RS51230B - Antagonist anti-cd40 monoklonalna antitela i metode za njihovu upotrebu - Google Patents

Antagonist anti-cd40 monoklonalna antitela i metode za njihovu upotrebu

Info

Publication number
RS51230B
RS51230B RSP-2010/0041A RSP20100041A RS51230B RS 51230 B RS51230 B RS 51230B RS P20100041 A RSP20100041 A RS P20100041A RS 51230 B RS51230 B RS 51230B
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
seq
monoclonal antibody
antibody
chir
cells
Prior art date
Application number
RSP-2010/0041A
Other languages
English (en)
Inventor
Li Long
Mohammad Luqman
Asha Yabannavar
Isabel Zaror
Bao-Lu Chen
Xiaofeng Lu
Sang Hoon Lee
Deborah Hurst
Original Assignee
Novartis Vaccines And Diagnostics Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=34577667&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS51230(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. filed Critical Novartis Vaccines And Diagnostics Inc.
Publication of RS51230B publication Critical patent/RS51230B/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2013—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/06—Antigout agents, e.g. antihyperuricemic or uricosuric agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A61P33/06—Antimalarials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)

Abstract

Humano monoklonalno antitelo koje je sposobno da se specifično veže za humani CD40 antigen koji je eksprimiran na površini humanih CD-eksprimirajućih ćelija, pomenuto monoklonalno antitelo je bez značajne agonistočke aktivnosti, pri čemu, pomenuto monoklonalno antitelo se vezuje za CD40 antigen koji je ekprimiran na površini pomenute ćelije, rast ili diferencijacija pomenute ćelije je inhibirana, gde je pomenuto antitelo odabrano iz grupe koja se sastoji od:a) monoklonalnog antitela koje se vezuje za epitop koji je sposoban da veže monoklonalno antitelo CHIR-5.9 dobijeno iz hibridoma ćelijske linije deponovane u okviru ATCC kao Patent Deposit No. PTA-5542 ili monoklonalno antitelo CHIR-12.12 dobijeno iz hibridoma ćelijske linije deponovane u okviru ATCC kao Patent Deposit No. PTA-5543;b) monoklonalnog antitela koje se vezuje za epitop koji obuhvata ostatke 82-87 iz humane CD40 sekvence prikazane u SEQ ID N0:10 ili SEQ ID NO: 12;c) monoklonalnog antitela koje se vezuje za epitop koji obuhvata ostatke 82-89 iz humane CD40 sekvence prikazane u SEQ ID N0:10 ili SEQ ID NO: 12; id) monoklonalnog antitela koje kompetira sa monoklonalnim antitelom CHIR-5.9 dobijenog iz hibridoma ćelijske linije deponovane u okviru ATCC kao Patent Deposit No. PTA-5543 ili monoklonalnog antitela CHIR-12.12 dobijenog iz hibridoma ćelijske linije deponovane u okviru ATCC kao Patent Deposit No. PTA-5543 u eseju kompetitivnog vezivanja.Prijava sadrži još 33 patentna zahteva.

Description

OBLAST PRONALASKA
[001] Pronalazak se odnosi na humana antitela koja imaju sposobnost da se vezuju za CD40, metode za upotrebu antitela, i metode za lečenje bolesti koje su posredovane stimulacijom CD40 signalnog puta na ćelijama koje eksprimiraju CD40.
ISTORLTAT PRONALASKA
[002] B ćelije imaju važnu ulogu tokom normalnogin vivoimunog odgovora. Strani antigen će se vezati za površinu imunoglobulina na specifičnim B ćelijama, i tako će pokrenuti lanac događaja uključujući, endocitozu, obradu, prezentaciju obrađenih peptida na molekulima MHC klase H, i povećanje ekspresije (pozitivnu "up" regulacija) B7 antigena na površini B ćelija. Specifična T ćelija se zatim vezuje za B ćeliju posredstvom prepoznavanja obrađenog antigena prezentovanog na MHC klase II molekula od strane receptora za T ćeliju (TCR, T cell receptor). Stimulacija preko TCR aktivira T ćeliju i inicira proizvodnju citokina od strane T ćelije. Drugi signal koji dalje aktivira T ćeliju je interakcija između CD28 antigena na T ćelijama 1 B7 antigena na B ćelijama. Kada se gore navedeni signali prime, ekspresija CIMO Uganda na površini T ćelije (CD40L ili CD 154), koji ne eksprimiraju mirujuće humane T ćelije, se povećava (pozitivna "up" regulacija). Vezivanje CD40 Uganda za CD40 antigen na površini B ćelije stimuliše B ćeliju, i dovodi do sazrevanja B ćelije u plazma ćeliju koja sekretuje velike količine solubilnog imunoglobulina.
[003] CD40 je površinski ćelijski antigen veličine 55 kDa, koji se nalazi na površini normalnih i neoplastičnih humanih B ćelija, dendritičnih ćelija, antigen prezentujućih ćelija (APCs, antigen presenting cells), endotelijalnih ćelija, monocita i epitelijalnih ćelija. Promenjene ćelije iz pacijenata sa niskim i visokim stepenom lomfoma B ćelija, akutnom limfoblastnom leukemijom B ćelija, "multiple mvelorna", hroničnom limfocitnom leukemijom, i Hočkinsonovom bolešću eksprimiraju CD40. Ekspresija CD40 je takođe detektovana u dve trećine slučajeva akutne mijeloblastične leukemije i kod 50% limfoma povezanih sa Sidom. Maligne B ćelije iz nekoliko tumora B ćelijske linije eksprimiraju u visokom stepenu CD40, i da bi preživeli i proliferisali izgleda da zavise od CD40 signalnog puta.
[004] Imunoblastični limfomi B ćelija često nastaju kod imunokompromitujućih individua (osobe sa oslabljenim imunitetom) kao što su primaoci alografta (transplant od druge osobe) i drugi koji primaju dugotrajnu imunosupresivnu terapiju, pacijenti oboleli od side, i pacijenti sa sindromom primarne imunodeficijencije kao što je X-vezan limfoproliferativni sindrom ili Wiscott/Aldrich sindrom (Thomas et al., (1991) Adv. Cancer Res. 57:329; Strauss et al (1993) Ann. Intern. Med 118:45).
[005] CD40 antigen je povezan sa receptorom za humani hormon rasta nerva (NGF), receptorom za faktor nekroze tumora-oc (TNF-oc), I Fas, ukazujući na to da je CD40 receptor za ligand sa važnim funkcijama u aktivaciji B ćelija. Ekspresija CD40 na APC ima važnu ko-stimulatornu ulogu u aktivaciji i T pomoćnih i T citotoksičnih limfocita. CD4 receptor se eksprimira na aktiviranim T ćelijama, aktiviranim trombocitima, i zapaljenim vaskularnim glatkim mišićnim ćelijama. CD40 receptor se takođe može naći na eozinofilima, sinovijalnim membranama kod reumatoidnog artritisa, dermalnim fibroblastima, drugim tipovima ne-limfoidnih ćelija. Vezivanje CD40L za CD40 receptor stimuliše proliferaciju i diferencijaciju B ćelija, proizvodnju antitela, promenu izotipa, i stvaranje B-ćelija pamćenja.
[006] WO 01/83755 1 WO 02/28904 opisuje antitela koja su sposobna da se vežu za CD40, metode za proizvodnju ovakvih antitela i metode za njihovu upotrebu.
[007] Ellmark et al. (Immunologv 2002, 106, 456-463) izveštavaju o modulaciji interakcije CD40-CD40 ligand upotrebom anti-CD40 jcdnolančanih fragmenata antitela.
KRATAK PREGLED PRONALASKA
[008] Pronalazak obczbcđuje humano monoklonalno aniitelo koje je sposobno da se specifično veže za humani CD40 antigen koji je eksprimiran na površini humanih CD40-eksprimirajućih ćelija, pomenuto monklonalno antitelo je bez značajne agonističke aktivnosti, pri čemu, kada se pomeuto monoklonalno antitelo veže za CD40 antigen koji je eksprimiran na površini pomenute ćelije, rast ili diferencijacija pomenute ćelije je inhibirana, naznačeno time da pomenuto antitelo je odabrano i/, grupe koja se sastoji od: a) monoklonalnog antitela koje se vezuje za epitop koji je sposoban da veže monoklonalno antitelo CHIR-5.9 koje se može dobiti iz hibridoma ćelijske linije koja je deponovana u ATCC kolekciji pod brojem deponovanja patenta (Patent Deposit No., PTA) PTA-5543; b) monoklonalnog antitela koje se vezuje za epitop koji sadrži ostatke 82-87 sekvence humanog CD40 prikazane u SEQ ID NO: 10 ili SEQ ID NO: 12; c) monoklonalnog antitela koje se vezuje za epitop koji sadrži ostatke 82-89 sekvence humanog CD40 prikazane u SEQ ID NO: 10 ili SEQ ID NO: 12; i d) monoklonalnog antitela koje kompetira sa monoklonalnim antitelom CHIR-5.9 koje se može dobiti iz hibridoma ćelijske linije koja je deponovana u ATCC kolekciji
pod brojem deponovanja patenta PTA-5542 ili monoklonalnog antitela CHIR-12.12 koje se može dobiti iz hibridoma ćelijske linije koja je deponovana u ATCC kolekciji pod brojem deponovanja patenta PTA-5543 u eseju kompetitivnog vezivanja.
[009] Pronalazak takođe obezbeđuje izolovani molekul nukleinske kiseline koja sadrži polinukleotid koji kodira monoklonalno antitelo iz bilo kojeg od prethodnih patentnih zahteva.
[010] Pronalazak takođe obezbeđuje hibridoma ćelijsku liniju koja je sposobna da proizvodi monoklonalno telo iz pronalaska.
[011] Pronalazak takođe obezbeđuje upotrebu efektivne količine anti-CD40 monoklonalnog antitela iz pronalaska u proizvodnji medikamenta za inhibiciju rasta ili diferencijacije normalne humane B ćelije.
[012] Pronalazak takođe obezbeđujein vitrometod za inhibiciju rasta i diferencijacije normalne humane B ćelije, koji obuhvata kontaktiranje pomenute B ćelije sa efektivnom količinom anti-CD40 monoklonalnog antitela iz pronalaska.
[013] Pronalazak takođe obezbeđuje upotrebu efektivne količine anti-CD40 monoklonalnog antitela iz pronalaska u proizvodnji medikamenta za inhibiciju proliferacije normalne humane B ćelije, naznačeno time da je pomenuta proliferacija pojačana interakcijom CD40 liganda sa CD40 antigenom eksprimiran im na površini pomenute B ćelije.
[014] Pronalazak takođe obezbeđujein vitrometod za inhibiciju proliferacije normalne humane B ćelije, naznačeno time da je pomenuta proliferacija pojačana interakcijom CD40 liganda sa CD40 antigenom eksprimiranim na površini pomenute B ćelije, pomenut metod obuhvata kontaktiranje pomenute B ćelije sa efektivnom količinom anti-CD40 monoklonalnog antitela iz pronalaska.
[015] Pronalazak takođe obezbeđuje upotrebu efektivne količine anti-CD40 monoklonalnog antitela ili njegovog fragmenta iz pronalaska u proizvodnji medikamenta za inhibiciju proizvodnje antitela od strane B ćelija u ljudskom pacijentu.
[016] Pronalazak takođe obezbeđuje upotrebu efektivne količine anti-CD40 monoklonalnog antitela iz pronalaska u proizvodnji medikamenta za inhibiciju rasta ćelija raka B ćelijske linije.
[017] Pronalazak takođe obezbeđujein vitrometod za inhibiciju rasta ćelija raka B ćelijske linije, koji obuhvata kontaktiranje pomenute ćelije raka sa efektivnom količinom anti-CD40 monoklonalnog antitela iz pronalaska.
[018] Pronalazak takođe obezbeđuje upotrebu efektivne količine anti-CD40 monoklonalnog antitela iz pronalaska u proizvodnji medikamenta za tretiranje (lečenje) raka koga karakteriše ekspresija CD40.
[019] Pronalazak takođe obezbeđuje upotrebu efektivne količine anti-CD40 monoklonalnog antitela iz pronalaska u proizvodnji medikamenta za inhibiciju CD40 Ugandom posredovanog CD40 signalnog puta u humanim ćelijama koje eksprimiraju CD40.
[020] Pronalazak takođe obezbeđujein vitrometod za inhibiciju CD40 Ugandom posredovanog CD40 signalnog puta u humanim ćelijama koje eksprimiraju CD40, pomenti metod obuhvata kontaktiranje pomenute ćelije sa efektivnom količinom anti-CD40 monoklonalnog antitela iz pronalaska.
[021] Pronalazak takođe obezbeđujein vitrometod za identifikaciju antitela koje ima antagonistički efekat u odnosu ćelije koje eksprimiraju CD40, koji obuhvata izvođenje eseja za kompetitivno vezivanje sa monoklonalnim telom iz pronalaska.
[022] Pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži anti-CD40 monoklonalno antitelo iz pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač.
[023] Drugi aspekti pronalaska prikazani su u priključeni u patentnim zahtevima.
[024] Aspekti opisa koji sledi, a koji se ne odnose posebno na pronalazak koji se patentira, služe za poređenje i kao ilustracija.
KRATAK PREGLED OTKRIĆA
[025] Kompozicije i metode su otkrivene za lečenje bolesti posredovane stimulacijom CD40 signalnog puta na ćelijama koje eksprimiraju CD40, uključujući limfome, autoimmune bolesti i odbacivanje transplanata. Kompozicije uključuju monoklonalna antitela koja su sposobna da se vežu za humani CD40 antigen koji se nalazi na površini humanih ćelija koje eksprimiraju CD40, naznačeno time da vezivanje sprečava rast ili diferencijaciju ćelije. Kompozicije takođe uključuju monoklonalna antitela koja su sposobna da se specifično vezuju za humani CD40 antigen koji sc eksprimira na površini humane ćelije koja eksprimira CD40, pomenuto monoklonalno antitelo je bez značajne agonističke aktivnosti, naznačeno time da dostavljanje pomenutog monoklonalnog antitela rezultuje u značajno manjoj zapremini tumora nego pri sličnoj koncentraciji himemog anti-CD20 monoklonalnog antitela IDEC-C2B8 u "staged" ksenograft tumor modelu u "nude" mišu, korišćenjem Daudi humane ćelijske linije limfoma B ćelija. Kompozicije takođe uključuju antigcn-vezujuće fragmente ovih monoklonalnih antitela. hibridoma ćelijske linije koje proizvode ova antitela, i izolovane molekule nukleinskih kiselina koji kodiraju amino kiselinske sekvence ovih monoklonalnih antitela. Takođe ovde su otkrivene farmaceutske kompozicije koje obuhvataju ova anti-CD40 antitela u farmaceutski prihvatljivim nosačima.
[026] Metode su otkrivene za sprečavanje ili lečenje bolesti koja je posredovana stimulacijom CD40 signalnog puta, obuhvatajući tretiranje pacijenta sa anti-CD40 antitelom ili njegovim antigen vezujućim fragmentom koji je bez značajne agonističke aktivnosti kada se veže za CD40 antigen na humanoj ćeliji koja eksprimira CD40. Obolenja posredovana stimulacijom ćelija koje eksprimiraju CD40 uključuju autoimune bolesti, rak, i odbacivanje organa i presađenog tkiva. Limfomi koji se mogu lečiti ili sprečiti metodom kao stoje ovde otkriveno uključuju ne-Hočkinsonove limfome (limfomi visokog stepena, limfomi srednjeg stepena, i limfomi niskog stepena), Hočkinsonovu bolest, akutne limfoblastične leukemije, mijelome, hronične limfocitične leukemije, i mijeloblastične leukemije.
[027] Određene autoimmune bolesti o kojima se razmišlja da se leče pomoću metoda koje su ovde otkrivene, uključuju sistemski lupus eriematozus (SLE), reumatidni arthritis, Kronovu bolest, autoimunu trombocitopenijsku purpuru, multipnu sklerozu, ankilozni spondilitis, mijasteniju gravis, obična plikovnjača (Pemphigus vulgaris). Ovakva antitela se takođe mogu koristiti za sprečavanje odbacivanja transplanata organa i tkiva putem supresije autoimunih odgovora, za lečenje limfoma putem uskraćivanja malignim B limfocitima aktivirajućeg signala kojeg obezbeđuje CD40, i za dostavljanje toksina na specifičan način do ćelija koje nose CD40.
[028] Otrkrivene su metode za inhibiciju rasta, diferencijacije, i/ili proliferacije humanih B ćelija i za inhibiciju poizvodnje antitela od strane B ćelija u ljudskom pacijentu, kao metode za inhbiciju rasta ćelija raka B ćelijske linije. Metode za identifikaciju antitela koja imaju antagonističku aktivnost u odnosu na ćelije koje eksprimiraju CD40 takođe su otkrivene.
[029] Monoklonalna antitela koja su ovde otkrivena imaju jak afinitet za CD40 i karakteriše ih konstanta disocijacije (ekvilibrijum) (KD) od najmanje IO"<6>M do oko IO"<8>M, još poželjnije najmanje od 10"<s>M do oko 10"<12>M. Monoklonalna antitela i njihovi antigen vezujući fragmenti, koji su pogodni za upotrebu u metodama koje su ovde otkrivene su sposobna da se specifično vežu za humani CD40 antigen koji je eksprimiran na površini humane ćelije. Oni su bez značajne agonističke aktivnosti ali pokazuju antagonističku aktivnost kada se vezuju za CD40 antigen na humanim ćelijama. U jednom ostvarenju, anti-CD40 antitelo ili njegov fragment pokazuju antagonističku aktivnost kada se vežu za CD40 antigen na normalnim humanim B ćelijama. U drugom ostvarenju, anti-CD40 antitelo ili njegov fragment pokazuju antagonističku aktivnost kada se vežu za CD40 antigen na malignim humanim B ćelijama. Pogodna monoklonalna antitela imaju humane konstantne regionc; poželjno oni takođe imaju u potpunosti ili đelimično humanizovane regiona okosnice (framevvork); i najpoželjnije to su u potpunosti humana antitela ili njihovi antigen vezujući fragmenti. Primeri ovakvih monokloalnih antitela sn antitela obeležena ovde kao CHIR-5.9 i CHIR-12.12; monoklonalna aiv.kela proizvedena od strane hibr.đoma ćelijskih linija obeležena 131.2F8.5.9 (ovde se odnosi na ćelijsku liniju 5.9) i 153.8E2.D 10.D6.12.12 (ovde se odnosi na ćelijsku liniju 12.12); monoklonalno telo koje obuhvata amino kiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sasi.>|i od sekvence prikazane u SEQ ID NO:6. sekvence prikazane u SEQ ID NO:7. sekvence prikazane u SEQ ID NO:8. obe sekvence prikazane u SEQ ID NO:6 i SEQ ID NO:7. i obe sekvence prikazane u SEQ ID NO:6 i SEQ ID NO:8; monoklonalno antitelo koje obuhvata amino kiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od sekvence prikazane u SEQ ID NO:2, sekvence prikazane u SEQ ID NO:4, sekvence prikazane u SEQ ID NO:5, obe sekvence prikazane u SEQ ID NO:2 i SEQ ID NO:4, i obe sekvence prikazane u SEQ ID NO:2 i SEQ ID NO:5; monoklonalno antitelo koje obuhvata amino kiselinsku sekvencu koju kodira molekul nukleinske kiseline koji obuhvata nukleotidnu sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od sekvence rpikazane u SEQ ID NO:l, sekvence prikazane u SEQ ID NO:3, i obe sekvence prikazane u SEQ ID NO:l i SEQ ID NO:3; antigen vezujući fragmenti ovih monoklonalnih antitela koji zadržavaju sposobnost specifičnog vezivanja za humani CD40 i koji su bez značajne agonističke aktivnosti ali poseduju antagonističku aktivnost kada se vežu za CD40 antigen na humanim ćelijama. Primeri ovakvih monoklonalnih antitela takođe uključuju monoklonalno antitelo koje se vezuje za epitop koji je sposoban da veže monoklonalno antitelo koje proizvodi hibridoma ćelijska linija 12.12; monoklonalno antitelo koje se vezuje za epitop koji obuhvataostatke 82-887 amino kiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO: 10 ili SEQ ID NO: 12; monoklonalno antitelo koje kompetira sa monklonalnim antitelom CHIR-12.12 u eseju kompetitivnog vezivanja; i monoklonalno antitelo koje je antigen-vezujući fragment CHIR-12.12 monoklonalnog antitela ili bilo koje odprethodnih monoklonalnih antitela gde fragment zadržava sposobnost da se specifično veže za humani CD40 antigen. Oni stručni u ovoj oblasti prepoznaju da antagonistička antitela i antigen-vezujući fragmenti ovih antitela koja su otkrivena ovde uključuju antitela i njihove antigen-vezujuće fragmente koji se proizvode rekombinantno pomoću metoda poznatih u ovoj oblasti i koje su dalje u tekstu opisane, i uključuju na primer, monoklonalna antitela CHIR-5.9 I CHIR-12.12 koja su rekombinantno proizvedena.
[030] U jednom ostvarenju koje je ovde otkriveno, metode za lečenje obuhvataju dostavljanje (administraciju) pacijentu terapeustdki efektivne doze farmaceutske kompozicije koja sadrži pogodna antagonist anti-CD40 antitela ili njihove antigen vezujuće fragmente. Terapeutski efektivna doza anti-CD40 antitela ili njegovog fragmenta je u opsegu od oko 0.01 mg/kg do oko 40 mg/kg, od oko 0.01 mg/kg do oko 30 mg/kg, od oko 0.1 mg/kg do oko 30 mg/kg, od oko 1 mg/kg do oko 30 mg/kg, od oko 3 mg/kg do oko 30 mg/kg, od oko 3 mg/kg do oko 25 mg/kg, od oko 3 mg/kg do oko 20 mg/kg, od oko 5 mg/kg do oko 15 mg/kg, od oko 7 mg/kg do oko 12 mg/kg. Prihvata se da metod za lečenje može da obuhvati pojedinačnu administraciju terapeutski efektivne doze ili više administarcija terapeutski efektivne doze antagonosta anti-CD40 antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta.
[031] Antagonist anti-CD40 antitela koje je ovde identifikovano kao prikladno za upotrebu u metodama koje su ovde otkrivene može biti modifikovan. Modifikacije ovih antagonista anti-CD40 antitela uključuju, ali nisu ograničene njima, imunološki aktivna himerna anti-CD4() antitela, humanizovana anti-CD40 antitela. I imunološki aktivna misija anti-CD40 antitela.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[032] Slika I prikazuje vezivanje CHIR-5.9 i CHIR-12.12 monoklonalnih antitela za CD40 na površinu ćelijske linije limfoma (Ramos).
Slika 2A i 2B ilustruju osobine vezivanja CHIR-5.9 i CHIR-12.12 monoklonalnih anti-CD40 antitela u odnosu na CD40 ligand. Slika 2A prikazuje da vezivanje CHIR-5.9 i CHIR-12.12 monoklonalnih antitela za ćelijske površinske CD40 sprečava dalje CD40-ligand vezivanje. Slika 2B prikazuje da CHIR-5.9 i CHIR-12.12 monoklonalna antitela mogu da kompetiraju isključenjem (compete off) CD40 liganda prethodno vezanog za CD40 na površini ćelije.
Slike 3A i 3B prikazuju ADCC aktivnost kandidatnih monoklonalnih antitela CHIR-5.9 i CHIR-12.12 usmerenu na ćelije raka poreklom iz limfnih čvorova pacijenata sa ne-Hočkinsonovim limfomom (NHL). Obogaćene NK ćelije iz normalnih donora volontera ili sveže nakon izolacije (slika 3A) ili nakon gajenja preko noći na 37°C (slika 3B) korišćene su kao efektorne ćelije u eseju. Kako NHL ćelije takođe eksprimiaju CD20, ciljni antigen za rituksimab (Rituxian®), ADCC aktivnost kandidatnih mAbs (monoklonalnih antitela) je poređena sa onima sa rituksimab. Slika 4 demonstrirain vivoanti-tumorsku aktivnost monoklonalnih antitela CHIR-5.9 i CHIR-12.12 u poređenju sa onom kod rituksimab korišćenjem "unstaged" modela Snenameštenog) "ksenograft" limfoma B ćelija kod "nude" miša (Namalvva).
Slika 5 prikazujein vivoanti-tumorsku tumorsku aktivnost monoklonalnih antitela CHIR-5.9 i CHIR-12.12 u poređenju sa onom kod rituksimab korišćenjem "unstaged" modela "ksenograft" limfoma B ćelija kod "nude" miša (Daudi). RC. rezistencija na izazov tumorom.
Slika 6 prikazujein vivoanti-tumorsku aktivnost monoklonalnih antitela CHIR-5.9 i CHIR-12.12 u poređenju sa onom kod rituximab korišćenjem "staged" modela (nemštenog) "ksenograf' limfoma B ćelija kod "nude" miša (Daudi). CR, potpuna regresija.
Slika 7 prikazuje protocol koji je korišćen za određivanje broja CD20 I CD40 molekula na Namalwa i Daudi ćelijama.
Slika 8 prikazuje komparativni ADCC mAb CHIR-12.12 i rituksimab-a protiv Daudi limfoma ćelija.
Slika 9 prikazuje amino kiselinske sekvence lakih i teških lanaca mAb CHIR-12.12. Lider (ostaci 1-20 iz SEQ ID NO:2), varijabilni (ostaci 21-132 iz SEQ ID NO:2) i konstantni (ostaci 133-239 iz SEQ ID NO:2) regioni lakog lanca prikazani sun na slici 9A. Lider (ostaci 1-19 iz SEQ ID NO:4), varijabilni (ostaci 20-139 iz SEQ ID NO:4) i konstantni (ostaci 140-469 iz SEQ ID NO:4) regioni teškog lanca prikazani sun na slici 9B. Alternativni konstantni region za teški lanac CHIR-12.12 mAb prikazan na slici 9B reflektuje substituciju (zamenu) serinskog ostatka sa alaninskim ostatkom na poziciji 153 SEQ ID NO:4. Kompletna sekvenca ove varijante teškog lanca CHIR-12.12 mAb je prikazana u okviru SEQ ID NO:5.
Slika 10 prikazuje kodirajuće sekvence za laki lanac (slika 10A; SEQ ID NO: 1) i teški lanac (slika 10B; SEQ ID NO:3) za mAb CHIR-12.12.
Slika 11 prikazuje prikazuje amino kiselinske sekvence lakih i teških lanaca mAb CHIR-5.9. Lider (ostaci 1-20 iz SEQ ID NO:6). varijabilni (ostaci 21-132 iz SEQ ID NO:6) i konstantni (ostaci 133-239 iz SEQ ID NO:6) regioni lakog lanca prikazani sun na slici 11 A. Lider (ostaci 1-19 iz SEQ ID NO:7). varijabilni (ostaci 20-144 iz SEQ ID NO:7) i konstantni (ostaci 145-474 iz SEQ ID NO:7) regioni teškog lanca prikazani sun na slici 1 1B. Alternativni konstantni region za teški lanac CHIR-5.9 mAb prikazan na slici 11B rellektuje substituciju (zamenu) serinskog ostatka sa alaninskim ostatkom na poziciji 158 SEQ ID NO:7. Kompletna sekvenca ove varijante teškog lanca CHIR-5.9 mAb je prikazana u okviru SEQ ID NO:8.
Slika 12 prikazuje kodirajuću sekvencu (slika 12A; SEQ ID NO:9) za kratku izoformu humanog CD40 (amino kiselmska skevenca prikazana na slici 12B; SEQ ID NO: 10). i kodirajuću sekvencu (slika 12C; SEQ ID NO:l 1) za dužu izoformu humanog CD40
(amino kisleinska sekvenca prikazana na slici 12D)
Slika 13 pokazuje termalnu temperaturu topljenja CHIR-12.12 u različitim pll formulacijama merenu diferencijalnom skenirajućeom kalorimetrijom (DSC).
DETALJAN OPIS
[033] "Tumor" kako se ovde koriti, odnosi se na sve tipove ncoplastičnog rasta i proliferacije, bilo maligne ili benigne. i sve pre-kanceroznei kancerozne ćelije i tkiva.
[034] Izrazi "rak (kancer)" i "kancerozno" odnose se na ili opisuju fiziološko stanje u sisarima koje tipično karakteriše neregulisani ćelijski rast. Primeri raka uključuju ali nisu limitirani na limfom i leukemiju.
[035] "Antitela" i "imunoglobulini" (Igs) su glikoproteini koji imaju iste strukturne karakteristike. Dok antitela pokazuju sposobnost vezivanja za antigen, imunoglobulini uključuju i antitela i druge antitelima slične molecule kojima nedostaje antigenska specifičnost. Polipeptidi drugo spomenutih se na primer, proizvode u niskim količinama od strane limfnog sistema i u visokim količinama od strane mijeloma.
[036] Izraz "antitelo" se koristi u najširem smislu i pokriva antitelo koje je u potpunosti sklopljeno, fragmente antitela koji mogu vezati antigen (na pr., Fab', F'(ab)2, Fv, jednolančana antitela, dimerni fragmenti antitela "diabodies"), i rekombinantne peptide koji sadrže prethodne.
[037] Izraz "monoklonalno antitelo" kako se ovde koristi odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije dovoljno homogenih antitela, i.e., individualna antitela oja sačinjavaju populaciju su identična osim u slučaju prisustva prirodno nastalih mutacija koje mogu biti prisutne u malim količinama.
[038] "Nativna antitela" i "nativni imunoglobulini" su najčešće heterotetramerni glikoproteini od oko 150,000 daltona, sastavljena od dva identična laka (L) lanca i dva identična teška (T) lanca. Svaki laki lanac je povezan sa teškim lancem preko jedne kovalentne disulfidne veze, dok broj disulfidnih veza varira izmešu teških lanaca različitih imunoglobulinskih izotipova. Svaki teški i laki lanac takođe ima regularno raspoređene intralančane disulfidne mostove. Svaki teški lanac na jednom kraju ima varijabilni domen (VT) za kojim sledi odrešen broj konstantnih domena. Svaki laki lanac najednom kraju ima varijabilni domen (VL) i konstantan domen na drugom kraju; konstantni domen lakog lanca je u poravnanju sa prvim konstantnim domenom teškog lanca, i varijabilni domen lakog lanca je u poravnanju sa varijabilnim domenom teškog lanca. Veruje se da posebni amino kiselinski ostaci formiraju vezu između varijabilnih domena lakog i teškog lanca.
[0391 Izraz "varijabilan" odnosi se na činjenicu da se određeni delovi varijabilnih domena značajno razlikuju po sekvenci među antitelima i koriste se za vezivanje i specifičnost svakog određenog antitela za svoj određeni antigen. Međutim, varijabilnost nije ravnomerno raspoređena u varijabilnim đomenima antitela. Konccntrovana je u tri segmenta koja se nazivaju regioni za određivanje komplementarnosti (complementaritv deternuning regions. CDR) ili hipervarijabilni regioni u varijabilnim regionima i u lakom lancu i u teškom lancu. Delovi varijabilnih domena koji su u većem stepenu konzervirani zovu se regioni okosnice (framevvork regions, FR). Varijabilni domeni nativnih teških i lakih lanaca svaki za sebe sadrži četiri FR regiona, uglavnom zauzimaju konfiguraciju (3-ploče. povezani preko tri CDR-a, koji formiraju petlje povezujući i u nekim slučajevima bivaju deo strukture po-ploče. CDR-ovi u svakom lancu se drže blisko spojeni preko FR regiona is a CDR-ovima iz drugog lanca doprinose formiranju mesta za vezivanje antigena na antitelu (videti Kabat et al. (1991) NIH Publ. No.91/3242. Vol. I, strane 647-669)
[040] Konstantni domeni nisu direktno uključeni u vezivanje antitela za antigen, ali pokazuju različite efektorne funkcije, kao vezivanje Fc receptora (FcR), učestvovanje antitela u ćelijskoj toksičnosti koja zavisi od antitela, opsonizaciji, inicijaciji citotoksičnosti zavisnoj od komplementa, i degradaciji mast ćelija.
[041] Izraz "hipervarijabilni region" kada se ovde koristi odnosi se na amino kiselinske ostatke antitela koji su odgovorni za vezivanje antigena. Hipervarijabilni region sadrži amino kiselinske ostatke iz "regiona za određivanje komplementarnosti" ili "CDR" (i.e., ostaci 24-34 (LI), 50-56 (L2), i 89-97 (L3) u varijabilnom domenu lakog lanca i 31-35 (Hl), 50-65 (H2) i 95-102 (H3) u varijabilnom domenu teškog lanca; Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (5<1>'<1>ed.. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD) i/ili ostataka iz "hipervarijabilne petlje" (i.e., ostaci 26-32 (LI), 50-52 (L2) i 91-96 (L3) u varijabilnom domenu lakog lanca i 26-32 (Hl), 53-55 (H2) i 96-101 (H3) u varijabilnom domenu teškog lanca; Clothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917). "Okosnica" ili "FR" ostaci su oni ostaci iz varijabilnog domena koji nisu ostaci iz hipervarijabilnog regiona.
[042] "Fragmenti antitela" sadrže deo intaktnog antitela, poželjno antigen-vezujući ili varijabilni region intaktnog antitela. Primeri fragmenata antitela uključuju Fab, Fab', F'(ab)2, i Fv fragmente; dimerne fragmente antitela ("diabodies"); linearna antitela (Zapata et al. (1995) Protein Eng. 8(10): 1057-1062); molecule jednolančanih antitela; i multispecifična antitela formirana od fragmenata antitela. Enzimatsko sečenje antitela papainom produkuje dva identična antigen-vezujuća fragmenta, koja se nazivaju "Fab" fragmenti, svaki ima jedno antigen-vezujuće mesto i rezidualan "Fc" fragment, čije ime reflektuje njegovu sposobnost da lako kristalizuje. Tretiranje sa pepsinom dovodi do stvaranja F'(ab)2fragmenta koji ima dva mesta za kombinovanje antigena i i dalje je sposobno da se unakrsno veže (cross linking) za antigen.
[043] "Fv" je minimalni fragment antitela koji sadži kompletno mesto za prepoznavanje i vezivanje antigena. Kod dvolančane Fv vrste, ovaj region se sastoji od dimera i to od varijabilnog domena jednog teškog i jednog lakog lanca koji su blisko povezani ne-kovalentnom vezom. Kod jednolančane Fv vrste, jedan varijabilni domen iz teškog lanca i jedan iz lakog lanca mogu biti kovalentno povezani sa fleksibilnim peptidnim linkerom tako da laki i teški lanci mogu da se povezu u "dimernu" strukturu analognu onoj u dvolančanoj Fv vrsti. U ovakvoj konfiguraciji tri CDR-a iz svakog varijabilnog domena interaguju i definišu mesto za vezivanje antigena na površini VH-VLdimera. Zajedno, šest CDR-a obezbeduju specifičnost vezivanja antigena za antitelo. Međutim, čak i jedan varijabilni domen (ili polovina Fv koja sadrži samo tri CDR-a specifična za antigen) ima sposobnost da prepoznaje i veže antigen, iako sa manjim afinitetom nego kompletno mesto za vezivanje.
[044] Fab fragment takođe sadrži konstantan domen lakog lanca i prvi konstantan domen (ChI) teškog lanca. Fab fragmenti se razlikuju od Fab' fragmenata po dodavanju nekoliko ostataka na karboksil terminusu teškog lanca ("ni domena uključujući jedan ili više cisteina iz regiona zgloba (hinge) antitela. Fab'-SH je ovde oznaka za Fab' u kome je cisteinski ostatak (ostaci) konstantnih domena nosi slobodnu tiolsku grupu. F(ab')2 fragmenti antitela originalno su proizvedeni kao par Fab' fragmenata koji imaju "hinge" cisteine između sebe. Poznata su takođe i druga hemijska kuplovanja fragmenata antitela.
[045] "Laki lanci" antitela (imunoglobulini) iz bilo koje vrste kičmenjaka mogu se svrstati u okviru jednog ili dva jasno odvojena tipa koji se zovu kappa (K) i lambda (A,) na osnovu amino kiselinska sekvence njihovih konstntnih domena.
[046] U zavisnosti od amino kieslinske sekvence konstantnog domena njihovih teških lanaca, imunoglobulini se mogu podeliti u vi[e klasa. Postoji pet glavnih klasa humanih imunoglobulina: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, i nekoliko njih se mogu dalje podeliti u podgrupe (izotipovi), na primer, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4. IgA, i IgA2. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina nazivaju se alfa, delta, epsilon, gama i mu, odgovarajućim redosledom. Dobro su poznate strukture podjedinica i trodimenzionalne konfiguracije različitih klasa imunglobulina. Različiti izotipovi imaju različite efektome funkcije. Na primer, humani IgGl i IgG3 izotipovi posreduju u ćelijski posredovanoj citotoksičnoj aktivnosti koja je zavisna od antitela (antibodv-dependent cell mediated cytotoxicity,
ADCC).
[047] Reč "obeležje" kada se ovde koristi odnosi se na detektabilno jedinjenje ili kompoziciju koje je konjugovano direktno ili indirektno sa antitelom tako da generiše "obeleženo antitelo". Obeležje može biti detektabilno samo po sebi (na primer, obeleženo radioizotopom ili florescentno obeležje) ili u slučaju enzimskog obeležja, može da katalizuje hemijsku promenu substratnog jedinjenja ili kompozicije koja je detektabilna. Radionuklidi koji mogu da služe kao detektabilna obeležja uključuju na primer, I 131, 1-123, 1-125, Y-90. Re-188, Re-186, At-211, Cu-67, Bi-212, i Pd-109. Obeležje može takođe biti nedetektabilan entitet, kao toksin.
[048] Izraz "antagonist" koristi se u najširem smislu, i uključujue bilo koji molekul koji u delimično ili u potpunosti blokira, inhibira, ili neutrališe biološku aktivnost nativnog targeta (ciljni entitet) koji je ovde otkriven ili njegovu transkripciju ili translaciju. "Nosači" kako se ovde koriste uključuju farmaceutski prihvatljive nosače ekscipijente, ili stabilizatore koji su netoksični za ćeliju ili sisara koji je njima izložen u dozama il koncentracijama koje se primenjuju. Cesto fiziološki prihvatljiv nosač je vodeni pH puferisani rastvor. Primeri fiziološki prihvatljivih nosača uključuju pufere kao što su fosfat, citrat, sukcinat i druge organske kiseline; antioksidanse uključujući askorbinsku kiselinu; polipeptidc male molekulske mase (manje od 10 ostataka); proteine uključujući serum albumm, želatin, ili imunoglobulini; hidrotilnc polimete kao polivinilpirolidon; amino kiseline kao glicin. glutamin, asparagin. argmm ili lizm; monosaharide, disaharide, i druge ugljene hvdratc uključujući glukozu, manozu. ili dekstrine; helirajuće agense kao EDTA; šećerne alkohole kao manitol ili sorbitol; "counterions" (vrsta jona) koji formiraju soli kao natrijum; i/ili ncjonski surfaktantni kao TVVEEN; polietilen glikol (PEG) i Pluronics. Administracija '"u kombinaciji sa" jednim ili više dodatnih terapeutskih agenasa ukjlučuje simultanu (istovremenu) i uzastopnu administraciju bilo kojim redosledom.
[049] "Domaćinska ćelija" kako se ovde koristi odnosi se na mikroorganizam ili eukariotsku ćeliju ili ćelijsku liniju kultivisanu kao jednoćelijski entitet koji može biti ili je bio korišćen kao recipijent za rekombinantni vektor ili druge polinukleotide prenosioce i ukljuje potpmstvo originalne ćelije koja je transfektovana. Podrazumeva se da potomstvo jedne ćelije ne mora da bude obavezno i kompletno identično morfološki ili na nivou genoma ili ne morabiti totalan DNK komplement originalnoj roditeljskoj ćeliji, usled prirodne, slučajne ili namerne mutacije.
[050] "Humane efektorne ćelije" su leukociti koji eksprimiraju jedan ili više FcR-ova i pokazuju efektornu funkciju. Poželjno ćelije eksprimiraju makar FcyRIIl i izvode ćelijski posredovanu citotoksičnu efektornu aktivnosti koja je zavisna od antitela (ADCC). Primeri humanih leukocita koji posreduju ADCC uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC), ćelije prirodne ubicc (natural killer, NK), monocite. makrofage, eozinofile, i neutrofile, gde su PBMC i NK ćelije poželjne. Antitela koja imaju ADCC aktivnost tipično pripadaju IgGl ili IgG3 izotipu. Obratiti pažnju na to da pored izolacije IgGl i IgG3 antitela, ovakva ADCC-posredujuća antitela mogu da se naprave inžinjeringom varijabilnog regiona iz ne-ADCC antitela ili varijabilnog regiona fragmenta sa konstantnim regionom IgGl ili IgG3 izotipova.
[051] Izrazi "Fc receptor" ili "FcR" koriste se da opišu receptor koji se vezuje za Fc region antitela. Poželjni FcR je naivna sekvenca humanog FcR. Dodatno, poželjni FcR je onaj koji vezuje IgG antitelo (gama receptor) i uključuje receptore FcyRI, FcyRII, FcyRIH podklasa, uključujući alalske varijante i alternativno splaksovane (obrada transkripta) forme ovih receptora. FcyRII receptori uključuju FcyRIIA ("aktivirajući receptor") i FcyRIIB ("inhibirajući receptor") koji imaju slične amino kiselinske sekvence i koji se razlikuju pre svega u njhovim citoplazmatskim domenima. Aktivirajući receptor FcyRIIA sadrži imunoreceptorski aktivirajući motiv na bazi tirozina (ITAM) u svom citoplazmatskom domenu. Inhibirajući receptor FcyRIIB sadrži imunoreceptorski inhibirajući motiv na bazi tirozina (ITIM) u svom citoplazmatskom domenu (videti Daeron (1997) Annu. Rev. Immunol. 15:203-234). FcR-ovi su opisani u revijskom radu Ravetech i Kinet (1991) J. Lab. Clin. Med. 126:330-341. Drugi FcR-ovi uključujući one koji će biti otkriveni u budućnosti ovde su obuhvaćeni izrazom "FcR". Izraz takođe uključuje neonatalni receptor FcRnm koji je odgovoran za transfer majčinskih IgG fetusu (Guyer et al. (1976) J. Immunol. 1 17:587 i Kim et al. (1994) J. Immunol.~24:249 (1994).
[0521 Postoji mnogo načina da se napravi humano antitelo. Na primer, sekretorne ćelije mogu biti uvedene u besmrtnost infekcijom sa Epstein-Barr virusom (EBV. Međutim, ćelije inficirane sa EBV su teške za kloniranje i često proizvode samo relativno niske količine imunoglobulina (James and Bell (1987) J. Immunol. Methođs 100:5-40). U budućnosti, uvođenje besmrtnosti humanih B ćelija, moći će da se izvede unošenjem definisane kombinacije transformiranih gena. Ovakva mogućnost ic otvorena skorašnjom demonstracijom da ekspresija katalitićke subjedinice telomerase zajedno sa SV40 velikim onkoproteinom i onkogenim elelom H-ras doodi do tumorske konverzije normalnih humanih epitelijalnih i fihroblastnih ćelija (Hahn et al
(1999) Nature 400;464-468). Sada je moguće proizvesti transgene životinje (na primer miševe) koje su sposobne da nakon imunizacije endogeno proizvode immunoglobulin (Jakobovis et al (1993) Nature 362:255-258: Lonberg and Huszar
(1995) Int. Rev. Immunol. 13:65-93; Fishvvild et al (1996) Nat. Biotechnol 14:845-851; Mendez et al (1997) Nat. Genet. 15:146.156: Green ( 1999) J. Immunol. Methods 231:11-23; Tomizuka et al (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727; revijski rad Little et al (2000) Immunol. Todav 21:346-370). Na primer, opisano je da homozigotna delecija gena za region zaspajanje (joining region) (JH) teškog lanca antitela u himernim mutantnim miševima i mutantnim miševima za germinatvne linije rezultirala u kompletnoj inhibiciji endogene proizvodnje antitela (Jakobovits et al
(1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-2555). Transfer humanih genskih "array" imunoglobulina germinativne linije u ovakve miševe mutantne za germinativnu liniju rezultira u produkciji humanih antitela nakon izazova sa antigenom (Jakobovits et al.,
(1993) Nature 362:255-258). Mendez et al (1997) (Nature Genetics 15:146-156) su napravili liniju transgenih miševa koja kada je izazvana antigenom generiše kompletno humana visoko afinitativna antitela. Ovo je ostvareno putem integracije germinativne linije megabaze lokusa za humani teški lanac i laki lanac u miševe sa delecijom u endogenom JHsegmentu kao što je opisano prethodno u tekstu. Ovi miševi (XenoMouse® II technology (Abgenix; Fremont, California) nose 1,020 kb humanog lokusa za teški lanac koji sadrži približno 66 VHgena, kompletne DHi Jhregione i tri različita konstantna regiona, i takođe nosi 800 kb humanog te lokusa koji sadrži 32 Vkgena, Jksegmente i Ckgene. Antitela proizvedena u ovim miševima blisko podsećaju na ona viđena u ljudima u svakom pogledu, uključujući rearanžman gena, sklapanje, i repetoar. Humana antitela se preferencijalno eksprimiraju u odnosu na endogena antitela usled delecije u njihovom endogenom segmentu koji sprečava rearanžman gena u mišijem lokusu. Ovakvi miševi mogu se imunizovati sa antigenom određenig interesa.
[053] Serumi iz ovako imunizovanih životinja mogu se pregledati (skrining) na reaktivnost antitela protiv inicijalnog antigena. Pimfociti se mogu izolovati iz limfnih čvorova ili ćelija slezine i dalje se mogu selektovati B ćelije odabiranjem CD 138-negativnih i CD19-pozitivnih ćelija. U jednom aspektu, ovakve kulture B ćelija (BCC) mogu se fuzionisati za ćelijama mijeloma da bi se dobile hibridome kako je detaljno opisano u prethodnom tekstu.
[054] U drugom apektu, ovakve B ćelijske kulture mogu se dalje pregledati pođeljno na reaktivnost protiv inicijalnog antigena. Ovakvo pregledanje uključuje ELISA sa target/antigen proteinom, kompetitivni esej sa poznatim antitelima koja se vezuju za antigen od interesa, iin vitrovezivanje za tranzijentno transfektovane CHO ili druge ćelije koje eksprimiraju targetni (ciljni) antigen.
[055] Ovo otkriće se odnosi na kompozicije i metode za lečenje ljudskih pacijenata sa obolenjima posredovanim stimulacijom CD40 signalizacije na ćelijama koje eksprimiraju CD40. Metode uključuju tretman sa anti-CD40 antitelom iz pronalaska, ili njegovim fragmentom za vezivanje antigena, pri čemu administracija antitela ili njegovog fragmenta za vezivanje antigena dovodi do pozitivnog terapeutskog odgovora kod pacijenta koji je podvrgnut ovoj terapiji. Anti-CD40 antitela pogodna za upotrebu u metodama iz pronalaska specifično vezuju humani CD40 antigen koji se eksprimira na površini humane ćelije i nemaju značajnu agonističku aktivnost, ali pokazuju antagonističu aktivnost kada se vežu za CD40 antigen na humanoj ćeliji koja eksprimira CD40. Ova anti-CD40 antitela i njihovi fragmenti za vezivanje antigena odnose se ovde na antagonist anti-CD40 antitela. Ovakva antitela uključuju ali nisu limitirana samo na njih, kompletna humana monoklonalna antitela CHIR-5.9 i CHIR-12.12 opisana dalje u tekstu i monoklonalna antitela koja imaju karakteristike vezivanja monoklonalnih antitela CHIR-5.9 i CHIR-12.12. Stručnjaci zi ove oblasti prepoznaju da antagonist antitela i fragmenana ovih antitela koji vezuju antigen otkrivena u ovom pronalasku uključuju antitela i njihove fragmente za vezivanje antigena koji su rekombinantno proizvedeni primenom metoda poznatih u oblast ii opisnim dalje u tekstu, i uključuju, na primer, monolonalna antitela CHIR-5.9 i CHIR-12.12 koja su rekombinantno proizvedena.
[056] Antitela koja imaju karakteristike vezivanja monoklonalnih antitela CHIR-5.9 i CHIR-12.12 uključuju antitela koja kompetitivno interferiraju sa vezivanjem CD40 i/ili vezuju isti epitop kao CHIR-5.9 i CHIR-12.12. Stručnjak bi mogao da odredi da li antitelo kompetitivno interferira sa CHIR-5.9 ili CHIR-12.12 pomoću standatdnih metoda.
[057] Kada ova antitela vežu CD40 koji je izložen na površini humanih ćelija, kao humanih B ćelija, antitela su bez značajne agonističke aktivnosti; u nekim ostvarenjima njihovo vezivanje za CD40 koji je izložen na površini humanih ćelija rezultira inhibicijom proliferacije i diferencijacije ovih humanih ćelija. Zato, antagonist anti-CD40 antitela pogodna za upotrebu u metodama iz ovog pronalaska uključuju ona monoklonalna antitela koja ogu da pokažu antagonističku aktivnost prema normalnim i malignim humanim želijama koje eksprimiraju CD40 antigen an površini ćelija.
[058] U nekim ostvarenjima anti-CD40 antitela iz psonalaska pokazuju povećanu antitumorsku aktivnost u odnosu na himemo anti-CD2o monoklonalno antitelo IDEC-C2B8, gde je anti-tumorska aktivnost merena esejom sa ekvivalentnim količinama ovih antitela u "nude" mišijem modelu transplantnog tumora (nude mouse xenograft tumor model) korišćenjem humanih ćelijskih linija limfoma. IDEC-C2B8 (IDEC Pharmaceuticals Corp., San Diego, California; komercijalno dostupna pod zaštićenim imenom Rituxan®, takođe pod imenom rituxmab) je himemo anti-CD20 monoklonalno antitelo koje sadrži humani IgGl i kappa konstantni region sa mišijim varijabilnim regionima izolovanim iz mišijeg anti-CD20 monoklonalnog antitela. IDEC-2B8 (Reff et al. (1994) Blood 83: 435-545. Rituximab® je licenciran za lečenje vraćenih limfoma B ćelija niskog stepena ili folikularnog ne-Hočkinsonovog limfoma (NHL). Otkriće antitela sa superiornim anti-tumosrskom aktivnošću u odnosu na Rituximab®, moglo bi dramatično da poboljša metode za lečenje raka. limfoma B ćelija, posebno B-ćelijskog ne-Hočkinsonovog limfoma.
[059] Pogodni "nude" misiji modeli transplantnog tumora uklučuju one koji koriste humane ćelijske linije Burkitt-ovog limfoma poznati kao NamaKva i Daudi. Poželjna ostvarenja mere esejom anti-tumorskau aktivnost u "staged nude" mišijem modelu transplantnog tumora koristeži Daudi humane ćelijske linije lomtoma kao šio je opisano u primeru 17 koji sledi. '"Staged mule" misiji model transplantnog tumoru t: kome se koristi Daudi ćelijsku linija limfoma jc efektivni ja u razlikovanju terapeutske efikasnosti datog antitela nego"unstaged" mode!, jer se u "staged" modelu doziranje antitela se inicira samo nakon sto je tumor dosegao merljivu veličinu. U'"unstaged" modelu doziranje antitela se inicira najčešće u t->ku otprilike 1 dana po inoku!uci|i tumora i pre nego što je opipljiv tumor prisutan. Sposobnost antitela da nadigra Rituxan® (to jest da pokaže pojačanu anti-tumorsku aktivnost) u "staged" modelu je jaka indikacija da ćc antitelo biti terapeutski efiektivnije nego Ritu\an®. Takoše. u Daudi modelu anti CD-20. target za Rituxan® se povišeno eksprimira na površini ćelije u odnosu na CD40.
[060] Pod izrazom "ekvivalentna količina" anti CD-40 antitela iz ovog pronlaska i Rituxan®-a odnosi se na to daje ista mg doza dostavljena na bazi težine. Zato. tamo gde je antitelo iz pronalaska dozirano 0.01 mg/kg telesne težine miša koji se koristi u mišijem tumor modelu, Rituxan® se takođe dozira u količini 0.01 mg/kg telesne težine miša. Slično tome, kada se anti-CD40 antitelo iz pronalaska dozira 0.1, 1 ili 10 mg/kg telesne težine miša koji se koristi u mišijem tumor modelu, Rituxan® se takođe dozira u količini 0.1, 1 ili 10 mg/kg telesne težine miša.
[061] Kada se adiministracija vrši u "nude" mišijem modelu transplantnog tumora, neka antitela iz pronalsaka rezultiraju u manjem volumenu tumora nego pri ekvivalentnoj količini Rituxan®"-a. Zato kompletno humano monoklonalno antitelo CHIR-12.12 pokazuje najmanje 20% povećanja u anti-tumorskoj aktivnosti u odnosu na onu koja se vidi sa ekvivalentnom dozom Rituxan®-a kada se uradi esej u "staged" mišijem modelu transplantnog tumora korišćenjem Daudi humane ćelijske linije na način opisan u primerima koji slede i može da dovede do povećanje ant-tumorske aktivnosti u eseju od 50 % do 60%. Povećana anti-tumorska aktivnost se ogleda u povećanoj redukciji zapremine tumora kada se uporedi anti-CD40 antitelo iz pronalaska sa ekvivalentnom dozom Rituxan®"-a. Zato, na primer, u zavisnosti od dužine trajanja nakon inokulacije tumora, monoklonalno antitelo CHIR12.12 može da pokaže zapreminu tumora koja je veličine oko jedne trećine do oko jedne polovine one zapažene za ekvivalentnu dozi Rituxan®"-a.
[062] Još jedna razlika u efikasnosti antitela je merenjein vitrokoncentracije antitela koje je potrebno da se dobije maksimalna liza (degradacija) ćelija tumorain vitrou prisustvu NK ćelija. Na primer, anti-CD40 antitela iz pronalaska mogu dostići maksimum lize Daudi ćelija na EC50 manjimod Vi,ipoželno Vai najpoželjnije 1/10 koncentracije Rituxan®"-a.
[063] Pored monoklonalnog antitela CHIR12.12, druga anti-CD40 antitela koja bi delila karakteristike posedovanja više efikasnosti nu odnosu na ekvivalentne količine Rituxan®"-a u esejima koji su opisani prethodno tekstu, ali nisu ograničena na: (1) monoklonalno antitelo proizvedeno do strane hibridoma ćelijske linije 12.12; (2) monoklonalno antitelo koje sadrži amino kiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja obuhvata sekvencu u SEQ ID NO:2, sekvencu u SEQ ID NO:4, sekvencu u SEQ ID NO:5, obe skvence u SEQ ID NO:2 i SEQ ID NO:5; (3) monoklonalno antitelo koje sadrži amino kiselinsku sekvencu koju kodira molekul nukleinske kiseline koji obuhavta nukleotidnu sekvencu odabranu iz grupe koja sadrži nukleotidnu sekvencu u SEQ ID NO:l, nukleotidnu sekvencu u SEQ ID NO:3. i obe nukleotidne sekvence u SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO:3; (4) monoklonalno antitelo koje je sposobno da se veže za epitop sposoban da vezuje monoklonalno antitelo koje prizvodi hibridoma ćelijska linija CHIR12-12; (5) monoklonalno antitelo koje se vezuje za epitop koji obuhvata ostatke 82-87 amino kiselinske sekvence u SEQ ID NO: 10 ili SEQ ID NO: 12: (6) monoklonalno antitelo koje kompetira sa monoklonalnim antitelom Cl URI 2-12 u eseju kompetitivno« vezivanja; (7) monoklonalno antitelo koje je fragment za vezivanje antigena od CHIR12.12 monoklonalng antitela ili prethodna monoklonalna antitela u prethodnim tačkama (1-6). gde fragment zadržava sposobnost da se specifično veže za humani CD40 antigen.
Antagonist anti- CD40 antitela
[064] Monoklonalna antitela CHIR-5.9 i CHIR-12.12 predstavljaju pogodna antagonst anti-CD40 antitela za upotrebu u metodama iz ovog pronalaska. CHIR-5.9 i CHIR-12.12 antitela su u potpunosti humana anti-CD40 antitela IgG| izotipa koja su proizvedena od strane hibridoma ćelijskih linija 131.3F8.5.9 (ovde se označavaju kao ćelijska linija 5.9) i 153.8E2.DIO.12.12 (ovde se označavaju kao ćelijska linija 12.12). Ove ćelijske linije su napravljene korišćenjem ćelija slezine iz imunizovanih ksenotipova miševa koji sadrže lokus za teški lanac humanog IgGii lokus za humaniklanac (XenoMouse® technologv; Agbenix; Fremont, California). Ćelije slezine su fuzionisane sa mišijim SP2/0 ćelijama mijeloma (Sierra BioSource). Dobijene hibridome su subklonirane nekoliko puta da bi se dobila stabilne monoklonalne ćelijske linije 5.9 i 12.12. Druga antitela iz pronalaska mogu se pripremati na sličan način upoterbom transgenih miševa za imunoglobulinske lokuse ili drugim metodama poznatim u oblast i/ili kao što je opisano ovde.
[065] Nukleotidne i amino kiselinske sekvence varijabilnih regiona CHIR-12.12 antitela i amino kiselinske sekvence varijabilnih regiona CHIR-5.9 antitela su otkrivene. Detaljnije, amno kiselinske sekvence za lider, varijabilne, i konstantne regione za laki lanac i teški lanac za Ab CHIR-12.12 su prikazane na slikama 9A i 9B. Videti takođe SEQ ID NO:2 (kompletna sekvenca za laki lanac mAb CHIR-12.12), SEQ ID NO:4 (kompletna sekvenca za teški lanac mAb CHIR-12.12) i SEQ ID NO:5 (kompletna sekvenca varijante teškog lanca mAb CHIR-12.12 prikazane u SEQ ID NO:4, gde varijanta obuhvata serinsku zamenu alaninskog ostatka na poziciji 153 u SEQ ID NO:4). Nukleotidne sekvence koje kodiraju laki lanac i teški lanac mAb CHIR-12.12 prikazane su na slikama HAi 11B. Videti takođe SEQ ID NO: 1 (kodirajuća sekvenca za laki lanac mAb CHIR-12.12), SEQ ID NO:3 (kodirajuća sekvenca za teški lanac mAb CHIR-12.12). Amino kiselinske sekvence za lider, varijabilne, i konstantne regione za laki lanac i teški lanac CHIR-5.9 prikazen sun a slikama 10A i 10B. Videti takođe SEQ ID NO:6 (kompletna sekvenca za laki lanac mAb CHIR-5.9), SEQ ID NO:7 (kompletna sekvenca za teški lanac mAb CHIR-5.9) i SEQ ID NO:8 (kompletna sekvenca varijante teškog lanca mAb CHIR-5.9 prikazane u SEQ ID NO:7, gde varijanta obuhvata serinsku zamenu alaninskog ostatka na poziciji 158 u SEQ ID NO:7). Dalje, hibridome koje eksprimiraju CHIR-5.9 i CHIR-12.12 antitela deponovana su u ATCC pod brojem đodeljenim za patent PTA-5542 i PTA-5543.
[066] Pored antagonističke aktivnosti, poželjno je da anti-CD4() antitela iz ovog pronalaska poseduju još jedan mehanizam delovanja protiv ćelija tumora. Na primer. nativna CHIR-5.9 i CHIR-12.12 antitela imaju ADCC aktivnost. Alternativno, varijabilni regioni CHIR-5.9 i CHIR-12.12 antitela mogu se eksprimirati na drugom izotipu antitela koje poseđuje ADCC aktivnost. Taode je moguće da se konjuguju nativne forme ili antigen vezujući fragmenti CHIR-5.9 i CHIR-12 12 za citotoksin. terapeutski agens, ili jon radioaktivnog metala ili izotop, kao što je<p>omenuto dole u tekstu.
[067] CHIR-5.9 i CHIR-12.12 monoklonalna antitela vezuju solubilni CD40 u ELISA tipu eseja sprečavaju vezivanje CD-40-liganda za CD40 na površini ćelije i premeštaju prethodno vezan CD40-Iigand kao što je odrešeno esejima protočne citometrije (flow cytometry). Antitela CHIR-5.9 i CHIR-12.12 međusobno kompetiraju za vezivanje za CD40 ali ne sa 158B, anti-CD40 monoklonalnim antitelom opisanim u WO 02/28904. Kada se testirjuin vitroefekti na prolifcraciju B ćelija iz normalnih humanih subjekata, CHIR-5.9 i CHIR-12.12 deluju kao antagonisti anti-CD40 antitea. Dalje, CHIR-5.9 i CHIR-12.12 ne izazivaju jaku proliferaciju humanih limfocita u normalnim subjektima. Ova antitela su sposobna da ubiju ciljne ćelije koje eksprimiraju CD40 putem ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC). Afinitet vezivanja CHIR-5.9 za humani CD40 je 1.2xl0"<8>M i afinitet vezivanja CHIR-12.12 je 5xl0"'°M, kako je određeno Biacore™ esejom.
[068] Pogodan antagonist anti-CD40 antitela za upotrebu u metodama iz ovog pronalaska pokazuje visok afinitet za vezivanje za jedinstveno mesto za CD40 antigen na površini ćelije. Monoklonalna antitela iz ovog pronalaska pokazuju ekvilibrijum konstantu disocijacije (KD) za CD40 od najmanje 10"5 M, najmanje 3x10° M, poželjno najmanje IO"<6>M do oko 10 7 M, još poželjnije najmanje 10"<s>M do oko IO"<12>M izmereno standardnim esejom kao što je Biacore™. Biacore analiza je poznata u oblast i detalji su obezbeđeni u "Biapplicationa handbook". Metode opisane u WO 01/27160 mogu se koristiti da se moduliše afinitet vezivanja.
[069] Pod "CD40 antigen", "CD40 antigen na površini ćelije", "CD40 receptor", ili "CD40" označava se transmembranski glikoprotein koji pripada familiji receptora faktora nekroze tumora (TNK) (videti na primer, U.S. Patent No 5,674,492 i 4,708,871; Stamenkovic et al. (1989) EMBO 8:1403; Clark (1990) Tissue Antigens 36.33; Barclay(1997) The Leucocvte Antigen Facts Book (2<nd>ed.; Academic Press. San Diego)). Identifikovane su dve izoforme humanog CD40 koje kodiraju alternativno obrađene (splajsovane) varijante transkripta ovih gena. Prva izoforma (poznata takođe kao "duga izoforma" ili "izoforma 1") se eksprimira kao prekursorni polipeptid os 227 amino kiselina (SEQ ID NO: 12 (prvi put prijavljen kao GeneBank Accession No. CAA43045, i identifikovana kao izoforma 1 u GeneBank Accession No. NP_001241) kodirana od strane SEQ ID NO: 11 (videti GeneBank Accession Nos. X60692 i NM_001250)), koja poseduje signalnu sekvencu koju predstavlja prvih 19 ostataka. Druga izoforma poznata takođe kao "kratka izoforma" ili "izoforma 2") se eksprimira kao prekursorni polipeptid os 203 amino kiselina (SEQ ID NO: 10 (GeneBank Accession NM_690593) kodirana od strane SEQ ID NO:9 (GeneBank Accession Nos. NM_152854)). koja takođe poseduje signalnu sekvencu koju predstavlja prvih 19 ostataka. Prekursorni polipeptidi za ove dve izoforme humanog CD40 dele iste prvih 165 ostataka (to jest ostatke 1-165 SEQ ID NO: 10 i SEQ ID NO: 12). Prekursorni polipeptid kratke izoforme (prikazan u SEQ ID NO: 10) je kodiram transkriptnom varijantom (SEQ ID NO:9) kojoj nedostaje kodirajući segment, koji dovod do pomeraja u okviru čitanja transkripta (frame sli i ft rezultirajuća CD40 izoforma sadrži kraći i različit C-terminus (ostaci 166-203 u SEQ ID NO: 10) u odnosu na onaj koji se nalazi u dugoj izoformi CD40 (C-termiiius prikazan u ostacima 166-277 u SEQ ID NO: 12). Za potrebe ovog pronalaska izraz "CD40 antigen"."CD40 antigen na površini ćelije"."'CD40 receptor". ili"CIMU" obuhvataju obe i kratku i dugu izoformu CD40. Anti-cd40 antitela iz ovog pronalaska vezuju se za epitop humanog CD40 koji se nalazi na istoj lokaciji ili u okviru kratke izoforme ili duge izoforme ovog antigena na površini želije kao što je pomenuto u tekstu ispod.
|070] CD40 antigen je izložen na površini različitih tipova ćelija kao što je opisano bilo gde ovde u tekstu. Pod izrazom " izložen na površini" i "eksprimiran na površini" označava se da ceo ili deo CD40 antigena je izloženo na spoljašnjoj starni ćelije. Izložen ili eksprimiran CD40 antigen može biti u potpunosti ili delimično glikolizovan.
[071] Pod "antagonistička aktivnost" označava se da substanca deluje kao agonist. Agonist se kombinuje sa receptorom na ćeliji i inicira reakciju ili aktivnost koja je slična ili ista onoj koja je inicirana prirodnim ligandom receptora. Agonist CD40 inukuje jedan ili sve od sledećih odgovora ali nije njima ograničen: proliferacija i diferencijacija B ćelija, proizvodnja antitela, intracelularna adhezija, pravljenje B ćelija pamćenja, zamena izotipa, povećana ekspresija MHC klase II i CD80/86 putem regulacije, sekrecija pro-zapaljinskih citokina kao što su IL-8. IL-2 i TNF. Pod "anatgonistička aktivnost" označava se da supstanca funkcioniše kao antagonist. Antagonist CD40 sprečava ili redukuje indukciju bilo kakvog odgovora indukovanog vezivanjem CD40 receptora za agonist ligand, posebno CD40L. Antagonist može da redukuje indukciju jednog ili više odgovora na vezivanje agonista za 5%, 10%,15%20%, 25%, 30%, 35%, poželjno 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, još poželjnije 70%, 80%, 85% i najpoželjnije 90%, 95%, 99% ili 100%. Metode za merenje anti-CD40 antitela i CD40-ligand sepcifičnog vezivanja i antagonističke aktivnosti poznate su stručnajcina iz ove oblast ii uključuju ali nisu njima ogrnaičene, standardne eseje kompetitivnog vezivanja, eseje za posmatranje i praćenje sekrecije imunoglobulina od strane B ćelija, eseje za proliferaciju B ćelija, eseje za proliferaciju Bancherau-Like B ćelija, eseji za proizvodnju antitela u T pomoćnim ćelijama, eseji za povećanje ekspresije aktivacionih markera B ćelija. Videti na primer, ovakve eseje otkrivene u WO 00/75348 i U.S. Patent No. 6,087,329.
[072] Pod "značajnom" agonističkom aktivnošću podrazumeva se agonistička aktivnost od 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% veća od agonističke aktivnosti indukovane neutralnom substancom ili negativnom kontrolom merena esejom odgovora B ćelija. Poželjno je da "značajna" agonistička aktivnost je agonistička aktivnost koja je najmanje 2 puta veća ili najmanje 3-puta veća nego agonistička aktivnost indukovana neutralnom substancom ili negativnom konstrolom izmereno esejom odgovora B ćelija. Zato, na primer, tamo gde je B ćelijski odgovor od interesa B ćelijska proliferacija, "značajna" agonistička aktivnost bila bi indukcija nivoa proliferacije B ćelija koja je najmanje 2 puta veća ili najmanje 3 puta veća nego nivo proliferacije B ćelija indukovane neutralnom substancom ili negativnom kontrolom. U jednom ostvarenju, nespecifični immunoglobulin, na primer IgGl. koji se ne vezuje za CD40 služi kao negativna kontrola. Substanca koja je "bez značajne agonističke aktivnosti" pokazuje agonističku aktivnost ne veću od oko 25% veću od agonističke aktivnosti indukovane neutralnom substancom ili negativnom kontrolom, poželjno ne veću od oko20%veću. 15%' veću. 10% veću. 5% veću,1%veću. 0.5% veću, ili čak ne od oko 0.1% veću nego agonističku aktivnost i indukovanu neutralnom substancom ili negativnom kontrolom izmereno esejom odgovora B ćelija. Antagonistička anti-CD4() antitela korisna za metode iz ovog pronalaska su bez značajne agonističke aktivnosti kao što je pomenuto u prtehođnom tekstu, kada se vežu za CD40 antigen na humanim ćelijama. U jednom ostvarenju pronalaska, antagonističko anti-CD40 antitelo je bez značajne agonističek aktivnosti u esejima koji uključuju više od jednog odgovora B ćelija (na primer. proliferacija i diferencijacija, ili proliferacija. diferencijacija, i proizvodnja antitela).
[073] Kao što se ovde koristi. "anti-CD40 antitelo" obuhvata bilo koje antitelo koje specifično prepoznaje CD40 površinski antigen B ćelija, uključujući polilonalna antitela, jednolančana antitela, ili bilo koje njihove fragmente kao Fab. F(ab')2. Fv, i druge fragmente koji zadržavaju antigen vezujuću funkciju roditeljskog (ishodnog) anti-CD40 antitela. Od posebonog interesa za ovaj pronalazak su antagnist anti-CD40 antitela ovde otkrivena i koja imaju karakteristike vezivanja monoklonalnih antitela CHIR-5.9 i CHIR-12.12 koja su opisana gore u tekstu. Ovakva antitela uključuju ali nisu njima ograničena, sledeće: (1) monokonalno antitelo proizvedeno od strane hibridoma ćelijskih linija označene kao 131.2F8.5.9. (ovde označene kao ćelijska linija 5.9) i 153.8E2.D10.D6.12.12(ovde označene kao ćelijska linija 12.12) deponovane u ATCC ka Patent Deposit No. PTA-5542 i Patent Deposit No. PTA-5543; (2) monoklonalno antitelo koje obuhvata amino kiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od sekvence prikazane u SEQ ID NO:2, sekvence prikazane u SEQ ID NO:4, sekvence prikazane u SEQ ID NO:5, obe sekvence prikazane u SEQ ID NO:2 i SEQ ID NO:4, i obe sekvence prikazane u SEQ ID NO:2 i SEQ ID NO:5;
(3) monoklonalno antitelo koje obuhvata amino kiselinsku sekvencu odabranu iz
grupe koja se sastoji od sekvence prikazane u SEQ ID NO:6, sekvence prikazane u SEQ ID N0:7, sekvence prikazane u SEQ ID NO:8, obe sekvence prikazane u SEQ ID N0:6 i SEQ ID NO:7, i obe sekvence prikazane u SEQ ID NO:6 i SEQ ID NO:8; (4) monoklonalno antitelo koje ima amino kiselinsku sekvencu koju kodira molekul nukleinske sekvence koja obuhvata nukleotidnu sekvencu odabranu iz grupe koja sadrži nukleotidne sekvence prikazane u SEQ ID NO.l, nukleotidne sekvence prikazane u SEQ ID NO:3, i obe sekvence prikazane u SEQ ID NO: i SEQ ID NO:3; (5) monoklonalno antitelo koje se vezuje za epitop koji je sposoban da veže antitelo proizvedeno od strane hibridoma ćelijske linije 5.9. ili 1 hibridoma ćelijske linije 2.12; (6) monoklonalno antitelo koje se vezuje za epitop koji obuhvata ostatke 82-87 amino kiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO: 10 ili SEQ ID NO: 12; (7) monoklonalno antitelo koje kompetira sa monoklonalnim antitelom CHIR-5.9 ili CHIR-12.12 u eseju kompetitivnog vezivanja; i (8) monoklonalno antitelo koje je fragment koji vezuje antigen poreklom iz CHIR-12.12 ili CHIR-5.9. monoklonalnih antitela iz grupe antitela koja su gore opisana u prethodnim tačaka (l)-(7), gde fragment zadržava sposobnost specifičnog vezivanja za humani CD40 antigen..
Proizvodnja antagonist anti- CD40 antitela
[074] Antagonst anti-CD40 antitela otkrivena ovde i za upotrebu u metodama iz ovog pronalaska mogu se proizvesti korišćenjem bio koje metode za proizvodnju antitela poznatu u stručnjacima iz ove oblasti. Zato. poliklonalni serumi mogu sc pripremiti konvencionalnim metodama. Uopšteno. rastvor koji sadrži CD40 antigen prvo *e koristi za imunizaciju pogodne životinje, poželjno miša. pacova, zeca. ili koze. Zečevi ili koze su poželjni za pripremu oliklonalnih seruma zbog zapremine seruma koji se dobija. i dostupnosti obeleženih anti-zečijih i anti-kozijih antitela.
[075] Poliklonalni serumi se mogu pripremiti u transgemm životinjama, poželjno u mišu koji nosi lokuse za humani immunoglobulin. U poželjnom ostvarenju. SlV ćelije koje eksprimiraju CD40 koriste sc kao imunogen. Imunizacija se može takođe izvesti mešanjem ili emulzifikacijom rastvora koji sadrži antigen u fiziološkom rastvoru, požrljno u adjuvantu kao što je Freund-ov kompletan adjuvant. injektiranjem mešavine ili emulzije parenteralno (generalno subkutanoz.no ili intramuskularno.i. Doza od 50-200flg/injckciji najčešće je dovoljna. Imunizacija se generalno pojačava nakon 2-6 nedelja sa jednom ili dve injekcije proteina u fiziološkom rastvoru, poželjno korišćenjem Freund-ovog nekompletnog adjuvanta. Alternativno, antitelo se može generisatiin vitroimunizacijom upotrebom metoda poznatih u oblasti koje za potrebe ovog pronalaska se smatraju ekvivalentnein vivoimunizaciji. Poliklonalni antiserumi se dobijaju puštanjem krvi imunizovane životinje u čašu ili plastični kontejner, inkubacijom krvi na 25°C tokom jednog sata, nakon čega sledi inkibacija na 4°C tokom 2-18 sati. Serum se dobija centrifugiranjem (na primer. 1000 x g 10 minuta). Oko 20-50 ml po puštanju krvi može se dobiti iz zečeva..
[076] Proizvodnja Sf9{ Spodoptera frugiperda)ćelija otkrivena je u US Patent No. 6,004,552. Ukratko, sekvence koje kodiraju humani CD40 su rekombinovane u bakulovirusu korišćenjem vektora za transfer. Plazmidi su ko-transfektovani sa DNL divljeg soja bakulovirusa u Sf9 ćelije. Rekombinantne bakulovorusom inficirane Sf9 ćelije su identifikovane i klonalno prečišćene.
[077] Poželjno, antitelo je po priprodi monoklonalno. Pod "monoklonalno antitelo" podrazumeva se antitelo dobijeno oz populacije suštinski homogenih antitela, i.e., individulana antitela koja sačinjavaju populaciju su identična osim što postoji mogućnost prisustva prirodnih mutacija koje mogu biti prisutne u malim količinama. Izraz nije ograničen u smislu vrste ili izvora antitela. Izraz obuhvata cele imunoglobuline kao i fragmente kao na primer, Fab, F(ab')2, Fv i druga koja zadržavaju svojstvo antitela a to je vezivanje antigena. Monoklonalna antitela su visoko specifična usmerena protiv jednog antigenog mesta, i.e., CD40 antigena na površini ćelije u ovom pronalasku. Dalje, za razliku od pripreme konvencionalnih (polikolonalnih) antitela koja tipično uključuju različita antitela usmerena protiv različitih determinanti (epitopa), svako monoklonalno antitelo usmereno je protiv jedne determinantne na antigenu. Atribut "monoklonalno", označava karakter antitela da je dobijeno iz suštinski homogene populacije antitela i ne treba ga tumačiti kao neophodnu proizvodnju antitela bilo kojim metodom. Na primer, monoklonalna antitela koja će se koristiti u skladu sa ovim pronalaskom mogu biti proizvedena metodom hibridoma koja je prvi put opisana od strane Kohler et al. (1975) Nature 256:495, ili mogu biti proizvedena metodama rekombinantne DNK (videti, e.g.. U.S. Patent No. 4,816,567). "Monoklonalna antitela" mogu takođe biti izolovana iz biblioteke antitela u fazima koristeći tehnike ovde opisane, na primer, Clakson et al.
(1991) Nature 352:624-628; Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222:581-597; i U.S.
Patent No. 5,514,548.
[078] Pod izrazom "epitop" podrazumeva se deo molekula antigena protiv koga se proizvodi antitelo i za koje će se antitelo vezati Fpitopi mogu da sadrže linearne amino kiselinske ostatke (i. e., ostatke u okviru apitopa koji su poredani sekvcncijalno jedan za drugim na linearan način), ne-linearne amino kisleinske ostatke (ovde označene kao "nelinearni epitopi"; ovi epitopi nisu poredani sekvencijalno), ili obe linearne ili nelinearne amino kiselinske ostatke.
[079] Monoklonalna antitela mogu se pripremiti pomoću metode Kohler et al. (1975, Natiute 256:495-496, ili njihovom modifikacijom. Tipično, miš se imunizuje sa rastvorom koji sadrži antigen. Imunizacija se može izvesti mešanjem ili emulzifikacijom rastvora koji sadrži antigen u fiziološkom rastvoru, poželjno u u adjuvantu kao što je Freund-ov kompletni adjuvant. i injektiranjem mešavine ili emulzije parenteralno. Bilo koji metod imunizacije poznat u oblasti može se koristiti da bi se dobila monoklnalna antitela iz ovog pronalaska. Nakon imunizacije životinje, slezina (i opcionalno nekoliko velikih limfnih čvorova) se uklanjaju i disociraju na pojedinačne ćelije. Ćelije slezine se mogu pregledati dodavanjem ćelijske suspenzije na ploču ili bunarčić koji je obložen sa antigenom od interesa. B ćelije koje eksprimiraju membranski vezane imunoglobuline specifične za antigen vezuju se za ploču i ne ispiraju se. Rezultirajuće B ćelije ili sve disocirane ćelije slezine, se zatim indukuju da se fuzionišu sa ćelijama mijeloma da bi formirali hibridome, i gaje se u selektivnom medijumu. Dobijene ćelije se zasejavaju serijskim razblaženjima i rade se eseji za proizvodnju antitela koja se specifično vezuju za antigen od interesa (i koji se ne vezuju za nesrodne antigene). Odabrane hibridome koje sekretuju monoklonalno antitelo (mAb) se zatim gaje iliin vitro(e. g., bocama za u kulture tkiva ili "hollovv fiber" reaktorima), iliin vivo(kao ascites - nakupljanje tečnosti u abdomen miševa).
[080] Tamo gde se antagonist anti-CD40 antitela iz pronalaska pripremaju korišćenjem metoda rekombinantne DNK, DNK koja kodira monoklonalna antitela je već izolovana i sekvencirana pomoću konvencionalnih metoda (e. g., upotrebom oigonukleotidnih proba koje su sposobne da se specifično vežu za gene koji kodiraju teške i lake lance mišijih antitela). Ćelije hibridoma koje su opisane ovde služe kao poželjan izvor ovakve DNK. Jednom izolovana, DNK može biti ubačena u ekpresione vektore, kojim se zatim transfektuju domaćinske ćelije kao E. coli ćelije, simian COS ćelije, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), ili ćelije mijeloma koje inače ne proizvode imunoglobulinski protein, da bi se dobila sinteza monoklonalnih antitela u rekombinantnim domaćinskim ćelijama. Revijski radovi o rekombianatnoj bakterijskoj ekspresiji DNK koja kodira antitelo uključuju Skerra et al. (1993) Curr. Opinion in Immunol. 5:256 i Phickthun (1992) Immunol . Revs. 130:151. Alternativno, antitelo se može proizvesti u ćelijskoj liniji kao što je CHO ćelijska linija, kao što je otkriveno u U. S. Patent Nos. 5,545,403; 5,545,405; i 5,998,144. Ukartko, ćelisjka linija je transfektovana sa vektorima sposobnim da eksprimiraju laki lanac i teški lanac. Putem transfekcije dva proteina na odvojenim vektorima, mogu se proizvesti himerna antitela. Još jedna prednost je pravilna glikozilacija antitela.
[081] U nekim ostvarenjima, antagonist anti-CD40 antitelo, na primer, CHiR-12.12 ili CHIR-5.9 antitelo, ili njihov antigen-vezujući fragment, se proizvodi u CHO ćelijama upotrebom GS genskog ekspresionog sistema (Lonza Biologics, Portsmouth. Nevv Hatnpshire), koji koristi glutamin sintetazu kao marker. Videti takođe U. S. Patent Nos. 5,122,464; 5,591,639; 5,658,759: 5,770,3.59; 5,827.739; 5.879.936; 5.5891.693; i 5.981,216.
(082] Monoklonalna antitela za cd4() poznata su u ovoj oblasti. Viedeti na primer. odeljke posvećene antigenima B-ćelija u McMichael. ecl119S7; 1989). Leukocvte Tvping III i IV (0\ford Universilv prcss. Nevv York); U. S. Patent Nos. 5.674.492; 5.874.082; 5.677,165; 6.056,959; WO 00/63395; International Publieations Nos. \VO 02/28905 i WO 02/28904; Gorđon te al (1988) .!. Immunol. 142:1425: Vile et al.
(1989) Eur. J. Immunol. 19:1463; Clark et al. (1986) PNAS 83:4494; Paulie et al.
(1989) J. Immunol. 142:590; Gordon et al (1987) Eur. J. Immunol. 17:1535: Jabara et al. (1990) J. Exp. Med. 172:1861; Zhang et al (1991) J. Immunol. 146:1836; Gasean et al. (1991) J. Immunol. 147:8; Banchereau et al. (1991) J. Clm. Immunol. Spectrum 3:8: i Banchereau et al. (1991) Science 251:70. Od posebnog interesa za ovaj pronalazak su antagnst anti-CD40 antitela otkrivena ovde koja imaju karakteristike vezivanja monoklonalnih antitela CHIR-5.9 i CHIR-12.12 koja su ovde opisana.
[083] Izraz "epitop CD40-antigena" koji se ovde koristi odnosi se na molekul koji ima sposobnost imunoreaktivnosti sa anti-CD40 monoklonalnim antitelima iz ovog pronalaska, isključujući sam CD40 antigen. Epitopi CD40 antigena mogu sadržat proteinem fragmente proteina, peptide, ugljene hvdrate, lipidc, i druge molekule, ali za potrebe ovog pronalaska to su najčešće proteini, kratki oligopeptidi. imitatori oligopeptida "oligopeptide mimics" (to jest organska jedinjenja koja imitiraju vezujuća svojstva antitela kod CD40 antigena), ili njihove kombinacije. Pogodni imitatori oligopeptida su opisani, između ostalog, u PCT prijavi US 91/04282.
[084] Dodatno, izraz "anti-CD40 antitelo" koje se ovde koristi obuhvata himerna anti-CD40 antitela; ovakva himerna anti-CD40 antitela za upotrebu u metodama ovog pronalaska imaju vezujuće karakteristike CHIR-5.9 i CHIR-12.12 monoklonalnih antitela koja su ovde opisana. Pod "himernim" antitelima podrazumevaju se antitela koja su najpoželjnije dobijena korišćenjem tehnika rekombinantne dezoksiribonukleinske kiseline i koja obuhvataju i humana (uključujući imunološki "povezane" vrste, a. g., šimpanze) i ne-humane komponente. Zato je najpoželjnije da konstantan region himernog antitela je suštinski identično konstantnom regionu neutralnog humanog antitela; varijabilni region himernog antitela najpoželjnije je dobijen iz ne-humanog izvora i poseduje željenu antigenu spcifičnost za CD40 antigen koji se nalazi na površini ćelije. Ne-humani izvor može biti bilo koji kičmenjak koji se može koristiti za generisanje antitela protiv humanog anti-CD4o površinskog antigena ili materijal koji sadrži humani CD40 površinski antigen. Ovakvi ne-humani izvori uključuju ali nisu ograničena njima, glodare (na primer, zec, pacov, miš itd.; videti na primer, U. S. Patent No. 4,816, 567 i ne-humane primate (na primer majmun starog sveta, bezrepi majmuni itd.; videti na primer U. S. Patent Nos. 5,750,105 i 5,756,096). Kao što se ovde koristi, fraza "imunološki aktivan" kada se koristi sa himernim anti-CD40 antitelom znači himemo antitelo koje veuzje humani CD40.
[085] Himerna i humanizovana anti-CD40 antitela takođe su obuhvaćena izrazom anti-CD40 antitelo kao što se ovde koristi. Himerna antitela obuhvataju segment antitela dobijenih iz različitih vrsta. Rituxan© j eprimer himernog antitela sa mišijim varijabilnim regionom i humanim konstantnim regionom.
[0861 Pod "humanizovan" podrazumevaju se forme anti-CD40 antitela koje sadrže minimalnu sekvencu dobijenu iz ne-humanih imunoglobulinskih sekvenci. U najvećem delu humanizovana antitela su humani imunoglobulini (recipijentno antitelo) u kojima ostaci iz hipervarijabilnog regiona (poznata takođe kao region za određivanje komplementarnosti ili CDR) recipijenta su zamenjem sa ostacima iz hipervarijabilnog regiona ne-humane vrste (donorsko antitelo) kao što je miš. zec. ili ne-humani primat koji poseduje željenu specifičnost, afinitet i kapacitet. Fraza "region za određivanje komplementarnosti" odnosi se na amino kiselinske sekvence koje zajedno definišu afinitet vezivanja i specifičnost prirodnog Fv regiona nativnog imunoglobulinskog vezujućeg mesta. Videti. na primer, Chothia et al (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917;; Kabat et al (1991) U. S. Dept of Health and Human Services. NIH Publication No. 91-3242). Fraza "konstantni region" odnosi se na dco molekula antitela koji obezbeđuje efektornu funkciju. U prethodnom radu usmerenom ka proizvodnjine-imunogenih antitela za upotrebu u terapiji humanih oboljenja, misiji konstantni regioni su zamenjeni humanim konstantnim regionima. Konstantni regioni humanizovanog antitela koji je ovde predmet dobijeni su iz humanih imunoglobulina. Međutim, ova humanizovana antitela i dalje izazivaju neželjene i potencijalno opasne immune odgovore u ljudima i dolazilo je i do gubitka afiniteta. Humanizovana anti-CD40 antitela za upotrebu u metodama iz ovog pronalaska imaju karakteristike vezivanja slične onima koje pokazuju CHIR-5.9 i CHIR-12.12 monoklonalna antitela koja su ovde opisana.
[087] Humanizacija može biti izvedena po metodi Winter i ko-autora (Jones et al.
(1986) Nature 321:522-525; Reichmann et al. (1988) Nature 322:323-327; Verhoeven et al. (1988) Science 239:1534-1536), zamenom glodarskog ili mutantnog glodarskog CDR ili sekvenci CDR sa odgovarajućim sekvencama humanog antitela. Videti takođe U. S. Patent Nos. 5,225,539; 5,585,089; 5,693,761; 5,69.3,762; 5,859,205. U nekim slučajevima ostaci u okviru regiona okosnice (framevvork) jednog ili više varijabilnih regiona humanog imunoglobulina zamenjeni su odgovarajućim ne-humanim ostacima (videti na primer, U. S. Patent Nos. 5,585,089; 5,693,761;
5,693,762 i 6,180,370). Dalje, humanizovana antitela mogu obuhvatiti ostatke koji se ne nalaze u recipijentnom antitelu ili u donorskom antitelu. Ove modifikacije su napravljene da dalje oplemene preformanse antitela (na primer, da se dobije željeni afinitet). Uopšteno, humanizovano antitelo obuhvatiće suštinski sva od najmanje jednan, i tipično dva, varijabilna domena, u kojima svi ili suštinski svi hipervarijabilni regioni odgovaraju onima iz ne-humanog imunoglobulina i svi ili suštinski svi regioni okosnice (framevvork) su oni od humane sekvence imunoglobulina. Humanizovano antitelo će opcionalno takođe sadržati makar deo imunoglobulinskog konstantnog regiona (Fc), tipično ono od humanog imunoglobulina. Za dalje detalje videti Jones et al. (1986) Nature 331:522-525; Reichmann et al. (1988) Nature 322:323-327 i Presta
(1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596. Na osnovu toga "humanizovana" antitela mogu uključiti antitela mogu uključiti antitela naznačeno time da je suštinski manje od netaknutog humanog varijabilnog regiona zamenjeno sa odgovarajućom sekvencom iz ne-humane vrste. U praksi, humanizovana antitela su tipično humana antitela u kojima neki CDR ostaci i moguće neki ostaci iz okosnice su zamenjeni sa ostacima iz analognih mesta u glodarskom antitelu. Videti na primer, U. S. Patent Nos.5,225,539; 5,585,089; 5,693,762; 5.859. 205. Videti takođe U. S. Patent No. 6,180,370, i International Publication No. VVO 01/27160, gde su otkrivena humanizovana antitela i tehnike za proizvodnju humanizovanih antitela koja imaju poboljšan afinitet za predeterminisani antigen.
[088] Takođe pod izrazom anti-CD40 antitela obuhvaćene su ksenogena ili modifikovana anti-CD40 antitela proizvedena u ne-humanom sisarskom domaćinu, posebno u transgenom mišu. koje karakterišu inaktivirani endogeni inv.inoglobulinski (Ig) lokusi. U ovakvim transgemm životinjama, kompetentni endogeni geni za ekspresiju lakih i teških subjediuica domaćinskih imunoglobulina su učinjeni nefunkcionalnim i zamenjeni sa analognim humanim imunoglobulinskim lokusima. Ove transgene životinje proizvode humana antitela u značajnom odsustvu lakih ili teških subjedinica domaćinskog imunoglobulina. Videti na primer. U. S. Patent Nos. 5,877.397 i 5.939,598.
[089] Poželjno, potpuno humana antitela na CD40 dobijena su imunizacijom transgenog miša. Jedan ovakav mišje dobijen korišćenjem XenoMou.se® tehnologije (Abgenix; Frcmont, California) i otkriven u U. S. Patent Nos. 6.075,181. 6.091.001 i 6,114,598. Da bi se proizvela antitela otkrivena ovde, miševi transgenic za humani lokus za teški lanac IgG, i humani lokus zaklaki lanac imunizovani su sa Sf9 ćelijama koje eksprimiraju humani CD40. Miševi mogu biti transgenic takođe za druge izotipove. Kompletno humana antitela korisna za metode ovog pronalaska karakterišu osobine vezivanja slične onima koje pokazuju CHIR-5.9 i CHIR-12.12 monoklonalna antitela otkrivena ovde.
[090J Fragmenti anti-CD40 antitela pogodni su za upotrebu u metodama iz pronalaska sve dok zadržavaju željeni afinitet antitela koji je kompletne dužine. Zato, fragment anti-CD40 antitela će zadržati sposobnost da se vezuju za CD40 antigen koji se nalazi na površini B ćelije. Ovakve fragmente karakterišu osobine slične odgovarajućem antagonist anti-CD40 antitelu kompletne dužine, odnosno, fragmenti će se specifično vezati za humani CD40 antigen koji se eksprimira na površini humane ćelije, i bez su značajne agonističke aktivnosti ali pokazuju antagonističku aktivnost kada vežu CD40 antigen na humanim ćelijama koje eksprimiraju CD40. Ovakvi fragmenti ovde se označavaju kao "antigen-vezujući" fragmenti.
[091] Pogodni antigen-vezujući fragmenti antitela obuhvataju deo antitela kompletne dužine, generalno njegov antigen-vezujući ili varijabilni region. Primeri fragmenata antitela uključuju ali nisu njima ograničeni Fab, F(ab')2, i Fv fragmente i jednolančane molekule antitela. Pod "Fab" označava se monovalentni antigen-vezujući fragment imunoglobulina koji je sastavljen od lakog lanca i dela teškog lanca. Pod F(ab')2podrazumeva se bivalentni antigen-vezujući fragment imunoglobulina koji sadrži oba laka lanca i deo oba teška lanca. Pod "jednolančane Fv" ili "sFv" fragmente antitela podrazumevaju se fragmenti koji obuhvataju VHi VLdomene antitela naznačeno time dađ su ovi domeni prisutni u jednom polipcptdinom lancu. Videti na primer U. S. Patent Nos. 4,946,778, 5,260,203, 5.455.030 i 5,856,456. Uopšteno, Fv polipeptid dalje sadrži polipeptidni linker između VHi VLdomena koji omogućava sFv da formira željene strukture za vezivanje antigena. Za revije o sFv videti Plutchun (1994) u The paharmacologv of Monoclonal Antibodies Vol. 113, ed. Rosenburg and Moore (Springer-Verlag, New York), pp.269-315. Antigen-vezujući fragmenti antagonist anti-CD40 antitela otkriveni ovde mogu biti takođe konjugirani za citotoksin da bi se ubile ciljne ćelije raka, kao što je opisano dole u tekstu.
[092] Antitela ili fragmenti antitela mogu biti izolovani iz fagne biblioteke antitela napravljene pomoću tehnika koje su opisane u na primer, McCaffert> et al. (1990) Nature 348:552-334 (1990) i U. S. Patent No. 5,514,548. Clakson et al ( 1991) Nature 352:624-628 i Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222:581-597 opisuju izolaciju mišijih i humanih antitela. korišćenjem biblioteke faga. Dalje publikacije opisuju proizvodnju humanih antitela visokog afiniteta (nM opseg) pomoću "ehain shulTIing" i Marks et al.
(1992) Bio/Technology 10:779-783). kao i kombmatorna infekcija iin vivorekombinaeija kao strategija za konstruisanje veoma velikih fag-uh biblioteka (VVaterhouse et al. (1993) Nucleic. Acids Rcs. 21:2265-2266). Zato. < u- tehnike su izvodljive alternative tradicionalnim hibridoma- monoklonalna antiteia tehnikama izolacije monoklonalnih antitela.
[ 093 ] Različite tehnike za proizvodnju fragmenata antitela -u.i razvijene. Tradicionalno, ovi fragmenti su dobijeni preko proteolitičkog sećenja netaknutih antitela (videti na primer, Miromoto ct al (1992) Journal of Bioehemical and Biophvsical Methods 24:107-117 (1992) i Brennan et al. (1985) Science 229:81). Međutim, ovi fragmenti se sad mogu proizvesti direktno od strane rekombinantnih domaćinskih ćelija. Na primer, fragmenti antitela mogu biti izolovani iz fagne biblioteke antitela koja je objašnjena gore u tekstu. Alternativno, Fab'-SH fragmenti mogu se direktno dobiti izE. colii hemijski kuplovati da se formiraju F(ab')2 fragmenti (Čarter et al. (1992) Bio/Technology 10:163-167). Na osnovu drugog pristupa F(ab')2fragmenti mogu biti izolovani direktno iz rekombinantne domaćinske ćelisjke kulture. Druge tehnike za proizvodnju fragmenata antitela biće očigledne učesnicima koji su obučeni u ovoj oblasti.
[094] Antagonist anti-CD40 antitela korisna za metode iz ovog pronalaska uključuju CHIR-5.9 i CHIR12.12 monoklonalna antitela ovde otkrivena kao i antitela koja se razlikuju od ovog antitela ali zadržavaju CDR-ove; i antitela sa jednom ili više amino kiselinskih adicija, delecija, zamena, naznačeno time da antagonistička aktivnost je merena inhibicijom proliferacije B-ćelija i/ili diferencijacijom. Pronalazak takođe obuhvata de-imunizovana antagonist anti-CD40 antitela koja semogu proizvesti kao što je opisano u na primer International Publication Nos. WO 98/52976 i WO 0034317. Na ovaj način ostaci u okviru antagonist anti-CD40 antitela iz pronalaska su modifikovani tako da menjaju antitela čineći ih ne- ili manje imunogenim za ljude dok zadržavaju antagonsitičku aktivnost ka humanim ćelijama koje eksprimiraju CD40 naznačeno time da je ovakva aktivnost izmerena esejima koji su pomenuti negde ovde. Takođe u okviru patentnih zahteva uključeni su fuzioni proteini koji sadrže antagonist ant-CD40 antitelo iz ovog pronalaska ili njihove fragmente, gde fuzioni proteini mogu biti sintetisani ili eksprimirani u odgovarajućim polinukleotidnim vektorima, što je poznato u ovoj oblasti. Ovakvi fuzioni proteini opisani su i povezani sa konjugacijom antitela kao što je pomenuto dole u tekstu.
[095] Antitela iz ovog pronalaska mogu imati napravljene varijacije u sekvenci korišćenjem metoda ovde opisanih, na primer Patent Publication Nos. EP 0 983 303 Al, WO.00-34317 i WO 98-52976. Na primer, pokazano je da sekvence u okviru CDR mogu da uzrokuju vezivanje antitela za MHC klase II i izazovu neželjene odgovore T ćelija. Bilo koja ovakva konzervativna ili ne-konzervativna zamena može se napraviti pomoću metoda prepoznatljivih u ovoj oblasti kao što su one pomenute na različitim mestima ovde u tekstu, i dobijena antitela će biti obuhvaćena ovim pronalaskom. Varijante antitela mogu biti rutinski testirana na antagonsitičku aktivnost, afinitet, i specifičnost pomoću metoda koje su ovde opisane.
[096] Antitelo proizvdeno bilo kojom od gore opisanih metoda, ili bilo kojom metodom otkrivenom u pronalasku, biće obuhvaćeno ovim otkrićem ako poseduje najmanje jednu od sledećih bioloških aktivnosti: inhibiciju sekrecije imunoglobulina od strane noramlnih humanih perifernih B ćelija stimulisanih T ćelijama: inhibiciju preživljavanja i/ili proliferacije noramlnih humanih perifernih B ćelijasvmuilisanih od strane CD40L-eksprimirajućih ćelija ili solubilnog CD40 liganda!sCD40L): inhibicija ''preživljavanja" anti-apoptotičkih intracelularnih signala u bilo kojoj ćeliji stimulisanoj sa sCD4()L ili CD40L u čvrstoj fazi; i inhibicija proliferacije humanih malignih B ćelija kao što je notirano dole. Ovi eseji se mogu izvesti kao što je opisano ovde u primerima. Videti takođe eseje opisane u Schultzc et al. (199S) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:8200/8204: Denton et al. (1998) Pediatr. Transplant. 2:6-15: Evans et al. (2000) J. Immunol. 164:688-697; Noelle (1998) Agents Actions Suppl. 49:17-22; Lederman et al. (1996) Curr. Opin. Hemato. 3:77-86; Coligan et al. (1991) Current Protocols in Immunologv 13:12; Kvvekkeboom et al. (1993) Immunologv 79:439-444; i U. S. Patent Nos. 5.674.492 i 5.847,082.
[097J Reprezentativni esej za detekciju antagonist anti-CD40 antitela specifična za CD40 antigenske epitope ovde identifikovan je "esej kompetitivnog vezivanja". Eseji kompetitivnog vezivanja su serološki eseji u kojima se nepoznatte detektuju i kvantifikuju na osnovu njihove sposobnosti da inhibiraju vezivanje poznatog obelećenog liganda za njegovo specifično antitelo. Ovo se takođe naziva i esej kompetitivne inhibicije. U reprezenattivnom eseju kompetitivnog vezivanja, obeleženi CD40 polipeptid se precipitira sa kandidatnim antitelima u uzorku, na primer, u kombinaciji sa monoklonalnim antitelima koja su sintetisana protiv jednog ili više epivtopa monoklonalnih antitela iz pronalaska. Anti-CD40 antitela koja specifično reaguju sa epitopom od interesa mogu biti identifikovana pregledanjem serije antitela pripremljenih protiv CD40 proteina ili fragmenta proteina koji obuhvata određeni epitop od CD40 proteina od interesa. Na primer, za humani CD40, epitopi od interesa uključuju epitope koji sadrže linearne i/ili ne-linearne amino kiseinske ostatke kratke
izoforme humanog CD40 (videti GeneBank Accession No. NP_690593) prikazane na slici 12B (SEQ ID NO: 10), kodiran sekvencom prikazanom na slici 12A (SEQ ID NO:9; takođe videti GeneBank Accession No. M_152853) ili od duge izoforme humanog CD40 (videti GeneBank Accession Nos. CAA43045 i NP_001241) prikazane na slici 12D (SEQ ID NO: 12), kodiran sekvencom prikazanom na slici 12C(SEQ ID NO: 11; videti GeneBank Accession Nos. X60592 i NM_001250). Alternativno, eseji kompetitivnog vezivanja sa prethodno identifikovanim antagonist anti-CD40 antitelima mogu se koristiti da se odaberu monoklonalna antitela koja se mogu porediti sa prethodno identifikovanim antitelima.
[098] Antitela koja se koriste u takvim esejima mogu biti obeležena ili neobeležena. Neobeležena antitela mogu biti korisćena u aglutinaciji; obeležena antitela mogu se koristiti u širokom dijapazonu eseja, uključujući široku lepezu obeležja. Detekcija formiranja antitelo-antigen kompleksa izmežu anti-CD40 antitela i epitopa od inetresa može biti olakšana vezivanjem detektabilne substance za antitelo. Prihvatljiva sredstva za detekciju uključuju upotrebu obeležja kao što su radionukleotidi, enzimi, koenzimi, fluprescenti, slobodni radikali, partikule, boje, i slično. Primeri pogodniih enzima uključuju peroksidazu rena, alkalnu fosfatazu, p-galaktozidazu, ili acetilholinesterazu; primeri pogodnih prostetičnih grupa kompleksa uključuju streptavidin/biotin i avidin/biotin; primeri pogodnih fluorescentnih materijala uključuju umbeliferon, fluorescein, fluorescein izotioetjanat. rodamin, dihlorotrizinilamin fluorescein. đanzil hlorid ili fikoeritrin; primer luminescentnog materijala je luminol; primeri bioluminescentnih materijala uključuju luciferazu. luciferin, i ekuorin; primeri pogodnih radioaktivni';! materijala uključuju '~~\. 1 ' I. °S. ili 3H. Ovakvi obeleženi reagensi mogu da se koriste u različitim dobro poznatim esejima, kao što su radioimunoeseji, enzimski ununoeseji. na primer «ELISA, fluorescentni imunoeseji, i slični. Videt na primer. U. S. Patent Nos. 3,766,162: 3.791.932; 3.817,837; i 4.233.402.
[099] Bilo koje od prethodno opisaniih antagonist anti-CD40 antitela ili fragmenata antitela mogu biti konjugovanni pre upotrebe u metodama iz ovog pronalaska. Metode za proizvodnju konjugovanih antitela poznate su u ovoj oblasti. Zato. anti-CD40 antitelo može biti obeleženo pomoću indirektnog obelez.avanja ili pristupa indirektnog obeležavanja. Pod "indirektno obeležavanje" ili prristup indirektnim obeležavanjem" podrazumeva se to da je helirajući agens kovalentno vezan za antitelo i da makar jedan radionukleotid je ubačen u helirajući agens. Videti an primer, helirajuće agense i radionukleotide opisane od strane Srivagtava and Mease (1991) Nucl. Med. Bio. 18:589-603.
[0100] Pogodna obelećja uključuju fluorofore, hromofore, radioaktivne atome (posebno 32P i<125>I), "eleetrondense" reagense, enzime i ligande koji imaju specifične prtnere za vezivanje. Enzimi se tipično detektuju na osnovu njihove aktivnosti. Na primer, peroksidaza rena se najčešće detektuje na osnovu sposobnosti da konvertuje 3,3'-5.5' - tetrametilbenzidin (TMB) u plavi pigment, koji se može kvantifikovati na spektrofotometru. "Specifični partner za vezivanje" odnosi se na protein koji ima sposobnost vezivanja ligand molekula sa visokom specifičnošću kao na primer u slučaju antigena i njegovog specifičnog monoklonalnog antitela. Drugi specifični partneri za vezivanje uključuju biotin i avidin ili streptavidi, igG i protein A, i mnogobrojnne receptor-ligand parove poznate u nauci. Trebalo bi razumeti da gore opisani primeri ne služe za kategorizaciju različiti obeležja u različite klase, pošto isto obeležje može da poslući u različitim metodama. Na primer 125 I mož*/ e sluć' i•ti kao radioaktivno obeležje ili kao "electron-dense" reagens. HRP može da služi kao enzim ili antigen za mAb. Dalje, mogu se kombinovati različita obeležja da bi se postigao željeni efekat. Na primer, mAbs i avidin takođe zaktevaju obeležja u primeni ovog pronalaska: zato, mAb se može obelećiti sa biotinom, i njegovo prisustvo se može detektovati sa<125>I koji je obeležen sa avidinom, ili sa anti-biotin mAb obeleženim sa HRP. Druge permutacije i mogućnosti biće očigledne onima iz ove oblasti, i smatraju se ekvivalentnim u okviru ovog pronalaska.
[0101] Alternativno, snti-CD40 antitelo može biti obeleženo korišženjem "direktnog obeležavanja" ili "pristupom direktnog obeležavanja" gde se radionukleotid kovalentno direktno veže za antitelo (tipično preko amino kiselinskog ostatka). Poželjni radionukleotidi obezbeđeni su u Srivagtava and Mease (1991)supra.Pristup indirektnim obeležavanjem posebno je poželjan. Videti takođe na primer, International Publication Nos. WO 00/52031 i WO 00/52473, gde se linker koristi za pričvršćavanje radioaktivnog obeleživača za antitela; i obeležene forme anti-CD40 antitela opisana u U. S. Patent No. 6,015,542.
[01021 Dalje, antitelo (ili njegov fragment) može biti konjugovan sa tcrapcutskom delom kao što je citotoksin, terapeutski agens, ili radioaktivni jon metala ili radioizotop. Citotoksin ili citotoksični agens uključuje bilo koji agens koji je štetan za ćelije. Primeru uključuju, taksol. citohalasin B, gramicidin D, ctidijum bromid. emctin, mitomicin. etoposid. tenoposid. vinkristin, vinblastin. kolhicin, doksorubicin. daunorubicin. dihidroksi antracin dion. mitoksantron, mitramicm. aktinomicin D. 1-dehidrotestosteron, glukokortikoidi. prokain, tetraciklin, lidokain, propanolol. i puromicin. i njihovi analozi ili homolozi. Terapeutski agensi uključuju, ali nisu njima ograničeni na antimetabolitc (na primer. metotreksat, 6-inerkaptopurin, 6-tioguanin. citarabin. 5-fluorouracil dekarbazin). alkilirajućc agense (na primer. mehloretamin. tioepa hlorambucil. melfalan. karmustin (BSNU) i lomustin (CCNU). ciklofosfamid. busulfan, dibromomanitol. streptozotocin. mitimicin C. i cis-dihlorodiamin platinum (II) (DDP) cisplatina), antracikline (na primer, daunorubicin (nekadašnji daunomicin). i doksorubicin), antibiotike (na primer, daktinomicin (nekadašnji aktinomicin). bleomicin, mitramicin, i antramicin (AMC)), i anti-mitotički agensi (na primer. vinkristin i vinblastin). Radioizotopi uključuju ali nisu limitirana na nijh, 1-131. 1-123. 1-125, Y-90, Re-188, At-211, Cu-67. Bi-212, Bi.213, Pd-109, Tc-99," In-111 i slični. Konjugati iz pronalaska mogu se koristiti za modifikovanje datog biološkog odgovora; lekoviti deo nije ograničavajući kao limitirajući za klasične hemijske terapeutske agense. Na primer, lekoviti deo može biti protein ili polipeptid koji procesuje željenu biološku aktivnost. Ovakvi proteini mogu uključiti na priemr, toksin kao abrin, ricin A, ekzotoksin pseudomonasa, toksin difterije; protein kao što je factor nektoze tumora, interferon-alfa, interferon-beta, nervni faktor rasta, factor rasta izvedein iz trombocita, activator tkivnog plazminogena, ili modofikatore biloškog odgovora kao na primer, limfokine, interleukin-1 ("IL-1"), interleukin 2 ("IL-2"), interleukin 6 ("IL-6"), stimulatorni faktor kolinije granulocitnih makrofaga ("GM-CSF"), stimulatorni factor kolonije garnulocita ("G-CSF"), ili drugi faktori rasta.
[0103] Tehnike za konjugaciju ovakvih terapeutskih delova za antitela dobro su poznata. Videti, na primer, Amon et al. (1985) "Monoclonal antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapv", in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapv, ed. Reisfeld et al. (Alan R, Liss, Ine), pp. 243-256; ed Hellstrom et al. (1987) "Antibodies for Drug Deliverv" in Controlled Drug Deliverv, ed. Robinson et al (2d ed; Marcel Dekker, Ine), pp. 623-653; Thorpe (1985) "Antibodv Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review, in "Monoclonal Antibodies '84 : Bilogical and Clinical Applications, ed. Pinchera et al. pp. 475-506 (Editrice Kurtis, Milano, Italy, 1985); "Analysis, Results and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy", in "Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, ed Baldwin et al (Academic Press, New York, 1985), pp. 303-316; and Thorpe et al. (1982) Immunol. Rev. 62:119-158.
[0104] Alternativno, antitelo može biti konjugovano za drugo antitelo da bi se formiralo antitelo heterokonjugat kao što je opisano u U. S. Patent No. 4,676,980. Dodatno, lonkeri mogu biti korišćrni između obeležja i antitela iz pronalaska (videti U. S. Patent No. 4,831,175). Antitela, ili njihovi fragmenti za vezivanje anigena mogu biti direktno obeleženi sa radioaktivnim jodom, indijumom, itrijumom, ili drugim radioaktivnim česticama poznatim u nauci (U. S. Patent No. 5,595,721). Tretman se može sastojati od kombinacije tretmana sa konjugovanim i ne-konjugovanim antitelima koji se dostavljaju istovremeno ili naknadno (WO 00/52031 i W 00/52473).
Varijante antagonist anti- CD4() antitela
[0105] Pogodne biološki aktivne varijante antagonist anti-CD40 antitela mogu se koristiti u metodama iz ovog pronalaska. Ovakve varijante zadržaće željene osobine vezivanja roditeljskog antagonist anti-CD4() antitela. Metode za pravljenje varijanti antitela generalno su dostupne u ovoj oblasti nauke. (0106] Na primer, varijante amino kiselinskih sekvenci antagonist anti-CD4() antitela, na primer CHIR-5.9 ili CHIR-12.12 monoklonalno antitelo ovde opisano , može se pripremiti mutacijama u kloniranoj DNK sekvenci koja kodira antitelo od interesa. Metode za mutugenezu i promene u nukleotidnoj sekvenci dobro su pozneta u nauci. Videti na primer. VValkcr and Gaastra. eds (1983) Teehniques in Molecular Biolog)'
(MacMillan Publishing Companv. New York); Kunkel ( 1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel et al (1987) Methods Enzvmol. 154:367-382; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratorv Manual (Cold Spring Harbor. New York); U.S. Patent No. 4,873.192; i reference su ovde citirane. Uputstvo kako odgovarajuće amino kiselinske zamene koje ne utiču na biološu aktivnost polipeptida od interesa mogu se naći u modelu od Dayhoff et al. (1978) u Atlas of protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.). Konzervativne zamene kao što je zamena jedne amino kiseline sa drugom koja ima slične osobine mogu biti poželjne. Primeri konzervativnih zamena uključuju ali nisu limitirane na, Gly$=>Ala, Val<=>Ile<=>Val, Asp<s=>Glu, Lys<=>Arg. Asn»Gln. i Phe<=>Trp<=>Tyr.
[0107] Prilikom konstruisanja varijanti polipeptida antagonist anti-CD40 antitela od interesa, modifikacije su načinjene tako da varijante i dalje poseduju željenu aktivnost, to jest sličnan afinitet vezivanja i sposobne su da se specifično vežu za humani CD40 antigen koji je eksprimiran na površini humane ćelije, i koji je bez značajne agonističke aktivnosti protiv ali pokazuje antagonističku aktivnost kada se veže za CD40 antigen na humanim CD-40-eksprimirajućim ćelijama. Očigledno, bilo koja mutacija napravljena u DNK koja kodira varijantu polipeptida ne srne da sekvencu promeni tako da je van okvira čitanja i poželjno da ne kreira komplementarne regione koji mogu napraviti sekundarnu iRNK strukturu. Videti EP
Patent Application Publication No. 75,444.
[0108] Dodatno, konstantni region antagonist anti-CD40 antitela može biti mutiran da bi se promenila efektorna funkcija na različite načine. Na primer, videti U.S: Patent No. 6,737,056B1, i US Patent Application Publication No. 2004/0132101 Al, koji otkrivaju Fc mutaciju koja optimizuje vezivanje antitela za Fc receptore.
[0109] Poželjno, varijante referentnog antagonist anti-CD40 antitela imaju amino kiselinske sekvence koje poseduju najmanje 70% ili 75% sekvencne identičnosti, poželjno najmanje 80% ili 85% sekvencne identičnosti, još poželjnije najmanje 90%, 91%, 92%, 93% , 94% ili 95% sekvencne identičnosti sa amino kiselinskom sekvencom za molekul referentnog antagonist anti-CD40 antitela, na primer, CHIR-5.9 ili CHIR-12.12 monoklonalno telo ovde opisano, ili kraće delove molekula referentnog antitela. Još poželjnije, molekuli dele najmanje 96%, 97%, 98% ili 99% sekvencne identičnosti. Za poterbe ovog pronalaska procenat sekvencne identičnosti je određen upotrebom Smith-Waterman algoritma za pretraživanje homologije korišćenjem "affine gap" pretrage sa "gap open penaltv" od 12 i "gap extension penaltv" od 2, BLOSUM matriks od 62. Smith-VVaterman algoritam za pretraživanje homologije je prikazan u Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489. Varijanta može na primer da se razlikuje od referentnog antagonist anti-CD4() antitela za samo nekoliko. I do 15 amino kiselinskih ostataka, za samo 1 do 10 amino kiselinskih ostataka, kao 6-10, za samo 4, 3. 2. ili čak 1 amino kiselinski ostatak.
101101 U odnosu na optimalno poravnanje dve amino kiselinske sekvence. kontinuirani segment icontigous segment) varijante amino kislemske sekvence može imati dodatne amino kiselinske ostatke ili deletirane amino kiselinske ostatke u odnosu na referentnu amino kiselinsku sekvencu. Kontinuirani segment upotrebijen za poredenje sa referentnom amino kiselinskom sekvencom uključiće najmanje 20 kontinuiranih amino kiselinskih ostataka, i moće biti 30. 40. SO. ili viec amino kiselinskih ostataka. Mogu se uvesti korekcije u identičnosti sekvence povezne sa zamenama konzervativnih ostataka ili prekida (videti Smith-VVaterman algoritam za pretraživanje homologije).
[0111| Precizna hemijska struktura polipeptida koji je sposoban da se specifično veže za CD40 i zadrži antagonističku aktivnost, posebno kada se veže za CD40 antigen na malignim B ćelijama, zavisi od mnogobrojnih faktora. Kakos u amino i karboksi grupe sklone jonizovanju prisutne u molekulu, određeni poipeptid može se dobiti kao kisela ili bazna so, ili u neutralnoj formi. Sve pripreme koje zadržavaju njihovu biološku aktivnost kada se postave u prikladne uslove okruženja uključene su u definisanje antagonist anti-CD40 antitela kao što se ovde koriste. Dalje, primarna amino kiselinska sekvenca polipeptida može biti pojačana derivatiacijom korišćenjem šećernih delova (glikozilacija) ili drugim dopunskim molekulima kao što su lipidi. fosfati, acetil grupe, i slični. Mogu takođe biti pojačani konjugacijom sa saharidima. Određeni aspekti takvog pojačanja postižu se putem post-translacionog sistema obrade u domaćinu proizvođaču; druge modifikacije mogu se uvestiin vitro.U svakom događaju, ove modifikacije uključene su u definiciju anti-CD40 antitela koje se ovde koristi sve dok antagonistička svojstva ant-CD40 antitela nisu uništena. Očekuje se da ovakve modifikacije mogu kvantitativno ili kvalitativno sa utiču na aktivnost, ili pojačavanjem ili smanjenjem aktivnosti polipeptida, u različitim esejima.
Dalje, pojedinačni amino kiselinski ostaci u lancu mogu biti modifikovani oksidacijom, redukcijom, ili derivatizacijom, i polipeptid može biti isečen da bi se dobili fragmenti koji zadrćavaju kativnost. Ovakve promene koje ne uništavaju antagonističku aktivnost ne uklanjaju polipeptidnu sekvencu iz definicije anti-CD40 antitela od interesa kao što se ovde koristi.
[0112] Nauka obezbeđuje značajna uputstva koja se odnose na pripremu i upotrebu polipeptidnih varijanti. Prilikom pripreme varijanti anti-CD40 antitela stručnjak iz oblasti može da utvrdi koje će nukleotidne modifikacije nativnog proteina ili amino kiselinske sekvence rezultirati u varijanti koja je pogodna za upotrebu kao terapeutska aktivna komponenta farmaceutske kompozicije koja se koristi u ovde opisanim metodama.
Terapijske metode za upotrebu antagonist anti- CD40 antitela
[0113] Metode koje su ovde otkrivene usmerene su ka upotrebi antagonist anti-CD40 antitela da bi se lečili pacijenti sa bolestima posredovanim timulacijo, CD40 signalizacije na CD40-eksprimirajućim ćelijama. Pod "CD40-eksprimirajuće ćelije" podrazumevaju se normalne i maligne B ćelije koje eksprimiraju CD40 antigen. Metode za detekciju CD40 ekspresije u ćelijama poznate su u nauci i uključuju, ali nisu limitirana na tehnike lančane reakvije polimeraze (PCR), imunohistohemije, protočne citometrije, "VVestern blot", ELISA, il slične. Pod "malignom" B ćelijom podrazumeva se neoplastična B ćelija, uključujući ali bez ograničenja B ćelije izvedene iz limfoma uključujući B ćlijski limfom niskog, srednjeg i visokog stepena. imunoblastičnog limfoma, nc-Hodkinson-ovog limfoma, Epsctin-Barr visrusa (EBV). limfoma poveznog sa sidom, kao i B ćelije akutnih limfoblastičnih leukemija, mijeloma, hroničnih limfocitičnih leukemija, akutnih mijelobastičnih leukemija, i slični.
[0114] "Tretman" je ovde definisan kao primena ili dostava pacijentu antagonist anti-CD40 antitela ili njihovog fragmenta koji vezuje antigen, ili primena ili dostava antagonist anti-CD40 antitela ili njihovog fragmenta izolovanom tkivu ili ćelisjkoj liniji iz pacijenta, pri čemu pacijent ima bolest, simptom bolesti ili predispoziciju za razvoj bolesti, pri tome cilj je izlečenje, lečenje, ublaženje, olakšanje, ispravka, smanjanje, poboljšanje ili delovanje na bolest, simptome bolesti, ili predispoziciju za razvoj bolesti. Pod "tretman" takođe se podrazumeva primena ili dostava pacijentu farmaceutske kompozicije koja sadrži antagonist anti-CD40 antitela ili njihov fragment ili primena ili dostava farmaceutske kompozicije koja sadrži antagonist anti-CD40 antitela ili njihov fragment izolovanom tkivu ili ćelisjkoj liniji iz pacijenta, pri čemu pacijent ima bolest, simptom bolesti ili predispoziciju za razvoj bolesti, pri tome cilj je izlečenje, lečenje, ublaženje, olakšanje, ispravka, smanjanje, poboljšanje ili delovanje na bolest, simptome bolesti, ili predispoziciju za razvoj bolesti.
[0115] Pod "anti-tumorska aktivnost" podrazumeva se redukcija stope proliferacije ili akumulacije malignih ćelija koje eksprimiraju CD40, i tako dolazi do pada u stopi rasta postojećeg tumora ili tumora koji je nastao u toku terapije, i/ili destrukcije postojećih neoplastičnih (tumorskih) ćelija ili novo formiranih neoplastičnih ćelija, i tako dolazi do sveukupne redukcije veličine tumora tokom terapije. Terapija sa najmanje jednim anti-CD40 antitelom (ili njiegovim fragmentom koji vezuje antigen) izaziva fizioločki odgovor koji je korstan u smislu tretmana bolesnih stanja povezanih sa stimulacijom CD40 signalizacije na CD40-eksprimirajućim ćelijama u čoveku.
[0116] Metode ovde otkrivene nalaze primenu u tretmanu ne-Hodgkinson-ovih lmfoma povezanih sa nenormalnom, nekontrolisanom proliferacijom ili akumulacijom B ćelija. Za potrebe ovog pronalaska ovakvi limfomi biće označeni na osnovu" Working Fonnulation"klasifikacione šeme, koja ove B limfome kategoriše kao niskog stepena, srednjeg stepena i visokog stepena (videti "Non-Hodgkinsons Lvmphoma Pathologic Classtfication Project", Cancer 49(19982):2112-2134). Zato, limfomi B ćelija niskog stepena uključuju mali limfocitni limfom, folikularni limfom malih ćelija sa usečenim jedrom, i mešani folikularni limfom malih ćelija sa usečenim jedrima i velikih ćelija; srednjeg stepena limfomi uključujući folikularni limfom velikih ćelija, difuzni limfome malih ćelija sa usečenim jedrom, mešani difuzni malih ćelija sa usečenim jedrima i velikih ćelija, i difuzni limfom velikih ćelija; i limfomi visokog stepena obuhvataju imunoblastični limfom velikih ćelija, limfoblastični limfom, i limfome malih ćelija sa usečenim jedrom Burkit-vog i ne-Burkit-ovog tipa.
[0117] Prihvaćeno je da su ovde otkrivene metode korisne u terapeutskim tretmanima limfoma B ćelija koji su klasifikovani na osnovu Reviseđ European and American Lvmphoma Classification sitema (REAL, sistem revidirane evropske i američka klasifikacije). Ovakvi limfomi B ćelija uključuju ali nisu njima ograničena, limfome klasifikovane kao neoplazme prekursorskih B ćelija, kao B limfobiastična leukemija/limfom: neoplazma perifernih B ćelija, uključujući hroničnu limfociinu leukemiju B ćelija/ mali limfocitni limfom. limfoplazmocitni limfom/imunocitoma. limfom ćelija omotača folikula imantle), limfom centra folikula (folikularni)
(uključujući difuzni limfom malih ćelije, mešani difuzni malih ćelija velikih ćelija, i difuzni limfom velikih ćelija), limfom marginalne zone B ćelija (uključujući ekstranodalni, nodalni i slezinski tip). leukemija dlakastih ćelija, plazmacitoma/mijeloma. difuzni limfom velikih ćelija B ćelija podtip primarni mediajstinalni (timusni). Burkitt-ov limfom. Burkilt-sličan limfom B ćelija visokog stepena, akutne leukemije; akutne limfocitne leukemije; mijeloblastične leukemije: akutne milelocitične leukemije; promijelocitične leukemije; mijelomonocitične leukemije; monocitične leukemije; eritroleukemije: policitemia veru; multipne mijelome; Waldenstorm-ova makroglobulinemija; bolest teškog lanca; i neklasifikovani limfomi B ćelija niskog stepena i visokog stepena.
[0118] Priznato je da metode koje su ovde otkrivene mogu biti korisne u sprečavanju stvaranja izdanaka tumora koji nastaju tokom terpije. Metode ovde otkrivene posebno su korisne u tretmanima subjekata koji imaju limfome B ćelija niskog stepena. posebno onih subjekata koji imaju povratak bolesti nakon hemoterapije. Limfomi B ćelija niskog stepena su sporiji nego limfomi B ćelija srednjeg- i visokog- stepena i koje karakteriše povratak/ponavlajnje pravac. Zato tretman ovih limfoma se poboljšava upotrebom meoda koje su ovde otkrivenem jer se epizode relapsa (povratka) redukuju i u broju i ozbiljnosti.
[0119] Antagonist anti-CD40 antitela ovde opisani mogu takođe pronaći primenu u tretmanima inflaminatornih oboljenja i deficijencija ili poremećaja imunog sistema uključujući ali bez ograničenja na njih, sistemski lupus eritromatozus, psorijazu. skelrodermu, CREST sindrom, inflaminatorni mijozitis, Sjorgenson-ov sindrom, bolest mešovitog vezivnog tkiva, reumatodni arthritis, multipnu sklerozu, zapaljinsku bolest creva, akutni respiratorni distres sindrom, inflaminacija pluća, idiopatska fibroza pluća, osteoporoza, hipersenzitivnost odloženog tipa astmu, primarna bilijarna ciroza, i idioptsku trombocitopenijsku purpura.
[0120] U skladu sa metodama ovde opisanim makar jedno antagonist anti-CD40 antitela (ili njigov antigen vezujući fragment) kao što je definisano bilo gde u tekstu, koristi se za promovisanje pozitivnog terapeutskog odgovora u odnosu na malignu humanu B ćeliju. Pod izrazom "pozitivan terapeutski odgovor" u odnosu na tretman raka podrazumeva se poboljšanje bolesti koje je vezano za anti-tumorsku aktivnost ovih antitela ili njihovih fragmenata, i/ili poboljšanje simptoma poveniin sa bolešću. To znači da se anti-proliferativni efekat, prevencija daljeg pupljenja tumora, redukcija veličine tumora, redukcija broja tumorskih ćelija, i/ili smanjenje jednog ili više simptoma posredovanih stimulacijon CD40-eksprimirajućih ćelija može uočiti. Zato, na primer, poboljšanje bolesti može se okarakterisati kao potpuni odgovor. Pod izrazom "potpuni odgovor" podrazumeva se odsustvo klinički detektabilne bolesti sa normalizacijom prethodnih radiografskih studijam, koštane srži, i cerebrospiralne tečnosti (CSF). Ovakvi odgovori mogu potrajati najmanje jedan mesec nakon tretmana na osnovu metoda koje su ovde otkrivene. Alternativno, poboljšanje bolesti može biti kategorizovane kao delimičan odgovor. Pod "delimičan odgovor" podrazumeva se najmanje 50% smanjenja u svim tumorskim teretima koji se mogu izmoriti (na primer, broj ćelija tumora koje su prisutne u subjektu) u odsustvu novih lezija i koja traje najmanje jedan mesec. Ovakav odgovor primenljiv je samo na merljive tumore.
[0121] Odgovor tumora može se proceniti po promenama u morfologiji tumora ito jest. sveukupno opterećenje tumora, veličina tumora, i slično) upotrebom tehnika skrininga kao što su sken magnentne rezonance (MRI). x-radiografija. kompjuterska tomografija i'CT), metode biolumineseentog slikanja, na primer, vi/.eulizaoija pomoću luciferaze, skeniranje kostiju, i uzorkovanie tumorske biopsijc uklučujuei aspiraciju koštane srži (BMA). Pored ovih pozitivnih terapeutskih odgovora, subjekta koji je podvrgnut terapiji sa antagonist anti-CD40 antitelom ili njegovim fragmentom za vezivanje antigena može da oseti koristan efekat poboljšanja simptoma povezanih sa bolešću. Zato za tumore B ćelija, subjekat može da doživi smanjenje takozvanih B-simptoma, na primer noćna znojenja. temperatura, gubitak telesne težine, i/ili urtikariju.
[0122] Pod izrazom "terapeutski efektivna doza ili količina" ili "efektivna količina" podrazumeva se koločina antagonist anti-CD40 antitela ili njegovim fragmentom za vezivanje antigena koje kada se dostavi dovodi do pozitivnog terapeutskog odgovora u odnosu na tretman pacijenta sa bolešću koja obuhvata stimulaciju CD40-eksprimirajućih ćelija. U nekim ostvarenjima, terapeutski efektivna doza antagonist anti-CD40 antitela ili njegovog fragmenta je u rangu od oko 0.01 mg/kg do oko 40 mg/kg, od oko 0.01 mg/kg do oko 30 mg/kg, od oko 0.1 mg/kg do oko 30 mg/kg, od oko 1 mg/kg do oko 30 mg/kg, od oko 3 mg/kg do oko 30 mg/kg, od oko 3 mg/kg do oko 25 mg/kg, od oko 3 mg/kg do oko 20 mg/kg, od oko 5 mg/kg do oko 15 mg/kg, od oko 7 mg/kg do oko 12 mg/kg. Prihvata se da metod za tretiranje može da obuhvati pojedinačnu administraciju terapeutski efektivne doze ili više administarcija terapeutski efektivne doze antagonist anti-CD40 antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta.
[0123] Dalje ostvarenje ovog otkrića je upotreba antagonist anti-CD40 antitela za dijagnostički monitoring nivoa proteina u tkivu kao deo procedure kliničkog testiranja, na primer, da se utvrdi efikasnost datog režima tretmana. Detekcija može biti olakšana kuplovanjem antitela sa detektabilnom substancom. Primeri detektabilne substance uključuju različite enzime, prostetičke grupe, fluorescentne materijale, liminescentne materijale, bioluminescentne materijale, i radioaktivne materijale. Primeri pogodnih enzima uključuju peroksidazu rena, alkalnu fosfatazu, (3 galaktozidazu, ili acetilholinesterazu; primeri pogodnih prostetičnih grupa kompleksa uključuju streptavidin/biotin i avidin/biotin; primeri pogodnih fluorescentnih materijala uključuju umbeliferon, fluorescein, fluorescein izotiocijanat, rodamin. dihlorotrizinilamin fluorescein, danzil hlorid ili fikoeritrin; primer luminescentnog materijala je luminol; primeri bioluminescentnih materijala uključuju luciferazu. luciferin, i ekuorin; primeri pogodnih radioaktivnih materijala uključuju<ll3>l, 13II,<33>S. ili<3>H.
[0124] Anti-CD40 antitela ovde opisana mogu dalje da se koriste za obezbeđivanje reagensa na primer obeležena antitela koja se mogu koristiti na primer za identifikaciju želija koje eksprimiraju CD40. Ovo može biti veoma korisno u determinaciji ćelijskog tipa nepoznatog uzorka. Paneli monoklonalnih tela mogu se koristiti za identifikaciju vrste i/ili tipa organa. Na sličan način, ove anti-CD40 antitela mogu se korsititi za skrining ćelija u kulturi tkiva na kontaminaciju (to jest skrining prisustva mesavine CD40-eksprimirajućih i ne-CD40 eksprimirajućih ćelija u kulturi.
[0125| Antagonist anti-CD40 antitela mogu se koristiti u kombinaciji sa poznatim hemoterapeuticima i citokinima za tretiranje stanja bolesti koja obuhvata stimulisane CD40-eksprimirajuće ćelije. Na primer, anti-CL)40 antitela iz pronalaska mogu se koristiti u kombinaciji sa citokinima kao što je mter!eukin-2. U drugom ostvarenju. anti-CD40 antitela iz ovog pronalaska mogu se koristili u kombinaeji sa ritu\imab (1DEC-C2B8; Rituxan®: 1DEC Pharmaceutieals Corp., San Diego. Calil'ornia).
[0126| Na ovaj način, antagonist anti-CD40 antitela koja su ovde opisana, ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, dostavljaju se u kombinaciji sa najmanje jednom terapijom za kancer, uključujući ali bez ograničenja na njih, operaciju ili operaciomu proceduru (na primer, uklanjanje slezine, hirurgija jetre, uklanjanje limfnih čvorova, leukophoresisdeukoforeza, transplantacija koštane srži, i slično); radiacionu terpiju; hemoterapija, opcioanlno u kombinaciji sa uutolognim transplantom koštane srži, gde pogodni hemoterapeutski agens uključujući, ali bez ograničenja na njega, fludaribin ili fludaribin fosfat, hlorambucil, vinkristin, pentostatin, 2-hlordeoksiadenozin (kladribin), ciklofosfamid, doksorubicin, prednizon, i njihove kombinacije na primer, režimi koji sadrže antraciklinkao što je CAP) ciklofosfamid, doksorubicin plus prednizon), CHOP (ciklofosfamid, vinkristin, prednizon plus doksorubicin), VAD (vinkristin, doksorubicin plus deksametazon), MP (melfalan plus prednizon), i druge citotoksične i/ili terapeutske agense koji se koriste u hemoterapiji kao mitoksantron, daunorubicin, idarubicin, asparaginaza, i antimetabolite uključujući ali bez ograničenja na njih citarabin, metotreksat, 5-fluorouracil dekarbazin, 6-tioguanin, 6-merkaptopurin, nelarabin; druge terapije koje uključuju anti kancerogena monoklonalna antitela (na primer, alemtuzumab (Campath®) ili drugo anti-CD52 antitelo, R-1594, IMMU-106, TRU-105, AME-133. tositumomab/I-131 tositumomab (Bexxar®), ibritumomab tiuxetan (Zevalin®), ili bilo koje drugo anti-CD20 antitelo
koje cilja antigen na malignim B ćelijama; anti-CD19 antitelo (na primer, MT103, bispecifično antitelo); anti-CD22 (na primer, humanizovano monoklonalno antitelo epratuzumab); bevacizumab (Avastin®) ili drugo anti-kancerno antitelo koje cilja humani vaskulami endotelijalni factor rasta; anti-CD22 antitelo koje cilja CD22 antigen na malignim B ćelijama (na primer, monoklonalno antitelo BL-22, alfaCD22 toksin); oc-M-CSF antitelo koje cilja koloniajlni stimulatorni faktor makrofaga, antitela koja ciljaju receptor activator nuklearnog faktora-kappaB (RANK) i njegov ligand RANK, koji su prekomerno eksprimirani u višestrukom mijelomu; anti-CD23 antitelo koje cilja CD23 antigen na malignim B ćelijama (na primer IDEC-152); anti-CD80 antitelo koje cilja CD80 antigen (na primer IDEC-114); anti-CD38 antitelo koje cilja CD38 antigen na malignim B ćelijama; antitela koja ciljaju receptore za glavni kompleks za histokompatibilnost II (anti-MHC antitela) koji su eksprimirani na malignim B ćelijama; druga anti-CD40 antitela (na primer, SGN-40) koji ciljaju CD40 antigen na malignim B ćelijama; i antitela koja ciljaju receptorl inducibilnog liganda faktor tumora nekroze-povezanog sa apoptozom (TRAIL-R1)) (na primer, agonističko humano monoklonalno antitelo HGS-ETR1) i TRAIL-R2 eksprimirani na mnogobrojnim solidnim tumorima i tumorima hematopoetskog porekla); terapije za rak koje se baziraju na malim molekulima, uključujući ali bez ograničenja mikrotubule i/ili inhibitore topoizomeraze (na primer, mitotički inhibitor dolastatin i analoge dolastatina; tubulin-vezujući agens T900607; XL119; i inhibitor topoizomeraze aminokamptotecin), SDX-105 (bendamustin hiđrohloriđ), iksabepilon (analog epotilona, takođe označen kao BMS-247550). inhibitori protein kinaze C. na primer. midostaurin ((PKC-412, CGP 41251, N-benzoilstaurosporin). piksantron. eloksatin (antineoplastični agens), ganit (gulijum nitrat), Thalonnđ® (talodomid). inumomodulatorski derivati lalidomida (na primer. revlimid (nekadašnji revimid)). Afftnitak ^ (antisens inhibitor protein kinaze C-alfa), SDX-101 (R-etodolak. uključujući apoptozu malignih limfocota). drugu generaciju analoga purinskih nukleozida kao što su klofarabin. inhibitori proizvodnje proteina Bcl-2 od strane ćelija raka (na primer, antisens agensi oblimcrsen i Genasense®) inhibitori proteazoma (na primer. Velcadc™ (bortezomib)). mali molekuli inhibitori kinaze (na primer, CHIR-258). mali molekuli inhibitori VEGF (na primer. ZD-6474), mali molekuli inhibitori proteina toplotnog šoka 90 (HSP - heat shock protein) (na primer 17-AAG). mali molekuli inhibitori histonskih deacetilaza (na primer, hibrid/polarui "cytodifferentiation" HPC) agensi kao suberanilohidroksamična kislina (SAHAi. i FR-901228) i apoptotički agensi kao Trisenox® (arsen trioksid) i Xcytrin®
(moteksafin gadolinium); terapije raka bazirane na terapijama vakcina/imunoterapija. uključujući ali bez ograničenja, pristupe sa vakcinama (na primer, Id-KLH, onkofag. vitaletin), personalizovana imunoterapija ili aktivna idiopatska imunoterapija (na primer, MyVax® Personalized Immunotherapy, nekada označena kao GTOP-99). Promune® (CpG 7909, sintetički agonist za "toll-like" receptor 9 (TLR9)), terapija sa interferonom-alfa, interleukin-2 (IL-2) terapija, interleukin-12 terapija, interleukin-15 terapija, interleukin-21 terapija; terapija steroidima; ili druge terapije raka; pri čemu se dodatna terapija raka dostavlja pre, tokom, ili nakon terapije sa antagonist anti-CD40 antitela. Zato, tamo gde kombinovane terapije sadrže administraciju antagonist anti-CD40 antitela ili njegov antigen-vezujući fragment u kombinaciji sa administracijom drugog terapeutskog agensa, kao što je hemoterapija, radiaciona terapija, druga anti-kancerna terapija antitelom, terapija raka bazirana na malom moleuklu, ili terapija raka bazirana na vakcini/imunoterapiji, metode ovde otkrivene obuhvataju koadministraciju, upotrebom odvojenih formulacija ili pojedinačnu
farmaceutsku formulaciju, ili i uzastopna administracija po bilo kpm rasporedu. Gde, metode koje su ovde otkrivene obuhvataju kombinovane terapeutske režime, ove terapije mogu biti date istovremeno, to jest, antagonist anti-CD40 antitela ili njegov antigen-vezujući fragment dostavlja se isovremeno ili u okviru istog vremenskpog opsega kao i druga terapija za rak (to jest, terapije teku istovremeno, ali antagonist anti-CD40 antitela ili njegov antigen-vezujući fragment ne daje se tačno u isto vreme kao druga terapija za rak). Alternativno, antagonist anti-CD40 antitela iz ovog pronalaska ili njegov antigen-vezujući fragmentmogu takođe biti dostavljeni pre ili posle druge terapije. Sekvencijalna administracija različitih terapija za rak može se izvesti bez obzira da li subjekat koji se tretira reaguje na prvu turu terapije u smeru smanjenja mogućnost remisije (faza smirenja) ili relapsa (ponovo izbijanje). Tamo gde kombinovane terapije obuhvataju administraciju antagonist anti-CD40 antitela ili njegov antigen-vezujući fragment u kombinaciji sa administracijom citotoksičnog agensa, poželjno antagonist anti-CD40 antitela ili njegov antigen-vezujući fragment se dostavljaju pre administracije citotoksičnog agensa.
[0127] U nekim ostvarenjima pronalaska, ovde opisan antagonist anti-CD40 antitela ili njegov antigen-vezujući fragment dostavljaju se u kombinaciji sa hemoterapijom i ocionalno u kombinaciji sa autologotn transplantacijom koštane srži, naznačeno time da antitelo i hemoterapeutski agens(i) mogu biti dostavljeni sekvencijalno, po bilo kom redosledu, ili simultano (to jest, istovremeno ili u okviru istog vremenskog okvira). Primeri pogodnih hemoterapeutskih agenasa uključuju ali nisu limitirana na njih. fludarabin ili fludarabin fosfat, hlorambucil, vinkristin, pentostatm. 2-hlordeoksiadenozin (kladribin), ciklofosfamid. doksorubicin, prednizon. i njihove kombinacije na primer, režimi koji sdarže antraciklin kao što je CAP (ciklofo>!amiđ. doksorubicin plus prednizon), CHOP (ciklofosfamid, vinkristin, prednizon plus doksorubicin), VAD (vinkristin. doksorubicin plus deksametazon), MP (melfalan p:us prednizon). i druge cilotoksične i/ili terapeutske agense koji se koriste u hemoterapiji kao mitoksantron. daunorubicin, idarubicin. asparaginaza. i antimetabolite uključujući ali bez ograničenja na njih citarabin. metotreksat, 5-fIuorouracil dekarbazm. o-tioguanin, 6-merkaptopurin i nelarabin. U nekim ostvarenjima antagonist anti-CD40 antitela na primer. monoklonalno antitelo CHIR-12.12 ili CHIR-5.9 ili bilo koji njihov antigen-vezujući fragment dostavlja se pre tretmana sa hemoterapeutskim agensom. U okiru alternativnih ostvarenja antagonist anti-CD40 antitelo se dostavlja nakon tretmana sa hemoterapeutskim agensom. U još drugim ostvarenjima hemoterapeutski agens se dostavlja istovremeno sa antagonist anti-CD40 antitelom ili njegovim antigen-vezujući fragmentom.
[0128] Zato, na primer, u nekim ostvarenjima antagonist anti-CD40 antitelo. na primer monoklonalno antitelo CHIR-12.12 ili CHIR-5.9 ili bilo koji njihov antigen-vezujući fragment dostavlja se u kombinaciji sa fludarabin-om ili fludarabin fosfatom. U jednom takvom ostvarenju, antagonist anti-CD40 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment dostavlja se pre dostavljanja fludarabina ili fludarabin fosfata. U alternativnim ostvarenjima antagonist anti-CD40 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment dostavlja se nakon tretmana sa fludarabin-om ili fludarabin fosfatom. U još drugim ostvarenjima fludarabin ili fludarabin fosfat se dostavlja istovremeno sa antagonist anti-CD40 antitelom ili njegovim antigen-vezujući fragmentom.
[0129] U drugim ostvarenjima ovog pronalaska hlorambucil, alkilirajući lek. se dostavlja u kombinaciji sa antagonist anti-CD40 antitelom koje je ovde opisano, na primer monoklonalno antitelo CHIR-12.12 ili CHIR-5.9 ili njihov antigen-vezujući fragment. U jednom takvom ostvarenju, antagonist anti-CD40 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment dostavlja se pre dostavljanja hlorambucila. U alternativnim ostvarenjima antagonist anti-CD40 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment dostavlja se nakon tretmana sa hlorambucilom. U još drugim ostvarenjima, hlorambucil se dostavlja istovremeno sa antagonist anti-CD40 antitelom ili njegovim antigen-vezujući fragmentom.
[0130] U drugim ostvarenjima, režimi koji sadrže antraciklin kao CAP (ciklofosfamid, doksorubicin plus prednizon), CHOP (ciklofosfamid, vinkristin, prednizon plus doksorubicin) mogu se kombinovati sa administracijom antagonist anti-CD40 antitela koje je vde opisano, na primer monoklonalno antitelo CHIR-12.12 ili CHIR-5.9 ili njihovim antigen-vezujući fragmentom. U jednom takvom ostvarenju antagonist anti-CD40 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment dostavlja se pre administracije režima koji sadrže antraciklin. U drugim ostvarenjima antagonist anti-CD40 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment dostavlja se nakon tretmana sa režimima koji sadrže antraciklin. U još drugim ostvarenjima, režimi koji sadrži antraciklin se dostavlja istovremeno sa antagonist anti-CD40 antitelom ili njegovim antigen-vezujući fragmentom.
[0131] U alternatinim ostvarenjima, ovde opisano antagonist anti-CD40 antitelo, na primer monoklonalno antitelo CHIR-12.12 ili CHIR-5.9 ili njihov antigen-vezujući fragment se dostavlja u kombinaciji sa alemtuzumab-om (Campath®. distribuiran od strane Berle.\Laboratories, Richmond. California). Alemtuzumab jc rekombinantno humanizovano monoklonalno antitelo (Campath-1II) koje cilja CD52 antigen eksprimiran na malignim B ćelijama. U okviru jednog takvog ostvarenja, antagonist anti-CD4() antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment dostavlja se pre administracije alemtuzumaba. U drugim ostvarenjima, antagonist anti-CD4() antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment dostavlja se nakon tretmana alemtuzumabom. U još drugim ostvarenjima, alemtuzumab se dostavlja istovremeno sa antagonist anti-CD40 antitelom ili njegovim antigen-vezujući fragmentom.
[0132] U alternatinim ostvarenjima, ovde opisano antagonist anti-CD40 antitelo. na primer. monoklonalno antitelo CHIR-12.12 ili CHIR-5.9 ili njihov antigen-vezujući fragment se dostavlja u kombinaciji sa terapeutskim anti-CD20 antitelom koje cilja CD20 antigen na malignim B ćelijama, na primer, rituksimab (Rituxan®), potpuno humano antitelo Humax-CD20, R-1594, IMMU-106, TRU-015, AME-133. tositumomab/I-131 tositumomab (Bexxar®) ili ibritumomab tiuksetan (Zevalin®). U jednom takvom ostvarenju, antagonist anti-CD40 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment dostavlja se pre administracije anti-CD20 antitela. U drugim ostvarenjima, antagonist anti-CD40 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment dostavlja se nakon tretmana anti-CD20 antitelom. U još drugim ostvarenjima, anti-CD20 antitelo se dostavlja istovremeno sa antagonist anti-CD40 antitelom ili njegovim antigen-vezujući fragmentom.
[0133] U alternativnim ostvarenjima, ovde opisano antagonist anti-CD40 antitelo, na primer, monoklonalno antitelo CHIR-12.12 ili CHIR-5.9 ili njihov antigen-vezujući fragment se dostavlja u kombinaciji sa terapijom raka baziranoj na malom molekulu, uključujući ali bez ograničenja, inhibitore mikrotubule i/ili topoizomeraze (na primer. mitotički inhibitor dolastatin i analoge dolastatina; tubulin-vezujući agens T900607; XL119; i inhibitor topoizomeraze aminokamptotecin), SDX-105 (bendamustin hidrohlorid), iksabepilon (analog epotilona, takođe označen kao BMS-247550), inhibitori protein kinaze C, na primer, midostaurin ((PKC-412, CGP 41251, N-benzoilstaurosporin), piksantron, eloksatin (antineoplastični agens), ganit (galijum nitrat), Thalomid® (talodomid), imunomodulatorski derivati talidomida (na primer, revlimid (nekadašnji revimid)), Affinitak™ (antisens inhibitor protein kinaze C-alfa), SDX-101 (R-etodolak, uključujući apoptozu malignih limfocota), drugu generaciju analoga purinskih nukleozida kao što su klofarabin, inhibitori proizvodnje proteina Bci-2 od strane ćelija raka (na primer, antisens agensi oblimersen i Genasense®) inhibitori proteazoma (na primer, Velcade™ (bortezomib)), mali molekuli inhibitori kinaze (na primer, CHIR-258), mali molekuli inhibitori VEGF (na primer, ZD-6474), mali molekuli inhibitori proteina toplotnog šoka 90 (HSP - heat shock protein) (na primer 17-AAG), mali molekuli inhibitori histonskih deacetilaza (na primer, hibrid/polarni "cvtodifferentiation" HPC) agensi kao suberanilohidroksamična kislina (SAHA), i FR-901228) i apoptotički agensi kao Trisenox® (arsen trioksid) i Xcytrin® (moteksafin gadolinium). U jednom takvom ostvarenju, antagonist anti-CD40 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment dostavlja se pre administracije terapije raka baziranoj na malom molekulu. U drugim ostvarenjima, antagonist anti-CD40 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment dostavlja se nakon tretmana terapijom raka baziranoj na malom molekulu. LJ još drugim ostvarenjima, terapija raka bazirana na malom molekulu se dostav lja istovremeno sa antagonist anti-CD40 antitelom ili njegovim antigen-vezujući fragmentom.
[OI34j U još drugim ostvarenjima, ovde opisano antagonist anti-CD40 antitelo. na primer. monoklonalno antitelo CHIR-12.12 ili CHIR-5.9 ili njihov antigen-vezujući fragment može se koristi u kombinaciji sa terapijom raka koja se bazira na vakcini/imunoterapiji, uključujući ali bez ograničenja ma primer. Id-KLH. on'kolag. vitaletin). personalizovana imunoterapija ili aktivna iđiopatska imunoterapija ma primer. MyVax® Personalizcd Immunotherapv. nekada označena kao GTOP-99). Promune® (CpG 7909, sintetički agonist za "toll-like" receptor 9 (TLR9)). terapi ja sa interferonom-alfa, interleukin-2 (IL-2) terapija, interleukin-12 terapija, interleukin-1 5 terapija ili intciieukin-21 terapija; ili terapija steroidima. U jednom takvom ostvarenju, antagonist anti-CD40 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment dostavlja se pre administracije terapije raka koja se bazira na vakcini/imunoterapiji. U drugim ostvarenjima, antagonist anti-CD40 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment dostavlja se nakon tretmana terapijom raka koja se bazira na vakcini/imunoterapiji. U još drugim ostvarenjima, terapija raka koja se bazira na vakcini/imunoterapiji se dostavlja istovremeno sa antagonist anti-CD40 antitelom ili njegovim antigen-vezujući fragmentom.
[0135] U jednom takom ostvarenju, ovde opisano antagonist anti-CD40 antitelo, na primer, monoklonalno antitelo CHIR-12.12 ili CHIR-5.9 ili njihov antigen-vezujući fragment može se koristi u kombinaciji sa IL-2. IL-2, agens koji je poznat da povećava broj efektormih ćelija prirodnih ubica (NK) kod tretiranih pacijenata, može se dostavljati pre, ili zajedno sa antagonist anti-CD40 antitelom iz pronalaska ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom. Ovaj povećan broj NK efektornih ćelija može dovesti do povećane ADCC aktivnosti dostavljenog antagonist anti-CD40 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta. U drugim ostvarenjima, IL-20 služi kao imunoterapeutski agens za stimulaciju NK ćelijske aktivnosti kada sc dostavi u kombinaciji sa antagonist anti-CD40 antitelom iz pronalaska, na primer, monoklonalno antitelo CHIR-12.12 ili CHIR-5.9 ili njihov antigen-vezujući fragment.
[0136] Dalje, kombinovana terapija sa dva ili više terapeutska agensa i antagonist anti-CD40 antitelom koje je ovde opisano, može se takođe koristiti za lečenje bolesnih stanja koja obuhvataju CD-eksprimirajuće ćelije, na primer kanceri povezani sa B ćelijama, i autoimune i/ili inflaminatorne (zapaljinske) poremećaje. Bez ograničenja, primeri uključuju trostruku ombinacionu terapiju, gde dva hemoterapeutska agensa se dostavljaju u kombinaciji sa antagonist anti-CD40 antitelom koje je ovde opisano, i gde hemoterapeutski agens i drugo anti-kancerno monoklonalno antitelo (na primer, alemtuzumab, rituksimab, ili anti-CD23 ntitelo) se dostavljeju u kombinaciji sa antagonist anti-CD40 antitelom koje je ovde opisano. Primeri ovake kombincije uključuju monoklonalno antitelo CHIR-12.12 ili CHIR-5.9 ili njihov antigen-vezujući fragment; i kombinacije fludarabina, anti-CD antitela, na rpiemr, rituksimab (Rituxan®; IDEC Pharmaccuticala Corp., San Diego, California) i antagonist anti-CD40 antitelo, na primer, monoklonalno antitelo CHIR-12.12 ili CHIR-5.9 ili njihov antigen-vezujući fragment.
Farmaceutske formulacije i načini administracije ( dostavljanja)
[0137] Antagonist anti-CD40 antitela iz ovovg pronalaska dostavljaju se u koncentraciji koja je terapeutski sfektivna da spreči ili lcči bolesti posredovane CD-eksprimirajućih ćelija kao što su SLE. PBC. ITP, multipna skleroza, psorijaza. Kronova bolest, odbacivanje transplanta. i limfoma B ćelija. Da bi se ostvario ovaj cilj. antitela moraju biti formulisana upotrebom različitih ekspicijenata poznatih u oblasti. Tipično, antitela se dostavljaju putem injekcije, ili intravenozno ili intrapcritonealno. Metode za ostvarivanje ove administracije poznati su onima koji se bave ovom oblašću. Takođe. moguće je dobiti kompozicije koje mogu biti dostavljene topično (lokalno) ili oralno, ili da se može preneti preko mukoznih membrana.
[0138| Intravenozna administracija dešava se poželjno infuzijom tokom vremenskog perioda od oko 1 do oko 10 sati, poželjnije tokom perioda od oko I do oko 8 sati. i još poželjnije, tokom perioda od oko 2 do oko 7 sati, i još poželjnije, tokom perioda od oko 4 do oko 6 sati. u zavisnoti od anti-cđ4() antitela koje se dostavlja. Inicijalna infuzija sa farmaceutskom kompozicijom može se dati tokom perioda od oko 4 do oko 6 sati sa sledećim infuzijama koje se dostavljaju brže. Sledeće infuzije mogu se dostaviti tokom perioda od oko 1 do oko 6 sati uključujući, na primer. od oko 1 do oko 4 sata, oko 1 do oko 3 sata, oko 4 do oko 2 sata.
[0139J Farmaceutska kompozicija iz pronalaska je formulisana da bude kompatibilna sa željenim putem administracije. Primeri mogućih puteva administracije uključuju parenteralnu (na primer, intravenozno (IV), intramuskularno (IM), intradermalno. subkutanozno tj. potkožno (SC) ili infuzija), oralnu i pulmonarnu tj. plućnu (na primer inhalacija), nazalnu, transdermalnu (lokalnu), transmukozalnu, i rektalnu administraciju. Rastvori ili suspenzije koje se koriste za parenteralnu, intradermalnu. ili subkutanoznu primenu mogu uključiti sledeće komponente: sterilni rastvarač kao što je voda za injekciju, Fizioločki rastvor, fiksirana ulja, polietilen glikolo, glvcerin. propilen glikol, i drugi sintetički rastvarači; antibakterijski agensi kao benzil alcohol ili metil parabeni; antioksidansi kao askorbinska kiselina ili natrijum bisulfat; helirajući agensi kao etilendiamintetrasirćetna kiselina; puferi kao acetati, citrati, ili
fosfati i agensi za podešavanje tomusa kao natrijum hlorid ili dekstroza. pH se može podesiti sa kiselinama ili bazama kao što su hidrohlorna kiselina ili natrijum hidroksid. Parenteralna preparacija može biti smeštena u ampulama, špriceima za jednokratnu upotrebu, ili vajlama sa višestrukom dozom od stakla ili plastike.
[0140] Anti-CD40 antitela su tipično obezbeđena standardnom tehnikom u farmaceutski prihvatljivom puferu, na primer, sterilni fiziološki rastvor, sterilna puferisana oda, propilen glikol, ili njihova kombinacija, itd. Metode za pripremu agenasa koji se dostavljaju parenteralno opisane su u Remingrons Pharmaceutical Sciences (18<lh>ed; Mack Publishing Companv, Eaton, Pennsvlania, 1990). Videti takođe WO 98/56418 koji opisuje stabilisano antitelo u farmaceutskoj formulaciji koja je pogodna za upotrebu u metodama koje su ovde opisane.
[0141] Količina makar jednog anti-CD40 antitela ili njegovog fragmenta koja treba dase dostavlja je već određena od strane stručnjaka iz oblasti bez eksperimentisanja. Faktori koji utiču na način administracije i odgovarajuće količine makar jednog antagonist anti-CD40 antitela (ili njegovog fragmenta) uključuju ali nisu njima ograničeni, težinu bolesti, istorijat bolesti, godište, visinu, težinu, zdravstveni status, i fizičku kondiciju individue koja se podvrgava terapiji. Slično, količina antagonist anti-CD40 antitela ili njegovog fragmenta koja će se dostaviti zavisiće od načina dostave id a li subjekat se podvrgava jednoj dozi ili višestrukim dozama ovog anti-tumorskog agensa. Generalno, viša doza anti-CD40 antitela ili njegovog fragmenta poželjna je kod subjekta sa povezanom telesnom težinom a koji sc podv rgava terapiji. Doza anti-CD40 antitela ili njegovog fragmenta koja će se dostaviti je u opsegu od oko 0.003 mg/kg do oko 50 mg/kg, poželjno u opsegu od oko 0.01 mg/kg do oko 40 mg/kg. Zato, na primer, doza može biti 0.01 mg/kg, 0.03 mg/kg. 0.1 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.5 mg/kg. 1 mg/kg. 1.5 mg/kg. 2 mg/kg, 2.5 mg/kg. 3 mg/kg. 5 mg/kg. 7 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg. 20 mg/kg. 25 mg/kg, 30 mg/kg. 35 mg/kg. 40 mg/kg. 45 mg/kg ili 50 mg/kg.
[0142] U drugom ostvarenju ovog otkrića metoda obuhvata administraciju višestrukih doza antagonist anti-CD40 antitela ili njegovog fragmenta. Metoda može da obuhvati administraciju 1, 2. 3, 4, 5, 6, 7. 8. 9. 10. 15, 20, 25. 30. 35. 40 ili više terapeutski efektivnih doza farmaceutske kompozicije koja sadrži antagonist anti-CD40 antitelo ili njegov fragment. Frekvenca i trajanje administracije više doza farmaceutske kompozicije koja sadrži antagonist anti-CD40 antitelo ili njegov fragment može na licu mesta da odredi osoba obučena u ovoj oblasti bez eksperimentisanja. Takođe, tretman subjekta sa terapeutski efektivnom količinom antitela može uključiti jednu dozu, ili poželjno može uključiti seriju tretmana. U poželjnom primeru. subjekat se tretira sa antagonist anti-CD40 antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom u opsegu od oko 0.1 do 20 mg/kg telesne težine jednom nedeljno između 1 do 10 nedelja, poželjno između 2 do 8 nedelja, još poželjnije između 3 do 7 nedelja. i još poželjnije tokom oko 4, 5, ili 6 nedelja. Tretman se može izvesti na godišnjem niou da bi se sprečio povratak ili nakon indikacije relapsa (povratka raka). Takođe efektvina doza antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta koje se koristi u tretmanu može da se poveća ili smanji tokom određenog tretmana. Promene u doziranju mogu rezultirati i postati očigledne iz dijagnostičkih eseja koji su ovde opisani.
[0143] Tako, u jednom ostvarenju, režim doziranja uključuje prvu administraciju terapeutski efektivne doze najmanje jednog anti-CD40 antitela ili njegovog fragmenta 1, 7, 14, i 21 dana tokom perioda tretmana. U drugom ostvarenju, režim doziranja uključuje prvu administraciju terapeutski efektivne doze najmanje jednog anti-CD40 antitela ili njegovog fragmenta 1, 2, 3, 4, 5, 6 i 7 nedelje u periodu tretmana; režim doziranja uključujući prvu administraciju terapeutski efektivne doze najmanje jednog anti-CD40 antitela ili njegovog fragmenta 1-og dana 3-eg dana nedelje u priodu tretmana; i poželjni režim doziranja uključujući prvu administraciju terapeutski efektivne doze najmanje jednog anti-CD40 antitela ili njegovog fragmenta 1-og dana nedelje u priodu tretmana. Period tretmana može uključiti 1 nedelju, 2 nedelje, 3 nedelje, mesec, 3 meseca, 6 meseci ili jednu godinu.
[0144] U nekim ostvarenjima, terapeutski efektivne doze antagonist anti-CD40 antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta, je u opsegu od oko 0.003 mg/kg do oko 50 mg/kg, od oko 0.01 mg/kg do oko 40 mg/kg, od oko 0.01 mg/kg do oko 30 mg/kg, od oko 0.1 mg/kg do oko 30 mg/kg, od oko 0.5 mg/kg do oko 30 mg/kg, od oko 1 mg/kg do oko 30 mg/kg, od oko 3 mg/kg do oko 30 mg/kg, od oko 3 mg/kg do oko 25 mg/kg, od oko 3 mg/kg do oko 20 mg/kg, od oko 5 mg/kg do oko 15 mg/kg. ili od oko 7 mg/kg do oko 12 mg/kg. Zato, na primer, doza bilo kog antagonist anti-CD40 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela može biti 0.003 mg/kg. 0.01 mg/kg, 0.03 mg/kg. 0.1 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 1.5 mg/kg. 2 mg/kg. 2.5 mg/kg, 3 mg/kg. 5 mg/kg, 7 mg/kg. 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg. 30 mg/kg. 35 mg/kg, 40 mg/kg. 45 mg/kg ili 50 mg/kg ili druga tako da do/a potpada u opseg od oko 0.003 mg/kg do oko 50 mg/kg. Ista terapeutski efektivna doza antagonist anti-CD40 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela može biti dostavljena tokom svake nedelje doziranja antitelom. Alternativno, različite terapeutski efektivne doze antagonist anti-CD40 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta mogu se upotrebljavati tokom celog perioda tretmana.
[01451 U drugim ostvarenjima, inicijalna terapeutski efektivna doza antagonist anti-CD40 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta kao što je definisano bilo gde ovde, može biti u nižem opsegu doziranja (na primer, oko 0.003 mg/kg do oko 20 mg/kg) sa sledećim dozama koje potpadaju pod viši opseg doziranja (na primer. od oko 20 mg/kg do oko 50 mg/kg).
[0146] U alternativnim ostvarenjima, inicijalna terapeutski efektivna doza antagonist anti-CD40 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta kao što je definisano bilo gde ovde, može biti u višem opsegu doziranja (na primer od oko 20 mg/kg do oko 50 mg/kg) sa sledećim dozama koje padaju u donji opseg doziranja (na primer. 0.003 mg/kg do oko 20 mg/kg). Zato, u jednom ostvarenju inicijalna terapeutski efektivna doza antagonist anti-CD40 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta je oko 20 mg/kg do oko 35 mg/kg, uključujući oko 20 mg/kg, oko 25 mg/kg, oko 30 mg/kg, i oko 35 mg/kg, i zatim terapeutski efektivne doze antagonist anti-CD40 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela su oko 5 mg/kg, do oko 15 mg/kg, uključujući 5 mg/kg, 8 mg/kg, 10 mg/kg, 12 mg/kg, i oko 15 mg/kg.
[0147] U nekim ostvarenjima poronalaska. terapija sa antagonist anti-CD40 antitelom se inicira administracijom "doze za punjenje (Ioading dose)" antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta subjektu kome je potrebna terapija sa antagonist anti-CD40 antitelom. Pod izrazom "doza za punjenje (Ioading dose)" podrazumeva se inicijalna doza antagonist anti-CD40 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta koja se dostavlja subjektu, pri čemu doza antagonist anti-CD40 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta pada u viši opseg doziranja (na primer od oko 20 mg/kg do oko 50 mg/kg). "Doza za punjenje" može se dostaviti IV, ili u obliku vipestrukih dostavljanja, na primer, višestruke infuzije gde antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment se dostavljaju IV, sve dok se kompletna "doza za punjenje" dostavi u periodu od 24 sata. Nakon administracije "doze za punjenje", subjektu se dostavljaju dodatna jedna ili više terapeutski efektivnih doza antagonist anti-CD40 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta. Dodatne terapeutski efektivne doze mogu se dostaviti, na primer, po nedeljnom rasporedu za doziranje, ili jednom u dve nedelje, jednom u tri nedelje, ili jednom u četiri nedelje. U ovakvim ostvarenjima, dodatne terapeutski efektivne doze generalno se nalaze u nižem opsegu doziranja (na primer, oko 0.003 mg/kg do oko 20 mg/kg).
[0148] Alternativno, u nekim ostvarenjima, nakon "doze za punjenje" naredne terapeutski efektivne doze antagonist anti-CD40 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta se dostavljaju na osnovu "rasporeda održavanja", naznačeno time da terapeutski efektivne doze antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta se dostavljaju jednom mesečno, jednom svakih 6 meseci, jednom svaka dva meseca, jednom svakih 10 meseci, jednom svaka tri meseca. jednom svakih 14 meseci, jednom svaka četiri meseca, jednom svakih 18 meseci, jednom svakih pet meseci, , jednom svaka 22 meseca, jednom svakih šest meseci. jednom svakih 7 meseci, jednom svakih 8 meseci, jednom svakih 9 meseci. jednom svakih 10. jednom svakih 11 meseci, ili jednom svakih 12 meseci: U ovakvim ostvarenjima, terapeutski efektivne doze antagonist auti-CD40 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta se nalaze u nižem opsegu doziranja (na primer. oko 0.003 mg/kg do oko 20 mg/kg), posebno kada se dodatne doze dostavljaju u frekventnijim intervalima, na primer. jednom u dve nedelje do jednom u mesec dana. ili pada u viši opseg doziranja (na primer od oko 20 mg/kg do oko 50 mg/kg), posebno kada se dodatne doze dostavljaju u manje frekventnim intervalima oko jednom mesečno do oko 12 meseci razdvojeno.
[0149] Antagonist anti-CD40 antitela prisutna u farmaceutskim kompozicojama koje su ovde opisane za upotrebu u metodama koje su ovde otkrivene mogu biti nativna ili dobijena tehnikama rekombinacije, i mogu biti od bilo kog izvora, uključujući sisarske izvore kao na primer, miš, pacov, zec, prmat. prase, i čovek. Poželjno, ovakvi polipeptidi se dobijaju os humanog izvora, i još poželjnije su rckombinantni humani proteini iz hibridoma ćelijskih linija.
[0150] Farmaceutske kompozicije korisne u metodama koje su ovde otkrivene obuhvataju bioločki aktivne varijante antagonist anti-CD40 antitela iz pronalaska. Ovakve varijante trebalo bi da kada se dostave subjektu, zadrže biološku aktivnost nativnog polipeptida tako da farmaceutska kompozicija koja sadrži varijantu polipeptida ima isti terapeutski efekat kao farmaceutska kompozicija koja sadrži nativni polipeptid. To jest, varijanta anti-CD40 antitela će služiti kao terapeutski aktivna komponenta u farmaceutskoj kompoziciji na način sličan onok koji se detektuje za nativno antagonist antitelo, na primer, CHIR-5.9 ili CHIR-12.12 koje se eksprimira od strane hibridoma ćelijske linije 5.9 ili 12.12. Metode su dostupne u oblasti, za determinaciju da li varijanta anti-CD40 antitela zadržava željenu biološku aktivnost, i tako služi kao terapeutski aktivna komponenta u farmaceutskoj kompoziciji. Biološka aktivnost varijanti antitela može se meriti esejima specifično dizajniranim za merenje aktivnosti nativnog antagonist antitela, uključujući eseje koji su ovde opisani.
[0151] Bilo koja farmaceutska kompozicija koja sadrži antagonist anti-CD40 antitelo koje ima ovde opisane osobine vezivanja, može se koristiti kao terapeutski aktivna komonenta u metodama koje su ovde otkrivene. Zato, tečna, liofilizovana, ili osušena sprejom (spray dried) kompozicija koja sadrži jedno ili više antagonist anti-CD40 antitela iz pronalaska može se pripremiti kao vodeni ili nevodeni rastvor ili suspenzija za dalju administraciju subjektu u skladu sa ovde otkrivenim metodama. Svaka od ovih kompozicija sadržaće najmanje jedno od antagonist anti-CD40 antitela iz ovog pronalaska kao teraputski ili profilaktički aktivnu komponentu. Pod izrazom "teraputski ili profilaktički aktivna komponenta" podrazumeva se da je anti-CD40 antitelo specifično inkorporisano u kompoziciju da bi dovelo do željenog terapeutskog ili profilaktičkog odgovora u odnosu na tretman, prevenciju, ili dijagnozu bolesti ili stanja u subjektu kada se farmaceutska kompozicija dostavlja subjektu. Poželjno, farmaceutske kompozicije obuhvataju odgovarajuće stabilizujuće agense, "bulking" agense, ili obe da bi se minimalizovali problemi povezani sa gubitkom proteinske stabilnosti i biološke aktivnosti tokom pripreme i skladištenja.
[0152] Mogu se dodati formulacije u farmaceutske kompozicije koje sadrže antagonist anti-CD40 antitelo iz ovog pronalaska. Ove formulacije mogu uključiti, ali nisu njima limitirane, ulja, pol i me re. vitamine, ugljene hvdrate, "amine" kiseline, soli. pufere, albumin. surfaktante, ili "bulking" agense. Poželjni ugljeni hicirati uključuju šećer ili šećerne alkohole kao mono-, di-, ili polisahariđe. ili glukane rastvorljne u vodi. Saharidi ili glukani mogu uključiti fruktozu. glukozu, manozu. sorbozu. ksilozu. maltozu. saharozu. dekstran, pululan. dekstrin, a i p ciklođekstrin. solubilm škrob, hidroksietil škrob, i karboksimetil clulozu ili njihove mešavine."Šećerni alkohol** se definiše kao C4 do C*ugljovodonik koji ima hidroksil grupu i uključuje galaktitol. inozitol, manitol. ksilitol, sorbitol. glvcerol, i arabitol. Ovi šećeri ili šećerni alkoholi mogu se koristiti pojedinačno ili u kombinaciji. Koncentracija šećera ili šećernog alkohola je između 1.0% o 7% vv/v. poželjnije između2%i &% vv/v. Poželjne amino kiseline uključuju love (L) forme karnitina, arginina. i betaina; međutim, druge amino kiseline mogu biti dodate. Poželjni polimeri uključuju polivinilpiroliđon (PVP) sa prosečnom molekulskom težinom između 2,000 i 3,000. ili polietilen glikol (PEG) sa prosečnom molekulskom težinom između 3,000 i 5,000. Surfaktanti koji sc mogu dodati formulaciji prikazani su u EP Nos. 270,799 i 268,1 10.
[0153] Dodatno, antitela mogu biti hemijski modifikovana kovalentnom konjugacijom za polimer da bi se povećao njihov polu-život u cirkulaciji, na primer. Poželjni polimeri i metode za njihovo vezivanje za peptide prikazani su u U.S. Patent Nos. 4,766,106; 4.179,337; 4,495,285; i 4,609,546.
[0154] Poželjni polimeri su polioksetilovani polioli i polietilen glikol (PEG). PEG je solubilan u vodi na sobnoj temperaturi ii ma opštu formulu: R(0-CH2--CH2)„0—R gde R može biti vodonik, ili protektivna grupa kao alkil ili alkanol grupa. Poželjno, protektivna grupa imaa između 1 i 8 ugljenika, poželjnije to je metil. Simbol n je pozitivan broj, poželjno između 1 i 1,000, poželjnije između 2 i 500. Najpoželjnije između 3,000 i 12,000. Poželjno, PEG ima najmanje jednu hidroksil grupu, poželjnije to je terminalna hidroksil grupa. Ova hidroksil grupa je preferencijalno aktivirana da reaguje sa slobodnom amino grupom inhibitora. Međutim, biće jasno da tip i količina reaktivnih grupa može da varira da bi se postigao kovalentno konjugovano PEG/antitelo iz ovog pronalaska.
[0155] Polioksetilovani polioli koji su rastvorljivi u vodi takođe su korisni u za ovaj pronalazak. Oni uključuju polioksetilovan sorbitol, polioksetilovanu glukozu, polioksetilovan glvcerol (POG), i slične. POG je poželjan. Jedan razlog je što glicerolska kičma (backbone) polioksetilovanog glicerola se nalazi i u kičmi koja se prirodno sreće u, na primer kod životinjskih i ljudskih mono-, di-, i triglicerida. Zato se ovo grananje (branching) ne bi moralo da se prepoznava kao strain agens u telu. PIG ima poželjnu molekulsku masu u istom opsegu kao PEG. Struktura POG prikazana je i Knauf et al. (1988) J. Bio. Chem. 263:15064-15070 i diskusija o POG/IL-2 konjugatima nađena je u U.S. Patent No. 4,766,106.
[0156] Još jedan sistem za dostavu leka za povećanje polu-života u cirkulaciji je lipozom. Metode za pripremu lipozomskih sistema za dostavu su diskutovane u Gabizon et al. (1982) Cancer Research 42:4734; Cafiso (1981) Biochem Biophvs Acta 649:129; and Szoka (1980) Ann. Rev. Bioplsvs. Eng. 9:467. Drugi sistemi za dostavu lekova poznati su u oblast ii opisani su u na primer, Poznanskv et al. (1980) Drug Deliverv Svstems (R.L. Juliano, ed., Oxford. N.Y.) pp. 253-315; Poznanskv
(1984) Pharm Revs 36:277.
[0157] Formulacije koje treba da budu inkorporirane u farmaceutsku kompoziciju treba da obezbede stabilnost antagonist anti-CD40 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta. To jest. antagonist anti-CD40 antitelo ili njegovo antigen-vezujući fragment treba da zadrže njihovu fizičku i/ili hemijsku stabilnost id a imaju ćcljennu bilošku aktivnost, to jest. jednu ili više antagonističkih aktivnosti koje su gore u tekstu definisane. uključujući ali bez ograničenja na njih. inhibiciju sekrecije imunoglobulina od strane normalnih humanih perifernih B ćelija koje su stimulisane T ćelijama; inhibiciju preživljavanja i/ili proliferacije normalnih humanih periferalnih B ćelija koje stimulišu Jurkat B ćelije; inhibiciju preživljavanja i/ili proliferacije normalnih humanih periferalnih B ćelija stimulisanih od strane CD40L-eksprimirajućeih ćelija ili solubilnog CD40 liganda (sCD40L): inhibiciju "preživljavanja" anti-apoptotičnih intracelularnih signala u bilo kojoj ćeliji koju stimuliše cCD40L ili CD40L čvrste faze; inhibiciju CD40 signalne transdukcije u bilo kojoj ćeliji nakon ligacije sa sCD40L ili CD40L čvrste faze; inhibiciju proliferacije humanih malignih B ćelija kao što je pomenuto bilo gde ovde.
[0158] Metode za praćenje proteinske stabilnosti dobro su poznate u ovoj oblasti. Videt na primer, Jones (1993) Ađv Drug Delivery Rev. 10:_29-90; Lee. ed. (1991) Peptide and Protein Drug Delivery (Marcel Dekker, Inc., New York. Nevv York); i eseji stabilnosti koji su otkriveni dole u tesktu. Generalno, proteinska stabilnost se meri na odabranoj temperaturi za spcifičan vremenski period. U poželjnim ostvarenjima, stabilna farmacutska formulacija antitela obezbeđuje stabilnost antagonist anti-CD40 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta kada se skladišti na sobnoj temperaturi (oko 25°C) tokom najmanje 1 meseca, najmanje 3 meseca, ili najmanje 6 meseci, i/ili je stabilna na oko 2-8°C najmanje 6 meseci, najmanje 9 meseci, najmanje 12 meseci, najmanje 18 meseci, namanje 24 meseca.
[0159] Protein kao antitelo kada je formulisano u farmaceutskoj kompoziciji, smatra se da zadržava svoju fizičku stabilnost u datoj vremenskoj koordinati ako ne pokazuje vidljive znakove (na primer gubitak boje ili gubitak jasnoće) ili merljive znakove (na primer, upotrebom hromatografije putem isključivanja veličine (size-exclusion chromatography-CES) ili rasipanje UV svetla) precipitacije, agregacije i/ili denaturacije u toj farmaceutskoj kompoziciji. U odnosu na hemijsku stabilnost, protein kao antitelo, kada kada je formulisano u farmaceutskoj kompoziciji, smatra se da zadržava svoju hemisjku stabilnost u datoj vremenskoj koordinati ako merenja hemijske stabilnosti ukazuju da protein (na primer antitelo) zadržava biološku aktivnost od interesa u toj farmaceutskoj kompoziciji. Metode za monitoring (nadgledanje) promena u hemisjkoj stabilnosti dobro su poznate u nauci i uključuju ali bez ograničenja na njih, metode za detekciju hemijski promenjenih formi proteina kao rzultata "clipping"-a upotrebom SDS-PAGE, SE, i/ili matriksom potpomognuta laserska desorpcija jonizacijomTtime of flight" masena spektrometrija; i degradacija povezana za promenama u molekulskom naclektrisanju (na primer povezana sa deamtdacijom) upotrebom an primer, "'ion-exchange" hromatografiju. Videti na primer, metode koje su otkrivene dole u tesktu.
[0160] Antagonist anti-CD40 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, kada je formulisan u farmaceutskoj kompoziciji, smatra se da zadržava svoju željenu biološku aktivnost u datoj vremenskoj koordinati ako je željena biološka aktivnost u toj vremenskoj koordinati u okviru oko 30%, poželjno u ok\iru oko 20% željene biološke akivnosti koja je pokazana u momentu kada je farmaceutska kompozicija pripremljena kao što je određeno pogodnim esejom za željenu biološku aktivnom. Eseji za merenje željene biološke aktivnosti antagonist anti-CD40 antitela koja su ovde otkrivena, i njihovih antigen-vezujućih fragmenata mogu se izvesti kao što je opisano ovde u Primerima. Videti takođe eseje opisane u Schultze et al. ( 1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:8200-8204; Denton ot al. (1998) Peđiair. Transplant. 2:6-15: Evans et al. (2000) J. Immunol. 164:688-697; Noelle (1998) Agcnts Actions Suppl. 49:_ 17-22; Ledcnnan ct al. (1996) Curr. Opin. Hematol. 3:77-86; Coligan et al.
(1991) Current Protocols in Immunologv 13:_12; Kvvekkehoom et al. ( 1993) lmmunology 79:_439-444; and U.S. Patent Nos. 5.674.492 and 5.847,082.
[0161] U nekim ostvarenjima ovog pronalaska antagonist anti-CD40 antitelo. na primer CHIR-12.12 or CHIR-5.9 monoklonalno antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment je formulisano u tečnoj farmaceutskoj formulaciji. Antagonist anti-CD4() antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može se pripremiti upoterbom bilo koje metode u ovoj oblasti nauke, uključujući one metode koje su ovde gore opisane. U jednom ostvarenju antagonist anti-CD40 antitelo, na primer CHIR-12.12 or CHIR-5.9 monoklonalno antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment je rekombinantno proizveden u CHO ćelijskoj liniji.
[0162] Nakon njegove priprem i prečišćavanja, antagonist anti-CD40 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može biti formulisano kao tečna farmaceutska formulacija na način koji je ovde prikazan. Ako će antagonist anti-CD40 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment biti skladištem pre njegove formulacije, može biti zamrznuto, na primer, na <-20°C a zatim otopljeno na sobnoj temperaturi za dalju formulaciju. Tečna farmaceutska formulacija sadrži terapeutski efektivnu količinu antagonist anti-CD40 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta. Količina antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta prisutna u formulaciji uzima u obzir put (rutu) administracije i željenu zapreminu doze.
[0163] Na ovaj način, tečna farmaceutska kompozicija sadrži antagonist anti-CD40 antitelo, na primer, CHIR-12.12 ili CHIR-5.9 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment u koncentraciji od oko 0.1 mg/ml do oko 50.0 mg/ml, oko 0.5 mg/ml do oko 40.0 mg/ml, oko 1.0 mg/ml do oko 30.0 mg/ml, oko 5.0 mg/ml do oko 25.0 mg/ml, oko 5.0 mg/ml do oko 20.0 mg/ml, ili oko 15.0 mg/ml do oko 25.0 mg/ml. U nekim ostvarenjima tečna farmaceutska kompozicija sadrži antagonist anti-CD40 antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment u koncentraciji od oko 0.1 mg/ml do oko 5.0 mg (ml, oko 5.0 mg/ml do oko 10.0 mg/ml, oko 10.0 mg/ml do oko 15.0 mg/ml, oko 15.0 mg/ml do oko 20.0 mg/ml, oko 20.0 mg/ml do oko 25.0 mg/m 1, oko 25.0 mg/ml do oko 30.0 mg/ml, oko 30.0 mg/ml do oko 35.0 mg/ml, oko 35.0 mg/ml do oko 40.0 mg/ml, oko 40.0 mg/ml do oko 45.0 mg/ml, ili oko 45.0 mg/ml do oko 50.0 mg/ml. U drugim ostvarenjima tečna farmaceutska kompozicija sadrži antagonist anti-CD40 antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment u koncentraciji od oko 15:0 mg/ml, oko 16.0 mg/ml, oko 17.0 mg/ml, oko 18.0 mg/ml. oko 19.0 mg/ml, oko 20.0 mg/ml, oko 21.0 mg/ml, oko 22.0 mg/ml, oko 23.0 mg/ml. oko 24.0 mg/ml, ili oko 25.0 mg/ml. Tečna farmaceutska kompozicija sadrži antagonist anti-CD40 antitelo. na primer. CHIR-12.12 ili CHIR-5.9 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment i pufer koji održava pH formulacije u opsegu od oko pH 5.0 do oko pH 7.0. uključujući oko pH 5.0, 5.1. 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9. 6.0. 6.1. 6.2. 6.3, 6.4. 6.5. 6.6, 6.7. 6.8. 6.9. 7.0. i druge takve vrednosti u opsegu od oko pH 5.0 do oko pH 7.0. U nekim ostvarenjima pufer održava pH formulacije a opsegu od oko pH 5.0 do oko pH 6.5. oko pH 5.0 do oko pH 6.0, oko pH 5.0 do oko pl! 5.5, oko pH 5.5 do oko 7.0, oko pH 5.5 do oko pH 6.5, ili oko pH 5.5 do oko pH 6.0.
[0164| Bilo koji pogodan puffer koji održava pH tečne formulacije anti-CD40 antitelau opsegu od oko pH 5.0 do oko pH<n>0 može da se koristi u formulaciji, sve dok se zadržava fizikohemijska stabilnost i željena biološka aktivnost atiteka kao sto je gore pomenuto. Pogodni puferi uključuju ali bez ograničenja na njih. na primer. konvencioanlne kiseline i njihove soli, gde"counter" jon (jon koji održava neutralnost) može biti an primer, natrijum. kalijum. amomjum. kalcijum ih magnezijum. Primeri konvencionalnih kiselina i njihovih soli koje mogu da se koriste za puferisanje farmaceutske tečne formulacije uključuju ali bez ograničenja na njih. sukcinatnu kiselinu ili sukcinat, limunsku kiselinu ili cilrat, sirćetnu kiselinu ili acetat. tartarna kiselina ili tartarat, fosfornu kiselinu ili fosfat, glukonska kiselina ili glukonat. glutaminska kiselina ili glutamat, aspartična kiselina ili aspartat, maleična kiselina ili maleat, malična kisleina ili malatni pufer. Koncentarcija pufera u formulaciji može biti od okol mM do oko 50 mM, uključujući oko 1 mM, 2 mM, 5 mM, 8 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM. ili druge takve vrednosti u opsegu od oko 1 mM do oko 50 mM. U nekim ostvarenjima, koncentracija pufera u formulaciji je od oko 5 mM do oko 15 mM, uključujući oko 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, ili druge takve vrednosti u opsegu od oko 5 mM do oko 15 mM.
[0165] U nekim ostavrenjima pronalaska, tečna farmaceutska formulacija sadrži terapeutski efektivnu količinu antagonist anti-CD40 antitela, na primer, CHIR-_12.12 ili CHIR-_5.9 monoklonalna antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta i sukcinatni pufer ili citratni pufer u koncentraciji koja održava pH formulacije u opsegu od oko pH 5.0 do oko pH 7.0, poželjno od oko pH 5.0 do oko pH 6.5. Pod izrazom "sukcinatni pufer" ili "citratni pufer", podrazumeva se pufer koji sadrži so sukcinatne kiseline ili so limunske kiseline. U poželjnom ostvarenju, sukcinatni iili citratni "counterion" je natrijumov katjon i zato je pufer natrijum sukcinat ili natrijum citrat. Međutim, bilo koji katjon može biti efektivan. Drugi moguće sukcinatni ili citratni katjoni uključuju ali bez ograničenja, kalijum, amonijum, kalcijum i magnezijum. Kao što je gore pomenuto, koncentracija sukcinatnog ili citratnog pufera u formulaciji može biti od okol mM do oko 50 mM, uključujući oko 1 mM, 2 mM, 5 mM, 8 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, ili druge takve vrednosti u opsegu od oko I mM do oko 50 mM. U nekim ostvarenjima koncentracija pufera u formulaciji je od oko 5 mM do oko 15 mM, uključujući oko 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, ili oko 15 mM. U drugim ostvarenjima tečna farmaceutska formulacija sadrži antagonist anti-CD40 antitelo, na primer, CHIR-12.12 ili CHIR-5.9 monoklonalno antitelo ili njegovo antigen-vezujući fragment u koncentraciji od oko do oko 0.1 mg/ml do oko 50.0 mg/ml, ili oko 5.0 mg/ml do oko 25.0 mg/ml. i sukcinatni ili citratni puffer, na primer, natrijum sikcinatni ili natrijum citratni puffer. u koncedntraciji od oko 1 mM do oko 20 mM, oko 5 mM do oko 15 mM. poželjno oko 10 mM.
[0166] Tamo gde je poželjno, da tečna farmaceutska formulacija bude izotonična, tečna farmaceutska formulacija koja sadrži terapeutski efektivnu količinu antagonist anti-CD40 antitela, na primer. CHIR-12.12 ili CHIR-5.9 monoklonalno antitelo ili njegovo antigen-vezujući fragment, i pufer koji održava pH formulacije u opsegu od oko pll 5.0 do oko pH 7.0 može dalje da sadrži količinu izoionirajućeg agensa dovoljnog da učini fromulaciju blizu izotoničnom. Pod"blizu izotonična" podrazumeva sevodena formulacija koja ima osmolaritet od oko 240 mmol/kg do oko 360 mmol/kg. poželjno oko 240 do oko 340 mmol/kg. još poželjnije oko 250 do oko 330 mmol/kg. još više poželjno oko 260 do oko 320 mmol/kg. još poželim je oko 270 do oko 310 mmol/kg. Metode za određivanje izotoničnosti rastvora poznate su onima iz ove oblasti nauke. Videti na primer, Setnikar et al. (1959) J. Ani. I'iuum. Assoc. 48:628.
[01671 Stručnjacima iz ove oblasti poznati su mnogobrojni farmaceutski prihvatljive rasvorne substance korisne u obezbedivanju izotoničnosti u farmaceutskim kompozicijama. Izotonirajući agens može biti bilo koji reagens sposoban da podesi osmotski pritisak tečne farmaceutske formulacije u ovom pronalasku u vrednosti priblišno istoj koju ima telesna tečnost. Poželjno je da se upotreblajva fiziološki prihvatljiv izotoničan agens. Zato, tečna farmaceutska formulacija koja sadrži terapeutski efektivnu količinu antagonist anti-CD40 antitela, na primer. CHIR-12.12 ili CHIR-5.9 monoklonalno antitelo ili njegovo antigen-vezujući fragment i pufer koji održava pH formulacije u opsegu od oko pH 5.0 do oko pH 7.0 može dalje da sadrži komponente koje mogu obezbediti izotoničnost, na primer, natrijum hlorid; amino kiseline kao alanin, valin, i glicin; šećere i šećerne alkohole (polioli). uključujući ali bez ograničenja na njih, glukozu, dekstrozu, fruktozu, saharozu, maltozu. manitol. trehalozu, glvcerol, sorbitol i ksilitol; sirćetnu kisleinu, druge organske kiseline ili njihove soli, i relativno male količine citrata ili fosfata. Prosečno obučena osoba znaće za dodatne agense koji su pogodni za obezbeđivanje optimalnog tonusa tečne formulacije.
[0168] U nekim poželjnim ostvarenjima tečna farmaceutska formulacija koja sadrži terapeutski efektivnu količinu antagonist anti-CD40 antitela, na primer, CHIR-12.12 ili CHIR-5.9 monoklonalno antitelo ili njegovo antigen-vezujući fragment i pufer koji održavapHformulacije u opsegu od oko pH 5.0 do oko pH 7.0, dalje da sadrži natrijum hlorid kao izotonirajući agens. Koncentracija natrijum hlorida u fromulaciji zavisiće od doprinosa drugih komponenti tonusu. U nekim ostvarenjima koncentracina natrijum hlorida je oko 50 mM do oko 300 mM, oko 50 mM do oko 250 mM, oko 50 mM do oko 200 mM, oko 50 mM do oko 175 mM, oko 50 mM do oko 150 mM, oko 75 mM do oko 175 mM, oko 75 mM do oko 150 mM, oko 100 mM do oko 175 mM, oko 100 mM do oko 200 mM, oko 100 mM do oko 150 mM, oko 125 mM do oko 175 mM, oko 125 mM do oko 150 mM, oko 130 mM do oko 170 mM, oko 130 mM do oko 160 mM, oko 135 mM do oko 155 mM, oko 140 mM do oko 155 mM, ili oko 145 mM do oko 155 mM. U jednom takvom ostvarenju koncentracija natrijum hlorida je oko 150 mM. U grugim takvim ostvarenjima, koncentracija natrijum hlorida je okol50 mM, puffer je natrijum sukcinat ili natrijum citrat u koncentraciji od oko 5 mM do oko 15 mM, tečna farmaceutska formulacija koja sadrži terapeutski efektivnu količinu antagonist anti-CD40 antitela, na primer, CHIR-12.12 ili CHIR-5.9 monoklonalno antitelo ili njegovo antigen-vezujući fragment i pufer koji održava pH formulacije od oko pH 5.0 do oko pH 7.0, oko pH 5.0 do oko pH 6.0, oko pH 5.5 do oko pH 6.5. U drugim ostvarenjima tečna farmaceutska formulacija koja sadrži terapeutski efektivnu količinu antagonist anti-CD40 antitela, na primer, CHIR-12.12 ili CHIR-5.9 monoklonalno antitelo ili njegovo antigen-vezujući fragment, u koncentraciji od oko 0.1 mg/ml do oko 50.0 mg/ml ili oko 5.0 mg/ml do oko 25.0 mg/ml. oko 150 mM natrijum hlorida. i oko 10 mM natrijum sukcinata ili natrijum eitrata pri pH od oko pll 5.5
[0169] Degradacija proteina usleđ zamrzavanja/odmrzavanja ili mehaničkog sečenja tokom obarde tečne farmaceutske formulacije iz ovog pronalaska može se inhibirati inkorporacijom surfaktanata u formulaciju u cilju smanjenja površineks tenzije interfaze između rastvora i vazduha. Zato u nekim ostvarenjima, tečna farmaceutska formulacija koja sadrži terapeutski efektivnu količinu antagonist anti-CD4() antitela, na primer, CHIR-12.12 ili CHIR-5.9 monoklonalno antitelo ili njegovo antigen-vezujući fragment, pufer koji održava pH formulacijeu opsegu od oko pH 5.0 do oko pH 7.0. i dalje sadrći surfactant. U drugim ostvarenjima, tečna farmaceutska formulacija koja sadrži terapeutski efektivnu količinu antagonist anti-CD40 antitela. na primer, CHIR-12.12 ili CHIR-5.9 monoklonalno antitelo ili njegovo antigen-vezujući fragment, pufer koji održava pH formulacijeu opsegu od oko pH 5.0 do oko pH 7.0, izotonirajući agens kao natrijum hlorid u koncentraciji od oko 50 mM do oko 300 mM i dalje sadrži surfaktant.
[0170] Tipični surfaktanti koji se upotrebljavaju su nejonski surfaktanti, uključujući ester poloksetilen sorbitola kao polisorbat 80 (Tween 80) i polisorbat 20 (Tween 20); polioksipropilen-polioksietilen estri kao Pluronic F68; polioksietilen alkoholi kao Brij 35; "simethicone"; polietilen glikol kao PEG400; lizofosfatidilholin; polioksietilen-p-t-oktilfenol kao Triton X-100. Klasičnna stabilizacija lekova sa surfaktantima ili emulzifajerima je opisana, na primer u Levine et al. (1991) J. Parenteral Sci. Technol. 45(3): 160-165. Poželjan surfaktant koj se upotrebljava u praksi ovog pronalaska je polisorbat 80. Tako, gde je uključen surfactant on se tipično dodaje u količini od oko 0.001 % do oko 1.0% (w/v), oko 0.001%do oko 0.5%, oko 0.001% do oko 0.4%. oko 0.001% do oko 0.3%. oko 0.001% to oko 0.2%. oko 0.005% do oko 0.5%, oko 0.005% do oko 0.2%, oko 0.01% do oko 0.5%, oko 0.01% do oko 0.2%, about 0.03% do oko 0.5%, oko 0.03% do oko 0.3%, oko 0.05% do oko 0.5%, do oko 0.05% do oko 0.2%.
[0171] Zato, u nekim ostvarenjima, tečna farmaceutska formulacija koja sadrži terapeutski efektivnu količinu antagonist anti-CD40 antitela, na primer, CHIR-12.12 ili CHIR-5.9 monoklonalno antitelo ili njegovo antigen-vezujući fragment, pufer je natrijum sukcinat ili natrijum citratni puffer u koncentraciji od okol mM do oko 50 mM, oko 5 mM do oko 25 mM, ili oko 5 mM do oko 15 mM; formulacija ima pH od oko pH 5.0 do oko pH 7.0, oko pH 5.0 do oko pH 6.0, ili oko pH 5.5 do oko pH 6.5; i formulacija dalje sadrži surfaktant na primer, polisorbat 80 u količini od oko 0.001 % do oko 1.0% ili oko 0.001% do oko 0.5%. Ovakve fromulacije mogu opcionalno sadržati izotonirajući agens kao natrijum hlorid u koncentraciji od oko 50 mM do oko 300 mM, oko 50 mM do oko 200 mM, ili oko 50 mM do oko 150 mM. U drugim ostvamjima, tečna farmaceutska formulacija koja sadrži terapeutski efektivnu količinu antagonist anti-CD40 antitela, na primer, CHIR-12.12 ili CHIR-5.9 monoklonalno antitelo ili njegovo antigen-vezujući fragment u koncentraciji od oko 0.1 mg/ml do oko 50.0 mg/ml ili oko 5.0 mg/ml do oko 25.0 mg/ml. uključujući oko 20.0 mg/ml; oko 50 mM do oko 200 mM natrijum hlorida, uključujući oko 150 mM natrijum hlorida; natrijum sukcinat ili natrijum citrat u oko 5 mM do oko 20 mM; uključujući oko 10 mM natrijum sukcinata ili natrijum citrata; natrijum hlorid u koncentraciji od oko 50 mM do oko 200 mM, uključujući oko 150 mM; i opcionalno..surfactant. na primer. polisorbat 80. u količini od oko 0.001%do oko 1 X)' i. uključujući oko 0.001 % do oko0.5%;pri čemu tečna farmaceutska formulacija ima pH od oko 5.0 do oko pH 7.0. oko pH 5.0 do oko pH 6.0. oko pH 5.0 do oko pH 5.5. oko pH r>.5 do oko pH 6.5. ili oko pH 5.5 do oko pH 6.0.
|0I721 Tečna farmaceutska formulacija može biti suštinski bez bilo kakbog prezervativa i drugih nosača, ekscipijenata ili stabilizatora kao sto je pomenuto ovde gore u tekstu. Alternativ no, formulacija može da uključi jedan ili v iše prezervativa na primer. antibakterijske agense, farmaceutski prihvatljive nsače. ekscipijente. ili stabilizatoreopisane gore u tekstu pri tome da nemaju neželjene efekte na fizikohemijsku stabilnost antagonist anti-CD40 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta. Primeri prihvatljivih nosača, ekscipijenata. i stabilizatora uključuju ali nisu njima limitirani, dodatni puferski agens, ko-rastvarači, surfaktanti. antioksidansi uključujući askorbinsku kiselinu i metionin. helirajuće agense kao EDTA, komplekse metala (na primer, Zn.protein kompleks), i biodegradabilne pohmere kao poliestre. Detaljna diskusija na temu formulacija i selekcije farmaceutski prihvatljivih nosača, stabilizatora i "isomolvtes" (fiziološki rastvori) moće sc videti u Remington's Pharmaceutical Sciences (I8th ed.; Mack Publishmg Companv, Eaton, Pennsvlvania, 1990).
[0173] Nakon pripreme farmaceutske formulacije ili druge farmaceutske kompozicije koja je ovde opisana, ona može biti liofilizovana da bi se sprečila degradacija. Metode za liofilizaciju tečnih kompozivcija poznate se onima koji se bave ovom oblašću. Upravo pre upotrebe, kompozicija može biti rekonstituisana sa sterilnim rastvaračem.
(Ringerov rastvor, destilovana voda, ili sterilni fiziološki rastvor, na primci) koji može da uključu dodatne sasatojke. Nakon rekonstitucije, kompozicija se poželjno dostavlja subjektima pomoću metoda koje su poznate onim koji su stručnjaci u oblasti.
Upotreba antagonist anti- CD40 antitela u proizvodnji medikamenata
[0174] Ovo tokriće takođe obezbeđuje upotrebu antagonist anti-CD40 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u proizvodnji medikamenta za lečenje su bjekta sa rakom koga karakteriše rast neoplastičnih B ćelija, naznačeno time da je medicament koordinisan sa tretmanom sa najmanje jednom terapijom za rak. Kanceri koje karakteriše rast neoplastičnih ćelija uključujuju ali bez ograničenja na njih. kancere povezane sa B ćelijama koji su goreopisani, na primer ndn-Hočkinsonov limfom, hroničnu limfocitičnu leukemiju, mupltiplu mijelomu, limfom B ćelija, limfom B ćelija visokog stepena, limfom B ćelija srednjeg stepena, limfom B ćelija niskog stepena), akutnu limfoblastičnu leukemiju B ćelija, mijeloblastičnu leukemiju. Hočkinosonova bolest, plzmacitomu, folikularnni limfom, folikularni limfom malih ćelija sa usečenim jedrom, folikul, folikularni limfom velikih ćelija, mešani folikularni limfom malih ćelija sa usečenim jedrima, difuzni limfome malih ćelija sa usečenim jedrom, difuzni limfome malih limfocita, prolimfocitnu leukemiju, limfoplazmocitni limfom, limfom marginalne zone, limfom limfoidnog tkiva povezan sa mukozom, limfom monocitoidnih B ćelija, limfom slezine, leukemiju dlakastih ćelija, difuzni limfome velikih ćelija, limfom ''madiastinal" velikih B ćelija, limfomatoidnu granulomatozu. intravskularnu limfomatozu. difuzni limfom mešanih ćelija, difuzni limfom velikih ćelija, Burkitt-ov limfom, limfom povezan sa sidom, i limfom ćelija omotača (mantle).
[0175] Pod "koordinisanim" podrazumeva sc medikament koji sadrži antagonist anti-CD40 antitela ili njegovo antigen-vezujući fragment koji se koristi ili pre. za vrenie ili nakon tretmana subjekta sa makar jednom terapijom za rak. Primeri drugih terapija uključuju ali bez ograničenja na njih. operaciju; radiacionu terpiju; hcmoterapiju; opcionalno u kombinaciji sa autolognim transplantom koštane srži. gde pogodni hemoterapeutski agens uključujući, ali bez. ograničenja na njega. Iludaribm ili fludaribin fosfat, hlorambucil. vinkristin. pentostatin. 24ilordeok.siadenoz.in (kladribin), ciklofosfamid, doksorubicin, prednizon. i njihove kombinacije na primer. režimi koji sadrže antraciklin kao što je (CAP) ciklofosfamid. doksorubicin plus prednizon), CHOP (ciklofosfamid. vinkristin. prednizon plus doksorubicin). VAD (vinkristin, doksorubicin plus deksametazon). MP (melfalan plus prednizon). i druge citotoksične i/ili terapeutske agense koji se koriste u hemoterapiji kao mitoksantron. daunorubicin, idarubicin, asparaginaza, i antimetabolite uključujući ali bez ograničenja na njih citarabin, metotreksat, 5-fluorouracil dekarbazin, 6-tioguanin. 6-merkaptopurin, i nelarabin; druge terapije koje uključuju anti kancerogena monoklonalna antitela (na primer, alemtuzumab (Campath®) ili drugo anti-CD52 antitelo, koje cilja CD52 glikoprotein na površini malignih B ćelija; ritu.\imab (Rituxan®), potpuno huamnizovano antitelo HuMax-CD20, R-1594, IMMU-106, TRU-015, AME-133, tositumomab/I-131 tositumomab (Bexxar®), ibritumomab tiuksetan (Zevalin®) ili bilo koje drugo terapeutsko anti-CD20 antitelo koje cilja CD20 antigen na malignim B ćelijama; anti-CD19 antitelo (na primer. MT103 bispecifično antitelo); anti-CD22 (na primer, humanizovano monoklonalno antitelo epratuzumab); bevacizumab (Avastin®) ili drugo anti-kancerno antitelo koje cilja humani vaskularni endotelijalni faktor rasta; anti-CD22 antitelo koje cilja CD22 antigen na malignim B ćelijama (na primer, monoklonalno antitelo BL-22, alfaCD22 toksin); a-M-CSF antitelo koje cilja kolonijalni stimulatorni faktor makrofaga, antitela koja ciljaju receptor aktivator nuklearnog faktora-kappaB (RANK) i njegov ligand (RANKL), koji su prekomemo eksprimirani u višestrukom mijelomu; anti-CD23 antitelo koje cilja CD23 antigen na malignim B ćelijama (na primer IDEC-152); anti-CD38 antitelo koje cilja CD38 antigen na malignim B ćelijama; antitela koja ciljaju receptore za glavni kompleks za histokompatibilnost II (anti-MHC antitela) koji su eksprimirani na malignim B ćelijama; druga anti-CD40 antitela (na primer, SGN-40) koji ciljaju CD40 antigen na malignim B ćelijama; i antitela koja ciljaju receptor 1 inducibilnog liganda faktor tumora nekroze-povezanog sa apoptozom (TRAIL-R1))
(na primer, agonističko humano monoklonalno antitelo HGS-ETR1) eksprimirani na mnogobrojnim solidnim tumorima i tumorima hematopoetskog porekla); terapije za rak koje se baziraju na malim molekulima, uključujući ali bez ograničenja mikrotubule i/ili inhibitore topoizomeraze (na primer, mitotički inhibitor dolastatin i analoge dolastatina; tubulin-vezujući agens T900607; XL1I9; i inhibitor topoizomeraze aminokamptotecin), SDX-105 (bendamustin hidrohlorid),lksabepilon (analog epotilona, takođe označen kao BMS-247550), inhibitori protein kinaze C, na primer. midostaurin ((PKC-412, CGP 41251, N-benzoilstaurosporin), piksantron, eloksatin (antineoplastični agens), ganit (galijum nitrat), Thalomid® (talodomid). imunomodulatorski derivati talidomida (na primer, revlimid (nekadašnji revimid)). Affinitak-« (antisens inhibitor protein kinaze C-alfa), SDX-101 (R-etodolak. uključujući apoptozu malignih linifocota). drugu generaciju analoga purinskih niikleozida kao što su klofarabin, inhibitori proizvodnje proteina Bcl-2 od strane ćelija raka (na primer, antisens agensi oblimersen i Genasense®) inhibitori proteazoma (na primer. Velcade™ (bortezomib)), mali molekuli inhibitori kinaze ma primer. CHIR-258). mali molekuli inhibitori VEGF (na primer. ZD-6474). mali molekuli inhibitori proteina toplotnog šoka 90 (HSP - hcal shock protein) ina primer 17-AAG). mali molekuli inhibitori histonskih deacetilaza (na primer. hibrid/polarm "cvtodiffercntiation" HPC) agensi kao subcranilohidrok.samična kislina (SAHAi. i 1<;>R-9()1228) i apoptotički agensi kao Trisenox© (arsen tnoksid) i Xc\trin i imoteksal'in gadolinium); terapije raka bazirane na terapijama vakeiiui/imunoterapija. uključujući ali bez ograničenja, pristupe sa vakemama (na primer. Id-KLH. onkotag. vitalelin). personalizovana imunoterapija ili aktivna idiopatska imunoterapija (na primer. MyVax® Personalized Immunolherapv, nekada označena kao GTOP-99). I'romune® (CpG 7909, sintetički agonist za "tolldike" receptor 9 (TLR9)), terapija sa interferonom-alfa, intcrleukin-2 (IL-2) terapija, interleukin-12 terapija, interleukin-15 terapija, interleukin-21 terapija; terapija steroidima; ili druge terapije raka; gde se tretman sa dodatnom terapijom za rak ili dodatnim terapijama za rak, obavljapre. za vreme ili nakon tretmana subjekta sa madikamentima koji sadrže antagonist anti-CD40 antitela ili njegov antigen-vezujući fragment, kao što je gore pomenuto.
[0176] U nekim ostvarenjima ovo otkriće obezbeđuje upotrebu anti-CD40 antitela. na primer, CHIR-12.12 ili CHIR-5.9 monoklonalno antitelo ili njihov antigen-vezujući fragment, u proizvodnji medikamenta za lečenje limfoma B ćelija, na primer ne-Hočkinsonovog limfoma, u subjektu, naznačeno time daje medikament koordinidsan sa tretmanom sa najmanje jednom terapijom za rak odabranom iz grupe koja se sastoji od hemoteralije, anti-kancer teraoije antitelom, terapija raka bazirana na malom molekulu, terapija raka bazirana na vakcini/imunoterapiji, naznačeno time da će se medicament koristiti pre, za vreme, ili nakon tretmana subjekta sa drugom terapijom za rak, ili u slučaju višestruko kombinovanih terapija, ili pre, za vreme ili nakon tretmana subjekta sa drugim terapijama za rak.
[0177] Zato, na primer, u nekim ostvarenjima ovo otkriće obezbeđuje upotrebu anti-CD40 antitela, na primer, CHIR-12.12 ili CHIR-5.9 monoklonalno antitelo ili njihov antigen-vezujući fragment, u proizvodnji medikamenta za lečenje limfoma B ćelija, na primer ne-Hočkinsonovog limfoma, u subjektu, naznačeno time da je medikament koordinidsan sa hemoterapijom, gde je hemoterapeutski agens odabran iz grupe koja se sastoji od citoksana, doksorubicina, vinkristina, prednizona, i njihove kombinacije na primer CHOP. U drugim ostvarenjima, ovo otkriće obezbećuje upotrebu anti-CD40 antitela, na primer, CHIR-12.12 ili CHIR-5.9 monoklonalno antitelo ili njihov antigen-vezujući fragment, u proizvodnji medikamenta za lečenje limfoma B ćelija, na primer ne-Hočkinsonovog limfoma, u subjektu, naznačeno time da je medikament koordinidsan sa tretmanom sa najmanje jednim drugim anti-kancernim antitelom odabraniz iz grupe koja se sastoji od alemtuzumaba (Campath®) ili drugog anti-CD52 antitela, koje cilja CD52 glikoprotein na površini malignih B ćelija; rituximaba (Rituxan®), potpuno huamnizovanog antitela HuMax-CD20, R-1594. IMMU-106, TRU-015, AME-133, tositumomab/I-131 tositumomab (Bexxar®), ibritumomab tiuksetan (Zevalin®) ili bilo kojeg drugog terapeutskog anti-CD20 antitela koje cilja CD20 antigen na malignim B ćelijama; anti-CD19 antitela (na primer, MT103 bispecifično antitelo); anti-CD22 (na primer, humanizovano monoklonalno antitelo epratuzumab); bevacizumab (Avastin®) ili drugo anti-kancerno antitelo koje cilja humani vaskularni endotelijalni faktor rasta; i bilo koja njihova kombinacija; naznačeno time da medikament treba da se koristi pre, za vrema ili nakon tretmana subjekta sa drugim terapijama za rak. ih u slučaju višestruke kombinacije terapija, ili pre. za vreme ili nakon tretmana subjekta sa drugim terapijama za rak.
|0I78j l' još nekim drugim ostvarenjima, ovo otkriće obezbeđuje upotrebu CHIR-12.12 ili CHfR-5.9 monoklonalnog antitela ili njihovog antigen-vezujućeg fragmenta, u proizvodnji medikamenta za lečenje limfoma B ćelija, na primer ne-Hočkinsonovog limfoma. u subjektu, naznačeno time daje medikament koordinidsan ..Ltretmanom sa najmanje jednom terapijom za rak baziranoj na malom molekulu i odabranoj iz grupe koja se sastoji od inhibitora mikrotubula i/ili topoizomeraze (na primer. mitotički inhibitor dolastatin i analoge dolastatina; tubulin-vezujući agens T90O607; XL1 19: i inhibitor topoizomeraze aminokamptotecin), SDX-105 (bendamustm hidrohloriđ). iksabcpilon (analog epotilona, takođe označen kao BMS-247550). inhibitori protein kinaze C. na primer, midostaurin ((PKC-412, CGP 41251, N-benzoiistaurosporin). piksantron. eloksatin (antineoplastični agens), ganit (galijum nitrati. Thalomid®
(talodomid). apoptotički agens kao Xcytrin® (moteksafin gadolinium). inhibitori proizvodnje proteina Bcl-2 od strane ćelija raka (na primer, antisens agensi oblimersen i Genasense®), elarabin, i bilo koja njihova kombinacija; naznačeno time da medikament treba da se koristi pre, za vrema ili nakon tretmana subjekta sa drugim terapijama za rak, ili u slučaju višestruke kombinacije terapija, ili pre, za vreme ili nakon tretmana subjekta sa drugim terapijama za rak.
[0179] U još nekim drugim ostvarenjima, ovo otkriće obezbeđuje upotrebu CHIR-12.12 ili CHIR-5.9 monoklonalnog antitela ili njihovog antigen-vezujućeg fragmenta, u proizvodnji medikamenta za lečenje limfoma B ćelija, na primer ne-Hočkinsonovog limfoma, u subjektu, naznačeno time daje medikament koordinidsan sa tretmanom sa najmanje jednom terapijom za rak baziranoj na vakcini/imunoterapiji odabranoj iz grupe koja se sastoji od pristupa sa vakcinama (na primer, MyVax® Personalized Immunotherapy, nekada označena kao GTOP-99), Promunc® (CpG 7909, sintetički agonist za "toll-like" receptor 9 (TLR9)), terapija sa interferonom-alfa, interleukin-2
(IL-2) terapija, interleukin-12 terapija, interleukin-15 terapija, interleukin-21 terapija; 1 njihova kombinacija; naznačeno time da medikament treba da se koristi pre, za vrema ili nakon tretmana subjekta sa drugim terapijama za rak, ili u slučaju višestruke kombinacije terapija, ili pre, za vreme ili nakon tretmana subjekta sa drugim terapijama za rak.
[0180] U nekim ostvarenjima ovo otkriće obezbeđuje upotrebu anti-CD40 antitela, na primer, CHIR-12.12 ili CHIR-5.9 monoklonalno antitelo ili njihov antigen-vezujući fragment, u proizvodnji medikamenta za lečenje leukemija povezanih sa B ćelijama, na primer akutna limfocitična leukemija B ćelija (B-ALL), u subjektu, naznačeno time da je medikament koordinidsan sa tretmanom sa najmanje jednom terapijom za rak odabranom iz grupe koja se sastoji od hemoteralije i terapije metabolitom. naznačeno time da će se medicament koristiti pre, za vreme, ili nakon tretmana subjekta sa drugom terapijom za rak, ili u slučaju višestruko kombinovanih terapija, ili pre, za vermc ili nakon tretmana subjekta sa drugim terapijama za rak. Primeri ostvarenjia uključuju ali bez ograničenja na njih, one primere gde medicament sadrži anti-CD40 antitelo, na primer. CHIR-12.12 ili CHIR-5.9 monoklonalno antitelo ili njihov antigen-vezujući fragmenta, koje je koordinisano sa tretmanom sa hemoterapeutskim agensom ili antimetabolitom odabranim iz grupe koja se sastoji od citoksana, doksorubicina, vinkristina, prednizona, citaribina, mitokantrona. idarubicina. aspaarginaze, metotreksata, 6-tioguanina, 6-markaptopurina. i njihove kombinacije: naznačeno time da ćc sc medicament koristiti pre, za vreme. ili nakon tretmana subjekta sa drugom terapijom za rak. ili u slučaju višestruko kombinovanih terapija, ili pre, za verme ili nakon tretmana subjekta sa drugim terapijama za rak. U jednom ovakvom primeru, međkamenl je koordimsan sa tretmanom citarabinom plus daunorubicin, citaribin plus mitoksantron. i/ili citaribin plus idarubicin: naznačeno time da će se medicament koristiti pre. za vreme. ili nakon tretmana B-ALL subjekta sa drugom terapijom za rak. ili u slučaju višestruko kombinovanih terapija, ili pre, za verme ili nakon tretmana subjekta sa drugim terapijama za rak.
[0181] Takođe, ovde je otkrivena upotreba antagonist anti-CD40 antitela, na primer. CHIR-12.12 ili CHIR-5.9 monoklonalnog antitela ili njihovog antigen-vezujućeg fragmenta, u proizvodnji medikamenta za lečenje subjekta sa kanecrom koga karakteriše rast neoplastičnih B ćelija, uključujući kancere povezane sa B ćelijama koji su ovde gore opisani, naznačeno time da se medikament koristi u subjektu koji je prethodno tretiran sa najmanje jednom terapijom za rak. Pod "prethodno tretiran" ili "predtretman" podrazumeva se subjekat koji je primio jednu ili više drugih terapija za rak (to jest tertian je najmanje sa jednom terapijom za rak) pre primanja medikamenta koji sadrži anti-CD40 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment. "Prethodno tretiran" ili "predtretman" uključuje subjekte koji su tretirani najmanje sa jednom terapijom tokom 2 godine, tokom 18 meseci, tokom 1 godine, tokom 6 meseci, tokom 2 meseca, tokom 6 nedelja, tokom 1 meseca, tokom 4 nedelje, tokom 3 nedelje, tokom
2 nedelje, tokom 1 nedelje, tokom 6 dana, tokom 5 dana, tokom 4 dana. tokom 3 dana, tokom 2 dana, ili čak tokom 1 dana, pre inicijacije tretmana sa medikamentom koji sadrži antagonist anti-CD40 antitela, na primer, CHIR-12.12 ili CHIR-5.9 monoklonalnog antitela ili njihovog antigen-vezujućeg fragmenta. Nije neophodno da je subjekat reagovao na predtretman sa prethodnom terapijom za rak, ili na prethodne terapije. Zato, subjekat koji prima medikament koji sadrži antagonist anti-CD40 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može da odgovori, ili može da ne uspe u odgovoru (to jest, kancer je uporan/rezistentan) na predtretman sa prethodnom terapijom za rak, ili na jednu ili više prethodnih terapija za rak sa predtretmanom koji se sastoji od višestrukih terapija za rak. Primeri drugih terapija za rak za koje subjekat može da primi predtretman pre primanja medikamenta koji sadrži antagonist anti-CD40 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment uključuje ali bez ograničenja na njih, operaciju; radiacionu terpiju; hemoterapiju; opcionalno u kombinaciji sa autolognim transplantom koštane srži, gde pogodni hemoterapeutski agens uključujući, ali bez ograničenja na njih one koji su navedeni gore u tekstu; druge anti-kancer terapije koje uključuju antitela koja su ovde opisana; terapije za rak koje se baziraju na malom molekulu, uključujući ali bez ograničenja na njih, male molecule koji su navedeni gore u tekstu; terapije za rak bazirane na vakciji/imunoterpiji uključujući, ali bez ograničenja na njih, one koji su navedeni gore u tekstu; terapiju steroidima; ili bilo koju njihovu kombinaciju.
[0182] "Tretman" u kontekstu koordinisane upotrebe medikamenta koji je ovde opisan sa jednom ili viće terapija za rak ovde je definisan kao primena ili administracija medikamenta ili terapije za rak subjektu, ili primena ili administracija medikamenta ili druge terapije za rak izolovanom tkivu ili ćelijskoj liniji iz subjekta, gde subjekat ima kancer (rak) koga karakteriše rast neoplastičnih B ćelija, svmptom povezan sa ovakvim rakom, ili predispozicijom ka razvoju ovakvog raka, gde je svrha lečenje, ublaženje, olakšavanje, mcnjanje, zalečivanje, boljitak, poboljšanje, ili delovanje na rak, bilo koje simptome raka, ili predispoziciju ka razvoju raka.
[0183] Primeri koji slede ponuđeni su kao ilustracija a ne kao ograničenje.
EKSPERIMENTALNE PROCEDURE
|01S4] Antagonist anti-CD4() antitela, korišćena u primerima koji slede su CHIR-5.9 i CHIR-12.12 monoklonalna antitela. CHIR-5.9 i CHIR-12.12 monoklonalna antitela su humana IgGl podtip anti-humana CD40 monoklonalna antitela (mAbs) generisana intimizacijom transgenih miševa koji nose lokus za teški lanac humanog IgGl i lokus za humani K laki lanac (XenoMouse® technologv; Abgenix; Fremont. California). Kao što je pokazano FACS analizom. CIIlR-_5.9 and CHIR-_12.12 se vezuju specifično za CD40 čoveka i mogu da spreče vezivanje CD40 liganda. Oba Mabs mogu da izbace kompeticijom prethodno vezan CD40-ligand za poveršinski CD40. Oba antitela su jaki antagonist ii inhibiraju in vitro CD40 ligand-posredovanu proliferaciju normalnih B ćelija, kao i ćelija raka iz NHL i CLL pacijenata. In vitro. oba antitela ubijaju ćelijske linije raka kao i primarne ćelije raka iz pacijenata sa NHL putem ADCC. Dozno-zavisna anti-tumorska aktivnost viđena je u modelu "xenogratt" humanog limfoma (transplanta). Afinitet vezivanja CHIR-5.9 za humani CD40 je 1.2x10-8 M, a afinitet vezivanja CH1R- 12.12 za humani CD40je 5x10-10 M.
[0185] Misija hibridoma linija 131.2F8.5.9 (CMCC#12047) i hibridoma linija 153.8E2.D10.D6.12.12 (CMCC#12056) su deponovane u American Type Culture Collection (kolekcija bakteriskih kultura) [ATCC; 10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209 (USA)] under Patent Deposit Number PTA-5542 i PTA-5543.
[0186] Protokoli koji slede korišćeni su u primerima koji su ovde dole opisani.
ELISA esej za imuno globulinsku kvantifikaciju
[0187] Koncentracije humanih IgM i IgG procenjene su ELIS-om. ELISA ploče sa 96 bunarčića obložene su sa 2 }ig/ml kozijih anti-huamnih IgG MAb (The Jackson Laboratorv, Bar Harbor, Maine) ili sa 2 (ig/ml kozijih anti-huamnih IgG MAb 4102 (Bio Source International, California) u 0.05 M karbonatnom puferu (pH 9.6), inkubacijom 16 sati na 4°C. Ploče su isprane 3 puta sa PBS-0.05 % Tween-20 (PBS-Tween) i saturisane sa BSA 1 sat. Nakon 2 pranja ploče su inkubirane 2 sata na 37°C sa različitim razblaženjima test uzorka. Nakon 3 pranja vezani Ig je detektovan inkubacijom 2 sata na 37°C sa p:g/ml peroksidazom obeleženim kozijim anti-humanim IgG MAb ili kozijim anti-humanim IgG Mab. Ploče su oprane 4 puta, aktivnost vezane peroksidaze otkrivena je dodavanjem o-fenilendiamina kao substarta. Humani IgG ili IgM standardi (Caltaq, Burlingame. California) korišćeni su za utvrđivanje standardne krive za svaki esej.
Izolacija mononuklearnih ćelija periferne krvi ( PBMC) iz humane periferne kni
[0188] 20 ml of Ficoll-Paque rastvora (slabi endotoksin; Pharmacia) je dodato po 50 ml polistirenskoj tubi, u 3 tube, 30 minutes pre dodavanja krvi. Ficol-Paque rastvor je zagrejan do sobne temperature. Pripremljeno je 3 L varikine diluirane 1: 10 koja je kotišćena za pranje svih tuba i pipeta koji su dolazili u kontakt sa krvlju. Krv jc nanesena na vrh Ficoll-Paque rastvora bez uzburkivanja sloja fikola. i to 1.5 ml krvi/l ml of Ficoll-Paque. Tube su centrifugirane na 1700 rpm tokom 30 minuta na obnoj temperaturi sa isključenom "brake" (kočnicom) na centrifuzi. Površinski sloj koji predstavlja plazmu maksimalno je uklonjen, umanjujući vacuum da bi se izbeglo uklanjanje drugog sloja rastvora. Drugi sloj. koji sadrži 13 i T limt'ocite pokupljen je pomoću sterilne Pasterove pipette i stavljen u dve polistirenske tube od 50 ml. Zatim je to razblaženo sa 3x zapreminom hladnog RPMI bez aditiva. i tube su centrifugirane na 1000 RPM tokom 10 minula. Medijum je uklonjen aspiracijom, ćelije iz obe tube od 50 ml su resuspendovane u totalnoj zapremini od 10 mlRPMl (bez aditiva) i prebačene u tube od 15 ml. Ćelije su izbrojane pomoću hemacitometra i centrifugirane na 1000 RPM tokom 10 minuta. Medijum je uklonjen i ćelije su resuspendovane u 4 ml RPMI. Frakcija je sadržala PBMC.
Izolacija B ćelija iz PBMC
[0189] 100 u.1 Dvnabeads (anti-h CD 19) stavljeno je u plastične tube od 5 ml. 3 ml sterilnog PBS-a dodato je kuglicama i izmešano. stavljeno na magnetni držač, i ostavljeno da stoji 2 minuta. Rastvor je ukonjen pomoću Pasterove pipete. 3 ml sterilnog PBS-a je aztim dodato, pomešano i stavljeno na magnetni držač, i ostavljeno da stoji 2 minuta. Proceudra sa sterilnim PBS ponovlejna je još jednom sa ukupno 3 pranja. PBMC je dodat u kublice i inkubiran, dok se mešao, tokom 30 minuta na 40°C. Tuba sa PBMC i kuglicama je stavljena na magnetni držač, i ostavljena da stoji 2 minuta a zatim je rastvor prebačen u novu tubu od 5 ml na magnetni držač. Nakon 2 minuta rastvor je rastvor prebačen u novu tubu od 15 ml. Ovaj korak je ponovljen još četiri puta i rastvori od prva četiri puta su sakupljeni u tubu od 15 ml centrifugirani na 1000 RPM tokom 5 minuta. Ovaj korak je produkovao talog za separaciju T-ćelija.
[0190] 100 p.1 RPMI (bez aditiva) je dodato da bi se pokupile kuglice, i ratsvor je prebačen u 0.7-mI tubu. 10 pđ of Dynal Detacha Beads (kuglice) je dodato u suspenziju na sobnoj temperaturi, i ostavljeno je da se rotira 45 minuta. Suspenzija je prebačena u nove tube od 5 ml i dodato je 3 ml RPMI (sa aditivima). Tube su stavljene na magnetni držač, i ostavljene da stoje 2 minuta. Zatim je rastvor prebačen u novu tubu od 5 ml i stavljena na magnetni držač 2 minuta, a zatim u novu tubu od 15 ml. Prethodni korak je ponovljen još tri puta, i rastvor je sakupljan u tubu od 15 ml. Tuba od 15 ml centrifugirana je na 1000 RPM tokom 10 minuta i ćelije su resuspendovane u 10 ml RPMI. Korak sipiranja je ponovljen još dva puta sa ukupno 3 pranja. Ćelije su sakupljene i izbrojane pre poslednjeg centrifugiranja. Ovaj korak je završni korak u prečišćavanju B ćelija. Ćelije su čuvane u 90% FCS i 10% DMSO i zamrznute na - 800°C.
Izolacija T ćelija
[0191] Kolona za obogaćivanje humanih T ćelija (The human T cell Enrichment Column, R&D svstems, anti-h CD 3 column kit) pripremljen je pomoću 20 ml IX pufera za pranje kolone mešanjem 2 ml lxpufera za pranje kolone i 18 ml sterilne destilovane vode. Kolona je očišćena sa 70% etanolom i stavljena na vrh tube od 15 ml. Gornji zatvarač kolone je uklonjen da bi se izbegla odvoženje vazduha na dno kolone. Zatim, donji zatvarač je ukonjenm i vrh je očišćen sa 70% etanolom, Tečnost u koloni je puštena da se ocedi u tubu od 15 ml. Nova sterilna tuba od 15 ml je postavljena pod kolonu nakon što se pufer za kolonu spustioo na nivo belog filtera. Frakcija PBMC sa raspdanutim B ćelijama je resuspcndovana u 1 ml pufera i dodata na vrh kolone. Clije su puštene da se inkubiraju u koloni na sobnoj temperaturi tokom 10 minuta. T ćelije su eluirane iz kolone sa 4 alikvota svaki 2 ml sa 1\puferom za pranje kolone. Sakuplejne T ćelije su centrifugirane na 1000 RPM tokom 5 minuta. Supernatant je uklonjen i ćelije su resuspendovane u 10 ml RPMI. Ćelije su izbrojane i centrifugirane još jedan put. Supernatant je ukonjen. i time je završena je purifikacija T ćelija. Čeh je su čuvane u 90% FCS i 10% DMSO i zamrznute na -80"C.
[0192] Za gore opisane procedure RPML kompozicija sadržala je 10% FCS (inaktivi ran na 56°C tokom 45 mm). 1 % Pen/Strep (100 u/ml Penicilini. 0. i Pii/ml Streptomvcin), 1% Glutamate, 1% sodium puravate. 50 PM 2-ME.
Esej protočne citoinetrije ( Flow Cvtojluorometric As. sav)
[0193] Ramos ćelije (106 cells/uzorku) su inkubirane u 100 |ll primarnih antitela (10 U.g/ml in PBS-BSA) tokom 20 min na 4°C. Nakon 3 pranja sa PBS-BSA ili HBSS-BSA ćelije su inkubirane u 100 ui FITC-obeleženim F(ab')2fragmentima kozijih anti-(humani IgG) antitelima (Caltaq) tokom 20 min na 4°C. Nakon 3 pranja sa PBS-BSA i 1 pranjem sa PBS ćelije su resuspendovane u 0.5 ml PBS-a. Analize su izvršene sa FACSCAN V (Becton Dickinson, San Jose, California).
Generisanje klonova hibridoma
[0195] Splenocite (ćelije jetre) iz imunizovanih miševa su fuzionisani sa SP 2/0 or P 3 x 63Ag8.653 mišijim mijeloma ćelijama u odnosu 10:1 korišćenjem 50% polietilen glikola kao što je prtehodno opisao Boer et al. (1988) J. Immunol. Meth. I 13:143. Fuzionisane ćelije su resuspendovane u kompletnom IMDM medijumu obogaćenim sa hipoksantinom (0.1 mM), aminopterinom (0.01 mM), timidinom (0.016 mM), i 0.5 ng/ml hIL, 6 (Genzvme, Cambridge, Massachusetts). Fuzionisane ćelije su zatim distribuirane u ploče za kulture tkiva sa 96 bunarčića tako da svaki bunarčić u prošeku ima 1 rasuću hibridomu.
[0195] Nakon 10-14 dana supernatanti populacija hibridoma su pregledane na proizvodnju specifičnih antitela. Za pregledavanja proizvodnje apecifičnih antitela od strane hibridoma klonova, supernatanti iz svakog bunarčića su sakupljeni i prvo su testirani na specifičnost anti-CD40 aktivnosti pomoću ELISA testa. Pozitivni su zatim upotrebljeni za fluorescentno bojenje ćelija EBV-transformisanih B ćelija kao što je opisano za FACS esej u tekstu iznad. Pozitivne hibridoma ćelije su klonirane dva puta ograničavajućom dilucijom u IMDM/FBS koji sadrži 0.5 ng/ml hIL-6.
Primer 1: proizvodnja anti- CD40 antitela
[0196] Nekoliko potpuno humanih antagonist anti-CD40 monoklonalnih antitela IgGl izotipa su generisani. Transgeni miševi koji nose humani lokus za IgGl teški lanac i lokus za k humaniKlanac (Abgenix g-1 XenoMouse® technologv (Abgenix; Fremont, California)) koriščeni su za generisanje ovih antitela. SF9 insektske ćelije koje eksprimiraju CD40 ekstracelularni domen korišćene su kao imunogen. Ukupno 31 slezina miša su fuzionisani sa mišijim SP2/0 ćelijama mijeloma da bi sc dobilo 895 antitela koja prepoznaju rekombinantni CD40 u ELISA (tabele 1A i 1B). U prošeku 10% hibridoma proizvedeno koričenjem Abgenix XenoMouse® tehnologije može da sadrži misiji lambda laki lanac umesto humanog kappa lanca. Odabrana su antitela koja sadrže misiji lambda laki lanac. Ukupno 260 antitela koja takođe pokazuju vezivanje za CD40 sa površine ćelija odabrani su za dalje analize. Stabilne hibridome odabrane tokom serije procedura subkloniranja korišćene su za dalju karakterizaciju u esejuima za proučavanje vezivanja i funkcija. [0197J Klonovi iz drugih 7 hibridoma identifikovani su da poseduju antagonističku aktivnost (tabela 2 u tekstu iznad). Na osnovu relativnog antagonističkog potencijala i ADCC aktivnosti, dva klona hibridoma su odabrana za dalju cvaluaciju. Oni su nazvani 131.2F8.5.9 (5.9) i 153.8E2.D10.D6.12.12 (12.12). Profili vezivanja ovih antitela za CD40+ ćelijske linije limfoma prikazane su u obliku citometrijskog histograma na slici 1.
Primer 2: Polinukleotidne amino kiselinske sekvence humanih anti- CD40 antitela
[0198] cDNK koje kodiraju varijabilne regione kandidatnih antitela umnožene su PCR-om, klonirane i sekvencirane. Amino kiselinske sekvence lakog lanca i teškog lanca CHIR-12.12 antitela prikazana sun a slikama 9A i 9B. Videti takođe SEQ ID NO:2 (laki lanac mAb CHIR-12.12) i SEQ ID NO:4 (teški lanac mAb CHIR-12.12). Varijanta teškog lanca mAb CHIR-12.12 prikazana je na slici 9B (videti takođe SEQ ID NO:5), koja se razlikuje od SEQ ID NO:4 jer joj je serinski ostatak zamenjen sa alaninom na poziciji 153 of SEQ ID NO:4. Nukleotidna sekvenca koja kodira laki lanac i teški lanac CHIR-12.12 antitela prikazan je na slikama 10A i 10 B. Videti takođe SEQ ID NO: 1 (kodirajuća sekvenca za laki lanac mAb CHIR-12.12) i SEQ ID NO:3 (kodirajuća sekvenca za teški lanac mAb CHIR-_12.12). Amino kiselinske sekvence lakog lanca i teškog lanca CHIR-5.9 antitela prikazana su na slikama 11A i 1 lB.Videti takođe SEQ ID N0:6 (laki lanac mAb CHIR-5.9) i SEQ ID N0:7 (teški lanac mAb CHIR-5.9). Varijanta teškog lanca mAb CHIR-5.9 prikazana je na slici 11B (videti takođe SEQ ID NO:8), koja se razlikuje od SEQ ID N0:7 jer joj je serinski ostatak zamenjen sa alaninom na poziciji 158 of SEQ ID NO:7.
[0199] Kao što se očekuje, između antitela dobijenih iz nezavisnih hibridoma postoji značajna razlika u nukleotidnoj sekvenci u okviru regiona za određivanje komplementarnosti (CDRs). Smatra se da diverzitet CDR3 regiona u VH najznačajnije određuje specifičnost antitela.
Primer 3: Efekat CHIR- 5. 9 i CHIR- 12. 12 na CD40/ CD40L interakciju in vitro
[0200] Kandidatna antitela CHIR-5.9 i CHIR-12.12 sprečavaju vezivanje CD40 liganda za CD40 na površini ćelija i izlažu prethodno vezan CD40 ligand. Antitela CHIR-5.9 i CHIR-12.12 su testirana na njihovu sposobnost da spreče vezivanje CD40 liganda za CD40 na površini ćelijske linije limfoma (Ramos). Vezivanje obe vrste antitela (neobeležene) sprečavalo je dalje vezivanje PE-CD40 liganda što je izmereno esejom protočne citometrije (slika 2A). U drugoj grupi aseja dva antitela su testirana na njihovu sposobnost da zamene CD40 ligand koji je prethodno vezan za CD40 na površini ćelije. Oba antitela bila su efektivna u kompetiranju sa prethodno vezanim CD40 ligandom, pri čemu je CHIR-5.9 bio efektivni"" od CHIR-12.12 (slika 2B).
Primer 4: CHIR- 5. 9 i CHIR- 12. 12 vezuju se za različite epitope na CD40 u odnosu na
15B8
[0201 j Kandidatna monoklonalna antitela CHIR-5.9 i CHIR-12.12 kompetiraju sa drugima za vezivanje za CD40 ali ne sa 15B8. IgG2 anti-CD40 mAb (vidctilnternational Publication No. VVO 02/28904). Studije kompetitivnog vezivanja antitela korišćenjem Biacore dizajnirana su tako što se koristieCM.5 bisenzorni čipovi sa proteinom A koji je tmobilisan via aminskog kuplovanja, koje je koriščeno za hvatanje anti-CD40, CHIR-12.12, ili 15B8. Normalne krive asocijacije/diasocijacije vezivanja posmatrane su u funkciji pormene koncentracije CD40-his (podaci nisu prikazani). Za stidoje kompeticije ili CD40-his/CHIR-5.9 Fab kompleks (100 nM CD40:1 PM CHIR- 5.9.Fab), u različitim koncentracijama je propuštano da prelazi preko modifikovane površine. U slučaju CHIR-12.12, nije zabeležena asocojacija kompleksa, ukazujući na to da CHIR-5.9 blokira vezivanje CHIR-12.12 za CD40-his. Za 15B8, viđena je asocijacija Fab CHIR-5.9 kompleks ukazijući an to da CHIR-5.9 ne blokira vezivanje 15B8 za CD40 vezujuće mesto. Međutim, Hovvever, "off rate" kompleksa se dramatično povećala (podaci nisu prikazani).
[0202] Takođe, određeno je da 15B8 i CHIR-12.12 ne kompetiraju za CD40-his vezivanje. Ovaj eksperiment je postavljen tako što se hvataju CHIR-12.12 na biosenzornom čipu sa proteinom A, pri čemu se blokiraju rezidualna mesta na proteinu A sa kontrolnim hlgGl, vezuju za CD40-his i zatim propušta 15B8 preko modifikovane površine. 15B8 se nije vezao pod ovim uslovima ukazujući na to da CHIR-12.12 ne blokira 15B8 da se veže za CD40.
Primer 5: Osobine vezivanja odabranih hibridoma
[0203] Protein A je imobilisan na CM5 biosenzomim čipovima preko aminskog kuplovanja. Humana anti-CD40 monoklonalna antitela, pri količini 1.5 U-g/ml, su uhvaćena na površinu modofikovnog biosenzora tokom 1.5 minuta pri 10 |ig/min. Antitelo i antigen su razblaženi u 0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% surfaktant P20 (HBS-EP). Kinetička konstanta i konstanta afiniteta određene su pomoću Biaevaluation softvera sa 1:1 " interaction model/global fit".
[0204] Kako je prikazano na tabeli 3 u tekstu ispod, 121 puta razlika u "off rate" CHIR-5.9 i CHIR-12.12 rezultirala je u 24-puta većem afinitetu za CHIR-12.12.
Primer 6: CHIR- 5. 9 i CHIR- 12. 12 su potentni antagonsti za CD40- posredovanu
proliferaciju humanih limfocita u normalnom subjektu
[0205] Angažovanost CD40 sa CD40 Ugandom indukuje proliferacija humanih B ćelija. Očekivano je da antagonost anti-CD40 monoklonalno antitelo inhibira ovu proliferaciju. Dva kandidatna antitela (CHIR-5.9 i CHIR-12.12) testirana sun a njihovu sposobnost da inhibiraju Ugandom indukovanu proliferaciju PBMC u normalnim humanim subjektima. Fotmaldehidom fiksirane CHO ćelije transfektanti koje eksprimiraju CD40-ligand (CD40L) korišćene su kao izvor CD40 liganda. Humane PBMC su gajene tokom 4 dana sa formaldehidom fiksiranim CHO ćelijama koj eksprimiraju CD40-ligand u prisustvu različitih koncentracija anti-CD40 mAb CHIR-5.9 ili CHIR-12.12. Proliferacija je merena inkorporacijom tricijum-timidina. Ćelije su pulsirane sa tricijum obeleženim timidinom na 37°C tokom 14-18 sati.
[0206] Za oba tela je pkazano das a visokom efikasnošću inhibiraju CD40 Ugandom indukovannu proliferaciju humanih PBMC (tabela 4A, mAb CHIR-5.9, tabela 4B. mAb CHIR-12.12). Eksperiment je izveden sa višestrukim donorima PBMC(n=12 za CHIR-5.9 i n=2 za CHIR-12.12) da bi se obezbedillo to da detektovana inhibicija nije osobina ćelija iz jednog donora. Procene koje su seldile nakon toga sa 4 dodatna donora PBMC su izvedene za mAb (monoklonalno antitelo) CHIR-12.12 i pokazivale slične trendove onima koj su primećeni. Širok spektar koncentracija antitela (0.01 p.g/ml to 100 p.g/ml) korišćen je u ovim esejima. U većini slučajeva, skoro potpuna inhibicija CD400-ligandom indukovana proliferacija mogla se postići pri koncentraciji antitela od 0.1 |ig/ml. Koncentracija antitela (pM) koja dovodi do inhibicije 50% CD40-ligandom indukovanie proliferacije limfocita (IC50) za limfocite iz 6 donora do prosećnog IC50 (pM) od 47 (SD=21; donor 1, 24; donor 2, 66; donor 3, 45; donor 4, 84; donor 5, 30; donor 6, 35), koji se poredi poželjno sa prosečnim IC50 (pM) od 49.65 prikazanim u tabeli 4B. Na osnovu trenutnih podataka, oba kandidatna antitela izgleda das u slična u njihovoj potenciji da inhibiraju CD40 Ugandom indukovanu proliferaciju normalnih PBMC.
[0207] Pored B ćelija, humane PBMC takođe poseduju prirodne ćelije ubice koje mogu da posreduju u citotoksičnosti zavisnoj od antitela (antibodv dependent cytotoxicity, ADCC). Da bi se razjasnio mehanizam inhibicije proliferacije koja je posredovana antitelom, izvedeni su eseji sa B ćelijama prečišćenim iz humanih PBMC. Sločno dobijenim rezultatima sa PBMC. oba antitela su potencijalno inhibirala CD40-ligandom indukovanu proliferaciju prečišćenih B ćelija (tabela 5. n=3). Ovi podaci pokazuju da antagonistička aktivnost kandidatnih antitela. a ne mehanizam ADCC je uzrok inhibicije proliferacije u ovim esejima.
Primer 7: CHIR- 5. 9 and CHIR- 12. 12 ne indukuju jaku proliferaciju humanih B ćelija
iz normalnih subjekata
[0208] CD40 ligand aktivira proliferaciju normalnih B ćelija i B ćelija limfoma. Vezivanje nekih anti-CD40 antitela (agonista) može da obezbedi sličan stimulatorni signal za proliferaciju normalnih i B ćelija raka. Antitela sa jakom stimulatornom aktivnošću B ćelija nisu podobni kandidati za terapeutski tretman limfoma B ćelija. Dva kandidatna antitela testirana su na njihovu sposobnost da indukuju proliferaciju B ćelija iz normalnih donora volontera. B ćelije prečišćene Ficoll-Hypaque Plus gradijent centrifugiranjem iz normalnih donorskih PBMC gajene sun a pločama sa 96 bunarčića u različitim koncentracijama kandidatnih antitela (u opsegu od 0.001 do 100 p:g/ml) tokom ukupno 4 dana. U pozitivnoj kontrolnoj grupi, PBMC su gajene sa formaldehidom fiksiranim CHO ćelijama koje eksprimiraju CD40 ligand. B ćelijska proliferacija je merena inkorporacijom timidina obeleženog sa tricijumom na 37°C tokom 14-18 sati. Dok je CD40 izložen na CHO ćelijama indukovao izraženu proliferaciju B ćelija rezuktirajući u prosečnom indeksu stimulcije (SI) od 145, kandidatna antitela su indukovala samo slabu proliferaciju sa inedksom stimulacije od 2.89 i 5.08 za CHIR-12.12 i CHIR-5.9, (n=3) (tabela 6).
[0209] Pored B ćelija, humane PBMC sadrže ćelijske tipove koji nose Fc receptore (FcR) za IgGl molekule koji obezbeđuju unakrsno povezivanje (cross linking) anti-CD40 antitela vezanih za CD40 na B ćelijama. Unakrsno povezivanje može da potencijalno poveća stimulatornu aktivnost anti-CD40 antitela. Da bi se potvrdilo odsustvo B ćelijske stimulatorne aktivnosti CHIR-5.9 i CHIR-12.12 antitela u prisustvu ćelija sa sposobnošću unakrsnog povezivanja, eksperimenti proliferacije izvedeni su sa totalnim PBMC koje sadrže B ćelije kao i FcR+ ćelijama. Podaci iz ovih eksperimenata (tabela 7A, mAb CHIR-5.9; tabela 7B, mAb CHIR-12.12) potvršuju da ova kandidatna antitela čak i u prisustvu ćelija sa FcR generalno ne stimulišu B ćelije da proliferišu preko pozadinske proliferacije koja je indukovana kontrolnim humanim IgGl (n=10). CD40 ligand jc indukovao prosečan indeks stimulcije (SI) od 7.41. Prosečan SI sa kandidatnim antitelima bili su 0.55 i 1.05 za CHIR-12.12 i CHIR-5.9. Samo jedan od 10 donora PBMC je pokazivao neki stimulatorni odgovor na CHIR-5.9 antitelo (donor #2 u tabeli 7). Odsustvo stimulatorne aktivnostiod strane kandidatnim mAbs dalje je potvrđena merenjem PBMC proliferacije kao odgovor na kandidatna anti-CD40 antitela imobilisana na plastičnim površinama bunarčića za gajenja (n=2). Prosečni SI stimulacije sa CD Ugandom, CHIR-12.12 i CHIR-5.9 bio je 22, 0.67, i 1.2 (tabela 8). Uzimajući sve u obzir, podaci pokazuju da kandidatna anti-CD40 antitela ne poseduju jakue osobine stimulacije B ćelija.
Primer 8: CHIR- 5. 9 i CHIR- 12. 12 imaju sposobnost da ubiju ciljne ćelije koje nose
CD40- putem ADCC
[0210] Kandidatna antitela mogu ubiti ciljne ćelije koje nose CD40- putem ADCC mehanizma. Oba CHIR-5.9 i CHIR-12.12 su potpuna humana antitela IgGl izotipa i očekuje se da imaju sposobnost da indukuju ubijanje ciljnih ćelija putem ADCC mehanizma. Ona su testirana na njihovu sposobnost da ubiju ćelijske linije raka u in vitro esejima. Dve humane ćelijske linije limfoma (Ramos i Daudi) su selektovane kao ciljne ćelije za ove eseje. PBMC ili obogaćene NK ćelije iz 8 normalnih donora volontera korišćene su kao efektorne ćelije u ovim esejima. Potentniji ADCC odgovor viđen je sa CHIR-12.12 u poređenju sa CHIR-5.9 protiv ciljnih ćelija iz obe ćelijske linije kancera limfoma. Ćelijske linije limfoma takođe eksprimiraju CD20, ciljni antigen za rituximab (Rituxan®), koji je dopustio poređenje ADCC aktivnosti ova dva kandidatna mAbs sa ADCC aktivnošću rituximaba. Za ćelijske linije limfoma, prosečna specifična liza od 35%, 59%, i 47% viđena je za CHIR-5.9, CHIR-12.12 i ituximab kada je korišćena koncentracija od 1 p.g/ml (tabela 9). Dva antitela nisu pokazivala značajnu aktivnost u esejima citotoksičnosti zavisne od komplementa
(CDC).
Primer 9: CD40 je prisutan na površini NHL ćelija iz biopsije limenih čvorova
pacijenata
[021 1] NHL ćelije su izolovane iz biopsija limfnih čvorova iz pacijenata i sačuvane su u tečnom azotu do upotrebe. Ćelijska vijabilnost u momentu analize prelazila je909, .Ćelije iz dva rituxirnab-senzitivna i tri rituximabrezistentna pacijenta (pet pacijenata ukupno) bile su obeležene sa ili direktno obeleženim 15B8-FTTC ili 15B8 plus anti-huIgG2-FITC i analizirane protočnom citometrijom. Pokazano je da NHL ćelije iz svih pacijenata eksprimiraju CD40. Tabela 10 pokazuje da u porseku 76% NHL ćelija eksprimira CD40 (u opsegu 60-91%)
Primer 10: CHIR- 5. 9 i CHIR- 12. 12 ne stimulišu proliferaciju ćelija raka iz limfnih
čvorova NHL pacijenata
[0212] CD40 ligand je poznat po tome da obezbeđuje stimulatorni signal za preživljavanje i proliferaciju ćelija limfoma iz NHL pacijenata. Vezivanje nekih anti-CD40 antitela (agonista) može da obezbedi sličan stimulatorni signal za proliferaciju ćelija raka pacijenta. Antitela sa jakom B ćelijskom stimulatornom aktivnošću nisu pogodni kandidati za terapeutski tretman limfoma B ćelija. Dva kandidatna antitela su testiran na njihovu sposobnost da indukuju proliferaciju NHL ćelija iz 3 pacijenta. Ćelije izolovane iz biopsija limfnih čvorova (LN) gajene su u različitim koncentracijama kandidatnih antitela (opseg od 0.01 do 300 p.g/ml) tokom ukupno 3 dana. Ćelijska proliferacija merena je inkorporacijom timidina obeleženog tricijumom. Nijedno kandidatno mAbs nije indukovao bilo kakvu proliferaciju ćelija raka ni pri jednoj od testiranih koncentracija (tebela 11). Antitela čak ni u prisustvu egzogeno dodatog IL-4, faktora rasta B ćelija, nije indukovao proliferaciju NHL ćelija (testirano u jednom od tri ćelija izolovanih iz pacijenata. Ovi rezultati ukazuju na to da CHIR-5.9 i CHIR-12.12 nisu agonist anti-CD40 antitela id a ne stimulišu proliferaciju in vitro NHL ćelija iz pacijenata.
Primer 11: CHIR- 5. 9 i CHIR- 12. 12 mogu da blokiraju CD40- ligandom posredovanu
proliferaciju ćelija raka iz pacijenata sa ne- Hočkiusonovim limfomom
[0213] Upotreba CD40 od strane CD40 liganda indukuje proliferaciju ćelija raka poreklom iz NHL pacijenata. Očekivano je da antagonist anti-CD40 antitelo inhibira ovu proliferaciju. Dva kandidatna anti-CD40 antitela testirana su u različitim koncentracijama (0.01 u.g /ml to 100fig/ml) na njihovu sposobnost da inhibiraju CD40-ligandom posredovanu proliferaciju NHL ćelija iz pacijenata. NHL ćelije iz pacijenata gajene su u suspenziji preko CD40L-eksprimirajućih "fceder" u prisustvu IL-44. NHL ćelijska proliferacija merena je na osnovu inkorporacije 3H-timidina. Pokazano je da oba pokazuju visoku efikasnost ili inhibiciju CD40-ligandom posredovane proliferacije NHL ćelija (tabela 12, n=2). Skoro kompletna inhibicija CD40-ligandom posredovane proliferacije mogla se dobiti pri koncentraciji antitela od 1.0 to 10 jig/ml.
Primer 12: Efekat CHIR- 5. 9 na broj vijabilnih NHL ćelija kada se gaje sa ćelijama
koje nose CD40- ligand
[0214] Ispitani su efekti CHIR-5.9 na broj vijabilnih NHL ćelija kada se gaje sa ćelijama koje nose CD40-ligand tokom produženog vremenskog perioda (dana 7, 10, i 14). CD40-ligandom posredovana signalizacija preko CD40 jc važna za preživljavanje B ćelija. Ova grupa eksperimenata procenila je efekat anti-CD40 antitela na broj NHL ćelija dana 7, 10, 14. NHL ćelije iz pet pacijenata gajene su u suspenziji preko CD40L- eksprimirajućih ozračenih ćelija hranilica (feeder cells) u prisustvu IL-4. Kontrolna humana IgG i CHG-5.9 antitela dodata su u koncentracijama od 10U.g/ml dana 0 i dana 7. Vijabilne ćelije u istim uslovima izbrojane su specifičnog dana. Broj ćelija u kontrolnoj grupi (IgG) rastao je tokom vremena što jr bilo i očekivano. Redukovan broj ćelija dobijen je iz kultura tretiranih sa CHIR-5.5 u poređenju sa kontrolnom grupom. Najveći nivoi redukcije broja ćelija od strane CHIR-5.5 antitela viđen je dana 14 i bio je u prošeku 80.5% (opseg od 49-94%) u poređenju sa izotip kontrolom (n=5). Ovi podaci su sumirani u tabeli 13.
Primer 13: CHIR- 5. 9 CHIR- 12. 12 su sposobni da ubiju ćelije raka iz limfnih
čvorova NHL pacijenata putem ADCC
[0215] Oba CHIR-5.9 i CHIR-12.12 su potpuno humana antitela IgGl izotipa i pokazano je da indukuju ubijanje ćelijskih linija limfoma in vitro putem mehanizma ADCC (tabela 9). Testirana je njihova sposobnost da ubiju ćelije raka iz jednog NHL pacijenta u in vitro esejima. Obogaćne NK ćelije iz normalnih domora dobrovoljaca ili sveže nakon izolacije ili nakon gajenja preko noći na 37°C su korišćene kao efektorne ćelije u ovom eseju. Slični rezultati dobijeni su i sa sveže izolovanim NK ćelijama is a NK ćelijama nakon prekonoćne kultivacije. Viši nivo ADCC primećen je sa CHIR- 12.12 u poređenju sa CHIR-5.9 protiv NHL ćelija iz pacijenta. NHL ćelije takođe eksprimiraju CD30, ciljni antigen za rituksimab (Rttuxan®), koji je omogućio poređenje ADCC aktivnosti ova dva kandidatna mAbs sa rituksimabom. Antitelo CHIR-12.12 i rituksimab pokazuju slični nivo ADCC aktivnosti, dok CHIR-5.9 je imao nižu ocenu u ovom eseju. Ovi podaci su prikazani na sliakma 3A i 3B.
Primer 14: CHIR- 5. 9 i CHIR 12. 12 mogu da blokiraju CD40- posredovano
preživljavanje i proliferaciju ćelija raka iz CLL pacijenata
[0216] Kandidatna antitela mogu da blokiraju CD40-posredovano preživljavanje i proliferaciju ćelija raka iz CLL pacijenata. CLL ćelije iz pacijenata su gajene u suspenziji preko CHO ćelija koje eksprimiraju CD40L koje su fiksirane sa formaldehidom u dva različita uslova: dodavanjem humanog antitela izotipa IgG (kontrola); i dodavanjem ili CHIR-5.9 ili CHIR-12.12 monoklonalnog antitela. Sva antitela su dodata u koncentraciji od 1, 10, i 100 p.g/mL u odsustvu IL-4. Brojanje ćelija rađeno je na 24 i 48 sati pomoću MTS eseja. Redukovani broj ćelija dobijen je iz kultura tretiranih sa CHIR-5.9- (n=6) i CHIR-12.12- (n=2) u poređenju sa kontrolnom grupom. Veće razlike u brojevima ćelija između anti-CD40 monoklonalnim antitelima tretiranim i kontrolnim antitelima tretiranim kulturama viđene su u vremenskoj tački od 48 sati. Ovi podaci su sumirani u tabeli 14.
Primer 15: CHIR- 5. 9 i CHIR- 12. 12 pokazuju anti- tumorsku aktivnost u životinjskim
modelima
Farmakologija/ in vivo efikanost
[0217] Očekuje se da kandidatna mAbs proizvode željene farmaceutske efekte u redukciji tereta raka putem jednog/oba od dva anitumorska mehanizma, blokade proliferacije/signala preživljavanja i indukcije ADCC. Trenutno dostupni humani modeli "xenograft" limfoma koriste dugotrajne ćelijske linije limfoma, koje za razliku od primarnih ćelija raka, za svoj rast i preživljavanje ne zavise od CD40 stimulacije. Zato, komponenta ovih antitumorske aktivnosti mAbs koja je bazirana na blokiranju tumorske proliferacije/signala preživljavanja ne bi trebalo da doprinosi anti-tumorskoj efikasnosti ovih modela. Efikasnost u ovim modelima zavisna je od ADCC, drugog anti-tumorskog mehanizma koji je povezan sa CHIR-5.9 i CHIR-12.12 mAb. Dva "xenograft" modela humanog limfoma bazirana na Namalvva i Daudi ćelijskim linijama procenjena su na anti-tumorske aktivnosti kandidatnih mAb. Da bi se dalje pokazala njihova terapeutska aktivnost, ova kandidatna mAb su procenjena u "unstaged" (nenamešten) modela "xenograft" humanog limfoma baziranim na Daudi ćelijskoj liniji.
Suma podataka efikasnosti in vivo
[0218] Kad se dostavlja intraperitonealno (i.p.) jednom nedljno sa ukupno 3 doze, CHIR -12.12, jedno od dva kandidatna mAb, značajno je inhibiralo rast agresivnog "unstaged" limfoma B ćelija (Namalvva), na dozno-zavistan način (slika 4). Drugo kandidatno mAb, CHIR-5.9 je testirano samo kao jedna doza u ovoj studiji i bilo je manje efikasno nego ista doza CHIR-12.12. Interesantno, pokazano je da CHIR-12.12 sfikasnije u ovom modelu u odnosu na rituksimab. Moguće je da niža efikasnost rituksimaba može biti usled niske ekspresije CD20 od strane Namalvva ćelijske linije. Efikasnost koj je viđena kod kandidatnih mAb ima veću važnost jer samo jedan od dva mehanizma za ubijenje ćelija (ADCC) je operativan u sadašnjem modelu "xenograft" limfoma. Očekuje se da su dva mehanizma ubijanja, ADCC i blokiranje signala za preživljavanje, doprinose anti-tumorksim aktivnostima u ljudskim pacijentima sa limfomom. Ovo verovatno može da poveća šansu za postizanje efikasnosti u ljudskim pacijentima sa limfomom. Kandidatna anti-CD40 mAb takođe su pokazala trend ka redukciji rasta tumora u drugom modelu limfoma B ćelija (ne-validirani Daudi model, podaci nisu prikazani). U studijama koje su sledile, dva kandidatna antitela su pokazala da imaju dozno-zavisnu anti tumorsku efikasnost u oda i '"unstaged" (nenemešten) i"staged (nameštenom) Daudi modeli limfoma (slike 5 i 6). U"staged" Daudi modelu, CHIR-_12.12. mAb je bilo efikasnije u redukciji zapremine tumora nego slična doza Rituxan®.
[02I9| Da bi se obezbedio konzistentni rast tumora, "nude" miševi đeficijentni za T želije su bili kompletno ozračeni (celo telo) na 3 Gy da bi sc dalje supnmirao imuni sistem jedan dan pre inokulacije tumora. Ćelije tumora su inokulisane subkutanoz.no u desni bok sa 5xl0<6>ćelija po mišu. Tretman je iniciran ili jedan dan nakon implemetacije tumora ("unstaged" subkulatnozni "ksenograft" modeli humanih limfoma B ćelija, Namahva i Daudi) ili kada je zapremina tumora dostigla vrednost 200-400 mm"1 ("staged" Daudi model, najčešćs nakon 15 dana posle inokulacije tumora). Miševi koji su nosily tumor injecirani su sa anti-CD40 mAbs intraperitonealno (i.p.) jednom nedeljno sa navedenim dozama. Zapremine tumora beležene su dva puta nedeljno. Kada je tumor u bilo kojoj grupi dostigao 2500 mn<r>studij je prekidana. Obratiti pažnju da u nameštenom (staged) Daudi modelu, podaci o zapremini tumora analizirani su do nada 36 zbog smrti nekih miševa nakon tog dana. Kompletna regresija (KR) merna je do kraja studije. Podaci su analizirani uz pomoć ANOVA ili Kruskal-Wallis testa i odogovarajućeg post-testa za poređenje više grupa.
[0220] U "unstaged" (nenamešten) Daudi modelu anti-CD40 mAb CHIR-12.12, ali nw i Rituxan® (rituksimab), značajno (p= <0.01) je inhibirao rast Namahva tumora
(redukcija zapremine tumora 60% versus 25% za rituksamab, n=10 miševa/grupi)
(slika 4). Zato, u ovom modelu, anti-CD40 mAb CHIR-12.12 je bilo potentnije u odnosu na rituksimab. Bitno je zapamtiit da je drugo kandidatno monoklonalno antitelo CHIR-5.9, u najmanju ruku efikasno kao i rituksimab pri dozi od 1/10 one od rituksimaba. Oba anti-CD40 mAb CHIR-12.12 i rituksan značajno su sprečila razvoj
tumora u "unstaged" Daudi modelu tumora (4/15 rezistencije na izazov tumora) (slika 5).
[0221] Kada su ova anti-CD40 monoklonalna antitela dalje poređena u "staged" "xenograft" Daudi modelu, u kome je tretman započeo kada je potkožni tumor bio opipljiv, anti-CD40 mAb CHIR-12.12 pri 1 mg/kg je izazvao značajnu redukciju tumora (p=0.003) sa 60% kompletne regresije (6/10), dok rituksimab pri sličnoj dozi nije značajno inhibirao rast tumora niti je izazvao kompletnu regresiju (0/10). Videti sliku 6.
[0222] Ukupno, anti-CD40 mAb CHIR-12.12 je značajno inhibirao rast tumora u eksperimentalnim modelima limfoma. Pri istoj dozi i istom režimu, mAb CHIR-12.12 pokazao je bolju anti-kancernu aktivnost nego Rituxan® (rituksimab). Ovi podaci ukazuju na to da anti-CD40 mAb CHIR-12.12 ima potentnu anti-humani limfom aktivnost in vitro i u "xenograft" modelima i mogao bi biti klinički efektivan u tretmanu limfoma.
Primer 16: farmakokinetika CHIR- 5. 9 i CHIR- 12. 12
[0223] Pročavana je farmakokinetika anti-CD40 mAb u miševima nakon IV i IP dostavljanja pojedinačne doze. Anti- CD40 mAb pokazivalo je visoku sistemsku biodostunost nakon IP administarcije, i produžen terminalni polu-život (>5 dana)
(podaci nisu prikazani). Ova pilot studija je izvedena da pomogne u dizajniranju farmakoloških studija; međutim, to malo je bitno ili je nebitno za razvoj aktivnosti ovih monoklonalnih antitela jer ova potpuno humana mAb ne reagiju unakrsno (cross reaction) sa mišijim CD40.
Primer 17: Karaktcrizacija epitopa za monoklnana antitela CHIR- 12. 12 i CHIR- 5. 9
[0224] Da bi sc odredila lokacija epitopa na CD40 koga prepoznaju monoklonalna antitela CHIR-12.12 i CHIR- 5.9, uarađene su SDS-PAGE i Westcrn blot analize. Prečišćeni CD40 (0.5 u.g) je odvojen na 14-12% NUPAGE gelu u redukujućim i neredukujućim uslovima, prebačen je na PVDF membrane, i dodata je proba anti-humani IgG konjugovan sa alkalnom fosfatazom i razvijen je pomoću VVcstern BlueR stabilizirajućeg substrata za alkalnu fosfatazu (Promega).
[0225] Rezultati ukazuju na to da anti-CD40 monoklonalno antitelo CHIR-12.12 prepoznaje epitope na obe forme CD40 i redukujuće i neredukujuće, pri čemu neredukujuća forma CD40 pokazuje veći intenzitet nego redukujuća forma CD40 (tabela 15; blotovi nisu prikazani). Činjenica daje prepoznavanje bilo pozitivno za obe forme CD40 ukazije na to da ovo antitelo ineraguje sa konformcionim delom epitopa koji ima linearnu sekvencu. Monoklonalno antitelo CHIR- 5.9, primarno prepoznaje neredukujuću formu CD40 ukazujućie na to da ovo antitelo ineraguje sa primarno konformacionim epitopom (tabela 15; blotovi nisu prikazani).
[0226] Da bi se mapirao region na CD40, četiri ekstracelularna domena CD40 su klonirana i eksprimirana u insektskim ćelijama kao fuzioni GST proteini. Sekrecija četiri odmena je obezbeđena sa GP67 sekrecionim signalom. Supernatanti insektskih ćelija su analizirani pomoću SDS-PAGE i western blot analiza da bi se identifikovao domen koji sadrži epitop.
[0227] Monoklonalno antitelo CHIR-12.12 prepoznaje epitop na Domenu 2 pod oba i redukujućim i neredukujućim uslovima (tabelal6; blotovi nisu prikazani). Nasuprot tome, monoklonalno antitelo CHIR-5.9 pokazuje veoma slabo prepoznavanje Domena 2 (tabela 16; blotovi nisu prikazani). Nijedno od ovih antitela ne prepoznaje Domene 1, 3, ili 4, u ovoj analizi.
[0228] Da bi se preciznije definisao epitop koga prepoznaje monoklonalno antitelo CHIR-12.12, sintetisani su peptidi iz ekstracelularnog domena 2 CD40. koji odgovaraju sekvenci
PCGESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNTGLRVQQKGTSETDTICT
(ostaci 61-104 sekvence prikazane u SEQ ID NO:10 ili SEQ ID NO: 12). SPOTs membrane (Sigma) koje sadrže trideset pet 10-mernih peptida sa 1 amini kisleinom "offset" (promenjena) su generisani. Blot je skinut i ponovno je dodata proba sa mAb CHIR-5.9 da bi se odredio region koji prepoznaje ovo antitelo.
[0229] SPOTs analiza sa probom sa anti-CD40 monoklonalnim antitelom CHIR-12.12 pri 10 pig/ml dala je pozitivne reakcije sa spotovima 18 do 22. Region sekvence koji je pokriven ovim peptidima prikazan je u tabeli 17.
[0230] Ovi rezultati odgovaraju linearnom epitopu: YCDPNL (ostaci 82-87 sekvence prikazane u SEQ ID NO:10 ili SEQ ID NO: 12). Ovaj epitop sadrži Y82, D84, i N86, za koje je predviđeno da su umešani u the CD40-CD40 ligand interakciji.
[0231] SPOT analize sa mAb CHIR-_5.9 pokazale su slabo prepoznavanje peptida koji predstavljen sa mestima 20-22 prikazani u tabeli 18, ukazujući na to daje umešan region YCDPNLGL (ostaci 82-89 sekvence koja je prikazana u SEQ ID NO: 10 ili SEQ ID NO: 12) u vezivanje za CD40. Treba naglasiti da mAbs CHIR-12.12 i CHR-5.9 kompetiraju međusobno za vezivanje za CD40 u BIACORE analizi.
[0232] Linearni epitopi analzirani SPOTs analizama su u okviru CD40 BI modula. Sekvenca CD40 BI modula je: HKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTIC (ostaci 80-103 iz SEQ ID NO: 10 ili SEQ ID NO: 12).
[0233] U okviru epitopa koji je identif'ikovan za saCHIR-12.12 je C83. Poznato je da ovaj cisteinski ostatak formira disulfidnu vezu Cl03. Vrlo je verovatno da konformacioni epitop CHIR-12.12 mAb sadrži ovu disulfidnu vezu (C83-C103) i/ili okolne amino kiseline konformaciono bliske C 103.
Primer 18: broj CD20 i CD40 molekula na Namahva i Daudi ćelijama
[0234] Broj CD20 i CD40 molekula na Namahva i Daudi ćelijama određenje kao što je prikazano na slici 7, upotrebom koncentracija 0.01, 0.1, 1, 10. and 100 |ig/ml. Kao što može da se vidi na slici 7, prosečan broj CD20 molekula (cilj za rituximab) jc veći na obe Namalwa i Daudi ćelijske linije nego što je broj CD40 molekula (ciljni molekul za mAb CHIR-12.12).
Primer 19: ADCC mAb CHIR- 12. 12 i Rituximab protiv Daudi ćelija limfoma
[0235] Rituksimab i kandidatno mAb CHIR-12.12 su testirani in vitro na ADCC aktivnost pri promenljivim koncentracijama, protiv Daudi ćelijske linije limfoma kao cljnih ćelija (target - T) i prečišćenih NK ćelija iz zdravih humanih volontera kao efektornih (E) ćelija. Sveže izolovane humane NK ćelije su pomećane sa kalceinom obeleženim Daudi ćelijama limfoma pri odnosu E:T od 10. Ćelijske mešavine su inkubirane tokom 4 sata na 37°C u prisustvu pomenutih koncentracija ili mAb CHIR-12.12 ili rituksimaba. Nivo kalceina oslobođen iz liziranih ciljnih ćelija u supernatantu izmeren je kao arbitrarna jedinica fluorecencije (AFU). Procenat specifične lize izračunat je kao 100 x (AFU test - AFU spontanog ošlobađanja)/(AFU maksimalnog oslobađanja - AFU spontanog oslobađanja), gde je AFU spontano oslobađanje kalcein oslobođen od strane ciljnih ćelija u odsustvu antitela ili NK ćelija, i AFU maksimalno oslobađanje je kalcein osolobođen od strane ciljnih ćelija nakon lize sa detedžentom.
[0236] Liza Daudi ćelija zavisna od koncentracije antitela je primećena (slika 8; tabela 19 dole). Maksimalna specifična liza ciljnih ćelija limfoma indukovania sa anti-CD40 mAb bila je veća u odnosu na lizu indukovanu sa rituksimabom (63.6% versus 45.9%, n=6; uporedni t-test za mAb CHIR-12.12 versus rituksimab, p=0.0002). Dodatno, ED50 za rituksimab je bio u proseku( n=6) 51.6 pM, 13-puta veći nego ED50 za anti-CD40 mAb CHIR 12.12.
Rituximab-rituksimab
Primer 20: CHIR 12. 12 blokira CD40L- posredovano preživljavanje i signalne pmeve
u normalnim humanim B ćelijama
[0237] Solubilan CD40 ligand (CD40L) aktivira B ćelije i indukuje različite aspekte funksionalnih odgovora, uključujući povećanje preživljavanja i proliferacije. i aktivaciju NFkB, ERK/MAPK, PDKVAkt, i p38 signalnih puteva. Dodatno. CD40L-posredovana stimulacija obezbeđuje signale preživljavanja putem redukcije isečenog PARP i indukcije anti-apoptotičkih proteina XIAP and Mcl-1 u normalnim B ćelijama. CD40L-posredovana stimulacija takože regrutuje TRAF2 i TRAF3 da se vežu za citoplazmatski domen CD40.
[0238] Sledeće studije pokazuju da CHIR 12.12 direktno inhibira sve ove stimulatorne efekte na normalnim humanim B ćelijama. Na primer, tretman sa CHIR 12.12 rezultirao je u povećanom sečenju caspaze-9, caspaze-3, i PARP kao i redukciji XIAP i Mcl-1 na vremenski i dozno zavistan način, vraćajući apoptozu B ćelija. Tretman sa CHIR 12.12 takođe je inhibirao fosofrilaciju IkB kinaze (IKK)ki (3 (NFkB put), ERK, Akt, i p38 kao odgovor na CD40L-posredovanu CD40 stimulaciju.
CHIR 12. 12 je inhibirao preživljavanje posredovano CD40 Ugandom tako što je
indukaovao sečenje PARP.
[0239] U ovim eksperimentima, 0.6 x IO<6>normalnih humanin B ćelija iz zdravih donora (ptocenat čistoće između 85-95%) je stimulisano sa 1 (ig/ml sCD40L (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, NK). CHIR-12.12 (10 p.g/ml) i kontrolni IgG su zatim dodati. Ćelije su sakupljene na 0, 20 minuta, 2 sata, 6 sati, 18 sati, i 26 sati. Isečene caspaze-9, isečene caspaze-3, isečen PARP, i [3-actin kontrole su detektovane u ćelisjkim lizatima putem Western blot analize.
[0240] Ukratko, primećeno je daje CD40L-posredovana CD40 stimulacija obezbedila signale preživljavanja jer nije rezultovala u povećanju isečene caspaze-9, isečene caspaze-3, ili isečenog PARP tokom vremena, ukazujući na to da ćelije nisu prolazile kroz proces apotoze. Međutim, tertman sa CHIR-12.12 rezultirao je u povećanju ovih produkata sečenja, ukazujući na to daje tretman sa CHIR-12.12 ukinuo efekte CD40L vezivanja na signalizaciju preživljavanja u sCD40L-_stimulisanim normalnim B ćelijama, ponovo dovodeći do apoptoze B ćelija (podaci nisu prikazani).
CHIR- 12. 12 je inhibirao ekspresiju anti- apoptotičkih proteina " preživljavanja".
[0241] U ovim eksperimentima, 0.6 x IO<6>normalnih humanin B ćelija iz zdravih donora (ptocenat čistoće između 85-95%) je stimulisano sa 1 u.g/ml sCD40L (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, NK). CHIR-12.12 (10 pg/ml) i kontrolni IgG su zatim dodati. Ćelije su sakupljene na 0, 20 minuta, 2 sata, 6 sati, 18 sati, i 26 sati. Mcl-_1, XIAP, CD40, i P-aktin kontrole su detektovane u ćelijskim lizatima putem \Vestern blot analize.
[0242] Ukratko, sCD40L stimulacija rezultovala je u ekspresiji Mcl-1 i XIAP tokom vremena. Međutim, tretman sCD40L-stimulisanih ćeija sa CHIR 12.12 rezultovao je u smanjenju ekspresije ovih proteina tokom vremena (podaci nisu prikazani). Kako Mcl-1 i XIAP predstavljaju signale "preživljavanja" koji su sposobni da blokiraju apoptotički put, ovi rezultati pokazuju da tretman sa CHIR 12.12 uklanja blokadu za apoptozu u sCD40L-stimulisanim normalnim B ćeijama.
Tretman sa CHIR 12. 12 inhibirao je fosjorilaciju IKKa ( Seri 80) and IKK / 3( Ser 181).
[0243] U ovim eksperimentima, 0.6 x IO<6>normalnih humanin B ćelija iz zdravih donora (ptocenat čistoće između 85-95%) je stimulisano sa 1 Ltg/ml sCD40L (Alexis Corp.. Bingham, Nottinghamshire. NK). CHIR-12.12 (10 uvg/ml) i kontrolni IgG su zatim dodati. Ćelije su sakupljene na 0 i 20 minuta. Fosforilisane IKKa (Seri80) i IKK P (Ser 181) kao i ukupni IKK (3 kontrole su detektovane u ćelijskim lizatima putem NVestern blot analize.
[0244] Tretman sa CHIR-12.12 je ukinuo ovaj odgovor na sCD40L stimulaciju u normalnim B ćelijama (podaci nisu prikazani).
CHIR- 12. 12 tretman inhibirao je šreiivljavanje koje je posredovano CD40 Ugandom
na dozno zavistan način.
[0245] U ovim eksperimentima, 0.6 x I0<6>normalnih humanin B ćelija iz zdravih donora (ptocenat čistoće između 85-95%) je stimulisano sa 1 p:g/ml sCD40L (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, NK). CHIR-12.12 (0.01, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0 ug/ml) i kontrolni IgG su zatim dodati. Ćelije su sakupljene na 24 sata. Isečeni PARP. i [3-aktinske kontrole su detektovane u ćelijskim lizatima putem Western blot analize.
[0246] Ukaratko, CHIR-12.12 je rezultovao u povećanju PARP sečenja u sCD40L stimulisanim ćelijama na dozno zavistan način i tako je ukinuo put za signalizaciju za preživljavanje u sCD40L-stimulisanim normalnim B ćelijama (podaci nisu prikazani).
CHIR- 12. 12 je inhibirala ekspresiju anti- apoptotočkih proteina " preživljavanja" na
dozno zavistan način.
[0247] U ovim eksperimentima, 0.6 x IO<6>normalnih humanin B ćelija iz zdravih donora (ptocenat čistoće između 85-95%) je stimulisano sa 1 p.g/ml sCD40L (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, NK). CHIR-12.12 (0.5, 2, i 10 P-g/ml) i kontrolni IgG su zatim dodati. Ćelije su sakupljene na 22 sata. Mcl-1, XIAP, isečeni PARP, i (i-aktinske kontrole su detektovane u ćelijskim lizatima putem Western blot analize.
[0248] Ukaratko, CHIR-12.12 tretman je redukovao ekpresiju Mcl-1 i XIAP i povećao je ekspresiju isečenog PARP u sCD40L stimulisanim ćelijama na dozno zavistan način i tako je ukinuo ove blokade apoptotočkog puta u sCD40L-stimulisanim normalnim B ćelijama (podaci nisu prikazani).
CHIR- 12. 12 nije uticalo na ekspresiju anti- apoptotočkih proteina, isečenog PARP i
XI4P u odsustvu signalizacije solubilnog CD40L
[0249] U ovim eksperimentima, 0.6 x IO<6>normalnih humanin B ćelija iz zdravih donora (ptocenat čistoće između 85-95%) je tertirano sa CHIR-12.12 (10 p.g/ml) i kontrolnim IgG (to jest. ćelije nisu pred-stimulisane sa sCD40L pre dodavanja antitela). Ćelije su sakupljene na 0. 4, 14, i 16 sati. X1AP. isečeni PARP, i [3-aktinske kontrole su detektovane u ćelijskim lizatima putem VVestern blot analize.
|0250] Ukartko, rezultati pokazuju da bez sCD40L stimulacije, ćelije su pokazivale povećane koncentracije isečenog PARP. dok je ekspresija XIAP ostala konstantna, u obe grupe i IgG tretiranim ćelijama i CHIR-12.12 ćelijama (podaci nisu prikazani). Ovi rezultatai ukazuju na to da CHIR-12.12 ne izaziva apoptozu u nomalnim humanim B ćelijama bez CD40L stimulacije.
CHIR- 12. 12 inhibira fosfori lacijit IKKa ( Seri80) i IKK jS( Ser 181) Akt. ERK i p38 u
normalnim B ćelijama.
[0251] U ovim eksperimentima, 0.6 x IO<6>normalnih humanin B ćelija iz zdravih donora (ptocenat čistoće između 85-95%) je izgladnjivano serumom u 1% medijumu sa FBS i stimulisano sa 1 pg/ml sCD40L (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, NK). Kulture su tretirane sa CHIR-12.12 (10 p.g/ml) i kontrolnim IgG. Ćelije su sakupljene na 0 i 20 minuta. Isečeni PARP, i fi-aktinske kontrole su detektovane u ćelijskim lizatima putem Western blot analize. Fosfo- IKKa, fosfo-IKKp, totalno IKKP, fosfoERK, totalni ERK, fosfoAkt, totalni Akt, fosfop38, i totalni p38 su detektovane u ćelijskim lizatima putem NVestern blot analize.
[0252] Ukratko, stimulacija sa sCD40L rezultirala je u povećanju IKKa/p fosforilacije, ERK fosforilacije, Akt fosforilacije, i p38 fosforilacije, i tako dovela do preživljavanja i ili proliferacije ćelija. Tretman ćelija sa CHIR-12.12 ukinio je efekte sCD40L stimulacije na ove signalne puteve u normalnim B ćelijama (podaci nisu prikazani).
CHIR- 12. 12 je inhibirao višestruke signalne PI3K i MEK / ERK u Cd40 signalnoj
kaskadi.
[0253] U ovim eksperimentima, 0.6 x IO6 normalnih humanin B ćelija iz zdravih donora (ptocenat čistoće između 85-95%) je izgladnjivano serumom u 1% medijumu sa FBS i stimulisano sa 1 p:g/ml sCD40L (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, NK). Kulture su takođe tretirane sa CHIR-12.12 (1 i 10 p:g/ml) Wortmanin, (inhibitor PI3K/Aktr, 1 and 10 pjvl), LY 294002 (inhibitor PI3K/Akt; 10 i 30 uM), i PD 98095 (inhibitor MEK, 10 i 30 |ig/ml). Ćelije su sakupljene na 0 i 20 minuta. FosfoERK, fosfoAkt, totalni Akt, fosfo-IKKa,/f3 i totalno, su detektovane u ćelijskim lizatima putem Western blot analize.
[0254] Ukratko, rezultati pokazuju daje CHIR-12.12 ukinuo fosforilaciju svih ovih signalnih transduktornih molekula, pri čem su inhibitori transdukcije pokazivali samo specifično ukidanje signalizacije, ukazujući da CHIR-12.12 najverovatnije inhibira uzvodno od ovih signalnih molekula transdukcije posredovano CD40L stimulacijom (podaci nisu prikazani).
CHIR- 12. 12 inhibira vezivanje signalnih molekula TRAF2 i TRAF3 za citoplazjnatski
domen CD40 u normalnim B ćelijama.
[0255] U ovim eksperimentima, 4 x IO6 normalnih humanin B ćelija iz zdravih donora (ptocenat čistoće između 85-95%) je izgladnjivano serumom u 1% medijumu sa FBS i stimulisano sa 1 p,g/ml sCD40L (Alexis Corp., Bingham. Nottinghamshire. NK) tokom 20 minuta. Ćelije su sakupljene na 0 i 20 minuta. CD40 je imunoprccipitovan pomoću poliklonalnih anti-CD40 (Santa Cruz Biotechnologv. CA). i urađen je VVcstcrn blot sa anti-TRAF2 mAb (Santa Cruz Biotechnologv, CA), auti-TRAF3 mAb (Santa Cruz Biotechnologv, CA), i anti-CD40 mAb (Santa Cruz Biotechnologv. CA).
[0256] Ukratko, rezultati pokazuju da TRAF2 i TRAF3 ko-precipitiraju sa CD40 nakon stimulacije sa sCD40L. Nasuprot tome. tretman sa CHIR-12.12 ukinuo je formiranje CD40-TRAF2/3 signalnog kompleksa u normalnim B ćelijama koje su stimulisane sa sCD40L. Nije bilo promena u ekspresiji CD40 (podaci nisu prikazani).
[0257] Bez potrebe da se vežemo za teoriju, rezultati ovih eksperimenata, irezultati iz primera koji su gore u tekstu podvučeni, ukazuju na to daje CHIR-12.12 antitelo antagonističko anti-CD40 monoklonalno antitelotelo sa dualnom aktivnošću koje poseduje jedinstvenu kombinaciju atributa. Potpuno humano monoklonalno antitelo blokira CD40L.posredovane CD40 signalne puteve za preživljavanje i proliferaciju B ćelija; ovaj antagonizam dovodi do krajnje smrti ćelije. CHIR-12.12 takođe posreduje u prepoznavanju i vezivanju efektornih ćelija, inicirajući ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC). Jednom kada je CHIR-12.12 vezano za efektorne ćelije, oslobađaju se citoplazmatični enzimi, i dovode do apoptoze B ćelija i lize. CHIR-12.12 je potentniji antitumorsko antitelo od rituksimaba kada se porede u pre-kliničkim tumorskim modelima.
Primer 21: agonistička i antagonistička aktivnost protiv primarnih ćelija raka porekom
iz NHL. CLL, i NM pacijenata
[0258] U saradnji sa kliničkim istraživačima, kandidatma mAbs su testirana na različite aktivnosti (navedene su dole) protiv primarnih ćelija raka iz pacijenata sa NHL i CLL i multipnim mijelomama. • Agonistički efekat u esejima proliferacije (8 NHL pacijenta, 8 CLL pacijenti i 8 MM pacijenta) • Antagonistički efekat u esejima proliferacije (8 NHL pacijenta, 8 CLL pacijenti i 8 MM pacijenta) • Apoptotički efekat na osnovu Annexin V eseja (3-4 NHL pacijenta, 4 CLL pacijenata, i 4 MM pacijenta) • "Reversing" signal preživljavanja na osnovu Annexin V eseja (3 NHL pacijenta, 3 CLL pacijenta i 3 MM pacijenta) • Ctotoksičnost zavisna od komplementa (4 NHL pacijenta, 4 CLL pacijenta, i 4MM pacijenta) • Ctotoksičnost zavisna od antitela (6 NHL pacijenta, 6 CLL pacijenta i 6 MM pacijenta)
Primer 22: identifikacija relevantnih vrsta životinja za studije toksičnosti
[0259] Kako ova dva kandidatna antitela unakrsno ne reaguju sa glodarskim CD40, druge vrste moraju biti identifikovane za testiranje toksikoloških efekata.
[0260] Sposobnost kandidatnih antitela da unakrsno reaguju sa životinjskim CD40 testirana je esejom protočne citometrije. U ovoj studiji testirani su pacov, zec. pas, cinomolgus majmun i marmozet majmun.
[0261] Kandidatna antitela pokazuju antagonističku aktivnost nakon vezivanja za CD40 na humanim B ćelijama. Da bi sc idcntifikovalc vrste životinja koje imaju sličan odgovor na kandidatna antitela, limfociti iz vrsta koje pokazuju vezivanje za kandidatna antitela testirani su na antagonističku aktivnost u esejima proliferacije. Limfociti iz vrsta koje su odabrane na osnovu njihovog antagonističkog vezivanja kandidatnih antitela, dalje su testirani na njihovu sposobnost da služe kao efektorne ćelije za ubijanje CD40-eksprimirajućih ćelijskih linija putem mehanizma ADCC. Na kraju odabrane životinjske vrste se testiraju u IHC studiji na načine vezivanja za tkiva kandidatnih antitela. Životinjske vrste koje odgovaraju na kandidatna antitela u ovim esejima na sličan način kao onaj koji je viđen za humane ćelije, odabiraju se za toksikološke studije.
[0262] Inicijalna studija ukazuje da kandidatno anti-CD40 mAbs unakrsno reaguje sa CD40 cinomolgusnog majmuna.
Primer 23: CHIR- 5. 9 i CHIR- 12. 12 profili ciljanja tumor
[0263] Da bi se odredio relativni profil ciljanja tumora za CHIR-12.12 i CHIR-5.9 mAbs, fluorescentno obeležena kandidatna mAbs i izotipna kontrolna antitela se dostavljaju u miševe koji nose tumore. Uzorci tumora i normalnih organa se sakuplajju u različitim vremenskim tačkama nakon doziranja. Akumulacija obelećenih antitela u tumorima i normalnim organima se analizira.
Primer 24: mehanizmi delovania CHIR- 5. 9 i CHIR- 12. 12
[0264] Da bi se razotkrio mehanizam (i) koji posreduju u inhibiciji rasta tumora sa CHIR-5.9 i CHIR-12.12 mAbs, sledeće studije su urađene: Fc-receptor "knock-out" ili model blokiranja: ADCC je posredovan vezivanjem efektornih ćelija kao NK, makrofaga, i monocita za Fc deo antitela preko Fc receptora. Miševi deficijentni u aktivaciji Fc receptora kao i antitela koja su napravljena da poremete vezivanje Fc z ate receptore blokiraće inhibiciju rasta tumora posredovanu ADCC-om. Gubitak ili značajna redukcija od strane ova dva kandidatna monoklonalna antitela je uglavnom posredovana ADCC mehanizmom.
Primer 25: tečna farmaceutska formulacija za antagonist anti- CD40 * antitela
[0265] Cilj ove studije bio je ispitivanje efekat pH rastvora na stabilnost antagonist anti-CD40 antitela CHIR-12.12 pomoću obe metode i biofizičke i biohemijske, da bi se odabralo optimalno okruženje ratsvora za ovo antitelo. Rezultati "differential Scanning Calorimetrv (DSC)" pokazali su da je konformaciona stabilnost CHIR-12.12 u formulaciji koja ima pH 5.5-6.5. Na osnovu kombinacije SDS-PAGE, "Size-Exclusion" HPLC (SEC-HPLC) , i "Cation-Exchange" HPLC (CEX-_HPLC) analiza, fizičko-hemijska stabilnost CHIR-12.12 je optimalna na oko pH 5.0-5.5. U svetlu ovih rezultata, jedna preporučena tečna farmaceutska formulacija sadrži ovo antitelo u formulaciji koja sadrži CHIR-12.12 pri oko 20 mg/ml fonnulisani u oko 10 mM natrijum sukcinatu, oko 150 mM natrijum hloridu, ii ma pH od oko 5.5.
Materijali i metode
[0266J CHIR-12.12 antitelo korišćeno u studijama formulacije je humano monoklonalno antitelo proizvedeno od strane CHO kulture ćelija. MAb ima molekulsku masu od 150 kDa i sastoji se od dva laka lanca i dva teška lanca koji su povezani međusobno preko disulfidnih veza. On je usmeren protiv CD40 površinskog receptora na CD40-ekspirmirajućim ćelijama, uključujući normalne i maligne B ćelije, za tertman različitih kanccra i autoimunih/inflaminatornih oboljenja.
[0267] Anti-CD40 lekovita supstanca koriščena u ovoj studiji bila je CHO-izveden prečišćen anti-CD40 (CHIR-12.12) "bulk lot". Kompozicija lekovite substance je bila 9.7 mg/ml CHIR-12.12 antitelo u 10 mM natrijum citratu, 150 mM natrijum hlorid, na pH 6.5. Kontrolni uzorak u studiji je bio primljena lekovita substancam nakon čega je zamrznuta na < - 60°C, otopljen na RT i testiran sa uzorcima za stabilnost u unapred odreženim vremensim tačkam. Uzorci za stabilnost pripremljeni su dijalizom lekovite substance nasuprot različitij pH rastvora i koncentracija CHIR-12.12 u svakom uzorku određena je na UV 280 kao što je prikazano na tabeli 20.
[0268] Fizičkohemijska stabilnost CHIR-12.12 antitela u različitim formulacijama procenjena je u esejima uz korišćenje standardnih protokola.
Kalorimetrija diferencijalnog bojenja ( Dijferential Scanning Calorimetr<y>) ( DSC)
[0269] Konformaciona stabilnost različitih uzoraka formulacija praćena je pomoću MicroCal VP-DSC nakon zagrevanja 15°C to 90°C na l°C/min.
SDS- PAGE
[0270] Fragmentacija i agregacija su procenjenc pomoću4-20% Tris-Glycme gela u neredukujućim i redukujućim uslovima. Protein je detektovan bojenjem sa Coomassie plavim.
" Siže Exclusion" hromatografija ( SEC- HPLC)
[0271] Proteinska fragmentacija i agregacija takođe su mereni sa Protein VVater Alliance HPLC sa Tosohaas TSKGEL 3000SWXL kolonom, 100 mM natrijum fosfatom, pH 7.0 kao mobilnom fazom pri stopi protoka od 0.7 ml/min.
" Cation Exchange" hromatografija ( CEX- HPLC)
[0272] "Charge change" povezana degradacija merena je pomoću NVaters 600s HPLC sistema sa Dionex Propac WCX-10 kolonu, 50 mM HEPEs, pH 7.3 kao mobilnom fazom A i 50 mM HEPES koji sadrži 500 mM NaCl, pH 7.3 kao mobilna faza B pri stopi protoka od 0.5°C/min.
Rezultati i diskusija
Studija konformacione stabilnosti
[0273] Termičko odvijanje (unfolding) CHIR-12.12 otkriolo je bar dve termane tranzicije, koje verovatno predstavljaju odvijanje topljenjem Fab i the Fc domena. Pri višim temperaturama, protein je pretpostavljeno agregirao, što je rezultiralo u gubitku DSC signala. Za potrebe pregledanja formulacije, najniža termalna tranziciona temperatura je definisana kao temperatura topljenja Tm u ovoj studiji. Slika 13 prikazuje termalnu temperaturu topljenja u funkciji pH-ova foormulacije. Formulacije pri pH 5.5-6.5 obezbeđivale su anti-CD40 sa većom konformacionom stabilnošću kao što je pokazano višim termalnim temperaturama.
SDS- PAGE analiza
[0274] Uzorci CHIR-12.12 formulacije na pH 4.5-9.0 inkubirani su na 40°C tokom 2 meseca i pušteni su na SDS-PAGE i analizirani (podaci nisu prikazani). U neredukujućim uslovima vrste sa molekulskom težinom (MW) od 23 kDa i 2.7 kDa su primećeni u formulacijama iznad pH 5,5, i vreste sa MW of 51 kDa su primećeni u svim formulacijama, ali su se pojavljivali manje na pH 5.0-5.5. Vrsta sa MW od 100 kDa mogla je da se vidi na pH 7.5 i pH 9.0.
[0275] Pod redukujućim uslovima CHIR-_12.12 je bio redukovan na slobodne teške lance i lake lance sa MW od 50 kDa i 24 kDa. Vrste od 100 kDa nisu delovale da su kompletno redukovane i to se povećavalo sa povećanjem pH rastvora, ukazujući na to da se ne-disulfidna kovalentna asocijacija mogle dogositi u molekulima. Kakos u postojale druge vrste nepoznatog identiteta na SDS-PAGE poređenje stabilnosti svake formulacije je bazirano na preostaloj čistoći CHIR-12.12. Formulacije na pH 5.0-6.0 obezbeđivale su stabilnije okruženje za CHIR-12.12. Nekoliko agregata je detektovano SDS-PAGE analizom (podaci nisu prikazani).
SEC- HPLC analiza
[0276] SEC-HPLC analiza detektovala je intaktni CHIR-_12.12 kao glavnu vrstu signalnog vrha (main peak species), agregacionu vrstu kao vrstu prednjeg signalnog vrha (front peak species), vrstu veliki fragment kao "rameni" signalni vrh (shoulder peak) na poleđini vrste glavnog signalnog vrha, i vrstu malog fragmenta detektovani su vrste post-glavni signalni vrh (post-main peak species). Nakon inkubacije na 5°C i 25°C tokom 3 meseca zanemarljive količine fragmenata proteina i agregata (< 1.09c ) detektovane su u gore pomenutim formulacijama i CHIR-12.12 vrsta glavnog signalnog vrha imala je i dalje čistoću veću od 99% (podaci nisu prikazani). Međutim, fragmenti proteina su se polako pojavljivali nakon čuvanja na40°C i još više fragmenata je formirano na pH 4.5 i pH 6.5-9.0, kao što je prikazano na tabli 21. Nakon inkubacije CHIR-12.12 formulacija na 40°C tokom 3 meseca. oko 2-3% agregata je detektovano pri pH 7.5 i pH 9.0, dokje manje od 1% agregata detektovano u drugim pH formulacijama (podaci nisu prikazani). Reukati SEC-HPLC ukazuju na to daje CHIR-12.12 stabilniji na pH oko 5.0-6.0.
[0277] CEX-HPLC analiza je detektovala intaktna CHIR-12.12 kao glavnu vrstu signalnog vrha (main peak species), kisele varijante eluirane pre glavne vrste signalnog vrha, i varijante dodatog C-terminalnog lizina eluorano nakon glavne vrste signalnog vrha. Tabela 22 prikazuje zavisnost procenta ostatka vrste glavnog signala CHIR-12.12 i kiselih varijanti od pH rastvora. Kontrolni uzorak već jc sadržao visok stepen kiselih vrsta (-33%), verovatno usleđ fermentacije u ranoj fazi u procesa prečišćavanja. Osteljivost CHIR-12.12 na više pH rastvora je dokaz dve činjenice. Prvo, inicijalni uzork formulacije na pH 9.0 ft=0) je već generisao 12% više kiselih vrsta nego kontrola. Drugo, procenat kisleih vrsta povećao se intenzivno sa povećanjem pH. Degradacija povezana sa promenom šarže je verovatno uzrokovana deamidacijom. Gore navedeni podaci ukazuju na to daje ovaj tip degradacije CHIR-12.12 minimalizovan na pH oko 5.0-5.5.
Zaključci
[0278] pH ima značajan efekat na konformacionu i fizičko-hemijsku stabilnost CHIR-12.12. Degradacija povezana sa promenom šarže je determinisana kao glavni put degradacije za CHIR-12.12. koji je minimalizovan na pH 5.0-5.5. Na osnovu svih podataka o stabilnosti, jedna preporučena tečna formulacija koja sadrži ovo antitelo je formulacija koja obuhvata CHIR-12.12 pri otprilike 20 mg/ml formulisana u oko 10 mM natrijum sukcinatu, oko 150 mM natrijum hloridu, i koja ima pH od oko pH 5.5.
Primer 26: kliničke studiie sa CHIR- 5. 9 i CHIR- 12. 12
Klinički ciljevi
[0279] Sveukupni cilj je da se obezbedi efektivna terapija za tumore B ćelija putem ciljanja tumora za anti- CD40 IgGl. Ovi tumori uključuju limfome B-ćelija, hroničan limfocitičan limfom (CLL), akutnu limfoblastičnu leukemiju (ALL) mulltipnu mijelomu (MM), Waldenstrom-ovu makroglobulinemiju, i sistemsku Castleman-ovu bolest. Signal za ove bolesti je determinisan u fazi II aiko neka merenja aktivnosti mogu da se dobiju i u fazi I. Inicijalno, agens je proučavan kao pojedinačan agens, ali biće kombinovan sa drugim agensim. hemoterapeuticima, i drugim antiutelima. kako razvoj napreduje.
Faza I
[0280] • Procena sigurnosti i farmakokinetike - povećavanje doze u subjektima sa malignostima B ćelija
• Odabir doze na osnovu sigurnosti, tolerancije, i promene serumskih markera CD40. Uopšteno, MTD je potražen al ii druge indikacije efikasnosti (raspad CD40+ B ćelija, itd) mogu biti adekvatne za pronalaženje doze. • Uzimanje u obzir više od jedne doze posebno za različite indikacije, na primer, CLL doza može biti drugačija nego NHL. Zato, neke doze mogu biti neophodne u fazi II. • Pacijenti se doziraju na nedeljnoj bazi sa farmakokinetičkog (Pk) uzorkovanja u realno vremenu. Inicijalno, 4-nedeljni ciklus je maksimalno dozvoljeno doziranje. Pk može veoma varirati u zavisnosti od bolesti koja se proučava, gustine CD40 , itd. •Ovo ispitivanje(a) je dostupno za subjekte sa limfomom B ćelija, CLL i potencijalno drugim malignitetima B ćelija. • Odluka da se prekine ili nastavi studija bazira se na sigurnosti, dozi, i preliminarnim dokazima anti-tumorske aktivnosti.
• Aktivnost leka kao što je determinisan stopom odgovora determinisano je u Fazi II.
• Identifikovanje doze(a) za fazu II.
Faza II
[0281] Nekoliko ispitivanja biće inicirano u gore pomenutim tipovima tumora sa koncentracijom na lomfom B ćelija, CLL i mltipnu mijelomu (MM). Odvojena ispitivanja mogu biti potrebna za NHL niskog stepena i srednjeg/visokog stepena kao CD40 mogu imati drugu funkciju u zavisnosti od stepena limfoma. Kod bolesti niskog stepena, CD4o deluje više kao factor preživljavanja, sprečavajući apoptozu. Kod bolesti višeg stepena prekid CD40 signalizacije može doesti do ćelisjke smrti. Više od jedne doze, i više od jednog rasporeda može biti testirano u slučajnoj postavci II faze.
[0282] U svakoj bolesti populacija koja ne ispuni sadašnji standard zaštite:
• CLL: pacijenata koji su rezistentni na Campath® i hemoterapiju.
• NHL niskog stepeba: Rituxan® ili neuspeli CHOP-R
• NHL srednjeg stepena: neuspeli CHOP-R
• Multipna Mijeloma: neuspele hemoterapije
V Odluka da se prekine ili nastavi bazira se na dokazu o teraputskom konceptu u Fazi
II
V Odluka da li surogatni marker može biti upotrebljen kao rana indikacija kliničke efikasnosti
V Identifikovati doze za Fazu III
Faza III
[0283] Faza II zavisiće od toga da li je signal detektovan u fazi II i koje terapije kompeticije se smatraju da budu standardne. Ako je signal u fazi bolesti gde nema standardne terapije, onda pojedinačno oružije, dobro kontrolisana studija može da posluži kao ispitivanje od najvećeg značaja. Ako postoje kompetirajući agensi koji se smatraju standardnim, onda se sprovode "headto-head" studije.

Claims (34)

1. Humano monoklonalno antitelo koje je sposobno da se specifično veže za humani CD40 antigen koji je eksprimiran na površini humanih CD-eksprimirajućih ćelija, pomenuto monoklonalno antitelo je bez značajne agonistočke aktivnosti, pri čemu, pomenuto monoklonalno antitelo se vezuje za CD40 antigen koji je ekprimiran na površini pomenute ćelije, rast ili diferencijacija pomenute ćelije je inhibirana, gde je pomenuto antitelo odabrano iz grupe koja se sastoji od: a) monoklonalnog antitela koje se vezuje za epitop koji je sposoban da veže monoklonalno antitelo CHIR-5.9 dobijeno iz hibridoma ćelijske linije deponovane u okviru ATCC kao Patent Deposit No. PTA-5542 ili monoklonalno antitelo CHIR-12.12 dobijeno iz hibridoma ćelijske linije deponovane u okviru ATCC kao Patent Deposit No. PTA-5543; b) monoklonalnog antitela koje se vezuje za epitop koji obuhvata ostatke 82-87 iz humane CD40 sekvence prikazane u SEQ ID NO: 10 ili SEQ ID NO: 12; c) monoklonalnog antitela koje se vezuje za epitop koji obuhvata ostatke 82-89 iz humane CD40 sekvence prikazane u SEQ ID NO.T0 ili SEQ ID NO: 12; i d) monoklonalnog antitela koje kompetira sa monoklonalnim antitelom CHIR-5.9 dobijenog iz hibridoma ćelijske linije deponovane u okviru ATCC kao Patent Deposit No. PTA-5543 ili monoklonalnog antitela CHIR-12.12 dobijenog iz hibridoma ćelijske linije deponovane u okviru ATCC kao Patent Deposit No. PTA-5543 u eseju kompetitivnog vezivanja.
2. Monoklonalno antitelo prema patentnom zahtevu 1, gde je pomenuto antitelo odabrano iz grupe koja se sastoji od monoklonalnog antitela CHIR-5.9 dobijenog iz hibridoma ćelijske linije deponovane u okviru ATCC kao Patent Deposit No. PTA-5542 i monoklonalnog antitela CHIR-12.12 dobijenog iz hibridoma ćelijske linije deponovane u okviru ATCC kao Patent Deposit No. PTA-5543.
3. Monoklonalno antitelo prema patentnom zahtevu 1, gde je pomenuto antitelo odabrano iz grupe koja se sastoji od: (i) monoklonalnog antitela koje sadrži laki lanac varijabilnog domena koji obuhvata ostatke 44-54, 70-76 i 109-117 od SEQ ID NO:2; (ii) monoklonalnog antitela koje sadrži teški lanac varijabilnog domena koji obuhvata ostatke 50-54, 69-84 i 114-121 od SEQ ID NO:4; (iii) monoklonalnog antitela koje sadrži teški lanac varijabilnog domena koji obuhvata ostatke 50-54, 69-84 i 114-121 od SEQ ID NO:5; (iv) monoklonalnog antitela koje sadrži laki lanac varijabilnog domena koji obuhvata ostatke 44-54, 70-76 i 109-117od SEQ ID NO:6; (v) monoklonalnog antitela koje sadrži teški lanac varijabilnog domena koji obuhvata ostatke 50-54, 69-84 i 114-121 od SEQ ID NO:7; i (vi) monoklonalnog antitela koje sadrži teški lanac varijabilnog domena koji obuhvata ostatke 50-54, 69-84 i 114-121 od SEQ ID NO:8; ili je monokloonalno antitelo odabrano iz grupe koja se sastoji od: (i) monoklonalnog antitela koje sadrži laki lanac varijabilnog domena koji obuhvata ostatke 46-52, 70-72 i 111-116 od SEQ ID NO:2; (ii) monoklonalnog antitela koje sadrži teški lanac varijabilnog domena koji obuhvata ostatke 45-51, 72-74 i 115-120 od SEQ ID NO:4; (iii) monoklonalnog antitela koje sadrži teški lanac varijabilnog domena koji obuhvata ostatke 45-51, 72-74 i 115-120 od SEQ ID NO:5; (iv) monoklonalnog antitela koje sadrži laki lanac varijabilnog domena koji obuhvata ostatke 46-52,70-72 i 111-116 od SEQ ID NO:6; (v) monoklonalnog antitela koje sadrži teški lanac varijabilnog domena koji obuhvata ostatke 45-51, 72-74 i 115-120 od SEQ ID NO:7; i (vi) monoklonalnog antitela koje sadrži teški lanac varijabilnog domena koji obuhvata ostatke 45-51, 72-74 i 115-120 od SEQ ID NO:8;
4. Monoklonalno antitelo prema patentnom zahtevu 1, gde je pomenuto antitelo koje obuhvata amino kiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od: (i) ostataka 21-132 od SEQ ID NO:2; (ii) ostataka 21-239 of SEQ ID NO:2; (iii) SEQ ID NO:2; (iv) ostataka 20-139 od SEQ ID NO:4; (v) ostataka 20-469 od SEQ ID NO:4; (vi) SEQ ID NO:4; (vii) ostataka 20-469 od SEQ ID NO:5: (viii) SEQ ID NO:5; (ix) ostataka 21-132 od SEQ ID NO:2 i ostataka 20-139 of SEQ ID NO:4; (x) ostataka 21-239 od SEQ ID NO:2 i ostataka 20-469 of SEQ ID NO:4; (xi) ostataka 21-239 od SEQ ID NO:2 i ostataka 20-469 of SEQ ID NO:5; (xii) SEQ ID NO:2 i SEQ ID NO:4; i (xih) SEQ ID NO:2 i SEQ ID NO:5.
5. Monoklonalno antitelo prema patentnom zahtevu 1, gde je pomenuto antitelo koje obuhvata amino kiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od: (i) ostataka 21-132 of SEQ ID NO:6; (ii) ostataka 21-239 of SEQ ID NO:6; (iii) SEQ ID NO:6; (iv) ostataka 20-144 of SEQ ID NO:7; (v) ostataka 20-474 of SEQ ID NO:7; (vi) SEQ ID NO:7; (vii) ostataka 20-474 of SEQ ID NO:8; (viii) SEQ ID NO:8; (ix) ostataka 21-132 od SEQ ID NO:6 i ostataka 20-144 of SEQ ID NO:7; (x) ostataka 21-239 od SEQ ID NO:6 i ostataka 20-474 of SEQ ID NO:7; (xi) ostataka 21-239 od SEQ ID NO:6 i ostataka 20-474 of SEQ ID NO:8 (xii) SEQ ID NO:6 i SEQ ID NO:7; i (xiii) SEQ ID NO:6 i SEQ ID NO:8.
6. Monoklonalno antitelo prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, što se pomenuto monoklonalno antitelo vezuje za pomenuti humani CD40 antigen sa afinitetom (Kd) od najmanje IO"<6>M.
7. Monoklonalno antitelo prema patentnom zahtevu 6, sto se pomenuto monoklonalno antitelo vezuje za pomenuti humani CD40 antigen sa afinitetom (Kd) od najmanje IO<*8>M.
8. Monoklonalno antitelo prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, što je pomenuto monoklonalno antitelo antigen-vezujući fragment monoklonalnog antitela, što pomenuti fragment zadržava sposobnost specifičnog vezivanja za pomenuti humani CD40 antigen.
9. Antigen-vezujući fragment prema patentnom zahtevu 8, što je pomenuti fragment odabran iz grupe koja se sastoji od Fab fragmenta, F(ab')2fragmenta, Fv fragmenta, i jednolančanog Fv fragmenta.
10. Monoklonalno antitelo prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, što je pomenuto monoklonalno antitelo proizvedeno u CHO ćelijskoj liniji.
11. Izolovani molekul nukleinske kiseline koji obuhvata polinukleotid koji kodira monoklonalno antitelo iz bilo kojeg od prethodnih patentnih zahteva.
12. Ćelijska linija hibridoma koja je sposobna da proizvodi monoklonalno antitelo iz bilo kojeg patentnih zahteva 1-7.
13. Upotreba efektivne količine anti-CD40 monoklonalnog antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1-10 u proizvodnji medikamenta za inhibiciju rasta ili diferencijacije normalnih humanih B ćelija.
14. In vitro metod za inhibiciju rasta ili diferencijacije normalnih humanih B ćelija, koji obuhvata kontakt pomenute B ćelije sa efektivnom količinom anti-CD40 monoklonalnog antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1-10.
15. Upotreba efektivne količine anti-CD40 monoklonalnog antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1-10 u proizvodnji medikamenta za inhibiciju proliferacije normalnih humanih B ćelija, što je pomenuta proliferacija potpomognuta interakcijom CD40 liganda sa CD40 antigenom eksprimiranim na površini pomenute B ćelije.
16. In vitro metod za inhibiciju proliferacije normalnih humanih B ćelija, što je pomenuta proliferacija potpomognuta interakcijom CD40 liganda sa CD40 antigenom eksprimiranim na površini pomenute B ćelije, pomenut metod obuhvata kontakt pomenute B ćelije sa efektivnom količinom anti-CD40 monoklonalnog antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1-10.
17. Upotreba efektivne količine anti-CD40 monoklonalnog antitela ili njegovog fragmenta prema bilo kom od patentnih zahteva 1-10 u proizvodnji medikamenta za inhibiciju proizvodnje antitela od strane B ćelija u ljudskom pacijentu.
18. Upotreba efektivne količine anti-CD40 monoklonalnog antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1-10 u proizvodnji medikamenta za inhibiciju rasta ćelija kancera B ćelijske linije.
19. In vitro metod za inhibiciju rasta ćelija kancera B ćelijske linije, obuhvatajući kontakt pomenutih ćelija raka sa efektivnom količinom anti-CD40 monoklonalnog antitela prema bilo kom patentnom zahtevu 1-10.
20. Upotreba efektivne količine anti-CD40 monoklonalnog antitela prema bilo kom patentnom zahtevu 1-10 u proizvodnji medikamenta za treman raka koga karakteriše ekspresija CD40.
21. Upotreba efektivne količine anti-CD40 monoklonalnog antitela prema bilo kom patentnom zahtevu 1-10 u proizvodnji medikamenta za inhibiciju CD40 signalnog puta koji je posredovan CD40-ligandom u humanim CD40-eksprimirajućim ćelijama.
22. In vitro metod za inhibiciju CD40 signalnog puta koji je posredovan CD40-ligandom u humanim CD40-eksprimirajućim ćelijama, pomenuti metod obuhvata kontakt pomenutih ćelija sa efektivnom količinom anti-CD40 monoklonalnog antitela prema bilo kom patentnom zahtevu 1-10.
23. Upotreba prema patentnom zahtevu 21 ili metod prema patentnom zahtevu 22. što je pomenuta humana CD40-eksprimirajuća ćelija normalna B ćelija ili maligna B ćelija i pomenuti CD40 signalni put je preživljavanje B ćelije.
24. In vitro metod za identifikaciju antitela koje ima antagonističku aktivnost protiv CD40-eksprimirajućih ćelija, obuhvatajući izvođenje eseja kompetitivnog vezivanja sa monoklonalnim antitelom prema bilo kom od patentnih zahteva 1-10.
25. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata anti-CD40 antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-10 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
26. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 25, gde je pomenuta kompozicija tečna farmaceutska formulacija koja obuhvata pufer u količini dovoljnoj da održi pH fromulacije u opsegu od oko pH 5.0 do oko pH 7.0.
27. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 26, što pomenuta kompozicija sadrži izotonični agens u količini dovoljnoj da održi istu kompoziciju blizu izotoničnom.
28. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 27, što je izotonični agens natrijum hlorid, pomenuti natrijum hlorid je prisutan u pomenutoj formulaciji u koncentraciji od oko 50 mM do oko 300 mM.
29. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 28, što je natrijum hlorid prisutan u pomenutoj formulaciji u koncentraciji od oko 150 mM.
30. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 26 ili 29, što je pufer odabran iz grupe koja se sastoji od sukcinatnog, citratnog i fosfatnog pufera.
31. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 30, što pomenuta formulacija sadrži pomenuti pufer u koncentraciji od oko l mM do oko 50 mM.
32. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 31, što je pomenuti pufer natrijum sukcinat ili natrijum citrat u koncentraciji od oko 5 mM do oko 15 mM.
33. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 26 do 32, što formulacija dalje obuhvata surfaktant u količini od oko 0.001% do oko 1.0%.
34. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 33, što je pomenuti surfaktant polisorbat 80, koji je prisutan u pomenutoj formulaciji u količini od oko 0.001% do oko 0.5%.
RSP-2010/0041A 2003-11-04 2004-11-04 Antagonist anti-cd40 monoklonalna antitela i metode za njihovu upotrebu RS51230B (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US51733703P 2003-11-04 2003-11-04
US52557903P 2003-11-26 2003-11-26
US56571004P 2004-04-27 2004-04-27
PCT/US2004/037152 WO2005044854A2 (en) 2003-11-04 2004-11-04 Antagonist anti-cd40 monoclonal antibodies and methods for their use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS51230B true RS51230B (sr) 2010-12-31

Family

ID=34577667

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20130482A RS53073B (sr) 2003-11-04 2004-11-04 Upotreba antagonističkih anti-cd40 monoklonska antitela
RSP-2010/0041A RS51230B (sr) 2003-11-04 2004-11-04 Antagonist anti-cd40 monoklonalna antitela i metode za njihovu upotrebu

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20130482A RS53073B (sr) 2003-11-04 2004-11-04 Upotreba antagonističkih anti-cd40 monoklonska antitela

Country Status (22)

Country Link
EP (6) EP1682178B8 (sr)
JP (6) JP4746552B2 (sr)
KR (2) KR101403910B1 (sr)
CN (2) CN1905897B (sr)
AT (3) ATE473016T1 (sr)
AU (3) AU2004287482B2 (sr)
CA (3) CA2544853C (sr)
CY (3) CY1110231T1 (sr)
DE (3) DE602004028037D1 (sr)
DK (4) DK1682180T3 (sr)
EC (2) ECSP066607A (sr)
ES (3) ES2333971T3 (sr)
HR (2) HRP20100066T1 (sr)
IL (1) IL175225A (sr)
MA (1) MA28331A1 (sr)
PL (4) PL1682180T3 (sr)
PT (4) PT1682178E (sr)
RS (2) RS53073B (sr)
SG (1) SG148143A1 (sr)
SI (3) SI1694360T1 (sr)
WO (3) WO2005044294A2 (sr)
ZA (1) ZA200604419B (sr)

Families Citing this family (83)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7658924B2 (en) 2001-10-11 2010-02-09 Amgen Inc. Angiopoietin-2 specific binding agents
DE10303974A1 (de) 2003-01-31 2004-08-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
US8277810B2 (en) 2003-11-04 2012-10-02 Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc. Antagonist anti-CD40 antibodies
KR101403910B1 (ko) * 2003-11-04 2014-06-09 노바티스 백신즈 앤드 다이아그노스틱스 인코포레이티드 길항제 항-ｃｄ４０ 단클론성 항체 및 그것의 사용 방법
ATE516819T1 (de) * 2003-11-04 2011-08-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Verfahren zur behandlung von b-zell-bedingtem krebs
WO2005108428A2 (en) * 2004-02-26 2005-11-17 Compugen Ltd. Cd40 splice variants and their uses
EP1894012A2 (en) * 2005-05-18 2008-03-05 Novartis AG Methods for diagnosis and treatment of proliferative disorders mediated by cd40 signaling
WO2006125117A2 (en) * 2005-05-18 2006-11-23 Novartis Ag Methods for diagnosis and treatment of diseases having an autoimmune and/or inflammatory component
WO2006138181A2 (en) 2005-06-14 2006-12-28 Amgen Inc. Self-buffering protein formulations
WO2007053661A2 (en) * 2005-11-01 2007-05-10 Novartis Ag Uses of anti-cd40 antibodies
ES2400660T3 (es) * 2005-11-01 2013-04-11 Novartis Ag Usos de anticuerpos anti-CD40
CN101506236B (zh) 2005-11-30 2012-12-12 雅培制药有限公司 抗淀粉样β蛋白的单克隆抗体及其用途
RU2442793C2 (ru) 2005-11-30 2012-02-20 Эбботт Лэборетриз АНТИТЕЛА ПРОТИВ ГЛОБУЛОМЕРА Аβ, ИХ АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЕ ЧАСТИ, СООТВЕТСТВУЮЩИЕ ГИБРИДОМЫ, НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ, ВЕКТОРЫ, КЛЕТКИ-ХОЗЯЕВА, СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ УКАЗАННЫХ АНТИТЕЛ, КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ УКАЗАННЫЕ АНТИТЕЛА, ПРИМЕНЕНИЯ УКАЗАННЫХ АНТИТЕЛ И СПОСОБЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ УКАЗАННЫХ АНТИТЕЛ
US9005974B2 (en) 2005-12-09 2015-04-14 Academish Medisch Centrum Bij De Universiteit Van Amsterdam Means and methods for influencing the stability of cells
NZ592159A (en) 2005-12-09 2012-12-21 Amc Amsterdam Means and methods for influencing the stability of antibody producing cells
AR059066A1 (es) 2006-01-27 2008-03-12 Amgen Inc Combinaciones del inhibidor de la angiopoyetina -2 (ang2) y el inhibidor del factor de crecimiento endotelial vascular (vegf)
CN101426817B (zh) 2006-04-21 2013-07-10 诺华有限公司 拮抗性抗-cd40抗体药物组合物
US8455626B2 (en) 2006-11-30 2013-06-04 Abbott Laboratories Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies
JP5577098B2 (ja) * 2006-12-21 2014-08-20 アムジエン・インコーポレーテツド ポリペプチドを含有する安定な緩衝化された製剤
EP2124952A2 (en) 2007-02-27 2009-12-02 Abbott GmbH & Co. KG Method for the treatment of amyloidoses
US7951368B2 (en) 2007-06-25 2011-05-31 Amgen Inc. Compositions of specific binding agents to hepatocyte growth factor
BRPI0820707A2 (pt) * 2007-11-07 2015-06-16 Genentech Inc Métodos e composição para avaliar a responsividade do linfoma de células b para o tratamento com anticorpos anti-cd40
US20110002934A1 (en) * 2007-11-09 2011-01-06 Novartis Ag Uses of anti-cd40 antibodies
JO2913B1 (en) 2008-02-20 2015-09-15 امجين إنك, Antibodies directed towards angiopoietin-1 and angiopoietin-2 proteins and their uses
KR101787768B1 (ko) 2009-04-18 2017-10-18 제넨테크, 인크. 항-ｃｄ４０ 항체를 사용한 치료에 대한 ｂ-세포 림프종의 반응성 평가를 위한 방법
AU2010271583B2 (en) 2009-07-15 2015-02-12 Kling Biotherapeutics B.V. Means and methods for producing high affinity antibodies
US8987419B2 (en) 2010-04-15 2015-03-24 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Amyloid-beta binding proteins
CN103298833B (zh) 2010-08-14 2015-12-16 Abbvie公司 β淀粉样蛋白结合蛋白
EP2635601B1 (en) 2010-11-04 2016-07-20 Boehringer Ingelheim International GmbH Anti-il-23 antibodies
AU2016201742B2 (en) * 2010-11-15 2017-11-02 Novartis Ag Silent Fc variants of anti-CD40 antibodies
AR083847A1 (es) * 2010-11-15 2013-03-27 Novartis Ag Variantes de fc (fragmento constante) silenciosas de los anticuerpos anti-cd40
WO2012075111A1 (en) 2010-11-30 2012-06-07 Novartis Ag Uses of anti-cd40 antibodies in combination therapy for b cell-related cancers
EP2646466B1 (en) 2010-12-02 2017-03-29 AIMM Therapeutics B.V. Means and methods for producing high affinity antibodies
JP5458188B2 (ja) * 2011-02-17 2014-04-02 協和発酵キリン株式会社 抗ｃｄ４０抗体の高濃度製剤
ES2653639T3 (es) * 2011-02-28 2018-02-08 Napajen Pharma, Inc. Complejo ácido nucleico-polisacárido
PL2683406T3 (pl) 2011-03-11 2019-11-29 Beth Israel Deaconess Medical Ct Inc Przeciwciała anty-cd40 i ich zastosowania
PL2699601T3 (pl) * 2011-04-21 2018-05-30 Bristol-Myers Squibb Company Polipeptydy przeciwciała, które antagonizują CD40
SG10201604104PA (en) 2011-10-25 2016-07-28 Prothena Therapeutics Ltd Antibody formulations and methods
KR102057742B1 (ko) 2011-11-17 2019-12-19 군드람 정 의학적 용도를 위한 이중특이성 항체
WO2013165791A1 (en) * 2012-05-03 2013-11-07 Boehringer Ingelheim International Gmbh Anti-il-23p19 antibodies
US20140004131A1 (en) 2012-05-04 2014-01-02 Novartis Ag Antibody formulation
KR102270618B1 (ko) * 2012-10-30 2021-06-30 아펙시젠, 인코포레이티드 항-cd40 항체 및 사용 방법
JP6475631B2 (ja) 2012-11-19 2019-02-27 バリオファルム・アクチェンゲゼルシャフト Ｃｄ２０およびｃｄ９５に結合する組換え二重特異性抗体
CN105636984A (zh) * 2013-06-13 2016-06-01 法斯特弗沃德制药有限公司 用于治疗慢性炎症和预防胃肠道癌或纤维化的cd40信号转导抑制剂和其他化合物，该其他化合物是胆汁酸、胆汁酸衍生物、tgr5受体激动剂、fxr激动剂或其组合
CA2938193C (en) 2014-01-31 2023-05-02 Aimm Therapeutics B.V. Means and methods for producing stable antibodies
EP3113796A1 (en) 2014-03-07 2017-01-11 Bristol-Myers Squibb Company Method of using antibody polypeptides that antagonize cd40 to treat ibd
US10618963B2 (en) 2014-03-12 2020-04-14 Yeda Research And Development Co. Ltd Reducing systemic regulatory T cell levels or activity for treatment of disease and injury of the CNS
CN114081946A (zh) 2014-03-12 2022-02-25 耶达研究与开发有限公司 降低系统性调节性t细胞水平或活性来治疗cns疾病和损伤
CN108025068A (zh) * 2014-03-12 2018-05-11 耶达研究与开发有限公司 降低系统性调节性t细胞水平或活性来治疗cns的疾病和损伤
US10519237B2 (en) 2014-03-12 2019-12-31 Yeda Research And Development Co. Ltd Reducing systemic regulatory T cell levels or activity for treatment of disease and injury of the CNS
CN106132429A (zh) * 2014-03-19 2016-11-16 百时美施贵宝公司 使用针对cd40l的域抗体治疗移植物排斥的方法
EP3172339A1 (en) 2014-07-24 2017-05-31 Boehringer Ingelheim International GmbH Biomarkers useful in the treatment of il-23a related diseases
EP3191131A4 (en) 2014-08-21 2018-09-05 The General Hospital Corporation Tumor necrosis factor superfamily and tnf-like ligand muteins and methods of preparing and using the same
US10059763B2 (en) 2014-09-03 2018-08-28 Boehringer Ingelheim International Gmbh Compound targeting IL-23A and TNF-alpha and uses thereof
US9888673B2 (en) 2014-12-10 2018-02-13 Regents Of The University Of Minnesota Genetically modified cells, tissues, and organs for treating disease
IL307578A (en) 2015-02-04 2023-12-01 Boehringer Ingelheim Int Methods of treating inflammatory diseases
HUE048284T2 (hu) 2015-05-29 2020-07-28 Abbvie Inc Anti-CD40 antitestek és alkalmazásuk
WO2017027861A1 (en) 2015-08-13 2017-02-16 Amgen Inc. Charged depth filtration of antigen-binding proteins
BR112018004296B1 (pt) 2015-09-04 2020-05-05 Primatope Therapeutics Inc anticorpos anti-cd40 humanizados e usos dos mesmos
CN108368510B (zh) 2015-09-30 2023-09-01 詹森生物科技公司 特异性结合人cd40的激动性抗体和使用方法
CN109071665B (zh) 2016-04-18 2022-11-01 塞德斯医疗公司 结合人cd40的激动性抗体及其用途
JP7461741B2 (ja) 2016-06-20 2024-04-04 カイマブ・リミテッド 抗ｐｄ－ｌ１およびｉｌ－２サイトカイン
BR112019000512A2 (pt) 2016-07-14 2019-04-24 Genmab A/S anticorpo, ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira, composição, métodos de tratamento de uma doença, para produzir um anticorpo biespecífico e para detectar se a reticulação entre as células que expressam cd40 e cd137 ocorre em uma amostra, uso de um anticorpo multiespecífico, e, kit
EP3632933A4 (en) * 2017-06-01 2021-03-03 Seoul National University R & DB Foundation Novel anti-cd40 antibodies and use thereof
CN110267989B (zh) * 2017-06-01 2023-04-04 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗cd40抗体、其抗原结合片段及其医药用途
HRP20240485T1 (hr) 2017-08-24 2024-07-05 Novo Nordisk A/S Pripravci glp-1 i njihova upotreba
SG11202006770PA (en) * 2018-01-29 2020-08-28 Univ California Therapies and methods to treat tlr2-mediated diseases and disorders
EP3752532A1 (en) * 2018-02-12 2020-12-23 Diabetes-Free, Inc. Improved antagonistic anti-human cd40 monoclonal antibodies
CN112638375A (zh) 2018-06-15 2021-04-09 旗舰创业创新五公司 通过后细胞信号传导因子的调节来增加免疫活性
WO2020102454A1 (en) 2018-11-13 2020-05-22 Regents Of The University Of Minnesota Cd40 targeted peptides and uses thereof
AR117091A1 (es) * 2018-11-19 2021-07-07 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos monoclonales antagonistas contra cd40 y sus usos
EP3962493A2 (en) 2019-05-03 2022-03-09 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Methods of modulating immune activity/level of irf or sting or of treating cancer, comprising the administration of a sting modulator and/or purinergic receptor modulator or postcellular signaling factor
WO2021127217A1 (en) 2019-12-17 2021-06-24 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Combination anti-cancer therapies with inducers of iron-dependent cellular disassembly
MX2022009844A (es) 2020-02-18 2022-09-05 Novo Nordisk As Composiciones y usos del peptido similar al glucagon-1 (glp-1).
EP4172323A1 (en) 2020-06-29 2023-05-03 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Viruses engineered to promote thanotransmission and their use in treating cancer
CN111763259B (zh) * 2020-09-03 2020-12-15 北京百奥赛图基因生物技术有限公司 抗cd40抗体及其用途
HRP20250696T1 (hr) 2021-01-28 2025-08-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Sastavi i postupci za liječenje sindroma oslobađanja citokina
US20240343817A1 (en) * 2021-07-14 2024-10-17 Staidson (Beijing) Biopharmaceuticals Co., Ltd. Antibody that specifically recognizes cd40 and application thereof
US12234294B2 (en) 2021-11-05 2025-02-25 Kiniksa Pharmaceuticals, Gmbh Pharmaceutical composition of a humanized anti-CD40 antibody
CN117229396A (zh) * 2022-06-06 2023-12-15 普米斯生物技术(珠海)有限公司 抗cd40抗体及其用途
US20240269251A1 (en) 2023-01-09 2024-08-15 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Genetic switches and their use in treating cancer
WO2025184567A1 (en) 2024-03-01 2025-09-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for re-dosing aav using anti-cd40 antagonistic antibody to suppress host anti-aav antibody response
US20250277048A1 (en) 2024-03-01 2025-09-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. The use of cd40 inhibitors for inhibiting an immune response and enabling immunogen administration and re-administration

Family Cites Families (99)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR901228A (fr) 1943-01-16 1945-07-20 Deutsche Edelstahlwerke Ag Système d'aimant à entrefer annulaire
NL154600B (nl) 1971-02-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen.
US3817837A (en) 1971-05-14 1974-06-18 Syva Corp Enzyme amplification assay
US3766162A (en) 1971-08-24 1973-10-16 Hoffmann La Roche Barbituric acid antigens and antibodies specific therefor
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4233402A (en) 1978-04-05 1980-11-11 Syva Company Reagents and method employing channeling
NZ201918A (en) 1981-09-18 1987-04-30 Genentech Inc N-terminal methionyl analogues of bovine growth hormone
JPS5896026A (ja) 1981-10-30 1983-06-07 Nippon Chemiphar Co Ltd 新規ウロキナ−ゼ誘導体およびその製造法ならびにそれを含有する血栓溶解剤
CA1341562C (en) 1982-03-31 2007-11-27 Tadatsugu Taniguchi Gene coded for interleukin-2 polypeptide, recombinant dna carrying the said gene, a living cell line possessing the recombinant dna, and method for producing interleukin-2 using the said cell
EP0091539B2 (en) 1982-03-31 1996-11-27 Ajinomoto Co., Inc. Gene coding for interleukin-2 polypeptide, recombinant DNA carrying said gene, cell lines possessing the recombinant DNA,and method for producing interleukin-2 using said cells
BE893016R (fr) 1982-04-29 1982-08-16 Amatucci Aldo Turbine a vent
US4609546A (en) 1982-06-24 1986-09-02 Japan Chemical Research Co., Ltd. Long-acting composition
US4992271A (en) 1982-09-23 1991-02-12 Cetus Corporation Formulation for lipophilic IL-2 proteins
FI82266C (fi) 1982-10-19 1991-02-11 Cetus Corp Foerfarande foer framstaellning av il-2 -mutein.
US5700913A (en) 1982-12-15 1997-12-23 Ajinomoto Co., Inc. Unglycosylated human interleukin-2 polypeptides
US4708871A (en) 1983-03-08 1987-11-24 Commonwealth Serum Laboratories Commission Antigenically active amino acid sequences
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4518584A (en) 1983-04-15 1985-05-21 Cetus Corporation Human recombinant interleukin-2 muteins
WO1985000817A1 (en) 1983-08-10 1985-02-28 Amgen Microbial expression of interleukin ii
US4530787A (en) 1984-03-28 1985-07-23 Cetus Corporation Controlled oxidation of microbially produced cysteine-containing proteins
US4604377A (en) 1984-03-28 1986-08-05 Cetus Corporation Pharmaceutical compositions of microbially produced interleukin-2
US4569790A (en) 1984-03-28 1986-02-11 Cetus Corporation Process for recovering microbially produced interleukin-2 and purified recombinant interleukin-2 compositions
US4656132A (en) 1984-03-28 1987-04-07 Cetus Corporation Method of improving the yield of heterologous protein produced by cultivating recombinant bacteria
US4572798A (en) 1984-12-06 1986-02-25 Cetus Corporation Method for promoting disulfide bond formation in recombinant proteins
CA1340265C (en) 1985-01-18 1998-12-15 Kirston E. Koths Oxidation resistant muteins
US4752585A (en) 1985-12-17 1988-06-21 Cetus Corporation Oxidation-resistant muteins
US5981216A (en) 1985-04-01 1999-11-09 Alusuisse Holdings A.G. Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4748234A (en) 1985-06-26 1988-05-31 Cetus Corporation Process for recovering refractile bodies containing heterologous proteins from microbial hosts
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US4816440A (en) 1985-09-26 1989-03-28 Cetus Corporation Stable formulation of biologically active proteins for parenteral injection
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4745180A (en) 1986-06-27 1988-05-17 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using heparin fragments
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4931544A (en) 1986-09-04 1990-06-05 Cetus Corporation Succinylated interleukin-2 for pharmaceutical compositions
US4831175A (en) 1986-09-05 1989-05-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Backbone polysubstituted chelates for forming a metal chelate-protein conjugate
CA1292686C (en) 1986-10-27 1991-12-03 Ze'ev Shaked Pharmaceutical compositions of recombinant interleukin-2 and formulation process
CA1294215C (en) 1986-10-27 1992-01-14 Ze'ev Shaked Pharmaceutical compositions of recombinant beta-interferon and formulation processes
US4894226A (en) 1986-11-14 1990-01-16 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polyproline conjugation
US4873192A (en) 1987-02-17 1989-10-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Process for site specific mutagenesis without phenotypic selection
US4931543A (en) 1987-05-11 1990-06-05 Cetus Corporation Process for recovering microbially produced interleukin-2
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5879936A (en) 1988-04-18 1999-03-09 Aluguisse Holding A.G. Recombinant DNA methods, vectors and host cells
US5078997A (en) 1988-07-13 1992-01-07 Cetus Corporation Pharmaceutical composition for interleukin-2 containing physiologically compatible stabilizers
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
EP0444210B1 (en) 1989-09-21 1995-05-24 Idemitsu Kosan Company Limited Arylstyrene polymer and copolymer and process for preparing the same
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
ATE139258T1 (de) 1990-01-12 1996-06-15 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5891693A (en) 1990-01-25 1999-04-06 Alusuisse Holdings A.G. Recombinant DNA methods vectors and host cells
IE66205B1 (en) 1990-06-14 1995-12-13 Paul A Bartlett Polypeptide analogs
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
GB9022543D0 (en) 1990-10-17 1990-11-28 Wellcome Found Antibody production
US5756096A (en) 1991-07-25 1998-05-26 Idec Pharmaceuticals Corporation Recombinant antibodies for human therapy
MX9204374A (es) 1991-07-25 1993-03-01 Idec Pharma Corp Anticuerpo recombinante y metodo para su produccion.
US5962406A (en) 1991-10-25 1999-10-05 Immunex Corporation Recombinant soluble CD40 ligand polypeptide and pharmaceutical composition containing the same
US5229109A (en) 1992-04-14 1993-07-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Low toxicity interleukin-2 analogues for use in immunotherapy
US5397703A (en) 1992-07-09 1995-03-14 Cetus Oncology Corporation Method for generation of antibodies to cell surface molecules
US5874082A (en) 1992-07-09 1999-02-23 Chiron Corporation Humanized anti-CD40 monoclonal antibodies and fragments capable of blocking B cell proliferation
AU5670194A (en) 1992-11-20 1994-06-22 Enzon, Inc. Linker for linked fusion polypeptides
DE614989T1 (de) 1993-02-17 1995-09-28 Morphosys Proteinoptimierung Verfahren für in vivo Selektion von Ligandenbindende Proteine.
US5595721A (en) 1993-09-16 1997-01-21 Coulter Pharmaceutical, Inc. Radioimmunotherapy of lymphoma using anti-CD20
AU680102B2 (en) 1993-12-23 1997-07-17 Immunex Corporation Method of preventing or treating disease characterized by neoplastic cells expressing CD40
WO1995023512A1 (en) 1994-03-03 1995-09-08 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Terminal complement inhibitor fusion genes and proteins
US6091001A (en) 1995-03-29 2000-07-18 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US5830698A (en) 1997-03-14 1998-11-03 Idec Pharmaceuticals Corporation Method for integrating genes at specific sites in mammalian cells via homologous recombination and vectors for accomplishing the same
ATE319745T1 (de) 1997-05-21 2006-03-15 Biovation Ltd Verfahren zur herstellung von nicht-immunogenen proteinen
JP3919235B2 (ja) 1997-06-13 2007-05-23 ジェネンテク，インコーポレイテッド 抗体製剤
SK285962B6 (sk) 1997-06-20 2007-12-06 Biogen Idec Ma Inc. Použitie činidla rušiaceho väzbu CD40:CD154 na zmiernenie závažnosti syndrómu inhibície exogénneho proteínu
US6051228A (en) * 1998-02-19 2000-04-18 Bristol-Myers Squibb Co. Antibodies against human CD40
DZ2788A1 (fr) 1998-05-15 2003-12-01 Bayer Ag Agonistes et antagonistes selectifs à IL-2.
US6168785B1 (en) 1998-07-16 2001-01-02 Institut Pasteur Biological applications of new peptides of IL-2 and derivatives and use as therapeutic agents
AU776910B2 (en) 1998-12-08 2004-09-23 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschrankter Haftung Modifying protein immunogenicity
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US20020006901A1 (en) 1999-02-05 2002-01-17 Aldo T. Iacono Use of aerosolized cyclosporine for prevention and treatment of pulmonary disease
MY133346A (en) 1999-03-01 2007-11-30 Biogen Inc Kit for radiolabeling ligands with yttrium-90
US20020102208A1 (en) 1999-03-01 2002-08-01 Paul Chinn Radiolabeling kit and binding assay
US6566500B1 (en) 1999-03-30 2003-05-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods for modifying toxic effects of proteinaceous compounds
JP2003508016A (ja) 1999-04-16 2003-03-04 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー Ｃｄ４０／ｃｄ４０ｌキメラポリペプチドをコードする核酸、それらの生成方法及びそれらの使用
US6946129B1 (en) 1999-06-08 2005-09-20 Seattle Genetics, Inc. Recombinant anti-CD40 antibody and uses thereof
IL149008A0 (en) 1999-10-04 2002-11-10 Chiron Corp Stabilized liquid polypeptide-containing pharmaceutical compositions
US6849425B1 (en) 1999-10-14 2005-02-01 Ixsys, Inc. Methods of optimizing antibody variable region binding affinity
AU1590201A (en) * 1999-11-09 2001-06-06 Chiron Corporation Compositions and methods for treating autoimmune diseases and transplant rejections
EP2275557A1 (en) 2000-04-12 2011-01-19 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US20030059427A1 (en) * 2000-04-28 2003-03-27 Force Walker R. Isolation and characterization of highly active anti-CD40 antibody
AU2001259215A1 (en) * 2000-04-28 2001-11-12 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Human anti-cd40 antibodies and methods of making and using same
DE60143535D1 (de) * 2000-10-02 2011-01-05 Novartis Vaccines & Diagnostic Humane antikörper gegen cd40
AR039067A1 (es) 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
EP1455812A4 (en) * 2001-11-26 2006-03-22 Chiron Corp TREATMENT OF ANTI-CD40 MONOCLONAL ANTIBODY FOR THE TREATMENT OF MULTIPLE SCLEROSIS
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
US20070098717A1 (en) * 2003-11-04 2007-05-03 Chiron Corporation Methods of therapy for solid tumors expressing the cd40 cell-surface antigen
US20070110754A1 (en) * 2003-11-04 2007-05-17 Chiron Corporation Use of antagonist anti-cd40 antibodies for treatment of chronic lymphocytic leukemia
ATE516819T1 (de) * 2003-11-04 2011-08-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Verfahren zur behandlung von b-zell-bedingtem krebs
PL1684805T3 (pl) * 2003-11-04 2010-12-31 Novartis Vaccines & Diagnostics Inc Sposoby leczenia szpiczaka mnogiego z zastosowaniem antagonistycznych monoklonalnych przeciwciał przeciwko CD40
KR101403910B1 (ko) * 2003-11-04 2014-06-09 노바티스 백신즈 앤드 다이아그노스틱스 인코포레이티드 길항제 항-ｃｄ４０ 단클론성 항체 및 그것의 사용 방법
JP6039343B2 (ja) 2012-10-04 2016-12-07 キヤノン株式会社 電子機器、電子機器の制御方法、プログラム、記憶媒体

Also Published As

Publication number Publication date
EP1694360A2 (en) 2006-08-30
PT1682178E (pt) 2010-10-21
AU2011201529A1 (en) 2011-04-28
JP2011105769A (ja) 2011-06-02
RS53073B (sr) 2014-04-30
DE602004028037D1 (de) 2010-08-19
EP1682178A2 (en) 2006-07-26
JP4765039B2 (ja) 2011-09-07
EP2149585A1 (en) 2010-02-03
EP2255828A1 (en) 2010-12-01
KR20060111555A (ko) 2006-10-27
HK1095091A1 (en) 2007-04-27
ATE447412T1 (de) 2009-11-15
IL175225A0 (en) 2006-09-05
DK1682180T3 (da) 2010-01-11
HK1094156A1 (en) 2007-03-23
EP1682178B1 (en) 2010-07-07
DK2149585T3 (da) 2013-10-21
JP2007510666A (ja) 2007-04-26
IL175225A (en) 2011-12-29
ES2346977T3 (es) 2010-10-22
WO2005044854A3 (en) 2005-08-11
ES2435410T3 (es) 2013-12-19
AU2004287879B2 (en) 2011-01-06
PL2149585T3 (pl) 2014-01-31
ATE473016T1 (de) 2010-07-15
PT1682180E (pt) 2010-02-10
KR101403910B1 (ko) 2014-06-09
EP1682178B8 (en) 2010-09-01
AU2011201529B2 (en) 2012-11-01
AU2004287482A1 (en) 2005-05-19
ECSP066607A (es) 2006-10-25
HRP20100066T1 (hr) 2010-03-31
CA2544949C (en) 2014-02-25
KR101125127B1 (ko) 2012-03-16
WO2005044306A2 (en) 2005-05-19
SI1682180T1 (sl) 2010-03-31
PL1694360T3 (pl) 2011-04-29
JP2007512243A (ja) 2007-05-17
AU2004287482B2 (en) 2011-04-14
CY1110231T1 (el) 2015-01-14
WO2005044294A3 (en) 2005-09-15
CA2544949A1 (en) 2005-05-19
DK1682178T3 (da) 2010-10-04
PL1682180T3 (pl) 2010-04-30
PT1694360E (pt) 2010-12-13
MA28331A1 (fr) 2006-12-01
DE602004028505D1 (de) 2010-09-16
WO2005044306A3 (en) 2005-09-15
ZA200604419B (en) 2008-06-25
WO2005044854A2 (en) 2005-05-19
PT2149585E (pt) 2013-11-27
JP2011126900A (ja) 2011-06-30
SG148143A1 (en) 2008-12-31
CY1110803T1 (el) 2015-06-10
ECSP12006607A (es) 2012-04-30
EP1682180A2 (en) 2006-07-26
CN1905897B (zh) 2012-09-05
PL1682178T3 (pl) 2010-12-31
KR20060132602A (ko) 2006-12-21
EP2248830A1 (en) 2010-11-10
SI1694360T1 (sl) 2010-12-31
EP1682180B1 (en) 2009-11-04
HK1139964A1 (en) 2010-09-30
JP2008502309A (ja) 2008-01-31
CN1938045B (zh) 2014-03-26
JP5019881B2 (ja) 2012-09-05
EP2149585B1 (en) 2013-08-14
DK1694360T3 (da) 2010-10-18
HRP20131085T1 (hr) 2013-12-20
CA2544948A1 (en) 2005-05-19
JP2011072317A (ja) 2011-04-14
JP4746552B2 (ja) 2011-08-10
DE602004023961D1 (de) 2009-12-17
EP1694360B1 (en) 2010-08-04
CA2544853A1 (en) 2005-05-19
HK1095270A1 (en) 2007-05-04
ATE476448T1 (de) 2010-08-15
AU2004287879A1 (en) 2005-05-19
ES2333971T3 (es) 2010-03-03
AU2004287879C1 (en) 2011-05-26
CA2544853C (en) 2014-05-20
CY1110839T1 (el) 2015-06-10
CN1938045A (zh) 2007-03-28
WO2005044294A2 (en) 2005-05-19
CN1905897A (zh) 2007-01-31
SI1682178T1 (sl) 2010-11-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RS51230B (sr) Antagonist anti-cd40 monoklonalna antitela i metode za njihovu upotrebu
JP4765037B2 (ja) 慢性リンパ球性白血病の処置のためのアンタゴニスト抗ｃｄ４０モノクローナル抗体の使用
JP4765040B2 (ja) 多発性骨髄腫の処置のためのアンタゴニスト抗ｃｄ４０モノクローナル抗体の使用
US20080057070A1 (en) Antagonist Anti-Cd40 Monoclonal Antibodies and Methods for Their Use
JP2008502309A5 (sr)
MXPA06004983A (en) Antagonist anti-cd40 monoclonal antibodies and methods for their use
HK1095270B (en) Antagonist anti-cd40 monoclonal antibodies and methods for their use
HK1139964B (en) Use of antagonistic anti-cd40 monoclonal antibodies
HK1095269B (en) Use of antagonist anti-cd40 antibodies for treatment of chronic lymphocytic leukemia
HK1094162B (en) Use of antagonist anti-cd40 monoclonal antibodies for treatment of multiple myeloma