JP2008502309A - アントゴニスト抗ｃｄ４０モノクローナル抗体およびそれらを使用するための方法 - Google Patents

アントゴニスト抗ｃｄ４０モノクローナル抗体およびそれらを使用するための方法 Download PDF

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Abstract

ＣＤ４０発現細胞上のＣＤ４０シグナル伝達の刺激により媒介される疾患を処置するための処置方法を提供する。本方法は、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントの治療有効量を、それを必要とする患者に投与する工程を包含する。アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、有意なアゴニスト活性を有さないが、ヒトＣＤ４０発現細胞上のＣＤ４０抗原に抗体が結合した場合にアンタゴニスト活性を示す。抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントのアンタゴニスト活性はＢ細胞のようなヒトＣＤ４０発現細胞の増殖および／または分化を好都合に阻害する。

Description

（発明の分野）
本発明はＣＤ４０に結合できるヒト抗体、抗体の使用方法、および、ＣＤ４０発現細胞上のＣＤ４０シグナル伝達の刺激により媒介される疾患の処置方法に関する。
（発明の背景）
Ｂ細胞は正常なインビボの免疫応答の間に重要な役割を果たす。外来抗原は特定のＢ細胞上の表面免疫グロブリンに結合し、エンドサイトーシス、プロセシング、ＭＨＣ−クラスＩＩ分子上へのプロセシングされたペプチドの提示、およびＢ細胞表面上のＢ７抗原のアップレギュレーションを含む事象の連鎖をトリガーする。次に特定のＴ細胞がＭＨＣ−クラスＩＩ分子上の提示されたプロセシングされた抗原のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）認識を介してＢ細胞に結合する。ＴＣＲを介した刺激はＴ細胞を活性化し、そしてＴ細胞のサイトカイン生産を開始させる。更にＴ細胞を活性化させる第２のシグナルはＴ細胞上のＣＤ２８抗原とＢ細胞上のＢ７抗原の間の相互作用である。上記したシグナルを受け取ると、静止期のヒトＴ細胞上には発現されないＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０ＬまたはＣＤ１５４）がＴ細胞表面上でアップレギュレートされる。Ｂ細胞表面上のＣＤ４０抗原へのＣＤ４０リガンドの結合はＢ細胞を刺激し、Ｂ細胞を可溶性免疫グロブリンの高水準を分泌するプラズマ細胞へとＢ細胞を成熟させる。
ＣＤ４０は正常および新生物性のヒトＢ細胞の両方、樹状細胞、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、内皮細胞、単球および状脾細胞の表面上に存在する５５ｋＤａの細胞表面抗原である。軽度悪性および高度悪性のＢ細胞リンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病およびホジキン病を有する患者に由来する形質転換細胞はＣＤ４０を発現する。ＣＤ４０発現はまた急性骨髄芽球性白血病症例の三分の二およびエイズ関連リンパ腫の５０％において検出される。Ｂ細胞株の数種の腫瘍に由来する悪性Ｂ細胞は高度のＣＤ４０を発現し、そして生存および増殖のためにはＣＤ４０シグナル伝達に依存していると考えられる。
免疫芽球性Ｂ細胞リンパ腫は免疫無防備状態の個体、例えば同種移植片のレシピエントおよび他の長期免疫抑制療法を受けているもの、エイズ患者および一次免疫不全症候群、例えばＸ関連リンパ増殖症候群またはＷｉｓｃｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ症候群を有する患者において生じる場合が多い（非特許文献１；非特許文献２）。
ＣＤ４０抗原はヒト神経成長因子（ＮＧＦ）受容体、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）受容体およびＦａｓに関連しており、ＣＤ４０がＢ細胞の活性化における重要な機能を有するリガンドに対する受容体であることを示唆している。ＡＰＣ上のＣＤ４０の発現はＴヘルパーおよび細胞毒性Ｔリンパ球の両方の活性化において重要な同時刺激性の役割を果たしている。ＣＤ４０受容体は活性化Ｔ細胞、活性化血小板、および、炎症状態の血管平滑筋上に発現される。ＣＤ４０受容体は好酸球、慢性関節リウマチの滑膜、皮膚線維芽細胞および他の非リンパ様細胞型の上にも検出される。ＣＤ４０ＬのＣＤ４０受容体への結合はＢ細胞の増殖および分化、抗体生産、アイソタイプ切り替えおよびＢ細胞記憶形成を刺激する。
Ｔｈｏｍａｓら「Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．」１９９１年，第５７巻：３２９ Ｓｔｒａｕｓら「Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．」１９９３年，第１１８巻：４５
（発明の要旨）
リンパ腫、自己免疫疾患および移植片拒絶反応を含むＣＤ４０発現細胞上のＣＤ４０シグナル伝達の刺激により媒介される疾患を処置するための組成物および方法が提供される。組成物はヒトＣＤ４０発現細胞の表面上に位置するヒトＣＤ４０抗原に結合し得るモノクローナル抗体を包含し、ここで結合は細胞の増殖および分化を防止する。組成物はまたヒトＣＤ４０発現細胞の表面上に発現するヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合し得るモノクローナル抗体を包含し、該モノクローナル抗体は有意なアゴニスト活性を有さず、ここで、該モノクローナル抗体の投与はＤａｕｄｉヒトＢリンパ腫細胞株を用いた段階型（ｓｔａｇｅｄ）ヌードマウス異種移植片腫瘍モデルにおいてキメラ抗ＣＤ２０モノクローナル抗体ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８の同じ濃度よりも有意に低値の腫瘍体積をもたらす。組成物はまた、これらのモノクローナル抗体の抗原結合フラグメント、これらの抗体を生産するハイブリドーマ細胞株、および、これらのモノクローナル抗体のアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子も包含する。本発明は更に薬学的に許容しうる担体中にこれらの抗ＣＤ４０抗体を含む薬学的組成物を包含する。
ＣＤ４０シグナル伝達の刺激により媒介される疾患を予防または処置するための方法が提供され、これは、ヒトＣＤ４０発現細胞上のＣＤ４０抗原と結合した場合に有意なアゴニスト活性を有さない抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントにより患者を処置することを含む。ＣＤ４０発現細胞の刺激により媒介される疾患には自己免疫疾患、癌および臓器および組織の移植拒絶反応が包含される。本発明の方法により処置または予防できるリンパ腫は非ホジキンリンパ腫（高度悪性リンパ腫（ｈｉｇｈ−ｇｒａｄｅ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ）、中等度悪性リンパ腫（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ−ｇｒａｄｅ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ）および軽度悪性リンパ腫（ｌｏｗ−ｇｒａｄｅ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ））、ホジキン病、急性リンパ芽球性白血病、骨髄腫、慢性リンパ性白血病および骨髄芽球性白血病を包含する。
本発明の方法を用いた処置で意図される特定の自己免疫疾患は全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、慢性関節リウマチ、クローン病、乾癬、自己免疫性血小板減少性紫斑病、多発性硬化症、強直性脊椎炎、重症筋無力症および尋常性天疱瘡を包含する。このような抗体はまた自己免疫応答を抑制することにより臓器および組織の移植片の拒絶反応を防止するため、ＣＤ４０により与えられる活性化シグナルを悪性Ｂリンパ球で枯渇させることによりリンパ腫を処置するため、および、特異的な態様においてＣＤ４０担持細胞に毒素を送達するためにも使用できる。
ヒトＢ細胞の増殖、分化および／または増殖を抑制するため、および、ヒト患者におけるＢ細胞による抗体の生産を抑制するための方法、並びに、Ｂ細胞株の癌細胞の増殖を抑制するための方法も提供される。ＣＤ４０発現細胞に対してアンタゴニスト活性を有する抗体を発見するための方法も提供される。
本明細書に開示されたモノクローナル抗体はＣＤ４０に対して強力な親和性を有し、そして少なくとも１０−６Ｍ、好ましくは少なくとも１０−７Ｍ〜約１０−８Ｍ、より好ましくは少なくとも１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍの解離平衡定数（ＫＤ）を特徴とする。本発明の方法において使用するのに適するモノクローナル抗体およびその抗原結合フラグメントはヒト細胞の表面上に発現されるヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合できる。それらは有意なアゴニスト活性は有さないが、ヒト細胞上のＣＤ４０抗原に結合するとアンタゴニスト活性を示す。１つの実施形態において、抗ＣＤ抗体またはそのフラグメントは正常ヒトＢ細胞上のＣＤ４０抗原に結合した場合にアンタゴニスト活性を示す。別の実施形態においては、抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメントは悪性ヒトＢ細胞上のＣＤ４０抗原に結合した場合にアンタゴニスト活性を示す。適当なモノクローナル抗体は、ヒト定常領域を有し；好ましくはそれらは全体的または部分的にヒト化されたフレームワーク領域も有し；そして最も好ましくは完全ヒト抗体またはその抗原結合フラグメントである。このようなモノクローナル抗体の例ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２；ハイブリドーマ細胞株１３１．２Ｆ８．５．９（本明細書においては細胞株５．９と称する）および１５３．８Ｅ２．Ｄ１０．Ｄ６．１２．１２（本明細書においては細胞株１２．１２と称する）により生産されるモノクローナル抗体；配列番号６に示される配列、配列番号７に示される配列、配列番号８に示される配列、配列番号６および配列番号７に示される両方の配列および配列番号６および配列番号８に示される両方の配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体；配列番号２に示される配列、配列番号４に示される配列、配列番号５に示される配列、配列番号２および配列番号４に示される両方の配列および配列番号２および配列番号５に示される両方の配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体；配列番号１に示される配列、配列番号３に示される配列および配列番号１および配列番号３に示される両方の配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体；およびヒトＣＤ４０に特異的に結合する能力を保有しており、そして有意なアゴニスト活性を有さないが、ヒト細胞上のＣＤ４０抗原に結合した場合はアンタゴニスト活性を示すこれらのモノクローナル抗体の抗原結合フラグメントのような本明細書において命名した抗体である。このようなモノクローナル抗体の例はまたハイブリドーマ細胞株１２．１２により生産されるモノクローナル抗体に結合し得るエピトープに結合するモノクローナル抗体；配列番号１０または配列番号１２に示すアミノ酸配列の残基８２〜８７を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体；競合結合アッセイにおいてモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２と競合するモノクローナル抗体；およびＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体または上記したモノクローナル抗体のいずれかの抗体結合フラグメントであるモノクローナル抗体、ただしフラグメントはヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合する能力を保有するもの、を包含する。当業者の知る通り、本明細書に開示したアンタゴニスト抗体およびこれらの抗体の抗原結合フラグメントは、当該分野でよく知られ、本明細書において後述する方法を用いて組み換え生産された抗体およびその抗原結合フラグメントを包含し、そして、例えば組み換え生産されたモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２を包含する。
本発明の１つの実施形態において、処置方法は適当なアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを含む薬学的組成物の治療有効量を患者に投与することを含む。抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメントの治療有効量は約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇ、または、約７ｍｇ／ｋｇ〜約１２ｍｇ／ｋｇの範囲である。処置の方法はアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントの治療有効量の単回投与または複数回投与を包含すると知られている。
本発明の方法において使用するのに適するものとして本発明において発見されたアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は修飾してよい。これらのアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の修飾の例としては、免疫学的に活性なキメラ抗ＣＤ４０抗体、ヒト化抗ＣＤ４０抗体、および、免疫学的に活性なネズミ抗ＣＤ４０抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
（発明の詳細な説明）
「腫瘍」とは本明細書においては悪性または良性に関わらず全ての新生物性の細胞の成長および増殖および全ての前癌性および癌性の細胞および組織を指す。
「癌」および「癌性」という用語は、未調節の細胞生育を典型的特徴とする哺乳類における生理学的状態を指すか、これを説明するものである。癌の例はリンパ腫および白血病を包含するが、これに限定されない。
「抗体」および「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、同一の構造的特徴を有する糖タンパク質である。抗体が抗原に対する結合特異性を示す一方で、免疫グロブリンは抗体および抗原特異性を欠く他の抗体様分子の両方を包含する。後者の種類のポリペプチドは、例えば、リンパ系によって低いレベルで産生され、骨髄腫によって増加したレベルで産生される。
用語「抗体」は、最も広範な意味で使用され、完全に組み立てられた抗体、抗原に結合し得る抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ’、Ｆ’（ａｂ）２、Ｆｖ、単鎖抗体、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ））および上記のものを含む組換えペプチドを包含する。
用語「モノクローナル抗体」とは、本明細書中で使用される場合、実質的に同質の抗体（すなわち、微量に存在し得る可能性のある天然に存在する変異を除いて、集団を構成する個々の抗体が同一である）の集団から得られる抗体をいう。
「天然の抗体」および「天然の免疫グロブリン」は、通常は、２つの同一の軽（Ｌ）鎖と２つの同一の重（Ｈ）鎖とからなる、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体の糖タンパク質である。各々の軽鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に連結されるが、ジスルフィド連結の数は様々な免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で変わる。各々の重鎖および軽鎖はまた、規則的に間隔の空いた鎖内ジスルフィド架橋を有する。各々の重鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、次にいくつかの定常ドメインが続く。各々の軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、もう一端に定常ドメインを有する；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一の定常ドメインと整列され、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列される。特定のアミノ酸残基が、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間で界面を形成すると考えられる。
用語「可変」とは、可変ドメインの特定の部分が抗体間で広範囲にわたって配列が異なり、その特定の抗原に対する各々の特定の抗体の結合および特異性に使用される事実をいう。しかし、その可変性は、抗体の可変ドメインの全体にわたって均一には分布しない。可変性は、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインの両方で相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中する。可変ドメインのうちより高度に保存される部分は、フレームワーク（ＦＲ）領域と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは、各々、４つのＦＲ領域を含み、これらの領域は、大部分はβシート配置をとり、βシート構造に結合する（そして、場合によってはβシート構造の一部分を形成する）ループを形成する３つのＣＤＲによって結合される。各々の鎖におけるＣＤＲは、ＦＲ領域によって近接して一緒に保持され、そして、他の鎖由来のＣＤＲと共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら（１９９１）ＮＩＨ Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１−３２４２，Ｖｏｌ．Ｉ，６４７−６６９頁を参照のこと）。
定常ドメインは、抗原に抗体を結合させることに直接的に関連しないが、種々のエフェクター機能（例えば、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）結合、抗体依存性の細胞の毒性における抗体の関与、オプソニン作用、補体依存性細胞毒性の惹起、および肥満細胞脱顆粒）を示す。
用語「超可変領域」は、本明細書中で使用される場合、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基をいう。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」に由来するアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメインにおける残基２４〜３４（Ｌ１）、残基５０〜５６（Ｌ２）および残基８９〜９７（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインにおける残基３１〜３５（Ｈ１）、残基５０〜６５（Ｈ２）および残基９５〜１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ））ならびに／あるいは「超可変ループ」に由来するアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメインにおける残基２６〜３２（Ｌ１）、残基５０〜５２（Ｌ２）および残基９１〜９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインにおける残基２６〜３２（Ｈ１）、残基５３〜５５（Ｈ２）および残基９６〜１０１（Ｈ３）；ＣｌｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７）を含む。「フレームワーク」残基または「ＦＲ」残基は、超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
「抗体フラグメント」とは未損傷の抗体の部分、好ましくは、未損傷の抗体の抗原結合または可変領域を含む。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント；ダイアボディー；直鎖抗体（Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２）；単鎖抗体分子；および抗体フラグメントから形成した多重特異性抗体を包含する。抗体のパパイン消化により各々が単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」フラグメントと称される２つの同一の抗原結合フラグメント、および名称が容易に結晶化するその能力を反映している残余の「Ｆｃ」フラグメントが生成する。ペプシン処理により２つの抗原複合化部位を有し、なお抗原に交差結合できるＦ（ａｂ’）２フラグメントが形成する。
「Ｆｖ」とは完全な抗原認識結合部位を含有する最小の抗体フラグメントである。２鎖Ｆｖ種においては、この領域は、堅固な非共有結合の会合における１重鎖１軽鎖可変ドメインの２量体よりなる。単鎖Ｆｖ種においては、１重鎖１軽鎖可変ドメインは可撓性のペプチドリンカーにより共有結合でき、これにより軽鎖および重鎖は２鎖Ｆｖ種の場合と同様に「２量体」構造において会合できる。この配置にあるものは、各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶＨ−ＶＬ２量体の表面上の抗原結合部位を定義する場合である。集合的に６つのＣＤＲは抗体に対して抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に対して特異的なＣＤＲを僅か３つしか含まないＦｖの半分）であっても、完全な結合部位よりは低い親和性とはいえ、なお抗原を認識して結合する能力を有する。
Ｆａｂフラグメントはまた軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂフラグメントは抗体ヒンジ領域由来のシステイン１つ以上を含む重鎖ＣＨ１度メインのカルボキシ末端において数個の残基が付加されていることによりＦａｂ’フラグメントとは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは本明細書においては定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を担持しているようなＦａｂ’に関する表記である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは当初は間にヒンジシステインを有する対となったＦａｂ’フラグメントとして形成された。抗体フラグメントの他の化学的カップリングも知られている。
任意の脊椎動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、２つの明らかに異なる型（カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる）の一方に割り当てられ得る。
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは異なるクラスに割り当てられ得る。ヒト免疫グロブリンの５つの主要なクラスが存在する：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ、そしてこれらの中の数種は、さらにサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡおよびＩｇＡ２）に分けられ得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元配置は周知である。異なるアイソタイプは異なるエフェクター機能を有する。例えば、ヒトＩｇＧ１アイソタイプおよびＩｇＧ３アイソタイプは、抗体依存性の細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）の活性を媒介する。
語「標識」とは、本明細書中で使用される場合、「標識された」抗体を生成するように抗体に直接的または間接的に結合体化される検出可能な化合物または組成物をいう。標識は、それ自体で検出可能である（例えば、放射性同位体標識もしくは蛍光標識）か、または酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物もしくは基質組成物の化学的変化を触媒し得る。検出可能な標識として機能し得る放射性核種としては、例えば、Ｉ−１３１、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｙ−９０、Ｒｅ−１８８、Ｒｅ−１８６、Ａｔ−２１１、Ｃｕ−６７、Ｂｉ−２１２、およびＰｄ−１０９が挙げられる。この標識は、毒素のような検出できない実体であってもよい。
用語「アンタゴニスト」は、最も広い意味で使用され、本明細書中に開示される天然の標的の生物学的活性またはその転写もしくは翻訳を、部分的もしくは完全にブロック、阻害、または中和する任意の分子を包含する。
「キャリア」は、本明細書中で使用される場合、使用される投薬量および濃度でそのキャリアに曝露される細胞または哺乳動物に対して非毒性である、薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤または安定剤を包含する。多くの場合、生理学的に受容可能なキャリアは、ｐＨ緩衝化水溶液である。生理学的に受容可能なキャリアの例としては、緩衝液（例えば、リン酸、クエン酸、コハク酸および他の有機酸）；抗酸化物質（アスコルビン酸が挙げられる）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；単糖類、二糖類および他の炭水化物（グルコース、マンノースまたはデキストリンが挙げられる）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩を形成する対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／あるいは非イオン性界面活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびＰｌｕｒｏｎｉｃｓ）が挙げられる。１以上のさらなる治療剤と「併用して」投与することは、同時（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ）（同時（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ））投与および任意の順序での連続投与を包含する。
「宿主細胞」とは、本明細書中で使用される場合、組換えベクターまたは他の転移ポリヌクレオチドのためのレシピエントとして使用され得るかもしくは使用される単細胞性実体として培養された微生物または真核細胞もしくは真核生物細胞株をいい、トランスフェクトされた元の細胞の子孫を包含する。単一の細胞の子孫は、天然の変異、偶発的な変異または意図的な変異に起因して、形態またはゲノムＤＮＡ相補体もしくは全ＤＮＡ相補体において元の親と必ずしも完全に同一でなくてもよいことが理解される。
「ヒトエフェクター細胞」は、１以上のＦｃＲを発現し、かつエフェクター機能を果たす白血球である。好ましくは、この細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、抗原依存性の細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）のエフェクター機能を果たす。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、マクロファージ、好酸球および好中球が挙げられ、ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が好ましい。ＡＤＣＣ活性を有する抗体は、代表的には、ＩｇＧ１アイソタイプまたはＩｇＧ３アイソタイプのものである。ＩｇＧ１抗体およびＩｇＧ３抗体を単離することに加えて、このようなＡＤＣＣを媒介する抗体は、非ＡＤＣＣ抗体由来の可変領域または可変領域フラグメントをＩｇＧ１アイソタイプもしくはＩｇＧ３アイソタイプの定常領域に対して操作することによって作製され得ることに注意すること。
用語「Ｆｃレセプター」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを説明するために使用される。好ましいＦｃＲは、天然配列のヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体に結合するもの（γレセプター）であり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプター（これらのレセプターの対立遺伝子改変体および代替的スプライシング形態を含む）が挙げられる。ＦｃγＲＩＩレセプターとしてはＦｃγＲＩＩＡ（「活性化レセプター」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害レセプター」）が挙げられ、これらは、その細胞質ドメインが主に異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化レセプターＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫レセプターチロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。阻害レセプターＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫レセプターチロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む（Ｄａｅｒｏｎ（１９９７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−２３４を参照のこと）。ＦｃＲは、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ（１９９１）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌら（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２５−３４；およびｄｅ Ｈａａｓら（１９９５）Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−３４１で概説される。他のＦｃＲ（将来同定されるものを含む）は、本明細書中の用語「ＦｃＲ」によって包含される。この用語はまた、新生児レセプターであるＦｃＲｎを包含し、これは、母性ＩｇＧの胎児への伝達を担う（Ｇｕｙｅｒら（１９７６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７およびＫｉｍら（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））。
ヒト抗体を作製するための多くの方法が存在する。例えば、分泌細胞は、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）による感染によって不死化され得る。しかし、ＥＢＶに感染した細胞は、クローニングするのが困難であり、通常は、比較的低い収量の免疫グロブリンしか産生しない（ＪａｍｅｓおよびＢｅｌｌ（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １００：５−４０）。将来、ヒトＢ細胞の不死化は、形質転換遺伝子の規定された組み合わせを導入することによって達成される可能性がある。このような可能性は、ＳＶ４０ラージ腫瘍性タンパク質およびＨ−ｒａｓの発癌性対立遺伝子と一緒のテロメラーゼ触媒サブユニットの発現が、正常なヒト上皮細胞および線維芽細胞の腫瘍変換を生じたという最近の実証によって強調されている（Ｈａｈｎら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ ４００：４６４−４６８）。現在、免疫の際に、内因性免疫グロブリン産生の非存在下においてヒト抗体のレパートリーを産生し得るトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作製することが可能である（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５−２５８；ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ（１９９５）Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら（１９９６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５−８５１；Ｍｅｎｄｅｚら（１９９７）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５：１４６−１５６；Ｇｒｅｅｎ（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：１１−２３；Ｔｏｍｉｚｕｋａら（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：７２２−７２７；Ｌｉｔｔｌｅら（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ２１：３６４−３７０に概説される）。例えば、キメラマウスおよび生殖細胞系変異マウスにおける抗体重鎖の連結領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合欠失が内因性抗体産生の完全な阻害を生じることが記載されている（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２５５１−２５５５）。このような生殖細胞系変異マウス中へのヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイの転移は、抗原チャレンジの際にヒト化抗体の産生を生じる（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５−２５８）。Ｍｅｎｄｅｚら（１９９７）（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６−１５６）は、抗原でチャレンジされる場合に高親和性の完全ヒト抗体を生成するトランスジェニックマウスの系統を作出した。これは、内因性ＪＨセグメント中に欠失を有するマウスに、上で記載されるように、メガベースのヒト重鎖遺伝子座およびヒト軽鎖遺伝子座を生殖細胞系に組み込むことによって達成された。これらのマウス（ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）ＩＩ技術（Ａｂｇｅｎｉｘ；Ｆｒｅｍｏｎｔ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ））は、約６６のＶＨ遺伝子、完全なＤＨ領域およびＪＨ領域、ならびに３つの異なる定常領域を含む１，０２０ｋｂのヒト重鎖遺伝子座を提供し、そしてまた、３２のＶκ遺伝子、ＪκセグメントおよびＣκ遺伝子を含む８００ｋｂのヒトκ遺伝子座を提供する。これらのマウスで産生される抗体は、あらゆる点（遺伝子再配列、組立て、レパートリーを含む）で、ヒトで見られるものと酷似する。ヒト抗体は、マウス遺伝子座において遺伝子再配列を妨げる内因性セグメントにおける欠失に起因して、内因性抗体よりも優先的に発現される。このようなマウスは、特定の目的の抗原で免疫され得る。
このような免疫動物由来の血清は、初期抗原に対する抗体反応性についてスクリーニングされ得る。リンパ球は、リンパ節または脾臓細胞から単離され得、そしてＣＤ１３８陰性細胞およびＣＤ１９陽性細胞に対して選択することによってＢ細胞に対してさらに選択され得る。一局面において、このようなＢ細胞培養物（ＢＣＣ）は、骨髄腫細胞に融合されて上で詳述されるようなハイブリドーマを生成し得る。
別の局面において、このようなＢ細胞培養物は、好ましくは、初期抗原に対する反応性についてさらにスクリーニングされ得る。このようなスクリーニングは、標的／抗原タンパク質を用いるＥＬＩＳＡ、目的の抗原に結合する公知の抗体を用いる競合アッセイ、および標的抗原を発現する、一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞もしくは他の細胞に対するインビトロ結合を含む。
本発明はＣＤ４０発現細胞上のＣＤ４０シグナル伝達の刺激により媒介される疾患を有するヒト患者を処置するための組成物および方法に関する。方法は本発明の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを用いた処置を包含し、ここで抗体またはその抗原結合フラグメントの投与はこの処置方法を受けている患者における正の処置応答を促進する。本発明の方法において使用するのに適する抗ＣＤ４０抗体はヒト細胞の表面上に発現されたヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合し、該抗体は有意なアゴニスト活性を有さないが、ヒトＣＤ４０発現細胞上のＣＤ４０抗原に結合した場合にはアンタゴニスト活性を示す。これらの抗ＣＤ４０抗体およびその抗原結合フラグメントは本明細書においてはアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体と称する。このような抗体の例は、後述する完全なヒトモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２およびモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２の結合特性を有するモノクローナル抗体を包含するが、これらに限定されない。当業者の知る通り、本明細書に記載したアンタゴニスト抗体およびそのような抗体の抗原結合フラグメントは当該分野でよく知られ、そして後述するような方法を用いて組み換えにより生産された抗体およびそのような抗体の抗原結合フラグメントを包含し、そして、例えば、組み換え生産されたモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２を包含する。
モノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２の結合特性を有する抗体は結合ＣＤ４０を競合的に妨害し、そして／または、ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２と同じエピトープに結合する抗体を包含する。当業者は標準的な方法を用いながら抗体がＣＨＩＲ−５．９またはＣＨＩＲ−１２．１２を競合的に妨害するかどうかを調べることができる。
これらの抗体がヒトＢ細胞のようなヒト細胞の表面上にディスプレイされたＣＤ４０に結合する場合、抗体は有意なアゴニスト活性を有さず；一部の実施形態においては、ヒト細胞の表面上にディスプレイされたＣＤ４０へのその結合はこれらのヒト細胞の増殖および分化の抑制をもたらす。即ち、本発明の方法において使用するのに適するアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、細胞表面ＣＤ４０抗原を発現する正常および悪性のヒト細胞に対するアンタゴニスト活性を示すことができるモノクローナル抗体を包含する。
一部の実施形態においては本発明の抗ＣＤ抗体はキメラ抗ＣＤ２０モノクローナル抗体ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８と相対比較して増大した抗腫瘍活性を示し、ここで抗腫瘍活性はヒトリンパ腫細胞株を用いたヌードマウス異種移植片腫瘍モデルにおいてこれらの抗体の等量を用いて試験される。ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８（ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ；Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）の商品名で市販、リツキシマブとも称する）はネズミ抗ＣＤ２０モノクローナル抗体、ＩＤＥＣ−２Ｂ８から単離されたネズミ可変領域と共にヒトＩｇＧ１およびカッパ定常領域を含有するキメラ抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である（Ｒｅｆｆ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｂｌｏｏｄ ８３：４３５−４４５）。Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ（登録商標）は再発Ｂ細胞軽度悪性または濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の処置のために認可されている。Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ（登録商標）と比較した場合により優れた抗腫瘍活性を有する抗体の発見はＢ細胞リンパ腫、特にＢ細胞非ホジキンリンパ腫のための癌治療の方法を極端に向上させると考えられる。
適当なヌードマウス異種移植片腫瘍モデルはＮａｍａｌｗａおよびＤａｕｄｉとして知られているヒトバーキットリンパ腫細胞株を用いるものを包含する。好ましい実施形態は実施例１７において後述するとおり、Ｄａｕｄｉヒトリンパ腫細胞株を用いた段階型（ｓｔａｇｅｄ）ヌードマウス異種移植片腫瘍モデルの抗腫瘍活性を試験する。Ｄａｕｄｉリンパ腫細胞株を用いた段階型ヌードマウス異種移植片腫瘍モデルは非段階型の抗体の治療効果と判別する場合により効果的であるが、その理由は段階型モデルにおいては、抗体の投与は腫瘍が測定可能な大きさに到達した後にのみ開始されるためである。非段階型モデルにおいては、抗体の投与は腫瘍の接種後約１日以内、そして触診可能な腫瘍が存在する前に一般的には開始される。段階型モデルにおいてＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）より高性能となる（即ち増大した抗腫瘍活性を示す）抗体の能力は、抗体がＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）よりも高効果であることを強力に示している。更にまた、Ｄａｕｄｉモデルにおいては、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）の標的である抗ＣＤ２０はＣＤ４０よりも高水準で細胞表面上に発現される。
本発明の抗ＣＤ４０抗体およびＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）の「等価な量」とは重量基準において同じｍｇ用量を投与することを意図している。即ち、本発明の抗ＣＤ４０抗体を腫瘍モデルにおいて使用されるマウスのｋｇ体重当たり０．０１ｍｇで投与した場合、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）もまたマウスのｋｇ体重当たり０．０１ｍｇで投与される。同様に、本発明の抗ＣＤ４０抗体を腫瘍モデルにおいて使用されるマウスのｋｇ体重当たり０．１、１または１０ｍｇで投与した場合、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）もまたマウスのｋｇ体重当たりそれぞれ０．１、１または１０ｍｇで投与される。
ヌードマウス異種移植片腫瘍モデルにおいて投与する場合、本発明の一部の抗体は等量のＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）よりも有意に低値の腫瘍体積をもたらす。即ち、例えば、完全ヒトモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２は、本明細書において後述する実施例に記載した態様でＤａｕｄｉヒトリンパ種細胞株を用いた段階型ヌードマウス異種移植片腫瘍モデルにおいて試験した場合、等量の用量のＲｉｔｕｘａｎで観察されるものと相対比較して少なくとも２０％増大した抗腫瘍活性を示し、またこの試験では５０から６０％程度増大した抗腫瘍活性を示すことができる。この増大した抗腫瘍活性はＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）の等用量と比較した場合に本発明の抗ＣＤ４０抗体で観察される腫瘍体積のより大きい低減において反映される。即ち、例えば、腫瘍接種後の時間経過に応じて、モノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２はＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）の等用量で観察されるものの約三分の一から約二分の一である腫瘍体積を示すことができる。
抗体の薬効の別の相違点は、ＮＫ細胞の存在下、インビトロの腫瘍細胞の最大溶解を得るために必要な抗体の濃度をインビトロで測定する点である。例えば、本発明の抗ＣＤ４０抗体はＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）の濃度の１／２、好ましくは１／４、最も好ましくは１／１０未満のＥＣ５０においてＤａｕｄｉ細胞の最大溶解に到達する。
モノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２のほかに、上記した試験においてＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）の等量よりも有意に高値の薬効を有するという特徴を共有している他の抗ＣＤ４０抗体は、例えば、（１）ハイブリドーマ細胞株１２．１２により生産されるモノクローナル抗体；（２）配列番号２に示される配列、配列番号４に示される配列、配列番号５に示される配列、配列番号２および配列番号４に示される両方の配列および配列番号２および配列番号５に示される両方の配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体；（３）配列番号１に示される配列、配列番号３に示される配列および配列番号１および配列番号３に示される両方の配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体；（４）ハイブリドーマ細胞株１２．１２により生産されるモノクローナル抗体に結合し得るエピトープに結合するモノクローナル抗体；（５）配列番号１０または配列番号１２のアミノ酸配列の残基８２〜８７を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体；（６）競合結合アッセイにおいてモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２と競合するモノクローナル抗体；および（７）ＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体または前述の項目（１）〜（６）の上記モノクローナル抗体の抗原結合フラグメントであるモノクローナル抗体、ここでフラグメントはヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合する能力を保持しているもの、を包含するが、これに限定されない。
（アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体）
モノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２は本発明の方法において使用するための適当なアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体を示す。ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２抗体はハイブリドーマ細胞株１３１．２Ｆ８．５．９（本明細書においては細胞株５．９と称する）および１５３．８Ｅ２．Ｄ１０．Ｄ６．１２．１２（本明細書においては細胞株１２．１２と称する）により生産されるＩｇＧ１アイソタイプの完全ヒト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体である。これらの細胞株はヒトＩｇＧ１重鎖遺伝子座およびヒトκ鎖遺伝子座を含有する免疫化されたｘｅｎｏｔｙｐｉｃなマウスの脾細胞を用いて作成されている（ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ａｂｇｉｎｉｃ；Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。脾細胞をマウスミエローマＳＰ２／０細胞と融合させた（Ｓｉｅｒｒａ ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）。得られたハイブリドーマを数回サブクローニングして安定なモノクローナル細胞株５．９および１２．１２を作成した。本発明の他の抗体はヒト免疫グロブリン遺伝子座に関してトランスジェニックであるマウスを用いて同様に、或いは、当該分野で知られるか、本発明に記載した他の方法により製造してよい。
ＣＨＩＲ−１２．１２抗体の可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列、および、ＣＨＩＲ−５．９抗体の可変領域のアミノ酸配列を開示する。より特定すれば、ｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２の軽鎖および重鎖のリーダー、可変および定常領域のアミノ酸配列はそれぞれ図９Ａおよび９Ｂに示す通りである。さらにまた配列番号２（ｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２の軽鎖の完全配列）、配列番号４（ｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２の重鎖の完全配列）および配列番号５（配列番号４に示すｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２の重鎖の変異体の完全配列、ここで変異体は配列番号４の１５３位のアラニン残基に対するセリン置換を含む）も参照できる。ｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２の軽鎖および重鎖をコードするヌクレオチド配列はそれぞれ図１１Ａおよび１１Ｂに示す。更にまた配列番号１（ｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２の軽鎖のコーディング配列）および配列番号３（ｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２の重鎖のコーディング配列）も参照できる。ｍＡｂ ＣＨＩＲ−５．９の軽鎖および重鎖のリーダー、可変および定常領域のアミノ酸配列はそれぞれ図１０Ａおよび１０Ｂに示す通りである。さらにまた配列番号６（ｍＡｂ ＣＨＩＲ−５．９の軽鎖の完全配列）、配列番号７（ｍＡｂ ＣＨＩＲ−５．９の重鎖の完全配列）および配列番号８（配列番号７に示すｍＡｂ ＣＨＩＲ−５．９の重鎖の変異体の完全配列、ここで変異体は配列番号７の１５８位のアラニン残基に対するセリン置換を含む）も参照できる。更にまたＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２抗体を発現するハイブリドーマはそれぞれＰＴＡ−５５４２およびＰＴＡ−５５４３の特許寄託名称でＡＴＣＣに寄託されている。
アンタゴニスト活性のほかに、本発明の抗ＣＤ４０抗体は腫瘍細胞に対する別の作用機序を有することが好ましい。例えばネイティブのＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２抗体はＡＤＣＣ活性を有する。或いは、ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２抗体の可変領域はＡＤＣＣ活性を有する別の抗体アイソタイプの上に発現させることができる。更にまた、本明細書において後述する通り、ネイティブの形態、組み換え形態またはＣＨＩＲ−５．９またはＣＨＩＲ−１２．１２の抗原結合フラグメントを細胞毒素、治療薬または放射性金属イオンまたは放射性同位体に結合体化することも可能である。
ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体はＥＬＩＳＡ型の試験において可溶性ＣＤ４０に結合し、細胞表面ＣＤ４０へのＣＤ４０リガンドの結合を防止し、そしてフローサイトメトリー試験により測定される通り、予備結合したＣＤ４０リガンドを排除する。抗体ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２はＣＤ４０への結合に関しては相互に競合するが、１５Ｂ８、即ち、参照により全体が本明細書に組み込まれる２０００年１０月２日出願の「ヒト抗ＣＤ４０抗体」と題された米国暫定出願６０／２３７，５５６および２００１年１０月２日に出願された「ヒト抗ＣＤ４０抗体」とやはり題されたＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／３０８５７（代理人Ｄｏｃｋｅｔ Ｎｏ．ＰＰ１６０９２．００３）に記載された抗ＣＤ４０モノクローナル抗体とは競合しない。正常ヒト対象由来のＢ細胞の増殖に対する作用についてインビトロで試験したところ、ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２はアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体として機能する。更にＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２は正常対象由来のヒトリンパ球の強力な増殖を誘導しない。これらの抗体は抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）によりＣＤ４０発現標的細胞を殺傷することができる。ＢｉａｃｏｒｅＴＭ試験により測定した場合、ヒトＣＤ４０に対するＣＨＩＲ−５．９の結合親和性は１．２ｘ１０−８Ｍであり、そしてＣＨＩＲ−１２．１２の結合親和性は５ｘ１０−１０Ｍである。
本発明の方法で使用するための適当なアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体はＣＤ４０細胞表面抗原に対する強力な単一部位結合親和性を示す。本発明のモノクローナル抗体はＢｉａｃｏｒｅＴＭ試験のような標準的な試験を用いて測定した場合、少なくとも１０−５Ｍ、少なくとも３ｘ１０−５Ｍ、好ましくは少なくとも１０−６Ｍ〜１０−７Ｍ、より好ましくは少なくとも１０−８Ｍ〜約１０−１２ＭのＣＤ４０に対する解離平衡定数（ＫＤ）を示す。Ｂｉａｃｏｒｅ分析は当該分野で知られており、詳細は「ＢＩＡａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｈａｎｄｂｏｏｋ」に記載されている。ＷＯ０１／２７１６０に記載されている方法は結合親和性をモジュレートするために使用できる。
「ＣＤ４０抗原」、「ＣＤ４０細胞表面抗原」、「ＣＤ４０受容体」または「ＣＤ４０」とは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体ファミリーに属する膜貫通糖蛋白を意図している（例えば米国特許５，６７４，４９２および４，７０８，８７１；Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．（１９８９）ＥＭＢＯ ８：１４０３；Ｃｌａｒｋ（１９９０）Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ３６：３３；Ｂａｒｃｌａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｔｈｅ Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｆａｃｔｓ Ｂｏｏｋ（２ｄ ｅｄ．；Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）を参照できる）。この遺伝子の選択的にスプライシングされた転写物の変異体によりコードされるヒトＣＤ４０の２アイソフォームが発見されている。第１のアイソフォーム（「長アイソフォーム」または「アイソフォーム１」としても知られている）は最初の１９残基により表わされるシグナル配列を有する２７７アミノ酸前駆体ポリペプチド（配列番号１１（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｘ６０５９２およびＮＭ＿００１２５０参照）によりコードされる配列番号１２（当初、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＣＡＡ４３０４５として報告され、そしてＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１２４１においてアイソフォーム１として同定された））として発現される。第２のアイソフォーム（「短アイソフォーム」または「アイソフォーム２」としても知られている）は最初の１９残基により表わされるシグナル配列を有する２０３アミノ酸前駆体ポリペプチド（配列番号９（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿１５２８５４）によりコードされる配列番号１０（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿６９０５９３））として発現される。ヒトＣＤ４０のこれらの２種のアイソフォームの前駆体ポリペプチドはその最初の１６５残基（即ち配列番号１０および配列番号１２の残基１〜１６５）を共有している。短アイソフォームの前駆体ポリペプチド（配列番号１０）は翻訳フレームシフトをもたらすコーディングセグメントの欠如した転写産物の変異体（配列番号９）によりコードされ；その結果として生じるＣＤ４０アイソフォームはＣＤ４０の長アイソフォーム（配列番号１２の残基１６６〜２７７に示されるＣ末端）に含有されるものに由来する、より小さく固有のＣ末端（配列番号１０の残基１６６〜２０３）を含有する。本発明の目的のためには、「ＣＤ４０抗原」、「ＣＤ４０細胞表面抗原」、「ＣＤ４０受容体」または「ＣＤ４０」という用語はＣＤ４０の短および長アイソフォームの両方を包含する。本発明の抗ＣＤ４０抗体は後述する通りこの細胞表面抗原の短アイソフォームまたは長アイソフォームのいずれかの内部の同じ位置に存在するヒトＣＤ４０のエピトープに結合する。
ＣＤ４０抗原は本明細書に記載する通り種々の細胞型の表面上にディスプレイされる。「表面上にディスプレイされる」および「表面上に発現される」とは、ＣＤ４０抗原の全体または部分が細胞の外部に曝露されることを意図している。ディスプレイまたは発現されたＣＤ４０抗原は完全または部分的にグリコシル化されていてよい。
「アゴニスト活性」とはアゴニストとして機能する物質を意図する。アゴニストは細胞上の受容体と組み合わさって受容体の天然のリガンドにより開始されるものと同様または同一の反応または活性を開始させる。ＣＤ４０のアゴニストは例えば以下の応答、即ち、Ｂ細胞の増殖および分化、抗体生産、細胞間付着、Ｂ細胞記憶形成、アイソタイプスイッチング、ＭＨＣクラスＩＩおよびＣＤ８０／８６の細胞表面発現のアップレギュレーション、および、ＩＬ−８、ＩＬ−１２およびＴＮＦのようなプロ炎症サイトカインの分泌のいずれかまたは全てを誘導するが、これらに限定されない。「アンタゴニスト活性」とは拮抗剤として物質が機能することを意図している。ＣＤ４０のアンタゴニストはＣＤ４０受容体のアゴニストリガンド、特にＣＤ４０Ｌへの結合により誘導される応答のいずれかの誘導を防止または低減する。アンタゴニストはアゴニスト結合への応答のいずれかの１つ以上の誘導を５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、好ましくは４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、より好ましくは７０％、８０％、８５％、そして最も好ましくは９０％、９５％、９９％または１００％低減してよい。抗ＣＤ４０抗体およびＣＤ４０リガンドの結合特異性およびアンタゴニスト活性を測定するための方法は当該分野で知られており、例えば標準的な競合結合アッセイ、Ｂ細胞による免疫グロブリン分泌をモニタリングする試験、Ｂ細胞増殖試験、Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ様Ｂ細胞試験、抗体生産に関するＴ細胞ヘルパー試験、Ｂ細胞増殖試験の同時刺激、およびＢ細胞活性化マーカーのアップレギュレーションに関する試験が包含されるが、これに限定されない。例えば参照により本明細書に組み込まれるＷＯ００／７５３４８および米国特許６，０８７，３２９に開示されているもののような試験を参照できる。
「有意な」アゴニスト活性とは、Ｂ細胞応答の試験において測定した場合に中立的な物質または陰性対照により誘導されるアゴニスト活性よりも少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％高値のアゴニスト活性を意図する。好ましくは、「有意な」アゴニスト活性とはＢ細胞応答の試験において測定した場合に中立的な物質または陰性対照により誘導されるアゴニスト活性よりも少なくとも２倍高値、または少なくとも３倍高値のアゴニスト活性である。即ち、例えば目的のＢ細胞応答がＢ細胞増殖である場合、「有意な」アゴニスト活性は中立的な物質または陰性対照により誘導されるＢ細胞増殖の水準よりも少なくとも２倍高値、または少なくとも３倍高値であるＢ細胞増殖の水準の誘導である。１つの実施形態においては、ＣＤ４０に結合しない非特異的な免疫グロブリン、例えばＩｇＧ１は陰性対象として機能する。「有意なアゴニスト活性を有さない」物質とは、中立的な物質または陰性対照により誘導されるアゴニスト活性より約２５％超の高値ではない、好ましくはＢ細胞応答の試験において測定した場合に中立的な物質または陰性対照により誘導されるアゴニスト活性より約２０％超、１５％超、１０％超、５％超、１％超、０．５％超、更には約０．１％超の高値ではないアゴニスト活性を示す。本発明の方法において有用なアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は上記の通り、ヒト細胞上でＣＤ４０抗原に結合する場合、有意なアゴニスト活性を有さない。本発明の１つの実施形態においては、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、１つのＢ細胞応答において、有意なアゴニスト活性を有さない。本発明の別の実施形態において、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、１つ以上のＢ細胞応答試験（例えば、増殖および分化、または増殖、分化および抗体生産）において、有意なアゴニスト活性を有さない。
本発明の方法において「抗ＣＤ４０抗体」はＣＤ４０Ｂ細胞表面抗原を特異的に認識するいずれかの抗体、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体およびそれらのフラグメント、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖおよび親抗ＣＤ４０抗体の抗原結合機能を保持している他のフラグメントを包含する。本発明において特に有利なものは、上記したモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２の結合特性を共有している本明細書に開示したアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体である。このような抗体は例えば以下のもの、即ち、（１）特許寄託番号ＰＴＡ−５５４２および特許寄託番号ＰＴＡ−５５４３でそれぞれＡＴＣＣに寄託されている１３１．２Ｆ８．５．９（本明細書においては細胞株５．９と称する）および１５３．８Ｅ２．Ｄ１０．Ｄ６．１２．１２（本明細書においては細胞株１２．１２と称する）と命名されたハイブリドーマ細胞株により生産されるモノクローナル抗体；（２）配列番号２に示される配列、配列番号４に示される配列、配列番号５に示される配列、配列番号２および配列番号４に示される両方の配列および配列番号２および配列番号５に示される両方の配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体；（３）配列番号６に示される配列、配列番号７に示される配列、配列番号８に示される配列、配列番号６および配列番号７に示される両方の配列および配列番号６および配列番号８に示される両方の配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体；（４）配列番号１に示される配列、配列番号３に示される配列および配列番号１および配列番号３に示される両方の配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体；（５）ハイブリドーマ細胞株５．９または１２．１２により生産されるモノクローナル抗体に結合し得るエピトープに結合するモノクローナル抗体；（６）配列番号１０または配列番号１２に示されるアミノ酸配列の残基８２〜８７を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体；（７）競合結合アッセイにおいてモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９またはＣＨＩＲ−１２．１２と競合するモノクローナル抗体；および（８）ＣＨＩＲ−１２．１２またはＣＨＩＲ−５．９モノクローナル抗体または前述の項目（１）〜（７）の上記モノクローナル抗体の抗原結合フラグメントであるモノクローナル抗体、ここでフラグメントはヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合する能力を保持しているもの、を包含するが、これらに限定されない。
（アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の作製）
本明細書において開示され、そして本発明の方法において使用するためのアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、当業者に公知の任意の抗体作製方法を使用して作製され得る。例えば、ポリクローナル血清は、従来の方法によって調製され得る。一般的に、ＣＤ４０抗原を含む溶液が最初に使用されて、適切な動物（好ましくは、マウス、ラット、ウサギ、またはヤギ）を免疫化する。入手可能な血清の量、および標識された抗ウサギ抗体および抗ヤギ抗体が利用できることに起因して、ウサギまたはヤギが、ポリクローナル血清の調製に好ましい。
ポリクローナル血清は、トランスジェニック動物（好ましくは、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を有するマウス）において調製され得る。好ましい実施形態において、ＣＤ４０を発現するＳｆ９細胞が、免疫原として使用される。免疫化はまた、生理食塩水（好ましくは、フロイント完全アジュバントのようなアジュバント）中の抗原を含む溶液を混合または乳化し、そしてその混合物またはエマルジョンを非経口的（一般的には、皮下または筋肉内）に注射することによって、実施され得る。１回の注射あたり５０〜２００μｇの用量は、代表的に十分である。免疫化は、一般的に、生理的食塩水中のタンパク質の１回以上の注射によって、好ましくはフロイント不完全アジュバントを使用して、２〜６週間後にブーストされる。あるいは、本発明の目的がインビボの免役化と等しいと考えられる場合、当該分野で公知の方法を使用したインビトロの免疫化によって、抗体が作製され得る。ポリクローナル抗血清は、免役化された動物の血液をガラスまたはプラスチックの容器に採取し、その血液を２５℃で１時間インキュベートし、次いで４℃で２〜１８時間インキュベートすることによって得られる。この血清は、遠心分離（例えば、１，０００×ｇで１０分間）によって回収される。１回の採血あたり約２０〜５０ｍｌが、ウサギから得られ得る。
Ｓｆ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞の作製は、米国特許第６，００４，５５２号において開示され、本明細書中に参考として援用される。手短に言えば、ヒトＣＤ４０をコードする配列を、輸送ベクターを使用してバキュロウイルスに再組換えさせた。上記プラスミドを、野生型バキュロウイルスＤＮＡと共にＳｆ９細胞に同時トランスフェクトした。組換えバキュロウイルスに感染したＳｆ９細胞を同定して、クローン的に精製した。
好ましくは、上記抗体は、本質的にモノクローナル抗体である。「モノクローナル抗体」によって、実質的に同質な抗体の集団から得られた抗体が意図される。すなわち、上記集団を構成する個々の抗体は、微量に存在し得る、天然に存在する可能性のある変異を除いて、同一である。この用語は、抗体の種または供給源に関して限定されない。この用語は、全ての免疫グロブリン、ならびにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖおよび抗体の抗原結合機能を保持する他のもののようなフラグメントを包含する。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一の抗原部位（すなわち、本発明におけるＣＤ４０細胞表面抗原）に対して指向する。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対して指向する異なる抗体を代表的に包含する従来の（ポリクローナル）抗体の調製とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向する。修飾語句「モノクローナル」は、実質的に同質である抗体の集団から得られる場合の抗体の性質を示し、いずれかの特定の方法による抗体の作製を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５によって最初に記載されたハイブリドーマ方法によって作製されても、または組換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）によって作製されてもよい。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８；Ｍａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７；および米国特許第５，５１４，５４８号において記載される技術を使用したファージ抗体ライブラリーから単離され得る。
「エピトープ」によって、抗体が作製され、そしてその抗体が結合する抗原分子の部分が意図される。エピトープは、直鎖状のアミノ酸残基（すなわち、エピトープ内の残基が、直鎖状様式で連続して順々に配置される）、非直鎖状のアミノ酸残基（本明細書において「非直鎖状エピトープ」といわれ；これらのエピトープは、連続的には配置されない）、または直鎖状アミノ酸残基と非直鎖状アミノ酸残基との両方を含み得る。
モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９６の方法、またはその改変を使用して調製され得る。代表的には、マウスが、抗原を含む溶液を使用して免疫化される。免疫化は、生理食塩水（好ましくは、フロイント完全アジュバントのようなアジュバント）中の抗原を含む溶液を混合または乳化し、そしてその混合物またはエマルジョンを非経口的に注射することによって実施され得る。当該分野で公知の任意の免疫化方法は、本発明のモノクローナル抗体を得るために使用され得る。動物を免疫化した後、脾臓（そして必要に応じて、数個の大きなリンパ節）が取り出され、そして単一の細胞に分離される。上記脾臓細胞は、目的の抗原でコーティングされたプレートまたはウェルに細胞懸濁液を適用することによって、スクリーニングされ得る。上記抗原に特異的な膜結合型免疫グロブリンを発現するＢ細胞は、プレートに結合し、リンスで除かれない。得られたＢ細胞、または全ての分離された脾臓細胞は、次いでミエローマ細胞との融合が誘導されてハイブリドーマを形成し、そして選択培地中で培養される。得られた細胞は、系列希釈によってプレートされ、そして目的の抗原に特異的に結合する（かつ、無関係の抗原に結合しない）抗体の産生についてアッセイされる。選択されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を分泌するハイブリドーマは、次いでインビトロ（例えば、組織培養ボトルまたは中空繊維反応器において）、またはインビボ（例えば、マウスの腹水）のいずれかで培養される。
本発明のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体が、組換えＤＮＡ方法を使用して調製される場合、モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）を使用して容易に単離され、そして配列決定される。本明細書におい記載されるハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として機能する。一旦単離されると、上記ＤＮＡは、発現ベクター中に配置され得、次いでこの発現ベクターは、それ以外では免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞）にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成を得る。抗体をコードする細菌のＤＮＡにおける組換え発現に関する概説の論文としては、Ｓｋｅｒｒａら（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２５６およびＰｈｉｃｋｔｈｕｎ（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ．１３０：１５１が挙げられる。あるいは、抗体は、米国特許第５，５４５，４０３号；同第５，５４５，４０５号；および同第５，９９８，１４４号（これらは、本明細書において参考として援用される）に開示されるように、ＣＨＯ細胞株のような細胞株において産生され得る。手短に言えば、上記細胞株は、それぞれ軽鎖および重鎖を発現し得るベクターを用いてトランスフェクトされる。別個のベクター上の２つのタンパク質をトランスフェクトすることによって、キメラ抗体が産生され得る。別の利点は、上記抗体の正しいグリコシル化である。
いくつかの実施形態において、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体（例えば、ＣＨＩＲ−１２．１２抗体またはＣＨＩＲ−５．９抗体）またはその抗原結合フラグメントは、グルタミンシンターゼをマーカーとして使用するＧＳ遺伝子発現系（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，Ｎｅｗ Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ）を使用してＣＨＯ細胞中で産生され得る。米国特許第５，１２２，４６４号；同第５，５９１，６３９号；同第５，６５８，７５９号；同第５，７７０，３５９号；同第５，８２７，７３９号；同第５，８７９，９３６号；同第５，８９１，６９３号；および同第５，９８１，２１６号もまた参照のこと；これらの内容は、その全体が本明細書において参考として援用される。
ＣＤ４０に対するモノクローナル抗体は、当該分野で公知である。例えば、以下におけるＢ細胞抗原のための節を参照のこと：ＭｃＭｉｃｈａｅｌ（編）（１９８７；１９８９）Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ ＩＩＩ ａｎｄ ＩＶ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；米国特許第５，６７４，４９２号；同第５，８７４，０８２号；同第５，６７７，１６５号；同第６，０５６，９５９号；ＷＯ ００／６３３９５；国際公開第０２／２８９０５号および国際公開第０２／２８９０４号；Ｇｏｒｄｏｎら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：１４２５；Ｖａｌｌｅら（１９８９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：１４６３；Ｃｌａｒｋら（１９８６）ＰＮＡＳ ８３：４４９４；Ｐａｕｌｉｅら（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：５９０；Ｇｏｒｄｏｎら（１９８７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：１５３５；Ｊａｂａｒａら（１９９０）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：１８６１；Ｚｈａｎｇら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：１８３６；Ｇａｓｃａｎら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８；Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら（１９９１）Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ３：８；およびＢａｎｃｈｅｒｅａｕら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：７０；これらの全ては、本明細書において参考として援用される。本発明に対する特有の目的は、上記に記載のモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９およびモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２の結合特性を共有する、本明細書において開示されるアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体である。
本明細書において使用される場合、用語「ＣＤ４０抗原エピトープ」は、本発明の抗ＣＤ４０モノクローナル抗体と免役反応をし得る分子をいい、ＣＤ４０抗原それ自身は除く。ＣＤ４０抗原エピトープは、タンパク質、タンパク質フラグメント、ペプチド、炭水化物、脂質、および他の分子を含み得るが、本発明の目的に関しては、最も一般的なタンパク質、短いオリゴペプチド、オリゴペプチドの模倣体（ｍｉｍｉｃ）（すなわち、ＣＤ４０抗原の抗体結合特性を模倣する有機化合物）、またはそれらの組み合わせである。適切なオリゴペプチド模倣体は、特に、ＰＣＴ出願ＵＳ ９１／０４２８２に記載される。
さらに、用語「抗ＣＤ４０抗体」は、本明細書において使用される場合、キメラ抗ＣＤ４０抗体を包含する；本発明の方法で使用するためのこのようなキメラ抗ＣＤ４０抗体は、本明細書において記載されるＣＨＩＲ−５．９モノクローナル抗体およびＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体の結合特性を有する。「キメラ」抗体によって、最も好ましくは組換えデオキシリボ核酸技術を使用して誘導され、そしてヒト（免疫学的に「関連した」種（例えば、チンパンジー）を含む）と非ヒトの両方の構成要素を含む抗体が意図される。従って、上記キメラ抗体の定常領域は、最も好ましくは、天然のヒト抗体の定常領域と実質的に同一であり；上記キメラ抗体の可変領域は、最も好ましくは非ヒト供給源に由来し、そしてＣＤ４０細胞表面抗原に対して所望の抗原特異性を有する。上記非ヒト供給源は、ヒトＣＤ４０細胞表面抗原またはヒトＣＤ４０細胞表面抗原を含む物質に対する抗体を作製するために使用され得る任意の脊椎動物供給源であり得る。このような非ヒト供給源としては、げっ歯類（例えば、ウサギ、ラット、マウスなど；例えば、米国特許第４，８１６，５６７号（本明細書において、参考として援用される）を参照のこと）および非ヒト霊長類（例えば、旧世界サル、サルなど；例えば、米国特許第５，７５０，１０５号および同第５，７５６，０９６号（本明細書において、参考として援用される）を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書において使用される場合、語句「免疫学的に活性」とは、キメラ抗ＣＤ４０抗体をいう際に使用される場合、ヒトＣＤ４０に結合するキメラ抗体を意味する。
キメラ抗ＣＤ４０抗体およびヒト化抗ＣＤ４０抗体はまた、本明細書において使用される場合、用語抗ＣＤ４０抗体によって包含される。キメラ抗体は、異なる種に由来する抗体のセグメントを含む。Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）は、マウス可変領域およびヒト定常領域を有するキメラ抗体の例である。
「ヒト化」によって、非ヒト免疫グロブリン配列に由来する最小の配列を含む抗ＣＤ４０抗体の形態が意図される。大部分については、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリンであり（レシピエント抗体）、このヒト化抗体において、レシピエントの超可変領域（相補性決定領域またはＣＤＲとしても公知）由来の残基は、非ヒト種（例えば、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類）の超可変領域に由来する残基によって置換される（ドナー抗体）。語句「相補性決定領域」とは、天然の免疫グロブリン結合部位のうちの天然のＦｖ領域の結合親和性および結合特異性を一緒に規定するアミノ酸配列をいう。例えば、Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７；Ｋａｂａｔら（１９９１）米国保健省（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、ＮＩＨ公開番号９１−３２４２を参照のこと。語句「定常領域」とは、エフェクター機能を与える抗体分子の部分をいう。ヒト疾患の治療において使用するための非免疫原性抗体の作製に関する先行する研究において、マウスの定常領域は、ヒト定常領域によって置換された。この対象のヒト化抗体の定常領域は、ヒト免疫グロブリンに由来した。しかしながら、これらのヒト化抗体は、ヒトにおいて好ましくなく、かつ危険な可能性のある免疫応答を依然として誘発し、そして親和性が喪失した。本発明の方法において使用するためのヒト化抗ＣＤ４０抗体は、本明細書中に記載されたＣＨＩＲ−５．９モノクローナル抗体およびＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体によって示される結合特性と類似した結合特性を有する。
ヒト化は、本質的に、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６）に従って、げっ歯類もしくは変異体げっ歯類のＣＤＲまたはげっ歯類もしくは変異体げっ歯類のＣＤＲ配列を、ヒト抗体の対応する配列の代わりに置換することによって実施され得る。米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５８５，０８９号；同第５，６９３，７６１号；同第５，６９３，７６２号；同第５，８５９，２０５号もまた参照のこと；これらは、本明細書において参考として援用される。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンの１以上の可変領域のフレームワーク領域内の残基は、対応する非ヒト残基によって置換される（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号；同第５，６９３，７６１号；同第５，６９３，７６２号；および同第６，１８０，３７０号を参照のこと）。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含み得る。これらの改変は、抗体性能をさらに洗練させるため（例えば、所望の親和性を得るため）になされる。一般的に、上記ヒト化抗体は、少なくとも１つの、そして代表的には２つの可変領域の全てを実質的に含み、この抗体において、非ヒト免疫グロブリンの超可変領域に対応する超可変領域の全てまたは実質的に全て、ならびに上記フレームワーク領域の全てまたは実質的に全ては、ヒト免疫グロブリン配列のものである。上記ヒト化抗体はまた、必要に応じて、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）（代表的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域）の少なくとも一部分を含む。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３３１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９；およびＰｒｅｓｔａ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６を参照のこと；これらは、本明細書において参考として援用される。従って、このような「ヒト化」抗体は、実質的に決してインタクトでないヒト可変ドメインが、非ヒト種からの対応する配列によって置換されている抗体を包含し得る。実際には、ヒト化抗体は、代表的に、いくつかのＣＤＲ残基およびおそらくいくつかのフレームワーク残基が、げっ歯類抗体におけるアナログ部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。例えば、米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５８５，０８９号；同第５，６９３，７６１号；同第５，６９３，７６２号；同第５，８５９，２０５号を参照のこと。米国特許番号６，１８０，３７０および国際公開第０１／２７１６０号もまた参照のこと。ここで、ヒト化抗体および所定の抗原に対して改善された親和性を有するヒト化抗体を作製するための技術が、開示される。
用語抗ＣＤ４０抗体によって、不活化された内因性免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座によって特徴付けられる非ヒト哺乳動物宿主（より具体的には、トランスジェニックマウス）において産生される異種抗ＣＤ４０抗体または改変抗ＣＤ４０抗体もまた包含される。このようなトランスジェニック動物において、宿主免疫グロブリンの軽鎖サブユニットおよび重鎖サブユニットを発現し得る内因性遺伝子は、非機能性にされ、アナログのヒト免疫グロブリン遺伝子座で置換される。これらのトランスジェニック動物は、軽鎖または重鎖の宿主の免疫グロブリンサブユニットが実質的に存在せずに、ヒト抗体を産生する。例えば、米国特許第５，８７７，３９７号および同第５，９３９，５９８号（本明細書において参考として援用される）を参照のこと。
好ましくは、トランスジェニックマウスを免疫化することによって、ＣＤ４０に対する完全ヒト抗体が得られる。このようなマウスの１つは、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）技術（Ａｂｇｅｎｉｘ；Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して得られ、そして米国特許第６，０７５，１８１号、同第６，０９１，００１号および同第６，１１４，５９８号（これらの全ては、本明細書において参考として援用される）に開示される。本明細書において開示される抗体を作製するために、ヒトＩｇ Ｇ１重鎖遺伝子座およびヒトκ軽鎖遺伝子座についてのトランスジェニックマウスを、ヒトＣＤ４０を発現するＳｆ９細胞で免疫化した。マウスはまた、他のアイソタイプについてのトランスジェニックであってもよい。本発明の方法において有用な完全ヒト抗体は、本明細書において開示されるＣＨＩＲ−５．９モノクローナル抗体およびＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体によって示される結合特性と類似の結合特性によって特徴付けられる。
上記抗ＣＤ４０抗体のフラグメントは、それらが全長抗体の所望される親和性を保持する限り、本発明の方法においての使用に適切である。従って、抗ＣＤ４０抗体のフラグメントは、ＣＤ４０ Ｂ細胞表面抗原に結合する能力を保持する。このようなフラグメントは、対応する全長のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体に類似の特性によって特徴付けられる。すなわち、このフラグメントは、ヒト細胞の表面上に発現されたヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合し、そして有意なアゴニスト活性を有さないが、ヒトＣＤ４０発現細胞上のＣＤ４０抗原に結合された場合、アンタゴニスト活性を示す。このようなフラグメントは、本明細書において「抗原結合」フラグメントといわれる。
抗体の適切な抗原結合フラグメントは、全長抗体の一部分（一般的には、抗原結合領域またはその可変領域）を含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、およびＦｖフラグメント、ならびに単鎖抗体分子が挙げられるが、これらに限定されない。「Ｆａｂ」によって、軽鎖と重鎖の一部とからなる免疫グロブリンの一価の抗原結合フラグメントが意図される。Ｆ（ａｂ’）２によって、両方の軽鎖と両方の重鎖の一部とを含む免疫グロブリンの二価の抗原結合フラグメントが意図される。「単鎖Ｆｖ」抗体フラグメントまたは「ｓＦｖ」抗体フラグメントによって、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインが一本のポリペプチド鎖中に存在するフラグメントが意図される。例えば、米国特許第４，９４６，７７８号、同第５，２６０，２０３号、同第５，４５５，０３０号および同第５，８５６，４５６号（これらは、本明細書において参考として援用される）を参照のこと。一般的に、上記Ｆｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に、ｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にするためのポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓＦｖの概要については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９４）、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第１１３巻、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ（編）（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、２６９−３１５頁を参照のこと。本明細書において開示されるアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の抗原結合フラグメントはまた、本明細書の以下に記載されるように、細胞毒と結合体化されて標的癌細胞の殺傷を達成し得る。
抗体または抗体フラグメントは、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５４（１９９０）および米国特許第５，５１４，５４８号において記載される技術を使用して作製された抗体ファージライブラリーから単離され得る。Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８およびＭａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７は、それぞれ、ファージライブラリーを使用したマウス抗体およびヒト抗体の単離を記載する。以下の刊行物は、鎖の混合（ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）による高親和性（ｎＭ範囲）のヒト抗体の作製（Ｍａｒｋｓら（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９−７８３）、および非常に広範なファージライブラリーを構築するためのストラテジーとしての、組み合わせ感染およびインビボの再組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：２２６５−２２６６）を記載する。従って、これらの技術は、モノクローナル抗体を単離するための伝統的なモノクローナル抗体のハイブリドーマ技術に対する実行可能な代替物である。
種々の技術が、抗体フラグメントの作製のために開発されている。伝統的には、これらのフラグメントは、インタクトな抗体のタンパク質分解性消化を介して得られた（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら（１９９２）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７−１１７（１９９２）およびＢｒｅｎｎａｎら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１を参照のこと）。しかし、これらのフラグメントは、現在は、組換え宿主細胞によって直接的に産生され得る。例えば、この抗体フラグメントは、上記に記載の抗体ファージライブラリーから単離され得る。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収され得、化学的に結合されてＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成する（Ｃａｒｔｅｒら（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３−１６７）。別のアプローチに従って、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、組換え宿主細胞の培養物から直接単離され得る。抗体フラグメントを作製するための他の技術は、当業者には明らかである。
本発明の方法において有用なアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体としては、本明細書において開示されたＣＨＩＲ−５．９モノクローナル抗体およびＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体、ならびにこれらの抗体とは異なるが、そのＣＤＲを保持している抗体；ならびに１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、または置換を有する抗体が挙げられる。ここで、上記アンタゴニスト活性は、Ｂ細胞の増殖および／または分化の阻害によって測定される。本発明はまた、脱免疫化された（ｄｅ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体を包含する。この抗体は、例えば、国際公開第９８／５２９７６号および同第００３４３１７号（本明細書において参考として援用される）に記載されたとおりに作製され得る。この様式において、本発明のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体内の残基が改変されて、ヒトＣＤ４０発現細胞に対するアンタゴニスト活性を保持しながら、抗体を、ヒトに対して免疫原性がなくさせるか、または免疫原性を低くさせる。ここで、このような活性は、本明細書の他の部分で記述されるアッセイによって測定される。特許請求の範囲の範囲内には、本発明のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメントを含む融合タンパク質もまた包含され、この融合タンパク質は、当該分野で公知のように、合成されても、対応するポリヌクレオチドベクターから発現されてもよい。このような融合タンパク質は、以下に記述される抗体の結合体化への参照とともに記載される。
本発明の抗体は、例えば欧州特許出願公開第０ ９８３ ３０３ Ａ１号、国際公開第００／３４３１７号および同第９８／５２９７６号（本明細書において参考として援用される）において記載される方法を使用して作製される配列のバリエーションを有し得る。例えば、ＣＤＲ内の配列は、抗体をＭＨＣクラスＩＩに結合させ、好ましくないヘルパーＴ細胞応答を誘発し得ることが示されている。保存的置換は、上記抗体に結合活性を保持させるが、好ましくないＴ細胞応答を誘発するその能力を失わせ得る。任意のこのような保存的置換または非保存的置換は、当該分野で認められた方法（例えば、本明細書中の別の部分に記載される方法）を使用して作製され得、そして生じた抗体は、本発明の範囲内である。この改変抗体は、本明細書において記載された方法を使用して、通常、アンタゴニスト活性、親和性、および特異性について試験され得る。
上記した方法のいずれか、または本明細書に開示しないいずれか別の方法により生産される抗体または、それが以下の生物学的活性、即ち、Ｔ細胞により刺激される正常ヒト末梢Ｂ細胞による免疫グロブリン分泌の抑制；Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞により刺激される正常ヒト末梢Ｂ細胞の生存および／または増殖の抑制；ＣＤ４０Ｌ発現細胞または可溶性ＣＤ４０リガンド（ｓＣＤ４０Ｌ）により刺激される正常ヒト末梢Ｂ細胞の生存および／または増殖の抑制；ｓＣＤ４０Ｌまたは固相ＣＤ４０Ｌにより刺激されるいずれかの細胞における「生存」抗アポトーシス細胞内シグナルの抑制；ｓＣＤ４０Ｌまたは固相ＣＤ４０Ｌとのライゲーションによるいずれかの細胞におけるＣＤ４０シグナル伝達の抑制；および後述するヒト悪性Ｂ細胞の増殖の抑制の少なくともいずれか１つを有している場合に本発明の範囲に包含される。これらの試験は本明細書の実施例に記載する通り実施できる。また、参照により本明細書に組み込まれるＳｃｈｕｌｔｚｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：８２００−８２０４；Ｄｅｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，２：６−１５；Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：６８８−６９７；Ｎｏｅｌｌｅ（１９９８）Ａｇｅｎｔｓ Ａｃｔｉｏｎｓ Ｓｕｐｐｌ．４９：１７−２２；Ｌｅｄｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３：７７−８６；Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １３：１２；Ｋｗｅｋｋｅｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ７９：４３９−４４４；および米国特許５，６７４，４９２および５，８４７，０８２に記載の試験法も参照される。
本明細書において同定されるＣＤ４０抗原エピトープに特異的なアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体を検出するための代表的なアッセイは、「競合的結合アッセイ」である。競合的結合アッセイは、そのアッセイにおいて、未知のものが、特異的な抗体に対する標識された既知のリガンドの結合を阻害するその能力によって検出されて定量される、血清学的アッセイである。これはまた、競合的阻害アッセイともいわれる。代表的な競合的結合アッセイにおいて、標識されたＣＤ４０ポリペプチドは、例えば、本発明のモノクローナル抗体の１つ以上のエピトープに対して惹起されたモノクローナル抗体と組み合わせて、サンプル中の候補抗体によって沈殿される。目的のエピトープと特異的に反応する抗ＣＤ４０抗体は、ＣＤ４０タンパク質または目的のＣＤ４０タンパク質の特定のエピトープを含むタンパク質のフラグメントに対して調製された一連の抗体をスクリーニングすることによって同定され得る。例えば、ヒトＣＤ４０について、目的のエピトープとしては、図１２Ｂ（配列番号１０）に記載されたヒトＣＤ４０の短いアイソフォーム（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿６９０５９３を参照のこと）（図１２Ａに記載される配列（配列番号９；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿１５２８５４もまた参照のこと）によってコードされる）、もしくは図１２Ｄ（配列番号１２）に記載されたヒトＣＤ４０の長いアイソフォーム（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＡ４３０４５およびＮＰ＿００１２４１を参照のこと）（図１２Ｃに記載される配列（配列番号１１；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ６０５９２およびＮＭ＿００１２５０を参照のこと）によってコードされる）の直鎖状アミノ酸残基および／または非直鎖状アミノ酸残基を含むエピトープが挙げられる。あるいは、以前に同定された適切なアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体を用いた競合的結合アッセイは、以前に同定された抗体に匹敵するモノクローナル抗体を選択するために使用される。
このような免疫アッセイで使用される抗体は、標識されていても標識されていなくてもよい。標識されていない抗体は、凝集反応において使用され得；標識された抗体は、多種多様の標識を使用して、多種多様のアッセイにおいて使用され得る。抗ＣＤ４０抗体と目的のエピトープとの間の抗体−抗原複合体の形成の検出は、上記抗体に検出可能な物質を結合させることによって容易にされ得る。適切な検出手段としては、放射性核種、酵素、補酵素、蛍光剤、化学ルミネセンス、色素体、酵素基質または補因子、酵素インヒビター、補欠分子族複合体、フリーラジカル、粒子、色素などのような標識の使用が挙げられる。適切な酵素の例としては、ホースラディシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが挙げられる；ルミネセンス物質の例は、ルミノールである；生物ルミネセンス物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられる；そして適切な放射活性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、または３Ｈが挙げられる。このような標識された試薬は、種々の周知のアッセイ（例えば、放射免疫アッセイ、酵素免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫アッセイなど）において使用され得る。例えば、米国特許第３，７６６，１６２号；同第３，７９１，９３２号；同第３，８１７，８３７号；および同第４，２３３，４０２号を参照のこと。
以前に記載したアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗体フラグメントのいずれかを結合体化した後に本発明の方法において用いてよい。結合体化した抗体を製造するための方法は当該分野で知られている。即ち、抗ＣＤ４０抗体は直接の標識方法または間接的な標識方法により標識してよい。「間接的な標識」または「間接的な標識方法」とはキレート剤を抗体に共有結合させ、そして少なくとも１つの放射性核種をキレート剤に挿入することを意図する。例えば参照により本明細書に組み込まれるＳｒｉｖａｇｔａｖａ ａｎｄ Ｍｅａｓｅ （１９９１）Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏ．１８：５８９−６０３に記載されているキレート剤および放射性核種を参照できる。適当な標識は蛍光団、発色団、放射性原子（特に３２Ｐおよび１２５Ｉ）、電子稠密試薬、酵素および特異的結合相手を有するリガンドを包含する。酵素は典型的にはその活性により検出される。例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼは通常は分光光度計により定量可能な青色色素に３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を変換するその能力により検出される。「特異的結合相手」とは抗原とそれに特異的なモノクローナル抗体の場合のように、高い特異性でリガンド分子に結合し得る蛋白を指す。他の特異的な結合相手はビオチンとアビジンまたはストレプトアビジン、ＩｇＧとプロテインＡ、および当該分野で知られている多くの受容体リガンド対を包含する。上記した説明は種々の標識を個々のクラスに分類することを意味せず、同じ標識が数種の異なる様式で作用してよい。例えば１２５Ｉは放射性標識として、または電子稠密試薬として作用してよい。ＨＲＰは酵素として、またはｍＡｂに対する抗原として作用してよい。更にまた、種々の標識を所望の作用のために組み合わせてもよい。例えば、ｍＡｂおよびアビジンは本発明の実施においてやはり標識を必要とし；即ち、ｍＡｂをビオチンで標識し、その存在は、１２５Ｉで標識したアビジンを用いて、または、ＨＲＰで標識した抗ビオチンｍＡｂを用いて検出する場合がある。他の順序および可能性は当業者が容易に知りえるものであり、本発明において等価であるとみなされる。
或いは、抗ＣＤ４０抗体は「直接の標識」または「直接の標識方法」を用いて標識してよく、この場合、放射性核種は抗体に直接共有結合される（典型的にはアミノ酸残基を介する）。好ましい放射性核種は上出のＳｒｉｖａｇｔａｖａ ａｎｄ Ｍｅａｓｅ（１９９１）に記載されている。間接的な標識方法が特に好ましい。例えば参照により本明細書に組み込まれる抗体に放射性標識を結合するためにリンカーを使用している国際特許公開ＷＯ００／５２０３１およびＷＯ００／５２４７３、および、米国特許６，０１５，５４１に記載されている抗ＣＤ４０抗体の標識された形態を参照できる。
更にまた、抗体（またはそのフラグメント）を細胞毒、治療薬または放射性金属イオンまたは放射性同位体のような治療部分に結合体化してよい。細胞毒または細胞毒性薬剤には細胞に有害であるいずれかの物質が包含される。例としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、マイトキサントロン、ミスラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロパノロールおよびピューロマイシンおよびこれらの類縁体または相同体が挙げられる。治療薬としては例えば代謝拮抗物質（例えばメトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えばメクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾシン、マイトマイシンＣおよびシスジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン類（例えばダウノルビシン（以前のダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えばダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン（ＡＭＣ））および抗有糸分裂剤（例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられる。放射性同位体には例えばＩ−１３１、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｙ−９０、Ｒｅ−１８８、Ｒｅ−１８６、Ａｔ−２１１、Ｃｕ−６７、Ｂｉ−２１２、Ｂｉ−２１３、Ｐｄ−１０９、Ｔｃ−９９、Ｉｎ−１１１等が包含される。本発明の結合体化は所定の生物学的応答を修飾するために使用でき；薬剤部分は伝統的な化学療法剤に限定されない。例えば薬剤部分は所望の生物学的活性を有する蛋白またはポリペプチドであってよい。このような蛋白は例えば毒素、例えばアブリン、リシンＡ、シュードモナスの外毒素またはジフテリア毒素；蛋白、例えば腫瘍壊死因子、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、神経生育因子、血小板誘導成長因子、組織プラスミノーゲン活性化物質；または、生物学的応答モディファイアー、例えばリンホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）または他の成長因子を包含する。
このような治療薬を抗体に結合体化する手法はよく知られている。例えばＡｒｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｉｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｅｄ．Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．），ｐｐ．２４３−２５６；ｅｄ．Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．（１９８７）「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」， Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ， ｅｄ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２ｄ ｅｄ；Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｃｋｅｒ， Ｉｎｃ．），ｐｐ．６２３−６５３；Ｔｈｏｒｐｅ（１９８５）「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｓ ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ｅｄ． Ｐｉｎｃｈｅｒａ ｅｔ ａｌ．ｐｐ．４７５−５０６（Ｅｄｉｔｒｉｃｅ Ｋｕｒｔｉｓ，Ｍｉｌａｎｏ，Ｉｔａｌｙ，１９８５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｅｄ．Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８５），ｐｐ．３０３−３１６；およびＴｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−１５８を参照できる。
あるいは、抗体は、第２の抗体に結合体化されて、米国特許第４，６７６，９８０号に記載されるような抗体ヘテロ結合体（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を形成し得る。さらに、リンカーが、上記標識と本発明の抗体との間に使用され得る（米国特許第４，８３１，１７５号を参照のこと）。抗体またはその抗原結合フラグメントは、放射活性なヨウ素、インジウム、イットリウムまたは当該分野で公知の他の放射活性粒子を用いて直接的に標識され得る（米国特許第５，５９５，７２１号）。処置は、同時または引き続いて投与される結合体化抗体および非結合体化抗体を用いた、処置の組み合わせからなり得る（ＷＯ ００／５２０３１およびＷＯ ００／５２４７３）。
（アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の改変体）
上記アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の生物学的に活性な適切な改変体が、本発明の方法において使用され得る。このような改変体は、親のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の所望の結合特性を保持する。抗体改変体を作製するための方法は、当該分野で一般的に利用可能である。
例えば、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体（例えば、本明細書において記載されるＣＨＩＲ−５．９モノクローナル抗体またはＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体）のアミノ酸配列の改変体は、目的の抗体をコードするクローン化されたＤＮＡ配列中の変異によって調製され得る。変異誘発およびヌクレオチド配列変更についての方法は、当該分野で周知である。例えば、以下を参照のこと：ＷａｌｋｅｒおよびＧａａｓｔｒａ（編）（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；米国特許第４，８７３，１９２号；およびこれらにおいて引用される参考文献（これらは、本明細書において参考として援用される）。目的のポリペプチドの生物学的活性に影響しない適切なアミノ酸置換基に関してのガイダンスは、Ｄａｙｈｏｆｆら（１９７８）、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）（本明細書において参考として援用される）のモデルにおいて見出され得る。１つのアミノ酸を類似の特性を有する別のアミノ酸で交換するような、保存的置換が好まれ得る。保存的置換の例としては、Ｇｌｙ⇔Ａｌａ、Ｖａｌ⇔Ｉｌｅ⇔Ｌｅｕ、Ａｓｐ⇔Ｇｌｕ、Ｌｙｓ⇔Ａｒｇ、Ａｓｎ⇔Ｇｌｎ、およびＰｈｅ⇔Ｔｒｐ⇔Ｔｙｒが挙げられるが、これらに限定されない。
目的のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体ポリペプチドの改変体の構築において、改変は、改変体が所望の活性（すなわち、類似の結合親和性）を保有し続け、そしてヒト細胞の表面上に発現されたヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合することができ、そして有意なアゴニスト活性を有さないが、ヒトＣＤ４０発現細胞上のＣＤ４０抗原に結合された場合に、アンタゴニスト活性を示すようになされる。明らかに、上記改変ポリペプチドをコードするＤＮＡ中に作製された任意の変異は、リーディングフレームの外の配列に位置してはならず、そして好ましくは、２次ｍＲＮＡ構造を生じ得る相補的領域を作製しない。欧州特許出願公開第７５，４４４号を参照のこと。
さらに、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の定常領域が変異されて、多くの方法でエフェクター機能を変更し得る。例えば、米国特許第６，７３７，０５６Ｂ１号および米国特許出願公開第２００４／０１３２１０１Ａ１号を参照のこと。これらは、Ｆｃレセプターへの抗体結合を最適化するＦｃ変異体を開示する。
好ましくは、参照アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の改変体は、参照アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体分子（例えば、本明細書において記載されるＣＨＩＲ−５．９モノクローナル抗体またはＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体）についてのアミノ酸配列に対してか、あるいは参照抗体分子のより短い部分に対して、少なくとも７０％もしくは７５％の配列同一性、好ましくは少なくとも８０％もしくは８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。より好ましくは、上記分子は、少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を共有する。本発明の目的のために、アフィンギャップサーチを使用したＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎホモロジーサーチアルゴリズム（１２のギャップオープンペナルティおよび２のギャップ伸長ペナルティ、６２のＢＬＯＳＵＭマトリックスを使用）を使用して、配列同一性％が決定される。このＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎホモロジーサーチアルゴリズムは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２−４８９において教示される。改変体は、例えば、わずか１〜１５アミノ酸残基、わずか１〜１０アミノ酸残基（例えば、６〜１０）、わずか５、わずか４、３、２、またはさらに１アミノ酸残基だけ上記参照アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体と異なる。
２つのアミノ酸配列の最適アラインメントに関して、上記改変アミノ酸配列の隣接するセグメントは、上記参照アミノ酸配列について、アミノ酸残基の付加またはアミノ酸残基の欠失を有し得る。上記参照アミノ酸配列を比較するために使用される隣接するセグメントは、少なくとも２０個の連続するアミノ酸残基を含み、そして３０個、４０個、５０個またはそれ以上のアミノ酸残基であり得る。保存的な残基置換またはギャップに関連する配列同一性に対する補正が、なされ得る（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎホモロジーサーチアルゴリズムを参照のこと）。
特に、悪性Ｂ細胞上のＣＤ４０抗原に結合された場合、ＣＤ４０を特異的に結合し、かつアンタゴニスト活性を保持し得るポリペプチドの正確な化学的構造は、多くの因子に依存する。イオン化可能なアミノ基およびカルボニル基が分子中に存在する場合、特定のポリペプチドは、酸性塩もしくは塩基性塩として、または中性形態で得られ得る。適切な環境状態に配置された場合に、その生物学的活性を保持するような調製物の全ては、本明細書において使用されるアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の定義の中に含まれる。さらに、上記ポリペプチドの一次アミノ酸配列は、糖部分を使用した誘導体化（グリコシル化）または他の補助的な分子（例えば、脂質、リン酸、アセチル基など）によって増加され得る。上記ポリペプチドの一次アミノ酸配列は、糖類との結合体化によってもまた増加され得る。このような増加の特定の局面は、産生する宿主の翻訳後の処理システムを通じて達成され；他のこのような改変は、インビトロで導入され得る。とにかく、このような改変は、上記抗ＣＤ４０抗体のアンタゴニスト特性が破壊されない限り、本明細書において使用される抗ＣＤ４０抗体の定義の中に含まれる。このような改変体は、種々のアッセイにおいて、上記ポリペプチドの活性を増強させるか、または弱めるかのいずれかによって、その活性に量的または質的に影響し得ることが予想される。さらに、上記鎖中の個々のアミノ酸残基は、酸化、還元、または他の誘導体化によって改変され得、そして上記ポリペプチドは、活性を保持するフラグメントを得るために切断され得る。アンタゴニスト活性を破壊しないこのような変更は、本明細書において使用される目的の抗ＣＤ４０抗体の定義から上記ポリペプチド配列を除かない。
当該分野は、ポリペプチド改変体の調製および使用に関する実質的なガイダンスを提供する。抗ＣＤ４０抗体改変体の調製において、当業者は、天然のタンパク質ヌクレオチドまたはアミノ酸配列に対するどの修飾が、本発明の方法において使用される薬学的組成物の治療上活性な成分として使用するために適切である改変体を生じるかを容易に決定し得る。
（本発明のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体を使用する処置方法）
本発明の方法はＣＤ４０発現細胞上のＣＤ４０シグナル伝達の刺激により媒介される疾患を有する患者を処置するためのアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の使用に関する。「ＣＤ４０発現細胞」とは、ＣＤ４０抗原を発現する正常および悪性のＢ細胞を意図している。細胞におけるＣＤ４０発現を検出するための方法は当該分野で知られており、例えばＰＣＲ法、免疫組織化学、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ等を包含するが、これに限定されない。「悪性」Ｂ細胞とは、いずれかの新生物性のＢ細胞、例えばリンパ腫から誘導されたＢ細胞、例えば軽度−、中等度−、および高度−悪性Ｂ細胞リンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、エプスタインーバーウィルス（ＥＢＶ）誘導リンパ腫、および、エイズ関連リンパ腫、並びにＢ細胞急性リンパ芽球性白血病、骨髄腫、慢性リンパ性白血病、急性骨髄芽球性白血病等を意図しているが、これに限定されない。
「処置」とは、本明細書においては、患者へのアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントの適用または投与、または、患者に由来する単離された組織または細胞へのアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメントの適用または投与として定義され、ここで患者は疾患、疾患の症状、または疾患の罹患し易さを有しており、ここで、目的は疾患、疾患の症状または疾患の罹患し易さに対し、完治、治癒、緩和、緩解、改変、軽快、軽減、改善または影響をもたらすことである。「処置」とはまた疾患、疾患の症状、または疾患の罹患し易さを有している患者へのアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメントを含む薬学的組成物の適用または投与、または、患者に由来する単離された組織または細胞へのアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメントを含む薬学的組成物の適用または投与を意図しており、ここで、目的は疾患、疾患の症状または疾患の罹患し易さに対し、完治、治癒、緩和、緩解、改変、軽快、軽減、改善または影響をもたらすことである。
「抗腫瘍活性」とは悪性のＣＤ４０発現細胞の増殖または蓄積の速度の低減、即ち、既存の腫瘍の生育速度、または、治療中に生じた腫瘍の低減、および／または、既存の新生物（腫瘍）細胞または新しく形成した新生物細胞の破壊、即ち治療中の腫瘍の全体的大きさの減少を意図している。少なくとも１つの抗ＣＤ４０抗体（またはその抗原結合フラグメント）を用いた治療はヒトにおけるＣＤ４０発現細胞上のＣＤ４０シグナル伝達の刺激に伴う疾患状態の治療に関連して有益である生理学的応答を誘発する。
本発明の方法は異常な制御不能なＢ細胞の増殖または蓄積に関連する非ホジキンリンパ腫の治療において使用できる。本発明の目的のためには、このようなリンパ腫はＷｏｒｋｉｎｇ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ分類スキームに従って、軽度悪性、中等度悪性、および高度悪性に分類されるＢ細胞リンパ腫であるものを指す（「Ｔｈｅ Ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ Ｌｙｍｐｈｏｍａ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｊｅｃｔ」，Ｃａｎｃｅｒ ４９（１９８２）：２１１２−２１３５参照）。即ち、軽度悪性Ｂ細胞リンパ腫は小型のリンパ球の濾胞性の小分裂の細胞、および、濾胞性の混合型小分裂および大細胞のリンパ腫を包含し；中等度悪性のリンパ腫は濾胞性の大細胞、散在小分裂細胞、散在混合型小および大細胞、および散在大細胞リンパ腫を包含し；そして高度悪性リンパ腫はバーキットおよび非バーキット型の大細胞免疫芽性、リンパ芽性および小型非分裂細胞リンパ腫を包含する。
本発明の方法はＲｅｖｉｓｅｄ Ｅｕｒｏｐｅａｎ ａｎｄ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｌｙｍｐｈｏｍａ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ （ＲＥＡＬ）システムに従って分類されるＢ細胞リンパ腫の治療処置において有用である。このようなＢ細胞リンパ腫は、例えば、前駆体Ｂ細胞新生物として分類されるリンパ腫、例えばＢリンパ芽球性白血病／リンパ腫；末梢Ｂ細胞新生物、例えばＢ細胞慢性リンパ性白血病／小型リンパ球リンパ腫、リンパプラズマ細胞様リンパ腫／免疫担当細胞腫、皮膜細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、小胞中心リンパ腫（濾胞性）（例えば散在性小細胞、散在性混合型大小細胞、および散在性大細胞リンパ腫）、辺縁層Ｂ細胞リンパ腫（例えば結節外、結節性および脾型）、ヘアリー細胞白血病、プラズマ細胞腫／骨髄腫、サブタイプ一次縦隔（胸腺性）の散在性大細胞Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫およびバーキット様高度悪性Ｂ細胞リンパ腫（ｈｉｇｈ−ｇｒａｄｅ Ｂ ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ）；急性白血病；急性リンパ球性白血病；骨髄芽球性白血病；急性骨髄球性白血病；プロ骨髄球性白血病；骨髄単球性白血病；単球性白血病；赤白血病；顆粒球性白血病（慢性骨髄球性白血病）；慢性リンパ球性白血病；真性赤血球増加症；多発性骨髄腫；ヴァルデンストレームマクログロブリン血症；重鎖疾患；および未分類の軽度悪性または高度悪性のＢ細胞リンパ腫を包含するが、これらに限定されない。
本発明の方法は治療の間に更に生じる腫瘍の派生を防止する場合に有用である。本発明の方法は軽度悪性Ｂ細胞リンパ腫を有する対象、特に標準的な化学療法の後の再発を有する対象において特に有用である。軽度悪性Ｂ細胞リンパ腫は中等度および高度悪性のＢ細胞リンパ腫よりも無痛性であり、再発／後退の経過を特徴とする。即ち、これらのリンパ腫の治療は、本発明の方法を用いれば、再発のエピソードが回数および重症度において低減するため、改善されるのである。
本明細書に記載したアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体はまた炎症性疾患および免疫系の不全または障害、例えば全身性エリテマトーデス、乾癬、硬皮症、ＣＲＥＳＴ症候群、炎症性筋炎、シェーグレン症候群、混合型結合組織疾患、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、炎症性腸疾患、急性呼吸窮迫症候群、肺炎症、特発性肺線維症、骨粗鬆症、遅延型過敏症、喘息、原発性胆汁性肝硬変および特発性血小板減少性紫斑病の治療において有用であるが、これらに限定されない。
本発明の方法によれば、本明細書において定義した少なくとも１つのアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体（またはその抗原結合フラグメント）を用いて悪性ヒトＢ細胞に関する正の治療応答を促進する。癌の治療に関する「正の治療応答」とは、これらの抗体またはそのフラグメントの抗腫瘍活性に伴う疾患の改善、および／または、疾患に関連する症状の改善を意図している。即ち、抗増殖作用、腫瘍が更に派生することの防止、腫瘍の大きさの低減、癌細胞の数の低減、および／または、ＣＤ４０発現細胞の刺激により媒介される症状１つ以上の低減が観察され得る。即ち、例えば、疾患の改善は完全な応答として特徴付けられる場合がある。「完全な応答」とはいずれかの以前の異常な放射線撮影試験、骨髄および脳脊髄液（ＣＳＦ）の正常化を伴う臨床的に検知可能な疾患の非存在を意図している。このような応答は本発明の方法による治療の後少なくとも１ヶ月継続しなければならない。或いは、疾患の改善は部分的応答として分類してよい。「部分的応答」とは、新しい患部の非存在下において、そして、少なくとも１ヶ月持続的する、全ての測定可能な腫瘍負荷（即ち対象に存在する腫瘍細胞の数）の少なくとも約５０％低減を意図している。このような応答は測定可能な腫瘍のみに適用される。
腫瘍の応答はスクリーニング手法、例えば磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）走査、Ｘ線撮影、コンピューター断層撮影（ＣＴ）走査、生体発光画像化、例えばルシフェラーゼ画像化、骨走査画像化および腫瘍生検試料採取、例えば骨髄吸引（ＢＭＡ）を用いた腫瘍形態（即ち全体的腫瘍負荷、腫瘍サイズ等）における変化に関して試験できる。これらの正の治療応答のほかに、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを用いた治療を受けている対象は疾患に関連する症状の改善の有利な作用を経験してよい。即ち、Ｂ細胞腫瘍については、対象は所謂Ｂ症状、即ち寝汗、発熱、体重減少および／または蕁麻疹の低減を経験してよい。
「治療有効な用量または量」または「有効量」とは、投与された場合にＣＤ４０発現細胞の刺激を含む疾患を有する患者の治療に関して正の治療応答をもたらすようなアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントの量を意図する。本発明の一部の実施形態においては、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメントの治療有効量は約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇまたは約７ｍｇ／ｋｇ〜約１２ｍｇ／ｋｇの範囲である。投与方法はアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントの治療有効量の単回投与または治療有効量の複数回投与を包含する。
本発明の別の実施形態は例えばある治療方法の有効性を測定するための臨床試験の操作法の一部としての組織中の蛋白濃度の診断的モニタリングのためのアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の使用である。検出は検出可能な物質に抗体をカップリングさせることにより容易にすることができる。検出可能な物質の例は、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生体発光物質および放射性物質を包含する。安定な酵素にはセイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼを包含し；適当な補欠分子族複合体の例はストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを包含し；適当な蛍光物質の例はウンビリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリスリンを包含し；発光物質の例はルミノールを包含し；生体発光物質の例はルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびイクオリンを包含し；そして適当な放射性物質の例は１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈを包含する。
本明細書に記載した抗ＣＤ４０抗体は更に、例えば試薬、例えばＣＤ４０を発現する細胞を発見するために使用できる標識された抗体を得るために使用できる。これは未知試料の細胞型を決定する場合に極めて有用である。モノクローナル抗体のパネルを使用して種および／または臓器の型により組織を同定することができる。同様の態様において、これらの抗ＣＤ４０抗体を用いて組織培養細胞を汚染に関してスクリーニング（即ち培養物中のＣＤ４０発現および非ＣＤ４０発現細胞の混合物の存在についてスクリーニング）することができる。
アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は刺激されたＣＤ４０発現細胞を含む疾患状態の治療のための既知の化学療法剤およびサイトカインと組み合わせて使用できる。例えば、本発明の抗ＣＤ４０抗体をインターロイキン−２のようなサイトカインと組み合わせて使用できる。別の実施形態においては、本発明の抗ＣＤ４０抗体をリツキシマブ（ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８：Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）；ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）と組み合わせて使用できる
この態様において、本明細書に記載したアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、少なくとも１つの他の癌の治療、例えば手術または外科的処置（例えば脾臓切除、肝切除、リンパ節切除、白血球搬出、骨髄移植など）；放射線療法；場合により自己骨髄移植と組み合わせた化学療法、ここで適当な化学療法剤は例えばフルダラビンまたはリン酸フルダラビン、クロラムブシル、ビンクリスチン、ペントスタチン、２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン）、シクロホスファミド、ドキソルビシン、プレドニソンおよびこれらの組合せ（これらに限定されない）、例えばアントラサイクリン含有処方、例えばＣＡＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン＋プレドニソン）、ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニソン＋ドキソルビシン）、ＶＡＤ（ビンクリスチン、ドキソルビシン＋デキサメタゾン）、ＭＰ（メルファラン＋プレドニソン）および化学療法に使用する他の細胞毒性および／または治療薬、例えばミトキサントロン、ダウノルビシン、イダルビシン、アスパラギナーゼ、および、代謝拮抗物質、例えば、シタラビン、メトトレキセート、５−フルオロウラシルデカルバジン、６−チオグアニン、６−メルカプトプリンおよびネララビンを包含するもの（これらに限定されない）；他の抗癌モノクローナル抗体療法（例えば、アルメツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標））または悪性Ｂ細胞上のＣＤ５２細胞表面糖蛋白をターゲティングした他の抗ＣＤ５２抗体；リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））、完全ヒト抗体ＨｕＭａｘ−ＣＤ２０、Ｒ−１５９４、ＩＭＭＵ−１０６、ＴＲＵ−０１５、ＡＭＥ−１３３、トシツモマブ／Ｉ−１３１トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ（登録商標））、イブリツモマブチウキセタン（Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標））または悪性Ｂ細胞上のＣＤ２０抗原をターゲティングするいずれかの他の治療用抗ＣＤ２０抗体；抗ＣＤ１９抗体（例えばＭＴ１０３、二重特異性抗体）；抗ＣＤ２２抗体（例えばヒト化モノクローナル抗体エプラツズマブ）；ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））またはヒト血管内皮成長因子をターゲティングする他の抗癌抗体；悪性Ｂ細胞上のＣＤ２２抗原をターゲティングする抗ＣＤ２２抗体（例えばモノクローナル抗体ＢＬ−２２、アルファＣＤ２２毒素）；マクロファージコロニー刺激因子をターゲティングするα−Ｍ−ＣＳＦ抗体；多発性骨髄腫において過剰発現される核因子−カッパＢの受容体活性化剤（ＲＡＮＫ）およびそのリガンド（ＲＡＮＫＬ）をターゲティングする抗体；悪性Ｂ細胞上のＣＤ２３をターゲティングする抗ＣＤ２３抗体（例えばＩＤＥＣ−１５２）；ＣＤ８０抗原をターゲティングする抗ＣＤ８０抗体（例えばＩＤＥＣ−１１４）；悪性Ｂ細胞上のＣＤ３８抗原をターゲティングする抗ＣＤ３８抗体；悪性Ｂ細胞上に発現される主要組織適合複合体クラスＩＩ受容体をターゲティングする抗体（抗ＭＨＣ抗体）；悪性Ｂ細胞上のＣＤ４０抗原ヲターゲティングする他の抗ＣＤ４０抗体（例えばＳＧＮ−４０）；および固形腫瘍および造血起源の腫瘍の多くにおいて発現される腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド受容体１（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１）（例えばアゴニスト性ヒトモノクローナル抗体ＨＧＳ−ＥＴＲ１）およびＴＲＡＩＬ−Ｒ２をターゲティングする抗体）；小分子系癌療法、例えば微小管および／またはトポイソメラーゼ阻害剤（例えば有糸分裂抑制剤ドラスタチンおよびドラスタチン類縁体；チュブリン結合剤Ｔ９００６０７；ＸＬ１１９；およびトポイソメラーゼ阻害剤アミノカンプトテシン）、ＳＤＸ−１０５（塩酸ベンダムスチン）、イキサベピロン（エポチロン類縁体、別名ＢＭＳ−２４７５５０）、蛋白キナーゼＣ阻害剤、例えばミドスタウリン（（ＰＫＣ−４１２，ＣＧＰ４１２５１、Ｎ−ベンゾイルスタウロスポリン）、ピキサントロン、エロキサチン（抗新生物剤）、ガナイト（硝酸ガリウム）、Ｔｈａｌｏｍｉｄ（登録商標）（（登録商標）サリドマイド）、サリドマイドの免疫モジュレート誘導体（例えばレブリミド（前レブミド））、ＡｆｆｉｎｉｔａｋＴＭ（蛋白キナーゼＣ−アルファのアンチセンス抑制剤）、ＳＤＸ−１０１（Ｒ−エトドラック、悪性リンパ球のアポトーシスを誘導）、第２世代のプリンヌクレオシド類縁体、例えばクロファラビン、癌細胞による蛋白Ｂｃｌ−２の生産の抑制剤（例えばアンチセンス剤であるオブリメルセンおよびＧｅｎａｓｅｎｓｅ（登録商標））、プロテオソーム抑制剤（例えばＶｅｌｃａｄｅＴＭ（ボルテゾミブ））、小分子キナーゼ阻害剤（例えばＣＨＩＲ−２５８）、小分子ＶＥＧＦ阻害剤（例えばＺＤ−６４７４）、熱ショック蛋白（ＨＳＰ）９０の小分子阻害剤（例えば１７−ＡＡＧ）、ヒストンデアセチラーゼの小分子阻害剤（例えばハイブリッド／極性細胞分化ＨＰＣ）剤、例えばスベラニロヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）およびＦＲ−９０１２２８）およびアポトーシス剤、例えばＴｒｉｓｅｎｏｘ（登録商標）（３酸化砒素）およびＸｃｙｔｒｉｎ（登録商標）（モテキサフィンガドリニウム）；ワクチン／免疫療法系癌治療法、例えばワクチン法（例えば、Ｉｄ−ＫＬＨ、オンコファージ、ビタレチン）、個人別免疫療法または能動的イディオタイプ免疫療法（例えばＭｙＶａｘ（登録商標）Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、以前の名称ＧＴＯＰ−９９）、Ｐｒｏｍｕｎｅ（登録商標）（ＣｐＧ７９０９、ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ受容体９（ＴＬＲ９）の合成アゴニスト）；インターフェロン−アルファ療法、インターロイキン−２（ＩＬ−２）療法、ＩＬ−１２療法、ＩＬ−１５療法、およびＩＬ−２１療法；ステロイド療法；または他の癌療法と組み合わせて（これらに限定されない）投与され；ここで付加的な癌治療剤はアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体療法の前、最中、または後に投与してよい。即ち、化学療法、放射線療法、他の抗癌抗体療法、小分子系癌療法またはワクチン／免疫療法系癌療法の場合のように複合療法が他の治療薬の投与と組み合わせたアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントの投与を含む場合は、本発明の方法は別々の処方物または単一の処方物を用いた同時投与、またはいずれかの順序における連続的投与を包含する。本発明の方法が複合療法の用法を含む場合は、これらの療法は同時に行うことができ、即ち、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは他の癌治療薬と同時に、または同じ時間枠内で投与される（即ち、治療は同時進行してよいが、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは他の癌治療薬と厳密に同時に投与されない）。或いは、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは他の癌治療薬の前または後に投与してもよい。異なる癌治療薬の逐次的投与は、投与された患者が治療の第１の過程に応答して後退または再発の可能性が低減するか否かに関わらず実施してよい。複合療法が細胞毒処方物の投与と組み合わせたアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントの投与を含む場合、好ましくはアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは細胞毒処方物の投与の前に投与する。
本発明の一部の実施形態においては、本明細書に記載したアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは化学療法剤と組み合わせて、そして場合により自己骨髄移植と組み合わせて投与され、ここで抗体および化学療法剤は逐次的にいずれかの順序において、または、同時に（即ち同一時点において、または同じ時間枠内において）投与してよい。適当な化学療法剤の例はフルダラビンまたはリン酸フルダラビン、クロラムブシル、ビンクリスチン、ペントスタチン、２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン）、シクロホスファミド、ドキソルビシン、プレドニソンおよびこれらの組合せ、例えばアントラサイクリン含有処方、例えばＣＡＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン＋プレドニソン）、ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニソン＋ドキソルビシン）、ＶＡＤ（ビンクリスチン、ドキソルビシン＋デキサメタゾン）、ＭＰ（メルファラン＋プレドニソン）および化学療法に使用する他の細胞毒性および／または治療薬、例えばミトキサントロン、ダウノルビシン、イダルビシン、アスパラギナーゼ、および、代謝拮抗物質、例えば、シタラビン、メトトレキセート、５−フルオロウラシルデカルバジン、６−チオグアニン、６−メルカプトプリンおよびネララビンを包含するが、これらに限定されない。一部の実施形態においては、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体、例えばモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２またはＣＨＩＲ−５．９またはその抗原結合フラグメントは化学療法剤の投与の前に投与する。別の実施形態においてはアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は化学療法剤の投与の後に投与する。更に別の実施形態においては、化学療法剤はアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントと同時に投与する。
即ち、例えば、一部の実施形態においては、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体、例えばモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２またはＣＨＩＲ−５．９またはその抗原結合フラグメントはフルダラビンまたはリン酸フルダラビンと組み合わせて投与してよい。１つのそのような実施形態において、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントはフルダラビンまたはリン酸フルダラビンの投与の前に投与する。別の実施形態においては、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントはフルダラビンまたはリン酸フルダラビンの投与の後に投与する。更に別の実施形態においては、フルダラビンまたはリン酸フルダラビンはアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントと同時に投与する。
本発明の別の実施形態においては、クロラムブシル、即ちアルキル化剤を本明細書に記載したアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体、例えばモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２またはＣＨＩＲ−５．９または抗原結合フラグメントと組み合わせて投与する。１つのそのような実施形態において、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントはクロラムブシルの投与の前に投与する。別の実施形態においては、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントはクロラムブシルの投与の後に投与する。更に別の実施形態においては、クロラムブシルはアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントと同時に投与する。
本発明の別の実施形態においては、アントラサイクリン含有処方、例えばＣＡＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン＋プレドニソン）およびＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニソン＋ドキソルビシン）を本明細書に記載したアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体、例えばモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２またはＣＨＩＲ−５．９または抗原結合フラグメントと組み合わせて投与してよい。１つのそのような実施形態において、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントはアントラサイクリン含有処方の投与の前に投与する。別の実施形態においては、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントはアントラサイクリン含有処方の投与の後に投与する。更に別の実施形態においては、アントラサイクリン含有処方はアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントと同時に投与する。
別の実施形態においては、本明細書に記載したアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体、例えばモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２またはＣＨＩＲ−５．９またはその抗原結合フラグメントはアレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）；Ｂｅｒｌｅｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａにより販売）と組み合わせて投与する。アレムツズマブは悪性Ｂ細胞上に発現されるＣＤ５２抗原をターゲティングする組み換えヒト化モノクローナル抗体（Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ）である。１つのそのような実施形態において、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントはアレムツズマブの投与の前に投与する。別の実施形態においては、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントはアレムツズマブの投与の後に投与する。更に別の実施形態においては、アレムツズマブはアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントと同時に投与する。
別の実施形態においては、本明細書に記載したアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体、例えばモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２またはＣＨＩＲ−５．９またはその抗原結合フラグメントは悪性Ｂ細胞上のＣＤ２０をターゲティングする治療用抗ＣＤ２０抗体、例えばリツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））、完全ヒト抗体ＨｕＭａｘ−ＣＤ２０、Ｒ−１５９４、ＩＭＭＵ−１０６、ＴＲＵ−０１５、ＡＭＥ−１３３、トシツモマブ／Ｉ−１３１トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ（登録商標））またはイブリツモマブチウキセタン（Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標））と組み合わせて投与する。１つのそのような実施形態において、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは抗ＣＤ２０抗体の投与の前に投与する。別の実施形態においては、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは抗ＣＤ２０抗体の投与の後に投与する。更に別の実施形態においては、抗ＣＤ２０抗体はアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントと同時に投与する。
別の実施形態においては、本明細書に記載したアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体、例えばモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２またはＣＨＩＲ−５．９またはその抗原結合フラグメントは小分子系癌療法、例えば微小管および／またはトポイソメラーゼ阻害剤（例えば有糸分裂抑制剤ドラスタチンおよびドラスタチン類縁体；チュブリン結合剤Ｔ９００６０７；ＸＬ１１９；およびトポイソメラーゼ阻害剤アミノカンプトテシン）、ＳＤＸ−１０５（塩酸ベンダムスチン）、イキサベピロン（エポチロン類縁体、別名ＢＭＳ−２４７５５０）、蛋白キナーゼＣ阻害剤、例えばミドスタウリン（（ＰＫＣ−４１２，ＣＧＰ４１２５１、Ｎ−ベンゾイルスタウロスポリン）、ピキサントロン、エロキサチン（抗新生物剤）、ガナイト（硝酸ガリウム）、Ｔｈａｌｏｍｉｄ（登録商標）（サリドマイド）、サリドマイドの免疫モジュレート誘導体（例えばレブリミド（前レブミド））、ＡｆｆｉｎｉｔａｋＴＭ（蛋白キナーゼＣ−アルファのアンチセンス抑制剤）、ＳＤＸ−１０１（Ｒ−エトドラック、悪性リンパ球のアポトーシスを誘導）、第２世代のプリンヌクレオシド類縁体、例えばクロファラビン、癌細胞による蛋白Ｂｃｌ−２の生産の抑制剤（例えばアンチセンス剤であるオブリメルセンおよびＧｅｎａｓｅｎｓｅ（登録商標））、プロテオソーム抑制剤（例えばＶｅｌｃａｄｅＴＭ（ボルテゾミブ））、小分子キナーゼ阻害剤（例えばＣＨＩＲ−２５８）、小分子ＶＥＧＦ阻害剤（例えばＺＤ−６４７４）、熱ショック蛋白（ＨＳＰ）９０の小分子阻害剤（例えば１７−ＡＡＧ）、ヒストンデアセチラーゼの小分子阻害剤（例えばハイブリッド／極性細胞分化ＨＰＣ）剤、例えばスベラニロヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）およびＦＲ−９０１２２８）およびアポトーシス剤、例えばＴｒｉｓｅｎｏｘ（登録商標）（３酸化砒素）およびＸｃｙｔｒｉｎ（登録商標）（モテキサフィンガドリニウム）と組み合わせて投与する。１つのそのような実施形態において、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは小分子系癌治療薬の投与の前に投与する。別の実施形態においては、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは小分子系癌治療薬の投与の後に投与する。更に別の実施形態においては、小分子系癌治療薬はアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントと同時に投与する。
別の実施形態においては、本明細書に記載したアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体、例えばモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２またはＣＨＩＲ−５．９またはその抗原結合フラグメントはワクチン／免疫療法系癌治療法、例えばワクチン法（例えば、Ｉｄ−ＫＬＨ、オンコファージ、ビタレチン）、個人別免疫療法または能動的イディオタイプ免疫療法（例えばＭｙＶａｘ（登録商標）Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、以前の名称ＧＴＯＰ−９９）、Ｐｒｏｍｕｎｅ（登録商標）（ＣｐＧ７９０９、ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ受容体９（ＴＬＲ９）の合成アゴニスト）、インターフェロン−アルファ療法、インターロイキン−２（ＩＬ−２）療法、ＩＬ−１２療法、ＩＬ−１５療法、およびＩＬ−２１療法またはステロイド療法と組み合わせて投与する。１つのそのような実施形態において、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントはワクチン／免疫療法系癌治療薬の投与の前に投与する。別の実施形態においては、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントはワクチン／免疫療法系癌治療薬の投与の後に投与する。更に別の実施形態においては、ワクチン／免疫療法系癌治療薬はアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントと同時に投与する。
１つのそのような実施形態において、本明細書に記載したアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体、例えばモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２またはＣＨＩＲ−５．９またはその抗原結合フラグメントはＩＬ−２と組み合わせて投与する。ＩＬ−２、即ち投与患者におけるナチュラルキラー（ＮＫ）エフェクター細胞の数を増大させることがわかっている物質を本発明のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントの前またはこれと同時に投与することができる。この増大したＮＫエフェクター細胞数は投与されたアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントの増強されたＡＤＣＣ活性をもたらす。別の実施形態においては、ＩＬ−２１は本明細書に記載したアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体、例えばモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２またはＣＨＩＲ−５．９またはその抗原結合フラグメントと組み合わせて投与された場合、ＮＫ細胞活性を刺激する免疫療法剤として作用する。
更にまた、２種以上の治療薬と本明細書に記載したアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の複合療法もまた刺激されたＣＤ４０発現細胞を含む疾患状態、例えばＢ細胞関連癌、および自己免疫および／または炎症性の障害の治療のために使用できる。例えば２種の化学療法剤を本明細書に記載したアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体と組み合わせて投与する、そして、化学療法剤と別の抗癌モノクローナル抗体（例えばアレムツズマブ、リツキシマブまたは抗ＣＤ２３抗体）を本明細書に記載したアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体と組み合わせて投与する、３種複合療法も包含される。このような組合せの例は、フルダラビン、シクロホスファミドおよびアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体、例えばモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２またはＣＨＩＲ−５．９またはその抗原結合フラグメントの組合せ；およびフルダラビン、抗ＣＤ２０抗体、例えばリツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）；ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）およびアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体、例えばモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２またはＣＨＩＲ−５．９またはその抗原結合フラグメントの組合せを包含する。
（薬学的処方物および投与様式）
本発明のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体はＣＤ４０発現細胞媒介疾患、例えばＳＬＥ、ＰＢＣ、ＩＴＰ、多発性硬化症、乾癬、クローン病、移植片拒絶反応およびＢ細胞リンパ腫を防止または治療するために治療上有効である濃度において投与する。この目的を達成するためには、抗体は当該分野で知られている許容される賦形剤種々を使用して処方物してよい。典型的には抗体は静脈内または腹腔内のいずれかの注射により投与される。この投与を達成するための方法は当該分野で知られている。局所または経口投与してよい、または粘膜を通過する伝達が可能な、組成物を得ることも可能である。
静脈内投与は、投与される抗ＣＤ４０抗体に依存して、好ましくは約１時間〜約１０時間にわたる期間、より好ましくは約１時間〜約８時間にわたる期間、さらにより好ましくは約２時間〜７時間にわたる期間、なおより好ましくは約４時間〜６時間にわたる期間の注入によって起こる。薬学的組成物による最初の注入は、約４時間〜約６時間の期間にわたって行わ得れ、続く注入はより迅速に送達され得る。続く注入は、約１時間〜約６時間（例えば、約１時間〜約４時間、約１時間〜約３時間、または約１時間〜約２時間を含む）の期間にわたって投与され得る。
本発明の薬学的組成物は、意図される投与経路と適合するように処方される。可能な投与経路の例としては、非経口投与（例えば、静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、皮内、皮下（ＳＣ）、または注入）、経口投与および肺投与（例えば、吸入）、鼻投与、経皮（局所）投与、経粘膜投与ならびに直腸投与が挙げられる。非経口適用、皮内適用、もしくは皮下適用に使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：滅菌希釈液（例えば、注射用水）、生理食塩溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、ポリピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸）；緩衝剤（例えば、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩、および張度調整のための薬剤（塩化ナトリウムまたはブドウ糖））。ｐＨは、酸または塩基（例えば、塩酸または水酸化ナトリウム）で調整され得る。この非経口調製物は、アンプル、使い捨てシリンジ、またはガラス製もしくはプラスチック製の複数用量バイアルの中に封じ込められ得る。
上記抗ＣＤ４０抗体は、代表的には、標準的技術によって、薬学的に受容可能な緩衝剤（例えば、滅菌生理食塩水、滅菌緩衝水、ポリピレングリコール、前述のものの組み合わせなど）内に提供される。非経口的に投与可能な薬剤を調製するための方法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版；Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，１９９０）（本明細書において参考として援用される）において記載される。例えば、本発明の方法において使用するために適切な安定化抗体の薬学的処方物を記載するＷＯ９８／５６４１８もまた参照のこと。
投与される少なくとも１種の抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメントの量は、当業者によって過度の実験なしに容易に決定される。投与の様式および少なくとも１種のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体（またはそのフラグメント）のそれぞれの量に影響する因子としては、上記疾患の重篤度、上記疾患の病歴、ならびに治療を受ける個体の年齢、身長、体重、健康状態、および生理学的状態が挙げられるが、これらに限定されない。同様に、投与されるアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメントの量は、投与の様式およびその被験体がこの抗腫瘍剤の一回用量または複数用量のどちらを受けるかに依存する。一般的に、、治療を受ける被験体の体重の増加につれて、抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメントの投薬量をより高くすることが好ましい。投与される抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメントの用量は、約０．００３ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの範囲であり、好ましくは、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇの範囲である。従って、例えば、用量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、または５０ｍｇ／ｋｇであり得る。
本発明の別の実施形態において、上記方法は、複数用量のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメントの投与を包含する。上記方法は、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１５回、２０回、２５回、３０回、３５回、４０回、もしくはそれ以上の治療有効用量のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメントを含有する薬学的組成物の投与を包含し得る。抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメントを含有する薬学的組成物の複数用量の投与の頻度および期間は、当業者によって過度の実験なしに容易に決定され得る。さらに、治療有効量の抗体を用いた被験体の処置は、一回の処置を包含し得るか、または好ましくは一連の処置を包含し得る。好ましい例において、被験体は、約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重の間の範囲のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを用いて、約１週間〜１０週間の間、好ましくは約２週間〜８週間の間、より好ましくは約３週間〜７週間の間、そしてさらにより好ましくは約４週間、５週間、または６週間の間に週に１回処置される。処置は、再発を防止するためか、または再発の徴候に対して、毎年行われ得る。処置に使用される抗体またはその抗原結合フラグメントの有効な投薬量は、特定の処置のクールにわたって増加されても減少されてもよいこともまた、認識される。投薬量の変化は、本明細書において記載される診断アッセイの結果から生じ得、そしてそのアッセイの結果から明らかになり得る。
従って、１つの実施形態において、その投薬レジメンは、処置期間の１日目、７日目、１４日目、および２１日目での治療有効用量の少なくとも１種の抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメントの第１の投与を含む。別の実施形態において、上記投薬レジメンは、処置期間の１週の１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、および７日目での治療有効用量の少なくとも１種の抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメントの第１の投与を含む。さらなる実施形態は、処置期間の１週の１日目、３日目、５日目、および７日目での治療有効用量の少なくとも１種の抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメントの第１の投与を有する投薬レジメン；処置期間の１週の１日目および３日目での治療有効用量の少なくとも１種の抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメントの第１の投与を含む投薬レジメン；および処置期間の１週の１日目での治療有効用量の少なくとも１種の抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメントの第１の投与を含む好ましい投薬レジメンを包含する。この処置期間は、１週、２週、３週、１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、または１年を含み得る。処置期間は、続いてもよいし、互いに１日、１週、２週、１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、または１年離れていてもよい。
いくつかの実施形態において、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントの治療上有効な用量の範囲は、約０．００３ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇ、または約７ｍｇ／ｋｇ〜約１２ｍｇ／ｋｇである。従って、例えば、任意の１種のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２もしくはモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９）またはその抗原結合フラグメントの用量は、０．００３ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、または約０．００３ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの範囲にある他のそのような用量である得る。同じ治療有効用量のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、抗体投薬の各々の週を全体にわたって、投与され得る。あるいは、異なる治療有効用量のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、処置期間のクールにわたって使用され得る。
いくつかの実施形態において、本明細書の他の部分で定義されるように、最初の治療有効用量のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、より低い用量範囲（すなわち、約０．００３ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ）であり得、引き続く用量は、より高い用量範囲（すなわち、約２０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ）になり得る。
代替的な実施形態において、本明細書の他の部分で定義されるように、最初の治療有効用量のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、より高い用量範囲（すなわち、約２０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ）であり得、引き続く用量は、より低い用量範囲（すなわち、０．００３ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ）になり得る。従って、１つの実施形態において、上記最初の治療有効用量のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、約２０ｍｇ／ｋｇ〜約３５ｍｇ／ｋｇ（約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、および３５ｍｇ／ｋｇを含む）であり、そして引き続く治療有効用量のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇ（約５ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１２ｍｇ／ｋｇ、および約１５ｍｇ／ｋｇを含む）である。
本発明のいくつかの実施形態において、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体療法は、「ローディング用量（ｌｏａｄｉｎｇ ｄｏｓｅ）」の抗体またはその抗原結合フラグメントを、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体療法を必要としている被験体に投与することによって開始される。「ローディング用量」によって、投与される抗体またはその抗原結合フラグメントの用量がより高い用量範囲（すなわち、約２０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ）にある、上記被験体に投与されるアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントの最初の用量が意図される。上記「ローディング用量」は、完全な「ローディング用量」が約２４時間の期間内に投与される限り、一回投与（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメントがＩＶ投与される一回注入）としてか、または複数投与（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメントがＩＶ投与される複数注入）として投与され得る。「ローディング用量」の投与に続いて、次いで上記被験体は、１以上のさらなる治療有効用量のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを投与される。引き続く治療有効用量は、例えば、毎週の投薬スケジュールに従ってか、または２週間に一度、３週間に一度、もしくは４週間に一度、投与され得る。このような実施形態において、上記引き続く治療有効用量は、一般的により低い用量範囲（すなわち、０．００３ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ）内にある。
あるいは、いくつかの実施形態において、「ローディング用量」に続いて、上記引き続く治療有効用量のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、「維持スケジュール」に従って投与される。このスケジュールにおいて、上記治療有効用量の抗体またはその抗原結合フラグメントは、１ヶ月に１回、６週間に１回、２ヶ月に１回、１０週間に１回、３ヶ月に１回、１４週間に１回、４ヶ月に１回、１８週間に１回、５ヶ月に１回、２２週間に１回、６ヶ月に１回、７ヶ月に１回、８ヶ月に１回、９ヶ月に１回、１０ヶ月に１回、１１ヶ月に１回、または１２ヶ月に１回、投与される。このような実施形態において、上記治療有効用量のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、特に引き続く用量がより頻繁な間隔（例えば、２週間に１回〜１ヶ月に１回）で投与される場合、より低い用量範囲（すなわち、０．００３ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ）であるか、または特に引き続く用量がより頻繁でない間隔（例えば、引き続く用量が約１ヶ月〜約１２ヶ月隔て投与される）で投与される場合、より高い投薬範囲内（すなわち、約２０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ）である。
本発明の方法において使用するための、本明細書において記載される薬学的組成物中に存在するアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、天然のものであっても、組換え技術によって得られても良いし、そして任意の供給源（例えば、マウス、ラット、ウサギ、霊長類、ブタおよびヒトのような哺乳動物供給源が挙げられる）に由来してもよい。好ましくは、このようなポリペプチドは、ヒト供給源に由来し、そしてより好ましくはハイブリドーマ細胞株からの組換えヒトタンパク質である。
本発明の方法において有用な薬学的組成物は、本発明のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の生物学的に活性な改変体を包含し得る。このような改変体は、被験体に投与されたときに、改変体ポリペプチドを含有する薬学的組成物が、天然のポリペプチドを含有する薬学的組成物と同じ治療的効果を有するように、上記天然ポリペプチドの所望の生物学的活性を保持するべきである。すなわち、上記改変体の抗ＣＤ４０抗体は、天然のアンタゴニスト抗体（例えば、それぞれハイブリドーマ細胞株５．９またはハイブリドーマ細胞株１２．１２によって発現されるＣＨＩＲ−５．９またはＣＨＩＲ−１２．１２）について観察されるものと類似した様式において、薬学的組成物中の治療活性成分として機能する。改変体抗ＣＤ４０抗体が、所望の生物学的活性を保持し、それ故、薬学的組成物中の治療活性成分として機能するか否かを決定するための方法は、当該分野で利用可能である。抗体改変体の生物学的活性は、天然のアンタゴニスト抗体の活性を測定するために特異的に設計されたアッセイ（本発明において記載されるアッセイを含む）を使用して測定され得る。
治療活性成分として本明細書中に記載される結合特性を有するアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体を含有する、あらゆる薬学的組成物が、本発明の方法において使用され得る。従って、１種以上の本発明のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体を含有する液体、凍結乾燥または噴霧乾燥した組成物は、本発明の方法に従う、その後の被験体への投与のために、水系もしくは非水系の溶液または懸濁液として調製され得る。これらの組成物の各々は、治療的または予防的に活性な成分として、少なくとも１種の本発明のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体を含有する。「治療的または予防的に活性な成分」により、抗ＣＤ４０抗体が、組成物中に特異的に組み込まれて、薬学的組成物が被験体に投与されるときに、この被験体内で疾患または状態の処置、予防または診断に関して、所望の治療的または予防的な応答をもたらすことが意図される。好ましくは、薬学的組成物は、適切な安定化剤、充填剤、またはこれらの両方を含有し、調製および保存の間の、タンパク質の安定性および生物学的活性の喪失に伴う問題を最小限にする。
処方用物質（ｆｏｒｍｕｌａｎｔ）が、本発明のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体を含有する薬学的組成物に添加され得る。これらの処方用物質としては、油、ポリマー、ビタミン、炭水化物、アミン酸（ａｍｉｎｅ ａｃｉｄ）、塩、緩衝液、アルブミン、界面活性剤、または充填剤が挙げられ得るがこれらに限定されない。好ましくは、炭水化物としては、糖または糖アルコール（例えば、単糖類、二糖類、もしくは多糖類、または水溶性グリカン）が挙げられる。糖類またはグルカンとしては、フルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、スクロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、αシクロデキストリンおよびβシクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、ならびにカルボキシメチルセルロース、またはこれらの混合物が挙げられ得る。「糖アルコール」は、ヒドロキシル基を有するＣ４〜Ｃ８炭化水素として定義され、そして、糖アルコールとしては、ガラクチトール、イノシトール、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、グリセロールおよびアラビトールが挙げられる。これらの糖または糖アルコールは、個別または組み合わせで使用され得る。糖または糖アルコールの濃度は、１．０％ｗ／ｖと７％ｗ／ｖとの間であり、より好ましくは、２．０％ｗ／ｖと６．０％ｗ／ｖとの間である。好ましくは、アミノ酸としては、左旋（Ｌ）形態のカルニチン、アルギニンおよびベタインが挙げられる；しかし、他のアミノ酸も添加され得る。好ましいポリマーとしては、２，０００と３，０００との間の平均分子量を有するポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、または、３，０００と５，０００との間の平均分子量を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。処方物中に添加され得る界面活性剤としては、欧州特許第２７０，７９９号および同第２６８，１１０号に示される。
さらに、抗体は、例えば、その循環半減期を増加させるために、ポリマーへの共有結合によって化学修飾され得る。好ましいポリマー、およびこのポリマーをペプチドに結合させる方法は、米国特許第４，７６６，１０６号；同第４，１７９，３３７号；同第４，４９５，２８５号；および同第４，６０９，５４６号（これらは、全て、その全体が本明細書中に参考として援用される）に示される。好ましいポリマーは、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧは、室温で水溶性であり、一般式：Ｒ（Ｏ−−ＣＨ２−−ＣＨ２）ｎＯ−−Ｒを有する。この式において、Ｒは、水素、またはアルキル基もしくはアルカノール基のような保護基であり得る。好ましくは、この保護基は、１個と８個の間の炭素を有し、より好ましくは、この保護基はメチルである。記号ｎは、正の整数であり、好ましくは、１と１，０００との間、より好ましくは、２と５００との間である。ＰＥＧは、１，０００と４０，０００との間、より好ましくは、２，０００と２０，０００との間、最も好ましくは、３，０００と１２，０００との間の好ましい平均分子量を有する。好ましくは、ＰＥＧは、少なくとも１つのヒドロキシ基を有し、より好ましくは、それは、末端のヒドロキシ基である。好ましくはインヒビター上の遊離アミノ基と反応するように活性化されるのは、このヒドロキシ基である。しかし、反応基の型および量は、本発明の共有結合化ＰＥＧ／抗体を達成するために変動し得ることが理解される。
水溶性のポリオキシエチル化ポリオールもまた、本発明において有用である。これらとしては、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロール（ＰＯＧ）などが挙げられる。ＰＯＧが好ましい。１つの理由は、ポリオキシエチル化グリセロールのグリセロール骨格が、例えば、動物およびヒトのモノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリドにおいて天然に存在するものと同じ骨格であるからである。従って、この分枝形成は、必ずしも体内で外来因子として認識されない。ＰＯＧは、ＰＥＧと同じ範囲の好ましい分子量を有する。ＰＯＧの構造は、Ｋｎａｕｆら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６３：１５０６４−１５０７０に示され、ＰＯＧ／ＩＬ−２結合体の考察については、米国特許第４，７６６，１０６号に見られ、これらは、両方とも、その全体が本明細書により参考として援用される。
循環半減期を増加するための別の薬物送達系は、リポソームである。リポソーム送達系を調製する方法は、Ｇａｂｉｚｏｎら（１９８２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４２：４７３４；Ｃａｆｉｓｏ（１９８１）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ６４９：１２９；およびＳｚｏｋａ（１９８０）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｅｎｇ．９：４６７において議論されている。他の薬物送達系が当該分野で公知であり、例えば、Ｐｏｚｎａｎｓｋｙら（１９８０）Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｒ．Ｌ．Ｊｕｌｉａｎｏ編，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｎ．Ｙ．）ｐｐ．２５３−３１５；Ｐｏｚｎａｎｓｋｙ（１９８４）Ｐｈａｒｍ Ｒｅｖｓ ３６：２７７に記載される。
薬学的組成物に組み込まれる処方用物質は、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントの安定性のために提供されるべきである。すなわち、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、その物理的および／または化学的安定性を保持し、そして、所望の生物学的活性（すなわち、本明細書において上で定義される１種以上のアンタゴニスト活性（Ｔ細胞により刺激された正常なヒト末梢Ｂ細胞による免疫グロブリン分泌の阻害；Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞により刺激された正常なヒト末梢Ｂ細胞の生存および／または増殖の阻害；ＣＤ４０Ｌ発現細胞もしくは可溶性ＣＤ４０リガンド（ｓＣＤ４０Ｌ）により刺激された正常ヒト末梢Ｂ細胞の生存および／または増殖の阻害；ｓＣＤ４０Ｌもしくは固相ＣＤ４０Ｌにより刺激された、あらゆる細胞における「生存」抗アポトーシス細胞内シグナルの阻害；ｓＣＤ４０Ｌまたは固相ＣＤ４０Ｌとの連結の際の任意の細胞におけるＣＤ４０シグナル伝達の阻害；ならびに、本明細書中の他の部分で言及した、ヒト悪性Ｂ細胞の増殖の阻害が挙げられるがこれらに限定されない））を有するべきである。
タンパク質の安定性をモニタリングするための方法は、当該分野で周知である。例えば、Ｊｏｎｅｓ（１９９３）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．１０：２９−９０；Ｌｅｅ編（１９９１）Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；および本明細書中、以下に開示される安定性アッセイを参照のこと。一般に、タンパク質の安定性は、特定の時間の間にわたって、選択された温度において測定される。好ましい実施形態において、安定な抗体の薬学的処方物は、室温（約２５℃）において、少なくとも１ヶ月、少なくとも３ヶ月、もしくは少なくとも６ヶ月保存した場合に、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントの安定性を提供し、そして／あるいは、２〜８℃において、少なくとも６ヶ月間、少なくとも９ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、少なくとも１８ヶ月間、少なくとも２４ヶ月間、安定である。
薬学的組成物中に処方される場合、抗体のようなタンパク質は、その薬学的組成物中で、沈殿、凝集および／または変性の、目に見える徴候（すなわち、変色または透明度の喪失）または（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）またはＵＶ光散乱を使用して）測定可能な徴候を示さない場合に、所定の時点において、その物理的安定性を保持すると考えられる。化学的安定性に関して、薬学的組成物中に処方される場合、抗体のようなタンパク質は、その薬学的組成物中で、化学的安定性の測定が、そのタンパク質（すなわち、抗体）が、目的の生物学的活性を保持することを暗示する場合に、所定の時点において、その化学的安定性を保持すると考えられる。化学的安定性の変化をモニタリングするための方法は、当該分野で周知であり、この方法としては、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥＣおよび／またはマトリックス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間質量分析を使用する、タンパク質の化学的に変更された形態（例えば、クリッピングからの結果）を検出するための方法；および、例えば、イオン交換クロマトグラフィーを使用する、分子の電荷の変化に伴う分解（例えば、脱アミドに伴う分解）を検出する方法が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、本明細書中で、以下に開示される方法を参照のこと。
薬学的組成物中に処方される場合、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体、またはその抗原結合フラグメントは、所定の時点での所望の生物学的活性が、その薬学的組成物が調製された時点で所望の生物学的活性に適切なアッセイにおいて測定されるときに示される所望の生物学的活性の、約３０％以内、好ましくは、約２０％以内である場合に、その時点において所望の生物学的活性を保持するとみなされる。本明細書中に開示されるアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体およびその抗原結合フラグメントの所望の生物学的活性を測定するためのアッセイは、本明細書中の実施例に記載されるように実施され得る。また、Ｓｃｈｕｌｔｚｅら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：８２００−８２０４；Ｄｅｎｔｏｎら（１９９８）Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２：６−１５；Ｅｖａｎｓら（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：６８８−６９７；Ｎｏｅｌｌｅ（１９９８）Ａｇｅｎｔｓ Ａｃｔｉｏｎｓ Ｓｕｐｐｌ．４９：１７−２２；Ｌｅｄｅｒｍａｎら（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３：７７−８６；Ｃｏｌｉｇａｎら（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １３：１２；Ｋｗｅｋｋｅｂｏｏｍら（１９９３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ７９：４３９−４４４；ならびに米国特許第５，６７４，４９２号および同第５，８４７，０８２号（これらは、本明細書中に参考として援用される）に記載されるアッセイもまた参照のこと。
本発明のいくつかの実施形態において、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体（例えば、ＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体、もしくはＣＨＩＲ−５．９モノクローナル抗体）、またはその抗原結合フラグメントは、液体薬学的処方物中に処方される。アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、当該分野で公知の任意の方法を使用して調製され得、これらの方法としては、本明細書において上で開示された方法が挙げられる。１つの実施形態において、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体（例えば、ＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体、もしくはＣＨＩＲ−５．９モノクローナル抗体）、またはその抗原結合フラグメントは、ＣＨＯ細胞株において組換え的に産生される。
その調製および精製の後、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、本明細書中に示される様式で液体薬学的処方物として処方され得る。アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントが、その処方前に保存される場合、これらは、例えば、≦−２０℃において凍結され、次いで、さらなる処方のために、室温にて融解され得る。この液体薬学的処方物は、治療有効量のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。投与経路および所望の投薬容量を考慮に入れて、この処方物中に存在する抗体またはその抗原結合フラグメントの量が採用される。
この様式において、液体薬学的組成物は、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体（例えば、ＣＨＩＲ−１２．１２抗体もしくはＣＨＩＲ−５．９抗体）またはその抗原結合フラグメントを、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５０．０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約４０．０ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ〜約３０．０ｍｇ／ｍｌ、約５．０ｍｇ／ｍｌ〜約２５．０ｍｇ／ｍｌ、約５．０ｍｇ／ｍｌ〜約２０．０ｍｇ／ｍｌ、または約１５．０ｍｇ／ｍｌ〜約２５．０ｍｇ／ｍｌの濃度で含む。いくつかの実施形態において、この液体薬学的組成物は、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５．０ｍｇ／ｍｌ、約５．０ｍｇ／ｍｌ〜約１０．０ｍｇ／ｍｌ、約１０．０ｍｇ／ｍｌ〜約１５．０ｍｇ／ｍｌ、約１５．０ｍｇ／ｍｌ〜約２０．０ｍｇ／ｍｌ、約２０．０ｍｇ／ｍｌ〜約２５．０ｍｇ／ｍｌ、約２５．０ｍｇ／ｍｌ〜約３０．０ｍｇ／ｍｌ、約３０．０ｍｇ／ｍｌ〜約３５．０ｍｇ／ｍｌ、約３５．０〜約４０．０ｍｇ／ｍｌ、約４０．０ｍｇ／ｍｌ〜約４５．０ｍｇ／ｍｌ、または約４５．０ｍｇ／ｍｌ〜約５０．０ｍｇ／ｍｌの濃度で含む。他の実施形態において、この液体薬学的組成物は、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを、約１５．０ｍｇ／ｍｌ、約１６．０ｍｇ／ｍｌ、約１７．０ｍｇ／ｍｌ、約１８．０ｍｇ／ｍｌ、約１９．０ｍｇ／ｍｌ、約２０．０ｍｇ／ｍｌ、約２１．０ｍｇ／ｍｌ、約２２．０ｍｇ／ｍｌ、約２３．０ｍｇ／ｍｌ、約２４．０ｍｇ／ｍｌ、または約２５．０ｍｇ／ｍｌの濃度で含む。この液体薬学的組成物は、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体（例えば、ＣＨＩＲ−１２．１２抗体もしくはＣＨＩＲ−５．９抗体）またはその抗原結合フラグメント、およびこの処方物のｐＨをｐＨ約５．０〜ｐＨ約７．０の範囲（ｐＨ約５．０、ｐＨ約５．１、ｐＨ約５．２、ｐＨ約５．３、ｐＨ約５．４、ｐＨ約５．５、ｐＨ約５．６、ｐＨ約５．７、ｐＨ約５．８、ｐＨ約５．９、ｐＨ約６．０、ｐＨ約６．１、ｐＨ約６．２、ｐＨ約６．３、ｐＨ約６．４、ｐＨ約６．５、ｐＨ約６．６、ｐＨ約６．７、ｐＨ約６．８、ｐＨ約６．９、ｐＨ約７．０、およびｐＨ約５．０〜ｐＨ約７．０の範囲内の他のこのような値が含まれる）に維持する緩衝液を含む。いくつかの実施形態において、緩衝液は、処方物のｐＨを、ｐＨ約５．０〜ｐＨ約６．５、ｐＨ約５．０〜ｐＨ約６．０、ｐＨ約５．０〜ｐＨ約５．５、ｐＨ約５．５〜ｐＨ約７．０、ｐＨ約５．５〜ｐＨ約６．５、またはｐＨ約５．５〜ｐＨ約６．０の範囲に維持する。
液体抗ＣＤ４０抗体処方物のｐＨをｐＨ約５．０〜ｐＨ約７．０の範囲に維持する任意の適切な緩衝液は、その抗体の物理化学的安定性および所望の生物学的活性が本明細書において上に言及されたように維持される限り、処方物において使用され得る。適切な緩衝液としては、従来の酸およびその塩が挙げられるがこれらに限定されず、ここで、対イオンは、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、またはマグネシウムであり得る。薬学的な液体処方物を緩衝化するために使用され得る従来の酸およびその塩の例としては、コハク酸またはコハク酸塩の緩衝液、クエン酸またはクエン酸塩の緩衝液、酢酸または酢酸塩の緩衝液、酒石酸または酒石酸塩の緩衝液、リン酸またはリン酸塩の緩衝液、グルコン酸またはグルコン酸塩の緩衝液、グルタミン酸またはグルタミン酸塩の緩衝液、アスパラギン酸またはアスパラギン酸塩の緩衝液、マレイン酸またはマレイン酸塩の緩衝液、およびリンゴ酸またはリンゴ酸塩の緩衝液が挙げられるがこれらに限定されない。処方物内の緩衝液の濃度は、約１ｍＭ〜約５０ｍＭ（約１ｍＭ、約２ｍＭ、約５ｍＭ、約８ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、または約１ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲内の他のこのような値を含む）であり得る。いくつかの実施形態において、処方物内の緩衝液の濃度は、約５ｍＭ〜約１５ｍＭ（約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、約１５ｍＭ、または約５ｍＭ〜約１５ｍＭの範囲内の他のこのような値を含む）であり得る。
本発明のいくつかの実施形態において、液体薬学的処方物は、治療有効量のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体（例えば、ＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体もしくはＣＨＩＲ−５．９モノクローナル抗体）またはその抗原結合フラグメント、およびこの処方物のｐＨをｐＨ約５．０〜ｐＨ約７．０、好ましくは、ｐＨ約５．０〜ｐＨ約６．５の範囲に維持する濃度のコハク酸緩衝液またはクエン酸緩衝液を含む。「コハク酸緩衝液」または「クエン酸緩衝液」によって、それぞれ、コハク酸の塩またはクエン酸の塩を含む緩衝液が意図される。好ましい実施形態において、コハク酸またはクエン酸の対イオンは、ナトリウムカチオンであり、従って、緩衝剤は、それぞれ、コハク酸ナトリウムまたはクエン酸ナトリウムである。しかし、任意のカチオンが、有効であると予想される。他の可能なコハク酸カチオンまたはクエン酸カチオンとしては、カリウム、アンモニウム、カルシウム、およびマグネシウムが挙げられるがこれらに限定されない。上記のように、処方物内のコハク酸緩衝液またはクエン酸緩衝液の濃度は、約１ｍＭ〜約５０ｍＭ（約１ｍＭ、約２ｍＭ、約５ｍＭ、約８ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、または約１ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲内の他のこのような値を含む）であり得る。いくつかの実施形態において、処方物内の緩衝液の濃度は、約５ｍＭ〜約１５ｍＭ（約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、または約１５ｍＭを含む）である。他の実施形態において、液体薬学的処方物は、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体（例えば、ＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体、もしくはＣＨＩＲ−５．９モノクローナル抗体）、またはその抗原結合フラグメントを、０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５０．０ｍｇ／ｍｌ、または約５．０ｍｇ／ｍｌ〜約２５．０ｍｇ／ｍｌの濃度で、そして、コハク酸緩衝液またはクエン酸緩衝液（例えば、コハク酸ナトリウム緩衝液またはクエン酸ナトリウム緩衝液）を、約１ｍＭ〜約２０ｍＭ、約５ｍＭ〜約１５ｍＭ、好ましくは、約１０ｍＭの濃度で含む。
液体薬学的処方物が等張付近であることが望ましい場合、治療有効量のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体（例えば、ＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体、もしくはＣＨＩＲ−５．９モノクローナル抗体）、またはその抗原結合フラグメント、およびこの処方物のｐＨをｐＨ約５．０〜ｐＨ約７．０の範囲内に維持するための緩衝液を含む液体薬学的処方物は、さらに、この処方物を等張付近にさせるために十分な量の等張化剤を含み得る。「等張付近（ｎｅａｒ ｉｓｏｔｏｎｉｃ）」により、水溶性処方物が、約２４０ｍｍｏｌ／ｋｇ〜約３６０ｍｍｏｌ／ｋｇ、好ましくは約２４０ｍｍｏｌ／ｋｇ〜約３４０ｍｍｏｌ／ｋｇ、より好ましくは約２５０ｍｍｏｌ／ｋｇ〜約３３０ｍｍｏｌ／ｋｇ、なおより好ましくは約２６０ｍｍｏｌ／ｋｇ〜約３２０ｍｍｏｌ／ｋｇ、なおより好ましくは約２７０ｍｍｏｌ／ｋｇ〜約３１０ｍｍｏｌ／ｋｇの浸透圧を有することが意図される。溶液の等張度を測定する方法は、当業者に公知である。例えば、Ｓｅｔｎｉｋａｒら（１９５９）Ｊ．Ａｍ．Ｐｈａｒｍ．Ａｓｓｏｃ．４８：６２８を参照のこと。
当業者は、薬学的組成物に等張性を提供するのに有用な、種々の薬学的に受容可能な溶質に精通している。等張化剤は、本発明の液体薬学的処方物の浸透圧を、体液の浸透圧にほぼ等しい値に調整し得る任意の試薬であり得る。生理学的に受容可能な等張化剤の使用が望ましい。従って、治療有効量のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体（例えば、ＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体、もしくはＣＨＩＲ−５．９モノクローナル抗体）、またはその抗原結合フラグメント、およびこの処方物のｐＨをｐＨ約５．０〜ｐＨ約７．０の範囲内に維持するための緩衝液を含む液体薬学的処方物は、さらに、等張性を提供するために使用され得る成分（例えば、塩化ナトリウム；アミノ酸（例えば、アラニン、バリンおよびグリシン）；糖類および糖アルコール（ポリオール）（グルコース、デキストロース、フルクトース、スクロース、マルトース、マンニトール、トレハロース、グリセロール、ソルビトールおよびキシリトールが挙げられるがこれらに限定されない）；酢酸、他の有機酸またはその塩、および比較的少量のクエン酸またはリン酸）を含み得る。当業者は、液体処方物の最適な張度を提供するために適切なさらなる薬剤を知っている。
いくつかの好ましい実施形態において、治療有効量のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体（例えば、ＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体、もしくはＣＨＩＲ−５．９モノクローナル抗体）、またはその抗原結合フラグメント、およびこの処方物のｐＨを、ｐＨ約５．０〜ｐＨ約７．０の範囲内に維持するための緩衝液を含む液体薬学的処方物は、さらに、等張化剤として塩化ナトリウムを含む。処方物中の塩化ナトリウムの濃度は、張度に対する他の成分の寄与に依存する。いくつかの実施形態において、塩化ナトリウムの濃度は、約５０ｍＭ〜約３００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約５０ｍＭ〜約２００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約１７５ｍＭ、約５０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約７５ｍＭ〜約１７５ｍＭ、約７５ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約１００ｍＭ〜約１７５ｍＭ、約１００ｍＭ〜約２００ｍＭ、約１００ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約１２５ｍＭ〜約１７５ｍＭ、約１２５ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約１３０ｍＭ〜約１７０ｍＭ、約１３０ｍＭ〜約１６０ｍＭ、約１３５ｍＭ〜約１５５ｍＭ、約１４０ｍＭ〜約１５５ｍＭ、または約１４５ｍＭ〜約１５５ｍＭである。１つのこのような実施形態において、塩化ナトリウムの濃度は、約１５０ｍＭである。他のこのような実施形態において、塩化ナトリウムの濃度は、約１５０ｍＭであり、緩衝液は、約５ｍＭ〜約１５ｍＭの濃度のコハク酸ナトリウム緩衝液またはクエン酸ナトリウム緩衝液であり、この液体薬学的処方物は、治療有効量のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体（例えば、ＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体、もしくはＣＨＩＲ−５．９モノクローナル抗体）、またはその抗原結合フラグメントを含み、そして、この処方物は、ｐＨ約５．０〜ｐＨ約７．０、ｐＨ約５．０〜ｐＨ約６．０、またはｐＨ約５．５〜ｐＨ約６．５のｐＨを有する。他の実施形態において、液体薬学的処方物は、ｐＨ約５．５のｐＨにおいて、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５０．０ｍｇ／ｍｌ、または約５．０ｍｇ／ｍｌ〜約２５．０ｍｇ／ｍｌの濃度のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体（例えば、ＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体、もしくはＣＨＩＲ−５．９モノクローナル抗体）、またはその抗原結合フラグメント、約１５０ｍＭの濃度の塩化ナトリウム、および約１０ｍＭのコハク酸ナトリウムまたはクエン酸ナトリウムを含む。
本発明の液体薬学的処方物の処理の間の凍結融解または機械的なせん断に起因するタンパク質の分解は、溶液−空気界面における表面張力を低下させるために、処方物内に界面活性剤を組み込むことによって阻害され得る。こうして、いくつかの実施形態において、液体薬学的処方物は、治療有効量のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体（例えば、ＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体もしくはＣＨＩＲ−５．９モノクローナル抗体）またはその抗原結合フラグメント、処方物のｐＨをｐＨ約５．０〜ｐＨ約７．０の範囲内に維持するための緩衝液を含み、そしてさらに、界面活性剤を含む。他の実施形態において、液体薬学的処方物は、治療有効量のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体（例えば、ＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体、もしくはＣＨＩＲ−５．９モノクローナル抗体）、またはその抗原結合フラグメント、処方物のｐＨをｐＨ約５．０〜ｐＨ約７．０の範囲内に維持するための緩衝液、約５０ｍＭ〜約３００ｍＭの濃度の等張化剤（例えば、塩化ナトリウム）を含み、そしてさらに、界面活性剤を含む。
使用される代表的な界面活性剤は、非イオン性界面活性剤であり、これらとしては、以下が挙げられる：ポリオキシエチレンソルビトールエステル（例えば、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ ８０）およびポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ ２０））；ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンエステル（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８）；ポリオキシエチレンアルコール（例えば、Ｂｒｉｊ ３５）；シメチコン；ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ４００）；リゾホスファチジルコリン；およびポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）。界面活性剤または乳化剤による医薬の伝統的な安定化については、例えば、Ｌｅｖｉｎｅら（１９９１）Ｊ．Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．４５（３）：１６０−１６５（本明細書中に参考として援用される）に記載される。本発明を実施する際に使用される好ましい界面活性剤は、ポリソルベート８０である。界面活性剤が含まれる場合、界面活性剤は、代表的に、約０．００１％（ｗ／ｖ）〜約１．０％（ｗ／ｖ）、約０．００１％（ｗ／ｖ）〜約０．５％（ｗ／ｖ）、約０．００１％（ｗ／ｖ）〜約０．４％（ｗ／ｖ）、約０．００１％（ｗ／ｖ）〜約０．３％（ｗ／ｖ）、約０．００１％（ｗ／ｖ）〜約０．２％（ｗ／ｖ）、約０．００５％（ｗ／ｖ）〜約０．５％（ｗ／ｖ）、約０．００５％（ｗ／ｖ）〜約０．２％（ｗ／ｖ）、約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約０．５％（ｗ／ｖ）、約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約０．２％（ｗ／ｖ）、約０．０３％（ｗ／ｖ）〜約０．５％（ｗ／ｖ）、約０．０３％（ｗ／ｖ）〜約０．３％（ｗ／ｖ）、約０．０５％（ｗ／ｖ）〜約０．５％（ｗ／ｖ）、または約０．０５％（ｗ／ｖ）〜約０．２％（ｗ／ｖ）の量で添加される。
こうして、いくつかの実施形態では、液体薬学的処方物は、治療有効量のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体（例えば、ＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体、もしくはＣＨＩＲ−５．９モノクローナル抗体）、またはその抗原結合フラグメントを含み、緩衝液は、約１ｍＭ〜約５０ｍＭ、約５ｍＭ〜約２５ｍＭ、または約５ｍＭ〜約１５ｍＭの濃度のコハク酸ナトリウム緩衝液またはクエン酸ナトリウム緩衝液であり；この処方物は、ｐＨ約５．０〜ｐＨ約７．０、ｐＨ約５．０〜ｐＨ約６．０、またはｐＨ約５．５〜ｐＨ約６．５のｐＨを有し；そして、この処方物は、さらに、約０．００１％〜約１．０％、または約０．００１％〜約０．５％の量の界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０）を含む。このような処方物は、必要に応じて、約５０ｍＭ〜約３００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約２００ｍＭまたは約５０ｍＭ〜約１５０ｍＭの濃度の等張化剤（例えば、塩化ナトリウム）を含み得る。他の実施形態において、液体薬学的処方物は、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５０．０ｍｇ／ｍｌ、または約５．０ｍｇ／ｍｌ〜約２５．０ｍｇ／ｍｌ（約２０．０ｍｇ／ｍｌを含む）の濃度のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体（例えば、ＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体、もしくはＣＨＩＲ−５．９モノクローナル抗体）、またはその抗原結合フラグメント；約５０ｍＭ〜約２００ｍＭの塩化ナトリウム（約１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む）；約５ｍＭ〜約２０ｍＭのコハク酸ナトリウムまたはクエン酸ナトリウム（約１０ｍＭのコハク酸ナトリウムまたはクエン酸ナトリウムを含む）；約５０ｍＭ〜約２００ｍＭ（約１５０ｍＭを含む）の濃度の塩化ナトリウム；および必要に応じて、約０．００１％〜約１．０％（約０．００１％〜約０．５％を含む）の量の界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０）；を含み、ここで、この液体薬学的処方物は、ｐＨ約５．０〜ｐＨ約７．０、ｐＨ約５．０〜ｐＨ約６．０、ｐＨ約５．０〜ｐＨ約５．５、ｐＨ約５．５〜ｐＨ約６．５、またはｐＨ約５．５〜ｐＨ約６．０のｐＨを有する。
液体薬学的処方物は、本質的に、保存剤、および本明細書において上記された他のキャリア、賦形剤または安定化剤を含まなくてもよい。あるいは、この処方物は、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントの物理化学的安定性に悪影響を及ぼさないという条件で、１種以上の保存剤（例えば、抗細菌剤）、本明細書において上に記載される薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤を含み得る。受容可能なキャリア、賦形剤および安定化剤の例としては、さらなる緩衝化剤、共溶媒、界面活性剤、抗酸化剤（アスコルビン酸およびメチオニンを含む）、キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）、および生分解性ポリマー（例えば、ポリエステル）が挙げられるがこれらに限定されない。薬学的に受容可能なキャリア、安定化剤、および等モル化剤（ｉｓｏｍｏｌｙｔｅ）の処方および選択の詳細な議論は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版；Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，１９９０）（本明細書中に参考として援用される）に見出され得る。
本明細書中に記載される液体薬学的処方物または他の薬学的組成物が調製された後、これらは、分解を防ぐために凍結乾燥され得る。液体組成物を凍結乾燥するための方法は、当業者に公知である。使用の直前に、組成物は、さらなる成分を含み得る滅菌希釈剤（例えば、Ｒｉｎｇｅｒ溶液、蒸留水または滅菌生理食塩水）で再構成され得る。再構成後、組成物は、好ましくは、当業者に公知の方法を使用して、被験体に投与される。
（医薬の製造におけるアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の使用）
本発明はまた新生物Ｂ細胞生育を特徴とする癌に関して患者を処置するための医薬の製造におけるアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントの使用を提供し、この場合、医薬は少なくとも１種の他の癌治療薬の投与と協調させる。新生物Ｂ細胞生育を特徴とする癌は例えば上記したＢ細胞関連癌、例えば非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫、高度悪性Ｂ細胞リンパ腫、中等度悪性Ｂ細胞リンパ腫、軽度悪性Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、骨髄芽球性白血病およびホジキン病、プラズマ細胞腫、濾胞性リンパ腫、濾胞性小分裂リンパ腫、濾胞性大細胞リンパ腫、濾胞性混合型小分裂リンパ腫、散在小分裂細胞リンパ腫、散在小リンパ球性リンパ腫、プロリンパ球性白血病、リンパプラズマ細胞様リンパ腫、辺縁域リンパ腫、粘膜関連リンパ様組織リンパ腫、単球性Ｂ細胞リンパ腫、脾型リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、散在性大細胞リンパ腫、縦隔大Ｂ細胞リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、血管内リンパ腫、散在混合型細胞リンパ腫、散在性大細胞リンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、バーキットリンパ腫、エイズ関連リンパ腫および皮膜細胞リンパ腫を包含するが、これらに限定されない。
「協調させる」とは少なくとも１つの他の癌療法の処置の前、最中または後のいずれかにおいてアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを含む医薬を使用することを意図している。他の癌療法は例えば手術；放射線療法；場合により自己骨髄移植と組み合わせた化学療法、ここで適当な化学療法剤は例えばフルダラビンまたはリン酸フルダラビン、クロラムブシル、ビンクリスチン、ペントスタチン、２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン）、シクロホスファミド、ドキソルビシン、プレドニソンおよびこれらの組合せ、例えばアントラサイクリン含有処方、例えばＣＡＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン＋プレドニソン）、ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニソン＋ドキソルビシン）、ＶＡＤ（ビンクリスチン、ドキソルビシン＋デキサメタゾン）、ＭＰ（メルファラン＋プレドニソン）および化学療法に使用する他の細胞毒性および／または治療薬、例えばミトキサントロン、ダウノルビシン、イダルビシン、アスパラギナーゼ、および、代謝拮抗物質、例えば、シタラビン、メトトレキセート、５−フルオロウラシルデカルバジン、６−チオグアニン、６−メルカプトプリンおよびネララビンを包含するもの（これらに限定されない）；他の抗癌モノクローナル抗体療法（例えば、アルメツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標））または悪性Ｂ細胞上のＣＤ５２細胞表面糖蛋白をターゲティングした他の抗ＣＤ５２抗体；リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））、完全ヒト抗体ＨｕＭａｘ−ＣＤ２０、Ｒ−１５９４、ＩＭＭＵ−１０６、ＴＲＵ−０１５、ＡＭＥ−１３３、トシツモマブ／Ｉ−１３１トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ（登録商標））、イブリツモマブチウキセタン（Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標））または悪性Ｂ細胞上のＣＤ２０抗原をターゲティングするいずれかの他の治療用抗ＣＤ２０抗体；抗ＣＤ１９抗体（例えばＭＴ１０３、二重特異性抗体）；抗ＣＤ２２抗体（例えばヒト化モノクローナル抗体エプラツズマブ）；ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））またはヒト血管内皮成長因子をターゲティングする他の抗癌抗体；悪性Ｂ細胞上のＣＤ２２抗原をターゲティングする抗ＣＤ２２抗体（例えばモノクローナル抗体ＢＬ−２２、アルファＣＤ２２毒素）；マクロファージコロニー刺激因子をターゲティングするα−Ｍ−ＣＳＦ抗体；多発性骨髄腫において過剰発現される核因子−カッパＢの受容体活性化剤（ＲＡＮＫ）およびそのリガンド（ＲＡＮＫＬ）をターゲティングする抗体；悪性Ｂ細胞上のＣＤ２３をターゲティングする抗ＣＤ２３抗体（例えばＩＤＥＣ−１５２）；悪性Ｂ細胞上のＣＤ３８抗原をターゲティングする抗ＣＤ３８抗体；悪性Ｂ細胞上に発現される主要組織適合複合体クラスＩＩ受容体をターゲティングする抗体（抗ＭＨＣ抗体）；悪性Ｂ細胞上のＣＤ４０抗原ヲターゲティングする他の抗ＣＤ４０抗体（例えばＳＧＮ−４０）；および固形腫瘍および造血起源の腫瘍の多くにおいて発現される腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド受容体１（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１）（例えばアゴニスト性ヒトモノクローナル抗体ＨＧＳ−ＥＴＲ１）およびＴＲＡＩＬ−２をターゲティングする抗体）；小分子系癌療法、例えば微小管および／またはトポイソメラーゼ阻害剤（例えば有糸分裂抑制剤ドラスタチンおよびドラスタチン類縁体；チュブリン結合剤Ｔ９００６０７；ＸＬ１１９；およびトポイソメラーゼ阻害剤アミノカンプトテシン）、ＳＤＸ−１０５（塩酸ベンダムスチン）、イキサベピロン（エポチロン類縁体、別名ＢＭＳ−２４７５５０）、蛋白キナーゼＣ阻害剤、例えばミドスタウリン（（ＰＫＣ−４１２，ＣＧＰ４１２５１、Ｎ−ベンゾイルスタウロスポリン）、ピキサントロン、エロキサチン（抗新生物剤）、ガナイト（硝酸ガリウム）、Ｔｈａｌｏｍｉｄ（登録商標）（サリドマイド）、サリドマイドの免疫モジュレート誘導体（例えばレブリミド（前レブミド））、ＡｆｆｉｎｉｔａｋＴＭ（蛋白キナーゼＣ−アルファのアンチセンス抑制剤）、ＳＤＸ−１０１（Ｒ−エトドラック、悪性リンパ球のアポトーシスを誘導）、第２世代のプリンヌクレオシド類縁体、例えばクロファラビン、癌細胞による蛋白Ｂｃｌ−２の生産の抑制剤（例えばアンチセンス剤であるオブリメルセンおよびＧｅｎａｓｅｎｓｅ（登録商標））、プロテオソーム抑制剤（例えばＶｅｌｃａｄｅＴＭ（ボルテゾミブ））、小分子キナーゼ阻害剤（例えばＣＨＩＲ−２５８）、小分子ＶＥＧＦ阻害剤（例えばＺＤ−６４７４）、熱ショック蛋白（ＨＳＰ）９０の小分子阻害剤（例えば１７−ＡＡＧ）、ヒストンデアセチラーゼの小分子阻害剤（例えばハイブリッド／極性細胞分化ＨＰＣ）剤、例えばスベラニロヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）およびＦＲ−９０１２２８）およびアポトーシス剤、例えばＴｒｉｓｅｎｏｘ（登録商標）（３酸化砒素）およびＸｃｙｔｒｉｎ（登録商標）（モテキサフィンガドリニウム）；ワクチン／免疫療法系癌治療法、例えばワクチン法（例えば、Ｉｄ−ＫＬＨ、オンコファージ、ビタレチン）、個人別免疫療法または能動的イディオタイプ免疫療法（例えばＭｙＶａｘ（登録商標）Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、以前の名称ＧＴＯＰ−９９）、Ｐｒｏｍｕｎｅ（登録商標）（ＣｐＧ７９０９、ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ受容体９（ＴＬＲ９）の合成アゴニスト）；インターフェロン−アルファ療法、インターロイキン−２（ＩＬ−２）療法、ＩＬ−１２療法、ＩＬ−１５療法、およびＩＬ−２１療法；ステロイド療法；または他の癌療法と組み合わせて投与され；ここで付加的な癌治療剤は上記した通りアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを含む医薬の対象への投与の前、最中、または後に投与してよい。
一部の実施形態においては、本発明は対象におけるＢ細胞リンパ腫、例えば非ホジキンリンパ腫を治療するための医薬の製造におけるアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体、例えばモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２またはＣＨＩＲ−５．９またはその抗原結合フラグメントの使用を提供し、この場合、医薬は化学療法剤、抗癌抗体療法剤、小分子系癌治療薬およびワクチン／免疫療法系の癌治療薬からなる群より選択される少なくとも１種の他の癌治療薬の投与と協調させ、ここで、医薬は他の癌治療薬の対象への投与の前、最中または後のいずれかにおいて、または、多重複合療法の場合は、他の癌治療薬群の対象への投与の前、最中または後のいずれかにおいて、使用する。
即ち、例えば一部の実施形態においては、本発明は対象におけるＢ細胞リンパ腫、例えば非ホジキンリンパ腫を治療するための医薬の製造におけるモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２またはＣＨＩＲ−５．９またはその抗原結合フラグメントの使用を提供し、ここで医薬は化学療法剤の投与と協調させ、ここで、化学療法剤はサイトキサン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニソンおよびこれらの組合せ、例えばＣＨＯＰからなる群より選択される。他の実施形態においては、本発明は対象におけるＢ細胞リンパ腫、例えば非ホジキンリンパ腫を治療するための医薬の製造におけるモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２またはＣＨＩＲ−５．９またはその抗原結合フラグメントの使用を提供し、ここで医薬はアルメツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標））または悪性Ｂ細胞上のＣＤ５２細胞表面糖蛋白をターゲティングした他の抗ＣＤ５２抗体；リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））、完全ヒト抗体ＨｕＭａｘ−ＣＤ２０、Ｒ−１５９４、ＩＭＭＵ−１０６、ＴＲＵ−０１５、ＡＭＥ−１３３、トシツモマブ／Ｉ−１３１トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ（登録商標））、イブリツモマブチウキセタン（Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標））または悪性Ｂ細胞上のＣＤ２０抗原をターゲティングするいずれかの他の治療用抗ＣＤ２０抗体；抗ＣＤ１９抗体（例えばＭＴ１０３、二重特異性抗体）；抗ＣＤ２２抗体（例えばヒト化モノクローナル抗体エプラツズマブ）；ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））またはヒト血管内皮成長因子をターゲティングする他の抗癌抗体およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つの他の抗癌抗体の投与と協調させ、ここで、医薬は他の癌治療薬の対象への投与の前、最中または後のいずれかにおいて、または、多重複合療法の場合は、他の癌治療薬群の対象への投与の前、最中または後のいずれかにおいて、使用する。
更に別の実施形態においては、対象におけるＢ細胞リンパ腫、例えば非ホジキンリンパ腫を治療するための医薬の製造におけるモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２またはＣＨＩＲ−５．９またはその抗原結合フラグメントの使用を提供し、ここで医薬は微小管および／またはトポイソメラーゼ阻害剤（例えば有糸分裂抑制剤ドラスタチンおよびドラスタチン類縁体；チュブリン結合剤Ｔ９００６０７；ＸＬ１１９；およびトポイソメラーゼ阻害剤アミノカンプトテシン）、ＳＤＸ−１０５（塩酸ベンダムスチン）、イキサベピロン（エポチロン類縁体、別名ＢＭＳ−２４７５５０）、蛋白キナーゼＣ阻害剤、例えばミドスタウリン（（ＰＫＣ−４１２，ＣＧＰ４１２５１、Ｎ−ベンゾイルスタウロスポリン）、ピキサントロン、エロキサチン（抗新生物剤）、ガナイト（硝酸ガリウム）、Ｔｈａｌｏｍｉｄ（登録商標）（サリドマイド）、アポトーシス剤、例えばＸｃｙｔｒｉｎ（登録商標）（モテキサフィンガドリニウム）、癌細胞による蛋白Ｂｃｌ−２の生産の抑制剤（例えばアンチセンス剤であるオブリメルセンおよびＧｅｎａｓｅｎｓｅ（登録商標））、ネララビンおよびこれらのいずれかの組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つの他の小分子系癌療法剤の投与と協調させ、ここで、医薬は他の癌治療薬の対象への投与の前、最中または後のいずれかにおいて、または、多重複合療法の場合は、他の癌治療薬群の対象への投与の前、最中または後のいずれかにおいて、使用する。
更に別の実施形態においては、対象におけるＢ細胞リンパ腫、例えば非ホジキンリンパ腫を治療するための医薬の製造におけるモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２またはＣＨＩＲ−５．９またはその抗原結合フラグメントの使用を提供し、ここで医薬はワクチン法（例えば、Ｉｄ−ＫＬＨ、オンコファージ、ビタレチン）、個人別免疫療法または能動的イディオタイプ免疫療法（例えばＭｙＶａｘ（登録商標）Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、以前の名称ＧＴＯＰ−９９）、Ｐｒｏｍｕｎｅ（登録商標）（ＣｐＧ７９０９、ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ受容体９（ＴＬＲ９）の合成アゴニスト）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）療法、ＩＬ−１２療法、ＩＬ−１５療法、およびＩＬ−２１療法これらのいずれかの組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つの他のワクチン／免疫療法系癌治療法剤の投与と協調させ、ここで、医薬は他の癌治療薬の対象への投与の前、最中または後のいずれかにおいて、または、多重複合療法の場合は、他の癌治療薬群の対象への投与の前、最中または後のいずれかにおいて、使用する。
一部の実施形態においては、対象におけるＢ細胞関連白血病、例えばＢ細胞急性リンパ球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）を治療するための医薬の製造における抗ＣＤ４０抗体、例えばモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２またはＣＨＩＲ−５．９またはその抗原結合フラグメントの使用を提供し、ここで医薬は化学療法剤および代謝拮抗剤からなる群より選択される少なくとも１つの他の癌治療薬の投与と協調させ、ここで、医薬は他の癌治療薬の対象への投与の前、最中または後のいずれかにおいて、または、多重複合療法の場合は、他の癌治療薬群の対象への投与の前、最中または後のいずれかにおいて、使用する。このような実施形態の例は、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体、例えばモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２またはＣＨＩＲ−５．９またはその抗原結合フラグメントを含む医薬を、サイトキサン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニソン、シタラビン、ミトキサントロン、イダルビシン、アスパラギナーゼ、メトトレキセート、６−チオグアニン、６−メルカプトプリンおよびこれらの組合せからなる群より選択される化学療法剤または代謝拮抗剤の投与と協調させる場合を包含し（これらに限定されない）；ここで医薬は他の癌治療薬の対象への投与の前、最中または後のいずれかにおいて、または、多重複合療法の場合は、他の癌治療薬群の対象への投与の前、最中または後のいずれかにおいて、使用する。１つのこのような例においては、医薬はシタラビン＋ダウノルビシン、シタラビン＋ミトキサントロン、および／または、シタラビン＋イダルビシンの投与と協調され；ここで、医薬は他の癌治療薬の対象への投与の前、最中または後のいずれかにおいて、または、多重複合療法の場合は、他の癌治療薬群の対象への投与の前、最中または後のいずれかにおいて、使用する。
本発明はまた上記したＢ細胞関連癌を含む新生物Ｂ細胞生育を特徴とする癌に関して患者を処置するための医薬の製造におけるアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体、例えばモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２またはＣＨＩＲ−５．９またはその抗原結合フラグメントの使用を提供し、ここで医薬は少なくとも１種の他の癌治療薬を予備投与されている対象において使用する。「予備投与されている」または「予備投与」とは、対象がアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを含む医薬を与えられるよりも前に、１種以上の他の癌治療薬を与えられている（即ち少なくとも１種の他の癌治療薬を投与されている）ことを意図している。「予備投与されている」または「予備投与」は、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体、例えば本明細書に記載したモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２またはＣＨＩＲ−５．９またはその抗原結合フラグメントの投与の開始に先立って、２年以内、１８ヶ月以内、１年以内、６ヶ月以内、２ヶ月以内、６週間以内、１ヶ月以内、４週間以内、３週間以内、２週間以内、１週間以内、６日以内、５日以内、４日以内、３日以内、２日以内、または、１日以内であっても、少なくとも１種の他の癌治療薬を投与されている対象を包含する。対象が以前の癌治療薬または以前の癌治療薬群の予備投与に対して応答していたことは必須ではない。即ち、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを含む医薬を与えられる対象は以前の癌治療薬の予備投与に対し、または、予備投与が複数の癌治療薬を使用する以前の癌治療薬群の１つ以上に対し、応答できていても、または、応答に失敗していてもよい。アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを含む医薬を与えられるよりも前に対象が予備投与されていることができる他の癌治療薬の例は、手術；放射線療法；場合により自己骨髄移植と組み合わせた化学療法、ここで適当な化学療法剤は例えば上記したものを包含するもの；例えば上記した抗癌抗体を包含する他の抗癌モノクローナル抗体療法；上記した小分子を包含する小分子系癌療法；上記したものを包含するワクチン／免疫療法系の癌療法；ステロイド療法；他の癌治療；またはこれらのいずれかの組み合わせを包含する。
他の癌治療薬１つ以上との本明細書に記載した医薬の協調使用の内容における「処置」とは、本明細書においては、対象への医薬または他の癌治療薬の適用または投与、または対象由来の単離組織または細胞株への医薬または他の癌治療薬の適用または投与として定義され、ここで、対象は新生物Ｂ細胞生育、そのような癌に関連する症状、またはそのような癌の発症し易さを有しており、ここで、目的は癌、癌に関連するいずれかの症状または癌の発症し易さに対し、完治、治癒、緩和、緩解、改変、軽快、軽減、改善または影響をもたらすことである。
以下の実施例は説明として提示するものであり、限定ではない。
以下の実施例において使用したアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体はＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２であるＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２抗ＣＤ４０抗体はヒトＩｇＧ１重鎖の遺伝子座およびヒトκ軽鎖の遺伝子座を担持したトランスジェニックマウスの免疫化により作成したヒトＩｇＧ１サブタイプの抗ヒトＣＤ４０モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である（ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ａｂｇｅｎｉｘ；Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）．ＦＡＣＳ分析から解るとおり、ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２はヒトＣＤ４０に特異的に結合し、ＣＤ４０リガンド結合を防止できる。両方のｍＡｂは細胞表面ＣＤ４０に予備結合したＣＤ４０リガンドを競合排除することができる。両抗体とも強力なアンタゴニストであり、正常Ｂ細胞並びにＮＨＬおよびＣＬＬ患者由来の癌細胞のインビトロＣＤ４０リガンド媒介増殖を抑制する。インビトロにおいて、両抗体は癌細胞株並びにＮＨＬ患者由来の原発癌をＡＤＣＣにより殺傷する。用量依存性の抗腫瘍渇しえが異種移植片のヒトリンパ腫モデルにおいて観察されている。ＣＨＩＲ−５．９のヒトＣＤ４０に対する結合親和性は１．２ｘ１０−８Ｍであり、そして、ＣＨＩＲ−１２．１２のヒトＣＤ４０に対する結合親和性は５ｘ１０−１０Ｍである。
マウスハイブリドーマ系統１３１．２Ｆ８．５．９（ＣＭＣＣ＃１２０４７）およびハイブリドーマ系統１５３．８Ｅ２．Ｄ１０．Ｄ６．１２．１２（ＣＭＣＣ＃１２０５６）はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ［ＡＴＣＣ；１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９（ＵＳＡ）］に特許寄託番号ＰＴＡ−５５４２およびＰＴＡ−５５４３のもとに寄託されている。
以下に記載する実施例においては以下のプロトコルを用いた。
（免疫グロブリン定量のためのＥＬＩＳＡ試験）
ヒトＩｇＭおよびＩｇＧの濃度はＥＬＩＳＡで推定した。９６穴のＥＬＩＳＡプレートを４℃で１６時間インキュベートすることにより０．０５Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中の２μｇ／ｍＬヤギ抗ヒトＩｇＧＭＡｂ（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ）または２μｇ／ｍＬヤギ抗ヒトＩｇＭＭＡｂ４１０２（Ｂｉｏ Ｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）でコーティングした。プレートをＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄し、そして１時間ＢＳＡで飽和させた。２回洗浄後、プレートを被験試料の種々の希釈度において３７℃で２時間インキュベートした。３回洗浄後、１μｇ／ｍＬペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧＭＡｂまたはヤギ抗ヒトＩｇＭＭａｂと共に３７℃で２時間インキュベートすることにより結合Ｉｇを検出した。プレートを４回洗浄し、結合ペルオキシダーゼ活性を基質としてＯ−フェニレンジアミンを添加することにより明らかにした。ヒトＩｇＧまたはＩｇＭ標準物質（Ｃａｌｔａｑ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて各試験の標準曲線を求めた。
（ヒト末梢血からの末梢血単球（ＰＢＭＣ）の単離）
血液添加前３０分に、５０ｍＬポリスチレン試験管当たり２０ｍＬのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ溶液（低内毒素；Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を３試験管に添加した。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ溶液を室温に加温した。１：１０希釈度で３Ｌのブリーチ液を調製し、血液に接触した前試験管およびピペットを洗浄するために使用した。血液をＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ溶液の上面にＦｉｃｏｌｌ層を撹乱させずに１．５ｍＬ血液／Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ １ｍＬとなるように層化した。遠心分離機のブレーキをオフにしたまま、室温で３０分間１７００ｒｐｍで試験管を遠心分離した。上層（血漿）を可能な限り大量に除去し、溶液の第２層を除去することのないよう真空を最小限とした。ＢおよびＴリンパ球を含有する第２層を滅菌パスツールピペットを用いて採取し、２本の５０ｍＬ容量のポリスチレン試験管内に入れた。採取物を３倍容量の無添加冷ＲＰＭＩで希釈し、試験管を１０分間１０００ＲＰＭで遠心分離した。培地を吸引除去し、両方の５０ｍＬ試験管の細胞を合計１０ｍＬの冷ＲＰＭＩ（添加剤含有）中に再懸濁し、１５ｍＬの試験管に移した。細胞を血球計で計数し、次に１０分間１０００ＲＰＭで遠心分離した。培地を除去し、細胞を４ｍＬＲＰＭＩ中に再懸濁した。この画分はＰＢＭＣを含有していた。
（ＰＢＭＣからのＢ細胞の単離）
ダイナビーズ（抗ｈＣＤ１９）１００μＬを５ｍＬプラスチック試験管に入れた。滅菌ＰＢＳ３ｍＬをビーズに添加して混合し、磁気ホルダー内にいれ、次に２分間静置させた。溶液をパスツールピペットを用いて除去した。滅菌ＰＢＳ３ｍＬを添加し、混合し、磁気ホルダー内にいれ、次に２分間静置させた。滅菌ＰＢＳを用いたこの操作を再度反復して合計３洗浄とした。ＰＢＭＣをビーズに添加し、４０℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＭＣおよびビーズを含有する試験管を磁気ホルダー中に２分間入れ、次に溶液を磁気ホルダー中の新しい５ｍＬ試験管に移した。２分後、溶液を新しい１５ｍＬ試験管に移した。この工程を更に４回反復し、最初の４回の溶液を１５ｍＬ試験管に収集し、次に５分間１０００ＲＰＭで遠心分離した。この工程によりＴ細胞分離のためのペレットが得られた。
１００μＬＲＰＭＩ（添加物含有）を添加してビーズを採取し、溶液を０．７ｍＬ試験管に移した。Ｄｙｎａｌ Ｄｅｔａｃｈａ Ｂｅａｄｓ１０μＬを室温で懸濁液に添加し、そして４５分間回転放置した。懸濁液を新しい５ｍＬ試験管に移し、３ｍＬのＲＰＭＩ（添加物含有）を添加した。試験管を２分間磁気ホルダーに入れた。溶液をホルダー中の新しい５ｍＬ試験管に２分間、次に１５ｍＬ試験管に移した。前の工程を更に３回反復して溶液を１５ｍＬ試験管に採取した。１５ｍＬ試験管を１０分間１０００ＲＰＭで遠心分離し、細胞を１０ｍＬＲＭＰＩに再懸濁した。洗浄工程を更に２回反復し、合計３洗浄とした。細胞を最終遠心分離の前に計数した。この工程によりＢ細胞の精製が終了した。細胞を９０％ＦＣＳおよび１０％ＤＭＳＯ中に保存し、−８００℃で凍結した。
（Ｔ細胞の単離）
１０Ｘカラム洗浄緩衝液２ｍＬおよび滅菌蒸留水１８ｍＬを混合することにより１Ｘカラム洗浄緩衝液２０ｍＬを用いてヒトＴ細胞エンリッチメントカラム（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、抗ｈＣＤ３カラムキット）を調整した。カラムを７０％エタノールで清浄化し、１５ｍＬ試験管の最上部に置いた。カラムの上蓋をまず外すことにより、カラムの底部に空気が引き込まれないようにした。次に、下蓋を外し、先端を７０％エタノールで清浄化した。カラム内の液体を１５ｍＬ試験管に流下させた。カラム緩衝液が白色フィルターの高さまで流下した後に、新しい滅菌１５ｍＬ試験管をカラム下に置いた。Ｂ細胞枯渇ＰＢＭＣ画分を緩衝液１ｍＬに懸濁し、カラム最上部に添加した。細胞を１０分間室温でカラムと共にインキュベートした。１Ｘカラム洗浄緩衝液各々２ｍＬの４回分でカラムからＴ細胞を溶離させた。収集したＴ細胞を５分間１０００ＲＰＭで遠心分離した。上澄みを除去し、細胞を１０ｍＬＲＰＭＩ中に再懸濁した。細胞を計数し、再度遠心分離した。上澄みを除去し、Ｔ細胞の精製を終了した。細胞を９０％ＦＣＳおよび１０％ＤＭＳＯ中に保存し、−８０℃で凍結した。
上記操作法に関しては、ＲＰＭＩ組成物は１０％ＦＣＳ（４５分間５６℃で不活性化）、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（１００ｕ／ｍＬペニシリン、０．１μｇ／ｍＬストレプトマイシン）、１％グルタメート、１％ナトリウムプラベート、５０μＭ２−ＭＥを含有するものであった。
（フローサイトメトリー試験）
Ｒａｍｏｓ細胞（１０６細胞／試料）を４℃で２０分間一次抗体（ＰＢＳ−ＢＳＡ中１０μｇ／ｍＬ）１００μＬ中でインキュベートした。ＰＢＳ−ＢＳＡまたはＨＢＳＳ−ＢＳＡで３洗浄した後、細胞を４℃で２０分間ヤギ抗（ヒトＩｇＧ）抗体のＦＩＴＣ標識Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（Ｃａｌｔａｑ）１００μＬ中でインキュベートした。ＰＢＳ−ＢＳＡで３洗浄、そしてＰＢＳで１洗浄の後、細胞をＰＢＳ０．５ｍＬ中に再懸濁した。分析はＦＡＣＳＣＡＮ Ｖ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて実施した。
（ハイブリドーマクローンの作成）
ｄｅ Ｂｏｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１１３：１４３の記載に従って、５０％ポリエチレングリコールを用いて１０：１の比で免疫化されたマウス由来の脾細胞をＳＰ２／０またはＰ３ｘ６３Ａｇ８．６５３ネズミミエローマ細胞と融合させた。融合細胞をヒポキサンチン（０．１ｍＭ）、アミノプテリン（０．０１ｍＭ）、チミジン（０．０１６ｍＭ）および０．５ｎｇ／ｍＬｈＩＬ−６（Ｇｅｎｚｙｍｅ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を添加した完全ＩＭＤＭ培地に再懸濁した。次に融合細胞を９６穴組織培養プレートのウェル間に分配し、各ウェルが平均１成長ハイブリドーマを含むようにした。
１０〜１４日後、ハイブリドーマの集団の上澄みを特異的抗体生産の有無についてスクリーニングした。ハイブリドーマクローンによる特異的抗体生産のスクリーニングのためには、各ウェルの上澄みをあわせ、まずＥＬＩＳＡにより抗ＣＤ４０活性特異性について試験した。次に陽性試料を用いて上記ＦＡＣＳ試験について記載したとおりＥＢＶ形質転換Ｂ細胞の蛍光細胞染色のために使用した。陽性ハイブリドーマ細胞は０．５ｎｇ／ｍＬのｈＩＬ−６を含有するＩＭＤＭ／ＦＢＳ中の限界希釈により２回クローニングした。
（実施例１：抗ＣＤ４０抗体の製造）
ＩｇＧ１アイソタイプの数種の完全ヒトアンタゴニスト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体を作成した。ヒトＩｇＧ１重鎖遺伝子座およびヒトκ鎖遺伝子座を担持したトランスジェニックマウス（Ａｂｇｅｎｉｘ γ−１ ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ａｂｇｅｎｉｘ；Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ））を用いてこれらの抗体を作成した。ＣＤ４０細胞外ドメインを発現するＳＦ９昆虫細胞を免疫原として使用した。合計３１マウス脾臓をマウスミエローマＳＰ２／０細胞と融合させることによりＥＬＩＳＡにおいて組み換えＣＤ４０を認識する８９５抗体を作成した（表１Ａおよび１Ｂ）。Ａｂｇｅｎｉｘ ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを用いて製造したハイブリドーマの平均約１０％がヒトκ鎖の代わりにマウスラムダ軽鎖を含む。マウスラムダ軽鎖を含有する抗体を選抜した。やはり細胞表面ＣＤ４０への結合を示した２６０抗体のサブセットを更に分析するために選択した。一連のサブクローニング操作の間に選択された安定なハイブリドーマを結合および機能の試験におけるその後の特性化のために使用した。
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 他の７ハイブリドーマ由来のクローンがアンタゴニスト活性を有するものとして同定された（上記表２）。その相対的アンタゴニスト力価およびＡＤＣＣ活性に基づいて、２ハイブリドーマクローンを選択してその後の評価に付した。それらを１３１．２Ｆ８．５．９（５．９）および１５３．８Ｅ２．Ｄ１０．Ｄ６．１２．１２（１２．１２）と命名した。これらの２抗体のＣＤ４０＋リンパ腫細胞株への結合の特徴を図１におけるフローサイトメトリーヒストグラムとして示す。
（実施例２：ヒト抗ＣＤ４０抗体のポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列）
候補抗体の可変領域をコードするｃＤＮＡをＰＣＲ増幅し、クローニングし、そして配列決定した。ＣＨＩＲ−１２．１２抗体の軽鎖および重鎖のアミノ酸配列をそれぞれ図９Ａおよび９Ｂに示す。配列番号２（ｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２の軽鎖）および配列番号４（ｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２の重鎖）も参照できる。ｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２の重鎖の変異体は図９Ｂ（配列番号５も参照）に示す通りであり、これは配列番号４の１５３位のアラニン残基に対するセリン残基の置換を有する点において配列番号４と異なる。ＣＨＩＲ−１２．１２．抗体の軽鎖および重鎖をコードするヌクレオチド配列をそれぞれ図１０Ａおよび１０Ｂに示す。配列番号１（ｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２の軽鎖のコーディング配列）および配列番号３（ｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２の重鎖のコーディング配列）も参照できる。ＣＨＩＲ−５．９抗体の軽鎖および重鎖のアミノ酸配列をそれぞれ図１１Ａおよび９Ｂに示す。配列番号６（ｍＡｂ ＣＨＩＲ−５．９の軽鎖）および配列番号７（ｍＡｂ ＣＨＩＲ−５．９の重鎖）も参照できる。ｍＡｂ ＣＨＩＲ−５．９の重鎖の変異体は図１１Ｂ（配列番号８も参照）に示す通りであり、これは配列番号７の１５８位のアラニン残基に対するセリン残基の置換を有する点において配列番号７と異なる。
独立したハイブリドーマから誘導した抗体について予測される通り、相補性決定領域（ＣＤＲ）におけるヌクレオチド配列にはかなりの変異がある。ＶＨのＣＤＲ３領域の多様性は最も顕著に抗体特異性を決定すると考えられる。
（実施例３：インビトロのＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用に対するＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２の作用）
候補抗体ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２は細胞表面ＣＤ４０へのＣＤ４０リガンドの結合を防止し、そして予備結合したＣＤ４０リガンドを置き換える。リンパ腫細胞株（Ｒａｍｏｓ）の細胞表面ＣＤ４０へのＣＤ４０リガンドの結合を防止する抗体ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２の能力を調べた。両方の抗体（未標識）の結合はフローサイトメトリー試験により測定した場合ＰＥ−ＣＤ４０リガンドのその後の結合を防止した（図２Ａ）。試験の第２のセットにおいて、細胞表面ＣＤ４０に予備結合したＣＤ４０リガンドを置き換える能力について２抗体を試験した。両抗体とも予備結合ＣＤ４０リガンドを競合排除するために有効であり、ＣＨＩＲ−５．９がＣＨＩＲ−１２．１２より僅かにより有効であった（図２Ｂ）。
（実施例４：ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２は１５Ｂ８とは異なるＣＤ４０上のエピトープに結合する）
候補モノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２はＣＤ４０との結合については相互に競合するが、ＩｇＧ２抗ＣＤ４０ｍＡｂである１５Ｂ８とは競合しない（国際出願ＷＯ０２／２８９０４参照）。Ｂｉａｃｏｒｅを用いた抗体競合結合アッセイをアミンカップリングを介して固定したプロテインＡを有するＣＭ５バイオセンサーを用いて設計し、これを用いて抗ＣＤ４０、ＣＨＩＲ−１２．１２または１５Ｂ８のいずれかをキャプチャーした。通常の会合／解離の結合曲線がＣＤ４０−ｈｉｓの種々の濃度において観察された（データ示さず）。競合試験のためには、ＣＨＩＲ−１２．１２または１５Ｂ８のいずれかをプロテインＡの表面上にキャプチャーする。その後、ＣＤ４０−ｈｉｓ／ＣＨＩＲ−５．９Ｆａｂ複合体（１００ｎＭＣＤ４０：１μＭＣＨＩＲ−５．９Ｆａｂ）の種々の濃度のものを修飾された表面を通過させて流動させた。ＣＨＩＲ−１２．１２の場合は複合体の会合は観察されず、ＣＤ４０−ｈｉｓへのＣＨＩＲ−１２．１２の結合をＣＨＩＲ−５．９がブロックすることを示していた。１５Ｂ８については、ＦａｂＣＨＩＲ−５．９複合体の会合が観察され、ＣＤ４０結合部位への１５Ｂ８の結合をＣＨＩＲ−５．９がブロックしないことを示していた。しかしながら、複合体のオフ率は劇的に上昇した（データ示さず）。
１５Ｂ８およびＣＨＩＲ−１２．１２はＣＤ４０−ｈｉｓ結合と競合しないことも明らかになった。この実験はプロテインＡのバイオセンサーチップ上にＣＨＩＲ−１２．１２をキャプチャーし、残存するプロテインＡ部位を対照ｈＩｇＧ１でブロッキングし、ＣＤ４０−ｈｉｓを結合させ、そして次に修飾した表面に１５Ｂ８を流動させることによりセットアップした。１５Ｂ８はこの条件下で実際に結合し、ＣＨＩＲ−１２．１２が１５Ｂ８のＣＤ４０への結合をブロッキングしないことを示していた。
（実施例５：選択されたハイブリドーマの結合特性）
プロテインＡをアミンカップリングによりＣＭ５バイオセンサーチップに固定化した。１０μＬ／分の速度で１．５分間修飾バイオセンサーチップ上にヒト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体を１．５μｇ／ｍＬでキャプチャーさせた。組み換え可溶性ＣＤ４０−ｈｉｓを種々の濃度デバイオセンサー表面上に流動させた。抗体および抗原を０．０１Ｍ ＨＥＰＳｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ＳｕｒｆａｃｔａｎｔＰ２０（ＨＢＳ−ＥＰ）中に希釈した。速度定数および親和性定数はＢｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウエアおよび１：１相互作用モデル／グローバルフィットを用いて求めた。
以下の表３に示す通り、ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２のオフ率には１２１倍の差が有り、ＣＨＩＲ−１２．１２について２４倍高値の親和性が示された。
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 （実施例６：ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２は正常対象由来のヒトリンパ球のＣＤ４０媒介増殖の強力なアンタゴニストである）
ＣＤ４０リガンドによるＣＤ４０の捕獲はヒトＢ細胞の増殖を誘導する。アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体はこの増殖を抑制すると期待される。２種の候補抗体（ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２）の正常ヒト対象由来のＰＢＭＣのＣＤ４０リガンド誘導増殖を抑制する能力について試験した。ホルムアルデヒド固定ＣＨＯ細胞トランスフェクト体発現ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）をＣＤ４０リガンドの原料として使用した。ヒトＰＢＭＣは抗ＣＤ４０ｍＡｂ ＣＨＩＲ−５．９またはＣＨＩＲ−１２．１２の種々の濃度の存在下においてＣＤ４０リガンドを発現するホルムアルデヒド固定ＣＨＯ細胞と共に４日間培養した。増殖はトリチウム化チミジンの取り込みにより測定した。細胞を１４〜１８時間３７℃でトリチウム化標識チミジンでパルシングした。
両抗体ともヒトＰＢＭＣのＣＤ４０リガンド誘導増殖の抑制において極めて効果的であることがわかった（表４Ａ、ｍＡｂ ＣＨＩＲ−５．９、表４Ｂ、ｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２）。実験はＰＢＭＣの複数ドナー（ＣＨＩＲ−５．９についてはｎ＝１２、ＣＨＩＲ−１２．１２についてはｎ＝２）を用いて実施することにより観察された抑制が単一のドナー由来の細胞の特殊性ではないように留意した。更に４ＰＢＭＣドナーのフォローアップ評価をｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２について実施したところ同様の傾向が観察された。これらの試験では広範な範囲の抗体濃度（０．０１μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬ）を用いた。ＣＤ４０リガンド誘導増殖のほぼ完全な抑制が大部分の例において０．１μｇ／ｍＬの濃度の抗体において達成できた。６ドナー由来のリンパ球についてＣＤ４０リガンド誘導リンパ球増殖を５０％抑制するための抗体濃度（ｐＭ）（ＩＣ５０）は平均で４７のＩＣ５０（ｐＭ）であり（ＳＤ＝２１；ドナー１、２４；ドナー２、６６；ドナー３、４５；ドナー４、８４；ドナー５、３０；ドナー６、３５）、これらは表４Ｂに示す４９．６５の平均ＩＣ５０（ｐＭ）と良好な一致を示した。現在のデータセットに基づけば、両方の候補抗体は正常ＰＢＭＣのＣＤ４０リガンド誘導増殖の抑制に関してはその力価は同様であると考えられる。
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 Ｂ細胞のほかに、ヒトＰＢＭＣはまた抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を媒介できるナチュラルキラー細胞を含有する。増殖の抗体媒介抑制の機序を明確化するために、ヒトＰＢＭＣから精製したＢ細胞を用いて試験を実施した。ＰＢＭＣで得られた結果と同様、両方の抗体とも精製Ｂ細胞のＣＤ４０リガンド誘導増殖を強力に抑制した（表５、ｎ＝３）。これらのデータはＡＤＣＣの機序ではなく候補抗体のアンタゴニスト活性がこれらの試験の増殖抑制の原因であることを示している。
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 （実施例７：ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２は正常対象由来ヒトＢ細胞の強力な増殖を誘導しない）
ＣＤ４０リガンドは正常Ｂ細胞およびＢ細胞リンパ腫細胞を活性化して増殖させる。一部の抗ＣＤ４０抗体（アゴニスト）の結合は正常および癌Ｂ細胞の増殖のための同様の刺激シグナルを与えることができる。強力なＢ細胞刺激活性を有する抗体はＢ細胞リンパ腫の治療的投与のための適当な候補ではない。２種の候補抗体が正常ボランティアドナー由来のＢ細胞の増殖を誘導する能力について試験した。正常ドナーＰＭＢＣ由来のＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ勾配遠心分離により精製したＢ細胞を合計４日間種々の濃度の候補抗体（０．００１〜１００μｇ／ｍＬの範囲）と共に９６穴プレート中培養した。陽性対照群においては、ＰＢＭＣをＣＤ４０リガンドを発現するホルムアルデヒド固定ＣＨＯ細胞と共に培養した。Ｂ細胞の黄色は１４〜１８時間３７℃でトリチウム化標識チミジンの取り込みにより測定した。ＣＨＯ細胞上に提示されるＣＤ４０リガンドは１４５の平均刺激指数（ＳＩ）をもたらすＢ細胞の旺盛な増殖を誘導したが、候補抗体はＣＨＩＲ−１２．１２およびＣＨＩＲ−５．９についてそれぞれ２．８９および５．０８の刺激指数で弱い増殖を誘導したのみであった（ｎ＝３）（表６）。
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 Ｂ細胞のほかに、ヒトＰＢＭＣはＢ細胞上のＣＤ４０に結合した抗ＣＤ４０抗体の交差結合をもたらすことができるＩｇＧ１分子に対するＦｃ受容体（ＦｃＲ）を担持した細胞型を含有する。この交差結合は潜在的に抗ＣＤ４０抗体の刺激活性を増強する。交差結合細胞の存在下のＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２抗体のＢ細胞刺激活性の欠如を確認するために、Ｂ細胞並びにＦｃＲ＋細胞を含有する全ＰＢＭＣを用いて増殖実験を実施した。これらの実験のデータ（表７Ａ、ｍＡｂ ＣＨＩＲ−５．９；表７Ｂ、ｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２）によれば、これらの候補抗体はＦｃＲ担持細胞の存在下であっても全体として対照ヒトＩｇＧ１により誘導されたバックグラウンド増殖より高値の増殖をもたらすようにはＢ細胞を刺激しないことが確認された（ｎ＝１０）。ＣＤ４０リガンドは７．４１の平均刺激指数（ＳＩ）を誘導した。候補抗体の場合の平均ＳＩはＣＨＩＲ−１２．１２およびＣＨＩＲ−５．９についてそれぞれ０．５５および１．０５であった。試験した１０ドナーＰＢＭＣの１検体のみがＣＨＩＲ−５．９抗体に対してある程度の刺激応答を示した（表７のドナー２）。候補ｍＡｂによる刺激活性が無いことは、更に、培養ウェルのプラスチック表面上に固定化した候補抗ＣＤ４０抗体に応答したＰＭＢＣ増殖を測定することにより確認した（ｎ＝２）。ＣＤ４０リガンド、ＣＨＩＲ−１２．１２およびＣＨＩＲ−５．９刺激を用いた場合の平均のＳＩはそれぞれ２２、０．６７および１．２であった（表８）。総括すると、これらのデータは候補抗ＣＤ４０抗体が強力なＢ細胞刺激特性を有していないことを示している。
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 培養ウェルの表面（ｎ＝２）。ＣＤ４０リガンド、ＣＨＩＲ−１２．１２、およびＣＨＩＲ−５．９の刺激での平均ＳＩは、それぞれ２２、０．６７、および１．２であった。これらのデータを一緒に考えて、候補抗ＣＤ４０抗体は、強力なＢ細胞刺激特性を持っていないことを示す。
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 （実施例８：ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２はＡＤＣＣによりＣＤ４０担持標的細胞を殺傷することができる）
候補抗体はＡＤＣＣの機序によりＣＤ４０担持標的細胞（リンパ腫系統）を殺傷することができる。ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２の両方はＩｇＧ１アイソタイプの完全ヒト抗体であり、そして、ＡＤＣＣの機序により標的細胞の殺傷を誘導する能力を有することが期待される。それらがインビトロの試験において癌細胞株を殺傷する能力があるかどうか調べた。２種のヒトリンパ腫系統（ＲａｍｏｓおよびＤａｕｄｉ）をこれらの試験の標的細胞として選択した。８正常ボランティアドナー由来のＰＢＭＣまたはリッチ化ＮＫ細胞をこれらの試験のエフェクター細胞として使用した。リンパ腫癌細胞株の標的細胞の両方に対してＣＨＩＲ−５．９と比較してＣＨＩＲ−１２．１２の場合により強力なＡＤＣＣ応答が観察された。リンパ腫細胞株はリツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））に対する標的抗原であるＣＤ２０も発現し、これにより、リツキシマブＡＤＣＣ活性にこれら２種の候補ｍＡｂのＡＤＣＣ活性を比較するこが可能となった。リンパ腫細胞株標的については、１μｇ／ｍＬの濃度で使用した場合、ＣＨＩＲ−５．９、ＣＨＩＲ−１２．１２およびリツキシマブについてそれぞれ３５％、５９％および４７％の平均の特異的溶解は観察された（表９）。２種の抗体は補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）試験においてはそれほど活性を示さなかった。
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 （実施例９：ＣＤ４０はリンパ節生検患者由来のＮＨＬ細胞の表面に存在する）
ＮＨＬ細胞を患者の生検リンパ節から単離し、使用時まで液体窒素中に保存した。分析の時点における細胞の生存性は９０％を超過していた。２人のリツキシマブ感受性および３人のリツキシマブ抵抗性の患者（合計５患者）に由来する細胞を直接標識１５Ｂ８−ＦＩＴＣまたは１５Ｂ８＋抗ｈｕＩｇＧ２−ＦＩＴＣのいずれかで染色し、フローサイトメトリーで分析した。全患者由来のＮＨＬ細胞はＣＤ４０を発現することが判明した。表１０はＮＨＬ細胞の７６％がＣＤ４０を発現すること示している（範囲６０〜９１％）。
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 （実施例１０：ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２はＮＨＬ患者のリンパ節由来の癌細胞の増殖を刺激しない）
ＣＤ４０リガンドはＮＨＬ患者由来のリンパ腫細胞の生存および増殖のための刺激シグナルを与える。一部の抗ＣＤ４０抗体（アゴニスト）の結合は患者の癌細胞の増殖に対して同様の刺激シグナルを与えることができる。強力なＢ細胞刺激活性を有する抗体はＢ細胞リンパ腫の適当な候補ではない。２種の候補抗体が３患者由来のＮＨＬ細胞の増殖を誘導する能力について試験した。リンパ節（ＬＮ）生検から単離された細胞を種々の濃度の候補抗体（範囲０．０１〜３００μｇ／ｍＬ）と共に合計３日間培養した。細胞の増殖はトリチウム化チミジンの取り込みにより測定した。２種の候補ｍＡｂの何れも試験した何れの濃度においても癌細胞の増殖を誘導しなかった（表１１）。外部から添加したＢ細胞成長因子であるＩＬ−４の存在下であっても抗体はＮＨＬ細胞の増殖を誘導しなかった（３患者細胞の１つにおいて試験）。これらの結果はＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２はアゴニスト抗ＣＤ４０抗体ではなく、そして患者由来のＮＨＬ細胞のインビトロ増殖を刺激しないことを示している。
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 （実施例１１：ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２は非ホジキンリンパ腫患者由来の癌細胞のＣＤ４０リガンド媒介増殖をブロックできる）
ＣＤ４０によるＣＤ４０の係留はＮＨＬ患者由来の癌細胞の増殖を誘導する。アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体はこの増殖を抑制することが期待される。２種の候補抗ＣＤ４０抗体を種々の濃度（０．０１〜１００μｇ／ｍＬ）において、それらが患者由来のＮＨＬ細胞のＣＤ４０リガンド誘導増殖を抑制する能力を有するかどうか調べた。患者由来のＮＨＬ細胞をＩＬ−４の存在下ＣＤ４０Ｌ発現フィーダー上で懸濁液中培養した。ＮＨＬ細胞の増殖は３Ｈ−チミジン取り込みにより測定した。両方の抗体ともＮＨＬ細胞のＣＤ４０リガンド誘導増殖の抑制において極めて効果的であることがわかった（表１２、ｎ＝２）。ＣＤ４０リガンド誘導増殖のほぼ完全な抑制が抗体濃度１．０〜１０μｇ／ｍＬで達成される。
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 （実施例１２：ＣＤ４０リガンド担持細胞と共に培養した場合の生存ＮＨＬ細胞の数に対するＣＨＩＲ−５．９の作用）
長時間（７、１０および１４日）に渡りＣＤ４０リガンド担持細胞と共に培養した場合の生存ＮＨＬ細胞数に対するＣＨＩＲ−５．９の作用を調べた。ＣＤ４０を介したＣＤ４０リガンド媒介シグナル伝達はＢ細胞の生存のために重要である。この実験セットでは７、１０および１４日におけるＮＨＬ細胞数に対する抗ＣＤ４０抗体の作用を評価した。５患者由来のＮＨＬ細胞をＩＬ−４の存在下ＣＤ４０Ｌ発現照射フィーダー細胞上で懸濁液中培養した。対照ヒトＩｇＧおよびＣＨＩＲ−５．９抗体は第０日および第７日に１０μｇ／ｍＬの濃度で添加した。各条件下の生存細胞を特定の日に計数した。対照群（ＩｇＧ）の細胞数は予測どおり時間に従って増大していた。対照群と比較してＣＨＩＲ−５．９投与培養では減少した数の細胞が回収された。ＣＨＩＲ−５．９抗体による細胞数の低減の最大水準は第１４日に観察され、アイソタイプ対照と比較して平均８０．５％（範囲４９〜９４％）であった（ｎ＝５）。これらのデータを表１３にまとめる。
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 （実施例１３：ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２はＡＤＣＣによりＮＨＬ患者のリンパ節由来の癌細胞を殺傷することができる）
ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２は両方ともＩｇＧ１アイソタイプの完全ヒト抗体であり、そしてＡＤＣＣの機序によりインビトロでリンパ腫細胞株の殺傷を誘導することがわかっている（表９）。これらの単一のＮＨＬ患者由来の癌細胞を殺傷する能力についてインビトロの試験で調べた。正常ボランティアドナー由来のリッチ化ＮＫ細胞を単離直後または３７℃一夜培養後にこの試験のエフェクター細胞として使用した。単離直後のＮＫ細胞および一夜培養後に使用したＮＫ細胞の両方で同様の結果が得られた。患者由来のＮＨＬ細胞に対してはＣＨＩＲ−５．９と比較してＣＨＩＲ−１２．１２で高値のＡＤＣＣ水準が観察された。ＮＨＬ細胞はリツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））に対する標的抗原であるＣＤ２０も発現し、これにより、リツキシマブにこれら２種の候補ｍＡｂのＡＤＣＣ活性を比較するこが可能となった。抗体ＣＨＩＲ−１２．１２およびリツキシマブは同様の水準のＡＤＣＣ活性を示し、ＣＨＩＲ−５．９はこの試験では低値であった。これらのデータは図３Ａおよび３Ｂに示す。
（実施例１４：ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２はＣＬＬ患者由来の癌細胞のＣＤ４０媒介生存および増殖をブロックできる）
候補抗体はＣＬＬ患者由来の癌細胞のＣＤ４０媒介生存および増殖をブロックできる。患者由来のＣＬＬ細胞を２つの異なる条件下、即ち、ヒトアイソタイプ抗体ＩｇＧ添加；およびＣＨＩＲ−５．９またはＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体のいずれか添加において、ＣＤ４０Ｌ発現ホルムアルデヒド固定ＣＨＯ細胞上で懸濁液中培養した。全ての抗体はＩＬ−４の非存在下１、１０および１００μｇ／ｍＬの濃度で添加した。細胞計数はＭＴＳ試験により２４および４８時間に実施した。細胞の低減数は対照群と比較した場合にＣＨＩＲ−５．９（ｎ＝６）およびＣＨＩＲ−１２．１２（ｎ＝２）投与培養物から回復した。抗ＣＤ４０ｍＡｂ投与および対照抗体投与の培養物の間の細胞数のより大きい差が４８時間の時点において観察された。データは表１４にまとめる。
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 （実施例１５：ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２は動物モデルにおいて抗腫瘍活性を示す）
（薬理学的／インビボの薬効）
候補ｍＡｂは２つの抗腫瘍機序、即ち増殖／生存シグナルの遮断、および、ＡＤＣＣの誘導のいずれか／両方により腫瘍負荷を低減する望ましい薬理学的作用をもたらすことが期待される。現在入手可能なヒトリンパ腫異種移植片モデルは原発癌細胞とは対照的にその生育および生存をＣＤ４０刺激に依存していない長期リンパ腫細胞株を使用している。従って、腫瘍増殖／生存シグナルの遮断に基づいたこれらのｍＡｂの抗腫瘍活性の要素はこれらのモデルにおいて抗腫瘍薬効に寄与するとは期待されない。これらのモデルにおける薬きょうはＡＤＣＣ、即ちＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２ｍＡｂに関連する第２の抗腫瘍機序に依存している。ＮａｍａｌｗａおよびＤａｕｄｉ細胞株に基づいた２種の異種移植片ヒトリンパ腫モデルを、候補ｍＡｂの抗腫瘍活性に関して評価した。その治療活性を更に明らかにするために、これらの候補ｍＡｂをＤａｕｄｉ細胞株に基づいた段階型および非段階型の異種移植片ヒトリンパ腫モデルにおいて評価した。
（インビボの薬効データのまとめ）
合計３投薬において一週間に１回腹腔内（ｉｐ）投与した場合、２つの候補ｍＡｂの１つであるＣＨＩＲ−１２．１２は用量依存性の態様で攻撃的な非段階型Ｂ細胞リンパ腫（Ｎａｍａｌｗａ）の生育を顕著に抑制した（図４）。第２の候補ｍＡｂであるＣＨＩＲ−５．９は本試験では単一の用量においてのみ試験したが、同じ用量のＣＨＩＲ−１２．１２よりも有効性が低値であった。興味深いことに、ＣＨＩＲ−１２．１２はリツキシマブよりも本モデルにおいてより有効であることが解った。リツキシマブの低有効性はＮａｍａｌｗａリンパ腫細胞株上の低いＣＤ２０発現に起因する可能性がある。候補ｍＡｂで観察された薬効は、２つの癌細胞殺傷機序のうち１つ（ＡＤＣＣ）のみが現在の異種移植片リンパ腫モデルにおいて効力を有することから、より大きい重要性を有する。２つの殺傷機序、即ちＡＤＣＣおよび生存シグナルの遮断はヒトリンパ腫患者における抗腫瘍活性に寄与することが期待される。これはヒトリンパ腫患者における薬効を達成する機会を増大させると考えられる。候補抗ＣＤ４０ｍＡｂはまた、第２のＢ細胞リンパ腫における腫瘍生育の抑制の傾向も示している（非有効化Ｄａｕｄｉモデル、データ示さず）。フォローアップ試験において、２つの候補抗体は非段階方および段階型のＤａｕｄｉリンパ腫モデルの両方において用量依存的抗腫瘍薬効を有することが示された（それぞれ図５および６）。段階型Ｄａｕｄｉモデルにおいて、ＣＨＩＲ−１２．１２ｍＡｂはＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）の同用量よりも腫瘍体積の低減においてより有効であった。
（異種移植片ヒトＢ細胞リンパ腫モデル）
一貫した腫瘍生育を確保するために、Ｔ細胞欠損ヌードマウスを３Ｇｙで全身照射することにより腫瘍接種１日前に免疫系を更に抑制した。腫瘍細胞はマウス当たり５ｘ１０６個で右体側部に皮下接種した。投与は腫瘍移植後１日（非段階皮下異種移植片ヒトＢ細胞リンパ腫モデル、ＮａｍａｌｗａおよびＤａｕｄｉ）または腫瘍体積が２００〜４００ｍｍ３に達した時点（段階型Ｄａｕｄｉモデル、通常は腫瘍接種の１５日後）のいずれかに開始した。腫瘍担持マウスに所定用量において一週間に１回腹腔内（ｉｐ）に抗ＣＤ４０ｍＡｂを注射した。腫瘍体積は一週間に２回記録した。腫瘍体積が２５００ｍｍ３に達した時点で、試験を終了した。段階型Ｄａｕｄｉモデルにおいては腫瘍体積データは第３６日まで分析したが、これは一部のマウスがこの日以降に死亡したためである。完全な後退（ＣＲ）は試験終了時まで計数した。データはＡＮＯＶＡまたはＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定および多群比較のための相当する後試験を用いて分析した。
非段階型Ｎａｍａｌｗａモデルにおいて、抗ＣＤ４０ｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２はＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）（リツキシマブ）とは異なり、Ｎａｍａｌｗａ腫瘍の生育を有意に（ｐ≦０．０１）抑制した（腫瘍体積減少６０％に対しリツキシマブでは２５％、ｎ＝１０マウス／群）（図４）。即ち本モデルにおいては、抗ＣＤ４０ｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２はリツキシマブより強力であった。第２の候補ｍＡｂであるＣＨＩＲ−５．９はリツキシマブの１０分の１の用量において少なくともリツキシマブと同様に有効であった。両方の抗ＣＤ４０ｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２およびＲｉｔｕｘａｎは非段階化Ｄａｕｄｉ腫瘍モデルにおいて腫瘍の発生を有意に防止した（腫瘍攻撃に１４／１５の抵抗性）（図５）。
皮下腫瘍が触診可能になった時点で処置を開始した段階型異種移植片Ｄａｕｄｉモデルにおいてこれらの抗ＣＤ４０モノクローナル抗体を更に比較したところ、１ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ４０ｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２は６０％の完全後退（６／１０）で有意な腫瘍現象（ｐ＝０．００３）を誘発したが、同じ用量のリツキシマブは腫瘍生育の有意な抑制はもたらさず、また完全後退ももたらさなかった（０／１０）。図６を参照できる。
総括すると、抗ＣＤ４０ｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２は実験的リンパ腫モデルにおいて腫瘍の生育を有意に抑制した。同じ用量および用法において、ｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２はＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）（リツキシマブ）よりも良好な抗癌活性を示した。更にまた、毒性の臨床兆候はこの用量および用法において観察されなかった。これらのデータは抗ＣＤ４０ｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２は強力なインビトロおよび異種移植片モデルにおいて抗ヒトリンパ腫活性を有しており、そして、リンパ腫の処置のために臨床的に有効であることを示唆している。
（実施例１６：ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２の薬物動態）
抗ＣＤ４０ｍＡｂのマウスにおける薬物動態を単回ＩＶおよびＩＰ用量投与の後に試験した。抗ＣＤ４０ｍＡｂはＩＰ投与後に高い全身生体利用性および延長された終末半減期（＞５日）を示した（データ示さず）。このパイロット試験は薬理学的試験の設計において利用するために実施したが、この完全ヒトｍＡｂはマウスＣＤ４０とは交差反応しないため、このｍＡｂの生成活性に関しては殆ど、または全く重要性を有さなかった。
（実施例１７：モノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２およびモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９についてのエピトープの特徴づけ）
モノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２およびモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９により認識されるＣＤ４０上のエピトープの位置を決定するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析を実施した。精製したＣＤ４０（０．５μｇ）を、還元条件下および非還元条件下で、４〜１２％のＮＵＰＡＧＥゲル上で分離し、ＰＶＤＦメンブレンに移し、そして、１０μｇ／ｍｌ濃度のモノクローナル抗体でプローブした。ブロットを、アルカリホスファターゼ結合体化抗ヒトＩｇＧでプローブし、そして、アルカリホスファターゼについてのＷｅｓｔｅｒｎ ＢｌｕｅＲ安定化基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて発色させた。
結果は、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２が、ＣＤ４０の非還元型形態および還元型形態の両方の上にあるエピトープを認識し、ＣＤ４０の非還元型形態が、ＣＤ４０の還元型形態よりも高い強度を示すことを示す（表１５；ブロットは示さず）。ＣＤ４０の両方の形態についての認識が、陽性であるという事実は、この抗体が、直鎖状配列である立体配座のエピトープ部分と相互作用することを示す。モノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９は、主に、ＣＤ４０の非還元型形態を認識し、この抗体が、本来の立体配座のエピトープと相互作用することを示唆する（表１５；ブロットは示さず）。
Figure 2008502309
 ＣＤ４０上の抗原性領域をマッピングするために、ＣＤ４０の４つの細胞外ドメインをクローニングし、そして、ＧＳＴ融合タンパク質として昆虫細胞において発現させた。４つのドメインの分泌を、ＧＰ６７分泌シグナルで確認した。昆虫細胞の上清を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析により分析し、エピトープを含むドメインを同定した。
モノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２は、還元条件および非還元条件の両方の下で、ドメイン２上のエピトープを認識する（表１６；ブロットは示さず）。対照的に、モノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９は、ドメイン２に対して、非常に弱い認識を示す（表１６；ブロットは示さず）。これらの抗体のいずれもが、この分析において、ドメイン１、ドメイン３またはドメイン４は認識しない。
Figure 2008502309
 ｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２により認識されるエピトープをより正確に規定するために、ペプチドを、ＣＤ４０の細胞外ドメイン２から合成した。これは、配列ＰＣＧＥＳＥＦＬＤＴＷＮＲＥＴＨＣＨＱＨＫＹＣＤＰＮＬＧＬＲＶＱＱＫＧＴＳＥＴＤＴＩＣＴ（配列番号１０または配列番号１２に示される配列の残基６１〜１０４）に対応する。１アミノ酸がオフセット（ｏｆｆｓｅｔ）された１０マーペプチド３５種を含むＳＰＯＴメンブレン（Ｓｉｇｍａ）を作製した。ｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２および抗ヒトＩｇＧ β−ガラクトシダーゼを二次抗体として用いるウェスタンブロット分析を実施した。このブロットを、細片に分け、ｍＡｂ ＣＨＩＲ−５．９で再度プローブして、この抗体により認識される領域を決定した。
１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４０モノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２でプローブするＳＰＯＴ分析では、スポット１８〜２２の反応が陽性であった。これらのペプチドによりカバーされる配列領域を、表１７に示す。
Figure 2008502309
 これらの結果は、以下の直鎖状エピトープに対応する：ＹＣＤＰＮＬ（配列番号１０または配列番号１２に示す配列の残基８２〜８７）。このエピトープは、Ｙ８２、Ｄ８４およびＮ８６を含み、これらは、ＣＤ４０−ＣＤ４０リガンドの相互作用に関与すると予測されている。
ｍＡｂ ＣＨＩＲ−５．９を用いるＳＰＯＴ分析は、表１８に示されるスポット２０〜２２により表されるペプチドの弱い認識を示し、これは、そのＣＤ４０への結合において、領域ＹＣＤＰＮＬＧＬ（配列番号１０または配列番号１２に示す配列の残基８２〜８９）が関与することを示唆した。ｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２およびｍＡｂ ＣＨＩＲ−５．９は、ＢＩＡＣＯＲＥ分析においてＣＤ４０への結合に関して、互いに競合することに注意すべきである。
Figure 2008502309
 ＳＰＯＴ分析により同定した直鎖状エピトープは、ＣＤ４０ Ｂ１モジュールの内部である。ＣＤ４０ Ｂ１モジュールの配列は、ＨＫＹＣＤＰＮＬＧＬＲＶＱＱＫＧＴＳＥＴＤＴＩＣ（配列番号１０または配列番号１２の残基８０〜１０３）である。
直鎖状エピトープ内でＣＨＩＲ−１２．１２について同定されたのはＣ８３である。このシステイン残基がＣ１０３とジスルフィド結合を形成することは公知である。ＣＨＩＲ−１２．１２ ｍＡｂの立体配座のエピトープ（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｅｐｉｔｏｐｅ）は、このジスルフィド結合（Ｃ８３−Ｃ１０３）および／またはＣ１０３にコンホメーション的に近い周囲のアミノ酸を含むようである。
（実施例１８：ＮａｍａｌｗａおよびＤａｕｄｉ細胞上のＣＤ２０およびＣＤ４０分子の数）
ＮａｍａｌｗａおよびＤａｕｄｉ細胞上のＣＤ２０およびＣＤ４０分子の数を図７に示す通り０．０１、０．１、１、１０および１００μｇ／ｍＬの抗体濃度を用いて測定した。図７から解るとおり、ＣＤ２０分子（リツキシマブの標的）の平均数はＣＤ４０分子（ｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２の標的）の数よりもＮａｍａｌｗａおよびＤａｕｄｉ細胞株の両方において高値であった。
（実施例１９：ｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２およびリツキシマブのＤａｕｄｉリンパ腫細胞に対するＡＤＣＣ）
リツキシマブおよび候補ｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２のＡＤＣＣ活性を標的（Ｔ）細胞としてのリンパ腫細胞株Ｄａｕｄｉおよびエフェクター（Ｅ）細胞としての健常者ボランティア由来精製ＮＫ細胞に対して種々の濃度においてインビトロで試験した。新しく単離したヒトＮＫ細胞をカルセイン標識Ｄａｕｄｉリンパ腫細胞とＥ：Ｔ比１０で混合した。細胞混合物をｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２またはリツキシマブのいずれかの所定濃度の存在下に３７℃で４時間インキュベートした。上澄み中の溶解した標的細胞から放出されたカルセイン濃度を任意蛍光単位（Ａｒｂｉｔａｒｙ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｕｎｉｔｓ：ＡＦＵ）として測定した。パーセント特異的溶解は１００ｘ（ＡＦＵ試験−ＡＦＵ自発的放出）／（ＡＦＵ最大放出−ＡＦＵ自発的放出）として計算し、式中ＡＦＵ自発的放出は抗体またはＮＫ細胞の非存在下で標的細胞かにより放出されたカルセインであり、そしてＡＦＵ最大放出は洗剤による溶解で標的細胞から放出されたカルセインである。
抗体濃度依存性Ｄａｕｄｉ細胞溶解が観察された（図８；下記表１９）。抗ＣＤ４０ｍＡｂにより誘導された標的リンパ腫細胞の最大特異的溶解はリツキシマブにより誘導された溶解と比較して高値であった（６３．６％ｖｓ４５．９％、ｎ＝６；ｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２対リツキシマブの一対ｔ検定、ｐ＝０．０００２）。更にまた、リツキシマブのＥＤ５０は平均（ｎ＝６）で５１．６Ｍでありこれは本活性に関する抗ＣＤ４０ｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２のＥＤ５０より１３倍高値であった。
Figure 2008502309
 （実施例２０：ＣＨＩＲ−１２．１２は正常ヒトＢ細胞におけるＣＤ４０Ｌ媒介ＣＤ４０生存およびシグナル伝達経路をブロックする）
可溶性ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）はＢ細胞を活性化し、そして、生存および増殖の増強およびＮＦκＢ、ＥＲＫ／ＭＡＰＫ、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔおよびｐ３８シグナル伝達経路の活性化を含む機能的応答の種々の特徴を含む。加えて、ＣＤ４０Ｌ媒介ＣＤ４０刺激は、正常Ｂ細胞における分解ＰＡＲＰの低下および抗アポトーシス蛋白、ＸＩＡＰおよびＭｃｌ−１の誘導により生存シグナルを提供する。ＣＤ４０Ｌ媒介ＣＤ４０刺激はまたＴＲＡＦ２およびＴＲＡＦ３をＣＤ４０細胞質ドメインに結合させる。
次の研究により、ＣＨＩＲ−１２．１２は、正常ヒト細胞におけるこれらの全ての刺激効果を直接抑制することがわかった。例えばＣＨＩＲ−１２．１２の投与はカスパーゼ−９、カスパーゼ−３およびＰＡＲＰの増大した分解並びにＸＩＡＰおよびＭｃｌ−１の現象を時間および用量依存的な態様でもたらし、Ｂ細胞アポトーシスを再開させる。ＣＨＩＲ−１２．１２の投与はまたＣＤ４０Ｌ媒介ＣＤ４０刺激に応答したＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ）αおよびβ（ＮＦκＢ経路）、ＥＲＫ、Ａｋｔおよびｐ３８のホスホリル化を抑制している。さらにまた、ＣＨＩＲ−１２．１２は初期ＣＤ４０Ｌ媒介ＣＤ４０刺激の非存在下ではこれらのアポトーシス作用をトリガーしなかったことがわかった。
（ＣＨＩＲ−１２．１２はＰＡＲＰの分解を誘導することによりＣＤ４０リガンドにより媒介される生存を抑制する）
これらの実験においては、健常者ドナー由来の０．６ｘ１０６の正常ヒトＢ細胞（パーセント純度８５〜９５％）を１μｇ／ｍＬのｓＣＤ４０Ｌ（Ａｌｅｘｉｓ，Ｃｏｒｐ．，Ｂｉｎｇｈａｍ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）で刺激した。次にＣＨＩＲ−１２．１２（１０μｇ／ｍＬ）および対照ＩｇＧを添加した。細胞を０、２０分、２時間、６時間、１８時間および２６時間で収集した。分解カスパーゼ−９、分解カスパーゼ−３、分解ＰＡＲＰおよびβ−アクチン対照をウエスタンブロットにより細胞溶解物中で検出した。
慨すれば、ＣＤ４０Ｌ媒介ＣＤ４０刺激は経時的に分解カスパーゼ−９、分解カスパーゼ−３または分解ＰＡＲＰの増大をもたらさなかったことから、生存シグナルを与えなかったことが観察され、細胞がアポトーシスを起こしていないことが示された。しかしながら、ＣＨＩＲ−１２．１２の投与はこれらの分解産物の増大をもたらし、ＣＨＩＲ−１２．１２の投与がｓＣＤ４０Ｌ刺激正常Ｂ細胞における生存シグナル伝達に対するＣＤ４０Ｌ結合の作用を排除し、Ｂ細胞アポトーシスを再開させたことを示していた（データ示さず）。
（ＣＨＩＲ−１２．１２は「生存」抗アポトーシス蛋白の発現を抑制した）
これらの実験においては、健常者ドナー由来の０．６ｘ１０６の正常ヒトＢ細胞（パーセント純度８５〜９５％）を１μｇ／ｍＬのｓＣＤ４０Ｌ（Ａｌｅｘｉｓ，Ｃｏｒｐ．，Ｂｉｎｇｈａｍ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）で刺激した。次にＣＨＩＲ−１２．１２（１０μｇ／ｍＬ）および対照ＩｇＧを添加した。細胞を０、２０分、２時間、６時間、１８時間および２６時間で収集した。Ｍｃｌ−１、ＸＩＡＰ、ＣＤ４０およびβ−アクチン対照をウエスタンブロットにより細胞溶解物中で検出した。
慨すればｓＣＤ４０Ｌ刺激は経時的なＭｃｌ−１およびＸＩＡＰの持続的発現をもたらした。しかしながら、ｓＣＤ４０Ｌ刺激細胞にＣＨＩＲ−１２．１２を投与したところ経時的にこれらの蛋白の発現が低減した（データ示さず）。Ｍｃｌ−１およびＸＩＡＰはアポトーシス経路をブロックすることができる「生存」シグナルであるため、これらの結果はＣＨＩＲ−１２．１２投与はｓＣＤ４０Ｌ刺激正常Ｂ細胞におけるアポトーシスのブロッキングを解除することを示している。
（ＣＨＩＲ−１２．１２投与は正常Ｂ細胞におけるＩＫＫα（Ｓｅｒ１８０）およびＩＫＫβ（Ｓｅｒ１８１）のホスホリル化を抑制した）
これらの実験においては、健常者ドナー由来の１．０ｘ１０６の正常ヒトＢ細胞（パーセント純度８５〜９５％）を１μｇ／ｍＬのｓＣＤ４０Ｌ（Ａｌｅｘｉｓ，Ｃｏｒｐ．，Ｂｉｎｇｈａｍ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）で刺激した。次にＣＨＩＲ−１２．１２（１０μｇ／ｍＬ）および対照ＩｇＧを添加した。細胞を０および２０分に収集した。ホスホリル化ＩＫＫα（Ｓｅｒ１８０）およびＩＫＫβ（Ｓｅｒ１８１）および前ＩＫＫβ対照はウエスタンブロットにより細胞溶解物中で検出した。
慨すればｓＣＤ４０Ｌによる刺激は経時的なＩＫＫα（Ｓｅｒ１８０）およびＩＫＫβ（Ｓｅｒ１８１）のホスホリル化をもたらしたが、ＣＨＩＲ−１２．１２の投与がは正常Ｂ細胞においてｓＣＤ４０Ｌ刺激へのこの応答を排除した（データ示さず）。
（ＣＨＩＲ−１２．１２投与は用量依存的にＣＤ４０リガンドにより媒介される生存を抑制した）
これらの実験においては、健常者ドナー由来の０．６ｘ１０６の正常ヒトＢ細胞（パーセント純度８５〜９５％）を１μｇ／ｍＬのｓＣＤ４０Ｌ（Ａｌｅｘｉｓ，Ｃｏｒｐ．，Ｂｉｎｇｈａｍ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）で刺激した。次にＣＨＩＲ−１２．１２（０．０１，０．１、０．２，０．５、１．０μｇ／ｍＬ）および対照ＩｇＧを添加した。細胞を２４時間で収集した。分解ＰＡＲＰおよびβアクチン対照はウエスタンブロットにより細胞溶解物中で検出した。
慨すればＣＨＩＲ−１２．１２投与は用量依存的な態様でｓＣＤ４０Ｌ刺激細胞においてＰＡＲＰ分解の増大をもたらし、従って、ｓＣＤ４０Ｌ刺激正常Ｂ細胞における製造シグナル伝達経路を排除した（データ示さず）。
（ＣＨＩＲ−１２．１２は用量依存的な態様で「生存」抗アポトーシス蛋白の発現を抑制する）
これらの実験においては、健常者ドナー由来の０．６ｘ１０６の正常ヒトＢ細胞（パーセント純度８５〜９５％）を１μｇ／ｍＬのｓＣＤ４０Ｌ（Ａｌｅｘｉｓ，Ｃｏｒｐ．，Ｂｉｎｇｈａｍ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）で刺激した。次にＣＨＩＲ−１２．１２（０．５、２および１０μｇ／ｍＬ）および対照ＩｇＧを添加した。細胞を２２時間で収集した。分解ＰＡＲＰおよびβアクチン対照はウエスタンブロットにより細胞溶解物中で検出した。Ｍｃｌ−１、ＸＩＡＰ、分解ＰＡＲＰおよびβアクチン対照はウエスタンブロットにより細胞溶解物中で検出した。
慨すればＣＨＩＲ−１２．１２投与は用量依存的な態様でｓＣＤ４０Ｌ刺激細胞において低減したＭｃｌ−１およびＸＩＡＰの発現および増大したＰＡＲＰ発現をもたらし、従ってｓＣＤ４０Ｌ刺激正常Ｂ細胞におけるアポトーシス経路へのこれらのブロッキングを排除した（データ示さず）。
（ＣＨＩＲ−１２．１２は可溶性ＣＤ４０Ｌシグナル伝達の非存在下において抗アポトーシス蛋白、分解ＰＡＲＰおよびＸＩＡＰの発現に影響しなかった）
これらの実験においては、健常者ドナー由来の１．０ｘ１０６の正常ヒトＢ細胞（パーセント純度８５〜９５％）にＣＨＩＲ−１２．１２（１０μｇ／ｍＬ）および対照ＩｇＧのみを投与した（即ち抗体添加前にｓＣＤ４０Ｌによる予備刺激を細胞に与えなかった）。細胞は０，４，１４および１６時間で収集した。ＸＩＡＰ、分解ＰＡＲＰおよびβアクチン対照はウエスタンブロットにより細胞溶解物中で検出した。
慨すれば、結果はｓＣＤ４０Ｌ刺激の非存在下においては、ＩｇＧ投与対照細胞およびＣＨＩＲ−１２．１２細胞の両方において、細胞は分解ＰＡＲＰの増大した濃度を発現したのに対し、ＸＩＡＰの発現は一定のままであったことを示している（データ示さず）。これらのデータはＣＨＩＲ−１２．１２がＣＤ４０Ｌ刺激非存在下においては正常ヒトＢ細胞のアポトーシスをトリガーしないことを示している。
（ＣＨＩＲ−１２．１２は正常Ｂ細胞においてＩＫＫα（Ｓｅｒ１８０）およびＩＫＫβ（Ｓｅｒ１８１）、Ａｋｔ、ＥＲＫおよびｐ３８のホスホリル化を抑制する）
これらの実験においては、健常者ドナー由来の１．０ｘ１０６の正常ヒトＢ細胞（パーセント純度８５〜９５％）を１％ＦＢＳ含有培地中で血清枯渇させ、そして１μｇ／ｍＬのｓＣＤ４０Ｌ（Ａｌｅｘｉｓ，Ｃｏｒｐ．，Ｂｉｎｇｈａｍ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）で刺激した。培養物にＣＨＩＲ−１２．１２（１および１０μｇ／ｍＬ）および対照ＩｇＧを投与した。細胞を０および２０分間で収集した。ホスホ−ＩＫＫα、ホスホ−ＩＫＫβ、全ＩＫＫβ、ホスホＥＲＫ、全ＥＲＫ、ホスホ−Ａｋｔ、全Ａｋｔ、ホスホ−ｐ３８および全ｐ３８はウエスタンブロットにより細胞溶解物中で検出した。
慨すれば、ｓＣＤ４０Ｌ刺激はＩＫＫα／βのホスホリル化、ＥＲＫのホスホリル化、Ａｋｔのホスホリル化およびｐ３８のホスホリル化の増大をもたらし、すなわち、細胞の生存および／または増殖をもたらした。ＣＨＩＲ−１２．１２の細胞への投与は正常Ｂ細胞におけるこれらのシグナル伝達経路に対するｓＣＤ４０Ｌ刺激の作用を排除した（データ示さず）。
（ＣＨＩＲ−１２．１２はＣＤ４０シグナル伝達カスケードにおけるＰＩ３ＫおよびＭＥＫ／ＥＲＫのような多重シグナル伝達経路を抑制する）
これらの実験においては、健常者ドナー由来の１．０ｘ１０６の正常ヒトＢ細胞（パーセント純度８５〜９５％）を１％ＦＢＳ含有培地中で血清枯渇させ、そして１μｇ／ｍＬのｓＣＤ４０Ｌ（Ａｌｅｘｉｓ，Ｃｏｒｐ．，Ｂｉｎｇｈａｍ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）で刺激した。培養物にはまたＣＨＩＲ−１２．１２（１および１０μｇ／ｍＬ）、Ｗｏｒｔｍａｎｉｎ（ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ阻害剤；１および１０μＭ）、ＬＹ２９４００２（ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ阻害剤；１０および３０μＭ）およびＰＤ９８０９５（ＭＥＫ阻害剤、１０および３０μｇ／ｍＬ）を投与した。細胞を０および２０分間で収集した。ホスホ−ＥＲＫ、ホスホ−Ａｋｔ、全Ａｋｔ、ホスホ−ＩＫＫα／βおよび全体をウエスタンブロットにより細胞溶解物中で検出した。
慨すれば、結果はＣＨＩＲ−１２．１２がこれらのシグナル導入分子の全てのホスホリル化を排除したが、シグナル導入阻害剤はシグナル伝達の特定の排除のみを示しており、ＣＨＩＲ−１２．１２はＣＤ４０Ｌ刺激により媒介されるこれらのシグナル導入分子の上流を阻害すると考えられる（データ示さず）。
（ＣＨＩＲ−１２．１２は正常Ｂ細胞における細胞質ドメインへのシグナル伝達分子ＴＲＡＦ２およびＴＲＡＦ３の結合を抑制する）
これらの実験においては、健常者ドナー由来の４．０ｘ１０６の正常ヒトＢ細胞（パーセント純度８５〜９５％）を１％ＦＢＳ含有培地中で４時間血清枯渇させ、そして１μｇ／ｍＬのｓＣＤ４０Ｌ（Ａｌｅｘｉｓ，Ｃｏｒｐ．，Ｂｉｎｇｈａｍ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）で２０分間刺激した。細胞を０および２０分間で収集した。ＣＤ４０はポリクローナル抗ＣＤ４０（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＡ）で免疫沈降させ、抗ＴＲＡＦ２ｍＡｂ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＡ）、抗ＴＲＡＦ３ｍＡｂ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＡ）および抗ＣＤ４０ｍＡｂ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＡ）を用いたウエスタンブロットにおいてプロービングした。
慨すれば、結果はＴＲＡＦ２およびＴＲＡＦ３がｓＣＤ４０Ｌ刺激後にＣＤ４０で同時沈降されたことを示している。一方、ＣＨＩＲ−１２．１２の投与はｓＣＤ４０Ｌ刺激正常Ｂ細胞におけるＣＤ４０−ＴＲＡＦ２／３シグナル伝達複合体の形成を排除した。ＣＤ４０発現には変化は無かった（データ示さず）。
理論に制約されないが、これらの実験の結果および上記した実施例の結果はＣＨＩＲ−１２．１２抗体が独特の組合せの属性を有する二重作用のアンタゴニスト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体であることを示している。この完全ヒトモノクローナル抗体はＢ細胞の生存および増殖のためのＣＤ４０Ｌ媒介ＣＤ４０シグナル伝達経路をブロックし；このアンタゴニスト活性は究極的な細胞の脂肪をもたらす。ＣＨＩＲ−１２．１２はまたエフェクター細胞による認識および結合も媒介し、抗体依存性の細胞毒性（ＡＤＣＣ）を開始させる。ＣＨＩＲ−１２．１２がエフェクター細胞に結合すれば、細胞毒性酵素が放出され、Ｂ細胞のアポトーシスおよび溶解をもたらす。ＣＨＩＲ−１２．１２は前臨床腫瘍モデルにおいて比較した場合にリツキシマブよりも強力な抗腫瘍抗体である。
（実施例２１：ＮＨＬ、ＣＬＬおよびＮＭ患者由来の原発癌細胞に対するアゴニストおよびアンタゴニスト活性）
臨床研究者等との共同作業により、候補ｍＡｂをＮＨＬおよびＣＬＬおよび多発性骨髄腫患者由来の原発癌細胞に対する種々の活性（下記に列挙）について試験する。
・増殖試験におけるアゴニスト作用（８ＮＨＬ患者、８ＣＬＬ患者および８ＭＭ患者）
・増殖試験におけるアンタゴニスト活性（８ＮＨＬ患者、８ＣＬＬ患者および８ＭＭ患者）
・アネキシンＶ試験によるアポトーシス作用（３〜４ＮＨＬ患者、４ＣＬＬ患者および４ＭＭ患者）
・アネキシンＶ試験による生存シグナルの逆行（３ＮＨＬ患者、３ＣＬＬ患者および３ＭＭ患者）
・補体依存性細胞毒性（４ＮＨＬ患者、４ＣＬＬ患者および４ＭＭ患者）
・抗体依存性細胞毒性（６ＮＨＬ患者、６ＣＬＬ患者および６ＭＭ患者）
（実施例２２：毒性試験のための該当動物種の発見）
これらの２候補抗体はげっ歯類ＣＤ４０と交差反応しないため、毒性額的作用を試験するためには他の種を発見しなければならない。
２候補抗ＣＤ４０抗体が動物ＣＤ４０と交差結合する能力は、フローサイトメトリーで試験される。ラット、ウサギ、イヌ、カニクイザルおよびマーモセットサルをこの試験のために調べる。
候補抗体はヒトＢ細胞上のＣＤ４０への結合においてアンタゴニスト活性を示す。候補抗体に対して同様の応答を有する動物種を発見するために、候補抗体への結合を示す種由来のリンパ球をアンタゴニスト活性に関する増殖試験において試験する。候補抗体のアンタゴニスト活性性結合に関して選択された種由来のリンパ球は更に、ＡＤＣＣの機序を介してＣＤ４０発現リンパ腫細胞株を殺傷するためにエフェクター細胞として作用するその能力について試験する。最後に選択された動物種を候補抗体の組織結合パターンに関するＩＨＣ試験において試験する。ヒト細胞について観察されたものと同様の態様においてこれらの試験で候補抗体に応答する動物種を毒性額的試験のために選択する。
初回の試験は候補抗ＣＤ４０ｍＡｂがカニクイザルＣＤ４０と交差反応することを示している。
（実施例２３：ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２の腫瘍ターゲティングプロファイル）
ＣＨＩＲ−１２．１２およびＣＨＩＲ−５．９ｍＡｂの相対的腫瘍ターゲティングプロファイルを調べるために、蛍光標識候補ｍＡｂおよびアイソタイプ対照抗体を腫瘍担持マウスに投与する。腫瘍標本および正常臓器を投与後種々の時点で採取する。腫瘍および正常臓器内の標識抗体の蓄積を分析する。
（実施例２４：ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２の作用機序）
ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２ｍＡｂによる腫瘍生育抑制を媒介する機序を解明するために、以下の試験を行う。
Ｆｃ−受容体ノックアウトまたはブロックモデル：ＡＤＣＣはＦｃ受容体を介した抗体のＦｃ部分へのＮＫ、マクロファージおよび単球のようなエフェクター細胞の結合により媒介される。Ｆｃ受容体並びにこれらの受容体へのＦｃ結合を妨害するように操作された抗体の活性化において不全であるマウスはＡＤＣＣ媒介腫瘍生育抑制をブロックする。このモデルにおける腫瘍の消失または有意な減少はこれらの２候補ｍＡｂによる腫瘍増殖の抑制がＡＤＣＣ機序により主に媒介されていることを示唆している。
（実施例２５：アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体のための液体薬学的処方物）
本試験の目的は生物物理額的および生物化学的な方法の両方によりアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体ＣＨＩＲ−１２．１２の安定性に対する溶液ｐＨの影響を検討することによりこの抗体のための旨適な溶液環境を選択することであった。示差操作熱量分析（ＤＳＣ）の結果によれば、ＣＨＩＲ−１２．１２のコンホーメーション安定性はｐＨ５．５〜６．５を有する処方物において旨適となった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズエクスクルージョンＨＰＬＣ（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）およびカチオン交換ＨＰＬＣ（ＣＥＸ−ＨＰＬＣ）分析の組合せに基づけばＣＨＩＲ−１２．１２の物理化学的安定性は約５．０〜５．５のｐＨにおいて旨適となった。これらの結果に基づけば、この抗体を含む１つの推奨される液体薬学的処方物は約１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、約１５０ｍＭの塩化ナトリウムを中に製剤され、約５．５のｐＨを有する約２０ｍｇ／ｍＬのＣＨＩＲ−１２．１２を含む処方物である。
（材料および方法）
処方物試験に使用したＣＨＩＲ−１２．１２はＣＨＯ細胞培養方法により生産したヒトモノクローナル抗体である。このｍＡｂは分子量１５０ｋＤａを有し、そして、ジスルフィド結合により連結された２つの軽鎖および２つの重鎖よりなる。これを種々の癌および自己免疫／炎症性疾患の処置のために、正常および悪性のＢ細胞を含むＣＤ４０発現細胞上のＣＤ４０細胞表面受容体に対してターゲティングさせる。
本試験のために使用した抗ＣＤ４０薬剤物質はＣＨＯ誘導精製抗ＣＤ４０（ＣＨＩＲ−１２．１２）バルクロットであった。薬剤物質の組成は１０ｍＭクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．５中９．７ｍｇ／ｍＬＣＨＩＲ−１２．１２抗体であった。試験における対照試料は受領した薬剤物質であり、その後≦−６０℃で凍結し、室温で解凍し、そして所定時点において安定性試料と共に試験した。安定性試料は種々のｐＨの溶液に対して薬剤物質を透析することにより調製し、そして各試料のＣＨＩＲ−１２．１２濃度は表２０に示す通りＵＶ２８０により測定した。
Figure 2008502309
 種々の処方物におけるＣＨＩＲ−１２．１２の物理化学的安定性は以下のプロトコルを用いて試験した。
（示差走査熱量分析（ＤＳＣ））
種々の処方物試料のコンホーメーション安定性は１℃／分で１５℃から９０℃まで加熱しながらＭｉｃｒｏ ＣａｌＶＰ−ＤＳＣを用いてモニタリングした。
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
フラグメント化および凝集は非還元および還元条件下において４〜２０％トリスグリシンゲルを用いて推定した。蛋白はクーマシーブルー染色により検出した。
（サイズエクスクルージョンクロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ））
蛋白のフラグメント化および凝集は更にＷａｔｅｒ Ａｌｌｉａｎｃｅ ＨＰＬＣによりＴｏｓｏｈａｓｓ ＴＳＫ−ＧＥＬ ３０００ＳＷＸＬカラム、移動相として１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０を用いながら０．７ｍＬ／分の流量で測定した。
（カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ−ＨＰＬＣ））
電荷変化関連の分解はＷａｔｅｒｓ ６００ｓＨＰＬＣシステムによりＤｉｏｎｅｘ Ｐｒｏｐａｃ ＷＣＸ−１０カラム、移動相Ａとして５０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３および移動層Ｂとして５００ｍＭ ＮａＣｌ含有５０ｍＭ ＨＥＰＳ、ｐＨ７．３を用いながら０．５℃／分の流量で測定した。
（結果および考察）
（コンホーメーション安定性試験）
ＣＨＩＲ−１２．１２の熱による展開（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）は少なくとも２種の熱遷移を示しており、恐らくはそれぞれＦａｂおよびＦｃドメインの展開と融解を表わしていると考えられる。より高温においては、蛋白は凝集し、ＤＳＣシグナルは消失すると推定される。処方物スクリーニング目的のために、本試験においては最低熱遷移温度を融点、即ちＴｍと定義した。図１３は処方物のｐＨの関数として熱融解温度を示す。ｐＨ５．５〜６．５の処方物はより高い熱融解温度により明らかにされる通り、より高いコンホーメーション安定性を有する抗ＣＤ４０をもたらした。
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析）
ｐＨ４．５〜９．０のＣＨＩＲ−１２．１２処方物試料を２ヶ月４０℃でインキュベート氏、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に付した（データ示さず）。非還元条件下では、ｐＨ５．５より高値の処方物においては２３ｋＤａおよび２７ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する物質種が観察され、全ての処方物において５１ｋＤａのＭＷを有する物質種が観察されたが、ｐＨ５．０〜５．５ではより少量であった。１００ｋＤａのＭＷを有する物質種がｐＨ７．５およびｐＨ９．０で観察された。
還元条件下ではＣＨＩＲ−１２．１２はそれぞれ５０ｋＤａおよび２４ｋＤａの遊離の重鎖および軽鎖に分解された。１００ｋＤａの物質種は完全に還元可能とは考えられず、溶液ｐＨの上昇に伴って増大し、非ジスルフィドの共有結合的会合が分子内に起こっていると考えられた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは実体未知である他の物質種が存在したため、各処方物の安定性の比較はＣＨＩＲ−１２．１２の残存純度に基づいている。ｐＨ５．０〜６．０の処方物はＣＨＩＲ−１２．１２に対してより安定な環境をもたらした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは凝集は殆ど検出されなかった（データ示さず）。
（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析）
ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析は主要ピーク物質種として未損傷のＣＨＩＲ−１２．１２を、主要ピーク物質種から分離した前ピーク物質種として凝集物質種を、主要ピーク物質種の広報のショルダーピークとして大型フラグメント物質種を検出し、そして小型フラグメント物質種が主要ピーク物質種後方に検出された。５℃および２５℃で３ヶ月インキュベートした後、蛋白フラグメントおよび凝集物の無視できる量（＜１．０％）が上記処方物中に検出され、そしてＣＨＩＲ−１２．１２の主要ピーク物質種は９９％純度より高値のままであった（データ示さず）。しかしながら、表２１に示す通り、４０℃で保存すると蛋白フラグメントが徐々に形成され、そしてｐＨ４．５およびｐＨ６．５〜９．０においてはより多くのフラグメントが形成された。３ヶ月４０℃でＣＨＩＲ−１２．１２処方物をインキュベートした後、約２〜３％の凝集物がｐＨ７．５およびｐＨ９．０で検出されたが、他のｐＨの処方物では１％未満の凝集塊が検出された（データ示さず）。ＳＥＣ−ＨＰＬＣ結果はＣＨＩＲ−１２．１２がｐＨ約５．０〜６．０でより安定であることを示している。
Figure 2008502309
 （ＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析）
ＣＥＸ−ＨＰＬＣは主要ピーク物質種としての未損傷のＣＨＩＲ−１２．１２、主要ピーク物質種より早く溶離する酸性変異体、および主要ピーク物質種より後方に溶離するＣ末端リジン付加変異体を検出した。表２２は残存主要ピークＣＨＩＲ−１２．１２物質種および酸性変異体のパーセンテージの溶液ｐＨへの依存性を示す。対照試料は既に高水準の酸性物質種（〜３３％）を含有しており、これはおそらくは早期の醗酵および精製工程によるものと考えられる。より高いｐＨの溶液に対するＣＨＩＲ−１２．１２の感受性は２つの事実により顕在化する。第１に、ｐＨ９．０の初期処方物試料（ｔ＝０）は既に対照より１２％多い酸性物質種を形成している。第２に、酸性物質種のパーセンテージはｐＨ上昇に伴って急激に増大している、電荷変化関連分解は脱アミド化に起因すると考えられる。上記したデータはこの型のＣＨＩＲ−１２．１２の分解はｐＨ約５．０〜５．５において最小限となったことを示している。
Figure 2008502309
 （結論）
ｐＨはＣＨＩＲ−１２．１２のコンホーメーションおよび物理化学的安定性に対して有意な作用を有している。電荷変化関連分解はＣＨＩＲ−１２．１２の主要分解経路であると判明し、これはｐＨ５．０〜５．５で最小限となった。全体的な安定性のデータに基づけば、この抗体を含む１つの推奨される液体薬学的処方物は約１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、約１５０ｍＭの塩化ナトリウムを中に製剤され、約５．５のｐＨを有する約２０ｍｇ／ｍＬのＣＨＩＲ−１２．１２を含む処方物である。
（実施例２６：ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２を用いた臨床試験）
（臨床目標）
全体的な臨床目標はＢ細胞腫瘍の効果的な処置を、抗ＣＤ４０ＩｇＧ１でそれらをターゲティングすることにより行うことである。これらの腫瘍はＢ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症および全身キャッスルマン病を包含する。これらの疾患に関するシグナルは、第Ｉ相において活性の一部の尺度が得られると考えられるが、第ＩＩ相において決定される。当初は薬剤を単一剤として検討するが、開発が進行するに従って化学療法および他の抗体と組み合わせられる。
（第Ｉ相）
・安全性と薬物動態を評価−Ｂ細胞悪性疾患対象における用量漸増
・安全性、耐容性およびＣＤ４０の結成マーカーの変化に基づいて用量を選択。一般的にＭＴＤを調べるが、薬効の他の指標（ＣＤ４０＋Ｂ細胞の枯渇等）も用量設定のために十分である。
・特に異なる適応症に対して１用量より多くを検討、例えばＣＬＬ用量はＮＨＬ用量と異なってよい。即ち第ＩＩ相においては何らかの用量設定が必要となる場合がある。
・患者はリアルタイム薬物動態（Ｐｋ）サンプリングとともに毎週投与する。初期は４週間のサイクルが可能な最大投薬である。Ｐｋは検討する疾患、ＣＤ４０の密度等に応じて大きく変動する場合がある。
・本治験はＢ細胞リンパ腫、ＣＬＬおよび潜在的に他のＢ細胞悪性疾患を有する対象に対してオープンとする。
・試験の中断または継続の判断は安全性、用量および抗腫瘍活性の予備的兆候に基づく。
・応答率により測定された薬剤の活性を第ＩＩ相において測定する。
・第ＩＩ相の用量の発見。
（第ＩＩ相）
Ｂ細胞リンパ腫、ＣＬＬおよび多発性硬化症（ＭＭ）を集中的に上記した腫瘍型において数種の治験を開始する。軽度悪性および中等度／高度悪性のＮＨＬにおいては、ＣＤ４０はリンパ腫の程度に応じて異なる機能を有する場合があるため別の治験が必要となる場合がある。軽度悪性疾患の場合はＣＤ４０は生存因子としてより機能し、アポトーシスを防止する。より高度な悪性の疾患の場合はＣＤシグナル伝達の中断は細胞死をもたらす場合がある。１種より多い用量、および１種より多いスケジュールを無作為第ＩＩ相設定において試験してよい。
各疾患において、現在の標準的療法が失敗している集団をターゲティング
する。
・ＣＬＬ：Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）および化学療法に対して抵抗性であった患者。
・軽度悪性ＮＨＬ：Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）またはＣＨＯＰ−Ｒ不成功例。
・中等度悪性ＮＨＬ：ＣＨＯＰ−Ｒ不成功例。
・多発性骨髄腫：化学療法不成功例。
＊試験の中断または継続の判断は第ＩＩ相における処置コンセプトの証明に基づく。
＊代用マーカーを臨床薬効の早期指標として使用できるかどうか判断する。
＊第ＩＩＩ相の用量を発見。
（第ＩＩＩ相）
第ＩＩＩ相は第ＩＩ相においてどこでシグナルを検出したか、およびどのような競合的治療法が標準と考えられるかによる。シグナルが処置の標準がないような疾患の段階にある場合、シングルアームの十分コントロールされた試験を中核的治験として使用する。標準と考えられる競合薬剤がある場合は、ｈｅａｄ−ｔｏ−ｈｅａｄの試験を実施する。
本明細書に記載した発明の多くの変形例および他の実施形態は本発明が上記説明および添付図面において提示した教示内容の利点を有する本発明の関わる分野の当業者には自明である。従って、本発明は開示した特定の実施形態に限定されるものではなく、そして変形例および他の実施形態は添付の請求項および本明細書に開示した実施形態の範囲に包含されるものとする。本明細書においては特定の用語を使用したが、それらは包括的および説明用途の意味においてのみ使用されており、限定を意図しない。
本明細書において言及した全ての公開物および特許出願は本発明が関わる分野の当業者の技術水準を示している。全ての公開物および特許出願は各々の公開物または特許出願が特定的および個々に参照により本明細書に組み込まれる場合と同様の程度にまで参照により本明細書に組み込まれる。
Figure 2008502309
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図１はリンパ腫細胞株（Ｒａｍｏｓ）の表面上のＣＤ４０へのＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体の結合を示す。 図２Ａおよび２ＢはＣＤ４０リガンドと相対比較した場合のＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗ＣＤ４０抗体の結合特性を示す。図２Ａは細胞表面ＣＤ４０へのＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体の結合がその後のＣＤ４０リガンド結合を防止することを示している。図２ＢはＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体が細胞表面ＣＤ４０に予備結合したＣＤ４０リガンドを競合排除できることを示している。 図２Ａおよび２ＢはＣＤ４０リガンドと相対比較した場合のＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗ＣＤ４０抗体の結合特性を示す。図２Ａは細胞表面ＣＤ４０へのＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体の結合がその後のＣＤ４０リガンド結合を防止することを示している。図２ＢはＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体が細胞表面ＣＤ４０に予備結合したＣＤ４０リガンドを競合排除できることを示している。 図３Ａおよび３Ｂは非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）患者のリンパ節由来の癌細胞に対する候補モノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２のＡＤＣＣ活性を示す。単離直後（図３Ａ）または３７℃一夜培養後（図３Ｂ）のいずれかの正常なボランティアドナー由来のリッチ化ＮＫ細胞をこの試験のエフェクター細胞として使用した。ＮＨＬ細胞はリツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））の標的抗原であるＣＤ２０も発現するため、候補ｍＡｂのＡＤＣＣ活性はリツキシマブのものと比較した。 図３Ａおよび３Ｂは非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）患者のリンパ節由来の癌細胞に対する候補モノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２のＡＤＣＣ活性を示す。単離直後（図３Ａ）または３７℃一夜培養後（図３Ｂ）のいずれかの正常なボランティアドナー由来のリッチ化ＮＫ細胞をこの試験のエフェクター細胞として使用した。ＮＨＬ細胞はリツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））の標的抗原であるＣＤ２０も発現するため、候補ｍＡｂのＡＤＣＣ活性はリツキシマブのものと比較した。 図４は非段階型（ｕｎｓｔａｇｅｄ）ヌードマウス異種移植片Ｂ細胞リンパ腫（Ｎａｍａｌｗａ）モデルを用いてリツキシマブと比較したモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２のインビボの抗腫瘍活性を示す。 図５は非段階型（ｕｎｓｔａｇｅｄ）ヌードマウス異種移植片Ｂ細胞リンパ腫（Ｄａｕｄｉ）モデルを用いてリツキシマブと比較したモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２のインビボの抗腫瘍活性を示す。ＲＣ、腫瘍攻撃に対する耐性。 図６は段階型（ｓｔａｇｅｄ）ヌードマウス異種移植片Ｂ細胞リンパ腫（Ｄａｕｄｉ）モデルを用いてリツキシマブと比較したモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９およびＣＨＩＲ−１２．１２のインビボの抗腫瘍活性を示す。ＣＲ、完全な後退。 図７はＮａｍａｌｗａおよびＤａｕｄｉ細胞上のＣＤ２０およびＣＤ４０分子の数を測定するために使用したプロトコルを示す。 図８はＤａｕｄｉリンパ腫細胞に対するｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２およびリツキシマブの比較ＡＤＣＣを示す。 図９はｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２の軽鎖および重鎖に関するアミノ酸配列を示す。軽鎖のリーダー（配列番号２の残基１〜２０）、可変（配列番号２の残基２１〜１３２）および定常（配列番号２の残基１３３〜２３９）領域を図９Ａに示す。重鎖のリーダー（配列番号４の残基１〜１９）、可変（配列番号４の残基２０〜１３９）および定常（配列番号４の残基１４０〜４６９）領域を図９Ｂに示す。図９Ｂに示すｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２の重鎖に関する代替の定常領域は配列番号４の１５３位のアラニン残基に対するセリン残基の置換を反映している。ｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２の重鎖のこの変異体の完全な配列は配列番号５に示す。 図１０はｍＡｂ ＣＨＩＲ−１２．１２に関する軽鎖（図１０Ａ；配列番号１）および重鎖（図１０Ｂ；配列番号３）に関するコーディング配列を示す。 図１１はｍＡｂ ＣＨＩＲ−５．９の軽鎖および重鎖に関するアミノ酸配列を示す。軽鎖のリーダー（配列番号６の残基１〜２０）、可変（配列番号６の残基２１〜１３２）および定常（配列番号６の残基１３３〜２３９）領域を図１１Ａに示す。重鎖のリーダー（配列番号７の残基１〜１９）、可変（配列番号７の残基２０〜１４４）および定常（配列番号７の残基１４５〜４７４）領域を図１１Ｂに示す。図１１Ｂに示すｍＡｂ ＣＨＩＲ−５．９の重鎖に関する代替の定常領域は配列番号７の１５８位のアラニン残基に対するセリン残基の置換を反映している。ｍＡｂ ＣＨＩＲ−５．９の重鎖のこの変異体の完全な配列は配列番号８に示す。 図１２はヒトＣＤ４０の短アイソフォーム（図１２Ｂのアミノ酸配列；配列番号１０）のコーディング配列（図１２Ａ；配列番号９）およびヒトＣＤ４０の長アイソフォーム（図１２Ｄのアミノ酸配列）のコーディング配列（図１２Ｃ；配列番号１１）を示す。 図１２はヒトＣＤ４０の短アイソフォーム（図１２Ｂのアミノ酸配列；配列番号１０）のコーディング配列（図１２Ａ；配列番号９）およびヒトＣＤ４０の長アイソフォーム（図１２Ｄのアミノ酸配列）のコーディング配列（図１２Ｃ；配列番号１１）を示す。 図１３は示差走査熱量計（ＤＳＣ）により測定した異なるｐＨの処方物におけるＣＨＩＲ−１２．１２の熱溶融温度を示す。

Claims (54)

  1. ヒトＣＤ４０発現細胞の表面上に発現されるヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合し得るヒトモノクローナル抗体であって、該モノクローナル抗体は、有意なアゴニスト活性を有さず、ここで該モノクローナル抗体は、モノクローナルキメラ抗ＣＤ２０モノクローナル抗体ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８の等しい量に対して増加された抗腫瘍活性を示し、ここで該抗腫瘍活性は、ＤａｕｄｉヒトＢリンパ腫細胞株を用いた段階型ヌードマウス異種移植片腫瘍モデルにおいてアッセイされる、ヒトモノクローナル抗体。
  2. 請求項１に記載のヒトモノクローナル抗体であって、該抗体は、
    ａ）モノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２；
    ｂ）特許寄託番号ＰＴＡ−５５４３としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株１２．１２により生産されるモノクローナル抗体；
    ｃ）配列番号２に示される配列、配列番号４に示される配列、配列番号５に示される配列、配列番号２および配列番号４に示される両方の配列、ならびに配列番号２および配列番号５に示される両方の配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体；
    ｄ）配列番号１に示される配列、配列番号３に示される配列、ならびに配列番号１および配列番号３に示される両方の配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体；
    ｅ）該ハイブリドーマ細胞株１２．１２により生産されるモノクローナル抗体に結合し得るエピトープに結合するモノクローナル抗体；
    ｆ）配列番号１０または配列番号１２に示されるヒトＣＤ４０配列の残基８２〜８７を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体；
    ｇ）競合結合アッセイにおいてモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２と競合するモノクローナル抗体；
    ｈ）前述の項目ａ）のモノクローナル抗体、または、前述の項目ｃ）〜ｇ）のいずれか１項のモノクローナル抗体であって、ここで該抗体は、組み換え的に生産される、モノクローナル抗体；ならびに、
    ｉ）前述の項目ａ）〜ｈ）のいずれか１項のモノクローナル抗体の抗原結合フラグメントであるモノクローナル抗体であって、ここで該フラグメントは該ヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合する能力を保持する、モノクローナル抗体
    からなる群より選択される、モノクローナル抗体。
  3. 前記モノクローナル抗体が、少なくとも約１０−６Ｍ〜約１０−１２Ｍの親和性（ＫＤ）で、前記ヒトＣＤ４０抗原に結合する、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
  4. 請求項１に記載のモノクローナル抗体を生産し得る、ハイブリドーマ細胞株。
  5. ＣＤ４０の発現によって特徴付けられる癌を処置するための方法であって、該方法は、
    請求項１に記載のヒト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体の有効量をヒト患者に投与する工程
    を包含する、方法。
  6. 前記癌が、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫、高度悪性Ｂ細胞リンパ腫、中等度悪性Ｂ細胞リンパ腫、軽度悪性Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、骨髄芽球性白血病およびホジキン病からなる群より選択される請求項５に記載の方法。
  7. ヒトＣＤ４０発現細胞の表面上に発現されるヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合し得るヒトモノクローナル抗体であって、該モノクローナル抗体は、有意なアゴニスト活性を有さず、これにより、該モノクローナル抗体が該細胞の表面上に発現された該ＣＤ４０抗原に結合した場合、該細胞の増殖または分化が阻害され、ここで該抗体は、
    ａ）モノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９またはＣＨＩＲ−１２．１２；
    ｂ）ハイブリドーマ細胞株５．９またはハイブリドーマ細胞株１２．１２により生産されるモノクローナル抗体；
    ｃ）配列番号６に示される配列、配列番号７に示される配列、配列番号８に示される配列、配列番号６および配列番号７に示される両方の配列、ならびに配列番号６および配列番号８に示される両方の配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体；
    ｄ）配列番号２に示される配列、配列番号４に示される配列、配列番号５に示される配列、配列番号２および配列番号４に示される両方の配列、ならびに配列番号２および配列番号５に示される両方の配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体；
    ｅ）配列番号１に示される配列、配列番号３に示される配列、ならびに配列番号１および配列番号３に示される両方の配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体；
    ｆ）ハイブリドーマ細胞株５．９またはハイブリドーマ細胞株１２．１２により生産されるモノクローナル抗体に結合し得るエピトープに結合するモノクローナル抗体；
    ｇ）配列番号１０または配列番号１２に示されるヒトＣＤ４０配列の残基８２〜８７を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体；
    ｈ）配列番号１０または配列番号１２に示されるヒトＣＤ４０配列の残基８２〜８９を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体；
    ｉ）競合結合アッセイにおいてモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９またはＣＨＩＲ−１２．１２と競合するモノクローナル抗体；
    ｊ）前述の項目ａ）のモノクローナル抗体、または、前述の項目ｃ）〜ｉ）のいずれか１項のモノクローナル抗体であって、ここで該抗体は、組み換え的に生産される、モノクローナル抗体；ならびに、
    ｋ）前述の項目ａ）〜ｊ）のいずれか１項のモノクローナル抗体の抗原結合フラグメントであるモノクローナル抗体であって、ここで該フラグメントは、該ヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合する能力を保持する、モノクローナル抗体
    からなる群より選択される、モノクローナル抗体。
  8. 前記フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメントおよび単鎖Ｆｖフラグメントからなる群より選択される、請求項７に記載の抗原結合フラグメント。
  9. 前記モノクローナル抗体が、少なくとも約１０−６Ｍ〜約１０−１２Ｍの親和性（ＫＤ）で、前記ヒトＣＤ４０抗原に結合する、請求項７に記載のモノクローナル抗体。
  10. 配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８に示される配列からなる群より選択される、アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。
  11. ヒトＣＤ４０発現細胞の表面上に発現されるヒトＣＤ４０抗原に対する特異性を有するヒトモノクローナル抗体を生産し得るハイブリドーマ細胞株であって、これにより該モノクローナル抗体は、有意なアゴニスト活性を有さず、これにより、該モノクローナル抗体が該細胞の表面上に発現された該ＣＤ４０抗原に結合する場合、該細胞の増殖または分化が阻害され、そしてここで該モノクローナル抗体は、
    ａ）モノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９またはＣＨＩＲ−１２．１２；
    ｂ）ハイブリドーマ細胞株５．９またはハイブリドーマ細胞株１２．１２により生産されるモノクローナル抗体；
    ｃ）配列番号６に示される配列、配列番号７に示される配列、配列番号８に示される配列、配列番号６および配列番号７に示される両方の配列、ならびに配列番号６および配列番号８に示される両方の配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体；
    ｄ）配列番号２に示される配列、配列番号４に示される配列、配列番号５に示される配列、配列番号２および配列番号４に示される両方の配列、ならびに配列番号２および配列番号５に示される両方の配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体；
    ｅ）配列番号１に示される配列、配列番号３に示される配列、ならびに配列番号１および配列番号３に示される両方の配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体；
    ｆ）ハイブリドーマ細胞株５．９またはハイブリドーマ細胞株１２．１２により生産されるモノクローナル抗体に結合し得るエピトープに結合するモノクローナル抗体；
    ｇ）配列番号１０または配列番号１２に示されるヒトＣＤ４０配列の残基８２〜８７を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体；
    ｈ）配列番号１０または配列番号１２に示されるヒトＣＤ４０配列の残基８２〜８９を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体；
    ｉ）競合結合アッセイにおいてモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９またはＣＨＩＲ−１２．１２と競合するモノクローナル抗体；ならびに、
    ｊ）ａ）〜ｉ）のモノクローナル抗体の抗原結合フラグメントであるモノクローナル抗体であって、ここで該フラグメントは、該ヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合する能力を保持する、モノクローナル抗体
    からなる群より選択される、ハイブリドーマ細胞株。
  12. 正常ヒトＢ細胞の増殖または分化を阻害するための方法であって、該方法は、
    有効量のヒト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体に該Ｂ細胞を接触させる工程
    を包含し、該ヒト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体は、
    ａ）モノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９またはＣＨＩＲ−１２．１２；
    ｂ）ハイブリドーマ細胞株５．９またはハイブリドーマ細胞株１２．１２により生産されるモノクローナル抗体；
    ｃ）配列番号６に示される配列、配列番号７に示される配列、配列番号８に示される配列、配列番号６および配列番号７に示される両方の配列、ならびに配列番号６および配列番号８に示される両方の配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体；
    ｄ）配列番号２に示される配列、配列番号４に示される配列、配列番号５に示される配列、配列番号２および配列番号４に示される両方の配列、ならびに配列番号２および配列番号５に示される両方の配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体；
    ｅ）配列番号１に示される配列、配列番号３に示される配列、ならびに配列番号１および配列番号３に示される両方の配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体；
    ｆ）ハイブリドーマ細胞株５．９またはハイブリドーマ細胞株１２．１２により生産されるモノクローナル抗体に結合し得るエピトープに結合するモノクローナル抗体；
    ｇ）配列番号１０または配列番号１２に示されるヒトＣＤ４０配列の残基８２〜８７を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体；
    ｈ）配列番号１０または配列番号１２に示されるヒトＣＤ４０配列の残基８２〜８９を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体；
    ｉ）競合結合アッセイにおいてモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９またはＣＨＩＲ−１２．１２と競合するモノクローナル抗体；
    ｊ）前述の項目ａ）のモノクローナル抗体、または、前述の項目ｃ）〜ｉ）のいずれか１項のモノクローナル抗体であって、ここで該抗体は、組み換え的に生産される、モノクローナル抗体；ならびに、
    ｋ）前述の項目ａ）〜ｊ）のいずれか１項のモノクローナル抗体の抗原結合フラグメントであるモノクローナル抗体であって、ここで該フラグメントは、該ヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合する能力を保持する、モノクローナル抗体
    からなる群より選択され、該抗体またはそのフラグメントは、有意なアゴニスト活性を有さず、そしてそれにより該抗体またはその抗原結合フラグメントが、該Ｂ細胞上の該ＣＤ４０抗原に結合する場合、該Ｂ細胞の増殖または分化が阻害される、方法。
  13. 前記モノクローナル抗体またはそのフラグメントが、少なくとも約１０−６Ｍ〜約１０−１２Ｍの親和性（ＫＤ）で、前記ヒトＣＤ４０抗原に結合する、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメントおよび単鎖Ｆｖフラグメントからなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
  15. 正常ヒトＢ細胞の増殖を阻害するための方法であって、ここで該増殖は、該Ｂ細胞の表面上に発現されるＣＤ４０抗原とのＣＤ４０リガンドの相互作用により増強され、該方法は、
    有効量のヒト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体に該Ｂ細胞を接触させる工程
    を包含し、該ヒト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体は、
    ａ）モノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９またはＣＨＩＲ−１２．１２；
    ｂ）ハイブリドーマ細胞株５．９またはハイブリドーマ細胞株１２．１２により生産されるモノクローナル抗体；
    ｃ）配列番号６に示される配列、配列番号７に示される配列、配列番号８に示される配列、配列番号６および配列番号７に示される両方の配列、ならびに配列番号６および配列番号８に示される両方の配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体；
    ｄ）配列番号２に示される配列、配列番号４に示される配列、配列番号５に示される配列、配列番号２および配列番号４に示される両方の配列、ならびに配列番号２および配列番号５に示される両方の配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体；
    ｅ）配列番号１に示される配列、配列番号３に示される配列、ならびに配列番号１および配列番号３に示される両方の配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体；
    ｆ）ハイブリドーマ細胞株５．９またはハイブリドーマ細胞株１２．１２により生産されるモノクローナル抗体に結合し得るエピトープに結合するモノクローナル抗体；
    ｇ）配列番号１０または配列番号１２に示されるヒトＣＤ４０配列の残基８２〜８７を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体；
    ｈ）配列番号１０または配列番号１２に示されるヒトＣＤ４０配列の残基８２〜８９を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体；
    ｉ）競合結合アッセイにおいてモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９またはＣＨＩＲ−１２．１２と競合するモノクローナル抗体；
    ｊ）前述の項目ａ）のモノクローナル抗体、または、前述の項目ｃ）〜ｉ）のいずれか１項のモノクローナル抗体であって、ここで該抗体は、組み換え的に生産される、モノクローナル抗体；ならびに、
    ｋ）前述の項目ａ）〜ｊ）のいずれか１項のモノクローナル抗体の抗原結合フラグメントであるモノクローナル抗体であって、ここで該フラグメントは、該ヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合する能力を保持する、モノクローナル抗体
    からなる群より選択され、該抗体またはそのフラグメントは、有意なアゴニスト活性を有さず、そしてこれにより、該抗体またはそのフラグメントが、該Ｂ細胞上の該ＣＤ４０抗原に結合した場合、該Ｂ細胞の増殖または分化が阻害される、方法。
  16. 前記モノクローナル抗体が、少なくとも約１０−６Ｍ〜約１０−１２Ｍの親和性（ＫＤ）で、前記ヒトＣＤ４０抗原に結合する、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメントおよび単鎖Ｆｖフラグメントからなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
  18. ヒト患者においてＢ細胞による抗体生産を阻害するための方法であって、該方法は、
    有効量のヒト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体またはそのフラグメントをヒト患者に投与する工程
    を包含し、該ヒト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体は、
    ａ）モノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９またはＣＨＩＲ−１２．１２；
    ｂ）ハイブリドーマ細胞株５．９またはハイブリドーマ細胞株１２．１２により生産されるモノクローナル抗体；
    ｃ）配列番号６に示される配列、配列番号７に示される配列、配列番号８に示される配列、配列番号６および配列番号７に示される両方の配列、ならびに配列番号６および配列番号８に示される両方の配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体；
    ｄ）配列番号２に示される配列、配列番号４に示される配列、配列番号５に示される配列、配列番号２および配列番号４に示される両方の配列、ならびに配列番号２および配列番号５に示される両方の配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体；
    ｅ）配列番号１に示される配列、配列番号３に示される配列、ならびに配列番号１および配列番号３に示される両方の配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体；
    ｆ）ハイブリドーマ細胞株５．９またはハイブリドーマ細胞株１２．１２により生産されるモノクローナル抗体に結合し得るエピトープに結合するモノクローナル抗体；
    ｇ）配列番号１０または配列番号１２に示されるヒトＣＤ４０配列の残基８２〜８７を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体；
    ｈ）配列番号１０または配列番号１２に示されるヒトＣＤ４０配列の残基８２〜８９を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体；
    ｉ）競合結合アッセイにおいてモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９またはＣＨＩＲ−１２．１２と競合するモノクローナル抗体；
    ｊ）前述の項目ａ）のモノクローナル抗体、または、前述の項目ｃ）〜ｉ）のいずれか１項のモノクローナル抗体であって、ここで該抗体は、組み換え的に生産される、モノクローナル抗体；ならびに、
    ｋ）前述の項目ａ）〜ｊ）のいずれか１項のモノクローナル抗体の抗原結合フラグメントであるモノクローナル抗体であって、ここで該フラグメントは、該ヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合する能力を保持する、モノクローナル抗体
    からなる群より選択され、該抗体またはそのフラグメントは、有意なアゴニスト活性を有さず、そしてこれにより、該抗体またはそのフラグメントが該Ｂ細胞上の該ＣＤ４０抗原に結合した場合、該Ｂ細胞の増殖または分化が阻害される、方法。
  19. 前記モノクローナル抗体が、少なくとも約１０−６Ｍ〜約１０−１２Ｍの親和性（ＫＤ）で、前記ヒトＣＤ４０抗原に結合する、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメントおよび単鎖Ｆｖフラグメントからなる群より選択される、請求項１８に記載の方法。
  21. Ｂ細胞株の癌細胞の増殖を阻害するための方法であって、該方法は、
    有効量のヒト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体に該癌細胞を接触させる工程
    を包含し、該ヒト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体は、
    ａ）モノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９またはＣＨＩＲ−１２．１２；
    ｂ）ハイブリドーマ細胞株５．９またはハイブリドーマ細胞株１２．１２により生産されるモノクローナル抗体；
    ｃ）配列番号６に示される配列、配列番号７に示される配列、配列番号８に示される配列、配列番号６および配列番号７に示される両方の配列、ならびに配列番号６および配列番号８に示される両方の配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体；
    ｄ）配列番号２に示される配列、配列番号４に示される配列、配列番号５に示される配列、配列番号２および配列番号４に示される両方の配列、ならびに配列番号２および配列番号５に示される両方の配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体；
    ｅ）配列番号１に示される配列、配列番号３に示される配列、ならびに配列番号１および配列番号３に示される両方の配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体；
    ｆ）ハイブリドーマ細胞株５．９またはハイブリドーマ細胞株１２．１２により生産されるモノクローナル抗体に結合し得るエピトープに結合するモノクローナル抗体；
    ｇ）配列番号１０または配列番号１２に示されるヒトＣＤ４０配列の残基８２〜８７を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体；
    ｈ）配列番号１０または配列番号１２に示されるヒトＣＤ４０配列の残基８２〜８９を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体；
    ｉ）競合結合アッセイにおいてモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９またはＣＨＩＲ−１２．１２と競合するモノクローナル抗体；
    ｊ）前述の項目ａ）のモノクローナル抗体、または、前述の項目ｃ）〜ｉ）のいずれか１項のモノクローナル抗体であって、ここで該抗体は、組み換え的に生産される、モノクローナル抗体；ならびに、
    ｋ）前述の項目ａ）〜ｊ）のいずれか１項のモノクローナル抗体の抗原結合フラグメントであるモノクローナル抗体であって、ここで該フラグメントは、該ヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合する能力を保持する、モノクローナル抗体
    からなる群より選択され、該抗体またはそのフラグメントは、有意なアゴニスト活性を有さず、そしてこれにより、該抗体またはそのフラグメントが該Ｂ細胞上の該ＣＤ４０抗原に結合した場合、該Ｂ細胞の増殖または分化が阻害される、方法。
  22. 前記モノクローナル抗体が、少なくとも約１０−６Ｍ〜約１０−１２Ｍの親和性（ＫＤ）で、前記ヒトＣＤ４０抗原に結合する、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメントおよび単鎖Ｆｖフラグメントからなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
  24. 前記癌が、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫、高度悪性Ｂ細胞リンパ腫、中等度悪性Ｂ細胞リンパ腫、軽度悪性Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、骨髄芽球性白血病およびホジキン病からなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
  25. 自己免疫疾患を処置するための方法であって、該方法は、
    有効量のヒト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体をヒト患者に投与する工程
    を包含し、該ヒト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体は、
    ａ）モノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９またはＣＨＩＲ−１２．１２；
    ｂ）ハイブリドーマ細胞株５．９またはハイブリドーマ細胞株１２．１２により生産されるモノクローナル抗体；
    ｃ）配列番号６に示される配列、配列番号７に示される配列、配列番号８に示される配列、配列番号６および配列番号７に示される両方の配列、ならびに配列番号６および配列番号８に示される両方の配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体；
    ｄ）配列番号２に示される配列、配列番号４に示される配列、配列番号５に示される配列、配列番号２および配列番号４に示される両方の配列、ならびに配列番号２および配列番号５に示される両方の配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体；
    ｅ）配列番号１に示される配列、配列番号３に示される配列、ならびに配列番号１および配列番号３に示される両方の配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体；
    ｆ）ハイブリドーマ細胞株５．９またはハイブリドーマ細胞株１２．１２により生産されるモノクローナル抗体に結合し得るエピトープに結合するモノクローナル抗体；
    ｇ）配列番号１０または配列番号１２に示されるヒトＣＤ４０配列の残基８２〜８７を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体；
    ｈ）配列番号１０または配列番号１２に示されるヒトＣＤ４０配列の残基８２〜８９を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体；
    ｉ）競合結合アッセイにおいてモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９またはＣＨＩＲ−１２．１２と競合するモノクローナル抗体；
    ｊ）前述の項目ａ）のモノクローナル抗体、または、前述の項目ｃ）〜ｉ）のいずれか１項のモノクローナル抗体であって、ここで該抗体は、組み換え的に生産される、モノクローナル抗体；ならびに、
    ｋ）前述の項目ａ）〜ｊ）のいずれか１項のモノクローナル抗体の抗原結合フラグメントであるモノクローナル抗体であって、ここで該フラグメントは、該ヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合する能力を保持する、モノクローナル抗体
    からなる群より選択され、該抗体またはそのフラグメントは、有意なアゴニスト活性を有さず、そしてこれにより、該抗体またはそのフラグメントが該Ｂ細胞上の該ＣＤ４０抗原に結合した場合に、該Ｂ細胞の増殖または分化が阻害される、方法。
  26. 前記モノクローナル抗体が、少なくとも約１０−６Ｍ〜約１０−１２Ｍの親和性（ＫＤ）で、前記ヒトＣＤ４０抗原に結合する、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメントおよび単鎖Ｆｖフラグメントからなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。
  28. 前記自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス、自己免疫性血小板減少性紫斑病、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、強直性脊椎炎、重症筋無力症および尋常性天疱瘡からなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。
  29. ＣＤ４０の発現によって特徴付けられる癌を処置するための方法であって、該方法は、有効量のヒト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体をヒト患者に投与する工程
    を包含し、該ヒト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体は、
    ａ）モノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９またはＣＨＩＲ−１２．１２；
    ｂ）ハイブリドーマ細胞株５．９またはハイブリドーマ細胞株１２．１２により生産されるモノクローナル抗体；
    ｃ）配列番号６に示される配列、配列番号７に示される配列、配列番号８に示される配列、配列番号６および配列番号７に示される両方の配列、ならびに配列番号６および配列番号８に示される両方の配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体；
    ｄ）配列番号２に示される配列、配列番号４に示される配列、配列番号５に示される配列、配列番号２および配列番号４に示される両方の配列、ならびに配列番号２および配列番号５に示される両方の配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体；
    ｅ）配列番号１に示される配列、配列番号３に示される配列、ならびに配列番号１および配列番号３に示される両方の配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体；
    ｆ）ハイブリドーマ細胞株５．９またはハイブリドーマ細胞株１２．１２により生産されるモノクローナル抗体に結合し得るエピトープに結合するモノクローナル抗体；
    ｇ）配列番号１０または配列番号１２に示されるヒトＣＤ４０配列の残基８２〜８７を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体；
    ｈ）配列番号１０または配列番号１２に示されるヒトＣＤ４０配列の残基８２〜８９を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体；
    ｉ）競合結合アッセイにおいてモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９またはＣＨＩＲ−１２．１２と競合するモノクローナル抗体；
    ｊ）前述の項目ａ）のモノクローナル抗体、または、前述の項目ｃ）〜ｉ）のいずれか１項のモノクローナル抗体であって、ここで該抗体は、組み換え的に生産される、モノクローナル抗体；ならびに、
    ｋ）前述の項目ａ）〜ｊ）のいずれか１項のモノクローナル抗体の抗原結合フラグメントであるモノクローナル抗体であって、ここで該フラグメントは、該ヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合する能力を保持する、モノクローナル抗体
    からなる群より選択され、該抗体またはそのフラグメントは、有意なアゴニスト活性を有さず、そしてこれにより、該抗体またはそのフラグメントが該Ｂ細胞上の該ＣＤ４０抗原に結合した場合、該Ｂ細胞の増殖または分化が阻害される、方法。
  30. 前記モノクローナル抗体が、少なくとも約１０−６Ｍ〜約１０−１２Ｍの親和性（ＫＤ）で、前記ヒトＣＤ４０抗原に結合する、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメントおよび単鎖Ｆｖフラグメントからなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
  32. ＣＤ４０発現細胞に対してアンタゴニスト活性を有する抗体を同定するための方法であって、該方法は、
    モノクローナル抗体との競合結合アッセイを実施する工程
    を包含し、該モノクローナル抗体は、
    ａ）モノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９またはＣＨＩＲ−１２．１２；
    ｂ）ハイブリドーマ細胞株５．９またはハイブリドーマ細胞株１２．１２により生産されるモノクローナル抗体；
    ｃ）配列番号６に示される配列、配列番号７に示される配列、配列番号８に示される配列、配列番号６および配列番号７に示される両方の配列、ならびに配列番号６および配列番号８に示される両方の配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体；
    ｄ）配列番号２に示される配列、配列番号４に示される配列、配列番号５に示される配列、配列番号２および配列番号４に示される両方の配列、ならびに配列番号２および配列番号５に示される両方の配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体；
    ｅ）配列番号１に示される配列、配列番号３に示される配列、ならびに配列番号１および配列番号３に示される両方の配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体；
    ｆ）ハイブリドーマ細胞株５．９またはハイブリドーマ細胞株１２．１２により生産されるモノクローナル抗体に結合し得るエピトープに結合するモノクローナル抗体；
    ｇ）配列番号１０または配列番号１２に示されるヒトＣＤ４０配列の残基８２〜８７を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体；
    ｈ）配列番号１０または配列番号１２に示されるヒトＣＤ４０配列の残基８２〜８９を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体；ならびに
    ｉ）前述の項目ａ）のモノクローナル抗体、または、前述の項目ｃ）〜ｈ）のいずれか１項のモノクローナル抗体であって、ここで該抗体は、組み換え的に生産される、モノクローナル抗体；ならびに、
    ｊ）ａ）〜ｉ）のモノクローナル抗体の抗原結合フラグメントであるモノクローナル抗体であって、ここで該フラグメントは、該ヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合する能力を保持する、モノクローナル抗体
    からなる群より選択される、方法。
  33. ＣＤ４０のドメイン２に特異的に結合する、アンタゴニスト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体。
  34. 前記抗体が、ヒト抗体である、請求項３３に記載のモノクローナル抗体。
  35. 前記抗体が、有意なアゴニスト活性を有さない、請求項３４に記載のモノクローナル抗体。
  36. 前記抗体が、ハイブリドーマ細胞株５．９により生産される抗体およびハイブリドーマ細胞株１２．１２により生産される抗体からなる群より選択される、抗体の結合特異性を有する、請求項３３に記載のモノクローナル抗体。
  37. 前記抗体が、特許寄託番号ＰＴＡ−５５４２としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株および特許寄託番号ＰＴＡ−５５４３としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株により生産される抗体からなる群より選択される、請求項３３に記載のモノクローナル抗体。
  38. 前記抗体が、モノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２またはＣＨＩＲ−５．９の結合特性を有する、請求項３３に記載のモノクローナル抗体。
  39. 前記抗体が、配列番号１０または配列番号１２に示されるヒトＣＤ４０配列の残基８２〜８７を含むエピトープに結合する、請求項３３に記載のモノクローナル抗体。
  40. 請求項３３のモノクローナル抗体であって、該抗体は、
    ａ）配列番号２に示される配列、配列番号４に示される配列、配列番号５に示される配列、配列番号２および配列番号４に示される両方の配列、ならびに配列番号２および配列番号５に示される両方の配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体；
    ｂ）配列番号１に示される配列、配列番号３に示される配列、ならびに配列番号１および配列番号３に示される両方の配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体；
    ｃ）ハイブリドーマ細胞株１２．１２により生産されるモノクローナル抗体に結合し得るエピトープに結合するモノクローナル抗体；
    ｄ）配列番号１０または配列番号１２に示されるヒトＣＤ４０配列の残基８２〜８７を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体；
    ｅ）競合結合アッセイにおいてモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２と競合するモノクローナル抗体；ならびに、
    ｆ）ＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体または前述の項目ａ）〜ｅ）における該モノクローナル抗体の抗原結合フラグメントであるモノクローナル抗体であって、ここで該フラグメントは、該ヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合する能力を保持する、モノクローナル抗体
    からなる群より選択される、モノクローナル抗体。
  41. ヒトＣＤ４０発現細胞においてＣＤ４０リガンド媒介性ＣＤ４０シグナル伝達経路を阻害するための方法であって、該方法は、
    有効量のヒト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体に該細胞を接触させる工程
    を包含し、該ヒト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体は、
    ａ）モノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９またはＣＨＩＲ−１２．１２；
    ｂ）ハイブリドーマ細胞株５．９またはハイブリドーマ細胞株１２．１２により生産されるモノクローナル抗体；
    ｃ）配列番号６に示される配列、配列番号７に示される配列、配列番号８に示される配列、配列番号６および配列番号７に示される両方の配列、ならびに配列番号６および配列番号８に示される両方の配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体；
    ｄ）配列番号２に示される配列、配列番号４に示される配列、配列番号５に示される配列、配列番号２および配列番号４に示される両方の配列、ならびに配列番号２および配列番号５に示される両方の配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体；
    ｅ）配列番号１に示される配列、配列番号３に示される配列、ならびに配列番号１および配列番号３に示される両方の配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体；
    ｆ）ハイブリドーマ細胞株５．９またはハイブリドーマ細胞株１２．１２により生産されるモノクローナル抗体に結合し得るエピトープに結合するモノクローナル抗体；
    ｇ）配列番号１０または配列番号１２に示されるヒトＣＤ４０配列の残基８２〜８７を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体；
    ｈ）配列番号１０または配列番号１２に示されるヒトＣＤ４０配列の残基８２〜８９を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体；
    ｉ）競合結合アッセイにおいてモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９またはＣＨＩＲ−１２．１２と競合するモノクローナル抗体；
    ｊ）前述の項目ａ）のモノクローナル抗体、または、前述の項目ｃ）〜ｉ）のいずれか１項のモノクローナル抗体であって、ここで該抗体は、組み換え的に生産される、モノクローナル抗体；ならびに、
    ｋ）前述の項目ａ）〜ｊ）のいずれか１項のモノクローナル抗体の抗原結合フラグメントであるモノクローナル抗体であって、ここで該フラグメントは、該ヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合する能力を保持する、モノクローナル抗体
    からなる群より選択される、方法。
  42. 前記モノクローナル抗体が、少なくとも約１０−６Ｍ〜約１０−１２Ｍの親和性（ＫＤ）で、前記ヒトＣＤ４０抗原に結合する、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメントおよび単鎖Ｆｖフラグメントからなる群より選択される、請求項４１に記載の方法。
  44. 前記ヒトＣＤ４０発現細胞が、正常ヒトＢ細胞または悪性ヒトＢ細胞であり、そして前記ＣＤ４０シグナル伝達経路が、Ｂ細胞生存性である、請求項４１に記載の方法。
  45. ヒトＣＤ４０発現細胞の表面上に発現されたヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合し得るヒトモノクローナル抗体を含む薬学的組成物であって、該モノクローナル抗体は、有意なアゴニスト活性を有さず、ここで、該抗体は、
    ａ）モノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９またはＣＨＩＲ−１２．１２；
    ｂ）ハイブリドーマ細胞株５．９またはハイブリドーマ１２．１２により生産されるモノクローナル抗体；
    ｃ）配列番号６に示される配列、配列番号７に示される配列、配列番号８に示される配列、配列番号６および配列番号７に示される両方の配列、ならびに配列番号６および配列番号８に示される両方の配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体；
    ｄ）配列番号２に示される配列、配列番号４に示される配列、配列番号５に示される配列、配列番号２および配列番号４に示される両方の配列、ならびに配列番号２および配列番号５に示される両方の配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体；
    ｅ）配列番号１に示される配列、配列番号３に示される配列、ならびに配列番号１および配列番号３に示される両方の配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体；
    ｆ）ハイブリドーマ細胞株５．９またはハイブリドーマ細胞株１２．１２により生産されるモノクローナル抗体に結合し得るエピトープに結合するモノクローナル抗体；
    ｇ）配列番号１０または配列番号１２に示されるヒトＣＤ４０配列の残基８２〜８７を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体；
    ｈ）配列番号１０または配列番号１２に示されるヒトＣＤ４０配列の残基８２〜８９を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体；
    ｉ）競合結合アッセイにおいてモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９またはＣＨＩＲ−１２．１２と競合するモノクローナル抗体；
    ｊ）前述の項目ａ）のモノクローナル抗体、または、前述の項目ｃ）〜ｉ）のいずれか１項のモノクローナル抗体であって、ここで該抗体は、組み換え的に生産される、モノクローナル抗体；ならびに、
    ｋ）前述の項目ａ）〜ｊ）のいずれか１項のモノクローナル抗体の抗原結合フラグメントであるモノクローナル抗体であって、ここで該フラグメントは該ヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合する能力を保持する、モノクローナル抗体
    からなる群より選択される、薬学的組成物。
  46. 前記組成物が、処方物のｐＨを、約ｐＨ５．０〜約ｐＨ７．０の範囲に維持するための量の緩衝剤を含む液体薬学的処方物である、請求項４５に記載の薬学的組成物。
  47. 前記処方物が、同一の組成物を等張付近にするための量の等張化剤をさらに含む、請求項４６に記載の薬学的組成物。
  48. 前記等張化剤が、塩化ナトリウムであり、該塩化ナトリウムは、約５０ｍＭ〜約３００ｍＭの濃度で前記処方物中に存在する、請求項４７に記載の薬学的組成物。
  49. 前記塩化ナトリウムが、約１５０ｍＭの濃度で前記処方物中に存在する、請求項４８に記載の薬学的組成物。
  50. 前記緩衝剤が、コハク酸塩、クエン酸塩およびリン酸塩の緩衝剤からなる群より選択される、請求項４６〜４９のいずれか一項にに記載の薬学的組成物。
  51. 前記処方物が、約１ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度で前記緩衝剤を含む、請求項５０に記載の薬学的組成物。
  52. 前記緩衝剤が、約５ｍＭ〜約１５ｍＭの濃度のコハク酸ナトリウムまたはクエン酸ナトリウムである、請求項５１に記載の薬学的組成物。
  53. 前記処方物が、約０．００１％〜約１．０％の量で界面活性剤を含む、請求項４６〜５２のいずれか１項にに記載の薬学的組成物。
  54. 前記界面活性剤が、ポリソルベート８０であり、該ポリソルベート８０は、約０．００１％〜約０．５％の量で前記処方物中に存在する、請求項５３に記載の薬学的組成物。
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