KR20050063749A - Ｃｄ４０에 대한 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 CD40, 바람직하게는 인간 CD40에 특이적으로 결합하며 CD40 아고니스트로 작용하는 항체 및 그 항원-결합 부위에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인간 항-CD40 항체 및 그 항원 결합 부위에 관한 것이다. 본 발명은 또한 키메라의, 이특이적인, 유도체화된, 단일쇄 항체 또는 융합 단백질의 일부인 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인간 항-CD40 항체로부터 유래된 분리된 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 및 그러한 면역글로불린을 암호하는 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인간 항-CD40 항체를 제조하는 방법, 이들 항체를 포함하는 조성물 및 진단 및 치료를 위하여 항체와 조성물을 이용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인간 항-CD40 항체를 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄 면역글로불린 분자를 암호하는 핵산 분자를 이용하는 유전자 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 트랜스제닉 동물에 관한 것이다.

Description

ＣＤ４０에 대한 항체 {ANTIBODIES TO CD40}
본 출원은 2001년 11월 9일에 출원된 미국 가출원 60/348,980호의 이익을 향유한다.
CD40 항원은 종양 괴사 인자 수용체(TNF-R) 패밀리에 속하는 50 kDa 세포 표면 당단백질이다. (Stamenkovic et al., EMBO J. 8:1403-10(1989)) CD40은 B 림프구, 가지 세포, 단핵구, 대식 세포, 가슴샘 상피 세포, 내피 세포, 섬유아세포, 및 평활근육 세포를 포함한 많은 정상 및 종양 세포 타입에서 발현된다. (Paulie S et al., Cancer Immunol.Immunother. 20:23-8 (1985); Banchereau J. et al., Adv.Exp.Med.& Biol. 378:79-83 (1995); Alderson M.R. et al., J. of Exp.Med. 178:669-74 (1993); Ruggiero G. et al., J.of Immunol. 156:3737-46 (1996); Hollenbaugh D. et al., J.of Exp.Med. 182:33-40 (1995); Yellin M.J.et al., J.of Leukocyte Biol. 58:209-16 (1995); 및 Lazaar A.L.et al., J.of Immuno. 161:3120-7(1998)). CD40은 모든 B-림프종 및 모든 고형 종양의 70%에서 발현된다. 구성적으로 발현됨에도 불구하고, CD40은 LPS, IL-1β, IFN-γ 및 GM-CSF와 같은 성숙 시그날에 의해 항원 전달 세포에서 상향 조절된다.
CD40 활성화는 체액성 및 세포성 면역 반응을 조절하는 데 중요한 역할을 한다. CD40 활성화 없는 항원 전달은 내성을 유도할 수 있는 한편, CD40 시그날링은 그러한 내성을 역전시키고, 모든 항원 전달 세포(APC)에 의한 항원 전달을 증가시키고, 헬퍼 사이토카인 및 케모카인의 분비를 유도하고, 공자극성 분자 발현 및 시그날링을 증가시키고, 면역 세포의 세포 용해 활성을 자극할 수 있다.
CD40은 B 세포 증식, 성숙 및 클래스 전환에서 중요한 역할을 한다 (Foy T.M. et al., Ann.Rev.of Immunol.14:591-617(1996)) CD40 시그날링 경로의 파괴는 혈청 면역글로불린 아이소타입의 비정상적인 분포, CD4+ T 세포 프라이밍의 부족, 및 이차 체액성 반응의 결함을 야기한다. 예를 들어, X-결합된 과-IgM 증후군은 사람 CD40L 유전자의 돌연변이와 관련된 질병이며, 이 병을 가진 사람은 IgM 아이소타입의 항체외의 항체들을 생산할 수 없으며, 이는 CD40과 CD40L 간의 생산적 상호작용이 효과적인 면역 반응에 필요함을 나타낸다.
CD40L에 의한 CD40 관련은 CD40 세포질 도메인이 TRAFs (TNF-R 연합된 인자)와 연합되도록 한다. (Lee H.H. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:1421-6(1999); Pullen S.S. et al., Biochemistry 37:1183-45(1998); Grammar A.C. et al., J. of Immunol. 161:1183-93(1998); Ishida T.K. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:9437-42(1996); Pullen S.S. et al., J.of Biol.CHEM.274:14246-54(1999)). TRAF와의 상호작용은 NFκB와 Jun/AP1 경로 둘다의 활성화로 귀결될 수 있다. (Tsukamoto N. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:1234-9(1999); Sutherland C.L.et al., J.of Immunol.162:4720-30(1999)). 세포 타입에 의존하면서, 이 시그날링은 IL-6(Jeppson J.D. et al., J.of Immunol. 161:1738-42(1998); Uejima Y.et al., Int.Arch.of Allergy & Immunol.110:225-32(1996)), IL-8(Gruss H.J. et al., Blood 84:2305-14(1994); von Leoprechting A.et al., Cancer Res.59:1287-94(1999); Denfeld R.W. et al., Europ.J.of Immunol.26:2329-34(1996)), IL-12(Cella M.et al., J. of Exp.Med.184:747-52(1996); Ferlin W.G.et al., Europ.J.of Immunol. 28:525-31(1998); Armant M. et al., Europ.J.of Immunol.26:1430-4(1996); Koch F.et al., J. of Exp.Med. 184:741-6(1996); Seguin R. and L.H.Kasper, J.of Infect.Diseases 179:467-74(1999); Chaussabel D.et al., Cellular Immunol.193:48-58(1999)), IL-15 (Kuniyoshi J.S. et al., Cellular Immunol. 193:48-58(1999)) 및 케모카인(MIP1α, MIP1β, RANTES, 및 기타)(McDyer J.F.et al., J.of Immunol.162:3711-7(1999); Schaniel C.et al., J.of Exp.Med.188:451-63(1998);Altenburg A.et al., J.of Immunol. 612:4140-7(1999);Deckers J.G.et al., J.of the Am.Society of Nephrology 9:1187-93(1998))과 같은 사이토카인의 분비 증가, MHC 클래스 I 및 II의 발현 증가(Santos-Argumedo L.et al., Cellular Immunol.156:272-85(1994)), 및 부착 분자(예, ICAM)(Lee H.H.et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:1421-6(1999);Grousson J.et al., Archives of Dermatol.Res.290:325-30(1998);Katada Y.et al., Europ.J. of Immunol. 26:192-200(1996); Mayumi M.et al., J. of Allergy & Clin.Immunol. 96:1136-44(1995); Flores-Romo L.et al., Immunol.79:445-51(1993)) 및 공자극 분자(예, B7)(Roy M.et al., Europ.J.of Immunol. 25:596-603(1995); Jones K.W. and C.J.Hackett, Cellular Immunol. 174:42-53(1996); Caux C.et al., Journal of Exp.Med. 180:1263-72(1994); Kiener P.A. et al., J. of Immunol. 155:4917-25(1995))의 발현 증가를 야기한다. CD40 관련에 의해 유도된 사이토카인은 T 세포 생존과 활성화를 증가시킨다.
세포 및 면역 기능의 증강에 더하여, CD40 활성화의 효과는 케모카인과 사이토카인에 의한 세포 보충 및 분화; 단핵구의 활성화; 세포용해성 T 림프구(CTL)와 자연 세포독성(NK) 세포의 세포용해 활성 증가; CD40 양성 종양에서 어팝토시스(apoptosis)의 유도; CD40 양성 종양의 면역원성 증강; 및 종양-특이적 항체 생산을 포함한다. 세포-매개 면역 반응에서 CD40 활성화의 역할이 또한 잘 정립되어 있으며, Grewal et al., Ann.Rev.of Immunol.16:111-35(1998); Mackey et al., J. of Leukocyte Biol. 63:418-28(1998); 및 Noelle R.J.,Agents & Actions -Suppl.49:17-22(1998)에 개시되어 있다.
교차-프라이밍 모델 시스템을 이용한 연구는 APC의 CD40 활성화가 세포용해성 T 림프구(CTL)의 생성을 위한 헬퍼 T 세포 필요를 대신할 수 있음을 보여주었다. (Bennett et al., Nature 393:478-480(1998)). CD40L 결핍 마우스로부터의 증거는 헬퍼 T 세포 프라이밍에서 CD40 시그날링이 명백하게 요구됨을 나타낸다. (Grewal I.S. et al., Science 273:1864-7(1996); Grewal I.S. et al., Nature 378:617-20(1995)). CD40 활성화는, 그렇지 않으면 면역허용원인 항원 함유 B 세포를 수행능력있는 APC로 전환시킨다. (Buhlmann J.E. et al., Immunity 2:645-53(1995)). CD40 활성화는 탯줄 혈액 선조가 성숙하여 가지 세포로 분화되도록 한다. (Flores-Romo L.et al., J.of Exp.Med. 185:341-9(1997); Mackey M.F. et al., J.of Immunol.161:2094-8(1998)). CD40 활성화는 또한 단핵구가 기능성 가지 세포로 분화되도록 한다. (Brossart P.et al., Blood 92:4238-47(1998)). 또한, CD40 활성화는 APC-CD40 유도된 사이토카인을 통하여 NK 세포의 세포용해성 활성을 증가시킨다. (Carbone E.et al., J. of Exp.Med. 185:2053-60(1997); Martin-Fontecha A.et al., J.of Immunol.162:5910-6(1999)). 이러한 관찰들은 CD40이 APC의 성숙, 헬퍼 사이토카인의 분비, 공자극 분자의 상향 조절, 및 효과인자 기능의 증강을 유도하여 면역 반응의 개시 및 증강에서 중요한 역할을 함을 나타낸다.
체액성 및 세포독성 면역 반응의 개시 및 성숙에서 CD40 시그날링의 중요한 역할은 이 시스템을 면역 증강을 위한 이상적인 표적이 되도록 한다. 그러한 증강은 일반적으로 활성화된 APC의 교차-프라이밍을 통해 면역 시스템에 전달되는 종양 항원에 대한 효과적인 면역 반응을 일으키는데 특히 중요할 수 있다. (Huang A.Y. et al., Ciba Foundation Symp. 187:229-44(1994); Toes R.E.M. et al., Seminars in Immunol. 10:443-8(1998); Albert M.L. et al., Nature 392:86-9 (1998); Bennett S.R. et al., J. of Exp.Med.186:65-70(1997))
몇몇 그룹은 생체외 및 생체내에서 항종양 반응을 위한 CD40 활성화의 효과성을 입증하였다. (Toes R.E.M. et al.,Seminars in Immunol. 10:443-8(1998)) 두 그룹은 바이러스 형질전환된 세포에 의한 피하 종양 및 신장 세포 암종의 폐 전이성 모델을 이용하여, CD40 활성화가 종양 특이적 항원에 대한 내성을 역전시켜 T 세포의 효과적인 항종양 프라이밍을 일으킬 수 있음을 독립적으로 입증하였다. (Sotomayor E.M. et al., Nature Medicine 5:780-787(1999); Diehl L. et al., Nature Medicine 5: 774-9 (1999).) 면역 세포의 부재하에서 항종양 활성은 또한 SCID 마우스에서 사람 유방암주 모델에서 CD40L 및 항-CD40 항체 치료에 의해 보고되었다. (Hirano A. et al., Blood 93: 2999-3007 (1999).) 항-CD40 항체에 의한 CD40 활성화는 마우스 모델에서 CD40+ 와 CD40-림프종을 제거하는 것으로 최근에 나타났다. (French R. R. et al., Nature Medicine 5: 548-53 (1999).) 더욱이, Glennie 및 공동연구자들에 의한 이전의 연구는 항-CD40 항체에 의한 시그날링 활성이 효과인자를 보충할 수 있는 다른 항-표면 마커 항체보다 생체내 종양 제거를 유도하는 데 더 효과적인 것으로 결론내린다. (TuttA. L. et al.,J.of Immunol. 161: 3176-85(1998).) 이러한 관찰들과 일치되게, 항-CD40 항체를 생체내에서 CD40+ 종양 세포에 대한 활성을 시험할 경우, 모두는 아니지만 대부분의 종양을 죽이는 활성은 ADCC 보다는 CD40 시그날링과 관련되었다. (Funakoshi S. et al., J.oflmmunotherapy with Emphasis on Tumorlmmunol. 19: 93-101 (1996). ) 다른 연구에서는, 골수 가지 세포를 생체외에서 다양한 제제로 처리하고, 생체내 항종양 활성에 대해 시험하였다. 이들 연구는 CD40L 자극된 DC가 항종양 반응을 일으키는 가장 성숙되며 가장 효과적인 세포임을 입증하였다.
항종양 면역성에서 CD40의 필수적인 역할은 또한 종양 백신에 대한 야생형 및 CD40-/- 마우스의 반응을 비교하여 입증되었다. 이들 연구는 CD40-/- 마우스가 정상 마우스에서 관찰된 종양 면역성을 이룰 수 없음을 보여준다. (Mackey M. F. et al., Cancer Research 57: 2569-74 (1997).) 다른 연구에서는, 종양 함유 마우스로부터의 비장세포를 종양 세포로 자극하고 생체외에서 활성화 항-CD40 항체로 처리한 결과, 종양 특이적 CTL 활성이 증가됨이 나타났다. (Donepudi M. et al., Cancer Immunol. Immunother. 48 : 153-164 (1999). ) 이들 연구는 CD40 양성 및 음성 종양 둘다에서 CD40이 항종양 면역성에서 중요한 위치를 차지함을 입증한다. CD40은 림프종, 백혈병, 다발 골수증, 코인두, 방광, 난소, 및 간의 암종의 대부분, 및 일부 유방암 및 직장결장암에서 발현되므로, CD40의 활성화는 광범위한 임상적 적용성을 가진다.
항-CD40 활성화 모노클로날 항체는 몇 가지 중요한 기작을 통하여 종양 제거에 기여한다. 이들 중 으뜸은, 증가된 항원 전달 또는 CD40 양성 종양 세포 자체의 면역원성뿐만 아니라, 증가된 종양 항원 처리와 전달을 위한 숙주 가지 세포의 활성화이며, 그 결과 종양 특이적 CD4+ 및 CD8+ 림프구가 활성화된다. 부가적인 항종양 활성은 어팝토시스를 유도하거나 ADCC로 이끄는 체액성 반응을 자극하여 CD40+ 종양을 직접 죽이는 것뿐만 아니라, CD40 시그날링의 다른 면역 증강 효과(케모카인 및 사이토카인의 생산, 단핵구 보충과 활성화, 및 증가된 CTL 및 NK 세포 용해성 활성)에 의해 매개될 수 있다. 어팝토시스성 및 죽어가는 종양 세포는 또한 CD40 활성화된 APC에 의해 처리되고 전달되는 종양 특이적 항원의 중요한 공급원이 될 수 있다.
따라서, 치료적, 임상적으로 관련된 항-CD40 아고니스트 항체는 중요하게 필요하다.
도 1a-1h는 분리된 항-CD40 모노클로날 항체 경쇄 및 중쇄 가변부의 예측된 아미노산 서열을 상응하는 경쇄 및 중쇄 유전자의 생식세포 아미노산 서열과 서열 배열한 것이다. 클론과 생식세포 서열간의 차이는 그림자로 나타난다. 생식세포 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 밑줄이 그어져 있다. 중쇄 서열의 배열에서, CDR3 영역에의 명백한 삽입은 생식세포 서열에서 대쉬(-)로 나타내고 CDR3 영역에서 명백한 결실은 클론 서열에서 대쉬(-)로 나타낸다.
도 1a : mAbs 3.1.1 및 7.1.2의 예측된 카파 경쇄 가변 영역 아미노산 서열과 Vκ=A3/A19 및 J=Jκ1 유전자 생식세포 아미노산 서열.
도 1b : 클론 15.1.1로부터의 예측된 카파 경쇄 가변 영역 아미노산 서열과 생식세포 아미노산 서열( Vκ=A3/A19 및 J=Jκ2 ).
도 1c : mAbs 10.8.3 및 21.4.1의 예측된 카파 경쇄 가변 영역 아미노산 서열과 생식세포 아미노산 서열 (Vκ=L5(DP5) 및 J=Jκ4).
도 1d : mAbs 3.1.1의 예측된 중쇄 가변 영역 아미노산 서열과 생식 세포 아미노산 서열 (VH=3-30+ (DP-49), D=D4+DIR3 및 J=JH6);
도 1e : mAbs 7.1.2의 예측된 중쇄 가변 영역 아미노산 서열과 생식 세포 아미노산 서열 (VH=3-30+ (DP-49), D=DIR5+D1-26 및 J=JH6);
도 1f : mAbs 10.8.3의 예측된 중쇄 아미노산 서열과 생식 세포 아미노산 서열 (VH=4.35 (VIV-4), D=DIR3 및 J=JH6);
도 1g : mAbs 15.1.1의 예측된 중쇄 가변 영역 아미노산 서열과 생식 세포 아미노산 서열 (VH=4-59 (DP-71), D=D4-23 및 J=JH4); 및
도 1h : mAbs 21.4.1의 예측된 중쇄 가변 영역 아미노산 서열과 생식 세포 아미노산 서열 (VH=1-02 (DP-75), D=DLR1 및 J=JH4).
도 2a-2h는 분리된 항-CD40 모노클로날 항체 경쇄 및 중쇄 가변부의 예측된 아미노산 서열과 상응하는 경쇄 및 중쇄 유전자의 생식 세포 아미노산 서열의 서열 배열이다. 클론과 생식 세포 서열간의 차이는 진하게 표시된다. 생식 세포 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 밑줄을 긋는다. 중쇄 서열의 배열에서, CDR3 영역에의 명백한 삽입은 생식 세포 서열에서 대쉬 (-)로 나타내고 CDR3 영역에서 명백한 결실은 클론 서열에서 대쉬 (-)로 나타낸다.
도 2a : mAbs 22.1.1, 23.5.1 및 23.29.1의 예측된 카파 경쇄 아미노산 서열과 생식 세포 아미노산 서열 (Vκ=A3/Al9 및 J=Jκ1);
도 2b : mAbs 21.2.1의 예측된 카파 경쇄 아미노산 서열과 생식 세포 아미노산 서열 (Vκ=A3/Al9 및 J=Jκ3);
도 2c : mAbs 23.28.1, 23.28.1L-C29A 및 24.2.1의 예측된 카파 경쇄 아미노산 서열과 생식 세포 아미노산 서열 (Vκ=A27 및 J=Jκ3);
도 2d : mAbs 21.2.1의 예측된 중쇄 아미노산 서열과 생식 세포 아미노산 서열 (VHH=3-30+, D=DIR3+D6-19 및 J=JH4);
도 2e : mAbs 22.1.1, 22.1.1H-C109A의 예측된 중쇄 아미노산 서열과 생식 세포 아미노산 서열 (VHH=3-30+, D=D1-1 및 J=JH6);
도 2f : mAbs 23.5.1의 예측된 중쇄 아미노산 서열과 생식 세포 아미노산 서열 (VHH=3-30+, D=D4-17 및 J=JH6);
도 2g : mAb 23.29.1의 예측된 중쇄 아미노산 서열과 생식 세포 아미노산 서열 (VHH=3-30.3, D=D4-17 및 J=JH6); 및
도 2h : mAb 23.28.1, 23.28.1H-D16E의 예측된 중쇄 아미노산 서열과 생식 세포 아미노산 서열 (VHH=4-59, D=DIR1+D4-17 및 J=JH5).
도 3은 본 발명의 항-CD40 항체(21.4.1)이 사람 가지 세포에 의한 IL-12p40 생산을 증가시키는 능력을 보여주는 투여량-반응 곡선이다.
도 4는 본 발명의 항-CD40 항체(21.4.1)이 사람 가지 세포에 의한 IL-12p70 생산을 증가시키는 능력을 보여주는 투여량-반응 곡선이다.
도 5는 본 발명의 항-CD40 항체(21.4.1)이 Jy 자극 세포의 면역원성을 증가시키고 Jy 표적 세포에 대한 CTL 활성을 증가시키는 능력을 보여주는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 항-CD40 항체(21.4.1)로 처리된 SCID-베이지 마우스에서 CD40 양성 다우디(Daudi) 종양의 성장이 감소되는 것을 보여주는 종양 성장 억제 곡선이다.
도 7은 본 발명의 항-CD40 항체(21.4.1)로 처리된 SCID-베이지 마우스에서 CD40 음성 K562 종양 및 사람 가지 세포 및 T 세포의 성장이 감소되는 것을 보여주는 종양 성장 억제 곡선이다.
도 8은 다른 농도의 항-CD40 아고니스트 mAb 23.29.1에 의해 SCID 마우스에서 CD40 음성 K562 종양의 성장이 억제 되는 것을 보여준다.
도 9는 다른 농도의 항-CD40 아고니스트 mAb 3.1.1에 의해 SCID 마우스에서 CD40 음성 K562 종양의 성장이 억제되는 것을 보여준다.
도 10은 항-CD40 아고니스트 mAb에 의해 SCID 마우스에서 T 세포와 가지 세포의 존재 및 부재하에서 CD40 양성 Raji 종양의 성장이 억제되는 것을 보여준다.
도 11은 항-CD40 아고니스트 항체에 의해 SCID 마우스에서 CD40 양성 Raji 종양의 성장이 억제되는 것을 보여준다.
도 12는 항-CD40 아고니스트 항체에 의해 SCID-베이지 마우스에서 BT 474 유방암 세포의 성장이 억제되는 것을 보여준다.
도 13은 항-CD40 아고니스트 항체에 의해 SCID-베이지 마우스에서 PC-3 전립선 종양의 성장의 억제를 보여준다.
도 14는 Daudi 종양 세포로 주사하고(iv) 항-CD40 아고니스트 항체로 처리된 SCID-베이지 마우스를 위한 생존 곡선이다.
도 15는 환원된(R) 사람 CD40과 환원안된(NR) 사람 CD40에 대한 항-CD40 아고니스트 항체의 웨스턴 블롯 분석이다.
도 16은 마우스와 사람 CD40의 D1-D4 도메인의 배열이다.
도 17은 키메라의 융합 부위의 위치를 보여주는 마우스 및 사람 CD40 아미노산 서열의 배열이다.
도 18은 키메라 CD40 구조체의 도식의 그룹이다.
발명의 개요
본 발명은 CD40에 결합하고 CD40 아고니스트로 작용하는 분리된 항체 또는 그 항원-결합 부분을 제공한다.
본 발명은 항-CD40 항체, 또는 그 항원 결합 부분, 및 약학적 허용 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 이 조성물은 항-종양 제제 또는 영상화 제제와 같은 다른 성분을 추가로 포함할 수 있다. 진단 방법 및 치료 방법 또한 본 발명에 의해 제공된다.
본 발명은 항-CD40 항체 또는 그 항원 결합 부분을 생산하는, 하이브리도마와 같은 분리된 세포주를 제공한다.
본 발명은 또한 항-CD40 항체의 중쇄 및/또는 경쇄, 또는 그 항원-결합 부분을 암호하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명은 이 핵산 분자에 의해 암호된 폴리펩티드를 재조합적으로 생산하는 방법뿐만 아니라 이 핵산 분자를 포함하는 벡터와 숙주 세포를 제공한다.
항-CD40 항체의 중쇄 및/또는 경쇄, 또는 그 항원 결합 부분을 발현하는 비-인간 트랜스제닉 동물이 제공된다.
본 발명은 또한 항-CD40 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 또는 그 항원-결합 부분을 암호하는 핵산 분자의 유효량으로 이를 필요로 하는 대상을 치료하는 방법을 제공한다.
발명의 상세한 설명
정의 및 일반적인 기법
달리 정의되지 않으면, 본 발명과 관련하여 사용되는 과학적 및 기술적 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 의미를 갖는다. 또한, 내용상 달리 요구되지 않으면, 단수 용어는 복수를 포함하며 복수 용어는 단수를 포함한다. 일반적으로, 본원에서 개시된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 하이브리드화와 관련하여 사용되는 명명법 및 기법은 당업계에 잘 알려지고 통상적으로 이용되는 것들이다.
본 발명의 방법과 기법은 달리 표시되지 않으면 일반적으로 당업계에 공지되고 본 명세서를 통해 인용되고 언급된 다양한 일반적이고 더욱 구체적인 참고 문헌에 개시된 대로 통상적인 방법에 따라 수행된다. 예를 들어, 본원에 참고로 인용되는 Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), 및 Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1990)를 참고한다. 효소 반응과 정제 기법은 당업계에서 흔히 수행되거나 본원에서 개시된 대로, 제조자의 설명서에 따라 수행된다. 본원에서 개시된 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의학 및 약학 화학과 관련하여 사용되는 명명법 및 실험실 방법 및 기법은 당업계에 잘 알려지고 흔히 이용되는 것들이다. 화학 합성, 화학 분석, 약학 조제, 제제화, 및 전달 및 환자의 치료를 위해 표준 기법을 사용한다.
달리 표시되지 않으면, 하기 용어는 하기 의미를 갖는 것으로 이해된다:
용어 "폴리펩티드"는 천연 또는 인공 단백질, 단백질 단편 및 단백질 서열의 폴리펩티드 유사체를 포함한다. 폴리펩티드는 단량체 또는 중합체일 수 있다.
용어 "분리된 단백질", "분리된 폴리펩티드" 또는 "분리된 항체"는 그 기원 또는 유래 공급원에 의해 (1) 그 천연 상태에서 그것에 수반되는 천연 연합 성분과 관련되지 않거나, (2) 동일 종으로부터의 다른 단백질이 없거나, (3) 다른 종으로부터의 세포에 의해 발현되거나, 또는 (4) 자연에서 발생하지 않는 단백질, 폴리펩티드 또는 항체이다. 따라서, 화학적으로 합성되거나 또는 그것이 천연에서 기원하는 세포와 다른 세포 시스템에서 합성된 폴리펩티드는 그것의 천연 연합 성분과는 "분리된" 것일 것이다. 단백질은 또한 당업계에 공지된 단백질 정제 기법을 이용하여 분리하여 천연 연합 성분이 실질적으로 없게 할 수 있다.
분리된 항체의 예는 CD40을 이용하여 친화성 정제된 항-CD40 항체, 하이브리도마 또는 다른 세포주에 의해 생체외에서 합성된 항-CD40 항체, 및 트랜스제닉 마우스로부터 유래된 인간 항-CD40 항체를 포함한다.
단백질 또는 폴리펩티드는 샘플의 적어도 약 60 내지 75%가 단일종의 폴리펩티드를 나타낼 때 "실질적으로 순수"하거나, "실질적으로 균질"하거나 또는 "실질적으로 정제"된 것이다. 폴리펩티드 또는 단백질은 단량체 또는 다량체일 수 있다. 실질적으로 순수한 폴리펩티드 또는 단백질은 일반적으로 약 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% W/W의 단백질 샘플, 더욱 일반적으로는 약 95%를 포함할 것이며, 그리고 바람직하게는 99% 이상 순수할 것이다. 단백질 순도 또는 균질성은 단백질 샘플의 폴리아크릴아미드 젤 전기영동 및 이어서 당업계에 공지된 염색약으로 젤을 염색하여 단일 폴리펩티드 밴드를 가시화하는 것과 같은, 당업계에서 공지된 많은 수단에 의해 나타내질 수 있다. 어떤 목적을 위해서는, HPLC 또는 정제를 위해 당업계에 공지된 다른 수단을 이용하여 고 해상도를 제공할 수도 있다.
본원에서 사용된 용어 "폴리펩티드 단편"은 아미노-말단 및/또는 카르복시 말단 결실을 갖지만 남아있는 아미노산 서열이 천연-발생 서열에서 상응하는 위치와 동일한 폴리펩티드를 말한다. 일부 구체예에서, 단편은 적어도 5,6,8 또는 10 아미노산 길이이다. 다른 구체예에서, 단편은 적어도 14, 적어도 20, 적어도 50, 또는 적어도 70, 80, 90, 100, 150 또는 200 아미노산 길이이다.
본원에서 사용된 용어 "폴리펩티드 유사체"는 아미노산 서열의 일부에 상당한 동일성을 가지며 하기 특성중 적어도 하나를 갖는 단편을 포함하는 폴리펩티드를 말한다: (1) 적합한 결합 조건하에서 CD40에의 특이적 결합, (2) CD40을 활성화시키는 능력, (3) ICAM, MHC-II, B7-1, B7-2, CD71, CD23, 및 CD83과 같은 세포 표면 분자의 발현을 상향 조절하는 능력, 또는 (4) IFN-β1, IL-2, IL-8, IL-12, IL-15, IL-18 및 IL-23과 같은 사이토카인의 분비를 증가시키는 능력. 일반적으로, 폴리펩티드 유사체는 자연-발생 서열에 대해 보존적 아미노산 치환(또는 삽입 또는 결실)을 포함한다. 유사체는 일반적으로 적어도 20 또는 25 아미노산 길이, 바람직하게는 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 또는 200 아미노산 길이 또는 그 이상의 길이이며, 종종 전길이 자연-발생 폴리펩티드만큼 길수도 있다.
바람직한 아미노산 치환은 (1) 단백질분해에 대한 민감성을 감소시키거나, (2) 산화에 대한 민감성을 감소시키거나, (3) 단백질 복합체를 형성하는 결합 친화도를 변화시키거나, (4) 그러한 유사체의 물리화학적 또는 기능적 특성을 부여하거나 변형시키는 것들이다. 유사체는 자연-발생 펩티드 서열 이외의 서열의 다양한 뮤테인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단일 또는 다수 아미노산 치환(바람직하게는 보존적 아미노산 치환)이 자연-발생 서열(바람직하게는 분자간 접촉을 형성하는 도메인 밖의 폴리펩티드 부분에서)에서 만들어질 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 모 서열의 구조적 특성을 실질적으로 변화시키지 않아야 한다(예, 대체 아미노산은 모 서열에서 발생하는 헬릭스를 파괴하거나 모 서열을 특징짓는 이차 구조의 다른 타입을 파괴해서는 안된다). 당업계에서 인식하는 폴리펩티드 이차 및 삼차 구조의 예는 본원에 참고로 인용되는 Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York(1984)) ; Introduction to Protein Structure (C. Branden andJ. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N. Y. (1991)) ; 및 Thornton et al., Nature 354: 105 (1991)에 개시된다.
비-펩티드 유사체는 주형 펩티드의 특성과 유사한 특성을 갖는 약제로서 약학 산업에서 흔히 이용된다. 이러한 유형의 비-펩티드 화합물은 "펩티드 모방체" 또는 "펩티도모방체"로 불린다. 본원에 참고로 인용되는 Fauchere,J. Adv.Drug Res. 15: 29 (1986); Veber and Freidinger,TINS p. 392(1985) ; 및 Evans et al., J. Med. Chem. 30: 1229 (1987)를 참고한다. 그러한 화합물은 종종 컴퓨터화된 분자 모델링의 도움으로 개발된다. 치료적으로 유용한 펩티드에 구조적으로 유사한 펩티드 모방체를 이용하여 동등한 치료적 또는 예방적 효과를 생산할 수도 있다. 일반적으로, 펩티도모방체는 인간 항체와 같은 패러다임 폴리펩티드(즉, 원하는 생화학적 특성 또는 약리학적 활성을 갖는 폴리펩티드)에 구조적으로 유사하지만, 당업계에 공지된 방법에 의해 CH2NH--,--CH2S--,--CH2-CH2--,--CH=CH--(cis 및 trans),--COCH2--,--CH(OH)CH2--, 및 -CH2SO-- 로 이루어진 군으로부터 선택된 결합에 의해 선택적으로 치환된 펩티드 결합 하나 이상을 갖는다. 컨센서스(consensus) 서열의 아미노산 하나 이상을 동일 유형의 D-아미노산으로 체계적으로 치환하여(예, L-라이신 대신 D-라이신) 보다 안정한 펩티드를 생성시킬 수 있다. 또한, 컨센서스 서열 또는 실질적으로 동일한 컨센서스 서열 변이를 포함하는 억제된(constrained) 펩티드를 공지된 방법(Rizo and Gierasch, Ann. Rev. Biochem. 61: 387 (1992),참고로 본원에 인용됨)에 의해, 예를 들어 펩티드를 고리화하는 분자내 이황화 가교를 형성할 수 있는 내부 시스테인 잔기를 첨가하여, 생성할 수 있다.
"항체"는 완전한 항체, 또는 특이적 결합에 대해 본래의 항체와 경쟁하는 그 항원-결합 부분을 의미한다. 일반적으로, Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N. Y. (1989))(전체가 참고로 본원에 인용됨)를 참고한다. 항원-결합 부분은 재조합 DNA 기법에 의해 또는 본래 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생산할 수도 있다. 항원-결합 부분은 특히 Fab, Fab', F (ab')2, Fd, Fv, dAb, 및 폴리펩티드에의 특이적 항원 결합을 부여하기에 충분한 항체의 부분을 적어도 함유하는 상보성 결정 영역(CDR) 단편, 단일쇄 항체(scFv), 키메라 항체, 디아바디(diabodies) 및 폴리펩티드를 포함한다.
N-말단으로부터 C-말단으로, 경쇄 및 중쇄 가변부 둘다 영역 FR1,CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각 도메인에의 아미노산 지정은 Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991) ), 또는 Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987); Chothia et al., Nature 342: 878-883 (1989)의 정의에 따른 것이다.
본원에서 사용될 때, 번호로 불리는 항체는 동일한 번호의 하이브리도마로부터 얻어진 모노클로날 항체이다. 예를 들어, 모노클로날 항체 3.1.1은 하이브리도마 3.1.1로부터 얻어진다.
본원에서 사용될 때, Fd 단편은 VH와 CH 1 도메인으로 구성되는 항체 단편을 의미하고; Fv 단편은 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 구성되며; dAb 단편 (Ward et al., Nature 341: 544-546(1989))은 VH 도메인으로 구성된다.
일부 구체예에서, 항체는 VL 및 VH 도메인이 이들이 단일 단백질 쇄로 만들어지도록 하는 합성 링커를 통해 짝을 이루어 일가 분자를 형성한 단일쇄 항체(scFv)이다. (Bird et al., Science 242: 423-426 (1988) 및 Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883(1988).) 일부 구체예에서, 항체는 디아바디, 즉, 단일 폴리펩티드 쇄 상에 VL 및 VH 도메인이 발현되지만, 단일 쇄상의 두 도메인간의 결합을 허용하기에는 짧은 링커를 이용하여 이들 도메인이 다른 쇄의 상보성 도메인과 짝을 이루도록 하여 두 개의 항원 결합 부위를 생성한 이가 항체이다.(See e. g., Holliger P. et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993), 및 Poljak R. J. et al., Structure 2:1121-1123 (1994).) 일부 구체예에서, 본 발명의 항체로부터의 하나 이상의 CDR을 공유적으로 또는 비공유적으로 분자내에 통합시켜 그 분자를 CD40에 특이적으로 결합하는 면역부착소로 만들수도 있다. 그러한 구체예에서, CDR은 보다 큰 폴리펩티드 쇄의 일부로 통합될 수도 있고, 다른 폴리펩티드 쇄에 공유적으로 연결되거나 또는 비공유적으로 통합될 수도 있다.
하나 이상의 결합 부위를 갖는 구체예에서, 결합 부위는 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
본원에서 사용될 때, 용어 "인간 항체"는 가변부와 불변부 서열의 모두가 인간 서열인 항체를 의미한다. 이들 항체는 하기하는 바대로 다양한 방식으로 제조될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "키메라 항체"는 둘 이상의 다른 항체로부터의 영역을 포함하는 항체를 의미한다. 한 구체예에서, 하나 이상의 CDR은 인간 항-CD40 항체로부터 유래된다. 다른 구체예에서, 모든 CDR은 인간 항-CD40 항체로부터 유래된다. 다른 구체예에서, 하나 보다 많은 인간 항-CD40 항체로부터의 CDR이 키메라 항체에 배합된다. 예를 들어, 키메라 항체는 첫번째 인간 항-CD40 항체의 경쇄로부터의 CDR1, 두번째 인간 항-CD40 항체의 경쇄로부터의 CDR2 및 세번째 인간 항-CD40 항체의 경쇄로부터의 CDR3를 포함할 수 있으며, 중쇄로부터의 CDR은 하나 이상의 다른 항-CD40 항체로부터 유래될 수도 있다. 또한, 골격 영역은 동일한 항-CD40 항체중 하나로부터 또는 하나 이상의 다른 사람으로부터 유래될 수도 있다.
본원에서 이용될 때 "활성화 항체"("아고니스트 항체"로도 불림)는 CD40을 발현하는 세포, 조직 또는 유기체에 첨가될 때 적어도 약 20%만큼 하나 이상의 CD40 활성을 증가시키는 항체를 의미한다. 일부 구체예에서, 항체는 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%만큼 CD40 활성을 활성화시킨다. 일부 구체예에서, 활성화 항체는 CD40L의 존재하에 첨가된다. 일부 구체예에서, 활성화 항체의 활성은 전체 혈액 표면 분자 상향조절 분석을 이용하여 측정한다. 실시예 VII을 참고한다. 다른 구체예에서, 활성화 항체의 활성은 IL-12 방출을 측정하는 가지 세포 분석을 이용하여 측정한다. 실시예 VII을 참고한다. 다른 구체예에서, 활성화 항체의 활성은 생체내 종양 모델을 이용하여 측정한다. 실시예 X을 참고한다.
항체 또는 면역글로불린 분자의 단편 또는 유사체는 본 명세서의 개시에 따라 당업자가 용이하게 재조할 수 있다. 단편 또는 유사체의 바람직한 아미노- 및 카르복시 말단은 기능성 도메인의 경계 근처에서 발생한다. 구조적 및 기능적 도메인은 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열 데이터를 공공 또는 특허 서열 데이터베이스와 비교하여 동정할 수 있다. 바람직하게는, 컴퓨터화된 비교 방법을 이용하여 공지 구조 및/또는 기능의 다른 단백질에서 발생하는 서열 모티프 또는 예측된 단백질 배열을 동정한다. 공지의 삼차 구조로 접히는 단백질 서열을 동정하는 방법은 공지되어 있다. Bowie et al., Science 253: 164 (1991)을 참고한다.
본원에서 사용될 때, 용어 "표면 플라스몬(plasmon) 공명"은 예를 들어 BIA 코어 시스템(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N. J.)을 이용하여, 바이오센서 매트릭스내의 단백질 농도의 변화를 검출하여 실시간 생물특이적 상호작용을 분석할 수 있도록 하는 광학적 현상을 말한다. 추가 설명을 위해서는, Jonsson U. et al., Ann. Biol. Clin. 51: 19-26 (1993); Jonsson U. etal., Biotechniques 11: 620-627 (1991); Jonsson B. et al., J.Mol. Recognit. 8: 125-131 (1995); 및 Johnsson B. et al., Anal. Biochem. 198: 268-277 (1991)을 참고한다.
용어 "KD"는 특정 항체-항원 상호작용의 평형 해리 상수를 말한다.
용어 "에피토프"는 면역글로불린 또는 T-세포 수용체에 특이적 결합을 할 수 있는 임의의 단백질 결정인자를 포함한다. 에피토프 결정인자는 대개 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹핑으로 이루어지며 대개 특이적 전하 특성뿐만 아니라 특이적 삼차 구조 특성을 갖는다. 항체는 평형 해리 상수가 1 μM 이하, 바람직하게는 100nM 이하, 가장 바람직하게는 10nM 이하일 때 항원에 특이적으로 결합한다고 한다.
본원에서 사용될 때, 20개의 통상의 아미노산과 그들의 약자는 통상의 사용법을 따른다. 본원에 참고로 인용되는 Immunology-A Synthesis (2 Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass.(1991))를 참고한다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드"는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드 또는 이들 어느 유형의 뉴클레오티드의 변형된 형태인, 적어도 10 염기 길이인 뉴클레오티드 중합체 형태를 의미한다. 이 용어는 단일쇄 형태 및 이중쇄 형태를 포함한다.
본원에서 사용될 때 용어 "분리된 폴리뉴클레오티드"는 게놈, cDNA, 또는 합성 기원 또는 그 일부 조합의 폴리뉴클레오티드로서, 그 기원에 의해 "분리된 폴리뉴클레오티드"는 (1) 이 "분리된 폴리뉴클레오티드"가 자연에서 함께 발견되는 폴리뉴클레오티드들 모두 또는 일부와 연합되어 있지 않거나, (2) 자연에서는 연결되어 있지 않은 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되거나, 또는 (3) 자연에서는 더 큰 서열의 일부로 발생하지 않는다.
본원에서 사용된 용어 "올리고뉴클레오티드" 자연 발생 및 비-자연 발생 올리고뉴클레오티드 결합에 의해 함께 연결된 자연 발생, 및 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 200 염기 이하의 길이를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서브세트이다. 바람직하게는 올리고뉴클레오티드는 10 내지 60 염기 길이이고 가장 바람직하게는 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 내지 40 염기 길이이다. 올리고뉴클레오티드는 유전자 돌연변이의 구성에 사용하기 위해 이중쇄일수도 있지만, 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 프라이머와 프로브를 위해 대개 단일쇄이다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
본원에서 사용될 때 용어 "자연 발생 뉴클레오티드"는 데옥시리보뉴클레오티드와 리보뉴클레오티드를 포함한다. 본원에서 사용될 때 용어 "변형된 뉴클레오티드"는 변형되거나 치환된 당기 등을 가진 뉴클레오티드를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "올리고뉴클레오티드 결합"은 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포르아닐라데이트, 포스포로아미데이트, 등과 같은 올리고뉴클레오티드 결합을 포함한다. 예를 들어 LaPlanche et al., Nucl. Acids Res. 14: 9081(1986) ; Stec et al., J. Am. Chenz. Soc. 106: 6077 (1984); Stein et al., Nucl. Acids Res. 16: 3209 (1988); Zon et al., Anti-Cancer Drug Design 6: 539 (1991) ; Zon et al., Oligonucleotides and Analogues : A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); 미국 특허 제5,151,510호; Uhlmann and Peyman, Cliemical Reviews 90: 543(1990)를 참고하며, 이들의 개시 내용은 참고로 본원에 인용된다. 올리고뉴클레오티드는 필요하면 검출을 위한 라벨을 포함할 수 있다.
"작동 가능하게 연결된" 서열은 관심 유전자와 인접한 발현 조절 서열 및 떨어져서 또는 트랜스로 작용하여 관심 유전자를 조절하는 발현 조절 서열 둘다를 포함한다. 본원에서 사용될 때 용어 "발현 조절 서열"은 그들이 연결된 암호 서열의 발현 및 프로세싱이 일어나도록 하는 데 필요한 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 발현 조절 서열은 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 스플라이싱및 폴리아데닐화 시그날과 같은 효율적인 RNA 프로세싱 시그날 ; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 증가시키는 서열 (즉, Kozak 컨센서스 서열); 단백질 안정성을 증가시키는 서열; 및 필요할 경우, 단백질 분비를 증가시키는 서열을 포함한다. 그러한 조절 서열의 특성은 숙주 유기체에 따라 상이하여, 원핵세포에서는 그러한 조절 서열은 일반적으로 프로모터, 리보솜 결합 부위 및 전사 종결 서열을 포함하며; 진핵 세포에서는 일반적으로 그러한 조절 서열은 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함한다. 용어 "조절 서열"은 최소한, 그 존재가 발현 및 프로세싱에 필수적인 모든 성분을 포함하는 것으로 의도되며, 또한 그 존재가 이익이 되는 부가 성분, 예를 들어 리더 서열 및 융합 파트너 서열을 포함할 수 있다.
본원에서 사용될 때, 용어 "벡터"는 그것이 연결된 다른 핵산 분자를 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 일부 구체예에서, 벡터는 플라스미드, 즉 부가의 DNA 단편이 연결될 수 있는 원형의 이중 쇄 DNA 루프이다. 일부 구체예에서, 벡터는 바이러스 벡터이며, 여기서 부가의 DNA 단편은 바이러스 게놈내로 연결될 수도 있다. 일부 구체예에서, 벡터는 그들이 도입되는 숙주 세포에서 자가 복제를 할 수 있다(예를 들어, 박테리아의 복제 오리진을 갖는 박테리아 벡터 및 에피좀 포유류 벡터). 다른 구체예에서, 벡터(예, 비-에피좀 포유류 벡터)는 숙주 세포내로 도입시에 숙주 세포의 게놈내로 통합될 수 있으며, 그 결과 숙주 게놈과 함께 복제된다. 더욱이, 일부 벡터는 그들이 작동 가능하게 연결되는 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 그러한 벡터는 "재조합 발현 벡터"(또는 간단하게, "발현 벡터")로 본원에서 불린다.
본원에서 사용될 때 용어 "재조합 숙주 세포"(또는 간단하게 "숙주 세포")는 재조합 발현 벡터가 도입되는 세포를 의미한다. "재조합 숙주 세포"와 "숙주 세포"는 특정 대상 세포뿐만 아니라 그러한 세포의 후손도 의미함을 이해해야 한다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 후손에서 일부 변형이 일어날 수 있으므로, 그러한 후손은 사실상 모 세포와 동일하지 않을 수 있으나, 여전히 본원에서 사용될 때 용어 "숙주 세포"의 범위내에 포함된다.
본원에서 사용할 때 용어 "선택적으로 하이브리드하는"은 검출가능하게 그리고 특이적으로 결합하는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 및 그 단편은 비특이적 핵산에 대한 검출가능한 결합의 양을 최소화하는 하이브리드화 및 세척 조건하에서 핵산 쇄에 선택적으로 하이브리드한다. "높은 엄격도" 또는 "매우 엄격한" 조건을 이용하여 당업계에 공지되고 본원에서 개시되는 선택적 하이브리드화 조건을 달성할 수 있다. "높은 엄격도" 또는 "매우 엄격한" 조건의 한 예는, 막과 같은 고체 표면에 고정될 수 있는 한 폴리뉴클레오티드를 6X SSPE 또는 SSC, 50% 포름아미드, 5X 덴하르트(Denhardt's) 시약, 0.5% SDS, 100㎍/ml 변성되고 단편화된 연어 정자 DNA의 하이브리드화 완충액에서 42℃의 하이브리드화 온도에서 12-16 시간동안 다른 폴리뉴클레오티드와 항온처리하고, 이어서 1X SSC, 0.5% SDS의 세척 완충액을 이용하여 55℃에서 두번 세척하는 것이다. 상기의 Sambrook et al., pp. 9.50-9. 55를 역시 참고한다.
핵산 서열의 내용에서 용어 "퍼센트 서열 동일성"은 최대 일치성을 갖도록 배열할 때 두 서열에서 동일한 잔기를 의미한다. 서열 동일성 비교의 길이는 적어도 약 9 뉴클레오티드, 일반적으로 적어도 약 18 뉴클레오티드, 보다 일반적으로 적어도 약 24 뉴클레오티드, 전형적으로 적어도 약 28 뉴클레오티드, 더욱 전형적으로 적어도 약 32 뉴클레오티드 그리고 바람직하게는 적어도 약 36, 48 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 스트레치이다. 뉴클레오티드 서열 동일성을 측정하기 위해 이용될 수 있는 많은 상이한 알고리즘이 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, FASTA, Gap 또는 Bestfit(Wisconsin Package Version 10.0내의 프로그램임(Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin))을 이용하여 폴리뉴클레오티드 서열을 비교할 수 있다. 예를 들어, 프로그램 FASTA2와 FASTA3를 포함하는 FASTA는 질의(query) 서열과 조사(search) 서열간의 배열 및 최상의 겹침 영역의 퍼센트 서열 동일성을 제공한다 ((Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Methods MoL Biol. 132: 185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol. 266: 227-258 (1996); Pearson,J.Mol. Biol. 276: 71-84 (1998); 참고로 본원에 인용됨). 달리 특정되지 않으면, 특정 프로그램 또는 알고리즘을 위한 디폴트 파라미터가 이용된다. 예를 들어, 핵산 서열들간의 퍼센트 서열 동일성은 그 디폴트 파라미터(글자 크기 6 및 스코어링 매트릭스를 위한 NOPAM 인자)로 FASTA를 이용하거나, 또는 GCG 버젼 6.1에 제공되는 디폴트 파라미터로 Gap을 이용하여 결정할 수 있다.
뉴클레오티드 서열에 대한 언급은 달리 표시되지 않으면 그것의 상보체를 포함한다. 따라서, 특정 서열을 갖는 핵산에 대한 언급은 그 상보성 서열을 갖는 상보성 쇄를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
분자 생물학 분야에서, 연구자들은 용어 "퍼센트 서열 동일성", "퍼센트 서열 유사성" 및 "퍼센트 서열 상동성"을 상호교환적으로 이용한다. 이 분야에서, 이들 용어는 단지 핵산 서열에 대해서만 동일한 의미를 가질 것이다.
핵산 또는 그 단편을 언급할 때, 용어 "상당한 유사성" 또는 "상당한 서열 유사성"은, 적절한 뉴클레오티드 삽입 또는 결실을 가지고 다른 핵산(또는 그 상보성 쇄)과 배열될 때, 전술한 FASTA, BLAST 또는 Gap과 같은 공지된 서열 동일성 알고리즘에 의해 측정할 때 적어도 약 85%, 바람직하게는 적어도 약 90%, 및 더욱 바람직하게는 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 뉴클레오티드 염기에서 뉴클레오티드 서열 동일성이 있는 것을 의미한다.
폴리펩티드에 적용될 경우, 용어 "상당한 동일성"은 디폴트 갭 중량을 이용하여 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해 적절히 배열될 때, 두 펩티드 서열이 적어도 70, 75, 또는 80 퍼센트 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 90 또는 95 퍼센트 서열 동일성, 그리고 더욱 바람직하게는 적어도 97, 98, 또는 99 퍼센트 서열 동일성을 갖는 것을 의미한다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 상이하다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성(예, 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄 R기를 갖는 다른 아미노산 잔기에 의해 치환된 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능적 특성을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 둘 이상의 아미노산 서열이 보존적 치환에 의해 서로 상이한 경우, 퍼센트 서열 동일성 또는 유사성 정도는 치환의 보존적 특성에 대해 교정하기 위해 상향 조절될 수도 있다. 이러한 조절을 하기 위한 수단은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, Pearson, Methods Mol. Biol. 243: 307-31 (1994)를 참고한다. 유사한 화학적 특성을 가진 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹들의 예는 1) 지방족 측쇄 : 글리신, 알라닌, 발린, 루이신, 및 이소루이신; 2) 지방족-하이드록실 측쇄 : 세린 및 트레오닌; 3) 아미드-함유 측쇄 :아스파라긴 및 글루타민; 4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판; 5) 염기성 측쇄: 리신, 아르기닌, 및 히스티딘; 6) 산성 측쇄 : 아스파트산 및 글루탐산; 및 7) 황-함유 측쇄: 시스테인 및 메티오닌이다. 바람직한 보존적 아미노산 치환 그룹은 발린-루이신-이소루이신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루타메이트-아스파테이트, 및 아스파라긴-글루타민이다.
다르게는, 보존적 치환은 본원에 참고로 인용되는 Gonnet et al., Science 256: 1443-45 (1992)에 개시된 PAM250 로그-가능성 매트릭스에서 양성 값을 갖는 임의의 변화이다. "적당하게 보존적인" 치환은 PAM250 로그-가능성 매트릭스에서 음성이 아닌 값을 갖는 임의의 변화이다.
서열 동일성이라고도 불리는, 폴리펩티드의 서열 유사성은 일반적으로 서열 분석 소프트웨어를 이용하여 측정한다. 단백질 분석 소프트웨어는 보존적 아미노산 치환을 포함한 다양한 치환, 결실 및 기타 변형에 주어진 유사성의 측정을 이용하여 유사한 서열을 매치시킨다. 예를 들어, GCG는 유기체의 다른 종들로부터의 상동성 폴리펩티드와 같은 밀접하게 관련된 폴리펩티드간 또는 야생형 단백질과 그 뮤테인간의 서열 상동성 또는 서열 동일성을 결정하기 위해 디폴트 파라미터를 가지고 이용될 수 있는 "Gap" 및 "Bestfit"과 같은 프로그램을 함유한다. 예를 들어 GCG 버젼 6.1을 참고한다. 폴리펩티드 서열은 또한 GCG 버젼 6.1내의 프로그램인 FASTA를 디폴트 또는 추천된 파라미터를 이용하여 비교할 수 있다. FASTA (예, FASTA2와 FASTA3)는 질의 서열과 조사 서열간의 배열 및 최상의 겹침 영역의 퍼센트 서열 동일성을 제공한다 (Pearson, Methods Enzymol. 183: 63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132: 185-219 (2000)). 본 발명의 서열을 다른 유기체들로부터의 많은 서열을 함유하는 데이터베이스와 비교할 때 바람직한 다른 알고리즘은 디폴트 파라미터를 이용한 컴퓨터 프로그램 BLAST, 특히 blastp 또는 tblastn이다. 예를 들어, 본원에 참고로 인용되는 Altschul et al.,J MoL BioL 215: 403-410 (1990); Altschul et al.,Nucleic Acids Res. 25: 3389-402 (1997)을 참고한다.
상동성을 위해 비교되는 폴리펩티드 서열의 길이는 일반적으로 적어도 약 16 아미노산 잔기, 대개 적어도 약 20 잔기, 더욱 일반적으로 적어도 약 24 잔기, 전형적으로 적어도 약 28 잔기, 그리고 바람직하게는 약 35 잔기 이상일 것이다. 많은 다른 유기체들의 서열을 함유하는 데이터베이스를 조사할 경우, 아미노산 서열을 비교하는 것이 바람직하다.
본원에서 사용될 때, 용어 "표지" 또는 "표지된"은 항체내에 다른 분자가 통합됨을 의미한다. 한 구체예에서, 표지는 검출가능한 마커이며, 예를 들어 방사성표지된 아미노산의 통합, 또는 표시된 아비딘(예, 광학적 또는 색채적 방법으로 검출될 수 있는 형광 마커 또는 효소 활성을 함유하는 스트렙타비딘)에 의해 검출될 수 있는 비오티닐 부의 폴리펩티드에의 부착이 있다. 다른 구체예에서, 표지 또는 마커는 치료적일 수 있으며, 예를 들어 약제 접합물 또는 독소일 수 있다. 폴리펩티드와 당단백질을 표지하는 다양한 방법이 공지되어 있으며 이용될 수 있다. 폴리펩티드를 위한 표지의 예는 하기를 포함하며 이에 한정되지 않는다: 방사성동위원소 또는 방사성핵종(예, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), 형광 표지(예, FITC, 로다민, 란타나이드 포스포어), 효소 표지(예, 양고추냉이 퍼옥시다제, β-갈락토시다제, 루시퍼라제, 알카라인 포스파타제), 화학발광 마커, 비오티닐기, 2차 리포터에 의해 인식되는 선결정된 폴리펩티드 에피토프(예, 루이신 지퍼쌍 서열, 2차 항체를 위한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그), 가도리늄 킬레이트와 같은 자기 제제, 페르투시스 독소와 같은 독소, 택솔, 사이토칼라진 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포사이드, 테노포사이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 다이하이드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 액티노마이신 D, 1-디하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로케인, 테트라케인, 리도케인, 프로프라노롤, 및 푸로마이신 및 그 유사체 또는 상동체. 일부 구체예에서, 표지는 잠재적인 입체 방해를 감소시키기 위해 다양한 길이의 스페이서 아암에 의해 부착된다.
용어 환자는 인간과 가축을 포함한다.
본 명세서와 청구범위를 통하여, 단어 "포함하다" 또는 "포함하다" 또는 "포함하는"과 같은 그 변형어는 진술된 정수 또는 정수들의 그룹을 포함함을 의미하지만 임의의 기타 정수 또는 정수 그룹이 제외됨을 의미하지는 않는다.
인간 항-CD40 항체 및 그들의 특성 규명
인간 항체는 비인간(예, 설치류) 가변 영역 및/또는 불변 영역을 보유한 항체와 관련된 문제점들의 일부를 회피한다. 그러한 문제점은 항체의 신속한 제거 또는 그 항체에 대한 면역 반응을 포함한다. 따라서, 한 구체예에서, 본 발명은 인간화된 항-CD40 항체를 제공한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 인간 항-CD40 항체를 제공한다. 일부 구체예에서, 인간 항-CD40 항체는, 게놈이 인간 면역글로불린 유전자를 포함하는 설치류를 면역시켜 그 설치류가 인간 항체를 생산하도록 함으로써 생산된다. 인간 항-CD40 항체는 비인간 또는 비인간 유래된 모노클로날 항체(Mabs)에 고유한 면역원성 및 알러젠성 반응을 최소화시키고 따라서 투여된 항체의 효율성과 안전성을 증가시킬 것으로 예상된다. 완전한 인간 항체의 사용은 반복된 항체 투여를 요구할 수 있는 염증 및 암과 같은 만성 및 재발성 인간 질병의 치료에서 상당한 잇점을 제공할 것으로 예상된다.
본 발명은 11개의 활성화 인간 항-CD40 모노클로날 항체(mAbs) 및 그들을 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공한다. 표 A는 전길이 중쇄 및 경쇄를 암호하는 핵산(리더 서열 포함)의 서열 동정자(서열 번호: ), 상응하는 전길이 추론 아미노산 서열, 및 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 및 추론 아미노산 서열을 열거한다.
인간 항-CD40 항체
MAb 서열 동정자(서열 번호:)
가변영역 전길이
중쇄 경쇄 중쇄 경쇄
DNA 단백질 DNA 단백질 DNA 단백질 DNA 단백질
3.1.1 1 2 3 4 5 6 7 8
7.1.2 9 10 11 12 13 14 15 16
10.8.3 17 18 19 20 21 22 23 24
15.1.1 25 26 27 28 29 30 31 32
21.2.1 33 34 35 36 37 38 39 40
21.4.1 41 42 43 44 45 46 47 48
22.1.1 49 50 51 52 53 54 55 56
23.5.1 57 58 59 60 61 62 63 64
23.28.1 65 66 67 68 69 70 71 72
23.29.1 73 74 75 76 77 78 79 80
24.2.1 81 82 83 84 85 86 87 88
본 발명은 추가로 인간 항-CD40 mAb 23.25.1과 이를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공한다.
본 발명은 추가로 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 상기 열거된 인간 항-CD40 mAbs의 일부의 중쇄 및/또는 경쇄 변이체를 제공한다. 본 발명은 mAb 3.1.1의 두 개의 변이 중쇄를 제공한다. 하나에서는, 잔기 78의 알라닌이 트레오닌으로 바뀐다. 두번째에서는, 잔기 78의 알라닌이 트레오닌으로 바뀌며, 잔기 88과 97의 발린이 알라닌으로 바뀐다. 본 발명은 또한 mAb 3.1.1의 변이 경쇄를 제공하며, 여기서는 잔기 4의 루이신과 잔기 83의 루이신이 메티오닌과 발린으로 각각 바뀐다. 변이 중쇄 또는 경쇄와 야생형 경쇄 또는 중쇄의 각각의 조합은 돌연변이 쇄에 의해 표시된다. 따라서, 야생형 경쇄와 잔기 78에서 알라닌에서 트레오닌으로의 돌연변이를 포함한 중쇄를 함유한 항체는 3.1.1H-A78T로 표시된다. 하지만, 본 발명의 다른 구체예에서는, 3.1.1의 변이 중쇄와 변이 경쇄의 임의의 조합을 함유하는 항체가 포함된다.
또한, 본 발명은 mAb 22.1.1의 중쇄의 변이체를 제공하며, 여기서는 잔기 109의 시스테인이 알라닌으로 바뀐다. 변이 중쇄와 22.1.1 경쇄를 포함한 모노클로날 항체는 mAb 22.1.1 H-C109A로 표시된다. 본 발명은 또한 mAb 23.28.1의 두 개의 변이 중쇄와 변이 경쇄를 제공한다. 하나의 중쇄 변이체에서는, 잔기 16의 아스파르트산이 글루탐산으로 바뀐다. 변이 중쇄 변이체와 23.28.1 경쇄를 포함하는 mAb는 23.28.1H-D16E로 표시된다. 본 발명은 또한 23.28.1 경쇄 변이체를 포함하며 여기서 잔기 92의 시스테인은 알라닌으로 바뀐다. 23.28.1 중쇄와 변이 경쇄를 포함하는 mAb는 23.28.1 L C92A로 표시된다. 본 발명은 또한 23.28.1 중쇄 변이체 중 하나와 23.28.1 경쇄 변이체를 포함하는 mAb를 제공한다.
하이브리도마 23.29.1에 의해 생산된 경쇄는 잔기 174에서 불변 영역에서 돌연변이를 함유한다. 하이브리도마에 의해 생산된 경쇄는 이 위치에서 기본적인 리신대신에 아르기닌을 갖는다. 따라서, 본 발명은 또한 잔기 174에 일반 리신을 갖는 23.29.1 경쇄, 및 23.29.1 중쇄 및 변이 경쇄를 포함하는 23.29.1L-R174K로 표시되는 mAb를 제공한다.
바람직한 구체예에서, 항-CD40 항체는 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K 및 24.2.1이다. 일부 구체예에서, 항-CD40 항체는 서열 번호 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64, 72, 80, 88, 94, 100 또는 102로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 또는 그들로부터의 가변 영역, 또는 서열 번호 7, 15, 23, 31, 39, 47, 55, 63, 71, 79, 87, 93, 99 또는 101로부터 선택된 핵산 서열에 의해 암호되는 경쇄를 포함한다. 일부 구체예에서, 항-CD40 항체는 열거된 항체 중 하나로부터의 적어도 CDR2, 전술한 아미노산 서열(도 1A-1C 및 2A-2C)의 하나를 포함하거나 또는 전술한 핵산 서열 중 하나에 의해 암호되는 경쇄를 포함한다. 다른 구체예에서, 경쇄는 추가로 생식 세포 VκA3/Al9, L5 또는 A27 유전자에 의해 암호되는 아미노산 서열로부터의 아미노산 10개 이하를 포함하는 경쇄 가변 영역으로부터 독립적으로 선택된 CDR1 및 CDR3를 포함하거나, 또는 (1) 3.1.1, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23. 28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K 또는 24.2.1로부터 선택된 항체의; (2) 서열 번호 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94, 100 또는 102의 아미노산 서열의, 또는 (3) 서열 번호 3, 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 93, 99 또는 101의 핵산 서열에 의해 암호되는 아미노산 서열의 CDR1 및 CDR3 중 하나로부터 독립적으로 선택되는 CDR1 및 CDR3를 포함한다.
다른 바람직한 구체예에서, 항-CD40 항체는 서열 번호 6, 14, 22, 30, 38, 46, 54, 62, 70, 78 또는 86으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 또는 그로부터의 가변 영역, 또는 서열 번호 5, 13, 21, 29, 37, 45, 53, 61, 69, 77 또는 85로부터 선택된 핵산 서열에 의해 암호되는 중쇄를 포함한다. 일부 구체예에서, 항-CD40 항체는 열거된 항체들중 하나로부터의 적어도 CDR3, 전술한 아미노산 서열중 하나(도 1a-1c 및 2a-2c에 나타남)를 포함하거나 또는 전술한 핵산 서열중 하나에 의해 암호되는 중쇄를 포함한다. 다른 구체예에서, 중쇄는 추가로 생식 세포 VH 3-30+, 4-59, 1-02, 4.35 또는 3-30.3 유전자에 의해 암호되는 아미노산 서열로부터의 아미노산 18개 이하를 포함하는 중쇄 가변 영역으로부터 독립적으로 선택된 CDR1과 CDR2를 포함하거나, 또는 (1) 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23. 25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.29.1 및 24.2.1로부터 선택된 항체의; (2) 서열 번호 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 또는 98의 아미노산 서열의, 또는 (3) 서열 번호 1,9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 91, 95 또는 97의 핵산 서열에 의해 암호되는 아미노산 서열의 CDR1과 CDR2 중 하나로부터 독립적으로 선택되는 CDR1과 CDR2를 포함한다. 다른 구체예에서, 항-CD40 항체는 전술한 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
본원에서 사용될때, 항체 3.1.1H-A78T는 중쇄의 잔기 78이 알라닌 대신 트레오닌이라는 것을 제외하고는 3.1.1과 동일하다. 유사하게, 항체 3.1.11H-A78T-V88A-V97A 항체에서, 잔기 78은 A로 바뀌고, 잔기 88과 97은 중쇄에서 발린에서 알라닌으로 바뀐다. 항체 3.1.1L-L4M-L83V는 경쇄에서 잔기 4가 루이신 대신 메티오닌이고 잔기 83이 경쇄에서 루이신 대신 발린이라는 것을 제외하고는 3.1.1과 동일하다. 항체 22.1.1H-C109A는 중쇄의 잔기 109가 시스테인에서 알라닌으로 바뀐 것을 제외하고는 22.1.1과 동일하다. 항체 23.28.1H-D16E 와 23.28.1L-C92A는 중쇄의 잔기 16이 아스파테이트에서 글루타메이트로 바뀌고 경쇄의 잔기 92가 시스테인에서 알라닌으로 바뀌는 것을 제외하고는 23.28.1과 동일하다. 항체 23.29.1L-R174K는 경쇄의 잔기 174가 아르기닌에서 리신으로 바뀌는 것을 제외하고는 23.29.1과 동일하다.
항-CD40 항체의 클래스 및 서브클래스
항-CD40 항체의 클래스 및 하위클래스는 당업계에 공지된 방법으로 결정할 수 있다. 일반적으로, 항체의 클래스 및 하위클래스는 항체의 특정 클래스 및 하위 클래스에 대해 특이적인 항체를 이용하여 결정할 수 있다. 그러한 항체는 시판되고 있다. 클래스와 하위 클래스는 다른 기법들뿐만 아니라 ELISA, 또는 웨스턴 블롯에 의해 결정할 수 있다. 다르게는, 클래스와 하위클래스는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 불변부의 모두 또는 일부를 서열 결정하고 그들의 아미노산 서열을 면역글로불린의 다양한 클래스 및 하위클래스의 공지의 아미노산 서열에 비교하고, 항체의 클래스 및 하위 클래스를 결정함으로써 결정될 수 있다.
일부 구체예에서, 항-CD40 항체는 모노클로날 항체이다. 항-CD40 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA 또는 IgD 분자일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 항-CD40 항체는 IgG이고 IgGl, IgG2, IgG3 또는 IgG4 하위클래스다. 다른 바람직한 구체예에서, 항-CD40 항체는 하위 클래스 IgG2이다.
종 및 분자 선택성
본 발명의 다른 태양에서, 항-CD40 항체는 종 선택성 및 분자 선택성 둘다를 입증한다. 일부 구체예에서, 항-CD40 항체는 영장류 및 인간 CD40에 결합한다. 일부 구체예에서, 항-CD40 항체는 인간, 사이노몰구스(cynomolgus) 또는 레서스(rhesus) CD40에 결합한다. 다른 구체예에서, 항-CD40 항체는 마우스, 쥐, 개 또는 토끼 CD40에 결합하지 않는다. 본 명세서의 개시에 따라, 당업계에 공지된 방법을 이용하여 항-CD40 항체를 위한 종 선택성을 결정할 수 있다. 예를 들어, 웨스턴 블롯, FACS, ELISA, 또는 RIA를 이용하여 종 선택성을 결정할 수 있다.(예, 실시예 IV 참고).
일부 구체예에서, 항-CD40 항체는 RANK (핵 인자-카파 B의 수용체 활성자), 4-1BB(CD137), TNFR-1 (종양 괴사 인자 수용체-1) 및 TNFR-2(종양 괴사 인자 수용체 2)에 대한 그 선택성보다 100배 이상 큰 CD40에 대한 선택성을 갖는다. 일부 구체예에서, 항-CD40 항체는 CD40 외의 임의의 다른 단백질에 대해 감지할만한 특이적 결합을 나타내지 않는다. 본 명세서의 개시에 따라 당업계에 공지된 방법을 이용하여 CD40에 대한 항-CD40 항체의 선택성을 결정할 수 있다. 예를 들어, 웨스턴 블롯, FACS, ELISA 또는 RIA를 이용하여 선택성을 결정할 수 있다. (예, 실시예 V 참고)
항-CD40 항체에 의해 인식되는 CD40 에피토프의 동정
또한, 본 발명은 CD40에 결합하고 동일한 에피토프와 교차-경쟁하고/하거나 결합하고/하거나, 항체 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K 또는 24.2.1로부터 선택된 인간 항-CD40 항체와 동일한 KD로 CD40에 결합하는 인간 항-CD40 모노클로날 항체; 또는 서열 번호 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 또는 98의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 인간 항-CD40 항체, 또는 서열 번호 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94, 100 또는 102의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간 항-CD40 항체를 제공한다.
공지의 방법을 이용하여 항체가 항-CD40 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지 또는 항-CD40 항체와 결합하기 위해 교차 경쟁하는 지를 결정할 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 항-CD40 항체가 포화 조건하에서 CD40에 결합하도록 하고 이어서 시험 항체가 CD40에 결합하는 능력을 측정할 수 있다. 만일 시험 항체가 항-CD40 항체와 동시에 CD40에 결합할 수 있으면, 시험 항체는 항-CD40 항체와 다른 에피토프에 결합한다. 하지만, 만일 시험 항체가 동시에 CD40에 결합할 수 없으면, 시험 항체는 동일한 에피토프, 겹치는 에피토프, 또는 인간 항-CD40 항체에 의해 결합되는 에피토프와 매우 가까운 에피토프에 결합한다. 이 실험은 ELISA, RIA, FACS 또는 표면 플라스몬 공명을 이용하여 수행할 수 있다.(예, 실시예 VI 참고). 바람직한 구체예에서, 실험은 표면 플라스몬 공명을 이용하여 수행한다. 더욱 바람직한 구체예에서는, BIA 코어를 이용한다.
항-CD40 항체의 CD40에 대한 결합 친화도
본 발명의 일부 구체예에서, 항-CD40 항체는 높은 친화도로 CD40에 결합한다. 일부 구체예에서, 항-CD40 항체는 2 x 10-8 M 이하의 KD 로 CD40에 결합한다. 다른 바람직한 구체예에서, 항체는 2 x 10-9, 2 x 10-10, 4.0 x 10-11 M 이하의 KD로 CD40에 결합한다. 보다 더 바람직한 구체예에서, 항체는 2.5 x 10-12 M 이하의 KD로 CD40에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체는 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K 또는 24.2.1로부터 선택된 항체와 실질적으로 동일한 KD로 CD40에 결합한다. 다른 바람직한 구체예에서, 항체는 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-Rl 74K 및 24.2.1로부터 선택되는 항체로부터의 경쇄의 CDR2 및/또는 CDR3를 포함하는 항체와 실질적으로 동일한 KD로 CD40에 결합한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 항체는 서열 번호 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 또는 98의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하거나 또는 서열 번호 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94, 100 또는 102의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체와 실질적으로 동일한 KD로 CD40에 결합한다. 다른 바람직한 구체예에서, 항체는 서열 번호 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94, 100 또는 102의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역의 CDR2 또는 서열 번호 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 또는 98의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역의 CDR3를 포함하는 항체와 실질적으로 동일한 KD로 CD40에 결합한다.
일부 구체예에서, 항-CD40 항체는 낮은 해리 속도를 갖는다. 일부 구체예에서, 항-CD40 항체는 2.0 x 10-4 이하의 Koff를 갖는다. 일부 구체예에서, Koff 는 2.0 x 10-7 이하이다. 일부 구체예에서, Koff는 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23. 25.1, 23.28.1, 23. 28.1H-D16E, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K 및 24.2.1로부터 선택된 항체를 포함한 본원에 개시된 항체와 실질적으로 동일하다. 일부 구체예에서, 항체는 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23. 25.1, 23.28.1, 23. 28.1H-D16E, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K 및 24.2.1로부터 선택된 항체로부터의 중쇄의 CDR3 ,또는 경쇄의 CDR2를 포함하는 항체와 실질적으로 동일한 Koff로 CD40에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체는 서열 번호 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 또는 98의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하거나 또는 서열 번호 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94, 100 또는 102의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 실질적으로 동일한 Koff로 CD40에 결합한다. 다른 바람직한 구체예에서, 항체는 서열 번호 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94, 100 또는 102의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역의 CDR2 또는 서열 번호 6, 14, 22, 30, 38, 46, 54, 62, 70, 78, 86, 90,92, 96 또는 98의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역의 CDR3를 포함하는 항체와 실질적으로 동일한 Koff로 CD40에 결합한다.
항-CD40 항체의 CD40에 대한 결합 친화도 및 해리 속도는 공지 방법을 이용하여 결정할 수 있다. 결합 친화도는 경쟁적 ELISA, RIA, 또는 BIA 코어 같은 표면 플라스몬 공명에 의해 측정할 수 있다. 해리 속도 또한 표면 플라스몬 공명에 의해 측정할 수 있다. 바람직하게는 결합 친화도 및 해리 속도는 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된다. 더욱 바람직하게는, 결합 친화도와 해리 속도는 BIA 코어TM를 이용하여 측정한다. 예를 들어 실시예 XIV 참고.
경쇄와 중쇄 유전자 사용
본 발명의 항-CD40 항체는 인간 카파 또는 인간 람다 경쇄 또는 그로부터 유래된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 카파 경쇄를 포함하는 일부 구체예에서, 경쇄 가변부(VL)은 부분적으로 인간 A3/A19 (DPK-15), L5 (DP5), 또는 A27(DPK-22) Vκ 유전자에 의해 암호된다.
일부 구체예에서, 항-CD40 항체의 VL은 생식 세포 아미노산 서열에 대하여 하나 이상의 아미노산 치환을 함유한다. 일부 구체예에서, 항-CD40 항체의 VL은 생식 세포 아미노산 서열에 대하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, 생식 세포로부터의 하나 이상의 이들 치환은 경쇄의 CDR 영역에 있다. 일부 구체예에서, 생식 세포에 대한 아미노산 치환은 항체 3.1.1, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23. 5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K 및 24.2.1의 VL의 하나 이상에서의 생식 세포에 대한 치환과 동일한 위치중 하나 이상에 있다. 예를 들어, 항-CD40 항체의 VL은 항체 21.4.1에서 발견되는 생식 세포와 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환, 및 항체 21.4.1과 동일한 Vκ 유전자를 이용하는 항체 10.8.3에서 발견되는 생식 세포와 비교하여 기타 아미노산 치환을 함유할 수 있다. 일부 구체예에서, 아미노산 변화는 동일한 위치들 중 하나 이상에 있지만 기준 항체에서와는 다른 돌연변이에 관련된다.
일부 구체예에서, 생식 세포에 대한 아미노산 변화는 항체 3.1.1, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K 및 24.2.1의 VL의 임의의 것에서와 동일한 위치 중 하나 이상에서 발생하지만, 그 변화는 기준 항체내의 아미노산에 대해 그러한 위치(들)에서의 보존적 아미노산 치환을 나타낼 수도 있다. 예를 들어, 만일 이들 항체중 하나의 특정 위치가 생식 세포에 대하여 바뀌어 글루타메이트이면, 그 위치에서 아스파테이트를 보존적으로 치환할 수도 있다. 유사하게, 만일 생식 세포에 비교한 아미노산 치환이 세린이면, 그 위치에서 세린에 대해 트레오닌을 보존적으로 치환할 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 상기에서 개시된다.
일부 구체예에서, 인간 항-CD40 항체의 경쇄는 항체 3.1.1 (서열 번호: 4), 3.1.1L-L4M-L83V (서열 번호: 94), 7.1.2 (서열 번호: 12), 10.8.3 (서열 번호: 20), 15.1.1 (서열 번호: 28), 21.4.1 (서열 번호:), 21.2.1 (서열 번호: 36), 21.4.1 (서열 번호: 44), 22.1.1 (서열 번호: 52), 23.5.1 (서열 번호: 60), 23.28.1 (서열 번호: 68), 23.28.1L-C92A (서열 번호: 100), 23.29.1 (서열 번호: 76), 23.29.1L-R174K (서열 번호: 102) 또는 24.2.1 (서열 번호: 84)의 VL의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열, 또는 최대 1, 2, 3, 4, 6, 8, 또는 10개의 보존적 아미노산 치환 및/또는 최대 총 3개의 비보존적 아미노산 치환을 갖는 상기 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 항-CD40 항체의 경쇄는 적어도 경쇄 CDR2를 포함하며, 또한 본원에서 개시된 대로 생식 세포 서열의 CDR1과 CDR3 영역을 포함할 수도 있다. 다른 구체예에서, 경쇄는 3.1.1, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10. 8. 3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.29.1 및 24.2.1로부터 독립적으로 선택된 항체의 CDR1 및 CDR2, 또는 8 미만, 6 미만, 4 미만, 또는 3 미만의 보존적 아미노산 치환 및/또는 총 3 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 CDR 영역들을 포함할 수도 있다. 다른 구체예에서, 항-CD40 항체의 경쇄는 적어도 경쇄 CDR2를 포함하며, 또한 서열 번호 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94 또는 100으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열 번호 3, 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 93 또는 99로부터 선택된 핵산 분자에 의해 암호되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체의 CDR1과 CDR3 영역으로 부터 독립적으로 선택되는 CDR1과 CDR3 영역을 포함할 수도 있다.
중쇄와 관련하여, 일부 구체예에서, 중쇄 아미노산 서열의 가변 영역은 부분적으로 인간 VH 3-30+, VH 4-59, VH 1-02, VH 4.35 또는 VH 3-30.3 유전자에 의해 암호된다. 일부 구체예에서, 항-CD40 항체의 VH 는 생식 세포 아미노산 서열에 대하여 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입(부가)를 함유한다. 일부 구체예에서, 중쇄의 가변부는 생식 세포 아미노산 서열로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18 돌연변이를 포함한다. 일부 구체예에서, 돌연변이는 생식 세포 아미노산 서열에 비교하여 비보존적 치환이다. 일부 구체예에서, 돌연변이는 중쇄의 CDR 영역에 있다. 일부 구체예에서, 아미노산 변화는 항체 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1,21. 2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1,23. 28.1H-D16E, 23.29.1 및 24.2.1의 VH 중 하나 이상에서의 생식 세포로부터의 돌연변이와 동일한 위치중 하나 이상에서 만들어진다. 다른 구체예에서, 아미노산 변화는 하나 이상의 동일한 위치에 있으나 기준 항체에서와는 다른 돌연변이에 관련된다.
일부 구체예에서, 중쇄는 항체 3.1.1 (서열 번호: 2), 3.1.1H-A78T (서열 번호: 90), 3.1.1H-A78T-V88A-V97A (서열 번호: 92), 7.1.2 (서열 번호: 10), 10.8.3 (서열 번호: 18), 15.1.1 (서열 번호: 26), 21.2.1 (서열 번호: 34), 21.4.1 (서열 번호: 42), 22.1.1 (서열 번호: 50), 22.1.1H-C109A (서열 번호: 96), 23.5.1 (서열 번호: 58), 23.28.1 (서열 번호: 66), 23. 28.1H-D16E (서열 번호:98), 23.29.1 (서열 번호: 74) 및 24.2.1 (서열 번호: 82)의 가변부(VH)의 아미노산 서열, 또는 최대 1, 2, 3, 4, 6, 8, 또는 10 보존적 아미노산 치환 및/또는 총 최대 3 비보존적 아미노산 치환을 갖는 상기 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 중쇄는 항체 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.29.1 및 24.2.1 (도.1d-1h 또는 2d-2h에 나타남)의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역, 또는 8 미만, 6 미만, 4 미만, 또는 3 미만의 보존적 아미노산 치환 및/또는 총 3 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 상기 CDR 영역들을 포함한다.
일부 구체예에서, 중쇄는 CDR3를 포함하며, 또한 전술한 대로 생식 세포 서열의 CDR1과 CDR2 영역을 포함하거나, 또는 항체의 CDR1 및 CDR2를 포함할 수도 있으며, 이 각각은 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.29.1 및 24.2.1로부터 선택된 항체의 중쇄를 포함하는 항체로부터 독립적으로 선택된다. 다른 구체예에서, 중쇄는 CDR3를 포함하며, 또한 CDR1과 CDR2 영역을 포함할 수도 있는데 이들 각각은 서열 번호 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 또는 98 (도.1d-1h 또는 도. 2d-2h에 나타남)로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열 번호 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 91, 95 또는 97로부터 선택되는 핵산 서열에 의해 암호되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역의 CDR1과 CDR2 영역으로부터 독립적으로 선택된다. 다른 구체예에서, 항체는 상기에서 개시된 중쇄와 상기에서 개시된 경쇄를 포함한다.
만들어질 수 있는 아미노산 치환의 한가지 유형은 화학적으로 반응성일 수 있는 항체내의 시스테인 하나 이상을, 제한없이 알라닌 또는 세린과 같은 다른 잔기로 변화시키는 것이다. 한 구체예에서, 시스테인 치환은 항체의 가변부의 골격 영역 또는 불변부에서 반들어진다. 다른 구체예에서, 시스테인은 항체의 비일반적(noncanonical) 영역에 있다. 만들어질 수 있는 다른 유형의 아미노산 치환은 항체내의 임의의 잠재적인 단백질 분해 부위, 특히 가변부의 골격 영역내, 항체의 불변부내, 또는 항체의 비일반적 영역내의 그러한 부위들을 변화시키는 것이다. 시스테인 잔기의 치환 및 단백질 분해 부위의 제거는 항체 생성물내의 이종성 위험을 감소시키고 따라서 그 균질성을 증가시킬 수 있다. 다른 유형의 아미노산 치환은 아스파라긴과 글리신의 하나 또는 둘다를 변화시켜, 아스파라긴-글리신 쌍을 제거하는 것으로서, 이들 쌍은 잠재적인 탈아미드화 부위를 형성한다. 이것은 바람직하게는 항체의 골격 영역, 불변부 또는 비일반적 영역에서 이루어진다.
항-CD40 항체에 의한 CD40의 활성화
본 발명의 다른 태양은 활성화 항체인, 즉 CD40 아고니스트인 항-CD40 항체에 관한 것이다. 활성화 항체는 CD40에 대한 CD40L의 효과를 증폭시키거나 대신한다. 일부 구체예에서, 활성화 항체는 본질적으로 CD40L의 모방체이며, CD40에의 결합을 위해 CD40L과 경쟁한다. 일부 구체예에서, 이 항체는 CD40에의 결합을 위해 CD40L과 경쟁하지만, CD40에의 CD40L 결합의 효과를 증폭시킨다. 일부 구체예에서, 항-CD40 항체는 CD40L의 존재 또는 부재하에서 CD40을 활성화시킨다.
항-CD40 항체에 의한 생체내 종양 성장의 억제
일부 구체예에 따라, 본 발명은 생체외 종양 세포의 증식 또는 생체내 종양 성장을 억제하는 항-CD40 항체를 제공한다.
일부 구체예에서, 이 항체는 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% 만큼 종양 성장을 억제한다. 일부 구체예에서, 항체는 종양 성장을 75% 억제한다. 한 구체예에서, 종양 성장 억제는 항체로 치료를 시작한 후 14일에 검출가능하다. 다른 구체예에서, 종양 성장 억제는 항체로 치료를 시작한 후 7일에 검출가능하다. 일부 구체예에서, 다른 항종양 제제를 항-CD40 항체와 함께 동물에게 투여한다. 일부 구체예에서, 항종양 제제는 추가로 종양 성장을 억제한다. 일부 구체예에서, 항종양 제제는 아드리아마이신 또는 택솔이다. 일부 구체예에서, 항종양 제제와 항-CD40 항체의 동시 투여는 미처리 동물에서의 종양 성장에 비하여 치료 시작 후 22-24일의 기간 후에 적어도 50%만큼 종양 성장을 억제한다.
항-CD40 항체에 의한 어팝토시스의 유도
본 발명의 다른 태양은 CD40 양성 세포의 세포 사멸을 유도하는 항-CD40 항체를 제공한다. 일부 구체예에서, 항체는 생체내 또는 생체외에서 CD40 양성 세포의 어팝토시스를 야기한다.
세포 표면 분자의 발현의 증가
일부 구체예에서, 항-CD40 항체는 ICAM,MHC-II, B7-2, CD71, CD23 및 CD83을 포함하며 이에 제한되지 않는, B 세포 표면 분자들의 발현을 증가시킨다. 일부 구체예에서, 항체 1 ㎍/ml은 전혈 B-세포 표면 분자 상향 조절 분석에서 적어도 2배만큼, 더욱 바람직하게는 적어도 4배만큼 ICAM 발현을 증가시킨다. 일부 구체예에서, 항체 1 ㎍/ml은 전혈 B-세포 표면 분자 상향 조절 분석에서 적어도 2배, 바람직하게는 적어도 3배만큼 MHC-II 발현을 증가시킨다. 일부 구체예에서, 항체 1 ㎍/ml은 전혈 B-세포 표면 분자 상향 조절 분석에서 적어도 2배, 바람직하게는 적어도 5배만큼 CD23 발현을 증가시킨다. 예를 들어 실시예 VII, 표 25를 참고한다.
일부 구체예에서, 항-CD40 항체는 MHC-II, ICAM, B7-2, CD83 및 B7-1을 포함하며 이에 제한되지 않는 가지 세포 표면 분자의 발현을 증가시킨다. 일부 구체예에서, 상향 조절의 범위는 B 세포에서 관찰되는 상향 조절의 범위와 유사하다. 예를 들어 표 25와 26 참고. 일부 구체예에서, 항체는 B7-2와 MHC-II와 같은 가지 세포 표면 분자의 발현을 이들 분자의 B 세포 발현에 비하여 우선적으로 상향 조절한다. 예를 들어, 표 27 참고.
세포 사이토카인의 분비의 증가
일부 구체예에서, 항체는 IL-8, IL-12, IL-15, IL-18 및 IL-23을 포함하며 이에 제한되지 않는 사이토카인의 세포 분비를 증가시킨다.
일부 구체예에서, 항체는 가지 세포와 부착성 단핵구에 의한 사이토카인 분비를 증가시킨다. 일부 구체예에서 사이토카인 생산은 LPS, IFN-γ 또는 IL-1β 중 하나 이상으로 공자극하여 추가로 증가된다. 본 발명의 또다른 태양에서, LPS 공자극을 가진 항체는 약 0.48㎍/ml의 EC50으로 가지 세포 분석에서 IL-12p70 생산을 증가시킨다. 일부 구체예에서, 항체는 약 0.21 ㎍/ml의 EC50으로 가지 세포에서 IL-12p40 생산을 증가시킨다. (예, 실시예 VIII 참고)
일부 구체예에서, 항체는 실시예 VIII에 개시된 바와 같이, 알로겐 T 세포/가지 세포 분석에서 T 세포에 의한 IFN-감마의 분비를 증가시킨다. 일부 구체예에서, 항체는 약 0.3 ㎍/ml의 EC50으로 알로겐 T 세포/가지 세포 분석에서 IFN-감마의 분비를 증가시킨다. 일부 구체예에서, 항체는 약 0.2 ㎍/ml의 EC50으로 알로겐 T 세포/가지 세포 분석에서 IFN-감마의 분비를 증가시킨다. 한 구체예에서, 항체는 약 0.03 ㎍/ml의 EC50으로 알로겐 T 세포/가지 세포 분석에서 IFN-감마의 분비를 증가시킨다.
항체를 생산하는 방법 및 항체-생산 세포주
면역화
일부 구체예에서, 인간 항체는 그 게놈내에 인간 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 좌의 일부 또는 전부를 포함하는 비인간 동물을 CD40 항원으로 면역시켜 생산한다. 바람직한 구체예에서, 비인간 동물은 XenoMouseTM 동물이다.
XenoMouseTM 마우스는 인간 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 좌의 큰 단편을 포함하며 마우스 항체 생산이 결핍된 조작된 마우스 주이다. 예를 들어, Green et al., Nature Genetics 7: 13-21 (1994)와 미국 특허 제5,916,771호, 제5,939,598호, 5,985,615,5호, 제998,209호, 제6,075,181호, 제6,091,001호, 제6,114,598호, 제6,130,364호, 제6,162,963호 및 제6,150,584호를 참고한다. 또한 WO91/10741, WO 94/02602, WO96/34096, WO 96/33735, WO 98/16654, WO98/24893, WO 98/50433, WO 99/45031, WO 99/53049, WO 00/09560, 및 WO 00/037504를 참고한다.
다른 태양에서, 본 발명은 인간 면역글로불린 좌를 포함하는 비인간 트랜스제닉 동물을 CD40 항원으로 면역시켜 비인간, 비마우스 동물로부터 항-CD40 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 당업자는 전술한 문헌에 개시된 방법을 이용하여 그러한 동물을 생산할 수 있다. 이들 문헌에 개시된 방법들은 미국 특허 5,994,619호에 개시된 대로 변형될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 비인간 동물은 쥐, 양, 돼지, 염소, 소 또는 말이다.
XenoMouseTM 마우스는 완전한 인간 항체의 성인형 인간 레파토리를 생산하며 항원-특이적 인간 항체를 생산한다. 일부 구체예에서, XenoMouseTM 마우스는 인간 중쇄 좌 및 카파 경쇄 좌의 메가베이스 크기의 생식세포 배열 효모 인공 염색체(YAC) 단편의 도입을 통해 인간 항체 V 유전자 레파토리의 약 80%를 함유한다. 참고로 본원에 인용되는 Mendez et al., Nature Genetics 15: 146-156 (1997), Green and Jakobovits,J Exp. Med 188: 483-495 (1998), 및 WO 98/24893를 참고한다.
일부 구체예에서, 인간 면역글로불린 유전자를 포함하는 비인간 동물은 인간 면역글로불린 "미니좌"를 갖는 동물이다. 미니좌 접근에서, 외인성 Ig 좌는 Ig 좌로부터의 개별 유전자들을 포함시킴으로써 모방된다. 따라서, 하나 이상의 VH 유전자, 하나 이상의 DH 유전자, 하나 이상의 JH 유전자, mu 불변부, 및 두번째 불변부(바람직하게는 감마 불변부)가 동물에 삽입하기 위한 구조체내에 형성된다. 이 접근법은 특히 본원에 참고로 인용되는 미국 특허 제5,545,807호, 제5,545,806호, 제5,569,825호, 제5,625,126호, 제5,633,425호, 제5,661,016호, 제5,770,429호, 제5,789,650호, 제5,814,318호, 제5,591,669호, 제5,612,205호, 제5,721,367호, 제5,789,215호, 및 제5,643,763호에 개시된다.
미니좌 접근법의 잇점은 Ig 좌의 일부를 포함하는 구조체가 신속하게 생성되고 동물내에 도입될 수 있다는 것이다. 하지만, 미니좌 접근법의 잠재적 단점은 완전한 B-세포 발생을 지지할만큼 충분한 면역글로불린 다양성이 없어 항체 생산이 낮을 수도 있다는 것이다.
다른 태양에서, 본 발명은 면역화된 항-CD40 항체의 제조 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 비인간 동물을, 항체 생산을 허용하는 조건하에서 하기한 대로 CD40 항원으로 면역시킨다. 항체-생산 세포를 동물로부터 분리하고, 골수종과 융합시켜 하이브리도마를 생산하고, 관심의 항-CD40 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호하는 핵산을 분리한다. 이어서 이들 핵산을 공지되고 이하에서 더 개시되는 방법을 이용하여 조작하여 비인간 서열의 양을 감소시켜, 즉 항체를 인간화하여 인간에서 면역 반응을 감소시킨다.
일부 구체예에서는, CD40 항원은 분리되고/되거나 정제된 CD40 이다. 바람직한 구체예에서, CD40 항원은 인간 CD40이다. 일부 구체예에서, CD40 항원은 CD40의 단편이다. 일부 구체예에서, CD40 단편은 CD40의 세포외 도메인이다. 일부 구체예에서, CD40 단편은 CD40의 에피토프 적어도 하나를 포함한다. 다른 구체예에서, CD40 항원은 그 표면상에 CD40 또는 면역원성 단편을 발현 또는 과다발현하는 세포이다. 일부 구체예에서, CD40 항원은 CD40 융합 단백질이다.
동물의 면역화는 공지된 임의의 방법에 의할 수 있다. 예를 들어 Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990을 참고한다. 마우스, 쥐, 양, 염소, 돼지, 소 및 말과 같은 비인간 동물을 면역화시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 상기한 Harlow and Lane, 및 미국 특허 5,994, 619호를 참고한다. 바람직한 구체예에서, CD40 항원을 보조제와 함께 투여하여 면역 반응을 자극한다. 보조제의 예는 완전 또는 불완전 프로인트 보조제, RIBI(무라닐 다이펩티드) 또는 ISCOM(면역자극성 복합체)를 포함한다. 그러한 보조제는 폴리펩티드를 국소 침전소(deposit)에 격리시킴으로써 폴리펩티드가 급속히 분산되는 것을 방지할 수도 있거나, 또는 숙주가 면역 시스템의 대식세포와 기타 성분에 대해 주화성인 인자를 분비하도록 자극하는 물질을 함유할 수도 있다. 바람직하게는, 만일 폴리펩티드가 투여되면, 면역화 스케쥴은 몇주에 걸친 폴리펩티드의 두번 이상의 투여에 관련될 것이다.
실시예 I은 항-CD40 모노클로날 항체의 생산을 개시한다.
항체의 생산 및 항체-생산 세포주
동물을 CD40 항원으로 면역시킨 후, 항체 및/또는 항체-생산 세포를 동물로부터 얻을 수 있다. 일부 구체예에서는, 동물을 채혈하거나 죽여 항-CD40 항체-함유 혈청을 동물로부터 얻는다. 혈청은 동물로부터 얻어서 이용할 수 있으며, 면역글로불린 분획을 그 혈청으로부터 얻거나 또는 항-CD40 항체를 혈청으로부터 정제할 수도 있다. 이러한 방식으로 얻어진 혈청 또는 면역글로불린이 폴리클로날일 것임은 당업자에게 공지되어 있다. 혈청으로부터 제조된 폴리클로날 항체를 이용하는 단점은 얻어질 수 있는 항체의 양이 제한되고 폴리클로날 항체가 이종성 특성 배열을 갖는다는 것이다.
일부 구체예에서, 항체-생산 불멸화 세포주를 면역화된 동물로부터 분리된 세포로부터 제조한다. 면역화 후, 동물을 죽이고 림프 절 및/또는 비장 B 세포를 불멸화시킨다. 세포를 불멸화시키는 방법은 그들을 종양 유전자로 전이시키거나, 그들을 종양 형성 바이러스로 조절하거나, 불멸화된 세포를 선별하기 위한 조건하에서 그들을 배양하거나, 그들을 발암성 또는 돌연변이성 화합물에 노출시키거나, 그들을 불멸화된 세포, 예를 들어 골수종 세포와 융합시키고 종양 억제자 유전자를 불활성화시키는 것을 포함하며 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 Harlow and Lane을 참고한다. 만일 골수종 세포와의 융합을 이용하면, 골수종 세포는 바람직하게는 면역글로불린 폴리펩티드를 분비하지 않는다(비-분비성 세포주). CD40, 그 일부, 또는 CD40 을 발현하는 세포를 이용하여 불멸화된 세포를 스크리닝한다. 바람직한 구체예에서, 초기 스크리닝을 효소-연결된 면역분석(ELISA) 또는 방사성면역분석을 이용하여 수행한다. ELISA 스크리닝의 예는 본원에 참고로 인용되는 WO 00/37504에 개시된다.
예를 들어 하이브리도마와 같은 항-CD40 항체-생산 세포를 선별하고, 클로닝하고 추가로 강한 성장, 높은 항체 생산 및 원하는 항체 특성을 포함한 원하는 특성에 대해 스크리닝한다. 하이브리도마는 동계 동물에서, 면역 시스템이 결핍된 동물, 예를 들어 누드 마우스에서 생체내로, 또는 생체외 세포 배양물에서 확장될 수 있다. 하이브리도마를 선별하고, 클로닝하고 확장시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
바람직한 구체예에서, 면역화된 동물은 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 비인간 동물이며 비장 B 세포는 비인간 동물과 같은 종으로부터의 골수종 세포주에 융합된다. 보다 바람직한 구체예에서, 면역화된 동물은 XENOMOUSETM 동물이며 골수종 세포주는 비분비성 마우스 골수종이다. 더욱 바람직한 구체예에서, 골수종 세포주는 P3-X63-AG8.653이다. 예를 들어 실시예 I을 참고한다.
다른 태양에서, 본 발명은 인간 항-CD40 항체를 생산하는 하이브리도마를 제공한다. 바람직한 구체예에서, 하이브리도마는 전술한 마우스 하이브리도마이다. 다른 구체예에서, 하이브리도마는 쥐, 양, 돼지, 염소, 소 또는 말과 같은 비인간, 비마우스 종에서 생산된다. 다른 구체예에서, 하이브리도마는 인간 하이브리도마이다.
핵산, 벡터, 숙주 세포 및 항체를 생산하는 재조합 방법
핵산
본 발명은 또한 항-CD40 항체를 암호하는 핵산 분자를 포함한다. 일부 구체예에서, 상이한 핵산 분자들이 항-CD40 면역글로불린의 중쇄와 경쇄를 암호한다. 다른 구체예에서, 동일한 핵산 분자가 항-CD40 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄를 암호한다.
일부 구체예에서, 경쇄의 가변부를 암호하는 핵산 분자는 인간 A3/A19 (DPK-15), L5(DP5) 또는 A27 (DPK-22)Vκ유전자 서열 또는 그로부터 유래된 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 A3/A19Vκ 유전자 및 Jκ1, Jκ2 또는 Jκ3 유전자의 뉴클레오티드 서열 또는 그로부터 유래된 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 L5Vκ 유전자 및 Jκ4 유전자의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 A27 Vκ 유전자 및 Jκ3 유전자의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 경쇄를 암호하는 핵산 분자는 생식 세포 아미노산 서열로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 돌연변이를 포함하는 아미노산 서열을 암호한다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 생식 세포 서열에 비하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 비보존적 아미노산 치환 및/또는 1,2 또는 3 비보존적 치환을 포함하는 VL 아미노산 서열을 암호하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 치환은 CDR 영역, 골격 영역 또는 불변부에 있을 수 있다.
일부 구체예에서, 경쇄(VL)의 가변부를 암호하는 핵산 분자는 생식 세포 서열에 비하여, 항체 3.1.1, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8. 3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.29.1 및 24.2.1 중 하나의 VL에서 발견되는 돌연변이와 동일한 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 VL 아미노산 서열을 암호한다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 항체 3.1.1, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.29.1 및 24.2.1 중 하나의 VL에서 발견되는 생식 세포 서열에 비하여 적어도 세 개의 아미노산 돌연변이를 암호한다.
일부 구체예에서, 핵산 분자는 모노클로날 항체 3.1.1 (서열 번호: 4), 3.1.1L-L4M-L83V (서열 번호: 94), 7.1.2 (서열 번호: 12), 10.8. 3 (서열 번호: 20), 15.1.1 (서열 번호:28), 21.2.1 (서열 번호: 36), 2.1.4.1 (서열 번호: 44), 22.1.1 (서열 번호: 52), 23.5.1 (서열 번호: 60),23. 28.1 (서열 번호:68), 23.28.1L-C92A (서열 번호: 100), 23.29.1 (서열 번호: 76) 또는 24.2.1 (서열 번호:84)의 VL 아미노산 서열 또는 그 일부를 암호하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 일부는 적어도 CDR3 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 핵산은 상기 항체의 경쇄 CDR의 아미노산 서열을 암호한다. 일부 구체예에서, 상기 일부는 CDR1-CDR3를 포함하는 인접 부분이다.
일부 구체예에서, 핵산 분자는 서열 번호 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94 또는 100 중의 하나의 아미노산 서열, 또는 시그날 서열이 없는 상기 서열을 암호하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 바람직한 구체예에서, 핵산 분자는 서열 번호 3, 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 93 또는 99의 뉴클레오티드 서열 또는 그 일부, 선택적으로 시그날 서열이 없는 상기 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 부분은 VL 영역을 암호한다. 일부 구체예에서, 상기 부분은 적어도 CDR2 영역을 암호한다. 일부 구체예에서, 핵산은 상기 항체의 경쇄 CDR의 아미노산 서열을 암호한다. 일부 구체예에서, 상기 부분은 CDR1-CDR3로부터의 인접 영역을 암호한다.
일부 구체예에서, 핵산 분자는 항체 3.1.1, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.29.1 또는 24.2.1의 어느 하나의 VL 아미노산 서열에 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 VL 아미노산 서열, 또는 서열 번호 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94 또는 100의 어느 하나의 VL 아미노산 서열을 암호한다. 본 발명의 핵산 분자는 전술한 바와 같은 매우 엄격한 조건하에서 서열 번호 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94 또는 100의 아미노산 서열을 암호하는 핵산 서열에 하이브리드하는 핵산 또는 서열 번호 3, 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 93 또는 99의 핵산 서열을 갖는 핵산을 포함한다.
다른 구체예에서, 핵산은 3.1.1, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23. 28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K 또는 24.2.1로부터 선택된 항체의 전길이 경쇄, 또는 서열 번호 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64, 72, 80, 88, 94, 100 또는 102의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 본원에 개시된 것과 같은 돌연변이를 포함하는 경쇄를 암호한다. 또한, 핵산은 서열 번호 7, 15, 23, 31, 39, 47, 55, 63, 71, 79 또는 87의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수도 있으며, 또는 경쇄를 암호하는 핵산 분자는 본원에 개시된 것과 같은 돌연변이를 포함한다.
다른 바람직한 구체예에서, 핵산 분자는 인간 3-30+, 4-59, 1-02,4. 35 또는 3-30.3 VH 유전자 서열 또는 그로부터 유래된 서열을 포함하는 중쇄 (VH )의 가변부를 암호한다. 다양한 구체예에서, 핵산 분자는 인간 3-30+ VH 유전자, D4 (DIR3) 유전자 및 인간 JH6 유전자; 인간 3-30+ VH 유전자, 인간 D1-26 (DIR5) 유전자 및 인간 JH6 유전자; 인간 4.35 VH 유전자, 인간 DIR3 유전자 및 인간 JH6 유전자; 인간 4-59 VH 유전자, 인간 D4-23 유전자 및 인간 JH4 유전자; 인간 1-02 VH 유전자, 인간 DLR1 유전자 및 인간 JH4 유전자; 인간 3-30+ VH 유전자, 인간 D6-19 (DIR3) 유전자 및 인간 JH4 유전자; 인간 3-30+ VH 유전자, 인간 D1-1 유전자 및 인간 JH 6 유전자; 인간 3-30+ VH 유전자, 인간 D4-17 유전자 및 인간 JH6 유전자; 인간 3-30.3 VH 유전자, 인간 D4-17 유전자 및 인간 JH6 유전자; 인간 4-59 VH 유전자, 인간 D4-17(DIR1) 유전자 및 인간 JH5 유전자, 또는 이 인간 유전자들로부터 유래된 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 핵산 분자는 인간 V, D, 또는 J 유전자의 생식 세포 아미노산 서열에 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18 돌연변이를 포함하는 아미노산 서열을 암호한다. 일부 구체예에서, 상기 돌연변이는 VH 영역에 있다. 일부 구체예에서, 상기 돌연변이는 CDR 영역에 있다.
일부 구체예에서, 핵산 분자는 생식 세포 서열과 비교하여, 모노클로날 항체 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.29.1 또는 24.2.1의 VH 에서 발견되는 아미노산 돌연변이와 동일한, 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 암호한다. 일부 구체예에서, 핵산은 생식 세포 서열과 비교하여 전술한 모노클로날 항체 중 하나에서 발견되는 적어도 세 개의 아미노산 돌연변이에 동일한 적어도 세 개의 아미노산 돌연변이를 암호한다.
일부 구체예에서, 핵산 분자는 항체 3.1.1 (서열 번호: 2), 3.1.1H-A78T (서열 번호: 90), 3.1.1H-A78T-V88A-V97A (서열 번호: 92), 7.1.2 (서열 번호: 10), 10. 8. 3 (서열 번호:18), 15.1.1 (서열 번호: 26), 21.2.1 (서열 번호: 34), 21.4.1 (서열 번호: 42), 22.1.1 (서열 번호: 50), 22.1.1H-C109A (서열 번호: 96), 23.5.1 (서열 번호: 58), 23.28.1 (서열 번호: 66), 23.28.1H-D16E (서열 번호: 98), 23.29.1 (서열 번호: 74) 또는 24.2.1 (서열 번호:82)의 VH 아미노산 서열의 적어도 일부를 암호하는 뉴클레오티드 서열, 또는 보존적 아미노산 돌연변이 및/또는 총 세 개 이하의 비보존적 아미노산 치환을 갖는 상기 서열을 포함한다. 다양한 구체예에서, 이 서열은 하나 이상의 CDR 영역, 바람직하게는 CDR3 영역, 모든 세 개의 CDR 영역, CDR1-CDR3를 포함한 인접 부분, 또는 시그날 서열을 갖거나 갖지 않은 전체 VH 영역을 암호한다.
일부 구체예에서, 핵산 분자는 서열 번호 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 또는 98 중 하나의 아미노산 서열을 암호하는 뉴클레오티드 서열, 또는 시그날 서열이 없는 상기 서열을 포함한다. 일부 바람직한 구체예에서, 핵산 분자는 서열 번호 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 91, 95 또는 97의 뉴클레오티드 서열의 적어도 일부, 또는 시그날 서열이 없는 상기 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 부분은 VH 영역(시그날 서열이 있거나 없이), CDR3 영역, 모든 세 CDR 영역, 또는 CDR1-CDR3를 포함한 인접 영역을 암호한다.
일부 구체예에서, 핵산 분자는 도 lA-lC 또는 2A-2C에 나타난 VH 아미노산 서열 또는 서열 번호 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 또는 98의 어느 하나의 VH 아미노산 서열에 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 VH 아미노산 서열을 암호한다. 본 발명의 핵산 분자는 전술한 것과 같은 매우 엄격한 조건하에서 서열 번호 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 또는 98의 아미노산 서열을 암호하는 핵산 서열에 하이브리드하는 핵산, 또는 서열 번호 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 91, 95 또는 97의 핵산 서열을 갖는 핵산을 포함한다. 본 발명의 핵산 분자는 전술한 것과 같은 매우 엄격한 조건하에서 바로 이전에 개시한 VH 를 암호하는 핵산 서열에 하이브리드하는 핵산 분자를 포함한다.
다른 구체예에서, 핵산은 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.29.1 및 24.2.1로부터 선택된 항체의 전길이 중쇄, 또는 서열 번호 6, 14, 22, 30, 38, 46, 54, 62, 70, 78 또는 86의 아미노산 서열을 갖는 중쇄, 또는 본원에서 개시된 돌연변이 중 하나와 같은 돌연변이를 포함하는 중쇄를 암호한다. 또한, 핵산은 서열 번호 5, 13, 21, 29, 37, 45, 53, 61, 69, 77, 85 또는 89의 뉴클레오티드 서열, 또는 본원에 개시된 돌연변이 중 하나와 같은 돌연변이를 포함하는 중쇄를 암호하는 핵산 분자를 포함할 수도 있다.
항-CD40 항체의 중쇄 또는 전체 경쇄 또는 그 일부를 암호하는 핵산 분자를 그러한 항체를 생산하는 임의의 공급원으로부터 분리할 수 있다. 다양한 구체예에서, 핵산 분자는 CD40으로 면역된 동물로부터 분리된 B 세포로부터 분리되거나, 또는 항-CD40 항체를 발현하는 그러한 B 세포로부터 유래된 불멸화된 세포로부터 분리된다. 항체를 암호하는 mRNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, Sambrook et al.,을 참고한다. mRNA를 이용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR) 또는 항체 유전자의 cDNA 클로닝에 사용하기 위한 cDNA를 생산할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 핵산 분자는 그 융합 파트너 중 하나로서 비인간 트랜스제닉 동물로부터의 인간 면역글로불린-생산 세포를 갖는 하이브리도마로부터 분리된다. 더욱 바람직한 구체예에서, 인간 면역글로불린 생산 세포는 XenoMouseTM 동물로부터 분리된다. 다른 구체예에서, 인간 면역글로불린-생산 세포는 전술한 대로 비인간, 비마우스 트랜스제닉 동물로부터 얻는다. 다른 구체예에서, 핵산은 비인간, 비트랜스제닉 동물로부터 분리된다. 비인간, 비트랜스제닉 동물로부터 분리된 핵산 분자를, 예를 들어 인간화된 항체를 위해 이용할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 항-CD40 항체의 중쇄를 암호하는 핵산은 임의 공급원으로부터의 중쇄 불변부를 암호하는 뉴클레오티드 서열에 인프레임으로 연결된 본 발명의 VH 도메인을 암호하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 유사하게, 본 발명의 항-CD40 항체의 경쇄를 암호하는 핵산 분자는 임의 공급원으로부터의 경쇄 불변부를 암호하는 뉴클레오티드 서열에 인프레임으로 연결된 본 발명의 VL 도메인을 암호하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 추가 태양에서, 중쇄(VH) 및 경쇄 (VL)의 가변부를 암호하는 핵산 분자는 전길이 항체 유전자로 "전환"된다. 한 구체예에서, VH 또는 VL 도메인을 암호하는 핵산 분자는 이미 중쇄 불변부 또는 경쇄 불변부를 각각 암호하는 발현 벡터내로 삽입하여 VH 절편이 벡터내의 CH 절편에 작동 가능하게 연결되고 VL 절편이 벡터내의 CL 절편에 작동 가능하게 연결되도록 함으로써 전길이 항체 유전자로 전환된다. 다른 구체예에서, VH 및/또는 VL 도메인을 암호하는 핵산 분자는, VH 및/또는 VL 도메인을 암호하는 핵산 분자를 표준 분자 생물학 기법을 이용하여 CH 및/또는 CL 도메인을 암호하는 핵산 분자에 연결, 예를 들어 결찰시킴으로써 전길이 항체 유전자로 전환된다. 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 불변부 유전자의 핵산 서열은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, Kabat etal., Sequences of Proteins of Immunological Interes, 5th Ed., NIH Publ.No. 91-3242, 1991를 참고한다. 이어서 전길이 중쇄 및/또는 경쇄를 암호하는 핵산 분자를 그들이 도입되는 세포로부터 발현시키고 항-CD40 항체를 분리한다.
핵산 분자를 이용하여 대량의 항-CD40 항체를 재조합적으로 발현시킬 수 있다. 또한 핵산 분자를 이용하여 하기하는 바와 같은 키메라 항체, 이특이적 항체, 단일쇄 항체, 면역부착소, 디아바디, 돌연변이된 항체 및 항체 유도체를 생산할 수 있다. 만일 핵산 분자가 비인간, 비트랜스제닉 동물로부터 유래되면, 하기하는 바 대로, 핵산 분자를 항체 인간화를 위해 이용할 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자를 특정 항체 서열을 위한 프로브 또는 PCR 프라이머로서 이용한다. 예를 들어, 핵산 분자를 진단 방법에서 프로브로서, 또는 특히 항-CD40 항체의 가변부를 암호하는 부가의 핵산 분자를 분리하기 위해 이용될 수 있는 DNA의 영역을 증폭시키기 위한 PCR 프라이머로서 이용할 수 있다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 올리고뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 관심 항체의 중쇄 및 경쇄의 고도의 가변부 영역으로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 항체 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.28.1L-C92A, 23.29.1 또는 24.2.1의 하나 이상의 CDR의 일부 또는 모두를 암호한다.
벡터
본 발명은 본 발명의 항-CD40 항체의 중쇄 또는 그것의 항원-결합 부분을 암호하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 본 발명은 또한 그러한 항체의 경쇄 또는 그 항원-결합 부분을 암호하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 본 발명은 추가로 융합 단백질, 변형 항체, 항체 단편 및 그 프로브를 암호하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 항-CD40 항체, 또는 항원-결합 부분은 전술한 대로 얻어진 부분적 또는 전길이 경쇄 및 중쇄를 암호하는 DNA를, 전사 및 번역 조절 서열과 같은 필요한 발현 조절 서열에 유전자가 작동 가능하게 연결되도록 발현 벡터내로 삽입하여 발현된다. 발현 벡터는 플라스미드, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV), 식물 바이러스(카울리플라워 모자이크 바이러스, 담배 모자이크 바이러스), 코스미드, YAC, EBV 유래 에피좀 등을 포함한다. 항체 유전자는 벡터내의 전사 및 번역 조절 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 그들의 의도된 기능을 하도록 벡터내로 연결된다. 발현 벡터 및 발현 조절 서열은 이용되는 발현 숙주 세포와 양립하는 것으로 선택된다. 항체 경쇄 유전자와 항체 중쇄 유전자는 별도의 벡터내로 삽입될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 두 유전자 모두 동일한 발현 벡터내로 삽입된다. 항체 유전자는 표준 방법에 의해 발현 벡터내로 삽입된다(예, 항체 유전자 단편과 벡터상의 상보적 제한 부위의 결찰, 또는 제한 부위가 존재하지 않을 경우 평활 말단 결찰).
편리한 벡터는 전술한 대로, 임의의 VH 또는 VL 서열이 용이하게 삽입되고 발현될 수 있도록 조작된 적절한 제한 부위를 가지며, 기능적으로 완전한 인간 CH 또는 CL 면역글로불린 서열을 암호하는 것이다. 그러한 벡터에서, 스플라이싱은 일반적으로 삽입된 J 영역내의 스플라이스 공여 부위와 인간 C 도메인을 선행하는 스플라이스 수용 부위간에 일어나며, 또한 인간 CH 엑손내에 발생하는 스플라이스 영역에서도 일어난다. 폴리아데닐화와 전사 종결은 암호화 영역의 하부의 천연 염색체 부위에서 일어난다. 재조합 발현 벡터는 또한 숙주 세포로부터의 항체 쇄의 분비를 촉진하는 시그날 펩티드를 암호할 수 있다. 항체 쇄 유전자는 시그날 펩티드가 면역글로불린 쇄의 아미노 말단에 인프레임으로 연결되도록 벡터내로 클로닝될 수 있다. 시그날 펩티드는 면역글로불린 시그날 펩티드 또는 이종성 시그날 펩티드일 수 있다.(즉, 비-면역글로불린 단백질로부터의 시그날 펩티드).
항체 쇄 유전자에 더하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포내에서 항체 쇄 유전자의 발현을 조절하는 조절 서열을 보유한다. 당업자는 조절 서열의 선별을 포함한 발현 벡터의 고안이 형질 전환될 숙주 세포, 원하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 의존할 수도 있음을 이해할 것이다. 포유류 숙주 세포 발현을 위한 바람직한 조절 서열은 레트로바이러스 LTR, 사이토메갈로바이러스(CMV)(CMV 프로모터/인핸서와 같은), 시미안 바이러스(SV40)(SV40 프로모터/인핸서와 같은), 아데노바이러스(예, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(AdMLP)), 폴리오마로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서 및, 천연 면역글로불린과 액틴 프로모터와 같은 강한 포유류 프로모터와 같은, 포유류 세포에서 단백질의 고농도 발현을 지시하는 바이러스 요소를 포함한다. 바이러스 조절 요소 및 그 서열의 추가 내용을 위해서는, 예를 들어 미국 특허 5, 168, 062호, 4,510,245호 및 4,968,615호를 참고한다. 식물의 형질 전환뿐만 아니라, 프로모터 및 벡터의 설명을 포함한 식물에서 항체를 발현시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어 본원에 참고로 인용되는 미국 특허 6,517,529호를 참고한다. 박테리아 세포 또는 효모 세포와 같은 진균류 세포에서 폴리펩티드를 발현시키는 방법 또한 공지되어 있다.
항체 쇄 유전자 및 조절 서열에 더하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포내의 벡터의 복제를 조절하는 서열(예, 복제 오리진) 및 선별 마커 유전자와 같은 부가 서열을 보유할 수 있다. 선별 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선별을 촉진한다.(예, 미국 특허 4,399,216호, 4,634,665호 및 5,179,017호 참고). 예를 들어, 일반적으로 선별 마커 유전자는 G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약제에 대한 내성을, 벡터가 도입된 숙주 세포에 부여한다. 바람직한 선별 마커 유전자는 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 유전자(메토트렉세이트 선별/증폭으로 dhfr-숙주 세포에서 사용), neo 유전자(G418 선별), 및 글루타메이트 합성효소 유전자를 포함한다.
비-하이브리도마 숙주 세포 및 재조합적으로 단백질을 생산하는 방법
항-CD40 항체를 암호하는 핵산 분자 및 이들 핵산 분자를 포함하는 벡터를 적합한 포유류, 식물, 박테리아 또는 효모 숙주 세포의 형질감염을 위해 이용할 수 있다. 형질전환은 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포내로 도입하는 임의의 공지 방법에 의할 수 있다. 이종성 폴리뉴클레오티드를 포유류 세포내로 도입하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 덱스트란-매개된 형질감염, 칼슘 포스페이트 침전, 폴리브렌-매개된 형질감염, 원형질체 융합, 전기천공, 폴리뉴클레오티드를 리포좀내에 캡슐화하기, 및 핵으로의 DNA의 직접 미세주입을 포함한다. 또한, 핵산 분자를 바이러스 벡터에 의해 포유류 세포내로 도입할 수도 있다. 세포를 형질전환하는 방법은 공지되어 있다. 예를 들어 미국 특허 4,399,216호, 4,912,040호, 4,740,461호, 및 4,959,455호(본원에 참고로 인용됨)를 참고한다. 식물 세포를 형질전환하는 방법은 공지되어 있으며, 예를 들어 아그로박테리움-매개된 형질전환, 유전자 총(biolistic) 형질전환, 직접 주입, 전기 천공 및 바이러스 형질전환을 포함한다. 박테리아 및 효모 세포를 형질전환시키는 방법도 공지이다.
발현을 위한 숙주로 이용가능한 포유류 세포주는 공지이며 미합중국 모식균 배양 수집소(American Type Culture Collection)(ATCC)로부터 얻을 수 있는 많은 불멸화된 세포주를 포함한다. 이들은 특히 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, NSO, SP2 세포, HeLa 세포, 베이비 햄스터 신장(BHK) 세포, 원숭이 신장 세포(COS), 인간 간세포 암종 세포(예, Hep G2), A549 세포, 및 많은 다른 세포주를 포함한다. 특별히 바람직한 세포주는 어느 세포주가 높은 발현 수준을 갖는지를 결정하여 선택된다. 이용될 수 있는 다른 세포주는 Sf9 세포주와 같은 곤충 세포주이다. 항체 유전자를 암호하는 재조합 발현 벡터가 포유류 숙주 세포내로 도입될 경우, 항체는 숙주 세포내에서 항체가 발현되기에 충분한 시간동안, 또는 더욱 바람직하게는 숙주 세포가 성장한 배양 배지내로 항체가 분비되기에 충분한 시간 동안 그 숙주 세포를 배양함으로써 생산된다. 항체는 표준 단백질 정제 방법을 이용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다. 식물 숙주 세포는 예를 들어 니코티아나, 아라비돕시스, 개구리밥, 옥수수, 밀, 감자 등을 포함한다. 박테리아 숙주 세포는 이.콜리 및 스트렙토마이세스 종을 포함한다. 효모 숙주 세포는 쉬조사카로마이세스 폼베, 사카로마이세스 세레비제 및 피키아 파스토리스를 포함한다.
또한, 생산 세포주로부터 본 발명의 항체(또는 그로부터의 다른 부분들)의 발현은 많은 공지 방법을 이용하여 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 글루타민 합성효소 유전자 발현 시스템(GS 시스템)은 어떤 조건하에서 발현을 증가시키는 일반적인 접근법이다. GS 시스템은 유럽 특허 0 216 846, 0 256 055, 및 0 323 997호 및 유럽 특허 출원 89303964.4호와 관련하여 전체적으로 또는 부분적으로 개시된다.
다른 세포주 또는 트랜스제닉 동물에서 발현되는 항체는 서로 다른 당화를 가질 것이다. 하지만, 본원에서 제공된 핵산 분자에 의해 암호되거나 또는 본원에서 제공된 아미노산 서열을 포함하는 모든 항체는 항체의 당화에 상관없이 본 발명의 일부이다.
트랜스제닉 동물 및 식물
본 발명의 항-CD40 항체는 또한 관심의 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 서열을 위해 트랜스제닉인 포유류 또는 식물의 생산 및 그로부터 회수가능한 형태의 항체의 생산을 통해 형질전환적으로 생산될 수 있다. 포유류에서의 형질전환적 생산과 관련하여, 항-CD40 항체는 염소, 소 또는 다른 포유류의 우유에서 생산되어 회수될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 5,827,690호, 5,756,687호, 5,750,172호, 및 5,741,957호를 참고한다. 일부 구체예에서, 인간 면역글로불린 좌를 포함하는 비인간 트랜스제닉 동물을 CD40 또는 그 면역원성 부분으로 면역시킨다. 식물에서 항체를 제조하는 방법은 예를 들어 미국 특허 6,046,037호 및 5,959,177호에 개시된다.
일부 구체예에서, 본 발명의 항-CD40 항체를 암호하는 핵산 분자 하나 이상을 표준 트랜스제닉 기법에 의해 동물 또는 식물내로 도입시켜 비인간 트랜스제닉 동물 또는 식물을 생산한다. Hogan 및 미국 특허 6,417,429호를 참고한다. 트랜스제닉 동물을 제조하기 위해 이용되는 트랜스제닉 세포는 배아 줄기 세포 또는 체세포일 수 있다. 트랜스제닉 비인간 유기체는 키메라, 비키메라 이형접합체, 및 비키메라 동형접합체일 수 있다. 예를 들어, Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo : A Laboratory Manual 2ed., Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson etal., Mouse Genetics andTransgenics : A Practical Approach, Oxford University Press (2000); 및 Pinkert,Transgenic Animal Technology : A Laboratory Handbook, Academic Press (1999)를 참고한다. 일부 구체예에서, 트랜스제닉 비인간 동물은 관심의 중쇄 및/또는 경쇄를 암호하는 구조체를 표적화하여 표적화된 파괴 및 치환을 갖는다. 바람직한 구체예에서, 트랜스제닉 동물은 CD40, 바람직하게는 인간 CD40에 특이적으로 결합하는 중쇄 및 경쇄를 암호하는 핵산 분자를 포함하고 발현한다. 일부 구체예에서, 트랜스제닉 동물은 단일쇄 항체, 키메라 항체 또는 인간화된 항체와 같은 변형된 항체를 암호하는 핵산 분자를 포함한다. 항-CD40 항체는 임의의 트랜스제닉 동물에서 만들어질 수 있다. 바람직한 구체예에서, 비인간 동물은 마우스, 쥐, 양, 돼지, 염소, 소 또는 말이다. 비인간 트랜스제닉 동물은 혈액, 젖, 소변, 타액, 눈물, 점액 및 기타 체액에서 상기 암호된 폴리펩티드를 발현한다.
파아지 디스플레이 라이브러리
본 발명은 파아지 상의 인간 항체 라이브러리를 합성하는 단계, 라이브러리를 CD40 또는 그 일부로 스크리닝하는 단계, CD40에 결합하는 파아지를 분리하는 단계, 및 파아지로부터 항체를 얻는 단계를 포함하는, 항-CD40 항체 또는 그것의 항원-결합 부분을 생산하는 방법을 제공한다. 예로서, 파아지 디스플레이 기법에 사용하기 위한 항체의 라이브러리를 제조하는 한 방법은 인간 면역글로불린 좌를 포함하는 비인간 동물을 CD40 또는 그 항원성 부분으로 면역시켜 면역 반응을 생성하는 단계, 면역된 동물로부터 항체 생산 세포를 추출하는 단계; 추출된 세포로부터 RNA를 분리하고 RNA를 역전사시켜 cDNA를 생산하는 단계, 프라이머를 이용하여 cDNA를 증폭시키는 단계, 및 항체가 파아지상에 발현되도록 파아지 디스플레이 벡터내로 cDNA를 삽입하는 단계를 포함한다. 본 발명의 재조합 항-CD40 항체는 이 방식으로 얻을 수 있다.
본 발명의 재조합 항-CD40 인간 항체는 재조합 조합 항체 라이브러리를 스크리닝하여 분리할 수 있다. 바람직하게는, 라이브러리는 B 세포로부터 분리된 mRNA로부터 제조된 인간 VL 및 VH cDNA를 이용하여 생성된 scFv 파아지 디스플레이 라이브러리이다. 그러한 라이브러리를 제조하고 스크리닝하는 방법은 공지이다. 파아지 디스플레이 라이브러리를 생성하기 위한 키트들이 시판되고 있다(예, Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, catalog no. 27-9400-01 ; 및 Stratagene SurfZAP phage display kit, catalog no. 240612). 또한 항체 디스플레이 라이브러리를 생성하고 스크리닝하는데 이용될 수 있는 기타 방법과 시약이 있다(예, 미국 특허 5,223, 409; PCT 공개 Nos. WO 92/18619, WO 91/17271, WO 92/20791, WO 92/15679, WO93/01288, WO 92/01047, WO 92/09690; Fuchs et al., Bio/Technology 9: 1370-1372 (1991); Hay et al., Hum. Antibod. Hybridomas 3: 81-85 (1992); Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989); McCafferty et al., Nature 348: 552-554 (1990); Griffiths et al.,EMBO J.12 : 725-734 (1993); Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226: 889-896 (1992); Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :3576-3580 (1992); Garrad et al., Bio/Technology 9: 1373-1377 (1991) ; Hoogenboom et al., Nuc. Acid Res.19: 4133-4137 (1991); 및 Barbas et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88: 7978-7982(1991)를 참고).
한 구체예에서, 원하는 특성을 갖는 인간 항-CD40 항체를 분리하기 위해, 본원에 개시된 인간 항-CD40 항체를 먼저 이용하여, PCT 공개 WO93/06213호에 개시된 에피토프 임프린팅(imprinting) 방법을 이용하여 CD40에 대한 유사한 결합 활성을 갖는 인간 중쇄 및 경쇄 서열을 선별한다. 이 방법에 이용된 항체 라이브러리는 바람직하게는 PCT 공개 WO 92/01047, McCafferty et al., Nature 348 : 552-554 (1990); 및 Griffiths et al., EMBO J. 12: 725-734 (1993)에 개시된 대로 제조되고 스크리닝된 scFv 라이브러리이다. scFv 항체 라이브러리는 바람직하게는 인간 CD40을 항원으로 이용하여 스크리닝된다.
일단 초기 인간 VL 및 VH 도메인이 선택되면, 바람직한 VL/VH 쌍 조합을 선택하기 위해, 처음 선택된 VL 및 VH 절편의 다른 쌍들을 CD40 결합에 대해 스크리닝하는 "믹스 앤드 매치" 실험을 수행한다. 부가적으로, 항체의 질을 더 개선하기 위하여, 바람직한 VL/VH 쌍(들)의 VL 및 VH 절편을, 자연 면역 반응동안 항체의 친화성 성숙을 일으키는 생체내 체세포 돌연변이 과정과 유사한 과정에서 임의로, 바람직하게는 VL 및/또는 VH 의 CDR3 영역내에서 돌연변이시킬 수 있다. 이 생체외 친화성 성숙은, 일부 위치에서 네 가지의 뉴클레오티드 염기의 임의 혼합물로 "스파이크"되었으며 각각 VH CDR3 및 VL CDR3에 상보적인 PCR 프라이머를 이용하여 VL 및 VH 도메인을 증폭시켜, 생성된 PCR 생성물이 VL 및/또는 VH CDR3 영역내로 임의 돌연변이가 도입된 VL 및 VH 절편을 암호하도록 함으로써 이루어질 수 있다. 이들 임의 돌연변이된 VL 및 VH 절편은 CD40에 대한 결합에 대해 재스크리닝될 수 있다.
재조합 면역글로불린 디스플레이 라이브러리로부터 본 발명의 항-CD40 항체의 스크리닝 및 분리에 이어, 선택된 항체를 암호하는 핵산을 디스플레이 패키지로부터 회수하여(예, 파아지 게놈으로부터) 표준 재조합 DNA 기법에 의해 다른 발현 벡터내로 서브클로닝할 수 있다. 필요하면, 핵산을 추가로 조작하여 하기하는 바와 같이 본 발명의 다른 항체 형태를 생성할 수 있다. 조합 라이브러리를 스크리닝하여 분리된 재조합 인간 항체를 발현시키기 위해, 항체를 암호하는 DNA를 재조합 발현 벡터내로 클로닝시키고 하기하는 대로 포유류 숙주 세포내로 도입한다.
클래스 전환
본 발명의 다른 태양은 항-CD40 항체의 클래스 또는 하위클래스를 다른 클래스 또는 하위클래스로 전환시키는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, CL 또는 CH 를 암호하는 임의의 핵산 서열을 포함하지 않는, VL 또는 VH 를 암호하는 핵산 분자를 공지 방법을 이용하여 분리한다. 이어서 이 핵산 분자를 원하는 면역글로불린 클래스 또는 하위클래스로부터의 CL 또는 CH 를 암호하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결시킨다. 이것은 전술한 대로 CL 또는 CH 쇄를 포함하는 벡터 또는 핵산 분자를 이용하여 이룰 수 있다. 예를 들어, 원래 IgM이었던 항-CD40 항체는 IgG로 클래스가 전환될 수 있다. 또한, 클래스 전환을 이용하여 한 IgG 하위클래스를 다른 것으로, 예를 들어 IgG1에서 IgG2로 전환시킬 수 있다. 원하는 아이소타입을 포함하는 본 발명의 항체를 생산하는 다른 방법은 항-CD40 항체의 중쇄를 암호하는 핵산 및 항-CD40 항체의 경쇄를 암호하는 핵산을 분리하는 단계, VH 영역을 암호하는 서열을 분리하는 단계, 원하는 아이소타입의 중쇄 불변부를 암호하는 서열에 VH 서열을 연결하는 단계, 경쇄 유전자 및 중쇄 구조체를 세포내에서 발현시키는 단계, 및 원하는 아이소타입을 가진 항-CD40 항체를 수집하는 단계를 포함한다.
탈면역화된 항체
감소된 면역원성을 가진 항체를 생산하는 다른 방법은 항체의 탈면역화이다. 본 발명의 다른 태양에서, PCT 공개 WO98/52976 및 WO00/34317(참고로 본원에 인용됨)에 개시된 기법을 이용하여 항체를 탈면역시킬 수 있다.
돌연변이된 항체
다른 구체예에서, 핵산 분자, 벡터 및 숙주 세포를 이용하여 돌연변이된 항-CD40 항체를 만들 수 있다. 예를 들어, 항체의 결합 특성을 바꾸기 위하여, 중쇄 및/또는 경쇄의 가변부에서 항체를 돌연변이시킬 수도 있다. 예를 들어, 돌연변이를 하나 이상의 CDR 영역에 만들어, CD40에 대한 항체의 KD를 증가 또는 감소시키거나, Koff를 증가 또는 감소시키거나, 또는 항체의 결합 특이성을 바꿀 수 있다. 부위 지시된 돌연변이 유발의 기법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 상기한 Sambrook et al. 및 Ausubel et al.,을 참고한다. 바람직한 구체예에서, 돌연변이는 항-CD40 항체의 가변부에서 생식세포와 비교하여 변화될 것으로 알려진 아미노산 잔기에서 만들어진다. 다른 구체예에서, 하나 이상의 돌연변이는, 모노클로날 항체 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23. 28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K 및 24.2.1의 불변부에서 또는 가변부의 CDR 영역 또는 골격 영역에서 생식 세포와 비교하여 변화될 것으로 알려진 아미노산 잔기에서 만들어진다. 다른 구체예에서는, 하나 이상의 돌연변이가 서열 번호 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94, 100, 102, 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96, 98, 100 또는 102로부터 선택된 아미노산 서열 또는 그 핵산 서열이 서열 번호 3, 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 93, 99, 101, 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57,65, 73,81,89, 91,95, 97, 99 또는 101로 나타내지는 아미노산 서열의 가변부의 CDR 영역 또는 골격 영역에서 생식 세포와 비교하여 변화될 것으로 알려진 아미노산 잔기에서 만들어진다.
한 구체예에서, 골격 영역은 돌연변이되어, 생성된 골격 영역이 상응하는 생식 세포 유전자의 아미노산 서열을 갖는다. 돌연변이는 골격 영역 또는 불변부에서 만들어져 항-CD40 항체의 반감기를 증가시킬 수도 있다. 예를 들어, 본원에 참고로 인용되는 PCT 공개 WO 00/09560를 참고한다. 골격 영역 또는 불변부에서의 돌연변이는 또한 항체의 면역원성을 바꾸기 위해, 다른 분자에의 공유적 또는 비공유적 결합을 위한 부위를 제공하기 위해, 또는 보체 고정, FcR 결합 및 ADCC와 같은 특성을 바꾸기 위해 만들어질 수 있다. 본 발명에 따라, 단일 항체는 골격 영역, 불변부 및 가변부의 하나 이상에서 돌연변이를 가질 수도 있다.
일부 구체예에서, 돌연변이 전의 항-CD40 항체와 비교하여, 돌연변이된 항-CD40 항체의 VH 또는 VL 도메인 어느 하나에 1 내지 18(그 사이의 임의의 숫자를 포함)개의 아미노산 돌연변이가 있다. 전술한 어느 하나에서, 돌연변이는 하나 이상의 CDR 영역에서 발생할 수도 있다. 또한, 돌연변이 중 임의의 것은 보존적 아미노산 치환일 수 있다. 일부 구체예에서는, 불변부에서 5,4,3,2, 또는 1 이하의 아미노산 변화가 있다.
변형된 항체
다른 구체예에서, 다른 폴리펩티드에 연결된 본 발명의 항-CD40 항체의 모두 또는 일부를 포함하는 융합 항체 또는 면역부착소를 제조할 수도 있다. 바람직한 구체예에서, 항-CD40 항체의 가변부만을 폴리펩티드에 연결시킨다. 다른 바람직한 구체예에서, 항-CD40 항체의 VH 도메인은 첫번째 폴리펩티드에 연결되는 한편, 항-CD40 항체의 VL 도메인은 VH와 VL 도메인이 서로 상호작용하여 항체 결합 부위를 형성하는 방식으로 첫번째 폴리펩티드와 연합하는 두번째 폴리펩티드에 연결된다. 다른 바람직한 구체예에서, VH 도메인은 VH와 VL 도메인이 서로 상호작용할 수 있도록 링커에 의해 VL 도메인으로부터 분리된다(하기의 단일 쇄 항체 참고). 이어서 VH -링커-VL 항체를 관심 폴리펩티드에 연결시킨다. 융합 항체는 폴리펩티드를 CD40-발현 세포 또는 조직으로 보내는데 유용하다. 폴리펩티드는 독소와 같은 치료제, 성장 인자 또는 기타 조절 단백질일 수도 있고, 또는 양고추냉이 퍼옥시다제와 같은 쉽게 가시화될 수 있는 효소와 같은 진단제일 수도 있다. 또한, 둘(또는 그 이상)의 단일쇄 항체가 서로 연결된 융합 항체가 생성될 수 있다. 이것은 단일 폴리펩티드 쇄상에 이가 또는 다가 항체를 생성하고자 할 경우, 또는 이특이적 항체를 생성하고자 할 경우 유용하다.
단일쇄 항체(scFv)를 생성하기 위해, VH- 및 VL-암호화 DNA 단편을 유연한 링커를 암호하는, 예를 들어 아미노산 서열(Gly4-Ser)3을 암호하는 다른 단편에 작동 가능하게 연결시켜, VH 및 VL 도메인이 유연한 링커에 의해 연결되어 VH 및 VL 서열이 인접하는 단일쇄 단백질로 발현될 수 있도록 한다. 예를 들어, Bird etal., Science 242: 423-426 (1988); Huston et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 85 :5879-5883 (1988); McCafferty et al., Nature 348: 552-554 (1990)를 참고한다. 하나의 VH 및 VL 이 사용되면 단일쇄 항체는 일가이고, 만일 두 개의 VH 및 VL 이 사용되면 이가이며, 또는 둘보다 많은 VH 및 VL 이 사용되면 다가이다. CD40과 다른 분자에 특이적으로 결합하는 이특이적 또는 다가 항체가 생성될 수 있다.
다른 구체예에서, 다른 변형된 항체는 항-CD40 항체-암호화 핵산 분자를 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서의 개시에 따라 표준 분자 생물학 기법을 이용하여 "카파 바디(Kappa bodies)" (Ill et al., Protein Eng.10: 949-57 (1997) ),"미니바디(Minibodies)" (Martin et al., EMBOJ. 13 : 5303-9 (1994) ),"디아바디(Diabodies)" (Holliger et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993) ), 또는 "자누신(Janusins)"(Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655-3659 (1991) and Traunecker et al.,Iizt.J. Cancer (Suppl. ) 7: 51-52 (1992))을 제조할 수도 있다.
이특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결을 포함한 다양한 방법에 의해 생산할 수 있다. 예를 들어, Songsivilai & Lachmann, Clin.Exp. Immunol. 79 : 315-321 (1990), Kostelny et al., J. Immunol. 148: 1547-1553 (1992)를 참고한다. 또한, 이특이적 항체는 "디아바디" 또는 "자누신"으로 형성될 수도 있다. 일부 구체예에서, 이특이적 항체는 CD40의 두 개의 다른 에피토프에 결합한다. 일부 구체예에서, 이특이적 항체는 모노클로날 항체 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1,21.4.1, 21.2.1,22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1,23. 25.1, 23.28.1,23. 28.1H-D16E, 23. 28.1L-C92A, 23.29.1,23.29.1L-R174K 및 24.2.1로부터의 첫번째 중쇄와 첫번째 경쇄, 및 부가의 항체 중쇄 및 경쇄를 갖는다. 일부 구체예에서, 부가의 경쇄 및 중쇄는 또한 전술한 모노클로날 항체 중 하나로부터 유래하지만, 첫번째 중쇄 및 경쇄와는 상이하다.
일부 구체예에서, 전술한 변형된 항체는 본원에서 제공된 인간 항-CD40 모노클로날 항체로부터, 상기 모노클로날 항체의 아미노산 서열로부터, 또는 상기 모노클로날 항체를 암호하는 핵산 서열에 의해 암호되는 중쇄 또는 경쇄로부터의 가변부 또는 CDR 영역 중 하나 이상을 이용하여 제조한다.
유도체화되고 표지된 항체
본 발명의 항-CD40 항체 또는 항원-결합 부분은 유도체화되거나 다른 분자(예, 다른 펩티드 또는 단백질)에 연결될 수 있다. 일반적으로, 항체 또는 그 일부는 유도체화 또는 표지화에 의해 CD40 결합이 불리하게 영향을 받지 않도록 유도체화된다. 따라서, 본 발명의 항체와 항체 일부는 본원에서 개시된 인간 항-CD40 항체의 그대로의 형태 및 변형된 형태 둘다를 포함하는 것을 의도한다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 항체 일부는 다른 항체(예, 이특이적 항체 또는 디아바디), 검출제제, 세포독성 제제, 약학 제제, 및/또는 항체 또는 항체 일부와 다른 분자(예, 스트렙타비딘 코어 영역 또는 폴리히스티딘태그)의 연합을 매개할 수 있는 단백질 또는 펩티드와 같은 하나 이상의 다른 분자적 실체에 기능적으로 연결될(화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유적 연합 또는 기타에 의해) 수 있다.
유도체화된 항체의 한가지 유형은 둘 이상의 항체(동일한 유형 또는 다른 유형, 예를 들어 이특이적 항체를 생성하기 위해)를 가교시켜 생산된다. 적합한 가교제는 적절한 스페이서(예, m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스테르)에 의해 분리된 두 개의 별도로 반응하는 기를 갖는 이종이기능성 또는 동종이기능성(예, 디숙신이미딜 수버레이트)인 것들을 포함한다. 그러한 링커는 Pierce Chemical Company, Rockford, Ill에서 구할 수 있다.
다른 유형의 유도체화된 항체는 표지된 항체이다. 본 발명의 항체 또는 항원-결합 부위를 유도체화시킬 수 있는 유용한 검출 제제는 플루오로세인, 플루오로세인 이소티오시아네이트, 로다민, 5-디메틸아민-1-나프탈렌설포닐 클로라이드, 피코에리쓰린, 란타니드 포스포어 등을 포함한 형광 화합물을 포함한다. 항체는 또한 양고추냉이 퍼옥시다제, β-갈락토시다제, 루시퍼라제, 알카라인 포스파타제, 글루코스 옥시다제 등과 같은 검출에 유용한 효소로 표지될 수 있다. 항체가 검출가능한 효소로 표지될 경우, 구별될 수 있는 반응 생성물을 생산하기 위해 그 효소가 이용하는 부가의 시약을 첨가하여 검출한다. 예를 들어, 제제 양고추냉이 퍼옥시다제가 존재할 경우, 과산화수소와 디아미노벤지딘을 첨가하면 착색된 반응 생성물이 생기며, 이것을 검출할 수 있다. 항체는 또한 비오틴으로 표지하고, 아비딘 또는 스트렙타비딘 결합을 간접 측정하여 검출할 수 있다. 항체는 또한 이차 리포터에 의해 인지되는 선결된 폴리펩티드 에피토프(예, 루이신 지퍼 쌍 서열, 이차 항체를 위한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그)로 표지될 수 있다. 일부 구체예에서, 표지는 가능한 입체 방해를 감소시키기 위해 다양한 길이의 스페이서 아암에 의해 부착된다.
항-CD40 항체는 또한 방사성표지된 아미노산으로 표지할 수 있다. 방사성표지는 진단 및 치료 목적 둘다에 사용될 수 있다. 예를 들어, 방사성표지는 X-레이 또는 다른 진단 기법에 의해 CD40-발현 종양을 검출하기 위해 이용할 수 있다. 또한, 방사성 표지는 암세포 또는 종양을 위한 독소로서 치료적으로 이용할 수 있다. 폴리펩티드를 위한 표지의 예는 하기의 방사성동위원소 또는 방사성뉴클라이드 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I을 포함하며 이에 한정되지 않는다.
항-CD40 항체는 또한 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 메틸 또는 에틸기, 또는 카보하이드레이트기와 같은 화학기로 유도체화시킬 수도 있다. 이들 기는 예를 들어 혈청 반감기를 증가시키거나 조직 결합을 증가시키는 것과 같이 항체의 생물학적 특성을 개선하기 위해 유용하다.
약학 조성물 및 키트
본 발명은 또한 면역자극을 필요로 하는 대상의 치료를 위해 인간 항-CD40 아고니스트 항체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 그러한 조성물은 사람을 포함한 포유류에서, 바이러스 및 박테리아 감염을 포함한 감염의 빈도 또는 심각성을 치료, 예방, 감소시키기 위해, 암 및 암전 상태를 포함한 과다증식성 질병을 치료하기 위해, 과-IgM 신드롬과 같은 유전적 면역결핍 상태를 치료하기 위해, 그리고 호중성백혈구감소증을 특징으로 하는 상태를 포함한 일차 또는 복합 면역결핍 상태를 치료하기 위해 유용하다. 아고니스트 항-CD40 항체 치료로 치료하기 위한 대상은 예를 들어 화학요법으로 인해 면역억제된 개인 및 노년층을 포함하며 이에 한정되지 않는, 면역 증강을 필요로 하는 대상을 포함한다.
본 발명의 아고니스트 항-CD40 항체에 의해 치료될 수 있는 과다증식성 질병은 임의의 조직 또는 기관에 관련될 수 있으며 뇌, 폐, 편평세포, 방광, 위, 이자, 유방, 머리, 목, 간, 신장, 난소, 전립선, 직장결장, 식도, 부인과, 코인두, 또는 갑상선 암, 흑색종, 림프종, 백혈병 또는 다발 골수종을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 특히, 본 발명의 인간 아고니스트 항-CD40 항체는 유방, 전립선, 결장, 및 폐의 암종을 치료하는 데 유용하다.
치료는 본 발명의 아고니스트 항-CD40 모노클로날 항체 또는 그 항원-결합 단편 하나 이상을 단독으로 또는 약학적 허용 담체와 함께 투여하는 것에 관련된다. 본원에서 사용될 때, "약학적 허용 담체"는 생리학적으로 융화성인 임의의 그리고 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장 및 흡수 지연 제제, 등을 의미한다. 약학적 허용 담체의 일부 예는 물, 염수, 인산염 완충된 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 및 그 조합이다. 많은 경우에, 등장제제, 예를 들어 당, 만니톨, 소르비톨과 같은 폴리알콜, 또는 염화나트륨을 조성물내에 포함하는 것이 바람직할 것이다. 약학적 허용 물질의 부가의 예는 습윤제 또는 유화제, 방부제 또는 완충액과 같은, 항체의 반감기 또는 효과를 증가시키는 소량의 보조 물질 또는 습윤 제제이다.
본 발명의 아고니스트 항-CD40 항체와 이를 포함하는 조성물은 하나 이상의 다른 치료, 진단 또는 예방 제제와 함께 투여될 수 있다. 부가의 치료제는 다른 항-신생물제, 항-종양제, 항-혈관생성제 또는 화학요법제를 포함한다. 그러한 부가의 제제는 동일한 조성물에 포함되거나 또는 별도로 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 하나 이상의 아고니스트 항-CD40 항체를 백신으로 또는 백신에 대한 보조제로 이용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 다양한 형태, 예를 들어 액체 용액(예, 주사 용액 및 주입 용액), 분산액 또는 현탁액, 정제, 알약, 분말, 리포좀 및 좌약과 같은 액체, 반고체 및 고체 투여 형태일 수 있다. 바람직한 형태는 투여와 치료 적용의 의도한 양상에 의존한다. 일반적인 바람직한 조성물은 인간의 수동 면역화에 사용되는 것과 유사한 조성물과 같은 주사 또는 주입 용액의 형태이다. 바람직한 투여 양상은 비경구(예, 정맥내, 피하, 복강내, 근육내)이다. 바람직한 구체예에서, 항체는 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여된다. 다른 바람직한 구체예에서, 항체는 근육내 또는 피하 주사로 투여된다.
치료 조성물은 일반적으로 제조 및 저장 조건하에서 멸균 상태이고 안정해야 한다. 이 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 분산액, 리포좀, 또는 높은 약제 농도에 적합한 기타의 정리된 구조로 조제될 수 있다. 멸균 주사 용액은 필요량의 항-CD40 항체를 필요에 따라 상기에서 열거한 성분들중 하나 또는 조합과 함께 적절한 용매에 혼입하고, 이어서 여과 멸균시켜 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을, 염기성 분산액 매질과 상기 열거한 것들로부터의 필요한 기타 성분들을 함유하는 멸균 담체내로 혼입시켜 제조한다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 미리 멸균-여과된 용액으로부터 활성 성분과 임의의 부가 필요 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결-건조이다. 용액의 적절한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅을 사용하거나, 분산액의 경우에는 필요한 입자 크기를 유지하고, 계면활성제를 사용함으로써 유지될 수 있다. 주사용 조성물의 지속적인 흡수는 조성물내에 예를 들어 모노스테아레이트 염과 젤라틴과 같은 흡수를 지연시키는 제제를 포함시킴으로써 가능하다.
본 발명의 항체는, 많은 치료 분야의 경우 바람직한 투여 경로/모드가 피하, 근육내, 또는 정맥내 주입이긴 하지만, 다양한 공지 방법에 의해 투여될 수 있다. 당업자가 인식할 수 있을 것처럼, 투여 경로 및/또는 모드는 원하는 결과에 따라 다를 것이다.
일부 구체예에서, 항체 조성물은 이식물, 경피 패치, 및 미세캡슐화된 전달 시스템을 포함한, 서방성 제제와 같이, 신속한 방출로부터 항체를 보호할 담체와 함께 제조될 수 있다. 생분해성, 생물융화성 중합체를 이용할 수 있으며, 그 예는 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 있다. 그러한 제제를 제조하기 위한 많은 방법이 특허되었거나 또는 당업계에 공지이다. 예를 들어, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems (J. R. Robinson,ed., Marcel Dekker,Inc., New York, 1978)를 참고한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 항-CD40 항체는 예를 들어 불활성 희석제 또는 동화성의 먹을 수 있는 담체와 함께 경구 투여될 수 있다. 이 화합물(및 필요할 경우 기타 성분)은 또한 경질 또는 연질 쉘 젤라틴 캡슐에 쌓여지거나, 정제로 압착되거나, 또는 대상의 식사에 직접 포함될 수 있다. 경구 치료 투여의 경우, 항-CD40 항체를 부형제와 함께 포함시키고 소화가능한 정제, 볼 정제, 트로치, 캡슐, 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼, 등의 형태로 이용할 수 있다. 비경구 투여외의 방법으로 본 발명 화합물을 투여하기 위해서는, 화합물의 비활성화를 막기 위한 물질로 화합물을 코팅하거나 또는 이러한 물질과 함께 화합물을 동시 투여하는 것이 필요할 수도 있다.
부가의 활성 화합물을 또한 본 조성물내로 포함시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항-CD40 항체를 하나 이상의 부가의 치료제제와 함께 조제하고/하거나 동시투여한다. 이들 제제는 제한없이, 다른 표적에 결합하는 항체(예, 항-CTL4-항체와 같은, 하나 이상의 성장 인자 또는 사이토카인 또는 그들의 세포 표면 수용체에 결합하는 항체), 항신생 제제, 항종양 제제, 화학요법 제제, CD40을 활성화시키는 펩티드 유사체, 가용성 CD40L, CD40을 활성화시키는 하나 이상의 화학 제제, 및/또는 예를 들어 IFN-βl, IL-2, IL-8, IL-12, IL-15, IL-18, IL-23, IFN-γ, 및 GM-CSF와 같은, 종양 세포에 대한 면역 반응을 증가시킬 수 있는 공지의 제제를 포함한다. 그러한 조합 치료는 동시투여되는 제제뿐만 아니라 항-CD40 항체의 투여량이 낮아져 다양한 단독 요법과 관련된 가능한 독성 또는 합병증을 피할 수 있다.
본 발명의 아고니스트 항-CD40 항체와 이를 포함하는 조성물을 다른 치료 요법과 병용하여, 특히 방사선 치료와 병용하여 투여할 수 있다.
본 발명의 조성물은 "치료적 유효량" 또는 "예방적 유효량"의 본 발명의 항체 또는 그 항원-결합 부분을 포함할 수 있다. "치료적 유효량"은 원하는 치료 결과를 얻기 위해 필요한 기간 및 투여량에서 효과적인 양을 말한다. 항체 또는 항체 일부의 치료적 유효량은 개인의 질병 상태, 나이, 성별, 및 체중, 및 항체 또는 항체 일부가 개인에서 원하는 반응을 유도하는 능력과 같은 인자들에 따라 다를 수 있다. 치료적 유효량은 또한 항체 또는 항체 일부의 독성 또는 해로운 효과가 치료적으로 유익한 효과에 의해 크게 상쇄되는 양이다. "예방적 유효량"은 원하는 예방 효과를 얻기 위해 필요한 기간 및 투여량에서 효과적인 양이다. 일반적으로, 예방적 투여는 질병의 초기 단계 이전 또는 초기 단계에서 대상에 사용되므로, 예방적 유효량은 치료적 유효량보다 적을 것이다.
투여 요법은 적절한 원하는 반응(예, 치료 또는 예방 반응)을 제공하기 위해 조절될 수 있다. 예를 들어, 단일 환괴를 투여할 수도 있고, 여러 개의 분할된 투여량을 시간에 걸쳐 투여할 수도 있고, 또는 치료 상태의 요건에 의해 나타내지는 대로 투여량을 비례적으로 감소 또는 증가시킬 수도 있다. 비경구 조성물을 용이 투여와 투여량의 균일성을 위해 투여량 단위 형태로 조제하는 것이 특히 유익하다. 본원에서 사용될 때 투여 단위 형태는 치료될 포유류 대상을 위한 단위 투여량으로 맞춰진 물리적으로 분별된 단위; 필요한 약학적 담체와 함께 원하는 치료 효과를 생산하기 위해 계산된 선결된 활성 화합물의 양을 함유하는 각 단위를 말한다. 본 발명의 투여량 단위 형태를 위한 상세 사항은 (a) 항-CD40 항체 또는 일부의 독특한 특징과 얻어야 할 구체적 치료 또는 예방 효과, 및 (b) 개인에서 민감성의 치료를 위해 그러한 항체를 조합하는 당업계에 내재된 한계에 의해 지배되며 직접 의존한다.
본 발명의 항체 또는 항체 부분의 치료적 또는 예방적 유효량을 위한 예시적인 비제한적 범위는 0.025 내지 50 mg/kg, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 50 mg/kg, 더욱 바람직하게는 0.1-25, 0.1 내지 10 또는 0.1 내지 3 mg/kg이다. 투여량 값은 완화될 상태의 유형과 심각성에 따라 다양할 수도 있음을 주목해야 한다. 임의의 특정 대상의 경우, 구체적인 투여량 요법은 개체의 필요에 따라 그리고 조성물을 투여하거나 투여를 감독하는 사람의 전문가적 판단에 따라 시간에 걸쳐 조절되어야 하며, 본원에서 개시된 투여량 범위는 단지 예시일 뿐이며 청구된 조성물의 범위 또는 실시를 제한하고자 하는 것이 아님을 이해해야 한다.
본 발명의 다른 태양은 본 발명의 항-CD40 항체 또는 항체 일부 또는 그러한 항체를 포함하는 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 항체 또는 조성물에 더하여, 진단 또는 치료 제제를 포함할 수도 있다. 키트는 또한 진단 또는 치료 방법에 사용하기 위한 안내서를 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 키트는 항체 또는 항체를 포함하는 조성물 및 하기하는 방법에 사용할 수 있는 진단 제제를 포함한다. 다른 바람직한 구체예에서, 키트는 항체 또는 항체를 포함하는 조성물 및 하기하는 방법에 이용될 수 있는 하나 이상의 치료 제제를 포함한다.
본 발명은 또한 일정량의 화학치료제와 함께 본 발명의 항체 일정량을 포함하는 포유류에서 비정상적인 세포 성장을 억제하기 위한 조성물에 관한 것으로서, 여기서 화합물, 염, 용매화물 또는 전구약제, 및 화학치료제의 양은 비정상적인 세포 성장을 억제하는 데 함께 효과적이다. 많은 화학치료제가 현재 공지되어 있다. 일부 구체예에서, 화학치료제는 유사분열 억제제, 알킬화제, 항-대사물, 인터킬레이팅(intercalating) 항생제, 성장 인자 억제제, 세포 사이클 억제제, 효소, 토포아이소머라제(topoisomerase) 억제제, 생물학적 반응 변형제, 항-호르몬(예, 항-안드로젠), 및 항-혈관생성 제제로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
MMP-2 (매트릭스-메탈로프로테이나제 2) 억제제, MMP-9 (매트릭스-메탈로프로테이나제 9) 억제제, 및 COX-II (사이클로옥시게나제 II) 억제제와 같은 항-혈관생성 제제를 본 발명의 항-CD40 항체와 함께 이용할 수 있다. 유용한 COX-II 억제제의 예는 CELEBREXTM (아레콕시브), 발데콕시브, 및 로페콕시브를 포함한다. 유용한 매트릭스 메탈로프로테이나제 억제제의 예는 WO 96/33172 (1996년 10월 24일에 공개됨), WO 96/27583 (1996년 3월 7일에 공개), 유럽 특허 출원 No. 97304971.1 (1997년 7월 8일 출원), 유럽 특허 출원 No.99308617. 2 (1999년 10월 29일에 출원), WO 98/07697 (1998년 2월 26일에 공개), WO 98/03516 (1998년 1월 29일에 공개), WO 98/34918 (1998년 8월 13일에 공개), WO98/34915 (1998년 8월 13일에 공개), WO98/33768 (1998년 8월 6일에 공개), WO 98/30566 (1998년 7월 16일에 공개), 유럽 특허 출원 606,046 (1994년 7월 13일에 공개), 유럽 특허 출원 931,788 (1999년 7월 28일에 공개), WO 90/05719 (1990년 5월 31일에 공개), WO 99/52910 (1999년 10월 21일에 공개), WO 99/52889 (1999년 10월 21일에 공개), WO 99/29667 (1999년 6월 17일에 공개), PCT 국제 출원 No.PCT/IB98/01113 (1998년 7월 21일에 출원), 유럽 특허 출원 No. 99302232.1 (1999년 3월 25일 출원), 영국 특허 출원 9912961.1 (1999년 6월 3일 출원), 미국 가출원 No. 60/148,464 (1999년 8월 12일 출원), 미국 특허 5,863, 949 (1999년 1월 26일 허여됨), 미국 특허 5,861,510 (1999년 1월 19일 허여됨), 및 유럽 특허 공개 780,386 (1997년 6우러 25일 공개)에 개시되며, 이들은 모두 본원에 참고로 인용된다. 바람직한 MMP 억제제는 관절통을 나타내지 않는 것들이다. 더욱 바람직한 것은 다른 매트릭스-메탈로프로테이나제(즉,MMP-1, MMP-3, MMP-4, MMP-5, MMP-6, MMP-7, MMP-8, MMP-10, MMP-11, MMP-12 및 MMP-13)에 비하여 MMP-2 및/또는 MMP-9를 선택적으로 억제하는 것들이다. 본 발명에 유용한 MMP 억제제의 일부 특이적인 예는 AG-3340, RO 32-3555, RS 13-0830, 및 하기 리스트에 열거된 화합물이다: 3-[[4-(4-플루오로-페녹시)-벤젠설포닐]-(1-하이드록시카르바모일-사이클로펜틸)-아미노]-프로피온산; 3-엑소-3-[4-(4-플루오로-페녹시)-벤젠설포닐아미노]-8-옥사-바이사이클로[3.2.1]옥탄-3-카르복실산 하이드록시아미드; (2R, 3R)1-[4-(2-클로로-4-플루오로-벤질옥시)-벤젠설포닐]-3-하이드록시-3-메틸-피페리딘-2-카르복실산 하이드록시아미드;4-[4-(4-플루오로-페녹시)-벤젠설포닐아미노]-테트라하이드로-피란-4-카르복실산 하이드록시아미드;3-[[4-(4-플루오로-페녹시)-벤젠설포닐]-(1-하이드록시카르바모일-사이클로부틸)-아미노]-프로피온산;4-[4-(4-클로로-페녹시)-벤젠설포닐아미노]-테트라하이드로-피란-4-카르복실산 하이드록시아미드; (R)3-[4-(4-클로로-페녹시)-벤젠설포닐아미노]-테트라하이드로-피란-3-카르복실산 하이드록시아미드; (2R, 3R)1-[4-(4-플루오로-2-메틸-벤질옥시)-벤젠설포닐]-3-하이드록시-3-메틸-피페리딘-2-카르복실산 하이드록시아미드;3-[[4-(4-플루오로-페녹시)-벤젠설포닐](l-하이드록시카르바모일-l-메틸-에틸)-아미노]-프로피온산; 3-[[4-(4-플루오로-페녹시)-벤젠설포닐]-(4-하이드록시카르바모일-테트라하이드로-피란-4-일)-아미노]-프로피온산;3-엑소-3-[4-(4-클로로-페녹시)-벤젠설포닐아미노]-8-옥사-바이사이클로 [3.2.1] 옥탄-3-카르복실산 하이드록시아미드;3-엔도-3-[4-(4-플루오로-페녹시)-벤젠설포닐아미노]-8-옥사-바이사이클로 [3.2.1] 옥탄-3-카르복실산 하이드록시아미드 ; 및 (R)3-[4-(4-플루오로-페녹시)-벤젠설포닐아미노]-테트라하이드로-푸란-3-카르복실산 하이드록시아미드 ; 및 상기 화합물의 약학적 허용 염 및 용매화물.
본 발명의 화합물은 또한 EGF-R-항체, EGF 항체 및 EGF-R 억제제인 분자와 같은 EGF-R (상피 성장 인자 수용체) 반응을 억제할 수 있는 제제; VEGF 수용체와 VEGF를 억제할 수 있는 분자와 같은 VEGF (혈관 내피 성장 인자) 억제제; 및 erbB2 수용체에 결합하는 유기 분자 또는 항체와 같은 erbB2 수용체 억제제(예, HERCEPTINTM(Genentech, Inc.))와 같은 시그날 트랜스덕션 억제제와 이용될 수 있다. EGF-R 억제제는 예를 들어 WO 95/19970 (1995년 7월 27일 공개), WO 98/14451 (1998년 4월 9일 공개), WO 98/02434 (1998년 1월 22일 공개), 및 미국 특허 5,747,498호 (1998년 5월 5일 허여됨)에 개시되며, 그러한 물질은 본원에서 개시된 대로 본 발명에 이용될 수 있다. EGFR-억제 제제는 모노클로날 항체 C225 와 항-EGFR 22Mab(ImClone Systems Incorporated), ABX-EGF (Abgenix/Cell Genesys),EMD-7200(Merck KgaA), EMD-5590 (Merck KgaA), MDX-447/H-477 (Medarex Inc. 및 Merck KgaA), 및 화합물 ZD-1834, ZD-1838 및 ZD-1839 (AstraZeneca), PKI-166 (Novartis), PKI-166/CGP-75166 (Novartis), PTK 787 (Novartis), CP 701 (Cephalon), 레프루노미드(leflunomide)(Pharmacia/Sugen), CI-1033 (Warner Lambert Parke Davis), CI-1033/PD 183,805 (Warner Lambert Parke Davis), CL-387,785 (Wyeth-Ayerst), BBR-1611 (Boehringer Mannheim GmbH/Roche), 나미딘(Naamidine) A (Bristol Myers Squibb), RC-3940-II(Pharmacia), BIBX-1382(Boehringer Ingelheim), OLX-103(Merck & Co.), VRCTC-310 (Ventech Research), EGF 융합 독소 (SeragenInc.), DAB-389 (Seragen/Lilgand), ZM-252808 (Imperial Cancer Research Fund), RG-50864 (INSERM), LFM-A12 (Parker Hughes-Cancer Center), WHI-P97 (Parker Hughes Cancer Center), GW-282974 (Glaxo), KT-8391(Kyowa Hakko) 및 EGF-R 백신 (York Medical/Centro de Immunologia Molecular(CIM))을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 이들 및 다른 EGF-R 억제제를 본 발명에 이용할 수 있다.
예를 들어, SU-5416 및 SU-6668 (Sugen Inc. ), SH-268 (Schering), 및 NX-1838 (NeXstar)와 같은 VEGF 억제제 또한 본 발명의 화합물과 배합될 수 있다. VEGF 억제제는 예를 들어 WO 99/24440 (1999년 5월 20일 공개), PCT 국제 출원 PCT/IB99/00797 (1999년 5월 3일 출원), WO 95/21613 (1995년 8월 17일 공개), WO 99/61422 (1999년 12월 2일 공개), 미국 특허 5, 834, 504 (1998년 11월 10일 허여됨), WO 98/50356 (1998년 11월 12일 허여됨), 미국 특허 5,883, 113 (1999년 3월 16일 허여됨), 미국 특허 5,886, 020 (1999년 3월 23일 허여됨), 미국 특허 5,792, 783 (1998년 8월 11일 허여됨), WO 99/10349 (1999년 3월 4일 공개), WO97/32856 (1997년 9월 12일 공개), WO 97/22596 (1997년 6월 26일 공개), WO98/54093 (1998년 12월 3일 공개), WO98/02438 (1998년 1월 22일 공개), WO 99/16755 (1999년 4월 8일 공개), 및 WO98/02437 (1998년 1월 22일 공개)에 개시되며, 이들 모두 본원에 참고로 인용된다. 본 발명에 유용한 일부 특이적 VEGF 억제제의 다른 예는 IM862(Cytran Inc.); Genentech, Inc.의 항-VEGF 모노클로날 항체; 및 Ribozyme and Chiron으로부터의 합성 리보자임인 안지오자임이다. 이들 및 다른 VEGF 억제제를 본원에 개시된 대로 본 발명에 이용할 수 있다. GW-282974 (Glaxo Wellcome plc)및, 모노클로날 항체 AR-209 (Aronex Pharmaceuticals Inc.) 및 2B-1 (Chiron)와 같은 ErbB2 수용체 억제제는 본 발명의 화합물과 배합될 수 있으며, 예를 들어 본원에 참고로 인용되는 WO98/02434 (1998년 1월 22일 공개), WO99/35146 (1999년 7월 15일 공개), WO99/35132 (1999년 7월 15일 공개), WO 98/02437 (1998년 1월 22일 공개), WO 97/13760 (1997년 4월 17일 공개), WO 95/19970 (1995년 7월 27일 공개), 미국 특허 5,587, 458 (1996년 12월 24일 허여됨), 및 미국 특허 5,877, 305 (1999년 3월 2일 허여됨)에 개시된 것들이 있다. 본 발명에 유용한 ErbB2 수용체 억제제는 1999년 1월 27일에 출원된 미국 가출원 60/117,341호 및 1999년 1월 27일에 출원된 미국 가출원 60/117,346호에 개시되며, 이들 모두 참고로 본원에 인용된다. 전술한 PCT 출원, 미국 특허 및 미국 가출원에 개시된 erbB2 수용체 억제제 화합물 및 물질뿐만 아니라 erbB2 수용체를 억제하는 다른 화합물 및 물질도 본 발명에 따라 본 발명의 화합물과 이용될 수 있다.
항-생존 제제는 항-IGF-IR 항체 및 항-인테그린 항체와 같은 항-인테그린 제제를 포함한다.
진단적 사용 방법
다른 태양에서, 본 발명은 진단 방법을 제공한다. 항-CD40 항체를 이용하여 생체외 또는 생체내에서 생물학적 샘플에서 CD40을 검출할 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명은 대상내에 항체를 주입하는 단계, 항체가 결합된 곳을 국소화시켜 대상에서 CD40의 발현을 측정하는 단계, 대상에서의 발현을 정상 기준 대상 또는 표준의 발현과 비교하는 단계, 및 종양의 존재 또는 위치를 진단하는 단계를 포함하여, CD40-발현 종양의 존재 또는 위치를 대상에서 진단하는 방법을 제공한다.
항-CD40 항체를, 제한없이 ELISA, RIA, FACS, 조직 면역조직화학, 웨스턴 블롯 또는 면역침전을 포함하는 통상의 면역분석에서 이용할 수 있다. 본 발명의 항-CD40 항체를 이용하여 인간으로부터 CD40을 검출할 수 있다. 다른 구체예에서, 항-CD40 항체를 이용하여 사이노몰구스 및 레서스 원숭이, 침팬지 및 유인원과 같은 동반구 영장류로부터의 CD40을 검출할 수 있다. 본 발명은 생물 샘플을 본 발명의 항-CD40 항체와 접촉시키고 결합된 항체를 검출하는 것을 포함하는, 생물 샘플에서 CD40을 검출하는 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 항-CD40 항체는 검출가능한 표지로 직접 표지시킨다. 다른 구체예에서, 항-CD40 항체(첫번째 항체)는 표지되지 않으며 두번째 항체 또는 항-CD40 항체에 결합할 수 있는 다른 분자가 표지된다. 당업계에 공지된 바와 같이, 두번째 항체는 첫번째 항체의 구체적 종과 클래스에 특이적으로 결합할 수 있는 것으로 선택한다. 예를 들어, 만일 항-CD40 항체가 인간 IgG이면, 두번째 항체는 항-인간-IgG일 수 있다. 항체에 결합할 수 있는 다른 분자는 제한없이 단백질 A 및 단백질 G를 포함하며, 둘다 예를 들어 Pierce Chemical Co.에서 시판된다.
항체 또는 두번째 항체를 위한 적합한 표지는 상기에서 개시되었으며, 다양한 효소, 보철 기, 형광 물질, 발광 물질 및 방사성 물질을 포함한다. 적합한 효소의 예는 양고추냉이 퍼옥시다제, 알카라인 포스파타제, β-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스터라제를 포함하며; 적합한 보철 기 복합체의 예는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴을 포함하며; 적합한 형광 물질의 예는 움벨리페론, 플루오르세인, 플루오르세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오르세인, 댄실 클로라이드 또는 피코에리트린을 포함하며; 발광 물질의 예는 루미놀을 포함하며; 그리고 적합한 방사성 물질의 예는 125I, 131I, 35S 또는 3H를 포함한다.
다른 구체예에서, CD40은 검출가능한 물질로 표지된 CD40 표준과 표지되지 않은 항-CD40 항체를 이용한 경쟁 면역분석에 의해 생물 샘플에서 분석될 수 있다. 이 분석에서는, 생물 샘플, 표지된 CD40 표준 및 항-CD40 항체를 배합하고, 표지되지 않은 항체에 결합된 표지된 CD40 표준의 양을 측정한다. 생물 샘플내의 CD40의 양은 항-CD40 항체에 결합한 표지된 CD40 표준의 양에 역 비례한다.
많은 목적을 위해 상기에서 개시된 면역분석을 이용할 수 있다. 예를 들어, 항-CD40 항체를 이용하여 세포 배양물내의 세포에서 CD40을 검출할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 항-CD40 항체를 이용하여 다양한 화합물로 처리된 세포의 표면상의 CD40의 양을 측정한다. 이 방법은 CD40을 활성화시키거나 또는 억제하는 데 유용한 화합물을 동정하기 위해 이용될 수 있다. 이 방법에 따라, 세포의 샘플을 일정 기간동안 시험 화합물로 처리하는 한편, 다른 샘플을 미처리로 남겨둔다. 만일 총 CD40 농도를 측정하려면, 세포를 용해하고 총 CD40 농도를 전술한 면역분석중 하나를 이용하여 측정한다. 처리된 세포내의 CD40의 총 농도 대 미처리 세포내의 CD40의 총농도를 비교하여 시험 화합물의 효과를 측정한다.
총 CD40 농도를 측정하기 위한 바람직한 면역분석은 ELISA 또는 웨스턴 블롯이다. 만일 CD40의 세포 표면 농도를 측정하려면, 세포를 용해시키지 않고, CD40의 세포 표면 농도를 전술한 면역분석의 하나를 이용하여 측정한다. CD40의 세포 표면 농도를 측정하기 위한 바람직한 면역분석은 겸출가능한 표지(예, 비오틴 또는 125I)로 세포 표면 단백질을 표지하는 단계, 항-CD40 항체로 CD40을 면역침전시키는 단계, 및 표지된 CD40을 검출하는 단계를 포함한다. CD40의 국소화, 예를 들어 세포 표면 농도를 측정하는 다른 바람직한 면역분석은 면역조직화학을 이용하는 것이다. ELISA, RIA, 웨스턴 블롯, 면역조직화학, 통합 막 단백질의 세포 표면 표지화 및 면역침전과 같은 방법은 공지되어 있다. 예를 들어 상기의 Harlow and Lane을 참고한다. 또한, CD40의 활성화 또는 억제에 대해 다수의 화합물을 시험하기 위해 고 처리 스크리닝을 위해 면역분석을 대규모로 할 수 있다.
본 발명의 항-CD40 항체는 또한 조직 또는 조직에서 유래된 세포에서 CD40의 농도를 측정하기 위해 이용할 수 있다. 일부 구체예에서, 조직은 질병 조직이다. 일부 구체예에서, 조직은 종양 또는 그 생검이다. 본 방법의 일부 구체예에서, 조직 또는 그 생검은 환자로부터 채취한다. 이어서 조직 또는 생검을 면역분석에 이용하여 예를 들어, 총 CD40 농도, CD40의 세포 표면 농도 또는 CD40의 국소화를 전술한 방법들에 의해 측정한다.
전술한 진단 방법을 이용하여 종양이 고농도의 CD40을 발현하는지 여부를 측정할 수 있으며, 이때 CD40은 종양이 항-CD40 항체를 이용한 치료의 표적임을 나타낼 것이다. 또한, 동일한 방법을 이용하여, 종양에서 세포 사멸을 검출함으로써 항-CD40 항체를 이용한 치료 효과를 모니터할 수 있다. 진단 방법을 또한 이용하여 조직 또는 세포가 불충분한 농도의 CD40 또는 활성화된 CD40을 발현하는지 여부, 그리고 따라서 활성화 항-CD40 항체, CD40L 및/또는 CD40 농도 또는 활성을 증가시키기 위한 다른 치료제를 이용한 치료의 후보인지를 결정할 수 있다.
본 발명의 항체는 또한 CD40을 발현하는 조직과 기관을 동정하기 위해 생체내에서 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 항-CD40 항체를 이용하여 CD40-발현 종양을 동정한다. 본 발명의 인간 항-CD40 항체를 이용하는 한 가지 잇점은 그들이 비인간 기원의 항체와는 달리 인간화된 항체처럼, 투여시 항체에 대한 면역 반응을 유도하지 않고 생체내에서 안전하게 이용될 수 있다는 것이다.
본 방법은 진단 시험을 필요로 하는 환자에게 검출가능하게 표지된 항-CD40 항체 또는 이를 포함하는 조성물을 투여하는 단계 및 환자를 CD40-발현 조직의 국소화를 결정하기 위래 영상 분석하는 단계를 포함한다. 영상 분석은 의학 분야에 공지되어 있으며, 제한없이 X-레이 분석, 자기 공명 영상화(MRI) 또는 컴퓨터화된 단층촬영술을 포함한다. 항체는 X-레이 분석에 사용될 수 있는 바륨과 같은 대조 제제, 또는 MRI 또는 CE를 위해 이용될 수 있는 가돌리늄 킬레이트와 같은 자기 대조 제제와 같은 생체내 영상화에 적합한 임의 제제로 표지될 수 있다. 다른 표지화 제제는 제한없이 99Tc와 같은 방사성동위원소를 포함한다. 다른 구체예에서, 항-CD40 항체는 표지되지 않고, 검출가능하고 항-CD40 항체에 결합할 수 있는 다른 분자 또는 두번째 항체를 투여하여 영상화될 것이다. 구체예에서, 관심 조직이 CD40을 발현하는지 여부를 결정하기 위해 환자로부터 생검을 얻는다.
치료적 사용 방법
다른 태양에서, 본 발명은 본 발명의 항-CD40 항체를 이용하는 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 인간 아고니스트 항-CD40 항체를, 교차반응성 CD40을 발현하는 인간 또는 비인간 포유류에 투여할 수 있다. 항체를, 수의 목적을 위해, 또는 인간 질병의 동물 모델로서 비인간 포유류(즉, 영장류, 사이노몰구스 또는 레서스 원숭이)에 투여될 수 있다. 그러한 동물 모델은 본 발명의 항체의 치료 효능을 평가하는 데 유용하다.
일부 구체예에서, 항-CD40 항체를 과다-IgM 신드롬을 가진 CD40-의존성 면역결핍, 공통 가변성 면역결핍증, 브루톤의 무감마글로불린혈증, IgG 하위클래스 결핍증, 및 X-연결된 SCID(공통 감마쇄 돌연변이)를 포함한 일차 및/또는 복합 면역결핍증으로 고통받는 대상에 투여한다. 일부 구체예에서, 항-CD40 항체를 투여하여 예를 들어 화학요법으로 인해 면역억제되거나 HIV와 같은 후천성 면역 결핍 질환을 포함한 면역 약화 질병을 갖는 대상을 치료한다. 일부 구체예에서, 항-CD40 항체를 투여하여 노인의 면역성을 증가시킨다. 일부 구체예에서, 항-CD40 항체를 투여하여 박테리아, 바이러스, 진균류 또는 기생충 감염을 갖는 대상을 치료한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 인간 아고니스트 항-CD40 항체를 나이, 질병 또는 일반적인 약한 건강때문에 감염에 민감한 대상에 예방적으로 투여하여 감염의 수 또는 심각성을 방지하거나 감소시킬 수 있다.
일부 구체예에서, 항-CD40 항체를 과다증식 질병을 갖는 대상에 투여한다.
일부 구체예에서, 항-CD40 항체를 종양을 가진 대상을 치료하기 위해 투여한다. 일부 구체예에서, 종양은 CD40 양성이다. 일부 구체예에서, 종양은 CD40 음성이다. 종양은 고형 종양 또는 림프종같은 비고형 종양일 수 있다. 일부 구체예에서, 항-CD40 항체를 암인 종양을 갖는 환자에 투여한다. 일부 구체예에서, 항체는 암세포 증식을 억제하거나, 종양 중량 또는 부피의 증가를 억제하거나 방지하고/하거나 종양 중량 또는 부피의 감소를 야기한다.
본 발명의 항-CD40 항체 또는 항체 일부로 치료될 수 있는 환자는 뇌암, 폐암, 뼈암, 췌장암, 피부암, 머리와 목 암, 피부 또는 안내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문 영역의 암, 위암, 위장암, 결장직장암, 결장암, 유방암, 부인과 종양(예, 자궁 육종, 자궁관 암종, 자궁내막의 암종, 자궁목의 암종, 질의 암종 또는 음문의 암종), 식도의 암, 소장의 암, 내분비계의 암(예, 갑상선, 부갑상선 또는 부신의 암), 연조직의 육종, 백혈병, 골수종, 다발성 골수종, 요도의 암, 음경의 암, 전립선 암, 만성 또는 급성 백혈병, 유년의 고형 종양, 호지킨 병, 림프구 림프종, 비호지킨 림프종, 방광암, 간암, 신장암, 신장 또는 요관의 암(예, 신장 세포 암종, 신우의 암종), 또는 중추 신경계의 종양(예, 일차 CNS 림프종, 척수축 종양, 뇌줄기 신경아교증 또는 뇌하수체 샘종), 신경아교증 또는 섬유육종을 갖는 것으로 진단된 환자를 포함하며 이에 제한되지 않는다.
항체는 하루 세번부터 매 6개월마다 한번까지 투여될 수 있으며, 그리고 바람직하게는 경구, 점막, 볼, 비강내, 흡입성, 정맥내, 피하, 근육내, 비경구, 종양내, 경피, 또는 국소 경로를 통해 투여될 수도 있다. 항체는 또한 미니펌프를 통하여 연속하여 투여될 수 있다. 항체는 일반적으로 그 항체가 종양 또는 암의 성장을 중지시키거나 또는 중량 또는 부피를 감소시킬 경우, 종양이 존재하는 한 투여될 것이다. 항체의 투여량은 일반적으로 0.025 내지 50 mg/kg, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 50 mg/kg, 더욱 바람직하게는 0.1-20 mg/kg, 0.1-10mg/kg, 0.1-5mg/kg 또는 더욱 바람직하게는 0.1-2 mg/kg 범위일 것이다. 항체는 또한 예방적으로 투여될 수 있다.
일부 구체예에서, 항-CD40 항체는 하나 이상의 부가의 항종양 약제 또는 분자를 포함하는 치료 요법의 일부로서 암 또는 종양과 같은 과다증식 질병을 갖는 환자에게 투여된다. 예시적인 항종양 제제는 유사분열 억제제, 알킬화제, 항-대사물, 인터킬레이팅 제제, 성장 인자 억제제, 세포 사이클 억제제, 효소, 토포아이소머라제 억제제, 생물 반응 변형제, 항-호르몬, 키나제 억제제, 매트릭스 메탈로프로테아제 억제제, 유전적 치료제 및 항-안드로젠을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 더욱 바람직한 구체예에서, 항-CD40 항체는 아드리아마이신 또는 택솔과 같은 항종양 제제와 함께 투여된다. 일부 바람직한 구체예에서, 항-CD40 치료는 방사성 요법, 화학 요법, 광선역학 요법, 수술 또는 기타 면역 요법과 함께 수행된다. 일부 구체예에서, 항-CD40 항체는 하나 이상의 부가의 항체와 함께 투여된다. 예를 들어, 항-CD40 항체는 종양 또는 암세포 증식을 억제하는 것으로 알려진 항체와 함께 투여된다. 그러한 항체는 CTLA4, erbB2 수용체, EGF-R,IGF-1R, CD20 또는 VEGF를 억제하는 항체를 포함하며 이에 한정되지 않는다.
일부 구체예에서, 항-CD40 항체는 방사성표지, 면역독소 또는 독소로 표지되거나, 또는 독성 펩티드를 포함하는 융합 단백질이다. 항-CD40 항체 또는 항-CD40 항체 융합 단백질은 방사성 표지, 면역독소, 독소 또는 독성 펩티드를 종양 또는 암 세포로 보낸다. 바람직한 구체예에서, 방사성 표지, 면역독소, 독소 또는 독성 펩티드는 항-CD40 항체가 세포 표면상의 CD40에 결합한 후 종양 또는 암세포에 의해 흡수된다.
다른 태양에서, 항-CD40 항체는 환자에서 특정 세포의 어팝토시스를 유도하기 위해 치료적으로 이용될 수 있다. 많은 경우에, 어팝토시스를 위해 표적화된 세포는 암 세포 또는 종양 세포이다. 따라서, 본 발명은 항-CD40 항체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하여 어팝토시스를 유도하는 방법을 제공한다.
다른 태양에서, 본 발명은 활성화 항-CD40 항체를 환자에 투여하여 CD40 활성을 증가시키는 방법을 제공한다. 항-CD40 항체는 CD40 활성을 증가시키는 하나 이상의 다른 인자와 함께 투여된다. 그러한 인자는 CD40L, 및/또는 CD40을 활성화시키는 CD40L의 유사체를 포함한다.
일부 구체예에서, 항-CD40 항체는 제한없이 IFN-β1, IL-2, IL-8, IL-12, IL-15, IL-18, IL-23, IFN-γ, 및 GM-CSF를 포함하는 부가의 면역 증강 제제 하나 이상과 함께 투여된다.
일부 구체예에서, 본 발명의 인간 아고니스트 항-CD40 항체는 백신의 효능을 증가시키기 위한 보조제로 이용된다. 이러한 방식으로 사용될 때, 항-CD40 항체는 B 세포, 가지 세포 및 단핵구를 포함한 항원 전달 세포상의 CD40을 활성화할 뿐만 아니라, 사이토카인과 케모카인과 같은 면역조절 분자의 생산을 증가시킨다. 항체의 면역자극 효과는 백신 항원에 대한 백신화된 대상의 면역 반응을 증가시킨다.
다른 태양에서, 본 발명은 암 또는 가지 세포 면역 요법을 위한 가지 세포 백신을 생성하는 방법을 제공한다. 이 방법에 따라, 암 환자로부터의 가지 세포를 종양 용해물 또는 균질현탁액, 방사 또는 다른 수단에 의해 사멸된 종양 세포, 또는 종양 특이적 항원(예, 펩티드, 이디오타입) 및 1-10㎍/ml의 항-CD40 항체와 함께 1-5일간 배양한다. 종양 항원-자극된 가지 세포를 환자에 다시 주사하여 항-종양 면역 반응, 특히 항-종양 CTL 반응을 자극한다. 본 방법에 사용하기 위한 단핵구-유래 가지 세포는 IL-4와 GM-CSF에서 배양하여 말초 혈액 샘플로부터 얻을 수 있다. 가지 세포는 또한 CD34 양성 세포의 자기 정제 또는 분류 및 이어서 IL-4와 GM-CSF에서의 배양에 의해 환자의 골수로부터 유래될 수 있다.
유전자 치료
본 발명의 핵산 분자는 유전자 치료를 통해 이를 필요로 하는 환자에게 투여될 수 있다. 이 치료는 생체내 또는 생체외일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 중쇄 및 경쇄를 암호하는 핵산 분자를 환자에게 투여한다. 더욱 바람직한 구체예에서는, 핵산 분자가 항체 생산을 위해 특화된 B 세포의 염색체내로 안정하게 통합되도록 핵산 분자를 투여한다. 바람직한 구체예에서, 전구체 B 세포는 생체외에서 형질감염되거나 감염되고, 이를 필요로 하는 환자내로 재이식된다. 다른 구체예에서, 전구체 B 세포 또는 다른 세포는 관심의 세포 유형을 감염시키는 것으로 알려진 바이러스를 이용하여 생체내에서 감염된다. 유전자 치료를 위해 이용되는 전형적인 벡터는 리포좀, 플라스미드 및 바이러스 벡터를 포함한다. 바이러스 벡터의 예는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-관련 바이러스이다. 생체내 또는 생체외 감염 후, 치료된 환자로부터 샘플을 취하고 공지되거나 본원에서 개시된 임의의 면역분석을 이용하여 항체 발현의 정도를 모니터할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 유전자 치료 방법은 항-CD40 항체의 중쇄 또는 그 항원-결합 부분을 암호하는 분리된 핵산 분자를 투여하는 단계와 핵산 분자를 발현시키는 단계를 포함한다. 다른 구체예에서, 유전자 치료 방법은 항-CD40 항체의 경쇄 또는 그 항원-결합 부분을 암호하는 분리된 핵산 분자를 투여하는 단계와 핵산 분자를 발현시키는 단계를 포함한다. 더욱 바람직한 방법에서, 유전자 치료 방법은 본 발명의 항-CD40 항체의 중쇄 또는 그 항원-결합 부분을 암호하는 분리된 핵산 분자 및 경쇄 또는 그 항원-결합 부분을 암호하는 분리된 핵산 분자를 투여하는 단계 및 그 핵산 분자를 발현시키는 단계를 포함한다. 유전자 치료 방법은 또한 택솔 또는 아드리아마이신과 같은 다른 항암제를 투여하는 단계를 포함할 수도 있다.
본 발명이 더 잘 이해되도록, 하기 실시예를 개시한다. 이들 실시예는 단지 예시 목적이며 어떤 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다.
실시예 I
항-CD40 항체를 생산하는 하이브리도마의 생성
본 발명의 항체를 하기와 같이 제조, 선별, 및 분석하였다.
면역화 및 하이브리도마 생성
8주 내지 10주된 XenoMiceTM을 복강내로 또는 그들의 뒷발바닥으로 CD40-IgG 융합 단백질(10㎍/1회 투여량/마우스)로, 또는 그 형질막상에 인간 CD40을 발현하는 형질감염된 세포주인 300.19-CD40 세포(10 X 106 세포/1회 투여량/마우스)로 면역화시켰다. 3주 내지 8주의 기간에 걸쳐 이 투여를 5회 내지 7회 반복하였다. 융합 4일 전에, PBS중의 인간 CD40의 세포외 도메인을 마우스에 최종 주사하였다. 면역화된 마우스로부터의 비장과 림프절 림프구를 비분비성 골수종 P3-X63-Ag8.653 세포주와 융합시키고, 융합된 세포를 앞서 개시된 대로 HAT 선별하였다(Galfre and Milstein, Methods Enzymol. 73: 3-46, 1981). CD40 특이적 인간 IgG2κ 항체를 분비하는 하이브리도마의 패널을 회수하였다. 추가 연구를 위하여 열한개의 하이브리도마를 선택하고 그들을 3.1.1, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.29.1 및 24.2.1로 표시하였다.
부다페스트 조약에 따라 ATCC( 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209)에 2001년 8월 6일에 하이브리도마 3.1.1, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1 및 21.4.1을 기탁하였다. 2002년 7월 16일에 ATCC에 하이브리도마 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.29.1 및 24.2.1을 기탁하였다. 이 하이브리도마들은 하기 기탁 번호가 부여되었다:
실시예 II
본 발명에 따라 제조된 항-CD40-항체의 서열
본 발명에 따라 생산된 항체의 구조를 분석하기 위하여, 항-CD40 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마로부터의 중쇄 및 경쇄 단편을 암호하는 핵산을 클로닝하였다. 클로닝과 서열 결정은 하기와 같이 이루어졌다.
실시예 I에서 개시된 바와 같이 인간 CD40으로 면역화된 XenoMouseTM 마우스로부터 유래된 약 2 X 105 하이브리도마 세포로부터, Fast-Track 키트 (Invitrogen)을 이용하여 폴리(A)+ mRNA를 분리하였다. PCR에 의해 랜덤 프라임된 cDNA의 생성을 따랐다. 인간 VH 또는 인간 Vκ군 특이적 가변 영역 프라이머(Marks et al.,"Oligonucleotide primers for polymerase chain reaction amplification of human immunoglobulin variable genes and design of family-specific oligonucleotideprobes." Eur. J. Immunol. 21: 985-991 (1991)) 또는 유니버셜 인간 VH 프라이머, MG-30, CAGGTGCAGCTGGAGCAGTCIGG (서열 번호:118)를 인간 Cj2 불변 영역에 특이적인 프라이머, MG-40d, 5'-GCTGAGGGAGTAGAGTCCTGAGGA-3' (서열 번호 : 119) 또는 Cκ 불변 영역(hκP2 ; Green et al., 1994에서 개시됨)과 함께 이용하였다. 전술한 프라이머를 이용하여 폴리(A+)RNA로부터 생성된 PCR 생성물을 직접 서열 결정하여 항-CD40 생산 하이브리도마로부터의 인간 중쇄 및 카파 경쇄 전사물을 암호하는 핵산 분자를 얻었다. 또한 TA 클로닝 키트(Invitrogen)를 이용하여 pCRII내로 PCR 생성물을 클로닝하고 프리즘 염료-종결인자 서열 결정 키트와 ABI 377 서열결정 기계를 이용하여 모든 쇄를 서열 결정하였다. MacVector와 Geneworks 소프트웨어 프로그램을 이용하여 "V BASE 서열 디렉토리"(Tomlinson et al.,MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK)에 배열하여 모든 서열을 분석하였다.
또한, 모노클로날 항체 3.1.1, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.28.1, 23.29.1 및 24.2.1를 전길이 DNA 클로닝과 서열 결정하였다. 그러한 서열 결정을 위하여, QIAGEN RNeasy RNA 분리 키트(QIAGEN)을 이용하여 약 4 X 106 하이브리도마 세포로부터 RNA를 분리하였다. 올리고-dT(18)과 Advantage RT/PCR 키트(Clonetech)을 이용하여 mRNA를 역전사시켰다. 중쇄의 제한 부위, 적절한 Kozak 서열, ATG 개시 부위 및 시그날 서열의 일부를 포함한 전방 증폭 프라이머를 고안하기 위하여 V Base를 이용하였다. 표 1은 항체 클론을 서열결정하기 위하여 이용한 전방 증폭 프라이머를 나열한다.
[표 1]
IgG2 불변 영역의 3' 암호 서열, 종결 코돈, (5'-TTCTCTGATCAGAATTCC TATCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3') (서열 번호 : 125) 및 제한 부위를 포함하는 프라이머를 고안하기 위하여 동일한 방법을 이용하였다.
또한 카파 쇄의 ATG 개시 부위 주위의 프라이머를 고안하기 위하여 동일한 방법을 사용하였다:(5'-CTTCAAGCTTACCCGGGCCACCATGAGGCTCCCTGCTCAGC-3') (서열 번호 : 126). 적절한 Kozak 서열(CCGCCACC)를 ATG 개시 부위의 5'에 부가하였다. 이 프라이머를 이용하여 다음 항체 클론들의 경쇄를 PCR 클로닝하였다: 3.1.1, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1 및 23.29.1. 두번째 전방 프라이머 5'-TCTTCAAGCTTGCCCGGGCCCGCCACCATGGAAACCCCAGCGCAG-3' (서열 번호.134)를 이용하여 클론 23.28.1 및 24.2.1의 경쇄를 클로닝하였다. 또한 동일한 방법을 이용하여 카파 불변 영역의 종결 코돈 주위의 프라이머를 고안하였다(5'-TTCTTTGATCAGAATTCTCACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGC-3') (서열 번호: 127). 이들 프라이머 쌍을 이용하여 Advantage High Fidelity PCR Kit (Clonetech)를 이용하여 cDNA를 증폭시켰다. 염료-종결인자 서열 결정 키트와 ABI 서열 결정 기계를 이용한 표준 기법(예, 프라이머 워킹)을 이용하여 직접 서열 결정하여 PCR 생성물의 서열을 얻었다. PCR 생성물을 포유류 발현 벡터내로 클로닝하고 클론을 서열 결정하여 체세포 돌연변이를 확인하였다. 각 클론에 대하여, 적어도 세 반응에서 양 쇄의 서열을 확인하였다.
유전자 이용 분석
표 2는 본 발명에 따른 항체의 선택된 하이브리도마 클론에 의해 입증된 유전자 이용을 개시한다:
[표 2]
중쇄 및 경쇄 유전자 이용
서열 및 돌연변이 분석
이해되는 바와 같이, 유전자 이용 분석은 항체 구조의 제한된 개요만을 제공한다. XenoMouseTM 동물내의 B-세포가 추계학적으로 V-D-J 종쇄 또는 V-J 카파 경쇄 전사물을 생성함에 따라, 제한 없이 체세포 과돌연변이, 결실, N-부가, 및 CDR3 연장을 포함하는 많은 이차 과정이 일어난다. 예를 들어, Mendez et al., Nature Genetics 15: 146-156 (1997) 및 국제 특허 공개 WO 98/24893을 참고한다. 따라서, 항체 구조를 더 검사하기 위해, 클론으로부터 얻은 cDNA로부터 항체의 예측된 아미노산 서열을 얻었다. 표 A는 서열 결정된 항체의 예측된 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열 각각을 위한 서열 동정자를 제공한다.
표 3-7은 항체 3.1.1 (표 3), 7.1.2 (표 4), 10.8.3 (표 5), 15.1.1 (표 6) 및 21.4.1 (표 7)의 중쇄 및 카파 경쇄의 뉴클레오티드 서열 및 예측된 아미노산 서열을 제공한다.
표 8-13은 항체 21.2.1 (표 8), 22.1.1 (표 9), 23.5.1 (표 10), 23.28.1 (표 11), 23.29.1 (표 12) 및 24.2.1 (표 13)의 중쇄 및 카파 경쇄의 가변부의 뉴클레오티드 서열 및 예측된 아미노산 서열을 제공한다.
모노클로날 항체 23.28.1의 전길이 서열 결정으로부터 얻은 DNA 서열은 초기 PCR 생성물의 VH 영역을 서열 결정하여 얻은 DNA 서열과 1 염기쌍(C 대 G)이 상이하여, 천연 중쇄의 잔기 16이 D에서 E로 바뀐다.
표 14-19는 항체 21.2.1 (표 14), 22.1.1 (표 15), 23.5.1 (표 16), 23.28.1 (표 17), 23.29.1 (표 18) 및 24.2.1 (표 19)의 중쇄 및 카파 경쇄의 뉴클레오티드 서열 및 예측된 아미노산 서열을 제공한다. 표에서, 시그날 펩티드 서열(또는 이를 암호하는 염기)는 밑줄이 그어져 있다.
두 개의 돌연변이된 항체 22.1.1 및 23.28.1을 생성하였다. 항체 22.1.1의 중쇄를 돌연변이시켜 위치 109의 시스테인 잔기를 알라닌 잔기로 바꾸었다. 돌연변이된 이 클론을 22.1.1H-C019A로 표시하였다. 항체 23.28.1의 경쇄를 위치 92에서 돌연변이시켜 시스테인 잔기를 알라닌 잔기로 변화시켰다. 이 돌연변이된 클론을 23.28.1L-C92A로 표시하였다.
프라이머를 고안하고 Stratagene으로부터의 QuickChange Site Directed Mutagenesis Kit를 이용하여 제조자의 지시에 따라 특정 잔기들의 돌연변이 유발을 수행하였다. 자동 서열 결정으로 돌연변이를 확인하고, 돌연변이된 삽입물을 발현 벡터내로 서브클로닝하였다.
표 20은 항체 22.1.1H-C109A의 돌연변이된 중쇄의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열을 제공한다. 표 21은 항체 23.28.1의 돌연변이된 경쇄의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열을 제공한다. 돌연변이된 DNA 코돈은 이탤릭체로 기재되어 있다. 돌연변이된 아미노산 잔기는 굵게 표시되어 있다.
[표 3]
항체 3.1.1의 DNA 및 단백질 서열
[표 4]
항체 7.1.2의 DNA 및 단백질 서열
[표 5]
항체 10.8.3의 DNA 및 단백질 서열
[표 6]
항체 15.1.1의 DNA 및 단백질 서열
[표 7]
항체 21.4.1의 DNA 및 단백질 서열
[표 8]
항체 21.2.1의 성숙 가변부의 DNA 및 단백질 서열
[표 9]
항체 22.2.1의 성숙 가변부의 DNA 및 단백질 서열
[표 10]
항체 23.5.1의 성숙 가변부의 DNA 및 단백질 서열
[표 11]
항체 23.28.1의 성숙 가변부의 DNA 및 단백질 서열
[표 12]
항체 23.29.1의 성숙 가변부의 DNA 및 단백질 서열
[표 13]
항체 24.2.1의 성숙 가변부의 DNA 및 단백질 서열
[표 14]
항체 21.2.1의 DNA 및 단백질 서열
[표 15]
항체 22.2.1의 DNA 및 단백질 서열
[표 16]
항체 23.5.1의 DNA 및 단백질 서열
[표 17]
항체 23.28.1의 DNA 및 단백질 서열
[표 18]
항체 23.29.1의 DNA 및 단백질 서열
[표 19]
항체 24.2.1의 DNA 및 단백질 서열
[표 20]
항체 22.1.1H-C109A의 성숙 가변부의 DNA 및 단백질 서열
[표 21]
항체 23.28.1L-C92A의 성숙 가변부의 DNA 및 단백질 서열
실시예 III
중쇄 및 경쇄 아미노산 치환의 분석
도 1D-1H 및 2D-2H는 모노클로날 항체 3.1.1, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.29.1 및 24.2.1 항체의 예측된 중쇄 가변부 아미노산 서열과 그들의 각 유전자의 생식 세포 아미노산 서열간의 서열 배열을 제공한다. 중쇄 CDR3 영역의 대부분은 아미노산 삽입을 함유한다.
항체 21.4.1의 VH 도메인에 사용된 DLR1 유전자는 두 개의 시스테인(Cys) 잔기를 암호한다. 질량 분광분석 및 상동성 모델링은 두 개의 Cys 잔기가 이황화-연결되어 있으며 이 이황화 연결은 항체의 구조를 파괴하지 않음을 입증하였다.
도 1A-1C 및 2A-2C는 모노클로날 항체 3.1.1, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.29.1 및 24.2.1 클론의 예측된 경쇄 가변부 아미노산 서열과 그들 각각의 유전자의 생식세포 아미노산 서열간의 서열 배열을 제공한다. 이들 항체의 경쇄는 세 개의 다른 Vκ 유전자로부터 유래된다. 열한 개의 항체중 일곱개가 A3/A19 Vκ 유전자를 이용하며, 이중 여섯 개는 CDR1 영역에 두 개의 돌연변이를 가진다. 또한, A3/A19 Vκ 유전자를 이용하는 이 일곱개의 항체 중 다섯 개는 또한 Jκ1 유전자를 이용하며; 모든 이들 항체에서 Jκ1 유전자에서 유래된 첫번째 아미노산은 일치하여 W에서 R로 바뀐다.
전술한 아미노산 치환 또는 삽입의 다수가 CDR에 매우 인접하여 또는 CDR내에 존재함이 이해될 것이다. 그러한 치환은 CD40 분자에 대한 항체의 결합에 다소 영향을 미칠 것이다. 또한, 그러한 치환은 항체의 친화성에 상당한 영향을 가질 수 있다.
실시예 IV
본 발명의 항체의 종 교차반응성
다양한 종, 특히 일부 동반구 원숭이로부터의 CD40에 대한 본 발명의 항체의 결합 및 친화성을 결정하기 위하여 FACS 분석을 실시하였다. 본원에 예시된 본 발명의 항-CD40 항체의 농도를 증가시키면서 또는 음성 대조군으로서 항-열쇠구멍삿갓조개 헤모시아닌(KLH) 항체와 함께 인간 및 원숭이 전혈의 분액을 1시간동안 얼음에서 항온처리하였다. 이어서 샘플을 항-인간 IgG2-접합된 RPE(피코에리트린)과 함께 얼음에서 30분간 항온처리하였다. CD19/CD20 양성 B 세포의 유동 세포측정에 의해 결합을 측정하고 형광 강도(F12-H) 대 세포 수(카운트)의 히스토그램을 CellQuest 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 평균 형광 강도 대 항체 농도의 그래프로부터 각 항체에 대해 결합(KD)을 평가하였다. 세포 농도 범위에 걸쳐 결합을 측정함으로써 항체의 고갈을 조절하였다.
인간, 레서스 및 사이노몰구스 B 세포에 대한 결합에 대해 항체 3.1.1, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1 및 21.4.1을 시험하였다. 또한 인간 및 사이노몰구스 B 세포에 대한 결합에 대해 항체 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.29.1 및 24.2.1을 시험하였다.
원숭이 세포에 대한 최대 결합의 1/2을 위한 농도와 최대 시그날이 인간 B 세포를 위한 상응하는 파라미터에 대해 2배 내임을 관찰하였다. 마우스, 쥐, 토끼 및 개 혈액을 이용한 유사 실험에서는 결합이 전혀 관찰되지 않았다.
실시예 V
CD40에 대한 항체의 선택성
CD40에 대한 본 발명 항체의 선택성을 결정하기 위해 다른 생체외 분석을 실시하였다.
CD40 선택성 ELISA: 재료 및 방법
네 개의 항원 CD40/Ig, CD44/Ig, RANK/Ig,4-lBB/Ig,TNFR-1/Ig 및 TNFR-2/Ig (인하우스로 생성된 항원)으로 4℃에서 pH 9.6의 0.1M 소듐 비카보네이트 완충액중 100㎕/웰 1㎍/ml로 96-웰 FluroNUNC 플레이트(Nunc Cat No.475515)를 피복하였다. 이어서 PBST (PBS + 0.1% Tween-20)로 플레이트를 세번 세척하고 플레이트를 150㎕/웰로 PBST+0.5% BSA로 차단하였다. 실온에서 1시간동안 플레이트를 항온처리하고 이어서 PBST로 세번 세척하였다. 이어서, 실시예 I에서 생성된 항-CD40 항체를 1㎍/ml로 블록에서 희석하고 희석된 항체를 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간동안 항온처리하고 이어서 PBST로 세번 세척하였다. 이어서 실시예 I에서 생성된 항체를 함유한 웰을 블록에서 1:4000 희석의 항-인간 IgG2-HRP(Southern Biotech Cat No.9070-05) 100ml/웰로 처리하였다. 또한, 블록에서 1:5000으로 희석된 항-인간 IgG (Jackson Cat No. 209-035-088)으로 한 열을 처리하고 플레이트 피복에 대해 표준화하기 위해 100㎕/웰로 첨가하였다. 또한 양성 대조군으로서, 블록에서 희석된 0.05㎍/ml의 항-인간 CD40-HRP(Pharmingen Cat No. 345815/Custom HRP conjugated)로 한 열을 처리하였다. 실온에서 1시간동안 플레이트를 항온처리하고 이어서 PBST로 세번 세척하였다.100㎕/웰로 TMB 기질을 첨가하고 5 내지 10분동안 플레이트를 항온처리하였다. 이어서 Spectra-MaxTM 플레이트 판독기를 이용하여 플레이트를 판독하였다. 결과는 CD4-특이적 시그날(CD40 시그날 마이너스 배경)이 다른 분자들에 대한 상응하는 시그날보다 적어도 100배 큰 점에서, 항체가 RANK,4-1BB, TNFR-1 및 TNFR-2에 대한 그들의 선택성보다 적어도 100배 큰 선택성을 CD40에 대해 가짐을 보여주었다.
실시예 VI
에피토프 분류 연구
본 발명의 항체가 CD40에 대해 선택적임이 입증되었으므로, BIA 코어와 FACS를 이용하여 경쟁 결합 분석을 실시하였다.
BIA코어 경쟁 연구
BIA 코어 경쟁 연구를 실시하여 본 발명의 인간 항-CD40 항체가 CD40 분자상의 동일하거나 다른 부위에 결합하는 지 여부를 결정하였다.
이들 실험에서는 제조자의 프로토콜에 따라 BIA 코어 2000 기계를 사용하였다. 단백질-A를 BIA코어의 센서 칩 표면상에 고정화시켰다. CD40의 세포외 도메인을 포함하는 CD40-Ig의 포화 농도를 센서 칩에 결합시켰다. 이어서 본 발명의 첫번째 인간 아고니스트 항-CD40 항체, 시판되는 항-CD40 항체 또는 CD40L을 포화 조건하에서 센서칩-결합된 CD40에 결합시켰다. 이어서 본 발명의 두번째 인간 아고니스트 항-CD40 항체가 첫번째 항체, 시판되는 항체 또는 CD40L과 CD40에 결합하기 위해 경쟁하는 능력을 측정하였다. 이 기법은 항체를 다른 결합 그룹으로 분류할 수 있도록 하였다. CD40에의 결합은 독립적인 에피토프의 인식을 나타냈다. 결합의 부재는 동일한 에피토프 또는 중복되는 에피토프의 인식을 나타낼 수도 있다.
FACS 연구
본 발명의 인간 항-CD40 항체가 CD40 분자상의 동일하거나 다른 부위에 결합하는 지를 결정하고 그들이 시판되는 항-CD40 항체 EA5(Alexis Cat. No. ANC-300-050), LOB7/6 (Serotec MCA/590PE) 및 5C3 (Pharmingen # 555458 (비표지됨) 및 555460 (FACS를 위해 PE 표지됨)와 동일하거나 다른, CD40 분자상의 부위에 결합하는지를 결정하기 위해 FACS 연구를 실시하였다.
본 발명의 항-CD40 항체로 처리된 가지 세포를 PE 표지된 EA5 또는 PE 표지된 LOB7/6 항체로 얼음에서 30분간 카운터염색하였다. 세척 후, 세포 염색을 B-D 칼리버 세포측정에서 분석하였다. 시판되는 항체의 결합 감소는 시험 항체가 동일하거나 중복되는 에피토프에 결합하였음을 나타내는 것으로 해석하였다.
BIA코어 및 FACS에 의한 경쟁 결합 분석은 mAb 21.4.1 항체에 의해 인식된 에피토프가 EA5 항체에 의해 인식된 에피토프와 중복되며, 시판되는 LOB7/6 항체에 의해 인식되는 에피토프와는 겹치지 않으며 CD40L에 대한 결합 부위와 중복되지 않음을 보여주었다. 나머지 항체에 의해 인식된 에피토프는 CD40L에 대한 결합 부위와 중복된다.
표 22는 이들 에피토프 분류 연구의 결과를 요약한다.
[표 22]
본 발명의 일부 항-CD40 항체의 BIA 코어 경쟁 에피토프 분류
실시예 VII
항-CD40 항체에 의한 표면 분자의 상향 조절
본 발명의 인간 항-CD40 항체가 B 세포상의 표면 분자의 발현을 상향 조절하는 지를 결정하기 위하여 전혈 분석을 실시하였다.
인간 또는 영장류 전혈을 RPMI 배지로 1:1로 희석하고 다양한 농도의 CD40 아고니스트 항체 또는 대조군과 24시간동안 항온처리하였다. 시판되는 형광색소 표지된 항체 시약을 이용하여 세포를 HLA-DR, ICAM, B7-1, B7-2, CD19/CD20, CD40, CD23 및 CD71에 대해 30분간(얼음에서 어두운 곳에서) 염색하였다. 이어서 세포를 FACS-Caliber(Becton-Dickinson)에서 분석하였다. B-세포를 CD19 또는 CD20 양성 세포상의 게이팅 및 이 게이트에 대해 결정된 활성화 마커에 의해 동정하였다.
본 발명의 항-CD40 항체중 하나(21.4.1)를 이용하여 얻은 평균 EC50 및 중간 형광의 최대 배수 증가(1㎍/ml 이하 항체에서)가 표 23에 나타난다.
[표 23]
본 발명의 항-CD40 항체에 의한 B-세포 표면 분자의 상향 조절
또한 본 발명의 인간 항-CD40 항체가 단핵구-유래 가지 세포의 표면 분자의 발현을 상향 조절하는 지 여부를 결정하기 위하여 실험을 실시하였다.
단핵구 유래 가지 세포의 제조
말초 혈액을 정상 인간 지원자로부터 수집하였다. Sigma Accuspin 튜브 (St. Louis, MO)를 이용하여 단핵 세포를 분리하고, RPMI 배지 (Gibco BRL,Rockville, MD)로 세척하고, 완전 RPMI 배지 (100 U/ml 페니실린/스트렙토마이신, 10 mM HEPES 완충액, 2 mM 글루타민, 0.1 mM 비필수 아미노산을 함유함; 모두 Gibco BRL에서 구입함); 및 10% 태아 소 혈청 (Hyclone, Logan, Utah)중에 5 X 106/ml로 조직 배양 플라스크에 두었다. 37℃(5% CO2)에서 3시간동안 항온처리한 후, 비부착성 세포를 제거하고 선택 컬럼(R & D systems, Minneapolis,MN)을 이용하여 T 세포를 분리하였다. 부착 세포를 RPMI 배지로 세척하고 10 ng/ml IL-4( R & D systems) 및 100 ng/ml GM-CSF (R & D systems)으로 보충된 완전 RPMI 배지에서 7일간 항온처리하였다. 이어서, 비부착 세포를 분리하고, 세척하고, 모든 실험에서 단핵구 유래된 가지 세포로서 이용하였다. 나머지 부착 세포를 트립신/EDTA를 이용하여 제거하여 부착 단핵구를 이용하는 실험에서 사용하였다.
본 발명의 항-CD40 항체가 세포 표면 마커의 발현을 상향조절하는 지 결정하기 위하여, 단핵구 유래된 가지 세포를 다양한 농도의 아고니스트 항체와 함께 48-72시간동안 배양한 후, 시판되는 형광색소 표지된 항체 시약을 이용하여 HLA-DR, ICAM, B7-1, B7-2, CD40 및 CD83에 대해 염색(30분, 얼음 및 어두운 곳에서)하였다. 이어서 세포를 FACS-Caliber(Beckton-Dickinson)에서 분석하였다.
본 발명의 항-CD40 항체 중 하나(21.4.1)를 이용하여 얻은 평균 EC50 및 중간 형광의 최대 배수 증가(1㎍/ml 이하 항체에서)가 표 24에 나타난다.
[표 24]
본 발명의 항-CD40 항체에 의한 가지 세포 표면 분자의 상향 조절
다양한 본 발명의 항-CD40 항체와 부가의 마커를 이용하여 B 세포와 mDCs로 유사한 실험을 수행하였다. 항-CD40 항체 1 ㎍/ml을 이용하여 상기한 대로 B 세포 표면 분자(MHC-11, ICAM,B7-1, B7-2 및 CD23)의 발현을 측정하였다. 이 실험의 결과는 표 25에 나타난다. 항-CD40 항체 1 ㎍/ml을 이용하여 상기한 대로 72시간 후 가지 세포 표면 분자 (MHC-11, ICAM,B7-1, B7-2 및 CD83)의 발현을 측정하였다. 이 실험의 결과는 표 26에 나타난다. 표 25-26은 중앙 강도 +/- 표준 편차의 배수 증가를 보여준다.
[표 25]
본 발명의 항-CD40 항체에 의한 B-세포 표면 분자의 상향 조절
[표 26]
본 발명의 항-CD40 항체에 의한 가지 세포 표면 분자의 상향 조절
표 27은 B 세포에서의 평균-배수 증가에 대한, 가지 세포에서의 평균-배수 증가의 비율 관점에서 B 세포에 대한 가지 세포에서의 세포 표면 분자의 상향 조절을 비교한다.
[표 27]
B 세포에 대한 가지 세포상의 세포 표면 분자의 상향 조절
실시예 VIII
사이토카인 분비의 증가
본 발명의 인간 항-CD40 항체가 IL-12p40,IL-12p70 및 IL-8의 분비를 증가시키는 지 여부를 결정하기 위하여 단핵구 유래 가지 세포 분석을 실시하였다.
단핵구 유래 가지 세포와 부착성 단핵구를 상기한 대로 준비하였다. 본 발명의 항-CD40 항체(21.4.1)의 존재하에 또는 음성 대조군으로서 항-열쇠구멍 삿갓조개 헤모시아닌(KLH) 항체와 함께 세포를 배양하였다. ELISA(R & D systems)에 의해 24시간째에 상등액에서 사이토카인을 측정하였다. 일부 연구에서는(표 28 참고), 항체로 처리한 단핵구 유래 가지 세포를 또한 100 ng/ml LPS(Sigma), 1000 U/ml IFNγ (R & D systems) 또는 25 ng/ml IL-lβ( R & D systems)로 동시자극하였다.
항-CD40 항체는 단핵구 유래 가지 세포와 부착성 단핵구 둘다에서 IL-12p40, IL-12p70 및 IL-8 생산을 증가시켰다. LPS의 존재는 또한 IL-12p40 및 IL-12p70의 생산을 증가시켰다. 아이소타입 조절 항체, 항-KLH로 항온처리된 가지 세포의 상등액에서는 단지 최소량의 사이토카인이 검출되었다. 대표적인 결과는 표 28과 도 3 및 4에서 나타난다. 표 28은 본 발명의 항-CD40 항체(21.4.1) 1㎍/ml +/- 100 ng/ml LPS에 의해 가지 세포 또는 부착 단핵구에 의해 생산된 주요 사이토카인을 요약한다. 도 3에서 나타나는 것처럼, 항-CD40 항체는 인간 가지 세포에 의한 IL-12p40 생산을 증가시켰다. 도 4는 항체와 100 ng/ml LPS의 존재하에서 인간 가지 세포에 의한 IL-12p70 생산 증가를 보여준다.
[표 28]
본 발명의 항-CD40 항체에 의한 IL-12p40, IL-12p70 및 IL-8 분비의 증가
본 발명의 항-CD40 항체 다수를 이용하여 유사한 실험을 실시하였다. 단핵구 유래 가지 세포를 상기한 대로 제조하고 다양한 농도의 항-CD40 항체의 존재하에서 배양하고, 100 ng/ml LPS(Sigma)로 동시자극하였다. 상등액내의 IL-12p70을 ELISA(R & D Systems)에 의해 24시간째에 측정하고 각 항체에 대하여 EC50을 측정하였다. 실험의 결과는 표 29에 나타난다.
[표 29]
가지 세포에서 IL-12p70 분비의 증가
본 발명의 항-CD40 항체가 알로겐성 T 세포/가지 세포 분석에서 T 세포로부터의 IFN-감마 분비를 증가시키는 능력을 시험하였다. 이 분석을 실시하기 위하여, T 세포와 단핵구를 건강한 지원자의 말초 혈액으로부터 분리하였다. 단핵구는 상기한 방법을 이용하여 가지 세포로 분화시켰다. 개인으로부터 얻은 1 X 105 T 세포를 다른 개인으로부터 얻은 1 X 105 가지 세포와 함께 본 발명의 항-CD40 항체 또는 대조 항체의 존재하에서 배양하였다. 4일 배양 후, ELISA에 의해 IFN-감마 분비에 대하여 상등액을 분석하였다. 이 분석의 결과는 표 30에 나타난다.
[표 30]
본 발명의 항-CD40 항체에 의한 IFN-감마 분비의 증가
실시예 IX
본 발명의 항-CD40 항체에 의한 염증성 사이토카인의 유도
1, 10 및 100 ㎍/ml 농도의 항체에 의해 염증성 사이토카인이 유도되는지를 결정하기 위하여, Wing et al., Therapeutic. Immunol. 2: 183-90 (1995)에 의해 개시된 전혈 사이토카인 방출 분석에서 항체 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1 및 3.1.1을 시험하였다.10명의 정상 공여자로부터의 혈액에서 표시된 농도에서 이들 항체로 TNF-α, IL-lβ, IFN-γ, 또는 IL-6의 상당한 방출은 관찰되지 않았다.
실시예 X
항-CD40 항체의 의한 세포주 Jy의 면역원성 증가
CD40 양성 JIYOYE 세포 (ATCC CCL87) ("Jy 세포")를 RPMI 배지에서 배양하고 유지하였다. JIYOYE 세포를 본 발명의 항-CD40 항체(21.4.1)와 함께, 또는 아이소타입 매치된 항체(항-KLH)와 함께 완전한 RPMI 배지에서 24시간동안 항온처리하였다. 이어서 세포를 세척하고 25mg 미토마이신 C (Sigma)/7 ml 배지로 60분동안 처리하였다. 이어서 이들 세포를 분리된 인간 T 세포와 1:100 비율로 37℃(5% CO2)에서 6일간 항온처리하였다. 이어서 T 세포를 수집하고, 세척하고, 신선한 크롬 51 ((New England Nuclear, Boston, MA) 표지된 JIYOYE 세포에 대해 CTL 활성의 정도를 측정하였다. 비(specific) CTL 활성을 % 비 세포용해 = (세포용해 Jy (cpm) - 자발성 세포 용해(cpm))/ (총 세포용해 (cpm) - 자발성 세포 용해(cpm))로서 계산하였다.
도 5가 예시하는 바와 같이, 본 발명의 항-CD40 항체 (21.4.1)은 이 항체로 처리된 Jy 세포에 대한 면역원성을 크게 증가시켰다.
실시예 XI
동물 종양 모델
본 발명에 따라 만들어진 항-CD40 항체의 항-종양 활성을 더 조사하기 위하여, SCID-베이지 마우스 모델을 디자인하여 종양 성장에 대한 항체의 생체내 효과를 시험하였다.
찰스 강으로부터 SCID-베이지 마우스를 얻어 사용하기 1주일 전에 순응시켰다. 종양 세포(Daudi 세포 (ATCC CCL 213), CD40 (-) K562 세포 (ATCC CCL 243) 및 CD40 (+) Raji 세포 (ATCC CCL 86), BT474 유방암 세포 (ATCC HTB 20) 또는 PC-3 전립선 세포 (ATCC CRL 1435))를 1 x 107 세포/동물 농도로 피하 주사하였다. 일부 경우에, 종양 세포와 함께 동일한 인간 공여자로부터의 T 세포 (5 X 105) 및 가지 세포(1 X 105)를 주사하였다. 또한 본 발명의 항-CD40 항체, 또는 아이소타입 매치된 대조군(항-KLH)을 종양 주사 바로 전에 복강내 주사하였다(단 한번 주사). 이어서 종양 성장을 측정하였다. 구체적 실험은 하기에 개시한다.
한 실험에서, 본 발명의 항-CD40 항체, 또는 아이소타입 매치된 대조군(항-KLH)를 종양 주사 직전에 10 mg/kg 투여량으로 복강내 주사하였다. 종양 세포(Daudi 세포)를 1 x 107 세포/동물 농도로 피하 주사하였다. 인간 T 세포와 가지 세포의 존재하에 이식 후 17, 19, 20,21, 25, 26,27 및 28 일째에 캘리퍼스로 종양 성장을 측정하였다. 도 6에 나타난 바처럼, 항-CD40 항체는 약 60% 만큼 종양 성장을 억제하였다.
다른 실험에서는, 본 발명의 항-CD40 항체(21.4.1), 또는 아이소타입 매치된 대조군(항-KLH)를 종양 주사 직전에 0.1 mg/kg, 1 mg/kg, 또는 10 mg/kg 투여량으로 복강내 주사하였다(단 한번 주사). 종양 세포(K562 세포)를 1 x 107 세포/동물 농도로 피하 주사하였다. 이 실험에서는 종양 세포와 함께 동일한 인간 공여자로부터의 T 세포 (5 X 105) 및 가지 세포(1 X 105)를 주사하였다. 이식 후 17, 19, 20, 21, 25, 26, 27 및 28 일째에 캘리퍼스로 종양 성장을 측정하였다. 도 7에 나타난 바처럼, 항-CD40 항체는 약 60-85% 만큼 종양 성장을 억제하였다.
다른 실험에서는, 본 발명의 항-CD40 항체(21.4.1, 23.29.1 또는 3.1.1), 또는 아이소타입 매치된 대조군(항-KLH)를 종양 주사 직전에 복강내 주사하였다(단 한번 주사). 아이소타입 매치된 대조군 항체와 항체 21.4.1을 1 mg/ml의 투여량으로 주사하였다.1, 0.1, 0.01, 0.001 또는 0.0001 mg/kg의 투여량으로 항체 23.29.1 및 3.1.1을 주사하였다. 종양 세포(K562 세포)를 1 x 107 세포/동물 농도로 피하 주사하였다. 이 실험에서는 종양 세포와 함께 동일한 인간 공여자로부터의 T 세포 (5 X 105) 및 가지 세포(1 X 105)를 주사하였다. 이식 후 28 일째에 캘리퍼스로 종양 성장을 측정하였다. 이 실험의 결과는 도 8 및 9에 나타난다. 도면의 각 점은 개별 동물로부터의 측정을 나타낸다.
다른 실험에서는, 본 발명의 항-CD40 항체(21.4.1), 또는 아이소타입 매치된 대조군(항-KLH)를 종양 주사 직전에 복강내 주사하였다(단 한번 주사).1, 0.1, 0.01, 0.001 또는 0.0001 mg/kg의 투여량으로 항체를 주사하였다. 종양 세포(Raji 세포)를 1 x 107 세포/동물 농도로 피하 주사하였다. 일부 동물에서는, 종양 세포와 함께 동일한 인간 공여자로부터의 T 세포 (5 X 105) 및 가지 세포(1 X 105)를 주사하였다. 이식 후 28 일째에 캘리퍼스로 종양 성장을 측정하였다. 이 실험의 결과는 도 10에 나타난다. 도면의 각 점은 개별 동물로부터의 측정을 나타낸다.
다른 실험에서는, 본 발명의 항-CD40 항체(21.4.1, 23.28.1, 3.1.1 또는 23.5.1), 또는 아이소타입 매치된 대조군(항-KLH)를 종양 주사 직전에 복강내 주사하였다(단 한번 주사). 항체를 1 또는 0.1 mg/kg의 투여량으로 주사하였다. 종양 세포(Raji 세포)를 1 x 107 세포/동물 농도로 피하 주사하였다. 이식 후 28 일째에 캘리퍼스로 종양 성장을 측정하였다. 이 실험의 결과는 도 11에 나타난다. 도면의 각 점은 개별 동물로부터의 측정을 나타낸다.
다른 실험에서는, 본 발명의 항-CD40 항체(21.4.1, 23.29.1, 또는 3.1.1), 또는 아이소타입 매치된 대조군(항-KLH)를 종양 주사 직전에 복강내 주사하였다(단 한번 주사). 항체를 1 mg/kg의 투여량으로 주사하였다. 종양 세포(BT474 유방암 세포)를 1 x 107 세포/동물 농도로 피하 주사하였다. 종양 세포와 함께 동일한 인간 공여자로부터의 T 세포 (5 X 105) 및 가지 세포(1 X 105)를 주사하였다. 이식 후 39 일째에 캘리퍼스로 종양 성장을 측정하였다. 도 12에 나타난 바처럼, 모든 항체가 유방암 종양 성장을 억제하였다. 도면의 각 점은 개별 동물로부터의 측정을 나타낸다.
다른 실험에서는, 본 발명의 항-CD40 항체(3.1.1), 또는 아이소타입 매치된 대조군(항-KLH)를 종양 주사 직전에 복강내 주사하였다(단 한번 주사). 항체를 1 mg/kg의 투여량으로 주사하였다. 종양 세포(PC-3 전립선 종양 세포)를 1 x 107 세포/동물 농도로 피하 주사하였다. 이식 후 41 일째에 캘리퍼스로 종양 성장을 측정하였다. 도 13에 나타난 바처럼, 항-CD40 항체는 전립선 종양 성장을 약 60% 억제하였다. 도면의 각 점은 개별 동물로부터의 측정을 나타낸다.
실시예 XII
Daudi 종양 세포가 주사되고 본 발명의 항-CD40 항체로 처리된 SCID-베이지 마우스의 생존
다른 실험에서, 본 발명의 항-CD40 항체, 또는 아이소타입 매치된(단일 주사) 대조군을 종양 주사 직전에 복강내 주사하였다. 항체를 1 또는 0.1 mg/kg의 투여량으로 주사하였다. 종양 세포(Daudi 세포)를 5 x 106 세포/동물 투여량으로 정맥내 주사하였다. 이어서 동물 생존을 모니터하였다. 도 14에서 나타나는 대로, 시험된 항-CD40 항체는 모두 종양 주입된 마우스의 생존을 적어도 6일 연장시켰다.
표 31은 실시예 XI에서 개시된 다른 고형 종양 모델들에서 항-CD40 항체의 ED50를 열거한다. 표 31은 SCID 마우스에서 본 발명의 항-CD40 항체의 일부의 생체내 항-종양 활성을 요약한다. 또한, 이 표는 실시예 XII에서 전술한 Daudi 전신성 종양 모델에서 항-CD40 항체의 ED50을 열거한다.
[표 31]
SCID 마우스에서 다른 생체내 종양 모델을 이용한 본 발명의 항-CD40 항체의 ED 50
ND = 실시 안함
실시예 XIII
BIA코어에 의한 완전한 인간 항-CD40 항체의 친화성 상수(K D )의 결정
제조자의 프로토콜에 따라 BIA코어 3000 기구를 이용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 정제된 항체의 친화성 측정을 실시하였다.
바이오센서 생특이적 상호작용 분석 기구(BIA코어)는 표면 플라스몬 공명을 이용하여 CM5 센서 칩상의 분자 상호작용을 측정한다. 센서 칩의 덱스트란 측에 대한 분자들의 상호작용에 의해 야기된, 두 매질, 유리와 카르복시메틸화된 덱스트란간의 굴절 지수의 변화를 측정하고 제조자의 적용 노트에 개시된 대로 임의의 반사율 단위(RU)의 변화로 보고한다.
센서 칩상의 유동 세포의 카르복시메틸화된 덱스트란 표면을, 0.2 M N-에틸-N'-(디메틸아미노프로필)카르보디이미드에 의해 매개되는 0.05 M N-하이드록시숙신이미드를 이용한 유도체화에 의해 7분간 활성화시켰다. pH 3.5의 10 mM Na 아세테이트중의, 5㎍/ml 농도의 CD40-Ig 융합 단백질(실시예 I에 개시됨)을 5 ㎕/분의 속도로 유동 세포내로 수동으로 주사하고, 원하는 양의 RU로 유동 세포 표면에 공유적으로 고정시켰다. 1 M 에탄올아민 하이드로클로라이드(pH 8.5)를 이용하여 비반응 N-하이드록시숙신이미드 에스테르의 탈활성화를 실시하였다. 고정화에 이어, 안정한 기준선이 얻어질 때까지 50 mM NaOH 5㎕를 다섯번 재생 주사하여 유동 세포로부터 미반응 또는 약하게 결합된 물질을 제거한다. 유동 세포 2, 고밀도 표면은 표면 제조 후 약 300 RU로 측정되었고, 유동 세포 3, 저밀도 표면은 약 150 RU를 측정하였다. 유동 세포 1, 활성화된 블랭크 표면의 경우, 10 mM Na 아세테이트 완충액 35㎕를 고정화동안 항원 대신 주사하였다. 유동 세포 4는 무관한 항원 대조군인 고정화된 CTLA4-Ig 약 450 RU를 함유하였다.
각 항체의 희석 시리즈를 100 ㎍/ml 내지 0.1 ㎍/ml의 농도 범위로 1/2 로그로 준비하였다. 유속은 5㎕/분이고 각 농도점 샘플 25㎕를, 주사된 항체 각 농도 사이에서 50 mM NaOH 5㎕를 재생 주사하면서 센서 칩상에 주사하였다. BIA 평가 3.0 소프트웨어를 이용하여 데이터를 분석하였다.
역방향 동적 실험에서, 항체 21.4.1을 전술한 프로토콜을 이용하여 센서칩 표면에 고정화시켰다. 항-KLH를 대조군 항체 표면으로 이용하였다. 항원, CD40-Ig 융합 단백질을 100 ㎍/ml 내지 0.1 ㎍/ml의 농도 범위로 주사하였다.
표 32는 본 발명의 대표적인 항-CD40 항체를 위한 친화성 측정을 나열한다:
[표 32]
본 발명의 항-CD40 항체를 위한 친화성 측정
실시예 XIV
항-CD40 항체의 에피토프 맵핑
단백질 A 정제된 CD40-인간 IgG1 Fc 융합 항원을 이용하여 결합 분석을 실시하였다. 인간 CD40-IgG1 Fc 융합 단백질을 화이자(Pfizer)에 클로닝하였다. 인간 CD40 IgG1 융합 단백질을 포유류 세포주에서 발현시키고 단백질 A 컬럼에서 정제하였다. 융합 항원의 순도를 SDS/PAGE로 평가하였다.
CD40은 전형적인 타입 I 경막 단백질의 구조를 갖는다. 성숙 분자는 277 아미노산으로 이루어진다. CD40의 세포외 도메인은 네 개의 TNFR-유사 시스테인 풍부 도메인으로 이루어진다. 예를 들어, Neismith and Sprang,TIBS 23 : 74-79 (1998); van Kooten and Banchereau, J. LeukocyteBiol. 67: 2-17 (2000); Stamenkovic et al.,EMBO J. 8: 1403-1410 (1989)을 참고한다.
환원된 인간 CD40 및 비환원 인간 CD40에의 항-CD40 항체의 결합
CD40의 세포외 도메인이 네 개의 시스테인 풍부 도메인으로 이루어지므로, 환원제에 의한 분자내 결합의 파괴는 항체 반응성을 변화시킬 수 있다. 환원제에 의한 분자내 결합의 파괴가 본 발명의 선택된 항-CD40 항체의 반응성을 변화시키는지 여부를 결정하기 위하여, 정제된 CD40-hIgG를 비환원(NR), 또는 환원(R) 조건하에서 SDS/PAGE(4-20% 젤)에 로딩하였다. 미니젤 시스템을 이용하여 램리(Laemmli)의 방법에 의해 SDS/PAGE를 실시하였다. 분리된 단백질을 니트로셀룰로스 막에 옮겼다. 5%(w/v) 탈지 건조 분유를 함유하는 PBS를 이용하여, 현상 전에 적어도 1시간동안 막을 차단시키고, 각 항체로 1시간동안 탐침하였다. HRP-접합된 염소 항-인간 면역글로불린(1:8,000 희석;Catalog No. A-8667 from Sigma)을 이용하여 항-CD40 항체를 검출하였다. 제조자의 지시에 따라 증가된 화학발광(ECL??; Amersham Bioscience)을 이용하여 막을 현상하였다.
이어서 본 발명의 네 개의 항-CD40 항체 21.4.1,23.25.1, 23.29.1 및 24.2.1(㎍/ml), 및 이어서 HRP 접합된 염소 항-인간 IgG(1:8000 희석)로 웨스턴 블롯을 탐침하였다. 이 실험의 결과는 도 15에 나타난다. 이 결과는 항체 21.4.1,23. 25.1, 23.29.1 및 24.2.1이 비환원된 CD40에 결합하지만 환원된 CD40에는 결합하지 않으며, 따라서 이 항체는 형태적 에피토프를 인식함을 나타낸다.
인간 CD40 도메인 결실된 단백질에의 항-CD40 항체의 결합:
CD40의 세포외 영역은 네 개의 TNFR-유사 반복 도메인(D1-D4로 불림)을 포함한다. 예를 들어 Neismith and Sprang, TIBS 23: 74-79 (1998); van Kooten and Banchereau, J. Leukocyte Biol. 67: 2-17 (2000); Stamenkovic et al., EMBO J. 8 : 1403-1410 (1989)를 참고한다. 도 16은 마우스 및 인간 CD40 도메인 D1-D4의 아미노산 서열을 보여준다. 에피토프의 제시에서 CD40 분자의 상이한 영역들의 기여를 조사하기 위하여, 도메인이 결실된 많은 돌연변이를 구성하였다.
인간 CD40 결실 구조체를 만들기 위하여, 인간 CD40의 전체 세포외 도메인(아미노산 1-193)을, 서열 특이적 프라이머를 이용하는 PCR에 의해 인간 B 세포(CD 19+) cDNA(다 조직 cDNA 패널, Catalog No.K1428-1, from Clontech)로부터 증폭시키고, C-말단에 6XHis-태그를 부가하였다. 인간 CD40 5' 프라이머 5'-GCAAGCTTCACCAATGGTTCGTCTGCCTCTGCAGTG-3' (서열 번호:135)를 전길이 및 절단된 CD40 분자의 클로닝을 위한 3' 프라이머들의 다른 조합과 이용하였다. 인간 CD40의 전길이 세포외 도메인을 클로닝하기 위한 3' 프라이머는 5'-TCAGTGATGGTGATGGTGATGTCTCAGCCGAT CCTGGGGACCA-3' (서열 번호: 136)이었다. 인간 CD40의 D1-D3 도메인을 클로닝하기 위해 이용되는 3' 프라이머는 5'-TCAGTGATGGTGATGGTGATGTGGGCA GGGCTCGCGATGGTAT-3' (서열 번호:137)이었다. CD40의 D1-D2 도메인을 클로닝하기 위해 이용되는 3' 프라이머는 5'-TCAGTGATGGTGATGGTGATGA CAGGTGCAGATGGTGTCTGTT-3' (서열 번호:138)이었다. 절단된 CD40 cDNA의 이들 구조체를 생성한 후, pCR3.1 벡터(Invitrogen)를 이용하여 이들을 293F 세포주에서 발현시켰다. CD40-6XHis 융합 단백질을 니켈 컬럼으로부터 용출시켜 정제하였다.
이들 네 개의 결실 돌연변이의 아미노산 서열이 표 33에 나타난다.
[표 33]
CD40 His-태그 융합 단백질
이들 인간 CD40 결실 구조체를 발현시키기 위하여, 구조체를 pCR3.1 벡터(Invitrogen)에 클로닝하고 다양한 안정하고 일시적으로 형질감염된 293F 세포주에서 발현을 평가하였다. 일시적으로 형질감염된 293F 세포로부터의 상등액을 ELISA 및 웨스턴 블롯에 의해 항체 21.4.1, 23.25.1, 23.29.1 및 24.2.1에 대한 결합에 대해 분석하였다.
ELISA 분석은 다른 CD40 구조체들로 형질감염된 293F 세포로부터의 상등액을 이용하여 실시하였다. ELISA 플레이트를, ELISA 플레이트 피복 완충액에 1㎍/ml으로 희석된 염소 항-인간 CD40 폴리클로날 항체(R & D catalog No. AF 632) 또는 염소 항-마우스 CD40 폴리클로날 항체(R & D catalog No. AF 440)로 피복하였다. 293F 세포에서 CD40 구조체의 발현은 비오티닐화된 염소 항-인간 CD40 (R & D catalog No. BAF 632), 염소 항-마우스 CD40 (R & D catalog No. BAF 440), 또는 HRP-접합된 항-His (C 말단) 항체 (Invitrogen, Catalog No. 46-0707)로 검출하여 확인하였다. 항-CD40 인간 항체의 결합을 1:2000으로 희석된 HRP 접합된 염소 항-인간 IgG(FC 특이적 Caltag H10507)로 검출하였다. 표 34에서 나타나는 대로, 그 결과는, mAbs 21.4.1, 23.28.1 및 23.29.1에 의해 인식되는 에피토프(모두가 아니라면 대부분)가 CD40의 D1-D2 영역에 위치하며 mAb 24.2.1을 위한 에피토프는 도메인 D3-D4내에 적어도 부분적으로 위치함을 나타낸다. 인간 CD40-토끼 Fc 융합 단백질을 대조군으로 이용하여 항체 결합의 특이성을 확인하였다.
[표 34]
ELISA: CD40 결실 돌연변이에의 항체 결합
CD40 결실 구조체를 또한 웨스턴 블롯 분석에 의해 분석하였다. 그 결과는 표 35에 나타난다. ELISA 결과는 항체 21.4.1, 23.25.1, 23.29.1 및 24.2.1의 결합 부위가 도메인 D1-D3에 관련됨을 보여준다. 이 결과는 또한 항체 21.4.1, 23.25.1 및 23.29.1을 위한 결합 부위가 도메인 D1-D2 에 관련하며, 항체 24.2.1의 결합 부위가 도메인 D3에 관련됨을 보여준다.
[표 35]
웨스턴 블롯 : CD40 결실 돌연변이에의 항체 결합
마우스 CD40에의 항-CD40 항체의 결합
항체 21.4.1,23. 25.1, 23.29.1 및 24.2.1이 마우스 CD40에 결합하는 능력을 결정하였다.
이 실험을 위하여, 마우스 CD40을 마우스 B 세포 cDNA로부터 증폭시켰다. 마우스 CD40(D1-D3)-6xHis 융합 단백질을, 전사를 유도하기 위하여 CMV 프로모터를 이용하는 pCR3.1내로 클로닝하였다. 마우스 CD40의 세포외 도메인을 클로닝하기 위해 이용되는 5' 프라이머는 5'-TGCAAGCTTCACCATGGTGTCTTTGCCTCGGCTGTG-3'였다. 마우스 CD40의 D1-D3 도메인을 클로닝하기 위해 이용되는 3' 프라이머는 5'- GTCCTCGAGTCAGTGATGGTGATGGTGATGTGGGCAGGGATGACAGAC-3' 였다. 마우스와 인간 cDNA 구조체를 293F 세포내로 일시적으로 형질감염시켰다. 재조합 CD40의 발현은 마우스 및 인간 CD40에 대한 폴리클로날 항체, 항-His 항체, 및 항-CD40 항체 21.4.1,23. 25.1, 23.29.1 및 24.2.1을 이용하여 ELISA에 의해 검출하였다. 이들 실험의 결과를 표 36에 나타낸다. 이 실험은 모든 항체가 인간 CD40에 특이적이며 마우스 CD40과 교차반응하지 않음을 보여준다.
[표 36]
마우스와 인간 CD40의 교차반응성
인간/마우스 키메라 CD40에의 항-CD40 항체의 결합
항체 21.4.1,23. 25.1, 23.29.1 및 24.2.1가 마우스 CD40에 결합하지 않으므로, 이들 항체의 에피토프를 더욱 한정적으로 맵핑하기 위해 인간/마우스 키메라 CD40 단백질을 구성하였다.
인간 및 쥐과 CD40 키메라 단백질의 인프레임 융합의 구성을 위하여, 인간 및 마우스 CD40의 cDNA내의 동일한 위치에서 CD40 도메인의 경계에서 독특한 제한 부위를 이용하였다. CD40의 다양한 cDNA 구조체를, 도메인 1의 말단의 EcoRI 제한 부위(뉴클레오티드 244, 아미노산 64)와 도메인 2의 말단의 BanI 제한 부위(뉴클레오티드 330, 아미노산 94)를 이용하여 생성하였다.(도 17).
PCR에 의해 다양한 CD40 도메인을 증폭시키고 연결시켰다. 이 접근법은 마우스 CD40의 다양한 도메인을 인간 CD40으로부터의 상동성 도메인에 의해 치환할 수 있도록 하였다. 얻어진 구조체가 도 18에 나타난다.
이어서 항체 21.4.1,23. 25.1, 23.29.1 및 24.2.1가 마우스/인간 키메라 CD40 단백질에 결합할 수 있는 지를 ELISA로 결정하였다. 이 실험의 결과가 표 37에 나타난다. 표 37에 나타난 바처럼, mAbs 21.4.1 와 23.25.1은 부분적으로 D1에 그리고 부분적으로 D2에 위치한 에피토프를 인식하며; mAb 23.29.1은 완전히가 아니라면 대부분이 D2에 위치한 에피토프를 인식하며; mAb 24.2.1 은 D2와 D3에 위치한 에피토프를 인식한다.
[표 37]
키메라 CD40 단백질에의 항체 결합
본 명세서에서 인용된 모든 문헌과 특허 출원은 각 개별 문헌 또는 특허 출원이 구체적으로 그리고 개별적으로 본원에 참고로 인용되는 것으로 표시된 것처럼 본원에 참고로 인용된다. 전술한 발명이 명확한 이해를 위해 예시와 실시예에 의해 일부 상세하게 개시되었지만, 당업자는 본 발명의 개시에 비추어 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 변화 또는 변형이 가능함을 이해할 것이다.
<110> ABGENIX, INC. 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gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60 atctcctgca ggtctagtca gagcctccta catactaatg gatacaacta tttcgattgg 120 tacctgcaga agccagggca gtctccacaa ctcctgatct atttgggttc taatcgggcc 180 tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaagctct acaaactccg 300 tacagttttg gccaggggac caagctggag atcaaa 336 <210> 28 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Thr 20 25 30 Asn Gly Tyr Asn Tyr Phe Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95 Leu Gln Thr Pro Tyr Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 29 <211> 1401 <212> DNA 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ggtcacgtgc 840 gtggtggtgg acgtgagtca cgaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggacggc 900 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagcca cgggaggagc agttcaacag cacgttccgt 960 gtggtcagcg tcctcaccgt tgtgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 1020 aaggtctcca acaaaggcct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggg 1080 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 1140 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1200 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacac ctcccatgct ggactccgac 1260 ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1320 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1380 tccctgtctc cgggtaaatg a 1401 <210> 30 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys 20 25 30 Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile 35 40 45 Arg Ser Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln 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sapiens <400> 31 atgaggctcc ctgctcagct cctggggctg ctaatgctct gggtctctgg atccagtggg 60 gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 120 atctcctgca ggtctagtca gagcctccta catactaatg gatacaacta tttcgattgg 180 tacctgcaga agccagggca gtctccacaa ctcctgatct atttgggttc taatcgggcc 240 tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 300 agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaagctct acaaactccg 360 tacagttttg gccaggggac caagctggag atcaaacgaa ctgtggctgc accatctgtc 420 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 480 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 540 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 600 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 660 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag 720 720 <210> 32 <211> 239 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Ser 1 5 10 15 Gly Ser 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aacaccaagg tggacaagac agttgagcgc 720 aaatgttgtg tcgagtgccc accgtgccca gcaccacctg tggcaggacc gtcagtcttc 780 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc 840 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggacggc 900 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagcca cgggaggagc agttcaacag cacgttccgt 960 gtggtcagcg tcctcaccgt tgtgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 1020 aaggtctcca acaaaggcct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggg 1080 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 1140 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1200 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacac ctcccatgct ggactccgac 1260 ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1320 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1380 tccctgtctc cgggtaaatg a 1401 <210> 70 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln 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ctactactac aacggtctgg acgtctgggg ccaagggacc 360 acggtcaccg tctcctca 378 <210> 90 <211> 126 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 90 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Lys Asp Gly Gly Asn Lys Tyr His Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Arg Gly His Gln Leu Val Leu Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Asn Gly 100 105 110 Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 91 <211> 378 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 91 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agttatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcaaagg atggaggtaa taaataccat 180 gcagactccg 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 122 tatctaagct tctagactcg agcgccacca tgaaacacct gtggttcttc c 51 <210> 123 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 123 tatctaagct tctagactcg agcgccacca tgaaacatct gtggttcttc c 51 <210> 124 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 124 tatctaagct tctagactcg agcgccacca tggactggac ctggaggatc c 51 <210> 125 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 125 ttctctgatc agaattccta tcatttaccc ggagacaggg agag 44 <210> 126 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 126 cttcaagctt acccgggcca ccatgaggct ccctgctcag c 41 <210> 127 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 127 ttctttgatc agaattctca ctaacactct cccctgttga agc 43 <210> 128 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 128 tatctaagct tctagactcg accgccacca tggagtttgg gctgagctg 49 <210> 129 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 129 tatctaagct tctagactcg accgccacca tggagtttgg gctgagctg 49 <210> 130 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 130 tatctaagct tctagactcg accgccacca tggagtttgg gctgagctg 49 <210> 131 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 131 tatctaagct tctagactcg agcgccacca tgaaacatct gtggttcttc c 51 <210> 132 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 132 tatctaagct tctagactcg accgccacca tggagtttgg gctgagctg 49 <210> 133 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 133 tatctaagct tctagactcg agcgccacca tgaaacatct gtggttcttc c 51 <210> 134 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 134 tcttcaagct tgcccgggcc cgccaccatg gaaaccccag cgcag 45 <210> 135 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 135 gcaagcttca ccaatggttc gtctgcctct gcagtg 36 <210> 136 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 136 tcagtgatgg tgatggtgat gtctcagccg atcctgggga cca 43 <210> 137 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 137 tcagtgatgg tgatggtgat gtgggcaggg ctcgcgatgg tat 43 <210> 138 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 138 tcagtgatgg tgatggtgat gacaggtgca gatggtgtct gtt 43 <210> 139 <211> 197 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 139 Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr 1 5 10 15 Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu 20 25 30 Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val 35 40 45 Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu 50 55 60 Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His 65 70 75 80 Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr 85 90 95 Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr 100 105 110 Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly 115 120 125 Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu 130 135 140 Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys 145 150 155 160 Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln 165 170 175 Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg His 180 185 190 His His His His His 195 <210> 140 <211> 153 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 140 Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr 1 5 10 15 Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu 20 25 30 Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val 35 40 45 Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu 50 55 60 Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His 65 70 75 80 Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr 85 90 95 Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr 100 105 110 Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly 115 120 125 Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu 130 135 140 Pro Cys Pro His His His His His His 145 150 <210> 141 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 141 Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr 1 5 10 15 Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu 20 25 30 Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val 35 40 45 Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu 50 55 60 Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His 65 70 75 80 Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr 85 90 95 Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys His His His His His His 100 105 110 <210> 142 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 142 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Tyr Gly Asp Tyr Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 143 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Linker peptide <400> 143 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 144 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 144 tttttttttt tttttttt 18 <210> 145 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 6-His tag <400> 145 His His His His His His 1 5 <210> 146 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 146 tgcaagcttc accatggtgt ctttgcctcg gctgtg 36 <210> 147 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 147 gtcctcgagt cagtgatggt gatggtgatg tgggcaggga tgacagac 48

Claims (31)

  1. 인간 CD40에 특이적으로 결합하여 이를 활성화시키는 키메라 또는 인간 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분으로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 부분은
    a) 중쇄 가변부 유래의 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 또는
    b) 경쇄 가변부 유래의 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고,
    상기 중쇄 CDR1 및 중쇄 CDR2의 아미노산 서열은 각각 독립적으로 중쇄 가변부의 CDR1 및 CDR2로부터 선택되고, 상기 중쇄 가변부의 서열은 생식세포 VH 3-30+, 4-59, 1-02, 4.35 또는 3-30.3 유전자가 암호화하는 아미노산 서열 유래의 18개 이하의 아미노산 변화를 포함하며,
    상기 중쇄 CDR3의 아미노산 서열은 중쇄 가변부의 CDR3으로부터 유래한 것이고, 상기 중쇄 가변부는
    i) 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.29.1 및 24.2.1로 구성된 군에서 선택된 항체의 중쇄 가변부;
    ii) 서열 번호 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74 및 82로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부, 또는 서열 번호 90, 92, 96 및 98로 구성된 군에서 선택된 중쇄 아미노산 서열 유래의 아미노산 서열 또는 시그날 서열이 결여된 상기 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부; 및
    iii) 서열 번호 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73 및 81로 구성된 군에서 선택되는 핵산 서열이 암호화하는 중쇄 가변부, 또는 서열 번호 89, 91, 95 및 97로 구성된 군에서 선택된 중쇄 핵산 서열이 암호화하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부, 또는 시그날 서열이 결여되어 있는 상기 암호화된 중쇄 가변부
    로 구성된 군에서 선택되고,
    상기 중쇄 CDR3의 아미노산 서열은 최대 2개의 보존적 아미노산 치환 및/또는 2개의 비보존적 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있으며;
    상기 경쇄 CDR1 및 경쇄 CDR3의 아미노산 서열은 각각 독립적으로 경쇄 가변부의 CDR1 및 CDR3으로부터 선택되고, 경쇄 가변부는 생식세포 VκA3/A19, L5 또는 A27 유전자가 암호화하는 아미노산 서열 유래의 10개 이하의 아미노산 변화를 포함하며,
    상기 경쇄 CDR2의 아미노산 서열은 경쇄 가변부로부터 유래한 것이고, 경쇄 가변부는
    i) 3.1.1, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.29.1 및 24.2.1로 구성된 군에서 선택된 항체의 경쇄 가변부;
    ii) 서열 번호 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76 및 84로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부, 또는 서열 번호 94 및 100으로 구성된 군에서 선택된 경쇄 아미노산 서열 유래의 아미노산 서열 또는 시그날 서열이 결여된 상기 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부; 및
    iii) 서열 번호 3, 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75 및 83으로 구성된 군에서 선택되는 핵산 서열이 암호화하는 경쇄 가변부, 또는 서열 번호 93 및 99로 구성된 군에서 선택된 경쇄 핵산 서열이 암호화하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부, 또는 시그날 서열이 결여되어 있는 상기 암호화된 경쇄 가변부
    로 구성된 군에서 선택되고,
    상기 경쇄 CDR2의 아미노산 서열은 최대 2개의 보존적 아미노산 치환 및/또는 2개의 비보존적 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있는 것인 키메라 또는 인간 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  2. 제1항에 있어서,
    (a) 상기 중쇄 CDR1 및 상기 중쇄 CDR2의 아미노산 서열은 각각 최대 4개의 보존적 아미노산 치환과 생식세포 VH 3-30+, 4-59, 1-02, 4.35 또는 3-30.3 유전자가 암호화하는 아미노산 서열 유래의 2개의 비보존적 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함하거나; 또는
    (b) 상기 경쇄 CDR1 및 상기 경쇄 CDR3의 아미노산 서열은 각각 최대 3개의 보존적 아미노산 치환과 생식세포 Vκ A3/A19, L5 또는 A27 유전자 유래의 2개의 비보존적 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  3. 제1항에 있어서,
    (a) 상기 중쇄 CDR1 및 중쇄 CDR2의 아미노산 서열은 각각 독립적으로 중쇄 가변부의 CDR1 및 CDR2로부터 선택되고, 상기 중쇄 가변부는
    i) 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.29.1 및 24.2.1로 구성된 군에서 선택된 항체의 중쇄 가변부;
    ii) 서열 번호 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 및 98로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열 또는 시그날 서열이 결여된 상기 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부; 및
    iii) 서열 번호 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 91, 95 및 97로 구성된 군에서 선택된 핵산 서열이 암호화하는 중쇄 가변부 또는 시그날 서열이 결여되어 있는 상기 암호화된 중쇄 가변부
    로 구성된 군에서 선택되고,
    상기 중쇄 CDR1 및 중쇄 CDR2의 아미노산 서열은 각각 최대 2개의 보존적 아미노산 치환 및/또는 2개의 비보존적 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있거나; 또는
    (b) 상기 경쇄 CDR1 및 경쇄 CDR3의 아미노산 서열은 각각 독립적으로 경쇄 가변부의 CDR1 및 CDR3으로부터 선택되고, 상기 경쇄 가변부는
    i) 3.1.1, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.29.1 및 24.2.1로 구성된 군에서 선택된 항체의 경쇄 가변부;
    ii) 서열 번호 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94 및 100으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열 또는 시그날 서열이 결여된 상기 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부; 및
    iii) 서열 번호 3, 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 93 및 99로 구성된 군에서 선택되는 핵산 서열이 암호화하는 경쇄 가변부 또는 시그날 서열이 결여되어 있는 상기 암호화된 경쇄 가변부
    로 구성된 군에서 선택되고,
    상기 경쇄 CDR1 및 경쇄 CDR3의 아미노산 서열은 각각 최대 2개의 보존적 아미노산 치환 및/또는 2개의 비보존적 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  4. 제3항에 있어서,
    (a) 상기 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3의 아미노산 서열은 각각 독립적으로 중쇄 가변부로부터 선택되고, 상기 중쇄 가변부는
    i) 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.29.1 및 24.2.1로 구성된 군에서 선택된 항체의 중쇄 가변부;
    ii) 서열 번호 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 및 98로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열 또는 시그날 서열이 결여된 상기 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부; 및
    iii) 서열 번호 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 91, 95 및 97로 구성된 군에서 선택된 핵산 서열이 암호화하는 중쇄 가변부 또는 시그날 서열이 결여되어 있는 상기 암호화된 중쇄 가변부
    로 구성된 군에서 선택되거나; 또는
    (b) 상기 경쇄 CDR1 및 경쇄 CDR3의 아미노산 서열은 각각 독립적으로 경쇄 가변부의 CDR1 및 CDR3으로부터 선택되고, 상기 경쇄 가변부는
    i) 3.1.1, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.29.1 및 24.2.1로 구성된 군에서 선택된 항체의 경쇄 가변부;
    ii) 서열 번호 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94 및 100으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열 또는 시그날 서열이 결여된 상기 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부; 및
    iii) 서열 번호 3, 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 93 및 99로 구성된 군에서 선택되는 핵산 서열이 암호화하는 경쇄 가변부 또는 시그날 서열이 결여되어 있는 상기 암호화된 경쇄 가변부
    로 구성된 군에서 선택되는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  5. 제1항에 있어서,
    (a) 상기 중쇄는
    i) 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.29.1 및 24.2.1로 구성된 군에서 선택된 항체의 중쇄 가변부;
    ii) 서열 번호 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 및 98로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열 또는 시그날 서열이 결여된 상기 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부; 및
    iii) 서열 번호 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 91, 95 및 97로 구성된 군에서 선택된 핵산 서열이 암호화하는 중쇄 가변부 또는 시그날 서열이 결여되어 있는 상기 암호화된 중쇄 가변부
    로 구성된 군에서 선택된 중쇄 가변부의 아미노산 서열을 포함하고,
    상기 중쇄 가변부의 아미노산 서열은 최대 6개의 보존적 아미노산 치환 및/또는 4개의 비보존적 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있거나; 또는
    (b) 상기 경쇄는
    i) 3.1.1, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.29.1 및 24.2.1로 구성된 군에서 선택된 항체의 경쇄 가변부;
    ii) 서열 번호 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94 및 100으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열 또는 시그날 서열이 결여된 상기 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부; 및
    iii) 서열 번호 3, 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 93 및 99로 구성된 군에서 선택되는 핵산 서열이 암호화하는 경쇄 가변부 또는 시그날 서열이 결여되어 있는 상기 암호화된 경쇄 가변부
    로 구성된 군에서 선택된 경쇄 가변부의 아미노산 서열을 포함하며,
    상기 경쇄 가변부의 아미노산 서열은 최대 6개의 보존적 아미노산 치환 및/또는 4개의 비보존적 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  6. 제5항에 있어서,
    (a) 상기 중쇄는
    i) 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.29.1 및 24.2.1로 구성된 군에서 선택된 항체의 중쇄 가변부;
    ii) 서열 번호 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 및 98로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열 또는 시그날 서열이 결여된 상기 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부; 및
    iii) 서열 번호 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 91, 95 및 97로 구성된 군에서 선택된 핵산 서열이 암호화하는 중쇄 가변부 또는 시그날 서열이 결여되어 있는 상기 암호화된 중쇄 가변부
    로 구성된 군에서 선택된 중쇄 가변부의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    (b) 상기 경쇄는
    i) 3.1.1, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.29.1 및 24.2.1로 구성된 군에서 선택된 항체의 경쇄 가변부;
    ii) 서열 번호 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94 및 100으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열 또는 시그날 서열이 결여된 상기 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부; 및
    iii) 서열 번호 3, 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 93 및 99로 구성된 군에서 선택되는 핵산 서열이 암호화하는 경쇄 가변부 또는 시그날 서열이 결여되어 있는 상기 암호화된 경쇄 가변부
    로 구성된 군에서 선택된 경쇄 가변부의 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  7. 제1항에 있어서,
    (a) 상기 중쇄는
    i) 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.29.1 및 24.2.1로 구성된 군에서 선택된 항체의 중쇄;
    ii) 서열 번호 6, 14, 22, 30, 38, 46, 54, 62, 70, 78 및 86으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열 또는 시그날 서열이 결여된 상기 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및
    iii) 서열 번호 5, 13, 21, 29, 37, 45, 53, 61, 69, 77 및 85로 구성된 군에서 선택된 핵산 서열이 암호화하는 중쇄 또는 시그날 서열이 결여되어 있는 상기 암호화된 중쇄
    로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고,
    상기 아미노산 서열은 최대 6개의 보존적 아미노산 치환 및/또는 4개의 비보존적 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있거나; 또는
    (b) 상기 경쇄는
    i) 3.1.1, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.IL-R174K 및 24.2.1로 구성된 군에서 선택된 항체의 경쇄;
    ii) 서열 번호 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64, 72, 80, 88 및 102로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열 또는 시그날 서열이 결여된 상기 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및
    iii) 서열 번호 7, 15, 23, 31, 39, 47, 55, 63, 71, 79, 87 및 101로 구성된 군에서 선택되는 핵산 서열이 암호화하는 경쇄 또는 시그날 서열이 결여되어 있는 상기 암호화된 경쇄
    로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하며,
    상기 아미노산 서열은 경쇄의 각 CDR 영역 내에 최대 6개의 보존적 아미노산 치환 및/또는 4개의 비보존적 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  8. 제7항에 있어서,
    (a) 상기 중쇄는
    i) 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.29.1 및 24.2.1로 구성된 군에서 선택된 항체의 중쇄;
    ii) 서열 번호 6, 14, 22, 30, 38, 46, 54, 62, 70, 78, 86, 90, 92, 96 및 98로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열 또는 시그날 서열이 결여된 상기 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및
    iii) 서열 번호 5, 13, 21, 29, 37, 45, 53, 61, 69, 77, 85, 89, 91, 95 및 97로 구성된 군에서 선택된 핵산 서열이 암호화하는 중쇄 또는 시그날 서열이 결여되어 있는 상기 암호화된 중쇄
    로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    (b) 상기 경쇄는
    i) 3.1.1, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.IL-R174K 및 24.2.1로 구성된 군에서 선택된 항체의 경쇄;
    ii) 서열 번호 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64, 72, 80, 88 및 102로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열 또는 시그날 서열이 결여된 상기 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및
    iii) 서열 번호 7, 15, 23, 31, 39, 47, 55, 63, 71, 79, 87 및 101로 구성된 군에서 선택되는 핵산 서열이 암호화하는 경쇄 또는 시그날 서열이 결여되어 있는 상기 암호화된 경쇄
    로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 (a)의 중쇄 및 (b)의 경쇄를 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  10. 제1항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열은
    a) 3.1.1의 중쇄의 아미노산 서열 및 경쇄의 아미노산 서열;
    b) 7.1.2의 중쇄의 아미노산 서열 및 경쇄의 아미노산 서열;
    c) 10.8.3의 중쇄의 아미노산 서열 및 경쇄의 아미노산 서열;
    d) 15.1.1의 중쇄의 아미노산 서열 및 경쇄의 아미노산 서열;
    e) 21.4.1의 중쇄의 아미노산 서열 및 경쇄의 아미노산 서열;
    f) 21.2.1의 중쇄의 아미노산 서열 및 경쇄의 아미노산 서열;
    g) 22.2.1의 중쇄의 아미노산 서열 및 경쇄의 아미노산 서열;
    h) 22.1.1H-C109A의 중쇄의 아미노산 서열 및 경쇄의 아미노산 서열;
    i) 23.5.1의 중쇄의 아미노산 서열 및 경쇄의 아미노산 서열;
    j) 23.25.1의 중쇄의 아미노산 서열 및 경쇄의 아미노산 서열;
    k) 23.28.1의 중쇄의 아미노산 서열 및 경쇄의 아미노산 서열;
    l) 23.28.1L-C92A의 중쇄의 아미노산 서열 및 경쇄의 아미노산 서열;
    m) 23.28.1H-D16E의 중쇄의 아미노산 서열 및 경쇄의 아미노산 서열;
    n) 23.29.1의 중쇄의 아미노산 서열 및 경쇄의 아미노산 서열;
    o) 24.2.1의 중쇄의 아미노산 서열 및 경쇄의 아미노산 서열;
    p) 3.1.1H-A78T의 중쇄의 아미노산 서열 및 경쇄의 아미노산 서열;
    q) 3.1.1H-A78T-V88A-V97A의 중쇄의 아미노산 서열 및 경쇄의 아미노산 서열;
    r) 3.1.1L-L4M-L83V의 중쇄의 아미노산 서열 및 경쇄의 아미노산 서열; 및
    s) 23.29.1L-R174K의 중쇄의 아미노산 서열 및 경쇄의 아미노산 서열
    로 구성된 군에서 선택되며,
    상기 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열은 각각 최대 6개의 보존적 아미노산 치환 및/또는 4개의 비보존적 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  11. 제1항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 상기 중쇄의 중쇄 가변부 및 경쇄의 경쇄 가변부의 아미노산 서열은
    a) 서열 번호 2, 90 및 92로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열 및 서열 번호 4 및 94로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열;
    b) 서열 번호 10의 아미노산 서열 및 서열 번호 12의 아미노산 서열;
    c) 서열 번호 18의 아미노산 서열 및 서열 번호 20의 아미노산 서열;
    d) 서열 번호 26의 아미노산 서열 및 서열 번호 28의 아미노산 서열;
    e) 서열 번호 34의 아미노산 서열 및 서열 번호 36의 아미노산 서열;
    f) 서열 번호 42의 아미노산 서열 및 서열 번호 44의 아미노산 서열;
    g) 서열 번호 50 및 96으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열 및 서열 번호 52의 아미노산 서열;
    h) 서열 번호 58의 아미노산 서열 및 서열 번호 60의 아미노산 서열;
    i) 서열 번호 66 및 98로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열 및 서열 번호 68 및 100으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열; 및
    j) 서열 번호 74의 아미노산 서열 및 서열 번호 78의 아미노산 서열
    로 구성된 군에서 선택되고,
    상기 아미노산 서열은 경우에 따라 시그날 서열이 결여되어 있으며, 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열은 각각 최대 6개의 보존적 아미노산 치환 및/또는 4개의 비보존적 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 어떤 보존적 아미노산 치환 또는 비보존적 아미노산 삽입, 결실 또는 치환도 포함하지 않는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  13. 제1항에 있어서, 항체는 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 3.1.1L-L4M, L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.28.1H-D16E, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K 및 24.2.1로 구성된 군에서 선택되는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은
    a) 마우스, 래트, 개 및/또는 토끼 B 세포에는 결합하지 않는 성질;
    b) 인간, 사이노몰구스 원숭이 및/또는 레서스 원숭이 B 세포에 결합하는 성질;
    c) CD40에 대한 선택도가 핵 인자-카파 B(RANK), 4-1BB(CD137), 종양 괴사 인자 수용체-1(TNFR-1) 및 종양 괴사 인자 수용체-2(TNFR-2)의 수용체 할성자에 대한 선택도보다 100배 이상 높은 성질;
    d) 4 x 10-10 M 이하의 KD로 CD40에 결합하는 성질;
    e) CD40에 대한 해리 속도 Koff가 2 x 10-4 이하인 성질;
    f) 인간 T 세포 및/또는 인간 가지 세포의 존재 하에 생체내에서 종양 성장을 억제하는 성질;
    g) 인간 면역 세포의 부재 하에 CD40-양성 종양의 성장을 억제하는 성질;
    h) 인간 B 세포의 표면에서 ICAM, MHC-II, B7-2, CD71, CD23 및/또는 CD71의 발현을 증가시키는 성질;
    i) 인간 가지 세포에 의해 IL-12p40, IL-12p70 및/또는 IL-8의 분비를 증가시키는 성질;
    j) 인간 가지 세포의 표면에서 ICAM, MHC-II, B7-2 및/또는 CD83의 발현을 증가시키는 성질;
    k) 동종 자극 과정에서 인간 T 세포에 의해 인터페론-감마의 발현을 증가시키는 성질;
    l) 인간 CD40L의 존재 하에 인간 CD40에 결합하는 성질;
    m) CD40의 세포외 도메인 중 도메인 1 또는 도메인 2에 포함된 인간 CD40의 에피토프에 결합하는 성질; 및
    n) CD40의 세포외 도메인 중 도메인 2 또는 도메인 3에 포함된 인간 CD40의 에피토프에 결합하는 성질
    로 구성된 군에서 선택되는 1 이상의 성질을 갖는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  15. 인간 CD40에 특이적으로 결합하여 이를 활성화시키는 항체 또는 이의 항원 결합 부분으로서, 상기 항체 및 이의 항원 결합 부분은
    a) CD40에의 결합에 대해 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 3.1.1L-L4M, L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.28.1H-D16E, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K 및 24.2.1로 구성된 군에서 선택된 항체와 교차 경쟁하는 성질;
    b) 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 3.1.1L-L4M, L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.28.1H-D16E, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K 및 24.2.1로 구성된 군에서 선택된 항체와 동일한 CD40의 에피토프에 결합하는 성질;
    c) 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 3.1.1L-L4M, L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.28.1H-D16E, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K 및 24.2.1로 구성된 군에서 선택된 항체와 거의 동일한 KD로 CD40에 결합하는 성질; 및
    d) 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 3.1.1L-L4M, L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.28.1H-D16E, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K 및 24.2.1로 구성된 군에서 선택된 항체와 거의 동일한 해리 속도로 CD40에 결합하는 성질
    로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 성질을 갖는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 있어서,
    a) 면역글로불린 G(IgG), IgM, IgE, IgA 또는 IgD 분자, 또는 이로부터 유도된 것; 또는
    b) Fab 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 1본쇄 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체 또는 이중특이적 항체
    인 것인 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 항체 또는 이의 항원 결합 부분과 약학적 허용 담체를 포함하는 약학 조성물.
  18. 암 치료에 효과적인 항체 유효량을 인간에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간 CD40에 특이적으로 결합하여 이를 활성화시키는 항체 또는 이의 항원 결합 부분으로 인간의 암을 치료하는 방법.
  19. 제1항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 항체 또는 제17항의 약학 조성물의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 요하는 환자를 항-CD40 항체 또는 이의 항원 결합 부분으로 치료하는 방법.
  20. 제1항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 항체 또는 이의 항원 결합 부분 또는 제17항의 약학 조성물의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 면역 반응의 증가를 요하는 인간에서 면역 반응을 증가시키는 방법.
  21. 제1항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 항체 또는 이의 항원 결합 부분, 또는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 중쇄 또는 경쇄를 생산하는 분리된 세포주.
  22. 제21항에 있어서, 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 3.1.1L-L4M, L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.28.1H-D16E, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K 및 24.2.1로 구성된 군에서 선택된 항체를 생산하며, 상기 항체는 동일한 아미노산 서열을 갖는 것인 분리된 세포주.
  23. 제1항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 중쇄 또는 이의 항원 결합 부분 또는 경쇄 또는 이의 항원 결합 부분을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
  24. 제23항에 있어서, 핵산 분자는
    a) 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 3.1.1L-L4M, L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.28.1H-D16E, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K 및 24.2.1로 구성된 군에서 선택된 항체의 중쇄 또는 이의 항원 결합 부분의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열;
    b) 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 3.1.1L-L4M, L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.28.1H-D16E, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K 및 24.2.1로 구성된 군에서 선택된 항체의 경쇄 또는 이의 항원 결합 부분의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열;
    c) 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100 및 102로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열 또는 시그날 서열이 결여된 상기 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열; 및
    d) 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99 및 101로 구성된 군에서 선택된 핵산 서열
    로 구성된 군에서 선택된 핵산 서열을 포함하는 것인 분리된 핵산 분자.
  25. 제23항 또는 제24항의 핵산 분자를 포함하는 벡터로서, 경우에 따라 상기 핵산 분자에 작동가능하게 결합된 발현 조절 서열을 포함하는 것인 벡터.
  26. 제25항의 벡터 또는 제23항 또는 제24항의 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포.
  27. 적절한 조건 하에 제26항의 숙주 세포 또는 제21항의 세포주를 배양하는 단계 및 항-CD40 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 회수하는 단계를 포함하는, 항-CD40 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 제조 방법.
  28. 제23항 또는 제24항의 핵산 분자를 포함하고, 이를 발현하는 인간 이외의 트랜스게닉 동물 또는 트랜스게닉 식물.
  29. 제28항의 인간 이외의 트랜스게닉 동물 또는 트랜스게닉 식물로부터 항체를 분리하는 단계를 포함하는, 인간 CD40에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 제조 방법.
  30. (a) 중쇄 또는 이의 항원 결합 부분을 암호화하는 분리된 핵산 분자, 경쇄 또는 이의 항원 결합 부분을 암호화하는 분리된 핵산 분자, 또는 경쇄 및 중쇄 또는 이의 항원 결합 부분을 암호화하는 핵산 분자들의 유효량을 투여하는 단계; 및
    (b) 핵산 분자를 발현시키는 단계
    를 포함하는, 인간 CD40에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분으로 치료를 요하는 피험체를 치료하는 방법.
  31. 인간 CD40에 특이적으로 결합하여 이를 활성화시키는 키메라 또는 인간 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분으로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 상기 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열은
    a) 서열 번호 6의 아미노산 서열 및 서열 번호 8의 아미노산 서열;
    b) 서열 번호 14의 아미노산 서열 및 서열 번호 16의 아미노산 서열;
    c) 서열 번호 22의 아미노산 서열 및 서열 번호 24의 아미노산 서열;
    d) 서열 번호 30의 아미노산 서열 및 서열 번호 32의 아미노산 서열; 및
    e) 서열 번호 46의 아미노산 서열 및 서열 번호 48의 아미노산 서열
    로 구성된 군에서 선택되는 것인 키메라 또는 인간 모노클로날 항체 또는 항원 결합 부분.
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