CN1938045B - 治疗自身免疫和炎性疾病以及器官移植排异的拮抗性抗-cd40抗体的应用 - Google Patents

治疗自身免疫和炎性疾病以及器官移植排异的拮抗性抗-cd40抗体的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了治疗自身免疫和/或炎性疾病患者的方法。所述方法包括将治疗有效量的拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段给予需要它的患者。当所述抗体结合人CD40表达细胞上的CD40抗原时，所述拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段无明显的激动活性，而显示拮抗活性。抗-CD40抗体或其抗原结合片段的拮抗活性有利于抑制CD40表达细胞的CD40L-介导的激活，从而抑制CD40L介导的人CD40表达细胞的存活和信号传导途径。

Description

治疗自身免疫和炎性疾病以及器官移植排异的拮抗性抗-CD40抗体的应用
发明领域
本发明涉及使用拮抗性抗CD-40抗体治疗自身免疫和炎性疾病的方法。
发明背景
CD40是一种55kDa的细胞表面抗原，存在于正常和致瘤性人B细胞、树突状细胞、其它抗原呈递细胞(APC)、内皮细胞、单核细胞、CD8+T细胞和上皮细胞上。CD40抗原也表达在活化T细胞、活化的血小板、发炎的血管平滑肌细胞、嗜酸性粒细胞、类风湿性关节炎的滑膜、表皮成纤维细胞和其它非淋巴细胞类型。根据表达CD40细胞的类型的CD40连接，可诱导胞内粘附、分化、激活和增殖。例如，CD40与其相关的配体，CD40L(也称为CD154)结合可刺激B-细胞增殖和分化为浆细胞，产生抗体、同种型转换和产生B-细胞记忆。在B细胞分化期间，CD40表达在前B细胞上，但在其分化为浆细胞后丧失。
已在活化的T细胞表面鉴定到CD40配体(Fenslow等，(1992)J.Immunol.149：655；Lane等，(1992)Eur.J Immunol.22：2573；Noelle等，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6550)，但该配体不普遍表达在静止的人T细胞上。CD40L是一种与TNF-α同源的II型跨膜糖蛋白(Armitage等，(1992)Nature 357：80和Spriggs等，(1992)JExp.Med.176：1543)。CD40L的胞内结构域在邻近跨膜区域处含有两个精氨酸残基，这为产生可溶形式配体(sCD40L)提供了潜在的蛋白水解切割位点。CD40L过度表达可导致类似于啮齿类动物模型中的全身性红斑狼疮等自身免疫疾病(Higuchi等，(2002)J.Immunol.168：9-12)。相反，活化的T细胞上缺乏功能性CD40L可导致X-连锁高IgM综合征(Allen等，(1993)Science 259：990；和Korthauer等，(1993)Nature 361：539)。此外，阻断CD40/CD40L相互作用可防止非人灵长类模型的移植排异。参见，例如(1992)Transplantation 53：501-7。
APC上的CD40表达在激活这些细胞中起重要的协同刺激作用。例如，拮抗性抗CD40单克隆抗体(mAb)显示在B细胞激活中可模拟T辅助细胞的作用。当存在于表达FcγRII的粘附细胞上时，这些抗体可诱导B细胞增殖(Banchereau等，(1989)Science 251：70)。此外，在存在IL-4时，拮抗性抗CD40mAb可代替T辅助细胞信号引起IgM、IgG和IgE分泌(Gascan等，(1991)J Immunol.147：8)。另外，拮抗性抗-CD40mAb可防止分离自淋巴结的B细胞的程序性死亡(凋亡)。
这些和其它观察结果支持CD40和CD40L相互作用在调节体液和细胞介导的免疫应答中起着关键作用的当前理论。更新的研究表明CD40/CD40L相互作用在各种生理和病理过程中起着更广泛的作用。
CD40信号转导途径依赖于许多胞内因子的协同调节。与TNF受体家族的其它成员一样，CD40可与TRAF蛋白(TNF受体因子相关蛋白)，例如TRAF2和TRAF3反应，该蛋白在CD40与CD40L(固体状态CD40L或可溶性CD40L)结合后介导胞内信号。TRAF将信号经map激酶，例如NIK(NF-κB诱导激酶)和I-κB激酶(IKK α/β)转导入核中，最终激活转录因子NF-κB(Young等，(1998)Immunol.Today 19：502-06)。B细胞的一亚组中也显示可经Ras和MEK/ERK途径转导信号。其它参与CD40细胞信号转导的途径包括PI3K/Akt途径和P38MAPK途径(Craxton等，(1998)J.Immunol.5：439-447)。
经CD40的信号转导显示可防止细胞凋亡(Makus等，(2002)J.Immunol.14：973-982)。凋亡信号是以协同模式诱导程序性细胞死亡所必需。细胞死亡信号包括细胞内的内部刺激，例如内质网应力或外来刺激，例如FasL或TNFα的受体结合。信号转导途径是复杂的，涉及激活胱冬酶，例如胱冬酶3和9与聚(ADP核糖)聚合酶(PARP)。在该级联反应中，抗凋亡信号转导蛋白，例如Mcl-1和BCLx，LAP-蛋白家族的成员，例如X-连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)受到下调(Budihardjo等，(1999)Annu.Rev.Cell Dev.Biol.15：269-90)。例如，在树突状细胞中，CD40细胞信号可阻断FasL转导的凋亡信号(Bjorck等，(1997)Int’l Immunol.9：365-372)。
因此，CD40与CD40L结合然后激活CD40信号是正常免疫应答所必需的步骤；然而，CD40信号的调节异常可导致疾病。CD40信号转导途径显示参与自身免疫疾病(Ichikawa等，(2002)J.Immunol.169：2781-7和Moore等，(2002)J.Autoimmun.19：139-45)。此外，CD40/CD40L相互作用在炎性过程中起着重要作用。例如，CD40和CD40配体在人和实验性动脉粥样硬化病损中过度表达。CD40刺激可诱导基质降解酶和组织因子在粥样斑相关类型细胞，例如内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞中表达。此外，CD40刺激诱导促炎性细胞因子，例如IL-1、IL-6和IL-8和粘附分子，例如ICAM-1、E-选凝素和VCAM的产生。抑制CD40/CD40L相互作用防止了动物模型中的动脉粥样硬化。在移植模型中，阻断CD40/CD40L相互作用可防止炎症。CD10/CD40L结合已显示与阿尔茨海默淀粉样β肽协同作用促进了小胶质细胞激活，从而导致神经毒性。
在类风湿性关节炎(RA)患者中，关节软骨细胞的CD40表达增加，因此，CD40信号可能促进破坏性细胞因子和基质金属蛋白酶的产生。参见，Gotoh等，(2004)J.Rheumatol.31：1506-12。此外，促分裂原活化蛋白(MAP)激酶与核因子κB(NFκB)通过RA患者的CD14+滑膜细胞上的CD40结合而被激活，进而扩大了滑膜炎性应答(Harigai等，(2004)Arthritis.Rheum.50：2167-77)。在RA实验性模型中，抗-CD40L抗体治疗防止了疾病诱发、关节发炎和抗-胶原抗体的产生(Durie等，(1993)Science261：1328)。最后，临床试验表明给予RITUXAN(通常标示用于B细胞淋巴瘤)可消除RA患者的CD20+阳性B细胞从而改善了症状(Shaw等，(2003)Ann.Rheum.Dis.62：ii55-ii59)。
在抗原呈递至T细胞期间，阻断CD40/CD40L相互作用也显示可诱导T细胞耐受。因此，阻断CD40/CD40L相互作用可防止最初的T细胞激活以及可诱导对再次接触抗抗原时的长期耐受。
鉴于CC40L-介导的CD40信号转导在维持正常免疫力中具有至关重要的作用，因此需要在发生调节异常时干预该信号转导途径的方法。
发明简述
本发明提供了治疗自身免疫疾病和/或炎性疾病的患者的方法，包括给予该患者抗-CD40抗体或其抗原结合片段，当其与表达CD40的人细胞上的CD40抗原结合时不具有显著的激动活性。本发明也提供抑制表达CD40抗原的细胞应答的方法。用于本发明方法的合适的拮抗性抗-CD40抗体对CD40具有强亲和力。这些单克隆抗体和它们的抗原结合片段能特异性结合人细胞表面表达的人CD40抗原。当它们与人细胞CD40抗原结合时，无明显激动活性，但显示拮抗活性。在一个实施方案中，当抗-CD40抗体或其片段与抗原呈递细胞，例如B细胞的CD40抗原结合时，显示拮抗活性。
拮抗抗体在预防、缓解或治疗包括自身免疫和/或炎症成分的疾病中特别有用。这些疾病包括但不限于：自身免疫和炎性疾病，例如全身性红斑狼疮(SLE)、盘状狼疮、狼疮性肾炎(lupus nephritis)，结节病，炎性关节炎，包括但不限于，青少年关节炎、类风湿性关节炎、银屑病关节炎、莱特尔综合征、强直性脊柱炎和痛风性关节炎，器官或组织移植排异、超急性、急性或慢性排异和/或移植物抗宿主病、多发性硬化、高IgE综合征、结节性多动脉炎、原发性胆汁性肝硬化(primary biliarycirrhosis)、炎性肠病、克罗恩病、盆腔疾病(谷蛋白敏感性肠病)、自身免疫肝炎、恶性贫血、自身免疫溶血性贫血、银屑病、硬皮病、重症肌无力、自身免疫血小板减少性紫癜、自身免疫甲状腺炎、格雷夫斯病、桥本甲状腺炎、免疫复合物疾病、慢性疲劳免疫功能失调综合征(CFIDS)、多肌炎和皮肌炎、冷球蛋白血症、血栓溶解、心肌病、寻常型天疱疮(pemphigus vulgaris)、肺间质纤维化、结节病、I型和II型糖尿病、1、2、3和4型迟发型超敏症、过敏症或过敏病症、对治疗性蛋白质的不良/不想要(unintended)的免疫应答、哮喘、Churg-Strauss综合征(过敏性肉芽肿病)、特异性皮炎、过敏性和刺激性接触性皮炎、荨麻疹(urtecaria)、IgE-介导的过敏症、动脉粥样硬化症、脉管炎、先天性炎性肌病(idiopathic inflammatorymyopathies)、溶血性疾病、阿尔茨海默病、慢性炎性脱髓鞘多发神经病变等。
附图简述
图1列出了mAb CHIR-12.12的轻链和重链氨基酸序列。图1A显示了轻链的前导区(SEQ ID NO：2的残基1-20)、可变区(SEQ ID NO：2的残基21-132)和恒定区(SEQ ID NO：2的残基133-239)。图1B显示了重链的前导区(SEQ ID NO：4的残基1-19)、可变区(SEQ ID NO：4的残基20-139)和恒定区(SEQ ID NO：4的残基140-469)。图1B所示mAb CHIR-12.12重链的交替恒定区反映了SEQ ID NO：4的153位丝氨酸残基替换了丙氨酸残基。mAb CHIR-12.12重链的该变体的完整序列示于SEQ ID NO：5。
图2显示mAb CHIR-12.12的轻链(图2A；SEQ ID NO：1)和重链(图2B；SEQ IDNO：3)的编码序列。
图3列出了mAb CHIR-5.9的轻链和重链的氨基酸序列。图3A显示了轻链的前导区(SEQ ID NO：6的残基1-20)、可变区(SEQ ID NO：6的残基21-132)和恒定区(SEQ ID NO：6的残基133-239)。图1B显示了重链的前导区(SEQ ID NO：7的残基1-19)、可变区(SEQ ID NO：7的残基20-144)和恒定区(SEQ ID NO：7的残基145-474)。图3B所示mAb CHIR-5.9重链的交替恒定区反映了SEQ ID NO：7的158位丝氨酸残基替换了丙氨酸残基。mAb CHIR-5.9重链的该变体的完整序列示于SEQ ID NO：8。
图4显示了人CD40的短同种型(氨基酸序列示于图4B；SEQ ID NO：10)的编码序列(图4A；SEQ ID NO：9)和人CD40的长同种型(氨基酸序列示于图4D)的编码序列(图4C；SEQ ID NO：11)。
图5显示了CHIR-12.12在不同pH制剂中通过示差扫描量热法(DSC)测量的热融温度。
发明详述
本发明涉及使用对CD40细胞表面抗原具有强亲和力的抗体治疗自身免疫和炎性疾病的方法。当这些抗-CD40抗体及其抗原结合片段与表达CD40细胞上的CD40结合时，无明显的激动活性，而是显示拮抗活性。
“抗体”和“免疫球蛋白”(Ig)是具有相同结构特征的糖蛋白。虽然抗体显示对抗原的结合特异性，但免疫球蛋白也包括缺乏抗原特异性的抗体和其它抗体样分子。后一类型的多肽例如有淋巴系统以低水平产生和由骨髓瘤以高水平产生的免疫球蛋白。
术语“抗体”在最广义上包括全装配抗体、能结合抗原的抗体片段(例如，Fab′、F′(ab)2、Fv、单链抗体、双体分子)和包含以上物质的重组肽。
本文使用的术语“单克隆抗体”指得自基本上同质性抗体群的抗体，即除了可能存在极少量天然发生的突变以外，构成该群的每个抗体是相同的。
“天然抗体”和“天然免疫球蛋白”通常是由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)组成的约150,000道尔顿的异源四聚糖蛋白。每条轻链经共价二硫键与重链相连，二硫键的数目视不同免疫球蛋白同种型的重链而不同。每条重链和轻链也具有有规律地隔开的链内二硫桥。每条重链一端有一个可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链一端有一个可变区(VL)，另一端有一个恒定区。轻链的恒定区与重链的第一恒定区配对，轻链可变区与重链的可变区配对。据信，某些特定的氨基酸残基可在轻链和重链可变区之间形成相互作用界面。
术语“可变”表示以下内容：各抗体之间可变区的某些部分在序列上差别很大，这些部分是各特定抗体用于与其特定抗原特异性结合的部分。然而，可变性不是均匀分布在抗体的整个可变区，它集中于轻链或重链的可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区的3个区段中。可变区的较高度保守部分称为框架(FR)区。天然轻链和重链的可变区各含有主要采取β-片层构型由3个CDR相连的4个FR区域，CDR形成(有时形成部分)连接β-片层结构的环。每条链中的CDR通过FR区域保持紧密接近，并且与另一链的CDR接近共同形成抗体的抗原结合位点(参见，Kaba等，(1991)NIHPubl.No.91-3242，第I卷，647-669页)。
恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但显示各种效应物功能，例如Fc受体(FcR)结合、参与抗体依赖的细胞毒性、调理作用、启动依赖补体的细胞毒性和肥大细胞脱颗粒。
本文使用的术语“超变区”表示抗体中负责结合抗原的氨基酸残基。超变区包括“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(即，轻链可变区的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)和重链可变区的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，(1991)《免疫学感兴趣的蛋白质的序列》(Sequences of proteins of ImmunologicalInterest)(第5版，Public Health Service，National Institute of Health，Bethesda，MD)和/或“超变环”的氨基酸残基(即，轻链可变区的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)和重链可变区的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Clothia和Lesk，(1987)J.Mol.Biol.196：901-917)。“框架”或“FR”残基是除超变区残基以外的可变区残基。
“抗体片段”包括完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双抗体；线性抗体(Zapata等，(1995)Protein Eng 8(10)：1057-1062)；单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性(multispecific)抗体。木瓜蛋白酶消化抗体可产生两个称为“Fab”片段的相同的抗原结合片段(每个具有一个抗原结合位点)与一个残留的“Fc”片段(其名字反映它易于结晶)。胃蛋白酶处理得到具有两个抗原结合位点的F(ab′)2片段，该片段仍能交联抗原。
“Fv”是含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。在双链Fv种类中，该区域由紧密、非共价连接的一条重链可变区和一条轻链可变区的二聚体组成。在单链Fv种类中，一条重链可变区和一条轻链可变区可通过柔性肽接头共价相连从而使得轻链和重链可结合成类似于双链Fv种类中的“二聚体”结构。每个可变区的3个CDR正是以这种构型相互作用而确定了VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。6个CDR一起赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使一个可变区(或仅包含抗原特异的3个CDR的半个Fv)也能识别并结合抗原，虽然亲和力低于完整的结合位点。
Fab片段也含有轻链的恒定区和重链的第一个恒定区(CH1)。Fab片段因重链CH1区羧基末端多几个残基，包括抗体绞链区的一个或多个半胱氨酸残基而不同于Fab’片段。本文称为Fab′-SH是因为此Fab’的恒定区半胱氨酸残基带有一个游离巯基。F(ab′)2抗体片段最初制备为其间具有绞链半胱氨酸的多对Fab′片段。其它化学偶联的抗体片段反应也是已知的。
脊椎动物种类抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可分为两种明显不同的类型中的一种，该两种类型根据它们恒定区的氨基酸序列而称为kappa(κ)和lambda(λ)。
免疫球蛋白可依它们重链恒定区的氨基酸序列分为不同类型。人免疫球蛋白主要有5类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中几类可进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。不同类免疫球蛋白所对应的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是熟知的。不同的同种型具有不同的效应物功能。例如，人IgG1和IgG3同种型可介导依赖抗体的细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性。
本文使用的“标记”一词指可检测化合物或组合物，其直接或间接与抗体偶联从而产生“标记的”抗体。标记自身可检测(例如，放射性同位素标记或荧光标记)，或者就酶标记而言，该标记可催化底物化合物或组合物化学转变成可检测的。
术语“拮抗剂”以最广义使用时包括可部分或完全阻断、抑制或中和本文公开的天然靶分子的生物活性或其转录或翻译的任何分子。
本文使用的“载体”包括以所用剂量和浓度与细胞或哺乳动物接触时无毒性的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂。生理上可接受的载体通常是pH缓冲水溶液。生理上可接受的载体的例子包括缓冲液，例如磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖或其它糖类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖醇，例如甘露醇或山梨醇；成盐反荷离子，例如钠；和/或非离子表面活性剂，例如吐温、聚乙二醇(PEG)和普朗尼克。“联合”一种或多种其它治疗性药物给药包括同步(同时)和以任何顺序连续给药。
本文使用的术语“宿主细胞”指以单细胞培养的微生物或真核细胞或细胞系，它们可以是或已用作重组载体或其它转移多核苷酸的受者，包括受转染的原代细胞的后代。应该理解的是，由于天然的、偶发的或设计的突变，单个细胞的后代在形态或遗传上或总DNA互补性上不一定和原始的亲代完全相同。
“人效应细胞”是表达一种或多种FcR并能行使效应物功能的白细胞。这些细胞优选至少表达FcγRIII含有能执行依赖抗原的细胞介导的细胞毒性(ADCC)效应物功能。能介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞，优选PBMC和NK细胞。具有ADCC活性的抗体通常是IgG1或IgG3同种型。应该注意的是，除了分离的IgG1和IgG3抗体以外，这种ADCC介导性抗体可通过非ADCC抗体的可变区或可变区片段进行工程改造连接为IgG1或IgG3同种型的恒定区来制备。
术语“Fc受体”或“FcR”用于描述能结合抗体Fc区的受体。优选的FcR是天然序列的人FcR。此外，优选的FcR可结合IgG抗体(γ受体)包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类受体，包括这些受体的等位基因变体或者交替剪接形式。FcγRII受体包括具有相似氨基酸序列、主要区别在于它们的胞质结构域的FcγIIA(“活化性受体”)和FcγIIB(“抑制性受体”)。激活性受体FcγRIIA其细质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。抑制性受体FcγRIIB在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)(参见Daeron(1997)Annu.Rev.Immunol.15：203-234)。FcR的综述见Ravetch和Kinet(1991)Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)；Capel等，(1994)Immunomethods 4：25-34和de Haas等，(1995)J.Lab.Clin.Med.126：330-341。本文的术语“FcR”包含其它FcR，包括将来鉴定到的FCR。该术语也包括负责将成熟IgG转移给胎儿的新生受体，FcRn(Guyer等，(1976)J.Immunol.117：587和Kim等，(1994)J.Immunol.24：249(1994))。
制备人抗体的方法有很多。例如，可用Epstein-Barr病毒(EBV)感染使分泌细胞无限增殖。然而，EBV-感染的细胞难于克隆并且通常得到的免疫球蛋白产量较低(James和Bell(1987)J.Immunol.Methods 100：5-40)。将来，可能通过引入转化基因的有限组合来实现人B细胞的无限增殖。近来的发现增加了这种可能性，即端粒酶催化性亚基连同H-ras的SV40大癌蛋白和癌等位基因一起表达可导致正常人上皮细胞和成纤维细胞的致癌性转化(Hahn等，(1999)Nature 400：464-468)。目前已能制备转基因动物(例如，小鼠)，该动物在免疫后能产生人的抗体文库而不产生内源性免疫球蛋白(Jakobovits等，(1993)Nature 362：255-258；Lonberg和Huszar(1995)Int.Rev.Immunol.13：65-93；Fishwild等，(1996)Nat.Biotechnol.14：845-851；Mendez等，(1997)Nat.Genet.15：146-156；Green(1999)J.Immunol.Methods 231：11-23；Tomizuka等，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：722-727；综述见Little等，(2000)Immunol.Today 21：364-370)。例如，嵌合性和种系突变小鼠的抗体重链连接区(JH)基因的纯合消除可完全抑制内源性抗体产生已有描述(Jakobovits等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2551-2555)。将人种系免疫球蛋白基因阵列转移入这种种系突变小鼠可导致在抗原攻击后产生人抗体(Jakobovits等，(1993)Nature 362：255-258)。Mendez等，(1997)(Nature Genetics 15：146-156)制备了抗原攻击后可产生高亲和力完全人抗体的转基因小鼠品系。这可通过将兆碱基的重链和轻链基因座经种系整合入删除了上述内源性JH区段的小鼠来实现。这些小鼠(XenoMouseIItechnology(Abgenix；Fremont，California))具有1,020kb人重链基因座和800kb人κ基因座，其中人重链基因座含有约66个VH基因的完全的DH和JH区域，以及3个不同的恒定区，人κ基因座含有32个Vκ基因的Jκ区段和Cκ基因。这些小鼠产生的抗体在所有方面，包括基因重排、装配和全文库成分极其类似于在人中观察到的。由于删除能阻止鼠基因座中基因重排的内源性区段，因而人抗体的表达优先超过内源性抗体。这种小鼠可用特别感兴趣的抗原免疫。
可筛选这种免疫动物血清对初始抗原的抗体反应性。可从淋巴节或脾细胞分离淋巴细胞，还可通过选择CD138-阴性和CD19-阳性的淋巴细胞来选择B细胞。一方面，可将这种B细胞培养物(BCC)与骨髓瘤细胞融合以产生上述杂交瘤。
在另一方面，可优选筛选这种B细胞培养物对初始抗原的反应性。这种筛选包括使用靶/抗原蛋白质的ELISA，这是利用能与感兴趣抗原结合和能否瞬时感染的表达靶抗原的CHO或其它细胞体外结合的已知抗体的竞争性试验。
本发明涉及治疗自身免疫/或炎性疾病患者的组合物和方法。这些方法包括用本文所述抗-CD40抗体或其抗原结合片段治疗，给予此抗体或其抗原结合片段可使接受该治疗方法的患者产生有利的治疗应答。所述方法和组合物在治疗以下疾病(但不限于)中特别有用：全身性红斑狼疮(SLE)、盘状狼疮、狼疮性肾炎，结节病，炎性关节炎，包括，青少年关节炎、类风湿性关节炎、银屑病关节炎、莱特尔综合征、强直性脊柱炎和痛风性关节炎，器官或组织移植排异、超急性、急性或慢性排异和/或移植物抗宿主病、多发性硬化、高IgE综合征、结节性多动脉炎、原发性胆汁性肝硬化、炎性肠病、克罗恩病、腹腔疾病(谷蛋白敏感性肠病)、自身免疫肝炎、恶性贫血、自身免疫溶血性贫血、银屑病、硬皮病、重症肌无力、自身免疫血小板减少性紫癜、自身免疫甲状腺炎、格雷夫斯病、桥本甲状腺炎、免疫复合物疾病、慢性疲劳免疫功能失调综合征(CFIDS)、多肌炎和皮肌炎、冷球蛋白血症、血栓溶解、心肌病、寻常型天疱疮、肺间质纤维化、I型和II型糖尿病等。此外，这些拮抗性抗-CD40抗体和其抗原结合片段在治疗炎症相关疾病中特别有用，所述疾病包括但不限于：1、2、3和4型迟发型超敏、过敏或过敏病症、对治疗性蛋白质不良/不想要的免疫应答(参见，例如美国专利申请号US 2002/0119151和Koren等，(2002)Curr.Pharm.Biotechnol.3：349-60)、哮喘、Churg-Strauss综合征(过敏性肉芽肿病)、特异性皮炎、过敏性和刺激性接触性皮炎、荨麻疹、IgE-介导的过敏症、动脉粥样硬化症、脉管炎、先天炎性肌病、溶血性疾病、阿尔茨海默病、慢性炎性脱髓鞘多发神经病变等。
适用于本发明方法的抗-CD40抗体能特异结合表达于人细胞表面的人CD40抗原，并且当与表达CD40的人细胞上的CD40抗原结合时没有明显激动活性但显示拮抗活性。这些抗-CD40抗体和其抗原结合片段在本文中称为“拮抗性抗-CD40抗体”。这种抗体包括但不限于下文所述的完整的人单克隆抗体CH1R-5.9和CHIR-12.12，包括下文所述具有单克隆抗体CH1R-5.9和CHIR-12.12的结合特性的单克隆抗体。这些可重组产生的单克隆抗体描述于下文和分别于2003年11月4日、2003年11月26日和2004年4月27日提交的名为“拮抗性抗-CD40单克隆抗体及它们的使用方法”的待批临时申请，以及转让的美国专利申请号60/517,337(代理人审理号PP20107.001(035784/258442))、60/525,579(代理人审理号PP20107.002(035784/271525))和60/565,710(代理人审理号PP20107.003(035784/277214))所述，各专利申请的内容均全文纳入本文作为参考。
具有单克隆抗体CHIR-5.9和CHIR-12.12结合特性的抗体包括能竞争性干扰结合CD40和/或结合与CHIR-5.9和CHIR-12.12相同表位的抗体。本领域的技术人员采用本领域已知的标准方法可确定某抗体是否竞争性干扰CHIR-5.9或CHIR-12.12。
当这些抗体结合展示于人细胞表面的CD40时，这些抗体无明显的激动活性，所述人细胞例如有人B细胞、T细胞、树突状细胞、内皮细胞、激活的血小板、发炎的血管平滑肌细胞、嗜酸性粒细胞、滑膜、表皮成纤维细胞等。在一些实施方案中，它们与展示于人细胞表面的CD40结合抑制了这些人细胞的激活与分化。因此，适用于本发明方法的拮抗性抗-CD40抗体包括对表达细胞表面CD40抗原的正常和异常人细胞显示拮抗活性的单克隆抗体。
拮抗性抗-CD40抗体
单克隆抗体CHIR-5.9和CHIR-12.12代表可用于本发明方法的合适的拮抗性抗-CD40抗体。此二抗体是产自杂交瘤细胞系131.2F8.5.9(本文称为细胞系5.9)和153.8E2.D10.D6.12.12(本文称为细胞系12.12)的IgG同种型的完全人抗-CD40单克隆抗体。利用含有人IgG1重链基因座和人K链基因座的免疫的异种小鼠(XenoMousetechnology(Abgenix；Fremont，California))的脾细胞产生了这些细胞系。使脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞(Sierra BioSource)融合。将得到的杂交瘤亚克隆数次而产生了稳定的单克隆细胞系5.9和12.12。本发明的其它抗体可用具有人免疫球蛋白基因座的转基因小鼠或通过本领域已知和/或本文所述的其它方法类似地制备。
CHIR-12.12抗体的可变区的核苷酸和氨基酸序列，CHIR-5.9抗体的可变区的氨基酸序列分别见2003年11月4日、2003年11月26日和2004年4月27日提交的名为“拮抗性抗-CD40单克隆抗体及它们的使用方法”的待批临时申请，以及转让的美国专利申请号60/517,337(代理人审理号PP20107.001(035784/258442))、60/525,579(代理人审理号PP20107.002(035784/271525))和60/565,710(代理人审理号PP20107.003(035784/277214))中所述，各申请的内容全文纳入本文作为参考。mAb CHIR-12.12的轻链和重链的前导区、可变区和恒定区的氨基酸序列分别示于图1A和1B。也可参见SEQ ID NO：2(mAb CHIR-12.12轻链的完整序列)、SEQ IDNO：4(mAb CHIR-12.12重链的完整序列)和SEQ ID NO：5(SEQ ID NO：4所示mAbCHIR-12.12的重链变体的完整序列，该变体包括SEQ ID NO：4的153位丝氨酸残基替换了丙氨酸残基)。编码mAbCHIR-12.12的轻链和重链的核苷酸序列分别示于图2A和2B。也可参见SEQ ID NO：1(mAb CHIR-12.12的轻链的编码序列)和SEQID NO：3(mAb CHIR-12.12的重链的编码序列)。CHIR-5.9mAb的轻链和重链的前导区、可变区和恒定区的氨基酸序列分别示于图3A和3B。也可参见SEQ ID NO：6(mAb CHIR-5.9轻链的完整序列)、SEQ ID NO：7(mAb CHIR-5.9重链的完整序列)和SEQ ID NO：8(SEQ ID NO：7所示mAb CHIR-5.9的重链变体的完整序列，该变体包括SEQ ID NO：7的158位丝氨酸残基替换了丙氨酸残基)。此外，表达CHIR-5.9和CHIR-12.12抗体的杂交瘤分别由ATCC保藏，专利保藏命名分别为PTA-5542和PTA-5543。
如流式细胞术试验所测定的那样，ELISA型测定中CHIR-5.9和CHIR-12.12单克隆抗体能与可溶性CD40结合、阻止CD40-配体与细胞表面CD40结合并展示预先结合的CD40-配体。抗体CHIR-5.9和CHIR-12.12能相互竞争，而不与15B8竞争结合CD40，15B8是2000年10月2日提交的名为“人抗-CD40抗体”的美国临时申请系列号60/237,556和2001年10月2日提交的也名为“人抗-CD40抗体”的PCT国际申请号PCT/US01/30857(代理人审理号PP 16092.003)中所述的抗-CD40单克隆抗体，该两篇申请的内容全文纳入引为参考。当在体外测试对正常患者B细胞增殖的作用时，CHIR-5.9和CHIR-12.12起拮抗性抗-CD40抗体的作用。此外，CHIR-5.9和CHIR-12.12不诱导正常人淋巴细胞强增殖。如BiacoreTM试验测定的，CHIR-5.9与人CD40的结合亲和力是1.2×10-8M，CHIR-12.12的结合亲和力是5×10-10M。
用于本发明方法的合适的拮抗性抗-CD40抗体对CD40细胞表面抗原显示出强的单一位点结合亲和力。采用标准试验，例如BiacoreTM测定本发明的单克隆抗体对CD40的解离平衡常数(KD)显示为至少10-5M、至少3×10-5M、优选至少10-6M-10-7M、更优选至少10-8M-约10-12M。BiacoreTM分析是本领域已知的，其详述于《BIA应用手册》(BIAapplications handbook)。可用WO 01/27160所述的方法来调节结合亲和力。
“CD40抗原”、“CD40细胞表面抗原”、“CD40受体”或“CD40”表示属于肿瘤坏死因子(TNF)受体家族的跨膜糖蛋白(参见，例如美国专利号5,674,492和4,708,871；Stamenkovic等，(1989)EMBO 8：1403；Clark(1990)Tissue Antigens36：33；Barclay等，(1997)《白血球抗原手册》(The Leucocyte Antigen Facts Book)(第二版；Academic Press，San Diego))。已鉴定了由该基因交替剪接转录变体编码的人CD40的两种同种型。第一种同种型(也称为“长同种型”或“同种型1”)表达为具有由前19个残基代表的信号序列的277个氨基酸的前体多肽(SEQ ID NO：12(首次报道为GenBank登录号CAA43045，在GenBank登录号NP_001241中鉴定为同种型1)，由SEQ ID NO：11(参见GenBank登录号X60592和NM_001250)编码)。第二种同种型(也称为“短同种型”或“同种型2”)表达为也具有由前19个残基代表的信号序列的203个氨基酸的前体多肽(SEQ ID NO：10(首次报道为GenBank登录号NP_690593)，由SEQ ID NO：9(GenBank登录号NM_152854)编码)。人CD40的这两种同种型的前体多肽的前165个残基相同(即，SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12的残基1-165)。短同种型的前体多肽(SEQ ID NO：10所示)由缺乏编码区段而导致翻译读框移位的转录物变体(SEQ ID NO：9)所编码；与CD40长同种型所含有的(SEQ ID NO：12的残基166-277所示C-末端)相比，得到的CD40同种型含有较短且不同的C-末端(SEQ ID NO：10的残基166-203)。出于本发明的目的，术语“CD40抗原”、“CD40细胞表面抗原”、“CD40受体”或“CD40”包含CD40的短和长同种型。本发明的抗-CD40抗体能与下文所述位于该细胞表面抗原的短同种型或长同种型相同位置的人CD40表位结合。
如本文别处所述，CD40抗原展示在各种类型细胞的表面。“展示于表面”和“表达于表面”指全部或部分CD40抗原暴露于细胞的外部。展示或表达的CD40抗原可完全或部分糖基化。
“激动活性”指作为激动剂的物质功能。激动剂与细胞受体的结合引起了与该受体的天然配体所引起的相类似或相同的反应或活性。例如，CD40激动剂可诱导任何或全部的下列应答：细胞增殖和/或分化；通过诸如ICAM-1、E-选凝素、VCAM等分子上调细胞之间的粘附；分泌促炎性细胞因子，例如IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、TNF等；经CD40受体通过以下途径转导信号，例如TRAF(例如，TRAF2和/或TRAF3)、MAP激酶，如NIK(NF-κB诱导激酶)、1-κB激酶(IKKα/β)、转录因子NF-κB、Ras和MEK/ERK途径、PI3K/Akt途径、P38MAPK途径等；通过XIAP、Mcl-1、BCLx等分子转导抗-凋亡信号；B和/或T细胞记忆的产生；B细胞抗体产生；B细胞同种型转换；上调II类MHC和CD80/86的细胞表面表达等。“拮抗活性”指可作为拮抗剂的物质的功能。例如，CD40的拮抗剂可防止或降低通过CD40受体与激动性配体，具体是CD40L结合诱导的任何应答。拮抗剂可使激动剂结合所诱导的一种或多种应答降低5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、优选40％、45％、50％、55％、60％、更优选70％、80％、85％和最优选90％、95％、99％或100％。检测抗-CD40抗体和CD40-配体结合特异性与拮抗活性的方法是本领域技术人员已知的，包括但不限于标准的竞争性结合试验、监测B细胞分泌免疫球蛋白的试验、B细胞增殖试验、Banchereau样B细胞增殖试验、抗体产生的T细胞辅助试验、B细胞增殖的共同刺激试验和上调B细胞激活标记的试验。参见，例如分别公开于以下专利或申请中的试验：WO 00/75348；美国专利号6,087,329；和2003年11月4日、2003年11月26日和2004年4月27日提交的名为“拮抗性抗-CD40单克隆抗体及它们的使用方法”的待批临时申请，以及转让的美国专利申请号60/517,337(代理人审理号PP20107.001(035784/258442))、60/525,579(代理人审理号PP20107.002(035784/271525))和60/565,710(代理人审理号PP20107.003(035784/277214))，各申请的内容均全文纳入本文作为参考。
“明显的”激动活性指如生物试验，例如B细胞应答试验所测定的那样，比天然物质或阴性对照诱导的激动活性高至少30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的激动活性。“明显的”激动活性优选如生物试验，例如B细胞应答试验测定到的那样，比天然物质或阴性对照诱导的激动活性高至少2倍或3倍的激动活性。因此，例如当B细胞应答是感兴趣的，可使用B细胞增殖试验，“明显的”激动活性是诱导的B细胞增殖水平比天然物质或阴性对照诱导的B细胞增殖水平高至少2倍或3倍。在一个实施方案中，不结合CD40的非特异性免疫球蛋白，例如IgG1作为阴性对照。“无明显激动活性”的物质如生物试验，例如B细胞应答试验测定的那样，其激动活性不高于天然物质或阴性对照诱导的激动活性的约25％，优选不高于约20％、15％、10％、5％、1％、0.5％或甚至不高于约0.1％。如上所述，当与人细胞上的CD40抗原结合时，本发明方法中有用的拮抗性抗-CD40抗体无明显的激动活性。在本发明的一个实施方案中，拮抗性抗-CD40抗体在细胞应答中无明显的激动活性。在本发明的另一个实施方案中，拮抗性抗-CD40抗体在多个细胞应答的试验(例如，增殖和分化，或增殖、分化和B细胞抗体产生)中无明显的激动活性。
本文使用的“抗-CD40抗体”包括能特异性识别CD40抗原的抗体，包括多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体以及它们的片段，例如Fab、F(ab′)2、Fv和保留亲代抗-CD40抗体的抗原结合功能的其它片段。对本发明的方法而言，特别感兴趣的是与上述单克隆抗体CHIR-5.9和CHIR-12.12具有相同结合特性的拮抗性抗-CD40抗体。
因此，除了单克隆抗体CHIR-5.9和CHIR-12.12以外，实施本发明方法所用的其它抗体包括，但不限于以下抗体：(1)命名为131.2F8.5.9(本文称为细胞系5.9)和153.8E2.D10.D6.12.12(本文称为细胞系12.12)的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体，分别以专利保藏号PTA-5542和PTA-5543由ATCC保藏；(2)含有选自SEQ IDNO：2所示、SEQ ID NO：4所示、SEQ ID NO：5所示氨基酸序列、同时含有SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：4所示，与同时含有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的单克隆抗体；(3)含有选自SEQ ID NO：6所示、SEQ ID NO：7所示、SEQID NO：8所示氨基酸序列、同时含有SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示，与同时含有SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的单克隆抗体；(4)具有由含有选自SEQ ID NO：1所示、SEQ ID NO：3所示、同时含有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的核酸分子编码的氨基酸序列的单克隆抗体；(5)能结合杂交瘤细胞系5.9或12.12产生的单克隆抗体所能结合的表位的单克隆抗体；(6)能结合含有SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12所示氨基酸序列的残基82-87的表位的单克隆抗体；(7)在竞争性结合试验中能与单克隆抗体CHIR-5.9或CHIR-12.12竞争的单克隆抗体；和(8)是CHIR-12.12或CHIR-5.9单克隆抗体的或上述(1)-(7)项所述单克隆抗体的抗原结合片段的单克隆抗体，所述片段保留了特异性结合人CD40抗原的能力。本领域的技术人员知道适用于本文所公开方法的拮抗性抗-CD40抗体和这些抗体的抗原结合片段包括使用本领域已知和下文所述方法重组产生的拮抗性抗-CD40抗体和它们的抗原结合片段，所述抗体包括，例如重组产生的单克隆抗体CHIR-5.9和CHIR-12.12。
制备抗-CD40抗体
用于本发明的拮抗性抗-CD40抗体可用本领域技术人员已知的任何方法制备。可通过常规方法制备多克隆血清。通常先用含有CD40抗原的溶液免疫合适的动物，优选小鼠、大鼠、家兔或山羊。由于可得到的血清体积和可得到的标记的抗-家兔和抗-山羊抗体，优选用家兔和山羊制备多克隆血清。
可在转基因动物，优选携带人免疫球蛋白基因座的小鼠中制备多克隆血清。在一优选的实施方案中，表达CD40的SF9细胞用作免疫原。也可用盐水，优选用完全弗氏佐剂混合或乳化含有抗原的溶液，胃肠外(通常是皮下或肌肉内)注射该混合物或乳剂来免疫动物。每次注射50-200μg剂量一般足够。通常在2-6周后注射用盐水配制，优选用不完全弗氏佐剂配制的蛋白质一次或多次来加强免疫。或者可用本领域已知的方法通过体外免疫产生抗体，就本发明目的而言体外与体内免疫等效。将免疫动物的血液放入玻璃或塑料容器中25℃孵育该血液1小时，然后于4℃孵育2-18小时获得多克隆抗血清。离心(例如，1,000g×10分钟)回收血清。每次放血可从家兔获得约20-50ml血清。
Sf9(草地贪夜蛾(Spodoptera fruhiperda))细胞的制备方法公开于纳入本文作为参考的美国专利号6,004,552。简言之，将编码人CD40的序列用转移载体重组入杆状病毒。将该质粒与野生型杆状病毒DNA共同转染入Sf9细胞。鉴定重组杆状病毒感染的Sf9细胞并克隆纯化。
优选的抗体性质上是单克隆抗体。“单克隆抗体”指得自基本上同质的抗体群的抗体，即除了存在极少量天然发生的突变以外，构成该群的每个抗体均相同。该术语不受限于抗体的种类或来源。该术语包括完整的免疫球蛋白及其片段，例如Fab、F(ab′)2、Fv和保留抗体结合功能的其它片段。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原性位点，即本发明的CD40细胞表面抗原。此外，与常包含针对不同抗原决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相反，每种单克隆抗体只针对单一抗原决定簇。修饰语“单克隆”表示得自基本上同质抗体群的抗体的特性，不可理解为需要通过任何特定的方法来产生抗体。例如，本发明所用的单克隆抗体可通过Kohler等，(1975)Nature 256：495首次描述的杂交瘤方法或重组DNA方法制备(参见，例如美国专利号4,816,567)。“单克隆抗体”也可用，例如Clackson等，(1991)Nature 352：624-628；Marks等，(1991)J.Mol.Biol.222：581-597；和美国专利号5,514,548所述技术自噬菌体抗体文库分离得到。
“表位”指可诱导抗体产生并与该抗体结合的抗原分子中的一部分。表位可含有线形氨基酸残基(即，该表位内的残基以线性方式一个接一个顺序排列)，非线性氨基酸残基(本文称为“非线性表位”；这些表位不依次顺序排列)或线性与非线性氨基酸残基。
本文使用的术语“CD40-抗原表位”指能与本发明的抗-CD40单克隆抗体发生免疫反应(除CD40抗原自身外)的三维分子结构(线性或构型结构)。CD40-抗原表位包括蛋白质、蛋白质片段、肽、碳水化合物、脂质和其它分子，但就本发明的目的而言，最常用蛋白质、短的寡肽、寡肽模拟物(即，能模拟CD40抗原的抗体结合性能的有机化合物)或它们的组合。PCT申请US 91/04282描述了合适的寡肽模拟物。
可使用Kohler等，(1975)Nature 256：495-496所述方法或其改进形式制备单克隆抗体。通常用含有抗原的溶液免疫小鼠。可通过用盐水，优选完全弗氏佐剂混合或乳化含有抗原的溶液，胃肠外注射混合物或乳剂来免疫小鼠。可用本领域已知的任何免疫方法来获得本发明的单克隆抗体。免疫动物后，取出脾脏(任选取出几个大的淋巴结)解离为单细胞。将脾细胞悬液加入到包被有感兴趣抗原的板或孔中来筛选脾细胞。表达抗原特异性的膜结合免疫球蛋白的B细胞与板结合不会被洗掉。然后诱导得到的B细胞或所有解离的脾细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤并培养于选择性培养基中。接种得到的细胞的连续稀释液，测定产生的能特异性结合感兴趣抗原的(和不结合无关抗原的)抗体。然后将分泌单克隆抗体(mAb)的所选出的杂交瘤体外(例如，在组织培养瓶或中空纤维反应器中)或体内(作为小鼠的腹水)培养。
当采用重组DNA方法制备本发明的拮抗性抗-CD40抗体时，不难用常规方法(例如，用能特异性结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)分离并测序编码单克隆抗体的DNA。本文所述的杂交瘤细胞是这种DNA的优选来源。一旦分离后，可将该DNA置于表达载体中，然后将载体转染入不产生免疫球蛋白的宿主细胞，例如大肠杆菌、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞中从而在该重组宿主细胞中合成单克隆抗体。在细菌中重组表达编码抗体的DNA的综述性文章包括Skerra等，(1993)Curr.Opinion in Immunol.5：256和Phickthun(1992)Immunol.Revs.130：151。如引为参考的美国专利号5,545,403；5,545,405和5,998,144所公开的，作为使用杂交瘤的替代方法，可在细胞系，例如CHO细胞系中制备抗体。简言之，用能表达轻链和重链的载体分别转染该细胞系。通过在分开的载体上转染两种蛋白质，可制备嵌合抗体。另一优点是可产生正确糖基化的抗体。
在一些实施方案中，用GS基因表达系统(Lonza Biologics，Portsmouth，NewHampshire)在CHO细胞中制备拮抗性抗-CD40抗体，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9抗体或其抗原结合片段，所述表达系统利用谷氨酰胺合成酶作为标记。也参见美国专利号5,122,464；5,591,639；5,658,759；5,770,359；5,827,739；5,879,936；5,891,693；和5,981,216；其内容全文纳入本文作为参考。
CD40的单克隆抗体是本领域已知的。参见，例如以下文献中有关B-细胞抗原的章节，McMichael编，(1987；1989)《白细胞分型III和IV》(Leukocyte TypingIII and IV)(牛津大学出版社，纽约)；美国专利号5,674,492；5,874,082；5,677,165；6,056,959；WO00/63395；国际公布号WO02/28905和WO02/28904；Gordon等，(1988)J.Immunol.140：1425；Valle等，(1989)Eur.J.Immunol.19：1463；Clark等，(1986)PNAS 83：4494；Paulie等，(1989)J.Immunol.142：590；Gordon等，(1987)Eur.JImmunol 17：1535；Jabara等，(1990)J.Exp.Med.172：1861；Zhang等，(1991)J.Immunol.146：1836；Gascan等，(1991)J.Immunol.147：8；Banchereau等，(1991)Clin.Immunol.Spectrunt 3：8；和Banchereau等，(1991)Science 251：70；所有文献纳入本文作为参考。本发明特别感兴趣的是本文公开的与上述单克隆抗体CHIR-5.9和CHIR-12.12具有相同结合特性的拮抗性抗-CD40抗体。
此外，本文使用的术语“抗-CD40抗体”包括嵌合性抗-CD40抗体；用于本发明方法的这种嵌合性抗-CD40抗体具有本文所述CHIR-5.9和CHIR-12.12单克隆抗体的结合特性。“嵌合”抗体指最好用重组脱氧核糖核酸技术衍生的含有人(包括免疫学上相关种类，例如黑猩猩)和非人组分的抗体。Rituxan
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是具有鼠可变区和人恒定区的嵌合性抗体的例子。出于本发明的目的，嵌合抗体的恒定区最优选基本上与天然人抗体恒定区相同；嵌合抗体的可变区最优选衍生自非人来源具有所需的对CD40细胞表面抗原的抗原特异性。非人来源是可用于产生针对人CD40细胞表面抗原或含有人CD40细胞表面抗原物质的抗体的任何脊椎动物来源。这种非人来源包括，但不限于：啮齿类(例如，家兔、大鼠、小鼠等；参见，例如，引作参考的美国专利号4,816,567)和非人灵长类(例如，古猴(Old World Monkey)，类人猿等；例如引作参考的美国专利号5,750,105和5,756,096)。短语“免疫学活性”在本文中用于嵌合性抗-CD40抗体时，指能结合人CD40的嵌合抗体。
人源化抗-CD40抗体代表适用于本发明方法的其它抗-CD40抗体。“人源化”指含有衍生自非人免疫球蛋白序列的最少序列的抗-CD40抗体形式。就大部分而言，人源化抗体是指其中受者的超变区残基(也称为互补决定区或CDR)被非人种类(供体抗体)，例如小鼠、大鼠、家兔或非人灵长类的超变区残基取代的，具有所需特异性、亲和力或能力的人免疫球蛋白(受者抗体)。术语“互补决定区”指共同确定了天然免疫球蛋白结合位点的天然Fv区的结合亲和力和特异性的氨基酸序列。参见，例如Chothia等，(1987)J.Mol.Biol.196：901-917；Kabat等，(1991)美国健康与人类服务部(U.S.Dept.of Health and Human Services)，NIH公布号91-3242)。短语“恒定区”指抗体分子中赋予效应物功能的一部分。在以前产生用于治疗人类疾病的无免疫原性抗体的研究中，小鼠恒定区被人恒定区取代。所述人源化抗体的恒定区衍生自人免疫球蛋白。然而，这些人源化抗体仍能在人中引发不良且可能有害的免疫应答并且丧失了亲和力。用于本发明方法的人源化抗-CD40抗体具有类似于本文所述CHIR-5.9和CHIR-12.12单克隆抗体的结合特性。
基本上可根据Winter及其同事(Jones等，(1986)Nature 321：522-525；Riechmann等，(1988)Nature 332：323-327；Verhoeyen等，(1988)Science 239：1534-1536)的方法，通过用啮齿类或突变型啮齿类CDR或CDR序列取代人抗体的相应序列来进行人源化。也参见纳入本文作为参考的美国专利号5,225,539；5,585,089；5,693,761；5,693,762和5,859,205。在一些例子中，人免疫球蛋白的一个或多个可变区的框架区内的残基为对应的非人残基取代(参见，例如美国专利号5,585,089；5,693,761；5,693,762和6,180,370)。此外，人源化抗体可含有受者抗体中或供体抗体中每发现的残基。制备这些修饰来进一步精制抗体性能(例如，获得所需的亲和力)。总体上，人源化抗体基本上含有所有可变区、至少一个，通常是两个可变区，其中所有或基本上所有的超变区是对应的非人免疫球蛋白序列和所有或基本上所有的框架区域是人免疫球蛋白序列。人源化抗体也任选包含免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。更多的细节见引作参考的Jones等，(1986)Nature 331：522-525；Riechmann等，(1988)Nature 332：323-329；和Presta(1992)Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596。因此，这种“人源化”抗体可包括其中基本上小于完整的人可变区(的可变区)被非人种类的相应序列取代的抗体。实际上，人源化抗体通常是其中一些CDR残基和可能的一些框架区残基被啮齿类抗体中相类似位点的残基取代的人抗体。参见，例如美国专利号5,225,539；5,585,089；5,693,761；5,693,762；5,859,205。也参见美国专利号6,180,370，和国际公布号WO01/27160，其中公开了人源化抗体和产生对预定抗原亲和力提高的人源化抗体的技术。
术语抗-CD40抗体也包括非人哺乳动物宿主，更具体说是特征为具有失活的内源性免疫球蛋白(Ig)基因座的转基因小鼠产生的异种或修饰的抗-CD40抗体。在这种转基因动物中，使表达宿主免疫球蛋白轻链和重链的活性内源性基因失去功能而用类似的人免疫球蛋白基因座取代。这些转基因动物产生基本上没有宿主轻或重链免疫球蛋白亚基的人抗体。参见，例如纳入本文作为参考的美国专利号5,877,397和5,939,598。
抗CD40的完整人抗体优选通过免疫转基因小鼠获得。这种小鼠可用XenoMouse技术(Abgenix；Fremont，California)获得其描述见纳入本文作为参考的美国专利号6,075,181；6,091,001和6,114,598。为制备本文公开的抗体，用表达人CD40的Sf9细胞免疫具有人IgG1重链基因座和人K轻链基因座的转基因小鼠。小鼠也可以是其它同种型的转基因动物。本发明方法所用的完整人抗体的特征在于其结合特性与本文公开的CHIR-5.9和CHIR-12.12单克隆抗体的相似。
只要抗-CD40抗体的片段保留了所需的全长抗体的亲和力，它们就适用于本发明的方法。因此，抗-CD40抗体片段将保留结合CD40B细胞表面抗原的能力。这种片段的特征在于其性能与相应的全长拮抗性抗-CD40抗体相似，即这种片段能特异性结合表达于人细胞表面上的人CD40抗原，并且当与表达人CD40的细胞上的CD40抗原结合时无明显的激动活性而显示拮抗活性。本文称这种片段称为“抗原结合”片段。
抗体的合适的抗原结合片段含有全长抗体的一部分，通常是其抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括，但不限于：Fab、F(ab′)2、Fv片段和单链抗体片段。“Fab”指由轻链或重链部分组成的免疫球蛋白的单价抗原结合片段。F(ab′)2指含有两条轻链和两条重链部分的免疫球蛋白的二价抗原结合片段。“单链Fv”或“sFv”抗体片段指含有抗体的VH和VL结构域的片段，其中这些结构域以一条多肽链存在。参见，例如纳入本文作为参考的美国专利号4,946,778；5,260,203；5,455,030和5,856,456。Fv多肽通常在VH和VL结构域之间还含有多肽接头可使sFv形成抗原结合所需的结构。sFv的综述见Pluckthun(1994)《单克隆抗体的药理学》(The Pharmacology of Monoclonal Antibodies)，第113卷，Rosenburg和Moore编，(Springer-Verlag，New York)，269-315页。如下文所述，本文公开的拮抗性抗-CD40抗体的抗原结合片段与细胞毒素偶连以发挥杀伤靶细胞的作用。
可采用描述于，例如McCafferty等，(1990)Nature 348：552-554(1990)和美国专利号5,514,548的技术自噬菌体抗体文库分离抗体或抗体片段。Clackson等，(1991)Nature 352：624-628和Marks等，(1991)J.Mol.Biol.222：581-597分别描述了利用噬菌体文库分离小鼠和人抗体。以后的出版物描述了可用于构建非常大噬菌体文库的链改组(Marks等，(1992)Bio/Technology 10：779-783)以及组合感染和体内重组方法来产生高亲和力(nM范围)人抗体(Waterhouse等，(1993)Nucleic.Acids Res.21：2265-2266)。因此，这些技术是分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方法。
已开发了各种技术来制备抗体片段。这些片段通常经完整抗体的蛋白水解获得(参见，例如Morimoto等，(1992)Journal of Biochemical and Biophysical Methods24：107-117(1992)和Brennan等，(1985)Science 229：81)。然而，现在这些片段可通过重组宿主细胞直接制备。例如，可自上述噬菌体文库分离抗体片段。或者，可从大肠杆菌中直接回收Fab′-SH片段并化学偶联形成F(ab′)2片段(Carter等，(1992)Bio/Technology 10：163-167)。根据另一方法，可从重组宿主细胞培养物直接分离F(ab′)2片段。其它制备抗体片段的技术是技术人员熟知的。
本发明方法所用的拮抗性抗-CD40抗体包括本文公开的CHIR-5.9和CHIR-12.12单克隆抗体以及与该抗体不同但保留CDR的抗体；具有一个或多个氨基酸添加、删除或取代的抗体，其中可通过抑制B细胞增殖和/或分化来测定其拮抗活性。本发明也包括脱免疫的(de-immunized)拮抗性抗-CD40抗体，该抗体可按纳入本文作为参考的国际公布号WO 98/52976和WO 0034317所述制备。本发明的拮抗性抗-CD40抗体内的残基经该方式修饰后使得该抗体对人体无免疫原性或免疫原性降低，但保留它们对表达CD40的人细胞的拮抗活性，其中所述活性可通过本文其它部分所述试验测定。本发明权利要求的范围也包括含有本发明拮抗性抗-CD40抗体或其片段的融合蛋白，所述融合蛋白可如本领域所知的通过合成或从相应的多核苷酸载体表达。参考下述抗体偶联描述了这种融合蛋白。
本发明的抗体可具有用例如纳入本文作为参考的专利公布号EP 0983303A1、WO 00/34317和WO 98/52976所述方法产生的序列变异。例如，已证明CDR中的序列可导致抗体与II类MHC分子结合并引发不良的辅助T细胞应答。保守取代可使该抗体保留结合活性而丧失引发不良T细胞应答的能力。可用本领域已知的，例如本文其它部分所述的方法进行这种保守或非保守取代，得到的抗体属于本发明的范围内。可用本文所述方法常规测试变体抗体拮抗活性、亲和力和特异性。
实施本发明所用的抗-CD40抗体可具有一种或多种作用机理。如果上述方法之一或其它本文未公开的方法制备的抗体在体外和/或体内拥有至少一种以下的生物活性，则属于本发明范围内：抑制经T细胞刺激的正常人外周B细胞分泌免疫球蛋白；抑制表达CD40L的细胞或可溶CD40配体(sCD40L)激活的正常人外周B细胞存活和/或增殖；抑制Jurkat T细胞激或的正常人外周B细胞存活和/或增殖；抑制sCD40L或固态CD40L激活的细胞中“存活的”抗-凋亡胞内信号；和抑制细胞结合sCD40L或固态CD40L后CD40信号转导；携带CD40的靶细胞或携带CD40的同源配体的细胞(包括但不限于T细胞和B细胞)的消除、无反应性和/或耐受诱导；诱导CD4+CD25+调节性T细胞的扩增或激活(参见，例如“通过CD40-CD40L干扰发生的供体同种抗原特异性组织排异”(donor alloantigen-specific tissuerejection via CD40-CD40L interference)，van Maurik等，(2002)J Immunol.169：401-5404)，通过各种机理产生的细胞毒性(包括但不限于依赖抗体的细胞介导细胞毒性(ADCC)、依赖补体的细胞毒性(CDC)、下调靶细胞的增殖和/或凋亡)，调节靶细胞的细胞因子分泌和/或细胞表面分子的表达，和它们的组合。测定这种生物活性的试验可如本文和以下待批临时专利申请的描述进行：2003年11月4日、2003年11月26日和2004年4月27日提交的名为“拮抗性抗-CD40单克隆抗体及它们的使用方法”的待批临时申请，以及转让的美国专利申请号60/517,337(代理人审理号PP20107.001(035784/258442))、60/525,579(代理人审理号PP20107.002(035784/271525))和60/565,710(代理人审理号PP20107.003(035784/277214))，每篇文献的内容全文纳入本文作为参考。也参见纳入本文作为参考的以下文献中所述的试验：Schultze等，(1998)，Proc.Natl.Sci.USA 92：8200-8204；Denton等，(1998)，Pediatr.Transplant.2：6-15；Evans等，(2000)，J.Immunol.164：688-697；Noelle等，(1998)，Agents Actions Suppl.49：17-22；Lederman等，(1996)，Curr.Opin.Hematol.3：77-86；Coligan等，(1991)，《最新免疫学方法》(Current Protocols in Immunology)13：12；Kwekkeboom等，(1993)，Immunology 79：439-444和美国专利号5,674,492和5,847,082。
可检测本文鉴定的CD40-抗原表位特异性拮抗性抗-CD40抗体的代表性试验是“竞争性结合试验”。竞争性结合试验是通过抑制标记的已知配体与其特异性抗体的结合能力来检测和定量未知物的血清学试验。这也称为竞争性抑制试验。在代表性的竞争性结合试验中，标记的CD40多肽可被样品中的候选抗体沉淀，例如采用与用本发明单克隆抗体的一种或多种表位所产生的单克隆抗体组合。可通过筛选用CD40蛋白或蛋白片段(含有感兴趣CD40蛋白的特定表位)制备的一系列抗体来鉴定能与感兴趣表位特异性反应的抗-CD40抗体。例如，就人CD40而言，感兴趣的表位包括含有以下同种型的线性和/或非线性氨基酸残基的表位：如图4B所示的序列(SEQ ID NO：10)，由图4A所示序列(SEQ ID NO：9；也参见GenBank登录号NM152854)编码的人CD40的短同种型(见GenBank登录号NP690593)，或如图4D所示的序列(SEQ ID NO：12)，由图4C所示序列(SEQ ID NO：11；参见GenBank登录号X60592和NM-001250)编码的人CD40的长同种型(参见GenBank登录号CAA43045和NP-001241)。或者，用以前鉴定的合适的拮抗性抗-CD40抗体进行的竞争性结合试验可用于选择与以前鉴定的抗体相当的单克隆抗体。
这种免疫试验采用的抗体可以是标记的或未标记的。未标记的抗体可用于凝集，采用各种广泛标记物的标记抗体可用于各种各样的试验。通过使可检测物质与抗体连接有助于检测抗-CD40抗体与感兴趣表位之间形成的抗体-抗原复合物。合适的检测方法包括采用例如放射性核素、酶、辅酶、荧光剂、化学发光剂、色原、酶底物或辅助因子、酶抑制剂、辅基复合物、自由基、颗粒、染料等。合适的酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的例子包括链霉抗生物素蛋白/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光物质的例子包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质的例子是鲁米诺；生物发光物质的例子包括萤光素酶、萤光素和水母蛋白；合适的放射性物质的例子包括125I、131I、35S或3H。这种标记的试剂可用于各种熟知的试验，例如放射性免疫试验，酶免疫试验如ELISA、荧光免疫试验等。参见，例如美国专利号3,766,162；3,791,932；3,817,837和4,233,402。
任何前述的拮抗性抗-CD40抗体或它们的片段可在用于本发明方法前进行偶联。制备偶联抗体的方法是本领域已知的。因此，可采用间接标记或间接标记方法来标记抗-CD40抗体。合适的标记物包括荧光基团、生色团、放射性原子(特别是32P和125I)、电子密集试剂(electron-dense reagent)、酶和具有特异性结合伴侣的配体。一般通过酶的活性来检测酶。例如，常通过辣根过氧化物酶将3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)转变为可用分光光度计定量的蓝色色素的能力来检测此酶。“特异性结合伴侣”指能以高特异性结合配体分子的蛋白质，例如抗原和其特异性单克隆抗体。其它特异性结合伴侣包括生物素和亲和素或链霉抗生物素蛋白、IgG和蛋白A、本领域已知的许多受体-配体对。因为同一标记物可以几种不同模式使用，应理解以上描述不意味着将各种标记物归为截然不同的类型。例如，HRP可用作酶或mAb的抗原。此外，可组合各种标记用于所需的作用。例如，mAb和亲和素在实施本发明中也需要标记：因此，可用生物素标记mAb，用标记有125I的亲和素或用标记有HRP的抗-生物素mAb检测其存在。其它组合与可能性是本领域普通技术人员不难理解的，并认为是本发明范围内的等价物。
此外，抗体(或其片段)可与治疗性部分，例如治疗性药物偶联。药物部分可以是拥有所需生物活性的蛋白质或多肽。这种蛋白质可包括，例如CTLA4-Ig的蛋白质、抗体或任何其它蛋白质；或是生物应答调节剂，如淋巴因子、肿瘤坏死因子、干扰素-α、干扰素-β、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤溶酶原激活剂、BLyS(B淋巴细胞刺激剂)、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其它生长因子。
将这种治疗性部分偶联于抗体的技术是熟知的。参见，例如Arnon等，(1985)，《单克隆抗体和癌症治疗》(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)，Reisfeld等编，(Alan R.Liss，Inc.)，第243-256页；Hellstrom等，(1987)，《受控药物递送》(Controlled Drug Delivery)，Robinson等编，(第二版；Marcel Dekker，Inc.)，第623-653页；Thorpe，(1985)，《单克隆抗体’84：生物和临床应用》(Monoclonal Antibodies′84：Biological and Clinical Applications)，Pinchera等编，第475-506页，(Editrice Kurtis，Milano，Italy，1985)；《癌症诊断和治疗的单克隆抗体》(Monoclonal Antibodies forCancer Detection and Therapy)，Baldwin等编，(Academic Press，New York，1985)，第303-316页；和Thorpe等，(1982)Immunol.Rev.62：119-158。
或者，抗体可与第二抗体偶联形成如美国专利号4,676,980所述的抗体杂合偶联物。此外，可在标记物和本发明的抗体之间使用接头(参见美国专利号4,831,175)。抗体或其抗原结合片段可直接或间接标记(美国专利号5,595,721)。治疗方案可包括同时或顺序给予偶联和非偶联抗体联合治疗(WO 00/52031和WO 00/52473)。
拮抗性抗-CD40抗体的变体
拮抗性抗-CD40抗体的合适的生物活性变体可用于本发明的方法。这种变体保留了亲代拮抗性抗-CD40抗体所需的结合特性。制备抗体变体的方法一般是本领域可得的。
例如，拮抗性抗-CD40抗体，如本文所述的CHIR-5.9或CHIR-12.12单克隆抗体的氨基酸序列变体可通过在克隆的编码感兴趣抗体的DNA序列中产生突变来制备。诱变与核苷酸序列改变的方法是本领域熟知的。参见，例如纳入本文作为参考的Walker和Gaastra编，(1983)，《分子生物学技术》(Techniques in MolecularBiology)，(MacMillan Publishing Company，New York)；Kunkel，(1985)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492；Kunkel等，(1987)Methods Enzymol.154：367-382；Sambrook等，(1989)，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：ALaboratory Manual)，(冷泉港，纽约)；美国专利号4,873,192；和本文引用的参考文献。关于适当的氨基酸取代而不影响感兴趣多肽生物活性的指南可见纳入本文作为参考的Dayhoff等，(1978)《蛋白质序列和结构图》(Atlas of Protein Sequence andStructure)，(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.)的模型。优选保守性取代，例如用具有相似性能的另一氨基酸取代一个氨基酸。保守性取代的例子包括，但不限于：GlyAla、Val
Figure 048374894_6
IleLeu、Asp
Figure 048374894_8
Glu、LysArg、AsnGln和PheTrpTyr。
在构建感兴趣的拮抗性抗-CD40抗体多肽的变体过程中，进行修饰使变体继续具有所需的活性，即相似的结合亲和力并能特异性结合表达于人细胞表面的人CD40抗原，当与表达CD40的人细胞上的CD40抗原结合时无明显的激动活性却显示拮抗活性。在编码变体多肽的DNA中进行的任何突变显然无须将序列置于读框外并且优选不产生可能产生二级mRNA结构的互补区。参见欧洲专利公布号75,444。
此外，可用许多方法使拮抗性抗-CD40抗体的恒定区发生突变而改变其效应物功能。例如，参见公开了优化抗体与Fc受体结合的Fc突变的美国专利号6,737,056B1和美国专利申请公布号2004/0132101A1。
拮抗性抗-CD40参比抗体的变体的氨基酸序列优选与该拮抗性抗-CD40参比抗体分子，例如本文所述的CHIR-5.9或CH1R-12.12单克隆抗体的氨基酸序列，或与该参比抗体分子的较短部分具有至少70％或75％序列相同性，优选至少80％或85％序列相同性，更优选至少90％、91％、92％、93％、94％或95％序列相同性。这些分子更优选具有至少96％、97％、98％或99％序列相同性。出于本发明的目的，可用Smith-Waterman同源性检索算法以均匀空格检索测定序列相同性百分比，检索用的参数为空格开放罚分12、空格延伸罚分2和BLOSUM矩阵62。Smith-Waterman同源性检索算法的说明见Smith和Waterman，(1981)，Adv.Appl.Math.2：482-489。例如，变体可与参比抗-CD40抗体有不到1-15个氨基酸残基、不到1-10个氨基酸残基，如6-10，不到5个、不到4个、3个、2个、甚至1个氨基酸残基不同。
就两条氨基酸序列的最佳比对而言，与参比氨基酸序列相比，变体氨基酸序列的毗连区段可具有额外的氨基酸残基或删除的氨基酸残基。用于和参比氨基酸序列比较的毗连区段包括至少20个毗连氨基酸残基，可以是30、40、50或更多个氨基酸残基。可对保守残基取代或空格相关的序列相同源性进行校正(参见Smith-Waterman同源性检索算法)。
能特异性结合CD40并保留拮抗活性的多肽的精确化学结构，特别是当与恶性B细胞上的CD40抗原结合时取决于许多因素。由于分子中存在可电离的氨基和羧基，可获得酸性盐或碱性盐，或中性盐形式的特定多肽。在合适的环境中可保留它们的生物活性的所有这种制剂包括在本文所用的拮抗性抗-CD40抗体的定义中。此外，可通过用糖组分衍生(糖基化)或通过其它添加分子，例如脂质、磷酸、乙酰基等来增加该多肽的一级氨基酸序列。也可通过和糖偶联来增加该多肽的一级氨基酸序列。这种增加在某些方面可通过生产性宿主的翻译后加工系统来实现；可在体外引入其它这种修饰。在任何情况中，只要抗-CD40抗体的拮抗性能未受破坏，这种修饰就包括在本文所用的抗-CD40抗体的定义中。在各种试验中，预计这种修饰可通过提高或降低该多肽的活性从性质上或数量上影响此活性。此外，该链中的单个氨基酸残基可通过氧化、还原或其它衍生方法来修饰，可切割该多肽得到保留了活性的片段。这种不破坏拮抗活性的改变不将该多肽序列排除在本文所用的感兴趣的抗-CD40抗体的定义之外。
本领域为多肽变体的制备和使用提供了基本指南。在制备抗-CD40抗体变体的过程中，本领域的技术人员不难确定对天然蛋白质的核苷酸或氨基酸序列的哪种修饰将导致变体适合用作本发明方法所用的药物组合物中的治疗性活性组分。
采用本发明的拮抗性抗-CD40抗体的治疗方法
本发明的方法涉及用拮抗性抗-CD40抗体来治疗自身免疫疾病和/或炎性疾病患者，或者易患自身免疫疾病和/或炎性疾病的对象(即，患者)，所述疾病和/或炎症由表达CD40抗原的细胞上的CD40配体介导的CD40信号所介导。术语“表达CD40的细胞”指表达CD40抗原的细胞。检测CD40在细胞中表达的方法是本领域熟知的，包括但不限于：PCR技术、免疫组织化学方法、流式细胞术、Western印迹等。
本发明的方法在治疗炎性和/或自身免疫疾病中特别有用，其中包括CD40L介导的CD40刺激。本发明的组合物可以预防性或治疗性或它们的组合给药。
炎性疾病的特征为炎症和组织破坏，或它们的组合作用。“炎性疾病”包括免疫介导的炎性过程，其中引发过程或免疫应答的靶涉及非自身抗原，包括同种异体抗原、异种抗原、病毒抗原、细菌抗原、未知抗原或过敏原。
此外，出于本发明的目的，术语“炎性疾病”包括“自身免疫疾病”。本文使用的术语“自身免疫”一般理解为包括涉及“自身”抗原的免疫介导的炎性过程。在自身免疫疾病中，自身抗原引发了宿主的免疫应答。
本发明也包括治疗与组织移植排异相关的炎症。“移植排异”或“移植物排异”指宿主产生的抗移植物，包括HLA抗原、血型抗原等的免疫应答。
本发明也可用于治疗移植物抗宿主病，例如与骨髓移植有关的疾病。在这种移植物抗宿主病中，供体骨髓含有淋巴细胞和将成熟成为淋巴细胞的细胞。供体的淋巴细胞将受者的抗原认作非自身抗原并产生炎性免疫应答。因此，本文所用的“移植物抗宿主病”或“移植物抗宿主反应”指其中供体淋巴细胞与宿主抗原反应的T细胞介导的免疫应答。
本文所述的拮抗性抗-CD40抗体和它们的抗原结合片段可用于本发明的方法来治疗自身免疫和/或炎性病症，包括但不限于：全身性红斑狼疮(SLE)、盘状狼疮、狼疮性肾炎，结节病，炎性关节炎，包括，青少年关节炎、类风湿性关节炎、银屑病关节炎、莱特尔综合征、强直性脊柱炎和痛风性关节炎，器官或组织移植排异、超急性、急性或慢性的排异和/或移植物抗宿主病、多发性硬化、高IgE综合征、结节性多动脉炎、原发性胆汁性肝硬化、炎性肠病、克罗恩病、腹腔疾病(谷蛋白敏感性肠病)、自身免疫肝炎、恶性贫血、自身免疫溶血性贫血、银屑病、硬皮病、重症肌无力、自身免疫血小板减少性紫癜、自身免疫甲状腺炎、格雷夫斯病、桥本甲状腺炎、免疫复合物病、慢性疲劳免疫功能失调综合征(CFIDS)、多肌炎和皮肌炎、冷球蛋白血症、血栓溶解、心肌病、寻常型天疱疮、肺间质纤维化、I型和II型糖尿病、1、2、3和4型迟发型超敏反应、过敏或过敏病症、对治疗性蛋白质的不良/不想要的免疫应答(参见，例如美国专利申请号US 2002/0119151和Koren等，(2002)Curr.Pharm.Biotechnol.3：349-60)、哮喘、Churg-Strauss综合征(过敏性肉芽肿病)、特异性皮炎、过敏性和刺激性接触性皮炎、荨麻疹、IgE-介导的过敏症、动脉粥样硬化症、脉管炎、先天性炎性肌病、溶血性疾病、阿尔茨海默病、慢性炎性脱髓鞘多发神经病变等。在一些其它实施方案中，本发明的拮抗性抗-CD40抗体在治疗肺部炎症中有用，包括但不限于：肺移植物排异、哮喘、结节病、肺气肿、囊性纤维变性、特发性肺纤维变性、慢性支气管炎、过敏性鼻炎和肺部的过敏性疾病，例如超敏性肺炎、嗜酸细胞性肺炎、由于骨髓和/或肺移植或其它原因导致的闭塞性支气管炎、移植动脉粥样硬化/移植静脉硬化、以及因胶原、血管和自身免疫疾病，如类风湿性关节炎和红斑狼疮导致的肺纤维化。
本文将“治疗”定义为将拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段应用于或给予对象，或将拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段应用于或给予对象的分离组织或细胞系，所述对象患有自身免疫疾病和/或炎性疾病，与自身免疫疾病和/或炎性疾病相关的症状，或易于患自身免疫疾病和/或炎性疾病，给药的目的是为治愈、治疗、缓解、减轻、改变、补救、改善、提高或影响自身免疫疾病和/或炎性疾病、自身免疫疾病和/或炎性疾病相关的任何症状、或患自身免疫疾病和/或炎性疾病的易感性。“治疗”也指将含有拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的药物组合物应用于或给予对象，或将含有拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的药物组合物应用于或给予对象的分离的组织或细胞系，所述对象患有自身免疫疾病和/或炎性疾病，与自身免疫疾病和/或炎性疾病相关的症状，或易于患自身免疫疾病和/或炎性疾病，给药的目的是为治愈、治疗、缓解、减轻、改变、补救、改善、提高或影响自身免疫疾病和/或炎性疾病、自身免疫疾病和/或炎性疾病相关的任何症状、或患自身免疫疾病和/或炎性疾病的易感性。
“抗-炎症活性”指降低或防止炎症。用至少一种本文他处定义的拮抗性抗-CD40抗体(或其抗原结合片段)治疗可导致治疗自身免疫疾病和/或炎性疾病相关的有益生理应答，所述疾病涉及表达CD40抗原的细胞。应该知道本发明方法可用于预防细胞表型，例如增殖、激活等的变化。
根据本发明的方法，可用至少一种本文他处所定义的拮抗性抗-CD40抗体(或其抗原结合片段)来促进治疗或预防自身免疫疾病和/或炎性疾病相关的阳性治疗性应答。自身免疫疾病和/或炎性疾病相关的“有益治疗性应答”指与这些抗体或它们的抗原结合片段抗炎活性相关的疾病改善，和/或疾病相关症状的改善。即，可观察到抗增殖作用、防止表达CD40的细胞的进一步增殖，降低炎性应答，包括但不限于减少炎性细胞因子、粘附分子、蛋白酶、免疫球蛋白(例如携带CD40的细胞是B细胞)等的分泌和它们的组合，抗炎性蛋白质产生增加，自身反应细胞数量减少、免疫耐受性增加、抑制自身反应细胞的存活率和/或表达CD40的细胞激或所介导的一种或多种症状减轻。这种有益的治疗应答不受给药途径的限制，可包括给予供体、供体组织(例如器官输注)、宿主和它们的任何组合等。
可利用以下筛选技术来评价临床应答：例如磁共振成像(MRI)扫描、x-射线照相成像、计算机化断层显像(CT)扫描、流式细胞术或荧光激活细胞分选(FACS)分析、组织学、总病理学和血液化学，包括但不限于用ELISA、RIA、层析等检测发生的变化。除了这些有益的治疗性应答以外，用拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的有益作用是治疗对象的疾病相关症状得以改善。
“治疗有效剂量或量”或“有效量”指给予的拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的量可导致自身免疫疾病和/或炎性疾病治疗相关的有益治疗性应答。在本发明的一些实施方案中，抗-CD40抗体或其片段的治疗有效量为约0.01mg/kg-40mg/kg、约0.01mg/kg-30mg/kg、约0.1mg/kg-30mg/kg、约1mg/kg-30mg/kg、约3mg/kg-30mg/kg、约3mg/kg-25mg/kg、约3mg/kg-20mg/kg、约5mg/kg-15mg/kg或约7mg/kg-12mg/kg。应该知道治疗方法可包括一次给予或多次给予治疗有效剂量的拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段。
本发明另一实施方案涉及拮抗性抗-CD40抗体可作为临床测试过程的一部分用于诊断性监测组织中的蛋白质水平，例如用于检测某给定治疗方案的效果。将抗体与可检测的物质偶联有助于检测。可检测物质的例子包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质和放射性物质。合适的酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的例子包括链霉抗生物素蛋白/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光物质的例子包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质的例子包括鲁米诺；生物发光物质的例子包括萤光素酶、萤光素和水母蛋白；合适的放射性物质的例子包括125I、131I、35S或3H。
拮抗性抗-CD40抗体与它们合适的抗原结合片段可与已知的治疗自身免疫和炎性疾病的疗法联用，所述疗法包括已知有用的、或已经使用或正在使用的治疗自身免疫和炎性疾病的任何疗法。这种疗法和治疗性药物包括，但不限于：外科或手术方法(例如，脾切除术、淋巴结切除术、甲状腺切除术、血浆去除术、白细胞去除术(leukophoresis)、细胞、组织或器官移植、肠手术(intestinal procedures)、器官灌注等)、放疗、例如类固醇治疗和非类固醇治疗、激素治疗、细胞因子治疗、使用皮肤药物(例如，用于治疗皮肤病症，如过敏、接触性皮炎和银屑病的局部药物)的治疗、免疫抑制治疗和其它抗炎性单克隆抗体治疗等。本文所述的拮抗性抗-CD40抗体或它们的抗原结合片段可以此方式与至少一种其它治疗联用，包括但不限于外科手术、器官灌注、放疗、类固醇治疗、非类固醇治疗、抗生素治疗、抗真菌治疗、激素治疗、细胞因子治疗、使用皮肤药物(例如，用于治疗皮肤病症，如过敏、接触性皮炎和银屑病的局部药物)的治疗、免疫抑制治疗和其它抗炎性单克隆抗体治疗、它们的组合等。因此，当该联合治疗包括组合给予拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段和给予另一种治疗性药物(例如类固醇)时，本发明的方法包括任一顺序共同给予或连续给予分开的制剂或单一药物制剂。
当本发明的方法包括联合治疗方案时，可同时进行这些治疗，即拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段同时给予或与其它治疗相同的时间范围内给予(即，同时进行治疗，但拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段不是在正好与其它疗法相同的时间给予)。或者，本发明的拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段也可在其它疗法之前或之后给予。可顺序给予不同的疗剂而不论受治疗的对象是否对第一疗程起反应从而降低了病情缓解或复发的可能性。
在本发明的一些实施方案中，本文所述的拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段与免疫抑制药物或抗炎性药物联合给予，其中抗体和治疗性药物可以任一顺序依次给予或同时给予(即，同时或在相同的时间范围内给予)。可与本发明的拮抗性抗-CD40抗体联合给予的合适的免疫抑制药物的例子包括，但不限于：氨甲喋呤、环磷酰胺、优青糖苷、瘤可宁、环孢菌素，例如气溶胶化的环孢菌素(参见，例如全文纳入本文作为参考的美国专利申请公布号US20020006901)、他利莫斯(FK506；ProGrafTM)、霉酚酸吗啉乙酯(mycophenolate mofetil)、依木兰(6-巯基嘌呤)、昔洛利莫斯(sirolimus)(雷帕霉素)、脱氧精胍啉(deoxyspergualin)、来氟米特(leflunomide)及其malononitriloamide类似物；和免疫抑制蛋白，例如抗-CTLA4抗体和Ig融合物、抗-B淋巴细胞刺激性抗体(例如，LYMPHOSTAT-BTM)和Ig融合物(BLyS-Ig)、抗-CD80抗体和依那西普(etanercept)(Enbrel
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)以及抗-T细胞抗体，如抗-CD3(OKT3)、抗-CD4等。合适的抗炎药物的例子包括，但不限于皮质类固醇，例如氯倍他索、鲁倍他索、氢化可的松、曲安西龙、倍他米松、fluocinole、醋酸氟轻松(fluocinonide)、强的松、氢化泼尼松、甲基泼尼松；非类固醇抗炎药物(NSAID)，例如柳氮磺胺吡啶、含有氨水杨酸的药物(称为5-ASA药物)、塞来昔布(celecoxib)、双氯酚酸、依托度酸、非诺洛芬、氟吡洛芬、布洛芬、酮基布洛芬、meclofamate、美洛昔康、萘丁美酮、萘普生、
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内嗪、吡罗昔康、罗非考昔(rofecoxib)、水杨酸盐、舒林酸和托美汀；抗炎性抗体，例如阿达木单抗(adalimumab)(HUMERA
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；TNF-α拮抗剂)和英利昔单抗(infliximab)(Remicade
Figure 048374894_16
；TNF-α拮抗剂)等。
移植排异和移植物抗宿主病可是超急性(体液)、急性(T细胞介导的)或慢性(病因未知)疾病或它们的组合。因此，在一些实施方案中，本发明的拮抗性抗-CD40抗体可用于防止和/或缓解排异和/或与组织的超急性、急性和/或慢性移植排异有关的症状，所述组织包括但不限于：肝、肾、胰、胰岛细胞、小肠、肺、心脏、角膜、皮肤、血管、骨骼、异源或自体骨髓等。移植组织可得自供体并移植入受者宿主，因此该移植方法包括将动物组织移植入人体(例如，异种移植)、将人的组织移植入另一个人(例如，同种异体移植)和/或将人身体一部分的组织移植入另一部分(例如，自体移植)。用本发明的抗体治疗也可减少移植后遗症，例如发烧、厌食、血液动力学异常、白细胞减少症、移植器官/组织的白细胞渗出以及机会感染。
在一些实施方案中，本发明的拮抗性抗-CD40抗体可单独使用或与免疫抑制药物组合联用来治疗和/或预防移植排异，例如超急性、急性和/或慢性移植排异和/或移植物抗宿主病。因此，在一些实施方案中，当本发明的拮抗性抗-CD40抗体用于治疗移植物排异时，这些抗体可与合适的免疫抑制药物联用，所述免疫抑制药物包括，但不限于：氨甲喋呤、环磷酰胺、优青糖苷、瘤可宁、环孢菌素，例如气溶胶化的环孢菌素(参见，例如全文纳入本文作为参考的美国专利申请公布号US20020006901)、他利莫斯(FK506；ProGrafTM)、霉酚酸吗啉乙酯、依木兰(6-巯基嘌呤)、昔洛利莫斯(sirolimus)(雷帕霉素)、脱氧精胍啉、来氟米特及其malononitriloamide类似物；和免疫抑制蛋白，例如抗-CTLA4抗体和Ig融合物、抗-B淋巴细胞刺激物抗体(例如，LYMPHOSTAT-BTM)和Ig融合物(BLyS-Ig)、抗-CD80抗体和依那西普(Enbrel
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)以及抗-T细胞抗体，例如抗-CD3(OKT3)、抗-CD4等。
同样，特别考虑了本发明的组合物和方法可与其它药物联用以进一步改善移植受者，例如接受肺移植的受者的症状和结果。因此，在一些实施方案中，本发明的拮抗性抗-CD40抗体可单独或与胃肠外和/或非胃肠外给药的环孢菌素联合用于治疗移植排异(例如，肺移植受者的超急性、急性和/或慢性排异或移植物抗宿主病)，所述环孢菌素包括，例如口服环孢菌素、可注射环孢菌素、气雾化(例如，吸入的)环孢菌素和它们的组合。在一些实施方案中，当该治疗的至少一种组分是气雾化环孢菌素时，可使用例如加压递送装置或喷雾器，吸入气溶胶形式的环孢菌素将环孢菌素递送入受者的肺部。环孢菌素可以干粉或湿粉形式给药。
在一些实施方案中，本发明的拮抗性抗-CD40抗体可单独使用或与免疫抑制药物联用来治疗和/或预防类风湿性关节炎。因此，在一些实施方案中，当本发明的拮抗性抗-CD40抗体用于治疗类风湿性关节炎时，该抗体可与合适的免疫抑制药物联用，所述免疫抑制药物包括但不限于：氨甲喋呤、环磷酰胺、优青糖苷、瘤可宁、环孢菌素、他利莫斯(FK506；ProGrafTM)、霉酚酸吗啉乙酯、依木兰(6-巯基嘌呤)、昔洛利莫斯(sirolimus)(雷帕霉素)、脱氧精胍啉、来氟米特及其malononitriloamide类似物；和免疫抑制蛋白，包括例如抗-CTLA4抗体和Ig融合物、抗-B淋巴细胞刺激性抗体(例如，LYMPHOSTAT-BTM)和Ig融合物(BLyS-Ig)、抗-CD20抗体(例如，RITUXAN
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)；完整的人抗体HuMax-CD20、R-1594、IMMU-106、TRU-015、AME-133、tositumomab/1-131、tositumomab(Bexxar)、ibritumomab tituxetan(Zcvalin)；抗-CD80抗体和依那西普(Enbrel)以及抗-T细胞抗体，例如抗-CD3(OKT3)、抗-CD4等。如上所述，可用任何方法评价治疗效果，包括但不限于美国风湿病标准学会(American College of Rheumatology criteria)、欧盟风湿病标准联合会(European League of Rheumatism criteria)或其它标准所定义的通过临床应答测量的效果。参见，例如Felson等，(1995)，Arthritis.Rheum.38：727-35和van Gestel等，(1996)，Arthritis Rheum.39：34-40。
在其它实施方案中，本发明的拮抗性抗-CD40抗体可单独使用或与免疫抑制药物联用来治疗和/或预防多发性硬化症。因此，在一些实施方案中，当本发明的拮抗性抗-CD40抗体用于治疗多发性硬化症时，该抗体可与合适的免疫抑制药物联用，所述免疫抑制药物包括但不限于：氨甲喋呤、环磷酰胺、优青糖苷、瘤可宁、环孢菌素、他利莫斯(FK506；ProGrafTM)、霉酚酸吗啉乙酯、依木兰(6-巯基嘌呤)、昔洛利莫斯(sirolimus)(雷帕霉素)、脱氧精胍啉、来氟米特及其malononitriloamide类似物；和免疫抑制蛋白，包括例如抗-CTLA4抗体和Ig融合物、抗-B淋巴细胞刺激性抗体(例如，LYMPHOSTAT-BTM)和Ig融合物(BLyS-Ig)、抗-CD20抗体(例如，RITUXAN
Figure 048374894_22
)；完整的人抗体HuMax-CD20、R-1594、IMMU-106、TRU-015、AME-133、tositumomab/1-131、tositumomab(Bexxar)、ibritumomabtituxetan(Zcvalin)；抗-CD80抗体和依那西普(Enbrel
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)以及抗-T细胞抗体，例如抗-CD3(OKT3)、抗-CD4等。
药物制剂和给药方式
本发明的拮抗性抗-CD40抗体可以有效治疗浓度给予来预防或治疗自身免疫疾病和/或炎性疾病。为实现此目的，可用本领域已知的各种可接受的赋形剂配制该抗体。该抗体一般通过注射给药，例如静脉内、腹膜内或皮下。实现此种给药的方法是本领域普通技术人员已知的。也可能获得可局部或口服给药，或能透过粘膜输送的组合物。
取决于所给予的抗-CD40抗体，静脉内给药优选输液约1-10小时，更优选约1-8小时，甚至更优选约2-7小时、还要优选约4-6小时。该药物组合物的最初输液可以约4-6小时，后续输液可更快递送。给予后续输液可以约1-6小时，例如约1-4小时、约1-3小时或约1-2小时。
可将本发明的药物组合物配制成与其给药途径相容。可能的给药途径的例子包括胃肠外(例如，静脉内(IV)、肌肉内(IM)、真皮内、皮下(SC)或输液)、口服和肺部(例如，吸入)、鼻、经皮(局部)、经粘膜和直肠给药。胃肠外、真皮内或皮下应用的溶液或悬液可包含以下组分：无菌稀释剂，例如注射用水、盐水溶液、不易挥发的油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌制剂，例如苄醇或羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如维生素C或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐和张力调整剂，例如氯化钠和葡萄糖。可用酸或碱，例如盐酸或氢氧化钠调节pH。胃肠外制剂可包装在玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或或多剂量小瓶中。
拮抗性抗-CD40抗体通常以标准技术用药学上可接受的缓冲液提供，例如无菌盐水、无菌缓冲水、丙二醇、上述物质的组合等。纳入本文作为参考的《雷明顿药物科学》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)(第18版；Mack PublishingCompany，Eaton，Pennsylvania，1990)描述了制备可胃肠外给予的试剂的方法。也参见，例如WO 98/56418中适用于本发明方法的稳定化抗体药物制剂的描述。
本领域普通技术人员不难确定至少一种拮抗性抗-CD40抗体或其片段的给药量而无须过多实验。影响给药方式和至少一种拮抗性抗-CD40抗体(或其片段)各自用量的因素包括，但不限于：所治疗的具体疾病、疾病的严重性、病史、所治疗个体的年龄、身高、体重、重量、健康和身体状况。类似地，待给予的拮抗性抗-CD40抗体或其片段的量取决于给药方式和对象是接受单剂量还是多剂量的该药物。随着所治疗患者的体重增加，一般优选较高剂量的抗-CD40抗体或其片段。待给予的抗-CD40抗体或其片段的剂量为约0.003mg/kg-50mg/kg、优选0.01mg/kg-约40mg/kg。因此，例如该剂量可以是0.01mg/kg、0.03mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、7mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg或50mg/kg。
在本发明的另一个实施方案中，该方法包括给予多剂量的拮抗性抗-CD40抗体或其片段。该方法可包括给予1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40或更多次治疗有效量的含拮抗性抗-CD40抗体或其片段的药物组合物。本领域技术人员不难确定多剂量的含拮抗性抗-CD40抗体或其片段的药物组合物的给药频率和持续时间而无需过多的实验。此外，用治疗有效量的抗体治疗对象包括单次治疗，或优选可包括一系列治疗。在一优选的实施例中，用拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段以约0.1-20mg/kg体重，每周一次治疗约1-10周，优选约2-8周、更优选约3-7周、甚至更优选约4、5或6周。每年进行治疗以防复发或根据复发迹象进行治疗。也应理解，用于治疗的抗体或其抗原结合片段的有效剂量在具体治疗期间可增加或降低。根据本文所述诊断试验的结果决定剂量的变化。因此，在一个实施方案中，给药方案包括在治疗期间的第1、7、14和21天先给予治疗有效量的至少一种抗-CD40抗体或其片段。在另一个实施方案中，给药方案包括在治疗期间每周的第1、2、3、4、5、6和7天先给予治疗有效量的至少一种抗-CD40抗体或其片段。其它实施方案包括在治疗期间每周的第1、3、5和7天先给予治疗有效量的至少一种抗-CD40抗体或其片段的给药方案；包括在治疗期间每周的第1和3天先给予治疗有效量的至少一种抗-CD40抗体或其片段的给药方案；和在治疗期间每周的第1天先给予治疗有效量的至少一种抗-CD40抗体或其片段的优选给药方案。治疗时期可包括1周、2周、3周、1个月、3个月、6个月或1年。治疗时期可连续或相互隔开1天、1周、2周、1个月、3个月、6个月或1年。
(剂量)范围是约0.003mg/kg-50mg/kg、约0.01mg/kg-40mg/kg、约0.01mg/kg-30mg/kg、约0.1mg/kg-30mg/kg、约0.5mg/kg-30mg/kg、约1mg/kg-30mg/kg、约3mg/kg-30mg/kg、约3mg/kg-25mg/kg、约3mg/kg-20mg/kg、约5mg/kg-15mg/kg或约7mg/kg-12mg/kg。因此，例如，任何一种拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段，如抗-CD40单克隆抗体CHIR-12.12或CHIR-5.9或它们的抗原结合片段的剂量可以是0.003mg/kg、0.01mg/kg、0.03mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、7mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg或在约0.003mg/kg-50mg/kg范围内的其它这种剂量。在抗体给药的每周可给予相同的治疗有效量的拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段。或者，治疗期间可采用不同的治疗有效量的拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，本文他处定义的拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的最初治疗有效量可为较低的剂量范围(即，约0.003mg/kg-20mg/kg)，后续剂量可在较高的剂量范围(即，约20mg/kg-50mg/kg)。
在其它实施方案中，本文他处定义的拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的最初治疗有效量可为较高的剂量范围(即，约20mg/kg-50mg/kg)，后续剂量可在较低的剂量范围(即，约0.003mg/kg-20mg/kg)。因此，在一个实施方案中，拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的最初治疗有效剂量是约20mg/kg-35mg/kg，包括约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg和约35mg/kg，其后拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的治疗有效剂量为约5mg/kg-15mg/kg，包括约5mg/kg、8mg/kg、10mg/kg、12mg/kg和约15mg/kg。
在本发明的一些实施方案中，拮抗性抗-CD40抗体治疗先给予需要拮抗性抗-CD40抗体治疗的对象以“负荷剂量”的此抗体或其抗原结合片段。“负荷剂量”指给予对象的拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的初始剂量，其中给予的抗体或其抗原结合片段的剂量在较高的剂量范围内(即，约20mg/kg-50mg/kg)。只要全部的“负荷剂量”在约24小时期间给予，该“负荷剂量”可以单次给予，例如该抗体或其抗原结合片段经静脉内一次性输液给药；或可以多次给予，例如该抗体或其抗原结合片段多次输液静脉内给药。给予“负荷剂量”后，可给予对象一次或多次额外的治疗有效量的拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段。然后可根据，例如每周的给药时间表、或每两周一次、每三周一次或每四周一次给予治疗有效剂量。在这种实施方案中，后续的治疗有效量在较低的剂量范围内(即，0.003mg/kg-约20mg/kg)。
或者，在一些实施方案中，给予“负荷剂量”后，拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段根据“维持时间表”给予，其中治疗有效量的该抗体或其抗原结合片段按每月一次、每六周一次、每两个月一次、每十周一次、每三个月一次、每十四周一次、每四个月一次、每十八周一次、每五个月一次、每二十二周一次、每六个月一次、每七个月一次、每八个月一次、每九个月一次、每十个月一次、每十一个月一次或每十二个月一次给药。在这种实施方案中，特别是当后续剂量以更高频率的间隔给药，例如每两个月一次到每月一次时，拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的治疗有效量在较低剂量范围内(即，0.003mg/kg-约20mg/kg)；特别是当后续剂量以更低频率的间隔，例如约间隔一个月到约十二个月给药时，治疗有效量在较高剂量范围内(即，约20mg/kg-50mg/kg)。
用于本发明方法的本文所述药物组合物中的拮抗性抗-CD40抗体可以是天然产生的或通过重组技术获得，可以是任何来源，包括哺乳动物来源，例如小鼠、大鼠、家兔、灵长类、猪和人。这种多肽优选得自人来源，更优选来自杂交瘤细胞系产生的重组人蛋白。
可用于本发明方法的药物组合物包含本发明拮抗性抗-CD40抗体的生物活性变体。这种变体保留了天然多肽的生物活性，从而当将该变体多肽的药物组合物给予对象时具有与含天然多肽的药物组合物相同的治疗效果。即，抗-CD40变体抗体以类似于天然拮抗性抗体，例如分别由杂交瘤细胞系5.9或12.12表达的CHIR-5.9或CHIR-12.12所见方式，用作药物组合物中的治疗活性组分。本领域已建立了可用于确定抗-CD40变体抗体是否保留了所需生物活性因而可用作药物组合物中治疗活性组分的方法。可采用为检测天然拮抗性抗体活性而专门设计的试验，包括本发明所述的试验来测定抗体变体的生物活性。
任何含有本文所述结合特性的拮抗性抗-CD40抗体作为治疗活性组分的药物组合物可用于本发明的方法。因此，可根据本发明的方法将含一种或多种本发明拮抗性抗-CD40抗体的液体、冻干或喷雾干燥的组合物制备成随后给予对象的水性或非水性溶液或悬液。这些组合物的每一种包含至少一种本发明的拮抗性抗-CD40抗体作为治疗或预防活性组分。“治疗或预防活性组分”指专门加入该组合物中的抗-CD40抗体，当将该药物组合物给予对象时，可在对象中引发疾病或病症的治疗、预防或诊断相关的所需治疗性或预防性应答。该药物组合物优选含有合适的稳定剂、填充剂，或二者，以最大程度降低制备和储存期间与蛋白质稳定性和生物活性丧失相关的问题。
可在含本发明的拮抗性抗-CD40抗体的药物组合物中加入一些制剂(formulant)。这些制剂包括，但不限于：油、聚合物、维生素、碳水化合物、氨基酸、盐、缓冲液、白蛋白、表面活性剂或填充剂。碳水化合物优选包括糖或糖醇，例如单糖、二糖或多糖或水溶性葡聚糖。糖或葡聚糖可包括果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、蔗糖、葡聚糖、支链淀粉、糊精、α和β环糊精、可溶性淀粉、羟乙基淀粉和羧甲基纤维素或它们的混合物。“糖醇”定义为含羟基的C4-C8烃，包括半乳糖醇、肌醇、甘露醇、木糖醇、山梨醇、甘油和阿拉伯糖醇。这些糖或糖醇可单独或组合使用。糖或糖醇的浓度在1.0％和7％w/v之间，更优选在2.0％和6.0％w/v之间。优选的氨基酸包括左旋(L)形式的肉毒碱、精氨酸和甜菜碱；然而，也可加入其它氨基酸。优选的聚合物包括平均分子量为2,000和3,000之间的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或平均分子量为3,000和5,000之间的聚乙二醇(PEG)。可加入该制剂的表面活性剂见欧洲专利号270,799和268,110。
此外，例如可通过与聚合物共价偶联来化学修饰抗体以增加它们的循环半衰期。可与肽连接的优选聚合物和方法见全文纳入本文作为参考的美国专利号4,766,106；4,179,337；4,495,285和4,609,546。优选的聚合物是聚氧乙基化多元醇和聚乙二醇(PEG)。PEG在室温下可溶于水并具有通式R(O--CH2--CH2)nO--R，其中R可以是氢或保护性基团，例如烷基或烷醇基团。保护性基团优选具有1-8个碳原子，更优选甲基。符号n是优选1-1,000的正整数，更优选2-500。PEG优选平均分子量1,000-40,000、更优选2,000-20,000、最优选3,000-12,000。PEG优选具有至少一个羟基、更优选末端羟基。优选激活该羟基以与抑制剂上的游离氨基反应。然而，应该理解的是，可调节反应基团的类型和数量以获得共价偶联PEG/本发明抗体。
水溶性聚氧乙基化多元醇也可用于本发明。它们包括聚氧乙基化山梨醇、聚氧乙基化葡萄糖、聚氧乙基化甘油(POG)。优选POG。原因之一是聚氧乙基化甘油的甘油骨架与例如动物和人的单、二、甘油三酯中天然存在的骨架相同。因此，该分支化合物在体内不会被视作外来物质。POG的优选分子量与PEG相同。POG的结构见Knauf等，(1988)，J.Bio.Chem.263：15064-15070，美国专利号4,766,106描述了POG/IL-2偶联物，两篇文献均全文纳入本文作为参考。
另一种增加循环半衰期的药物递送系统是脂质体。制备脂质体递送系统方法的描述见Gabizon等，(1982)，Cancer Research 42：4734；Cafiso(1981)，BiochemBiophys Acta 649：129和Szoka(1980)，Ann.Rev.Bioplays.Eng.9：467。本领域已知的其它药物递送系统描述于，例如Poznansky等，(1980)，《药物递送系统》(Drug Delivery Systems)，(R.L.Juliano编，Oxford，N.Y.)，第253-315页；Poznansky，(1984)，Phare Revs 36：277。
加入药物组合物中的制剂应使得拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段稳定。即，拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段应保留其物理和/或化学稳定性并具有所需生物活性，即，一种或多种本文以上定义的拮抗活性，包括但不限于：抑制T细胞刺激的正常人外周B细胞分泌免疫球蛋白；抑制Jurkat T细胞激活的正常人外周B细胞存活和/或增殖；抑制表达CD40L的细胞或可溶CD40配体(sCD40L)激活的正常人外周B细胞存活和/或增殖；抑制sCD40L或固态CD40L激活的细胞中“存活的”抗-凋亡胞内信号；抑制细胞结合sCD40L或固态CD40L后的CD40信号转导；和抑制本文它处所述人恶性B细胞的增殖。
监测蛋白质稳定性的方法是本领域熟知的。参见，例如Jones，(1993)Adv.DrugDelivery Rev.10：29-90；Lee编，(1991)，《肽和蛋白质药物递送》(Peptide andProtein Drug Delivery)，(Marcel Dekker，Inc.，纽约，纽约)和本文所述的稳定性试验。通常在选择的温度下，测定蛋白质在一段特定的时期内的稳定性。在优选的实施方案中，于室温(约25℃)储存至少1个月、至少3个月、或至少6个月，和/或于约2-8℃储存至少6个月、至少9个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月时，稳定的抗体药物制剂应能使拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段稳定。
当将一种蛋白质，例如抗体配制入药物组合物中时，如果该药物组合物中未出现沉淀、聚集和/或变性的可见迹象(即，变色或澄清度丧失)或可测定的迹象(例如，用体积排阻层析(SEC)或紫外光散射测定)，则认为该蛋白质在给定的时间点保留了其物理稳定性。就化学稳定性而言，当将一种蛋白质，例如抗体配制入药物组合物中时，如果化学稳定性测定显示该蛋白质(即，抗体)在该药物组合物中保留其感兴趣的生物活性，则可认为该蛋白质保留了其化学稳定性。监测化学稳定性变化的方法是本领域熟知的，包括但不限于用例如SDS-PAGE、SEC和/或衬质辅助激光解析与电离-飞行时间质谱检测因剪接造成蛋白质的化学性质改变的方法；和用例如离子交换色谱检测与分子荷电改变相关(例如，与脱氨基相关)降解的方法。参见，例如下文所述的方法。
当将拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段配制入药物组合物中时，如果用合适的试验检测到在给定时间点其所需生物活性为该药物组合物制备之时所需生物活性的约30％以内，优选约20％以内，则认为所述拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段在该时间点保留了所需生物活性。检测拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的所需生物活性的试验可如本文实施例中所述进行。也可参见纳入本文作为参考的以下文献中所述的试验：Schutze等，(1998)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：8200-8204；Denton等，(1998)，Pediatr Transplant.2：6-15；Evans等，(2000)，J.Immunol.164：688-697；Noelle，(1998)，Agents Actions Suppl.49：17-22；Lederman等，(1996)，Curr Opin.Hematol.3：77-86；Coligan等，(1991)，CurrentProtocols in Immunology 13：12；Kwekkeboom等，(1993)Immunology 79：439-444；和美国专利号5,674,492和5,847,082。
在本发明的一些实施方案中，将拮抗性抗-CD40抗体，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9单克隆抗体或其抗原结合片段配制入液体药物制剂中。拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段可用本领域已知的方法制备，包括上文公开的方法。在一个实施方案中，拮抗性抗-CD40抗体，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9单克隆抗体或其抗原结合片段是在CHO细胞系中重组产生。
拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段制备和纯化后，可以按本文所述方式配制成液体药物制剂。当拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段在配制前要需保存时，可将其冻存在例如-20℃，然后室温融化作进一步配制。该液体药物制剂含有治疗有效量的拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段。制剂中此抗体或其抗原结合片段的量要考虑给药途径和所需剂量体积。
在此方式中，该液体药物组合物包含以下浓度的拮抗性抗-CD40抗体，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9抗体或其抗原结合片段：约0.1mg/ml-50.0mg/ml、约0.5mg/ml-40.0mg/ml、约1.0mg/ml-30.0mg/ml、约5.0mg/ml-25.0mg/ml、约5.0mg/ml-20.0mg/ml或约15.0mg/ml-25.0mg/ml。在一些实施方案中，该液体药物组合物包含以下浓度的拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段：约0.1mg/ml-5.0mg/ml、约5.0mg/ml-10.0mg/ml、约10.0mg/ml-15.0mg/ml、约15.0mg/ml-20.0mg/ml、约20.0mg/ml-25.0mg/ml、约25.0mg/ml-30.0mg/ml、约30.0mg/ml-35.0mg/ml、约35.0mg/ml-40.0mg/ml、约40.0mg/ml-45.0mg/ml或约45.0mg/ml-50.0mg/ml。在其它实施方案中，该液体药物组合物包含以下浓度的拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段：约15.0mg/ml、约16.0mg/ml、约17.0mg/ml、约18.0mg/ml、约19.0mg/ml、约20.0mg/ml、约21.0mg/ml、约22.0mg/ml、约23.0mg/ml、约24.0mg/ml或约25.0mg/ml。液体药物组合物包含拮抗性抗-CD40抗体，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9抗体或其抗原结合片段和维持制剂的pH约pH 5.0-pH 7.0的缓冲液，所述pH包括约pH 5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0和约pH 5.0-pH 7.0范围内的其它数值。在一些实施方案中，缓冲液维持制剂的pH约pH 5.0-pH 6.5、约pH 5.0-pH 6.0、约pH 5.0-pH 5.5、约pH5.5-7.0、约pH 5.5-pH 6.5或约pH 5.5-pH 6.0的范围。
可在该制剂中采用将抗-CD40抗体液体制剂的pH维持于约pH 5.0-pH 7.0范围的任何合适缓冲剂，只要抗体能保留如上所述的理化稳定性和所需生物活性。合适的缓冲剂包括，但不限于常规的酸及它们的盐，其中反荷离子可以是，例如钠、钾、铵、钙或镁。可用于缓冲该药物液体制剂的常规酸及它们的盐的例子包括，但不限于琥珀酸或琥珀酸盐、柠檬酸或柠檬酸盐、乙酸或乙酸盐、酒石酸或酒石酸盐、磷酸或磷酸盐、葡糖酸或葡糖酸盐、谷氨酸或谷氨酸盐、天冬氨酸或天冬氨酸盐、马来酸或马来酸盐和苹果酸或苹果酸盐。制剂中缓冲剂的浓度可以约1mM-50mM，包括约1mM、2mM、5mM、8mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM或约1mM-50mM范围内的其它数值。在一些实施方案中，制剂中缓冲剂的浓度可以约5mM-15mM，包括约5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM或在约5mM-15mM范围内的其它数值。
在本发明的一些实施方案中，该液体药物制剂包含治疗有效量的拮抗性抗-CD40抗体，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9单克隆抗体或其抗原结合片段和琥珀酸盐或柠檬酸盐缓冲剂，所述缓冲剂的浓度能维持制剂的pH约pH 5.0-pH7.0、优选约pH 5.0-pH 6.5。“琥珀酸盐缓冲液”或“柠檬酸盐缓冲液”指分别含有琥珀酸盐或柠檬酸盐的缓冲液。在一优选的实施方案中，琥珀酸盐或柠檬酸盐反荷离子分别是钠阳离子，因此缓冲剂分别是琥珀酸钠或柠檬酸钠。然而，预计任何阳离子均有效。其它可能的琥珀酸盐或柠檬酸盐阳离子包括，但不限于钾、铵、钙和镁。如上所述，该制剂中琥珀酸盐和柠檬酸盐缓冲剂的浓度可以约1mM-50mM，包括约1mM、2mM、5mM、8mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM或在约1mM-50mM范围内的其它数值。在一些实施方案中，该制剂中缓冲剂的浓度可以约5mM-15mM，包拮约5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM或约15mM。在其它实施方案中，该液体药物制剂包含浓度约0.1mg/ml-50.0mg/ml或约5.0mg/ml-25.0mg/ml的拮抗性抗-CD40抗体，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9单克隆抗体或其抗原结合片段；和浓度约1mM-20mM、约5mM-15mM，优选约10mM的琥珀酸盐或柠檬酸盐缓冲剂，例如琥珀酸钠或柠檬酸钠缓冲剂。
该液体药物制剂接近等渗是有益的，该液体药物制剂除了包含治疗有效量的拮抗性抗-CD40抗体，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9单克隆抗体或其抗原结合片段和维持制剂的pH约pH 5.0-pH 7.0的缓冲剂之外，还可包含其量足以使得该制剂接近等渗的等渗剂。“接近等渗”指水性制剂具有以下重量克分子渗透浓度：约240mmol/kg-360mmol/kg、优选约240-340mmol/kg、更优选约250-330mmol/kg、再要优选约260-320mmol/kg、还要优选约270-310mmol/kg。测定溶液等渗性的方法是本领域技术人员已知的。参见，例如Setnikar等，(1959)，J.Am.Pharm.Assoc.48：628。
本领域的技术人员熟悉用于提供药物组合物等渗性的各种药学上可接受的溶质。等渗剂可以是能将本发明液体药物制剂的渗透压调节至与体液的渗透压接近值的任何制剂。使用生理上可接受的等渗剂是有益的。因此，液体药物制剂除了包含治疗有效量的拮抗性抗-CD40抗体，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9单克隆抗体或其抗原结合片段和维持制剂的pH约pH 5.0-pH 7.0内的缓冲剂之外，还可包含提供等渗性的组分，例如氯化钠；氨基酸，如丙氨酸、缬氨酸和甘氨酸；糖和糖醇(多元醇)包括，但不限于葡萄糖、右旋糖、果糖、蔗糖、甘露糖、海藻糖、甘油、山梨醇和木糖醇；乙酸，其它有机酸或它们的盐，和相对少量的柠檬酸盐或磷酸盐。普通技术人员知道适合于提供液体制剂的最佳等渗性的其它制剂。
在一些优选的实施方案中，该液体药物制剂除包含治疗有效量的拮抗性抗-CD40抗体，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9单克隆抗体或其抗原结合片段和维持制剂的pH约pH 5.0-pH 7.0内的缓冲剂之外，还可包含作为等渗剂的氯化钠。制剂中氯化钠的浓度取决于其它组分对张力的作用。在一些实施方案中，氯化钠的浓度约50mM-300mM、约50mM-250mM、约50mM-200mM、约50mM-175mM、约50mM-150mM、约75mM-175mM、约75mM-150mM、约100mM-175mM、约100mM-200mM、约100mM-150mM、约125mM-175mM、约125mM-150mM、约130mM-170mM、约130mM-160mM、约135mM-155mM、约140mM-155mM或约145mM-155mM。在一个这样的实施方案中，氯化钠的浓度约150mM。在其它这样的实施方案中，氯化钠的浓度约150mM，缓冲液是浓度为约5mM-15mM的琥珀酸钠或柠檬酸钠缓冲液，该液体药物制剂包含治疗有效量的拮抗性抗-CD40抗体，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9单克隆抗体或其抗原结合片段，制剂的pH为约pH 5.0-pH 7.0、约pH 5.0-pH 6.0或约pH5.5-pH 6.5。在其它实施方案中，该液体药物制剂包含浓度为约0.1mg/ml-50.0mg/ml或约5.0mg/ml-25.0mg/ml的拮抗性抗-CD40抗体，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9单克隆抗体或其抗原结合片段，约150mM的氯化钠和约10mM的琥珀酸或柠檬酸钠，pH为约pH 5.5。
在向制剂中加入表面活性剂以降低溶液-空气界面的表面张力可抑制本发明液体药物制剂加工过程中由于冻融或机械剪切力导致的蛋白质降解。因此，在一些实施方案中，该液体药物制剂包含治疗有效量的拮抗性抗-CD40抗体，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9单克隆抗体或其抗原结合片段，维持制剂的pH维持约pH 5.0-pH 7.0内的缓冲剂，还包含表面活性剂。在其它实施方案中，该液体药物制剂包含治疗有效量的拮抗性抗-CD40抗体，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9单克隆抗体或其抗原结合片段，维持制剂的pH约pH 5.0-pH 7.0内的缓冲剂，等渗剂，例如浓度约50mM-300mM的氯化钠，还包含表面活性剂。
采用的典型表面活性剂是非离子型表面活性剂，包括聚氧乙烯山梨醇酯，例如聚山梨酸酯80(吐温80)和聚山梨酸酯20(吐温20)；聚氧丙烯-聚氧乙烯酯，例如Pluronic F68；聚氧乙烯醇，例如Brij 35；二甲硅油；聚乙二醇，例如PEG400；溶血磷脂酰胆碱；和聚氧乙烯-对-叔-辛酚，例如Triton X-100。表面活性剂或乳化剂的经典药物稳定作用描述于，例如纳入本文作为参考的Levine等，(1991)，J.Parenteral Sci.Technol.45(3)：160-165。用于实施本发明的优选表面活性剂是聚山梨酸酯80。当制剂中包含表面活性剂时，一般按以下量加入：约0.001％-1.0％(w/v)、约0.001％-0.5％、0.001％-0.4％、约0.001％-0.3％、约0.001％-0.2％、约0.005％-0.5％、约0.005％-0.2％、约0.01％-0.5％、约0.01％-0.2％、约0.03％-0.5％、约0.03％-0.3％、约0.05％-0.5％或约0.05％-0.2％。
因此，在一些实施方案中，该液体药物制剂包含治疗有效量的拮抗性抗-CD40抗体，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9单克隆抗体或其抗原结合片段；缓冲液是浓度为约1mM-50mM、约5mM-25mM或约5mM-15mM的琥珀酸钠或柠檬酸钠缓冲液；制剂的pH为约pH 5.0-pH 7.0、约pH 5.0-pH 6.0或约pH5.5-pH 6.5；制剂还包含约0.001％-1.0％或约0.001％-0.5％的表面活性剂，例如聚山梨酸酯80。这种制剂任选可包含等渗剂，例如浓度约50mM-300mM、约50mM-200mM或约50mM-150mM的氯化钠。在其它实施方案中，该液体药物制剂包含浓度约0.1mg/ml-50.0mg/ml或约5.0mg/ml-25.0mg/ml，包括约20.0mg/ml的治疗有效量的拮抗性抗-CD40抗体，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9单克隆抗体或其抗原结合片段；约50mM-200mM的氯化钠；约5mM-20mM的琥珀酸钠或柠檬酸钠，包括约10mM的琥珀酸钠或柠檬酸钠；浓度约50mM-200mM的氯化钠；和任选的约0.001％-1.0％，包括约0.001％-0.5％的表面活性剂，例如聚山梨酸酯80；该液体药物制剂的pH约pH 5.0-pH 7.0、约pH 5.0-pH 6.0、约pH5.0-pH 5.5、约pH 5.5-pH 6.5或约pH5.5-pH 6.0。
该液体药物制剂可基本上不含任何防腐剂和其它载体、赋形剂或本文上述的稳定剂。或者，该制剂可包含一种或多种防腐剂，例如抗细菌制剂，药学上可接受的载体、赋形剂或本文上述的稳定剂，前提是它们对拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的理化稳定性无不利影响。可接受的载体、赋形剂和稳定剂的例子包括，但不限于额外的缓冲剂，助溶剂，表面活性剂，抗氧化剂包括维生素C和甲硫氨酸，螯合剂，例如EDTA、金属络合剂(如，Zn-蛋白质络合物)和生物可降解的聚合物，例如聚酯。关于制剂和药学上可接受的载体、稳定剂和等渗剂的选择讨论见纳入本文作为参考的《雷明顿药物科学》(Remington′sPharmaceutical Sciences)，(第18版；Mack Publishing Company，Eaton，Pennsylvania，1990)。
本文所述液体药物制剂或其它药物组合物制备后可冻干以防降解。冻干液体组合物的方法是本领域普通技术人员已知的。在使用前，用含有其它成分的无菌稀释剂(例如林格溶液、蒸馏水或无菌盐水)重建该组合物。重建后，该组合物优选用本领域的技术人员已知的方法给药。
拮抗性抗-CD40抗体在生产药物中的应用
本发明也提供拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段在生产治疗自身免疫疾病和/或炎性疾病对象的药物中的应用，其中所述药物与至少一种其它疗法起合作治疗作用。“合作”指在用至少一种其它疗法治疗对象之前、期间或之后采用上述药物。其它疗法的例子包括，但不限于本文所述的那些，即外科或手术方法(例如，脾切除术、淋巴结切除术、甲状腺切除术、血浆去切除术、白细胞去除术、细胞、组织或器官移植、器官灌注、肠手术等)、放疗、诸如类固醇治疗和非类固醇治疗、激素治疗、细胞因子治疗、使用皮肤药物(例如，治疗皮肤病症，如过敏、接触性皮炎和银屑病的局部药物)的治疗、免疫抑制治疗和其它抗炎性单克隆抗体治疗等的疗法，其中采用其它一种或多种疗法治疗可在用含有上述拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的药物治疗对象之前、期间或之后。在一个这种实施方案中，本发明提供单克隆抗体CHIR-12.12或CHIR-5.9在生产治疗自身免疫疾病和/或炎性疾病对象的药物中的应用，所述药物与至少一种本文上述其它疗法起合作治疗作用。
在一些实施方案中，包含拮抗性抗-CD40抗体，例如本文公开的单克隆抗体CHIR-12.12或CHIR-5.9或其抗原结合片段的药物与两种其它疗法起合作治疗作用。当包含拮抗性抗-CD40抗体的药物与两种其它疗法合作治疗时，可在用两种其它疗法或之一治疗对象之前、期间或之后使用所述药物。
本发明也提供拮抗性抗-CD40抗体，例如本文公开的单克隆抗体CHIR-12.12或CHIR-5.9或其抗原结合片段在生产治疗自身免疫疾病和/或炎性疾病对象的药物中的应用，所述药物可用于已用至少一种其它疗法预先治疗过的对象。“预先治疗过”或“预先治疗”指在接受包含拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的药物之前，对象已用一种或多种其它疗法治疗过。“预先治疗过”或“预先治疗”包括在用包含拮抗性抗-CD40抗体，例如本文公开的单克隆抗体CHIR-12.12或CHIR-5.9或其抗原结合片段的药物治疗开始前的以下时间内用其它一种或多种疗法治疗过的对象：2年、18个月、1年、6个月、2个月、6周、1个月、4周、3周、2周、1周、6天、5天、4天、3天、2天或甚至1天。该对象无需对先前的治疗有反应。因此，接受包含拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的药物的对象可以对先前疗法或一种或多种先前疗法(当先前治疗包括多种疗法时)有反应或无反应。
提供以下实施例是为了说明，绝非限制。
实验
导言
用于以下实施例的拮抗性抗-CD40抗体是CHIR-5.9和CHIR-12.12。CHIR-5.9和CHIR-12.12抗-CD40抗体是通过免疫携带人IgG1重链基因座和人K轻链基因座的转基因小鼠(XenoMouse
Figure 048374894_26
technology(Abgenix；Fremont，California))产生的人IgG1亚型抗-人CD40单克隆抗体(mAb)。表达CD40胞外结构域的SF9昆虫细胞用作免疫原。
简言之，如先前de Boer等，(1988)，J.Immunol.Meth.113：143所述，用50％聚乙二醇使免疫小鼠的脾细胞与SP2/0或P 3x 63Ag8.653鼠骨髓瘤细胞以10：1的比例融合。将融合细胞重悬于添加了次黄嘌呤(0.1mM)、氨基喋呤(0.01mM)、胸苷(0.016mM)和0.5ng/ml hIL-6(Genzyme，Cambridge，Massachusetts)的完全IMDM培养基中。然后将融合细胞分置于96-孔组织培养板孔中，平均每孔含有一个生长中的杂交瘤。
10-14天后，筛选杂交瘤细胞群上清液有无特异性抗体产生。为筛选杂交瘤克隆产生的特异性抗体，合并各孔上清液并先用ELISA检测抗-CD40特异性活性。然后将阳性(杂交瘤细胞)用标准FACS试验作EBV-转化B细胞的荧光细胞染色。通过用含有0.5ng/ml hIL-6的IMDM/FBS作有限稀释克隆阳性杂交瘤细胞两次。
总共31个小鼠脾(细胞)与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞融合得到895个在ELISA中能识别重组CD40的抗体。使用Abgenix XenoMouse
Figure 048374894_27
technology(Abgenix；Fremont，California))产生的杂交瘤细胞平均约10％含有小鼠λ轻链替代了人κ链。选出含有小鼠λ链的抗体。选出同样显示能与细胞表面CD40结合的260个抗体亚组用于进一步分析。将在一系列亚克隆过程中选出的稳定杂交瘤细胞用于结合和功能试验作进一步鉴定。该选择方法的进一步细节，可分别参见2003年11月4日和2003年11月26日提交的二者均名为“拮抗性抗-CD40单克隆抗体及它们的用法”的待批临时申请，和转让的美国专利申请号60/517,337(代理人审理号PP20107.001(035784/258442))和60/525,579(代理人审理号PP20107.002(035784/271525))，它们的内容均纳入本文作为参考。
7个其它杂交瘤的克隆经鉴定具有拮抗活性。根据它们相对的拮抗能力和ADCC活性，选出两个杂交瘤细胞克隆作进一步评价(下表1)。它们命名为131.2F8.5.9(5.9)和153.8E2.D10.D6.12.12(12.12)。
表1.抗-CD40IgG1抗体C HIR-5.9和CHIR-12.12的最初一组数据小结
小鼠杂交瘤细胞系(Mouse hybridoma line)131.2F8.5.9(CMCC#；12047)和杂交瘤细胞系153.8E2.D10.D6.12.12(CMCC#；12056)由美国典型培养物保藏中心(ATCC；10801 University Blvd.，Manassas，Virginia 20110-2209(USA))分别以专利保藏号PTA-5542和PTA-5543保藏。
将编码该候选抗体可变区的cDNA经PCR扩增、克隆和测序。CHIR-12.12抗体轻链和重链的氨基酸序列分别示于图1A和1B。也参见SEQ ID NO：2(mAbCHIR-12.12的轻链)和SEQ ID NO：4(mAb CHIR-12.12的重链)。mAb CHIR-12.12重链的变体示于图1B(也参见SEQ ID NO：5)，其与SEQ ID NO：4的区别在于SEQ ID NO：4的153位用丝氨酸残基取代了丙氨酸残基。编码CHIR-12.12抗体的轻链和重链的核苷酸序列分别示于图2A和2B。也参见SEQ ID NO：1(mAb CHIR-12.12轻链的编码序列)和SEQ ID NO：3(mAb CHIR-12.12重链的编码序列)。CHIR-5.9抗体轻链和重链的氨基酸序列分别示于图3A和3B。也参见SEQ ID NO：6(mAb CHIR-5.9的轻链)和SEQ ID NO：7(mAb CHIR-5.9的重链)。mAb CHIR-5.9重链的变体示于图3B(也参见SEQ ID NO：8)，其与SEQID NO：7的区别在于在SEQ ID NO：7的158位用丝氨酸残基取代了丙氨酸残基。
得自独立杂交瘤的抗体如预计的那样在互补决定区(CDR)的核苷酸序列中有本质上改变。据信，VH的CDR3区中的多样性对决定抗体特异性最重要。
如FACS分析所示，CHIR-5.9和CHIR-12.12能特异性结合人CD40并阻止CD40-配体结合。这两种mAb均能竞争去除预先和细胞表面CD40结合的CD40-配体。CHIR-5.9与人CD40的结合亲和力是1.2×10-8M，CHIR-12.12与人CD40的结合亲和力是5×10-10M。
CHIR-12.12和CHIR-5.9单克隆抗体是强拮抗剂，在体外能抑制CD40配体-介导的正常B细胞增殖。对这些结果和获得这些结果所用试验的更详细描述可分别参见2003年11月4日和2003年11月26日提交的二者均名为“拮抗性抗-CD40单克隆抗体及它们的用法”的待批临时申请，和转让的美国专利申请号60/517,337(代理人审理号PP20107.001(035784/258442))和60/525,579(代理人审理号PP20107.002(035784/271525))，它们的内容均全文纳入本文作为参考。
实施例1：CHIR-12.12阻断CD40L-介导的细胞信号传导
可溶性CD40配体(CD40L)能激活B细胞并诱导各方面的功能性应答，包括提高存活和增殖，激活NFκB、ERK/MAPK、PI3K/Akt，和p38信号传导途径。此外，CD40L-介导的CD40刺激通过在正常B细胞中减少切割的PARP和诱导抗凋亡蛋白，XIAP和Mcl-1而提供存活信号。CD40L-介导的CD40刺激也能募集TRAF2和TRAF3与CD40胞质结构域结合。
以下研究证明CHIR-12.12可直接抑制所有这些对正常B细胞的刺激作用。例如，CHIR-12.12处理以时间和剂量依赖模式导致胱冬酶-9、胱冬酶-3和PARP切割的增加以及XIAP和Mcl-1的减少，而恢复B细胞凋亡。用CHIR-12.12治疗也抑制了对CD40L-介导的CD40刺激的反应中IκB激酶(IKK)α和β(NFκB途径)、ERK、Akt和p38的磷酸化。此外，发现无最初CD40L-介导的CD40刺激时CHIR-12.12不激发这些凋亡作用。
CHIR-12.12通过诱导PARP切割可抑制CD40配体介导的存活
在这些实验中，用1μg/ml sCD40L(Alexis Corp.，Bingham，Nottinghamshire，UK)刺激0.6×106个健康供体的正常人B细胞(纯度百分比为85-95％)。然后加入CHIR-12.12(10μg/ml)和对照IgG。于0、20分钟、2小时、6小时、18小时和26小时收集细胞。通过Western印迹检测细胞裂解物中切割的胱冬酶-9、切割的胱冬酶-3、切割的PARP和β肌动蛋白对照。
简言之，观察到CD40L-介导的CD40刺激提供了存活信号，因为它未导致胱冬酶-9、胱冬酶-3或PARP的切割随时间而增加，表明细胞未经历凋亡。然而，用CHIR-12.12处理导致这些切割产物增加，表明CHIT-12.12处理消除了CD40L结合对sCD40L-刺激的正常B细胞中存活信号传导的作用，恢复了B细胞的凋亡(数据未显示)。
CHIR-12.12可抑制“存活”性抗凋亡蛋白的表达
在这些实验中，用1μg/ml sCD40L(Alexis Corp.，Bingham，Nottinghamshire，UK)刺激0.6×106个健康供体的正常人B细胞(纯度百分比为85-95％)。然后加入CHIR-12.12(10μg/ml)和对照IgG。于0、20分钟、2小时、6小时、18小时和26小时收集细胞。通过Western印迹检测细胞裂解物中的Mcl-1、XIAP、CD40和β肌动蛋白对照。
简言之，sCD40L刺激导致Mcl-1和XIAP随时间推移的持续表达。然而，用CHIR-12.12处理sCD40L-激活的细胞导致这些蛋白质随时间推移表达减少(数据未显示)。由于Mcl-1和XIAP是能阻断凋亡途径的“存活”性信号，这些结果证明CHIR-12.12处理消除了对sCD40L-激活的正常B细胞的凋亡阻断。
CHIR-12.12处理可抑制正常B细胞中IKKα(Ser 180)和IKKβ(Ser 181)的磷酸化
在这些实验中，用1μg/ml sCD40L(Alexis Corp.，Bingham，Nottinghamshire，UK)刺激1.0×106个健康供体的正常人B细胞(纯度百分比为85-95％)。然后加入CHIR-12.12(10μg/ml)和对照IgG。于0和20分钟收集细胞。通过Western印迹检测细胞裂解物中磷酸化的IKKα(Ser180)和IKKβ(Ser181)与总IKKβ对照。
简言之，sCD40L刺激导致IKKα(Ser180)和IKKβ(Ser181)随时间推移的磷酸化；然而，用CHIR-12.12处理消除了正常B细胞对sCD40L-刺激的应答(数据未显示)。
CHIR-12.12处理可以剂量依赖方式抑制CD40配体介导的存活
在这些实验中，用1μg/ml sCD40L(Alexis Corp.，Bingham，Nottinghamshire，UK)刺激0.6×106个健康供体的正常人B细胞(纯度百分比为85-95％)。然后加入CHIR-12.12(0.01、0.1、0.2、0.5、1.0μg/ml)和对照IgG。24小时后收集细胞。通过Western印迹检测细胞裂解物中切割的PARP和β肌动蛋白对照。
简言之，CHIR-12.12处理以剂量依赖方式导致sCD40L-激活的细胞中PARP切割增加，因此消除了sCD40L-激活正常B细胞中的存活信号传导通路(数据未显示)。
CHIR-12.12可以剂量依赖方式抑制“存活”性抗-凋亡蛋白的表达
在这些实验中，用1μg/ml sCD40L(Alexis Corp.，Bingham，Nottinghamshire，UK)刺激0.6×106个健康供体的正常人B细胞(纯度百分比为85-95％)。然后加入CHIR-12.12(0.5、2和10μg/ml)和对照IgG。22小时后收集细胞。通过Western印迹检测细胞裂解物中的Mcl-1、XIAP、切割的PARP和β肌动蛋白对照。
简言之，CHIR-12.12处理以剂量依赖方式减少了sCD40L-激活细胞中的Mcl-1和XIAP表达并增加了切割的PARP表达，因此消除了sCD40L-激活正常B细胞中对凋亡途径的阻断(数据未显示)。
在不存在可溶性CD40L信号时，CHIR-12.12不影响抗-凋亡蛋白、切割的PARP和XIAP的表达
在这些实验中，仅用CHIR-12.12(10μg/ml)和对照IgG(即，在加入抗体前，细胞不用sCD40L预刺激)处理1.0×106个健康供体的正常人B细胞(纯度百分比为85-95％)。于0、4、14和16小时收集细胞。通过Western印迹检测细胞裂解物中的XIAP、切割的PARP和β-肌动蛋白对照。
简言之，这些结果显示无sCD40L刺激时，在IgG处理的对照细胞和CHIR-12.12处理的细胞中，细胞表达的切割的PARP浓度增加，而XIAP表达维持恒定(数据未显示)。这些数据表明，无CD40L刺激时，CHIR-12.12不激发正常人B细胞凋亡。
CHIR-12.12可抑制正常B细胞中IKKα(Ser180)和IKKβ(Ser181)、Akt、ERK和p38的磷酸化
在这些实验中，将1.0×106个健康供体的正常人B细胞(纯度百分比为85-95％)在含有1％FBS的培养基中进行血清饥饿并用1μg/ml sCD40L(AlexisCorp.，Bingham，Nottinghamshire，UK)刺激。细胞用CHIR-12.12(1和10μg/ml)和对照IgG处理。于0和20分钟收集细胞。通过Western印迹检测细胞裂解物中的磷酸-IKKα、磷酸-IKKβ、总IKKβ、磷酸-ERK、总ERK、磷酸-Akt、总Akt、磷酸-p38和总p38。
简言之，sCD40L刺激导致IKKα/β磷酸化、ERK磷酸化、Akt磷酸化和p38磷酸化增加，从而导致细胞存活和增殖。用CHIR-12.12处理细胞消除了sCD40L-刺激对正常B细胞这些信号途径的作用(数据未显示)。
CHIR-12.12可抑制多种信号途径，例如CD40信号传导级联反应中的PI3K和MEK/ERK
在这些实验中，将1.0×106个健康供体的正常人B细胞(纯度百分比为85-95％)在含有1％FBS的培养基中进行血清饥饿(serum starved)并用1μg/mlsCD40L(Alexis Corp.，Bingham，Nottinghamshire，UK)刺激。培养物用CHIR-12.12(1和10μg/ml)、Wortmanin(一种PI3K/Akt抑制剂；1和10μM)、LY 294002(一种PI3K/Akt抑制剂；10和30μM)和PD 98095(一种MEK抑制剂；10和30μg/ml)处理。于0和20分钟收集细胞。通过Western印迹检测细胞裂解物中的磷酸-ERK、磷酸-Akt、总Akt、磷酸-IKKα/β和总IKKα/β。
简言之，这些结果显示CHIR-12.12消除了所有这些信号转导分子的磷酸化，而信号转导抑制剂仅显示特异性消除了信号转导，表明CHIR-12.12可能抑制CD40L刺激介导的这些上游信号转导分子(数据未显示)。
CHIR-12.12可抑制正常B细胞中信号传导分子TRAF2和TRAF3与CD40胞质结构域的结合
在这些实验中，将4.0×106个健康供体的正常入B细胞(纯度百分比为85-95％)在含有1％FBS的培养基中进行血清饥饿并用1μg/ml sCD40L(AlexisCorp.，Bingham，Nottinghamshire，UK)刺激20分钟。于0和20分钟收集细胞。用多克隆抗-CD40(Santa Cruz Biotechnology，CA)免疫沉淀CD40并用抗-TRAF2mAb(Santa Cruz Biotechnology，CA)、抗-TRAF3mAb(Santa Cruz Biotechnology，CA)和抗-CD40mAb(Santa Cruz Biotechnology，CA)检测Western印迹。
简言之，这些结果显示sCD40L刺激后TRAF2和TRAF3可与CD40共同沉淀。相反，用CHIR-12.12处理消除了sCD40L-激活的正常B细胞中CD40-TRAF2/3信号传导复合物的形成。CD40的表达无变化(数据未显示)。
不受理论的束缚，这些实验的结果和以上实施例的结果表明CHIR-12.12抗体是具有独特组合特性的双重作用拮抗性抗-CD40单克隆抗体。该完整的人单克隆抗体能阻断B细胞存活和增殖所需的CD40L-介导的CD40信号传导途径；该拮抗作用最终导致细胞死亡。CHIR-12.12也介导效应细胞的识别和结合，引起抗体依赖的细胞毒性(ADCC)。一旦CHIR-12.12与效应细胞结合后，释放溶细胞酶，导致B细胞凋亡和裂解。当与临床前肿瘤模型比较时，CHIR-12.12是比利妥昔单抗(rituximab)更强的抗肿瘤抗体。
实施例2：与15B8相比CHIR-5.9和CHIR-12.12和CD40上不同表位结合
候选单克隆抗体CHIR-5.9和CHIR-12.12能互相竞争与CD40结合，但不与15B8，一种IgG2抗-CD40mAb(参见国际公布号WO02/28904)竞争。利用CM5生物传感器芯片设计了使用Biacore的抗体竞争结合试验，所述芯片含有经氨基偶联而固定的蛋白质A用于捕捉抗-CD40、CHIR-12.12或15B8。用不同浓度的CD40-his观察到正常的缔合/解离结合曲线(数据未显示)。就竞争研究而言，CHIR-12.12或15B8均被捕捉于蛋白质A表面。然后使不同浓度的CD40-his/CHIR-5.9Fab复合物(100nM CD40：1μM CHIR-5.9Fab)流过该修饰的表面。就CHIR-12.12而言，未观察到复合物的缔合，表明CHIR-5.9阻断了CHIR-12.12与CD40-his的结合。就15B8而言，观察到Fab CHIR-5.9复合物的缔合，表明CHIR-5.9不阻断15B8与CD40的结合位点结合。然而，该复合物的解离速率(off rate)显著增加(数据未显示)。
也证明了15B8和CHIR-12.12不竞争与CD40-his结合。该实验步骤如下：用蛋白质A生物传感器芯片捕捉CHIR-12.12、用对照IgG1封闭残留的蛋白质A位点、结合CD40-his然后使15B8流过该修饰的表面。15B8在这些条件下确实有结合，表明CHIR-12.12不阻断15B8与CD40的结合。
实施例3：CHIR-12.12和CHIR-5.9mAb的结合性能
将蛋白质A经氨基偶联而固定于CM5生物传感器芯片上。将1.5μg/ml的人抗-CD40单克隆抗体在1.5分钟内以10μl/分钟(流过)被捕捉在此修饰的生物传感器表面上。使不同浓度的重组可溶性CD40-his流过该生物传感器表面。用0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％表面活性剂P20(HBS-EP)稀释抗体和抗原。用Biaevaluation软件以1∶1相互作用模型/球形拟合(global fit)测定动力学和亲和力常数。
如下表2所示，CHIR-5.9和CHIR-12.12的解离速率有121倍差异，这导致CHIR-12.12的亲和力高24倍。
表2.CHIR-5.9和CHIR-12.12抗-CD40抗体的结合性能小结
实施例4：单克隆抗体CHIR-12.12和CHIR-5.9识别表位的特性分析
为确定单克隆抗体CHIR-12.12和CHIR-5.9识别的CD40表位的位置，进行了SDS-PAGE和Western印迹分析。在还原和非还原条件下在4-12％NUPAGE凝胶上分离纯化的CD40(0.5μg)，转移至PVDF膜上用10μg/ml浓度的单克隆抗体检测。印迹以碱性磷酸酶偶联的抗-人IgG检测并用碱性磷酸酶的WesternBlueR稳定底物(Promega)显色。
结果表明抗-CD40单克隆抗体CHIR-12.12同时识别非还原和还原形式CD40上的表位，与非还原形式的CD40结合的强度显著高于还原形式的CD40(表3；印迹未显示)。两种形式的CD40的识别均是阳性表明该抗体能与部分是线性序列的构象表位相互作用。单克隆抗体CHIR-5.9主要识别非还原形式的CD40，提示该抗体主要与构象表位相互作用(表3；印迹未显示)。
表3.结构域鉴定
为勘察CD40上的抗原性区域，克隆了CD40的4个胞外结构域并在昆虫细胞中表达为GST融合蛋白。GP67分泌信号肽保证了这四个结构域的分泌。昆虫细胞上清液经SDS-PAGE和Western印迹来鉴定到含有表位的结构域。
单克隆抗体CHIR-12.12能在还原和非还原条件下识别结构域2上的一个表位(表4；印迹未显示)。相反，单克隆抗体CHIR-5.9显示对结构域2的识别非常微弱(表4；印迹未显示)。在该项分析中，这些抗体均不识别结构域1、3或4。
表4.结构域2分析
Figure 2004800374894A00800031
为精确地确定mAb CHIR-12.12所识别的表位，合成了对应于以下序列的CD40的胞外结构域2的肽：PCGESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICT(SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12所示序列的残基61-104)。制备了含有35个10mer肽和1-氨基酸旁支(offset)的SPOT膜(Sigma)。用mAb CHIR-12.12和抗-人IgG β-半乳糖苷酶作为二抗进行Western印迹分析。剥下印迹用mAb CHIR-5.9再检测来确定该抗体识别的区域。
用10μg/ml的抗-CD40单克隆抗体CHIR-12.12检测作SPOT分析，点18-22得到阳性反应。这些肽覆盖区域的序列示于表5。
表5.用抗-CD40单克隆抗体CHIR-12.12检测作SPOT分析的结果
Figure 2004800374894A00800032
这些结果对应于线性表位：YCDPNL(SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12所示序列的残基82-87)。该表位含有预计参与CD40-CD40配体相互作用的Y82、D84和N86。
用mAb CHIR-5.9作SPOT分析显示，其对表6所示点20-22代表的肽识别弱，提示区域YCDPNLGL(SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12所示序列的残基82-89)参与了mAb CHIR-5.9与CD40的结合。应注意的是，在BIACORE分析中mAbs CHIR-12.12和CHIR-5.9可相互竞争与CD40结合。
表6.用抗-CD40单克隆抗体CHIR-5.9检测的SPOT的结果
Figure 2004800374894A00800041
SPOT分析鉴定到的线性表位位于CD40B1模块中。CD40B1模块的该序列是：HKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTIC(SEQ ID NO：10或12的残基80-103)。
在此线性表位中CHIR-12.12鉴定的是C83。已知该半胱氨酸残基与C103形成二硫键。CHIR-12.12mAb识别的构象表位可能含有该二硫键(C83-C103)和/或构象上接近C103的环绕氨基酸。
实施例5：在自身免疫和炎性疾病模型中测试
全身性红斑狼疮(SLE)模型
在人全身性红斑狼疮(SLE)的模型中测试了CHIR-12.12，该模型中将SLE患者的外周血单核细胞(PMBC)移入SCID小鼠。参见，例如Duchosal等，(1990)，J.Exp.Med.172：985-8所述的模型。
将SLE患者的PBMC移入SCID小鼠后，测定CHIR-12.12处理是否影响T淋巴细胞对自身抗原的应答和自身抗体的产生与疾病表现，例如肾小球肾炎。第一组研究测试了CHIR-12.12作为单一药物的作用，然后测试了它与其它药物，例如CTLA4-Ig联用的作用。
多发性硬化症模型
绒猴实验性自身免疫性脑炎(EAE)是人多发性硬化症的一种模型。参见，例如Raine等，(1999)，Ann.Neurol.46：144-60和Hart等，(2004)，Lancet Neurol.3：588-97所述的模型。CHIR12.12能与绒猴CD40结合故在该模型中测试了其效力。
炎症和动脉粥样硬化症
体外测试了CHIR-12.12抑制CD40L-诱导的基质降解酶的产生、组织因子表达、促炎性细胞因子和上调粘附分子的能力。随后的研究利用表达人CD40分子的转基因小鼠测试了CHIR-12.12体内抗炎症活性的能力。参见，例如Yasui，(2002)，Int.Immunol.14：319-29所述的模型。
移植
在非人灵长类模型中测试了CHIR-12.12防止移植排异的能力。用CHIR-12.12抗体处理弥猴肾同种异体移植受者来证明用或不用其它免疫抑制药物，例如环孢菌素、FK506、雷帕霉素、皮质类固醇、CTLA4-Ig和抗-B淋巴细胞刺激抗体等时对移植物接受的作用。参见，Wee等，(1992)，Transplantation 53：501-7所述的模型。
阿尔茨海默病
先在体外测试CHIR-12.12阻断小胶质细胞激活的能力。在表达人CD40和过度产生淀粉样-β肽的双重转基因小鼠中进行CHIR-12.12体外效力研究。参见，例如Tan等，(2002)Nat.Neurosci.5：1288-93所述的模型。
实施例6：用CHIR-5.9和CHIR-12.12进行的临床研究
临床目标
总目标是通过用拮抗性抗-CD40IgG1靶向细胞来提供类风湿性关节炎(RA)的有效疗法。虽然对活性的一些测量可在I期获得，但该疾病的信号在I期测定。先作为单一药物研究该药物，随后该药物与其它治疗性药物联用。
I期
·在患RA的对象中评价安全性和药代动力学-剂量递增。
·根据安全性、耐受性和CD40的血清标记变化选择剂量。一般用MTD，但其它效力指标(携带CD40+的细胞的消除等)也足够确定剂量。
·考虑一种以上的剂量，其中一些在II期中可能需要。
·患者每周给药并进行实时药代动力学(Pk)取样。最初4周一轮采用最大剂量。Pk根据疾病的状态、CD40密度等可能高度不同。
·该试验对RA患者公开。
·根据安全性、剂量和治疗活性的初步证据决定是否终止或继续研究。
·通过在II期测定的应答速率确定药物的活性。
·鉴定II期所用的剂量。
II期
在RA患者中进行几项试验。在随机化的II期方法中可能测试多种剂量或多种给药时间方案。
靶向不符合当前护理标准(standard of care)的RA(患者)群(非类固醇抗炎药(NSAID)和减轻症状类抗风湿药(DMARD；例如金和青霉胺)治疗均遭失败)
√根据II期治疗概念的证据决定是否终止或继续研究
√决定替代标记是否可用作临床效果的早期指标
√鉴定III期所用的剂量
III期
III期取决于在II期检测到的信号与何种竞争性疗法认为是标准的。如果信号是无治疗标准疾病阶段的信号，可采用单臂(single arm)、良好控制的研究作为关键性试验。如果认为有标准的竞争性药物，然后进行一对一(head-to-head)的研究。
实施例7：拮抗性抗-CD40抗体的液体药物制剂
为选择拮抗性抗-CD40抗体CHIR-12.12的最佳溶液环境，本项研究的目的是通过生物物理和生物化学方法检测溶液pH对该抗体稳定性的作用。示差扫描量热法(DSC)结果显示CHIR-12.12在pH 5.5-6.5的制剂中构象稳定性最佳。基于SDS-PAGE、体积排阻HPLC(SEC-HPLC)和离子交换HPLC(CEX-HPLC)分析的综合结果，CHIR-12.12在约pH 5.0-5.5时的理化稳定性最佳。鉴于这些结果，含有该抗体的一种推荐的液体药物制剂是用约10mM琥珀酸钠、约150mM氯化钠配制，pH约5.5、含有浓度约20mg/ml的CHIR-12.12的制剂。
材料与方法
用于制剂研究的CHIR-12.12抗体是通过CHO细胞培养方法产生的人单克隆抗体。该mAb的分子量为150kDa，由二硫键连接的两条轻链和两条重链组成。其靶向表达CD40的细胞，包括正常和恶性B细胞上的CD40细胞表面受体，可治疗各种癌症和自身免疫/炎性疾病。
用于本项研究的抗-CD40药物是散装的，得自CHO的纯化抗-CD40(CHIR-12.12)。该药物组合物是用10mM琥珀酸钠、150mM氯化钠配制，pH约6.5、浓度约9.7mg/ml的CHIR-12.12。该研究的对照样品是接受的药物，经≤-60℃冻结后在室温融化并在预定的时间点连同稳定性样品一起测试。如表7所示，用不同pH溶液透析该药物来制备稳定性样品并用UV280测定各样品的CHIR-12.12浓度。
表7.CHIR-12.12制剂
Figure 2004800374894A00800051
使用以下方案测定各种制剂中CHIR-12.12抗体的理化稳定性。
示差扫描量热法(DSC)
用MicroCal VP-DSC按1℃/分钟速度从15℃加热至90℃检测不同制剂样品的构象稳定性。
SDS-PAGE
用4-20％Tris-甘氨酸凝胶在非还原和还原条件下评估断裂和聚集。通过考马斯亮蓝染色法检测蛋白质。
体积排阻色谱(SEC-HPLC)
也通过Water Alliance HPLC检测蛋白质的断裂和聚集，所述HPLC使用Tosohaas TSK-GEL 3000SWXL柱，100mM磷酸钠、pH 7.0作为流动相，流速0.7ml/分钟。
离子交换色谱(CEX-HPLC)
用Waters 600s HPLC系统检测降解相关的荷电变化，所述HPLC系统使用Dionex Propac WCX-10柱，以50mM HEPE，pH 7.3作为流动相A和含有500mM NaCl的50mM HEPE，pH 7.3作为流动相B，流速0.5℃/分钟进行。
结果与讨论
构象稳定性研究
CHIR-12.12的热去折叠表明至少有两次热转换，可能分别代表Fab和Fc结构域的去折叠解链。在较高温度下，该蛋白质可能凝聚导致DSC信号丧失。出于制剂筛选目的，本项研究中将最低的热转换温度定义为解链温度，Tm。图5显示了作为制剂pH函数的热解链温度。较高的热解链温度表明pH 5.5-6.5的该制剂使得抗-CD40具有较高的构象稳定性。
SDS-PAGE分析
pH4.5-9.0的CHIR-12.12制剂样品于40℃孵育2个月，以SDS-PAGE分析(数据未显示)。在非还原条件下，在pH大于5.5的制剂中观察到分子量(MW)为23kDa和27kDa的抗体，在所有制剂中均观察到MW为51kDa的抗体，但在pH5.0-5.5的制剂中明显减少。pH 7.5和pH 9.0的制剂中可见MW为100kDa的抗体。
在还原条件下，CHIR-12.12还原为MW分别为50kDa和24kDa的游离重链和轻链。100kDa的抗体似乎不能完全被还原并随着溶液pH的增加而增多，提示在这些分子中可能发生非二硫共价键结合。由于SDS-PAGE上存在身份未知的其它分子，各制剂的稳定性比较根据CHIR-12.12的剩余纯度。pH 5.0-6.0的制剂为CHIR-12.12提供了更稳定的环境。SDS-PAGE几乎没检测到凝聚(数据未显示)。
SEC-HPLC分析
SEC-HPLC分析检测到作为主峰抗体的完整CHIR-12.12，与该主峰分离开的前峰抗体是凝聚的抗体，抗体大片段位于主峰后部的肩峰，抗体小片段在主峰后检测到。5℃和25℃温育3个月后，在上述制剂中检测到其量可忽略不计的蛋白质片段和凝聚物(＜1.0％)，CHIR-12.12主峰抗体纯度保持在99％以上(数据未显示)。然而，储存于40℃时，蛋白质片段逐步增加，如表8所示，更多的片段在pH 4.5和pH 6.5-9.0时形成。CHIR-12.12制剂40℃温育3个月后，在pH 7.5和pH 9.0的制剂中检测到约2-3％的凝聚物，而在其它pH的制剂中检测到不到1％的凝聚物(数据未显示)。SEC-HPLC结果表明CHIR-12.12在约pH 5.0-6.0时更稳定。
表8.CHIR-12.12稳定性样品在实时和加速储存条件下的SEC-HPLC结果
CEX-HPLC分析
CEX-HPLC分析检测到作为主峰抗体的完整的CHR-12.12，酸性变体早于主峰抗体洗脱，C-末端添加了赖氨酸的变体在主峰抗体之后洗脱。表9显示剩余的主峰CHIR-12.12抗体和酸性变体的百分比取决于溶液的pH。可能由于早期发酵和纯化方法所致，对照样品已经含有高比例的酸性抗体(约33％)。CHIR-12.12对pH较高的溶液敏感有两个事实证明。首先，pH 9.0的最初制剂样品(t＝0)已经比对照多产生了12％的酸性抗体。其次，随着pH上升酸性抗体的百分比急剧增加。可能由于脱氨基作用导致荷电变化相关的降解。上述数据表明CHIR-12.12抗体的此种降解在约pH 5.0-5.5处最少。
表9.在实时和加速储存条件下不同pH CHIR-12.12制剂的CEX-HPLC峰面积百分比
Figure 2004800374894A00800071
结论
pH对CHIR-12.12的构象和理化稳定性有显著影响。荷电变化相关的降解确定为CHIR-12.12的主要降解途径，该降解在pH 5.0-5.5时最少。根据总的稳定性数据，一种含有该抗体的推荐的液体药物制剂是用约10mM琥珀酸钠、约150mM氯化钠配制的pH约5.5、含浓度约20mg/ml的CHIR-12.12的制剂。
本文所述发明所属领域的技术人员可从本文的描述和相关附图中获益进而可对本发明作出许多改进和其它实施方案。因此，应该理解的是本发明不受限于以上公开的具体实施方案，所述改进和其它实施方案均包括在附加权利要求所确定的范围内和本文所公开的实施方案内。虽然本文使用了特定的术语，但它们仅是用于一般性描述，目的不是限制的本发明。
本说明书中述及的所有出版物和专利申请表明了本发明所属领域技术人员的水平。如同每篇单独出版物或专利申请具体且独立地用作参考一样，所有出版物和专利申请的内容纳入本文作为参考。
序列表
序列表
<110>L.隆(Long，Li)
M.卢克曼(Luqman，Mohammad)
A.亚巴娜发(Yabannavar，Asha)
I.扎罗(Zaror，Isabel)
 
<120>治疗自身免疫和炎性疾病以及器官移植排异的拮抗性抗-CD40抗体的应用
 
<130>PP23725.001(284072)
 
<150>60/565,710
<151>2004-04-27
 
<150>60/525,579
<151>2003-11-26
 
<150>60/517,337
<151>2003-11-04
 
<160>12
 
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
 
<210>1
<211>720
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>CHIR-12.12人抗-CD40抗体轻链的编码序列
 
<221>CDS
<222>(1)...(720)
 
<400>1
atg gcg ctc cct gct cag ctc ctg ggg ctg cta atg ctc tgg gtc tct  48
Met Ala Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Ser
 1               5                   10                  15
gga tcc agt ggg gat att gtg atg act cag tct cca ctc tcc ctg acc  96
Gly Ser Ser Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Thr
             20                  25                  30
gtc acc cct gga gag ccg gcc tcc atc tcc tgc agg tcc agt cag agc    144
Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser
         35                  40                  45
ctc ctg tat agt aat gga tac aac tat ttg gat tgg tac ctg cag aag    192
Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys
     50                  55                  60
cca ggg cag tct cca cag gtc ctg atc tct ttg ggt tct aat cgg gcc    240
Pro Gly Gln Ser Pro Gln Val Leu Ile Ser Leu Gly Ser Asn Arg Ala
65                  70                  75                  80
tcc ggg gtc cct gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggc aca gat ttt    288
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
                 85                  90                  95
aca ctg aaa atc agc aga gtg gag gct gag gat gtt ggg gtt tat tac    336
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr
            100                 105                 110
tgc atg caa gct cga caa act cca ttc act ttc ggc cct ggg acc aaa    384
Cys Met Gln Ala Arg Gln Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys
        115                 120                 125
gtg gat atc aga cga act gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg    432
Val Asp Ile Arg Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
    130                 135                 140
cca tct gat gag cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg    480
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
145                 150                 155                 160
ctg aat aac ttc tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat    528
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
                165                 170                 175
aac gcc ctc caa tcg ggt aac tcc cag gag agt  gtc aca gag cag gac   576
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
            180                 185                 190
agc aag gac agc acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa    624
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
        195                 200                 205
gca gac tac gag aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag    672
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
    210                 215                 220
ggc ctg agc tcg ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgttag     720
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys *
225                 230                 235
 
<210>2
<211>239
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>CHIR-12.12人抗-CD40抗体轻链
 
<400>2
Met Ala Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Ser
 1               5                  10                  15
Gly Ser Ser Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Thr
            20                  25                  30
Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys
    50                  55                  60
Pro Gly Gln Ser Pro Gln Val Leu Ile Ser Leu Gly Ser Asn Arg Ala
65                  70                  75                  80
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
                85                  90                  95
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr
            100                 105                 110
Cys Met Gln Ala Arg Gln Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys
        115                 120                 125
Val Asp Ile Arg Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
    130                 135                 140
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
145                 150                 155                 160
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
                165                 170                 175
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
            180                 185                 190
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
        195                 200                 205
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
    210                 215                 220
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225                 230                 235
 
<210>3
<211>2016
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>CHIR-12.12人抗-CD40抗体重链的编码序列(包括内含子)
 
<400>3
atggagtttg ggctgagctg ggttttcctt gttgctattt taagaggtgt ccagtgtcag   60
gtgcagttgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc  120
tgtgcagcct ctggattcac cttcagtagc tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca  180
ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata tcatatgagg aaagtaatag ataccatgca  240
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagatcac gctgtatctg  300
caaatgaaca gcctcagaac tgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag agatgggggt  360
atagcagcac ctgggcctga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcagca  420
agtaccaagg gcccatccgt cttccccctg gcgcccgcta gcaagagcac ctctgggggc  480
acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg  540
aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga  600
ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac  660
atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagagt tggtgagagg  720
ccagcacagg gagggagggt gtctgctgga agccaggctc agcgctcctg cctggacgca  780
tcccggctat gcagtcccag tccagggcag caaggcaggc cccgtctgcc tcttcacccg  840
gaggcctctg cccgccccac tcatgctcag ggagagggtc ttctggcttt ttccccaggc  900
tctgggcagg cacaggctag gtgcccctaa cccaggccct gcacacaaag gggcaggtgc  960
tgggctcaga cctgccaaga gccatatccg ggaggaccct gcccctgacc taagcccacc 1020
ccaaaggcca aactctccac tccctcagct cggacacctt ctctcctccc agattccagt 1080
aactcccaat cttctctctg cagagcccaa atcttgtgac aaaactcaca catgcccacc 1140
gtgcccaggt aagccagccc aggcctcgcc ctccagctca aggcgggaca ggtgccctag 1200
agtagcctgc atccagggac aggccccagc cgggtgctga cacgtccacc tccatctctt 1260
cctcagcacc tgaactcctg gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg 1320
acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg 1380
aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga 1440
caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc 1500
tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc 1560
cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaaggtgg gacccgtggg gtgcgagggc 1620
cacatggaca gaggccggct cggcccaccc tctgccctga gagtgaccgc tgtaccaacc 1680
tctgtcccta cagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag 1740
gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1800
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1860
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1920
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1980
acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaatga                           2016
 
<210>4
<211>469
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>CHIR-12.12人抗-CD40抗体重链
 
<400>4
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Arg Gly
 1               5                  10                  15
Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln
            20                  25                  30
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
        35                  40                  45
Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Tyr Glu Glu Ser Asn Arg Tyr His Ala
65                  70                  75                  80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ile
                85                  90                  95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Gly Ile Ala Ala Pro Gly Pro Asp Tyr
        115                 120                 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
    130                 135                 140
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ala Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
145                 150                 155                 160
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
                165                 170                 175
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
            180                 185                 190
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
        195                 200                 205
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
    210                 215                 220
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys
225                 230                 235                 240
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
                245                 250                 255
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
            260                 265                 270
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
        275                 280                 285
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
    290                 295                 300
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
305                 310                 315                 320
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
                325                 330                 335
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
            340                 345                 350
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
        355                 360                 365
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
    370                 375                 380
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
385                 390                 395                 400
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
                405                 410                 415
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
            420                 425                 430
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
        435                 440                 445
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
    450                 455                 460
Leu Ser Pro Gly Lys
465
 
<210>5
<211>469
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>CHIR-12.12人抗-CD40抗体变体的重链
<400>5
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Arg Gly
 1               5                  10                  15
Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln
            20                  25                  30
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
        35                  40                  45
Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Tyr Glu Glu Ser Asn Arg Tyr His Ala
65                  70                  75                  80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ile
                85                  90                  95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Gly Ile Ala Ala Pro Gly Pro Asp Tyr
        115                 120                 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
    130                 135                 140
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
145                 150                 155                 160
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
                165                 170                 175
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
            180                 185                 190
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
        195                 200                 205
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
    210                 215                 220
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys
225                 230                 235                 240
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
                245                 250                 255
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
            260                 265                 270
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
        275                 280                 285
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
    290                 295                 300
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
305                 310                 315                 320
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
                325                 330                 335
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
            340                 345                 350
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
        355                 360                 365
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
    370                 375                 380
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
385                 390                 395                 400
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
                405                 410                 415
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
            420                 425                 430
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
        435                 440                 445
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
    450                 455                 460
Leu Ser Pro Gly Lys
465
 
<210>6
<211>239
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>CHIR-5.9人抗-CD40抗体轻链
 
<400>6
Met Ala Leu Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Pro
 1                5                 10                  15
Gly Ser Ser Gly Ala Ile Val Met Thr Gln Pro Pro Leu Ser Ser Pro
            20                  25                  30
Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Val His Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg
    50                  55                  60
Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Phe Phe Arg Arg Leu
65                  70                  75                  80
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe
                85                  90                  95
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr
            100                 105                 110
Cys Met Gln Val Thr Gln Phe Pro His Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ala Ser Lys
145                 150                 155                 160
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
                165                 170                 175
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
            180                 185                 190
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
        195                 200                 205
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
    210                 215                 220
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
225                 230                 235                 240
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
                245                 250                 255
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
            260                 265                 270
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
        275                 280                 285
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
    290                 295                 300
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
305                 310                 315                 320
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
                325                 330                 335
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
            340                 345                 350
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
        355                 360                 365
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
    370                 375                 380
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
385                 390                 395                 400
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
                405                 410                 415
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
            420                 425                 430
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
        435                 440                 445
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
    450                 455                 460
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465                 470
<210>8
<211>474
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>CHIR-5.9人抗-CD40抗体变体的重链
 
<400>8
Met Gly Ser Thr Ala Ile Leu Ala Leu Leu Leu Ala Val Leu Gln Gly
 1               5                  10                  15
Val Cys Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
            20                  25                  30
Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe
        35                  40                  45
Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser
65                  70                  75                  80
Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser
                85                  90                  95
Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Ala Ala Gly Arg Asp Tyr Tyr Tyr Tyr
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Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
    130                 135                 140
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
145                 150                 155                 160
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
                165                 170                 175
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
            180                 185                 190
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
        195                 200                 205
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
    210                 215                 220
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
225                 230                 235                 240
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Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
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       275                 280                 285
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
    290                 295                 300
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
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Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
                325                 330                 335
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
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Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
        355                 360                 365
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
    370                 375                 380
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
385                 390                 395                 400
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
                405                 410                 415
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
            420                 425                 430
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
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    450                 455                 460
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465                 470
 
<210>9
<211>612
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(612)
 
<221>misc_feature
<222>(0)...(0)
<223>人CD40短同种型的编码序列
 
<400>9
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Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr
 1               5                   10                  15
gct gtc cat cca gaa cca ccc act gca tgc aga gaa aaa cag tac cta     96
Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu
             20                  25                  30
ata aac agt cag tgc tgt tct ttg tgc cag cca gga cag aaa ctg gtg    144
Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val
         35                  40                  45
agt gac tgc aca gag ttc act gaa acg gaa tgc ctt cct tgc ggt gaa    192
Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu
     50                  55                  60
agc gaa ttc cta gac acc tgg aac aga gag aca cac tgc cac cag cac    240
Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His
65                  70                  75                  80
aaa tac tgc gac ccc aac cta ggg ctt cgg gtc cag cag aag ggc acc    288
Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr
                 85                  90                  95
tca gaa aca gac acc atc tgc acc tgt gaa gaa ggc tgg cac tgt acg    336
Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr
            100                 105                 110
agt gag gcc tgt gag agc tgt gtc ctg cac cgc tca tgc tcg ccc ggc    384
Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly
        115                 120                 125
ttt ggg gtc aag cag att gct aca ggg gtt tct gat acc atc tgc gag    432
Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp ThrIle Cys Glu
    130                 135                 140
ccc tgc cca gtc ggc ttc ttc tcc aat gtg tca tct gct ttc gaa aaa    480
Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys
145                 150                 155                 160
tgt cac cct tgg aca agg tcc cca gga tcg gct gag agc cct ggt ggt    528
Cys His Pro Trp Thr Arg Ser Pro Gly Ser Ala Glu Ser Pro Gly Gly
                165                 170                 175
gat ccc cat cat ctt cgg gat cct gtt tgc cat cct ctt ggt gct ggt    576
Asp Pro His His Leu Arg Asp Pro Val Cys His Pro Leu Gly Ala Gly
            180                 185                 190
ctt tat caa aaa ggt ggc caa gaa gcc aac caa taa                 612
Leu Tyr Gln Lys Gly Gly Gln Glu Ala Asn Gln*
        195                 200
 
<210>10
<211>203
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
 
<400>10
Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr
 1               5                  10                  15
Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu
            20                  25                  30
Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val
        35                  40                  45
Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu
    50                  55                  60
Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His
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Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr
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Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr
            100                 105                 110
Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly
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Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu
    130                 135                 140
Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys
145                 150                 155                 160
Cys His Pro Trp Thr Arg Ser Pro Gly Ser Ala Glu Ser Pro Gly Gly
                165                 170                 175
Asp Pro His His Leu Arg Asp Pro Val Cys His Pro Leu Gly Ala Gly
            180                 185                 190
Leu Tyr Gln Lys Gly Gly Gln Glu Ala Asn Gln
        195                 200
 
<210>11
<211>834
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(834)
 
<221>misc_feature
<222>(0)...(0)
<223>人CD40长同种型的编码序列
 
<400>11
atg gtt cgt ctg cct ctg cag tgc gtc ctc tgg ggc tgc ttg ctg acc   48
Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr
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gct gtc cat cca gaa cca ccc act gca tgc aga gaa aaa cag tac cta   96
Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu
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Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val
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agt gac tgc aca gag ttc act gaa acg gaa tgc ctt cct tgc ggt gaa  192
Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu
     50                  55                  60
agc gaa ttc cta gac acc tgg aac aga gag aca cac tgc cac cag cac  240
Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His
65                  70                  75                  80
aaa tac tgc gac ccc aac cta ggg ctt cgg gtc cag cag aag ggc acc  288
Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr
                 85                  90                  95
tca gaa aca gac acc atc tgc acc tgt gaa gaa ggc tgg cac tgt acg  336
Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr
            100                 105                 110
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Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly
        115                 120                 125
ttt ggg gtc aag cag att gct aca ggg gtt tct gat acc atc tgc gag  432
Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu
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ccc tgc cca gtc ggc ttc ttc tcc aat gtg tca tct gct ttc gaa aaa  480
Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys
145                 150                 155                 160
tgt cac cct tgg aca agc tgt gag acc aaa gac ctg gtt gtg caa cag  528
Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln
                165                 170                 175
gca ggc aca aac aag act gat gtt gtc tgt ggt ccc cag gat cgg ctg  576
Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu
            180                 185                 190
aga gcc ctg gtg gtg atc ccc atc atc ttc ggg atc ctg ttt gcc atc  624
Arg Ala Leu Val Val Ile Pro Ile Ile Phe Gly Ile Leu Phe Ala Ile
        195                 200                 205
ctc ttg gtg ctg gtc ttt atc aaa aag gtg gcc aag aag cca acc aat  672
Leu Leu Val Leu Val Phe Ile Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn
    210                 215                 220
aag gcc ccc cac ccc aag cag gaa ccc cag gag atc aat ttt ccc gac  720
Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp
225                 230                 235                 240
gat ctt cct ggc tcc aac act gct gct cca gtg cag gag act tta cat  768
Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His
                245                 250                 255
gga tgc caa ccg gtc acc cag gag gat ggc aaa gag agt cgc atc tca  816
Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser
            260                 265                 270
gtg cag gag aga cag tga                                          834
Val Gln Glu Arg Gln*
        275
 
<210>12
<211>277
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>12
Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr
 1               5                  10                  15
Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu
             20                  25                  30
Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val
         35                  40                  45
Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu
     50                  55                  60
Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His
65                  70                  75                  80
Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr
                 85                  90                  95
Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr
            100                 105                 110
Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly
        115                 120                 125
Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu
    130                 135                 140
Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys
145                 150                 155                 160
Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu VaL VaL Gln Gln
                165                 170                 175
Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu
            180                 185                 190
Arg Ala Leu Val Val Ile Pro Ile Ile Phe Gly Ile Leu Phe Ala Ile
        195                 200                 205
Leu Leu Val Leu Val Phe Ile Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn
    210                 215                 220
Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp
225                 230                 235                 240
Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His
                245                 250                 255
Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser
            260                 265                 270
Val Gln Glu Arg Gln
        275

Claims (38)

1.有效量的能特异性结合表达于人CD40表达细胞表面上的人CD40抗原的人抗-CD40单克隆抗体在制备治疗人的炎性疾病或自身免疫疾病的药物中的用途，所述炎性疾病或自身免疫疾病由表达该CD40抗原的细胞上的CD40配体介导的CD40信号介导，所述单克隆抗体当结合所述细胞表面表达的CD40抗原时无明显的激动活性，所述人抗-CD40单克隆抗体选自：
a)与人CD40的表位相结合的单克隆抗体，其中，所述人CD40的表位与单克隆抗体CHIR-5.9或单克隆抗体CHIR-12.12结合，所述单克隆抗体CHIR-5.9可获自在ATCC以专利保藏号PTA-5542保藏的杂交瘤细胞系，所述单克隆抗体CHIR-12.12可获自在ATCC以专利保藏号PTA-5543保藏的杂交瘤细胞系；
b)与人CD40的表位结合的单克隆抗体，其中，所述表位含有SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12所示人CD40序列的残基82-87；
c)与人CD40的表位结合的单克隆抗体，其中，所述表位含有SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12所示人CD40序列的残基82-89；和
d)在竞争性结合试验中与单克隆抗体CHIR-5.9或CHIR-12.12竞争结合人CD40的单克隆抗体，其中，所述单克隆抗体CHIR-5.9可获自在ATCC以专利保藏号PTA-5542保藏的杂交瘤细胞系，所述单克隆抗体CHIR-12.12可获自在ATCC以专利保藏号PTA-5543保藏的杂交瘤细胞系。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述炎性疾病或自身免疫疾病选自：全身性红斑狼疮(SLE)、盘状狼疮、狼疮性肾炎、结节病、青少年关节炎、类风湿性关节炎、银屑病关节炎、莱特尔综合征、强直性脊柱炎、痛风性关节炎、器官或组织移植排异、移植物抗宿主病、多发性硬化、高IgE综合征、结节性多动脉炎、原发性胆汁性肝硬化、炎性肠病、克罗恩病、腹腔疾病(谷蛋白敏感性肠病)、自身免疫肝炎、恶性贫血、自身免疫溶血性贫血、银屑病、硬皮病、重症肌无力、自身免疫血小板减少性紫癜、自身免疫甲状腺炎、格雷夫斯病、桥本甲状腺炎、免疫复合物病、慢性疲劳免疫功能失调综合征(CFIDS)、多肌炎和皮肌炎、冷球蛋白血症、血栓溶解、心肌病、寻常型天疱疮、肺间质纤维化、结节病、I型和II型糖尿病、1、2、3和4型迟发型超敏、过敏或过敏病症、哮喘、Churg-Strauss综合征(过敏性肉芽肿病)、特异性皮炎、过敏性和刺激性接触性皮炎、荨麻疹、IgE-介导的过敏症、动脉粥样硬化症、脉管炎、先天性炎性肌病、溶血性疾病、阿尔茨海默病、慢性炎性脱髓鞘多发神经病变。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述单克隆抗体选自下组：
a）含有轻链可变区和重链可变区的单克隆抗体，其中，所述轻链可变区含有SEQ ID NO：2的互补决定区(CDR)残基，所述重链可变区含有SEQ ID NO：4的互补决定区(CDR)残基；和
b）含有轻链可变区和重链可变区的单克隆抗体，其中，所述轻链可变区含有SEQ ID NO：6的互补决定区(CDR)残基，所述重链可变区含有SEQ ID NO：7的互补决定区(CDR)残基。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述单克隆抗体含有选自下组的氨基酸序列：
a）SEQ ID NO:2的残基21－132；
b）SEQ ID NO:2的残基21－239；
c）SEQ ID NO:2；
d）SEQ ID NO:4的残基20－139；
e）SEQ ID NO:4的残基20－469；
f）SEQ ID NO:4；
g）SEQ ID NO:5的残基20－469；
h）SEQ ID NO:5；
i）SEQ ID NO:2的残基21－132和SEQ ID NO:4的残基20－139；
j）SEQ ID NO:2的残基21－239和SEQ ID NO:4的残基20－469；
k）SEQ ID NO:2的残基21－239和SEQ ID NO:5的残基20－469；
l）SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4；和
m）SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:5。
5.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述单克隆抗体含有选自下组的氨基酸序列：
a）SEQ ID NO:6的残基21－132；
b）SEQ ID NO:6的残基21－239；
c）SEQ ID NO:6；
d）SEQ ID NO:7的残基20－144；
e）SEQ ID NO:7的残基20－474；
f）SEQ ID NO:7；
g）SEQ ID NO:8的残基20－474；
h）SEQ ID NO:8；
i）SEQ ID NO:6的残基21－132和SEQ ID NO:7的残基20－144；
j）SEQ ID NO:6的残基21－239和SEQ ID NO:7的残基20－474；
k）SEQ ID NO:6的残基21－239和SEQ ID NO:8的残基20－474；
l）SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7；和
m）SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8。
6.如权利要求3－5中任一项所述的用途，其特征在于，所述抗体以至少10-6M的亲合力（KD）与人CD40抗原结合。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述抗体以至少10-8M的亲合力（KD）与人CD40抗原结合。
8.如权利要求3－5中任一项所述的用途，其特征在于，所述抗体选自：
a）单克隆抗体CHIR-5.9或其抗原结合片段，其中，所述单克隆抗体CHIR-5.9可获自在ATCC以专利保藏号PTA-5542保藏的杂交瘤细胞系；
b）单克隆抗体CHIR-12.12或其抗原结合片段，其中，所述单克隆抗体CHIR-12.12可获自在ATCC以专利保藏号PTA-5543保藏的杂交瘤细胞系；
其中，所述片段保留了特异性结合所述人CD40抗原的能力，并选自Fab片段、F(ab’)2片段、Fv片段和单链Fv片段。
9.如权利要求3－5中任一项所述的用途，其特征在于，所述单克隆抗体是抗原结合片段，该抗原结合片段保留了特异性结合所述人CD40抗原的能力，并选自Fab片段、F(ab’)2片段、Fv片段和单链Fv片段。
10.如权利要求3－5中任一项所述的用途，其特征在于，所述单克隆抗体在CHO细胞系中产生。
11.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述单克隆抗体或其抗原结合片段在CHO细胞系中产生。
12.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述单克隆抗体在CHO细胞系中产生。
13.有效量的能特异性结合人CD40表达细胞表面表达的人CD40抗原的人抗-CD40单克隆抗体在制备治疗人的移植排异用的药物中的用途，所述单克隆抗体当结合所述细胞表面表达的CD40抗原时无明显的激动活性，所述人抗-CD40单克隆抗体选自：
a)与人CD40的表位相结合的单克隆抗体，其中，所述人CD40的表位与单克隆抗体CHIR-5.9或单克隆抗体CHIR-12.12结合，所述单克隆抗体CHIR-5.9可获自在ATCC以专利保藏号PTA-5542保藏的杂交瘤细胞系，所述单克隆抗体CHIR-12.12可获自在ATCC以专利保藏号PTA-5543保藏的杂交瘤细胞系；
b)与人CD40的表位结合的单克隆抗体，其中所述表位含有SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12所示人CD40序列的残基82-87；
c)与人CD40的表位结合的单克隆抗体，其中所述表位含有SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12所示人CD40序列的残基82-89；和
d)在竞争性结合试验中与单克隆抗体CHIR-5.9或CHIR-12.12竞争结合人CD40的单克隆抗体，其中，所述单克隆抗体CHIR-5.9可获自在ATCC以专利保藏号PTA-5542保藏的杂交瘤细胞系，所述单克隆抗体CHIR-12.12可获自在ATCC以专利保藏号PTA-5543保藏的杂交瘤细胞系。
14.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述治疗还包括给予用药学上可接受的赋形剂配制的免疫抑制药物。
15.如权利要求14所述的用途，其特征在于，所述免疫抑制药物选自：环孢菌素、FK506、雷帕霉素、皮质类固醇、CTLA4-Ig和抗-B淋巴细胞刺激抗体。
16.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述单克隆抗体选自下组：
a）含有轻链可变区和重链可变区的单克隆抗体，其中，所述轻链可变区含有SEQ ID NO：2的互补决定区(CDR)残基，所述重链可变区含有SEQ ID NO：4的互补决定区(CDR)残基；和
b）含有轻链可变区和重链可变区的单克隆抗体，其中，所述轻链可变区含有SEQ ID NO：6的互补决定区(CDR)残基，所述重链可变区含有SEQ ID NO：7的互补决定区(CDR)残基。
17.如权利要求16所述的用途，其特征在于，所述单克隆抗体含有选自下组的氨基酸序列：
a）SEQ ID NO:2的残基21－132；
b）SEQ ID NO:2的残基21－239；
c）SEQ ID NO:2；
d）SEQ ID NO:4的残基20－139；
e）SEQ ID NO:4的残基20－469；
f）SEQ ID NO:4；
g）SEQ ID NO:5的残基20－469；
h）SEQ ID NO:5；
i）SEQ ID NO:2的残基21－132和SEQ ID NO:4的残基20－139；
j）SEQ ID NO:2的残基21－239和SEQ ID NO:4的残基20－469；
k）SEQ ID NO:2的残基21－239和SEQ ID NO:5的残基20－469；
l）SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4；和
m）SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:5。
18.如权利要求16所述的用途，其特征在于，所述单克隆抗体含有选自下组的氨基酸序列：
a）SEQ ID NO:6的残基21－132；
b）SEQ ID NO:6的残基21－239；
c）SEQ ID NO:6；
d）SEQ ID NO:7的残基20－144；
e）SEQ ID NO:7的残基20－474；
f）SEQ ID NO:7；
g）SEQ ID NO:8的残基20－474；
h）SEQ ID NO:8；
i）SEQ ID NO:6的残基21－132和SEQ ID NO:7的残基20－144；
j）SEQ ID NO:6的残基21－239和SEQ ID NO:7的残基20－474；
k）SEQ ID NO:6的残基21－239和SEQ ID NO:8的残基20－474；
l）SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7；和
m）SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8。
19.如权利要求16－18中任一项所述的用途，其特征在于，所述抗体以至少10-6M的亲合力（KD）与人CD40抗原结合。
20.如权利要求19所述的用途，其特征在于，所述抗体以至少10-8M的亲合力（KD）与人CD40抗原结合。
21.如权利要求16－18中任一项所述的用途，其特征在于，所述抗体选自：
a）单克隆抗体CHIR-5.9或其抗原结合片段，其中，所述单克隆抗体CHIR-5.9可获自在ATCC以专利保藏号PTA-5542保藏的杂交瘤细胞系；
b）单克隆抗体CHIR-12.12或其抗原结合片段，其中，所述单克隆抗体CHIR-12.12可获自在ATCC以专利保藏号PTA-5543保藏的杂交瘤细胞系；
其中，所述片段保留了特异性结合所述人CD40抗原的能力，并选自Fab片段、F(ab’)2片段、Fv片段和单链Fv片段。
22.如权利要求16－18中任一项所述的用途，其特征在于，所述单克隆抗体是抗原结合片段，该抗原结合片段保留了特异性结合所述人CD40抗原的能力，并选自Fab片段、F(ab’)2片段、Fv片段和单链Fv片段。
23.如权利要求16－18中任一项所述的用途，其特征在于，所述单克隆抗体在CHO细胞系中产生。
24.如权利要求21所述的用途，其特征在于，所述单克隆抗体或其抗原结合片段在CHO细胞系中产生。
25.如权利要求22所述的用途，其特征在于，所述单克隆抗体在CHO细胞系中产生。
26.有效量的能特异性结合人CD40表达细胞表面表达的人CD40抗原的人抗-CD40单克隆抗体在制备治疗人的类风湿性关节炎用的药物中的用途，所述单克隆抗体当结合所述细胞表面表达的CD40抗原时无明显的激动活性，所述人抗-CD40单克隆抗体选自：
a)与人CD40的表位相结合的单克隆抗体，其中，所述人CD40的表位与单克隆抗体CHIR-5.9或单克隆抗体CHIR-12.12结合，所述单克隆抗体CHIR-5.9可获自在ATCC以专利保藏号PTA-5542保藏的杂交瘤细胞系，所述单克隆抗体CHIR-12.12可获自在ATCC以专利保藏号PTA-5543保藏的杂交瘤细胞系；
b)与人CD40的表位结合的单克隆抗体，其中，所述表位含有SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12所示人CD40序列的残基82-87；
c)与人CD40的表位结合的单克隆抗体，其中，所述表位含有SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12所示人CD40序列的残基82-89；和
d)在竞争性结合试验中与单克隆抗体CHIR-5.9或CHIR-12.12竞争结合人CD40的单克隆抗体，其中，所述单克隆抗体CHIR-5.9可获自在ATCC以专利保藏号PTA-5542保藏的杂交瘤细胞系，所述单克隆抗体CHIR-12.12可获自在ATCC以专利保藏号PTA-5543保藏的杂交瘤细胞系。
27.如权利要求26所述的用途，其特征在于，所述治疗还包括给予用药学上可接受的赋形剂配制的免疫抑制药物。
28.如权利要求27所述的用途，其特征在于，所述免疫抑制药物选自环孢菌素、FK506、雷帕霉素、皮质类固醇、CTLA4-Ig、抗-CD20抗体和抗-B淋巴细胞刺激抗体。
29.如权利要求26所述的用途，其特征在于，所述单克隆抗体选自：
a）含有轻链可变区和重链可变区的单克隆抗体，其中，所述轻链可变区含有SEQ ID NO：2的互补决定区(CDR)残基，所述重链可变区含有SEQ ID NO：4的互补决定区(CDR)残基；和
b）含有轻链可变区和重链可变区的单克隆抗体，其中，所述轻链可变区含有SEQ ID NO：6的互补决定区(CDR)残基，所述重链可变区含有SEQ ID NO：7的互补决定区(CDR)残基。
30.如权利要求29所述的用途，其特征在于，所述单克隆抗体含有选自以下的氨基酸序列：
a）SEQ ID NO:2的残基21－132；
b）SEQ ID NO:2的残基21－239；
c）SEQ ID NO:2；
d）SEQ ID NO:4的残基20－139；
e）SEQ ID NO:4的残基20－469；
f）SEQ ID NO:4；
g）SEQ ID NO:5的残基20－469；
h）SEQ ID NO:5；
i）SEQ ID NO:2的残基21－132和SEQ ID NO:4的残基20－139；
j）SEQ ID NO:2的残基21－239和SEQ ID NO:4的残基20－469；
k）SEQ ID NO:2的残基21－239和SEQ ID NO:5的残基20－469；
l）SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4；和
m）SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:5。
31.如权利要求29所述的用途，其特征在于，所述单克隆抗体含有选自下组的氨基酸序列：
a）SEQ ID NO:6的残基21－132；
b）SEQ ID NO:6的残基21－239；
c）SEQ ID NO:6；
d）SEQ ID NO:7的残基20－144；
e）SEQ ID NO:7的残基20－474；
f）SEQ ID NO:7；
g）SEQ ID NO:8的残基20－474；
h）SEQ ID NO:8；
i）SEQ ID NO:6的残基21－132和SEQ ID NO:7的残基20－144；
j）SEQ ID NO:6的残基21－239和SEQ ID NO:7的残基20－474；
k）SEQ ID NO:6的残基21－239和SEQ ID NO:8的残基20－474；
l）SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7；和
m）SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8。
32.如权利要求29－31中任一项所述的用途，其特征在于，所述抗体以至少10-6M的亲合力（KD）与人CD40抗原结合。
33.如权利要求32所述的用途，其特征在于，所述抗体以至少10-8M的亲合力（KD）与人CD40抗原结合。
34.如权利要求29－31中任一项所述的用途，其特征在于，所述抗体选自：
a）单克隆抗体CHIR-5.9或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体CHIR-5.9可获自在ATCC以专利保藏号PTA-5542保藏的杂交瘤细胞系；和
b）单克隆抗体CHIR-12.12或其抗原结合片段，其中，所述单克隆抗体CHIR-12.12可获自在ATCC以专利保藏号PTA-5543保藏的杂交瘤细胞系；
其中，所述片段保留了特异性结合所述人CD40抗原的能力，并选自Fab片段、F(ab’)2片段、Fv片段和单链Fv片段。
35.如权利要求29－31中任一项所述的用途，其特征在于，所述单克隆抗体是抗原结合片段，所述片段保留了特异性结合所述人CD40抗原的能力，并选自Fab片段、F(ab’)2片段、Fv片段和单链Fv片段。
36.如权利要求29－31中任一项所述的用途，其特征在于，所述单克隆抗体在CHO细胞系中产生。
37.如权利要求34所述的用途，其特征在于，所述单克隆抗体在CHO细胞系中产生。
38.如权利要求35所述的用途，其特征在于，所述单克隆抗体在CHO细胞系中产生。
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