ES2333971T3 - Anticuerpos monoclonales anti-cd40 antagonistas y procedimientos para su uso. - Google Patents
Anticuerpos monoclonales anti-cd40 antagonistas y procedimientos para su uso. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2333971T3 ES2333971T3 ES04810510T ES04810510T ES2333971T3 ES 2333971 T3 ES2333971 T3 ES 2333971T3 ES 04810510 T ES04810510 T ES 04810510T ES 04810510 T ES04810510 T ES 04810510T ES 2333971 T3 ES2333971 T3 ES 2333971T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- antibody
- seq
- chir
- monoclonal antibody
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/20—Interleukins [IL]
- A61K38/2013—IL-2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/06—Antiasthmatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/06—Antigout agents, e.g. antihyperuricemic or uricosuric agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
- A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
- A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
- A61P33/06—Antimalarials
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/06—Antianaemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Neurology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
Abstract
Un anticuerpo monoclonal humano que es capaz de unirse específicamente a un antígeno CD40 humano expresado en la superficie de una célula humana que expresa CD40, estando dicho anticuerpo monoclonal exento de actividad agonista significativa, por el que, cuando dicho anticuerpo monoclonal se une al antígeno CD40 expresado en la superficie de dicha célula, se inhibe el crecimiento o la diferenciación de dicha célula, en el que dicho anticuerpo se selecciona del grupo constituido por: a) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo capaz de unirse al anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o al anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543; b) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-87 de la secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº 10 ó SEC ID Nº 12; c) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-89 de la secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº 10 ó SEC ID Nº 12; y d) un anticuerpo monoclonal que compite con el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543 en un ensayo de unión competitiva.
Description
Anticuerpos monoclonales
anti-CD40 antagonistas y procedimientos para su
uso.
La invención se refiere a anticuerpos humanos
capaces de unirse a CD40, procedimientos para usar los anticuerpos y
procedimientos para tratar enfermedades mediadas por la estimulación
de señales CD40 en células que expresan CD40.
Las células B desempeñan un papel importante
durante la respuesta inmune normal in vivo. Un antígeno
extraño se unirá a inmunoglobulinas de superficie en células B
específicas, provocando una cadena de acontecimientos que incluyen
la endocitosis, el procesamiento, la presentación de los péptidos
procesados en moléculas del MHC de clase II y la regulación
ascendente del antígeno B7 en la superficie de las células B. A
continuación, una célula T específica se une a la célula B por vía
del reconocimiento por el receptor de células T (TCR) del antígeno
procesado presentado en la molécula del MHC de clase II. La
estimulación a través del TCR activa la célula T e inicia la
producción de citocinas de célula T. La interacción entre el
antígeno CD28 en células T y el antígeno B7 en células B puede
proporcionar una segunda señal que activa más la célula T. Cuando se
reciben las señales mencionadas anteriormente, el ligando de CD40
(CD40L o CD154), que no se expresa en las restantes células T
humanas, es regulado de manera ascendente en la superficie de la
célula T. La unión del ligando de CD40 al antígeno CD40 en la
superficie de la célula B estimula la célula B, causando la
maduración de la célula B a una célula plasmática que secreta altos
niveles de inmunoglobulina soluble.
El antígeno CD40 es un antígeno de superficie
celular de 55 kDa presente en la superficie de las células B
normales y células B neoplásicas humanas, células dendríticas,
células presentadoras de antígenos (APC), células endoteliales,
células monocíticas y epiteliales. Las células transformadas de
pacientes con linfomas de células B de bajo y alto grado, leucemia
linfoblástica aguda de células B, mieloma múltiple, leucemia
linfocítica crónica y enfermedad de Hodgkin expresan el antígeno
CD40. La expresión de CD40 también se detecta en dos tercios de los
casos de leucemia mieloblástica aguda y en 50% de los linfomas
relacionados con el SIDA. Las células B neoplásicas de diversos
tumores de linaje de células B expresan un alto grado de CD40 y
parecen depender de la señal de CD40 para la supervivencia y
proliferación.
Los linfomas inmunoblásticos de células B con
frecuencia aparecen en individuos inmunocomprometidos tales como
los receptores de aloinjertos y otros que reciben terapia
inmunosupresora durante períodos prolongados, pacientes con SIDA, y
pacientes con síndromes de inmunodeficiencia primaria tales como el
síndrome linfoproliferativo asociado a X o el síndrome de
Wiscott-Aldrich (Thomas y col. (1991) Adv. Cancer
Res. 57:329; Straus y col. (1993) Ann. Intern. Med 118:45).
El antígeno CD40 está relacionado con el
receptor del factor de crecimiento de los nervios (NGF) humano, el
receptor del factor de necrosis tumoral \alpha
(TNF-\alpha), y Fas, sugiriendo que CD40 es un
receptor para un ligando con funciones importantes en la activación
de las células B. La expresión de CD40 en las APC desempeña una
función coestimuladora importante en la activación de linfocitos T
ayudantes y linfocitos T citotóxicos. El receptor de CD40 se
expresa en células T activadas, plaquetas activadas y en células de
músculo liso vascular inflamadas. Los receptores de CD40 pueden
encontrarse también en eosinófilos, membranas sinoviales en la
artritis reumatoide, en fibroblastos dérmicos y en otras células no
linfoides. La unión de CDL40 al receptor de CD40 estimula la
proliferación y diferenciación de las células B, la producción de
anticuerpos, el cambio de isotipo y la generación de memoria
de
células B.
células B.
Los documentos WO 01/83755 y WO 02/28904
describen anticuerpos capaces de unirse a CD40, procedimientos para
producir estos anticuerpos y procedimientos para su uso.
Ellmark y col. (Immunology 2002, 106,
456-463) dan un informe sobre la modulación de la
interacción CD40-ligando de CD40 usando fragmentos
de anticuerpos anti CD40 de cadena simple humanos.
La invención proporciona un anticuerpo
monoclonal humano que es capaz de unirse específicamente al antígeno
CD40 humano expresado en la superficie de células que expresan CD40
humano, estando dicho anticuerpo monoclonal exento de actividad
agonista significativa, por lo que, cuando dicho anticuerpo
monoclonal se une al antígeno CD40 expresado en la superficie de
dicha célula, el crecimiento o la diferenciación de dicha célula se
inhibe, seleccionándose dicho anticuerpo del grupo constituido
por:
a) un anticuerpo monoclonal que se une a un
epítopo capaz de unirse al anticuerpo monoclonal
CHIR-5.9 que puede obtenerse de la línea celular de
hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº
PTA-5542 o al anticuerpo monoclonal
CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular
de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº
PTA-5543;
\global\parskip0.900000\baselineskip
b) un anticuerpo monoclonal que se une a un
epítopo que comprende los residuos 82-87 de la
secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº 10 ó SEC ID Nº
12;
c) un anticuerpo monoclonal que se une a un
epítopo que comprende los residuos 82-89 de la
secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº 10 ó SEC ID Nº
12; y
d) un anticuerpo monoclonal que compite con el
anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse
de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito
de Patente Nº PTA-5542 o el anticuerpo monoclonal
CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular
de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº
PTA-5543 en un ensayo de unión competitiva.
La invención también proporciona una molécula de
ácido nucleico aislada que comprende un polinucleótido que codifica
un anticuerpo monoclonal de cualquier reivindicación anterior.
La invención también proporciona una línea
celular de hibridoma capaz de producir un anticuerpo monoclonal de
la invención.
La invención también proporciona el uso de una
cantidad eficaz de un anticuerpo monoclonal anti CD40 de la
invención en la fabricación de un medicamento para inhibir el
crecimiento o la diferenciación de una célula B humana normal.
La invención también proporciona un
procedimiento in vitro para inhibir el crecimiento o la
diferenciación de una célula B humana normal que comprende poner en
contacto dicha célula B con una cantidad eficaz de un anticuerpo
monoclonal anti CD40 de la invención.
La invención también proporciona el uso de una
cantidad eficaz de un anticuerpo monoclonal anti CD40 de la
invención en la fabricación de un medicamento para inhibir la
proliferación de una célula B humana normal, en el que dicha
proliferación es aumentada por la interacción de un ligando de CD40
con un antígeno CD40 expresado en la superficie de dicha célula
B.
La invención también proporciona un
procedimiento in vitro para inhibir la proliferación de una
célula B humana normal, en el que dicha proliferación es aumentada
por la interacción de un ligando de CD40 con un antígeno CD40
expresado en la superficie de dicha célula B, comprendiendo dicho
procedimiento poner en contacto dicha célula B con una cantidad
eficaz de un anticuerpo monoclonal anti CD40 de la invención.
La invención también proporciona el uso de una
cantidad eficaz de un anticuerpo monoclonal anti CD40 o uno de sus
fragmentos de la invención en la fabricación de un medicamento para
inhibir la producción de anticuerpos por células B en un paciente
humano.
La invención también proporciona el uso de una
cantidad eficaz de un anticuerpo monoclonal anti CD40 de la
invención en la fabricación de un medicamento para inhibir el
crecimiento de células cancerosas de linaje de
células B.
células B.
La invención también proporciona un
procedimiento in vitro para inhibir el crecimiento de células
cancerosas de linaje de células B, que comprende poner en contacto
dichas células cancerosas con una cantidad eficaz de un anticuerpo
monoclonal anti CD40 de la invención.
La invención también proporciona el uso de una
cantidad eficaz de un anticuerpo monoclonal anti CD40 de la
invención en la fabricación de un medicamento para tratar un cáncer
caracterizado por la expresión de CD40.
La invención también proporciona el uso de una
cantidad eficaz de un anticuerpo monoclonal anti CD40 de la
invención en la fabricación de un medicamento para inhibir una ruta
de señalización de CD40 mediada por ligandos de CD40 en una célula
humana que expresa CD40.
La invención también proporciona un
procedimiento in vitro para inhibir una ruta de señalización
de CD40 mediada por ligandos de CD40 en una célula humana que
expresa CD40, comprendiendo dicho procedimiento poner en contacto
dicha célula con una cantidad eficaz de un anticuerpo monoclonal
anti CD40 de la invención.
La invención también proporciona un
procedimiento in vitro para identificar un anticuerpo que
tiene actividad antagonista hacia las células que expresan CD40, que
comprende llevar a cabo un ensayo de unión competitiva con un
anticuerpo monoclonal de la invención.
La invención también proporciona una composición
farmacéutica que comprende un anticuerpo anti CD40 de la invención y
un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Otros aspectos de la invención se presentan en
las reivindicaciones adjuntas.
Los aspectos de la siguiente descripción que no
se refieren específicamente a la invención reivindicada son para
comparación e ilustración.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Se dan a conocer composiciones y procedimientos
para tratar enfermedades mediadas por la estimulación de la señal
de CD40 en las células que expresan CD40, incluidos los linfomas,
las enfermedades autoinmunes y los rechazos de trasplantes. Las
composiciones incluyen anticuerpos monoclonales capaces de unirse a
un antígeno CD40 humano ubicado en la superficie de una célula
humana que expresa CD40, en las que la unión impide el crecimiento
o la diferenciación de la célula. Las composiciones también incluyen
anticuerpos monoclonales capaces de unirse específicamente a un
antígeno CD40 humano expresado en la superficie de células humanas
que expresan CD40, estando dicho anticuerpo monoclonal exento de
actividad agonista significativa, en las que la administración de
dicho anticuerpo monoclonal da como resultado un volumen del tumor
significativamente menor que una concentración similar del
anticuerpo monoclonal anti-CD20 quimérico
IDEC-C2B8 en un modelo de xenoinjerto tumoral
estadificado en ratón desnudo usando la línea celular human de
linfoma células B de Daudi. Las composiciones también incluyen
fragmentos de unión al antígeno de estos anticuerpos monoclonales,
líneas celulares de hibridomas que producen estos anticuerpos y
moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican las secuencias
de aminoácidos de estos anticuerpos monoclonales. También se dan a
conocer en el presente documento composiciones farmacéuticas que
comprenden estos anticuerpos anti CD40 en un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
Se dan a conocer procedimientos para prevenir o
para tratar una enfermedad mediada por la estimulación de la señal
de CD40, que comprende tratar al paciente con un anticuerpo anti
CD40 o uno de sus fragmentos de unión al antígeno que está exento
de actividad agonista significativa cuando se une a un antígeno CD40
en una célula humana que expresa CD40. Las enfermedades mediadas
por la estimulación de células que expresan CD40 incluyen
enfermedades autoinmunes, cánceres y rechazos de injertos de órganos
y tejidos. Los linfomas que pueden tratarse o prevenirse por medio
de un procedimiento como el dado a conocer en el presente documento
incluyen los linfomas no Hodgkin (linfomas de grado alto, linfomas
de grado intermedio y linfomas de grado bajo), la enfermedad de
Hodgkin, las leucemias linfoblásticas agudas, los mielomas, las
leucemias linfocíticas crónicas y las leucemias mieloblásticas.
Las enfermedades autoinmunes particulares
contempladas para tratamiento usando los procedimientos dados a
conocer en el presente documento incluyen el lupus eritematoso
sistémico (SLE), la artritis reumatoide, la enfermedad de Crohn, la
psoriasis, la púrpura trombocitopénica autoinmune, la esclerosis
múltiple, la espondilitis anquilosante, la miastenia gravis y el
pénfigo vulgar. Tales anticuerpos podrían usarse también para
prevenir el rechazo de injertos de órganos y tejidos al suprimir
las respuestas autoinmunes, para tratar linfomas por la privación
de la señal de activación de los linfocitos B neoplásicos
proporcionada por CD40, y para administrar toxinas a las células que
llevan el CD40 de una manera específica.
Se dan a conocer procedimientos para inhibir el
crecimiento, la diferenciación y/o la proliferación de las células
B humanas y para inhibir la producción de anticuerpos por las
células B en un paciente humano, como así también los
procedimientos para inhibir el crecimiento de las células cancerosas
de un linaje de células B. También se dan a conocer procedimientos
para identificar anticuerpos que tienen actividad antagonista hacia
las células que expresan CD40.
Los anticuerpos monoclonales dados a conocer en
el presente documento tienen una fuerte afinidad por CD40 y se
caracterizan por tener una constante de equilibrio de disociación
(K_{D}) de al menos 10^{-6} M, de preferencia al menos
10^{-7} M hasta aproximadamente 10^{-8} M, de más preferencia al
menos aproximadamente 10^{-8} M hasta aproximadamente 10^{-12}
M. Los anticuerpos monoclonales y sus fragmentos de unión al
antígeno que son adecuados para uso en los procedimientos dados a
conocer en el presente documento son capaces de unirse
específicamente a un antígeno CD40 humano expresado en la superficie
de una célula humana. Están exentos de actividad agonista
significativa pero exhiben actividad antagonista cuando se unen al
antígeno CD40 en las células humanas. En una forma de realización,
el anticuerpo anti CD40 o su fragmento exhibe actividad antagonista
cuando se une al antígeno CD40 en células B humanas normales. En
otra forma de realización, el anticuerpo anti CD40 o su fragmento
exhibe actividad antagonista cuando se une al antígeno CD40 en
células B neoplásicas humanas. Los anticuerpos monoclonales
adecuados tienen regiones humanas constantes; de preferencia tienen
también regiones del marco total o parcialmente humanizadas; y de
mayor preferencia son anticuerpos completamente humanos o sus
fragmentos de unión al antígeno. Los ejemplos de tales anticuerpos
monoclonales son los anticuerpos denominados en el presente
documento como CHIR-5.9 y
CHIR-12.12; los anticuerpos monoclonales producidos
por las líneas celulares de hibridoma denominadas en el presente
documento como 131.2F8.5.9 (a la que se hace referencia en el
presente documento línea celular 5.9) y 153.8E2.D10.D6.12.12 (a la
que se hace referencia en el presente documento línea celular
12.12); un anticuerpo monoclonal que comprende una secuencia de
aminoácidos seleccionada del grupo constituido por la secuencia
mostrada en SEC ID Nº 6, la secuencia mostrada en SEC ID Nº 7; la
secuencia mostrada en SEC ID Nº 8, las secuencias mostradas en SEC
ID Nº 6 y SEC ID Nº 7, y las secuencias mostradas en SEC ID Nº 6 y
SEC ID Nº 8; un anticuerpo monoclonal que comprende una secuencia
de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por la secuencia
mostrada en SEC ID Nº 2, la secuencia mostrada en SEC ID Nº 4, la
secuencia mostrada en SEC ID Nº 5, las secuencias mostradas SEC ID
Nº 2 y SEC ID Nº 4, y las secuencias mostradas SEC ID Nº 2 y SEC ID
Nº 5; un anticuerpo monoclonal que comprende una secuencia de
aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico que
comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo
constituido por la secuencia mostrada en SEC ID Nº 1, la secuencia
mostrada en SEC ID Nº 3, y las secuencias mostradas en SEQ ID Nº 1
y SEC ID Nº 3; y los fragmentos de estos anticuerpos monoclonales
que se unen al antígeno que retienen la capacidad de unirse
específicamente al CD40 humano, y que están exentos de actividad
agonista significativa pero que exhiben actividad antagonista cuando
se unen al antígeno CD40 en las células humanas. Los ejemplos de
tales anticuerpos monoclonales también incluyen un anticuerpo
monoclonal que se une a un epítopo capaz de unirse al anticuerpo
monoclonal producido par la línea celular de hibridoma 12.12; un
anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los
residuos con el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 en
un ensayo de unión competitiva; y un anticuerpo monoclonal que es un
fragmento de unión al antígeno del anticuerpo monoclonal
CHIR-12.12 o cualquiera de los anteriores
anticuerpos monoclonales, donde el fragmento retiene la capacidad
de unirse específicamente al antígeno CD40 humano. Los expertos en
la técnica reconocen que los anticuerpos antagonistas y los
fragmentos de estos anticuerpos que se unen al antígeno dados a
conocer en el presente documento incluyen anticuerpos y sus
fragmentos de unión al antígeno que son producidos de manera
recombinante usando procedimientos bien conocidos en la técnica y
que se describen en el presente documento a continuación, e
incluyen, por ejemplo, los anticuerpos monoclonales
CHIR-5.9 y CHIR-12.12 que se han
producido de manera recombinante.
En una forma de realización dada a conocer en el
presente documento, los procedimientos de tratamiento comprenden
administrar a un paciente una dosis terapéuticamente eficaz de una
composición farmacéutica que comprende anticuerpos antagonistas
anti CD40 adecuados o sus fragmentos de unión al antígeno. Una dosis
terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti CD40 o su fragmento
está en el intervalo desde aproximadamente 0,01 mg/kg hasta
aproximadamente 40 mg/kg, desde aproximadamente 0,01 mg/kg hasta
aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 0,1 mg/kg hasta
aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 1 mg/kg hasta
aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 3 mg/kg hasta
aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 3 mg/kg hasta
aproximadamente 25 mg/kg, desde aproximadamente 3 mg/kg hasta
aproximadamente 20 mg/kg, desde aproximadamente 5 mg/kg hasta
aproximadamente 15 mg/kg, o desde aproximadamente 7 mg/kg hasta
aproximadamente 12 mg/kg. Se reconoce que el procedimiento de
tratamiento puede comprender una administración única de una dosis
terapéuticamente eficaz o múltiples administraciones de una dosis
terapéuticamente eficaz del anticuerpo antagonista anti CD40 o sus
fragmentos de unión al antígeno.
Los anticuerpos antagonistas anti CD40
identificados en el presente documento como adecuados para uso en
los procedimientos dados a conocer en el presente documento pueden
modificarse. Las modificaciones de estos anticuerpos antagonistas
anti CD40 incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos anti CD40
quiméricos inmunológicamente activos, anticuerpos anti CD40
humanizados y anticuerpos anti CD40 murinos inmunológicamente
activos.
La Figura 1 muestra la unión de los anticuerpos
monoclonales CHIR-5.9 y CHIR-12.12
al antígeno CD40 en la superficie de línea celular de linfoma
(Ramos).
Las Figuras 2A y 2B ilustran las propiedades de
unión de los anticuerpos monoclonales anti CD40
CHIR-5.9 y CHIR-12.12 con respecto
al ligando de CD40. La Figura 2A muestra que la unión de los
anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y
CHIR-12.12 a la superficie de la célula impide la
posterior unión del ligando de CD40. La Figura 2B muestra que los
anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y
CHIR-12.12 pueden competir con la unión previa del
ligando de CD40 al CD40 de la superficie celular.
Las Figuras 3A y 3B muestran la actividad ADCC
de los anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y
CHIR-12.12 candidatos frente a células cancerosas de
los ganglios linfáticos de pacientes con linfoma no Hodgkin (NHL).
En este ensayo se usaron células NK enriquecidas de un donador
voluntario normal recién aisladas (Figura 3A) o tras cultivar
durante la noche a 37ºC (Figura 3B) como células efectoras. Como las
células de NHL también expresan CD20, el antígeno diana para
rituximab (Rituxan®), la actividad ADCC de los anticuerpos
monoclonales (mAbs) candidatos se comparó con la de rituximab.
La Figura 4 demuestra la actividad antitumoral
in vivo de los anticuerpos monoclonales
CHIR-5.9 y CHIR-12.12 comparada con
la de rituximab usando un modelo de xenoinjerto no estadificado de
células B de linfoma en ratón desnudo (Namalwa).
La Figura 5 demuestra la actividad antitumoral
in vivo de los anticuerpos monoclonales
CHIR-5.9 y CHIR-12.12 comparada con
la de ofrituximab usando un modelo de xenoinjerto no estadificado de
células B de linfoma en ratón desnudo (Daudi). RC, resistencia al
desafío tumoral.
La Figura 6 demuestra la actividad antitumoral
in vivo de los anticuerpos monoclonales
CHIR-5.9 y CHIR-12.12 comparada con
la de rituximab usando un modelo de xenoinjerto estadificado de
células B de linfoma en ratón desnudo (Daudi). CR, regresión
completa.
La Figura 7 muestra el protocolo usado para
determinar el número de moléculas de CD20 y CD40 en las células
Namalwa y Daudi.
La Figura 8 muestra la ADCC comparativa del mAb
CHIR-12.12 y rituximab frente a las células de
linfoma Daudi.
La Figura 9 presenta las secuencias de
aminoácidos para las cadenas ligeras y pesadas del mAb
CHIR-12.12. Las regiones líder (residuos
1-20 de SEC ID Nº 2), variable (residuos
21-132 de SEC ID Nº 2), y constante (residuos
133-239 de SEC ID Nº 2) de la cadena ligera se
muestran en la Figura 9A. Las regiones líder (residuos
1-19 de SEC ID Nº 4), variable (residuos
20-139 de SEC ID Nº 4), y constante (residuos
140-469 de SEC ID Nº 4) de la cadena pesada se
muestran en la Figura 9B. La región constante alternativa para la
cadena pesada del mAb CHIR-12.12 mostrada en la
Figura 9B refleja una sustitución de un residuo alanina por un
residuo serina en la posición 153 de SEC ID Nº 4. La secuencia
completa para esta variante de la cadena pesada del mAb
CHIR-12.12 se presenta en SEC ID Nº 5.
La Figura 10 muestra la secuencia codificadora
para la cadena ligera (Figura 10A; SEC ID Nº 1) y la cadena pesada
(Figura 10B; SEC ID Nº 3) para el mAb
CHIR-12.12.
La Figura 11 presenta las secuencias de
aminoácidos para las cadenas ligera y pesada del mAb
CHIR-5.9. Las regiones líder (residuos
1-20 de SEC ID Nº 6), variable (residuos
21-132 de SEC ID Nº 6), y constante (residuos
133-239 de SEC ID Nº 6) de la cadena ligera se
muestran en la Figura 11A. Las regiones líder (residuos
1-19 de SEC ID Nº 7), variable (residuos
20-144 de SEC ID Nº 7), y constante (residuos
145-474 de SEC ID Nº 7) de la cadena pesada se
muestran en la Figura 11B. La región constante alternativa para la
cadena pesada del mAb CHIR-5.9 mostrada en la Figura
11B refleja una sustitución de un residuo alanina por un residuo
serina en la posición 158 de SEC ID Nº 7. La secuencia completa para
esta variante de la cadena pesada del mAB CHIR-5.9
se presenta en la SEC ID Nº 8.
La Figura 12 muestra la secuencia codificadora
(Figura 12A; SEC ID Nº 9) para la isoforma corta del CD40 humano
(secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 12B; SEC ID Nº 10),
y la secuencia codificadora (Figura 12C; SEC ID Nº 11) para la
isoforma larga del CD40 humano (secuencia de aminoácidos mostrada en
la Figura 12D).
La Figura 13 muestra la temperatura de fusión de
CHIR-12.12 en formulaciones de diferente pH medidas
por calorimetría diferencial de barrido (DSC).
"Tumor", según se usa en el presente
documento, se refiere a todo crecimiento y proliferación de células
neoplásicas, sea maligno o benigno, y a todas las células y tejidos
precancerosos y cancerosos.
Los términos "cáncer" y "canceroso" se
refieren a, o describen, la afección fisiológica en mamíferos que
está típicamente caracterizada por el crecimiento celular no
regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a,
linfoma y leucemia.
Los "anticuerpos" y las
"inmunoglobulinas" (Igs) son glicoproteínas que tienen las
mismas características estructurales. Mientras que los anticuerpos
exhiben especificidad de unión para un antígeno, las
inmunoglobulinas incluyen tanto a los anticuerpos como a otras
moléculas análogas a anticuerpos que carecen de especificidad de
antígeno. Los polipéptidos del último tipo son producidos, por
ejemplo, en niveles bajos por el sistema linfático y en niveles
aumentados por los mielomas.
El término "anticuerpo" se usa en el
sentido más amplio y abarca los anticuerpos totalmente
estructurados, fragmentos de anticuerpos que pueden unirse al
antígeno (por ejemplo, Fab', F'(ab)2, Fv, anticuerpos de
cadena simple, fragmentos divalentes o diabodies), y péptidos
recombinantes que comprenden los anteriores.
El término "anticuerpo monoclonal" según se
usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido de
una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir,
los anticuerpos individuales que comprenden la población son
idénticos excepto por las posibles mutaciones que se dan en la
naturaleza que pueden estar presentes en cantidades menores.
Los "anticuerpos nativos" y las
"inmunoglobulinas nativas" son usualmente glicoproteínas
heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 dalton, compuestas de
dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H)
idénticas. Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada por un
enlace disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces
disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de
inmunoglobulinas. Cada cadena ligera y pesada también tiene enlaces
disulfuro intracadena espaciados regularmente. Cada cadena pesada
tiene en un extremo un dominio variable (V_{H}) seguido por un
número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio
variable en un extremo (V_{L}) y un dominio constante en su otro
extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con
el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio de
variable de cadena ligera está alineado con el dominio variable de
la cadena pesada. Se cree que residuos de aminoácidos particulares
forman una interfaz entre los dominios variables de las cadenas
ligera y pesada.
El término "variable" se refiere al hecho
de que ciertas partes de los dominios variables difieren ampliamente
en secuencia entre los anticuerpos y se utilizan en la unión y la
especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno
particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye
uniformemente a lo largo de los dominios variables de los
anticuerpos. Está concentrada en tres segmentos llamados regiones
determinantes de complementariedad (CDR) o regiones hipervariables
tanto en los dominios de las cadenas ligeras como de las cadenas
pesadas. Las partes más altamente conservadas de los dominios
variables se denominan regiones de marco (FR). Los dominios
variables de las cadenas ligeras y pesadas nativas comprenden cada
uno cuatro regiones FR, que adoptan en gran medida una
configuración lámina \beta, conectadas por tres CDR, que forman
bucles que conectan la estructura de la lámina \beta, y en algunos
casos forman parte de la misma. Las CDR en cada cadena se mantienen
juntas en estrecha proximidad por las regiones FR y, con las CDR de
la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión del
antígeno de los anticuerpos (véase Kabat y col. (1991) NIH Publ. Nº
91-3242, Vol. I, páginas
647-669).
Los dominios constantes no participan
directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero
exhiben diversas funciones efectoras, tales como la unión del
receptor de FC (FcR), la participación del anticuerpo en la
toxicidad celular dependiente de anticuerpos, la opsonización, la
iniciación de la citotoxicidad dependiente del complemento y la
desgranulación de los mastocitos.
El término "región hipervariable" cuando se
usa en el presente documento se refiere a los residuos de
aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión del
antígeno. La región hipervariable comprende residuos de aminoácidos
de una "región determinante de complementariedad" o "CDR"
(es decir, los residuos 24-34 (L1),
50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el
dominio variable de la cadena ligera y 31-35 (H1),
50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el
dominio variable de la cadena pesada; Kabat y col. (1991) Sequences
of Proteins of Immunological Interest (5th ed., Public Health
Service, National Institute of Health, Bethesda, MD) y/o los
residuos de un "bucle hipervariable" (es decir, los residuos
26-32 (L1), 50-52 (L2) y
91-96 (L3) en el dominio variable de la cadena
ligera y 26-32(H1), 53-55
(H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de la
cadena pesada; Clothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:
901-917). Los residuos del "marco" o "FR"
son los residuos del dominio variable diferentes de los residuos de
la región hipervariable.
Los "fragmentos de anticuerpos" comprenden
una parte de un anticuerpo intacto, de preferencia la región de
unión al anticuerpo o la región variable del anticuerpo intacto. Los
ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen Fab, Fab',
F(ab')2 y fragmentos Fv; fragmentos divalentes; anticuerpos
lineales (Zapata y col. (1995) Protein Eng. 8(10):
1057-1062); moléculas de anticuerpos de cadena
simple; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de
fragmentos de anticuerpos. La digestión con papaína de los
anticuerpos produce dos fragmentos idénticos de unión al antígeno,
llamados fragmentos "Fab", cada uno con un único sitio de unión
al antígeno, y un fragmento residual "Fc", cuyo nombre refleja
su capacidad para cristalizar fácilmente. El tratamiento con
pepsina da un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de
combinación con el antígeno y aún es capaz de formar un
entrecruzamiento con el antígeno.
"Fv" es el fragmento mínimo del anticuerpo
que contiene un sitio de reconocimiento y unión del antígeno
completo. En una especie Fv de dos cadenas, esta región está
constituida por un dímero de un dominio variable de cadena pesada y
uno de cadena ligera en estrecha asociación, no covalente. En una
especie Fv de cadena única, un dominio variable de cadena pesada y
uno de cadena ligera pueden estar unidos covalentemente por un
conector peptídico flexible tal que las cadenas ligera y pesada
pueden asociarse en una estructura "dimérica" análoga a la de
una especie Fv de dos cadenas. Es en esta configuración que las tres
CDR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de
unión al antígeno en la superficie del dímero
V_{H}-V_{L}. En conjunto, las seis CDR
confieren la especificidad de unión al antígeno para el anticuerpo.
Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv
que comprende sólo tres CDR específicas para un antígeno) tiene la
capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque con una menor
afinidad que el sitio de unión completo.
El fragmento Fab también contiene el dominio
constante de la cadena ligera y el primer dominio constante
(C_{H}1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab difieren de los
fragmentos Fab' por la adición de unos pocos residuos en el extremo
carboxi terminal del dominio C_{H}1 de la cadena pesada que
incluye una o más cisteínas de la región de bisagra del anticuerpo.
Fab'-SH es la denominación en el presente documento
para el Fab' en el que el(los) residuo(s) cisteína de
los dominios constantes tiene(n) un grupo tiol libre. Los
fragmentos de anticuerpos F(ab')2 se producían originalmente
como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas de bisagra entre
ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos
de anticuerpos.
Las "cadenas ligeras" de los anticuerpos
(inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrado pueden
asignarse a uno de dos tipos claramente diferentes, llamados kappa
(\kappa) y lambda (\lambda), basándose en las secuencias de
aminoácidos de sus dominios constantes.
Según la secuencia de aminoácidos del dominio
constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden
asignarse a diferentes clases. Hay cinco clases principales de
inmunoglobulinas humanas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM y varias de
estas pueden dividirse además en subclases (isotipos), por ejemplo,
IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Los dominios constantes de las
cadenas pesadas que corresponden a las diferentes clases de
inmunoglobulinas se denominan alfa, delta, épsilon, gamma y mu,
respectivamente. Las estructuras y las configuraciones
tridimensionales de las subunidades de las diferentes clases de
inmunoglobulinas son bien conocidas. Los isotipos diferentes tienen
funciones efectoras diferentes. Por ejemplo, los isotipos IgG1 e
IgG3 humanos median la actividad de citotoxicidad mediada por
células dependiente de anticuerpos (ADCC).
La palabra "marcador" cuando se utiliza en
el presente documento se refiere a un compuesto o composición
detectable que se conjuga directamente o indirectamente a los
anticuerpos para generar un anticuerpo "marcado". El marcador
puede ser detectable por sí mismo (por ejemplo, marcadores
radioisótopos o marcadores fluorescentes) o, en el caso de un
marcador enzimático, puede catalizar la alteración química de un
compuesto o composición de sustrato que es detectable. Los
radionúclidos que pueden servir como marcadores detectables
incluyen, por ejemplo, I-131,
I-123, I-125, Y-90,
Re-188, Re-186,
At-211, Cu-67,
Bi-212 y Pd-109. El marcador puede
también ser una entidad no detectable tal como una toxina.
El término "antagonista" se utiliza en el
sentido más amplio e incluye cualquier molécula que bloquea parcial
o totalmente, inhibe o neutraliza una actividad biológica de una
diana nativa dada a conocer en el presente documento o su
transcripción o traducción. "Vehículos" según se usa en el
presente documento incluye los vehículos, excipientes o
estabilizadores farmacéuticamente aceptables, que son no tóxicos
para la célula o el mamífero que se expone al mismo en las dosis y
concentraciones utilizadas. Frecuentemente el vehículo
fisiológicamente aceptable es una disolución acuosa de pH
tamponado. Los ejemplos de vehículos fisiológicamente aceptables
incluyen tampones tales como fosfato, citrato, succinato y otros
ácidos orgánicos; antioxidantes incluido el ácido ascórbico;
polipéptidos de bajo peso molecular (con menos de aproximadamente 10
residuos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina, o
inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como
polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina,
asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros
carbohidratos incluidos glucosa, manosa o dextrinas; agentes
quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcares tales como manitol
o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como el sodio; y/o
tensioactivos no iónicos tales como TWEEN, polietilenglicol (PEG) y
Pluronics. La administración "en combinación con" otro u otros
agentes terapéuticos incluye la administración simultánea (al mismo
tiempo) y la administración consecutiva en cualquier orden.
Una "célula huésped", según se usa en el
presente documento, se refiere a un microorganismo o a una célula o
línea celular de eucariota cultivada como una entidad unicelular que
puede usarse, o se ha usado, como receptor de un vector
recombinante u otros polinucleótidos de transferencia, e incluye a
la progenie de la célula original que se ha transfectado. Se
entiende que la progenie de una célula única puede no ser
necesariamente completamente idéntica en morfología o en
complemento de ADN genómico o total a la original, por las
mutaciones naturales, accidentales o deliberadas.
"Células efectoras humanas" son leucocitos
que expresan uno o más FcR y que realizan funciones efectoras. De
preferencia, las células expresan al menos Fc\gammaRIII y llevan a
cabo la función efectora de citotoxicidad mediada por células
dependiente de antígenos (ADCC). Los ejemplos de leucocitos humanos
que median la ADCC incluyen las células mononucleares de sangre
periférica (PBMC), células citolíticas naturales (NK), monocitos,
macrófagos, eosinófilos y neutrófilos, siendo las de preferencia las
PBMC y las células NK. Los anticuerpos que tienen actividad ADCC
son típicamente del isotipo IgG1 o IgG3. Nótese que además de aislar
anticuerpos IgG1 e IgG3, tales anticuerpos que median la ADCC
pueden generarse modificando una región variable de un anticuerpo
que no media la ADCC o un fragmento de región variable formando una
región constante del isotipo IgG1 o IgG3.
Los términos "receptor de Fc" o "FcR"
se usan para describir un receptor que se une a la región Fc de un
anticuerpo. El FcR de preferencia es un FcR humano de secuencia
nativa. Además, un FcR de preferencia es uno que se une a un
anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye a los receptores de las
subclases Fc\gammaRI, Fc\gammaRII y Fc\gammaRIII, incluidas
las variantes alélicas y formas de corte y empalme alternativas de
estos receptores. Los receptores Fc\gammaRII incluyen
Fc\gammaRIIA (un "receptor activador") y Fc\gammaRIIB (un
"receptor inhibidor"), que tienen secuencias de aminoácidos
similares que difieren principalmente en sus dominios citoplásmicos.
El receptor activador Fc\gammaRIIA contiene un motivo de
activación inmuno receptor basado en tirosina (ITAM) en su dominio
citoplásmico. El receptor inhibidor Fc\gammaRIIB contiene un
motivo de inhibición inmuno receptor basado en tirosina (ITIM) en
su dominio citoplásmico (véase Daeron (1997) Annu. Rev. Immunol. 15:
203-234). Los FcR se recopilan en Ravetch and Kinet
(1991) Annu. Rev. Immunol. 9: 457-492 (1991); Capel
y col. (1994) Immunomethods 4: 25-34; y de Haas y
col. (1995) J. Lab. Clin. Med. 126: 330-341. Otros
FcRs, incluidos los que se identificarán en el futuro, están
abarcados por el término "FcR" en el presente documento. El
término incluye también el receptor neonatal, FcRn, que es
responsable de la transferencia de las IgG maternas al feto (Guyer
y col. (1976) J. Immunol. 117: 587 y Kim y col. (1994) J. Immunol.
24: 249 (1994)).
Hay varias maneras de producir anticuerpos
humanos. Por ejemplo, pueden inmortalizarse células secretoras por
medio de la infección con el virus de Epstein-Barr
(EBV). Sin embargo, las células infectadas con EBV son difíciles de
clonar y usualmente producen sólo rendimientos relativamente bajos
de inmunoglobulina (James and Bell (1987) J. Immunol Methods 100:
5-40). En el futuro, posiblemente podría lograrse la
inmortalización de células B humanas mediante la introducción de
una combinación definida de genes transformadores. Esa posibilidad
se destaca por medio de una reciente demostración de que la
expresión de la subunidad catalítica de telomerasa junto con la
oncoproteína grande de SV40 y un alelo oncogénico de
H-ras dio como resultado la conversión tumorigénica
de células fibroblásticas y epiteliales humanas normales (Hahn y
col. (1999) Nature 400: 464-468). Ahora es posible
producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son
capaces, tras la inmunización, de producir un repertorio de
anticuerpos humanos en ausencia de producción endógena de
inmunoglobulinas (Jakobovits y col. (1993) Nature 362:
255-258; Lonberg and Huszar (1995) Int. Rev.
Immunol. 13: 65-93; Fishwild y col. (1996) Nat.
Biotechnol. 14: 845-851; Mendez y col. (1997) Nat.
Genet. 15: 146-156; Green (1999) J. Immunol. Methods
231: 11-23; Tomizuka y col. (2000) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 97: 722-727; recopilado en Little y
col. (2000) Immunol. Today 21: 364-370). Por
ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigota de la región de
unión de cadenas pesadas (JH) del anticuerpo en ratones quiméricos
y mutantes de línea germinal da como resultado la inhibición
completa de producción de anticuerpos endógenos (Jakobovits y col.
(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551-2555).
La transferencia del conjunto de genes de inmunoglobulinas humanas
de línea germinal en tales ratones mutantes de línea germinal da
como resultado la producción de anticuerpos humanos tras el desafío
con antígenos (Jakobovits y col. (1993) Nature 362:
255-258). Mendez y col. (1997) (Nature Genetics 15:
146-156) han generado una línea de ratones
transgénicos que, cuando se desafían con un antígeno, generan
anticuerpos totalmente humanos de alta afinidad. Esto se logró por
la integración en la línea germinal de loci megabase de cadenas
pesadas y cadenas ligeras humanas en los ratones con deleción en el
segmento endógeno JH como se describió anteriormente. Estos ratones
(tecnología XenoMouse® II (Abgenix; Fremont, California)) albergan
1.020 kb del locus de cadena pesada humana que contiene
aproximadamente 66 genes de VH, regiones DH y JH completas, y tres
regiones constantes diferentes, y también albergan 800 kb del locus
\kappa humano que contiene 32 genes de V\kappa, segmentos
J\kappa y genes de C\kappa. Los anticuerpos producidos en estos
ratones se asemejan mucho a los que se observan en seres humanos en
todos los aspectos, incluidos la reorganización genética, la
estructura y el repertorio. Los anticuerpos humanos se expresan de
preferencia sobre anticuerpos endógenos por deleción en el segmento
endógeno que evita la reorganización genética en el locus murino.
Tales ratones pueden inmunizarse con un antígeno de interés
particular.
Los sueros de tales animales inmunizados pueden
seleccionarse para reactividad de anticuerpo frente al antígeno
inicial. Los linfocitos pueden aislarse de ganglios linfáticos o de
células del bazo y además pueden seleccionarse para células B
seleccionando las células CD138 negativas y CD19 positivas. En un
aspecto, tales cultivos de células B (BCC) pueden fusionarse a
células de mieloma para generar hibridomas como se detalló
anteriormente.
En otro aspecto, tales cultivos de células B
pueden seleccionarse además para reactividad frente al antígeno
inicial, de preferencia. Tal selección incluye ELISA con la proteína
diana/antígeno, un ensayo de competición con anticuerpos conocidos
que se unen al antígeno de interés, y unión in vitro a
células CHO u otras células transfectadas de manera transitoria que
expresan el antígeno diana.
La presente descripción se refiere a
composiciones y procedimientos para el tratamiento de pacientes
humanos con enfermedades mediadas por la estimulación de la señal
de CD40 en células que expresan CD40. Los procedimientos implican
el tratamiento con un anticuerpo anti CD40 de la invención, o uno de
sus fragmentos de unión al antígeno, en el que la administración
del anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno promueve una
respuesta terapéutica positiva en el paciente que se somete a este
procedimiento de terapia. Los anticuerpos anti CD40 adecuados para
uso en los procedimientos de la invención se unen específicamente al
antígeno CD40 humano expresado en la superficie de una célula
humana y están exentos de actividad agonista significativa, pero
exhiben actividad antagonista cuando se unen al antígeno CD40 en
una célula humana que expresa CD40. Estos anticuerpos anti CD40 y
sus fragmentos de unión al antígeno se denominan en el presente
documento anticuerpos anti CD40 antagonistas. Tales anticuerpos
incluyen, pero no se limitan a, los anticuerpos monoclonales
CHIR-5.9 y CHIR-12.12 totalmente
humanos que se describen a continuación y los anticuerpos
monoclonales tienen las características de unión de los anticuerpos
monoclonales CHIR-5.9 y CHIR-12.12.
Los expertos en la técnica reconocen que los anticuerpos
antagonistas y los fragmentos de estos anticuerpos que se unen al
antígeno dados a conocer en el presente documento incluyen
anticuerpos y sus fragmentos de unión al antígeno que se producen de
manera recombinante utilizando procedimientos bien conocidos en la
técnica y que se describen a continuación en el presente documento,
e incluyen, por ejemplo, los anticuerpos monoclonales
CHIR-5.9 y CHIR-12.12, que se han
producido de manera recombinante.
Los anticuerpos que tienen las características
de unión de los anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y
CHIR-12.12 incluyen anticuerpos que interfieren de
manera competitiva con la unión a CD40 y/o se unen a los mismos
epítopos que CHIR-5.9 y CHIR-12.12.
Un experto podría determinar si un anticuerpo interfiere de manera
competitiva con CHIR-5.9 o
CHIR-12.12 usando procedimientos convencionales.
Cuando estos anticuerpos se unen a CD40 expuesto
en la superficie de las células humanas, tales como las células B
humanas, los anticuerpos están exentos de actividad agonista
importante; en algunas formas de realización, su unión a CD40
expuesto en la superficie de las células humanas da como resultado
la inhibición de la proliferación y la diferenciación de estas
células humanas. Por consiguiente, los anticuerpos anti CD40
antagonistas adecuados para uso en los procedimientos de la
invención incluyen los anticuerpos monoclonales que pueden exhibir
actividad antagonista hacia las células humanas normales y malignas
que expresan el antígeno de superficie celular CD40.
En algunas formas de realización, los
anticuerpos anti CD40 de la invención exhiben actividad antitumoral
aumentada comparado con el anticuerpo monoclonal anti CD20 quimérico
IDEC-C2B8, donde la actividad antitumoral se ensaya
con cantidades equivalentes de estos anticuerpos en un modelo de
xenoinjerto de tumor en ratón desnudo usando líneas celulares de
linfoma humanas. IDEC-C2B8 (IDEC Pharmaceuticals
Corp., San Diego, California; comercialmente disponible bajo la
marca Rituxan®, también se conoce como rituximab) es un anticuerpo
monoclonal anti CD20 quimérico que contiene IgG1 humana y regiones
constantes kappa con regiones variables murinas aisladas de un
anticuerpo monoclonal anti CD20 murino, IDEC-2B8
(Reff y col. (1994) Blood 83: 435-445). Rituximab®
está autorizado para el tratamiento de la recaída del linfoma no
Hodgkin folicular (NHL) o de grado bajo de células B. El
descubrimiento de anticuerpos con actividad antitumoral superior
comparado con Rituximab® podría mejorar drásticamente los
procedimientos de tratamiento del cáncer para los linfomas de
células B, en particular el linfoma no Hodgkin de células B.
Los modelos de xenoinjerto de tumores en ratón
desnudo adecuados incluyen los que utilizan líneas celulares de
linfoma de Burkitt humanas conocidas como Namalwa y Daudi. Las
formas de realización de preferencia ensayan la actividad
antitumoral en un modelo de xenoinjerto de tumor estadificado en
ratón desnudo utilizando la línea celular de linfoma humana Daudi,
como se describe en el presente documento a continuación en el
Ejemplo 17. Un modelo de xenoinjerto de tumor estadificado en ratón
desnudo usando la línea celular de linfoma Daudi es más eficaz para
distinguir la eficacia terapéutica de un anticuerpo dado que un
modelo no estadificado, ya que en el modelo estadificado la dosis
de anticuerpos se inicia sólo después de que el tumor haya alcanzado
un tamaño que puede medirse. En el modelo no estadificado, la dosis
de anticuerpos se inicia, por lo general, en un plazo de
aproximadamente 1 día de la inoculación del tumor y antes de que
esté presente el tumor palpable. La capacidad de un anticuerpo para
superar a Rituxan® (es decir, para exhibir actividad antitumoral
aumentada) en un modelo estadificado es una fuerte indicación de
que el anticuerpo será terapéuticamente más eficaz que Rituxan®.
Por otra parte, en el modelo de Daudi, anti CD20, la diana de
Rituxan® se expresa en la superficie celular en un nivel más alto
que CD40.
Se entiende por "cantidad equivalente" del
anticuerpo anti CD40 de la invención y Rituxan® a la misma dosis de
mg que se administra por peso. Por consiguiente, cuando el
anticuerpo anti CD40 de la invención se dosifica a 0,01 mg/kg de
peso corporal del ratón utilizado en el modelo de tumor, Rituxan®
también se dosifica a 0,01 mg/kg de peso corporal del ratón.
Asimismo, cuando el anticuerpo anti CD40 de la invención se dosifica
a 0,1, 1 ó 10 mg/kg de peso corporal del ratón utilizado en el
modelo de tumor, Rituxan® también se dosifica a 0,1, 1 ó 10 mg/kg,
respectivamente, de peso corporal del ratón.
Cuando se administran en el modelo de
xenoinjerto de tumor en ratón desnudo, algunos anticuerpos de la
invención dan como resultado un volumen de tumor significativamente
menor que una cantidad equivalente de Rituxan®. Por consiguiente,
por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12
totalmente humano exhibe al menos un 20% de aumento en la actividad
antitumoral comparado con la actividad observada con una dosis
equivalente de Rituxan cuando se ensaya en el modelo de xenoinjerto
tumor estadificado en ratón desnudo usando la línea celular de
linfoma humana Daudi de la manera descrita en los Ejemplos a
continuación en el presente documento, y puede exhibir tanto como
un 50% a 60% de aumento en la actividad antitumoral en este ensayo.
Esta actividad antitumoral aumentada se refleja en la mayor
reducción en el volumen del tumor observada con el anticuerpo anti
CD40 de la invención comparado con la dosis equivalente de
Rituxan®. Por consiguiente, por ejemplo, dependiendo del tiempo
después de la inoculación del tumor, el anticuerpo monoclonal
CHIR-12.12 puede exhibir un volumen de tumor que es
aproximadamente un tercio hasta aproximadamente la mitad del
observado para una dosis equivalente de Rituxan®.
Otra diferencia en la eficacia del anticuerpo es
la medición in vitro de la concentración de anticuerpo
necesaria para obtener la máxima lisis de células tumorales in
vitro en presencia de células NK. Por ejemplo, los anticuerpos
anti CD40 de la invención alcanzan una lisis máxima de células Daudi
a una CE50 inferior a ½, y de preferencia ¼, y de más preferencia
1/10 de la concentración de Rituxan®.
Además del anticuerpo monoclonal
CHIR-12.12, otros anticuerpos anti CD40 que podrían
compartir las características de tener eficacia significativamente
mayor que cantidades equivalentes de Rituxan® en los ensayos
descritos anteriormente incluyen, pero no se limitan a: (1) el
anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma
12.12; (2) un anticuerpo monoclonal que comprende una secuencia de
aminoácidos seleccionada del grupo constituido por la secuencia en
SEC ID Nº 2, la secuencia en SEC ID Nº 4, la secuencia en SEC ID Nº
5, las secuencias en SEC ID Nº 2 y SEC ID Nº 4, y las secuencias en
SEC ID Nº 2 y SEC ID Nº 5; (3) un anticuerpo monoclonal que tiene
una secuencia de aminoácidos codificada por una molécula de ácido
nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada
del grupo constituido por la secuencia de nucleótidos en SEC ID Nº
1, la secuencia de nucleótidos en SEC ID Nº 3, y las secuencias en
SEC ID Nº 1 y SEC ID Nº 3; (4) un anticuerpo monoclonal que se une
a un epítopo capaz de unir el anticuerpo monoclonal producido por la
línea celular de hibridoma 12.12; (5) un anticuerpo monoclonal que
se une a un epítopo que comprende los residuos 82-87
de la secuencia de aminoácidos en SEC ID Nº 10 ó SEC ID Nº 12; (6)
un anticuerpo monoclonal que compite con el anticuerpo monoclonal
CHIR-12.12 en un ensayo de unión competitiva; y (7)
un anticuerpo monoclonal que es un fragmento del anticuerpo
monoclonal CHIR-12.12 que se une al anticuerpo o los
anteriores anticuerpos monoclonales en los puntos anteriores
(1)-(6), en los que el fragmento retiene la capacidad de unirse
específicamente al antígeno CD40 humano.
\vskip1.000000\baselineskip
Los anticuerpos monoclonales
CHIR-5.9 y CHIR-12.12 representan
anticuerpos anti CD40 antagonistas adecuados para uso en los
procedimientos de la presente invención. Los anticuerpos
CHIR-5.9 y CHIR-12.12 son
anticuerpos monoclonales anti CD40 totalmente humanos del isotipo
IgG1 producidos a partir de las líneas celulares de hibridoma
131.2F8.5.9 (a la que se hace referencia en el presente documento
como la línea celular 5.9) y 153.8E2.D10.D6.12.12 (a la que se hace
referencia en el presente documento como la línea celular 12.12).
Estas líneas celulares se crearon usando esplenocitos de ratones
xenotípicos inmunizados que contienen el locus de cadena pesada de
IgG1 humana y el locus de cadena \kappa humana (tecnología
XenoMouse®; Abgenix; Fremont, California). Las células del bazo se
fusionaron con las células de mieloma SP2/0 de ratón (Sierra
BioSource). Las hibridomas resultantes se subclonaron varias veces
para crear las líneas celulares monoclonales estables 5.9 y 12.12.
Otros anticuerpos de la invención pueden prepararse de manera
similar usando ratones transgénicos para loci de inmunoglobulina
humana o por otros procedimientos conocidos en la técnica y/o
descritos en el presente documento.
Se dan a conocer las secuencias de nucleótidos y
de aminoácidos de las regiones variables del anticuerpo
CHIR-12.12 y las secuencias de aminoácidos de las
regiones variables del anticuerpo CHIR-5.9. Más
particularmente, las secuencias de aminoácidos para las regiones
líder, variable y constante para la cadena ligera y cadena pesada
para el mAb CHIR-12.12 se presentan en las Figuras
9A y 9B, respectivamente. Véase también SEC ID Nº 2 (secuencia
completa para la cadena ligera del mAb CHIR-12.12),
SEC ID Nº 4 (secuencia completa para la cadena pesada para el mAb
CHIR-12.12) y SEC ID Nº 5 (secuencia completa para
una variante de la cadena pesada para el mAb
CHIR-12.12 presentada en SEC ID Nº 4, donde la
variante comprende una sustitución del residuo alanina por serina
en la posición de 153 de SEC ID Nº 4). Las secuencias de nucleótidos
que codifican la cadena ligera y la cadena pesada para el mAb
CHIR-12.12 se presentan en las Figuras 11A y 11B,
respectivamente. Véase también SEC ID Nº 1 (secuencia codificadora
para la cadena ligera para el mAb CHIR-12.12) y SEC
ID Nº 3 (secuencia codificadora para la cadena pesada para el mAb
CHIR-12.12). Las secuencias de aminoácidos para las
regiones líder, variable y constante para la cadena ligera y cadena
pesada del mAb CHIR-5.9 se presentan en las Figuras
10A y 10B, respectivamente. Véase también SEC ID Nº 6 (secuencia
completa para la cadena ligera del mAb CHR-5.9),
SEC ID Nº 7 (secuencia completa para la cadena pesada del mAb
CHIR-5.9) y SEC ID Nº 8 (secuencia completa para
una variante de la cadena pesada del mAb CHIR-5.9
presentada en SEC ID Nº 7, donde la variante comprende una
sustitución del residuo alanina por serina en la posición de 158 de
SEC ID Nº 7). Además, los hibridomas que expresan los anticuerpos
CHIR-5.9 y CHIR-12.12 se han
depositado en la ATCC con una denominación de depósito de patente de
PTA-5542 y PTA-5543,
respectivamente.
Además de la actividad antagonista, resulta de
preferencia que los anticuerpos anti CD40 de esta invención tengan
otro mecanismo de acción contra una célula tumoral. Por ejemplo, los
anticuerpos CHIR-5.9 y CHIR-12.12
nativos tienen actividad ADCC. Como alternativa, las regiones
variables de los anticuerpos CHIR-5.9 y
CHIR-12.12 pueden expresarse en otro isotipo de
anticuerpos que tenga actividad ADCC. También es posible conjugar
formas nativas, formas recombinantes o fragmentos de
CHR-5.9 o CHIR-12.12 que se unen al
antígeno a una citotoxina, un agente terapéutico, o a un ion
metálico radiactivo o radioisótopo, como se señala a continuación en
el presente documento.
Los anticuerpos monoclonales
CHIR-5.9 y CHIR-12.12 se unen a CD40
soluble en ensayos de tipo ELISA, evitan la unión del ligando de
CD40 al CD40 de la superficie celular, y desplazan el ligando de
CD40 previamente unido, según se determina por ensayos de
citometría de flujo. Los anticuerpos CHIR-5.9 y
CHIR-12.12 compiten uno con el otro por la unión a
CD40 pero no con 15B8, el anticuerpo monoclonal anti CD40 descrito
en el documento WO 02/28904. Cuando se prueban in vitro los
efectos en la proliferación de células B de sujetos humanos
normales, CHIR-5.9 y CHIR-12.12
actúan como anticuerpos anti CD40 antagonistas. Además,
CHIR-5.9 y CHIR-12.12 no inducen
fuerte proliferación de linfocitos humanos de sujetos normales.
Estos anticuerpos son capaces de matar las células diana que
expresan CD40 por citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo
(ADCC). La afinidad de unión de CHIR-5.9 por el
CD40 humano es de 1,2 x 10^{-8} M y la afinidad de unión de
CHIR-12.12 es de 5 x 10^{-10} M, según se
determina por medio del ensayo Biacore^{TM}.
Los anticuerpos anti CD40 antagonistas adecuados
para uso en los procedimientos de la presente invención exhiben una
fuerte afinidad de unión de sitio único por el antígeno CD40 de
superficie celular. Los anticuerpos monoclonales de la invención
exhiben una constante de equilibrio de disociación (K_{D}) para
CD40 de al menos 10^{-5} M, al menos 3 X 10^{-5} M, de
preferencia al menos 10^{-6} M hasta 10^{-7} M, de más
preferencia al menos 10^{-8} M hasta aproximadamente 10^{-12}
M, medida usando un ensayo convencional tal como Biacore^{TM}. El
análisis Biacore se conoce en la técnica y se proporcionan detalles
en el "BIAapplications handbook". Los procedimientos descritos
en el documento WO 01/27160 pueden usarse para modular la afinidad
de unión.
Se entiende por "antígeno CD40",
"antígeno CD40 de superficie celular", "receptor de CD40"
o "CD40" una glicoproteína transmembranaria que pertenece a la
familia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF) (véase,
por ejemplo las Patentes de EEUU Nº 5.674.492 y 4.708.871;
Stamenkovic y col. (1989) EMBO 8: 1403; Clark (1990) Tissue
Antigens 36: 33; Barclay y col. (1997) The Leucocyte Antigen Facts
Book (2ª ed.; Academic Press, San Diego)). Se han identificado dos
isoformas de CD40 humano, codificadas por variantes de transcripción
con cortes y empalmes alternativos de este gen. La primera isoforma
(también conocida como la "isoforma larga" o "isoforma
1") se expresa como un polipéptido precursor de 277 aminoácidos
(SEC ID Nº 12 (informada primero en GenBank con Nº de acceso
CAA43045, e identificada como isoforma 1 en GenBank con Nº de acceso
NP 001241), codificado por SEC ID Nº 11 (véase Nº de acceso de
GenBank X60592 y NM 001250)), que tiene una secuencia señal
representada por los primeros 19 residuos. La segunda isoforma
(también conocida como la "isoforma corta" o "isoforma
2") se expresa como un polipéptido precursor de 203 aminoácidos
(SEC ID Nº 10 (Nº de acceso de GenBank NP 690593), codificado por
SEC ID Nº 9 (Nº de acceso de GenBank NM 152854)), que también tiene
una secuencia señal representada por los primeros 19 residuos. Los
polipéptidos precursores de estas dos isoformas de CD40 humano
comparten en común sus primeros 165 residuos (es decir, los residuos
1-165 de SEC ID Nº 10 y SEC ID Nº 12). El
polipéptido precursor de la isoforma corta (mostrado en SEC ID Nº
10) está codificado por una variante de transcripción (SEC ID Nº 9)
que carece de un segmento codificador, que da lugar a un cambio del
marco de traducción; la isoforma de CD40 resultante contiene un
extremo C terminal más corto y diferente (residuos
166-203 de SEC ID Nº 10) del que está contenido en
la isoforma larga de CD40 (extremo C terminal mostrado en los
residuos 166-277 de SEC ID Nº 12). Para los fines de
la presente invención, el término "antígeno CD40", "antígeno
CD40 de superficie celular", "receptor de CD40" o
"CD40" abarca tanto la isoforma corta como la larga de CD40.
Los anticuerpos anti CD40 de la presente invención se unen a un
epítopo de CD40 humano que se encuentra en la misma situación
dentro de la isoforma corta o la isoforma larga de este antígeno de
superficie celular como se señala a continuación en el presente
documento.
El antígeno CD40 está expuesto en la superficie
de una diversidad de tipos celulares, según se describe en otras
partes en el presente documento. Por "expuesto en la
superficie" y "expresado en la superficie" se entiende que
todo o una parte del antígeno CD40 está expuesto al exterior de la
célula. El antígeno CD40 expuesto o expresado puede estar total o
parcialmente glicosilado.
Por "actividad agonista" se entiende que la
sustancia funciona como un agonista. Un agonista se combina con un
receptor en una célula e inicia una reacción o actividad que es
similar a la misma que se inicia por el ligando natural del
receptor. Un agonista de CD40 induce, pero no se limita a,
cualquiera o todas las siguientes respuestas: proliferación y
diferenciación de células B, producción de anticuerpos, adhesión
intercelular, generación de memoria de células B, cambio de
isotipo, regulación ascendente de la expresión en la superficie
celular de MHC clase II y CD80/86, y secreción de citocinas
proinflamatorias tales como IL-8,
IL-12 y TNF. Por "actividad antagonista" se
entiende que la sustancia funciona como un antagonista. Un
antagonista de CD40 evita o reduce la inducción de cualquiera de
las respuestas inducidas por la unión del receptor de CD40 a un
ligando agonista, en particular CD40L. El antagonista puede reducir
la inducción de una o más de las respuestas a la unión de agonistas
en un 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, de preferencia 40%, 45%,
50%, 55%, 60%, de más preferencia 70%, 80%, 85% y de mayor
preferencia 90%, 95%, 99% ó 100%. Los procedimientos para medir la
especificidad de unión y la actividad de antagonista de anticuerpos
anti CD40 y ligandos de CD40 son conocidos por los expertos en la
técnica e incluyen, pero no se limitan a, ensayos de unión
competitiva convencionales, ensayos para controlar la secreción de
inmunoglobulinas por las células B, ensayos de proliferación de
células B, ensayos de proliferación de células B análogos a
Banchereau, ensayos de células T ayudantes para la producción de
anticuerpos, ensayos de proliferación de células B con
coestimulación y ensayos para regulación ascendente de marcadores
de activación de células B. Véase, por ejemplo, los ensayos dados a
conocer en el documento WO 00/75348 y en la Patente de EEUU Nº
6.087.329.
Por actividad antagonista "significativa"
se entiende una actividad agonista de al menos 30%, 35%, 40%, 45%,
50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ó 100% superior a la
actividad agonista inducida por una sustancia neutra o un control
negativo según se mide en el ensayo de una respuesta de células B.
De preferencia, la actividad agonista "significativa" es una
actividad agonista que es al menos 2 veces mayor o al menos 3 veces
mayor que la actividad agonista inducida por una sustancia neutra o
un control negativo según se mide en el ensayo de una respuesta de
células B. Por consiguiente, por ejemplo, cuando la respuesta de
células B de interés es la proliferación de células B, la actividad
agonista "significativa" sería la inducción de un nivel de
proliferación de células B que es al menos 2 veces mayor o al menos
3 veces mayor que el nivel de proliferación de células B inducido
por una sustancia neutra o un control negativo. En una forma de
realización, una inmunoglobulina no específica, por ejemplo IgG1,
que no se une a CD40 sirve como el control negativo. Una sustancia
"exenta de actividad agonista significativa" exhibirá una
actividad agonista de no más que aproximadamente 25% mayor que la
actividad agonista inducida por una sustancia neutra o un control
negativo, de preferencia no más que aproximadamente 20% mayor, 15%
mayor, 10% mayor, 5% mayor, 1% mayor, 0.5% mayor, o incluso no más
que aproximadamente 0,1% mayor que la actividad agonista inducida
por una sustancia neutra o un control negativo según se mide en un
ensayo de una respuesta de células B. Los anticuerpos anti CD40
antagonistas útiles en los procedimientos de la presente invención
están exentos de actividad agonista significativa como se señaló
anteriormente cuando se unen a un antígeno CD40 en una célula
humana. En una forma de realización de la invención, el anticuerpo
anti CD40 antagonista está exento de actividad agonista
significativa en una respuesta de células B. En otra forma de
realización de la invención, el anticuerpo anti CD40 antagonista
está exento de actividad agonista significativa en ensayos de más
de una respuesta de células B (por ejemplo, proliferación y
diferenciación, o proliferación, diferenciación y producción de
anticuerpos).
Según se utiliza en el presente documento
"anticuerpo anti CD40" abarca cualquier anticuerpo que reconoce
específicamente el antígeno CD40 de superficie celular, incluidos
anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos de
cadena única, y sus fragmentos tales como Fab, F(ab')_{2},
F_{v}, y otros fragmentos que retienen la función de unión al
antígeno del anticuerpo anti CD40 original. Son de particular
interés para la presente invención los anticuerpos anti CD40
antagonistas dados a conocer en el presente documento que comparten
las características de unión de los anticuerpos monoclonales
CHIR-5.9 y CHIR-12.12 descritos
anteriormente. Tales anticuerpos incluyen, pero no se limitan a,
los siguientes: (1) los anticuerpos monoclonales producidos por las
líneas celulares de hibridoma denominadas 131.2F8.5.9 (a la que se
hace referencia en el presente documento como línea celular 5.9) y
153.8E2.D10.D6.12.12 (a la que se hace referencia en el presente
documento como línea celular 12.12), depositadas en la ATCC como
Depósito de Patente Nº PTA-5542 y Depósito de
Patente Nº PTA-5543, respectivamente; (2) un
anticuerpo monoclonal que comprende una secuencia de aminoácidos
seleccionada del grupo constituido por la secuencia mostrada en SEC
ID Nº 2, la secuencia mostrada en SEC ID Nº 4, la secuencia
mostrada en SEC ID Nº 5, las secuencias mostradas en SEC ID Nº 2 y
SEC ID Nº 4, y por las secuencias mostradas en SEC ID Nº 2 y SEC ID
Nº 5; (3) un anticuerpo monoclonal que comprende la secuencia de
aminoácidos seleccionada del grupo constituido por la secuencia
mostrada en SEC ID Nº 6, la secuencia mostrada en SEC ID Nº 7, la
secuencia mostrada en SEC ID Nº 8, las secuencias mostradas en SEQ
ID NO:6 y SEC ID Nº 7, y por las secuencias mostradas en SEC ID Nº
6 y SEC ID Nº 8; (4) un anticuerpo monoclonal que tiene la secuencia
de aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico que
comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo
constituido por la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID Nº 1,
la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID Nº 3, y las
secuencias de nucleótidos mostradas en SEC ID Nº y SEC ID Nº 3; (5)
un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo capaz de unirse al
anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma
5.9 o la línea celular de hibridoma 12.12; (6) un anticuerpo
monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos
82-87 de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC
ID Nº 10 o SEC ID Nº 12; (7) un anticuerpo monoclonal que compite
con el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 o
CHIR-12.12 en un ensayo de unión competitiva; y (8)
un anticuerpo monoclonal que es un fragmento del anticuerpo
monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9 que
se une al antígeno o los anticuerpos monoclonales anteriores en los
puntos anteriores (1)-(7), en los que el fragmento retiene la
capacidad de unirse específicamente al antígeno CD40 humano.
\vskip1.000000\baselineskip
Los anticuerpos anti CD40 antagonistas dados a
conocer en el presente documento y para uso en los procedimientos
de la presente invención pueden producirse mediante cualquier
procedimiento de producción de anticuerpos conocido por los
expertos en la técnica. Por consiguiente, pueden prepararse sueros
policlonales por medio de procedimientos convencionales. En
general, primero se utiliza una disolución que contiene el antígeno
CD40 para inmunizar a un animal adecuado, de preferencia un ratón,
rata, conejo o cabra. Los conejos o cabras son de preferencia para
la preparación de sueros policlonales por el volumen de suero que
puede obtenerse y la disponibilidad de anticuerpos anti conejo y
anti cabra marcados.
Pueden prepararse sueros policlonales en un
animal transgénico, de preferencia un ratón que lleva loci de
inmunoglobulina humana. En una forma de realización de preferencia,
se usan células Sf9 que expresan CD40 como el inmunógeno. La
inmunización también puede llevarse a cabo mezclando o emulsionando
la disolución que contiene el antígeno en disolución salina, de
preferencia en un adyuvante tal como el adyuvante completo de
Freund, e inyectando por vía intravenosa la mezcla o emulsión por
vía parenteral (generalmente por vía subcutánea o intramuscular).
Típicamente es suficiente una dosis de 50-200
\mug/inyección. La inmunización se estimula por lo general
2-6 semanas más tarde con una o más inyecciones de
la proteína en disolución salina, de preferencia usando adyuvante
incompleto de Freund. Como alternativa, pueden también generarse
anticuerpos mediante inmunización in vitro usando
procedimientos conocidos en la técnica, que para los fines de esta
invención se considera equivalente a la inmunización in
vivo. Los antisueros policlonales se obtienen por extracción de
sangre de los animales inmunizados en un recipiente de vidrio o de
plástico, incubando la sangre a 25ºC durante una hora, seguido por
la incubación a 4ºC durante 2-18 horas. El suero se
recupera por centrifugación (por ejemplo, 1.000 g x durante 10
minutos). Pueden obtenerse aproximadamente 20-50 ml
por extracción de sangre de conejos...
La producción de células Sf9 (Spodoptera
frugiperda) se da a conocer en la Patente de EEUU Nº 6.004.552.
En resumen, se combinaron secuencias que codifican CD40 humano en un
baculovirus usando vectores de transferencia. Los plásmidos se
cotransfectaron con ADN de baculovirus de tipo silvestre en células
Sf9. Las células Sf9 infectadas con baculovirus recombinante se
identificaron y se purificaron como clones.
De preferencia el anticuerpo es monoclonal en la
naturaleza. Por "anticuerpo monoclonal" se entiende un
anticuerpo obtenido de una población sustancialmente homogénea de
anticuerpos, es decir, los anticuerpos individuales que comprende
la población son idénticos excepto por posible mutaciones que se
presentan naturalmente que pueden estar presentes en cantidades
menores. El término no está limitado con respecto a la especie o la
fuente del anticuerpo. El término abarca inmunoglobulinas
completas, así como fragmentos tales como Fab, F(ab')2, Fv y
otros que retienen la función de unión al antígeno del anticuerpo.
Los anticuerpos monoclonales son muy específicos, estando dirigidos
contra un único sitio antigénico, es decir, el antígeno CD40 de
superficie celular en la presente invención. Además, a diferencia
de las preparaciones de anticuerpos (policlonales) convencionales
que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra
diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal
está dirigido contra un único determinante en el antígeno. El
modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo ya
que se obtiene de una población sustancialmente homogénea de
anticuerpos, y no debe interpretarse como que es necesaria la
producción del anticuerpo por ningún procedimiento particular. Por
ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se utilizan según la
presente invención pueden obtenerse por el procedimiento de
hibridomas descrito por primera vez por Kohler y col. (1975) Nature
256: 495, o pueden producirse por los procedimientos de ADN
recombinante (véase, por ejemplo, Patente de EEUU Nº 4.816.567).
Los "anticuerpos monoclonales" pueden aislarse también de
bibliotecas de anticuerpos de fagos usando las técnicas descritas
en, por ejemplo, Clackson y col. (1991) Nature 352:
624-628; Marks y col. (1991) J Mol. Biol. 222:
581-597; y en la Patente de EEUU Nº 5.514.548.
Por "epítopo" se entiende la parte de la
molécula antigénica para la que se produce un anticuerpo y a la que
se unirá el anticuerpo. Los epítopos pueden comprender residuos
lineales de aminoácidos (es decir, los residuos en el epítopo están
organizados consecutivamente uno después de otro en forma lineal),
residuos no lineales (a los que se hace referencia en el presente
documento como "epítopos no lineales"; estos epítopos no están
organizados de forma consecutiva), o residuos de aminoácidos tanto
lineales como no lineales.
Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse
usando el procedimiento de Kohler y col. (1975) Nature 256:
495-496, o una de sus modificaciones. Típicamente,
se inmuniza un ratón con una disolución que contiene el antígeno.
La inmunización puede llevarse a cabo mezclando o emulsionando la
disolución que contiene el antígeno en disolución salina, de
preferencia en un adyuvante tal como el adyuvante completo de
Freund, e inyectando la mezcla o emulsión por vía parenteral. Puede
usarse cualquier procedimiento de inmunización conocido en la
técnica para obtener anticuerpos monoclonales de la invención. Tras
la inmunización del animal, se extirpa el bazo (y de manera
opcional, varios ganglios linfáticos grandes) y se separan las
células individuales. Las células del bazo pueden seleccionarse
aplicando una suspensión de células a una placa o pocillo recubierto
con el antígeno de interés. Las células B que expresan la
inmunoglobulina unida a membrana específica para el antígeno se
unen a la placa y no se eliminan por aclarado. A continuación se
induce la fusión de las células B resultantes, o de todas las
células separadas del bazo, con células de mieloma para formar
hibridomas, y se cultivan en un medio selectivo. Las células
resultantes se plaquean por dilución en serie y se realiza el
ensayo de producción de anticuerpos que se unen específicamente al
antígeno de interés (y que no se unen a antígenos no relacionados).
A continuación se cultivan los hibridomas que secretan el anticuerpo
monoclonal (mAb) seleccionado in vitro (por ejemplo, en
frascos de cultivo tisular o reactores de fibras huecas), o in
vivo (como ascitis en ratones).
Cuando los anticuerpos anti CD40 antagonistas de
la invención deben prepararse utilizando procedimientos de ADN
recombinante, el ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se
aísla y secuencia fácilmente usando procedimientos convencionales
(por ejemplo, mediante el uso de sondas de oligonucleótidos que son
capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas
ligeras y pesadas de anticuerpos murinos). Las células de hibridoma
descritas en el presente documento sirven como una fuente de
preferencia de tal ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en
vectores de expresión, que a continuación se transfectan en las
células huésped tales como células de E. coli, células COS de
simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de
mieloma que no producen de otra manera proteína inmunoglobulina,
para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células
huésped recombinantes. Los artículos de recopilación sobre expresión
recombinante en bacterias de ADN que codifica el anticuerpo
incluyen Skerra y col. (1993) Curr. Opinion in Immunol. 5: 256 y
Phickthun (1992) Immunol. Revs. 130: 151. Como alternativa, puede
producirse anticuerpo en una línea celular tal como una línea
celular CHO, como se da a conocer en las Patentes de EEUU Nº
5.545.403; 5.545.405; y 5.998.144. En resumen, la línea celular se
transfecta con vectores capaces de expresar una cadena ligera y una
cadena pesada, respectivamente. Transfectando las dos proteínas en
vectores separados, pueden producirse anticuerpos quiméricos. Otra
ventaja es la glicosilación correcta del anticuerpo.
En algunas formas de realización, el anticuerpo
anti CD40 antagonista, por ejemplo el anticuerpo
CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o su
fragmento de unión al antígeno se produce en células CHO usando el
sistema de expresión de genes GS (Lonza Biologics, Portsmouth, New
Hampshire), que usa glutamina sintetasa como un marcador. Véase
también las Patentes de EEUU Nº 5.122.464; 5.591.639; 5.658.759;
5.770.359; 5.827.739; 5.879.936; 5.891.693; y 5.981.216.
Los anticuerpos monoclonales contra CD40 son
conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, las secciones dedicadas
a antígenos de células B en McMichael, ed. (1987; 1989). Leukocyte
Typing III and IV (Oxford University Press, Nueva York); Patentes
de EEUU Nº 5.674.492; 5.874.082; 5.677.165; 6.056.959; documento WO
00/63395; documentos de Publicación Internacional Nº WO 02/28905 y
WO 02/28904; Gordon y col. (1988) J. Immunol. 140: 1425; Valle y
col. (1989) Eur. J. Immunol. 19: 1463; Clark y col. (1986) PNAS 83:
4494; Paulie y col. (1989) J. Immunol. 142: 590; Gordon y col.
(1987) Eur. J. Immunol. 17: 1535; Jabara y col. (1990) J. Exp. Med.
172: 1861; Zhang y col. (1991) J. Immunol. 146: 1836; Gascan y col.
(1991) J. Immunol. 147: 8; Banchereau y col. (1991) Clin. Immunol.
Spectrum 3: 8; y Banchereau y col. (1991) Science 251: 70. Son de
particular interés para la presente invención los anticuerpos anti
CD40 antagonistas dados a conocer en el presente documento que
comparten las características de unión de los anticuerpos
monoclonales CHIR-5.9 y CHIR-12.12
descritos anteriormente.
La expresión "epítopo del antígeno CD40"
según se utiliza en el presente documento se refiere a una molécula
que es capaz de tener inmunorreactividad con los anticuerpos
monoclonales anti CD40 de la presente invención, excluyendo el
propio antígeno CD40. Los epítopos del antígeno CD40 pueden
comprender proteínas, fragmentos de proteínas, péptidos, hidratos
de carbono, lípidos y otras moléculas, pero para los fines de la
presente invención son más comúnmente proteínas, oligopéptidos
cortos, miméticos de oligopéptidos (es decir, compuestos orgánicos
que imitan las propiedades de unión al anticuerpo del antígeno
CD40), o sus combinaciones. Los miméticos de oligopéptidos
adecuados se describen, entre otros, en la solicitud de PCT US
91/04282.
Además, la expresión "anticuerpo anti CD40"
según se utiliza en el presente documento abarca anticuerpos
quiméricos anti CD40; tales anticuerpos anti CD40 quiméricos para
uso en los procedimientos de la invención tienen las
características de unión de los anticuerpos monoclonales
CHIR-5.9 y CHIR-12.12 descritos en
el presente documento. Por anticuerpos "quiméricos" se
entiende que de más preferencia se obtienen usando técnicas de ácido
desoxirribonucleico recombinante y que comprenden tanto componentes
humanos (incluidas especies inmunológicamente "relacionadas",
por ejemplo, chimpancé) como no humanos. Por consiguiente, la región
constante del anticuerpo quimérico es de más preferencia
sustancialmente idéntica a la región constante de un anticuerpo
natural humano; la región variable del anticuerpo quimérico de más
preferencia se obtiene de una fuente no humana y tiene la
especificidad antigénica deseada para el antígeno CD40 de
superficie celular. La fuente no humana puede ser cualquier fuente
de vertebrado que pueda usarse para generar anticuerpos contra un
antígeno CD40 humano de superficie celular o material que comprenda
un antígeno CD40 humano de superficie celular. Tales fuentes no
humanas incluyen, pero no se limitan a, roedores (por ejemplo,
conejo, rata, ratón, etc.; véase, por ejemplo, la Patente de EEUU
Nº 4.816.567) y primates no humanos (por ejemplo, mono del viejo
mundo, simio, etc.; véase, por ejemplo, las Patentes de EEUU Nº
5.750.105 y 5.756.096). Según se usa en el presente documento, la
frase "inmunológicamente activo" cuando se usa en referencia a
anticuerpos anti CD40 quiméricos significa un anticuerpo quimérico
que se une a CD40 humano.
Los anticuerpos anti CD40 quiméricos y
humanizados también están abarcados por el término anticuerpo anti
CD40 según se utiliza en el presente documento. Los anticuerpos
quiméricos comprenden segmentos de anticuerpos obtenidos de
diferentes especies. Rituxan® es un ejemplo de un anticuerpo
quimérico con una región variable murina y una región constante
humana.
Por "humanizado" se entienden formas de
anticuerpos anti CD40 que contienen una secuencia mínima derivada
de secuencias de inmunoglobulinas no humanas. En su mayoría, los
anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo
receptor) en las que están reemplazados residuos de una región
hipervariable (también conocida como región determinante de
complementariedad o CDR) del receptor por residuos de una región
hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) tal
como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la
especificidad, afinidad y capacidad deseadas. La expresión "región
determinante de complementariedad" se refiere a las secuencias
de aminoácidos que juntas definen la afinidad y especificidad de
unión de la región Fv natural de un sitio de unión de
inmunoglobulina nativa. Véase, por ejemplo, Chothia y col. (1987) J.
Mol. Biol. 196: 901-917; Kabat y col. (1991) U.S.
Dept of Health and Human Services, Publicación NIH Nº
91-3242). La expresión "región constante" se
refiere a la parte de la molécula de anticuerpo que confiere
funciones de efector. En trabajos anteriores dirigidos a la
producción de anticuerpos no inmunogénicos para uso en terapia de
enfermedades humanas, se sustituyeron regiones constantes de ratón
por regiones constantes humanas. Las regiones constantes de los
anticuerpos humanizados del sujeto se obtuvieron de inmunoglobulinas
humanas. Sin embargo, estos anticuerpos humanizados aún provocaron
una respuesta inmune no deseada y potencialmente peligrosa en seres
humanos y hubo pérdida de afinidad. Los anticuerpos anti CD40
humanizados para uso en los procedimientos de la presente invención
tienen características de unión similares a las exhibidas por los
anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y
CHIR-12.12 descritos en el presente documento.
La humanización puede realizarse esencialmente
siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores (Jones y col.
(1986) Nature 321: 522-525; Riechmann y col. (1988)
Nature 332: 323-327; Verhoeyen y col. (1988) Science
239: 1534-1536), sustituyendo secuencias de un
anticuerpo humano por las correspondientes CDR o secuencias CDR de
roedores o roedores mutantes. Véase también las Patentes de EEUU Nº
5.225.539; 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762; 5.859.205. En algunos
casos, los residuos dentro de las regiones marco de una o más
regiones variables de la inmunoglobulina humana se reemplazan por
los correspondientes residuos no humanos (véase, por ejemplo, las
Patentes de EEUU Nº 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762; y 6.180.370).
Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que
no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo
donador. Estas modificaciones se realizan para refinar más el
rendimiento del anticuerpo (por ejemplo, para obtener la afinidad
deseada). En general, en anticuerpo humanizado comprenderá
sustancialmente todo de al menos uno, y típicamente dos, dominios
variables, en el que todas o sustancialmente todas las regiones
hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana
y todas o sustancialmente todas las regiones marco son las de una
secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado
también comprenderá opcionalmente al menos una parte de una región
constante (Fc) de inmunoglobulina, típicamente la de una
inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase Jones y col.
(1986) Nature 331: 522-525; Riechmann y col. (1988)
Nature 332: 323-329; y Presta (1992) Curr. Op.
Struct. Biol. 2:593-596. Por consiguiente, tales
anticuerpos "humanizados" pueden incluir anticuerpos en los
que sustancialmente menos de un dominio variable intacto humano se
ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no
humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente
anticuerpos humanos en los que algunos residuos de CDR y
posiblemente algunos residuos del marco están sustituidos por
residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores. Véase, por
ejemplo, las Patentes de EEUU Nº 5.225.539; 5.585.089; 5.693.761;
5.693.762; 5.859.205. Véase también la Patente de EEUU Nº 6.180.370,
y el documento de Publicación Internacional WO 01/27160, en los que
se dan a conocer anticuerpos humanizados y técnicas para producir
anticuerpos humanizados que tienen mejor afinidad para un antígeno
predeterminado.
También están abarcados por el término
anticuerpos anti CD40 los anticuerpos anti CD40 xenogénicos o
modificados producidos en un huésped mamífero no humano, más
particularmente un ratón transgénico, caracterizados por loci de
inmunoglobulina (Ig) endógena inactivados. En tales animales
transgénicos, los genes endógenos competentes para la expresión de
las subunidades ligera y pesada de las inmunoglobulinas del huésped
se convierten en no funcionales y se sustituyen con los loci
análogos de inmunoglobulina humana. Estos animales transgénicos
producen anticuerpos humanos en ausencia sustancial de subunidades
ligera o pesada de inmunoglobulina del huésped. Véase, por ejemplo,
la Patente de EEUU Nº 5.877.397 y 5.939.598.
De preferencia, los anticuerpos totalmente
humanos contra CD40 se obtienen inmunizando ratones transgénicos.
Uno de tales ratones se obtiene usando tecnología XenoMouse®
(Abgenix; Fremont, California), y se da a conocer en las Patentes
de EEUU Nº 6.075.181, 6.091.001 y 6.114.598. Para producir los
anticuerpos que se dan a conocer en el presente documento, se
inmunizaron ratones transgénicos para el locus de cadena pesada de
IgG_{1} humana y el locus de cadena ligera \kappa humana con
células Sf9 que expresan CD40 humano. Los ratones también pueden
ser transgénicos para otros isotipos. Los anticuerpos totalmente
humanos útiles en los procedimientos de la presente invención se
caracterizan por tener propiedades de unión similares a las
exhibidas por los anticuerpos monoclonales CHIR-5.9
y CHIR-12.12 descritos en el presente documento.
Los fragmentos de los anticuerpos anti CD40 son
adecuados para uso en los procedimientos de la invención siempre
que retengan la afinidad deseada del anticuerpo de longitud total.
Por consiguiente, un fragmento de un anticuerpo anti CD40 retendrá
la capacidad para unirse al antígeno CD40 de superficie de las
células B. Tales fragmentos se caracterizan por tener propiedades
similares al anticuerpo anti CD40 antagonista de longitud total
correspondiente, es decir, los fragmentos se unirán específicamente
a un antígeno CD40 humano expresado en la superficie de una célula
humana, y están exentos de actividad agonista significativa pero
exhiben actividad antagonista cuando se unen a un antígeno CD40 en
una célula humana que expresa CD40. En el presente documento se hace
referencia a estos fragmentos como fragmentos "que se unen al
antígeno".
Los fragmentos de un anticuerpo que se unen al
antígeno adecuados comprenden una parte de un anticuerpo de
longitud total, por lo general la región de unión al antígeno o una
de sus regiones variables. Los ejemplos de fragmentos de
anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab,
F(ab')_{2} y Fv y moléculas de anticuerpos de cadena
simple. Por "Fab" se entiende un fragmento monovalente de una
inmunoglobulina que se une al antígeno que está compuesto por la
cadena ligera y parte de la cadena pesada. Por F(ab')_{2}
se entiende un fragmento bivalente de una inmunoglobulina que se
une al antígeno que contiene ambas cadenas ligeras y parte de ambas
cadenas pesadas. Por "Fv de cadena simple" o fragmentos
"sFv" del anticuerpo se entiende fragmentos que comprenden los
dominios V_{H} y V_{L} de un anticuerpo, en los que estos
dominios están presentes en una cadena polipeptídica simple. Véase,
por ejemplo, las Patentes de EEUU Nº 4.946.778, 5.260.203,
5.455.030 y 5.856.456. Por lo general, el polipéptido Fv comprende
además un conector de polipéptido entre los dominios V_{H} y
V_{L} que permite al sFv formar la estructura deseada para la
unión del antígeno. Para una revisión de sFv véase Pluckthun (1994)
en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, ed.
Rosenburg and Moore (Springer-Verlag, Nueva York),
páginas 269-315. Los fragmentos de los anticuerpos
anti CD40 antagonistas que se unen al antígeno dados a conocer en
el presente documento también pueden conjugarse a una citotoxina
para producir la lisis de las células cancerosas diana, como se
describe a continuación en el presente documento.
Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos
pueden aislarse de bibliotecas de anticuerpos de fagos generadas
usando las técnicas descritas en, por ejemplo, McCafferty y col.
(1990) Nature 348: 552-554 (1990) y en la Patente
de EEUU Nº 5.514.548. Clackson y col. (1991) Nature 352:
624-628 y Marks y col. (1991) J. Mol. Biol. 222:
581-597 describen el aislamiento de anticuerpos
murinos y humanos, respectivamente, usando bibliotecas de fagos.
Publicaciones posteriores describen la producción de anticuerpos
humanos de alta afinidad (del orden de nM) por mezcla aleatoria de
cadenas (Marks y col. (1992) Biol/Technology
10:779-783), así como por infección combinatoria y
recombinación in vivo como una estrategia para construir
bibliotecas de fagos muy grandes (Waterhouse y col. (1993) Nucleic,
Acids Res. 21: 2265-2266). Por consiguiente, estas
técnicas son alternativas viables a las técnicas tradicionales de
hibridomas de anticuerpos monoclonales para el aislamiento de
anticuerpos monoclonales.
Se han desarrollado diversas técnicas para la
producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos
fragmentos se obtuvieron por digestión proteolítica de anticuerpos
intactos (véase, por ejemplo, Morimoto y col. (1992) Journal of
Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117
(1992) y Brennan y col. (1985) Science 229: 81). Sin embargo, estos
fragmentos pueden producirse ahora directamente por medio de células
huésped recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos
pueden aislarse de la biblioteca de anticuerpos de fagos analizada
anteriormente. Como alternativa, los fragmentos
Fab'-SH pueden recuperarse directamente de E.
coli y pueden acoplarse químicamente para formar fragmentos
F(ab')_{2} (Carter y col. (1992) Bio/Technology 10:
163-167). Según otro enfoque, los fragmentos
F(ab')_{2} pueden aislarse directamente del cultivo de
células huésped recombinantes. Otra técnica para la producción de
fragmentos de anticuerpos resultará evidente para el experto en la
técnica.
Los anticuerpos anti CD40 antagonistas útiles en
los procedimientos de la presente invención incluyen los
anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIR 12.12 dados
a conocer en el presente documento así como los anticuerpos que
difieren de estos anticuerpos pero que retienen las CDR; y los
anticuerpos con una o más adiciones, deleciones o sustituciones, en
los que la actividad antagonista se mide por inhibición de la
proliferación y/o diferenciación de las células B. La invención
también abarca los anticuerpos anti CD40 antagonistas
desinmunizados, que pueden producirse como se describe en, por
ejemplo, los documentos de Publicación Internacional Nº WO 98/52976
y WO 0034317. De esta manera, los residuos dentro de los
anticuerpos anti CD40 antagonistas de la invención se modifican
para convertir a los anticuerpos en no inmunogénicos o menos
inmunogénicos para los seres humanos manteniendo al mismo tiempo su
actividad antagonista hacia las células humanas que expresan CD40,
en los que tal actividad se mide por medio de los ensayos señalados
en otra parte en el presente documento. También se incluyen dentro
del alcance de las reivindicaciones las proteínas de fusión que
comprenden un anticuerpo anti CD40 antagonista de la invención, o
uno de sus fragmentos, cuyas proteínas de fusión pueden sintetizarse
o expresarse a partir de vectores de polinucleótidos
correspondientes, como se conoce en la técnica. Tales proteínas de
fusión se describen con referencia a la conjugación de anticuerpos
como se señala a continuación.
Los anticuerpos de la presente invención pueden
tener variaciones de secuencia producidas usando los procedimientos
descritos en, por ejemplo, los documentos de Publicación de Patente
Nº EP 0 983 303 Al, WO 00/34317 y WO 98/52976. Por ejemplo, se ha
mostrado que las secuencias dentro de la CDR pueden provocar que un
anticuerpo se una a MAC Clase II y desencadenar una respuesta de
células T ayudantes no deseada. Una sustitución conservadora puede
permitir que el anticuerpo retenga la actividad de unión y aún
pierda su capacidad para desencadenar una respuesta de células T no
deseada. Cualquiera de tales sustituciones conservadoras o no
conservadoras puede realizarse usando procedimientos reconocidos en
la técnica, tales como los señalados en otra parte en el presente
documento, y los anticuerpos resultantes se encontrarán dentro del
alcance de la invención. Los anticuerpos variantes pueden probarse
de manera rutinaria para verificar su actividad antagonista,
afinidad y especificidad usando los procedimientos descritos en el
presente documento.
Un anticuerpo producido por cualquiera de los
procedimientos descritos anteriormente, o cualquier otro
procedimiento no dado a conocer en el presente documento, se
encontrará dentro del alcance de esta descripción si posee al menos
una de las siguientes actividades biológicas: inhibición de la
secreción de inmunoglobulinas por las células B periféricas humanas
normales estimuladas por células T; inhibición de la supervivencia
y/o proliferación de células B periféricas humanas normales
estimuladas por células T Jurkat; inhibición de la supervivencia
y/o proliferación de células B periféricas humanas normales
estimuladas por células que expresan CD40L o ligando de CD40
soluble (sCD40L); inhibición de señales intracelulares intra
apoptóticas de "supervivencia" en cualquier célula estimulada
por sCD40L o CD40L de fase sólida; inhibición de transducción de
señal de CD40 en cualquier célula tras la unión con sCD40L o CD40L
de fase sólida; e inhibición de la proliferación de células B
neoplásicas humanas como se señala a continuación. Estos ensayos
pueden realizarse como se describe en los Ejemplos en el presente
documento. Véase también los ensayos descritos en Schultze y col.
(1998) Proc. Natl. Acad Sci. USA 92: 8200-8204;
Denton y col. (1998) Pediatr. transplant. 2: 6-15;
Evans y col. (2000) J. Immunol. 164: 688-697;
Noelle (1998) Agents Actions Suppl. 49: 17-22;
Lederman y col. (1996) Curr. Opin. Hematol. 3:
77-86; Coligan y col. (1991) Current Protocols in
Immunology 13: 12; Kwekkeboom y col. (1993) Immunology 79:
439-444; y Patentes de EEUU Nº 5.674.492 y
5.847.082.
Un ensayo representativo para detectar
anticuerpos anti CD40 antagonistas específicos para los epítopos del
antígeno CD40 identificado en el presente documento es un "ensayo
de unión competitiva". Los ensayos de unión competitiva son
ensayos serológicos en los que el desconocido se detecta y
cuantifica por su capacidad para inhibir la unión de un ligando
conocido marcado a su anticuerpo específico. Esto también se conoce
como un ensayo de inhibición competitiva. En un ensayo de unión
competitiva representativo, se precipita el polipéptido CD40
marcado por medio de anticuerpos candidato en una muestra, por
ejemplo, en combinación con anticuerpos monoclonales surgidos
contra uno o más epítopos de los anticuerpos monoclonales de la
invención. Los anticuerpos anti CD40 que reaccionan específicamente
con un epítopo de interés pueden identificarse seleccionando una
serie de anticuerpos preparados contra una proteína CD40 o fragmento
de la proteína que comprende el epítopo particular de la proteína
CD40 de interés. Por ejemplo, para CD40 humano, los epítopos de
interés incluyen epítopos que comprenden residuos de aminoácido
lineales o no lineales de la isoforma corta del CD40 humano (véase
GenBank Nº de acceso NP 690593) presentada en la Figura 12 (SEC ID
Nº 10), codificada por la secuencia presentada en la Figura 12A
(SEC ID Nº 9; véase también GenBank Nº de acceso M 152854), o de la
isoforma larga de CD40 humano (véase GenBank Nº de acceso CAA43045
y NP 001241) presentada en la Figura 12D (SEC ID Nº 12), codificada
por la secuencia presentada en la Figura 12C (SEC ID Nº 11; véase
GenBank Nº de acceso X60592 y MN 001250). Como alternativa, podrían
usarse ensayos de unión competitiva con anticuerpos anti CD40
antagonistas adecuados identificados anteriormente para seleccionar
los anticuerpos monoclonales comparables a los anticuerpos
identificados anteriormente.
Los anticuerpos utilizados en tales
inmunoensayos pueden estar marcados o no marcados. Los anticuerpos
no marcados pueden utilizarse en aglutinación; los anticuerpos
marcados pueden utilizarse en una amplia diversidad de ensayos,
usando una amplia diversidad de marcadores. La detección de la
formación de un complejo antígeno-anticuerpo entre
un anticuerpo anti CD40 y un epítopo de interés puede facilitarse
fijando una sustancia detectable al anticuerpo. Los medios de
detección adecuados incluyen el uso de marcadores como
radionúclidos, enzimas, coenzimas, fluorescentes,
quimioluminiscentes, cromógenos, complejos enzima sustrato o
cofactores, inhibidores de enzimas, complejos de grupos
prostéticos, radicales libres, partículas, colorantes y similares.
Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen la peroxidasa del rábano
picante, fosfatasa alcalina, \beta-galactosidasa o
acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos de grupos
prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y
avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes
apropiados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de
fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro
de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material fluorescente
es el luminol; los ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen
luciferasa, luciferina y aequorina; y los ejemplos de material
radiactivos adecuado incluyen ^{125}I, ^{131}I, ^{35}S o
^{3}H. Tales reactivos marcados pueden utilizarse en una
diversidad de ensayos conocidos, tales como radioinmunoensayos,
inmunoenzayos enzimáticos, por ejemplo, ELISA inmunoensayos
fluorescentes y similares. Véase, por ejemplo, Patentes de EEUU Nº
3.766.162; 3.791.932; 3.817.837; y 4.233.402.
Cualquiera de los anticuerpos anti CD40
antagonistas o sus fragmentos de anticuerpos descritos previamente
pueden conjugarse antes del uso en los procedimientos de la presente
invención. Los procedimientos para producir anticuerpos conjugados
son conocidos en la técnica. Por consiguiente, el anticuerpo anti
CD40 puede marcarse usando una marcación indirecta o un enfoque de
marcación indirecta. Por "marcación indirecta" o "enfoque de
marcación indirecta" se entiende que un agente quelante se une
covalentemente a un anticuerpo y se inserta al menos un
radionúclido en el agente quelante. Véase, por ejemplo, los agentes
quelantes y radionúclidos descritos en Srivagtava and Mease (1991)
Nucl. Med. Bio. 18: 589-603.
Los marcadores adecuados incluyen fluoróforos,
cromóforos, átomos radiactivos (especialmente ^{32}P y ^{125}I),
reactivos densos a electrones, enzimas y ligandos que tienen
parejas de unión específicas. Las enzimas se detectan normalmente
por su actividad. Por ejemplo, la peroxidasa del rábano picante se
detecta usualmente mediante su capacidad para convertir
3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) en un pigmento
azul, cuantificable con un espectrofotómetro. "Pareja de unión
específica" se refiere a una proteína capaz de unirse a una
molécula de ligando con alta especificidad, como por ejemplo en el
caso de un antígeno y un anticuerpo monoclonal específico para
éste. Otras parejas de unión específica incluyen biotina y avidina o
estreptavidina, IgG y proteína A, y las numerosas parejas de
receptor-ligando conocidas en la técnica. Debería
entenderse que la descripción anterior no pretende categorizar los
diversos marcadores en diferentes clases, ya que el mismo marcador
puede servir en varios modos diferentes. Por ejemplo, ^{125}I
puede servir como un marcador radioactivo o como un reactivo denso
en electrones. HRP puede servir como enzima o como antígeno para un
mAb. Además, pueden combinarse diversos marcadores para el efecto
deseado. Por ejemplo, los mAb y la avidina también requieren
marcadores en la práctica de esta invención: por consiguiente, puede
marcarse un mAb con biotina, y detectarse su presencia con avidina
marcada con ^{125}I, o con un mAb anti-biotina
marcado con HRP. Otras permutaciones y posibilidades serán
fácilmente evidentes para los expertos en la técnica, y se
consideran como equivalentes dentro del alcance de la presente
invención.
Como alternativa, el anticuerpo anti CD40 puede
marcarse usando "marcación directa" o un "enfoque de
marcación directa", en el que un radionúclido se fija
covalentemente a un anticuerpo (típicamente a través de un residuo
de aminoácido). Los radionúclidos de preferencia se proporcionan en
Srivagtava and Mease (1991) supra. El enfoque de marcación
indirecta es particularmente de preferencia. Véase también, por
ejemplo, los documentos de Publicación Internacional Nº WO 00/52031
y WO 00/52473, en los que se usa un conector para fijar el marcador
radiactivo a los anticuerpos; y las formas marcadas de anticuerpos
anti CD40 descritas en la Patente de EEUU Nº 6.015.542.
Además, un anticuerpo (o su fragmento) puede
conjugarse a un resto terapéutico como una citotoxina, un agente
terapéutico, iones metálicos radiactivos o radioisótopos. Una
citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que es
perjudicial para las células. Algunos ejemplos incluyen taxol,
citochalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina,
mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina,
colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracin
diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D,
1-dehidrotestosterona, glucocorticoides, procaína,
tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina, y sus análogos y
homólogos. Los agentes terapéuticos incluyen, pero no se limitan a,
antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato,
6-mercaptopurina, 6-tioguanina,
citarabina, 5-fluorouracilo decarbazina), agentes
alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucilo,
melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida,
busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y
cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino),
antraciclinas (por ejemplo, daunorrubicina (anteriormente
daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (por ejemplo,
dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina
y antramicina (AMC)) y agentes antimitóticos (por ejemplo,
vincristina y vinblastina) Los radioisótopos incluyen, pero no se
limitan a, I-131, I-123,
I-125, Y-90, Re-188,
Re-186, At-211,
Cu-67, Bi-212,
Bi-213, Pd-109,
Tc-99, In-111 y similares. Los
conjugados de la invención pueden utilizarse para modificar una
respuesta biológica determinada; no debe entenderse que el resto del
fármaco esté limitado a los agentes terapéuticos químicos clásicos.
Por ejemplo, el resto del fármaco puede ser una proteína o un
polipéptido que tenga una actividad biológica deseada. Tales
proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina tal como abrina,
ricina A, exotoxina de pseudomonas o toxina de difteria; una
proteína tal como el factor de necrosis tumoral, interferón alfa,
interferón beta, factor de crecimiento de los nervios, factor de
crecimiento derivado de las plaquetas, activador tisular del
plasminógeno, o, modificadores de respuesta biológica tales como,
por ejemplo, linfocinas, interleucina 1
("IL-1"), interleucina 2
("IL-2"), interleucina-6
("IL-6"), factor estimulador de colonias de
granulocitos y macrófagos ("GM-CSF"), factor
estimulador de colonias de granulocitos
("G-CSF") u otros factores de crecimiento.
Las técnicas para conjugar tales restos
terapéuticos a anticuerpos son bien conocidas. Véase, por ejemplo,
Amon y col. (1985) "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of
Drugs in Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies and Cancer
Therapy, ed. Reisfeld y col. (Alan R. Liss, Inc.), páginas
243-256; ed. Hellstrom y col. (1987) "Antibodies
for Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery, ed. Robinson y
col. (2ª ed; Marcel Dekker, Inc.), páginas 623-653;
Thorpe (1985) "Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer
Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological and
Clinical Applications, ed. Pinchera y col. páginas
475-506 (Editrice Kurtis, Milán, Italia, 1985);
"Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use
of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy", en Monoclonal
Antibodies for Cancer Detection and Therapy, ed. Baldwin y col.
(Academic Press, Nueva York, 1985), páginas
303-316; y Thorpe y col. (1982) Immunol. Rev. 62:
119-158.
Como alternativa, un anticuerpo puede conjugarse
a un segundo anticuerpo para formar un heteroconjugado de
anticuerpos como se describe en la Patente de EEUU Nº 4.676.980.
Además, pueden utilizarse conectores entre los marcadores y los
anticuerpos de la invención (véase Patente de EEUU Nº 4.831.175).
Los anticuerpos o sus fragmentos de unión al antígeno pueden
marcarse directamente con yodo, indio, itrio radiactivos o con otras
partículas radiactivas conocidas en la técnica (Patente de EEUU Nº
5.595.721). El tratamiento puede estar constituido por una
combinación de tratamiento con anticuerpos conjugados y no
conjugados administrados en forma simultánea o consecutiva
(documentos WO 00/52031 y WO 00/52473).
\vskip1.000000\baselineskip
En los procedimientos de la presente invención
pueden utilizarse variantes de los anticuerpos anti CD40
antagonistas biológicamente activas adecuadas. Tales variantes
retendrán las propiedades de unión deseadas del anticuerpo anti CD40
antagonista original. Por lo general, en la técnica están
disponibles procedimientos para producir variantes de
anticuerpos.
Por ejemplo, pueden prepararse variantes de
secuencias de aminoácidos de un anticuerpo anti CD40 antagonista,
por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 o
CHIR-12.12 descritos en el presente documento, por
medio de mutaciones en la secuencia de ADN clonada que codifica el
anticuerpo de interés. Los procedimientos para mutagénesis y
alteraciones de secuencias de nucleótidos son bien conocidos en la
técnica. Véase, por ejemplo, Walker and Gaastra, eds. (1983)
Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, Nueva
York); Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad Sci. USA 82:
488-492; Kunkel y col. (1987) Methods Enzymol. 154:
367-382; Sambrook y col. (1989) Molecular Cloning:
A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, Nueva York); Patente de
EEUU Nº 4.873.192; y las referencias citadas en la misma. En el
modelo de Dayhoff y col. (1978) en Atlas of Protein Sequence and
Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.) puede
encontrarse orientación para sustituciones adecuadas de aminoácidos
que no afectan la actividad biológica del polipéptido de interés.
Las sustituciones conservadoras, tales como los intercambios de un
aminoácido con otro que tiene propiedades similares, pueden ser de
preferencia. Los ejemplos de sustituciones conservadoras incluyen,
pero no se limitan a, Gly\LeftrightarrowAla,
Val\LeftrightarrowIle\LeftrightarrowLeu,
Asp\LeftrightarrowGlu, Lys\LeftrightarrowArg,
Asn\LeftrightarrowGln y
Phe\LeftrightarrowTrpo\LeftrightarrowTyr.
En la construcción de variantes del polipéptido
de interés del anticuerpo anti CD40 antagonista, las modificaciones
se realizan de manera tal que las variantes sigan teniendo la
actividad deseada, es decir, afinidad de unión similar y sean
capaces de unirse específicamente a un antígeno CD40 humano
expresado en la superficie de una célula humana y estén exentas de
actividad agonista significativa pero que exhiban actividad
antagonista cuando se unen a un antígeno CD40 en una célula humana
que expresa CD40. Obviamente, cualquier mutación realizada en el
ADN que codifica la variante polipéptido no deben colocar a la
secuencia fuera del marco de lectura y de preferencia no creará
regiones complementarias que podrían producir estructura de ARNm
secundaria. Véase Publicación de Solicitud de Patente Nº 75.444.
Además, la región constante de un anticuerpo
anti CD40 antagonista puede mutarse para alterar la función efectora
en una serie de formas. Por ejemplo, véase la Patente de EEUU Nº
6.737.056B1 y la Publicación de Solicitud de Patente Nº
2004/0132101A1, que dan a conocer mutaciones de Fc que optimizan la
unión del anticuerpo a los receptores de Fc.
De preferencia, las variantes de un anticuerpo
anti CD40 antagonista de referencia tienen secuencias de aminoácidos
que tienen al menos 70% o 75% de homología de secuencia, de
preferencia al menos 80% u 85% de homología de secuencia, de más
preferencia al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94% ó 95% de homología de
secuencia con la secuencia de aminoácidos para la molécula del
anticuerpo anti CD40 antagonista de referencia, por ejemplo, el
anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 o
CHIR-12.12 descritos en el presente documento, o con
una parte más corta de una molécula de anticuerpo de referencia. De
más preferencia, las moléculas comparten al menos 96%, 97%, 98% ó
99% de homología de secuencia. Para los fines de la presente
invención, el porcentaje de homología de secuencia se determina
usando el algoritmo de búsqueda de homología de
Smith-Waterman usando una búsqueda de huecos afines
con parámetros de penalización de hueco abierto de 12 y
penalización de extensión de hueco de 2, matriz BLOSUM de 62. El
algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman
se enseña en Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:
482-489. Una variante puede, por ejemplo, diferir
del anticuerpo anti CD40 antagonista de referencia en tan pocos
como 1 a 15 residuos de aminoácidos, tan pocos como 1 a 10 residuos
de aminoácidos, tal como 6-10, tan pocos como 5, tan
pocos como 4, 3, 2, o incluso 1 residuo de aminoácido.
Con respecto a la alineación óptima de dos
secuencias de aminoácidos, el segmento contiguo de la secuencia de
aminoácidos variante puede tener residuos de aminoácidos adicionales
o residuos de aminoácidos delecionados con respecto a la secuencia
de aminoácidos de referencia. El segmento contiguo utilizado para la
comparación con la secuencia de aminoácidos de referencia incluirá
al menos 20 residuos de aminoácidos contiguos y puede tener 30, 40,
50 o más residuos de aminoácidos. Pueden hacerse correcciones para
homología de secuencia asociadas con huecos o sustituciones
conservadoras de residuos (véase el algoritmo de búsqueda de
Smith-Waterman).
La estructura química exacta de un polipéptido
capaz de unirse específicamente a CD40 y que retiene la actividad
antagonista, en particular cuando se une al antígeno CD40 en células
B malignas, depende de una serie de factores. Como en la molécula
están presentes grupos amino y carboxilo ionizables, puede obtenerse
un polipéptido particular como una sal ácida o básica, o en forma
neutra. Todas las preparaciones que retienen su actividad biológica
cuando se colocan en condiciones ambientales adecuadas están
incluidas en la definición de anticuerpos anti CD40 antagonistas en
el presente documento. Además, puede aumentarse la secuencia de
aminoácidos principal del polipéptido por derivatización con restos
de azúcar (glicosilación) o por otras moléculas complementarias
tales como lípidos, fosfato, grupos acetilo y similares. También
puede aumentarse por conjugación con sacáridos. Ciertos aspectos de
tal aumento se realizan a través de sistemas de procesamiento
postraduccionales del huésped productor; otras de tales
modificaciones pueden introducirse in vitro. En cualquier
caso, tales modificaciones están incluidas en la definición de un
anticuerpo anti CD40 usada en el presente documento siempre que no
se destruyan las propiedades de antagonista del anticuerpo anti
CD40. Se espera que tales modificaciones puedan afectar
cuantitativamente o cualitativamente la actividad, ya sea aumentando
o disminuyendo la actividad del polipéptido, en los diversos
ensayos. Además, pueden modificarse residuos de aminoácidos
individuales en la cadena por oxidación, reducción u otra
derivatización, y el polipéptido puede escindirse para obtener
fragmentos que retengan la actividad. Tales alteraciones que no
destruyen la actividad antagonista no retiran a la secuencia del
polipéptido de la definición de anticuerpos anti CD40 de interés
según se utiliza en el presente documento.
La técnica proporciona orientación sustancial
con respecto a la preparación y al uso de las variantes de
polipéptidos. En la preparación de las variantes de anticuerpos
anti CD40, un experto en la técnica puede determinar fácilmente qué
modificaciones a la secuencia de nucleótidos o aminoácidos de la
proteína nativa darán como resultado una variante que sea adecuada
para uso como un componente terapéuticamente activo de una
composición farmacéutica utilizada en los procedimientos dados a
conocer en el presente documento.
\vskip1.000000\baselineskip
Los procedimientos dados a conocer en el
presente documento están dirigidos al uso de anticuerpos anti CD40
antagonistas para tratar pacientes que tienen una enfermedad mediada
por la estimulación de señales de CD40 en células que expresan
CD40. Por "células que expresan CD40" se entiende las células B
normales o malignas que expresan el antígeno CD40. Los
procedimientos para detectar la expresión de CD40 en células son muy
conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, técnicas
de PCR, inmunohistoquímica, citometría de flujo, transferencia
Western, ELISA y similares. Por célula B "maligna" se entiende
cualquier célula B neoplásica, incluidas, pero no limitadas a,
células B derivadas de linfomas incluidos los linfomas de células B
de grado bajo, intermedio y alto, linfomas inmunoblásticos,
linfomas no Hodgkin, enfermedad de Hodgkin, linfomas inducidos por
el virus de Epstein Barr (EBV) y linfomas relacionados con el SIDA,
así como leucemias agudas de células B, mielomas, leucemias
linfocíticas crónicas, leucemias mieloblásticas agudas, y
similares.
En el presente documento se define
"tratamiento" como la aplicación o administración de un
anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al
antígeno a un paciente, o la aplicación o administración de un
anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento a un tejido aislado
o línea celular de un paciente, en el caso de un paciente que tiene
una enfermedad, un síntoma de una enfermedad o una predisposición
hacia una enfermedad, siendo el objetivo curar, sanar, calmar,
aliviar, alterar, remediar, mejorar o afectar la enfermedad, los
síntomas de la enfermedad o la predisposición hacia la enfermedad.
Por "tratamiento" también se entiende la aplicación o
administración de una composición farmacéutica que comprende el
anticuerpo anti CD40 antagonista o sus fragmentos a un paciente, o
la aplicación o administración de una composición farmacéutica que
comprende los anticuerpos anti CD40 o sus fragmentos a un tejido
aislado o una línea celular de un paciente, que tiene una
enfermedad, un síntoma de una enfermedad o una predisposición hacia
una enfermedad, siendo el objetivo curar, sanar, calmar, aliviar,
alterar, remediar, mejorar o afectar la enfermedad, los síntomas de
la enfermedad o la predisposición hacia la enfermedad.
Se entiende por "actividad antitumoral" una
reducción en la tasa de proliferación o acumulación de células
malignas que expresan CD40, y por consiguiente un descenso en la
tasa de crecimiento de un tumor existente o en un tumor que surge
durante la terapia, y/o la destrucción de células neoplásicas
(tumor) existentes o células neoplásicas formadas nuevas, y por
consiguiente un descenso en el tamaño global de un tumor durante la
terapia. La terapia con al menos un anticuerpo anti CD40 (o su
fragmento de unión al antígeno) provoca una respuesta fisiológica
que es ventajosa con respecto al tratamiento de estados de
enfermedad asociados con la estimulación de las señales de CD40 en
células que expresan CD40 en un ser humano.
Los procedimientos dados a conocer en el
presente documento encuentran utilidad en el tratamiento de linfomas
no Hodgkin relacionados con la proliferación o acumulación anormal,
incontrolable de células B. Para los fines de la presente
descripción, se hará referencia a tales linfomas según el esquema de
clasificación de Working Formulation, es decir los linfomas
de células B categorizados como grado bajo, grado intermedio y grado
alto (véase "The Non-Hodgkin's Lymphoma
Pathologic Classification Project", Cancer 49 (1982):
2112-2135). Por consiguiente, los linfomas de
células B de grado bajo incluyen los linfomas linfocíticos de
células pequeñas, linfomas foliculares de células pequeñas hendidas
y linfomas foliculares mixtos de células pequeñas hendidas y
grandes; los linfomas de grado intermedio incluyen los linfomas
foliculares de células grandes, linfomas difusos de células
pequeñas hendidas, linfomas difusos mixtos de células pequeñas y
grandes y linfomas difusos de células grandes; y los linfomas de
grado alto incluyen los linfomas inmunoblásticos de células grandes,
linfomas linfoblásticos y linfomas de células pequeñas no hendidas
del tipo Burkitt y no Burkitt.
Se sabe que los procedimientos dados a conocer
en el presente documento son útiles en el tratamiento terapéutico
de linfomas de células B que se clasifican según el sistema Revised
European and American Lymphoma Classification (REAL). Tales
linfomas de células B incluyen, pero no se limitan a, linfomas
clasificados como neoplasias de células B precursoras, tales como
leucemia/linfoma linfoblástico de células B; neoplasias de células B
periféricas, incluidos la leucemia linfocítica crónica de células
B/linfoma linfocítico de células pequeñas, linfoma
linfoplasmacitoide/inmunocitoma, linfoma de células del manto (MCL),
linfoma centrofolicular (folicular) (incluidos los linfomas difuso
de células pequeñas, difuso mixto de células grandes y pequeñas y
difuso de células grandes), el linfoma marginal de células B
(incluidos los tipos extranodal, nodal y esplénico), la leucemia de
células vellosas, el plasmacitoma/mieloma, el linfoma difuso de
células B grandes del subtipo mediastínicoprimario (tímico), el
linfoma de Burkitt y el linfoma de Burkitt de grado alto de células
B; leucemias agudas; leucemia linfocítica aguda; leucemias
mieloblásticas; leucemias mielocíticas agudas; leucemia
promielocítica; leucemia mielomonocítica; leucemia monocítica;
eritroleucemia; leucemiagranulocítica (leucemia mielocítica
crónica); leucemia linfocítica crónica; policitemia vera; mieloma
múltiple; macroglobulinemia de Waldenstrom; enfermedad de las
cadenas pesadas; y linfomas de células B de grado bajo o grado alto
no clasificables.
Se reconoce que los procedimientos dados a
conocer en el presente documento pueden ser útiles para prevenir
otras consecuencias del tumor surgidas durante la terapia. Los
procedimientos dados a conocer en el presente documento son
particularmente útiles en el tratamiento de sujetos que tienen
linfomas de células B de grado bajo, en particular los sujetos que
tienen recaídas tras someterse a quimioterapia convencional. Los
linfomas de células B de grado bajo tienen un desarrollo más lento
que los linfomas de células B de grado intermedio y alto y se
caracterizan por un curso de recaída/remisión. Por consiguiente, el
tratamiento de estos linfomas mejora usando los procedimientos
dados a conocer en el presente documento, ya que los episodios de
recaída se reducen en cantidad y gravedad.
Los anticuerpos anti CD40 antagonistas descritos
en el presente documento también pueden encontrar utilidad en el
tratamiento de enfermedades inflamatorias y deficiencias o
trastornos del sistema inmunitario, incluyendo, pero no limitadas
a, lupus eritematoso sistémico, psoriasis, esclerodermia, síndrome
CREST, miositis inflamatoria, síndrome de Sjogren, enfermedad mixta
del tejido conectivo, artritis reumatoide, esclerosis múltiple,
enfermedad inflamatoria intestinal, síndrome de insuficiencia
respiratoria aguda, inflamación pulmonar, fibrosis pulmonar
idiopática, osteoporosis, hipersensibilidad de tipo retardada, asma,
cirrosis biliar primaria y púrpura trombocitopénica idiopática.
De conformidad con los procedimientos dados a
conocer en el presente documento, al menos un anticuerpo anti CD40
antagonista (o su fragmento de unión al antígeno) tal como se define
en otras partes en el presente documento se utiliza para promover
una respuesta terapéutica positiva con respecto a la célula B humana
maligna. Por "respuesta terapéutica positiva" con respecto al
tratamiento del cáncer se entiende una mejora en la enfermedad
asociada con la actividad antitumoral de estos anticuerpos o sus
fragmentos, y/o una mejora en los síntomas asociados con la
enfermedad. Es decir, puede observarse un efecto antiproliferativo,
prevención de otras consecuencias del tumor, una reducción del
tamaño del tumor, una reducción en la cantidad de células cancerosas
y/o una disminución en uno o más síntomas mediados por la
estimulación de las células que expresan CD40. Por consiguiente,
por ejemplo, una mejora de la enfermedad puede ser caracterizada
como una respuesta completa. Por "respuesta completa" se
entiende la ausencia de enfermedad clínicamente detectable con
normalización de cualquier estudio radiográfico, de médula ósea y
de líquido cefalorraquídeo (LCR), previamente anormal. Tal respuesta
debe persistir durante al menos un mes después del tratamiento
según los procedimientos dados a conocer en el presente documento.
Como alternativa, una mejora en la enfermedad puede clasificarse
como una respuesta parcial. Por "respuesta parcial" se
entiende una disminución de al menos el 50% en todas las cargas
tumorales que pueden medirse (es decir, la cantidad de células
tumorales presentes en el sujeto) en ausencia de nuevas lesiones y
que persiste durante al menos un mes. Tal respuesta es aplicable
sólo a los tumores que pueden medirse.
\newpage
La respuesta del tumor puede evaluarse para
cambios en la morfología del tumor (es decir, carga general del
tumor, tamaño del tumor y similares) utilizando técnicas de
detección tales como la exploración de imágenes de resonancia
magnética (RM), imágenes de rayos x, exploración por tomografía
computerizada (TC), imágenes bioluminiscentes, por ejemplo,
imágenes con luciferasa, imágenes de gammagrafía ósea y recogida de
muestras de biopsias de tumor incluyendo la aspiración de médula
ósea (AMO). Además de estas respuestas terapéuticas positivas, el
sujeto que se somete a terapia con el anticuerpo anti CD40
antagonista o su fragmento de unión al antígeno puede experimentar
el efecto ventajoso de una mejora en los síntomas asociados con la
enfermedad. Por consiguiente, para los tumores de células B, el
sujeto puede experimentar una disminución en los llamados síntomas
B, es decir, los sudores nocturnos, la fiebre, la pérdida de peso
y/o urticaria.
Por "dosis o cantidad terapéuticamente
eficaz" o "cantidad eficaz" se entiende una cantidad de
anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al
anticuerpo que, cuando se administra da lugar a una respuesta
terapéutica positiva con respecto al tratamiento de un paciente con
una enfermedad que comprende la estimulación de las células que
expresan CD40. En algunas formas de realización, una dosis
terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti CD40 o su fragmento
está en el intervalo desde aproximadamente 0,01 mg/kg hasta
aproximadamente 40 mg/kg, desde aproximadamente 0,01 mg/kg hasta
aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 0,1 mg/kg hasta
aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 1 mg/kg hasta
aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 3 mg/kg hasta
aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 3 mg/kg hasta
aproximadamente 25 mg/kg, desde aproximadamente 3 mg/kg hasta
aproximadamente 20 mg/kg, desde aproximadamente 5 mg/kg hasta
aproximadamente 15 mg/kg, o desde aproximadamente 7 mg/kg hasta
aproximadamente 12 mg/kg. Se reconoce que el procedimiento de
tratamiento puede comprender una única administración de una dosis
terapéuticamente eficaz o múltiples administraciones de una dosis
terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti CD40 antagonista o su
fragmento de unión al antígeno.
Otra forma de realización de la descripción es
el uso de anticuerpos anti CD40 antagonistas para el control de
diagnóstico de los niveles proteicos en el tejido como parte de un
procedimiento de pruebas clínicas, por ejemplo, para determinar la
eficacia de un régimen de tratamiento dado. La detección puede
facilitarse por el acoplamiento del anticuerpo a una sustancia
detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen
diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes,
materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes y materiales
radiactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen la
peroxidasa del rábano picante, la fosfatasa alcalina, la
\beta-galactosidasa o la acetilcolinesterasa; los
ejemplos de complejos de grupos prostético adecuados incluyen
estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales
fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína,
isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina
fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un
material fluorescente incluye el luminol; los ejemplos de
materiales bioluminiscentes incluyen la luciferasa, luciferina y
aequorina; y los ejemplos de materiales radiactivos adecuados
incluyen ^{125}I, ^{131}I ^{35}S o ^{3}H.
Los anticuerpos anti CD40 descritos en el
presente documento pueden usarse también para proporcionar
reactivos, por ejemplo, anticuerpos marcados que pueden usarse, por
ejemplo, para identificar células que expresan CD40. Esto puede ser
muy útil para determinar el tipo celular de una muestra desconocida.
Los paneles de anticuerpos monoclonales pueden usarse para
identificar tejidos por especies y/o tipo de órgano. De manera
similar, estos anticuerpos anti CD40 pueden usarse para seleccionar
células de cultivos tisulares para contaminación (es decir, para
seleccionar la presencia de una mezcla de células que expresan CD40
y que no expresan CD40 en un cultivo).
Los anticuerpos anti CD40 antagonistas pueden
usarse en combinación con quimioterapéuticos y citocinas conocidos
para el tratamiento de estados de enfermedad que comprenden células
que expresan CD40 estimuladas. Por ejemplo, los anticuerpos anti
CD40 de la invención pueden usarse en combinación con citocinas
tales como interleucina 2. En otra forma de realización, los
anticuerpos anti CD40 de la invención pueden usarse en combinación
con rituximab (IDEC-C2B8; Rituxan®; IDEC
Pharmaceuticals Corp., San Diego, California).
De esta manera, los anticuerpos anti CD40
antagonistas descritos en el presente documento, o sus fragmentos
de unión al antígeno, se administran en combinación con al menos
otra terapia contra el cáncer, incluidas, pero no limitadas a,
cirugía o procedimientos quirúrgicos (por ejemplo, esplenectomía,
hepatectomía, linfadenectomía, leucoforesis, transplante de médula
ósea, y similares); terapia de radiación; quimioterapia,
opcionalmente en combinación con transplante autólogo de médula
ósea, en las que los agentes quimioterapéuticos adecuados incluyen,
pero no se limitan a, fludarabina o fosfato de fludarabina,
clorambucilo, vincristina, pentostatina,
2-clorodesoxiadenosina (cladribina), ciclofosfamida,
doxorubicina, prednisona, y sus combinaciones, por ejemplo,
regímenes que contienen antraciclina tales como CAP (ciclofosfamida,
doxorubicina más prednisona), CHOP (ciclofosfamida, vincristina,
prednisona más doxorubicina), VAD (vincritsina, doxorubicina, más
dexametasona), MP (melfalán más prednisona), y otros agentes
citotóxicos y/o terapéuticos usados en quimioterapia tales como
mitoxantrona, daunorubicina, idarubicina, asparaginasa, y
antimetabolitos, incluidos, pero no limitados a, citarabina,
metotrexato, 5-fluorouracilo decarbazina,
6-tioguanina, 6-mercaptopurina y
nelarabina; otra terapia anticancerosa con anticuerpos monoclonales
(por ejemplo, alemtuzumab (Campath®) u otro anticuerpo anti CD52
dirigido a la glicoproteína de superficie celular CD52 en células B
malignas; rituximab (Rituxan®), el anticuerpo
HuMax-CD20 totalmente humano,
R-1594, IMMU-106,
TRU-015, AME-133,
tositumomab/I-131 tositumomab (Bexxar®), ibritumomab
tiuxetan (Zevalin®), o cualquier otro anticuerpo anti CD20
terapéutico dirigido al antígeno CD20 en células B malignas;
anticuerpo anti CD19 (por ejemplo, MT103, un anticuerpo
biespecífico); anticuerpo anti CD22 (por ejemplo, el anticuerpo
monoclonal humanizado epratuzumab); bevacizumab (Avastin®) u otro
anticuerpo anticanceroso dirigido al factor de crecimiento vascular
endotelial humano; anticuerpo anti CD22 dirigido al antígeno CD22 en
células B malignas (por ejemplo, el anticuerpo monoclonal
BL-22, una toxina alfaCD22); anticuerpo
\alpha-M-CSF dirigido al factor
estimulante de colonias de macrófagos; anticuerpos dirigidos al
activador del receptor del factor kappaB nuclear (RANK) y su
ligando (RANKL), que se sobreexpresan en el mieloma múltiple;
anticuerpo anti CD23 dirigido al antígeno CD23 en células B
malignas (por ejemplo, IDEC-152); anticuerpo anti
CD80 dirigido al antígeno CD80 (por ejemplo,
IDEC-114); anticuerpo anti CD38 dirigido al antígeno
CD38 en células B malignas; anticuerpos dirigidos a los receptores
del complejo mayor de histocompatibilidad clase II (anticuerpos anti
MHC) expresados en células B malignas; otros anticuerpos anti CD40
(por ejemplo, SGN-40) dirigidos al antígeno CD40 en
células B malignas; y anticuerpos dirigidos al receptor 1 del
ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis
tumoral (TRAIL-R1) (por ejemplo, el anticuerpo
monoclonal agonista humano HGS-ETR1) y
TRAIL-R2 expresado en una cantidad de tumores
sólidos y tumores de origen hematopoyético); terapia del cáncer
basada en moléculas pequeñas, incluidos, pero no limitados a,
inhibidores de microtúbulos y/o topoisomerasa (por ejemplo, el
inhibidor mitótico dolastatina y análogos de dolastatina; el agente
de unión a tubulina T900607; XL119; y el inhibidor de la
topoisomerasa aminocamptotecina), SDX-105
(clorhidrato de bendamustina), ixabepilona (un análogo de
epotilona, también llamado BMS-247550), inhibidores
de proteincinasa C, por ejemplo, midostaurina
((PKC-412, CGP 41251,
N-benzoilstaurosporina), pixantrona, eloxatina (un
agente antineoplásico), ganite (nitrato de galio), Thalomid®
(talidomida), derivados inmunomoduladores de la talidomida (por
ejemplo, revlimid (anteriormente revimid)), Affinitak^{TM}
(inhibidor antisentido de proteincinasa C-alfa),
SDX-101 (R-etodolac, que induce la
apoptosis de linfocitos malignos), análogos de nucleósidos purina de
segunda generación tales como clofarabina, inhibidores de la
producción de la proteína Bcl-2 por células
cancerosas (por ejemplo, los agentes antisentido oblimersen y
Genasense®), inhibidores de proteasoma (por ejemplo, Velcade^{TM}
(bortezomib)), inhibidores de cinasas de molécula pequeña (por
ejemplo, CHIR-258), inhibidores de VEGF de molécula
pequeña (por ejemplo, ZD-6474), inhibidores de la
proteína del choque térmico (HSP) 90 de molécula pequeña (por
ejemplo, 17-AAG), agentes inhibidores de
desacetilasas de histonas de molécula pequeña (por ejemplo, HPC
híbrido/polar de citodiferenciación) tales como ácido
suberanilohidroxámico (SAHA), y FR-901228 y agentes
apoptóticos tales como Trisenox® (trióxido de arsénico) y Xcytrin®
(motexafina gadolinio); terapias contra el cáncer basadas en
vacunas/inmunoterapia, incluidas, pero no limitadas a, enfoques de
vacunas (por ejemplo, Id-KLH, oncofago, vitaletina),
inmunoterapia personalizada o inmunoterapia activa de idiotipo (por
ejemplo, MyVax® Personalized Immunotherapy, denominada formalmente
GTOP-99), Promune® (CpG 7909, un agonista sintético
para el receptor de tipo toll 9 (TLR9)), terapia con interferón
alfa, terapia con interleucina 2 (IL-2), terapia con
IL-12, terapia con IL-15 y terapia
con IL-21; terapia con esteroides; u otra terapia
contra el cáncer; en las que la terapia anticancerosa adicional se
administra antes de, durante, o posteriormente a la terapia con el
anticuerpo anti CD40 antagonista. Por consiguiente, cuando las
terapias combinadas comprenden la administración de un anticuerpo
anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno en
combinación con la administración de otro agente terapéutico, como
con quimioterapia, terapia de radiación, otra terapia anticancerosa
con anticuerpos, terapia contra el cáncer basada en moléculas
pequeñas, o terapia contra el cáncer basada en
vacunas/inmunoterapia, los procedimientos dados a conocer en el
presente documento abarcan la coadministración, usando formulaciones
separadas de una formulación farmacéutica única, y/o la
administración consecutiva en cualquier orden. Cuando los
procedimientos dados a conocer en el presente documento comprenden
regímenes terapéuticos combinados, estas terapias pueden darse de
manera simultánea, es decir, el anticuerpo anti CD40 antagonista o
su fragmento de unión al antígeno se administra simultáneamente o
dentro del mismo período de tiempo que la otra terapia contra el
cáncer (es decir, las terapias tienen lugar simultáneamente, pero
el anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al
antígeno no se administra precisamente en el mismo momento que la
otra terapia contra el cáncer). Como alternativa, el anticuerpo
anti CD40 antagonista de la presente invención o su fragmento de
unión al antígeno puede también administrarse antes de, o
posteriormente a la otra terapia contra el cáncer. La administración
secuencial de las diferentes terapias contra el cáncer puede
realizarse independientemente de que el sujeto tratado responda al
primer curso de terapia para disminuir la posibilidad de remisión o
recaída. Cuando las terapias combinadas comprenden la
administración de un agente citotóxico, de preferencia el anticuerpo
anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno se
administra antes de administrar el agente citotóxico.
En algunas formas de realización de la
invención, los anticuerpos anti CD40 antagonistas descritos en el
presente documento, o sus fragmentos de unión al antígeno, se
administran en combinación con quimioterapia, y opcionalmente en
combinación con transplante autólogo de médula ósea, en las que el
anticuerpo y el(los) agente(s) quimioterapéuticos
pueden administrarse de manera secuencial, en cualquier orden, o
simultáneamente (es decir, de manera simultánea o dentro del mismo
período de tiempo). Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos
adecuados incluyen, pero no se limitan a, fludarabina o fosfato de
fludarabina, clorambucilo, vincristina, pentostatina,
2-clorodesoxiadenosina (cladribina),
ciclofosfamida, doxorubicina, prednisona, y sus combinaciones, por
ejemplo, regímenes que contienen antraciclina tales como CAP
(ciclofosfamida, doxorubicina más prednisona), CHOP (ciclofosfamida,
vincristina, prednisona más doxorubicina), VAD (vincritsina,
doxorubicina, más dexametasona), MP (melfalán más prednisona), y
otros agentes citotóxicos y/o terapéuticos usados en quimioterapia
tales como mitoxantrona, daunorubicina, idarubicina, asparaginasa,
y antimetabolitos, incluidos, pero no limitados a, citarabina,
metotrexato, 5-fluorouracilo decarbazina,
6-tioguanina, 6-mercaptopurina y
nelarabina. En algunas formas de realización, el anticuerpo anti
CD40 antagonista, por ejemplo el anticuerpo monoclonal
CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o uno de sus
fragmentos de unión al antígeno se administra antes del tratamiento
con el agente quimioterapéutico. En formas de realización
alternativas, el anticuerpo anti CD40 antagonista se administra
después del tratamiento con el agente quimioterapéutico. En aún
otras formas de realización, el agente quimioterapéutico se
administra de manera simultánea con el anticuerpo anti CD40
antagonista o su fragmento de unión al antígeno.
Por consiguiente, por ejemplo, en algunas formas
de realización, el anticuerpo anti CD40 antagonista, por ejemplo el
anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o
CH1R-5.9, o su fragmento de unión al antígeno se
administra en combinación con fludarabina o fosfato de fludarabina.
En una de tales formas de realización, el anticuerpo anti CD40
antagonista o su fragmento de unión al antígeno se administra antes
de la administración de fludarabina o fosfato de fludarabina. En
formas de realización alternativas, el anticuerpo anti CD40
antagonista o su fragmento de unión al antígeno se administra
después del tratamiento con fludarabina o fosfato de fludarabina.
En aún otras formas de realización, la fludarabina o el fosfato de
fludarabina se administra de manera simultánea con el anticuerpo
anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno.
En otras formas de realización de la invención,
se administra clorambucilo, un agente alquilante, en combinación
con el anticuerpo anti CD40 antagonista descrito en el presente
documento, por ejemplo el anticuerpo monoclonal CHIR 12.12 o
CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno. En
una de tales formas de realización, el anticuerpo anti CD40
antagonista o su fragmento de unión al antígeno se administra antes
de la administración del clorambucilo. En formas de realización
alternativas, el anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de
unión al antígeno se administra después del tratamiento con
clorambucilo. En aún otras formas de realización, el clorambucilo se
administra de manera simultánea con el anticuerpo anti CD40
antagonista o su fragmento de unión al antígeno.
En aún otras formas de realización, pueden
combinarse regímenes que contienen antraciclina tales como CAP
(ciclofosfamida, doxorubicina más prednisona) y CHOP
(ciclofosfamida, vincristina, prednisona más doxorubicina) con la
administración de un anticuerpo anti CD40 antagonista descrito en el
presente documento, por ejemplo el anticuerpo monoclonal CHIR 12.12
o CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno. En
una de tales formas de realización, el anticuerpo anti CD40
antagonista o su fragmento de unión al antígeno se administra antes
de la administración de los regímenes que contienen antraciclina. En
otras formas de realización, el anticuerpo anti CD40 antagonista o
su fragmento de unión al antígeno se administra después del
tratamiento con regímenes que contienen antraciclina. En aún otras
formas de realización, el régimen que contiene antraciclina se
administra de manera simultánea con el anticuerpo anti CD40
antagonista o su fragmento de unión al antígeno.
En formas de realización alternativas, un
anticuerpo anti CD40 antagonista descrito en el presente documento,
por ejemplo el anticuerpo monoclonal CHIR 12.12 o
CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno, se
administra en combinación con alemtuzumab (Campath®; distribuido
por Berlex Laboratories, Richmond, California). Alemtuzumab es un
anticuerpo monoclonal recombinante humanizado
(Campath-1H) que está dirigido al antígeno CD52
expresado en células B malignas. En una de tales formas de
realización, el anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de
unión al antígeno se administra antes de la administración de
alemtuzumab. En otras formas de realización, el anticuerpo anti
CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno se administra
después del tratamiento con alemtuzumab. En aún otras formas de
realización, el alemtuzumab se administra de manera simultánea con
el anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al
antígeno.
En formas de realización alternativas, un
anticuerpo anti CD40 antagonista descrito en el presente documento,
por ejemplo el anticuerpo monoclonal CHIR 12.12 o
CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno, se
administra en combinación con un anticuerpo anti CD20 terapéutico
dirigido al antígeno CD20 en células B malignas, por ejemplo,
rituximab (Rituxan®), el anticuerpo totalmente humano
HuMax-CD20, R-1594,
IMMU-106, TRU-015,
AME-133, tositumomab/I-131
tositumomab (Bexxar®), o ibritumomab tiuxetan (Zevalin®). En una de
tales formas de realización, el anticuerpo anti CD40 antagonista o
su fragmento de unión al antígeno se administra antes de la
administración del anticuerpo anti CD20. En otras formas de
realización, el anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de
unión al antígeno se administra después del tratamiento con el
anticuerpo anti CD20. En aún otras formas de realización, el
anticuerpo anti CD20 se administra de manera simultánea con el
anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al
antígeno.
En formas de realización alternativas, un
anticuerpo anti CD40 antagonista descrito en el presente documento,
por ejemplo el anticuerpo monoclonal CHIR 12.12 o
CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno, se
administra en combinación con una terapia contra el cáncer basada
en moléculas pequeñas, incluidas, pero no limitadas a, inhibidores
de microtúbulos y/i topoisomerasa (por ejemplo, el inhibidor
mitótico dolastatina y análogos de dolastatina; el agente de unión
a tubulina T900607; XL119; y el inhibidor de la topoisomerasa
aminocamptotecina), SDX-105 (clorhidrato de
bendamustina), ixabepilona (un análogo de epotilona, también llamado
BMS-247550), inhibidores de proteincinasa C, por
ejemplo, midostaurina ((PKC-412, CGP 41251,
N-benzoilstaurosporina), pixantrona, eloxatina (un
agente antineoplásico), ganite (nitrato de galio), Thalomid®
(talidomida), derivados inmunomoduladores de la talidomida (por
ejemplo, revlimid (anteriormente revimid)), Affinitak^{TM}
(inhibidor antisentido de proteincinasa C-alfa),
SDX-101 (R-etodolac, que induce la
apoptosis de linfocitos malignos), análogos de nucleósidos purina
de segunda generación tales como clofarabina, inhibidores de la
producción de la proteína Bcl-2 por células
cancerosas (por ejemplo, los agentes antisentido oblimersen y
Genasense®), inhibidores de proteasoma (por ejemplo, Velcade^{TM}
(bortezomib)), inhibidores de cinasas de molécula pequeña (por
ejemplo, CHIR-258), inhibidores de VEGF de molécula
pequeña (por ejemplo, ZD-6474), inhibidores de la
proteína del choque térmico (HSP) 90 de molécula pequeña (por
ejemplo, 17-AAG), agentes inhibidores de
desacetilasas de histonas de molécula pequeña (por ejemplo, HPC
híbrido/polar de citodiferenciación) tales como ácido
suberanilohidroxámico (SAHA), y FR-901228 y agentes
apoptóticos tales como Trisenox® (trióxido de arsénico) y Xcytrin®
(motexafina gadolinio). En una de tales formas de realización, el
anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al
antígeno se administra antes de la terapia contra el cáncer basada
en moléculas pequeñas. En otras formas de realización, el
anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno
se administra después de la terapia contra el cáncer basada en
moléculas pequeñas. En aún otras formas de realización, la terapia
contra el cáncer basada en moléculas pequeñas se administra de
manera simultánea con el anticuerpo anti CD40 antagonista o su
fragmento de unión al antígeno.
En aún otras formas de realización, un
anticuerpo anti CD40 antagonista descrito en el presente documento,
por ejemplo el anticuerpo monoclonal CHIR 12.12 o
CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno, puede
usarse en combinación con una terapia contra el cáncer basada en
vacunas/inmunoterapia, incluidas, pero no limitadas a, enfoques de
vacunas (por ejemplo, Id-KLH, oncofago, vitaletina),
inmunoterapia personalizada o inmunoterapia activa de idiotipo (por
ejemplo, MyVax® Personalized Immunotherapy, denominada formalmente
GTOP-99), Promune® (CpG 7909, un agonista sintético
para el receptor de tipo toll 9 (TLR9)), terapia con interferón
alfa, terapia con interleucina 2 (IL-2), terapia
con IL-12, terapia con IL-15 y
terapia con IL-21; o terapia con esteroides. En una
de tales formas de realización, el anticuerpo anti CD40 antagonista
o su fragmento de unión al antígeno se administra antes de la
administración de la terapia contra el cáncer basada en
vacunas/inmunoterapia. En otras formas de realización, el
anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno
se administra después del tratamiento con la terapia contra el
cáncer basada en vacunas/inmunoterapia. En aún otras formas de
realización, la terapia contra el cáncer basada en
vacunas/inmunoterapia se administra de manera simultánea con el
anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al
antígeno.
En una de tales formas de realización, un
anticuerpo anti CD40 antagonista descrito en el presente documento,
por ejemplo el anticuerpo monoclonal CHIR 12.12 o
CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno, puede
usarse en combinación con IL-2.
IL-2, un agente que se sabe que aumenta la cantidad
de células efectoras citolíticas naturales (NK) en los pacientes
tratados, puede administrarse antes de, o conjuntamente con, el
anticuerpo anti CD40 antagonista de la invención o su fragmento de
unión al antígeno. Esta cantidad aumentada de células NK efectoras
puede dar lugar a mayor actividad ADCC del anticuerpo anti CD40
antagonista o su fragmento de unión al antígeno administrado. En
otras formas de realización, IL-21 sirve como el
agente inmunoterapéutico para estimular la actividad de las células
NK cuando se administra en combinación con el anticuerpo anti CD40
antagonista descrito en el presente documento, por ejemplo, el
anticuerpo monoclonal CHIR 12.12 o CHIR-5.9, o su
fragmento de unión al antígeno.
Además, también puede usarse terapia de
combinación con dos o más agentes terapéuticos y un anticuerpo anti
CD40 descrito en el presente documento para el tratamiento de
estados de enfermedad que comprenden células que expresan CD40
estimuladas, por ejemplo cánceres relacionados con células B, y
trastornos autoinmunes y/o inflamatorios. Sin estar limitados, los
ejemplos incluyen la terapia de combinación triple, en la que dos
agentes quimioterapéuticos se administran en combinación con un
anticuerpo anti CD40 antagonista descrito en el presente documento,
y en la que un agente terapéutico y otro anticuerpo monoclonal
anticanceroso (por ejemplo, alemtuzumab, rituximab, o anticuerpo
anti CD23) se administran en combinación con un anticuerpo anti
CD40 antagonista descrito en el presente documento. Los ejemplos de
tales combinaciones incluyen, pero no se limitan a, combinaciones
de fludarabina, ciclofosfamida, y el anticuerpo anti CD40
antagonista, por ejemplo el anticuerpo monoclonal CHIR 12.12 o
CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno; y
combinaciones de fludarabina, un anticuerpo anti CD20, por ejemplo,
rituximab (Rituxan®; IDEC Pharmaceuticals Corp., San Diego,
California), y el anticuerpo anti CD40 antagonista, por ejemplo, el
anticuerpo monoclonal CHIR 12.12 o CHIR-5.9, o su
fragmento de unión al antígeno.
\vskip1.000000\baselineskip
Los anticuerpos anti CD40 antagonistas de esta
invención se administran en una concentración que es
terapéuticamente eficaz para prevenir o tratar enfermedades
mediadas por células que expresan CD40 tales como SLE, PBC, ITP,
esclerosis múltiple, psoriasis, enfermedad de Crohn, rechazo de
injertos, y linfoma de células B. Para lograr este objetivo, los
anticuerpos pueden formularse usando una diversidad de excipientes
aceptables conocidos en la técnica. Típicamente, los anticuerpos se
administran por medio de inyección, ya sea por vía intravenosa o
por vía intraperitoneal. Los procedimientos para llevar a cabo esta
administración son conocidos por los expertos en la técnica.
También es posible obtener composiciones que pueden administrarse
por vía tópica o por vía oral, o que pueden ser capaces de
transmitirse a través de membranas mucosas.
La administración intravenosa se realiza de
preferencia por medio de infusión durante un período de
aproximadamente 1 hasta aproximadamente 10 horas, de más
preferencia durante aproximadamente 1 hasta aproximadamente 8 horas,
de más preferencia aún durante aproximadamente 2 hasta
aproximadamente 7 horas, todavía de más preferencia durante
aproximadamente 4 hasta aproximadamente 6 horas, dependiendo del
anticuerpo anti CD40 que se administra. La infusión inicial con la
composición farmacéutica puede administrarse durante un período de
aproximadamente 4 hasta aproximadamente 6 horas con infusiones
posteriores administradas de manera más rápida. Las infusiones
posteriores pueden administrarse durante un período de
aproximadamente 1 hasta aproximadamente 6 horas, incluyendo, por
ejemplo, aproximadamente 1 hasta aproximadamente 4 horas,
aproximadamente 1 hasta aproximadamente 3 horas, o aproximadamente 1
hasta aproximadamente 2 horas.
Una composición farmacéutica de la invención
está formulada para que sea compatible con su vía de administración
prevista. Los ejemplos de posibles vías de administración incluyen
la administración parenteral (por ejemplo, intravenosa (IV),
intramuscular (IM), intradérmica, subcutánea (SC), o la infusión),
oral y pulmonar (por ejemplo, inhalación), nasal, transdérmica
(tópica), transmucosa y rectal. Las disoluciones o suspensiones
usadas para aplicaciones parenterales, intradérmicas o subcutáneas
pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal
como agua para inyección, disolución salina, aceites no volátiles,
polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes
sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o
metilparabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o
bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido
etilendiaminotetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o
fosfatos y agentes para ajustar la tonicidad tales como cloruro de
sodio o dextrosa. El pH puede ajustarse con ácidos o bases, tales
como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación
parenteral puede incluirse en ampollas, jeringas desechables o
viales de dosis múltiples fabricados de vidrio o de plástico.
Los anticuerpos anti CD40 se proporcionan
típicamente por medio de técnicas convencionales en un tampón
farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, disolución salina
estéril, agua tamponada estéril, propilenglicol, combinaciones de
los anteriores, etc. En Remington's Pharmaceutical Sciences (18th
ed.; Mack Publishing Company, Eaton, Pennsylvania, 1990) se
describen procedimientos para preparar agentes que pueden
administrarse por vía parenteral. Véase también, por ejemplo, el
documento WO 98/56418, que describe formulaciones farmacéuticas de
anticuerpos estabilizadas adecuadas para usar en los procedimientos
descritos en el presente documento.
Un experto en la técnica puede determinar
fácilmente sin excesiva experimentación la cantidad de al menos un
anticuerpo anti CD40 o su fragmento a administrar. Los factores que
influyen en el modo de administración y la respectiva cantidad de
al menos un anticuerpo anti CD40 antagonista (o su fragmento)
incluyen, pero se limitan a, la gravedad de la enfermedad, la
historia de la enfermedad, y la edad, altura, peso, salud y
condición física del individuo que se somete al tratamiento. De
manera similar, la cantidad de anticuerpo anti CD40 antagonista o
su fragmento a administrar dependerá del modo de administración y de
si el sujeto se someterá a una monodosis o a dosis múltiples de
este agente antitumoral. Por lo general, al aumentar el peso del
sujeto sometido al tratamiento, resulta de preferencia una dosis
más alta del anticuerpo anti CD40 o su fragmento. La dosis del
anticuerpo anti CD40 o su fragmento a administrar está en el
intervalo desde aproximadamente 0,003 mg/kg hasta aproximadamente
50 mg/kg, de preferencia en el intervalo de 0,01 mg/kg hasta
aproximadamente 40 mg/kg. Por consiguiente, por ejemplo, la dosis
puede ser de 0,01 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,5
mg/kg, 1 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 7
mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg,
40 mg/kg, 45 mg/kg o 50 mg/kg.
En otra forma de realización de la divulgación,
el procedimiento comprende la administración de dosis múltiples de
anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento. El procedimiento
puede comprender la administración de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,
10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 o más dosis terapéuticamente eficaces de
una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti CD40
antagonista o su fragmento. La frecuencia y duración de
administración de las dosis múltiples de las composiciones
farmacéuticas que comprenden anticuerpo anti CD40 o su fragmento
pueden ser determinadas fácilmente por un experto en la técnica sin
excesiva experimentación. Además, el tratamiento de un sujeto con
una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo puede incluir
un tratamiento único o, de preferencia, puede incluir una serie de
tratamientos. En un ejemplo de preferencia, se trata al sujeto con
anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno
en el intervalo de entre aproximadamente 0,1 y 20 mg/kg de peso
corporal, una vez por semana durante aproximadamente entre 1 y 10
semanas, de preferencia aproximadamente entre 2 y 8 semanas, de más
preferencia aproximadamente entre 3 y 7 semanas, y aún de más
preferencia durante aproximadamente 4, 5, ó 6 semanas. El
tratamiento puede llevarse a cabo anualmente para prevenir la
recaída o tras la indicación de la recaída. También se apreciará que
la dosis eficaz de anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno
usado para el tratamiento puede aumentar o disminuir en el
transcurso de un tratamiento particular. Los cambios en la dosis
pueden ser el resultado y pueden resultar evidentes a partir de los
resultados de los ensayos de diagnóstico como se describe en el
presente documento.
Por consiguiente, en una forma de realización,
el régimen de dosificación incluye una primera administración de
una dosis terapéuticamente eficaz de al menos un anticuerpo anti
CD40 o su fragmento en los días 1, 7, 14 y 21 de un período de
tratamiento. En otra forma de realización, el régimen de
dosificación incluye una primera administración de una dosis
terapéuticamente eficaz de al menos un anticuerpo anti CD40 o su
fragmento en los días 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7 de una semana en un
período de tratamiento. Otras formas de realización incluyen un
régimen de dosificación que tiene una primera administración de una
dosis terapéuticamente eficaz de al menos un anticuerpo anti CD40 o
su fragmento en los días 1, 3, 5 y 7 de una semana en un período de
tratamiento; un régimen de dosificación incluye una primera
administración de una dosis terapéuticamente eficaz de al menos un
anticuerpo anti CD40 o su fragmento en los días 1 y 3 de una semana
en un período de tratamiento; y un régimen de dosificación de
preferencia que incluye una primera administración de una dosis
terapéuticamente eficaz de al menos un anticuerpo anti CD40 o su
fragmento en el día 1 de una semana en un período de tratamiento.
El período de tratamiento puede comprender 1 semana, 2 semanas, 3
semanas, un mes, 3 meses, 6 meses o un año. Los períodos de
tratamiento pueden ser consecutivos o pueden estar separados uno de
otro por un día, una semana, 2 semanas, un mes, 3 meses, 6 meses o
un año.
En algunas formas de realización, la dosis
terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti CD40 antagonista o su
fragmento de unión al antígeno varía desde aproximadamente 0,003
mg/kg hasta aproximadamente 50 mg/kg, desde aproximadamente 0,01
mg/kg hasta aproximadamente 40 mg/kg, desde aproximadamente 0,01
mg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 0,1
mg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 0,5
mg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 1 mg/kg
hasta aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 3 mg/kg hasta
aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 3 mg/kg hasta
aproximadamente 25 mg/kg, desde aproximadamente 3 mg/kg hasta
aproximadamente 20 mg/kg, desde aproximadamente 5 mg/kg hasta
aproximadamente 15 mg/kg, o desde aproximadamente 7 mg/kg hasta
aproximadamente 12 mg/kg. Por consiguiente, por ejemplo, la dosis
de cualquier anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de
unión al antígeno, por ejemplo el anticuerpo monoclonal
anti-CD40 CHIR-12.12 o
CHIR-5.9 o su fragmento de unión al antígeno, puede
ser de 0,003 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg,
0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3 mg/kg, 5
mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35
mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, 50 mg/kg, u otra dosis semejante que
esté dentro el intervalo desde aproximadamente 0,003 mg/kg hasta
aproximadamente 50 mg/kg. La misma dosis terapéuticamente eficaz de
un anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al
antígeno puede administrarse a lo largo de cada semana de
dosificación del anticuerpo. Como alternativa, pueden usarse
diferentes dosis terapéuticamente eficaces de un anticuerpo anti
CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno durante el
transcurso de un período de tratamiento.
En otras formas de realización, la dosis
terapéuticamente eficaz inicial de un anticuerpo anti CD40
antagonista o su fragmento de unión al antígeno según se define en
otra parte en el presente documento puede estar en el intervalo de
dosificación inferior (es decir, desde aproximadamente 0,003 mg/kg
hasta aproximadamente 20 mg/kg) con dosis posteriores dentro del
intervalo de dosificación superior (es decir, desde aproximadamente
20 mg/kg hasta aproximadamente 50 mg/kg).
En formas de realización alternativas, la dosis
terapéuticamente eficaz inicial de un anticuerpo anti CD40
antagonista o su fragmento de unión al antígeno según se define en
otra parte en el presente documento puede estar en el intervalo de
dosificación superior (es decir, desde aproximadamente 20 mg/kg
hasta aproximadamente 50 mg/kg) con dosis posteriores dentro del
intervalo de dosificación inferior (es decir, desde 0,003 mg/kg
hasta aproximadamente 20 mg/kg). Por consiguiente, en una forma de
realización, la dosis terapéuticamente eficaz inicial del
anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno
es de aproximadamente 20 mg/kg hasta aproximadamente 35 mg/kg,
incluyendo aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 25 mg/kg,
aproximadamente 30 mg/kg y aproximadamente 35 mg/kg, y las
posteriores dosis terapéuticamente eficaces del anticuerpo anti
CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno son de
aproximadamente 5 mg/kg hasta aproximadamente 15 mg/kg, incluyendo
aproximadamente 5 mg/kg, 8 mg/kg, 10 mg/kg, 12 mg/kg y
aproximadamente 15 mg/kg.
En algunas formas de realización de la
invención, el tratamiento con anticuerpo anti CD40 antagonista se
inicia administrando una "dosis de carga" del anticuerpo o su
fragmento de unión al antígeno al sujeto que necesita terapia con
anticuerpos anti CD40 antagonistas. Por "dosis de carga" se
entiende una dosis inicial del anticuerpo anti CD40 antagonista o
su fragmento de unión al antígeno que se administra al sujeto, en la
que la dosis del anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno
administrado está dentro del intervalo de dosificación superior (es
decir, desde aproximadamente 20 mg/kg hasta aproximadamente 50
mg/kg). La "dosis de carga" puede administrarse como una única
administración, por ejemplo, una infusión única en la que el
anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno se administra por
vía IV, o como administraciones múltiples, por ejemplo, infusiones
múltiples en las que el anticuerpo o su fragmento de unión al
antígeno se administra por vía IV, siempre que la "dosis de
carga" completa se administre en un período de aproximadamente 24
horas. Tras la administración de la "dosis de carga", se
administra a continuación una o más dosis terapéuticamente eficaces
del anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al
antígeno al sujeto. Pueden administrarse dosis terapéuticamente
eficaces posteriores, por ejemplo, según un programa de dosificación
semanal, o una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, o
una vez cada cuatro semanas. En tales formas de realización, las
dosis terapéuticamente eficaces posteriores generalmente están en
el intervalo de dosificación inferior (es decir, desde 0,003 mg/kg
hasta aproximadamente 20 mg/kg).
Como alternativa, en algunas formas de
realización, tras la "dosis de carga", las posteriores dosis
terapéuticamente eficaces del anticuerpo anti CD40 antagonista o su
fragmento de unión al antígeno se administran según un "programa
de mantenimiento", en el que la dosis terapéuticamente eficaz
del anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno se administra
una vez al mes, una vez cada 6 semanas, una vez cada dos meses, una
vez cada 10 semanas, una vez cada tres meses, una vez cada 14
semanas, una vez cada cuatro meses, una vez cada 18 semanas, una
vez cada cinco meses, una vez cada 22 semanas, una vez cada seis
meses, una vez cada 7 meses, una vez cada 8 meses, una vez cada 9
meses, una vez cada 10 meses, una vez cada 11 meses, o una vez cada
12 meses. En tales formas de realización, la dosis terapéuticamente
eficaz del anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión
al antígeno está en el intervalo de dosificación inferior (es decir,
desde 0,003 mg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg), en particular
cuando las dosis posteriores se administran en intervalos más
frecuentes, por ejemplo, una vez cada dos semanas hasta una vez al
mes, o dentro del intervalo de dosificación superior (es decir,
desde aproximadamente 20 mg/kg hasta aproximadamente 50 mg/kg), en
particular cuando las dosis posteriores se administran en
intervalos menos frecuentes, por ejemplo, cuando las dosis
posteriores se administran separadas por aproximadamente un mes
hasta aproximadamente 12 meses.
Los anticuerpos anti CD40 antagonistas presentes
en las composiciones farmacéuticas descritas en el presente
documento para usar en los procedimientos dados a conocer en el
presente documento pueden ser nativos o pueden obtenerse por medio
de técnicas recombinantes y pueden ser de cualquier fuente,
incluidas las fuentes de mamíferos tales como, por ejemplo, ratón,
rata, conejo, primate, cerdo y ser humano. De preferencia tales
polipéptidos se obtienen de una fuente humana, y de más preferencia
son proteínas humanas, recombinantes de líneas celulares de
hibridoma.
Las composiciones farmacéuticas útiles en los
procedimientos dados a conocer en el presente documento comprenden
variantes biológicamente activas de los anticuerpos anti CD40
antagonistas de la invención. Tales variantes deben retener la
actividad biológica deseada del polipéptido nativo tal que la
composición farmacéutica que comprende el polipéptido variante
tenga el mismo efecto terapéutico que la composición farmacéutica
que comprende el polipéptido nativo cuando se administra a un
sujeto. Es decir, el anticuerpo anti CD40 variante servirá como
componente terapéuticamente activo en la composición farmacéutica de
manera similar a la observada para el anticuerpo antagonista
nativo, por ejemplo CHIR-5.9 o
CHIR-12.12 como se expresa por la línea celular de
hibridoma 5.9 ó 12.12, respectivamente. En la técnica están
disponibles procedimientos para determinar si un anticuerpo anti
CD40 variante retiene la actividad biológica deseada, y sirve por
consiguiente como un componente terapéuticamente activo en la
composición farmacéutica. La actividad biológica de las variantes
del anticuerpo puede medirse usando ensayos específicamente
diseñados
para medir la actividad del anticuerpo antagonista nativo, incluidos los ensayos descritos en el presente documento.
para medir la actividad del anticuerpo antagonista nativo, incluidos los ensayos descritos en el presente documento.
Cualquier composición farmacéutica que comprenda
un anticuerpo anti CD40 antagonista que tenga las propiedades de
unión descritas en el presente documento como el componente
terapéuticamente activo puede usarse en los procedimientos dados a
conocer en el presente documento. Por consiguiente, las
composiciones líquidas, liofilizadas o secadas por pulverización
que comprenden uno o más de los anticuerpos anti CD40 antagonistas
de la invención pueden prepararse como una disolución o suspensión
acuosa o no acuosa para la posterior administración a un sujeto de
acuerdo con los procedimientos dados a conocer en el presente
documento. Cada una de estas composiciones comprenderá al menos uno
de los anticuerpos anti CD40 antagonistas de la presente invención
como un componente terapéuticamente o profilácticamente activo. Por
"componente terapéuticamente o profilácticamente activo" se
entiende que el anticuerpo anti CD40 está específicamente
incorporado en la composición para provocar una respuesta
terapéutica o profiláctica con respecto al tratamiento, la
prevención o el diagnóstico de una enfermedad o afección en un
sujeto cuando se administra la composición farmacéutica a ese
sujeto. De preferencia la composición farmacéutica comprende
agentes estabilizantes, agentes de carga adecuados, o ambos para
reducir al mínimo los problemas asociados con la pérdida de
estabilidad y actividad biológica de las proteínas durante la
preparación y el almacenamiento.
Pueden añadirse compuestos de formulación a las
composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo anti CD40
antagonista de la invención. Estos compuestos de formulación pueden
incluir, pero se limitan a, aceites, polímeros, vitaminas, hidratos
de carbono, aminoácidos, sales, tampones, albúmina, tensioactivos o
agentes de carga. Los hidratos de carbono de preferencia incluyen
azúcares o alcoholes de azúcar tales como mono-, di- o
polisacáridos, o glucanos solubles en agua. Los sacáridos o glucanos
pueden incluir fructosa, glucosa, manosa, sorbosa, xilosa, maltosa,
sucrosa, dextrano, pullulano, dextrina, ciclodextrina \alpha y
\beta, almidón soluble, hidroxietil almidón y
carboximetilcelulosa, o sus mezclas. Se define "alcohol de
azúcar" como un hidrocarburo C_{4} a C_{8} que tiene un
grupo hidroxilo e incluye galactitol, inositol, manitol, xilitol,
sorbitol, glicerol y arabitol. Estos azúcares o alcoholes de azúcar
pueden usarse de manera individual o en combinación. La
concentración del azúcar o de alcohol de azúcar está entre 1,0% y 7%
p/v., de más preferencia entre 2,0% y 6,0% p/v. Los aminoácidos de
preferencia incluyen formas levógiras (L) de carnitina, arginina, y
betaína; sin embargo, pueden añadirse otros aminoácidos. De
preferencia los polímeros incluyen polivinilpirrolidona (PVP) con
un peso molecular promedio entre 2.000 y 3.000, o polietilenglicol
(PEG) con un peso molecular promedio entre 3.000 y 5.000. Los
tensioactivos que pueden añadirse a la formulación se muestran en
los documentos EP Nº 270.799 y 268.110.
Además, los anticuerpos pueden modificarse
químicamente por conjugación covalente a un polímero para, por
ejemplo, aumentar su semivida de circulación. Los polímeros de
preferencia y los procedimientos para ligarlos a péptidos, se
muestran en las Patentes de EEUU Nº 4.766.106; 4.179.337; 4.495.285;
y 4.609.546.
Los polímeros de preferencia son polioles
polioxietilados y polietilenglicol (PEG). El PEG es soluble en agua
a temperatura ambiente y tiene la fórmula general:
R(O-CH_{2} --CH_{2})_{n} O--R
donde R puede ser hidrógeno, o un grupo protector tal como un grupo
alquilo o alcanol. De preferencia, el grupo protector tiene entre 1
y 8 carbonos, de más preferencia es metilo. El símbolo n es un
número entero positivo, de preferencia entre 1 y 1.000, de más
preferencia entre 2 y 500. El PEG tiene de preferencia un peso
molecular promedio entre 1.000 y 40.000, de más preferencia entre
2.000 y 20.000, de mayor preferencia entre 3.000 y 12.000. De
preferencia, el PEG tiene al menos un grupo hidroxilo, de más
preferencia es un grupo hidroxi terminal. Este es el grupo hidroxi
que se activa de preferencia para reaccionar con un grupo amino
libre en el inhibidor. Sin embargo, se entenderá que el tipo y la
cantidad de los grupos reactivos pueden variarse para obtener un
PEG/anticuerpo de la presente invención conjugado de manera
covalente.
Los polioles polioxietilados solubles en agua
también son útiles en la presente invención. Estos incluyen
sorbitol polioxietilado, glucosa polioxietilada, glicerol
polioxietilado (POG), y otros. Resulta de preferencia el POG. Una
razón es porque la estructura central glicerol del glicerol
polioxietilado es la misma estructura central que se presenta en la
naturaleza en, por ejemplo, animales y seres humanos en los mono-,
di-, triglicéridos. Por consiguiente, esta ramificación no será
considerada necesariamente como un agente extraño en el cuerpo. El
POG tiene un peso molecular de preferencia en el mismo intervalo que
PEG. La estructura para el POG se muestra en Knauf y col. (1988) J.
Bio. Chem. 263:15064-15070, y puede encontrarse un
análisis de conjugados POG/IL-2 en la Patente de
EEUU Nº. 4.766.106.
Otro sistema de administración de fármacos para
aumentar la semivida circulatoria es el liposoma. Los procedimientos
para preparar los sistemas de administración de liposomas se
analizan en Gabizon y col. (1982) Cancer Research 42:4734; Cafiso
(1981) Biochem Biophys Acta 649:129; y Szoka (1980) Ann. Rev.
Bioplsys. Eng. 9:467. En la técnica se conocen otros sistemas de
administración de fármacos y están descritos, por ejemplo, en
Poznansky y col. (1980) Drug Delivery Systems (R.L. Juliano, ed.,
Oxford, N.Y.) páginas 253-315; Poznansky (1984)
Pharm Revs 36:277.
Los compuestos de formulación a incorporar en
una composición farmacéutica deberían proporcionar estabilidad del
anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al
antígeno. Es decir, el anticuerpo anti CD40 antagonista o su
fragmento de unión al antígeno deberá retener su estabilidad física
y/o química y deberá tener la actividad biológica deseada, es
decir, una o más de las actividades definidas anteriormente en el
presente documento, incluidas, pero no limitadas a, inhibición de la
secreción de inmunoglobulinas por células B periféricas humanas
normales estimuladas por células T; inhibición de la supervivencia
y/o proliferación de las células B periféricas humanas normales
estimuladas por células T de Jurkat; inhibición de la supervivencia
y/o proliferación de las células B periféricas humanas normales
estimuladas por células que expresan CD40L o ligando de CD40
soluble (sCD40L); inhibición de señales intracelulares
antiapoptóticas de "supervivencia" en cualquier célula
estimulada por sCD40L o CD40L de fase sólida; inhibición de la
transducción de señal de CD40 en cualquier célula tras la unión con
sCD40L o CD40L de fase sólida; e inhibición de la proliferación de
células B humanas malignas como se señaló en otra parte en el
presente documento.
Los procedimientos para controlar la estabilidad
de las proteínas son bien conocidos en la técnica. Véase, por
ejemplo, Jones (1993) Adv Drug Delivery Rev.
10:29-90; Lee, ed. (1991) Peptide y Protein Drug
Delivery (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, Nueva York); y los
ensayos de estabilidad que se dan a conocer en el presente
documento a continuación. En general, la estabilidad de las
proteínas se mide a una temperatura elegida durante un período de
tiempo especificado. En formas de realización de preferencia, una
formulación farmacéutica de anticuerpo estable proporciona
estabilidad del anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de
unión al antígeno cuando se almacena a temperatura ambiente
(aproximadamente 25ºC) durante al menos 1 mes, al menos 3 meses, o
al menos 6 meses, y/o es estable aproximadamente a
2-8ºC durante al menos 6 meses, al menos 9 meses, al
menos 12 meses, al menos 18 meses, al menos 24 meses.
Una proteína tal como un anticuerpo, cuando se
formula en una composición farmacéutica, se considera que mantiene
su estabilidad física en un momento dado si no muestra signos
visuales (es decir, decoloración o pérdida de transparencia) o
signos que pueden medirse (por ejemplo, usando cromatografía de
exclusión por tamaño (SEC) o dispersión de luz UV) de
precipitación, agregación, y/o desnaturalización en esa composición
farmacéutica. Con respecto a la estabilidad química, una proteína
tal como un anticuerpo, cuando se formula en una composición
farmacéutica, se considera que mantiene su estabilidad química en un
momento dado si las medidas de estabilidad química son indicativas
de que la proteína (es decir, el anticuerpo) mantiene su actividad
biológica de interés en esa composición farmacéutica. Los
procedimientos para controlar los cambios en la estabilidad química
son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a,
procedimientos para detectar formas químicamente alteradas de la
proteína tales como el resultado la degradación, usando, por
ejemplo, SDS-PAGE, SEC, y/o espectrometría de masas
por tiempo de vuelo de desorción/ionización de láser asistida por
matriz; y degradación asociada con cambios en la carga molecular
(por ejemplo, asociada con desamidación), usando, por ejemplo,
cromatografía de intercambio iónico. Véase, por ejemplo, los
procedimientos que se dan a conocer en el presente documento a
continuación.
Se considera que un anticuerpo anti CD40
antagonista o su fragmento de unión al antígeno, cuando se formula
en una composición farmacéutica, mantiene una actividad biológica
deseada en un momento dado si la actividad biológica deseada en ese
momento está aproximadamente dentro del 30%, de preferencia
aproximadamente dentro del 20% de la actividad biológica deseada
exhibida en el momento en que se preparó la composición farmacéutica
según se determina en un ensayo adecuado para la actividad
biológica deseada. Los ensayos para medir la actividad biológica
deseada de los anticuerpos anti CD40 antagonistas dados a conocer en
el presente documento, y sus fragmentos que se unen al antígeno,
pueden llevarse a cabo como se describe en los Ejemplos en el
presente documento. Véase también los ensayos descritos en Schultze
y col. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
92:8200-8204; Denton y col. (1998) Pediatr.
Transplant. 2:6-15; Evans y col. (2000) J. Immunol.
164:688-697; Noelle (1998) Agents Actions Suppl.
49:17-22; Lederman y col. (1996) Curr. Opin.
Hematol. 3:77-86; Coligan y col. (1991) Current
Protocols in Immunology 13:12; Kwekkeboom y col. (1993) Immunology
79:439-444; y las Patentes de EEUU Nº 5.674.492 y
5.847.082.
En algunas formas de realización de la
invención, el anticuerpo anti CD40 antagonista, por ejemplo, el
anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o
CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno se
formula en una formulación farmacéutica líquida. El anticuerpo anti
CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno puede
prepararse usando cualquier procedimiento conocido en la técnica,
incluidos los procedimientos dados a conocer anteriormente en el
presente documento. En una forma de realización, el anticuerpo anti
CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal
CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o su
fragmento de unión al antígeno se produce de manera recombinante en
una línea celular CHO.
Tras su preparación y purificación, el
anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno
puede formularse como una formulación farmacéutica líquida de la
manera expuesta en el presente documento. Cuando el anticuerpo anti
CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno debe
almacenarse antes de su formulación, pueden congelarse, por
ejemplo, a \leq -20ºC, y a continuación descongelarse a
temperatura ambiente para otra formulación. La formulación
farmacéutica líquida comprende una cantidad terapéuticamente eficaz
del anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al
antígeno. La cantidad de anticuerpo o su fragmento de unión al
antígeno presente en la formulación tiene en consideración la vía de
administración y el volumen de dosis deseado.
De esta manera, la composición farmacéutica
líquida comprende el anticuerpo anti CD40 antagonista, por ejemplo,
el anticuerpo CHIR-12.12 o CHIR-5.9,
o su fragmento de unión al antígeno en una concentración de
aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 50,0 mg/ml,
aproximadamente 0,5 mg/ml hasta aproximadamente 40,0 mg/ml,
aproximadamente 1,0 mg/ml hasta aproximadamente 30,0 mg/ml,
aproximadamente 5,0 mg/ml hasta aproximadamente 25,0 mg/ml,
aproximadamente 5,0 mg/ml hasta aproximadamente 20,0 mg/ml, o
aproximadamente 15,0 mg/ml hasta aproximadamente 25,0 mg/ml. En
algunas formas de realización, la composición farmacéutica líquida
comprende el anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de
unión al antígeno en una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml
hasta aproximadamente 5,0 mg/ml, aproximadamente 5,0 mg/ml hasta
aproximadamente 10,0 mg/ml, aproximadamente 10,0 mg/ml hasta
aproximadamente 15,0 mg/ml, aproximadamente 15,0 mg/ml hasta
aproximadamente 20,0 mg/ml, aproximadamente 20,0 mg/ml hasta
aproximadamente 25,0 mg/ml, aproximadamente 25,0 mg/ml hasta
aproximadamente 30,0 mg/ml, aproximadamente 30,0 mg/ml hasta
aproximadamente 35,0 mg/ml, aproximadamente 35,0 mg/ml hasta
aproximadamente 40,0 mg/ml, aproximadamente 40,0 mg/ml hasta
aproximadamente 45,0 mg/ml, o aproximadamente 45,0 mg/ml hasta
aproximadamente 50,0 mg/ml. En otras formas de realización, la
composición farmacéutica líquida comprende el anticuerpo anti CD40
antagonista o su fragmento de unión al antígeno en una
concentración de aproximadamente 15:0 mg/ml, aproximadamente 16,0
mg/ml, aproximadamente 17,0 mg/ml, aproximadamente 18,0 mg/ml,
aproximadamente 19,0 mg/ml, aproximadamente 20,0 mg/ml,
aproximadamente 21,0 mg/ml, aproximadamente 22,0 mg/ml,
aproximadamente 23,0 mg/ml, aproximadamente 24,0 mg/ml, o
aproximadamente 25,0 mg/ml. La composición farmacéutica líquida
comprende el anticuerpo anti CD40 antagonista, por ejemplo, el
anticuerpo CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o
su fragmento de unión al antígeno y un tampón que mantiene el pH de
la formulación en el intervalo de aproximadamente pH 5,0 hasta
aproximadamente pH 7,0, incluyendo aproximadamente pH 5,0, 5,1,
5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4,
6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, y otros valores semejantes dentro del
intervalo de aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 7,0.
En algunas formas de realización, el tampón mantiene el pH de la
formulación en el intervalo de aproximadamente pH 5,0 hasta
aproximadamente pH 6,5, aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente
pH 6,0, aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 5,5,
aproximadamente pH 5,5 hasta aproximadamente 7,0, aproximadamente
pH 5,5 hasta aproximadamente pH 6,5, o aproximadamente pH 5,5 hasta
aproximadamente pH 6,0.
En la formulación puede usarse cualquier tampón
adecuado que mantenga el pH de la formulación líquida del
anticuerpo anti CD40 en el intervalo de aproximadamente pH 5,0 hasta
aproximadamente pH 7,0, siempre que la estabilidad fisicoquímica y
la actividad biológica deseada del anticuerpo se mantengan como se
señaló anteriormente en el presente documento. Los tampones
incluyen pero no se limitan a, ácidos convencionales y sus sales,
donde el contraión puede ser, por ejemplo, sodio, potasio, amonio,
calcio o magnesio. Los ejemplos de ácidos convencionales y su sales
que pueden usarse para tamponar la formulación farmacéutica líquida
incluyen, pero no se limitan a, tampones de ácido succínico o
succinato, ácido cítrico o citrato, ácido acético o acetato, ácido
tartárico o tartrato, ácido fosfórico o fosfato, ácido glucónico o
gluconato, ácido glutámico o glutamato, ácido aspártico o
aspartato, ácido maleico o maleato y ácido málico o malato. La
concentración del tampón en la formulación puede ser desde
aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 50 mM, incluyendo
aproximadamente 1 mM, 2 mM, 5 mM, 8 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM,
30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, u otros valores semejantes dentro
del intervalo de aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 50 mM.
En algunas formas de realización, la concentración del tampón en la
formulación es desde aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 15
mM, incluyendo aproximadamente 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM,
11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, u otros valores semejantes dentro
del intervalo de aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 15
mM.
En algunas formas de realización de la
invención, la formulación farmacéutica líquida comprende una
cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti CD40
antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR 12,12 o
CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno y
tampón succinato o tampón citrato a una concentración que mantiene
el pH de la formulación en el intervalo de aproximadamente pH 5,0
hasta aproximadamente pH 7,0, de preferencia aproximadamente pH 5,0
hasta aproximadamente pH 6,5. Por "tampón succinato" o
"tampón citrato" se entiende un tampón que comprende una sal
de ácido succínico o una sal de ácido cítrico, respectivamente. En
una forma de realización de preferencia, el contraión de succinato o
citrato es el catión sodio, por consiguiente el tampón es succinato
de sodio o citrato de sodio, respectivamente. Sin embargo, se espera
que sea eficaz cualquier catión. Otros posibles cationes de
succinato o de citrato incluyen, pero no se limitan a, potasio,
amonio, calcio y magnesio. Como se señaló anteriormente, la
concentración del tampón succinato o citrato en la formulación
puede ser desde aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 50 mM,
incluyendo aproximadamente 1 mM, 2 mM, 5 mM, 8 mM, 10 mM, 15 mM, 20
mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, u otros valores
semejantes dentro del intervalo desde aproximadamente 1 mM hasta
aproximadamente 50 mM. En algunas formas de realización, la
concentración de tampón en la formulación va desde aproximadamente 5
mM hasta aproximadamente 15 mM, incluyendo aproximadamente 5 mM, 6
mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, o
aproximadamente 15 mM. En otras formas de realización, la
formulación farmacéutica líquida comprende el anticuerpo anti CD40
antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal
CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o su
fragmento de unión al antígeno en una concentración de
aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 50,0 mg/ml, o
aproximadamente 5,0 mg/ml hasta aproximadamente 25,0 mg/ml, y
tampón succinato o citrato, por ejemplo, tampón succinato de sodio o
citrato de sodio, a una concentración de aproximadamente 1 mM hasta
aproximadamente 20 mM, aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 15
mM, de preferencia aproximadamente 10 mM.
Cuando es deseable que la formulación
farmacéutica líquida sea prácticamente isotónica, la formulación
farmacéutica líquida que comprende una cantidad terapéuticamente
eficaz del anticuerpo anti CD40 antagonista, por ejemplo, el
anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o
CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno, y un
tampón para mantener el pH de la formulación dentro del intervalo
de aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 7,0 puede
comprender además una cantidad de un agente de isotonicidad
suficiente para hacer que la formulación sea prácticamente
isotónica. Por "prácticamente isotónica" se entiende que la
formulación acuosa tiene una osmolaridad de aproximadamente 240
mmol/kg hasta aproximadamente 360 mmol/kg, de preferencia
aproximadamente 240 hasta aproximadamente 340 mmol/kg, de más
preferencia aproximadamente 250 hasta aproximadamente 330 mmol/kg,
aún de más preferencia aproximadamente 260 hasta aproximadamente
320 mmol/kg, de mayor preferencia aún aproximadamente 270 hasta
aproximadamente 310 mmol/kg. Los procedimientos para determinar la
isotonicidad de una disolución son conocidos por los expertos en la
técnica. Véase, por ejemplo, Setnikar y col. (1959) J. Am. Pharm.
Assoc. 48:628.
Los expertos en la técnica están familiarizados
con una diversidad de solutos farmacéuticamente aceptable útiles
para proporcionar isotonicidad en las composiciones farmacéuticas.
El agente de isotonicidad puede ser cualquier reactivo capaz de
ajustar la presión osmótica de la formulación farmacéutica líquida
de la presente invención hasta un valor prácticamente igual al de
un líquido corporal. Es deseable utilizar un agente de isotonicidad
fisiológicamente aceptable. Por consiguiente, la formulación
farmacéutica líquida que comprende una cantidad terapéuticamente
eficaz del anticuerpo anti CD40 antagonista, por ejemplo, el
anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o
CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno, y un
tampón para mantener el pH de la formulación dentro del intervalo
de aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 7,0, puede
comprender además componentes que pueden usarse para proporcionar
isotonicidad, por ejemplo, cloruro de sodio; aminoácidos tales como
alanina, valina y glicina; azúcares y alcoholes de azúcares
(polioles), incluidos, pero no limitados a, glucosa, dextrosa,
fructosa, sacarosa, maltosa, manitol, trehalosa, glicerol, sorbitol,
y xilitol; ácido acético, otros ácidos orgánicos y sus sales, y
cantidades relativamente menores de citratos o fosfatos. El experto
en la técnica conocerá otros agentes que son adecuados para
proporcionar la tonicidad óptima de la formulación líquida.
En algunas formas de realización de preferencia,
la formulación farmacéutica líquida que comprende una cantidad
terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti CD40 antagonista, por
ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o
CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno, y un
tampón para mantener el pH de la formulación dentro del intervalo
de aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 7,0 comprende
además cloruro de sodio como el agente de isotonicidad. La
concentración de cloruro de sodio en la formulación dependerá de la
contribución de otros componentes a la tonicidad. En algunas formas
de realización, la concentración de cloruro de sodio es
aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 300 mM, aproximadamente
50 mM hasta aproximadamente 250 mM, aproximadamente 50 mM hasta
aproximadamente 200 mM, aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente
175 mM, aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 150 mM,
aproximadamente 75 mM hasta aproximadamente 175 mM, aproximadamente
75 mM hasta aproximadamente 150 mM, aproximadamente 100 mM hasta
aproximadamente 175 mM, aproximadamente 100 mM hasta
aproximadamente 200 mM, aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente
150 mM, aproximadamente 125 mM hasta aproximadamente 175 mM,
aproximadamente 125 mM hasta aproximadamente 150 mM, aproximadamente
130 mM hasta aproximadamente 170 mM, aproximadamente 130 mM hasta
aproximadamente 160 mM, aproximadamente 135 mM hasta
aproximadamente 155 mM, aproximadamente 140 mM hasta aproximadamente
155 mM, o aproximadamente 145 mM hasta aproximadamente 155 mM. En
una de tales formas de realización, la concentración de cloruro de
sodio es aproximadamente 150 mM. En otra de tales formas de
realización, la concentración de cloruro de sodio es
aproximadamente 150 mM, el tampón es tampón succinato de sodio o
citrato de sodio en una concentración de aproximadamente 5 mM hasta
aproximadamente 15 mM, la formulación farmacéutica líquida comprende
una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti CD40
antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal
CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o su
fragmento de unión al antígeno, y la formulación tiene un pH de
aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 7,0,
aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 6,0, o
aproximadamente pH 5,5 hasta aproximadamente pH 6,5. En otras
formas de realización, la formulación farmacéutica líquida
comprenden el anticuerpo anti CD40 antagonista, por ejemplo, el
anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o
CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno, en
una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente
50,0 mg/ml o aproximadamente 5,0 mg/ml hasta aproximadamente 25,0
mg/ml, aproximadamente cloruro de sodio 150 mM, y aproximadamente
succinato de sodio o citrato de sodio 10 mM, a un pH de
aproximadamente pH 5,5.
La degradación proteica por congelación
descongelación o cizallamiento mecánico durante el procesamiento de
una formulación farmacéutica líquida de la presente invención puede
inhibirse incorporando tensioactivos en la formulación para
disminuir la tensión superficial en la interfase
disolución-aire. Por consiguiente, en algunas
formas de realización, la formulación farmacéutica líquida comprende
una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti CD40
antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal
CHIR-12.12 o CHIR 5,9, o su fragmento de unión al
antígeno, un tampón para mantener el pH de la formulación dentro del
intervalo de aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 7,0, y
comprende además un tensioactivo. En otras formas de realización,
la formulación farmacéutica líquida comprende una cantidad
terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti CD40 antagonista, por
ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o
CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno, un
tampón para mantener el pH de la formulación dentro del intervalo de
aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 7,0, un agente de
isotonicidad tal como cloruro de sodio en una concentración de
aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 300 mM, y comprende
además un tensioactivo.
Los tensioactivos típicos utilizados son
tensioactivos noiónicos, incluidos los ésteres de
polioxietilensorbitol tales como polisorbato 80 (Tween 80) y
polisorbato 20 (Tween 20); ésteres de
polioxipropileno-polioxietileno tales como Pluronic
F68; alcoholes de polioxietileno tales como Brij 35; simeticona;
polietilenglicol tal como PEG400; lisofosfatidilcolina; y
polioxietilen-p-t-octilfenol
tal como Triton X-100. La estabilización clásica de
compuestos farmacéuticos por medio de tensioactivos o emulsivos se
describe, por ejemplo, en Levine y col. (1991) J. Parenteral Sci.
Technol. 45(3): 160-165. Un tensioactivo de
preferencia utilizada en la práctica de la presente invención es
polisorbato 80. Cuando se incluye un tensioactivo, éste se añade
típicamente en una cantidad desde aproximadamente 0,001% hasta
aproximadamente 1,0% (p/v), aproximadamente 0,001% hasta
aproximadamente 0,5%, aproximadamente 0,001% hasta aproximadamente
0,4%, aproximadamente 0,001% hasta aproximadamente 0,3%,
aproximadamente 0,001% hasta aproximadamente 0,2%, aproximadamente
0,005% hasta aproximadamente 0,5%, aproximadamente 0,005% hasta
aproximadamente 0,2%, aproximadamente 0,01% hasta aproximadamente
0,5%, aproximadamente 0,01% hasta aproximadamente 0,2%,
aproximadamente 0,03% hasta aproximadamente 0,5%, aproximadamente
0,03% hasta aproximadamente 0,3%, aproximadamente 0,05% hasta
aproximadamente 0,5%, o aproximadamente 0,05% hasta aproximadamente
0,2%.
Por consiguiente, en algunas formas de
realización, la formulación farmacéutica líquida comprende una
cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti CD40
antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal
CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o su
fragmento de unión al antígeno, el tampón es tampón succinato de
sodio o citrato de sodio en una concentración de aproximadamente 1
mM hasta aproximadamente 50 mM, aproximadamente 5 mM hasta
aproximadamente 25 mM, o aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente
15 mM; la formulación tiene un pH de aproximadamente pH 5,0 hasta
aproximadamente pH 7,0, aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente
pH 6,0, o aproximadamente pH 5,5 hasta aproximadamente pH 6,5; y la
formulación comprende además un tensioactivo, por ejemplo,
polisorbato 80, en una cantidad desde aproximadamente 0,001% hasta
aproximadamente 1,0% o aproximadamente 0,001% hasta aproximadamente
0,5%. Tales formulaciones pueden comprender opcionalmente un agente
de isotonicidad, tal como cloruro de sodio en una concentración de
aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 300 mM, aproximadamente
50 mM hasta aproximadamente 200 mM, o aproximadamente 50 mM hasta
aproximadamente 150 mM. En otras formas de realización, la
formulación farmacéutica líquida comprende el anticuerpo anti CD40
antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal
CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o su
fragmento de unión al antígeno, en una concentración de
aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 50,0 mg/ml o
aproximadamente 5,0 mg/ml hasta aproximadamente 25,0 mg/ml,
incluyendo aproximadamente 20,0 mg/ml; cloruro de sodio
aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 200 mM, incluyendo
cloruro de sodio aproximadamente 150 mM; succinato de sodio o
citrato de sodio a una concentración de aproximadamente 5 mM hasta
aproximadamente 20 mM; incluyendo succinato de sodio o citrato de
sodio aproximadamente 10 mM; cloruro de sodio a una concentración
de aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 200 mM, incluyendo
aproximadamente 150 mM; y opcionalmente un tensioactivo, por
ejemplo, polisorbato 80, en una cantidad desde aproximadamente
0,001% hasta aproximadamente 1,0%, incluyendo aproximadamente 0,001%
hasta aproximadamente 0,5%; donde la formulación farmacéutica
líquida tiene un pH de aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente
pH 7,0, aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 6,0,
aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 5,5, aproximadamente
pH 5,5 hasta aproximadamente pH 6,5, o aproximadamente pH 5,5 hasta
aproximadamente pH 6,0.
La formulación farmacéutica líquida puede estar
esencialmente libre de conservantes y otros vehículos, excipientes,
o estabilizadores señalados anteriormente en el presente documento.
Como alternativa, la formulación puede incluir uno o más
conservantes, por ejemplo, agentes antibacterianos, vehículos,
excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables
descritos en el presente documento anteriormente con la condición de
que no afecten de manera adversa la estabilidad fisicoquímica del
anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al
antígeno. Los ejemplos de vehículos, excipientes o estabilizadores
aceptables incluyen, pero no se limitan a, otros agentes
tamponadores, codisolventes, tensioactivos, antioxidantes incluidos
ácido ascórbico y metionina, agentes quelantes tales como EDTA,
complejos de metales (por ejemplo, complejos
Zn-proteína), y polímeros biodegradables tales como
poliésteres. Puede encontrarse una discusión detallada de
formulación y selección de vehículos, excipientes e isomolitos
farmacéuticamente aceptables en Remington's Pharmaceutical Sciences
(18th ed.; Mack Publishing Company, Eaton, Pennsylvania, 1990).
Una vez que la formulación farmacéutica líquida
u otra composición farmacéutica descrita en el presente documento
está preparada, puede liofilizarse para evitar la degradación. Los
procedimientos para liofilizar composiciones líquidas son conocidos
por los expertos en la técnica. Justo antes de usar, la composición
puede reconstituirse con un diluyente estéril (disolución de
Ringer, agua destilada o disolución salina, por ejemplo) que puede
incluir otros componentes. Tras la reconstitución, la composición se
administra de preferencia a los sujetos usando los procedimientos
conocidos por los expertos en la técnica.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente descripción también proporciona el
uso de un anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión
al antígeno en la fabricación de un medicamento para el tratamiento
de un sujeto por un cáncer caracterizado por crecimiento de células
B neoplásicas, en el que el medicamento está coordinado con el
tratamiento con al menos otra terapia contra el cáncer. Los
cánceres caracterizados por el crecimiento de células B neoplásicas
incluyen, pero no se limitan a, los cánceres relacionados con las
células B analizados anteriormente en el presente documento, por
ejemplo, linfoma no Hodgkin, leucemia linfocítica crónica, mieloma
múltiple, linfoma de células B, linfoma de células B de grado alto,
linfoma de células B de grado intermedio, linfoma de células B de
grado bajo, leucemia linfoblástica aguda de células B, leucemia
mieloblástica, enfermedad de Hodgkin, plasmacitoma, linfoma
folicular, linfoma folicular de células pequeñas hendidas, linfoma
folicular de células grandes, linfoma folicular mixto de células
pequeñas hendidas, linfoma difuso de células pequeñas hendidas,
linfoma linfocítico difuso de células pequeñas, leucemia
prolinfocítica, linfoma linfoplasmacítico, linfoma de zona
marginal, linfoma tisular linfoide asociado a mucosas, linfoma
monocitoide de células B, linfoma esplénico, leucemia de células
vellosas, linfoma difuso de células grandes, linfoma mediastínico de
células B grandes, granulomatosis linfomatoide, linfomatosis
intravascular, linfoma difuso de células mixtas, linfoma difuso de
células grandes, linfoma inmunoblástico, linfoma de Burkitt, linfoma
relacionado con el SIDA y linfoma de células del manto.
Por "coordinado" se entiende que el
medicamento que comprende el anticuerpo anti CD40 antagonista o su
fragmento de unión al antígeno se usará antes, durante, o después
del tratamiento del sujeto con al menos otra terapia contra el
cáncer. Los ejemplos de otras terapias contra el cáncer incluyen,
pero no se limitan a, cirugía; terapia con radiación;
quimioterapia; opcionalmente en combinación con transplante autólogo
de médula ósea, en las que los agentes quimioterapéuticos adecuados
incluyen, pero no se limitan a, fludarabina o fosfato de
fludarabina, clorambucilo, vincristina, pentostatina,
2-clorodesoxiadenosina (cladribina), ciclofosfamida,
doxorubicina, prednisona, y sus combinaciones, por ejemplo,
regímenes que contienen antraciclina tales como CAP
(ciclofosfamida, doxorubicina más prednisona), CHOP (ciclofosfamida,
vincristina, prednisona más doxorubicina), VAD (vincritsina,
doxorubicina, más dexametasona), MP (melfalán más prednisona), y
otros agentes citotóxicos y/o terapéuticos usados en quimioterapia
tales como mitoxantrona, daunorubicina, idarubicina, asparaginasa,
y antimetabolitos, incluidos, pero no limitados a, citarabina,
metotrexato, 5-fluorouracilo decarbazina,
6-tioguanina, 6-mercaptopurina y
nelarabina; otra terapia anticancerosa con anticuerpos monoclonales
(por ejemplo, alemtuzumab (Campath®) u otro anticuerpo anti CD52
dirigido a la glicoproteína de superficie celular CD52 en células B
malignas; rituximab (Rituxan®), el anticuerpo
HuMax-CD20 totalmente humano,
R-1594, IMMU-106,
TRU-015, AME-133,
tositumomab/I-131 tositumomab (Bexxar®), ibritumomab
tiuxetan (Zevalin®), o cualquier otro anticuerpo anti CD20
terapéutico dirigido al antígeno CD20 en células B malignas;
anticuerpo anti CD19 (por ejemplo, MT103, un anticuerpo
biespecífico); anticuerpo anti CD22 (por ejemplo, el anticuerpo
monoclonal humanizado epratuzumab); bevacizumab (Avastin®) u otro
anticuerpo anticanceroso dirigido al factor de crecimiento vascular
endotelial humano; anticuerpo anti CD22 dirigido al antígeno CD22
en células B malignas (por ejemplo, el anticuerpo monoclonal
BL-22, una toxina alfaCD22); anticuerpo
\alpha-M-CSF dirigido al factor
estimulante de colonias de macrófagos; anticuerpos dirigidos al
activador del receptor del factor kappaB nuclear (RANK) y su ligando
(RANKL), que se sobreexpresan en el mieloma múltiple; anticuerpo
anti CD23 dirigido al antígeno CD23 en células B malignas (por
ejemplo, IDEC-152); anticuerpo anti CD38 dirigido al
antígeno CD38 en células B malignas; anticuerpos dirigidos a los
receptores del complejo mayor de histocompatibilidad clase II
(anticuerpos anti MHC) expresados en células B malignas; otros
anticuerpos anti CD40 (por ejemplo, SGN-40)
dirigidos al antígeno CD40 en células B malignas; y anticuerpos
dirigidos al receptor 1 del ligando inductor de apoptosis
relacionado con el factor de necrosis tumoral
(TRAIL-R1) (por ejemplo, el anticuerpo monoclonal
agonista humano HGS-ETR1) expresado en una cantidad
de tumores sólidos y tumores de origen hematopoyético); terapia del
cáncer basada en moléculas pequeñas, incluidos, pero no limitados
a, inhibidores de microtúbulos y/o topoisomerasa (por ejemplo, el
inhibidor mitótico dolastatina y análogos de dolastatina; el agente
de unión a tubulina T900607; XL119; y el inhibidor de la
topoisomerasa aminocamptotecina), SDX-105
(clorhidrato de bendamustina), ixabepilona (un análogo de
epotilona, también llamado BMS-247550), inhibidores
de proteincinasa C, por ejemplo, midostaurina
((PKC-412, CGP 41251,
N-benzoilstaurosporina), pixantrona, eloxatina (un
agente antineoplásico), ganite (nitrato de galio), Thalomid®
(talidomida), derivados inmunomoduladores de la talidomida (por
ejemplo, revlimid (anteriormente revimid)), Affinitak^{TM}
(inhibidor antisentido de proteincinasa C-alfa),
SDX-101 (R-etodolac, que induce la
apoptosis de linfocitos malignos), análogos de nucleósidos purina de
segunda generación tales como clofarabina, inhibidores de la
producción de la proteína Bcl-2 por células
cancerosas (por ejemplo, los agentes antisentido oblimersen y
Genasense®), inhibidores de proteasoma (por ejemplo, Velcade^{TM}
(bortezomib)), inhibidores de cinasas de molécula pequeña (por
ejemplo, CHIR-258), inhibidores de VEGF de molécula
pequeña (por ejemplo, ZD-6474), inhibidores de la
proteína del choque térmico (HSP) 90 de molécula pequeña (por
ejemplo, 17-AAG), agentes inhibidores de
desacetilasas de histonas de molécula pequeña (por ejemplo, HPC
híbrido/polar de citodiferenciación) tales como ácido
suberanilohidroxámico (SAHA), y FR-901228 y agentes
apoptóticos tales como Trisenox® (trióxido de arsénico) y Xcytrin®
(motexafina gadolinio); terapias contra el cáncer basadas en
vacunas/inmunoterapia, incluidas, pero no limitadas a, enfoques de
vacunas (por ejemplo, Id-KLH, oncofago, vitaletina),
inmunoterapia personalizada o inmunoterapia activa de idiotipo (por
ejemplo, MyVax® Personalized Immunotherapy, denominada formalmente
GTOP-99), Promune® (CpG 7909, un agonista sintético
para el receptor de tipo toll 9 (TLR9)), terapia con interferón
alfa, terapia con interleucina 2 (IL-2), terapia con
IL-12, terapia con IL-15 y terapia
con IL-21; terapia con esteroides; u otra terapia
contra el cáncer; en las que el tratamiento con la terapia adicional
contra el cáncer, o terapias adicionales contra el cáncer, se
realizan antes, durante, o posteriormente al tratamiento del sujeto
con el medicamento que comprende el anticuerpo anti CD40 antagonista
o su fragmento de unión al antígeno, como se señaló anteriormente en
el presente documento.
En algunas formas de realización, la presente
descripción proporciona el uso de un anticuerpo anti CD40, por
ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o
CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno en la
fabricación de un medicamento para tratar un linfoma de células B,
por ejemplo el linfoma no Hodgkin, en un sujeto, en el que el
medicamento está coordinado con el tratamiento con al menos otra
terapia contra el cáncer seleccionada del grupo constituido por
quimioterapia, terapia anticancerosa con anticuerpos, terapia contra
el cáncer basada en moléculas pequeñas y terapia contra el cáncer
basada en vacunas/inmunoterapia, en el que el medicamento se usará
antes, durante o después del tratamiento del sujeto con la otra
terapia contra el cáncer o, en el caso de terapias de combinación
múltiples, antes, durante o después del tratamiento del sujeto con
las otras terapias contra el cáncer.
Por consiguiente, por ejemplo, en algunas formas
de realización, la descripción proporciona el uso del anticuerpo
monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o
sus fragmentos de unión al antígeno, en la fabricación de un
medicamento para tratar un linfoma de células B, por ejemplo el
linfoma no Hodgkin, en un sujeto, en el que el medicamento está
coordinado con el tratamiento con quimioterapia, en el que el agente
quimioterapéutico se selecciona del grupo constituido por citoxan,
doxorubicina, vincristina, prednisona y sus combinaciones, por
ejemplo CHOP. En otras formas de realización, la descripción
proporciona el uso del anticuerpo monoclonal
CHIP-12,12 o CHG-5,9, o sus
fragmentos de unión al antígeno, en la fabricación de un medicamento
para tratar un linfoma de células B, por ejemplo el linfoma no
Hodgkin, en un sujeto, en el que el medicamento está coordinado con
el tratamiento con al menos otro anticuerpo anticancersoso
seleccionado del grupo constituido por alemtuzurnab (Campath®) u
otro anticuerpo anti CD52 dirigido a la glicoproteína de superficie
celular CD52 en células B malignas; rituximab (Rituxan®), el
anticuerpo HuMax-CD20 totalmente humano,
R-1594, IMMU-106,
TRU-015, AME-133,
tositumomab/I-131 tositumomab (Bexxar®), ibritumomab
tiuxetan (Zevalin®), o cualquier otro anticuerpo anti CD20
terapéutico dirigido al antígeno CD20 en células B malignas;
anticuerpo anti CD19 (por ejemplo, MT103, un anticuerpo
biespecífico); anticuerpo anti CD22 (por ejemplo, el anticuerpo
monoclonal humanizado epratuzumab); bevacizumab (Avastin®) u otro
anticuerpo anticanceroso dirigido al factor de crecimiento vascular
endotelial humano; y cualquiera de sus combinaciones; en el que el
medicamento se usará antes, durante o después del tratamiento del
sujeto con la otra terapia contra el cáncer o, en el caso de
terapias de combinación múltiples, antes, durante o después del
tratamiento del sujeto con las otras terapias contra el cáncer.
En aún otras formas de realización, la presente
descripción proporciona el uso del anticuerpo monoclonal
CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o su
fragmento de unión al antígeno, en la fabricación de un medicamento
para tratar un linfoma de células B, por ejemplo el linfoma no
Hodgkin, en un sujeto, en el que el medicamento está coordinado con
el tratamiento con al menos otra terapia contra el cáncer basada en
moléculas pequeñas seleccionada del grupo constituido por
inhibidores de microtúbulos y/o topoisomerasa (por ejemplo, el
inhibidor mitótico dolastatina y análogos de dolastatina; el agente
de unión a tubulina T900607; XL119; y el inhibidor de la
topoisomerasa aminocamptotecina), SDX-105
(clorhidrato de bendamustina), ixabepilona (un análogo de epotilona,
también llamado BMS-247550), inhibidores de
proteincinasa C, por ejemplo, midostaurina
((PKC-412, CGP 41251,
N-benzoilstaurosporina), pixantrona, eloxatina (un
agente antineoplásico), ganite (nitrato de galio), Thalomid®
(talidomida), un agente apoptótico tal como Xcytrin® (metoxafin
gadolinio), inhibidores de la producción de la proteína
Bcl-2 por células cancerosas (por ejemplo, los
agentes antisentido oblimersen y Genasense®), nelarabina, y
cualquiera de sus combinaciones; en el que el medicamento se usará
antes, durante o después del tratamiento del sujeto con la otra
terapia contra el cáncer o, en el caso de terapias de combinación
múltiples, antes, durante o después del tratamiento del sujeto con
las otras terapias contra el cáncer.
En aún otras formas más de realización, la
presente descripción proporciona el uso del anticuerpo monoclonal
CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o su
fragmento de unión al antígeno, en la fabricación de un medicamento
para tratar un linfoma de células B, por ejemplo el linfoma no
Hodgkin, en un sujeto, en el que el medicamento está coordinado con
el tratamiento con al menos otra terapia contra el cáncer basada en
vacunas/inmunoterapia seleccionada del grupo constituido por
enfoques de vacunas (por ejemplo, Id-KLH, oncofago,
vitaletina), inmunoterapia personalizada o inmunoterapia activa de
idiotipo (por ejemplo, MyVax® Personalized Immunotherapy, denominada
formalmente GTOP-99), Promune® (CpG 7909, un
agonista sintético para el receptor de tipo toll 9 (TLR9)), terapia
con interleucina 2 (IL-2), terapia con
IL-12, terapia con IL-15 y terapia
con IL-21; y cualquiera de sus combinaciones; en el
que el medicamento se usará antes, durante o después del tratamiento
del sujeto con la otra terapia contra el cáncer o, en el caso de
terapias de combinación múltiples, antes, durante o después del
tratamiento del sujeto con las otras terapias contra el cáncer.
En algunas formas de realización, la presente
descripción proporciona el uso del anticuerpo monoclonal anti CD40,
por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o
CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno en la
fabricación de un medicamento para tratar una leucemia relacionada
con células B, por ejemplo la leucemia linfocítica aguda de células
B (B-ALL), en un sujeto, en el que el medicamento
está coordinado con el tratamiento con al menos otra terapia contra
el cáncer seleccionada del grupo constituido por quimioterapia y
terapia antimetabolitos, en el que el medicamento se usará antes,
durante o después del tratamiento del sujeto con la otra terapia
contra el cáncer o, en el caso de terapias de combinación múltiples,
antes, durante o después del tratamiento del sujeto con las otras
terapias contra el cáncer. Los ejemplos de tales formas de
realización incluyen, pero no se limitan a, los casos en los que el
medicamento que comprende el anticuerpo anti CD40 antagonista, por
ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o
CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno está
coordinado con el tratamiento con un agente quimioterapéutico o
antimetabolito seleccionado del grupo constituido por citoxan,
doxorubicina, vincristina, prednisona, citarabina, mitoxantrona,
idarubicina, asparaginasa, metotrexato,
6-tioguanina, 6-mercaptopurina, y
sus combinaciones; en el que el medicamento se usará antes, durante
o después del tratamiento del sujeto con la otra terapia contra el
cáncer o, en el caso de terapias de combinación múltiples, antes,
durante o después del tratamiento del sujeto con las otras terapias
contra el cáncer. En uno de tales ejemplos, el medicamento está
coordinado con el tratamiento con citarabina más daunorubicina,
citarabina más mitoxantrona, y/o citarabina más idarubicina; en el
que el medicamento se usará antes, durante o después del
tratamiento del sujeto con B-ALL con la otra terapia
contra el cáncer o, en el caso de terapias de combinación
múltiples, antes, durante o después del tratamiento del sujeto con
las otras terapias contra el cáncer.
También se da a conocer en el presente documento
el uso de un anticuerpo anti CD40 antagonista, por ejemplo, el
anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o
CHIR-5.9 que se dan a conocer en el presente
documento, o su fragmento de unión al antígeno en la fabricación de
un medicamento para el tratamiento de un sujeto por cáncer
caracterizado por crecimiento de células B neoplásicas, incluidos
los cánceres relacionados con células B descritos anteriormente en
el presente documento, en el que el medicamento se usa en un sujeto
que ha recibido tratamiento previo con al menos otra terapia contra
el cáncer. Por "pretratado" o "tratamiento previo" se
entiende que el sujeto ha recibido otra u otras terapias contra el
cáncer (es decir, ha sido tratado con al menos otra terapia contra
el cáncer) antes de recibir el medicamento que comprende el
anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al
antígeno. "Pretratado" o "tratamiento previo" incluye
sujetos que han sido tratados con al menos otra terapia contra el
cáncer en el plazo de 2 años, en el plazo de 18 meses, en el plazo
de 1 año, en el plazo de 6 meses, en el plazo de 2 meses, en el
plazo de 6 semanas, en el plazo de 1 mes, en el plazo de 4 semanas,
en el plazo de 3 semanas, en el plazo de 2 semanas, en el plazo de 1
semana, en el plazo de 6 días, en el plazo de 5 días, en el plazo
de 4 días, en el plazo de 3 días, en el plazo de 2 días, o incluso
en el plazo de 1 día antes del inicio del tratamiento con el
medicamento que comprende el anticuerpo anti CD40 antagonista, por
ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o
CHIR-5.9 que se dan a conocer en el presente
documento, o su fragmento de unión al antígeno. No es necesario que
el sujeto haya sido un paciente que responde al tratamiento previo
con la anterior terapia contra el cáncer, o anteriores terapias
contra el cáncer. Por consiguiente, el sujeto que recibe el
medicamento que comprende el anticuerpo anti CD40 antagonista o su
fragmento de unión al antígeno podría haber respondido, o podría no
haber respondido (es decir el cáncer era refractario), al
tratamiento previo con la anterior terapia contra el cáncer, o a una
o más terapias anteriores contra el cáncer donde el tratamiento
previo comprendía múltiples terapias contra el cáncer. Los ejemplos
de otras terapias contra el cáncer para las que un sujeto puede
haber recibido tratamiento previo antes de recibir el medicamento
que comprende el anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de
unión al antígeno incluyen, pero no se limitan a, cirugía; terapia
con radiación; quimioterapia; opcionalmente en combinación con
transplante autólogo de médula ósea, en las que los agentes
quimioterapéuticos adecuados incluyen, pero no se limitan a, los
presentados en el presente documento anteriormente; otras terapias
contra el cáncer con anticuerpos monoclonales incluidas, pero no
limitadas a, los anticuerpos anticancerosos presentados en el
presente documento anteriormente; terapias contra el cáncer basadas
en moléculas pequeñas incluidas, pero no limitadas a, las moléculas
pequeñas presentadas en el presente documento anteriormente;
terapias contra el cáncer basadas en vacunas/inmunoterapia
incluidas, pero no limitadas a, las presentadas en el presente
documento anteriormente; terapia con esteroides; otras terapias
contra el cáncer; o cualquiera de sus combinaciones.
"Tratamiento" en el contexto de uso
coordinado de un medicamento descrito en el presente documento con
otra u otras terapias contra el cáncer se define en el presente
documento como la aplicación o administración del medicamento o de
la otra terapia contra el cáncer a un sujeto, o la aplicación o
administración del medicamento u otra terapia contra el cáncer a un
tejido aislado o línea celular de un sujeto, en el que el sujeto
tiene un cáncer caracterizado por el crecimiento de células B
neoplásicas, un síntoma asociado con tal cáncer, o una
predisposición a desarrollar tal cáncer, siendo la finalidad curar,
sanar, calmar, aliviar, alterar, remediar, mejorar o afectar el
cáncer, cualquier síntoma asociado del cáncer, o la predisposición a
desarrollar el cáncer.
Los siguientes ejemplos se ofrecen a manera de
ilustración y no como limitación.
\vskip1.000000\baselineskip
Los anticuerpos anti CD40 antagonistas usados en
los ejemplos a continuación son CHIR-5.9 y
CHIR-12.12. Los anticuerpos anti CD40
CHIR-5.9 y CHIR-12.12 son
anticuerpos monoclonales (mAb) anti CD40 humano del subtipo IgG1
humana generados por inmunización de ratones transgénicos que llevan
el locus de cadena pesada de IgG1 humana y el locus de cadena
ligera \kappa humana (tecnología XenoMouse®; Abgenix; Fremont,
California). Como se muestra por medio del análisis FACS,
CHIR-5.9 y CHIR-12.12 se unen
específicamente al CD40 humano y pueden prevenir la unión del
ligando de CD40. Ambos mAb pueden competir con la unión previa del
ligando de CD40 al CD40 de la superficie celular. Ambos anticuerpos
son fuertes antagonistas e inhiben la proliferación de las células
B normales mediada por el ligando de CD40 in vitro, así como
de las células cancerosas de pacientes con NHL y CLL. in
vitro, ambos anticuerpos matan las líneas celulares cancerosas
así como las células cancerosas primarias de pacientes con NHL por
ADCC. Se observó actividad antitumoral dependiente de la dosis en un
modelo de xenoinjerto de linfoma humano. La afinidad de unión de
CHIR-5.9 al CD40 humano es de 1,2 x 10^{-8} M y la
afinidad de unión de CHIR-12.12 al CD40 humano es de
5 x 10^{-10} M.
La línea de hibridoma de ratón 131.2F8.5.9
(CMCC#12047) y la línea de hibridoma 153.8E2.D10.D6.12.12
(CMCC#12056) se han depositado en la American Type Culture
Collection [ATCC; 10801 University Blvd., Manassas, Virginia
20110-22209 (EEUU)] bajo Número de Depósito de
Patente PTA-5542 y PTA-5543,
respectivamente.
Los siguientes protocolos se han usado en los
ejemplos que se describen a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Se estimaron las concentraciones de IgM e IgG
humanas por ELISA. Se recubrieron placas de ELISA de 96 pocillos
con Mab anti IgG humana de cabra 2 \mug/ml (The Jackson
Laboratory, Bar Harbor, Maine) o con Mab anti IgM humana de cabra
4102 2 \mug/ml (Bio Source International, California) en tampón de
carbonato 0,05 M (pH 9,6), por incubación durante 16 horas a 4ºC.
Las placas se lavaron 3 veces con
PBS-Tween-20 al 0,05%
(PBS-Tween) y se saturaron con BSA durante 1 hora.
Tras 2 lavados, las placas se incubaron durante 2 horas a 37ºC con
diferentes diluciones de las muestras de prueba. Tras 3 lavados, se
detectó la Ig unida por incubación durante 2 horas a 37ºC con 1
\mug/ml de Mab anti IgG humana de cabra o Mab anti IgM humana de
cabra marcadas con peroxidasa. Las placas se lavaron 4 veces y la
actividad peroxidasa unida se reveló por medio de la adición de
O-fenilendiamina como sustrato. Se usaron patrones
de IgG o IgM humana (Caltaq, Burlingame, California) para establecer
la curva patrón para cada ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadieron 20 ml de disolución de
Ficoll-Paque (bajo en endotoxinas; Pharmacia) por
tubo de poliestireno de 50 ml, en 3 tubos, 30 minutos antes de
añadir la sangre. Se calentó la disolución de
Ficoll-Paque hasta temperatura ambiente. Se
prepararon 3 litros de lejía en una dilución 1:10 y se usaron para
lavar todos los tubos y pipetas en contacto con la sangre. La
sangre se colocó formando una fase en la parte superior de la
disolución de Ficoll-Paque sin interrumpir la fase
de Ficoll, a 1,5 ml de sangre/1 ml de Ficoll-Paque.
Se centrifugaron los tubos a 1700 rpm durante 30 minutos a
temperatura ambiente con el freno de la centrífuga desactivado. Se
eliminó la mayor cantidad posible de la fase superior (plasma),
disminuyendo el vacío al mínimo para evitar retirar la segunda fase
de disolución. La segunda fase, que contiene los linfocitos B y T,
se recogió usando una pipeta Pasteur estéril, y se colocó en dos
tubos de poliestireno de 50 ml. El material recogido se diluyó con
3 x el volumen de RPMI sin aditivos frío, y se centrifugaron los
tubos a 1000 rpm durante 10 minutos. Se retiró el medio por
aspiración, se resuspendieron las células de ambos tubos de 50 ml en
un total de 10 ml de RPMI (sin aditivos) frío y se transfirió a un
tubo de 15 ml. Las células se contaron usando un hemocitómetro, a
continuación se centrifugó a 1000 rpm durante 10 minutos. Se retiró
el medio y se resuspendieron las células en 4 ml de RPMI. Esta
fracción contenía las PBMC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se colocaron 100 \mul de Dynabeads
(anti-h CD19) en un tubo de plástico de 5 ml. Se
añadieron 3 ml de PBS estéril a las perlas y se mezcló, y se colocó
en un soporte magnético, a continuación se dejó en reposo durante 2
minutos. Se retiró la disolución usando una pipeta Pasteur. Se
añadieron 3 mil de PBS estéril, se mezcló y se colocó en el soporte
magnético, a continuación se dejó en reposo durante 2 minutos. Este
procedimiento con PBS estéril se repitió una vez más durante un
total de 3 lavados. Se añadieron las PBMC en las perlas y se
incubó, mezclando, durante 30 minutos a 40ºC. El tubo que contenía
las PBMC y las perlas se colocó en el soporte magnético durante 2
minutos, a continuación se transfirió la disolución a un nuevo tubo
de 5 ml en el soporte magnético. Tras 2 minutos, se transfirió la
disolución a un nuevo tubo de 15 ml. Esta etapa se repitió cuatro
veces más, y se recogieron las disoluciones de las primeras cuatro
veces en el tubo de 15 ml, posteriormente se centrifugó a 1000 rpm
durante 5 minutos. Esta etapa produjo el sedimento para la
separación de las células T.
Se añadieron 100 \mul de RPMI (con aditivos)
para recoger las perlas, y se transfirió la disolución a un tubo de
0,7 ml. Se añadieron 10 \mul de perlas Dynal Detacha a la
suspensión a temperatura ambiente y se dejó en un agitador de
rotación durante 45 minutos. La suspensión se transfirió a un nuevo
tubo de 5 ml y se añadieron 3 ml de RPMI (con aditivos). El tubo se
colocó en el soporte magnético durante 2 minutos. Se transfirió la
disolución a un nuevo tubo de 5 ml y se dejó en el soporte durante 2
minutos, a continuación se colocó en un tubo de 15 ml. La etapa
anterior se repitió tres veces más, recogiendo la disolución en el
tubo de 15 ml. Se centrifugó el tubo de 15 ml a 1000 rpm durante 10
minutos, y se resuspendieron las células en 10 ml de RPMI. La etapa
de lavado se repitió 2 veces más durante un total de 3 lavados. Las
células se contaron antes de la última centrifugación. Esta etapa
completó la purificación de las células B. Se almacenaron las
células en FCS al 90% y DMSO al 10% y se congelaron a -80ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó la columna de enriquecimiento de
células T (R&D systems, kit para columna de
anti-h CD 3) usando 20 ml de 1 X tampón de lavado
de columna mezclando 2 ml de 10 X tampón de lavado de columna y 18
ml de agua destilada estéril. Se limpió la columna con etanol al
70% y se colocó en la parte superior de un tubo de 15 ml. En primer
lugar se retiró el tapón superior de la columna para evitar la
entrada de aire en la parte inferior de la columna. A continuación,
se retiró el tapón inferior y se limpió la punta con etanol al 70%.
Se dejó fluir el líquido dentro de la columna al tubo de 15 ml. Se
colocó un nuevo tubo de 15 ml estéril bajo la columna una vez que
el tampón había llegado al nivel del filtro blanco. La fracción de
PBMC sin las células B se suspendió en 1 ml de tampón y se añadió a
la parte superior de la columna. Se dejó incubar las células con la
columna a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se eluyeron las
células T de la columna con 4 alícuotas de 2 ml cada una de 1 X
tampón de lavado de columna. Las células T recogidas se
centrifugaron a 1000 rpm durante 5 minutos. Se retiró el
sobrenadante y se resuspendieron las células en 10 ml de RPMI. Las
células se contaron y se centrifugaron una vez más. Se eliminó el
sobrenadante, completando la purificación de las células T. Las
células se almacenaron en FCS al 90% y DMSO al 10% y se congelaron a
-80ºC.
Para los procedimientos anteriores, la
composición de RPMI contenía FCS al 10% (inactivado a 56ºC durante
45 minutos), Pen/Strep al 1% (Penicilina 100 \mu/ml,
Estreptomicina 0,1 \mug/ml), Glutamato al 1%, piruvato de sodio al
1%, 2-ME 50 \muM.
\vskip1.000000\baselineskip
Se incubaron células Ramos (10^{6}
células/muestra) en 100 \mul de anticuerpo primario (10 \mug/ml
en PBS-BSA) durante 20 minutos a 4ºC. Tras 3
lavados con PBS-BSA o HBSS- BSA, se incubaron
células en 100 \mul de fragmentos F(ab')2 de anticuerpos
anti IgG humana de cabra marcados con FITC (Caltaq) durante 20
minutos a 4ºC. Tras 3 lavados con PBS-BSA y 1
lavado con PBS, se resuspendieron las células en 0,5 ml de PBS. Los
análisis se realizaron con un FACSCAN V (Becton Dickinson, San Jose,
California).
\vskip1.000000\baselineskip
Se fusionaron esplenocitos de ratones
inmunizados con células de mieloma murino SP 2/0 o P 3 x 63Ag8.653
en una relación de 10:1 usando polietilenglicol al 50% como está
descrito previamente por de Boer y col. (1988) J. Immunol. Meth.
113:143. Las células fusionadas se resuspendieron en medio IMDM
completo suplementado con hipoxantina (0,1 mM), aminopterina (0,01
mM), timidina (0,016 mM), y hIL-6 0,5 ng/ml
(Genzyme, Cambridge, Massachusetts). A continuación se
distribuyeron las células fusionadas entre los pocillos de placas de
cultivo tisular de 96 pocillos, de manera que cada una contenía 1
hibridoma en crecimiento en promedio.
Tras 10-14 días se analizaron
los sobrenadantes de las poblaciones de hibridomas para detectar la
producción de anticuerpos específicos. Para la detección de
anticuerpos específicos por los clones de hibridoma, se combinaron
los sobrenadantes de cada pocillo y se probaron para especificidad
de actividad anti-CD 40 por ELISA en primer lugar.
A continuación se usaron los positivos para tinción fluorescente de
células de las células B transformadas con VEB como se describió
para el ensayo FACS anteriormente. Las células de hibridomas
positivos se clonaron dos veces por dilución limitante en IMDM/FBS
que contenía hIL-6 0,5 ng/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
Se generaron varios anticuerpos monoclonales
anti CD40 antagonistas del isotipo IgG1, totalmente humanos. Se
usaron ratones transgénicos que contienen el locus de cadena pesada
de IgG1 humana y el locus de cadena \kappa humana (Abgenix
\gamma-1 tecnología XenoMouse® (Abgenix; Fremont,
California)) para generar estos anticuerpos. Se usaron como
inmunógeno células SF9 que expresan el dominio extracelular de CD40,
Se fusionó un total de 31 bazos de ratones con las células SP2/0 de
mieloma de ratón para generar 895 anticuerpos que reconocen el CD40
recombinante en ELISA (Tablas 1A y 1B). En promedio aproximadamente
el 10% de los hibridomas producidos usando tecnología Abgenix
XenoMouse® pueden contener la cadena ligera lambda de ratón en lugar
de la cadena kappa humana. Se seleccionar los anticuerpos que
contenían cadena ligera lambda de ratón y se descartaron. Se
seleccionó una subserie de 260 anticuerpos que también mostraban
unión al CD40 de superficie celular para otro análisis. Los
hibridomas estables seleccionados durante una serie de
procedimientos de subclonación se usaron para más caracterización en
ensayos de unión y funcionales.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Se identificaron clones de otros 7 hibridomas
que tenían actividad antagonista (Tabla 2 anterior). Basado en su
potencia antagonista relativa y actividades de ADCC, se
seleccionaron dos clones de hibridoma para otra evaluación. Se
denominan 131.2F8.5.9 (5.9) y 153.8E2.D10,D6.12.12 (12.12). El
perfil de unión de estos dos anticuerpos a la línea celular de
linfoma CD40+ se muestra como un histograma de citometría de flujo
en la Figura 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ADNc que codifican las regiones variables de
los anticuerpos candidato se amplificaron por PCR, se clonaron y se
secuenciaron. Las secuencias de aminoácido para la cadena ligera y
cadena pesada del anticuerpo CHIR-12.12 se
presentan en las Figuras 9A y 9B, respectivamente. Véase también SEC
ID Nº 2 (cadena ligera para mAb CHIR-12.12) y SEC
ID Nº 4 (cadena pesada para mAb CHIR-12.12). En la
Figura 9B se muestra una variante de la cadena pesada para mAb
CHIR-12.12 (véase también SEC ID Nº 5), que difiere
de la SEC ID Nº 4 porque tiene un residuo alanina sustituido por un
residuo serina en la posición 153 de SEC ID Nº 4. Las secuencias de
nucleótidos que codifica la cadena ligera y cadena pesada del
anticuerpo CHIR-12.12 se presentan en las Figuras
10A y 10B, respectivamente. Véase también SEC ID Nº 1 (secuencia
codificadora para cadena ligera para mAb CHIR-12.12)
y SEC ID Nº 3 (secuencia codificadora para cadena pesada para mAb
CHIR-12.12). Las secuencias de aminoácido para la
cadena ligera y cadena pesada del anticuerpo
CHIR-5.9 se presentan en las Figuras 11A y 11B,
respectivamente. Véase también SEC ID Nº 6 (cadena ligera para mAb
CHIR-5.9) y SEC ID Nº 7 (cadena pesada para mAb
CHIR-5.9). En la Figura 11B A se muestra una
variante de la cadena pesada para mAb CHIR-5.9
(véase también SEC ID Nº 8), que difiere de la SEC ID Nº 7 porque
tiene un residuo alanina sustituido por un residuo serina en la
posición 158 de SEC ID Nº 7.
Como se espera para los anticuerpos obtenidos de
hibridomas independientes, hay una variación sustancial en las
secuencias de nucleótidos en las regiones determinantes de
complementariedad (CDR). Se cree que la diversidad en la región de
CDR3 de V_{H} determina de manera significativa la especificidad
del anticuerpo.
\vskip1.000000\baselineskip
Los anticuerpos candidatos
CHIR-5.9 y CHIR-12.12 previenen la
unión del ligando de CD40 al CD40 de superficie celular y desplazan
el ligando de CD40 unido previamente. Se probó la capacidad de los
anticuerpos CHIR-5.9 y CHIR-12.12
para prevenir la unión del ligando de CD40 al CD40 en la superficie
de una línea celular de linfoma (Ramos). La unión de ambos
anticuerpos (no marcados) evitó la posterior unión del ligando
PE-CD40 según se midió por ensayos de citometría de
flujo (Figura 2A). En una segunda serie de ensayos se probó la
capacidad de los dos anticuerpos para reemplazar el ligando de CD40
unido previamente al CD40 de superficie celular. Ambos anticuerpos
fueron eficaces para competir con el ligando de CD40 unido
previamente, siendo CHIR-5.9 ligeramente más eficaz
que CHIR-12.12 (Figura 2B).
\vskip1.000000\baselineskip
Los anticuerpos monoclonales candidatos
CHIR-5.9 y CHIR-12.12 compiten uno
con el otro por la unión al CD40 pero no con 15B8, un mAb IgG2 anti
CD40 (véase documento de Publicación Internacional Nº WO 02/28904).
Se diseñaron estudios de unión competitiva de anticuerpos usando
Biacore con chips biosensores CM5 con proteína A inmovilizada por
medio de acoplamiento de aminas, que se usó para capturar anti CD40,
CHIR-12.12, o 15B8. Se observaron las curvas de
unión de asociación/disociación normales con concentraciones
variables de CD40-his (datos no mostrados). Para
los estudios de competición, se capturaron
CHIR-12.12 o 15B8 en la superficie de la proteína
A. Posteriormente se hizo fluir un complejo
CD40-his/Fab de CHIR-5.9 (CD40 100
nM: Fab de CHIR-5.9 1 \muM), en concentraciones
variables, a través de la superficie modificada. En el caso de
CHIR-12.12, no se observó asociación del complejo,
que indica que CHIR-5.9 bloquea la unión de
CHIR-12.12 a CD40-his. Para 15B8,
se observó asociación del complejo Fab CHIR-5.9 que
indica que CHIR-5.9 no bloquea la unión de 15B8 al
sitio de unión de CD40. Sin embargo, la tasa de disociación del
complejo aumentó drásticamente (datos no mostrados).
También se determinó que 15B8 y
CHIR-12.12 no compiten por la unión de
CD40-his. Este experimento se llevó a cabo
capturando CHIR-12.12 en el chip biosensor de
proteína A, bloqueando los sitios residuales de proteína A con
hIgG1 control, uniendo CD40-his y a continuación
haciendo fluir 15B8 sobre la superficie modificada. 15B8 se unió
bajo estas condiciones indicando que CHIR-12.12 no
bloquea la unión de 15B8 al CD40.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inmovilizó proteína A en chips biosensores
CM5 a través de acoplamiento de aminas. Se capturaron anticuerpos
monoclonales anti-CD40 humanos, en una concentración
de 1,5 \mug/ml, sobre la superficie modificada del biosensor
durante 1,5 minutos a 10 \mul/min. Se hizo fluir
CD40-his recombinante soluble sobre la superficie
del biosensor en concentraciones variables. El anticuerpo y el
antígeno se diluyeron en HEPES 0,01 M pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3
mM, Tensioactivo P al 20 0,005% (HBS-EP). Se
determinaron las constantes cinéticas y de afinidad usando el
programa informático Biaevaluation con un ajuste de interacción
modelo/global de 1:1.
Como se muestra en la Tabla 3 a continuación,
hay una diferencia de 121 veces en la tasa de disociación de
CHIR-5.9 y CHIR-12.12 que da como
resultado una afinidad 24 veces mayor para
CHIR-12.12.
\vskip1.000000\baselineskip
La interacción entre CD40 y el ligando de CD40
induce la proliferación de células B humanas. Se espera que un
anticuerpo anti-CD40 antagonista inhiba esta
proliferación. Se probó la capacidad de dos anticuerpos candidatos
(CHIR-5.9 y CHIR-12.12) para inhibir
la proliferación de PBMC de sujetos humanos normales inducida por
ligando de CD40. Se usaron células CHO que expresan ligando de CD40
(CD40L) por transfectante fijadas con formaldehído como fuente de
ligando de CD40. Se cultivaron PBMC humanas durante 4 días con las
usaron células CHO que expresan ligando de CD40 fijadas con
formaldehído en presencia de concentraciones variables de mAb anti
CD40 CHIR-5.9 o CHIR-12.12. La
proliferación se midió por la incorporación de timidina tritiada.
Las células se sometieron a pulsos de timidina marcada con tritio a
37ºC durante 14-18 horas.
Se encontró que ambos anticuerpos eran eficaces
para inhibir la proliferación de PBMC humanas inducida por ligando
de CD40 (Tabla 4A, mAb CHIR-5.9, Tabla 4B, mAb
CHIR-12.12). El experimento se realizó con múltiples
donadores de PBMC (n=12 para CHIR-5.9 y n=2 para
CHIR-12.12) para asegurar que la inhibición
observada no era una peculiaridad de las células de un único
donador. Las evaluaciones de seguimiento con otros 4 donadores de
PBMC se llevaron a cabo para mAb CHIR-12.12 con
tendencias similares observadas. Se usó una amplia variedad de
concentraciones de anticuerpo (0,01 \mug/ml hasta 100 \mug/ml)
en estos ensayos. En la mayoría de los casos pudo alcanzarse
inhibición prácticamente completa de la proliferación inducida por
ligando de CD40 a una concentración de anticuerpos de 0,1
\mug/ml. La concentración de anticuerpos (nM) para inhibir el 50%
de la proliferación de linfocitos inducida por ligando de
CD-40 (CI50) para linfocitos de 6 donadores dio una
CI50 promedio (nM) de 47 (DE = 21; donador 1, 24; donador 2, 66;
donador 3, 45; donador 4, 84; donador 5, 30; donador 6, 35), que se
compara de manera favorable con la CI50 promedio (nM) de 49,65
mostrada en la Tabla 4B. En base a la serie de datos actuales,
ambos anticuerpos candidatos parecen similares en su potencia para
inhibir la proliferación de PBMC normales inducida por ligando de
CD40.
\newpage
Además de las células B, las PBMC humanas
también contienen células citolíticas naturales que pueden mediar la
citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC). Para aclarar el
mecanismo de inhibición de la proliferación mediada por anticuerpos,
se realizaron ensayos con células B purificadas de PBMC humanas. De
manera similar a los resultados obtenidos con PBMC, ambos
anticuerpos inhibieron de manera potente la proliferación de células
B purificadas inducida por ligando de CD40 (Tabla 5, n = 3). Estos
datos demuestran que la actividad antagonista de los anticuerpos
candidatos, y no el mecanismo de ADCC, es la causa de la inhibición
de la proliferación en estos ensayos.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
El ligando de CD40 activa la proliferación de
células B normales y células B de linfoma de células B. La unión de
algunos anticuerpos anti-CD40 (agonistas) puede
proporcionar una señal estimuladora similar para la proliferación
de células B normales y cancerosas. Los anticuerpos con fuerte
actividad estimuladora de células B no son candidatos adecuados
para el tratamiento terapéutico de linfoma de células B. Se probó la
capacidad de los dos anticuerpos candidatos para inducir la
proliferación de células B de donadores voluntarios normales. Las
células B purificadas por medio de centrifugación en gradiente de
Ficoll-Hypaque Plus de PBMC de donadores normales
se cultivaron en placas de 96 pocillos con concentraciones variables
de los anticuerpos candidatos (intervalo de 0,001 hasta 100
\mug/ml) durante un total de 4 días. En el grupo de control
positivo, las PBMC se cultivaron con células CHO que expresan
ligandos de CD40 fijadas con formaldehído. La proliferación de
células B se midió por la incorporación de timidina marcada con
tritio a 37ºC durante 14-18 horas. Mientras que el
ligando de CD40 presentado en las células CHO indujo potente
proliferación de células B que dio un índice de estimulación (IE)
promedio de 145, los anticuerpos candidatos indujeron sólo una débil
proliferación con un índice de estimulación de 2,89 y 5,08 para
CHIR-12.12 y CHIR-5.9,
respectivamente (n = 3) (Tabla 6).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Además de células B, las PBMC humanas contienen
tipos de células que llevan receptores Fc (FcR) para moléculas de
IgG1 que pueden proporcionar entrecruzamiento de anticuerpos anti
CD40 unidos a CD40 en células B. Este entrecruzamiento podría
aumentar potencialmente la actividad estimuladora de los anticuerpos
anti CD40. Para confirmar la ausencia de actividad estimuladora de
células B de los anticuerpos CHIR-5.9 y
CHIR-12.12 en presencia de células entrecruzadas,
se realizaron experimentos de proliferación con PBMC totales
conteniendo células B así como células FcR+. Los datos de estos
experimentos (Tabla 7A, mAb CHIR-5.9; Tabla 7B, mAb
CHIR-12.12) confirman que estos anticuerpos
candidatos, incluso en presencia de células que llevan FcR, en
general no estimulan la proliferación de las células B más allá de
la proliferación de fondo inducida por la IgG1 humana de control
(n=10). El ligando de CD40 indujo un índice de estimulación (IE)
promedio de 7,41. El IE promedio con los anticuerpos candidatos fue
de 0,55 y 1,05 para CHIR-12.12 y
CHIR-5.9, respectivamente. Sólo una de las 10 PBMC
de los donadores probadas mostró respuesta estimuladora para el
anticuerpo CHIR-5.9 (donador Nº 2 en la Tabla 7).
La ausencia de actividad estimuladora por los mAb candidatos se
confirmó además por medio de la medición de la proliferación de
PBMC en respuesta a los anticuerpos anti CD40 candidatos
inmovilizados en la superficie de plástico de los
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
pocillos de cultivo (n = 2). El IE
promedio con estimulación con ligando de CD40,
CHIR-12.12 y CHIR-5.9 fue de 22,
0,67 y 1,2, respectivamente (Tabla 8). Tomados juntos, estos datos
muestran que los anticuerpos anti CD40 candidatos no tienen fuertes
propiedades estimuladoras de las células
B.
Los anticuerpos candidatos pueden causar
citolisis de células diana que llevan CD40 (líneas de linfoma)
mediante el mecanismo de ADCC. Tanto CHIR-5.9 como
CHIR-12.12 son anticuerpos de isotipo IgG1
totalmente humanos y se esperan que tengan la capacidad para
inducir la citolisis de células diana mediante el mecanismo de ADCC.
Se probó su capacidad para causar citolisis de líneas celulares
cancerosas en ensayos in vitro. Se seleccionaron dos líneas
celulares de linfoma humanas (Ramos y Daudi) como células diana para
estos ensayos. Se usaron PBMC o células NK enriquecidas de 8
donadoras voluntarios normales como células efectoras en estos
ensayos. Se observó una respuesta de ADCC más potente con
CHIR-12.12 comparado con CHIR-5.9
frente a las células diana de ambas líneas celulares cancerosas de
linfoma. Las líneas celulares de linfoma también expresan CD20, el
antígeno diana para rituximab (Rituxan®), que hizo posible la
comparación de la actividad ADCC de estos dos mAb candidatos con la
actividad de ADCC de rituximab. Para la diana de línea celular de
linfoma, se observó una lisis específica promedio de 35%, 59% y 47%
para CHIR-5.9, CHIR-12.12, y
rituximab, respectivamente, cuando se usaron en una concentración
de 1 \mug/ml (Tabla 9). Los dos anticuerpos no mostraron mucha
actividad en los ensayos de citotoxicidad dependiente del
complemento (CDC).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Se aislaron células de NHL de ganglios
linfáticos biopsiados de pacientes y se conservaron en nitrógeno
líquido hasta el uso. La viabilidad celular en el momento del
análisis era superior al 90%. Las células de dos pacientes sensibles
a rituximab y de tres pacientes resistentes a rituximab (cinco
pacientes en total) se tiñeron con un 15B8-FTTC
marcado directo o con 15B8 más
anti-huIgG2-FITC y se analizaron
por citometría de flujo. Se encontró que las células de NHL de todos
los pacientes expresaban CD40. La Tabla 10 muestra que un promedio
de 76% de células de NHL expresan CD40 (un intervalo del
60-91%).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se sabe que el ligando de CD40 proporciona una
señal estimuladora para la supervivencia y la proliferación de las
células de linfoma de pacientes con NHL. La unión de ciertos
anticuerpos anti CD40 (agonistas) puede proporcionar una señal
estimuladora similar para la proliferación de las células cancerosas
de los pacientes. Los anticuerpos con fuerte actividad estimuladora
de las células B no son candidatos adecuados para el tratamiento
terapéutico de los linfomas de células B. Se probó la capacidad de
los dos anticuerpos candidatos para inducir la proliferación de
células de NHL de 3 pacientes. Se cultivaron las células aisladas de
biopsias de ganglios linfáticos (GL) con concentraciones variables
de anticuerpos candidatos (intervalo de 0,01 hasta 300 \mu/ml)
durante un total de 3 días. La proliferación celular se midió por
medio de la incorporación de timidina tritiada. Ninguno de los dos
mAb candidatos indujo ninguna proliferación de células cancerosas en
ninguna concentración probada (Tabla 11). Los anticuerpos, incluso
en presencia de IL-4 añadida de manera exógena, un
factor de crecimiento, no indujeron la proliferación de las células
de NHL (probadas en las células de uno de los tres pacientes).
Estos resultados indican que CHIR-5.9 y
CHIR-12.12 no son anticuerpos anti CD40 agonistas y
que no estimulan la proliferación in vitro de las células de
NHL de los pacientes.
\vskip1.000000\baselineskip
La interacción entre CD40 y el ligando de CD40
induce la proliferación de células cancerosas de pacientes con NHL.
Se espera que un anticuerpo anti-CD40 antagonista
inhiba esta proliferación. Se probó la capacidad de los dos
anticuerpos anti CD40 candidatos en concentraciones variables (0,01
\mug /ml hasta 100 \mug/ml) para inhibir la proliferación
inducida por ligandos de CD40 de células de NHL de los pacientes. Se
cultivaron las células de NHL de los pacientes en suspensión sobre
un alimentador de expresión de CD40L en presencia de
IL-4. La proliferación de las células de NHL se
midió por la incorporación de ^{3}H-timidina. Se
encontró que ambos anticuerpos son muy eficaces para inhibir la
proliferación de células de NHL inducida por ligandos de CD40
(Tabla 12, n = 2). Pudo alcanzarse la inhibición prácticamente
completa de la proliferación inducida por ligandos de CD40 con
concentraciones de anticuerpos de 1,0 a 10 \mug/ml.
Se investigaron los efectos de
CHIR-5.9 sobre el número de células de NHL viables
cuando se cultivan con células que llegan ligando de CD40 durante
un período de tiempo prolongado (días 7, 10 y 14). La señal mediada
por el ligando de CD40 a través de CD40 es importante para la
supervivencia de las células B. Esta serie de experimentos evaluó
el efecto de los anticuerpos anti CD40 sobre el número de células de
NHL en los días 7, 10 y 14. Se cultivaron células de NHL de cinco
pacientes en suspensión sobre un soporte de células alimentadoras
con expresión de CD40L irradiado en presencia de
IL-4. Los anticuerpos IgG humano de control y
CHIR-5.9 se añadieron en concentraciones de 10
\mug/ml en el día 0 y en el día 7. Se contaron las células viables
bajo cada condición en el día especificado. Los números de células
aumentaron en el grupo de control (IgG) con el tiempo como se
esperaba. Se recuperaron números de células reducidos de los
cultivos tratados con CHIR-5.9 comparado con el
grupo de control. El mayor nivel de reducción en el número de
células por el anticuerpo CHIR-5.9 se observó en el
día 14 y fue en promedio de 80,5% (un intervalo de
49-94%) comparado con el control de isotipo (n = 5).
Estos datos se resumen en la Tabla 13.
Tanto CHIR-5.9 como
CHIR-12.12 son anticuerpos de tipo IgG1 totalmente
humanos y se ha mostrado que inducen la citolisis de líneas
celulares de linfoma in vitro por el mecanismo de ADCC (Tabla
9). Se probó su capacidad para causar citolisis de células
cancerosas de un único paciente con NHL en ensayos in vitro.
En este ensayo se usaron como células efectoras células NK
enriquecidas de un donador voluntario normal recién extraídas tras
el aislamiento o tras cultivar durante la noche a 37ºC. Se
obtuvieron resultados similares con las células NK recién aisladas
y con las células NK usadas tras cultivar durante la noche. El nivel
más alto de ADCC se observó con CHIR-12.12
comparado con CHIR-5.9 frente a las células de NHL
del paciente. Las células de NHL también expresan CD20, el antígeno
diana para rituximab (Rituxan®), que hizo posible la comparación de
la actividad ADCC de estos dos mAb candidatos con rituximab. El
anticuerpo CHIR-12.12 y rituximab muestran un nivel
de actividad ADCC similar con una puntuación inferior para
CHIR-5.9 en este ensayo. Estos datos se muestran en
las Figuras 3A y 3B.
\vskip1.000000\baselineskip
Los anticuerpos candidatos pueden bloquear la
supervivencia y la proliferación mediadas por CD40 de células
cancerosas de pacientes con CLL. Se cultivaron células de CLL de
pacientes en suspensión sobre células CHO que expresan CD40L
fijadas con formaldehído bajo dos condiciones diferentes: adición de
anticuerpo IgG de isotipo humano (control); y adición de anticuerpo
monoclonal CHIR-5.9 o CHIR-12.12.
Todos los anticuerpos se añadieron en concentraciones de 1, 10 y
100 \mug/ml en ausencia de IL-4. Los recuentos de
células se realizaron a las 24 y 48 horas por medio de ensayo MTS.
Se recuperaron números de células reducidos de los cultivos
tratados con CHIR-5.9 (n = 6) y
CHIR-12.12 (n = 2) comparados con el grupo de
control. Las mayores diferencias en los números de células entre
los cultivos tratados con mAb anti CD40 y tratados con anticuerpo
de control se observaron en el punto temporal de 48 horas. Estos
datos se resumen en la Tabla 14.
\vskip1.000000\baselineskip
Se espera que los mAb candidatos produzcan los
efectos farmacológicos deseados para reducir la carga tumoral por
cualquiera de dos mecanismos antitumorales, bloqueo de la señal de
proliferación/supervivencia e inducción de ADCC. Los modelos de
xenoinjerto de linfoma humano disponibles en la actualidad usan
líneas celulares de linfoma de largo plazo que, a diferencia de las
células cancerosas primarias, no son dependientes de la estimulación
de CD40 para su crecimiento y supervivencia. Por consiguiente, se
espera que el componente de esta actividad antitumoral de estos mAb
basado en el bloqueo de la señal de proliferación/supervivencia
tumoral no contribuya a la eficacia antitumoral en estos modelos.
La eficacia en estos modelos es dependiente de la ADCC, el segundo
mecanismo antitumoral asociado con los mAb CHIR-5.9
y CHIR-12.12. Se evaluaron las actividades
antitumorales de los mAb candidatos con dos modelos de xenoinjerto
de linfoma humano en líneas celulares Namalwa y Daudi. Para
demostrar más su actividad terapéutica, se evaluaron estos mAb en un
modelo de xenoinjerto no estadificado y xenoinjerto estadificado de
linfoma humano basados en la línea celular Daudi.
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando se administró por vía intraperitoneal
(i.p.) una vez a la semana durante un total de 3 dosis,
CHIR-12.12, uno de los dos mAb candidatos, inhibió
significativamente el crecimiento del linfoma de células B agresivo
no estadificado (Namalwa) en una manera dependiente de la dosis
(Figura 4). El segundo mAb candidato, CHIR-5.9, se
probó sólo en una dosis única en este estudio y fue menos eficaz que
CHIR-12.12 en la misma dosis. De manera
interesante, se encontró que CHIR-12.12 fue más
eficaz en este modelo que rituximab. Es posible que la eficacia
inferior por medio de rituximab pudiera deberse a la baja expresión
de CD20 en la línea celular de linfoma Namalwa. La eficacia
observada con los mAb candidatos tiene mayor importancia porque sólo
uno de los dos mecanismos de citolisis de células cancerosas (ADCC)
es operativo en el actual modelo de xenoinjerto de linfoma. Se
espera que dos mecanismos de citolisis, ADCC y bloqueo de la señal
de supervivencia, contribuyan a las actividades antitumorales en
los pacientes humanos con linfoma. Esto probablemente aumente la
posibilidad de alcanzar eficacia en los pacientes humanos con
linfoma. Los mAb anti CD40 candidatos también mostraron una
tendencia hacia la inhibición del crecimiento tumoral en un segundo
modelo de linfoma de células B (modelo de Daudi no validado, datos
no mostrados). En estudios de seguimiento, se mostró que los dos
anticuerpos candidatos tenían eficacia antitumoral dependiente de
la dosis, tanto en el modelo de linfoma Daudi no estadíficado como
en el estadificado (Figuras 5 y 6, respectivamente). En el modelo de
Daudi estadificado, el mAb CHIR-12.12 fue más eficaz
para reducir el volumen tumoral que una dosis similar de
Rituxan®.
\vskip1.000000\baselineskip
Para asegurar el crecimiento constante del
tumor, se irradió el cuerpo entero de ratones desnudos deficientes
en células T a 3 Gy para suprimir además el sistema inmune un día
antes de la inoculación del tumor. Las células tumorales se
inocularon por vía subcutánea en el costado derecho a razón de 5 x
10^{6} células por ratón. El tratamiento se inició un día después
de la implantación del tumor (modelos de xenoinjerto de linfoma de
células B humano subcutáneo no estadificado, Namalwa y Daudi) o
cuando el volumen del tumor alcanzó 200-400
mm^{3} (modelo de estadificado Daudi, usualmente 15 días después
de la inoculación del tumor). Se inyectaron los ratones que
llevaban el tumor con los mAb anti CD40 por vía intraperitoneal
(i.p.) una vez a la semana en las dosis indicadas. Se registraron
los volúmenes tumorales dos veces por semana. Cuando el volumen del
tumor en cualquier grupo alcanzó 2500 mm^{3}, el estudio se dio
por terminado. Nótese que en el modelo estadificado de Daudi, los
datos de volumen tumoral se analizaron hasta el día 36 por la muerte
de algunos ratones después de ese día. La regresión completa (CR)
se contó hasta el final del estudio. Los datos se analizaron usando
ANOVA o prueba de Kruskal-Wallis y la
correspondiente prueba posterior para la comparación de grupos
múltiples.
En el modelo no estadificado de Namalwa, el mAb
anti CD40 CHIR-12.12, pero no Rituxan® (rituximab),
aumentó significativamente (p= <0,01) el crecimiento de los
tumores de Namalwa (reducción del volumen tumoral del 60% frente al
25% para rituximab, n = 10 ratones/grupo) (Figura 4). Por
consiguiente, en este modelo, el mAb anti CD40
CHIR-12.12 fue más potente que rituximab. Cabe
destacar que el segundo mAb candidato, CHIR-5.9, fue
al menos tan eficaz como rituximab en una dosis de 1/10 de la de
rituximab. Ambos mAb anti CD40, CHIR-12.12 y rituxan
previnieron significativamente el desarrollo tumoral en el modelo de
tumor no estadificado de Daudi (14/15 resistencia al desafío
tumoral) (Figura 5).
Cuando estos anticuerpos monoclonales anti CD40
se compararon además en un modelo de xenoinjerto estadificado de
Daudi, en el que el tratamiento comentó cuando el tumor subcutáneo
era palpable, el mAb anti CD40 CHIR12.12 en una dosis de 1 mg/kg
causó reducción significativa del tumor (p=0,003) con regresión
completa del 60% (6/10), mientras que rituximab en la misma dosis no
inhibió significativamente el crecimiento tumoral ni causó regresión
completa (0/10). Véase Figura 6.
En resumen, el mAb anti CD40
CHIR-12.12 inhibió significativamente el crecimiento
tumoral en modelos experimentales de linfoma. En la misma dosis y el
mismo régimen, el mAb CHIR-12.12 mostró mejor
actividad anticancerosa que Rituxan® (rituximab). Además, no se
observaron signos de toxicidad en esta dosis y en este régimen.
Estos datos sugieren que el mAb anti CD40 CHIR-12.12
tiene potente actividad anti linfoma humano in vitro y en
modelos de xenoinjerto y podría ser clínicamente eficaz para el
tratamiento del linfoma.
\vskip1.000000\baselineskip
La farmacocinética de mAb anti CD40 en ratones
se estudió tras una administración única IV e IP. El mAb anti CD40
exhibió alta biodisponibilidad sistémica tras la administración IP,
y semivida terminal prolongada (> 5 días) (datos no mostrados).
Este estudio piloto se realizó para ayudar en el diseño de estudios
de farmacología; sin embargo, tiene poca o ninguna importancia para
la actividad de desarrollo de este mAb ya que este mAb totalmente
humano no reacciona de manera cruzada con CD40 de ratón.
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar la localización del epítopo en
CD40 reconocido por los anticuerpos monoclonales
CHIR-12.12 y CHIR-5.9, se realizaron
análisis SDS-PAGE y transferencia Western. Se separó
CD40 purificado (0,5 \mug) en un gel NUPAGE al
4-12% bajo condiciones reductoras y no reductoras,
se transfirió a membranas PVDF, y se realizó el sondeo con
anticuerpos monoclonales en una concentración de 10 \mug/ml. Las
transferencias se sondearon con IgG anti humano conjugada con
fosfatasa alcalina y se desarrolló usando el sustrato estabilizado
Azul Western® para fosfatasa alcalina (Promega).
Los resultados indican que el anticuerpo
monoclonal anti CD40 CHIR12.12 reconoce epítopos tanto en la forma
no reducida como en la forma reducida de CD40, exhibiendo la forma
no reducida de CD40 mayor intensidad que la forma reducida de CD40
(Tabla 15; transferencias no mostradas). El hecho de que el
reconocimiento fuera positivo para ambas formas de CD40 indica que
este anticuerpo interactúa con un epítopo conformacional, parte del
cual es una secuencia lineal. El anticuerpo monoclonal
CHIR-5.9 reconoce principalmente la forma no
reducida de CD40 sugiriendo que este anticuerpo interactúa
principalmente con un epítopo conformacional (Tabla 15;
transferencias no mostradas).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para realizar un mapa de la región antigénica en
CD40, se clonaron los cuatro dominios extracelulares de CD40 y se
expresaron en células de insecto como proteínas de fusión GST. La
secreción de los cuatro dominios se aseguró con una señal de
secreción GP67. El sobrenadante de las células de insecto se analizó
por análisis SDS-PAGE y transferencia Western para
identificar el dominio que contenía el epítopo.
EL anticuerpo monoclonal
CHIR-12.12 reconoce un epítopo en el Dominio 2 tanto
bajo condiciones reductoras como no reductoras (Tabla 16;
transferencias no mostradas). Por el contrario, el anticuerpo
monoclonal CHIR-5.9 exhibe reconocimiento muy débil
para el Dominio 2 (Tabla 16; transferencias no mostradas). Ninguno
de estos anticuerpos reconoce los Dominios 1, 3 ó 4 en este
análisis.
\vskip1.000000\baselineskip
Para definir con más precisión el epítopo
reconocido por el mAb CHIR-12.12, se sintetizaron
péptidos del Dominio 2 extracelular de CD40, que corresponde a la
secuencia PCGESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICT (residuos
61-104 de la secuencia mostrada en SEC ID Nº 10 o
SEC ID Nº 12). Se generaron membranas de síntesis SPOTs (Sigma)
conteniendo treinta y cinco péptidos 10-meros con un
desplazamiento de 1 aminoácido. Se realizó el análisis de
transferencia Western con mAb CHIR-12.12 y anti IgG
humana marcado con beta galactosidasa como anticuerpo secundario. Se
desmontó la transferencia y se volvió a sondear con mAb
CHIR-5.9 para determinar la región reconocida por
este anticuerpo.
Los análisis SPOTs sondando con anticuerpo
monoclonal anti CD40 CHIR-12.12 en una concentración
de 10 \mug/ml dieron reacciones positivas con las transferencias
18 a 22. La región de la secuencia cubierta por estos péptidos se
muestra en la Tabla 17.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Estos resultados corresponden a un epítopo
lineal de: YCDPNL (residuos 82-87 de la secuencia
mostrada en SEC ID Nº:10 o SEC ID Nº 12). Este epítopo contiene Y82,
D84 y N86, que se ha predicho que están implicados en la interacción
CD40-ligando de CD40.
Los análisis SPOTs con mAb
CHIR-5.9 mostraron un débil reconocimiento de los
péptidos representados por las transferencias 20-22
mostradas en la Tabla 18, sugiriendo implicación de la región
YCDPNLGL (residuos 82-89 de la secuencia mostrada en
SEC ID Nº 10 o SEC ID Nº 12) en su unión a CD40. Debe señalarse que
los mAb CHIR-12.12 y CHR-5.9
compiten uno con el otro por la unión a CD40 en el análisis
BIACORE.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Los epítopos lineales identificados por los
análisis SPOTs están dentro del módulo B1 de CD40. La secuencia del
módulo B1 de CD40 es:
\vskip1.000000\baselineskip
HKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTIC | (residuos 80-103 de SEC ID Nº 10 o SEC ID Nº 12). |
\vskip1.000000\baselineskip
Dentro del epítopo lineal identificado para
CHIR-12.12 está C83. Se sabe que este residuo de
cisteína forma un enlace disulfuro con C103. Es probable que el
epítopo conformacional del mAb CHIR-12.12 contenga
este enlace disulfuro (C83-C103) y/o aminoácidos
vecinos conformacionalmente próximos a C103.
\vskip1.000000\baselineskip
El número de moléculas de CD20 y CD40 en células
Namalwa y Daudi se determinó como se resume en la Figura 7, usando
concentraciones de anticuerpos de 0,01, 0,1, 1, 10 y 100 \mug/ml.
Como puede verse en la Figura 7, el número promedio de moléculas de
CD20 (diana para rituximab) es más elevado en ambas líneas
celulares, Namalwa y Daudi, que el número de moléculas de CD40
(diana para mAb CHIR-12.12).
\vskip1.000000\baselineskip
Se probó la actividad de ADCC del rituximab y
del mAb candidato CHIR-12.12 in vitro en
concentraciones variables contra la línea celular de linfoma de
Daudi como células diana (D) y células NK purificadas de voluntarios
humanos sanos como células efectoras (E). Se mezclaron células NK
humanas aisladas con células de linfoma de Daudi marcadas con
calceína en una relación E:D de 10. Se incubó la mezcla de células
durante 4 horas a 37ºC en presencia de las concentraciones indicadas
de mAb CHIR-12.12 o rituximab. El nivel de calceína
liberado de las células diana lisadas en el sobrenadante se midió
como Unidades Fluorescentes Arbitrarias (AFU). Se calculó el
porcentaje de lisis específica como: 100 x (AFU prueba - AFU
liberación espontánea)/(AFU liberación máxima - AFU liberación
espontánea), donde la AFU liberación espontánea es la calceína
liberada por las células diana en ausencia de anticuerpo o células
NK, y AFU liberación máxima es la calceína liberada por las células
diana tras la lisis por detergente.
Se observó lisis de células Daudi dependiente de
la concentración de anticuerpo (Figura 8; Tabla 19 a continuación).
La lisis específica máxima de células diana de linfoma inducida por
mAb anti CD40 fue mayor comparada con la lisis inducida por
rituximab (63,6% frente a 45,9%, n = 6; prueba t pareada de mAb
CHIR-12.12 frente a rituximab, p = 0,0002). Además,
la DE50 para rituximab fue en promedio (n = 6) 51,6 pM, 13 veces más
alta que la DE50 para el mAb anti CD40 CHIR 12.12 para esta
actividad.
\vskip1.000000\baselineskip
El ligando de CD40 soluble (CD40L) activa las
células B e induce diversos aspectos de respuestas funcionales,
incluidos el aumento de la supervivencia y la proliferación, y la
activación de las vías de señales de NF\kappaB, ERK/MAPK, PI3K/Akt
y p38. Además, la estimulación de CD40 mediada por CD40L proporciona
señales de supervivencia por reducción de PARP escindido e inducción
de proteínas antiapoptóticas, XIAP y Mcl-1, en
células B normales. La estimulación de CD40 mediada por CD40L
también recluta TRAF2 y TRAF3 para la unión al dominio
citoplasmático de CD40.
Los siguientes estudios demuestran que
CHIR-12.12 inhibió directamente todos estos efectos
de la estimulación en las células B humanas normales. Por ejemplo,
el tratamiento con CHIR-12.12 dio como resultado el
aumento de escisión de caspasa-9,
caspasa-3 y PARP así como la reducción de XIAP y
Mcl-1 de una manera dependiente del tiempo y de la
dosis, restaurando la apoptosis de las células B. El tratamiento con
CHIR-12.12 también inhibió la fosforilación de
I\kappaB cinasa (IKK) \alpha y \beta (vía de NF\kappaB),
ERK, Akt y p38 en respuesta a la estimulación de CD40 mediada por
CD40L. Además, se encontró que CHIR-12.12 no provocó
estos efectos apoptóticos sin la estimulación inicial de CD40
mediada por CD40L.
\vskip1.000000\baselineskip
En estos experimentos, se estimularon 0,6 x
10^{6} células B humanas normales de donadores sanos (porcentaje
de pureza entre 85 y 95%) con sCD40L 1 \mug/ml (Alexis Corp.,
Bingham, Nottinghamshire, RU). A continuación se añadió
CHIR-12.12 (10 \mug/ml) e IgG de control. Las
células se recogieron a los 0 y 20 minutos, a las 2 horas, 6 horas,
18 horas y 26 horas. Se detectaron controles de caspasa 9 escindida,
caspasa 3 escindida, PARP escindida y \beta actina en los lisados
celulares por transferencia Western.
En resumen, se observó que la estimulación de
CD40 mediada por CD40L proporcionó señales de supervivencia ya que
no dio lugar a aumentos de caspasa 9 escindida, caspasa 3 escindida
o PARP escindida con el tiempo, indicando que las células no estaban
sufriendo apoptosis. Sin embargo, el tratamiento con
CHIR-12.12 dio como resultado un aumento de estos
productos de escisión, indicando que el tratamiento con
CHIR-12.12 anuló los efectos de la unión de CD40L en
las señales de supervivencia en las células B normales estimuladas
con cCD40L, restaurando la apoptosis de las células B (datos no
mostrados).
\vskip1.000000\baselineskip
En estos experimentos, se estimularon 0,6 x
10^{6} células B humanas normales de donadores sanos (porcentaje
de pureza entre 85 y 95%) con sCD40L 1 \mug/ml (Alexis Corp.,
Bingham, Nottinghamshire, RU). A continuación se añadió
CHIR-12.12 (10 \mug/ml) e IgG de control. Las
células se recogieron a los 0 y 20 minutos, a las 2 horas, 6 horas,
18 horas y 26 horas. Se detectaron controles de
Mcl-1, XIAP, CD40 y \beta actina en los lisados
celulares por transferencia Western.
En resumen, la estimulación con sCD40L dio como
resultado la expresión sostenida de Mcl-1 y XIAP con
el tiempo. Sin embargo, el tratamiento de las células estimuladas
con sCD40L con CHIR-12.12 dio como resultado una
disminución en la expresión de estas proteínas con el tiempo (datos
no mostrados). Como Mcl-1 y XIAP son señales de
"supervivencia" capaces de bloquear la vía apoptótica, estos
resultados demuestran que el tratamiento con
CHIR-12.12 elimina el bloqueo contra la apoptosis en
las células B normales estimuladas con sCD40L.
\vskip1.000000\baselineskip
En estos experimentos, se estimularon 1,0 x
10^{6} células B humanas normales de donadores sanos (porcentaje
de pureza entre 85 y 95%) con sCD40L 1 \mug/ml (Alexis Corp.,
Bingham, Nottinghamshire, RU). A continuación se añadió
CHIR-12.12 (10 \mug/ml) e IgG de control. Las
células se recogieron a los 0 y 20 minutos. Se detectaron los
controles de IKK \alpha (Ser180) e IKK \beta (Ser 181) y de IKK
\beta total en los lisados celulares por transferencia
Western.
En resumen, la estimulación por medio de sCD40L
dio como resultado la fosforilación de IKK \alpha (Ser180) e IKK
\beta (Ser 181) con el tiempo; sin embargo, el tratamiento con
CHIR-12.12 anuló esta respuesta a la estimulación de
sCD40L en las células B normales (datos no mostrados).
\newpage
En estos experimentos, se estimularon 0,6 x
10^{6} células B humanas normales de donadores sanos (porcentaje
de pureza entre 85 y 95%) con sCD40L 1 \mug/ml (Alexis Corp.,
Bingham, Nottinghamshire, RU). A continuación se añadió
CHIR-12.12 (0,01, 0,1, 0,2, 0,5, 1,0 \mug/ml) e
IgG de control. Las células se recogieron a las 24 horas. Se
detectaron los controles de PARP escindida y \beta actina en los
lisados celulares por transferencia Western.
Brevemente, el tratamiento con
CHIR-12.12 dio como resultado el aumento de escisión
de PARP en células estimuladas con sCD40L de una manera dependiente
de la dosis y, por consiguiente, anuló la vía de señales de
supervivencia en las células B normales estimuladas con sCD40L
(datos no mostrados).
\vskip1.000000\baselineskip
En estos experimentos, se estimularon 0,6 x
10^{6} células B humanas normales de donadores sanos (porcentaje
de pureza entre 85 y 95%) con sCD40L 1 \mug/ml (Alexis Corp.,
Bingham, Nottinghamshire, RU). A continuación se añadió
CHIR-12.12 (0,5, 2 y 10 \mug/ml) e IgG de control.
Las células se recogieron a las 22 horas. Se detectaron los
controles de Mcl-1, XIAP, PARP escindida y \beta
actina en los lisados celulares por transferencia Western.
Brevemente, el tratamiento con
CHIR-12.12 redujo la expresión de
Mcl-1 y XIAP y aumentó la expresión de PARP en
células estimuladas con sCD40L de una manera dependiente de la dosis
y, por consiguiente, anuló estos bloqueos a la vía apoptótica en las
células B normales estimuladas con sCD40L (datos no mostrados).
\vskip1.000000\baselineskip
En estos experimentos, se estimularon 1,0 x
10^{6} células B humanas normales de donadores sanos (porcentaje
de pureza entre 85 y 95%) con CHIR-12.12 (10
\mug/ml) e IgG de control sola (es decir, las células no se
estimularon previamente con sCD40L antes de añadir el anticuerpo).
Las células se recogieron a las 0, 4, 14 y 16 horas. Se detectaron
los controles de XIAP, PARP escindida y \beta actina en los
lisados celulares por transferencia Western.
Brevemente, los resultados muestran que sin
estimulación de sCD40L, las células expresaron concentraciones
aumentadas de PARP escindida, mientras que la expresión de XIAP
permaneció constante, tanto en las células tratadas con IgG de
control como en las tratadas con CHIR-12.12 (datos
no mostrados). Estos datos indican que CHIR-12.12 no
provoca apoptosis en las células B humanas normales sin estimulación
de CD40L.
\vskip1.000000\baselineskip
En estos experimentos, se privaron de suero en
medio que contenía FBS al 1% 1,0 x 10^{6} células B humanas
normales de donadores sanos (porcentaje de pureza entre 85 y 95%) y
se estimularon con sCD40L 1 \mug/ml (Alexis Corp., Bingham,
Nottinghamshire, RU). Los cultivos se trataron con
CHIR-12.12 (1 y 10 \mug/ml) e IgG de control. Las
células se recogieron a los 0 y 20 minutos. Se detectaron
fosfo-IKK\alpha, fosfo-IKK\beta,
IKK\beta total, fosfoERK, ERK total, fosfo-Akt,
Akt total, fosfo-p38 y p38 total en los lisados
celulares por transferencia Western.
En resumen, la estimulación con sCD40L dio como
resultado aumentos en la fosforilación de IKK\alpha/\beta,
fosforilación de ERK, fosforilación de Akt y fosforilación de p38,
por consiguiente dando lugar a la supervivencia y/o proliferación de
las células. El tratamiento de las células con
CHIR-12.12 anuló los efectos de la estimulación de
sCD40L en estas vías de señales en las células B normales (datos no
mostrados).
\vskip1.000000\baselineskip
En estos experimentos, se privaron de suero en
medio que contenía FBS al 1% 1,0 x 10^{6} células B humanas
normales de donadores sanos (porcentaje de pureza entre 85 y 95%) y
se estimularon con sCD40L 1 \mug/ml (Alexis Corp., Bingham,
Nottinghamshire, RU). Los cultivos se trataron también con
CHIR-12.12 (1 y 10 \mug/ml), Wortmanin (un
inhibidor de PI3K/Akt, 1 y 10 \muM), LY 294002 (un inhibidor de
PI3K/Akt; 10 y 30 \muM) y PD 98095 (un inhibidor de MEK, 10 y 30
\mug/ml). Las células se recogieron a los 0 y 20 minutos. Se
detectaron fosfoERK, fosfo-Akt, Akt total,
fosfo-IKK\alpha/\beta y total en los lisados
celulares por transferencia Western.
En resumen, los resultados muestran que
CHIR-12.12 anuló la fosforilación de todas estas
moléculas de transducción de señales, mientras que los inhibidores
de transducción de señales mostraron sólo anulación específica de
las señales, indicando que CHIR-12.12 probablemente
inhibe en una etapa anterior a estas moléculas de transducción de
señales mediadas por la estimulación por CD40L (datos no
mostrados).
\vskip1.000000\baselineskip
En estos experimentos, se privaron de suero
durante cuatro horas en medio que contenía FBS al 1% 4,0 x 10^{6}
células B humanas normales de donadores sanos (porcentaje de pureza
entre 85 y 95%) y se estimularon con sCD40L 1 \mug/ml (Alexis
Corp., Bingham, Nottinghamshire, RU) durante 20 minutos. Las células
se recogieron a los 0 y 20 minutos. Se inmunoprecipitó CD40 usando
anti CD40 policlonal (Santa Cruz Biotechnology, CA), y se sondeó en
una transferencia Western con mAb anti TRAF2 (Santa Cruz
Biotechnology, CA), mAb anti TRAF3 (Santa Cruz Biotechnology, CA), y
mAb anti CD40 (Santa Cruz Biotechnology, CA).
En resumen, los resultados muestran que TRAF2 y
TRAF3 precipitaron conjuntamente con CD40 tras la estimulación de
sCD40L. Por el contrario, el tratamiento con
CHIR-12.12 anuló la formación del complejo de señal
CD40-TRAF2/3 en células B normales estimuladas con
sCD40L. No hubo cambios en la expresión de CD40 (datos no
mostrados).
Sin estar ligados por la teoría, los resultados
de estos experimentos, y los resultados en los ejemplos resumidos
anteriormente, indican que el anticuerpo CHIR-12.12
es un anticuerpo monoclonal anti CD40 antagonista de acción dual que
tiene una única combinación de atributos. Este anticuerpo monoclonal
totalmente humano bloquea las vías de señales de CD40 mediadas por
CD40L para la supervivencia y la proliferación de las células B;
este antagonismo da lugar finalmente a la muerte celular.
CHIR-12.12 también media el reconocimiento y la
unión por las células efectoras, iniciando la citotoxicidad celular
dependiente de anticuerpos (ADCC). Una vez que
CHIR-12.12 está unido a las células efectoras, se
liberan las enzimas citolíticas, dando lugar a la apoptosis y lisis
de las células B. CHIR-12.12 es un anticuerpo
antitumoral más potente que rituximab cuando se compara en modelos
de tumores preclínicos.
\vskip1.000000\baselineskip
En colaboración con investigadores clínicos, el
mAb candidato se prueba para una diversidad de actividades
(presentadas a continuación) contra las células primarias de cáncer
de pacientes con NHL, CLL y mieloma múltiple.
\bullet Efecto agonista en ensayos de
proliferación (8 pacientes con NHL, 8 pacientes con CLL y 8
pacientes con MM).
\bullet Efecto antagonista en ensayos de
proliferación (8 pacientes con NHL, 8 pacientes con CLL y 8
pacientes con MM).
\bullet Efecto apoptótico por el ensayo de
Anexina V (3-4 pacientes con NHL, 4 pacientes con
CLL y 4 pacientes con MM).
\bullet Señal de reversión de supervivencia
por el ensayo de Anexina V (3 pacientes con NHL, 3 pacientes con CLL
y 3 pacientes con MM).
\bullet Citotoxicidad dependiente del
complemento (4 pacientes con NHL, 4 pacientes con CLL y 4 pacientes
con MM).
\bullet Citotoxicidad dependiente de
anticuerpos (6 pacientes con NHL, 6 pacientes con CLL y 6 pacientes
con MM).
\vskip1.000000\baselineskip
Como estos dos anticuerpos candidatos no
reaccionan de manera cruzada con CD40 de roedores, deben
identificarse otras especies para probar los efectos
toxicológicos.
La capacidad de los dos anticuerpos anti CD40
candidatos para reaccionar de manera cruzada con CD40 de animales se
prueba por ensayos de citometría de flujo. Para este estudio se
prueban rata, conejo, perro, monos Cynomolgus y monos Tití.
Los anticuerpos candidatos muestran actividad
antagonista tras la unión a CD40 en células B humanas. Para
identificar una especie animal que tiene respuesta similar a los
anticuerpos candidatos, se prueban linfocitos de especies que
muestras unión a los anticuerpos candidatos en ensayos de
proliferación para actividad antagonista. Los linfocitos de las
especies seleccionadas para unión antagonista de anticuerpos
candidatos se prueban además para analizar su capacidad para servir
como células efectoras para causar citolisis de líneas celulares de
linfoma que expresan CD40 a través del mecanismo de ADCC.
Finalmente, las especies animales seleccionadas se prueban en un
estudio de IHC para analizar el patrón de unión de los anticuerpos
candidatos a los tejidos. Las especies animales que responden a los
anticuerpos candidatos en estos ensayos de manera similar a la
observada para células humanas se eligen para los estudios de
toxicología.
Los estudios iniciales indican que los mAb anti
CD40 candidatos reaccionan de manera cruzada con CD40 de mono
Cynomolgus.
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar el perfil de dianas tumorales
relativo de los mAb CHIR-12.12 y
CHIR-5.9, se administran mAb candidatos marcados
fluorescentes y anticuerpos de control de isotipo en ratones que
albergan tumores. Se recogen muestras de tumores y de órganos
normales en diferentes puntos temporales tras la dosificación. Se
analiza la acumulación de anticuerpos marcados en los tumores y en
los órganos normales.
\vskip1.000000\baselineskip
Para aclarar el(los) mecanismo(s)
que media(n) la inhibición del crecimiento tumoral por los
mAb CHIR-5.9 y CHIR-12.12, se
realizan los siguientes estudios:
Modelo knock out o de bloqueo de receptores de
Fc: La ADCC está mediada por la unión de las células efectoras tales
como células NK, macrófagos y monocitos a la parte Fc del anticuerpo
a través del receptor de Fc. Los ratones con deficiencias en la
activación de los receptores de Fc así como los anticuerpos
diseñados para interrumpir la unión del Fc a los receptores
bloquearán la inhibición del crecimiento tumoral mediada por ADCC.
La pérdida de inhibición tumoral o la inhibición tumoral
significativamente reducida en este modelo sugerirán que la
inhibición del crecimiento tumoral por estos mAb candidatos está
mediada principalmente por el mecanismo de ADCC.
\vskip1.000000\baselineskip
El objetivo de este estudio fue investigar los
efectos del pH de la disolución en la estabilidad del anticuerpo
anti CD40 antagonista CHIR-12.12 por medio de
procedimientos biofísicos y bioquímicos para seleccionar el entorno
de disolución óptimo para este anticuerpo. Los resultados de
calorimetría diferencial de barrido (DSC) mostraron que la
estabilidad de la conformación de CHIR-12.12 es
óptima en formulaciones que tienen pH 5,5-6,5.
Basado en una combinación de análisis SDS-PAGE, HPLC
de exclusión por tamaño (SEC-HPLC) y HPLC de
intercambio catiónico (CEX-HPLC), la estabilidad
fisicoquímica de CHIR-12.12 es óptima a un pH de
aproximadamente 5,0-5,5. En vista de estos
resultados, una formulación farmacéutica líquida recomendada que
comprende este anticuerpo es una formulación que comprende
CHIR-12.12 en una concentración de aproximadamente
20 mg/ml formulada en succinato de sodio aproximadamente 10 mM,
cloruro de sodio aproximadamente 150 mM y que tiene un pH de
aproximadamente pH 5,5.
\vskip1.000000\baselineskip
El anticuerpo CHIR-12.12
utilizado en los estudios de formulación es un anticuerpo monoclonal
humano producido por un proceso de cultivo de células CHO. Este mAb
tiene un peso molecular de 150 kDa y está constituido por dos
cadenas ligeras y dos cadenas pesadas unidas juntas por enlaces
disulfuro. Está dirigido contra el receptor de CD40 de superficie
celular en las células que expresan CD40, incluidas las células B
normales y malignas, para el tratamiento de diversos tipos de cáncer
y enfermedades autoinmunes/inflamatorias.
La sustancia del fármaco anti CD40 utilizada
para este estudio fue un lote a granel de anti CD40
(CHIR-12.12) purificado obtenido de células CHO. La
composición de la sustancia del fármaco era de anticuerpo
CHIR-12.12 9,7 mg/ml en citrato de sodio 10 mM,
cloruro de sodio 150 mM, a pH 6,5. La muestra de control en el
estudio era la sustancia del fármaco recibida, seguida por
congelación a \leq -60ºC, descongelación a TA y probada junto con
muestras de estabilidad en los puntos temporales predeterminados.
Las muestras de estabilidad se prepararon por diálisis de la
sustancia del fármaco contra disoluciones de diferentes pH y la
concentración de CHIR-12.12 en cada una de las
muestras se determinó por UV 280 tal como se presenta en la Tabla
20.
\vskip1.000000\baselineskip
La estabilidad fisicoquímica del anticuerpo
CHIR-12.12 en las diversas formulaciones se ensayó
usando los siguientes protocolos.
\vskip1.000000\baselineskip
La estabilidad conformacional de diferentes
muestras de formulaciones se controló usando un MicroCal
VP-DSC tras calentar de 15ºC hasta 90ºC a razón de
1ºC/min.
\vskip1.000000\baselineskip
Se estimó la fragmentación y la agregación
usando gel Tris-glicina al 4-20%
bajo condiciones no reductoras y reductoras. Se detectaron las
proteínas por medio de tinción con azul Coomassie.
\vskip1.000000\baselineskip
La fragmentación y agregación de proteínas
también se midió por medio de un sistema de HPLC Water Alliance con
una columna Tosohaas TSK-GEL 3000SWXL, con fosfato
de sodio 100 mM, pH 7,0 como fase móvil a un caudal de 0,7
ml/min.
\vskip1.000000\baselineskip
La degradación relacionada con el cambio de
cargas se midió usando un sistema de HPLC Waters 600s con una
columna Dionex Propac WCX-10, con HEPES 50 mM, pH
7,3 como fase móvil A y HEPES 50 mM que contenía NaCl 500 mM, pH 7,3
como fase móvil B a un caudal de 0,5ºC/min.
\vskip1.000000\baselineskip
El desplegamiento térmico de
CHIR-12.12 reveló al menos dos transiciones
térmicas, que representan probablemente el desplegamiento y fusión
de los dominios Fab y Fc, respectivamente. A temperaturas más altas,
la proteína presumiblemente agregó, dando lugar a pérdida de la
señal de DSC. Con la finalidad de seleccionar la formulación, se
definió la temperatura de transición térmica más baja como la
temperatura de fusión, Tf, en este estudio. La Figura 13 muestra la
temperatura de fusión térmica como una función de los pH de las
formulaciones. Las formulaciones a pH 5,5-6,5
proporcionaron anti CD40 con estabilidad conformacional superior
como se demuestra por las temperaturas de fusión térmica más
elevadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Las muestras de formulaciones de
CHIR-12.12 a pH 4,5-9,0 se incubaron
a 40ºC durante 2 meses y se sometieron al análisis
SDS-PAGE (datos no mostrados). Bajo condiciones no
reductoras, se observaron especies con peso molecular (PM) de 23 kDa
y 2,7 kDa en formulaciones con pH superior a 5,5, y se observaron
especies con PM de 51 kDa en todas las formulaciones, pero
aparecieron menos a pH 5,0-5,5. Pudo verse una
especie con PM de 100 kDa a pH 7,5 y pH 9,0.
Bajo condiciones reductoras,
CHIR-12.12 se redujo en cadenas pesadas y cadenas
ligeras libres con PM de 50 kDa y 24 kDa, respectivamente. Las
especies de 100 kDa parecieron no ser totalmente reducibles y
aumentaron con el aumento del pH de la disolución, sugiriendo que
podría existir asociación covalente diferente de disulfuro en las
moléculas. Como había otras especies con identidades desconocidas en
SDS-PAGE, la comparación de estabilidad para cada
formulación se basa en la pureza restante de
CHIR-12.12. Las formulaciones a pH
5,0-6,0 proporcionaron un entorno más estable para
CHIR-12.12. Se detectaron pocos agregados por medio
de SDS-PAGE (datos no mostrados).
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis SEC-HPLC detectó el
CHIR-12.12 intacto como la especie del pico
principal, una especie de agregación como una especie de pico
anterior separada de la especie del pico principal, una especie de
fragmento grande como un pico meseta en la parte posterior de la
especie del pico principal, y se detectaron especies de fragmentos
pequeños posteriores a las especies del pico principal. Tras la
incubación a 5ºC y 25ºC durante 3 meses, se detectaron cantidades
insignificantes de fragmentos y agregados de proteínas (<1,0%) en
las formulaciones anteriores y las especies del pico principal de
CHIR-12.12 siguieron teniendo más del 99% de pureza
(datos no mostrados). Sin embargo, se desarrollaron gradualmente
fragmentos tras el almacenamiento a 40ºC y se formaron más
fragmentos a pH 4,5 y pH 6,5-9,0, como se muestra en
la Tabla 21. Tras incubar las formulaciones de
CHIR-12.12 a 40ºC durante 3 meses, se detectó
aproximadamente 2-3% de agregados en pH 7,5 y pH
9,0, mientras que se detectó menos del 1% de agregados en las
formulaciones a otros pH (datos no mostrados). Los resultados de
SEC-HPLC indican que CHIR-12.12 es
más estable a un pH de aproximadamente 5,0-6,0.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis CEX-HPLC detectó el
CHIR-12.12 intacto como la especie del pico
principal, las variantes ácidas eluyeron más temprano que las
especies del pico principal y las variantes de adición de lisina en
el extremo C terminal eluyeron después de las especies de pico
principal. La Tabla 22 muestra la dependencia de los porcentajes de
las especies restantes de CHIR-12.12 del pico
principal y las variantes ácidas en el pH de la disolución. La
muestra de control ya contenía un alto grado de especies ácidas
(aproximadamente 33%), probablemente debido a los procesos de
fermentación de etapa temprana y purificación. La susceptibilidad de
CHIR-12.12 a las disoluciones de pH más alto se
evidencia por dos hechos. Primero, la muestra de la formulación
inicial a pH 9 (t = 0) ya generaba 12% más especies ácidas que el
control. Segundo, el porcentaje de especies ácidas aumentó
bruscamente con el aumento del pH. La degradación relacionada con el
cambio de cargas se debe probablemente a la desamidación. Los datos
anteriores indican que este tipo de degradación de
CHIR-12.12 se redujo al mínimo a pH de
aproximadamente 5,0-5,5.
\vskip1.000000\baselineskip
El pH tiene un efecto significativo en la
estabilidad conformacional y fisicoquímica de
CHIR-12.12. Se determinó que la degradación
relacionada con el cambio de cargas es la principal vía de
degradación para CHIR-12.12, que se redujo al mínimo
a pH 5,0-5,5. En base a los datos de estabilidad
general, una formulación farmacéutica líquida recomendada que
comprende este anticuerpo es una formulación que comprende
CHIR-12.12 a una concentración de aproximadamente 20
mg/ml formulada en succinato de sodio aproximadamente 10 mM, cloruro
de sodio aproximadamente 150 mM, y que tiene un pH de
aproximadamente 5,5.
\vskip1.000000\baselineskip
El objetivo general es proporcionar una terapia
eficaz para tumores de células B convirtiéndolos en dianas con una
IgG1 anti CD40. Estos tumores incluyen linfoma de células B, linfoma
linfocítico crónico (CLL), leucemia linfoblástica aguda (ALL),
mieloma múltiple (MM), macroglobulinemia de Waldenstrom y enfermedad
sistémica de Castleman. La señal para estas enfermedades se
determina en fase II aunque puede obtenerse alguna medición de
actividad en fase I. Inicialmente, el agente se estudia como un
agente único, pero se combinará con otros agentes,
quimioterapéuticos, y otros anticuerpos a medida que proceda el
desarrollo.
\vskip1.000000\baselineskip
Fase
I
\bullet Evaluar la seguridad y la
farmacocinética - aumento de dosis en sujetos con neoplasias de
células B.
\bullet Elegir la dosis en base a la
seguridad, tolerabilidad y cambio en los marcadores séricos de CD40.
En general se busca una dosis máxima tolerable (DMT) pero pueden
resultar adecuadas otras indicaciones de eficacia (depleción células
B CD40+, etc.) para buscar la dosis.
\bullet Considerar más de una dosis
especialmente para indicaciones diferentes, por ejemplo, la dosis
para CLL puede ser diferente que para NHL. Por consiguiente, puede
ser necesaria alguna búsqueda de dosis en fase II.
\bullet Los pacientes se dosifican
semanalmente con toma de muestras para farmacocinética (Pk) en
tiempo real. Inicialmente la dosis máxima permitida es un ciclo de 4
semanas. La Pk puede ser muy variable según la enfermedad
estudiada, densidad de CD40, etc.
\bullet Este(os) ensayo(s)
está(n) abierto(s) a sujetos con linfoma de células B, CLL, y
potencialmente otras neoplasias de células B.
\bullet La decisión para interrumpir o
continuar los estudios se basa en la seguridad, dosis y pruebas
preliminares de actividad antitumoral.
\bullet La actividad del fármaco, determinada
por la tasa de respuesta, se determina en la Fase II.
\bullet Identificar dosis para la Fase II.
\vskip1.000000\baselineskip
Fase
II
Se iniciarán varios ensayos en los tipos de
tumores mencionados anteriormente con concentración en linfoma de
células B, CLL y mieloma múltiple (MM). Pueden ser necesarios
ensayos separados en NHL de grado bajo y de grado intermedio/alto ya
que el CD40 puede tener una función diferente según el grado del
linfoma. En la enfermedad de grado bajo, CD40 actúa más como un
factor de supervivencia, previniendo la apoptosis. En la enfermedad
de grado más alto, la interrupción de las señales de CD40 puede dar
lugar a muerte celular. Puede probarse más de una dosis y más de un
programa en una configuración aleatorizada de fase II.
En cada enfermedad, dirigirse a una población
que ha fracasado con el tratamiento convencional actual:
\bullet CLL: pacientes que fueron resistentes
a Campath® y quimioterapia.
\bullet NHL de grado bajo: fracasos con
Rituxan® o CHOP-R.
\bullet NHL intermedio: fracasos con
CHOP-R.
\bullet Mieloma múltiple: fracasos con
quimioterapia.
- \ding{51}
- La decisión para interrumpir o continuar con el estudio se basa en la prueba del concepto terapéutico en Fase II.
- \ding{51}
- Determinar si puede usarse un marcador sustituto como indicación temprana para la eficacia clínica.
- \ding{51}
- Identificar las dosis para la Fase III.
\vskip1.000000\baselineskip
Fase
III
La fase III dependerá de cuándo se detecta la
señal en la fase II y de qué terapias competidoras se consideran el
patrón de referencia. Si la señal se detecta en una etapa de la
enfermedad en la que no hay patrón de referencia de terapia,
entonces podrá servir un estudio de un único brazo, bien controlado,
como ensayo fundamental. Si hay agentes competidores que se
consideran patrones de referencia, entonces se realizan estudios
directos.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Chen, Bao-Lu
\hskip1cmHurst, Deborah
\hskip1cmLee, Sang Hoon
\hskip1cmLong, Li
\hskip1cmLu, Xiaofeng
\hskip1cmLuqman, Mohammad
\hskip1cmYabannavar, Asha
\hskip1cmZaror, Isabel
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Anticuerpos monoclonales anti CD40
antagonistas y procedimientos para su uso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> PP20107.004 (282916)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/565.710
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
27-04-2004
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/525.579
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
26-11-2003
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/517.337
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
04-11-2003
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Version 4.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 720
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia codificadora para cadena
ligera del anticuerpo anti CD40 12.12 humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(720)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 239
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cadena ligera del anticuerpo anti
CD40 12.12 humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2016
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia codificadora para cadena
pesada del anticuerpo anti CD40 12.12 humano (con intrones)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 469
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cadena pesada del anticuerpo anti
CD40 12.12 humano
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 469
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cadena pesada de la variante del
anticuerpo anti CD40 12.12 humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 239
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cadena ligera del anticuerpo anti
CD40 5.9 humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 474
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cadena pesada del anticuerpo anti
CD40 5.9 humano
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 474
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cadena pesada de la variante del
anticuerpo anti CD40 5.9 humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 612
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(612)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (0)...(0)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia codificadora para la
isoforma corta del CD40 humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 203
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 834
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(834)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (0)...(0)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia codificadora para la
isoforma larga del CD40 humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 277
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (34)
1. Un anticuerpo monoclonal humano que es capaz
de unirse específicamente a un antígeno CD40 humano expresado en la
superficie de una célula humana que expresa CD40, estando dicho
anticuerpo monoclonal exento de actividad agonista significativa,
por el que, cuando dicho anticuerpo monoclonal se une al antígeno
CD40 expresado en la superficie de dicha célula, se inhibe el
crecimiento o la diferenciación de dicha célula, en el que dicho
anticuerpo se selecciona del grupo constituido por:
- a)
- un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo capaz de unirse al anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o al anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543;
- b)
- un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-87 de la secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº 10 ó SEC ID Nº 12;
- c)
- un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-89 de la secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº 10 ó SEC ID Nº 12; y
- d)
- un anticuerpo monoclonal que compite con el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543 en un ensayo de unión competitiva.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un anticuerpo monoclonal según la
reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo se selecciona del grupo
constituido por el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9
que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en
la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 y el
anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse
de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito
de Patente Nº PTA-5543.
3. Un anticuerpo monoclonal según la
reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo
monoclonal seleccionado del grupo constituido por:
- (i)
- un anticuerpo monoclonal que comprende un dominio variable de cadena ligera que contiene los residuos 44-54, 70-76 y 109-117 de SEC ID Nº 2;
- (ii)
- un anticuerpo monoclonal que comprende un dominio variable de cadena pesada que contiene los residuos 50-54, 69-84 y 114-121 de SEC ID Nº 4;
- (iii)
- un anticuerpo monoclonal que comprende un dominio variable de cadena pesada que contiene los residuos 50-54, 69-84 y 114-121 de SEC ID Nº 5;
- (iv)
- un anticuerpo monoclonal que comprende un dominio variable de cadena ligera que contiene los residuos 44-54, 70-76 y 109-117 de SEC ID Nº 6;
- (v)
- un anticuerpo monoclonal que comprende un dominio variable de cadena pesada que contiene los residuos 50-54, 69-84 y 114-121 de SEC ID Nº 7; y
- (vi)
- un anticuerpo monoclonal que comprende un dominio variable de cadena pesada que contiene los residuos 50-54, 69-84 y 114-121 de SEC ID Nº 8,
\vskip1.000000\baselineskip
o es un anticuerpo monoclonal seleccionado del
grupo constituido por:
- (i)
- un anticuerpo monoclonal que comprende un dominio variable de cadena ligera que contiene los residuos 46-52, 70-72 y 111-116 de SEC ID Nº 2;
- (ii)
- un anticuerpo monoclonal que comprende un dominio variable de cadena pesada que contiene los residuos 45-51, 72-74 y 115-120 de SEC ID Nº 4;
- (iii)
- un anticuerpo monoclonal que comprende un dominio variable de cadena pesada que contiene los residuos 45-51, 72-74 y 115-120 de SEC ID Nº 5;
- (iv)
- un anticuerpo monoclonal que comprende un dominio variable de cadena ligera que contiene los residuos 46-52, 70-72 y 111-116 de SEC ID Nº 6;
- (v)
- un anticuerpo monoclonal que comprende un dominio variable de cadena pesada que contiene los residuos 45-51, 72-74 y 115-120 de SEC ID Nº 7; y
- (vi)
- un anticuerpo monoclonal que comprende un dominio variable de cadena pesada que contiene los residuos 45-51, 72-74 y 115-120 de SEC ID Nº 8.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Un anticuerpo monoclonal según la
reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo
monoclonal que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada
del grupo constituido por:
- (i)
- los residuos 21-132 de SEC ID Nº 2;
- (ii)
- los residuos 21-239 de SEC ID Nº 2;
- (iii)
- SEC ID Nº 2;
- (iv)
- los residuos 20-139 de SEC ID Nº 4;
- (v)
- los residuos 20-469 de SEC ID Nº 4;
- (vi)
- SEC ID Nº 4;
- (vii)
- los residuos 20-469 de SEC ID Nº 5;
- (viii)
- SEC ID Nº 5;
- (ix)
- los residuos 21-132 de SEC ID Nº 2 y los residuos 20-139 de SEC ID Nº 4;
- (x)
- los residuos 21-239 de SEC ID Nº 2 y los residuos 20-469 de SEC ID Nº 4;
- (xi)
- los residuos 21-239 de SEC ID Nº 2 y los residuos 20-469 de SEC ID Nº 5;
- (xii)
- SEC ID Nº 2 y SEC ID Nº 4; y
- (xiii)
- SEC ID Nº 2 y SEC ID Nº 5.
\vskip1.000000\baselineskip
5. Un anticuerpo monoclonal según la
reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo
monoclonal que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada
del grupo constituido por:
- (i)
- los residuos 21-132 de SEC ID Nº 6;
- (ii)
- los residuos 21-239 de SEC ID Nº 6;
- (iii)
- SEC ID Nº 6;
- (iv)
- los residuos 20-144 de SEC ID Nº 7;
- (v)
- los residuos 20-474 de SEC ID Nº 7;
- (vi)
- SEC ID Nº 7;
- (vii)
- los residuos 20-474 de SEC ID Nº 8;
- (viii)
- SEC ID Nº 8;
- (ix)
- los residuos 21-132 de SEC ID Nº 6 y los residuos 20-144 de SEC ID Nº 7;
- (x)
- los residuos 21-239 de SEC ID Nº 6 y los residuos 20-474 de SEC ID Nº 7;
- (xi)
- los residuos 21-239 de SEC ID Nº 6 y los residuos 20-474 de SEC ID Nº 8;
- (xii)
- SEC ID Nº 6 y SEC ID Nº 7; y
- (xiii)
- SEC ID Nº 6 y SEC ID Nº 8.
\vskip1.000000\baselineskip
6. El anticuerpo monoclonal de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho anticuerpo monoclonal
se une a dicho antígeno CD40 humano con una afinidad (K_{D}) de al
menos 10^{-6} M.
7. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación
6, en el que dicho anticuerpo monoclonal se une a dicho antígeno
CD40 humano con una afinidad (K_{D}) de al menos 10^{-8} M.
8. El anticuerpo monoclonal de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho anticuerpo monoclonal
es un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo monoclonal, en
el que dicho fragmento retiene la capacidad de unirse
específicamente a dicho antígeno CD40 humano.
9. El fragmento de unión al antígeno de la
reivindicación 8, en el que dicho fragmento se selecciona del grupo
constituido por un fragmento Fab, un fragmento F(ab')_{2},
un fragmento Fv y un fragmento Fv de cadena única.
10. El anticuerpo monoclonal de cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en el que dicho anticuerpo
monoclonal se produce en una línea celular CHO.
11. Una molécula de ácido nucleico aislada que
comprende un polinucleótido que codifica un anticuerpo monoclonal de
cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
12. Una línea celular de hibridoma capaz de
producir el anticuerpo monoclonal de cualquiera de las
reivindicaciones 1-7.
13. Uso de una cantidad eficaz de un anticuerpo
monoclonal anti CD40 según cualquiera de las reivindicaciones
1-10 en la fabricación de un medicamento para
inhibir el crecimiento o la diferenciación de una célula B humana
normal.
14. Un procedimiento in vitro para
inhibir el crecimiento o la diferenciación de una célula B humana
normal, que comprende poner dicha célula B en contacto con una
cantidad eficaz de un anticuerpo monoclonal anti CD40 según
cualquiera de las reivindicaciones 1-10.
15. Uso de una cantidad eficaz de un anticuerpo
monoclonal anti CD40 según cualquiera de las reivindicaciones
1-10 en la fabricación de un medicamento para
inhibir la proliferación de una célula B humana normal, en el que
dicha proliferación está aumentada por la interacción de un ligando
de CD40 con un antígeno CD40 expresado en la superficie de dicha
célula B.
16. Un procedimiento in vitro para
inhibir la proliferación de una célula B humana normal, en el que
dicha proliferación está aumentada por la interacción de un ligando
de CD40 con un antígeno CD40 expresado en la superficie de dicha
célula B, comprendiendo dicho procedimiento poner dicha célula B en
contacto con una cantidad eficaz de un anticuerpo monoclonal anti
CD40 según cualquiera de las reivindicaciones
1-10.
17. Uso de una cantidad eficaz de un anticuerpo
monoclonal anti CD40 o su fragmento según cualquiera de las
reivindicaciones 1-10 en la fabricación de un
medicamento para inhibir la producción de anticuerpos por células B
en un paciente humano.
18. Uso de una cantidad eficaz de un anticuerpo
monoclonal anti CD40 según cualquiera de las reivindicaciones
1-10 en la fabricación de un medicamento para
inhibir el crecimiento de células cancerosas de linaje de células
B.
19. Un procedimiento in vitro para
inhibir el crecimiento de células cancerosas de linaje de células B,
que comprende poner dichas células cancerosas en contacto con una
cantidad eficaz de un anticuerpo monoclonal anti CD40 según
cualquiera de las reivindicaciones 1-10.
20. Uso de una cantidad eficaz de un anticuerpo
monoclonal anti CD40 según cualquiera de las reivindicaciones
1-10 en la fabricación de un medicamento para tratar
un cáncer caracterizado por la expresión de CD40.
21. Uso de una cantidad eficaz de un anticuerpo
monoclonal anti CD40 según cualquiera de las reivindicaciones
1-10 en la fabricación de un medicamento para
inhibir una vía de señales de CD40 mediada por ligandos de CD40 en
una célula humana que expresa CD40.
22. Un procedimiento in vitro para
inhibir una vía de señales de CD40 mediada por ligandos de CD40 en
una célula humana que expresa CD40, comprendiendo dicho
procedimiento poner dicha célula en contacto con una cantidad eficaz
de un anticuerpo monoclonal anti CD40 según cualquiera de las
reivindicaciones 1-10.
23. El uso de la reivindicación 21 o el
procedimiento de la reivindicación 22, en el que dicha célula humana
que expresa CD40 es una célula B humana normal o una célula B humana
maligna y dicha vía de señales de CD40 es la supervivencia de la
célula B.
\newpage
24. Un procedimiento in vitro para
identificar un anticuerpo que tiene actividad antagonista hacia las
células que expresan CD40, que comprende realizar un ensayo de unión
competitiva con un anticuerpo monoclonal según cualquiera de las
reivindicaciones 1-10.
25. Una composición farmacéutica que comprende
un anticuerpo monoclonal anti CD40 según cualquiera de las
reivindicaciones 1-10 y un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
26. La composición farmacéutica de la
reivindicación 25, en la que dicha composición es una formulación
farmacéutica líquida que comprende un tampón en una cantidad par
mantener el pH de la formulación en un intervalo de aproximadamente
pH 5,0 hasta aproximadamente pH 7,0.
27. La composición farmacéutica de la
reivindicación 26, en la que dicha formulación comprende además un
agente de isotonicidad en una cantidad suficiente para hacer que la
misma composición sea cuasi isotónica.
28. La composición farmacéutica de la
reivindicación 27, en la que dicho agente de isotonicidad es cloruro
de sodio, estando dicho cloruro de sodio presente en dicha
formulación en una concentración de aproximadamente 50 mM hasta
aproximadamente 300 mM.
29. La composición farmacéutica de la
reivindicación 28, en la que dicho cloruro de sodio está presente en
dicha formulación en una concentración de aproximadamente 150
mM.
30. La composición farmacéutica de una
cualquiera de las reivindicaciones 26 a 29, en la que dicho tampón
se selecciona del grupo constituido por los tampones succinato,
citrato y fosfato.
31. La composición farmacéutica de la
reivindicación 30, en la que dicha formulación comprende dicho
tampón en una concentración de aproximadamente 1 mM hasta
aproximadamente 50 mM.
32. La composición farmacéutica de la
reivindicación 31, en la que dicho tampón es succinato de sodio o
citrato de sodio en una concentración de aproximadamente 5 mM hasta
aproximadamente 15 mM.
33. La composición farmacéutica de una
cualquiera de las reivindicaciones 26 a 32, en la que dicha
formulación comprende además un tensioactivo en una cantidad desde
aproximadamente 0,001% hasta aproximadamente 1,0%.
34. La composición farmacéutica de la
reivindicación 33, en la que dicho tensioactivo es polisorbato 80,
que está presente en dicha formulación en una cantidad desde
aproximadamente 0,001% hasta aproximadamente 0,5%.
Applications Claiming Priority (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US51733703P | 2003-11-04 | 2003-11-04 | |
US517337P | 2003-11-04 | ||
US52557903P | 2003-11-26 | 2003-11-26 | |
US525579P | 2003-11-26 | ||
US56571004P | 2004-04-27 | 2004-04-27 | |
US565710P | 2004-04-27 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2333971T3 true ES2333971T3 (es) | 2010-03-03 |
Family
ID=34577667
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES04810421T Active ES2346977T3 (es) | 2003-11-04 | 2004-11-04 | Procedimiento de terapia para canceres que expresan el antigeno cd40. |
ES09075395T Active ES2435410T3 (es) | 2003-11-04 | 2004-11-04 | Uso de anticuerpos monoclonales antagonistas anti-CD40 |
ES04810510T Active ES2333971T3 (es) | 2003-11-04 | 2004-11-04 | Anticuerpos monoclonales anti-cd40 antagonistas y procedimientos para su uso. |
Family Applications Before (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES04810421T Active ES2346977T3 (es) | 2003-11-04 | 2004-11-04 | Procedimiento de terapia para canceres que expresan el antigeno cd40. |
ES09075395T Active ES2435410T3 (es) | 2003-11-04 | 2004-11-04 | Uso de anticuerpos monoclonales antagonistas anti-CD40 |
Country Status (23)
Country | Link |
---|---|
EP (6) | EP2248830A1 (es) |
JP (6) | JP4746552B2 (es) |
KR (2) | KR101403910B1 (es) |
CN (2) | CN1905897B (es) |
AT (3) | ATE476448T1 (es) |
AU (3) | AU2004287482B2 (es) |
CA (3) | CA2544949C (es) |
CY (3) | CY1110231T1 (es) |
DE (3) | DE602004023961D1 (es) |
DK (4) | DK1682180T3 (es) |
EC (2) | ECSP066607A (es) |
ES (3) | ES2346977T3 (es) |
HK (4) | HK1095270A1 (es) |
HR (2) | HRP20100066T1 (es) |
IL (1) | IL175225A (es) |
MA (1) | MA28331A1 (es) |
PL (4) | PL1682178T3 (es) |
PT (4) | PT1682180E (es) |
RS (2) | RS53073B (es) |
SG (1) | SG148143A1 (es) |
SI (3) | SI1682180T1 (es) |
WO (3) | WO2005044854A2 (es) |
ZA (1) | ZA200604419B (es) |
Families Citing this family (77)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7658924B2 (en) | 2001-10-11 | 2010-02-09 | Amgen Inc. | Angiopoietin-2 specific binding agents |
DE10303974A1 (de) | 2003-01-31 | 2004-08-05 | Abbott Gmbh & Co. Kg | Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung |
EP2248830A1 (en) * | 2003-11-04 | 2010-11-10 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Use of antagonist anti-CD40 antibodies for treatment of autoimmune and inflammatory diseases and organ transplant rejection |
US8277810B2 (en) | 2003-11-04 | 2012-10-02 | Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc. | Antagonist anti-CD40 antibodies |
EP2236172A1 (en) * | 2003-11-04 | 2010-10-06 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Combination therapy comprising anti-CD20 and anti-CD40 antibodies for the treatment of B cell-related cancers |
US20050281815A1 (en) * | 2004-02-26 | 2005-12-22 | Dani Eshel | CD40 splice variants and their uses |
EP1889065B1 (en) | 2005-05-18 | 2013-07-10 | Novartis AG | Methods for diagnosis and treatment of diseases having an autoimmune and/or inflammatory component |
AU2006247067B2 (en) * | 2005-05-18 | 2012-06-07 | Novartis Ag | Methods for diagnosis and treatment of proliferative disorders mediated by CD40 signaling |
US20080311078A1 (en) | 2005-06-14 | 2008-12-18 | Gokarn Yatin R | Self-Buffering Protein Formulations |
US20090202531A1 (en) * | 2005-11-01 | 2009-08-13 | Novartis Ag | Uses of anti-cd40 antibodies |
AU2006308606C1 (en) * | 2005-11-01 | 2013-07-25 | Novartis Ag | Uses of anti-CD40 antibodies |
KR101439828B1 (ko) | 2005-11-30 | 2014-09-17 | 애브비 인코포레이티드 | 아밀로이드 베타 단백질에 대한 모노클로날 항체 및 이의 용도 |
KR20080090408A (ko) | 2005-11-30 | 2008-10-08 | 아보트 러보러터리즈 | 항-Aβ 글로불로머 항체, 이의 항원-결합 잔기, 상응하는하이브리도마, 핵산, 벡터, 숙주 세포, 당해 항체의 제조방법, 당해 항체를 포함하는 조성물, 당해 항체의 용도 및당해 항체의 사용 방법 |
US9127251B2 (en) | 2005-12-09 | 2015-09-08 | Academisch Medisch Centrum Bij De Universiteit Van Amsterdam | Means and methods for influencing the stability of antibody producing cells |
WO2007067032A1 (en) | 2005-12-09 | 2007-06-14 | Academisch Medisch Cemtrum Bij De Universiteit Van Amsterdam | Means and methods for influencing the stability of cells |
AR059066A1 (es) | 2006-01-27 | 2008-03-12 | Amgen Inc | Combinaciones del inhibidor de la angiopoyetina -2 (ang2) y el inhibidor del factor de crecimiento endotelial vascular (vegf) |
CA2649907A1 (en) * | 2006-04-21 | 2007-11-01 | Novartis Ag | Antagonist anti-cd40 antibody pharmaceutical compositions |
US8455626B2 (en) | 2006-11-30 | 2013-06-04 | Abbott Laboratories | Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies |
MX2009006594A (es) * | 2006-12-21 | 2009-08-12 | Amgen Inc | Formulaciones de ph regulado y estables que contienen polipeptidos. |
US8895004B2 (en) | 2007-02-27 | 2014-11-25 | AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG | Method for the treatment of amyloidoses |
EP2170268A2 (en) | 2007-06-25 | 2010-04-07 | Amgen, Inc. | Compositions of specific binding agents to hepatocyte growth factor |
MX2010005080A (es) * | 2007-11-07 | 2010-07-28 | Genentech Inc | Metodos y composiciones para determinar la sensibilidad de linfoma de celula b al tratamiento con anticuerpos anti-cd40. |
JP5559695B2 (ja) * | 2007-11-09 | 2014-07-23 | ノバルティス アーゲー | 抗cd40抗体の使用 |
JO2913B1 (en) | 2008-02-20 | 2015-09-15 | امجين إنك, | Antibodies directed towards angiopoietin-1 and angiopoietin-2 proteins and their uses |
KR101787768B1 (ko) | 2009-04-18 | 2017-10-18 | 제넨테크, 인크. | 항-cd40 항체를 사용한 치료에 대한 b-세포 림프종의 반응성 평가를 위한 방법 |
CA2768207C (en) | 2009-07-15 | 2019-12-03 | Aimm Therapeutics B.V. | Means and methods for producing high affinity antibodies |
WO2011130377A2 (en) | 2010-04-15 | 2011-10-20 | Abbott Laboratories | Amyloid-beta binding proteins |
CN103298833B (zh) | 2010-08-14 | 2015-12-16 | Abbvie公司 | β淀粉样蛋白结合蛋白 |
NZ610592A (en) | 2010-11-04 | 2015-03-27 | Boehringer Ingelheim Int | Anti-il-23 antibodies |
AR083847A1 (es) | 2010-11-15 | 2013-03-27 | Novartis Ag | Variantes de fc (fragmento constante) silenciosas de los anticuerpos anti-cd40 |
AU2016201742B2 (en) * | 2010-11-15 | 2017-11-02 | Novartis Ag | Silent Fc variants of anti-CD40 antibodies |
WO2012075111A1 (en) | 2010-11-30 | 2012-06-07 | Novartis Ag | Uses of anti-cd40 antibodies in combination therapy for b cell-related cancers |
EP2646466B1 (en) | 2010-12-02 | 2017-03-29 | AIMM Therapeutics B.V. | Means and methods for producing high affinity antibodies |
JP5458188B2 (ja) | 2011-02-17 | 2014-04-02 | 協和発酵キリン株式会社 | 抗cd40抗体の高濃度製剤 |
US9713636B2 (en) * | 2011-02-28 | 2017-07-25 | Napajen Pharma, Inc. | Nucleic acid/polysaccharide complex |
EP3556774B1 (en) | 2011-03-11 | 2024-01-03 | Beth Israel Deaconess Medical Center Inc. | Anti-cd40 antibodies and uses thereof |
DK2699601T3 (en) * | 2011-04-21 | 2018-04-23 | Bristol Myers Squibb Co | ANTIBODY POLYPEPTIDES ANTAGONIZING CD40 |
WO2013063284A1 (en) | 2011-10-25 | 2013-05-02 | Onclave Therapeutics | Antibody formulations and methods |
EP2780372B1 (en) * | 2011-11-17 | 2019-01-02 | Jung, Gundram | Bi-specific antibodies for medical use |
KR102124758B1 (ko) * | 2012-05-03 | 2020-06-19 | 베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하 | 항-il-23p19 항체 |
US20140004131A1 (en) | 2012-05-04 | 2014-01-02 | Novartis Ag | Antibody formulation |
US9676861B2 (en) * | 2012-10-30 | 2017-06-13 | Apexigen, Inc. | Anti-CD40 antibodies and methods of use |
WO2014076292A1 (en) | 2012-11-19 | 2014-05-22 | Baliopharm Ag | Recombinant bispecific antibody binding to cd20 and cd95 |
MX2015017035A (es) * | 2013-06-13 | 2016-04-25 | Fast Forward Pharmaceuticals B V | Inhibidor de la señalizacion de cd40 y un compuesto adicional, en donde el compuesto adicional es un acido labil, un derivado de acido labil, un agonista del receptor tgr5, un agonista del fxr o una combinacion de los mismos, para el tratamiento de inflamacion cronica, y la prevencion de cancer gastrointestinal o fibrosis. |
JP6747975B2 (ja) | 2014-01-31 | 2020-08-26 | アイム・セラピューティクス・べー・フェー | 安定な抗体を産生するための手段及び方法 |
EP3113796A1 (en) | 2014-03-07 | 2017-01-11 | Bristol-Myers Squibb Company | Method of using antibody polypeptides that antagonize cd40 to treat ibd |
US10618963B2 (en) | 2014-03-12 | 2020-04-14 | Yeda Research And Development Co. Ltd | Reducing systemic regulatory T cell levels or activity for treatment of disease and injury of the CNS |
EP3116542A2 (en) | 2014-03-12 | 2017-01-18 | Yeda Research and Development Co., Ltd. | Reducing systemic regulatory t cell levels or activity for treatment of disease and injury of the cns |
CN108025068A (zh) * | 2014-03-12 | 2018-05-11 | 耶达研究与开发有限公司 | 降低系统性调节性t细胞水平或活性来治疗cns的疾病和损伤 |
US10519237B2 (en) | 2014-03-12 | 2019-12-31 | Yeda Research And Development Co. Ltd | Reducing systemic regulatory T cell levels or activity for treatment of disease and injury of the CNS |
US20170051059A1 (en) * | 2014-03-19 | 2017-02-23 | Bristol-Myers Squibb Company | Methods of treating transplant rejection using a domain antibody directed against cd40 |
JP2017524359A (ja) | 2014-07-24 | 2017-08-31 | ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | Il−23a関連疾患の処置に有用なバイオマーカー |
WO2016029043A1 (en) | 2014-08-21 | 2016-02-25 | The General Hospital Corporation | Tumor necrosis factor superfamily and tnf-like ligand muteins and methods of preparing and using the same |
TWI711629B (zh) | 2014-09-03 | 2020-12-01 | 德商包林格因蓋爾漢國際股份有限公司 | 靶向IL-23A與TNF-α之化合物及其用途 |
JP6830437B2 (ja) | 2014-12-10 | 2021-02-17 | リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ | 疾患を処置するための遺伝子改変された細胞、組織および臓器 |
KR102661078B1 (ko) | 2015-05-29 | 2024-05-23 | 애브비 인코포레이티드 | 항-cd40 항체 및 그의 용도 |
EP4209499A1 (en) | 2015-08-13 | 2023-07-12 | Amgen Inc. | Charged depth filtration of antigen-binding proteins |
EP3906943A1 (en) | 2015-09-04 | 2021-11-10 | Primatope Therapeutics Inc. | Humanized anti-cd40 antibodies and uses thereof |
CN108368510B (zh) | 2015-09-30 | 2023-09-01 | 詹森生物科技公司 | 特异性结合人cd40的激动性抗体和使用方法 |
CA3021328A1 (en) | 2016-04-18 | 2017-10-26 | Celldex Therapeutics, Inc. | Agonistic antibodies that bind human cd40 and uses thereof |
EP3471754A1 (en) | 2016-06-20 | 2019-04-24 | Kymab Limited | Anti-pd-l1 antibodies |
MX2018015853A (es) | 2016-07-14 | 2019-08-21 | Genmab As | Anticuerpos multiespecificos frente a los grupos de diferenciacion 40 y 137 (cd40 y cd137). |
EP3632933A4 (en) | 2017-06-01 | 2021-03-03 | Seoul National University R & DB Foundation | NOVEL ANTI-CD40 ANTIBODIES AND USES THEREOF |
BR112019025048A2 (pt) * | 2017-06-01 | 2020-06-30 | Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. | anticorpo anti-cd40, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, e uso médico dos mesmos |
AR112480A1 (es) | 2017-08-24 | 2019-10-30 | Novo Nordisk As | Composiciones de glp-1 y sus usos |
CA3089709A1 (en) * | 2018-01-29 | 2019-08-01 | The Regents Of The University Of California | Therapies and methods to treat tlr2-mediated diseases and disorders |
WO2019156565A1 (en) * | 2018-02-12 | 2019-08-15 | Fast Forward Pharmaceuticals B.V. | Improved antagonistic anti-human cd40 monoclonal antibodies |
US20210251994A1 (en) | 2018-06-15 | 2021-08-19 | Flagship Pioneering Innovations V, Inc. | Increasing immune activity through modulation of postcellular signaling factors |
WO2020102454A1 (en) | 2018-11-13 | 2020-05-22 | Regents Of The University Of Minnesota | Cd40 targeted peptides and uses thereof |
AR117091A1 (es) * | 2018-11-19 | 2021-07-07 | Bristol Myers Squibb Co | Anticuerpos monoclonales antagonistas contra cd40 y sus usos |
EP3962493A2 (en) | 2019-05-03 | 2022-03-09 | Flagship Pioneering Innovations V, Inc. | Methods of modulating immune activity/level of irf or sting or of treating cancer, comprising the administration of a sting modulator and/or purinergic receptor modulator or postcellular signaling factor |
JP2023509359A (ja) | 2019-12-17 | 2023-03-08 | フラグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ,インコーポレーテッド | 鉄依存性細胞分解の誘導物質との併用抗癌療法 |
US20230093542A1 (en) | 2020-02-18 | 2023-03-23 | Novo Nordisk A/S | Glp-1 compositions and uses thereof |
JP2023532339A (ja) | 2020-06-29 | 2023-07-27 | フラグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ,インコーポレーテッド | サノトランスミッションを促進するためにエンジニアリングされたウイルス及び癌の処置におけるそれらの使用 |
CN111763259B (zh) * | 2020-09-03 | 2020-12-15 | 北京百奥赛图基因生物技术有限公司 | 抗cd40抗体及其用途 |
JP2024506831A (ja) | 2021-01-28 | 2024-02-15 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | サイトカイン放出症候群を治療するための組成物及び方法 |
CN117229396A (zh) * | 2022-06-06 | 2023-12-15 | 普米斯生物技术(珠海)有限公司 | 抗cd40抗体及其用途 |
Family Cites Families (99)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR901228A (fr) | 1943-01-16 | 1945-07-20 | Deutsche Edelstahlwerke Ag | Système d'aimant à entrefer annulaire |
NL154600B (nl) | 1971-02-10 | 1977-09-15 | Organon Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen. |
US3817837A (en) | 1971-05-14 | 1974-06-18 | Syva Corp | Enzyme amplification assay |
US3766162A (en) | 1971-08-24 | 1973-10-16 | Hoffmann La Roche | Barbituric acid antigens and antibodies specific therefor |
US4179337A (en) | 1973-07-20 | 1979-12-18 | Davis Frank F | Non-immunogenic polypeptides |
US4233402A (en) | 1978-04-05 | 1980-11-11 | Syva Company | Reagents and method employing channeling |
NZ201918A (en) | 1981-09-18 | 1987-04-30 | Genentech Inc | N-terminal methionyl analogues of bovine growth hormone |
JPS5896026A (ja) | 1981-10-30 | 1983-06-07 | Nippon Chemiphar Co Ltd | 新規ウロキナ−ゼ誘導体およびその製造法ならびにそれを含有する血栓溶解剤 |
CA1341562C (en) | 1982-03-31 | 2007-11-27 | Tadatsugu Taniguchi | Gene coded for interleukin-2 polypeptide, recombinant dna carrying the said gene, a living cell line possessing the recombinant dna, and method for producing interleukin-2 using the said cell |
DE3377363D1 (en) | 1982-03-31 | 1988-08-18 | Ajinomoto Kk | Gene coding for interleukin-2 polypeptide, recombinant dna carrying said gene, cell lines possessing the recombinant dna,and method for producing interleukin-2 using said cells |
BE893016R (fr) | 1982-04-29 | 1982-08-16 | Amatucci Aldo | Turbine a vent |
EP0098110B1 (en) | 1982-06-24 | 1989-10-18 | NIHON CHEMICAL RESEARCH KABUSHIKI KAISHA also known as JAPAN CHEMICAL RESEARCH CO., LTD | Long-acting composition |
US4992271A (en) | 1982-09-23 | 1991-02-12 | Cetus Corporation | Formulation for lipophilic IL-2 proteins |
FI82266C (fi) | 1982-10-19 | 1991-02-11 | Cetus Corp | Foerfarande foer framstaellning av il-2 -mutein. |
US5700913A (en) | 1982-12-15 | 1997-12-23 | Ajinomoto Co., Inc. | Unglycosylated human interleukin-2 polypeptides |
US4708871A (en) | 1983-03-08 | 1987-11-24 | Commonwealth Serum Laboratories Commission | Antigenically active amino acid sequences |
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
US4518584A (en) | 1983-04-15 | 1985-05-21 | Cetus Corporation | Human recombinant interleukin-2 muteins |
WO1985000817A1 (en) | 1983-08-10 | 1985-02-28 | Amgen | Microbial expression of interleukin ii |
US4656132A (en) | 1984-03-28 | 1987-04-07 | Cetus Corporation | Method of improving the yield of heterologous protein produced by cultivating recombinant bacteria |
US4530787A (en) | 1984-03-28 | 1985-07-23 | Cetus Corporation | Controlled oxidation of microbially produced cysteine-containing proteins |
US4569790A (en) | 1984-03-28 | 1986-02-11 | Cetus Corporation | Process for recovering microbially produced interleukin-2 and purified recombinant interleukin-2 compositions |
US4604377A (en) | 1984-03-28 | 1986-08-05 | Cetus Corporation | Pharmaceutical compositions of microbially produced interleukin-2 |
US4572798A (en) | 1984-12-06 | 1986-02-25 | Cetus Corporation | Method for promoting disulfide bond formation in recombinant proteins |
US4752585A (en) | 1985-12-17 | 1988-06-21 | Cetus Corporation | Oxidation-resistant muteins |
CA1340265C (en) | 1985-01-18 | 1998-12-15 | Kirston E. Koths | Oxidation resistant muteins |
US5981216A (en) | 1985-04-01 | 1999-11-09 | Alusuisse Holdings A.G. | Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same |
US4748234A (en) | 1985-06-26 | 1988-05-31 | Cetus Corporation | Process for recovering refractile bodies containing heterologous proteins from microbial hosts |
US5206344A (en) | 1985-06-26 | 1993-04-27 | Cetus Oncology Corporation | Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof |
US4766106A (en) | 1985-06-26 | 1988-08-23 | Cetus Corporation | Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation |
US4676980A (en) | 1985-09-23 | 1987-06-30 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Target specific cross-linked heteroantibodies |
US4816440A (en) | 1985-09-26 | 1989-03-28 | Cetus Corporation | Stable formulation of biologically active proteins for parenteral injection |
GB8601597D0 (en) | 1986-01-23 | 1986-02-26 | Wilson R H | Nucleotide sequences |
US5225539A (en) | 1986-03-27 | 1993-07-06 | Medical Research Council | Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies |
US4745180A (en) | 1986-06-27 | 1988-05-17 | Cetus Corporation | Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using heparin fragments |
US5260203A (en) | 1986-09-02 | 1993-11-09 | Enzon, Inc. | Single polypeptide chain binding molecules |
US4946778A (en) | 1987-09-21 | 1990-08-07 | Genex Corporation | Single polypeptide chain binding molecules |
US4931544A (en) | 1986-09-04 | 1990-06-05 | Cetus Corporation | Succinylated interleukin-2 for pharmaceutical compositions |
US4831175A (en) | 1986-09-05 | 1989-05-16 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Backbone polysubstituted chelates for forming a metal chelate-protein conjugate |
CA1294215C (en) | 1986-10-27 | 1992-01-14 | Ze'ev Shaked | Pharmaceutical compositions of recombinant beta-interferon and formulation processes |
CA1292686C (en) | 1986-10-27 | 1991-12-03 | Ze'ev Shaked | Pharmaceutical compositions of recombinant interleukin-2 and formulation process |
US4894226A (en) | 1986-11-14 | 1990-01-16 | Cetus Corporation | Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polyproline conjugation |
US4873192A (en) | 1987-02-17 | 1989-10-10 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Process for site specific mutagenesis without phenotypic selection |
US4931543A (en) | 1987-05-11 | 1990-06-05 | Cetus Corporation | Process for recovering microbially produced interleukin-2 |
GB8717430D0 (en) | 1987-07-23 | 1987-08-26 | Celltech Ltd | Recombinant dna product |
US5879936A (en) | 1988-04-18 | 1999-03-09 | Aluguisse Holding A.G. | Recombinant DNA methods, vectors and host cells |
US5078997A (en) | 1988-07-13 | 1992-01-07 | Cetus Corporation | Pharmaceutical composition for interleukin-2 containing physiologically compatible stabilizers |
US5530101A (en) | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
EP0444210B1 (en) | 1989-09-21 | 1995-05-24 | Idemitsu Kosan Company Limited | Arylstyrene polymer and copolymer and process for preparing the same |
US5859205A (en) | 1989-12-21 | 1999-01-12 | Celltech Limited | Humanised antibodies |
US6075181A (en) | 1990-01-12 | 2000-06-13 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
DK0463151T3 (da) | 1990-01-12 | 1996-07-01 | Cell Genesys Inc | Frembringelse af xenogene antistoffer |
US5891693A (en) | 1990-01-25 | 1999-04-06 | Alusuisse Holdings A.G. | Recombinant DNA methods vectors and host cells |
IE66205B1 (en) | 1990-06-14 | 1995-12-13 | Paul A Bartlett | Polypeptide analogs |
US5877397A (en) | 1990-08-29 | 1999-03-02 | Genpharm International Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes |
GB9022543D0 (en) | 1990-10-17 | 1990-11-28 | Wellcome Found | Antibody production |
US5756096A (en) | 1991-07-25 | 1998-05-26 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Recombinant antibodies for human therapy |
IE922437A1 (en) | 1991-07-25 | 1993-01-27 | Idec Pharma Corp | Recombinant antibodies for human therapy |
US5962406A (en) | 1991-10-25 | 1999-10-05 | Immunex Corporation | Recombinant soluble CD40 ligand polypeptide and pharmaceutical composition containing the same |
US5229109A (en) | 1992-04-14 | 1993-07-20 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Low toxicity interleukin-2 analogues for use in immunotherapy |
US5874082A (en) | 1992-07-09 | 1999-02-23 | Chiron Corporation | Humanized anti-CD40 monoclonal antibodies and fragments capable of blocking B cell proliferation |
US5397703A (en) | 1992-07-09 | 1995-03-14 | Cetus Oncology Corporation | Method for generation of antibodies to cell surface molecules |
WO1994012520A1 (en) | 1992-11-20 | 1994-06-09 | Enzon, Inc. | Linker for linked fusion polypeptides |
CA2115811A1 (en) | 1993-02-17 | 1994-08-18 | Claus Krebber | A method for in vivo selection of ligand-binding proteins |
US5595721A (en) | 1993-09-16 | 1997-01-21 | Coulter Pharmaceutical, Inc. | Radioimmunotherapy of lymphoma using anti-CD20 |
ES2222463T3 (es) | 1993-12-23 | 2005-02-01 | Immunex Corporation | Uso de anticuerpos monoclonales o ligandos oligomericos solubles en la fabricacion de un medicamento para la prevencion o tratamiento de trastornos neoplasicos. |
CA2184356A1 (en) | 1994-03-03 | 1995-09-08 | Russell P. Rother | Terminal complement inhibitor fusion genes and proteins |
US6091001A (en) | 1995-03-29 | 2000-07-18 | Abgenix, Inc. | Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination |
US5830698A (en) | 1997-03-14 | 1998-11-03 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Method for integrating genes at specific sites in mammalian cells via homologous recombination and vectors for accomplishing the same |
GB2339430A (en) | 1997-05-21 | 2000-01-26 | Biovation Ltd | Method for the production of non-immunogenic proteins |
ATE230277T1 (de) | 1997-06-13 | 2003-01-15 | Genentech Inc | Stabilisierte antikörperformulierung |
WO1998058672A1 (en) | 1997-06-20 | 1998-12-30 | Biogen, Inc. | Cd154 blockade therapy for therapeutic protein inhibitor syndrome |
US6051228A (en) * | 1998-02-19 | 2000-04-18 | Bristol-Myers Squibb Co. | Antibodies against human CD40 |
DZ2788A1 (fr) | 1998-05-15 | 2003-12-01 | Bayer Ag | Agonistes et antagonistes selectifs à IL-2. |
US6168785B1 (en) | 1998-07-16 | 2001-01-02 | Institut Pasteur | Biological applications of new peptides of IL-2 and derivatives and use as therapeutic agents |
CN1202128C (zh) | 1998-12-08 | 2005-05-18 | 拜奥威神有限公司 | 修饰蛋白的免疫原性 |
US6737056B1 (en) | 1999-01-15 | 2004-05-18 | Genentech, Inc. | Polypeptide variants with altered effector function |
US20020006901A1 (en) | 1999-02-05 | 2002-01-17 | Aldo T. Iacono | Use of aerosolized cyclosporine for prevention and treatment of pulmonary disease |
MY133346A (en) | 1999-03-01 | 2007-11-30 | Biogen Inc | Kit for radiolabeling ligands with yttrium-90 |
US20020102208A1 (en) | 1999-03-01 | 2002-08-01 | Paul Chinn | Radiolabeling kit and binding assay |
US6566500B1 (en) | 1999-03-30 | 2003-05-20 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Compositions and methods for modifying toxic effects of proteinaceous compounds |
IL144952A0 (en) | 1999-04-16 | 2002-06-30 | Hoffmann La Roche | Nucleic acids encoding cd40/cd40l chimeric polypeptides, methods for their production and uses thereof |
US6946129B1 (en) | 1999-06-08 | 2005-09-20 | Seattle Genetics, Inc. | Recombinant anti-CD40 antibody and uses thereof |
AU783306B2 (en) | 1999-10-04 | 2005-10-13 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Stabilized liquid polypeptide-containing pharmaceutical compositions |
US6849425B1 (en) | 1999-10-14 | 2005-02-01 | Ixsys, Inc. | Methods of optimizing antibody variable region binding affinity |
AU1590201A (en) * | 1999-11-09 | 2001-06-06 | Chiron Corporation | Compositions and methods for treating autoimmune diseases and transplant rejections |
CA2405701A1 (en) | 2000-04-12 | 2001-10-25 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
WO2001083755A2 (en) * | 2000-04-28 | 2001-11-08 | La Jolla Institute For Allergy And Immunology | Human anti-cd40 antibodies and methods of making and using same |
US20030059427A1 (en) * | 2000-04-28 | 2003-03-27 | Force Walker R. | Isolation and characterization of highly active anti-CD40 antibody |
EP1322383B9 (en) | 2000-10-02 | 2006-09-06 | Chiron Corporation | Methods of therapy for b-cell malignancies using antagonist anti-cd40 antibodies |
AR039067A1 (es) | 2001-11-09 | 2005-02-09 | Pfizer Prod Inc | Anticuerpos para cd40 |
WO2003045978A2 (en) * | 2001-11-26 | 2003-06-05 | Chiron Corporation | Antagonist anti-cd40 monoclonal antibody therapy for multiple sclerosis treatment |
US20040132101A1 (en) | 2002-09-27 | 2004-07-08 | Xencor | Optimized Fc variants and methods for their generation |
EP2236172A1 (en) * | 2003-11-04 | 2010-10-06 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Combination therapy comprising anti-CD20 and anti-CD40 antibodies for the treatment of B cell-related cancers |
DK1682177T3 (da) * | 2003-11-04 | 2010-11-01 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Anvendelse af antagonist-anti-CD40-antistoffer til behandling af kronisk lymfocytisk leukæmi |
EP1680141B8 (en) * | 2003-11-04 | 2011-01-12 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Methods of therapy for solid tumors expressing the cd40 cell-surface antigen |
WO2005044855A2 (en) * | 2003-11-04 | 2005-05-19 | Chiron Corporation | Use of antagonist anti-cd40 monoclonal antibodies for treatment of multiple myeloma |
EP2248830A1 (en) * | 2003-11-04 | 2010-11-10 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Use of antagonist anti-CD40 antibodies for treatment of autoimmune and inflammatory diseases and organ transplant rejection |
JP6039343B2 (ja) | 2012-10-04 | 2016-12-07 | キヤノン株式会社 | 電子機器、電子機器の制御方法、プログラム、記憶媒体 |
-
2004
- 2004-11-04 EP EP10007970A patent/EP2248830A1/en not_active Withdrawn
- 2004-11-04 PT PT04810510T patent/PT1682180E/pt unknown
- 2004-11-04 ES ES04810421T patent/ES2346977T3/es active Active
- 2004-11-04 PL PL04810421T patent/PL1682178T3/pl unknown
- 2004-11-04 CN CN2004800390435A patent/CN1905897B/zh active Active
- 2004-11-04 ES ES09075395T patent/ES2435410T3/es active Active
- 2004-11-04 EP EP04810510A patent/EP1682180B1/en active Active
- 2004-11-04 PL PL04810420T patent/PL1694360T3/pl unknown
- 2004-11-04 PL PL09075395T patent/PL2149585T3/pl unknown
- 2004-11-04 PT PT90753955T patent/PT2149585E/pt unknown
- 2004-11-04 EP EP10006780A patent/EP2255828A1/en not_active Withdrawn
- 2004-11-04 DK DK04810510T patent/DK1682180T3/da active
- 2004-11-04 DE DE602004023961T patent/DE602004023961D1/de active Active
- 2004-11-04 AT AT04810420T patent/ATE476448T1/de active
- 2004-11-04 EP EP04810420A patent/EP1694360B1/en active Active
- 2004-11-04 ES ES04810510T patent/ES2333971T3/es active Active
- 2004-11-04 SI SI200431280T patent/SI1682180T1/sl unknown
- 2004-11-04 AU AU2004287482A patent/AU2004287482B2/en not_active Ceased
- 2004-11-04 JP JP2006538513A patent/JP4746552B2/ja active Active
- 2004-11-04 RS RS20130482A patent/RS53073B/en unknown
- 2004-11-04 RS RSP-2010/0041A patent/RS51230B/sr unknown
- 2004-11-04 PT PT04810420T patent/PT1694360E/pt unknown
- 2004-11-04 DK DK04810420.2T patent/DK1694360T3/da active
- 2004-11-04 SI SI200431514T patent/SI1682178T1/sl unknown
- 2004-11-04 AU AU2004287879A patent/AU2004287879C1/en not_active Ceased
- 2004-11-04 CA CA2544949A patent/CA2544949C/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-11-04 WO PCT/US2004/037152 patent/WO2005044854A2/en active Application Filing
- 2004-11-04 SG SG200808017-8A patent/SG148143A1/en unknown
- 2004-11-04 DK DK04810421.0T patent/DK1682178T3/da active
- 2004-11-04 CA CA2544853A patent/CA2544853C/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-11-04 AT AT04810510T patent/ATE447412T1/de active
- 2004-11-04 DE DE602004028505T patent/DE602004028505D1/de active Active
- 2004-11-04 CN CN200480037489.4A patent/CN1938045B/zh active Active
- 2004-11-04 EP EP04810421A patent/EP1682178B8/en not_active Not-in-force
- 2004-11-04 PL PL04810510T patent/PL1682180T3/pl unknown
- 2004-11-04 EP EP09075395.5A patent/EP2149585B1/en active Active
- 2004-11-04 WO PCT/US2004/036957 patent/WO2005044306A2/en active Application Filing
- 2004-11-04 AT AT04810421T patent/ATE473016T1/de active
- 2004-11-04 KR KR1020067010885A patent/KR101403910B1/ko active IP Right Grant
- 2004-11-04 JP JP2006538540A patent/JP5019881B2/ja active Active
- 2004-11-04 KR KR1020067010894A patent/KR101125127B1/ko active IP Right Grant
- 2004-11-04 SI SI200431525T patent/SI1694360T1/sl unknown
- 2004-11-04 CA CA002544948A patent/CA2544948A1/en not_active Abandoned
- 2004-11-04 DE DE602004028037T patent/DE602004028037D1/de active Active
- 2004-11-04 JP JP2006538514A patent/JP4765039B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2004-11-04 WO PCT/US2004/036958 patent/WO2005044294A2/en active Application Filing
- 2004-11-04 DK DK09075395.5T patent/DK2149585T3/da active
- 2004-11-04 PT PT04810421T patent/PT1682178E/pt unknown
- 2004-11-04 ZA ZA200604419A patent/ZA200604419B/xx unknown
-
2006
- 2006-04-26 IL IL175225A patent/IL175225A/en not_active IP Right Cessation
- 2006-06-05 EC EC2006006607A patent/ECSP066607A/es unknown
- 2006-06-05 MA MA29078A patent/MA28331A1/fr unknown
-
2007
- 2007-01-25 HK HK07100895.9A patent/HK1095270A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2007-01-26 HK HK07100959.2A patent/HK1094156A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2007-02-27 HK HK07102192.5A patent/HK1095091A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2010
- 2010-01-15 CY CY20101100045T patent/CY1110231T1/el unknown
- 2010-02-03 HR HR20100066T patent/HRP20100066T1/hr unknown
- 2010-07-08 HK HK10106624.9A patent/HK1139964A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2010-09-28 CY CY20101100869T patent/CY1110803T1/el unknown
- 2010-10-18 CY CY20101100931T patent/CY1110839T1/el unknown
- 2010-12-13 JP JP2010277537A patent/JP2011072317A/ja not_active Withdrawn
-
2011
- 2011-02-18 JP JP2011033969A patent/JP2011126900A/ja not_active Withdrawn
- 2011-02-25 JP JP2011040922A patent/JP2011105769A/ja not_active Withdrawn
- 2011-04-05 AU AU2011201529A patent/AU2011201529B2/en not_active Ceased
-
2012
- 2012-03-05 EC ECSP12006607 patent/ECSP12006607A/es unknown
-
2013
- 2013-11-13 HR HRP20131085TT patent/HRP20131085T1/hr unknown
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2333971T3 (es) | Anticuerpos monoclonales anti-cd40 antagonistas y procedimientos para su uso. | |
ES2346978T3 (es) | Uso de anticuerpos monoclonantes anti-cd40 antagonistas para el tratamiento del mieloma multiple. | |
CA2544368C (en) | Methods of therapy for b cell-related cancers | |
JP4765037B2 (ja) | 慢性リンパ球性白血病の処置のためのアンタゴニスト抗cd40モノクローナル抗体の使用 | |
US20080057070A1 (en) | Antagonist Anti-Cd40 Monoclonal Antibodies and Methods for Their Use | |
JP2008502309A5 (es) | ||
PT1680141E (pt) | Métodos terapêuticos para tumores sólidos que expressam o antigénio de superfície celular cd40 | |
ES2348237T3 (es) | Uso de anticuerpos anti-cd40 antagonistas para el tratamiento de leucemia linfocítica crónica. | |
MXPA06004983A (es) | Anticuerpos monoclonales anti-cd40 antagonistas y metodos para su uso |