkező szakember számára jól ismert.
Egy előnyben részeskett megvalósítást mód szerint az immunizált állat egy nem-humán állat, amely humán immunglobulint expresszál, és a lépböl származó B-sejteket egy olyan mielóma sejtvonalhoz fűzion áltatjuk, amely ugyanabba a fajba tartozik. mmt a nem-humán állat. Egy inkább előnyben részesített megvalósítási mód szerint az immunizált állat egy XETOMGUSBw: állat, és a míeíóma. sejt egy nem-szekréciós egér míefőma. Egy még inkább előnyben részesített megvalósítási mód szerint a mielóma sejt a P3-X63-AG8.653 (lásd például az 1. példát).
Egy másik megvalósítási mód szerint a találmány tárgyár olyan bibridőmák képezik, amelyek humán: aníi--CD4Ö ellenanyagot termelnek. Egy előnyben részesített, megvalósítási mód szerint a hibridőmák egér hibridőmák, az: előzőkben ismertetett módon. M,ás megvalósítási módok szerint a hibridőmákat nem humán. nem-egér fajuk termelik, azaz például patkányok, birkák, kecskék, szarvasmarhák vagy lovak. Egy másik megvalósítási mód szerint a hibridőmák humán hibridőmák.
Nutóeimsavak, vektorok, gazdaseitek és rekonrhináns; módszerek ellenanyagok előállítására
Nukleinsavak
A találmány tárgyát olyan nukleinsav molekulák képezik, amelyek anti-CD40 ellenanyagokat kódolnak. Néhány megvalósítási mód szerint a különböző nukleinsav molekulák egy antiCD40 immunglobulinnak egy nehéz láncát és egy könnyű láncát kódolják. Más megvalósítási módok szerint ugyanezek a nukleínsav molekulák egy anti-CD40 inn^uaglobűlin nehéz láncát és könnyű láncát kódolják.
Néhány megvalósítási mód szerint a könnyű lánc variábilis doménjéí kódoló nukleinsav molekula egy humán A3/Á19 (ΠΡΜ15-k 95 (DP5) vagy A27 (DPK-22}V3 génszefcvemeia., vagy egy ebből származó szekvencia. Néhány megvalósítási mód szerint a nukleínsav molekula tartalmazza egy A3/AI9 VK gén nukleotid székvenciájál. valamint egedül, JK2 vagy 3 3 gént, vágj’ ezekből származó szekvenciákat. Nehány megvalósítási mód szerint a nukleinsav molekula egy L5 v;; gén és egy 3-4 gén. uukleotíd szekvenciáját tartalmazza. Néhány megvalósítási mód. szerint a. műidéinsav molekula tartalmazza egy A27 VK: gén és egy 3K3 gém nukleotid szekvenciáját.
Néhány megvalósítási mód szerint, a könnyű láncot kódold nuklelnsav molekula, egy óban. ammnosav szekvenciát tartalmaz, amely a csíravonal. szekvenciához viszonyítva 1. 2, 3, 4, 5, ö, 7, S, 9 vagy 10 mutációt tartalmaz. Néhány megvalósítási mód szerint a nukleinsav molekula egy -olyan nukleotid szekvenciát tartalmaz. amely egy olyan ¥t amdmosav szekvenciát kódol, amely a csíravooal szekvenciához viszonyítva 1, 2, 3, 4, S, 6, 7, 8, 9 vagy 10 mem-komzervatív amlnosav helyettesítést, és/vagy 1., 2 vagy 3 öt «:·* :»·».· :.·*·♦:* * *-* *. Λ < φ. -* *♦ * * η 3 :. η : : : :<.:«««· *» »’·: **·> ♦♦ nem-konzervatív helyettesítést tartalmaz;. A helyettesítések lehetnek a €ÖR régiókban, a keretrégiókban, vagy a konstans do ménben.
Néhány megvalósítási mód szerint a könnyű lánc (V;.) variábilis doménjét kódold nukleinsav molekula egy olyan V-, amínosav szekvenciáé kódok amely a csiravonal szekvenciájához viszonyítva egy vagy több olyan mutációt tartalmaz, amelyek azonosak azokkal a mutációkkal amelyek az alábbi csoportba tartozó ellenanyagok közül az: egyik Wjében tai:álbatok: 3.1.1, 3X.13~L4M~ 338V, 7.1.:2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2,1, 22.1,1, 23.5.1,
23.25.1, 23.28.2, 23.28,13-092¾ 23.29.2 és a 24.2,1. Néhány megvalósítási mód szerint a nukleinsav molekula az alábbi ellenanyagok egyikében található 19 csiravonal szekvenciához viszonyítva legalább három amincsav mutációt tartalmaz-: 3.1.1, 3.1.1L-34M-L3W, 7.1.2, 10,3.3, 15.1.1. 21.4.1, 21.2,1, 22,1.1,
23.5.1. 23.25.1,23.28.5 23.28.13-0923, 23.29.1 és a. 24.2.1.
Néhány megvalósítási mód szerint a nukleinsav molekula egy olyan nukleorid szekvenciát tartalmaz, amely a kővetkező ellenanyagok %. amincsav szekvenciáját kódolja; 3.1.1 (4, számú szekvenciái, 3.513-34M-33W (99, számú szekvencia), 7.1,2 <12. számú szekvencia), 10.8,3 <20. számú szekvencia), 15.1,1 (28.
számú szekvencia), 21.4.1 (44. számú szekvencia.), 21.2.1 (36.
ftzmnu suuucnc-m. 22 1 1 ;52 számú szektencú. 23.5,1 (6x7.
számú szekvencia), 23.28.1 (65. száméi szekvencia), 23.28.13C92A (100. számú szekvencia), 23.29.1 (76. számú szekvencia), 23,29,1L-R174K (102. számú szekvencia) vagy 24.2,1 <84. számú szekvencia), vagy' annak egy része. Néhány megvalósítási mód szerint a szóban forgó rész legalább a CDR3 régiót tartalmazza. Néhány megvalósítási mód szerint a nukleinsav az említett ellena£2 *♦ ΧΧ.χ» * « Λ ♦ -*
* «· nyag könnyű lánc CDR <k aminosav szekvenciáját kódolja. Néhány megvalósítási mód szerint a szóban forgó rész egy egybefüggő rész. amely CDRl-CDR3-at tartalmaz.
Nehány megvalósítási mód szerint a nukleinsav molekula egy olyan mufoeotid szekvenciát tartalmaz, amely a. 4...,, 12.,, 20,, 28.?: 36,, 44,:, 52., 60., 68.,, 76·,., 84,, 94.vagy 100. aminosav szekvenciák egyikét kódolja, vagy a szobán forgó szekvenciából hiányzik a szignálszekveneia. Néhány előnyben részesített megvalósítási mód szedni a nukleinsav molekula, tartalmazza a 3., 11.,
19., 27., 85.:í 43,, 51,, 59.., 67.. 75., 83,, 93.., vagy 99, számú nukleoúd szekvenciát, vagy annak egy részéi, és a szóban forgó szekvenciákból adott esetben hiányzik a srignáiszékveneis.
Néhány megvalósítási mód szerint a szóban forgó rész egy Vb régiót: kódot Néhány megvalósítási mód szerint a szóban forgó rész legalább a CDR2 régiót kódolja. Néhány megvalósítási mód szerint a nukJeinsav a, szóban forgó ellenanyag könnyű lánca CDR-ek aminosav szekvenciáját kódolja. Néhány megvalósítási mód szerint a szóban forgó rész a €DRl-CDR3-hői egy egybefüggő régiót kódol
Néhány megvalósítási mód szerint a nukleínsav molekula egy ohan V-, aminosav szekvenciát kódol, amely legalább 70, 75, 80. 85, 90, 95, 97, 98 vagv 9983-ban azonos a 3.1.1, 3.1.1L-L4ML38V, 7.1.2, 10.3.3, 15.1.1, 21,4,1, 21.2,1, 2:2.1,1, 23.5.1,
23.25.1, 23.28.1, 23.28.Ib~€92Á,: 23.29.1 vagy :24,2.1 ellenanyagok egyikének Yh aminosav szekvenciájával, vagy az alábbi, 4,.
12., 20,, 28., 36,. 44., 52,, 60,, 68., 76,, 84.,, 94.vagy löö. aminosav szekvenciák egyikének % aminosav szekvenciájával, A találmány szerinti nukleínsav molekulák közé tartoznak azok a nukleinsavak, amelyek erősen szigorú, azaz például az előzőkben ismertetett körülmények között hibridizálódnak egy nőidéin sav * * **ΚΦ < * <s> « ·* c- *· · * * * * ·* ♦ *ΧΦ ♦ * »-»szekvenciához, amely a 4, 12., 2:0., 28, 36, 44, 52,? 60, 68.*
76., 84, 94.vagy 100. aminosav szekvenciák egyikét kódolja, vagy nukieinsav szekvenciája az alábbiak egyike: 3, 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 93,. vagy 99. számú nukleodd szekvendi S,
Egy másik megvalósítási mód szerint a nufcfemsav az alábbi csoportba tartató· ellenanyagok egyikének egy teljes hosszúságú könnyű láncát kódolja: 3.1.1, 3.1.1L--L4M L38V, 7.1.2, 10.8.3.
15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.12, 23.52, 23.25.1, 23.282, 23.2820C92A, 23.29.1. 23.2920 R17K vagy 24.2.0 vágj egy olyan könnyű láncot, amely a 8, 1.6, 24, 32, 40., 48, 56, 64, 72, 80, 88, 94, 100, vagy 102. számú aminosav szekvenciái tartalmazza, vágj? egy olyan könnyű láncok amely egy mutációt: tartalmaz, például egy, az alábbiakban ismertetett: mutációt. Bmehett, a nukleinsav tartalmazhatja a. 7, 15, 28,: 31,. 39, 47, 55, 63, 71, 79. vagy 87. számú nnkleinsav szekvenciát, vagy eg> olyan nukiemsav molekulát, amely egy,, az alábbiakban ismertetett mutációt tartalmazó könnyű láncot kódol.
Egy másik előnyben részesített megvalósítási mód szerint a nnkleinsav molekula, a nehéz lánc (02 variábilis doménjét kódolja, amely lehet a humán 3-30*, 4-59, 1-0:2, 4.35 vagy 3,30 Vu szekvencia, vagy egy ezekből származó szekvencia. A különböző megvalósítási módok szerint a nukleinsav molekula tartalmazhat egy humán 3-30- V« gént, egy 04 (DIRS} gént és egy humán 2W> gént; egy humán 3-3Ö* Vh gént, egy humán 01-26 (DIRS; gént, és egy humán dh6 gént; egy humán. 4.35 ¥h gént, egy humán .DIR3 gént és egy humán dkó gént; egy humán 4-59 Vh génk e^r humán 0423: gént és egy humán Jh4 gént; egy humán 1-02 Vh gént. egy humán DÓRI gént és egy humán Jn4 gént; egy humán 3-30· Vb ·♦*♦ ·».» gént, egy humán Db-19 (DIRS) gént, és egy humán ,bh szekvenciát; egy humán 3-30* Yh gént, egy humán Dl-i gént és egy humán 3u6 gént; egy humán: 3-304- ¥h gént, egy humán 04-17 gént és egy humán 3a6 gént; egy humán 4-59 Vn .gént, egy humán IMIT (DIRI) gént és úgy humán ,b;5 gént, vagy egy. a humán génekből származó szekvenciát
Néhány megvalósítási mód szerint a nukle risav molekula egy olyan, aminosav szekvenciát kódot amely a humán V, D vagy 3 gének csiravonal aminosav szekvenciájához viszonyítva 1, 2, 3, 4, 5, &, 7, 8, 9, 10 11, 12. 13, 14, 15, 16, 17 vagy 18 mutációt tartalmaz. Néhány megvalósítási mód szerint a szóban forgó mutációk a Vh régióban vannak. Néhány megvalósítási mód szerint a szóban forgó mutációk a CDR régiókban vannak.
Néhány megvalósítási mód szerint a nukleinsav molekula a csiravonal szekvenciához viszonyítva egy vagy több aminosav mutációt tartalmaz, amelyek azonosak azokkal a mutációkkal, amelyek a kővetkező csoportba tartozó monoklonális ellenanyagok Varjában találhatók: 3/1.1, 3,hlH-A78T, a 3J.,1-A787-¥88AV97A, 7.1.2, 10.8,3, 15.1.....1, 21.4.1, 21.2.1, 22,1.1, 22.1.1HC1.09A, 23.5.1, 23.25.0 23.28.1, 23,28.1O-O16E, 23.29.1 vagy
24.2.1. Néhány megvalósitási mód szerint a nukleinsav a csiravonal szekvenciáihoz viszonyítva legalább három olyan aminosav mutációt kódol, amelyek azonosak legalább három, az előzőkben felsorolt monoklonális ellenanyagokban talált mutációkká!.
Néhány megvalósítási mód szerint a nukle insav molekula, tartalmaz egy olyan szekvenciát, amely a következő csoportba tartozó ellenanyagok Va-ja aminesav szekvenciájának legalább egy részét kódolja: 3.1,1 (2. számú szekvencia). 3bLlH-Á787 (90. számú szekvencia), a 3,1.!-A78T-V88A-Y97A (92, számú fc «ί- ♦ * fc « fc « »· · * ·* • ♦ » »· κ· ί«»« ♦-<. ♦.♦ szekvenda), 7.1.2 (10. számú szekvencia), 10.8.3 (18. számú szekvencia), 15.1.1 (26. számú szekvencia), 21.2.1 (34. számú szekvencia), 21.4.1 (42. számú szekvencia), 22.1.1 (50, számú szekvencia) 22. L1H-C1Ö9A (96. számú szekvencia), 23,5.1 (58. számú szekvencia), 23.28J (66, számú szekvencia), 23,28..1H-D16E (98. számú szekvencia):, 23,29.1 (74. számú szekvencia), és 24,2.1 (82. számú szekvencia), vagy a. szóban forgó szekvenciában konzervatív aminosav mutációk találhatók, és/vagy összesen három vagy kevesebb nem-kenzervatáv aminosav helyettesítés. A különbözei megvalósítási módokban a szekvencia egy vagy’ több kódol, elónyöse.n egy CDR3 régiót., egybefüggő, a CDRl--CDR3-at tartalmazó részt, vagy a teljes Vh régiót, szignálszekvenciaval, vagy anélkül.
Néhány megvalósítási mód szerint a nnkleinsav molekula tartalmaz egy nokleotid szekvenciát, amely a 2<, 18,, 18., 26., 34., 4:2:., 58., 58,, 66·., 74.., 82., 98., 92., 96. vagy 98. számú aminosav szekvenciák közül az egyiket kódolja, vagy ezek. közül azt kódolja, ekvencía. Néhány előnyben részesített megvalósítási mód szerint a nnkleinsav molekula az 9.,
17,, 25., .33,, 41.,; 49., 57., 65,, 73,, 81,, 89., 91., 95, vagy 97. számú nnkleinsav szekvenciának legalább egy részét tartalmazza, vagy az említett szekvenciának szignálszekvencia nélküli részét.
amelyről hiányzik a szígn
Nehanv megvalósítást mód szerint az er 'v.· Ό .............
it rész a % régiót muciéval vagy anélkül), egy regtöt, mmnnarom CDR régiót, vagy* a. CDRl-€DR3-at tartalmazó, egybefüggő régiót kódolja.
Néhány megvalósítási mód szerint a nnkleinsav molekula egy olyan V, aminosav szekvenciát ködői, amely legalább 70, 75, 9Ö, 95, 97, 98 vagy· 99%-bán azonos az 1A-1C. vagy 2AÓ5
X «· « «· í (ír X
2C. ábrákon bemutatott Vb aminosav szekvenciával, vagy a 2.,
10., IS.. 26., 34., 42., 50., 53,» 66,, 74.» 82., 90., 92., 96. vagy 98. számú aminosav szekvenciák· közül bármelyiknek a W aminosav szekvenciájával.. A találmány szerinti nukleinsav molekulák közé tartoznak azok a mtkleinsavak, amelyek szigorú, az előzőkben ismertetett hibridizációs körülmények között hibridizálnak egy olyan nukleinsav szekvenciához» amely a 2.:, 10., 18.» 26., 34,., 42.,
50., 58., 66.,, 74., 82., 90., 92,» 96, vagy 98. számú aminosav szekvenciát kódolja, vagy amelynek a szekvenciája megfelel az 1,,
9.. , 17., 25,, 33., 41., 49., 57.. 65., 73., 81.» 89.» 91.» 95. vagy 97. számú nukfeinsav szekvenciának. A találmány szerint nnkfeinsav molekula lehet egy olyan nukleinsav molekula, amely szigorú, az előzőkben ismertetett hibridizációs körülmények között híbrióizálódik egy olyan nukleinsav szekvenciához, amely egy közvetlenül az előzőkben ismertetett ¥n-t kódol.
Egy másik megvalósítási mód szerint a nukleinsav egy, az alábbi csoportból választható ellenanyag teljes hosszúságú nehéz láncát kódolja: 3.1.1, 333Η--Α78Τ» a 33.1-A787-Y88A-W7A, 7.1.2, 10.8.3, 1533, 21,43, 21.23» 2233, 223.3H-C109A,
23.5.1, 23,253, 23.283» 23.28.1H-D16E, 23.293 és 24.2.1, vagy egy olyan nehéz láncot, amelynek aminosav szekvenciája 6.. 14..
22.» 30., 38., 46.» 54.» 62.» 70... 78. vagy 86.. számú, aminosav szekvenciának felel meg, vág? egy olyan nehéz láncot, amely egy mutációt tartalmaz, azaz példáid egyet az előzőkben Ismertetett mutációk, közül. Emellett a nukleinsav tartalmazhatja az 5., 13., 21.» 29,, 37.., 45., 53., 61.. 69., 77., 85. vagy 89. számú nukleoöd. szekvenciát» vagy egy olyan nukleinsav molekulát, amely egy mutációt tartalmaz, azaz például egyet az előzőkben ismertetett mutációk közül.
·**·
Egy anri-CDéO ellenanyag: nehéz, vagy teljes könnyű láncát, vagy annak egy részét kódoló nukleínsav molekula bármilyen, az ilyen ellenanyagot termelő forrásból izolálható. .A különböző megvalósítási módok: szerint a nukleinsav molekulákat S-sejtekből izolálhaijuk, melyeket CD40-nel immunizált állatokból lehet izolálni, vagy egy olyan 3-srifböl származó, örókéietüvé tett sejtből, amely expresszálja az anti-CD40 ellenanyagot. Az egy ellenanyagot. kódoló mEMS izolálást módszerei a szakterületen jól ismertek: (Sambrook és mtsai:: Moleoular Cloulng: A haboratory Manual: 2. kiadás. Cold Spnng Harbor Press, Cold Spring Sárkor, N.Y. {1989}]. A m.RNS-t a eDNS előállítására lehet használni, melyet azután az ellenanyag gének polímcráz láncreakcióval való klónozására, vagy eDNS klónozására, lehet használni. Egy előnyben részesített megvalósítási mód szerint a nukleinsav molekulát egy hihrídőmáböi izoláljuk, amelynek egyik fúziós partnere egy humán immunglobulint termelő sejt, egy nem-humán transzgemkus állatból. Egy még ennél is előnyösebb megvalósítási mód szerint, a humán immunglobulint termelő sejtet egy Xeoolfense^ álhitből izoláljuk. Egy másik megvalósítási mód szerint a humán immunglobulint termelő sejt egy nem-humán, nem-egér transzgenikus állat, az előzőkben ismertettek szerint. Egy másik megvalósítási mód szerint a nukleinsavat egy nem-humán, nem-transzgeníkus állatból izoláljuk. Az egy nem-humán, nem-transzgenikus adatból izolált nuklemsav molekulák: használhatók például a. humanizált ellenanyagokhoz.
Néhány megvalósítási mód szerint egy jelen találmány szerinti .antí-C'D40 ellenanyag nehéz láncát kódoló uukleixrsav tarral:mazhat egy nukleodd szekvenciák, amely egy találmány szerint % domént kódol, leolvasási keretben összekötve egy olyan nukleorid
68· :«
Φ »«·
» * ** szekvenciával,, amely egy bármilyen forrásból származó nehéz lánc konstans donxént kódol. HasoiÉöképpen, egy találmány szerinti anti-CIMO ellenanyag könnyű láncát kódoló nukleinsav molekula tartalmazhat egy , a találmány szerion VL domént kódoló nukleotíd szekvenciát, leolvasási keretben összekötve egy olyan nukleotíd szekvenciává], amely egy bármilyen forrásból származó könnyű lánc konstans domént kódot
A találmány egy másik megvalósítási módja, szerint a nukieinsav molekulákat, melyek a nehéz lánc (VH) vagy könnyű lánc A'ú variábilis doméniéí kódolják, teljes hosszúságú eienanyag génekké· „konvertáljuk”. Az egyik megva vsuási mód szerint a V< vagy V;. doméneket kódoló nukleinsav molekulákat úgy alakítjuk teljes hosszúságú ellenanyag génekké, hogy egy olyan, eypressziös vektorba építjük be, amely már kódolja, a nehéz lánc, konstans doménjéí vagy a könnyű lánc konstans döménjét, oly módon, hogy a Vw szegmens működés szempontjából a vektorban: a €» Szegmens(ek}hez kapcsolódik, és a % szegmens működés szempoíitjáhől a. vektorban a Cl szegmenshez kapcsolódik. Egy másik megvalósítási mód szerint a Vh vagy V·,.. doméneket kódoló nukleinsav molekulákat teyes hosszúságú ellenanyag génekké konverfáguk, oh módon, hogy Vw és/vagy Vl doméneket kódoló nukleinsav molekulát Ca és/vagy Ct domént kódoló nukleinsav molekulához kapcsoljuk, azaz például ligájuk, standard molekuláris biológiai: technikák alkalmazásával., A humán nehéz lánc és könnyű lánc immunglobulin konstans dómén gének nukleinsav szekvenciái a szakterületen ismertek |l£afeat és mísah Sepuences of Froteins eí Immunolcgieal Interest, 5. kiadás,. National htstííuíes oí Health., Bethesda, MD (1991)1 A teljes hosszúságú nehéz láncokat és/vagy könnyű láncokat kódoló: nukleinsav molekulákat azután
ÓV «·* »:*«·* * ·*'*' *-· :♦ « φ » ** * * α £ : , η s t ϊ *·» φφ »** *»· egy olyan sejtben expresszáltathatjuk, amelybe bejuttattuk, és az anti-CD40 ellenanyagot izolálhatjuk.
A nukleínsav molekulák arra. is használhatók, hagy az antiÜD4Ö ellenanyagok nagy mennyiségét expresszákassuk rekombináns módszerekkel. A nukleínsav molekulák arra is használhatók, hogy Iáméra ellenanyagokat» blspecihkus eSenanyagokat, egyláneú eiienanyagokat, immunoadhezmekeu diatesteket, mutált ellenanyagokat es ellenanyag származékokat állítsunk elő, az alábbiakban ismertetett módon. Ha. a nukleínsav molekulák egy nem-humán, nem-transzgenikits állatból származnak, akkor a nuktemsav molekulák az ellenanyag humanizálására használhatók, az alábbiakban ismertetett módon.
Egy másik megvalósítási mód szerint egy találmány szerint nukleínsav molekulát használunk próbaként vagy pokmeráz láncreakció primőrként egy specifikus ellenanyag: szekvenciához, A nukleínsav például próbaként használható diagnosztikai módszerekben, vagy poíhneráz láncreakció primőrként, hogy a DNS olyan régióit ampliíikáljuk, amelyek, többek között, arra használhatók, hogy további, anti~CD4Ű ellenanyagok variábilis doménjeit kódoló nukleínsav molekulákat izoláljunk. Néhány megvalósításmód szerint a nukleínsav molekulák olígonukleoiidok. Néhány megvalósítási mód szerint az olígonukleotidok a számunkra érdekes ellenanyag nehéz lánca és könnyű lánca, erősen variábilis régióiból származnak. Néhány megvalósítási mód szerint az oligonukleotídok a 3.1.1, 3.LIH-A78T, a 3.1,1-A78T-V88A-V97A, 3.L1L-L4M-L83V, 7./1,2, 10.8.3, 15.1 .1, 21.4.1, 21.2,1, 22.1.1, 22,1.1H-C109A, 23.5.1» 23.25.1, 23.28. .1, 23.28,1H-DI6E,
28,29.1, 23.28.1L-C92A, 23.29.1 vagy 24,2.1 ellenanyag egy vagy ~0 ·*φ· φ« *«ΐ* Φ * * -χ φ
Φ· »· Α *
Φ Φ Φ * *
ΦΦΦ* »·» ΦΦ '*·*· ·».« több kompi emeíúaritást meghatározó régióját, vagy annak egy részét kódolják.
Vektorok
A találmány tárgyát olyan. vektorok képezik, melyek a találmány szerinti arkí-ÖMÖ ellenanyag: nehéz láncát, vagy minak égy antigén-kótö részét kódolják. A találmány tárgyát képezik továbbá olyan vektorok, melyek a találmány szerinti anti-CD40 ellenanyag könnyű; láncát, vagy annak egy antigén-kötő részét koholják. A találmány tárgyát képezik továbbá a fúziós fehérjéket, módosított ellenanyagokat, ellenanyag fragmenseket és azok próbáit kódoló nnkleínsavakat tartalmazó vektorok.
Néhány megvalósítási mód szerint a találmány szerinti antiCD40 ellenanyagokat, vagy azok antigén-kötő részét úgy expresszáljuk, hogy az előzőkben ismertetett módon előállított, teljes hosszúságú nehéz láncokat és könnyű, láncokat, vagy azok egy részét kódoló DNS-ekef ezpressziós vektorokba építjük be, olymódon, hogy a géneket működés szempontjából. a szükséges expressziós kontrolt szekvenciákhoz, azaz például transzkripciós és transzlációs kontroll szekvenciákhoz kapcsoljuk. Az expresszíos vektorok közé tartoznak a ptazmídok, retrovlrusok, adenovírusok, aheno-asszociált vírusok {AAV), a növényi vírusok, azaz például karból, mozaíkvírus, a. dohány mozatkvítus, a kozmídok, az YAC-k, az EBV eredetű eplszómák és a hasonlók. Az ellenanyag gént úgy ágáljuk a vektorba, hogy a vektorban levő transzkripciós és transzlációs kontroll szekvenciák el. tudják látni a nekik szánt funkciójukat, azaz az éltenam ag gén transzkripciójának és transzlációjának szabályozását. Az expresszíös vektort és az expresszíos kontroll szekvenciákat úgy választjuk meg, hogy kompatibilisek
legyenek a használt expressziős gazdasejttek Az ellenanyag könnyű láncának génjét és az ellenanyag nehéz láncának génjét kőién wfetorokha is beépíthetjük. Egy előnyben részesített megvalósítási mód szerint mindkét gént ugyanabba az expressziös vektorba építjük be. Az ellenanyag: géneket az expressziós vektorba standard módszerekkel építjük be (azaz például az ellenanyag génfeagmensen és vektoron levő komplementer restrikciós hasítási helyek lígálásával, vagy? tompavég kgálással, ha mnesenek restrikciós hasítási helyek].
Egy jól használható vektor egy funkcionálisan komplett humán Cn vagy Cp immunglobulin szekvenciát kódok a megfeleld restrikciós hasítási helyeket ügy megválasztva, begy bármelyik: Vb vagy Vt expressziős: szekvenciái könnyen he lehessen szűrni és expresszálni, az előzékben ismertetett módon. Az ilyen vektorokban az illesztés italában a beszúrt J régió illesztési donor helye és a humán. C domént megelőző illesztést akceptor hely között játszódik le, valamint a humán Cd exonokbac levő illesztési régióknál. A políadenifczes és a transzkripciós iermmáelö a kódoló régiók után álló, természetes króm őszöm áll s helyeken játszódik le. A rekombináns expressziós vektor kódolhat egy szignálpephdet is, amely megkönnyíti az ellenanyag láncnak a gazdasejtből valő szekrécióját. Áz ellenanyag láncának génjét: úgy klónozhatjuk a vektorba, hogy a szignálpeptid leolvasási keretben kötődik az immunglobulin lánc N-termináiísához, A szignálpeptid lehet egy immunglobulin szignálpeptid, vagy egy heterológ szignálpeptid (azaz egy nemimmunglobulin fehérjéből származó szignálpeptid).
Az ellenanyag-lánc gének mellett & találmány szerinti rekombmáns expressziós vektorok olyan szabályozó-szekvenciákat hordoznak, melyek egy gazdasejtben szabályozzák az ellenanyag-lánc gének expressziöját. .A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy egy expressziós vektor tervezése, beleértve a szabályozó- szekvenciák kiválasztását, számos fektortől függ, például a transzformálásra kiválasztott gazdasejttoh a fehérje expressziójának kívánt szintjétől, stb. Az: emlős sejtben való expressriő előnyben részesített szabályozó-szekvenciái közé tartoznak az elvan virálís elemek, melyek a fehérje expresszió magas szintjét vezérlik emlős sejtekben, azaz például a retrovirális bIR-ekfeől, a cltomegalövirusból (CMV) származó promóterek és/vagy fokozok (azaz például a CMV promoter/fokozó/ a Simian vírus 40 (SV4Ö). promoter/fokozó. az adenovírus fo késói promoter uAdMLPh a políőma és az erős emlős promcterek, azaz például a természetes immunglobulin és aktín promóterek. A virálís szabályozó elemek, és azok szekvenciájának további leírása megtalálható a szakirodalomban (6.517,529 számú Amerikai Egyesült ÁUamok-beli szabadalmi leírás, amely pubiikádöí a továbbiakban referenciaként kezelünk/ A. polipeptidek bakteriális sejtekben vagy gombasejtekben, azaz például élesztösejlekben való expresszálásának módszerei szintén jól ismertek a szakterületen.
Az ellenanyag-lánc gének és szabályozó-szekvenciák mellett a találmány szerinti refeomblnáns expressziős vektorok hordozhatnak további szekvenciákat is, melyek a gazdasejtekben szabályozzák a vektor replíkációját (azaz például repliká.eiós origókat), és szelekciós markor géneket is, A szelekciós rnarker gének megkönnyítik azoknak a gazdasejteknek a szelekcióját, amelyekbe bejuttattuk a vektort pásd például: a 4,399,21.6, 4,634,655 és 5,179,617 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadakul leírást). Például a szelekciós rnarker gén általában gyógyszer-rezisztenciát, azaz például G18, hlgrumiein vagy metotrexát elleni
4 *
♦ 4 rezisztenciát, biztosit annak a gazdasejtnak, amelybe a vektort bejuttattok, Az előnyben részesített: marker gének, közé tartozik a. dihidrofelát-reduktáz (DOFE) gén Idhfr-gazdasejlekben való alkalmazáshoz, metotrexát szelekcióval/ampkhkádóx'al], a neo gén la G18 szelekcióhoz) és a glntamát-szintetáz gén.
Nem-hibridöma gazdasejtek: és módszerek fehérjék rekomhmáns módszerekkel való előáBításahoz
Az aoti-€D9ö ellenanyagokat kódoló nukleinsav moleknlák: és az ezeket a nukleínsav molekulákat tartalmazó vektorok használhatok egy megfelelő emlős, növényi, bakteriális vagy élesztő gazdasejt transzformálására. A transzformálást bármelyik ismert, módszerrel végrehajthat ak, a poimukieotídoknak a gazdaseftfee való bejuttatása céljából. A heteroiőg polinukleotidok emlős sejtekbe váló bejuttatásának módszerei a szakterületen jól ismertek, ide tartóz! a deteránnal végzett transzfekció, a kálóum-feszfátos kicsapás, a pohferéonel végzett transzfökció, a protopteszt fúzió, az elektroporácíó, a polmnkleotid(ok) ig>o~ szómákba való zárása és a DNS közvetlen, mikroinjekciózása a sejtmagba. Emellett a nukleínsav molekulákat az emlős sejtekbe viráks vektorokkal is be lehet juttatni. A sejtek transzformálásának módszerei a szakterületen jól ismertek (lásd például a 9,399,216, 4,912,090, 9,740,461 és 4,959,455 számú Amerikai Egyes® Állam ok-beli. szabadalmi leírást, amely szabadalmi leírásokat a továbbiakban referenciaként kezelünk), A növénysejtek transzformálási módszerei is jól ismertek a szakterületen, beleérne például az Aprofoacterám-mal végzett, transzformációt, a Holisztikus transzfermáeiöt, a közvetlen injekciózásf, az elektro*Φ\ *
Φ **
Φ * porációt és a virálís transzformációt. A bakteriális és élesztőseitek transzfdrmálási módszerei jól ismertek a szakterületen..
Az expresszióhoz gazdasejtként használható emlős sejtvonaiak jól ismertek a szakterületen., ide tartoznak az American Type Culfure Cokeotion-röl (ATOC) beszerezhető, orokéletuvé tett sejtvonaliak. Ezek közé tartoznak, többek között az aranyhörcsög petefészek ÍCHOj sejtek, az NSO, az SP2 sejtek, a Néha sejtek, a bébihörcsög vesesejtek (BHK). a majomvese sejtek (COS), a humán hepatocefcláris kardnömasejtek (azaz például a Hep G2), az A 549 sejtek, és számos más sejtvonal. Az adott referenciája sejtvonalakat ügy határozzuk meg, hogy mely sejtwnaláknak. magas az expresszios szintje. A használriató sejtvonalak közé tartoznak még a rovar seirvonaliak, azaz például az Sí9 sejtek. Ha ellenanyag géneket kódoló rekombináns expressziős vektorokat juttatunk be emlős gazdasejtekfee, akkor az ellenanyagokat ügy állítjuk elé. hogy a gazdasejteket annyi ideig tenyésztjük, hogy az lehetővé tegye az ellenanyag expresszióját a gazdasejtekben, vagy, előnyösebben, az ellenanyag szekrécióját a tenyésztő közegbe, amelyben a gazdasejteket szaporítjuk. Az ellenanyagok standard tisztítási módszerekkel nyerhetők ki a tenyésztő közegből A növényi gazdasejtek közé tartozik például a Meo&ron, az Áraöídöpsis, a békalencse, a kukorica, a burgonya, stb, A bakteriális gazdasejtek közé tartoznak az Escbenehm eok és a Sőpptomuces fajok. Az élesztő gazdasejrek közé tartozik a Snmzosnccburomyces: pomÖa a Saochummyees eenmsw és feomapusfens.
Emellett, a találmány szerinti ellenanyagok (vagy ezekből származó más egységek) expresszióját a termelő sej (.vonalakból számos ismert technikával fokozhatjuk. Például a glutamin sztntetáz expressziős rendszer (a GS: rendszer) egy általános megközelítési módja az expresszié fokozásának, bizonyos körülmények közön, A GS rendszert részben vagy egészben a Ö 216 846, 0 256 056 és 0 323 997 számú európai szabadalmi leírásban, és a 89303904,4 számú európai szabadalmi, bejelentésben tárgyalják.
Az valószínű, begy a különböző sejtvonalak által, vagy’ transzgeuikus állatokban expresszált ellenanyagok glikozílezettsége eltérő. Azonban a találmány szerinti uuklelnsav molekulák: állal kódolt összes ellenanyag, valamint azok az ellenanyagok, amelyek a találmány szerinti aminosav szekvenciát tartalmazzák, a találmány tárgyát képezik:, függetlenül az ellenanyagok glikozb lezettségétől.,
Transzgenikus állatok és növények
A találmány szerinti aníi--CD4Ü ellenanyagokat transzgenlkus módszerekéi is elő leket ásítani, a számunkra érdekes immunglobulin nehéz; lánc és könnyű lánc szekvenciákra transzgenlfcus emlős vagy növény előállításával, valamint ebből az ellenanyag kinyerhető formában való termelésével Az emlősökben való transzgenifcus termeléssel kapcsolatban az anti-CD40 ellenanyagok előállíthatok például kecskék, szarvasmarhák és más omlósok tejéből, és ebből kinyerhetők (lásd például az. 5,327,690, 5,736,687, 5,750,172 és 5,741,957 számú Amerikai Egyesült Ailamok-beli szabadalmi leírást). Néhány megvalósítási mód szerint a humán immunglobulin lökuszokat tartalmazó nem-humán transzgenikus állatokat immunizálunk CD4ö-nei, vagy annak egy immunegén részévei, az előzőkben Ismertetett módon. Az ellenanyagok növényekben történő előállítását például a 6,046,037 és *·* ·»·*·*.*. -Λ ·*·*· ♦ * * Λ * $ * ** * ί « *» J 5 ϊ »**:* ** ** **'« :*·»·
5,959,177 számú Amerikai Egyesüli Államok-beli szabadalmi leírásban ismertetik.
Néhány megvalósítási mód szerint a nem-humán transzgeníkus állatokat vág' növényeket agy állítjuk elő. hogy egy vagy több,, ey találmány szerinti antí-CSáü ellenanyagot kódoló nukleínsav molekulát juttatunk be egy állatba vagy nővénybe standard transzgenikus· módszereket alkalmazva [lásd például Bogán és 6-417,429 számú Amerikai Egyesük Államok-beli szabadalmi leírás, sáp?A A transzgenikus állatok előállítására, használt sejtek lehetnek embrionális őssejtek vagy szomatikus sejtek,. A transzgenikus: nem-humán szervezetek lehetnek kánéra, nemkknéra heterozigúták és nem-kiméra homozigóták (Bogán és mrsai; Manipulatíng éhe Mouse Embrió: A Lahoratorv Manual, 2, kiadás, Goid Spríng Harbor Press (1999(: daekson és mtsai: Mouse Genetics and Wansgenies: A Praetfoal Approach, Oxford Uníversity Press (2ÖÖÜ); Pinfcert: Transgenic Animál Technology: A Lahoratorv Bandbook, Aeademíe Press (1999((. Néhány megvalósítási mód szerint a trasszgenikus nem-humán állatokban célzott r oocsolás és helyettesítés játszódik le, egy célzó konstrukcióval, amely egy számunkra érdekes nehéz láncot és 'vagy egy számunkra érdekes könnyű láncot kódol. Egy előnyben részesített megvalósítási mód szerint a trauszgernkus állatok olyan nuklein sav molekulákat tartalmaznak és expresszáloak, amelyek egy módosított ellenanyagot, azaz például egy egvláncú ellenanyagot, egy Iáméra ellenanyagot vagy egy humanizált ellenanyagot kódolnak. Az anti-CD40 ellenanyagokat bármelyik transzgenikus állattal elő lehet állítani.. Egy előnyben, részesített megvalósítási mód szerint a nem-humán állat lehet egér, patkány, birka, sertés, kecske, szarvasmarha vagy ló. A nem-humán transzgenikus ;***·«· * állat az említett, kódok polípeptideket a vérbe, a tejbe, a nyálba, a könnyekbe, a nyálkába és más testfolyadékba expresszáljsu
Fág-dísplay könyvtárak
A találmány tárgya eljárás egy antúCD40 ellenanyag, vagy annak antigén-kötő része előállítására, azzal jellemezve, hegy a következő lépéseket tartalmazza:: humán ellenanyagok könyvtárát szintetizáljuk meg tágon, a könyvtárat CÖ40~nel vagy annak egy részével átvizsgáljuk, izoláljuk a CD40-hez kötődő fágot majd a fágből kinyerjük az eienanyagat. Példakánt megemlítjük, hogy a íág-display technikákban való használatra készített ellenanyag-könyvtárak egyik előállítási módszere a következő lépésekből áll: humán immunglobulin lókuszt tartalmazó, nem-humán, állatét immunizálunk CD40-nel,: vagy annak antigén részévek immunválasz keltése céljából, az immunizált állatból kinyerjük az ellenanyagot termelő sejteket; a kinyert sejtekből extraháljuk az RNS-t, az RNS-ről reverz transzkripcióval cDIB-t készítünk, a eDNS-t egy primőrrel amplífi.ká|nk5: majd a eDNS-t egy rág display vektorba építjük be, oly módon,. hog>;: az ellenanyagok a tágon expresszáljanak. A találmány szerinti rekombináns anti-€D4G ellenanyagokat így állíthatjuk elő,
A találmány szerinti reRomhináns anti-€D40 humán ellenanyagokat egy rekomhlnáns kombínatoríálís ellenanyag könyvtár átvizsgálásával izolálhatjuk. A könyvtár előnyösen egy sePv fág könyvtár,. melyet izolált B-sejtekből készített mWS használatával kapott humán % és'% cDNS-ekböl állítunk elő. Az ilyen könyvtárak előállítási és átvizsgálási módszerei a szakterületen ismertek. Vannak kereskedelmi forgalomban kittek, melyekkel tagkönyvtárakat lehet generálni flyen például a Pharmacia.
7S:
* **. -Λ Λ * Φ. » * * ·» **x
Recombiuant Pfeage Antibodv System, katalógusszám 27-9400Ol; és a Stratageoe SuríZap*M fág display kit, katalógusszáma 240612). Vannak más módszerek és reagensek is, melyeket ellenanyag könyvtárak létrehozására, és átvizsgálására lehet használni [lásd például 5,223,409 számú .Amerikai Egyesült Államokbeli szabadalmi leírás, WO 92/18619, WO 91/17271, WO 92/20791, WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047, WO 92/09690 számú PCT szabadalmi leírás; Hay és mtsai: Bum. Ántíhod.. Hybridomas 3, 81-85 (1992); Huse és mtsai:: Science 246, 1275-1281 f:9S9i; McCalferfy és mtsai: Natúré 348, 552554 (1990); Grikiths és mtsai: BMBÖ Journal 12, 725-734 (1993): flawkins és mtsai: Journal of kfofecalar Blelogy 226 , 889896 (1992): Clackson és mtsai: Natúré 852, 624-628 (1991): Gram és mtsai: Prooeedmgs of tbc National Áeaúemy of Sciences, USA 89, 3576-3580 (1992); Garrad és .mtsai:: Bio/Technoiogy 9, 1373-1377 :(1991):: Hoogenboem és mtsai': Nucleie Acids
Peseareh 19, 4133-4137 (1991): Barkas és mtsai: Pröeeedmgs of tbc National Áeademy of Sciences, USA 63, 7978-7982 (1991)].
Az egyik megvalósítási mód szerint a kívánt jellemzőkkel rendelkező humán and-CD40 ellenanyagok izolálásához először egy itt ismertetett humán anti-C.D4ö ellenanyagot: használunk olyan humán nehéz lánc és könnyű lánc szekvenciák szelektálására, melyek a CD40~béz hasonló kötési aktivitást mutatnak, •a WO 93/06213 számú PCT szabadalmi leírásban ismertetett epífcop imprintíng módszerek használatával. Azebben a módszerben használt ellenanyag könyvtárak előnyösen scFv könyvtárak, melyeket a szakirodalomban ismertetett módon állítunk elő és vizsgálunk át (WO 92/01047 számú PCT szabadalmi leírás; McCaherty és mtsai.: Natúré 343, 552-554 (1990): Gribiths
és mtsai: EMBO Journal 12, 725-734 (1993)1. Az scFv ellenanyag könyvtárakat előnyösen humán CD40-et antigénként használva vizsgáljuk át.
Amikor a. Vl és % doméneket már kiválasztottuk, akkor „mix and march” (keverés és illesztés) kísérleteket hajtunk végre, melyekben az elején kiválasztott Yi, es Yh szegmensek különböző párjait átvizsgáljuk a CD4ö-hez való kötődés szempontjából, hogy kiválasszuk a Yh/Yn pár kombinációkat. Emellett, hogy tovább javítsuk az ellenanyag minőségét, az előnyben részesített Vc/Vs páríokj Y;í szegmensei véletlenszerűen mutákathaiók. előnyösen a Yh és/vagy a Yt CDR3 régiójában,, egy olyan eljárással, amely analóg azzal az m wö szomatikus mutációs folyamattal, amely a természetes immunválasz során felelős az ellenanyag affínításéré sóért. Ezt az in yióu affinitás-érést ügy hajthatjuk végre, hogy a Vh CDR3-mal vagy a V·. CDR3~mal komplementer polímeráz láncreakció primerek használatával amplífíkáljuk a Yh és Yh doméneket, amely primerek bizonyos pozíciókban a négy nukleotid bázis véletlenszerű keverékével meg lettek: „tűzve®. oly módon, hogy a. kapott polimerén láncreakció termékek olyan Yh és Vt szegmenseket kódolnak, amelyekbe random mutációkat vittünk be a Yh és,/vagy” Vl CDR3 régiókban. Ezeket a véletlenszerűen m utaltatott Vb és Yh szegmenseket a €D40-hez való kötődés alapján újból átvizsgálhatjuk.
Egy, a találmány szerint anti-CD4ö ellenanyag egy rekomblnáns immunglobulin display könyvtárból történő szűrővizsgálata és izolálása után a kiválasztott ellenanyagot kódoló nukíeinsa.vak kinyerhetők a display csomagból (azaz például a fág genomjából), és standard rekombínáns DNS technikákkal más expresszié® vektorokba szubklónozzuk. Ha szükséges, akkor a
X, nukleinsav tovább manipulálható, bog}' más, a találmány szemű ellenanyag formákat hozzunk létre,, az alábbiakban Ismertetett módon. .Ahhoz, hogy egy kombinatorikus könyvtár átvizsgálásával izolált rekonahináns humán ellenanyagot expresszáljunk, az ellenanyagot kódoló DNS-t egy rekombináhs expreeszíős vektorba klónozzuk, és emlős gazdasejtekbe juttatjuk be, az alábbiakban ismertetett módon.
A találmány tárgya továbbá eljárás egy anti-CD40 ellenanyag osztályának: vagy alosztályának egy másik osztállyá vágy alosztállyá való konvertálására, Néhány megvalósítási mód szerint semmilyen C--t vagy Ch-L kódoló nukleinsav szekvenciát:
nem tartalmazó, Vt-t vagy %-t kódoló^ nukleinsav molekulát izolálunk, a szakterületen jól ismén eljárásokkal, A nukleinsav molekulát azután működés szempontjából egy kiválasztott immunglobulin osztáiyből vagy alosztályból származó Cr-t. vagy Ca-t kódoló nukleinsav szekvenciához kapcsoljuk. Például egy eredetileg az IgM osztályba tartozó anti--CD40 ellenanyagból osztályváltással IgG lehet. Emellett az osztályváltást arra is használhatjuk, hogy az egyik IgG alosztályt egy másikra cseréljük, azaz például IgG 1-ről IgG2~re. Egy,, a találmány szerinti, egy kívánt izotípust tartalmazó ellenanyag előálktásának másik módszere a következő lépésekből áll: izoláljuk egy anti-CD4Ö ellenanyag nehéz: láncát kódoló nuklemsavat, és egy aua~€D4Ö eűenanyag könnyű láncát kódoló nukleínsavat, izoláljuk a Yh: régiót kódoló szekvenciát, a V·· szekvenciát egy olyan, szekvenciához ligáljuk, amely a kívánt izotípusü nehéz lánc konstans domént kódolja, a könnyű, lánc gént és a nehéz lánc konstrukciót egy sejtben exp»»
A-
resszákaliuk, és összegyűjtjük a kívánt izotípusü -antí-:CD4Ö
Dezimmun izált ellenanyagok
A csökkent imniunogeraéásn ellenanyagok eldállitásának egy másik módja az ellenanyagok dezímmunízálása. A találmány egy másik aspektusa szerint az ellenanyag például a WÖ98/52976 és WOOö/34317 számú PCT szabadalmi leírásban ismertetett technikákkal dezimmunizálhaéó (amely publikációkat a továbbiakban teljes egészükben referenciaként kezelünk).
Mutált eltenanyagok
Sgy másik megvalósítási mód szerint a nukleinsav molekulák, vektorok és gazdasejtek használhatok mutált anti-CDAÖ ellenanyagok előállítására. Az ellenanyagok a nehéz lánc és/vagy a. könnyű lánc variábilis doménjeiben mutáííathatók, azaz például azzal a céllal, hogy megváltoztassuk: az ellenanyag, kötési tulajdonságait, A mutáció például egy vagy több COR régióban hajtható végre, hogy növeljük vagy’ csökkentsük az ellenanyag CDiö-hez mutatott Ko értékét, hogy’ növeljük vagy csökkentsük a Kőit értéket, vagy hogy megváltoztassuk az ellenanyag kötési specifitását. A helyspecifikus mutagenezis technikái jól ismertek, a szakterületen [Sambrook és mtsak Mötecuiar Cloráng: A baboraiory Manuab 2. kiadás. Coki Sprisg Harbor Press, Coki Spring Harbor, N.Y. (1989); Current Prötöcols in Moiecular Biotogy, szerk.: Aosubel és mtsai, Greene Pufelíshing és WleyInterseience: New York (1987)j. Bgy előnyben részesített megvalősitásí mód szerint a mutációkat olyan amínosav pozíciókban Hajtjuk végre, melyekről ismert, hogy egy anti-CD4ö ellenanyag egy
Φ'···' ·$>$::
· ί *» « * ** ΕΑ * 3 * * <*·»' χ..·, ·**:·:· -Ο variábilis döménjében a csíravonalhez viszonyítva megváltoznak. Egy másik megvalósítási mód szerint egy vagy több mutációt olyan mminosav pozíciókban haj íjunk végre, mely ékről ismert, hogy az alán iS. ·.
hon felsorolt aníi-€D4ö ellenanyagok közül egynek egy variábilis doménjében, vagy egy variábilis dómén keretrégiöjában, vagy egy konstans doménjébeo -a csiravonalfeoz viszonyúvá megváltoznak: 3.1.1, 3.UO-A78T, a 3.1.1-A78TY88A-W7A, 3...L1L-MM-L83V,. 7.1.2, 19,8.3, 15.1,1, 21.4.1,
21.2,1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23..25.1, 23.28.1,
23.28.10-0lóE< 23.29,1, 23.28.1L-C92A. 23,29.1, 23.29.1LRI74K v&sv 24,22 szerint egy vagy ;gy másik megvatositasí több mutációt hajtunk végre egy olyan wünosav poricidhan, amelyről ismert, hogy az alábbiakban Felsorolt aminosav .szekvenciák variábilis doménje COR régiójában vagy kereírégiőjában a csíravonalhoz viszonyúvá megváltozik: 4,, .12,, 2Ö., 20., 36,, 44.,
52., 60., 68., 76., 84., 94., 1ÖÖ„ 102., X, 10., 18,, 26.? 34., 42.,
50.. , 58., 66., 74., 82.. 99,, 92,, 96., 98,, 100. vagy 102,. számú szekvencia, vágj' melyeknek a neki cin sav .szseácvenci^át a 3., 11., 1% 27., 35,, 43., 51., 59., 67,, 75,, 83,, 93,, 99,, 101,, 1,39,, 17.,.
25., 33., 41., 49,, 57., 65., 73., 81., 89., 91., 95., 97., 99. vagy
101. számú szekvencia vázlaton mutatjuk be.
Az egyik megvalósítási mód szerint a keretrégiót úgy mutáltatjuk, hogy a kapott régióik] amísosav szekvenciája megfeleljen a megfelelő csíravonal génnek. Mutációt hajthatunk' végre egy keretrégióban vagy konstans doménben, hogy növeli ük az anh -CD'40 ellenanyag felezési idejét (lásd például a WO 00/09560 számú PCT publikációt, amely pubhkáeiőt a továbbiakban referenciaként kezelünk]. Olyan mutációt is végrehajthatunk egy keretrégióban vagy konstans doménben, amivel megválteztaíjuk az ellen$:
anyag immunpgenítását, hogy helyet biztosítsunk egy másik molekulához való kovalens vagy nem-kovalens kötéshez, vagy hogy megváltoztassuk az olyan ífoajdonságokah mint például a komplement fixálás, FcR kötődés és ADCC. A találmány szerint egyetlen ellenanyag tartalmazhat mutációkat bármelyik, vagy több keretrégíőban, konstans dotnénben és a variábilis rőgtőkban, riéhány megvalósítási mód szerint a mutáció előtti an ti CD4Ö ellenanyaghoz viszonyítva 1-18 aminosav mutáció van a mutált auö~€D4Ü ellenanyag: Vb vagy Vl doménjében. A fentiek közül bármelyikben a mutációk egy vagy több CDR régióban, fordulhatnak elő. Emellett, a mutációk bármelyike lehet konzervatív aminosav helyettesítés. Kéhány megvalósítási: mód szerint a konstans doménekben több mint 5» 4» 3, 2 vagy 1. aminosav változás van.
Módosított ellenanyagok.
Egy másik megvalósítási mód szerint egy fúziós ellenanyagot vagy ímmunoadhezint készíthetünk, amely a találmány szerint ann-CD40 ellenanyagot, vagy annak egy részét tartalmazza, egy másik polipeptidhez kapcsolva, Egy előnyben részesített megvalósítási mód szerint, az anti-CD40 ellenanyagnak csak a variábilis domemeit kapcsoljuk a polipepttdhez. Egy másik előnyben részesített .megvalósítási mód szerint egy anti-CDAÜ ellenanyag W doménjét egy első poipepbdbez kapcsoljuk, miközben egy antiCD40 ellenanyag V·, doménjét egy második poBpeptldhez kapcsoljuk, amely ügy kapcsolódik az első pokpeptídhez, hogy a % és V:, domenek kölcsönhatásba léphetnek egymással, ellenanyag kötőhelyet képezve. Egy másik előnyben részesített megvalósítási mód szerint a. Vh dómén egy linkeméi van. elválasztva a W, dómén tői. oly módon, hogy a W és Vl bőmének képesek kölcsónhaíásha lépni egymással (lásd az- alábbiakban az egyláncú ellenanyagoknál). A Ymlmker-Vc ellenanyagot azután a számunkra érdekes poiipeptidhez kapcsoljuk. A fúziós ellenanyag jól használható arra, hogy egy pokpepödet egy CD4Ö-et. expresszálö sejtre vagy szövetre irányítsunk,. A pohpeptíd lehet terápiás szer, azaz például toxin, növekedési faktor vágj? más szabályozó fehérje, vagy lehet diagnosztikai szer, azaz például egv enzim, amely könnyen láthatóvá tehető, mint például a tormaperoxidáx. Emellett olyan fúziós ellenanyagok is előállíthatok, melyekben két: vagy több egyláncú ellenanyag van. egymáshoz kapcsolva,. Ez jól használható, ha valaki divalens vagy peüivalens ellenanyagot akar létrehozná egyetlen polipeptid láncon, vagy ha valaki egy bispeeíhkus ellenanyagot akar létrehozni.
Ahhoz, hogy egy egyiáncú ellenanyagot (scFvj létrehozzunk, a Va-t és W~t kódoló DNS Iragmeoseket működés szempontjából egy másik, flexibilis linkért, azaz: például a (Gby-Seph aminosavakat kódoló fragmenshez kapcsoljuk, oly módon, hogy a Vh és Ys.. szekvenciák egybefüggő egyláncű fehérje formájában expresszálődjanak, a V;, valamint V? dómén eket egy üexibihs línkerrel összekötve |Bird és mtsab Science 242,. 423-426 (1988(: Muston és mtsai: Proceedings of tbc Marínnal Academy oí Sciences, USA 85, 5879-5833 (198S|;. McCaSeríy és mtsai: Natúré 348. 552-554 (1990)]. Az egyláncú ellenanyag lehet moncvrdens, ha. csak egyetlen V«-t és Vs-t használunk, bivalens, ha két %~t és %-t használunk, vág pollvafens, ha. kettőnél több %~t és Vc-t használunk. Bíspeoiíikus vagy· poliv&lens ellenanyagok generálhatók, melyek specifikusan kötődnek a CD40-hez és más molekulához,
> * -*·«
Φ 9. φφ. φ 9 φ *· * φ χ 9 X X * * ► »χ ΦΦΦ Φφ
Egy másik megvalósítási mód szerint a többi módosított ellenanyagot anti-CD40 ellenanyagot kódoló nukleinsav molekulákkal lehet előállítani Például „Bappa testek” |IS. és mtsai:: Protein Bng, 10. 949-57 (19971/ ^minitestek” (Martin és mtsai: EMBO Journal 13. 5303-9 (1994)}, „diatestek* [Holliger és mtsai: Proceedíngs of the National Academy of Sciences, ÖSA 90, 6444 yms I3;\u/ vagy uanusm-ok ffrauneeker és mtsai: EMBO Journal 11 3055-3659 (1991); Trannecker és mtsai; Int J. üancer (Suppij 7,. 51-52: (1992)}: készíthetők: standard, molekuláris biológiai technikák alkalmazásával, a leírásban szereplő kit&nííást követve.
A hispeciSkos ellenanyagokat vagy antigén-kötő írag~ menseket számos különböző módszerrel elő lehet állítani, beleértve a hibrídómák fúzióját vagy a Fab' íragmensék kapcsolását (Songsivilai Ö& hachmanm Óin. Exp, Immunoi. 79, 315-32:1 11990); Kostelny és mtsai: J. of hrnnunok. 143, 1547-1553 (1992)]:. Emellett bispecifikus ellenanyagok állíthatók el©,; „diatestek” vtagy Úwusinok” formájában, Néhány megvalósítási mód szerint a bi~ specifikus ellenanyag a CD4Ö két különböző epítopjához kötődik. Néhány megvalósítási mód szerint a bispecihkus ellenanyagnak van egy első nehéz: lánca és egy első könnyű lánca, amely az alábbi monokionális eienanyagből származik; 3.1,1, 3,1,1.H~A787, a 3,1.1-A78T~¥88A~W7A, 3,1.1Ο14ϋ-183< 7.1.2, 10,8..3, 15..1,.1,
21.4.1, 21,2.1. 22,1.1, 22J.IH-C1Ö9A, 2:3.5.1, 23.25.1, 23.23.1,
23.28.. 1H-DI6B, 23.291, 23.281L-C92A, 23.291., 23.29.1LRI.74E vagy 24.2.1, valamint tartalmaz egy további ellenanyag: nehéz láncot és könnyű láncot. Néhány megvalósítási mód szerint a további könnyű lánc és nehéz lánc szintén az előzőkben azono*·*·*.·# **
sitotí monoklonális ellenanya.gokb^ származik, de eltérnek az első könnyű lánctól és nehéz lánctól.
Néhány megvalósítási mád szerint az előzőkben ismertetett módosítón: ettenanyagqkaé egy itt biztosított humán anti-CD40 ellenanyag egy vagy több variábilis doménjének: vagy CDR régiójának felhasználásával áfijuk elé, a szóban forgó monoklonális ellenanyag egy aminosav szekvenciájából, vagy egy, a szóban forgó monokfonáhs ellenanyagot kódoló xiukleinsav szekvencia által kódolt nehéz láncból vag\’ könnyű láncból
A. találmány szerint: anh CD40 ellenanyagot vagy annak antigén-kötő részét derívatizáifeatjuk, vagy egy másik molekulához (azaz például másik pepiidhez vagy fehérjéhez) köthetjük, Az ellenanyagokat vagy azok egy részét általában ügy derívatizáljuk, hogy a derivatizáiás vagy' jelölés nem érinti károsan a CD40 kötődését. Ennek .megfelelően, a találmány szerinti ellenanyagok és ellenanyag-részek szándékaink szerint tartalmazzák az itt ismertetett humán anfr€D4Ö e&nanyagoknak mind az intakt, mind a módosított formák., keldául egy találmány szerinti ellenanyag vagy ellenanyag-rész fonfceionáiissn kapcsolható (kémiai kapcsolással. genetikai fúzióval, nem-kovalens asszociációval vagy másképpen! egy vagy több más moleknla-egységheZy azaz például egy másik ellenanyaghoz (ilyen például egy bispeoifikus ellenanyag vagy egy diatest), egy kimutató szerhez, egy eítotoxikns szerhez, egy gyógyszerhez., és/vagy egy olyan fehérjéhez: vagy peptidhez, amely képes befolyásolni az ellenanyag vagy ellenanyag-rész asszoeiálődását egy másik molekulával (azaz például a sztreptovidin mag régióval vagy egy políhisztidin jelöléssel).
fcfc
S
A derivatizált ellenanyag egyik típusát úgy állítjuk elő, hogy két. vagy több ellenanyag között keresztkötést hozunk létre (ezek lehetnek azonos típusúak, vagy eltérő típusúak,, például bispedbkus ellenanyagok: létrehozásához). A megföldu keresztkötéseket kiaiakítő anyagok közé tartoznak azok, amelyek heterobifcnkcianálisak, ezek két különböző reakaöképes csoporttal rendelkeznek, melyeket egy megfelelő térkitöltő (azaz például m-máleönídohenzilN-hidroxíszukrinimíd észter) választ el, vagy homobifunkcionálisák (azaz például dtszukdmmkö szuherát). Ezek a linkerek beszerezhetők a ÍÖeree Chemical Co,-tól Rockford, IS.
A derivafeák ellenanyagok egy másik típusa a jelzett ellenanyag, A jól használható kimutató ágensek, melyekkel égre a találmány szerinti elénanyagnak, vagy annak antígén-kőto részének származéka elkészíthető, köze tartóznák a. fluoreszcens vegyúletek, beleértve a huereszeemp a fiuereszeem-izotíncíanátot vagy a rodammt. az 5-dimetÍlamin-1 -naftílszulfonií kloridot, a fikoerítrint, a lantanida foszforokat és hasonlókat Egy elenanyagot olyan enzimekkel is jelölhetünk,: amelyek jól használhatók: a kimutatáshoz, ilyen például a tormaperosádáz, a p-galaktozíház, a lúdferáz. az alkalikus foszfatáz, a glükőzoxídáz és a hasonlók. Ha egy' ellenanyagot egy kimutatható enzimmel jelölünk, akkor ezt úgy lehet kimutatná hogy olyan reagenseket adunk .hozzá, melyeket az enzim használ,: kimutathat terméket termelve, Ha például a tormaperoxidáz van jelen, akkor hidrogénperoxid és díamin obenzidin hozzáadása: színes reakdőferméket eredményez, ami kimutatható. Egy ellenanyag biotinnal is jelezhető, és az svidín vagy sztreptavidín. kötődés indirekt mérésével kimutatható. Egy ellenanyag jelezhető^ továbbá, egy előre meghatározott poiipeptid epífopp&l, melyet egy szekunder riporter fölismer (ilyenek; például.
χφ ♦ φ
Φ :9 a leuein eippzár--pár szekvenciák, a szekunder ellenanyagok kötőhelyei, a fémkőió domének, epitop jelölések). Néhány megvalő^tási. mód szerint: a jelöléseket különböző hosszúságú térkitöltő karokkal kapcsoljuk, hogy csökkentsük az esetleges térbeli gátlásokat.
Egy anti-CD40 ellenanyag radioaktív izotóppal jelzett aminosawal is lehet jelezve,. A radioaktív jelölést mind díagnoszukai, mint terápiás célokra lehet használni, A radioaktív izotóp jelölés például arra használható, hogy röntgennel vagy más diagnosztikai technikákkal kimutassuk a CDáö-et expresszálö tumorokat. Emellett, a radioaktív jelölés használható még terápiásán is, totönként, rákos sejtek vagy tumorok ellen. A. polipeptid jelölések példái köze tartoznak például, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az alábbi radioaktív izotópok vagy radioaktív atommagok:: ^C, ssg, wYí imy
Egy antí~€D4ö ellenanyagból egy kémiai csoporttá]., azaz például polietíléngSkolfel (EEG) vagy egy metilcsoportíal, etílcsoporttal vagy szénhidrát-csoporttal is készíthető: származék. Ezek. a csoportok jól használhatók az ellenanyag biológiai jellemzőinek, azaz például a szérum felezési idejének, vagy a szövethez való
Gyógyszerészeti összetételek és kittek
A találmány tárgyát képezik továbbá az egy humán antiCD40 agonista ellenanyagot tartalmazó készítmények, az immunstimulálásra szoruló betegségek kezeléséhez. Az ilyen készítmények emlősben, beleértve az embert is, jól használhatók a fertőzés, beleértve .a, viráhs és bakteriális fertőzést: is, kezelésére, megelőzésére, gyakoriságának vagy’ súlyosságának csökkentésére.
η :
a.
hiperproláferativ rendellenesség, beleértve a rákos és pre-rakos állapotokat, kezelésére, genetikai immundehcienola alapotok, .»az például a hiper-IgM szindróma kezelésére, és a primer vagy komfeináit immuncfencfeneia. állapotok kezelésére, beleértve a neutropéniával jeSemezhetö állapotokat, Az agonista anti-CO4Ö ellenanyag terápiás kezelés alanyai közé tartozik minden immuoerősííésre szoruló alany, ide értve, anélkül, hogy ezekre ködár toznánk magunkat, az időseket, és azokat az egyebeket, akik például kemoterápiás kezelés miatt ímmunszuppresszálva. vannak.
Az egy, a találmány szerinti agonista anti-CD4Ö ellenanyaggal kezelhető híperproliferaíív betegségek előfordulhatnak bármilyen szövetben vagy szervben., beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az agyat, a tüdőt, a pikkelyes sejtet, a hólyagot, a gyomrot, a hasnyálmirigyet, az emlőket, a fejet, a. nyakat, a májat, a vesék a petefészket, a prosztatát, a kokmektália területet a nyelőcsövek a nőgyógyászati részeket, áz orr-garat területeket vagy' a tinóid rákokat, melanómákat, hrnfómákat, leukémiákat, vagy a többszörös leukémiákat, Fontosabban, a találmány szerinti humán agonista auti~€D4Ö ellenanyagok jól használhatók az emlő, a prosztata, a vastagbél és a tüdő karcinómáinak kezelésére,
A kezelés magában foglalhatja egy vagy több, a találmány szerinti agonista anti-ÜD4Ö monoktaáfe ellenanyag, vagy annak antigén-kötő fragmensei beadását, önmagában, vagy egy gyógyászatiiag elfogadható hordozóval együtt, A továbbiakban, a „gyögyászatüag elfogadható hordozó szakkifejezés jelentése bármelyik, és az összes oldószer, diszpergálő szer, bevonat, antifeakteriábs és antifungális szer, izofóniás és abszorpciót késleltető szer, és hasonlók, amely Szíolögiásan elfogadható., A gyógyászati90 lag elfogadható hordozók néhány példája a víz, a sóoldat, a foszfáttal puffereit sóoldat, a szacharóz, a glicerin, az. etanol. és basonlők, valamint ezek kombinációi. Számos esetben előnyös izotóniás szereket, azaz például cukrokat, polialkoholokat, azaz például mannitut, szerbi tót vagy nátrium-kloridut tenni a készkményfee,. A győgyászatilag elfogadható anyagok kézé tartoznak még például a nedvesítő szerek, vagy kismennyiségú kiegészítő anyagok, azaz például nedvesítő· vagy em ulgeálő szerek, konzerválőszerek vagy pnfferek, amelyek növelik az ekenanyag tárolási idejét vagy hatékonyságát
A találmány szerinti agordsta anti~CD40 ellenanyagok, és az ezeket t&rtáteazo készítmények egy vagy több más terápiás, diagnosztikai vagy profilaktíkus szerrel egjutt adhatók be. A további terápiás szerek közé tartoznak a más antineoplasztíkus, tumorellenes, aníi-angiogén vagy kemoterápiás szerek. Az ilyen további szereket betehetjűk ugyanabba a készítménybe, vagy beadhatjuk külön. Néhány megvalósítási mód szerint egy vagy több, a találmány szerinti agordsta anü~CD4ö ellenanyag használható vakcinaként, vagy egy vakcina adjuvánsaként.
A találmány szerinti készítmények számos különböző forrná.; úak lehetnek, lehetnek példán! folyadék, félig szilárd és szilárd dőzísformájüak, azaz például folyékony oldatok (például injekciózható es infundálható oldatok), diszperziók vagy szuszpenzfok, tabletták, pirulák, porok, liposzómák és kúpok. Az előnyben részesített forma függ a beadás szándékolt módjától és a terápiás alkalmazásiul, A tipikus, előnyben részesített készítmények kiszerelési formája hpekciőzhatő vagy ín&ndálhafó oldat, azaz az emberekben passzív immunizálásra használt késritméttyekhez hasonló kiszerelési formák. A beadás előnyben részesített módja a parente9
Φ* »φ φ ··* φ <
.χ. ·5 φ; -) * * * »· ¥ Φ Φ.
ί ί φ* ralis (azaz például intravénás, szubkután, .intraperitoneáhs, intramuszkuláris). Bgy előnyben részesített megvalósítási mód szerint az ellenanyagot Intravénás infúzióval vagy injekcióval adjuk be. Egy másik előnyben részesített megvalósítási mód szerint az ellen anyagot Intramuszkuláris vagy- szubkután injekcióval adjuk be.
Tipikus esetben a terápiás késritményeknek sterilnek és stabilnak kell lenniük a. gyártás és tárolás körülményei között.A készítményt kászerelbeyük oldat, mikroemulziő, diszperzió» li.poszórna, vagy más, rendezett sttuktátájú formában, amely alkalmas a magas gyógyszer-koncentráció elérésére. A steril injekciózható oldatokat úgy állíthatjuk elő, hogy az anti-CD40 ellenanyagot a kívánt mennyiségben betesszük egy megfelelő oldószerbe, szükség esetén az előzőkben felsorolt adalékanyagok közül eggyel, vágj- azok kombinációjával, majd sterilre szűrjük. A diszperziókat általában ügy állítjuk elő, hogy a hatóanyagot egy steril hordozóba tesszük, amely egy bázikus diszpergáló közeg, és tartalmazza az előzőkben felsoroltak közül a szükséges adalékanyagokat., A steril porok esetében» mélyeket steril injekciózható oldatok készítésében használunk, a készítés előnyben részesített módszere a vákuum-szárítás és a fagyasztva-szárítás, amely a hatóanyag porát eredményezi, plusz egy bármilyen további., szükséges adalékanyagot, annak egy korábban sterilre szúrt oldatából, Egy oldat megfelelő folyékonyságát fenntarthatjuk: például egy bevonattal, azaz például leeidonek diszperzió esetében a kívánt részecskeméret fenntartásával, és felületaktív anyagok használatával. Az injekciózható készítmények hosszú idejű abszorpcióját azzal érhetjük el, ha a készítménybe egy olyan szert teszünk, amely késlelteti az abszorpciót, ilyenek például a monosztearái sók és a zselatin.
A találmány szerinti ellenanyagokat a szakterületen ismert számos különböző mödszerrei beadhatjuk, kár számos terápiás alkalmazás esetében a beadás előnyben részesített útja. a. szubkután, intramuszkuláris vagy Intravénás infúzió. Amint az a szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, a beadás útja. és/vagy módja az elérni kívánt eredménytől függ.
Néhány megvalósítási mód szerint az ellenanyag készítmények hatóanyagát egy' olyan hordozóval lehet, elkészíteni, amely megvédi az ellenanyagot a gyors felszabadulástól, ilyen po.dául a szabályozott felszabadulásü készítmény, beleértve az ímplantátumokat, a: transzdermális tapaszokat és a mikrokapsxulázott bejuttató rendszereket. Biológiailag lebomlö. biokompa-tibilis polimerek használhatók,: azaz például az etilén vinilacetáí, a. pokanhldridek, a poliglifcoisav,. a kollagén, a poliortoészterek és a politejsav. Az ilyen készítmények számos előállítási módját szabadalmaztatták, vagy a szakterületen jártas szakember számára általánosan ismertek jSustafeed and ConíroSes Belesse Brug Delivery Systems, szerkó J.R. Robinson, álarcéi Bekkor Inc., Név York (1978)1.
Néhány megvalósítási mód szériát egy, a találmány szerinti aníi~CD40 ellenanyag beadható orálisan, például egy inért hlgitőszerrel, vag^1· egy asszimilálható, fogyasztható: hordozóval. A. vegyidet (vagy más adalékanyagok, ha szükséges) Is betekerő egy kemény vagy lágy zselatin kapszulába, tablettákká préselhető, vagy közvetlenül be tehető az alany étrendjébe. Az orális terápiás beadáshoz az antl-CDAÖ ellenanyagokat beteheijük töltöanvagokba, és fogyasztható tabletták, szájüreg tabletták, pásztóiak, kapszulák, elixirek, sxuszpenziők, szirupok, ostyák és hasonlók formájában használhatjuk. Ha egy találmány szerinti ·*·*·*·« ·*·* vegyül etet a pwenteralistól eltérő beadási úton akarunk beadni, akkor szükség lehet arra, hogy a vegyüíetet bevonjuk, vagy egy olyan anyaggal együtt adjuk be, amely megakadályozza az inakbválödását.
További aktív vegyületeik is beépíthetők a .készítményekbe. Néhány megvalósítási mód szerint egy, a találmány szerint antiCD40 ellenanyagot egy vagy több más terápiás szerrel együtt szerelünk ki és/vagy azokkal együtt adjuk be. Ezek közé a szerek közé tartóznak, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az olyan ellen am agok. amelyek más célpontokhoz kötődnek (azaz például egv vagy több növekedési faktorhoz, vagy' cítokinhez, vagy azok sejtfelszíni receptorához kötődő ellenanyag, azaz például egy anti-CTbd-ellenanyag), antineoplasztikus szerek, tumoréilenes szerek, kemoterápiás szerek, a CS40~ei: aktiváló pepiidanalógok, az oldható: CO4ŐL, egy vagy több, a ÜD4Ö~et aktiváló kémiai szer, és/vagy más szerek, melyekről a szakterületen ismert, hogy képesek fokozni a. tumorsejtek ellem immunválaszt, ilyenek például az IFN-βΙ, az: interleukin-2, az mterleukin~8, az: az interleükin-12, az interleukin-15, az kitéri cukin-IS, az interleukin-23, az IFNy, és a granulocita makrókig telepserkentö faktor. Az ilyen kombinációs terápiákhoz az auti-ÜD4Ö ellenanyag, és az azzal együtt beadott szerek alacsonyabb dózisaira lehet szükség, ezzel elkerülve a különböző: monoferápiákhoz kapcsolódó lehetséges töxieitásokat és komplikációkat,
A találmány szerinti agonista antí-CD40 ellenanyagokat és az azokat tartalmazó készítményeket be lehet adni más terápiás módszerekkel kombinálva, például besugárzáaos kezeléssel kombinálva.
-4*·
A találmány szerinti készftménvek tartalmazhatnak „íerá·>
píásan hatékony mennyiségeik vagy ^proftlaktíkusmi hatékony mennyiséget5’ egy találmány szerinti ellenanyagból vagy annak antigén-kötő részéből. A pferápíásah hatékony mennyiség55 szakkifejezés jelentése olyan mennyiség, amely a szükséges dózisokban és időtartam alatt eléri a kiránt terápiás eredményeket. Az ellenanyag, vagy ellenanyag-rész terápiásán hatékony mennyisége változhat, olyan faktoroktól függően, mint például betegség állapota, az egyed életkora, neme és testsúlya, valamint az ellenanyagnak vagy ellenanyag-résznek az a képessége, hogy az egyediben mennyire váltja ki a kívánt választ. A terápiásán hatékony mennyisége emellett az a mennyiség ts, amelynél az ellenanyag vagy ellenanyag-rész: bármilyen toxikus vagy káros hatását felülmúljak a terápiásán jótékony hatások, A ^proöakiikusan hatékony mennyiség” szakkifejezés jelentése az a mennyiség, amely a szükséges dőztshan és a szükséges időtartam alatt eléri a kívánt profflaktikus eredményt. Tipikus esetben, mivel a profílákükus dózist az alanyokban a betegség előtt, vagy annak: korábbi állapotában használjuk, a proSaktifcusan hatékony mennyiség kfee oh mint a terápiásán hatékony mennyiség,
A dözisrendet úgy lehet, megvákoztatni, hogy biztosítsa a kívánt optimális választ (azaz például a terápiás vagy profiláktikus választ!. Beadható például egyetlen betűs, időben elosztott dózisok adhatók be, vagy a dózist a terápiás helyzet követelményeinek megfelelően növelhetjük vagy csökkenthetjük. Az különösen előnyős, ha a parenterális készitményeket egységdózis formájában szereljük ki, hogy megkönnyítsük a beadást, és azért, hogy a dózisok egyformák legyenek. Az egységdőzis kifejezés a továbbiakban fizikailag diszkrét egységeknek felel meg, a kezdendő emlős alany
ΦΟ «««< φ φφ
- * φ φ ♦· φ ** *
Q;\ Λ. Φ ·.* ♦ * * Φ ~·· >. Φ· ·φ φ· «· « S Φ :«♦-«-» ** »« «#♦: ** egységes dózisaihoz alakítva; mindegyik egység a hatóanyagbóí egy elére meghatározott mennyiséget tartalmaz,, ami ügy van tószámitva, hogy a szükséges gyógyászati hordozóval a kívánt terápiás hatást eredményezze, A találmány szerinti e^ségdózis forrnák definícióját a következők határozzák meg és diktálják: a) az antiCD4Ö ellenanyagnak vagy annak egy részének egyedi jellemzői, valamint az elérendő^ terápiás vagy proSaktíkus hatás, és b) egy ilyen, az egyedek érzékenységének kezelésére használt ellenanyag készítésében rejlő korlátok,
A találmány szerint ellenanyag vagy ellenanyag-rész terápiásán vagj? profilakúkusan .hatékony mennyiségének példákén? megadott tartománya, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat. Ö.Ü25-50 tng'/kg, -előnyösebben 0,1-50 mg/kg, még előnyösebben ü, 1-2 5-től 0,1-3 mg/kg-ig<. Meg kell jegyeznünk, hogy a d©zisértékek változhatnak az enyhítendő állapot sülyosságátől és típusától Továbbá az is nyilvánvaló, hogy egy adott alany esetében a specifikus dóztsrendet az alany igényeihez kell igazítani időben, valamint a készítményeket beadd, vagy a beadást felügyel© személy szakmai megítélése alapján kell beállítani, és az itt megadott dőzisrendek csak példák, és szándékaink szerint ezek nem korlátozzak az igényelt készítmények oltalmi kórét vagy felhasználását.
A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti ustt-CDáO ellenanyagot vagy az ellenanyag egy részét tartalmazó kittek, vagy egy ilyen ellenanyagot tartalmazó készkmény. Egy kit, az ellenanyag vagy készítmény mellett tartalmazhat diagnosztikai vagy terápiás szereket is. A kit tartalmazhat egy diagnosztikai vagy terápiás módszerben való felhasználásra vonatkozó utasításokat is. Egy előnyben részesített megvalósítási mód szerint a kit tattalmázzá, az ellenanyagot, vagy az· azt tartalmazó készítményt, valamint egy diagnosztikai ágenst, amely az alábbiakban ismertetett módszerben használható, Egy további, előnyben részesített megvalósítási mód szerint a kit tartalmazza az ellenanyagot, vagy az azt tartalmazó készítményt:, egy vagy több terápiás szerrel együtt, méh ek az alábbiakban ismertetett módszerben alkalmazhatók.
A találmány tárgy át képezik továbbá az emlősökben az abnormális sejtnövekedés gátlására használt készítmények:, amelyek a találmány szerinti ellenanyagból tartalmaznák egv adott, mennyiséget, rgy kemoterápiás szer megfelelő mennyiségével kombinálva, ahol a vegyidet, só, szokni: vagy prodrog és a kemoterápiás szer mennyisége együtt hatékonyan gátolja az abnormális seítuóvekecósí. Jelenleg számos kemoterápiás szer ismert a szakterületen. Néhány megvafösitásf mód szerint a kemoterápiás szert a kővetkező csoportból választjuk ki; mítózis inhibitorok, alkilezö szerek, antimetabolitok, inierkalaló antibiotikumok, növekedési faktor inhibitorok, sejtciklus inhibitorok, enzimek, topoizomeráz inhibitorok, biológiai választ módosítók, anti-hormonok, azaz például anthantirogénefc és antí-angíogeneris szerek.
Az mdi-angiögenezis szerek, azaz példáid az MÍÍP-2 (mátrixmetalloproteináz 2j mhibítorok, az MMF-9 (mátrix-metalloproteiuáz 9) inhibitorok és a CGX-I1 jeiBooxígeoáz 0) inhibitorok használhatók egy, a találmány szerinti anti-CD40 elfenawaggal:, A jól használható COX4I inhibitorok közé tartozik a CELEBEEX™ (afecöXihj, a valdecoxíb és a rofeeoxib, A jól használható mátrix metalloproteináz inhibitorokat a szakirodalomban ismertetik jWO 96/33172 (publikálva 199ö. október 24~énj:; a WO 96/275S3 fouhilkálxa 1996. március 7-én); a 97304971.1 számú európai szabadalmi leírás (benyújtva 1997. július 8~án); a 99303617,2 szarná európai szabadalmi leírás (benyújtva 1997, július 8-án); a. 99308617.2 számú európai szabadalmi leírás (benyújtva 1999. október 29~éri|; a WÖ 98/07697 ípublikálva 1998. február 26-án), a WO 98/03516 (publikálva 1998. január 29-én): a WÖ 98/34918 (publikálva 1998. augusztus 13-án); a WO 98/34915 (publikálva
1998. augusztus 13-án): a WO 98/33768 (pubS&áJva 1993. augusztus 6-án); a WÖ 98/30566 (publikálva 1998. július 16-án); a 606,046 számú európai szabadalmi leírás (publikálva 1994. julius 13-án); a 931,788 számú európai szabadalmi leírás (publikálva
1999, július 28-án), WO 96/65719 (publikálva 1990. május 31én); a WÖ 99/52910 (publikálva 1999. június 17-én);: a FCT/ÍB98/01113 számú PCT szabadalmi bejelentés (benyújtva
1998. július 21-én): a 99302232.1 számú európai szabadalmi leírás (benyújtva 1999. március 25-én); a 9912961.1 számú angol szabadalmi bejelentés (benyújtva 1999, június 3-án); a 60/143,464 számú ideiglenes Amerikai Egvesúlt Áöamok-belí szabadalmi bejelentés (benyújtva 1999. augusztus 12-én); az 5,363,949 számú Amerikai Egyesült ASamok-belí szabadalmi leírás (kiadva 1999, január 26-án); az 5,861.510 számú Amerikai Egyesült Aliamok-beb szabadalmi leírás (kiadva 1999. január 19én): és a 730,386 számú európai szabadalmi leírás (publikálva
1997. június 25-én): amely publikációkat a továbbiakban teljes egészükben referenciaként kezelünk]. Azok az előnyben részesített MMP inhibitorok, melyek nem mutatnak arthralgiát. Még. inkább előnyben részesítjük azokat, amelyek szelektive gátolják az MMP2-t és vagy az MMP 9 et. a többi matríx-metalloprotemázhuz (azaz például az MMF-l, MMP-3, MMP--4. MMP-5, MMP-6, MMP-7, MMP-8,: .MMP-10, MMíMl, MMP-12 és MMP-13) feszunvkva. A. találmányban jól használható MMP inhibitorok néhány specifikus példája a következő: AG-3340, RO 32-3555. RS 13-0830, valamint az alábbi listában felsorolt vegyületek: 3-[[4-(4-Suoro-fen.oxih benzoiszulfonilj”G-to:ldrexikarbam©E-eildopenhl|-an^ino]~propton'·· sav: 3-exö-3-[4~{4-fiuorö-fenoxi)- benzolszulfemlatnino]-3-oxa-hiolklo[3.2. 1 joktán-3-karbonsav hidroxamid; (2R,3R) l-[4-(2~klér-4fiuoro-benziloxi)-benzolszulfoníl]~3-hídroxi-3-metíl-píperidín-2-karbonsav hidroxamid; 4-í4-(4-nuoro-fénoxi)-ben2olszulfoníi^niao]tetrahidro-pirán-4-karbonsav bídrnxamíd; 3-|4~(4-fluoro-fénoxi)benzölszulfonii)-fl-bidroxikarbarno3--ciklQbutil)-amino}-propiönsav: 4-]4-(4-kÍér-fenoxi;-benzolszulfonilamino]-tetrahidro-pirán~4~karbonsav hidroxamid; (R] 3-j4-(4-klör-fenQxi)-benzoIs^.3kbmlam.iöo]·· tetrahldro-pirán-S-karbonsav bidroxmnid; (2R? 3R) l-|4-(4~SnorO“
2- metíl-henziloxií-benzolszullbniI)-3-hldröxi-3-metÍl-plperidin“2karbonsav hidroxamid; 3-n4-í4-fluoro-fenoxi)-benzolszulíbní1.i-(l~ hidroxikarbamoil·· l-metS-etilf-aminol -propionsav; 3-í (4-(4-íluorofenom)-benzpÍszu:tonir-(4-bidro3dk8rbajnp9-tetrahidro~pmán-4~ilb amioof-propionsav; 3-exo-3- (4-(4~láör-fentm) -benzolszulfonilaminoj-8~oxa-biciklcí3.2. Iloktán-3-karbon sav hidroxamid: 3-endo-3~ í 4- (4-fluoro- iénoxi)-b€nzoÍszplíbnaminol-8-oxa-bieikloi 3.2.1 [aktán3- karbonsav hidroxamid; és |R) 3-[4-f4-8uoro~fenoxi)-benzoísznitonílamino}-fetrahidn>-furán~3-karboosav hidroxamid.; és ezeknek a vegyieteknek győgyá.szaöag elfogadható sói. és szobaijai,
A találmány szerinti vegyüfet hasznáfeafő jelátviteli inhibitorokkal is, azaz olyan szerekkel, amelyek képesek gátolni az SGFR {epídermáhs növekedési faktor receptor) válaszokat, azaz például az EGF-R ellenanyagok, az EOF ellenanyagok, és olyan molekulák, amelyek EGF-R infeibitorok; VEGE (vaszkuláris endotellálís növekedési faktor] inhibitorok, azaz például olyan VEGF receptorok és molekulák, amelyek képesek gátolni a VEGF-et; és erbB2 « * ·*
receptor inhibitorok, azaz olyan szerves molekulák vagy ellenanyagok, amelyek kötődnek az erbB2 receptorhoz, ilyen például a HERGEFtWM (öenentech, Inc.). Az EÖE-R inhibitorokat például a következő publikációkban ismertetik: WO 95/19970 (publikálva 1995. július 27-én); WO 98/14451 (publikálva 1998, április 9~ét< WO 98/02434 (publikálva 1998 január 22-én) és az 5,747,498 számú Amerikai Egyesült Alamok-bek szabadalmi leírás (kiadva
1998. május 5-én), és ezeket az anyagokat a találmányban az alábbiakban ismertetett módon lehet használni. Az EGFR-t gátló szerek közé tartoznak, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a következő monoklonális ellenanyagok: €225 és az andEGER 22Mafe (ImClone Systems incorporafed), ABX-EGF (Abgenix/Ceh Genesys), BMD-7200 (MerckKgaA), EMD-5S9Ö (Merck EgaAj, MDX-447/H-477 (Medarex Inc. és Merck EgaA, valamint a ZD-1834. ZD-183S és ZD-1839 vegyüietek (AstraZeneca), a FK1-166 iNovartis), a 'PKI-166/CGP-75166 (Novarbs), a FIX 787 (MovartisL a CP 701 (Cepbalon), a leílunomíde (Pharmscia/Sugen), a Cl-1933 (Warner Lambert Parké Davis), a Cl-1033/FD 183,805 1033 (Warner Lambert Parké Davis/, a CL-387,785 (WyetbAyerst). a. BBR-1611 (Boehringer Mannheim GmbH/Roche), a Naamidíne A (Bristol Myers Squibb), az RC-3940-11 (Pharmacia), a BIBX-1382 (Boehringer Ingelheim), az 0LX-IÖ3 (Merck & Co.j, a VRCTC-31G (Ventech Research), az EGE fúziós toxin (Seragen Inc,), a BAB-389 (Seragen/Lilgand), az LFM-A12 (Parker Hughes Cancer Center), a vvHl P97 (Parker Hughes Cancer Center), a GW-282974 (Glaxo), a 0-8391 (Xyowa. Hakkc) és az EGP-R vakcina (York Medical/Centro de Immunolgía Molecular (CÍM)). A találmányban ezek, és más. az EGE R·-t gátló szerek használhatók.
φ * * * φ ,· : φ:*-χ Φ
Φ
Φ φ *-·ϊ:
A VBGF inhibitorok, azaz- például a SO-5416 és a SO-6668 (Sugen Inc.)·, az SH-268 (Sohering) és az XX-1838 (KeXstar) szintén kombínálhatók a találmány szerinti vegyűfettel. A WOF inhibitorokat például a következő publikációkban ismertetik: WO 99/24440 (publikálva. 1999. május 20-án), 9C7/ÍB99/00797 PCT nemzetközi szabadalmi Ieirás (benyújtva 1999. május 3-án), WÖ 95/21613 (publikálva 1995. augusztus 1.7-én), WO 99/61422 (publikálva 1999. december 2-án), 5,834,504 számú. Amerikai Egyesült Allamok-belí szabadalmi leírás /kiadva. 1998, november lö-én), WO 98/50356 (publikálva 1998, november 12-énj; 5.883,113 számú Amerikai Egyesült AUamok-beli szabadalmi leírás (kiadva 1999 március lö-an), 5.SS6.020 számú Amerikai Egj-esült Aliamok-beli szabadalmi leírás (kiadva 1999. méress 23ánj, 5792,783 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi, ieirás (kiadva 1998.. augusztus 11-én), WO 99/10349 (publikálva
1999. március 4~én), WO 97/32856 (publikálva. 1997. szeptember 12~én|, Wö 97/22596 (publikálva 1997. június 26-án), WO 98/54093 (publikálva 1995. december 3-án), WÖ 98/02438 (publikálva 1998. január 22-énl. Wö 99/16755 (publikálva 1999. április 8-án), és WO 98/02437 (publikálva. 1998. január 22-én), amely pubiíkáciőkat a továbbiakban teljes egészükben referenciaként kezelünk. A találmányban jól használható néhány speciBkus VEOF inhibitor például a következő: IM862 (Gyéren Inc.); a öenentech, Inc. anti-VEOF monoklonális ellenanyaga: és az angíozkm egy szintetikus ribozim a Ribozyme and Chiron-tól. Ezek, és más VEGF inhibitorok: a találmányban az alábbiakban ismertetett módon használhatók. Az ErhB2 receptor ínhibitórok, azaz például a GW-282974 (Glaxo Wellcome plc), és az AR-209 (Aronex Pharmaceuticals Inc.) és 2B-1 (Chiron) monoklonális *·-*
ΙΟΙ
ΦΜ-» ·*· » * * •X ·* * *
¢.- φ X « * <<«* ** *4 «r-β ·» ♦·
4. « «
-* * «·χ·χ·χ· *·» ellenanyagok tovább kombinálbatók a talál máin szerinti vegyit lettel, ahogy azt például a következő publikációkban ismertetik; Wö 98/02434 (publikálva 1998, január 22-én.j; WO 99/35146 (publikálva 1999. július 15-én); Wö 99/35132 (publikálva 1999, július 15~én); WO 98/02437 (publikálva 1998. január 22-én); WO 97/13760 (publikálva 1997. április 17-én), WO 95/19970 (publikálva 1995, július :27-én); 5,587,458 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalma leírás (kiadva 1996. december 24-énj; és az 5,377,305 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás (kiadva 1999. március 2-án), amely publikációkat a továbbiakban teljes egészükben referenciaként kezelünk, A találmányban jól használható BrbB2 receptor mhíbitorokaí szintén ismertetik a. 60/1.1.7,341 számú ideiglenes Amerikai Egyesült Államök-heli szabadalmi leírásban, benyújtva 1999. január 27-én, és a. 60/117,346 számú ideiglenes Amerikai Egyesük ÁBamok-beli szabadalmi leírásban, benyújtva 1999. január 27-én, amely publikációkat a továbbiakban teljes egészükben referenciaként kezelünk. Az ErbB2 receptor inhibitor vegyületek» és az előzőkben ismertetett PCT szabadalmi bejelentésekben,. USA szabadalmi bejelentésekben és ideiglenes USA szabadalmi bejelentésekben leírt anyagok, valamint más, az Erb.82 receptort gátló vegyületek is receptorok a találmány szerinti vegyúlettei használhatók, a találmány szerinti egárással.
A túlélés elleni szerek közé tartoznak az anti-IGF-IE ellenanyagok és az autl-íntegrin szerek, azaz például az anh-integrin ellenanyagok.
Diagnosztikai módszerek
V. » « ♦
502 «·«·' **
A találmány tárgyát képezik továbbá a diagnosztikai módszerek. Az antí-€D4Ö ellenanyagok arra használhatók, hogy egy biológiai mintából in Aúo vagy m Α» kimutassuk a CB40-et. Az egyik megvalósítási mód szerint a találmány tárgya eljárás egy €D40-et expresszálő tumor jelenlétének vagy helyének kimutatására, egy erre szoruló alanyban, a CD40 expressziójának meghatározásával egy alanyban, azt lokalizálva, hogy az elfenmwag hova kötődött, összehasonlítva az alanyban kapott expresszlőf egy normál referencia alanyban kapott expressziével vagy egy standarddal, majd a tumor jelenlétét vagy helyét diagnosztizálva.
Az antí-W4ü ellenanyagok használhatok egy hagyományos immunesszében,: beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az BOSA-t, RIA-L: EACS-ot, szövet immunhísztokémiát, Western híottot vagy immunprecipitációt. A találmány szerinti antí-€D4Ü ellenanyagok használhatók a CD4Ö emberekben való kimutatására. Egy másik megvalósítási mód szerint az antí-CDAÖ ellenanyagok használhatók a CD40 övílágt ffiemlósökben, azaz például cynomolgus és rhesus majmokban, csimpánzokban és emberszabású majmokban való kimutatására. A találmány tárgya eljárás CD4G kimutatására egy biológiai mintából, azzal jellemezve, hogy egy biológiai mintát érintkezésbe hozunk egy.: a találmány szerint anti-CD40 ellenanyaggal és kimutatjuk a megkötött ellenanyagot, Az egyik megvalósítási, mód szerint az anti-CBAÖ ellenanyagot közvetlenül jelezzük egy kimutatható jelöléssel Egy másik megvalósítási mód szerint az anti-CD4ü ellenanyag (az első ellenanyag) jelöletlen,: és egy második ellenanyag, vagy más, az antíCD40 ellenanyaghoz kötődni képes molekula jelezve van. Amint az a szakterületen jártas szakember számára jól ismert, egy második ellenanyagot ügy választunk meg. hogy képes legyen specifikusan ;?ί:8· kötődm az első eienanvag egy bizonyos fajtájához és osztályához:. Ha példáid az antí-CÖ40 ellenanyag egy humán IgG. akkor a szekunder e&nanyagnak egf anb-humán~lg^~nek kell lennie. Más, az ellenanyagokhoz kötődni képes molekulák közé tartozik, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, aProteín A és Protein Ö, melyek mind kereskedelmi forgalomban vannak:, beszerezhetők például a Pierce Chemical Co.-toL
Az ellenanyag vagy szekunder ellenanyag megfelelő jelöléseit az előzőkben ismertettük, ide tartoznak a. különböző enzimek, prosztedfcus csoportok, fluoreszcens anyagok, lumineszcens anyagok és radioaktív anyagok, A megfelelő enzimek közé tartozik a tormaperofodaz, az alkahkus foszíatáx, a p-galaktozidáz, vagy az acetílkokneszteráz; a megfelelő proszíetíkus csoport komplexek közé tartozik a sztreptavidin/hiotin és az avídín/bíotím a megfelelő: fluoreszcens anyagok közé tartozik az umbeliforone, a nuoreszcein, a fluoreszceín-izötiooianát, a modemmé, a mklórtriazmllamín Ouoreszceíú, a danzbk'forid vagy fíkoeritón; a lumineszcens anyagok egyik példája a luminol; a. megfeleld radioaktív anyagok közé tartozik a *2Si, ai3H, a vagy a HKL
Egy másik megvalósítási mód szerint a CD4Ö egy biológiai mintában: kompetíciós ímmunesszével vizsgálható. ^mutatható anyaggal jelzett CD40 standardokat és egy jelöletlen anü-CD40 ellenanyagot használva. Böbén az esszében a biológiai mintát, a jelzett CD40 standardokat, és az anb~CD40 ellenanyagot kombináljuk, majd meghatározzuk a jelöletlen ellenanyaghoz kötődött jelzett CD4Ü standard mennyiségét, A CÖ4Q mennyisége a biológiai mintában fordítottan aranyos az anti-CD4Ö címanyaghoz kötődött jelzett CD4Ö standard mennyiségével.
** κΧ· * Φ·*· •04
Az előzőkben ismertetett immunesszéket számos különböző célra lehet használni. Például az anti-CD40 ellenanyagokat használhatjuk sejttenyészetben levő sejtekben a CD40 kimutatására. Egy előnyben részesített megvalósítási mód szerint az antl-CDAO ellenanyagokat arra használjuk, hogy meghatározzuk a CD40 mennyiségét olyan sejtek felszínén, melyeket, különböző vegyülő tekkel kezeltünk. Ez a módszer arra használható, hogy azonosítsuk azokat a. vegyuleteket, amelyek jól használhatók a CÖ4Ö aktiválására vagy gátlására. Eszerint a módszer szerint egy sejtmintát egy ideig e^ teszt-vegyüiettd kezelünk, míg égy másik mintát kezeletlenül hagyunk. Ha a CÖ4Ö össz-szintjét akarj tik megmérni, akkor a sejteket feákaéjuk, és a CD4Ö össz-szlntjét az egyik előzékben ismertetett módszerrel megmérjük,. A kezelt szervezetben méri Őssz-OMÖ szintet, hasonlítjuk össze a kezeletlen szervezetben mert szinttel, hogy meghatározzuk a íeszfc-vegyület hatását.
Az ÖSSZ-CÖ4Ü szint mérésének egy előnyben részesített immunesszéje az ELISA vagy a Western biot. Ha a. CD40 ^szintjét a felszínen akarjuk mérni, akkor a sejteket nem. lízáítatjuk, és a CD4Ö felszínen, mért szintiéi az előzőkben ismertetett immunesszék egyikével mérjük. A. CB4Ö felszíni szintjének meghatározásához élőm ben részesített egyik Immunesszé a következő: lépésekből áll: a sejtfelszkri fehérjéket egy kimutatható jelöléssel jelö|ük, azaz például bioimnál vagy *25<~vel, a CD4ö-et egy andCS4ü ellenanyagai kicsapjuk, és utána kimutatjuk a jelzett CD40-et. A CD4Ü lokalizációjának, azaz például a sejtfelszíni szinteknek, egy másik előnyben részesített immunesszéje az im~ mttnhisztokémia. Ezek a módszerek, azaz például az ELISA, a RIA, a Western htot, az immunhisztokémia, a integrális memhrárdébér-
jék sejtfelszíni jelölése és immunpredpkádóia a szakterületen jel ismert [Oarlow és mtsai: Antiböéhes; A Laboratory Ivlanual. 2, kiadás, Oold Spring Harbor Laboratory Press, Coki Spring Harbor, New York {1.988)0 Emellett az immunesszék méretnövelhetők, nagy áteresztőképességű szűrővizsgálatokhoz, azzal a céllal, hogy nagyszámú vegyüfetet vizsgálunk át, hogy aktiválják-e vagy gátolják-e a CD4O-et.
A találmány szerinti anti-CD40 ellenanyagok: arra. is használhatók, hogy meghatározzuk a CD40 szintjét egy szövetben, vagy a szövetből származó sejtekben. Néhány megvalósítási mód szerint a szövet egy kóros szövet. Néhány megvalósítási mód szerint. a szövet egy tumor, vagy annak: biopsziáya. A módszer néhány megvalósítási módja szerint a szövetei vagy annak hiopsziáját egy betegből vágjuk ki, A szövetet vagy blopsziát használjuk azután egy immunesszében, hogy meghatározzuk például az össz-CD40 szinteket, a CD4Ö sejtfelszíni szintjét, vagy' a CD40 lokalizációját, az előzőkben ismertetett módszereket használva.
Az előzőkben ismerteteti diagnosztikai módszerek használhatok annak meghatározására, hogy egy tumor magas szinten e:zpresszái-e CD40-et, ami azt mutathatja, hogy a tumor az antiCD40 ellenanyaggal: végzett kezelés célpontja. Továbbá, ugyanaz a. módszer használható az a.nd-CD4ö ellenanyaggal, végzett kezelés hatásának követésére, a sejtek tumorban való pusztulásának kimutatására. A diagnosztikai módszerek emelett: arra Is használhatók. hogy meghatározzuk, miszerint egy szövet vagy sejt nemkielégítő mennyiségben expresszáija a CD40-et vagy az aktivált CIMÖ-et, és ezért jelölt arra, hogy aktiváló antí-CD4Ö ellenanyagokkal, CD40L-ld, és/vagy más terápiás szerrel kezeljük, a CD40 szintek vagy aktivitás növelésére.
lto ♦ *r
*'*· **·♦ *
A találmány szerinti ellenanyagok használhatók ín toao is, CB4Ö-eí expresszáió szövetek és szervek azonosítására, Néhány megvalósítási mód szerint az anti-CD40 ellenanyagokat használtuk CD40-et expresszáió tumorok azonosítására, A találmány szerinti humán antí-CD40 ellenanyag: használatának: egyik előnye, hogy ín fonó biztonságosan használhatok, anélkül hogy immunválaszt fejtenének ki a beadás után, a nem-humán eredetű, vagy humanizált ellenanyagoktól eltérően.
Az eljárás abból áll, hogy egy kimutathatóan jelzett antiCD4G ellenanyagot, vagy egy ezt tartalmazd készítményt egy ilyen diagnosztikai: tesztre szoruló betegnek beadunk, és a betegeket képelemzés! eljárásnak vetjük alá, hogy meghatározzuk a €.D40~et expresszáió szövetek helyét. A képelemzés jól ismert a gyógyászatban, ide tartozik, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat. a röntgen-elemzés, a mágneses rezonancia leképezés (MRi) és a számítógépes tomográfia (CE1, Az ellenanyag bármilyen olyan, szerrel lehet jelezve, amely alkalmas az át vm leképezésre, például egy kontrasztanyaggal, azaz például báriummal, amely a. röntgen elemzéshez használható, vágj? egy mágneses kontraszt anyaggal, azaz például egy gatiolínium keláttal, amely az MRl-hez; vagy a. CE-bez használható. Más jelölő anyagok lehetnek, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a radioaktív izotópok, azaz például a ®Tc. Egy másik megvalósítási mód szerint az anti~€D4G ellenanyag jelöletlen, es a leképezéshez egy második ellenanyagot vagy más molekulát adnak be, amely kimutatható, és képes kötődni az antí.-CD40 ellenanyaghoz. Az egyik megvalósítási mód szerint hioipsziáf veszünk ki egy betegből, hogy meghatározzuk, a szövet expresszál-e CO4Ö-et,
107 ·♦ *· ;♦
Φ χ- χ Φ ** *Φ
2Λ módok
A találmány tárgyát a találmány szerint and-CD4Ö· ellenanyagot alkalmazó terápiás módszerek képezik.
Egy, a. találmány szerinti humán agonista anti-CD40 ellenanyagot egy fceresztreagálő CD4Ö~eé expresszáló embernek. vagy nem-humán emlősnek .fehet beadni. Az ehenanyagot ilyen nemhumán emlősnek (azaz például főemlősnek, eynomolgus- vagy rhesus majomnak) állatgyógyászati céllal lehet beadni, vagy egy emberi betegség ábatmodelljében. Az ilyen állatmodellek jól haszna.hatók a találmány szerinti ellenanyag terápiás hatékonyságának kiértekeBsében,
Néhány megvalósítási mód szerint az anti-CD4ö ellenanyagot olyan alanynak adjuk be, amely primer és/vagy kombinált immundeíícienciákban szenved, beleértve a CD40-dependens immundeScieuciát .Hyper-lgM szindrámával, az általános variábilis immundeíicienciát. a Oruton agammaglobullnemiát, az IgG alosztály dehcíeoriákat és az X-kaposolt S€ID~t (általános gamma-lánc mutációk). Néhány rnegvalósltási mód szerint az antí-CD4ö ellenanyagot egy olyan alany kezelése céljából adjuk be, amely Immunszuppresszálva van, például, kemoterápia miatt, vagy' egy immungvöngítő betegsége van, beleértve a szerzett immunhíányos betegséget, azaz például a HIV-et, Néhány megvatósítási mód szerint az antí-CDO elfenanyagpt azért adjuk be, hogy egy Idős emberben erősítsük az immunitást Néhány megvalósítási mód szerint az anti~CD40 ellenanyagot azért adjuk be, hogy egy olyan alanyt kezeljünk, akinek bakteriális, viráBs, gomba vagy parazita fertőzése van. Néhány megvalósítási mód szerint egy, a találmány szerinti humán agonista anti~CD4í> ellenanyag beadható proídaktikusan egy alanynak, aki életkora, betegsége, vág? gyenge általanos egészségi állapota miatt érzékem' a. fertőzésre, hogy megelőzzcük. vagy csökkentsük a fertőzések számát vagy súlyosságát.
Néhány megvalósítási mód szerint az anú~€ö4ö ellenanyagot égy híperproliföratív rendellenességben szenvedő alanynak adjuk be.
Néhány megvalósítási mód szerint az anti-CD40 ellenanyagét egy tumoros alany kezelésére adjuk be.. Néhány megvalósítási mód szerint a tumor CD40 pozitív. Néhány megvalósítási mód szerint a tumor CD40 negatív. A tumor lehet szolid tumor, vagy nem-szolid tumor, azaz például fetfóma. Néhány megvalósítási mód szerint egy antí~€D4ö ellenanyagot egy olyan betegnek adunk be, aki rákos tumort hordoz. Néhány megvalósítási mód szerint az ellenanyag gátolja a ráksejtek szaporodását, gátolja vagy megelőzi a tumor súlyának vagy térfogatának növekedését, és/vagy a. tumor súlyának: vagy térfogatának csökkenését okozza.
A találmány szerinti anh-CD4Ö eUenanyagokkál vagy ellenanyag-részekkel kezelhető betegek közé tartoznak, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, azok a betegek, akiknél agyrákot, tüdőrákot, csorrfcrákot hasnyáhmrigy rákot, bőrrákot, fej- és nyakrákot, bőr- vagy intraokulázis melanőmát, méhrákot, petefészek rákot, végbélr&kot, az análís régió rákját, gyomorrákot, kolorektálís rákot, vastagbél rákot, emlőrákot:, nőgyógyászati tumorokat (azaz: például méh szarkőmák, a méhkürt karcínőmája, a mehnyálkahártya rákja, a méhnyakrák, a. hüvelyrák, vagy a női szeméremtest kardnómája), nyelőcső rákot, vékonybél rákot, az endokrin rendszer rákját (azaz például a pajzsmirigy, a melekpajzsmirigy vagv a mellékvese mirigyek rákja), a lágyszovetek szarkóraml. leukémiát, mielőmát, többszörös, mielőmát, kngyesörákot, péníszrákot, prosztatarákot, krónikus vagy akut leukémiát, gyerekkori szilárd tumorokat, Hodgkin kört, Hmfocita limfomákat. nem-Hodgkín iimfomát, hólyagráköt, májrákot, vesevagy húgyvezeték rákot (azaz például wsesejt karclnöma,, a vesemedence karcinóma), vagy központi idegrendszer neoplazmáit (azaz például primer CMS limíóma, gerincvelő tumorok, agytörzs glíómák vagy a bipo&is adenómák;, gkőmáf vagy dbmszárkdmát
Az ellenanyag beadási gyakorisága napi háromszori beadástól félévenként egyszeri beadásig változhat, és beadhatjuk orálisan, a nyálkahártyába, a szájüreghe, mfranazálisan, belélegezve. Intravénásán, szuhkután, mtramuszkulárisan, parenteráfean, intratumoráli&an, mmszdermálisan vagy topifcálisam Áz eiienanyagoí egy mmipumpa segítségévek folyamatosan is beadhatjuk. Az ellenanyagot általában addig adjuk be, ameddig a tumor jelen van, azzal a feltétellel, hogy az ellenanyag leállítja a tumor vagy rák növekedését, vagy csökkenti a tömegét vágj' térfogatát. Az ellenanyag dózisa általában 0,025-50 mg/kg, előnyösebben 0,1-50 mg/kg, előnyösebben 0,1-20 mg/kg, 0,1-10 rng/'kg, 0,1-5 mg/kg, vagy még előnyösebben 0,1-2 mg/kg között van. Az ellenanyagom beadhatjuk prnSakhknsan is.
Néhány megvalósítási mód szerint az anti-CD40 ellenanyagot egy terápiás kezelési eljárás keretében adjak be, amely tartalmaz még egy vágj· több további anhneoplasztikus gyógyszert vagy molekulát, egy olyan betegnek, aki hiperproliferatív rendellenességben szenved, azaz például rákban vagy tumorban. A tumorellenes szerek közé tartoznak például, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a mitotikus inhibitorok, alkilező szerek, anumetabolitok, inrerkalálő szerek, növekedési foktor inhibitorok, sejtciklus inhibitorok, enzimek, topoizomeráz inhibitorok, biológiai választ módosító szerek, and-hormonok. kináz inhibitorok, mátrix *ί «4 4* 4 Μ «· * 4 X 4 ** 4 4 typ 4 X 4 Χ· 4 * * iiv 4 * 4 4 4 4 *4 ··♦»*·* 44 44 Μ» 44 metalloproteáz inhibitorok, genetikai terápiás szerek és az antíandrogének. Egy inkább előnyben részesített megvalósítási mód szerint az; antí~CD4Ö ellenanyagot egy autíneoplasztikus; szerrel, azaz például adriamioinnel vagy távollal együtt adjuk be. Néhány előnyben részesített megvalósítási mód szerint az antí-CD40 ellenanyag terápiát radíoterápíával, kemoterápiával, fetodinámlás teráp'ával; műtéttel vagy más immunterápiával együtt hajtjuk végre. Nehány megvalósítási mád szerint az- anti-€D4tí ellenanyagét egy vagy több más ellenanyaggal együtt adjuk he. Az anti-CD40 ellenanyagot például olyan ellenanyagokkal együtt lehet beadni, melyekről ismert, hogy gátolják a tumor vagy ráksejt szaporodásán Az ilyen ellenanyagok közé tarrozik. anélkül, hogy erre korlátoznánk magunkat, egy olyan ellenanyag, amely gátolja a CTLAE-et, az erbB2 receptort, az EGF-R~t, az IGE-IR-t, a €D20-ai vagy a VEGF-eL
Néhány megvalósítási mód szerint az anti-CD4Ü ellenanyagot egy radioaktív jelöléssel, egy immunioxinnal vagy egy olyan fúziós fehérjévé! jelezzük, amely tartalmaz egy toxikus peptídet. Az antí-CD-K) ellenanyag vagy anti-CD40 ellenanyag fúziós fehérje irányítja a radioaktív izotópot, imnwnfoxini, toxmt vagy toxikus pepiidet a tumor vagy rákos sejtbe. Egy előnyben részesített, megvalósítási mód szerint a radioaktív izotópot, immuntoxínt, toxrnt vagy toxikus pepiidet a tumor vagy rákos sejt intemalizáha. miután az anti-CD4Ö ellenanyag kötődik a sejt felszínéhez.
Egy másik megfontolás szerint az antí-CO4Ö ellenanyag, terápiásán használható arra, hogy egy betegben specifikus sejtek apoptözísát indukálja. Számos esetben az. apoptözisra megcélzott sejtek rákos- vagy tumorsejtek. Tehát a találmány tárgya. eljárás * 5 * > * *
Φφ.
apoptozis índökálássra, egy anti-CD4ö ellenanyagot beadva, egy ilyen kezelésre szoruló betegnek.
Egy másik megfontolás szerint a találmány tárgya eljárás egy aktiváló aao-€D4ü ellenanyag beadására egy betegnek, azzal a céllal, hegy fokozzuk a CD40 aktivitását. Ego antI-CB40 ellenanyagot egy vagy több más fokforral együtt adunk be, melyek fokozzák a CD40 aktivitását. Ilyen faktor például a CD40L, és/vagy a CD40L analógiái. amelyek aktiválják a CD40-et.
Néhány megvalósítási mód szerint egy anti-CÖ40 ellenanyagot egy vagy több további, az immunrendszert erősítő szerrel együtt adjuk be, beleérne, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az ÍFN-pl-et, azointerieukin-2-t, az interieukín-S-at. az az- interLeukin-12-t, az Interleukin- 15-őt, az interieukin-18-at, az; fcterleukin-23-at, az IFNy-t és a GM-CSF-et.
Néhány megvalósítási mód szerint egy». a találmány szerinti humán agonista anb-CD4ö ellenanyagot adjuvánsként használunk egy vakcina hatékonyságának növelésére. Ha igy használjuk, akkor az anti CB40 ellenanyag· aktiválja a CD4Ö-et az antigént prezentáló sejteken, beleértve a B-sejtekef.: dendrites sejteket és monocííákaí, valamint fokozza az immunmoáulátor molekulák, azaz például cítokinek és kemokinek termelését. Az ellenanyag immunsíímulálö hatása fokozza a vakcináit alanynak a vakcina antigénre adott immunválaszát.
Egy másik megfontolás szerint a találmány tárgya eljárás egy rák edenh vagy dendrites sejt immunterápiában használható dendrites sejt vakcina előállítása. Az eljárás szerint egy rákos betegből származó dendrites sejteket 1-5 napig tenyésztünk, tumor Hzátum mai vagy bömegerdzátummai - a tumorsejteket besugárzással, vagy más módszerrel pusztítjuk el - vagy tumor-speeiSkus antigénekkel (azaz például pepödekkel. ídio típusokkal), és ΓΙΟ pg/ml aníí-CD4ö ellenanyaggal, A tumor antigénnel impulzusjelzett dendrites sejteket rissza-injekciozzuk a betegbe, hogy temoreilenes immunválaszokat stimuláljunk, főleg tumoreienes CTL válaszokat. Az eljárásban használandó monoeita-eredetd dendrites sejteket, períferiális vér mintából kaphatjuk meg, ínterieukin4-ben és GM-CSF-ben tenyésztve, A dendrites sejtek származhatnak egy beteg csontvelejéből is. a CD34 pozitív sejtek mágneses tisztításával^ vagy osztályozásával, és ezt követően ínterleukín4-ben és GM-CSF-ben történő tenyésztéssel.
Génterápia
A találmány szerinti nukleinsav molekulákat egy ilyen kezelésre szoruló betegnek génterápiával lehet beadni. A terápia lehet in vivő vagy ex vivő, Egy előnyben részesített megvalósítási mód szerint a nehéz láncot és könnyű láncot kódoló nukleinsav molekulákat adjuk be a betegnek. Egy inkább előnyben részesített megvalósítási mód szerint a nukleinsav molekulákat ügy adjuk be, bog’ stabilan integrálódjanak a S-sejtek kromoszómáiba, mivel ezek a sejtek az: ellenanyagok előállítására specializálódták, Sgy előnyben részesített megvalósítási mód szerint a. prekurzor Bsejteket ax rivo tramszíektáljuk vagy fertőzzük, és visszaültettük egy Ilyen kezelésre szoruló betegbe. Sgy másik megvalósítási mód szerint: a prekarzor B-sejtekeé vagy más sejteket ín rivo fcranszfektáljuk, olyan vírust alkalmazva, amelyről ismert, hogy a számunkra érdekes sejttípust megfertőzi. A génterápiában használt tipikus vektorok közé tartoznak a. liposzőmák, piazmídok és virális vektorok. Á virális vektorok közé tartoznak például a retrovlrusok, az adenovirusok és az adeno-asszoeiált vírusok:. Az in vivő vagy ex
... ·*.$: Α-ΦνΦ φ· <Κ·« * * ν -»· X- Λφφ. φ .« ν · * > S * * ♦ » :* :* V $ *· φ «τΧ-** Χ<Φ S..-Í «£* »;>
mo fertőzés után az ellenanyag expresszióját ügy lehet követni, hogy mintái veszünk a kezelt betegből, és egy, a szakterületen ismert, vág}' itt ismertetett immunesszét használunk.
Egy előnyben részesített megyálósítási mád szerint a génterápiás módszer a következő lépésekből áll: egy anii-CD4Ö ellenanyag nehéz láncát, vagy annak antigén-kötő részét ködoio, izolált nukleinsav molekulát adunk be, és expresszáltatjuk a nukleinsav molekulát. Egy másik megvalósítási mód szerint a génterápiás módszer a következő lépéseket tartalmazza: egy antí-CD40 ellenanyag könnyű láncát, vagy annak antigén-kötő részét kódoló, izolált nukleinsav molekulát adunk be, és a nukleinsav molekulát. Egy még inkább előnyben részesített megvalósítási mód szerint az. eljárás a. következő lépésekből áll: egy anti-CD4Ö ellenanyag nehéz láncát, vagy annak antigén-kötő részét kódoló, izolált nukleinsav molekulát, vagy egy anti-CD4Ö ellenanyag: könnyű láncát, vagy annak antigén-kötő részét, kódoló, izolált nuk~ iemsav molekulát adunk be, és expresszáltatjuk a nukleinsav molekulákat. A génterápiás módszer magában foglalhatja azt a lépést is., hogy z masiK tumoré® » szert, azaz például taxolt vagy adriamíemt adunk be.
A találmány jobb megértéséhez az alábbi példákat meg. Ezek a példák csak illusztrációs célokat szolgálnak, és szándékaink szerint semmiképpen sem korlátozzák a találmánv oltalmi korét.
1. Példa
Ánti €D40 ellenanyagot termelő hibrid óm á.k előállítása
A találmány' szerinti ellenanyagokat az alábbiak szerint állítjuk elő, szelektáljuk és vizsgáink:
; * φ φ
23/3
Immunitás és bibridőma előállítás8-TÖ hetes XenoWcé^ egereket immunizálunk Ín&aperit©neálísan. vagy a hátsó lábaik mancsában, CD40-lgG fúziós fehérjével (10 pg/dózís/egér), vagy 3ÖÖ39-CD40 sejtekkel· amely egy, a plazma-membránján humán CD4ü-et expresszáló transzfektált sejtvonal (1O><10§ sejt/dózis/egér). Ezt a. dózist 5-7* megismételi ük, egy 3-8 hétig tartó időszak alatt. A fúzió előtt négy nappal az egereknek humán CD40 extracelíulárís doménjéhől foszfáttal púdereit sóoldalfean adunk be egy végső injekciót- Az immrmizálé egerekből származó lépet és nyn-okcsomő iimfochákat a nem-szekréciős mielőma P3-X63--Ag8,S53 sejtvonallal luzlonáhatjuk, majd a fúzión áltatott sejteket HAT szelekciónak vet ük alá, a már ismertetett módon, föalfce és estem: Methods in Enzymolegy 73, 3-46 (1981)]. Elnyerjük a hibridőmáhnák egy CÖ40~specifikus humán IgG2v ellenanyagokat szekretálő paneljét. A további vizsgálatokhoz tizenegy hibrldőmáé választunk: ki, ezek jelölése: 3.1.2 7-1.2,.
10.. 8.3.. .1533, 21.4.1, 21.2.1, 223 3, 23.5.1, 23.25.1, 23.293 és
24.23..
A 3.1.1, 7.1.2, 10,8..3, 1533. es 21.43 jelű hibridőmákat az .American Type Cülture Collection-nél helyeztük letétbe, a Budapesti Egyezménynek megfelelően GOSOl Gníversity Buufevard, Manassas, VA 20110-2:209, 2001, augusztus Ó.j, A 21.23, 223,1, 23.5,3, 23.25.1, 23,293 és 24.23 jelű hibridémákat 2002. július 16-án helyeztük letétbe az ATCC-nél. A hibridotnák az alábbi letéti számokat kapták:
Hibridőma
Letéti szám FFA-3600 * ν £ * Μ » f #· ·* ♦ ··.. > *
*.**' ** *«
Λ =.?·
7.1.2 (LN 158491 PTA-3601
10.8.3 (LN 15850= PTA-36G2
15.1.1 (LN 1585 0 PTA-3603
21.4.1 (LN 15853) PTA-36ÖS
21.2,1 (LN 15874) PTA-4549
22.1.1. (LN 15875): PTA-4550
23.5.1 (LN 15855) PTA-4548
23.25,1 (LN 15876) PTA-4551
23.28,1 (LN 15877) PTA-4552
23.29.1 (LN 15878) PTA-4SS3
24.2.1 ÍLN 158979) PTA-4554
A.találmány szerint döálUtm^^
Ahhoz, hogy a találmány szerint előállított ellenanyagok szerkezetét vizsgáljuk, klónozzuk a nehéz lánc és könnyű lánc Iragmeosekeh auti-CD40 monoklonálís ellenanyagokat termelő bihrídömnfehoL A klónozást és szekvenálást az alábbiak szerint hajtjuk végre.
A humán :CD40-nel tíz 1. példában: ismertetett módon immunizált XenoMouse™ egerekből származó, körülbelül 2* 1ÖS hibridőrna sejtből polí(A'y mENS-t izolálunk, egy Fast-'Track Kit használatával (Inriírogenp A véletlenszerűen indított: eDNS generálását polimeráz láncreakcióval követjük. Humán Vn vagy humán YK családra spocBkus variábilis régió printereket használunk fhíarks és mtsai: „Ökgouucleoöde pvimers fór pohanerase chain reacdon ampliíication oí humán ímmunoglobulin variabis gen.es and design of family-specifíc oligonucleotide prohesy Eur. J. Immunot 21,.
ÍOÁD.Ás ALAPJÁUL
SZOLGÁLÓ VÁLTÓST
985-991 (1991)7 vagy egy univerzális humán Yn prímért:, az MG30-at [CAGGTGCAGCTGGÁGCAGTCíGG (.113. számú szekvenda)], az RiG~40á humán Cj2 konstans régióra vagy a Cx konstans régióra 7auP2; Green és mtsai; Natúré Geneűcs 7. 13-21 (1994}j specifikus primerekkel 5 -GCTGAGGGAGTAGAGTCCTGAGGA-3 (119. számú, szekvencia)]. A humán nehéz lánc és könnyű lánc transxknptumöRat kódoló nukleinsav molekulákat az anti-CD4ö ellenanyagot termeld hibridómakból kapjuk, az előzőkben ismertetett primerekkel. közvetlenül szekvenálva a ροϋ(Α;!) BNS-röl kapott polimeráz láncreakció termékeket. A polimeráz láncreakció termékeket pCRS-be is klónozzuk, egy TA klónozó kit. puvitrogeo) használatával, majd mindkét szálat Pnsrn festék-terminátor szekvenálö kittekkel és egy .ARI 377 szekvenálő berendezéssel szekve:ná|uk. MmdegyíR szekvenciát a „¥ BA.SB sequenee dírecfcory*-hoz hasonlítva elemezzük (Tomünson és munkatársai, MRC Centre fór Protein Bngineermg, Cambridge:, N^y-Britannia), Mae Veotor és
Ezután, a 3.1.1, 7.1.2, 10.8.3, 15,1,1, 2L4.1, 21,2,1, 2222,
23.,5.1, 23.252,, 23.29.1 és 24.2:2 monofclonális ellenanyagokat teljes hosszúságú DNS klónozásnak és szekven áfásnak vetjük alá. z\z ilyen szekven áfáshoz RNS-t izolálunk körülbelül 4>20& hibridéma sejtből a Quiagen RNeasy RNS izoláló kát (QUIAGBN) használatával. A mRBS-t te vesz transzkripcióba visszük, ökgödT(lS)··· at és az Advantage RT/PGR kittet (Gloneteeh): használva. Á V Bőse-: hasznahu’·- az e'oreizvo amo'^kaciós primerek tenezeséhez, melyek tartalmaznak restrikciós hasítást helyeket, optimális Kozák szekvenciát, az ÁTG starthelyet és a nehéz lánc szignálszekvenciájának egy részét Az 1. táblázatban felsoroljuk az ellen-
*·* anyag kiónok szekvenálására használt: előrevivő· amplifikációs priI, Táb ázat
Kiön
Nehéz lánc előrevivő primer
10,83 i· *%· ·$ :í
X A .i.
S’-TATCTAAGCTTCTAGACTCGACCGCCACCATG G AGTFTGGGCTGAGCTG-3’ |12Ö.SZÁM0 SZEKVENCIA!
5-TATGTÁAGCT1 v 3..™r
GAGTTTGGGCTGAGCTG-3’ fi21 .SZÁMÚ SZEKVENCIA)
S’-CATCTAAGCTTCTAGACTCGACGGCCACCATG AAACACCTGTGGTTCTTCC-3’ (122. SZÁMÉ
IA1 ) S'-TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATG j AAACATCTGTÚGTTCTTCC--3’ (123. SZÁMÉ SZEKVENCIA)
1.4.1 | 5'-TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCC ACC ATG | GACTGGACCTGGAGGATCC-S’ p24.. SZÁMÉ I SZEKVENCIA):
S’-TATCTM GAGTTTGGGCTGAGCTG SZEKVENCIA)
ICGAC AGG 128. SZ \iG
0,0. :
| S-TATCWAGCTTGTAGÁCTGW
GAGTTTGGG SZEKVENCIÁI
TTTn/vv*Fifta (129 SZA?
ICACCA^
GAGTTTCGGCTGAGCTG-S’030. SZÁMÉ ^ZEKVENC
Λ X
| 23,28.1 5-TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATG AAACATCTGTGGTTCTTCC-3’ (131. SZÁMÚ SZEKVENCIA)
23.23 i 5 -TATCTAAGCTTCTAGACTCGACCG CCACCATG GAGTTTGGGCTGAGCTG- 3’ (132. SZÁMÚ SZEKVENCIA)
24.2,1 5 ’-TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCG CCACCATG AAAGATCTGTGGTTCTTCG~3S (133. SZÁMÚ SZEKVENCIA)
Ugyanezt a módszert használjuk olyan primer tervezésére, amely tartalmazza a 3'kódoló szekvenciákat, az IgO2 konstans régid stopkod onját (5* -TTCTCTGATCAGAATTCCTATCATTTACCCÍlGAGAGAGGGAGAG-3') (125. számú szekvencia), és restrikciós hasítási helyeket.
Ugyanezt a módszert használjuk a kappa lánc ATG starfckodonja korul egy primer tervezéséhez (5'-CTTCAAGCTTACCCGGGCCACCATGAGGCTCCCTGCTCAGC-31 (126. számú szekvencia), Az ATG starthelyhez viszonyítva 5' irányban egy optimális Kozák szekvenciát viszünk be. Ezt a prímért használjuk, hogy az alábbi ellenanyag klórrnk; 3,1,1» 7,1.2» 10.8.3» 15.1. L, 21.4.1,
21.2.1, 22.1.1» 23,5.1» 2305.1 és 25.29.1 könnyű láncait polime-ráz láncreakcióval klónozzuk, Használunk egy második előrevivő prímért. (5'-TGTTGAAGCTTGCCCCGGCGCGGGAGCATGGAAACCCCAGCGCAG-3' (134. számú szekvencia) is, a 23.28.1 és a
24,2.1 klónak könnyű láncainak klónozására. Emellett ugyanezt a módszert használjuk. hogy a kappa konstans régió körül egy prímért tervezzünk «5'-TTCTTTGATCAGAATTCTCACTAACACTCTC CCCTGTTGAAGC-3') (127. számú szekvencia)). A primer-párokat
Π 9 * Φ
-»·>
> Φ Λ φ • Φ -* Φ *· Α * * Φ Φ Φ * ♦ « <
*♦** Φ·#. >:-> »*·<.
a cDNS~ek: ampüfíkálására használjuk, az Advaniage High Fidelity PCR Kit. (Cfonetech) használatával, A po&neráz láncreakció termekének szekvenciáját közvetlen szekvenálássál kapjuk meg, standard technikák (azaz például primer-séta) alkalmazásával, téslék-terminátor szekvenálö kitteket és egy ABi szekvenálö berendezést használva. A polimeráz láncreakció termékét egy emlős expressziős vektorba klónozzuk. és a klánokat: szék vonaljuk. hogy igazoljuk a szomatikus nrurackkaa Mindegyik kiónnál mindkét szálon legalább hárem reakcióban igazoljuk a szekvenciát.
Génhasznosltásl elemzés
A 2. táblázatban a génhasznositást mutatjuk be, amit a találmány szerinti ellenanyagok kiválasztott híbrídőma klánjaival igazolunk:
o .2... Táblázat
: Klón Nehéz lánc Kapna könnyű 1 Inc
VH D VK JK :
3,1.1 (3-30+1 DP-49 | B4+ | D1R3 JH6 A3:/AÍ9 (DPK-IS) OKI
7.1 2 (3-30+) DP-49 DIRS* ®< ; .JH6 | A3/A19 (DPK-15) JK1 i
10.8.3 (4.35) VIV-4 DIR3 : dBS : L5 PP5) JK4
j 15.1.1 (4-59) DP-71 04-23 JH4 A3/A19 iDPK-15) KÁ íR-k.·
; 21.4.1 P-02) DP-7S DLR1 JH4 lm (DP5) JK4
* * * * » !» χ X>
* Α X- ♦ Φ * # ♦ . ♦:
* Χ· -» χ Ο »»♦* ** «* * X φ * X φ *** Χφ
:21.2.1 (3-300 DP-49 DIR3+ 06-19 ; JH4 ) A3/A19 (DPK-15] 3K3 1
722.1.1 P~3CM:l : DP-49 Dl-1 JHó A3/A19 (DPK-151 I JKl
23.5.1 (3--3Ö8 ; DP-49 04-12 JHÖ A3/A19 (DPK-15) JKl
23.28.1 (4-591 BP-7I : DIR1+ | 04-17 JH5 A27 (DPK-22) JO
23.29.1 (3-30.3) DP-46 : D4-17 JHÖ A3/A19 (DPK-15)
24.2.1 (4-59) DP--71 DIRH D4-T7 385 A27 (DPK-22) JK3
Szekvencia- .és mutáció elemzés
Amint az nyilvánvaló, a génbasznosítási elemzés az ellenanyag szerkezetének csak korlátozott áttekintését biztosítja. Amint a Xe»ifamw áSatokban a B-sejtek sztochasztikusan generálja, a Y4XJ nehéz lánc vagy a V-J kappa könnyű lánc transzkriptumokat, számos szekunder folyamat is beindul, beleértve, anélkül, bőgj? ezekre korlátoznánk magunkat, a szomatikus hipermutáciökat, a delécfokat, az N-addidökat és a CDR3 extenzíókafc [lásd például; Mendez és mtsai: Natúré Genetíes 15, 146-156 (1.997); és a WO 98/24893 számú nemzetközi szabadalmi leírást]. Ennek, megfelelően, ahhoz bog;/ az ellenanyag struktúráját tovább vizsgáljuk, a klánokból kapott eDN'S-ekbői generáljuk az ellenanyagok megjósolt aminosav szekvenciáját. Az A táblázatban megadjuk a. szekvenált ellenanyagok nukleotid- és megjósolt aminosav szekvenciáinak sxekveneia-axnoeskorL
Π;
A 3-7, táblázatban a 3,1.1 (3. táblázat), a 7.1,2 (4. táblásat), a Ϊ0.8.3 (5. táblázat), a 15.11 (6. táblázat! és a. 21,92 (7. táblázat) ellenanyagok nehéz láncának és kappa könnyű láncának nukleotid- és megjósolt aminosav szekvenciáját mutatjuk be.
A S-13. táblázatban a 21.2.1 (8. táblázat), a 2222 (9, táblázat), a 23.52 (löt táblázat), a 23.282 (12. táblázat), a 23.29.1 (12. táblázati és a 24.21 (13. táblázat) ellenanyagok nehéz lánca variábilis doménjének és kappa könnyű láncának nukleotíd- és megjósolt aminosav szekvenciáját mutatjuk be.
A 23.28.2 moookfonáiis ellenanyag teljes hosszúságú: székvenélásával kapott DNS szekvencia a kiindulási polímeráz láncreakció termék DNS szekvenciáitól egy bázispárban tér el (C-röl Gre), ami a természetes nehéz, lánc 16-os csoportjának D-ről B-re való változását eredményezi,
A 14-19. táblázat a 21,22 (14. táblázati a 22.1,1 (13, táblazár), a 23.51 (16. táblázat), a 23.28.1 (17, táblázat), a 23.292 (18. táblázat) és a 24.22 (19. táblázat) monoöonáks ellenanyagok nehéz lánca és kappa könnyű lánca nukleotíd- és megjósolt aminosav szekvenciáit mutatja. A táblázatokban a szignálpepüd szekvenciát (vagy az: ezeket kódoló bázisokat) aláhúztuk.
hét mutált ellenanyagot generáltunk, a 222 2 és 23.28.1 ellenanyagöt. A. 22.1.2 ellenanyag, nehéz láncát úgy mutáltatok el, hogy a 109-es pozícióban levő cisztem alaninta változzon. A mutált klón jelölése :2223H-C019A, A 23.282 ellenanyag: könnyű láncának a 92-es pozíciójában is mutáció van, amely a eíszlein csoportot alanin csoporttá változtatja. A mutált klón jelölése 23.282L-C92A.
A specifikus csoportok mutagenezisét egy hajtjuk végre, hogy pnmereket tervezünk, majd a Strsiagene QfockChange Síle ♦ A
Directed Mutagenesis Kittet használjuk,, a. gyártó utasításai szerint. A mutációkat automatizált szekvenáiővai igazoljuk, és a mutagenízáit Inszerteket expresszfos vektorokba szubklónezzuk.
A 20, táblázatban a 22,1,1B-C1Ö9A ellenanyag mutált nehéz láncának nukleotíd- és aminosav szekvenciáját mutatjuk be, A 21. táblázatban a 23.28,1 ellenanyag mutált könnyű láncának mikleotld- és aminosav szekvenciáját mutatjuk be. A mutált DNS kodonokat dóit betűkkel mutatjuk. A mutált aminosav csoportokat vastagítva mutáljuk.
3. Táblázat
A 3,'l.I-es számú ebe;
DNS és febérie szekvenciák
LEÍR?
s^eKven.cia
SZEKVENCIA (szignál szekvencia, aláhúzva)
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGC
TCTTTrAAGAGGTGTCCAGTGTCAGGTGCAGCTO GTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCrGGÖ AGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAT TCACCTTCAGTAGTTATGGCATGCACTGGGTCCG CCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGC AGTTATATCAAAGGATCMSAGGTAATAAATA.CCA1 GCAGACTCGGTGAAGGGCCGA
ATCTCCA
GAATAGCCTGAGAGTTGAAGACACGGCTGTGTAT
TACTGTGTGAGAAGAGGGCATCAGCTGGTTCTGG mi η? APTá r δ λ cos
CCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCC ACCAAGGGCCCATCGGTCfTCCGGCTGGCGCCCT G GGerGGCTGGTCAAGGACTAGTTCGCCGAACOG ♦ fc fc-i * ♦ .*·*
| Nehéz , lánc I fehérie
GTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCA
GCGGGGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTC
GTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACA
CCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAA
GG’rGGACAAGACAGTrGAGCGCAAATGTrGTGTC
GAGTGCCGACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAG
GACCGTCAGTCTTCeTCrFCCCCCCAAAACCCAA
GGACACCCTCATGATCTCCCGGAGGGCTGAGGTC
ACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGAC
GGCG AG -GTCCAGTTCAACTGGTACGTG GAGGGCG
TGGAGGTGGAEAATGGGAAGACAAAGGCACGGG
AGGAGCAGTTCAACAGCACGTTGCGTGTGGTCAG
CGl'eCTCACCGTTGTGCACGAGGACTGGCTGAAC
GG€€TGGCAGCCCCCA7CGAGAAAiACCATCTCCA AAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACGACAGGTGT ACACC
GAAGGAC ^GFGAGGTGCt
TAG
GGAATG GGGAGGGGG AG AACAACT AG
CACCTCCCATGCTCGACTCCGACGGCTCCTTC1TC.
CTCTACAGGAAGGTCAGGGTGGAGAAGAGGAGGT < í~<· λ r*;.i
ΓΤΓ & w^f^cüGTG&T
I GCATGAGGGTGTGCACAA.CCACTAGACGCAGAAG AGCCTCTCCCTGTCTCCGGG7AAATGA
MgFGLSWFIAAlIRGVQCQVQLVESGGGWQPG
RSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVA
YISKDöGNOIíADSVKGRFTISRDNSRNAOhQM
U4 * * φ « «Τ' · Λ # 'Φ Φ
Φ-Φ 6-φ « szekvencia
Könnyű lánc DNS szekvencia | SLRVEDTAVTYCVRRGBQLVLGYTYYNGLDVWG | QGTWWSSÁSTKGFSVFPLÁ.PCSRSTSESTAALGCL | VKDYFPBPVWSWNSGAlYrSGTOTRPA¥EQSSGE¥
I SLSSVVWPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKV DKTV
ERECCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCYWVDVSHEDPEVQFNWYVDCATX'HNAKTK. PREEQFNSTFRWSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVS N.KGLPAPIEKTÍSKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NGVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTW
P?
YGKLTVDK'
3WFSCSVMHE
ALHRHYTQKSLSLSPGK
ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAA
TGCTCTGGGTCTCTGGATCCAGTGGGGATATrGTO CTGACTCAGTCTCCACTCTCCCTÖCCCGTCAGGG CTGGAGAGCCGGCCTGCATCTCCTGCAGGTCTAG TCAGAGCCTCTTGTATAGTAATGGATACAACmT TGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCG ACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCCT CCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATC AGGCACAGATFTTAGACTGAAAATCAGCAGATTG | C AGG CTG AGG ATGTTGGGGTTTATTACTGC ATGG AAGCTCTACAAACTCCTCGGACGTTCGGCCAAGG GAGCAAGGTGGAAATCAAAGGAACTGTGGGTGC ACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGC | AGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTÖTGCGT GCTGAATAACTTGrATCCCAGAGAGGCCAAAGTA CAGTGGAAGGTGGATAA.CGCCCTCCAATCGGGTA ACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGC-A. AGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGAC
GCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGT CTACGCCTGCGAAOTCACCCAtCAGGGCCrGAOC TGGCCGGTCACAAAGAGCTTGAACAGGGGAGi
PAG
Könnyű lánc fehérje szekvencia
Nehéz lánc DNS szekvencia érett variábilis
Nehéz lánc szekvencia érett variábilis
MRLPAQLLG LLMLWYSGSSGDiVLTGSPtSLPYTPG· SiÖGRGY | YLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDVG
I YYYCMQALQTPRWGQGTKWIKRTVAAPSVFIFPP | SDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL | QSGNSQESYTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK | VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC i CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTG 1 GTGCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTG t
! CAGGCTCYGGATTCAGCTPGAGTAGTTATGGCAY
GCACTGGGTGGGCGAGGGTCCAGGC.AAGGGGCTG
GAGTGGGTGGCAGTTATATCAANGGATGGAGGT
AATAAATACCAEGCAGACTCCGTGAAGGGCCGAT
TCAGCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAATGCGCir
GTATCTGCAAATGAATAGCCTGAGAGTTGAAGAC i ACGGCTGTGTATrAGYGTGTCAGAAGAGGGCATC 1 | AGCTGGTTCTGGGATACTACTACTACAACGGTCT I GGACGTCTGGGGCCAAGGGACCAOGGTCACCG'TC ! TCCTCA
QVQLVSSGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMI
WVRQAPGKGLEWAVISKDGGNKYKWSWGRFI
PSRDNSENALYLQMNSLRYEDTAYYYCYRRGOQL
VLGTOYNGLDVWGOGTTVTVSS ♦ χ.
* * ψ * « ♦♦ * χ • · * * Κ >» >f.
# · * » * X $ <
*♦** ** φ.φ. #Λ dóin énje
Kőnnvü ) GATATTGTGCTGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCC
CGTCACCCCTGGAGAGO szekvencia i AGGTCTAGTCAGAGCCTCTTGTATAGTAATGGAT érett | ACAACTTTTrGGAYTGGTACCYGCAGAAGOCAGG variábilis | GCAGTCYCCAGAGCTCCYGAYGTATTTGGGTTGTA ATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGG CAG7GGATCAGGCACAGATTTTACAC7GAAAATC AGCAGATTGGAöGCTGÁGGATGTTGGGGTTTATT; ACTGCATGCAAGCTCTACAAACTCCTCGGACGTT CGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAÁA aomenie
Könnyű lánc fehérje szekvencia érett variábilis doménie
DIVLTGSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLYSNGYNFL
DWYLQKPGQSPQLLÍYEGSNRASGWDRFSGSGSGT
DFTLSSRLEAEDVGVYYCMQALOtFRTFGQGTKV
Nehéz lánc DNS (variábilis.
dómén) (3.1.10A7ST)
89. számú szekvencia
CAGGTGCAGGTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTG •'Τ'o
TG
CAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTATGGCAT GCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTG GAGTGGGTGGGAGTTÁTATCAÁAGGATGGÁGGT AATAAATACCATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGAT í TCAGCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAATaCGCT
Gi
ACGGCTGTGTATTACTGTGTGAGAAGAGGGCATC AGCTG GTTCTGGGATACTACTACTAC A AGG GTCT
GGACGTCTGGGÖCCAAGGGACCA.CGGTCACCGTC
Φ ♦:·
X·*·
V
-X Φ φ: -* $·
χ.φ-Φ <ί X φ **»» ·«
5ί· Φ Χ·φ • ΦΦ $ Φ ί *:
·» * φ.
:φ Φ Φ.
ΦΦφ »«
TCCTCA ........... ......................................... ..............
{ Nehéz QVQLWSGGGVVQPGRSLRLCAASGFTFSSYGMH
t lánc WWQARGXGbRWVAViSRDGGNKYSADSVKGRFT
fehérje iSRDNSKN7LYLQMNSLRVEDTAVY\”CVRRGHQLV
{variábilis LGYYYYmWTOGQGTnWSS
) dómén)
(3..1.ΧΗΑ78Τ)
90. számú | szervem I cia )Neoez : lánc DNS i (variábilis
CAÖGTGCAÖCTGGTGGAGTCTGGGGGACMJCGTG ,íc.C.
GfWGGAGG
CAGCCTCTGGAOCACCTWAGTAGTTATGGCAT
1: Oomenl :í<5· $ 1 14
X\..<« 1 v .1 Π
AGGCT^
A78Tvy /Aj
91. számú
GAGGGGGTGGCAGTT.ATATCAAAGGATGGAGGT AATAAATACCATGCAÖACTCCGTGAAGGGCCGAT TCAOCATCTOCAGAGé ’ Λ A .‘.'T.C ;
AT&cajv
TAGCCTG AG AGcTG AAGAC
ACGGCTGTGTATTACTGTGcGAGAAGAGGGCATC
AGCTGGTTCTGGGATACTACTACTACAACGGTCT cia
Nehéz i lánc sener! je ív&riábij iis dómén) | f-3 $ t?4 '· 41- * i :i
OSTGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTC
TCCTCA
QVQLVESGGGWQPGRSLRLCAASGETFSSYGMH
WVRQAPGKGLEWAVISKDGGNKYHADSVKGRFT
ISWNSKNTLYbQ«NSOG<EDTAWyC2lRRGSQO . AVGOGTWWSS
128
88/
Ve V 9 ζ Α)
92. számú szekvencia
Könnvu ,anc DNS (\ an&ows donién!
(3.1, ILL4MDS3V)
93. számú szekvencia **·' φφ Φ.ΦΦβ ί
Φ « JJ Φ φ φφ φ
X * -X Λ * χ.· « * Φ Φ « X « ·**·* »· *·*· Φ.Φ «
ÖATATTGTGáTGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCC
GGTCACGGGTGGAGAGCGGGCCTCCATCTCCTGC
AGGTCTAGWCAGAÖCGTCTrGTATAGTAATGGAT
ACOCTTTTTOGATTGaTACCTGCAGAAGCCAGG
GCAGTCTCGACAÖCTCCTGATCTA'TTTGGGTTCTA
ATGGGGCCTGCGGGGTGGeTGACAGGTTGAGTGGIG85 Δ GATTTTACACTGAAAAT C
A GC AG.AGTG GAGGCTG AGG ATGTTG GG GTTT ATT
ACTGCATGCAAGCTCTACAaAACTCCTCGGAGGTT
CGGCCAA€M3GACCAAGGTGGAAATCAAA
Könnyű | DIVMTQSPLSLPVTPGEPASÍSCRSSQSLLYSNGYNF lánc fehér- | LDWYLQKPGQSPQLUYLGSNRASGVPDRFSGSGSG je (variáhi- [ TDFTLKISRfEAEDVGVYYCMQALQTPRTFGQGTK isién) | VEIK
L4ML83V|
94. szám ú szekvencia
A.
2-es számú vas es ázvenciaia χ
129
sNCÍA (szignál szekvencia aláhúzva) \enez .lánc DNS szekvencia
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGC | TCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGTCAGGTGCAGCTG | GTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGG | AGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAT I TCACCTTCAGTAGCTATGGCATGCÁCTGGGTCCG CCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGC AGTTATATCAAATGATGGAGATAATAAATACCAT GCAGACTCCGTGTGGGGCCGATTCACCATCTCCA GAGACAATTCCAGGAGCACGCTFrATCTGGAAAT GAACAGCCTGAGAGCTGAÖGACACX5GCTGTATAT 7ACTGTGCGAGAAGAGGCATGGGGTCTAGTGGG AGCCGTGGGGATTAGTACTACTACTACGGrrTG vAAGGGACG&r'A«
CTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCC
CA’ <CG 'D /VJ''/
XT
CCCCG AAGCGGTG AGG GTGTCGTGG AACTCAG GC
GCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTG
TCCTAGAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAX CGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACC CAGACCTACÁCCTGCAACGTAGATCACAAGCCCA GCAACA.CCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCA AATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACC. ACGTGTGöCAGGACGGTCAGTCTTCCTCTTCCCCC CAAÁACCCAAGGACACCCTCATGATCTCGCGGAC CCCTGAGGTCACG1GCGTGGTGGTGGACGTGAGC CCQAGvj i vwtu ί ívmv r cser í TGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGGCAAGACA
GAAGACCCCÖAGGTCCAG' ** ** ΧΎΐψ Μ „φ * » ·* * * » * * -£ * * χ χ <
* * ♦ * χ » « ♦ ίν»« ·*·* κ* $4*
AGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCC
GTGTGGTCAGCGIGCTCACCGTIGWCACCAGGA
CTGCMTFGAACGGCAAGGAGTACAAGT'GCAAGGT
CTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAA
AGCATCTCCAAAAGCAAAGGGCAGCCCCGAGAA
CCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGG
AGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCT
ACCCCAGOGACAT jfuvvIG
GAGTGGGAGAGGAATGGGCAGCCGGAGAACAAC
TACAAGACCACACCTCGCATGCTGGACTCCGACG
CxC?
'GTGGAC
A&GAGCÁGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTG GCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCAGAAGCACTA. CACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTGCGGGTAAA
Nehéz fehérje zenMSFGLSWVFLVALLRGVOCQVOtVESGGGVVQPG
RSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWYA
VISNDGDNKYHADSVWGRFTISRDNSRSTLYLQMN
SLRAEDTAWYCARRGMGSSGSRGDYYYYYGLDV cia
GCLVKDWPEPVWSWNSGALTSGXWFPAVLQSS
GLV<?
°'N7KYD
BWBRRGCYEGPPCPAFPYAGPBYFLFPPEPEDTLM
ISR?PE\T€\AAOVSHEDPEYQFNWYYDGYEVHNA
KTKPREEQENSTFRVYSVLTVVHQDWLNGKEYKC
Pt
TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAYEWESNGQPENNYKT TPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV& E EALHNHYTQKSLSEBPGK * * * *· » -Í'SÍ $ :«
*.* 5: * *· * * *
η. u«* η.* =α ν xonnvu
Ή: r> a-.-5 il,.
vp.
;é>
szel
ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAA TGCTGTGGGTCTGTGGATCCAGTGGGí GATOACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCC C7GGAGAGCCGGCC7OCA7CTCC7GCAGGTCTAG TCAGAGCCTCTTGTATAGTAATGGATACAACTrTT TGGATTGGTACCTGCAGtóGCCAGGGCAGTCIGC ACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCCT CCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATC A^CACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTG GAGGC7GAGGATG77GGGG77TA7TACTGCATGC ~GTTCGG«
GACGAAGG7GGAAATCAAACGAAGTG7GGG7GC
ACCATCTG7CTTCA7CTTCGCGCCATCTGATGAGC
AG77GAAA7CmGAAC7GCC7GTG77G7G7öCC7
GC7GAA7AAC77C7A7CCCAGAGAGGGGAAAG7A
CAG7GGAAGGTGGA7AACGCCCTCCAATCGGGTA
ACTCCCAGGAGAGTG7CA.CAGAGCAGGACAGCA
AGGACAGCACGTACAGCCTCAGCAGCACCCTGAC
GCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAA.CACAAAGT
C7ACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGC
TCGCCOGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGT
GT7AG lánc fehérje szerven1 ΜΚοΡΑ0ί£ΰΕΕΜΕ\νν50880ΡΐνΜ708ΡΕ8Ι,ΡνΤΡ | GEPASÍSCRSSQSLLYSNGYNFLDWYLQKPGQSPQL | LIYLGSNRASGVPDRPSGSGSGTDFTLKISRVEAEDV j GVYYCMQA1Q7PRYFGQGTKVEIKRTVAAPSVPÍFP l PSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
132 iáoc szekvencia érett •variábilis
Nehéz c fehérje szekvencia érett variábilis doméníe ínyu lánc DNS saekven\.·:ΚΛ. SG.i.
variábilis döraéuie
I CAGGTGCAG CTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTG I GTCCAGCCTGGGAGGTCCÜTGAGA.CTCTCCTGTG I CAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCAT | GCACTGGGTCCGGGAGGCTCCAGGGAAGGGGCTG | GAGTGGGTGGCAGTrATATCAAATGATGGAGATA | ATAAATACCAÍGCAGACTCCGTGTGGGGCCGATr | CACCATCTCCAGAGACAATTCCAGGAGCACGCTT I TATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACA I CGGCTGTATATTA.CTGTGCGAGAAGAGGCATGGG | GTCTAGTGGGAGCCGTGGGGATTACTACTACTAC I TAeGGTrrGGACGTCTGGGGCCAAGGGAGCACGG ITCACCGTCTCCTCA ) QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMH | WVRQAPGKGLEWVAVISNDGDNKYHADSVWGRF
I WSRDNSRSThThQMNSLRAEDTAVYYCARRGMGS SGSRGOTyraGLDVWGQGITVTVSS
G ATATTGTG ATGACTCAGTCTCC ACTCTC CGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCGATCTCCTGC AÖGTCTAGTCAGAGCCTCTrGTATAGTAATGGAT ACAACTTTTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGG GCAGTCTCCACAGCTCCTGATGTATTTGGGTTCTA ATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGAGÁGGTTGAGTGG CAGTGGATCAGCjCACAGATTTTACACTGAAAATC AGG AGAGTG GAG GCTGAGGATGTTGGGGTTTATr ACTGCATGCMGGTGTAGÁAACTCCTGGGACGTT
SGACCAAGGTGGAAATCAAA
| Könnyű 1 DJVMTQSPLSLPVTPGEPASÍSCRSSQSLLYSNGYNE j
j lánc fe- [ LDWYLQKPGQSPQLL1YLGSNRASGVPDRFSGSGSG
Ibérié fc »>: | TDPTLSSRVEAEDVGVYYCVQALQTRFTFGQGTK 1 V^sK
fc \XWVi\ λ··Χ>·.1· λ 1 cía érett
fc ' * s- ·'··’
fc V CXU . écá.'K*·. JtAjk | dóm énje í 5. Táblázat
A ΓΟΤ 1.3-es számú ellenanyag DNS és fehérje szekvenciája
; LEÍRÁS .....:«: j SZEKVENCIA (szignál szekvencia aláhúzva)
: Nehéz ί ATGAAAC ACCTGTGGTTCTTCCTCCTG CTG GTG GC
; lánc DNS 1 AGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAGCTG
: szekven- 1 CAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGG
ria 1 AGACCGTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGC TCCATCAGTAGTTACTACTGGATGTGGATCCGGC AGCCCGGGGGGAAGGGAGTGGAATGGATTG GG C GTGTCTATACGAGTÖGGAGCAGCAACTACAACCC | CrCCCTCAAGAGTGGAGTCACCATGTGAGTAGAC ACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCT CTGTGACCGCGGCGGAGACGGCCGTGTATTACTG TGCGAGAGATGGTCTTTACAGGGGGTACGGTATG GACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCT j CCTCAGCCTCCAGCAAGGGCCCATCGGTCVIOOC CC'TGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGC | ACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGÁCTACT 1 TCGGGGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGG 1 CGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTGCCAGCT
13« *«· ♦·*
X * χ φ ♦ ♦ >»· ♦ * ¢.
GTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCA
GCGTGGTGACCGTGGCGYGGAGCAACYTCGGCAC ' A /''•'''‘•'PH ’''x
Γ» λ ,<7- a jvnfvv’
AGGAACACCA&GGTGGACAAGACAGTTGAGCGC
AAATGrrGTGTCGAGTGCCCACCGTÖCGGAGGAC
ITGlGGCAGGACCGTCAGTCTTCeTCTTCGCC
CCAAAACGCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGA
CGGCTGAGGTCAGGTGGGTGGTGGTGGACGTGAG
CCACGAAGACCCCGAGGTGCAGTTCAAGTGGTAG
GTGGACGGGGTGGAGGTGGATAATGCGAAGAGA
GGAGGÁGCAGTTCAACAGCACGTrC ηΤΠΠΤΓ AGPGTGG'W A ΡΡΠΤΤΠΤΡΡ ·.& pp AGG
ACTGGCTGAACGGCAAGGAÖTACAAGYGGAAGG
TCTCCAACAAAGGCCTCCGAGCCCCGÁTGGAGAA
AACCATCTCCAYAACCAAAGGGCAGCCCCGAGA
ACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAG
GAGATGACCAYGAACCAGGTGAGCCTGAGCTGGG
TGGTGAAAGGCTrCTAGGGCAGGGAGATCGCCGT
GGAGTGGGAGAGC.AATGGGCAGCCGGAGxAACA,A •X
-Ml V?
GGCTCCTrCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGG
ACAAGAGGAGGTGGCAGGAGGGGAAGGTGTTGT
CATGCTCCGTGATGCATGAGGGTCTGCACAACGA
CTACACGCAGAAGAGCCTCWCCTGTGTGGGGGT
MKHLWFFLLLVAA ϊ Ο Y*< G* fehérje szekven(TLSLTCTVSGGSISSWWIWIRQPAGKGLEWIGRVY Ι TSGSTNYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKLSSVTAA | DTAVYYCARDGLYRGYGMDVWGQGTTVTVSSAS •Λ*
135 •Φ -* φ. » Μ*· X
TKGPSYFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEWT
VSWNSGALTSGYHTFPAVLQSSGLYSLSSYVTYPSS
NFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECCPPC
PAPPYAGPSYFLFPPKPKDTLMISRTPEYTCYWDY^
SHEDPEYQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFR
WSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLP&PlEKSl
SKTKGQPREPQ^TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG
FYPSDIAYEWESNGQFENNYETTPMLDSDGSFFLY
SKFWDRSRWQQGNYFSCSYMHEAEBNHYTQKSL
EŐirnyü lánc DNS azekvenrs-i Q.Q. Q'3'V’’ϊ’ιΤ' -ο
TGCTCTGGTTCCCAGGTTCCAGATGCGACÁTGCA
GATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTG
TAGGAGAGAGAGTGAGCA
TCAGCCTATTAGCAGGTGGTTAGCCTGGTATCAG
GAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAACTCCTGATTT
ATTCTGCCTCCGGTFTGCAAAGWGGGTCCCATC
AAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGAGAGATTTC
ACTCTCACCATCAGGAGCCTGCAGCCTGAAGATr
TrGGAAGTrAGTATWTGAAGAGACTGACAGTTTC
CCGCTCACTTTCGGCGGCGGGACCAAGGTGGAÖ/
TCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTGAT
CTTCCCGOCATCTG ATGAGCAGTTGAAATCTGGA
ACTGCCTCTG'TTGTGTGGCTGCTGAATAACTTCTA
TCCCAGAGAGGCGAAAGTAGAGTGGAAGGTGGA
TAACGCGCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGT
GTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTAC
:a
GACTACGAGAAíACACAAAGTCTACGCCTGCGAA ·'*· -χ χ· :·»:# * χ·
♦ #·χ· *
Χ·Χ«
GTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAA
AGAGCWCAACAGGGGAGAGTGTT'AG
Könnyű.
lánc hérje szekvencia
MRKPAQLLGLLLLWFPGSRCDIOMTOSPSSVSASVG
DRVTITCRASQPISSWLAWYQQKPGKAPKIXIY’SAS
GLQSGYPSRBSGBGGGWFrLTíSSLQPEDFATrrCQ
QT.DSFPLTFGGGTKAtó.lKRTVAAPSVFlFPPSDB<>K
SG2ASWCIi«WPREAWQWKYDNÁUj8GNSQ
BSWEgOSKDSTTSLSSTLTLSKADYEKHKV^ACE
VTHQGLSSPVTKSFNRGEC lánc DNS szekvencia érett variábilis
□.ómenje
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTG
GTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTGGCTCACCTGCA
CTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTA.GTTACTACTGG
ATGTÖGATCCGGCAGCCCGCCGGGAAGGGAGTG
GAATGGATTGGGCGTGTCrATACCAGTGGGAGCA
CCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCAC
CATGTCAGTAGACACGTCCAAGAAGCAGTrCTCC :gtgtattactgtgcgagagatggtctttacag eOGTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGAC
CACGGTCACCGTCTCCTCA
Nehéz lánc fenerje szekvencia érett variábilis doménie
QY’QLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYTWÍWl rqpágkglewígrvytsgstnynpslksrytmsvd
TSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDCLYRCTOM
DWGQGTTVIYSS
Könnyű ' lánc Dl
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGT
CTGCATCTGTAGGÁCACAGAGTCACCATCACTTG ¢Λ *· ·« • * •· * « •χ-χ
V. ·φ * & .« $' » .« :♦'·: «·φ-
6.
Α 15.
~es számú ellenanvas DNS és szekvenciája
** φφ * « ·* ♦
Φ Φ X ♦ φ φ χ-χ *-Φ Φ Φ * ΦΦ χ· , χ φ φ (C * φ: Φ· ·φ
CTGTGACCGCTGCGGACACGGCCGTTTATTACTG 4Are.AAAGGGTOAGTAGGGTGGTAAfTrTAAG
ACGAGTGGGGCCAGGGAACCCTGGTGA GGGTCTCCTCAGCGTGCACGAAGGGCCCATCGGT £’£’'7ν',/·'*'
Π. Λ ί'ΣΑ 4Γ2·ιΓ< Α Λ
GAGTACTTCCGCGAACCGGTGACGGTGTGGTX5GA ACTGAGGCGCTCTGACGAGCGCMÍGTGCACACCTr GGGAGGTGTCCTAGAGWCTCAGGAGTGTAGTCCC :agcgtggtgaccgtgccctcgaggaactf rGCAACGTAGAfCAC TGGAGAAGACAGTT G AGG GC A A ATGTTGTGTC G AG TG CCCACGGTGGC ,r> Λ A re A S; Λ f :0^;rere>·
..—.ÍVNí' Λ i—· <' / re••re'r
TCGCGGACGGCTGAGGTGACGTGCG7GGTGGTGG AGGTGAGTCAGGAAGAGCGGGAGGTGCAGTTCAA CTGGTACGTGGAGG GCGTGGAGGTGGATAATGGC AAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGC ACGTTGCGTGTGGTCAGGGTCeTCACCGTrGTGC ACCAGGACIWGTGAACGGCAAGGAGTACAAGT GCAAGGTGTCCAACAAAGGGCTCCCAGCCCCGI
GCAGí
CCGAGAACGAGAGGTGTAGACCCTGCCCCCATCC re re &.re.á τπλργ
GTCAAA^í'ir'TiT^'r
TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGÖGCAGCCGG re δ & re a. δ rerex re a a re ar;' δ re δ rerevrerere δ τθrev
AAGCTGA
XX
-*·* ««ΚΨ * * X #· * * « ·♦ ·Χ Φ »» 9*
CCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAAGG tcitctgatgctgcgtgatgcatgaggctctgcac
AACCACTACAC<M:AGAAGAGCCTCTC€€TGTC,rC
CGGGTAAATGA íW lenőne szekve:
MKHLWFFLLLVAAPRWVLSGYQLOESGPGLVKPSE
TESOCTYSGGS1RGYYWTW1RQPRGKGLEWIGYIY
YSGSTNYNPSLKSRVTÍSYDMSKNQFSLKIGSY?TAA
DTAYYYCAREGDYGGNFNYFSQWGQ^GTLYTYSS
ASTRGPSYFPIAPCSRSTSESTAALGCEYEDYFPEPY^
TYGWRSGACrSGYHTFPAYEQSSGITSLSGYYWPS
ENFGTQTWGNYDRRPSNTKYDrrYERKKCCYECPP
CPAPPYAGPSYFEFPPRPEDTLMISRTFEYTCYVYO
YSSEDPFYQFWYYDGYEYHRAOKFREEQFNSTF
RYYSYLTWSQDWIBGREYKCKYSRKGLPAPIEK
TISKTKGQPREPQVYTUTORBEMTRNQVSLTCLYTC
GFYFSDIAVEWESNGQ PEN N YKTTPPMLDSDG SFFL
YSKLTVDKSRWQQGWFSCSVMHEALHNBYTQKS
LSLSPGK
Könnyű lánc szervenATGAGGCTCCCTGCTCAGCTGCTGGGGCTGCTAA
TGCTCTGGGTCTCTGGATCCAGTGGGGATATTGT
GATGAGTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCAGCC
CTGG AG AGCCG GGCTGG.ATCTCCTGCAG GTCTAG
TCAGAGCCTCCTAGATACTAATGGATACAACTAT
TTCGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTC
CACAACTCCTGATCTATtTGGGTTCTAATCGGG<X
TCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGGAGTGGAT
CAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGT oLrALrCs·V i kxzvLiLxA i u 1 i LxLsvu 1 1 1A1 1AC1 bv/l I Lt
CAAGCTCTACAAACTCCGTACAGTTTTGGCCAGG
14Ű ♦ * » « ·· ♦ &
·* φ
A·» * A*.
»» * :« >· * Jfr
Φ * -v ·♦*·* ♦♦
GGACCAAGCTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTG
CACCATCTCTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAG
CAGITGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCT
GCTGAATAACTTCTATCCCAGAGACGCCAAAGTA
CAGTGGAAGGTGGAAAAOGCCCTGCAATGGGGTA
ACTGCCAGGAÖAGTGTCACAGAGCAGGACAGCA
AGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGAC
GCTGAGCAAAGCAGACTAGGAGAAAGAGAAAGT
GTAGGGCTGCGAAGTGAGGGATCAGGGCGTGAGG ^^TCÁCAAAÖAG .m.· vonnvu kJ lánc fehérje szekvencia
MRLPAQLLGLLMLWYSGSSGDIVMTQSPLSLPVTP
GEPASISCRSSQSLLHTNGYNYFDWYLQKPGQSPQL
VS
ϊ. íáGSRv
GVYYCMQALQTPYSFGQGTKLEIKRWAA.PSVF'IFP PSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREARYQWKYDNA WSGN8QESWBGDSKBSTYI
KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
U <scw t-ϊ q
Nehéz | lánc DNS sz«, k\ en~ da érett variábilis duméofe
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTG
GTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCA
CTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGAAÖTTÁCTACTG
GACCTGGATCCGGCAGCCCOCAGGGAAGGGACT
GGAGTGGATTGGATATATCTATTAGAGTGGGAGG
ACCAACTACfeATCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCA
CCATATGAGTAGAGATGTGGAAGAACCAGTTGTC
CCTGAAGCTGAGTTCTGTGACCGCTGCGGACACG
GCCGTTTATTACTGTGCGAGAAAGGGTGACTACG
K·*· >♦«.)<
* X· * * * y.
'* . '* *. X JA *♦*< *«( V **
XΦ**
I Nehéz lánc íe) hérje i szekvencia érett:
? variábilis i doménie
QVQLQESGPGLVKPSET.LSLTCTVGGSiRS’SWWTW
IRQPPGRGGBWIGYIYYSGSTRYNPSCKSRVTISVD
MSRNQRSCBkSSVTAADTAWYCARRGDYGGNFR
YFHQWGQGTLVTVSS ? lánc DNS ? szekven( éra. érett:
:) variábilis I doménfe
GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCC
CGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGC
AGGTCTAGTCAGAGCCTCCTACATACTAATGGAT
GCAGTCTCCACAACTCCTGATCTATTTGGGTTCTA
ATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGG
Ca?
PAGACTGé
AG C AG AG TGGAGG CTG AGG ATGTTGG GGTTTATT ACTGCATGCAAGCTCTACAAACTCCGTACAGTTT
TGGCC AGGGGACCAAGCTGGAG ATC A AA
Könnyű lánc fehérje szekvencia érett, variábtfe doniénje
DíVMTQSPtSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHTNGYNY
FDW'YLQOGQePQLLIYXGSNRASGVPD^FSÖSGSG
TDFrhSSRVEABDVGV¥¥C»QADQTPYSFGQ:GTK
A 21.4.1-es szánü ellenanyag DNS és feherie szekvenciája
SZEKVENCIA (szignál szekvencia aláfeűzvi
Ii?
j ATGGACTGGA lánc DNS | CAGCAGCCACAGGAGCCCACTCCCAGGTGCAGCT szekven- | GGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGÁAGCCTGG da. | GGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTrCTGGA
TACACCTTCACOGGCrACTATATGC ACTG GGTGC
ACAGTGGTGGCACAA?
| TGCAGAGAAGTTTCAGGGCAGGGTCACGATGáOC i AGGGA.CACGTCCATCAGCACAGCCTACATGGAGC
TGACGACACGGCCGTGTA CTGTGCGAGAGATCAGCCCCTAGGATATTCT | ACTAATGGTGTATGGTCCTACTTTGACTACTGGGG ICCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTC CACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCC TGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCG G CCC TGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCG-AACC GGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACC agcggcgtgcacaccttcccagctgtcctacagt
CGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTAC ACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACGA AGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATCTTGTGT CGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCA GGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCÁ AGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGT CACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGA | cccogaggtccagttcaactggtacgtggacggc I GTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGG I GAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTGA.
i ··'<;?
GCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAA
CGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACM.
| AGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCC 1 AAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTG ; 1 AWfcVVV & ovvvvwli. ‘
I AGAACGAGGTGAGGCTGACCTGGCTGGTCAAAGG I CTTCTACCCCAGCGACA.TCGCCGTGGAGTGGGAG
Gk Λ iCACCTCCCí cr
Nehéz lánc fehérje szekvencia
CCTCTACAGCAAGCTCAGCGTGGACAAG.AGCAGG
TGGCAGCAGGGGAACGTGTTCTGATGCTCCGTGA
TGGATGAGGCTCTGCACAACCACrACACGCAGAA
GAGCOCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA mWT^/RiLFLVAAATGAHSQVQLVÖSGAEVKKPG
ASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWM
GWIhTDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMEt
NRiRSDDTAWYCARDQPhGYCTBGYCSYFOWG
QGTLVTVSSASTKGPSYFPLAPCSRSTSESTAALGGL
VKDYFPSPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY
SLSSWTVTSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV
ERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRT
PEVTCWVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTK
PPEEgFNSTFEWSYCrYWODWlNGEEYECICYS
NKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQWTLPPSREEMTK
NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPBNNYKTTP
MWSDGSFFhYSKIAVDKSRWOGGNYFSCSVMHE ! ALHNHYTQKKSLSLSPGK
Könnyű ATGAGGCTCCCTGCTCAGCYCCTGG GGCTCCTGC 1 *
lánc DNS TGCTCTGGTTCCCAGGTTCGAGATGCGACATCCA 1
u- _1
szekvenGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTG
TAGGAGACAGAGTGACCATCACTrGTCGGGCGAG
TCAG GGTATTTACAGCTGGTTAG CCTGG TATCAG
CAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAACCTCCTGATCT
ATACTGCATCCACTTTACAAAGTGGGGTCCCATC
AAGGTrCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTIG:
ACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAACCWAAGArr
TTGGAACTIAGTATTGTCAAGAGGGTAAGATTTTG
CCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGA TC * n /1 & .a cwypfsn/nrb 'GATGTGTGTTCAT
3. &
:ATGAGCAGTTGAAATCTGGA rGCCTCTGTrGTGTGCGTGCTGAATAACTTCTA
TCGGAGAGAGGCCAAAGTAGAGTGGAAGGTGGA '-*4CG •W’’ ΐ
GTGAGAGAGCAGGACAGCAAÖGACAGCACCTAC
AGGCTCAGCAGCAGGCTGAGGGTGAGGAAAGGA
Lf
GTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCGGTCACA AG AG CTTCAACAGGGG AG AGTGTTAG
Λοηηνυ lánc : '7 : ac i ; v.
szekvencia.
MRLFAQLLGLLLLWFPGSRCPiOMTOSPSSVSASVG DRVTITCRA sqg iyswlawyqqkpg eapnlliyta STLQSGVPSRFSG SG SGTDFTLTISSLQPEDF A7YYC
KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA.LQSGNS
Iqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyac
I;
| EWHQGLSSPVTKSFNRGEC
Nehéz lánc DNS szekvens r» & nnTftr a πρτππτπγ a riTP'TnnntnP'W: a γ,πτπ a | AGAAGCCTWGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAA I GGCTTCTGGATACACCTTCACGGGCTACTATATG ci a érett variábilis doménje
CACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTG
AG1TGGATGGGATGGATCAACCCTGACAGTGGTGG
GACAAACTATGCACAGAAGTTTCAGGGCAGGGTC
ACCATGACCAGGGACACGTCCATCAGCACAGCCT
CGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATCAGCCCCT
AGGATATTGTACTAATGGTGTATGCTCCTAGTTTG
ACTACTGGGGCGAGGGAACGCIGGTCAGCGTCT'C
CTCA fehérje szekvencia érett variábilis doménle
Könnvü lánc DNS
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYY'M HWRQAPGQGLEWWGWINPDSGGYNYAQRFGGR VTMTRDTSISTAYMELNRLRSDDTAWYCARDQ PL GYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSS
GACATCCAGÁTGACCGAGTCTCGATCTTCCGTGT
CTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTG szekvencia érett λ ariábilis doménje
GGGCGAGTCAGGGTATTTACAGCTG
FATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAC ''TPS-T.·-'Könnvü | tánc ; fehérjí
G GTCGCÁTCAAGGTTC AGCG GCAGTGGATCTGGG ACAGATTTGACICTCACCATCAGCAGCCTGCAAC CTGAAGATTTrGCAACTTAGTATTGTCAACAGGC: |TAACATTTT'CGGGCTCA€TTTCGGCGGAGGGACC AAG GTGGAGATCAAA
DIQMTQSPSSVSASYíGDR\zTÍTCRASQGrYSWLAWY*
GQKPGKAPNLLIYTASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFT
LTISSLQPEDFATYYCQGANIFPLTFGGGTKVEIIÍ
146
A 2
2. í-esi számú ellenanyag érett variábilis d ómenjeinek .DNS es
Neh lánc DNS
Nehéz lánc fehére könnyű lánc ηΆ S
SZEKVENCIA:
GTGC AGCTCGTGGAGTCTGG GG GAGGCGTG GTCCAGCCTGG G AGGTCCCTG AGACTCTCCTGTG CAGGCTCTGGATTGACCTTCAGTAGCTATGTCATG CAGTGGGTCCGCCAGGGTCCAGGCAAGGGGCTGG AGTGGGTGGCAGTTATGTCATATGATGGAAGTAG TAAATACTATGCAAACTCCGTGAAGGGCCGATTC ACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACÖCTGT ATCTGCAAATAAACAGCCTGAGAGCTGAGGA uw l: ui Ο; r
AGCAGTGCCTGGTCCTGACTACTGGGGCCAGGGÁ
ATCCTGGTCACCGTGTCCTCAG vUiUVV/ rnrGOGGGTÁA
OVQLVESGGGVA'QPGRSLRLSCAASGFTFSSYVMD WRQAPGKGtEWAOTSWGSSOYANSWGRF T1SRDNSKNTLYLQ1NSLRAEDTAVYYCARDGGK/ WGPBYWGQGILVWSS
GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCC
CGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGC
AGGTCTAGTCAGAGTGTTCTGTATAGTAATGGAT .ACAAGTATTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGG φφ «·: X .χ.χλ»·*•X
ΦΦ
φ·« ·*:' *:
S *Φ
Kennvu
GCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTA
ATGGGGCCTCCGGGGTGCCTGACAGGTTCAGTGG
CAGTGGATCAGGC^CAGATTTTACACTGAAAATC
AGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTl'TATT r'ATG
GGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAAG
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSVLYSNGYNY π rmxyKíöm í m .new» & «πιπ
LDWYwnmva
TDFTLIGSRVEAEDY^GWYGMQVLG'TPPTFGPGTK
VDÍK
9. Táblázat
A 22. L 1-es számú e&oanyag érett variábilis doméey élnék DNS és fehérje szekvenciája
LEÍRÁS; Nehéz lánc DNS
Nehéz ne
SZEKVENCIA:
CAG'GTG'CAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTG
GTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTG
CAGCCTCTGGATTGAGC'TTCAGTCGCTATGGCáT
G-CACTGGGTCCGCCAGGCTCGAGGCAAGGGGCTG
GAGTGGGTGGCAGTTATATCATCTGATGGAGGTA
CACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTG
TATCTGCAAATGAACAGCCWAGAGCTGAGGACA
CGGCTGTGTATTAGTGTACGACLAAGAGGGACTGG
AAAGACTTACTACCACTACTGTGGTATGGACGTC
TGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAG
QVQLVESGGGWQPGRSLRLGCAÁSGPTFSEYGMH
WRQAPGKGLEWAinSSDGGNKYYADSVKGRW
fehérje } ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRRGTGKT ’ Y^WCGMWGÖGTTYTVSS nonnvu lánc DK'
GATATTOTGATGACTCAGTCTCCACieTCCCTGCC CGTCACXCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGC AGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGtATAGTAATGGAT ATAACTATTTGGATTGGXACCTGCAGAAGCCAGG CKIAGTCTCCACACXTCCTÖATCIATTTGÖGTTCTA ATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTrCAGTGG CAGTGGTTCAGGCACTGATTTTACACTGAAAATC AGCÁGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTÍTATF j ACTGCATGCAAGGTCTACAAACTCCTCGGACGTT CGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAC
Kormvii lánc fehérje
DlVMTQSPLSLPYTPGSPASISCRSSQSlfoySNGTW
LDWDQKFGQSPBhnyLGSNIGVSGVPDRPSGSGSG
TDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPRTFGQGTK
VEIK
10. í abiázat
A 23.S. 1-es· számú ellenanyag érett variábilis- doyenjeinek DNS és fehérje szekvendaja
SZEKVENCIA:
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTG
L* 1 lüübAbvi v W $ üM&iL ί v ινν 1 vj 1 m
TAGCCTCTGGATTCACC’TTCAGTAACTATGGCAT
GCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTG
GAGTGGGTC^GCAATTATATCATATGATGGAAGTA
ATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATT
CACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTG
TATGTGCAAATGAACAGCOGAGAGCTGAGGAC
ACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACGCGGTCACT
ACGGGAGGGATÍACTACTCCTACTACGGTTTGGA
CGTCTGGGGCCAAGGGACCAGGGTCA.CCGTCTCC
Nehéz QVQEVESGGGWQPGRSLRLSCVASGFTFSNYGMH
lánc W Y RQA PGKG LE WY All SYDGSNKYYADSVKGRFTI
fehérje SRDNSKNTLYVQMNSL ,RAEDT.VvYYzCARRGHYGR
DYYSYYGLDV WG QG3F rvwss
ivonnyn lánc DNS íV
CGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTG AGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGCCTGGTAATGGAT ACAACTATTTGGATTGGTACCTGGAGAAGCCAGG GCAGTCTCCACAGCTCCTGA7CTATTTGGG77CTA ATGGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGG CAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATC AGCAGAGTGGAGGGTGAGGATGTTGGGGTTTATT ACTGCATGCAAGCTCTACÁAACTCCTCGGAGGTT CGG CC AAGGGACGAAGGTGGAAATGAAAG
Kőrmvu lánc fehérje
DIVMTQSPLSLFVrreEPASISCRSSQSLLPGNGYNY LDWYLQ KPGQSPQLLl YLG SN RA SG VPDRFSGSGSG TDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPRTFGQGTK VEIK
11. Táblázat
A 23,28.1-es számú, ellenanyag érett variábilis és fehérje szekvenciája niesneK DNS
Χ·Χ· * · * *- -» *·* χ χ· ? λΓ Α. * * * * * X * * * 9 « « :# * *
99*·9 ** χχ- ·>:<* ->χ
.«· ··
Nehéz ) CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTG ívanáöihs dómén) ’ (23.28.1 HCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGGA CTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGAGGTTÁCTACTG GAGCTGGATCCGGCAGCCCCCTGGGAAGGGACT /X /X
Ctkx ,Α^
DI6E)
SZAMO
SZEKVENCIA.
ACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCA
CCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTC
CCTGAAGCTGAACTCTGTGACCGGTGCGGACAGG
GCCGTGTATTATTGTGCGAGAAAGGGGGGCCTCT
A /-4íC* /X^T*·/^ $ /VT' Λ. /X/X. /X /vzp/i /X fT^XV /X /X /X/x /< /X Z’X /X X λΙ&μ ránk/1 t W1 IvüvVvvC £
GGGAACCCTGGTCAOCGTCTCCTCAG i,ez lánc fehérje (variábilis dómén) (23.28.18
D16B
QX’QLQESGFGLVKPSKr'ESLTCTVSGGSlRGYYWS
WIRQFPGKGLEWÍGYIYTSGSTNYNPSLESRVTISV
DTSKNGESGKLNSVTAADTAVWCARKGGETGOY SS 7Á«iv
SZEKVENCIA
A. 23.29.1 -< 12,. Táblázat
ís száma ellenanyag érett variábilis ϊ deménjeinek DNS
és fehérje szefevene iája
SZEKVENCIA;
|Nehéz C AGGTGCAGGTG GTGGAGT CTGG ρ fi p. a ρ, η p p tp
*♦ .*·♦·.. *·*··Χ ♦ ♦ * φ.
*' ·' ·Χ < -Φ :♦)» φ φ;
Φ * *· φ ψ φ « * * »- χ φ φ Φ φ.
χ-χφφ *Φ «-«- φ*·κ ♦♦
j lánc DNS ί GTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTG | I CAGCCTCTGGATTCACCTCAGTAGÓATGCCAT | 1 GCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTG j GAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTA ) ATAAATACTATGCAGAGTGGGTGAAGGGCCGATT j CACCATCTACAGAGACAATTCCAAGAACACGCTG | . TATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGAGA | ! CGGCTGTG’TÁTTACTGTGCGAGACGCGGTCACT'A ! | CGGGAATAATTACTACTCCTATTACGGTTTGGAC | | GTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTGCT | í 1 I CAG 1
|Nehéz j lánc 0VQ1VESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMH j WVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVRGRFT |
j fehérje- 1 lYRDNSRNTCYhQMNSLRAmTAVYYCARRGHYG | | NNYYSYYGLDVWGQGTTVTVSS | £ *
j Kőnmű 1GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCÜ |
lánc DNS j CGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCirCGATCTCCTGC | I AGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGCCTGGTAATGGAT ACAACTATTTGGATTGGTAGCTGCAGAAGCCAGG i GCAGTCTGGACAGCTCCTGATGTATTTGGGTTCTA. 1 ATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGG 1 CAGTGGCTCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATC AG CAG AGTGG AGG CTG AG G ATGTTGG GATTTATT i ·: 1 ACTGCATGCAAGCTCTACAAACTCCTCGGACGTT J CGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAC |
I Könnyű 1 DÍVMTQSPLSLFVTPGEFASISCRSSQSLLPGNGYNY |
) lánc j LDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSG j
j tehene 1 TDFTLKISRVEASDVGIYYCMQALQTPRTFGQGTK | i VEIK |
« ♦- χχ
-Μ «. « « ♦· *> ♦*».,
13. Táblázat
A 24.2. t-es; számú ellenanyag érett variábilis deménjeinek DNS és
SZEKVENCIA;
Nel lánc DNS
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTG
GTGAAGCCT1CGGAGACCCTGTCCCTCACCTGOA
CTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGAGGTTACTACTG
GAGCTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAA.GGGACT
GGAGTGGATTGGGTATATCTATrACAGTGGGAGC
AGCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCA
CCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTC
CCt
GCGGTGTATTACTGTGCGAGAAGGGGGGGCGTCT :.GGTGACTACGGCTGGTTCGCCCGGTGGGÖCCA
Nehéz
I GVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSÍRGYYWS I WÍRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISV ette
GWFAPWGQGTLVTVSS
Könnyű lánc DNS
GAAATTGTGTTGACGCAGTCTGGAGGCACCCTGT
CTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCÜTCTCCTG
CAGGGCGAGTGAGAGTGTTAGGAGGAGGTACTTA
GCGTGGTAGCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCA
GGGTGCTCATCTATGGTGCATGCAGCAGGGCCAG
TGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCT
AGCCTGAAGATrrTGeAGTGTATTACTGTCAGCA
Φ* χκ· »·.<:♦ «· * «;» * X- φ· φ »·»· »· <
-Λ ·Χ * ·Χ φ: :♦: X
X ·» * Φ φ. Φ φ. X
Χ-ΧΦ« Φ*: Χφ Φ*Φ·Κ· *·*· | GTATAGTAG CTTATTCACTTTCGGCCCTGGGACC
AAAGTGGATATCAAAC
I Kcnnvú ϊ ~?
i ι&η i fú í lenerje | EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSTYLAWY | QQKPGQAPRLL1YGASSRATG1PDRFSGSGSGTÖPTL | T1SRLEPEDFAVYYCQQYSSLFTFGPGTKVDIK . Táblázat
A 21.2.1-es számú ellenanyag DNS és fehérje szekvenciája „:Q'•κ-Wv enez
Inc Dl
SZEKVENCIA: (szignál szekvencia aláhúzva)
TCTrrTAAGAGGTGTCCAGTGTGAGGTGCAGCTG
GTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGG
AGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTGTGGAT
TCACGTTCAGTAGCTATGTCATGCACTGGGTCCG
CCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGC
AGTT ATGTC AT ATG ATG G AAGTAGTAAATACT AT
GCAAACTCCGTGAAGGGCCGÁTTCACCATCTCCA
GAGAGAATTCCAAGAACACGGTGTATGTGCAAAT
AAACAGCCTGAGAGCTGAGGACAGGGCTGTGTAT
TACTGTGCGAGAGATGGGGGTAAAGCAGTGCCTG
GTCCTGACTACTGGGGCCAGGGAATCCTGGTCAC
CGTCTGCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTC
TTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCG ,λαΟΟ | ACTACTTCCCCGAACCGGTGAGGGTGTCGTGGAA I CTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTC | CAGGAGCGTGGTGACCGTGCGCTCCAGGAAGTTC
G-GCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACA
AGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTG
AGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCC
AGCACCACCTGTGGCAGGACGGTCAGTCTTCCTC
TFGGGCCCAAAACCCAAGGAGACGGYGATGATCT
CCCGGACCCCTGAGGTCAGGTGCGTGGTGGTGGA
CGTCAGCCACGAAGACCCCOAGGTCCAGTTCAAC
-GG 'G'
GGAGGTGCATAATGCGA
AGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTGAACAGCA
CGTTCCGTGTGGTCAGCGTCGTCAGGGTTGTGGAC.
□ Λ Λ ^GGCAAGGA^
AAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCG
AGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCC
GAGAACCACAöGIGT&CACCCTGCCGOCAIOCCG
GGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGAC
CTGCCTGGTCAAAGGCTTGTACCCCAGCGACATC
GCCGTGGAÖIGÖGAGAGCAATGGGGAGCCGGAG
AACAACTACAAGACCACACCTCCCATGGTGGAGT
CCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACG
GTGGACAAGAGGAGGTGGGAGCAGGGGAACGTC
TTGTGATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCAGA
ACCAGTACACGCAGAAGAGCCTCTCGCTGIGTGG
Nehéz febérfe
MEFGLSWVFLYAL-LRGVQCOVOLVESGGG-VVQPG
RSRWSCAASGFTFSSWMHWYRQAFGKGLEWVA
VMSYBGSBmWSYKGRFTISRDBSBNTmOiMS
LRAEDTAVYV’CARDGGKAYPGPDWGQGILVTVS
SASTKG-PSVFPLAPGSRSTSESTAALGCLYKDYFPEP
VWSTOSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSYVTVP [56 »:φ: φ,φ ·»»♦:.
« φ. ·Χ ι « Φ κ φ * * V J
Η·Χ»Φ V4 *-♦ •X' *·* φφ φ φ φ φ φ <· Φ -«·:
#·» **
SSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTX^RKCCVECP PCPAPPVAGPSVFLFPPKPEDTLMISRTPEVTCVVVD VSR’EDPEVQFNAWYDGV EV ΗΝ AKTKPREEQFN STF RVY’SVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPÍEK TOKTEGgPREPQWTLPPSREEMTKNQVSLTGLVK GFYPSD1AWWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFRL \GKLTWKSRW0QGNVFSCSAMOEAlHNHYTgES LA
Könnyű | ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAA lánc DNS I TGCTCTGGGTCTCTGGATCCAGTGGGGATATTGT
CTGGAG.AGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAG
IAGAGTGTTGTGTATAGTAATGGATACAACTAT
TTGGAi
CACAGCTCCTGATCTATfTGGGTTCTAATCGGGCC
TCCG^‘^GGAGT'^
CAGGCACAGAIATTACACTGAAAATCAGCAGAGT .i '.ΐ Λ .t.í'AV ;fc ''ΊΓνΎ^· «fnwaaev t um χ λ x C AAAÜG AACTGT ( CCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCA GTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGC TGAA’TAACTTGTATGCeAGAGAGGCCAAAGTACA GTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAAC TCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAG GACAGCACCTACAGCCTCÁGCAGCACCCTGACGC TGAGCAAAGCAGAGTAGGAGAAACACAAAGTCT A CGCCTGCG AAGTCAGCCATC AG GGCCTGAGCYC GCCCCP
VJ? \a-· \u- Vv X.Í ;
GCTx
S.f ·♦'*· ♦♦ «-«r-w * «« « ♦ ·-« φ£ ·,φ ♦« « φ
Φ Φ > :Φ ·φ Φ át.
* * *· Κ· Φ Φ * ν »*'ΨΦ φφ ΦΦ ΦΛί.·* ««
Könnyű lánc fefeérle
MRLPAQLLGLLMLWVSGSSGDIVMTOSPLSLPVTP
GEPASISCRSSQSVLYSNGYNYLDWYLQKPGQSPQL
LIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKÍSRVEAEDV
GVYYCMQVCQYPPTEGPÖTKVDiKRTVAAPSWW PSDEQEKSGTASVVC1XNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKESTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYAGEVTOQGES
c.
A 22.1.1~es szánni ellenanyag DNS és í FT
Ne néz ) lánc DNS
SZEKVENCIA: (szignál szekvencia aláhúzva) atgga^ttgggctgagctgggttttcctcgItgc'
TCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGTCAGGTGCAACTG
GTG GAGTGTGG GGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGG
AGGTOCCTGAGACTCfCCTGTGGAGOCTCTGGAT
TGACCTTCAGTCGCTATG-GCATGCACTGGGTCCG
CCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGC
AGTTATATGATCTGATGGAGGTAATAAATACTAT
GCAGACTCCGTGAAGGGCCGAWCACCATCTOCA
GAGACAATFCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAAT
GAAGAGCCTGAGAGCTGAGGAGAGGGCTGTGTAT
TAGTGTAGGAGAAGAGGGAGTGG AAAGACTTACT nCAGTACP reu vCTCAGC v
GGGGGATCGGTCWCGGGGTGGCGCCGTGCTGCA
SÁG:
GCGTGGTCAAGGAGTAGTTGCCCGAAGCGGTGAG
158
* φ lánc
GGTGTCGTG G AACTC AGGCGCTCTGACCAG CGG C
GTGCACACCTTCGCAGGTGTCCTAGAGTCCTCAG
GACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCC
CTCCAGCAACTTCG-GCACCCAGACCTACAGCTGC
AACGTAGATCAGAAGCGCAGCAACACCAAGGTG
GACAAGACAGTTGAGCGGAAATGTTGTGTCGAGT
GCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGAGC
GTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGAC
ACCC ί Ca i .Lm IC 1 tttwnvwv 1 LtAvxO í CÁMcxl
GCGTGGTGGTGGACGTGAGGGACGAAGACCCCG
AGGTCCAÖTTCAAGTGGTACGTGGACGGCGTÖGA
GGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGA
GCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTGAGCGTC
GTGAGGGTTGTGCAGCAGGAGTGGGTGAACGGCA
AGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCC
TCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAAC
CAAAGGGCAGOCOCGAGAAGCACAGGTGTACAG
CCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGAOGAAGAAC
CAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTGT
ACCCCAGGGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCA
ATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACAC
CTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTGCrC
TAGAGGAAGCTCAGGGTGGAGAAGAGCAGGTGG
CAGCAGGGGAACGTGTTCTCATGCTCCGTGATGC
ATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCÁGAAGA
ÖGGTCTGGGTGTGTGGGGGTAAATGA •MEFGLSWVFLVALLRGVÖCÖVÖLVESGGGVYOFG
RSLRLSCAASGFTRSRYGMHWVRQAPGKGLEWVA
VISSDGGRRY¥ADS¥KGRFTISRDNSRNTL¥LOMR ♦ -Χ
ÍS§ φ .If φ ,}J, φτ φ β * β> ♦ » $ * Λ· ' «τ« « «. > «« ύβ » 4Í-1Í
SLRAEDTAVYYCTRRGTGKTYYHYCGMDVWGQG
WVWSSASTKGPSYFPLAPGS.RSTSESTAALGCOK
DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLGSSGLYSLS
SWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERK
CCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMI.SRTPE¥
TC.VVVDVSHEDPEVQFNVAVDGVEVHNAKTKPRE
EQFNSTFRWSVLTWHQDWLNC KEYKCKVSN KG
TPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS
LTCL¥KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLD
SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN
HYTOKSLSLSPGK
Könnyű lánc DNS
ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAA.
TGGTCTGGGTCTCTGGATCCAGTGGGGATATTGT
GATGACTCAGTCTCCACTCTCCGTGCCCGTCACCC
CTGGAGAGCCGGCCTCCÁTCTGCTGCAGGTCTAG
TCAGAGCCTCCTGTATAGTAATGGATATAACTÁ?
TTGGATTGGTAGCTGGAGAAGCCAGGGCAGTCTC
CACACCTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCC
TCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGTr
CAGGGÁCTGATTTTACACTGAAAATCAGGAGAGT
G G AGG CTG AGG ATGTTGGGGTTTATTAGTGGATG
CAAGCTCTACÁAACTCCTCGGACGTTCGGGGAAG
GGACCAAGGTGGAAATCAAACGxAACTGTGGCTG
CACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAG
LzAvjr 1 i i v ί. x ytGG l vlUl á u AjI V i
GCTGAATÁACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTA
CAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTA
ACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCA
AGGACAGCACCTAC.AGCCTCAGCAGCACCYTGAC
X* ·» ·«..»· í X- ·*, χ- :♦: x *- X :♦ :♦: ·». X :·«,.
X *' X -X -Ji >· X χ •XXX'« XX -»#' X**X *<S
GTTAG
konnvu r ϊ o í’X «-» X<SJL SkGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGT
GTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGC
TCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGT xenene
MRLFAQLLGLLMLWVSGSSGDIYMTOSPLSLPVTP
GEPASISCRSSQSLLYSNGYNYLDWYLQKPGQSPHL
LÍYLGS.NRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDV
GáYTCMOALOTPRTPCQCTWEIKEWÁAPSVFiFP
PSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA
LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH
KWACEYTHQGLSSPYTKSFNRGEC
A 23.5.1-ez számú ellenanyag DNS és fehérje szekvenciája
ÍRÁS: j SZEKVENCIA: (szignál szekvencia aláhúzva)
Nehéz sno nt
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGC
TCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGTCAGGTGCAGCTG
GTGGAGTCTöGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGG
CACCTTCAGTAAGTATGGCATG C ACTGG GTCCG C CTCCAGGCAAGGGG^^^ Δητ-η,η,
ÍAGIAIGG
ATTATATCATATGATGGAAGT.AATAAATACTATG
CAGACTCCGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAG ^^GTATGTGCAAATG
AACAGCCTGAGAGCTGAGGÁCACGGCTGTGTATT
ACT'GTGCGAGAGGCGGTCAGTACGGGAGGGATTA
CTACTGCTACTACGGTTTGGACGTCTGGGGCCAA
GGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCA
χ·
ΡΦ *-λ/ :Φ.<>φφ'
Φ Φ «: ·* *
Φ 9 * -* φ 9· 'Φ ♦ * .»Φ »Φ- ΦΧ ΦΦ :$· φ φ : χτφ φ φ *· * φ4φ 9-9 *
AGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTC
CTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTG
ACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCG
GCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCGTACAGTCCTC
AGGAC7CTACTCCC7CAGCAGCGTGGTGACGG7G
CCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCT
GCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGG
TGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGA
GTGCCGACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGA
COGTCAGTCTTCCTCTrCCGCCGAAAAGCCAAGG
ACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCAC
GTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCC
GAGGTC€AGTrCAA€TGGTACGTGGA.€GGGGTGG
AGGTGGATAATGCGAAGACAAAGCGACGGGAGG
TGíu
CCTCACCGTTGTGCACC-AGGACTGGCTGAACGGC
AAGÖAGTACAAGTGGAAGGTCTCCAACAAAGGC
CTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAA
CCAAAGGGCAGCCCGGAGAACCACAGGTGTACA
CCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAA
CCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTC
AATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACA
CCTCCCATGCTGGACTGCGACGGCTCCTTCTTCCT
CTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTG
GCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATG
CATGAGGCTCTf’^ Δ Δ ·*
GCGGGE ** χ» r φ· .φ * φ φ « « φ•S Φ *· φ Φ »· » * * * * β * * ►*-*Φ ** ΦΦ WX ·»ν
Nehéz rec rje
MEPGLSWVFLVALLRGVOCOVOWESGGGWQPG
RSLRLSCVASG.FTFSNYGMHWRQAPGKGLEWVA
IISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLWQMNS
LRAEDTAVYYCARRGHYGRDYYSYYGLDVWGQG
TWTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAAEGCEVIC dyfpepvtvswnsgaltsgvutfpavlqssglysls
SWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERK
Könnyű r'rCVVVDVSHEDPEVQFNWWDGVEVHNAOKPRE G «KNQVS
LTGEVKGFYPSDÍAVEWESNGQPEN'NYRTTPPMLD
SDGSFFLYSKLWDKSRWQQGNVFSCSYMHEALHX
HYTQEELGLSFGR
EQF.NSTFRVVSVLTWHQDWLNGKEYKCKVS.NK\.j
GHSKBCGx
ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAA anc « j TGCYGTGGGTCTCPGGÁTCCAGYGGGGATATrGT GATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCG CTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTGYAG I TCÁGAGCCTCCTGCCTGGTAATGGATACAACT?
TrGGATrGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTe I CACAGCTCCTGATCTATTTGGGTrCTAATCGGGCC J TCCGGGGTCGCTGÁGAGG’TTCAGTGGCAG’TGGP | CAGGGÁGAGATTW^
G GAGGCTGAGGATGTTGG GGTTTA.TTACTGCATG GAAGCTGTA.CAAAGTCCTCGGACGTTCGGCCAAG j GGACGAAGGTGGAAATCAAACGAAGTGTGGCTG
CAGCATCTGTCTTCATCTTGGCGCCATCTGATGAG
A/** ( GCTOAATAAGTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTA.
;63 * #· * * ι $ ♦;
* * « « *
IWV4 *á>
* «« ♦ V ·ν
lánc fehérje
< Τ T\szt y’X OTYÍTÜ Λ· CY^’Y’i ?ΓϊΓΥΓ5 <Υ^Ο /\·φΥΥ?*Τ·? ΤΖϊ £YT~>N ZTP ;
! GVYYC
YTFG QGTKVEIKRTVA APS VF ΙΕΡ í oc
EQLKSGTAXWCLLNNFYPREAKVQWEVDNA | LQSGNSOESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH
VÁ:
17. Táblázat
23.28.1 -es számú ellenanyag DNS és fehérie szekvenciája
LEÍRÁS: SZEKVENCIA: (szignál, szekvencia aláhúzva) >
Nehéz ATGAAACATCTGTGGTTCTTCCTTCTCCTGGTGGC
lánc DNS AGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAGGTG
(' vAGG A GTCGGGGGGA GG A GTGGTG A A GGPTTG GG
AGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGC TCCATCAGAGGTTACTACTGGAGCTGGATCCGGC AGCCCCCTGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGT
ATATCTATTACAGTGCMJAGCACGAACTACAACCC CTCGGTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGAC ACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAACT : CTGTGACCGCTGCGGACACGGCCGTGTATTATTG ................ ..... ... . .
0^2 X*«# fc * fc * fc e fck fc X
5$ * * «f <MPX .♦ ·.>.·$ *·»:
TGCGAGAAAGGGGGGCC'TCTACGGTGACTACGG
L- I vu & ΐ g.-O'LLgcL i 1 uui v
AGCGTGTGGTCAGGCTCGACCAAGGGCGCATGGG
TCTFCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCT-CC
GAGAGCACAGCGGGGCTGGGCTGGGTGGTGAAG
GACTAGTTCGCCGAAGCGGTGACGGTGTGGTGGA
ACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACAO ^«•GGACTC 'AZ'V* rvp
TCAGCAGCGTGGTGACGGTGGCGTGGAGGAACT1 CGGCACCCAGACCTAGACCTGCAAGGTAGATCAC AAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTT GAGCGCAAATGTIGTGTCGAGTGCCCACCGTGeC CAGCACCACCTGTGGGAGGACCGTCAGTCTTCGT CTrC€C€CQAAAA€CCxAAGGA.CAGOCTCATGATC. TCCGGGACCCCTGAGGTCAGGTGCGTGGTGGTGG ACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAÁ CTGGTACGTGGAGGG-CGTGGáGGTGCATAzOGCC AAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGC ACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGC AGCAGGAGTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGT GCAAGGTCTCCAACAAAGÖCCTGGGAGGCGCCAT CGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCC CCGAGAACCACAGGTGTACACCeTGCCCeCATCC CGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTG ACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACA sww» a nzvvcr' l'Ufí
AGAACAACTACAAGACCACACCTCCGATGCTGGA
CTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCÁ
CCGTGGACAAGAGGAGGTGGCAGCAGGGGAACG
5ί*Χ·«
U;5
TCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCAC
AACCACTACACGGAGAAGAGCCTCTÜGCTGTCTC
CGGGTAÁATGA
Nehéz
MKHLWFFtLLYAAPRWVtSOVOLOESGPGLVKPSE ^LSETCWSGGSIRGYYWSWIRÖFPGKGLEWIGY] fehéne
SGSTí i rdVOTSKNQFSERMSVTAA
DT AYYVC ARKGG LYG DYG WFA PWG QGTLVTTYSS
ASTKGPSWPLAPCSRSTSESTAALGCEWDYFPEPV
TVSWNSGALTSGYHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPS
SNFGTOTYTGYA'DHKPSNTKN'DKTVERKCCVECPP
CPAPPVAGPSVFLFÍ rPEVTCVWD
VSHEDPEVQFNWYVGYEV.HMAKTKPREEQFNSTF
RWSVLTWHQDWLNGKEYKCKY'SNKGEPAF
TISKTKGQWEPQVYTLPPSREBmíNQVSErCLVK GFYPSDlAYBWESNÖQPENNYKTrPPMLDSDGSPFL YSKFTYDKSRV/QQGNYFSCSYAÍHEALHNHYTQKS IPGK
ATCGAAACCCCAGCGCÁGCffCTC^CCTCCTGCF
ÁCTCTGGCTCCCAGAATCCACCGGAGAAATTGTG TTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCC GGGAAAGAGCCACOCTCTCGTGCAGGGCCAGT DAGTGTTAGCAGCAGCGAGTTAGCCTGGCACC AGGAGAAACCTGGGGAGGCTCCCAGACTCCTCAT ./-X v'X Λ.
GACAGGTFCAGTGGCAGTGGGTCT
TGACTCTGAGCATGAGGAGACTGGAGCCTGAAGA
TTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCACTGTCGTAGCT | TATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATAT I CAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATG
Ϊ66 «♦ m-χ χ-φ.φ* ·* *- .» «- * ΧΦ « ♦ φ -* Φ -X .« Φ X'
-γ -» φ φ. e a a x· ♦* *:φ φτ*φ φ* 'TTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCrGGAA
CTGCGTGTGTTGTGTGCGTGCTGfeATAACTTCTAT ;?
£300 i!
ESYTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE YTH ÜGESS PYTKSFNRGEC
ΧΟΧΎΩ YU fehérje
18. Táblázat
A. 23.29.1-es- száméi eSenanyag BNS és fehérje szekvenciája
LEÍRÁS; SZEKVENCIA; (szignál szekvencia aláhúzva)
' Nehéz lánc DNS ATG G AGTTTG GGCTGA GCTG GGTTTTCCTCGTTG C
TCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGTCAGGTGCAACTG
1 GTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGG AGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAT TCA.CCTTCAGTAGCTATGCCATGGACTGGGTCCG CCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGC AGTTATATCATATGATGGAAGTAATAAATACTAT GCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTACA __________________________________________________
** :»««·
167 * *- ♦·
GAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAAT : GAACAGCCTGAGAGGTGAGGAGACGGCTGTGTAT TACTGTGCGAGACGCGGTCACTACGGGAATAATT ACTACTCCTATTACGGTÍTGGAOGTCTGGGGCCA AGGGACCACGGTeACCGTCTCCTCAGCCTCCACC AAGGGCCCATCGGTCTTCOOCCTGGCGCCCTGCT CCAGGAGCACCTCCGAGAGCAGAGCGGCCCTGG GCTGCCTGGTCÁAGGACTACTTGCCCGÁACCGGT GACGGTGTCGTOGAACTCAG G CGCTCTG ACC AGC GGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTOCT CAGGAGTCTACTGGGTCAGGAGGGTGGTÖACCGT GCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACC TGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAG GTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCG AGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAÖG AGCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAG GACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCA CGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGAGCC CGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTG GAGGTGCA2AATGCCAAGACAAAGGGAGGGGAG GAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGÖTCAGCG TCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGG CAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTGGAACAAAGG : CCTCCCAGCGGCGATCGAGAAAACCATCTCCAAA ACCAAAGGGCAGeCCCGAGAACCACAGGTGTAC ACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGA ACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTT CTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAG’TGGGAGAGC i AATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACA
;Ő8
ΧΦ ΦΦ .»««.«. χ » Φ V « χ φ* φ Λ
Φ * · *· Φ Φ: -» ♦ * Φ Φ Φ »· « ·· φ»φφ: φ « φφ ««, χ *-♦
CCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCT ζ-ντ
1YAGAGCAAGGYCAGCGTGGAGAAGAGGAGGTC GCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGAYG
CATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGA | GCCTCTCCCTGTCTCCGGGTxAAATGA 'Nehéz lánc i MEFGLS^yF^ALLRGVOCQVQOEGGGGVVQPG”
RSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGEGLEWVA VISYDGSNKYYADSVKGRFTIYRDNSKNTLYLQMN SERAEDTAWYCARRGHYGNNYYSYYGLDVWGQ GTTYTVSSASTKGPSYFPLAPCSRSTSESTA.ALGCLV KDYFPEPYTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL BSWTVPSSNFGTQTYTCWDHKPSNTKVDKWER KCCYTCPPCPAPPVAGPSWLFPPKPKDTLMISRTPE VYCVWDYSHEDPEYQFHWYVDG V EYH NAKTKPR EEQFNSTFRWSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNK GLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDLAVEWESNGQPENK^KTTPPM LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNYFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSPGK
Ό'!'-? ί' Í -V ν ί. λ
ÍS
ATGAGGCTCGGTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCYAA
TGCTCTGGG1CTCTGGATCCAGTGGGGATATTGT
GATGACTCAGTCTCCACTGTCCCTGCCCGTCACÜC
CTGGAGAGCCGGOCTCCATCTCCTGCAGGTCTAG
TCAÖAGCCTCCTGCCTGGTAATGGATACAAGTAT
TTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTC
CACAGCtCCfGATCTATTTGGGTTCTAAfCGGGCC
TCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGCT
CAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGT
GGAGGCTGAGGATGWGGGATrFATTACYGCATÖ
-jí-M **·*# ♦- » * « Φ « # *# « · * S- 5 · * * * ¢:- # Φ Φ : Φ: : Φ *':
♦♦♦< »:♦ ** :♦*·♦. **
I CAAGCTCTACAAACTCCTCGGACGTTCGGCCAAG um€CAm μ o . i
CACCATCTGTCTTCATCTTCCCGGCATCTGATGAG C AGTTGAAATCTGG AACTG CCTCTGTTGTGTG CCT
CAGTGGAGGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTA
AGTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGAGAGGA
AGGACAGCACCTACXAGCCTCAGCAGCACCCTGA.C
GCTGAGCAAAGGAGACTACGAGAAACAGAAAGT
C'TAGGCCTGGGAAGTCAGCCATCAGGGCGTGAGC
GTTAG
Könnyű íefeérie
Könnyű lánc DNS (23.29.1 U mm
101
CIA1
MRbPAQbLGLLMtWVSG SSG PIYMTOSPLSLPVTP
SQSbbPGNGYNYbDWYbQKPGQ!
LÍYLGSN RASGYPDRFSGSG SGTDFTLKISRYEAED V G1YYCMQALQTPRTFGQGTKVE1KRTVAAPSVFÍFP PSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWRVDNA bQSGKSQESVTBQDSKDSTYSLSSTbTbSKADYEKH :evt«<3Glssfvtksfnrgec
ATGAGGGTCCGTGGTGAGCTCCTGGGGGTGCTAA
TGCTCTGGGTCTCTGGATCCAGTGGGGATATTGT
GATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCC
CTOGAGAGGCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAG
TCAGAGCCTCCTGCCTGGTAATGGATACAACTAT
TTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTC
CACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCC
TCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGCT
CAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGT
GGAGGCTGAGGATGITGGGATTTATTACTGCATG ·* 'X
44-4 4
ΚΊ4 » * 4:
•44 »*:»)(
CAAGCTCTACAAACTCCTCGGACGTTCGGCCAAG ggaccaaggtggaaatcaa,acgaactgtggctg
CACCATGTGTCTTCATCTTCGCGCGAT'CTGATGAG
CAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCT
GGTGAATAACFTCTATGGGAGAGAGGGCAAAGTT
CAGTGGAAGGTGGATAAGGCGGTCCAATGGGGTA
ACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGAGAGCA | GCTGACKZAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGT ] CTACGOCTGGGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGC
MRLPAOLLGLLMLWVSGSSGDIVMTQSPLSLPVTP
ΓΕ
3NGYNYEDWYLOKPGG
Könnyű lánc fehérje (23.29.1LR 174R)
LIYLGSNRASGVPDRPSGSGSGTDFTLKISRVEAEDV
GIYYCMQALQTPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFP
LKSGTAS^
LLNNF^
EAKVC
SZÁMÚ SZERVI
LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH
KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
A 24.2.
es szekvenciája
1 LEÍRÁS; | SZEKVENCIA; (szignál szekvencia aláhúzva)
| Nehéz lánc i ATGAAACATCTGTGGTTCTTCCTTCTCCTGGTGGC
1 DNS ! AGCTCCCAGATGGGTGCTGTGCGAGGTGCAGCTG
1 CA.GGAGTCGGGOGCAGGACTGGYGAAGCCTTCGG
Í71 (ί. Φ X ♦
φ. Φ ·φ 'X Φ «φφφ ** φ« ·♦«
AGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGC
AGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGT
ATATCTATTACAGTGGGAGCACCAACTACAACCC
-τ/' λ rj
ACGTCCAAG.AACCAGTTCTCCCTGAAGGTGAGTT
CTGTGACCGCTGCGGACACGGCCGTGTATTACTG
CTGGTTCGCCCCCTGGGGCCAGGGAACC
ACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGG
ΖΝΓΤ p./s ZN ZN ZN/FzT Z**:
GAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAG
5ACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGA
CTT
CCCAGCTGTCCTACAGTCCTC AG GACTCTACTOCC TCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCGTCCAGCAACTT
A ZAZAZrt
CC
AAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAÁGACAGTT GAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGO CAGCACCACCTGTGGCAGÖACCGTCAGTCTTCCT CTfCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTGATGATC TCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGG AGCCACÖAAGA
CTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCC
AAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGC
ACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGC
ACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAÁGT
GCAAGGTCTCCzYACAjüAGGCCTCCCAGCCCCCAT
CGAGAAAACCATCTCCAA * * A «X ΦΦ *Ή·* » »'«.
* *- ♦ · ♦ ♦ * χ-» ·» * -χ φ a Φ: * -X Φ Φ * 4» Φ <.
**** ·*·: ♦» »*·* «-<CCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCC CGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCW ACCTGCCTGGTCAAAGGGTTCTACCCCAGCGACA TCGCGGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGG AGAAGAACTAGAAGACCÁ.CACCTCGGATGCTGGA CTCCGACGGCTCCTIGTTCCTCTACAGCAAGCTCA CCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACG ^r^CTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCAC
ÍAAATGA ; Nehez lánc
MRRWR
1KGLEWIGYIY
TLSLTCTVSGGSIRGYYWSWiR YSGSTWFTSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTA.A DTAVYYCARRGGO’GDYGWFAPWGQGTIzVWSS ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAAIGCLVKDYFPEPV TVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSAG/TVPS SNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPP CPAPPYAGPSVFLFPPKPK.DTLMISRTPEVTCVVVD VSHEDPEVQFNWYVIX1VEVHNAKTKPREEQFNSTF EWSYIAOTBqDWLNGKEYKCKVSWGWAPIEK TÍSKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFL YSRlWDKSRWQCGWFSCSYMHEALHNHYYgKS LSLSPGR i Kőrcnvű λ TV* px Λ A. A p* ZXΛ ZW A z^:.>*”'riprpz^/TsZ^ 'T’^T'Z'* Z^rPZ'^ ζ^'Τ' ianc .· 1C i LrWL1L- L vAu A * «uuivvuuftuíw >TG
3CAG“
TTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCC AGGGGAAAGAGCCACCCTCTO CAGAGTGTTAGCAGCACCTACI » ·#·* ♦· * ♦ « ♦ ί ψ ' Í ί Α * * Λ * * .«. ♦. & φ ¢, ,φ ·*- Κ'Χ· *» .««.> fc» a^tóAGGCTCCCA '^GCTCAT
Könnvb
CTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCA
GACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACT
TG ACTCTC ACCATC AG C AGACTGG AG CCTG AAG A
TTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATAGTAGCT
TATTCACTTTCÖGCCCTÖGGACCAAAGWGATAT
CAAACGAACTG7GGCTGCACCATCTGTCTTCATC
TTCCCGCCATCTGATGA.GCAGTTGAAATCTGGAA
CTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAAmACTTCTAT
CCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGAT
AACGCCCTCCÁATÖGGGTAÁCTCCCAGGÁGAGTG
TCACAGAGCAG GAC AG CAAGGAC AGCACCTACA
G C CTCAG CAG CACCCTG ACGCTG AGCAAAGCÁG
ACTACGAGAAACÁCAAAGTCTACGCCTGGGAAGT
CACCCATCAGGGCCTGAGCTCGGCCGTCACAAAG
AGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
METPAQLLFLLLL WLPDTTG EiVLTŐSPGTLSLSPG b
RATLSCRASQSVSSTYLAWYQQKRGQAPRLLiYGA
SSRATGIPDRFSGSGSGDFTLTISRLEPEDEAVYYC
QQYSSLFTFGPGTKVDIRRTVAAPSVFÍFPPSDEQLK
SGTASVvCLLNNWPREAÍG’QWKVDXALQSGNSQ
ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKYYÁCE
VTRQGLSSPVTRSFNRGEC
20.
A 22.I.1H-C109A számú ellenanyag érett variábilis doménjeinek DNS és fehér! e szekvenciája
ÍRÁS: ΐ SZEKVENCIA: (szignál szekvencia aláhúzva) ♦ ·- φΤΧ •X * φ χ φ *· Φ :Φ χ Φ * φ κ- κ·
ΦΦΦχ- κ-κ- φφ ** *· Φ ί ϊ ί
Nehéz Iáim ΐ CAGGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTG J
195.
számú szek\'enGTCCAGGGTGGGAGGTGGGTGAGACTCTCCTGTG
CAGCCTCTGGATTCAGCTTCAGTÖGCYATGGCAT
GCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGC.AAGGGGCTG
GAGTGGGYGGGAGTTATATGATCTGATGGAGGTA
ATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATT
CACCATCTCCAGAGACAATTGCAAGAACACGCTG
TATGTG CAAATGAACAGGCTGAGAGGYG AG GACA
CGGGTGTGTATTACWTACGAGAAGA.GGGACTGG
AAAGACTTACTAGCACTACGCCGGTATGGACGTC
Nehéz lánc j Q VQLVESGGGWQFGRSLRLSCAASGFTFSRYGMH
fehérje j V /VRQAPGKGLEWVAV1SSDGGNKYYADSVKGRFT
(96, K 3RDNSKNTLYLQMNSLRAEIWAVYYCTRRGTGET
számú Y YHYAGMDVWGQGTTVTVSS
szekven-
eh)
21, Táblázat
23,28.1L-C92A számú ellenanyag érett variábilis domenjeinek DNS és fehérje szekvenciája
LEÍRÁS: SZEKVENCIA; (szignál szekvencia aláhúzva)
Könnyű lánc DNS í99, számú : szekven- j cia) GAAAWGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGT CTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCGTG CAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCGACTTA GCCTGGCACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCA GACTCCTCATCTATGGTÖCATCGAGCAGGGCCAC |. TGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGGAGTGGGTCT
»-χ· »-Χ· (Μ®. φ,χ
Κδηηνύ ienerje <100...
számú szekvencia):
GGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGG AGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCA CGCCOGTAGC:
AAAGTGGATATCAAAC
EÍVrrÖSPGTÍHsPGERATLSCRASQSYSSSDLAWH
QQKPGQAPRLUYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTL
TIS.RLEPEDFAVYY'CQHARSLFTFGPGTKY'OIK
3. Pálos.
A nehéz lánc és könnyű lánc amínosav helyettesítés^ azese
Az 1D--1H.. és 2D--2H. ábrákon szekvencia összehasonlítások láthatók a 3,1.1, 7.. 1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4,1, 21,2.1, 22,1.1,
22.1. IH-C1Ö9A, 23,5.L 23.28.1, 23.2:8,1H-DI6E, 23.29.1 és
24.2.1 monokionális ellenanyagok nehéz lánca, variábilis doménjének megjósolt amínosav szekvenciái és a megfelelő gének esiravonal amínosav szekvenciái között. A legtöbb nehéz lánc. CDR3 régió tartalmaz amínosav inszerciökat.
A 21.4,1 ellenanyag % doménjében használt DLR1 gén két (Μ Λ.· ciszternesonortot ICysl kódol roszköpías > es nornolóyía modellezés demonstrálta, hogy a két Cys csoport dí szulfid-híddal van összekötve, és ez a díszulfíd-híd nem teszi tönkre az ellenanyag struktúráját.
Az lA-lC. és 2A-2G. ábrákon a. 3.1.1, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.L 21.2.1, :22.1.1, 23.5,1, 23.28.1, 23.28.L-C92A, 23.29.1 és
24.2.1 monokionális ellenanyagok megjósolt könnyű lánc variábilis amioosav szekvenciák és a megfelelő gének csíravonal szekvenciáinak összehasonlítása. látható. Ezeknek az ellenanyagoknak a. könnyű láncai három különböző génből származnak. A tizenegy ellenanyagból hét az A3/A19 VK. gént használja, ezek közül hatban két mutáció van a CBR1 régióban. Emellett a hét, az A3/A19 VK gént használó ellenanyagok közül öt a JK1 gént is használja; az összes ilyen ellenanyagban az első, a dK 1 génből származó amínosav következetesen W-ről R-re változik.
Az nyilvánvaló, hogy az előzőkben azonosított aminosav helyettesi lések vagy inszerciók közül számos egy CDR-ben, vagy annak szoros közelségében található. Ügy tűnik, hogy ilyen helyettestté sek hatással lehetnek az ellenany agn ak a CB4G moleknlához való kötődésére. Emellett, az ilyen helyettesié seknek szignifikáns hatásuk lehet az ePenanvagok munkására is.
A találmány szerinh elleBanyag iájok közötti kemsztreaktivitása
FACS elemzéseket végeztünk, hogy meghatározzuk a találmány szerinti ellenanyagoknak a különböző fajokból, leginkább bizonyos óvilági majmokból származó CD40-hez való kötődését és affinitását. Emberi és majom teljes vér ahkvot részeit egy óra hosszat jégen inkuháljuk, az itt példaként megadott, találmány szerinti anti~CD4Ö ellenanyagok növekvő koncentrációival, vágj/ ami-fúrócsiga hemocianm ÍKLH) ellenanyaggal, mint negatív kontrollal, A mintákat azután 30 percig jégen tartjuk anti-humán igG2-vel konjugált EPE-vei (nkoerítrin). A CD19/CD20 pozitív Fiséi te k kötődését áramlási ckometriávál mérjük, és a fluoreszcencia intenzitás (F12-Hí versus sejtszám (Counts) hisztogrammokat CellQuest programmal elemezzük, Az egyes ellenanyagok
Φ φ φ ·*φφ.φ. φφ kötődését (Kr>) az átlagos fluoreszcencia intenzitás vs. ellenanyag koncentráció grafikonokról becsüljük meg. Az ellenanyag-kiürülést úgy szabályozzuk, hogy a kötődést egy sejtkonoentrácló tartóin ányban m érj ük.
Vizsgáljuk a 3.1.1» 7X2, 10.8,3, 15.1.1 és 21.4.1 nyagok humán, rhesus és cynomolgus B-sejtekhez való Emellett vizsgáljuk a 21,.2.1,. 22.1,1, 23.5.1, 23.25.1, 23,28,1,
23.29.1 és 24.2,1 ellenanyagoknak a humán és mmomolgus Bsejtekhez való kötődését.
Megfigyeltük, hogy a majomsejtek esetében a jel maximuma és maximális kötődés félének koncentrációja egy kettes faktoron belül van a humán. B~sejtek paramétereihez viszonyítva, Hasonló kísérletekben nem volt kötődés megfigyelhető egér, patkány, nyű és kutya vérével.
Egy másik in tóim esszét is végrehajtottunk, hogy meg rozznk a találmány szerinti ellenanyagoknak a CÖ4G-hez viszonyított szelekhviü
CD4Ö szelektivitás?. BLISA: Anyagok és Módszerek Egy 96-kikas RnoroNUNC lemezt (Nunc
475515) négy an tigénnel vonunk be: €D4Ö/Jg, CD44/ Ig, RÁNK/lg, s/lg, TNFR-l/Ig és TNRR-2/ig (saját laboratóriumban készttett ellenanyagok^ a bevonást éj n át M ®C~on, 1 gg/ml koncentrációjú, löü ul./luk mennyiségű. Ö,1 mol/l nátrlum-hidrogénkarbonát pufferben (pH“9,6) hajtjuk végre. A lemezeket ezután naromszor mossuá PB (FBSRÖJX es a temezt ** «♦ «••.χ.·* *- ♦ y φ ·Λ * £ *· * * * * * ♦ <**$·* ♦*
PBST+0?5%B8A--val blokkoljuk, 150 μΐ/luk .mennyiségben. A lemezt egy óra hosszat szobahőmérsékleten ihkubáljuk, majd háromszor mossuk PBST-vet Ezután hígítjuk az 1. példában előállított Hnh-CD40 ellenanyagokat a blokkban 1 pg/ml koncentrációban, majd. a hígított e&nawagokat a lemezhez adjuk. A lemezeket szobahőmérsékleten mkubáljuk egy óra hosszat, majd háromszor mossuk PEBT-vek Ezután az 1. példában generált ellenanyagokat tartalmazó inkákat l'öö pl/luk: antí-humán IgG2HRP-ve! kezeljük poathern Biotech Cat Mo. 9070-05), 1:4000 higitásban a blokkban. Ezután egy sort and-humán IgG-vet kezelünk paekson Cat:. No. 2099)35-088), 1:5000 arányban hígítva a blokkban, majd 100 μ/luk mennyiségben hozzáadjuk, hogy a lemezt a bevonáshoz normalizá|uk. Emellett. egy sort anuhumán CD4Ü-HRP-vel kezelünk (Pharmingen Cat Mo< 34SS1S/Custom HRP konjugálü 0,05 pg/ml-ben, blokkban hígítva, pozitív kontrollként. A lemezt egy óra hosszat szobahőmérsékleten mkubáfuk, majd háromszor mossuk PBST-vet 100 pl/luk: mennyiségben TMB szübsztrátot (öbP bab®) adunk hozzá, és a lemezt 5-10 percig infcufeáljuk. A lemezt ezután egy Speetrahlax™ leraezleoivasóval olvassuk le,. Az eredmények azt: mutatják, hogy az ellenanyagok. CÍMŰ szelektivitása legalább lüö-szor nagyobb. mint a RANK-kal, 4-lBB-vel, TNFR-I-gyel és TNFR-2-vel szemben mutatott szelektivitásuk, mivel a CD40~speclüfcns jel (CD40 jel mínusz háttér) legalább iDCot nagyobb. mint a más molekulákkal kapott, megfelelője!.
6. Példa
Miután demonstráltuk, hogy a találmány szerinti ellenanyagok szelektívek a CD4Ö-re, kompetíciós kötési elemzést végeztünk BIAcore-ral és FACS-sz&k
BlAeore kompetíciós vizsgálatok
Bitemé kompetíciós vizsgálatokat végeztünk, hogy meghatározzuk, a találmány szerinti humán anli-CD40 ellen anyagok a CD40 molekulán ugyanahhoz a helyhez, vagy egy másik helyhez kötődnek-e.
Ezekben a kísérletekben egy Bitemé 2ÖGÖ berendezést használunk, a gyártó utasításai szerint A Bitesre érzékelö-ehip felszínekre Protein-A-1 ímmohilizálunk. A CMO-Ig, amely tartalmazza a CD40 extracelluláris doniénjét, telítési koncentrációját az érzékelő chip-hez kötjük Ezután egy első, a találmány szerinti humán agonista. an£í-CB40 ellenanyagot, e^? kereskedelmi forgalombanban levő antí~€D4Ö ellenanyagot, vagy CD40L-I kötünk az érzékelő chiphez kötött' CD4Ö~bez, telítési körülmények között. Ezután mérjük egy, a találmány szerinti második humán agonista anti-CD40 ellenanyagnak azt a képességét, hogy miképpen verseng az első ellenanyaggal, a kereskedelmi forgalomban levő ellenanyaggal, vagy a CD4ÖL-lel, a CD40-hez való kötődésért. Ez a technika lehetővé teszí számunkra, hogy az ellenanyagokat különböző kötési csoportokhoz rendeljük. A CD4Ö~hez való kötődés egy független epitophoz való kötődést mutat. A kötődés hiánya va^r azt mutatja, hogy ugyanazt az epitopot ismerik fel, vagy’ átlapoló epi topokat mutat.
FACS vizsgálatok
Í8S
*
FACS vizsgálatokat végeztünk, hogy meghatározzuk, vajon a. találmány szerinti humán antó-CD40 ellenanyag a CD40 molekulának azonos, vagy eltérő részéhez kötődik, és annak meghatározására, hogy a CD4Ö molekulán ugyanahhoz,, vagy egy másik helyhez kötödnek-e, mint a kereskedelmi forgalomban levő .EA5 (Alexis katalógusszám ANC-3ÖÖ-Ö50), kÖB'7/6 (Serotec
MCA/590PE) és 5C3 {Pharmingen ·# 555458 (jelöletlen) és az: 555460 (FAÜS-hoz jelezve)) anti-CD40 ellenanyagok,
A találmány szerinti a.nti-CD40 ellenanyagokkal kezelt dendrites sejteket PE jelzett EA5 vagy PE jelzett LQB7/6 ellenanyaggal jégen, 30 percig ellenfestjúk. Mosás után a sejt-festést egy B-D kaliber ehométerrel elemezzük, A kereskedelmi forgalomban levő ellen anyagok csökkent kötődését úgy értelmezzük, mint annak jelzését, hogy a vizsgált ellenanyag ugyanahhoz, vagy egy átlagoló epitophoz; kötődik.
A BIAcore-ral és FACS-szal végzett kompetíciós elemzés azt mutatta, hogy a 21,4.1 monoklonálls ellenanyagok által felismert epitop átfed az EA5 ellenanyag által felismert epitoppal, nem fed át a kereskedelmi forgalomban levő LÖB7/5 ellenanyag által felismert ellenanyaggal, és nem fed át a CD4ÖE-hez való kötődés helyéért. A többi ellenanyag által felismert ephopok ál fednek a CD4()L--hez való kötődés helyével,
A 22. táblázatban összefoglaljuk ezeknek az epitop klasszifikációs vizsgálatoknak az eredményeit.
Néhány, a találmány szerinti anti-CD40 ellenanyag UlAcore kompetíciós epitop klasszihkáeíóia
EA5 i 5C3 : LQ37/6 j: 3.1.1
21.4.1 ί 23,21 ;8
LOB?
·'*> *< 4 OU..I 1 21.2.1 2P 1 1 23.5.1 : 23.29.1 X X
1 21.4.1 X X χ 1
: 23.25.1 | 23.23,1 : 24.2.1 X X X X
: CD40L | X j X :| X X X X
7, Példa
A felsőm molekulák felerősítése ann-€P40 ellenanyagokkal
Teljes vér esszét hajtottunk végre, hogy meghatározzuk. a találmány szerinti humán anti~CD4Ö ellenanyagok fe:terostnk--e a felszíni molekulák expressfeoját 8~sejíeken.
Humán vagy főemlős teljes vért: ki arányban hígítunk RPMI táptalajjal,, és 24 őrá hosszat különböző koncentrációjú CD40 agonista ellenanyagokkal vagy kontroliokkal iokubáijuk. A sejteket 30 percig festjük (jégen, sötétben) HLA-DR, ICÁM, BT-!., 07-2, CD19/CD20, CD40, CD23 és CD71. ellen, kereskedelmi forgalom··
-»» -»*··.·* * φ» * Φ. φ ΦΦ φ: φ
Α4» ** t « Í '*» *Φ Φφ ♦Φ banlevő Ooorokrommal jelölt ellenanyag reagenseket használva, A sejteket azután egy FACS-kaliberen elemezzük (Beeton Bmkinsonj, A B-sejteket a. CDI 8 vagy CD20 pozitív sejtek Lapozásával, és az erre a kapura megbatározott aktíváié markerekkel azonositjnk.
A fteoreszceneía középérték maximális növekedését (< I ag/ml ellenanyagnál) és a találmány szerint igényelt anti-CD40 ellenanyagok (21..4.1) használ;atával kapott ECso középértékeket a
23. táblázatban matatjuk be...
23. Táblázat
A B-sejt felszíni molekulák felerősítése egy, a találmány szerinti antí-CD40 ellenanyaggal
Maximálisan hányszorosára növekedett ECso (ng/ml)
i l. . . .... ... átlag ± st. dev. átlag ± st, dev.
: MHCII 4.50 ± 0,520 3,85 ± 0,35
j CD71 2,30 ± 0,77 0,73 ± 0,28
) ICÁM 4,52 12,42 15,3 ± 7,3
CD23 69.9 ± 25,8 19,0 ± 4,4
87-2 2,74 ±0,14 16,0 ±21,9
Annak meghatározására is végeztünk kísérleteket, hogy a találmány szerinti humán antí-CD4Ö ellenanyagok vajon felerősítike a monodra eredetű dendrites sejtek felszíni molekuláinak expresszióját.
A monoéba eredetű dendrites sejtek: készítése
Périferiáks vért: veszünk normál önkéntesekből A mononukleáris sejteket Sigma Accuspm csövekkel ($t koma, MO) izoláljuk, RPMI táptalajjal mossuk (Gibco BEL, Rockville, MD}, majd szövettenyésztő lombikokba tesszük, SXÖé/ml sűrűségben., kompién RPMI táptalajban (amely 100 E/ml penicillint/sztreptomicínt, 10 mmol/l HEPES puffért, 2 mmol/1 glutamint, 0,1 mmol/1 nemesszenciális amínosavakát tartalmaz, mindegyik a Gibco BRL-től származik), ami 10% borjúmagzat szérumot tartalmaz (Hyclone,: Logan Utahk Három óra hosszat inkubáljuk 37 *C-on (5% CO2), ezután a le nem tapadt sejteket eltávolítjuk, és a. T-sejteket szelekciós oszlopokkal izoláljuk (RősD Systems, Minneapclis, MN). A letapadt sejteket EPMJ táptalajjá: mossuk, és 7 napig komplett RPMI táptalajban inkabáljuk, amely 10 ng/ml interleukin-4-gyel (R&D Systems) és löö ng/ml granuloeita makrofág tefepserkentó faktorral (R&D Systems) van kiegészítve. A le nem tapadt sejteket azután izoláljuk, mossuk, és monocita eredetű dendrites sejtekként fmDC-k) használjuk az összes kísérletben. A többi letapadt sejtet. irípszm/BDTA kezeléssel eltávolítjuk, és letapadt monocitákat használó kísértetekben alkalmazzuk.
Annak meghatározására, hogy a. találmány szerinu antiCD40 ellenanyagok feleröskík~e a sejtfelszíni markerek expresszióját, a monocíta eredetű dendrites sejteket különböző koncentrációjú agonista ellenanyagokkal inkubáljuk 48-72 óra hosszat, majd megfestjük (30 perc, jégen, sötétben): HLA-BR, ICÁM. B7-1, B7-2. CD40 és CDS3 ellen, kereskedelmi forgalomban, levő, Suorokrömmal jelzett elenanyag reagenseket használva. A. sejteket azután egy FACS-Caliber-en ÍBecton Dtekmson) elemezzük.
A Suoreszeeoeía. középérték maximális növekedését (< 1. üg/ml eifenanyagnál) és a találmány szerint, igényelt anti-CE40 el184 faanyagok (21.4.1) használatával kapott ECso középértékeket a
24. táblázatban mutatjuk be.
24. Táblázat
A dendrites s^tfelszíní molekulák felerősítése egy, a találmány szerinti anb~€D4Ö ellenanyaggal
Maximálisan hányszorosára növekedett ECfv mg/mlj
átlag ± sí. dev. átlag ± sí. dev..
MHCJI 7,7 ± 5,6 252 ± 353
CDS3 36,3 ± 42,2 233 ±262
)CAM 104 ± 4.8 241± 140
B7-2 21,9 ±9,4 71,4 ± 44,4
Hasonló kísérleteket végeztünk 8~sejíekkel és mDC-kkel, különböző, a találmány szerinti .anti-CD4ö ellenanyagokat és további markereket használva. Mértük a B-sejtek feferinén levő molekulák (MHC-ll. ICÁM, 87-1. B7-2 és CD23) expressziójáí, az: előzőkben ismertetett módon, de az antí-CD-40 ellenanyagból 1 pg/ml-é használva. Ennek a kísérletnek az eredményeit a 25. táblázatban mutatják be. 72 óra ekekével mértük a dendrites .sejtek, felszínén levő molekulák (MHC-Π, ICÁM, 87-1, B7-2 és CD83) expresszióját, az előzőkben ismerhetett módon, de az antí-CD40 ellenanyagból 1 gg/ml-é használva, Ennek a kísérletnek az eredménxeit a 2b. táblázatban matatjuk be. A 25. és 26. táblázatban, az intenzitás középériékét ± standard deviáció mutatjuk be.
B-se
25. Táblázat felszínén levő molekulák felerősítése a taláteánv •85 fcf fc fcfc
fcfc*·» fc * *
fc fc ♦fc*·
* fc· *·Μ·
A dendrites sejtek felszínén levő molekulák felerősítése a
186
X,V'
A 27. táblázatban a sejtfelszíni molekulák felerősítését hasonlítjuk össze a dendrites sejtekben, a B-sejtekfeez vfezoxiyitva. azt hasonlítva össze, hagy a növekedett a dendrites sejtekben a B-sejtekhen mért növekedéshez viszonyítva.
27. Táblázat rfelszíni molekulák felerősítése a dendrites sejtekben.
a B-sejtékkel összehasonlítva
(CD8Ö1 B7-2 (€0861 MHCH-es i osztály i ICÁM j (CD541
3.1.1 1,08 19,40 1.38 | 1,15
21.2.1 1,01 7,37 1,49 | 1,12 1
21.4.1 0,77 7,04 1,37 | 0,74 j
222.1 L18 16,35 1,51 i 2 .4,4
23.52 8,83 10,54 1,59 | 1,06
23.25.1 0,66 2,57 0,85 | 0,98 I ϊ
23.28.1 0,71 10,81 2,16 | 2,57
: 23.29.1 0,73 9,07 1,66 | 1,23 ΐ !
24.2.1 3,48 52,30 2,64 | 1,35 J
7, Példa
A cl tokin-szekréció fokozása
Mormolta eredetű dendrites sejt esszét hajtunk végre, hogy meghatározzuk., vajon a. találmány szerinti humán anti-CD40 elIS?
XI * ú hv
lenanyagok fokozzák-e az ÍL~ 12p40, il-12p7Ö és az IL-8 szekrédA monocita eredetű dendrites sejteket és a letapadt 201«tákat az előzőkben ismertetett módon állítjuk elő. A sejteket a találmány szerinti and-CD4G ellenanyag: <21.4.11 jelenlétében, vagy egy anti-fárökagyló· hemodanín íkLHl ellenanyag, mint negatív kontroll jelenlétében tenyésztjük, A ciíokineket 24 óra elteltével & folüfoszőkban mérjük EO8A~val -(R&B Systems/ Néhány vizsgálatban (lásd. a 28. táblázatöt); az ellenanyaggal kezelt monocita eredetű dendrites sejteket ko-stimcááijuk, vágj' 100 ng/ml EPSszel (Sigma/ vagy 1ÖÖÖ S/rnl fFNy-val. vagy 25 ng/ml interleuklnΙβ-νηΙ sR&D Systems).
Az antl-CB40 ellenanyag fokozza az ib-!2:p40, 1L-Í2p7ö és az IL-8 termelődését, mind a monocita eredetű dendrites sejtekben, mind a. letapadt monocltákbart. Az LPS jelenléte tovább fokozza az Ib-12p4G>; IL-!2p70 és az. IL-8 termelődését. Az ízotípns kontroll ellenanyaggal, az anti-KLH-val inkubált dendrites sejtek felüld szóiban a cuokíneknek csak minimális szintje volt kimutat ható, A reprezentatív eredményeket a 28. táblázatban, valamint a 3. és 4. ábrán mutatjuk be. A 28, táblázatban 1 ng/mi találmány szerinti an ti-CD40 ellenanyaggal (21.4,1) ± 100 ng/ml LPS-szel kezeit dendrites sejtek vagy letapadt monociták által termelt alap cítokinek mennyisegét mutatjuk be. Amint az a 3. ábrán látható, az anri-CDAO ellenanyag fokozza a humán dendrites sejtek IL12p40 termelését, A 4, ábra bemutatja a humán dendrites sejtek fokozott IL~12p70 termelését ellenanyag és 100 ng/ml EPS jelenlétében,
28. Táblázat
Az ík~í2p40> !L-12p70 és az IL-8 szekréciójának: a találmány szerinti anti~ÜD40 ellenanyaggal való fokozása
Keselés Indukált cítokin
Sejttípus Ellena- nyag 1 K/sá LPS 100 ng/ml IL~12p4ö pg/ml IL-12p70 pg/ml 1L-8 pg/ml
Dendrites sejt 21.4.1 322b2 1000 »
21.4.1 - 1200 76 1200
antí-KLH ü- | 14280 352 ND
anti-KLH - 200 4 150
Letapadt monocita 21.4.1 ND ND 7000
21.4.1 ND A25 ND
antí-KLH r ND ND 400
anti-KLH - ND 30 ND
ND “ nincs meghatározva
Hasonló kísérleteket végzünk több, a találmány szerinti antíCD4Ö ellenanyaggal, A monodra erederö dendrites sejteket az előzőkben ismertetett módon állítjuk elő, és különböző koncentrációjú anti-CD40 ellenanyagok jelenlétében tenyésztjük, valamint 100 ng/ml LPS-szel fSigma) kc-stímulá|uk. Az: !L~12p7D-et 24 óra ekekével ELÍSA-va! (R&D Systems) mérjük a íelulúszóban, és mindegyik. ellenanyagnak meghatározzuk az ECso értékét. A kísérletek eredményeit a 29. táblázatban mutatjuk be.
29. Táblázat . : ί ·· : : ;
χ * H Φ ♦· ·- * *
Λ#*ί ** ·*· **
Az IL- 12ρ70 szekréció fokozása, dendrites sejtekben
: Ellenanyag klón D€ít-12p70
ECfoo mg/ml Max pg/ml
21.4.,,1 0,3 1796-7004
22.1.1 0,1 720-1040
23.25.1 •7V 1 0,2 η i 540-960
24.2.1 U,I 0,2 o/o-ii i 754-3680
3.1.1 0,2 068-960
23.28,1 0,2 1332-1404
23.29.1 <1 852-900
21.2.1 0,03 656-972
Vizsgáltuk emellett a találmány szerinti an<í-€D4<> ellenanyagoknak azt a képességét Ís,: bogy fokozzák-e az IFNy T-seja tekbói való szekrécióját egy allogén T-sejt/dendrites sejt esszében,. Ennek az esszének a végrehajtásához T-sejtekeí és monoeitákaí izolálunk egészséges önkéntesek perifériális véréből, A monucitákat dendrites sejtekké diferenciáltatjuk, az előzőkben ismertetett módszereket alkalmazva., Az egy «gyedből kapott l ^lö5 Tsejtet. 1* 1.07 egy másik egyediéi nyert dendrites sejttel tenyésztjük, egy, a találmány szerinti anti-CD40 ellenanyag vagy egy kontroll ellenanyag jelenlétében. Négynapos tenyésztés után a felüld szóknak ELISA-val vizsgáljuk az IFNy szekrécióját. Ennek az esszének az eredményeit a 30. táblázatban mutatjuk be.
30. Táblázat
Az IFNy szekréció fokozása a találmány szerinti anti- CD40 ί»
Φ·.«. Φ* *« · « *· ’ φ χ «. χ ♦- *·* * φ $ φ φ ♦ φ ♦ «*»:* ** ♦♦ *** '
— ! Ellenanyag kién AlloDC/TlFNy
ECsj mg/ml Max pg/ml
21.4,1 0,3 212
223,1 0,3 110-180
23.25.1 0,3 180-232
23.5.1 0,2 150-240
24.2.1 0,2 111,394
333. 0,1 100-19S
23.28.1 0,2 120-190
23.29.1 0,3 134-150
21.2.1 0,03 230-256
Gymiadásos ek Ínciukdőia a t szeonti ami ellenanyagokkal
A 10,83, 15.1.1, 213.1 és 3.1.1 ellenanyagokat egy, Wing és munkatársai által ismertetett teljes vér cítokin felszabadulási esszében vizsgálok fWing, és mtsai: Tberapeutíc. Immunoi, 2, 183-90 (1995)], annak meghatározására, hogy a gyulladásos citokin eket az ellenanyagok 1, 10 és 100 ug/ml koncentrációban induk&lják-e. Ezeknek az ellenanyagoknak a jelzett koncentódóiban nem volt megfigyelhető a TNFot ínterieukin-1 β, IFNv vagy interleukin-6 srigniikáns kibaesátása 19 normál donor vérében.
Mkfflbá
A >Jy sejtvonai immtmogemrásának fokozása anti~C.D40 eilenanvagokkal χψ Jt« *·♦ >♦ * ♦* φ· φ φ ♦· ·* *·* ·*· *· .· s ί *. υ : * :
-.,.» ·«♦:♦ ··
CD4ü pozitív JÍYOYE sejteket (ATCC OCX 87) (.,Jy sejtek”) tenyésztünk és tartunk fenn RFMl táptalajban. A JÍYOYE sejteket. 24 óra hosszat inkübáljuk egy, a találmány szerinti antl~€D40 ellenanyaggal (21.4,4), vagy egy azonos Izoripusű ellenanyaggal (anti-RER), komplett REMI táptalajban. A sejteket azután mossuk, és 60 percig 25 mg mitomtcin C/ 7 ml táptalajjal mossuk. Ezeket a sejteket azután 6 napig 37 X-on (5% €Oy izolált T-sejtéfckel ínkubáljuk 1:100 arányban. A sejteket azután összegyűjtjük, mossuk, és a CTL aktivitás szintjét ismét meghatározzuk friss krém 54-gyei (New Eogland Nuciear, Roston, MA) jelzett JÍYOYE sejtekkel. A specifikus CTL aktivitást a következőképpen számítjuk ki:
%-os spedükusdtcárés^GJy citolízis (cpm)-spontán dtoíms (cpm))/ (dssz-citohzis (cpm) - spontán ckolhis (cpm)).
Amint azt az 5. ábrán bemutatjuk, egy, a találmány szerinti anti-CD40 ellenanyag (21.4.1) szignifikánsan fokozza az immunogenitást az ellenanyaggal kezelt Jy sejtekkel szemben.
;Mld<ünnprm2áell .Althoz, hogy tovább vizsgáljuk a találmány szerint előállított nnü~CD4ö ellenanyagok turnorellenes aktivitását, egy SCID-bézs egér modellt terveztünk, hogy vizsgáljuk az ellenanyag in otoo hatását a. lumotnövekebésre.
A SCID-bézs egereket a Charles Kiver-tö! vettük, és a felhasználás előtt egy hétig hagyjuk akkiimauzálndní. Tumorsejteket (Daudi sejtek (ATCC CCL 2131, CD40)-)E562: sejtek (ATCC CCL 243) és CD40(4·) Raji sejtek (ATCC CCL 86), RT474 emlőrák sejtek,: (ATCC ÖT8 2öj vagy PC-3 prosztaxasejtek (ATCC CRC 1435)) szubkután Injekeiözunk K1Ü7 sejt/ állat koncentrációban, Néhány :♦·:
192.
esetben ugyanabból a humán donorból származó 5'*lös T-sejíet és 1*10? dendrites sejtet injekciózunk a tumorsejtekkel együtt. Egy, a találmány szerinti antí~CD40 ellenanyagot, vagy egy azonos botipusü kontrolt (antl-KLH) is injekciózunk intraperkoneáksan. közvetlenül a tumor mjekeiozása előtt (csak egy injekció). Ezután mérjük a tumor növekedését. A specifikus kísérleteket az alábbiakban ismertetjük,
Az egyik kísérletben közvetlenül a tumor injekciózása előtt (csak egy inj ekeid) egy, a találmány szerinti anti-CD4Ö ellenanyagot (21.4.1). vagy egy azonos izotípusü kontrollt fanti-KLH) injekciózunk iutraperítöneáksan, 10 mg/kg dózisban, A tumorsejteket szubkután injekciózzuk ImKF sejt/állat koncentrációban, A tumor növekedését tolómérővel. mérjük & beültetés utáni 17.,. 19.,.
20,, 21., 25., :26,,. 27. és 28. napon, humán T-sejtek és dendrites sejtek jelenlétében. Amint az a 6, ábrán látható, az anti~GD4ö ellenanyag körülbelül 60%-ha.n gátolja a tumor növekedését.
Egy másik kísérietben egy, a találmány szerinti anéi-€D4Ö ellenanyagot (21.4.1), vagy egy azonos izotípusü kontrollt (antíKLH) injekciózunk intrapehtoneálisan, 0,1 mg/kg, 1 mg/kg vagy 10 mg/kg dózisban, közvetlenül a tumor injekciósása előtt (csak egy injekció). A tumorsejteket (&S62 sejtek) szubkután injekciózzuk 1*107 sejt/állat koncentrációban. Ebben a kísérletben ugyanabból a humán donorból származó T-sejteket (5*10*) és dendrites sejteket (]*Ι05) injekciózunk a tumorsejtekkel együtt. A tumor növekedését tolómérővel mérjük a beültetés utáni 17., 19.,
20,, :21,,, 25,, 26., 27. és 28. napon. Amint az a 7. ábrán látható, az- anti-CD40 ellenanyag körülbelül 65~8S%~ban gátolja a tumor növekedését.
Egy másik kísérletben egy» a találmány szerinti anti-CD4ö ellenanyagot (21.4,1. 23,29.1 vagy 3,1,1] vagy egy azonos izotípusú kontrollt :(anti-BXH| injekciózunk íntraperitoneáksazp közvetlenül a tumor injekeíózása előtt (csak egy injekció). Az azonos izedpusú kontroll ellenanyagot és a 21.4.1 ellenanyagot 1 mg/ml dózisban Injekciózzuk, A 23,29.1 és 3.1.1 ellenanyagot 1, 0,1, 0,91, 3,001 vagy 0,0001 mg/kg dózisban injekciózzuk. A tumorsejteket (K562 sejtek) szubkután injekciózzuk» ΙχΙΟ7 sejt/állat koncentrációban. Ebben a kísérletben ugyanabból a humán donorból származó T-sejteket (5^109 és dendrites sejteket íl*1ÖQ injekciózunk a. iumorsejlekkel együtt. A tumor növekedését tolómérővel mégük a. beültetés utáni 28, napon. Ennek a kísérletnek az eredményeit a 8, és 9. ábrán mutatjuk he. Az ábrán minden egyes pont egy-egy állatból végzett mérést reprezentál.
Egy másik kísérletben egy» a találmány szerinti asö-CD40 ellenanyagot (21.4 I). vagy egy azonos izonpnsu köntrollt (antiKUf) injekciózunk iniraperitoneálisary közvetlenül a tumor injekciózása előtt, (csak egy injekció). Az: ellenanyagokat 1. 0,1, 0,01, 0»Ö01 vag>' 0,0091 mg/kg dózisban injekciózzuk. A tumorsejteket (Raji sejtek) szubkután injekciózzuk, Ή107 sejt/állat koncentrációban, Ebben a kísérletben ugyanabból a humán donorból származó T-sejreket (5z 108 és dendrites sejteket (klöN injekciózunk a tumorsejtekkel együtt. A tumor növekedését tolómérővel mérjük a beültetés utáni 28, napon. Ennek a kísérletnek az eredményeit a 10. ábrán mutatjuk be. Az ábrán minden egyes pont egy-egy állatból végzett mérést reprezentál,
Egy másik kíséri etben egy, a találmány szerinti anti-CD4Ö ellenanyagot (21,4,1, 23 28 1, 3.1.1 vagy 23.5,1). vagy egy azonos ízotípusú kontrollt Íanti-KLHl injekciózunk íntraperítoneálísan.
közvetlenül a tumor injekdözása előtt (csak egy injekció). Az ellenanyagokat 1 vagy 0,1 mg/kg dózisban injekciózzuk. A tumorsejteket (Raji sejtek) szubkután injekciózzuk, IvXCR sejt/állat koncentrációban. A tumor növekedését tolómérővel mérjük a beültetés utáni 28, napon. Ennek a kísérletnek az eredményeit a 11. ábrán re utánuk be. Az ábrán minden egyes pont egy-egy állatból végzett mérést reprezentál
Egy másik kísérletben egy, a találmány szerinti anti-CD40 ellenanyagot (21.4.1, 23.29.1 vágj’' 3.1,1/ vagy egy azonos izotípusü kontrollt (anti-KLH) injekciózunk íntraperitoneálisan, közvetlenül a tumor mjekdőzása előtt (csak egy injekció/ Az ellenanyagokat 1 mg/kg: dózisban injekciózzuk. A tumorsejteket (ST474 emlőrák sejtek) szubkután injekciózzuk, H1Ö7 sejt/állat koncentrációban. Ebben a lösérfethen ugyanabból a humán donorból származó T-sejteket <5*lö5) és dendrites sejteket (lx10;5j injekciózunk a tenorsejtekkel együtt, A tumor növekedését tolómérővel mérjük a beültetés utáni 39. napon. Amint az a 12. ábrán látható, mindegyik ellenanyag gátolja az emlőrák tumor növekedését. Az ábrán minden egyes pont egy-egy állatból végzett mérést reprezentál.
Egy másik: kísérletben egy, a találmány szerinti anü~€B40 ellenanyagot (3,1.1/ vagy egy azonos izotipusü kontrolit (anti-KLH) injekciózunk íntraperitoneálisan. közvetlenül a tumor mjekciózása előtt (csak egy injekció), Az ellenanyagokat 1 mg/kg dózisban injekciózzuk. A tumorsejteket (PC-3 prosztatatenor sejtek) szubkután injekciózzuk, 1*KF zejt/áilaé: konceutráclöban. A tumor növekedését tolómérővel mérjük a beültetés utáni 41. napon. Amint az a 13, ábrán látható, az anü-CD4Ö ellenanyag: körülbelül 6ö%Í95
bán gátolja az emlőrák tumor növekedését Az ábrán minden egyes pont egy -egy állatból végzett mérést reprezentál.
12. Példa
A Dau< ttmapr^te|feL.Mg^á^a..ég. a, teíá^árm..sgennh..anhCD40 eUenanvaggabkezelt SCID-bgzs egerek túlélése
Egy másik kísérletben egy, a találmány szerinti snfúCBsO ellenanyagot, vagy egy azonos Izotípusú kontráit (antí-KLH) injekciózunk. inéraperiioneálisas,. közvetlenül a tumor iryekelózása előtt, (csak egy injekciók Az ellenanyagokat 1 vagy 0.1 mg/kg dózisban injekciózzuk. A tüm-orsejteket (Daudi sejtek) intravénásán injekciózzuk, M0& sejt/állat.: koncentrációban. Ezután követjük az állatok túlélését. Amint az a 14. ábrán látható, az összes vizsgált anri-CD40 ellenanyag legalább hat nappal meghosszabbította, a. tumorokkal injekciózott egerek túlélését.
A 31. táblázatban felsoroljuk az anti-CDAÖ^ ellenanyagoknak a 11. példában ismertetett szolid tumorokban mért. BDm értékét. A. 31... táblázatban összefoglaljuk néhány, a találmány szerinti ann-CD40 ellenanyagnak SCID egerekben in fonó mért tumorellenes aktivitását,. Emellett, a táblázatban felsoroljuk az antl~CD4ö ellenanyagoknak az előző, 12, példában ismertetett Danái szisztémás tumor modellben kapott E-Dso értékét.
31. Táblázat
A találmány szerinti antí-CD40: ellenanyagok EBso értéke, különböző m ofoo tumor modelleket használva SÓD egerekben
5 Ellenanyag CD4ÖÍ-) CD4ö(*j CD40(D CD40H
K562 ős Raji ős Raji Danái
1 T/DC szab- T/DC szűri- szafeknlán intravénás
* * * * φ «: -χ « Φ ♦ ♦♦·* *♦ **
Bt
kután jmg/kg) kután (mg/kg| (mg/kg) (mg/kgj |
21,4.1 0,003 0,0008 0,016 0,1 1
22.1,1 0,01 ND >1,0 <w 1
1 23.23.1 >1,0 ND >1,0 ND |
23,5.1 >1,0 ND >1,0 ND
24.2,1 >1,0 ND >1,0 »
3.1,1 0,02 ND >1.0 <1, 0
1 23.28.1 >00 ND >1,0 0,1
9 a po ΐ 0,008 ND >1,0 <1,0
21,2.1 <1,0 ND ND ND
ND~nincs kísérlet
«ssa .atározása BIAcore-ral
Tisztított elten anyagok affinitás-mérését hajtottuk végre felszíni plasmon rezonanciával, a BlAcore 3000 berendezést használva, a gyártó utasításai szerint,
A Biosensnr bio specifikus kölcsönhatási efemzés berendezése (B1 Acnrej fel színi plasmon rezonanciát alkalmaz a molekuláris köfesönbatásetenak egy CM5 szenzoron való mérésére,, Á két anyag, üveg és karhozímetiiezett dexírán között a fénytörés változásait - amelyeket a molekulák közötti kölcsönhatás okoz a szenzor effip dextrán oldalán ··· mérjük, és tetszőleges fénytörési egységekben ÍRU) fejezzük ki, amint azt a gyártó alkalmazási leírásában részlegesen megadják.
Egy érzékelő chipen egy áramlási cella karboximetilezett dextrán oldalát aktiváljuk, oly módon, hogy hétperces, 0,2 m.ol/1 **** Y ** * *: 2 »’ »· t » .♦· í :. . * * » ·λ:-χ-χ. ** *» **♦ *φ
N-etil-N'~(dimoLilaminopropil)karbodiimíddel végezve a reakciót 0,05 mol/l N-hidroxiazukcmimides származékot készítünk. 5 gg/ml CD4ö-l.g fúziós fehérjét (amit az 1. példában ismertettünk) 10 mntol/l nátnum-aoetátban ρΗ=3,5· injekciózunk manuálisan 5 μΐ/pero sebességgel az áramlási cellába, és kovalens kötéssel immobilizáJjuk a sejt felszínéhez, a kívánt mennyiségű Eb-kkaL A ncnr-re agáit N-hídroxíszukcinimíd észterek dezaktlválását 1 mol/l ctanoiamin-hidrokloríddal fpS~8,5) hajtjuk vegye. Az Immoblllzálást kővetően az áramlási cellákat megtisztítjuk minden nemreagált. vagy gyengén megkötött anyagtól, 5 regenerációs ínjekcí óval (5 μΐ 50 m.mol/1 nátrium-hidroxid), ameddig stabil alapvonalat kapunk. A 2-es áramlási sejt, egy nagysűrúségű felszín, körülbelül 300 Rü-t mért a felszín elkészítése után, és a 3-as áramlási cella, egy alacsony sűrűségű felszín, körülbelül ISO EO~t mért. Az 1-es áramlási cellához az aktívák üres felszínre 35 pl 10 mmol/1 nátrium-acetát puffért injekciózunk az ímmobilizálás során az antigén helyett. A 4~es áramlási cella az immobilizátt CTíAA-Ig-ből, egy irreleváns antigén kontroliból körülbelül 450 RU~t tartalmaz.
Az egyes ellenanyagokból hígítást sort készítünk, 1ÖÖ pg/ml és Ö:,l ug/ml között, fél logaritmusokban. Az áramlási sebességet 5 fo/perore állítjuk, és az egyes koncentráció mintákból 25 μΙ-t injekciózunk az érzékelő chipre. és minden egyes injekciózott ellenanyag koncentráció között 5 μΐ SO mmol/l-es nátrium-hidroxid regeneráló oldatot injekciózunk. Az adatokat BlAevaluatíon 3.0 programmal elemezzük.
A fordított orientációjú kinetikai kísérletekben a 21.4.1 ellenanyagot az érzékelő chíp felszínére immobilizáljuk, az előzőkben ismertetett protokollt használva. Antí-KLO-t használunk kontroll η;* Ah Α.» ’ Έ* X η 5 ellenanyag felszínként, Az antigént, a CD40-lg fúziós fehérjét 1000,1 pg/mhkoneéufeáeíóÁarúmaáuyhan írgekciözzuk.
A 32. táblázatban a találmány szerinti reprezentatív autiCD4Ö ellenanyagok affinitás-méréseit soroljuk fel.
32, Táblázat
A találmány szerinti a.nti-CB4ö eifenanyagdk affinitás-mérései
Ellenanyag ΚσηΠ/Ms) K«n (1 /7 K> (Ak
3,1.1 1,12*10» 3,31*10-® 3,95* lö15
10.8,3 2,2270® 4,48 xlO-7 2,23*10-52
15,1.1 8,30* KP 2,83x10-7 4,05*10-97
21.4.1 8,26*109 2,23*10-» 3,48x109*
22.1.1 9,55x10® 1,55x10-9 2,797.0^
23.25.1 3,3837 ö5 1,05*10- 7,78x10-5 2
23.28.1 7,30*10» 8,11*10-5 1,61*10-5«
23.29.1 3,547.0® 3,90*10» 7,04x10-5 5
.IX Példa
A kötési esszéket. Protein A-val. tisztított C.D40 humán IgGl Fe fúziós antigénnel hajijuk végre, A. humán CD4Ö-lgG 1 Fe fúziós fehérjét a Ffizer-nél klónozták. A humán CD40 IgGl fúziós fehérjét emlős sejtvonalban exnresszáltatjuk, és Protein A oszlopon tisztítjuk, A fúziós antigén tisztaságát 8DS/PAGE--val állapijuk meg,
A CDAÖ-oek egy tipikus Fes típusú trwszmembrán fehérje struktúrája van. Az érett molekula 277 amino savból áll, A CD40 extracelinláris doménje négy TNFR-szerű, fesztemben gazdag doménból áll Pelsmith és Sprang; TJBS 23, 74-79 11998); van ί t.
Kooten és Banehereau: d. Leuköcyte Biot 67, 2-17 és mtsai: RMSO Journal 8, 1403-1410 0 9891
Az anú-CD40 ellenanyagok kötődése redukált és nem-redukált
Mivel a CD40 extraeellnlárís doménje négy eiszíeinfeen gazdag doméufeöl áll ezért az intramnlekuláris kötéseknek egy redukáld szerrel való felbontása megváltoztathatja az ellenanyag reakcióképességét. Annák meghatározására, begy az kslramolekulárls kötések egy redukáló szerrel történő felbontása megváltoztatja-e a találmány szerinti kiválasztott mü~GB4ö ellenanyagok reakcióképességét, öszölett CIMÖ-felgG-t töltünk SBS/PAGE-re 14-200. gél) nem-redukáió ÍNR) vagy redukáló (R) körülmények között. Az SBB/RAGE-t Laemmlí módszerével hajtjuk végre, egy mini-gél rendszert használva. Az elválasztott fehérjéket nitroeelluiöz membránra Ossz ük. A membránokat az előhívás előtt legalább 1 ára hosszat 534 zsírmentes tejport tartalmazó, foszfáttal puöerelí sóoldattal blokkoljuk, majd 1 óra hosszat vizsgáljuk az egyes ellenanyagokkal. Az. anli~CD4Ü ellenanyagokat: HRR-vel konjugált kecske anti-humán immunglobulinokkal. mutatjuk ki (l:80Ö0~es hígítás, katalógusszám A-8667, Sigmab A membránokat erősített kemdumineszeencíával (ECL, Amersham Bfoseiencej hívjuk elő, a gyártó utasításai szerint.
A Western biottot azután négy, a találmány szerinti andCD40 ellenanyaggal vizsgáljuk áh 21.4.1, 23.25,1, 23 29 J és
24,2.1 (.1 pg/mD, majd HRP-vel konjugált kecske anti-humán IgGt: használunk il:800Ö~es hlgkásj. Ennek a kísérletnek az eredményeit a 15. ábrán mutáljuk be. Az eredmények azt mutatják, hogy a 21,4.1, 23.2S.L, 23.29.1 és 34.2,1 ellenanyagok kötődnek a un
Μ * Φ
S J ♦ ♦ Φχ.
nem-redukált, de nem kötődnek a redukált CD40-hez, lenanyagok egy konformációs epMopot ismernek fel..
tenat az d
Az anti-CD40 eSenanyagok kötődése a barnán CD4Q, doménA CD4Ö extracelluláris régiója, négy WFR-szerú ismétlődő doménr tartalmaz (ezek jelölése D1-D4) )lásd Neismith és Sprang: TIBS 93, 74-79 (1998); van Eooten és Saneerea.u: 3, Leukocyte Biok 67, 2-17 (2Ö0Ö); Stamenkovic és mtsai.: EMBö Journal B. 1403-1410 (1989)1. A 16. ábra mutatja az egér és ember D1-D4 CD46 doméneket. Ahhoz, hogy vizsgáljuk a CD40 molekula különböző régióinak az epitop prezentálásához való hozzájárulását» számos demén-deléeiós mutánst állítunk elő.
Ahhoz, hogy e&é tsúk. a humán CD4Ö deléciós kon.strukdókat, a humán CD40 teljes extraceüulárís doménjét (1- 193-as aminosavák) polimeráz láncreakcióval amplifikáljuk humán B-sejt (CD 19+) cDNS-hől (Mulííple tíssue cDNA panelek, katalógusszám. K142B-1, a öonteoh-töl) ssekvencía-speciükus prímeteket használva, és egy Sx'His jelölést adunk a C-termínálishoz. Egy humán CD40 5' prímért. [5'-GCAAGCTTGACCAOGGWGGTCTGCCTCTGCAGTG-3’(135. számú szekvencia)) használunk 3’ primerek különböző kombinációival, a teljes hosszúságú vagy csonkított CD40 molekulák ktönozására, A humán CÖ4Ö teljes hosszúságú extracefciáris doménjének klónozásához használt 3 primer a következő: S'-TCAGTGATGGTGATGGTGATGTCTCAGCCGATCCTGGGGACCA-3' (136. számú szekvencia). A humán CD40 D.1-D3 doménjeinek klónozására használt 3’ primer a. következő: 5'-TCAGTGATGGTGATGGTGATGTGGGCAGGGCTCGCGATGGTAT-3' (137. számú szekvencia). A CD40 D1-.D2 doménjeinek klónozására hasz201 φΧX * * * φ Φ » * * * » «.· -* -* ·* * '* * >♦·*·:♦ «·» '*·* η alt 3' primer a következét S'-TCAGTGATGGTGxATGGTGATGACAGGTGCAöATGGTöTCTGTr-S' (138. számú szekvencia^. Miután ezeket a CD4Ö cDNS konstrukciókat előállítottuk, 293F sejtvonalbsm expresszáljuk, a. pCR3.1. vektor (ínvitrogenj használatával
A CD40-6XHÍS fúziós féhériéfeet elúció előtt nikkel osí

Claims (1)

  1. A humán CD40 deléciós konstrukciók expresszálására a konstrukcíókut a pCR3.1 vektorba (Invitrogen) klónozzuk, majd expressziójukat különböző stabilan és ideiglenesen teanszfektáh 293F sejtvonalakhan állapítjuk meg. Az ideiglenes transzfektált 293F sejtekből származó feiülüszőknak ELISA-val és Western bloteal vizsgáyuk a. 21.42, 23.25.1,: 2X292 és 24.2,1 ellenanyagokhoz való kötődésüket.
    Az BLISA esszéket, előre kialakítjuk, a különböző CD4Ö konstrukciókkal transzfefctált 293F sejtek: félűiüszőmok használatával, Az ELI8A lemezeket ELISA lemezbevonó puhérben 1 pg/ml-re hígított. kecske anthfaomán CB4Ö poiiklonális ellenanyagokkal fRő&D katalógusszám AF 632c vagy kecske anti-egér CD40 poiíklonáhs ellenanyagokkal 1RXD katalógusszám AF 440) vonjuk: be, A CD40 konstrukciók: 293F sejtekben való expresszióját bíotinílezett kecske antí-hunián CD4Ö (R&D katalógusszám BAF 632). kecske anti-egér CD40 (R&D katalógusszám BAF 440), vagy HRF-vel konjugáít antblife (C-termináls) ellenanyaggal (Invitrogen, katalógusszám 46-0707) mutatjuk ki. Az anti-CD40 humán ellenanyagok kötődését 1:2000 arányban hígított, HRR-vel konjugálí kecske anti-bumán IgG-vei mutatjuk: kí (FC specifikus Caltag H IÖ5Ö7). Az eredmények, amint, az a 34., táblázatban látható, azt mutatják, hogy a legtöbb, ha nem az: összes, a 21,42.
    23,28,1 és 23.29.1 monoklonális ellenanyagok által felismert eptep a CD4Ö D1-D2 régiójában van, inig: a 24.22 monoklonális ellenanyag epítopja legalább részben a B3-Ö4 doménben. található, Egy humán CÖ4Ö~nyül Fc fúziós fehérjét használunk: kontrollként, hogy igazoljuk az ellenanyag kötődés specifitását.
    ·*·*· * * * ·> .- « t «« bLTSA; Ellenanyag kötődés a CD4Ö delécíós mutánsokhoz
    Humán CD40 : (Dl-D2)-6><His Humán CD40 pl-D3>-bxHis : Humán CD40- 6*Hís 21.4,1 j 4 23.25.1 4 4· 4 23.29.1 -r j 4 4- 24.2.1 ~ 1 V anti-His anti-Eblg ND ND ND
    A CD4Ö delécíós konstrukciókat Western blottai is elemezzük. .Az eredmények a 35, táblázatban láthatok. Az EOBA eredmények azt mutatják, hogy a 21.4.1, 23.25.1, 23.29.1 és
    24.2.1 ellenanyagok kötőhelye a D1-D3 doniéneket foglalják magukban. Az eredmények azt is mutatják, hogy a 21.4.1, 23.25.1 és 23.29.1 ellenanyagok kötőhelyei a D1-D2 dóm éneket foglalják magukban, és a 24,2.1 ellenanyag kötőhelye a D3 domént foglaiják magukban.
HU0402247A 2001-11-09 2002-11-08 Antibodies to cd40 HU229829B1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US34898001P 2001-11-09 2001-11-09
PCT/US2002/036107 WO2003040170A2 (en) 2001-11-09 2002-11-08 Antibodies to cd40

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP0402247A2 HUP0402247A2 (hu) 2005-01-28
HUP0402247A3 HUP0402247A3 (en) 2012-09-28
HU229829B1 true HU229829B1 (en) 2014-09-29

Family

ID=23370387

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0402247A HU229829B1 (en) 2001-11-09 2002-11-08 Antibodies to cd40

Country Status (47)

Country Link
US (9) US7288251B2 (hu)
EP (2) EP1476185B1 (hu)
JP (3) JP4616555B2 (hu)
KR (1) KR100830086B1 (hu)
CN (2) CN103450360B (hu)
AP (1) AP1918A (hu)
AR (1) AR039067A1 (hu)
AU (1) AU2002356926B2 (hu)
BR (1) BRPI0214137B8 (hu)
CA (1) CA2466128C (hu)
CL (1) CL2009001779A1 (hu)
CR (2) CR7343A (hu)
CU (1) CU23745A3 (hu)
CY (1) CY1115675T1 (hu)
DK (1) DK1476185T3 (hu)
DO (1) DOP2002000507A (hu)
EA (1) EA011449B1 (hu)
EC (1) ECSP045093A (hu)
EG (1) EG25801A (hu)
ES (1) ES2432968T3 (hu)
GE (1) GEP20074222B (hu)
GT (1) GT200200228A (hu)
HK (1) HK1069122A1 (hu)
HN (1) HN2002000318A (hu)
HR (1) HRP20040525B1 (hu)
HU (1) HU229829B1 (hu)
IL (2) IL161823A0 (hu)
IS (1) IS2940B (hu)
MA (1) MA27139A1 (hu)
ME (1) ME00503B (hu)
MX (1) MXPA04004467A (hu)
MY (1) MY137641A (hu)
NI (1) NI200200128A (hu)
NO (1) NO334339B1 (hu)
NZ (1) NZ533180A (hu)
OA (1) OA12725A (hu)
PA (1) PA8557701A1 (hu)
PE (1) PE20030846A1 (hu)
PL (2) PL214289B1 (hu)
PT (1) PT1476185E (hu)
RS (1) RS52484B (hu)
SI (1) SI1476185T1 (hu)
TN (1) TNSN04078A1 (hu)
TW (2) TWI331040B (hu)
UY (1) UY27537A1 (hu)
WO (1) WO2003040170A2 (hu)
ZA (1) ZA200404207B (hu)

Families Citing this family (248)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6943235B1 (en) * 1999-04-12 2005-09-13 Agensys, Inc. Transmembrane protein expressed in prostate cancer
US7244827B2 (en) * 2000-04-12 2007-07-17 Agensys, Inc. Nucleic acid and corresponding protein entitled 24P4C12 useful in treatment and detection of cancer
US20050255106A1 (en) * 1999-05-22 2005-11-17 Linda Diehl Induction of anti-tumor ctl immunity through in vivo triggering of 4-1bb and/or cd40
US20030059427A1 (en) * 2000-04-28 2003-03-27 Force Walker R. Isolation and characterization of highly active anti-CD40 antibody
US7972845B2 (en) 2000-09-07 2011-07-05 Case Western Reserve University Human antibodies against Pseudomonas aeruginosa LPS derived from transgenic xenomouse
CA2658221C (en) 2001-04-27 2012-11-27 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Anti-cd40 monoclonal antibody
US7658924B2 (en) 2001-10-11 2010-02-09 Amgen Inc. Angiopoietin-2 specific binding agents
AR039067A1 (es) * 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
US20040185040A1 (en) 2001-11-21 2004-09-23 Celltech R & D Limited Modulating immune responses
US7618629B2 (en) 2001-11-21 2009-11-17 Celltech R&D, Inc. Manipulation of cytokine levels using CD83 gene products
PT1531850E (pt) * 2002-06-07 2012-05-07 Zymogenetics Inc Utilização de il-21 e anticorpo monoclonal para tratar cancros sólidos
US7052694B2 (en) * 2002-07-16 2006-05-30 Mayo Foundation For Medical Education And Research Dendritic cell potentiation
HN2004000285A (es) * 2003-08-04 2006-04-27 Pfizer Prod Inc ANTICUERPOS DIRIGIDOS A c-MET
DK1680140T3 (da) * 2003-10-16 2011-06-14 Imclone Llc Fibrolast-vækstfaktorreceptor-1-inhibitorer og fremgangsmåde til behandling deraf
PT1682178E (pt) 2003-11-04 2010-10-21 Novartis Vaccines & Diagnostic Métodos de terapêutica para cancros que expressam o antigénio cd40
US8277810B2 (en) 2003-11-04 2012-10-02 Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc. Antagonist anti-CD40 antibodies
CA2548015A1 (en) 2003-12-05 2005-06-23 John R. Schreiber Human anti-pseudomonas-aeruginosa antibodies derived from transgenic xenomouse
US20050136055A1 (en) * 2003-12-22 2005-06-23 Pfizer Inc CD40 antibody formulation and methods
WO2005063981A1 (ja) 2003-12-25 2005-07-14 Kirin Beer Kabushiki Kaisha 抗cd40抗体の変異体
AP2006003689A0 (en) 2004-01-09 2006-08-31 Pfizer Antibodies to MAdCAM
AU2005227322A1 (en) 2004-03-23 2005-10-06 Biogen Idec Ma Inc. Receptor coupling agents and therapeutic uses thereof
US20060099203A1 (en) 2004-11-05 2006-05-11 Pease Larry R B7-DC binding antibody
CA2572098C (en) * 2004-06-30 2015-01-27 Mayo Foundation For Medical Education And Research B7-dc binding antibody
EP2287195B1 (en) 2004-07-01 2019-05-15 Novo Nordisk A/S Pan-kir2dl nk-receptor antibodies and their use in diagnostik and therapy
US20070286855A1 (en) * 2004-08-03 2007-12-13 Mayo Foundation For Medical Education And Research Improving treatments
US7563443B2 (en) * 2004-09-17 2009-07-21 Domantis Limited Monovalent anti-CD40L antibody polypeptides and compositions thereof
PT1836225E (pt) 2005-01-06 2012-01-10 Novo Nordisk As Agentes de ligação a kir e métodos de utilização dos mesmos
JP4986633B2 (ja) * 2005-01-12 2012-07-25 協和発酵キリン株式会社 安定化されたヒトＩｇＧ２およびＩｇＧ３抗体
CN112480257A (zh) * 2005-03-23 2021-03-12 根马布股份公司 用于治疗多发性骨髓瘤的cd38抗体
GEP20115226B (en) 2005-04-26 2011-06-10 Pfizer P-cadherin antibodies
PL1889065T3 (pl) * 2005-05-18 2013-12-31 Novartis Ag Metody diagnostyki i leczenia chorób posiadających składnik autoimmunologiczny i/lub zapalny
US8337851B2 (en) * 2005-05-18 2012-12-25 Novartis Ag Methods of monitoring the efficacy of anti-CD40 antibodies in treating a subject for a CD40-expressing cancer
GB0512225D0 (en) * 2005-06-16 2005-07-27 Univ Sheffield Immunoglobulin molecules
CA2616005C (en) 2005-07-18 2015-09-22 Seattle Genetics, Inc. Beta-glucuronide-linker drug conjugates
UA94060C2 (ru) 2005-09-07 2011-04-11 Эмджен Фримонт Инк. Моноклональное антитело, которое специфически связывает alk-1
WO2007103048A2 (en) * 2006-03-01 2007-09-13 Regents Of The University Of Colorado Tlr agonist (flagellin)/cd40 agonist/antigen protein and dna conjugates and use thereof for inducing synergistic enhancement in immunity
US7993648B2 (en) * 2006-05-03 2011-08-09 The Regents of the Universitry of Colorado Immunostimulatory regimen comprising administering type 1 interferon and agonistic anti-CD40 antibody
WO2007132307A1 (en) 2006-05-09 2007-11-22 Pfizer Products Inc. Cycloalkylamino acid derivatives and pharmaceutical compositions thereof
EP1854810A1 (en) * 2006-05-09 2007-11-14 PanGenetics B.V. Deimmunized antagonistic anti-human CD40 monoclonal antibody from the ch5D12 antibody
WO2007131575A1 (en) 2006-05-12 2007-11-22 Fondazione Centro San Raffaele Del Monte Tabor Tolerogenic dendritic cells, method for their production and uses thereof
US20090074711A1 (en) * 2006-09-07 2009-03-19 University Of Southhampton Human therapies using chimeric agonistic anti-human cd40 antibody
EP2103628A4 (en) * 2006-12-14 2012-02-22 Forerunner Pharma Res Co Ltd MONOCLONAL ANTIBODY ANTI-CLAUDIN 3, AND TREATMENT AND DIAGNOSIS OF CANCER USING SUCH ANTIBODY
KR101520110B1 (ko) 2007-02-23 2015-05-18 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 가공된 항-ＩＬ-23ｐ19 항체
CN101663320A (zh) * 2007-02-23 2010-03-03 先灵公司 工程改造的抗IL-23p19抗体
ES2659517T3 (es) 2007-05-30 2018-03-16 Xencor, Inc. Métodos y composiciones para inhibir células que expresan CD32B
EP1997830A1 (en) 2007-06-01 2008-12-03 AIMM Therapeutics B.V. RSV specific binding molecules and means for producing them
US8039597B2 (en) * 2007-09-07 2011-10-18 Agensys, Inc. Antibodies and related molecules that bind to 24P4C12 proteins
MX2010005080A (es) 2007-11-07 2010-07-28 Genentech Inc Metodos y composiciones para determinar la sensibilidad de linfoma de celula b al tratamiento con anticuerpos anti-cd40.
EP2851374B1 (en) 2007-12-14 2017-05-03 Bristol-Myers Squibb Company Binding molecules to the human OX40 receptor
JO2913B1 (en) * 2008-02-20 2015-09-15 امجين إنك, Antibodies directed towards angiopoietin-1 and angiopoietin-2 proteins and their uses
WO2010104747A2 (en) 2009-03-10 2010-09-16 Baylor Research Institute Antigen presenting cell targeted vaccines
EP2328890B1 (en) 2008-08-06 2012-01-25 Pfizer Inc. 6 substituted 2-heterocyclylamino pyrazine compounds as chk-1 inhibitors
AU2009286247A1 (en) * 2008-08-29 2010-03-04 Academisch Ziekenhuis Leiden H.O.D.N. Lumc Delivery of a CD40 agonist to a tumor draining lymph node of a subject
EP2198878A1 (en) 2008-12-18 2010-06-23 University Of Miami Polypeptide bombesin antagonists
AU2016244220B2 (en) * 2008-12-23 2018-05-17 Amgen Inc. Human CGRP receptor binding proteins
JO3382B1 (ar) * 2008-12-23 2019-03-13 Amgen Inc أجسام مضادة ترتبط مع مستقبل cgrp بشري
EP2403524A4 (en) 2009-03-06 2012-09-26 Agensys Inc CONJUGATES ANTIBODY-DRUG (ADC) BINDING PROTEINS 24P4C12
MX2011009438A (es) * 2009-03-10 2012-04-02 Baylor Res Inst Anticuerpos anti-cd40 y usos de los mismos.
MX2011009439A (es) * 2009-03-10 2013-06-18 Baylor Res Inst Vacunas con especificidad de objetivo hacia celula presentadora de antigeno.
CN102459639A (zh) 2009-04-18 2012-05-16 健泰科生物技术公司 用于评估b细胞淋巴瘤对抗cd40抗体治疗的响应性的方法
ES2829423T3 (es) 2009-04-20 2021-05-31 Kyowa Kirin Co Ltd Anticuerpo anti-CD40 que contiene IgG2 que presenta tres mutaciones de aminoácido introducidas en el mismo
TW201138843A (en) 2009-12-18 2011-11-16 Colgate Palmolive Co Biguanide preservation of precipitated calcium carbonate
WO2011083391A2 (en) 2010-01-05 2011-07-14 Pfizer Inc. Biomarkers for anti-igf-ir cancer therapy
EP3178851B1 (en) 2010-03-31 2020-04-29 Boehringer Ingelheim International GmbH Anti-cd40 antibodies
GB201006096D0 (en) * 2010-04-13 2010-05-26 Alligator Bioscience Ab Novel compositions and uses thereof
FR2959994B1 (fr) 2010-05-12 2012-08-24 Lfb Biotechnologies Nouveaux anticorps humanises 12g4 mutes et leurs fragments diriges contre le recepteur humain de l'hormone anti-mullerienne de type ii
NZ729044A (en) 2010-09-09 2020-07-31 Pfizer 4-1bb binding molecules
CA2805361A1 (en) * 2010-09-29 2012-04-05 Universite De Liege Combination of an agonistic anti-cd40 monoclonal antibody or a cd40 ligand and inactivated or attenuated bacteria for use in the treatment and/or prevention of mastitis
AR083847A1 (es) 2010-11-15 2013-03-27 Novartis Ag Variantes de fc (fragmento constante) silenciosas de los anticuerpos anti-cd40
US20130273055A1 (en) * 2010-11-16 2013-10-17 Eric Borges Agents and methods for treating diseases that correlate with bcma expression
PT2663580T (pt) * 2011-01-10 2017-03-10 Univ Zuerich Terapêutica de associação incluindo anticorpos de ligação a antigénios associados a tumores
GB201103578D0 (en) 2011-03-02 2011-04-13 Sabrepharm Ltd Dipyridinium derivatives
HUE044591T2 (hu) 2011-03-11 2019-11-28 Beth Israel Deaconess Medical Ct Inc Anti-CD40 antitestek és alkalmazásuk
EP3536708A1 (en) 2011-04-19 2019-09-11 Pfizer Inc Combinations of anti-4-1bb antibodies and adcc-inducing antibodies for the treatment of cancer
DK2699601T3 (en) 2011-04-21 2018-04-23 Bristol Myers Squibb Co ANTIBODY POLYPEPTIDES ANTAGONIZING CD40
US10654916B2 (en) 2011-04-21 2020-05-19 The Regents Of The University Of California, A California Corporation Compositions and methods for the treatment of neuromyelitis optica
JP6125489B2 (ja) * 2011-04-29 2017-05-10 アペクシジェン， インコーポレイテッド 抗ｃｄ４０抗体および使用方法
CN103842383B (zh) 2011-05-16 2017-11-03 健能隆医药技术（上海）有限公司 多特异性fab融合蛋白及其使用方法
GB201115280D0 (en) * 2011-09-05 2011-10-19 Alligator Bioscience Ab Antibodies, uses and methods
GB201116092D0 (en) 2011-09-16 2011-11-02 Bioceros B V Antibodies and uses thereof
EP2758437B1 (en) * 2011-09-22 2020-06-03 Amgen Inc. Cd27l antigen binding proteins
KR102096224B1 (ko) 2011-10-28 2020-04-03 테바 파마슈티컬즈 오스트레일리아 피티와이 엘티디 폴리펩티드 구축물 및 이의 용도
WO2013091661A2 (en) * 2011-12-23 2013-06-27 Aarhus Universitet Proteolytic resistant protein affinity tag
EA028647B1 (ru) 2012-01-31 2017-12-29 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Антитела к asic1 и их применение
AR090263A1 (es) 2012-03-08 2014-10-29 Hoffmann La Roche Terapia combinada de anticuerpos contra el csf-1r humano y las utilizaciones de la misma
JP5798199B2 (ja) * 2012-03-08 2015-10-21 国立研究開発法人科学技術振興機構 抗がん剤
RU2737765C2 (ru) 2012-05-04 2020-12-02 Пфайзер Инк. Простатоассоциированные антигены и иммунотерапевтические схемы на основе вакцин
US20140004131A1 (en) 2012-05-04 2014-01-02 Novartis Ag Antibody formulation
US20150132272A1 (en) 2012-06-18 2015-05-14 Yale University Compositions and methods for diminishing an immune response
AU2013337903B2 (en) * 2012-10-30 2018-08-16 Apexigen, Inc. Anti-CD40 antibodies and methods of use
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
CA2899960C (en) 2013-02-01 2022-05-03 Transbio Ltd Anti-cd83 antibodies and use thereof
WO2014144817A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Amgen Inc. Inhibitory polypeptides specific to wnt inhibitors
PT2976361T (pt) 2013-03-18 2018-10-19 Janssen Pharmaceuticals Inc Anticorpos anti-cd134 (ox40) humanizados e utilizações dos mesmos
NZ713641A (en) 2013-04-29 2019-08-30 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-cd38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2b
US11117975B2 (en) 2013-04-29 2021-09-14 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-CD38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2B
US10184996B2 (en) 2013-06-17 2019-01-22 Koninklijke Philips N.V. Magnetic resonance imaging subject support
GB201311487D0 (en) * 2013-06-27 2013-08-14 Alligator Bioscience Ab Bispecific molecules
EP4269441A3 (en) 2013-08-08 2024-01-24 Cytune Pharma Il-15 and il-15ralpha sushi domain based on modulokines
US11427627B2 (en) 2013-09-05 2022-08-30 Amgen Inc. Fc-containing molecules exhibiting predictable, consistent, and reproducible glycoform profiles
AR097584A1 (es) 2013-09-12 2016-03-23 Hoffmann La Roche Terapia de combinación de anticuerpos contra el csf-1r humano y anticuerpos contra el pd-l1 humano
RS57043B1 (sr) 2013-10-25 2018-05-31 Psioxus Therapeutics Ltd Onkolitički adenovirusi snabdeveni heterologus genima
GB201322583D0 (en) * 2013-12-19 2014-02-05 Alligator Bioscience Ab Antibodies
MX2016008099A (es) * 2013-12-20 2016-10-13 Hoffmann La Roche Terapia combinada con un anticuerpo anti-ang2 y un agonista de cd40.
US10286058B2 (en) 2014-01-13 2019-05-14 Baylor Research Institute Vaccines against HPV and HPV-related diseases
EP3113796A1 (en) 2014-03-07 2017-01-11 Bristol-Myers Squibb Company Method of using antibody polypeptides that antagonize cd40 to treat ibd
BR112016022345A2 (pt) 2014-03-31 2017-10-10 Genentech Inc terapia de combinação compreendendo agentes antiangiogênese e agonistas de ligação de ox40
JP6755805B2 (ja) * 2014-04-30 2020-09-16 マックス−デルブリュック−ツェントルム フューア モレキュラーレ メディツィン イン デア ヘルムホルツ−ゲマインシャフト Ｃｄ２６９（ｂｃｍａ）に対するヒト化抗体
UA119352C2 (uk) 2014-05-01 2019-06-10 Тева Фармасьютикалз Острейліа Пті Лтд Комбінація леналідоміду або помалідоміду і конструкції анти-cd38 антитіло-атенуйований інтерферон альфа-2b та спосіб лікування суб'єкта, який має cd38-експресуючу пухлину
MX2016014761A (es) 2014-05-16 2017-05-25 Amgen Inc Ensayo para detectar poblaciones celulares linfocitos t colaboradores 1 (th1) y linfocitos t colaboradores (th2).
GB201413665D0 (en) 2014-07-03 2014-09-17 Transimmune Ag And Yale University Method for obtaining globally activated monocytes
DK3180087T3 (da) 2014-08-12 2019-05-13 Alligator Bioscience Ab Kombinationsterapier med anti cd40-antistoffer
EP3070102A1 (en) 2015-03-18 2016-09-21 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of antibodies human cd40 activating antibodies and anti human pld-1 antibodies
CN106659780A (zh) 2014-08-14 2017-05-10 豪夫迈·罗氏有限公司 活化人cd40的抗体和针对人pd‑l1的抗体的组合疗法
MX2017003247A (es) 2014-09-15 2017-11-30 Amgen Inc Proteina de union a antigenos, bi-especificos del receptor anti-cgrp/receptor pac1 y usos de las mismas.
NZ731491A (en) 2014-10-23 2021-12-24 Kira Biotech Pty Ltd Cd83 binding proteins and uses thereof
US9815886B2 (en) 2014-10-28 2017-11-14 Adma Biologics, Inc. Compositions and methods for the treatment of immunodeficiency
WO2016069919A1 (en) * 2014-10-29 2016-05-06 Seattle Genetics, Inc. Dosage and administration of non-fucosylated anti-cd40 antibodies
US10544199B2 (en) 2014-10-29 2020-01-28 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Interferon alpha 2B variants
TWI595006B (zh) 2014-12-09 2017-08-11 禮納特神經系統科學公司 抗ｐｄ－１抗體類和使用彼等之方法
MX2017013178A (es) 2015-04-13 2018-03-01 Five Prime Therapeutics Inc Terapia de combinacion para cancer.
JOP20200116A1 (ar) 2015-04-24 2017-06-16 Amgen Inc طرق لعلاج أو الوقاية من الصداع النصفي
BR112017023171A2 (pt) 2015-04-30 2018-07-17 Psioxus Therapeutics Limited adenovírus oncolítico que codifica proteína b7
CR20170562A (es) 2015-06-24 2018-02-01 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-receptor de transferrina con afinidad diseñada.
CA2990012A1 (en) * 2015-06-29 2017-01-05 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies to cd40
BR112017028353A2 (pt) * 2015-06-29 2018-09-04 The Rockfeller University anticorpos para cd40 com atividade agonista melhorada
EP3744340A3 (en) 2015-07-16 2021-03-03 Biokine Therapeutics Ltd. Compositions and methods for treating cancer
SI3307322T1 (sl) 2015-09-04 2021-08-31 Primatope Therapeutics Inc. Humanizirana protitelesa proti CD40 in njihove uporabe
BR112018006360A2 (pt) 2015-09-30 2018-10-09 Janssen Biotech Inc anticorpos agonísticos que se ligam especificamente ao cd40 humano e métodos de uso
AR106189A1 (es) 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO
EP3356406A1 (en) 2015-10-02 2018-08-08 H. Hoffnabb-La Roche Ag Bispecific anti-human cd20/human transferrin receptor antibodies and methods of use
GB2543550A (en) 2015-10-21 2017-04-26 Hox Therapeutics Ltd Peptides
KR20180069070A (ko) 2015-11-03 2018-06-22 얀센 바이오테크 인코포레이티드 Tim-3과 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도
US20190382439A1 (en) * 2015-11-16 2019-12-19 Ubiprotein, Corp. Method for extending half-life of a protein
CA3007311A1 (en) * 2015-12-07 2017-06-15 Opi Vi - Ip Holdco Llc Compositions of antibody construct-agonist conjugates and methods of use thereof
EA201891021A1 (ru) 2015-12-17 2018-11-30 Псайоксус Терапьютикс Лимитед Аденовирус группы b, кодирующий антитело к комплексу tcr или фрагмент указанного антитела
EP3423489A1 (en) 2016-03-04 2019-01-09 The Rockefeller University Antibodies to cd40 with enhanced agonist activity
JP7208492B2 (ja) 2016-03-10 2023-01-19 シージー オンコロジー， インコーポレイテッド 併用療法によって固形腫瘍又はリンパ系腫瘍を処置する方法
WO2017157305A1 (en) 2016-03-15 2017-09-21 Generon (Shanghai) Corporation Ltd. Multispecific fab fusion proteins and use thereof
EP3432927A4 (en) 2016-03-24 2019-11-20 Gensun Biopharma Inc. TRIPLE-SPECIFIC INHIBITORS FOR CANCER TREATMENT
UA125510C2 (uk) 2016-03-25 2022-04-13 Сіджен Інк. Спосіб отримання пегильованої сполуки лікарський препарат-лінкер, де лікарським препаратом є ауристатин, та її проміжних сполук
RU2018146050A (ru) 2016-05-27 2020-06-29 Эббви Байотерапьютикс Инк. Биспецифические связывающие белки, которые связывают иммуномодулирующий белок и опухолевый антиген
WO2017205742A1 (en) 2016-05-27 2017-11-30 Abbvie Biotherapeutics Inc. Anti-cd40 antibodies and their uses
CN115304669A (zh) * 2016-06-08 2022-11-08 上海交通大学医学院 增强激动型抗体活性的抗体重链恒定区序列
EP4371570A3 (en) 2016-06-08 2024-07-17 Xencor, Inc. Treatment of igg4-related diseases with anti-cd19 antibodies crossbinding to cd32b
KR102379464B1 (ko) 2016-06-20 2022-03-29 키맵 리미티드 항-pd-l1 항체
CA3030636A1 (en) 2016-07-14 2018-01-18 Genmab A/S Multispecific antibodies against cd40 and cd137
JP7241677B2 (ja) 2016-07-19 2023-03-17 テバ・ファーマシューティカルズ・オーストラリア・ピーティワイ・リミテッド 抗ｃｄ４７併用療法
KR102554331B1 (ko) 2016-08-12 2023-07-10 얀센 바이오테크 인코포레이티드 향상된 효능적 활성을 갖는 Fc 조작된 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체 및 그의 사용 방법
CA3033661A1 (en) 2016-08-12 2018-02-15 Janssen Biotech, Inc. Engineered antibodies and other fc-domain containing molecules with enhanced agonism and effector functions
EP3504239B1 (en) 2016-08-25 2024-05-29 F. Hoffmann-La Roche AG Intermittent dosing of an anti-csf-1r antibody in combination with macrophage activating agent
GB201713765D0 (en) 2017-08-28 2017-10-11 Psioxus Therapeutics Ltd Modified adenovirus
CN110546164B (zh) 2016-11-11 2023-10-20 锦湖Ht株式会社 特异性结合cd40的抗体及其用途
EA201991207A1 (ru) 2016-12-19 2019-12-30 Гленмарк Фармасьютикалс С.А. Новые агонисты tnfr и их применение
EP3558360A1 (en) 2016-12-22 2019-10-30 F. Hoffmann-La Roche AG Treatment of tumors with an anti-csf-1r antibody in combination with an anti-pd-l1 antibody after failure of anti-pd-l1/pd1 treatment
EP3565839A4 (en) 2017-01-05 2021-04-21 Gensun Biopharma Inc. CHECKPOINT REGULATOR ANTAGONISTS
WO2018144955A1 (en) * 2017-02-02 2018-08-09 Silverback Therapeutics, Inc. Construct-peptide compositions and methods of use thereof
BR112019015900A2 (pt) 2017-02-10 2020-04-07 Genmab B.V. polipeptídeo, métodos para aumentar a atividade agonística de um polipeptídeo, para aumentar a atividade de cdc de um polipeptídeo e de tratamento de um indivíduo tendo uma doença, composição, kit de partes, e, uso de um polipeptídeo ou uma composição
MA47775A (fr) 2017-03-14 2020-01-22 Amgen Inc Contrôle des glycoformes afucosylées totales d'anticorps produits en culture cellulaire
US10259865B2 (en) 2017-03-15 2019-04-16 Adma Biologics, Inc. Anti-pneumococcal hyperimmune globulin for the treatment and prevention of pneumococcal infection
US11730822B2 (en) 2017-03-24 2023-08-22 Seagen Inc. Process for the preparation of glucuronide drug-linkers and intermediates thereof
JP2020511959A (ja) * 2017-03-29 2020-04-23 グリコトープ ゲーエムベーハー ヒト化抗ｃｄ４０抗体
WO2018181059A1 (ja) 2017-03-30 2018-10-04 日油株式会社 ヘテロ二官能性単分散ポリエチレングリコール及びそれを用いた複合体
US11319408B2 (en) 2017-03-30 2022-05-03 Nof Corporation Hydrophilic polymer derivative having self-immolative acetal linker and conjugate using same
CA3053358A1 (en) * 2017-04-04 2018-10-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Novel bispecific antigen binding molecules capable of specific binding to cd40 and to fap
WO2018189220A1 (en) 2017-04-13 2018-10-18 F. Hoffmann-La Roche Ag An interleukin-2 immunoconjugate, a cd40 agonist, and optionally a pd-1 axis binding antagonist for use in methods of treating cancer
MX2019014375A (es) 2017-06-01 2020-01-23 Jiangsu Hengrui Medicine Co Anticuerpo anti-cd40, fragmento de union a antigeno del mismo, y uso medico del mismo.
PT3630143T (pt) * 2017-06-01 2023-08-29 Akamis Bio Ltd Vírus oncolítico e método
EP3418302A1 (en) 2017-06-19 2018-12-26 F. Hoffmann-La Roche AG Administration routes for immune agonists
TW201902462A (zh) * 2017-06-02 2019-01-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 用於免疫促效劑之新穎投與途徑
BR112020000698A2 (pt) 2017-07-14 2020-07-14 Pfizer Inc. anticorpos contra madcam
WO2019036855A1 (en) 2017-08-21 2019-02-28 Adagene Inc. ANTI-CD137 MOLECULES AND THEIR USE
CN117551197A (zh) * 2017-09-19 2024-02-13 Mab发现股份有限公司 激动性cd40抗体
US10610585B2 (en) 2017-09-26 2020-04-07 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Methods and compositions for treating and preventing HIV
US11773180B2 (en) 2017-11-08 2023-10-03 Kyowa Kirin Co., Ltd. Bispecific antibody which binds to CD40 and EpCAM
JP7284759B2 (ja) 2017-12-27 2023-05-31 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー 抗ｃｄ４０抗体およびその使用
CN109971717B (zh) * 2017-12-28 2023-06-20 上海细胞治疗研究院 共表达cd40抗体与间皮素特异性嵌合抗原受体的t细胞及其用途
CN109971723B (zh) * 2017-12-28 2023-07-07 上海细胞治疗研究院 包含CD40抗体与muc1特异性嵌合抗原受体基因的T细胞及其用途
GB201801614D0 (en) 2018-01-31 2018-03-14 Psioxus Therapeutics Ltd Formulation
WO2019148445A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Precision/context-dependent activatable antibodies, and methods of making and using the same
WO2019148444A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Anti-ctla4 antibodies and methods of making and using the same
KR102542988B1 (ko) 2018-03-13 2023-06-13 니치유 가부시키가이샤 주쇄 및 측쇄에 단분산 폴리에틸렌 글리콜을 가지는 헤테로이관능성 화합물
MA52186A (fr) 2018-03-26 2021-02-17 Amgen Inc Glycoformes afucosylées totales d'anticorps produits en culture cellulaire
JP2021519790A (ja) 2018-04-02 2021-08-12 アムジェン インコーポレイテッド エレヌマブ組成物及びその使用
EP3781203A4 (en) * 2018-04-20 2022-04-13 Lyvgen Biopharma Co., Ltd. ANTI-CD40 ANTIBODIES AND USES THEREOF
US20200017596A1 (en) * 2018-05-10 2020-01-16 Abvision, Inc. Monoclonal antibodies activating cd40 and uses thereof
US20190365719A1 (en) * 2018-06-01 2019-12-05 Massachusetts Institute Of Technology Combination treatments of hsp90 inhibitors for enhancing tumor immunogenicity and methods of use thereof
AU2019287765A1 (en) 2018-06-15 2021-01-07 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Increasing immune activity through modulation of postcellular signaling factors
KR20210028222A (ko) 2018-06-29 2021-03-11 젠선 바이오파마, 인코포레이티드 항종양 면역 체크포인트 조절 길항제
CA3109905A1 (en) 2018-08-20 2020-02-27 Pfizer Inc. Anti-gdf15 antibodies, compositions and methods of use
US20210355216A1 (en) 2018-10-05 2021-11-18 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods and systems for controlling the agonistic properties of antibody variable domains by light
WO2020108611A1 (zh) 2018-11-30 2020-06-04 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗cd40抗体、其抗原结合片段及其医药用途
CA3121291A1 (en) 2018-11-30 2020-06-04 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Cd40 antibody pharmaceutical composition and use thereof
WO2020154335A1 (en) * 2019-01-22 2020-07-30 Revmab Biosciences Usa, Inc. Novel anti-cd40 antibodies
US10570210B1 (en) 2019-03-04 2020-02-25 Beijing Mabworks Biotech Co.Ltd Antibodies binding CD40 and uses thereof
EP3947454A1 (en) 2019-03-27 2022-02-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Recombinant proteins with cd40 activating properties
US20220324988A1 (en) 2019-04-10 2022-10-13 Nankai University Anti-CD40 antibodies and uses thereof
MA55805A (fr) 2019-05-03 2022-03-09 Flagship Pioneering Innovations V Inc Métodes de modulation de l'activité immunitaire
US20220259328A1 (en) 2019-05-15 2022-08-18 Kyowa Kirin Co., Ltd. Bispecific antibody binding to cd40 and fap
TW202108625A (zh) 2019-05-15 2021-03-01 日商協和麒麟股份有限公司 與cd40及gpc3結合之雙專一性抗體
EP3990116A1 (en) 2019-06-28 2022-05-04 Gensun Biopharma Inc. ANTITUMOR ANTAGONIST CONSISTING OF A MUTATED TGFß1 - RII EXTRACELLULAR DOMAIN AND AN IMMUNOGLOBULIN SCAFFOLD
WO2021048135A1 (en) 2019-09-09 2021-03-18 Basilea Pharmaceutica International AG Pharmaceutical combinations comprising a furazanobenzimidazoles and a cd40 agonist for use in the treatment of neoplastic diseases
WO2021060439A1 (ja) 2019-09-26 2021-04-01 日油株式会社 ペプチドリンカーを有するヘテロ二官能性単分散ポリエチレングリコール
US20220349898A1 (en) 2019-09-26 2022-11-03 Amgen Inc. Methods of producing antibody compositions
IL293450A (en) * 2019-12-03 2022-07-01 Evotec Int Gmbh Interferon-related antigen-binding proteins and uses thereof
WO2021127217A1 (en) 2019-12-17 2021-06-24 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Combination anti-cancer therapies with inducers of iron-dependent cellular disassembly
CA3164129A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Amgen Inc. Mesothelin-targeted cd40 agonistic multispecific antibody constructs for the treatment of solid tumors
US20210214454A1 (en) * 2020-01-10 2021-07-15 Symphogen A/S Anti-cd40 antibodies and compositions
IL272194A (en) 2020-01-22 2021-07-29 Yeda Res & Dev Multi-target antibodies for use in the treatment of diseases
CN115702002A (zh) 2020-04-23 2023-02-14 朝途生物疗法株式会社 改良肽疫苗
AU2021271131A1 (en) 2020-05-14 2022-12-15 Molecular Partners Ag Recombinant CD40 binding proteins and their use
BR112022023049A2 (pt) 2020-05-14 2022-12-20 Molecular Partners Ag Proteínas multiespecíficas
KR20230042222A (ko) 2020-05-26 2023-03-28 인쎄름 (엥스띠뛰 나씨오날 드 라 쌍떼 에 드 라 흐쉐르슈 메디깔) 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(sars-cov-2) 폴리펩티드 및 백신 목적을 위한 이의 용도
GB202008003D0 (en) 2020-05-28 2020-07-15 Quine Medical Ab Anti-CD40 antibody
EP4162257A1 (en) 2020-06-04 2023-04-12 Amgen Inc. Assessment of cleaning procedures of a biotherapeutic manufacturing process
JP2023532339A (ja) 2020-06-29 2023-07-27 フラグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ，インコーポレーテッド サノトランスミッションを促進するためにエンジニアリングされたウイルス及び癌の処置におけるそれらの使用
KR20230087539A (ko) 2020-10-15 2023-06-16 암젠 인크 항체 생산 방법에서의 상대적인 비결합 글리칸
US20240010739A1 (en) 2020-11-12 2024-01-11 Institut National De La Santé Et De La Recherche Médicale (Inserm) Antibodies conjugated or fused to the receptor-binding domain of the sars-cov-2 spike protein and uses thereof for vaccine purposes
MX2023007610A (es) 2020-12-23 2023-07-12 Inst Nat Sante Rech Med Vacuna contra clamidia basada en el direccionamiento del antigeno momp vs4 a las celulas presentadoras de antigeno.
WO2022147481A1 (en) 2020-12-30 2022-07-07 Ansun Biopharma Inc. Combination therapy of an oncolytic virus delivering a foreign antigen and an engineered immune cell expressing a chimeric receptor targeting the foreign antigen
PE20240689A1 (es) * 2021-01-08 2024-04-10 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos y peptidos de union a antigenos para inhibidores del factor xia y uso de los mismos
KR20230131205A (ko) 2021-01-13 2023-09-12 에프. 호프만-라 로슈 아게 병용 요법
EP4284919A1 (en) 2021-01-29 2023-12-06 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods of making modified tumor infiltrating lymphocytes and their use in adoptive cell therapy
CN117157320A (zh) 2021-01-29 2023-12-01 国家健康科学研究所 沙眼衣原体抗原性多肽及其用于疫苗目的的用途
CA3211334A1 (en) 2021-03-09 2022-09-15 Yali FU Multispecific binding agents against cd40 and cd137 in therapy
WO2022212784A1 (en) 2021-03-31 2022-10-06 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Thanotransmission polypeptides and their use in treating cancer
CA3222409A1 (en) 2021-06-07 2022-12-15 Amgen Inc. Using fucosidase to control afucosylation level of glycosylated proteins
EP4365200A1 (en) * 2021-06-28 2024-05-08 Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co., Ltd. Anti-cd40 antibody, antigen-binding fragment and medical use thereof
EP4363059A1 (en) 2021-06-29 2024-05-08 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Immune cells engineered to promote thanotransmission and uses thereof
IL309831A (en) 2021-07-13 2024-02-01 BioNTech SE Multispecific binding agents against CD40 and CD137 in combined cancer therapy
CN118234749A (zh) * 2021-09-17 2024-06-21 诺华股份有限公司 用于预防异种移植中的移植物排斥的方法
CA3232917A1 (en) * 2021-10-01 2023-04-06 Mab Discovery Gmbh Agonistic cd40 antibodies as immune stimulatory agents
WO2023059607A1 (en) 2021-10-05 2023-04-13 Amgen Inc. Fc-gamma receptor ii binding and glycan content
WO2023088968A1 (en) 2021-11-17 2023-05-25 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Universal sarbecovirus vaccines
WO2023147488A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 Iovance Biotherapeutics, Inc. Cytokine associated tumor infiltrating lymphocytes compositions and methods
WO2023172890A2 (en) * 2022-03-07 2023-09-14 Agenus Inc. Anti-ilt2 antibodies and uses thereof
WO2023193239A1 (en) 2022-04-08 2023-10-12 Peter Peizhi Luo Anti-cd28 antibodies and methods of use thereof
WO2023198851A1 (en) 2022-04-14 2023-10-19 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for controlling the tumor cell killing by light
WO2023215725A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
WO2024054992A1 (en) 2022-09-09 2024-03-14 Bristol-Myers Squibb Company Methods of separating chelator
WO2024059899A1 (en) * 2022-09-20 2024-03-28 Currus Biologics Pty Ltd Bispecific polypeptides and uses thereof
WO2024076969A1 (en) * 2022-10-04 2024-04-11 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Anti-cd40 antibodies and uses thereof
WO2024074571A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Dc-targeting vaccine against nipah virus infection
WO2024077191A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Nucleic acid molecules encoding trif and additionalpolypeptides and their use in treating cancer
WO2024118836A1 (en) 2022-11-30 2024-06-06 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes with shortened rep step
WO2024115725A1 (en) 2022-12-01 2024-06-06 BioNTech SE Multispecific antibody against cd40 and cd137 in combination therapy with anti-pd1 ab and chemotherapy
CN115969997B (zh) * 2022-12-19 2024-02-13 华润生物医药有限公司 一种靶向cldn18.2的抗体药物偶联物及其应用
CN116375870B (zh) * 2022-12-30 2023-09-15 优睿赛思(武汉)生物科技有限公司 抗人cd40蛋白的人源化抗体、制备方法及其应用

Family Cites Families (138)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US439216A (en) * 1890-10-28 Maker
US59427A (en) * 1866-11-06 Improvement in fences
US142358A (en) * 1873-09-02 Improvement in the purification of illuminating-gas
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
US4740461A (en) * 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
JP2532858B2 (ja) 1985-04-01 1996-09-11 セルテツク リミテツド 形質転換したミエロ―マ細胞系
US4735210A (en) 1985-07-05 1988-04-05 Immunomedics, Inc. Lymphographic and organ imaging method and kit
US4968615A (en) * 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4959455A (en) * 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
US5750172A (en) 1987-06-23 1998-05-12 Pharming B.V. Transgenic non human mammal milk
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) * 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
GB8827305D0 (en) 1988-11-23 1988-12-29 British Bio Technology Compounds
US5175384A (en) * 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5959177A (en) * 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US5633076A (en) * 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
US6673986B1 (en) * 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
DE69133566T2 (de) * 1990-01-12 2007-12-06 Amgen Fremont Inc. Bildung von xenogenen Antikörpern
US6713610B1 (en) * 1990-01-12 2004-03-30 Raju Kucherlapati Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5151510A (en) 1990-04-20 1992-09-29 Applied Biosystems, Inc. Method of synethesizing sulfurized oligonucleotide analogs
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
DK0585287T3 (da) 1990-07-10 2000-04-17 Cambridge Antibody Tech Fremgangsmåde til fremstilling af specifikke bindingsparelementer
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5814318A (en) * 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
KR100272077B1 (ko) 1990-08-29 2000-11-15 젠팜인터내셔날,인코포레이티드 이종 항체를 생산할 수 있는 전이유전자를 가진 인간이외의 동물
US5661016A (en) * 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
DE69133557D1 (de) * 1990-08-29 2007-03-15 Pharming Intellectual Pty Bv Homologe rekombination in säugetier-zellen
US5625126A (en) * 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5789650A (en) * 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) * 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5770429A (en) * 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
CA2405246A1 (en) 1990-12-03 1992-06-11 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with alterred binding properties
ES2330052T3 (es) 1991-03-01 2009-12-03 Dyax Corporation Proteina quimerica que comprende micro-proteinas que tienen dos o mas puentes disulfuro y relaizaciones de las mismas.
US5416367A (en) * 1991-03-06 1995-05-16 Quicklogic Corporation Programmable application specific integrated circuit and logic cell therefor
DE69233750D1 (de) 1991-04-10 2009-01-02 Scripps Research Inst Bibliotheken heterodimerer Rezeptoren mittels Phagemiden
CA2103059C (en) 1991-06-14 2005-03-22 Paul J. Carter Method for making humanized antibodies
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
WO1993004169A1 (en) * 1991-08-20 1993-03-04 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
WO1993006213A1 (en) 1991-09-23 1993-04-01 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
JPH05242071A (ja) * 1991-11-20 1993-09-21 Mitsubishi Electric Corp 対象システムを制御または決定・推定する方法、およびその装置
CA2129663C (en) 1992-02-06 2005-07-05 James S. Huston Biosynthetic binding protein for cancer marker
US5874082A (en) * 1992-07-09 1999-02-23 Chiron Corporation Humanized anti-CD40 monoclonal antibodies and fragments capable of blocking B cell proliferation
US5397703A (en) * 1992-07-09 1995-03-14 Cetus Oncology Corporation Method for generation of antibodies to cell surface molecules
JPH07509137A (ja) 1992-07-24 1995-10-12 セル　ジェネシス，インク． 異種抗体の生産
US6177401B1 (en) 1992-11-13 2001-01-23 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften Use of organic compounds for the inhibition of Flk-1 mediated vasculogenesis and angiogenesis
US5455258A (en) 1993-01-06 1995-10-03 Ciba-Geigy Corporation Arylsulfonamido-substituted hydroxamic acids
PT804070E (pt) * 1993-03-09 2000-11-30 Genzyme Corp Isolamento de componentes de interesse a partir do leite.
ATE255906T1 (de) 1993-10-01 2003-12-15 Immunex Corp Antikörper gegen cd40
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
JPH09507074A (ja) * 1993-12-23 1997-07-15 イミュネックス・コーポレーション Ｃｄ４０を発現する腫瘍細胞を特徴とする疾患の予防又は治療方法
US5612126A (en) * 1994-01-19 1997-03-18 Burlington Industries, Inc. Stiff fabric and method of forming the stiff fabric
IL112248A0 (en) 1994-01-25 1995-03-30 Warner Lambert Co Tricyclic heteroaromatic compounds and pharmaceutical compositions containing them
JPH0812700A (ja) 1994-07-01 1996-01-16 Sumitomo Electric Ind Ltd マウスｃｄ４０に対するモノクローナル抗体
US5643763A (en) * 1994-11-04 1997-07-01 Genpharm International, Inc. Method for making recombinant yeast artificial chromosomes by minimizing diploid doubling during mating
GB9425060D0 (en) * 1994-12-13 1995-02-08 Univ Birmingham Carcinoma treatment
US6046037A (en) * 1994-12-30 2000-04-04 Hiatt; Andrew C. Method for producing immunoglobulins containing protection proteins in plants and their use
US5863949A (en) * 1995-03-08 1999-01-26 Pfizer Inc Arylsulfonylamino hydroxamic acid derivatives
US6091001A (en) 1995-03-29 2000-07-18 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US6130364A (en) * 1995-03-29 2000-10-10 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
WO1996032181A1 (de) * 1995-04-11 1996-10-17 Robert Bosch Gmbh Verfahren und vorrichtung zur reduzierung von schadstoffen, insbesondere von stickoxiden in verbrennungsabgasen
DK0821671T3 (da) * 1995-04-20 2001-04-23 Pfizer Arylsulfonylhydroxamsyrederivater som MMP- og TNF-inhibitorer
EP0826034A4 (en) * 1995-04-21 2002-06-19 Cell Genesys Inc PRODUCTION OF LARGE GENOMIC DNA DELETIONS
KR20050085971A (ko) 1995-04-27 2005-08-29 아브게닉스, 인크. 면역화된 제노마우스 유래의 인간 항체
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5747498A (en) 1996-05-28 1998-05-05 Pfizer Inc. Alkynyl and azido-substituted 4-anilinoquinazolines
US5880141A (en) 1995-06-07 1999-03-09 Sugen, Inc. Benzylidene-Z-indoline compounds for the treatment of disease
US5780215A (en) * 1995-07-26 1998-07-14 Konica Corporation Silver halide color photographic light-sensitive material
GB9520822D0 (en) 1995-10-11 1995-12-13 Wellcome Found Therapeutically active compounds
US6440418B1 (en) * 1995-11-07 2002-08-27 Idec Pharmaceuticals Corporation Methods of treating autoimmune diseases with gp39-specific antibodies
GB9624482D0 (en) 1995-12-18 1997-01-15 Zeneca Phaema S A Chemical compounds
DK0780386T3 (da) 1995-12-20 2003-02-03 Hoffmann La Roche Matrixmetalloproteaseinhibitorer
EP0885198B1 (en) 1996-03-05 2001-12-19 AstraZeneca AB 4-anilinoquinazoline derivatives
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
US5994619A (en) 1996-04-01 1999-11-30 University Of Massachusetts, A Public Institution Of Higher Education Of The Commonwealth Of Massachusetts, As Represented By Its Amherst Campus Production of chimeric bovine or porcine animals using cultured inner cell mass cells
EP0818442A3 (en) 1996-07-12 1998-12-30 Pfizer Inc. Cyclic sulphone derivatives as inhibitors of metalloproteinases and of the production of tumour necrosis factor
EP0912559B1 (en) 1996-07-13 2002-11-06 Glaxo Group Limited Fused heterocyclic compounds as protein tyrosine kinase inhibitors
HRP970371A2 (en) 1996-07-13 1998-08-31 Kathryn Jane Smith Heterocyclic compounds
CN1230185A (zh) 1996-07-13 1999-09-29 葛兰素集团有限公司 双环芳杂环化合物用作蛋白质酪氨酸激酶的抑制剂
ES2175415T3 (es) 1996-07-18 2002-11-16 Pfizer Inhibidores de metaloproteasas matriciales basados en fosfinato.
EA199900139A1 (ru) 1996-08-23 1999-08-26 Пфайзер, Инк. Производные арилсульфониламиногидроксамовой кислоты
US5817690A (en) * 1996-08-27 1998-10-06 American Home Products Corporation 4-aminoethoxy indolone derivatives
ID18494A (id) 1996-10-02 1998-04-16 Novartis Ag Turunan pirazola leburan dan proses pembuatannya
US5916771A (en) * 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
EP2314625B1 (en) 1996-12-03 2014-05-07 Amgen Fremont Inc. Transgenic mammals having human Ig loci including plural VH and Vkappa regions and antibodies produced therefrom
PT950059E (pt) 1997-01-06 2004-10-29 Pfizer Derivados de sulfona ciclicos
EA002594B1 (ru) 1997-02-03 2002-06-27 Пфайзер Продактс Инк. Производные арилсульфониламиногидроксамовой кислоты
CA2279863A1 (en) 1997-02-07 1998-08-13 Pfizer Inc. N-hydroxy-beta-sulfonyl-propionamide derivatives and their use as inhibitors of matrix metalloproteinases
JP3710489B2 (ja) 1997-02-11 2005-10-26 ファイザー・インク アリールスルホニルヒドロキサム酸誘導体
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
JP2002511852A (ja) 1997-05-07 2002-04-16 スージェン・インコーポレーテッド 蛋白質キナーゼ活性の調節剤としての２−インドリノン誘導体
JP2002512624A (ja) 1997-05-21 2002-04-23 バイオベーション リミテッド 非免疫原性タンパク質の製造方法
AU734009B2 (en) 1997-05-30 2001-05-31 Merck & Co., Inc. Novel angiogenesis inhibitors
ES2289791T3 (es) 1997-08-22 2008-02-01 Astrazeneca Ab Derivados de oxindolilquinazolina como inhibidores de la angiogenesis.
WO1999016755A1 (en) 1997-09-26 1999-04-08 Merck & Co., Inc. Novel angiogenesis inhibitors
WO1999024440A1 (en) 1997-11-11 1999-05-20 Pfizer Products Inc. Thienopyrimidine and thienopyridine derivatives useful as anticancer agents
GB9725782D0 (en) 1997-12-05 1998-02-04 Pfizer Ltd Therapeutic agents
RS49779B (sr) 1998-01-12 2008-06-05 Glaxo Group Limited, Biciklična heteroaromatična jedinjenja kao inhibitori protein tirozin kinaze
GB9800575D0 (en) 1998-01-12 1998-03-11 Glaxo Group Ltd Heterocyclic compounds
GB9801690D0 (en) 1998-01-27 1998-03-25 Pfizer Ltd Therapeutic agents
US6051228A (en) * 1998-02-19 2000-04-18 Bristol-Myers Squibb Co. Antibodies against human CD40
CA2322749A1 (en) 1998-03-03 1999-09-10 Abgenix, Inc. Cd147 binding molecules as therapeutics
JP4462654B2 (ja) 1998-03-26 2010-05-12 ソニー株式会社 映像素材選択装置及び映像素材選択方法
PA8469501A1 (es) 1998-04-10 2000-09-29 Pfizer Prod Inc Hidroxamidas del acido (4-arilsulfonilamino)-tetrahidropiran-4-carboxilico
PA8469401A1 (es) 1998-04-10 2000-05-24 Pfizer Prod Inc Derivados biciclicos del acido hidroxamico
US20020029391A1 (en) 1998-04-15 2002-03-07 Claude Geoffrey Davis Epitope-driven human antibody production and gene expression profiling
WO1999061057A2 (en) * 1998-05-23 1999-12-02 Tanox, Inc. Molecules targeting cd40 and tumor cells
AU759226B2 (en) 1998-05-29 2003-04-10 Sugen, Inc. Pyrrole substituted 2-indolinone protein kinase inhibitors
CA2341029A1 (en) 1998-08-17 2000-02-24 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
ATE260255T1 (de) 1998-11-05 2004-03-15 Pfizer Prod Inc 5-oxo-pyrrolidine-2-carbonsäure- hydroxamidderivate
EP1051432B1 (en) 1998-12-08 2007-01-24 Biovation Limited Method for reducing immunogenicity of proteins
EA006972B1 (ru) 1998-12-23 2006-06-30 Пфайзер Инк. Моноклональное антитело человека к ctla-4 и способы его применения
EP1181050A4 (en) * 1999-04-30 2005-05-18 Jolla Inst Allergy Immunolog METHODS FOR PREVENTING THE REACTIVATION OF LATENT VIRUSES AND CONTROLLING VIRUS REPLICATION
US20030118588A1 (en) * 1999-05-22 2003-06-26 Linda Diehl Induction of anti-tumor CTL immunity through in vivo triggering of 4-1BB and/or CD40
US6946129B1 (en) * 1999-06-08 2005-09-20 Seattle Genetics, Inc. Recombinant anti-CD40 antibody and uses thereof
US6482411B1 (en) * 1999-08-27 2002-11-19 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods of reducing bone loss with CD40 ligand
US6517529B1 (en) 1999-11-24 2003-02-11 Radius International Limited Partnership Hemodialysis catheter
GB9927757D0 (en) * 1999-11-25 2000-01-26 Kennedy Rheumatology Inst Treatment of autoimmune diseases
WO2001056603A1 (en) * 2000-02-01 2001-08-09 Tanox, Inc. Cd40-binding apc-activating molecules
US7063845B2 (en) 2000-04-28 2006-06-20 Gemini Science, Inc. Human anti-CD40 antibodies
US20030059427A1 (en) 2000-04-28 2003-03-27 Force Walker R. Isolation and characterization of highly active anti-CD40 antibody
WO2001083755A2 (en) * 2000-04-28 2001-11-08 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Human anti-cd40 antibodies and methods of making and using same
OA12589A (en) 2001-01-05 2006-06-08 Abgenix Inc Antibodies to insulin-like growth factor i receptor.
AR039067A1 (es) * 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
AP2006003689A0 (en) 2004-01-09 2006-08-31 Pfizer Antibodies to MAdCAM
US9665874B2 (en) 2012-03-13 2017-05-30 American Express Travel Related Services Company, Inc. Systems and methods for tailoring marketing
US10884952B2 (en) 2016-09-30 2021-01-05 Intel Corporation Enforcing memory operand types using protection keys

Also Published As

Publication number Publication date
PE20030846A1 (es) 2003-10-11
NZ533180A (en) 2008-03-28
DK1476185T3 (da) 2013-10-14
US20090169563A1 (en) 2009-07-02
HUP0402247A2 (hu) 2005-01-28
CN103450360A (zh) 2013-12-18
US7288251B2 (en) 2007-10-30
PT1476185E (pt) 2013-11-05
JP5848232B2 (ja) 2016-01-27
NO20042388L (no) 2004-08-09
KR100830086B1 (ko) 2008-05-20
CR7343A (es) 2004-10-28
JP4616555B2 (ja) 2011-01-19
MY137641A (en) 2009-02-27
JP2010213704A (ja) 2010-09-30
MA27139A1 (fr) 2005-01-03
CN103450360B (zh) 2016-11-02
IS7253A (is) 2004-05-06
US7563442B2 (en) 2009-07-21
BR0214137A (pt) 2004-09-14
JP5547532B2 (ja) 2014-07-16
EP1476185B1 (en) 2013-07-31
US8388971B2 (en) 2013-03-05
PL370514A1 (en) 2005-05-30
RS52484B (en) 2013-02-28
NO334339B1 (no) 2014-02-10
US20090130715A1 (en) 2009-05-21
IL161823A (en) 2014-02-27
CL2009001779A1 (es) 2010-02-05
CY1115675T1 (el) 2017-01-25
PL214634B1 (pl) 2013-08-30
TW200306204A (en) 2003-11-16
MXPA04004467A (es) 2005-05-16
US20160152713A1 (en) 2016-06-02
OA12725A (en) 2006-06-28
IS2940B (is) 2016-03-15
WO2003040170A2 (en) 2003-05-15
JP2005508176A (ja) 2005-03-31
PL214289B1 (pl) 2013-07-31
GT200200228A (es) 2008-09-26
ZA200404207B (en) 2005-08-31
AU2002356926A2 (en) 2003-05-19
CA2466128A1 (en) 2003-05-15
AP1918A (en) 2008-11-13
BRPI0214137B8 (pt) 2021-05-25
TWI331040B (en) 2010-10-01
CN1582165B (zh) 2013-05-29
RS39204A (en) 2006-12-15
AP2004003034A0 (en) 2004-06-30
CU23745A3 (es) 2012-01-31
US20070190051A1 (en) 2007-08-16
EP1476185A2 (en) 2004-11-17
HN2002000318A (es) 2003-03-10
CN1582165A (zh) 2005-02-16
US20030211100A1 (en) 2003-11-13
US20130024956A1 (en) 2013-01-24
EP2343086A3 (en) 2012-02-22
EG25801A (en) 2012-08-08
PA8557701A1 (es) 2003-12-19
UY27537A1 (es) 2003-02-28
ME00503B (me) 2011-10-10
DOP2002000507A (es) 2003-05-15
WO2003040170A3 (en) 2003-10-09
SI1476185T1 (sl) 2013-12-31
HUP0402247A3 (en) 2012-09-28
EP1476185A4 (en) 2007-04-04
US20060093600A1 (en) 2006-05-04
BRPI0214137B1 (pt) 2019-03-19
EA011449B1 (ru) 2009-02-27
IL161823A0 (en) 2005-11-20
US7626012B2 (en) 2009-12-01
AU2002356926B2 (en) 2007-01-04
TNSN04078A1 (fr) 2006-06-01
US7338660B2 (en) 2008-03-04
HK1069122A1 (en) 2005-05-13
US20120225014A1 (en) 2012-09-06
CA2466128C (en) 2013-10-29
JP2013099333A (ja) 2013-05-23
HRP20040525A2 (en) 2005-04-30
AU2002356926C1 (en) 2003-05-19
CR10878A (es) 2011-01-12
WO2003040170A9 (en) 2004-06-10
TW201034686A (en) 2010-10-01
GEP20074222B (en) 2007-10-25
NI200200128A (es) 2010-01-11
PL392809A1 (pl) 2011-03-14
ES2432968T3 (es) 2013-12-05
KR20050063749A (ko) 2005-06-28
US7618633B2 (en) 2009-11-17
EP2343086A2 (en) 2011-07-13
AR039067A1 (es) 2005-02-09
EA200400654A1 (ru) 2004-12-30
ECSP045093A (es) 2004-07-23
US20100098694A1 (en) 2010-04-22
HRP20040525B1 (hr) 2017-06-02
TWI338579B (en) 2011-03-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU229829B1 (en) Antibodies to cd40
KR101577843B1 (ko) 인간 ｏｘ４０ 수용체에 대한 결합 분자
US20200362051A1 (en) Molecules that bind to cd137 and psma
AU2002356926A1 (en) Antibodies to CD40
CN107474137A (zh) 结合淋巴细胞活化基因3（lag‑3）之人类抗体及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
GB9A Succession in title

Owner name: AMGEN FREMONT INC., US

Free format text: FORMER OWNER(S): ABGENIX, INC., US

Owner name: PFIZER PRODUCTS INC., US

Free format text: FORMER OWNER(S): ABGENIX, INC., US