TR201909840T4 - Anti-CD40 antikorları ve kullanımları. - Google Patents

Abstract

Mevcut buluş, CD40 üzerindeki belirli bir epitop için spesifik antikorlar ve CD40'ı bağlayan ve belirli fonksiyonel özelliklere sahip antikorlarla ilgilidir. Mevcut buluş ayrıca bu antikorların fragmanları, antikorların transplant rejeksiyonu ve greft-versus-host hastalığının azaltılması veya tedavisi için kullanılması ve antikorları yapma yöntemleri ile de ilgilidir.

Description

TARIFNAME ANTI-CD40 ANTIKORLARI VE KULLANIMLARI BULUSUN GEÇMISI Mevcut bulus, istemlerde belirtilen sekilde anti-CD4O antikorlari ve böyle antikorlarin, örnegin, transplant rejeksiyonu olasiligini azaltmak 'veya transplant rejeksiyonu öncesi süreyi arttirmak, immün baskilamayi baslatmak veya otoimmün bir bozuklugu tedavi etmek için kullanimlari ile Gilson C.R. ve dig., (Anti-CD4O monoclonal antibody synergizes with CTLA4-Ig in promoting long-term graft survival in murine siçan anti-fare CD4O antikoru 7El'in iki izoformunu açiklamaktadir.

Boon L. ve dig., (Preclinical assessment of anti-CD4O Mab 5D12 anti-CD4O antikoru ch5D12'nin klinik öncesi degerlendirmesini açiklamaktadir.

Immün sistemin, özellikle humoral immün sistemin baskilanmasi, organ transplantasyonu ve otoimmün bozukluklarinin tedavisinde faydalidir. Organ transplantasyonu, örnegin, organ hasarini içeren, hayati tehdit eden birçok hastalik için tercih edilen bir tedavi yöntemi olarak ortaya çikmistir. Transplant rejeksiyonu, nakledilen hücreleri veya dokulari alan bir organizma, bu dokuya istenmeyen bir immün tepkisi olusturdugunda meydana gelir. Transplant rejeksiyonu doku tipi eslestirme ile en aza indirilebilir, ancak eslesen doku bile genellikle donör tarafindan reddedilir. Bu nedenle, hemen hemen tüm doku transplantasyonu vakalari için immünobaskilayici tedaviler gereklidir.

Klinik transplantasyonda iyilestirilmis sonuçlar, esas olarak, rejeksiyon yanitlarini inhibe etmek için giderek daha potent spesifik olmayan immünobaskilayici ilaçlarin gelistirilmesiyle elde edilmistir. Kisa vadeli sonuçlar iyilesmis olsa da, uzun vadeli sonuçlar yetersiz kalmaktadir. Yasam boyu immünobaskilayici ajanlar, nakledilen organin kronik rejeksiyonu ile mücadele etmek için gerekebilir ve bu ajanlarin kullanimi, kardiyovasküler hastalik, enfeksiyon› ve malignite risklerini önemli ölçüde arttirir.

Transplantasyon rejeksiyonunun azaltilmasi için potansiyel bir hedef, CD40/CD154 etkilesimidir. CD40, B lenfositlerinin yüzeyinde eksprese edilir ve CD154, T hücrelerinin yüzeyinde eksprese edilir. Bu iki protein arasindaki etkilesim B hücresi aktivasyonu ile ilgili olup, bu, sitokin ekspresyonu ve CD23, CD8O ve CD86 dahil olmak üzere hücre yüzeyi markörlerinin ekspresyonunu tetikler. Bu etkilesimin, anti-CD154 antikorlari kullanilarak bloke edilmesinin, insan olmayan primatlarda nakledilen dokularin rejeksiyonunu azalttigi veya ortadan kaldirdigi gösterilmistir.

Herhangi bir tipte immünobaskilama (örnegin, bir transplantasyon prosedüründe) için, etkinlik ve toksisite arasindaki denge, klinik kabulü için kilit faktördür.

Dolayisiyla, örnegin transplant rejeksiyonu ve otoimmün hastaliklarda yer alan immünolojik yolaklari spesifik olarak hedef alan terapilere ihtiyaç vardir.

Mevcut Bulusun Özeti Mevcut bulus, CD40'a spesifik olarak baglanan izole edilmis bir hümanize antikor veya bunun antijen baglayici fragmani ile ilgili olup; SEQ ID NO: 2'nin 20-132 amino asitlerinde belirtilenlere karsilik gelen hiperdegisken bölgelerin tümünü ihtiva eden bir agir zincir degisken bölgesi ve SEQ ID NO: 4'ün 23-128 amino asitlerinde ortaya konanlara karsilik gelen hiperdegisken bölgelerin tümünü ihtiva eden bir hafif zincir degisken bölgesi içerir, burada bahsedilen antikor veya bunun antijen baglayici fragmani, CD154'ü in vitro eksprese eden Jurkat hücreleri tarafindan B lenfosit aktivasyonunu bloke eder.

Spesifik olarak CD4O üstündeki bir epitopa baglanan (örnegin, resus, murin veya insan CD40) izole edilmis bir antikor veya antijen baglayici fragmani (Örnegin, bir PC kismi bulunmayan veya bir F(ab')2, bir Fab, bir FV veya bir scFv yapisi olan) açiklanmakta olup, burada epitop, 2C1O antikoru tarafindan taninir (örnegin, burada bahsedilen epitop 3A8 veya Chi220 antikoru veya her ikisi tarafindan taninmaz).

Mevcut bulusa ait antikor, CD154'ü eksprese eden Jurkat hücrelerinin in vitro olarak B lenfosit (örnegin, resus veya insan B lenfositi) aktivasyonunu bloke etme yetenegine sahiptir.

Tercihen, söz konusu antikor, resus B hücrelerini in vitro inhibe etme, örnegin, CD23, CD8O veya CD86 ekspresyonunu azaltma kabiliyetine sahiptir. Antikorun 2C1O antikoru olabilecegi açiklanmaktadir. Antikor, insan sabit bölgelerine sahip olabilir. Antikor, bir hümanize antikordur. Bir açiklamada, söz konusu antikor, bir insan antikorudur. Antikorun monoklonal antikor veya bir poliklonal antikor olabilecegi açiklanmaktadir.

Antikorun, SEQ ID NO:2'in 20-132 amino asitleri tarafindan tanimlanan agir zincir degisken bölgesi veya bir antikor- baglanma kismi veya fragmanini içerdigi açiklanmaktadir. Mevcut bulusun antikoru, istemlerde belirtilen sekilde SEQ ID NO:2'in -132 amino asitleri tarafindan tanimlanan agir zincir degisken bölgesinin bir hümanize formunu içerir. Bir baska açiklamada, söz konusu antikor, antikorun hafif zincir degisken bölgesi SEQ bunun fragmanini içerir. Mevcut bulusun antikoru, istemlerde belirtilen sekilde SEQ ID NO:4'ün 23-128 sekansi dahil olmak üzere antikorun hafif zincir degisken bölgesinin bir hümanize formunu içerir. Bir baska açiklamada, antikorun agir zincir degisken bölgesi SEQ ID NO:2'in 20-132 amino asitlerini içerir ve antikorun hafif zincir degisken sekansi SEQ ID NO:4'ün 23- 128 amino asitlerini içerir.

Mevcut bulus ayrica, bulusa ait antikor veya antikor fragmanini kodlayan bir polinükleotidi, polinükleotidi içeren bir vektör ve vektörü içeren bir hücreyi içerir. Hücre, ökaryotik (örnegin, bir insan, fare, maymun veya tavsan hücresi gibi memeli) olabilir veya prokaryotik olabilir (örnegin, bir E. coli hücresi gibi bir bakteri hücresi).

Bir kisideki bagisiklik sistemini baskilamak için bir yöntem (örnegin, insan gibi bir memeli) açiklanmaktadir. Yöntem, mevcut bulusun etkili bir miktarda bir antikor veya antijen baglayici fragmaninin, kisiye uygulanmasini içerir.

Yine bir baska açiklamada, ihtiyaci olan bir denekte (örnegin, bir insan gibi bir memeli) transplant rejeksiyonunu tedavi etme veya profilaktik olarak tedavi etme veya transplant rejeksiyonu olusmadan önceki sürenin arttirilmasi yöntemi açiklanmaktadir.

Yöntem, nevcut bulusun etkili bir miktarda bir antikor veya antijen baglayici fragmaninin, kisiye uygulanmasini içerir.

Bir görünümde, mevcut bulus, bir kisideki immün sisteminin baskilanmasinda kullanima yönelik olarak mevcut bulusun bir antikoru veya antijen baglayici fragmani ile ilgilidir.

Daha baska bir görünümde, mevcut bulus transplant rejeksiyonunu tedavi etmede veya profilaktik olarak tedavi etmede veya ihtiyaci olan bir denekteki transplant rejeksiyonundan önceki sürenin arttirilmasinda kullanim için mevcut bulusun bir antikoru veya antijen baglayici fragmani ile ilgilidir. Önceki iki görünümün birinde, kisiye, bir organ transplanti (örnegin, bir kalp, böbrek, akciger, karaciger, pankreas, bagirsak ve timus veya bunlarin bir kismi) veya bir doku transplanti (örnegin, kemik, tendon, kornea, cilt, kalp kapagi, ven veya kemik iligi) yapilmis veya kisi, bunlara ihtiyaç halinde olabilir. Önceki iki görünümün herhangi birinde, uygulamaya transplantasyon veya greftten önce baslanabilir. Uygulama, transplantasyon veya greftten sonra en az 1, 2, 3, 4, 5, 7 veya 24 veya 36 ay süreyle devam edebilir.

Ihtiyaç duyan bir kisideki (örnegin, bir insan gibi bir memeli) bir graft-versus-host hastaliginin tedavi edilmesi veya proflaktik olarak tedavi edilmesi yöntemi açiklanmaktadir.

Kullanim, mevcut bulusun etkili bir miktarda bir antikor veya antijen baglayici fragmaninin, kisiye uygulanmasini içerir.

Daha baska bir görünümde, mevcut bulus buna ihtiyaci olan bir denekteki bir graft-versus-host, hastaliginin tedavi edilmesi veya proflaktik olarak tedavi edilmesi yönteminde kullanima yönelik mevcut bulusun bir antikoru veya antijen baglayici fragmani ile ilgilidir. Ihtiyaç halindeki bir kisideki (örnegin, bir insan gibi bir memeli ) bir otoimmün bozuklugunun tedavi edilmesi veya proflaktik olarak tedavi edilmesi yöntemi açiklanmaktadir.

Daha baska bir görünümde, mevcut bulus buna ihtiyaci olan bir denekteki bir otoimmün bozuklugunun tedavi edilmesi veya proflaktik olarak tedavi edilmesi yönteminde kullanima yönelik mevcut bulusun bir antikoru veya antijen baglayici fragmani ile Kullanim, mevcut bulusun etkili bir miktarda bir antikor veya antijen baglayici fragmaninin, kisiye uygulanmasini içerir.

Belirli uygulamalarda, otoimmün bozukluk, bir otoantikor varligi ile iliskilidir 'veya buna baglidir (örnegin, sistemik lupus eritematozusu (SLE), CREST sendromu (kalsinoz, Raynaud sendromu, özofagal dismotilite, sklerodaktil ve telanjiyektazi), opsoklonus, enflamatuvar miyopati (örnegin, polimiyozit, dermatomiyozit ve inklüzyon-vücut miyozidi), sistemik skleroderma, primer biliyer siroz, çölyak hastaligi (örnegin, gluten duyarli enteropati), dermatitis herpetiformis, Miller Fisher sendromu, akut motor aksonal nöropati (AMAN), iletim bloklu multifokal motor nöropati, otoimmün hepatit, antifosfolipid sendromu, Wegener granülomatozu, mikroskopik polianjihit, Churg-Strauss sendromu, romatoid artrit, kronik otoimmün hepatit, skleromiyozit, myastenia gravis, Lambert-Eaton miyastenik sendromu, Hashimoto tiroiditi, Graves hastaligi, paraneoplastik serebellar dejenerasyon, kati insan sendromu, limbik ensefalit, Isaac sendromu, Sydenham kora, pediyatrik otoimmün nörokromatopsikiyatrik hastaligi, streptokok (PANDAS) ile iliskili, ensefalit, diabetes mellitus tip 1 ve nöromiyelit optika). Baska uygulamalarda, bozukluk, pernisiyöz anemi, Addison hastaligi, psöriyazis, enflamatuvar bagirsak hastaligi, psoriatik artrit, Sjogren sendromu, lupus eritematozusu (örnegin, disk biçimli lupus eritematozus, ilaç-kaynakli lupus eritematozus ve neonatal lupus eritematozus), multipl skleroz ve reaktif artritten olusan gruptan seçilir. Yine baska uygulamalarda, bozukluk, polimiyozit, dermatomiyozit, çoklu endokrin yetmezligi, Schmidt sendromu, otoimmün üveit, adrenalit, tiroitit, otoimmün tiroit hastaligi, gastrik atrofi, kronik Hepatit, lupoit hepatit, ateroskleroz, erken demans, demiyelinizan hastaliklar, subakut kutanöz lupus eritematozus, hipoparatiroidizm, Dressler sendromu, otoimmün trombositopeni, idiopatik trombositopenik. purpura, hemolitik› anemi, pemfigus vulgaris, pemfigus, alopesia arcata, pemfigoit, skleroderma, progresif sistemik skleroz, yetiskin baslangiç diabetes mellitus (örnegin, tip II diyabet), erkek ve disi otoimmün infertilitesi, ankilozan spondolit, ülserli kolit, Crohn hastaligi, karisik bag dokusu hastaligi, polyarterit nedosa, sistemik nekroz Olusturucu vaskülit, genç baslangiç romatoid artrit, glomerülonefrit, atopik dermatit, atopik rinit, Goodpasture sendromu, Chagas hastaligi, sarkoidoz, romatik ates, astim, tekrarlayan düsük, anti-fosfolipid sendromu, çiftçi akcigeri, eritema multiforme, post kardiyotomi sendromu, Cushing sendromu, otoimmün kronik aktif hepatit, Bird-Fancier akcigeri, alerjik hastalik, alerjik ensefalomiyelit, toksik epidermal nekroliz, alopesi, Alport sendromu, alveolit, alerjik alveolit, fibrozlu alveolit, interstisyel akciger hastaligi, eritema nodosum, piyoderma gangrenosum, transfüzyon reaksiyonu, Cüzam, Sitma, leyismanya, tripanosomiyaz, Takayasu arteriti, polimiyalji romatika, temporal arterit, sistosomiyaz, dev hücreli arterit, askariyazis, aspergillozis, Sampter sendromu, egzama, lenfomatoid. granülomatoz, Behçet Hastaligi, Caplan sendromu, Kawasaki hastaligi, denge, endokardit, endomiyokardiyal fibroz, endoftalmit, eritema elevatum et diutinum, eritroblastoz fetalis, eozinofilik fasiit, Shulman sendromu, Felty sendromu, filaryaz, siklit, kronik siklit, heterokronik siklit, Fuch siklit, IgA.nefropati, Henoch-Skonlein purpura,greft versus host hastaligi, transplantasyon rejeksiyonu, insan immün yetmezlik virüsü enfeksiyonu, ekovirüs enfeksiyonu, kardiyomiyopati, Alzheimer hastaligi, parvovirüs enfeksiyonu, rubella virüs enfeksiyonu, asilama sonrasi sendromlar, konjenital kizamikçik enfeksiyonu, Hodgkin ve non-Hodgkin lenfoma, renal hücre karsinom, multipl miyelom, Eaton-Lambert sendromu, nükslü polikondrit, kötü huylu melanom, kriyoglobülinemi, Waldenstrom makroglobülemi, Epstein-Barr Virüs enfeksiyonu, kabakulak, Evan sendromu ve otoimmün gonadal yetmezliginden olusan gruptan seçilir. Önceki üç görünümün herhangi birinde, uygulama, parenteral, intravenöz, subkütan, oral, topikal, intratekal, lokal veya burada tarif edilen herhangi bir yol olabilir. Önceki dört görünümün herhangi birinde, kullanim, ayrica antikor uygulamasindan alti ay içerisinde (örnegin, 3, 2 veya 1 ay içerisinde; 4, 3, 2 veya 1 hafta içerisinde; 6, 5, 4, 3, 2 veya 1 gün içerisinde; veya 18, 12, 6, 3, 2, veya 1 saat içerisinde) ikinci maddenin verilmesini içerebilir, burada ikinci madde, bir immünobaskilayicidir. Ikinci madde, bir kalsinörin inhibitörü (örnegin, siklosporin A veya siklosporin G), takrolimus, bir mTor inhibitörü (örnegin, sirolimus, temsirolimus, zotarolimus veya everolimus), fingolimod, miriosin, alemtuzumab, rituksimab, bir anti-CD4 monoklonal antikoru, bir anti-LFAl monoklonal antikoru, bir anti-LFA3 monoklonal antikoru, bir anti-CD45 antikoru (örnegin, bir anti- CD45RB antikoru), bir anti-CD19 antikoru, monabatasept, belatasept, indolil-ASC; azatiyoprin, lenfosit immün globülin ve anti-timosit globülin [atgil], mikofenolat mofetil, mikofenolat sodyum, daklizumab, basiliksimab, siklofosfamid, prednison, prednisolon, leflunomid, FK778, FK779, busülfan, fludarabin, metotreksat, 6-merkaptopurin, 15-deoksispergualin, LF15-0195, bredinin, brekinar ve muromonab-CD3'ten olusan gruptan seçilebilir. Belirli uygulamalarda, ikinci madde, belatasepttir.

Bir antikor yapma yöntemi açiklanmaktadir. Yöntem sunlari içerir: (a) bir memeliye (örnegin, bir fare veya bir tavsana) 2C10 antikoru tarafindan taninan, ama tam uzunluklu CD40 molekülü tarafindan taninmayan epitop içeren CD4O polipeptidinin uzunlugunda, ama 6'den fazla, 8 veya 10 amino asit uzunlugunda) ihtiva eden bir polipeptidin bahsedilen fragmana bir immün yanit üretmek için yeterli bir tarzda uygulanmasi; (b) memeliden dalak hücrelerinin izole edilmesi; (c) dalak hücreleri ve miyelom hücreleri arasinda bir hibridom olusturulmasi; ve (d) hibridom tarafindan üretilen antikorun saflastirilmasi. Polipeptid bir füzyon proteini (örnegin, CD4O fragmani ve anahtar deligi limpet hemosiyanini veya glutatiyon S-transferaz arasinda) olabilir.

Ayrica, bu tür bir yöntem ile üretilen bir antikor açiklanmaktadir. az olan ve spesifik olarak 2Cll antikoru tarafindan baglanan bir CD40 fragmani açiklanmaktadir. Belirli açiklamada, fragman, 8- 100 amino asit uzunlugundadir. Bir baska açiklamada, fragman, 7- 100 uzunlugundadir. CD4O fragmani, CD40'in ekstraselüler domeninden olabilir (örnegin, SEQ ID No'lari:5 ve 6). Burada tarif edilen bir fragman ve bir heterolog sekansini içeren bir füzyon proteini açiklanmaktadir. ve baglayan, ancak bir örnekte (örnegin, dogal olarak diger polipeptidleri, nükleik asitleri ve/veya diger biyolojik molekülleri içeren biyolojik bir örnek) bulunan diger molekülleri büyük ölçüde tanimayan ve baglamayan bir bilesik veya antikor anlamina gelir. Bir örnekte, CD4O epitopuna spesifik olarak baglanan 2ClO antikoru tarafindan taninan bir antikor, CD4O üzerinde mevcut olan diger epitoplara baglanmaz. hedef antijenini spesifik olarak baglayabilen bir antikorun herhangi bir fragmani veya kismi anlamina gelir.

Insan disi (örn., murin) antikorlarin "insanlastirilmis" biçimleri, minimum düzeyde insan disi immünoglobülinden türetilen sekans içeren kimerik antikorlardir. Bir uygulamada, insanlastirilmis bir antikor, bir insan immünoglobülinidir (alici antikor), burada alicinin bir hiperdegisken bölgesine (HVR) ait kalintilar, insan olmayan bir türün (verici antikor), örnegin fare, siçan, tavsan ya da istenen antikor spesifikligine, afinitesine ve/veya kapasitesine sahip olan insan disi primatin bir HVR'sinden elde edilen kalintilarla ikame edilir. Bazi durumlarda, insan immünoglobülinin çerçeve (FR) kalintilari (baska bir deyisle, hiperdegisken bölgeler disindaki degisken bölgelerdeki kalintilar), karsilik gelen insan olmayan kalintilarla ikame edilir. Ayrica, insanlastirilmis antikorlar, alici antikorda veya verici antikorda bulunmayan kalintilar içerebilir. Bu modifikasyonlar antikor performansini daha da iyilestirmek için yapilabilir.

Genel olarak, insanlastirilmis antikor, en az bir ve tipik olarak iki degisken alanin büyük ölçüde tamamini içerebilecek olup, bunlarin içinden hiperdegisken döngülerin tamami ya da büyük ölçüde tamami, insan olmayan bir immünoglobülininkilere denk düser ve FR'lerin tamami ya da büyük ölçüde tamami bir insan immünoglobülin sekansinindir. Insanlastirilmis antikor, istege bagli olarak ayrica, immünoglobülin sabit bölgesinin (Fc), tipik olarak bir insan immünoglobülinin en az bir kismini içerir. Daha fazla ayrinti için bakiniz, örnegin, Jones ve dig., Nature Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-6, 1992. Bakiniz ayrica, örnegin, Vaswani ve dig., Ann. Allergy Asthma & Immunol. 1:105- Bir "insan antikoru", bir insan tarafindan üretilen bir antikorunkine karsilik gelen bir amino asit sekansina sahip olan ve/veya burada açiklanan insan antikoru üretim tekniklerinden herhangi birisi kullanilarak üretilen bir antikordur. Bir insan antikoruna ait bu tanimda, spesifik olarak insan kökenli olmayan antijen baglayici kalintilari içeren insanlastirilmis bir antikor hariç tutulur. Insan antikorlari, faj görüntüleme kitapliklari da dahil olmak üzere teknikte bilinen çesitli teknikler kullanilarak üretilebilir (Hoogenboom.ve dig., J. Mol. 1991). Insan monoklonal antikorlarinin hazirlanmasi için, Cole ve dig., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, referansli yayinda tarif edilen. yöntemler` de kullanilabilir.

Insan antikorlari, antijeni, antijenik yüklemeye yanit olarak bu antikorlari üretmek üzere modifiye edilmis, ancak endojen alanlari devre disi birakilmis olan. bir transgenik. hayvana, örnegin immünize edilmis ksenofarelere verilerek hazirlanabilir (XenoMouse® teknolojisi ile ilgili bkz. örn. U.S. Patent No'lari hücresi hibridomu teknolojisi vasitasiyla üretilen insan antikorlari ile ilgili olarak Li ve dig., Proc. Natl. Acad. Sci.

Bir kisideki bir hastalik, bozukluk veya duruma iliskin olarak hastalik, bozukluk veya durumun en az bir semptomunun azaltilmasi anlamina gelir.

Bir kisideki bir hastalik, bozukluk veya durumun "profilaktik olarak tedavi edilmesi" ifadesi, bir hastalik semptomu veya semptomlarinin görülmesi öncesinde kisiye bir terapötik madde uygulanmasiyla bir hastalik, bozukluk veya durumun vaka sikligi veya ciddiyetinin azaltilmasi (örnegin, önleme) anlamina gelir. transplant rejeksiyonu veya greft versus-host hastaligi) fizyolojik etkilerini etkili bir sekilde tedavi etmek için gereken doz anlamina gelir. bilesik veya bilesim anlamina gelir, baska bir deyisle, immünolojik bir yanitin (örnegin, hücresel veya humoral) gelismesini azaltir (örnegin önler) veya engeller. memeli) anlamina gelir. fragmani; ve (b) bir heterolog füzyon partneri içeren bir polipeptid anlamina gelir. Çizimlerin Kisa Açiklamalari Sekil 1, 2010 antikorunun agir zinciri ve hafif zincirinden degisken bölgeleri göstermektedir. Agir zincir için gösterilen nükleotid sekansi (SEQ ID No:1) bir sinyal peptidi (1-57 nükleotidleri; alti çizili) ve agir zincir degisken sekansi (58- 396 nükleotidleri) içerir. Karsilik gelen amino asit sekansi (SEQ ID No:2) asagida gösterilmis olup, burada l-l9 amino asitleri sinyal sekansina (alti çizili) karsilik gelir ve 20- l32 amino asitleri agir zincir degisken bölgesine karsilik Hafif zincir için gösterilen nükleotid sekansi (SEQ ID No:3) bir sinyal peptidi (1-66 nükleotidleri; alti çizili) ve hafif zincir degisken sekansi (67-384 nükleotidleri) içerir. Karsilik gelen amino asit sekansi (SEQ ID No:4) asagida gösterilmis olup, burada 1-22 amino asitleri sinyal peptidine (alti çizili) karsilik gelir ve 23-128 amino asitleri hafif zincir degisken bölgesine karsilik gelir.

Sekil 2A, 2C10'un insan ve resus CD20+ B hücrelerine baglanmasini dogrulayan akis sitometrisi verilerini gösteren bir çizimdir.

Sekil 2B, keçi anti-fare IgG-HRP kullanilarak tespit edilen sekilde 2ClO'un insan ve resus CD40'ina baglanmasini dogrulamak için çesitli konsantrasyonlarda 2ClO ile ELISA testlerinden CD4O adsorpsiyon verilerini gösteren bir çizimdir.

Sekil 3, B hücrelerine 2ClO tarafindan CD154 baglanmasinin doz-bagimli inhibisyonunu gösteren bir grafiktir. B hücreleri, histidin-etiketli çözünür CD154 ile enkübe edilerek ve histidin ekspresyonu bakimindan analiz edilerek CD154 baglanmasi açisindan analiz edilmistir. Sonuçlar, deneyin birden fazla kez tekrarini temsil edici mahiyettedir.

Sekil 4, resus veya insan çevresel kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler) ve Jurkat hücrelerini kapsayan testin prensibini gösteren bir sematik diyagram ve grafiklerdir.

Sekil 5, degisken 3A8, 5C8 veya 2C1O antikorlari konsantrasyonlari varliginda resus PBMC'leri ve Jurkat hücrelerinin ko-kültürlerinden alinan CDZO+ hücrelerindeki CD23 ekspresyonunu gösteren bir grafikler grubudur.

Sekil 6, degisken 3A8, 5C8 veya 2C1O antikorlari konsantrasyonlari varliginda insan PBMC'leri ve Jurkat hücrelerinin ko-kültürlerinden alinan CDZO+ hücrelerindeki CD86 ekspresyonunu gösteren bir grafik setidir.

Sekil 7, ya 3A8 ya da 2C10 antikoru varliginda Jurkat hücreleri olmaksizin kültürlenmis ya insan ya da resus PBMC'lerinden CD20+ hücreleri CD23 ekspresyonunu gösteren bir grafikler serisidir.

Sekil 8, ya resus IgGl (2ClORl) ya da IgG4 (2ClOR4) agir zincir sabit bölgeleri içerecek sekilde 2ClO ile gelistirilmis fare-resus kimerik formlari ve anti-CD4O 3A8 (3A8Rl) veya anti- CD4O Chi220'nin (Chi220) kimerik IgGl formlari ile tedavi edilmis resus makaklarinin çevresel B hücresi sayisini gösteren bir grafiktir. Tüm hayvanlar, birinci antikor tedavisinden sonra, 4- hidroksi-3-nitrofenilasetil konjugeli anahtar deligi limpet hemosiyanini (KLH) ile immünize edilmistir.

Sekil 9, 2ClORl, ZClOR4 veya 3A8Rl antikoru ile tedavi edilmis makak maymunlarindaki T hücresi-bagimli antikor yanitlarini gösteren bir grafiktir. Ilk antikor tedavisinden sonra bütün hayvanlar KLH ile immünize edilmistir.

Sekil 10, allojeneik adacik transplantasyonunun standart makak modelini gösteren bir semadir. Streptozotosin kullanilarak makak maymunlarinda diyabet indüklenmistir. Diyabetik maymunlara, allojenik adaciklar nakledilmis ve basiliksimab ve sirolumus ile immünobaskilama baslatilmistir. Deney hayvanlarina, transplantasyon sonrasi 0 ve 7'nci günlerde 2ClOR4 tedavisi uygulanmistir.

Sekil 11A, adacik transplantasyonu, zemindeger immün baskilama ve 2ClOR4 ile tedaviyi takiben 4 makaktaki serbest kan glukoz düzeylerini (FBG) gösteren bir çizimdir. Çizimdeki düz çizgi, plazmadaki 2ClO seviyesini temsil eder.

Sekil 11B, yalnizca zemindeger immünobaskilamasini alan makaklardaki FBG'yi gösteren bir çizimdir.

Sekil 12, artan 2ClO, 3A8 veya Chi220 antikorlari konsantrasyonlari ile enkübe edilmis ve her bir antikorun 2ClO'u çapraz bloke etme kabiliyetini degerlendirmek için bir APC konjugeli 2ClO ile boyanmis insan PBMC'leri kullanilarak bir rekabetçi blokaj testinin sonuçlarini gösteren bir grafiktir.

Ayrintili Açiklama Mevcut bulus, istemlerde belirtilen sekilde CD40 molekülü üzerinde belirli bir epitopu baglama yetenegine sahip hümanize anti-CD40 antikorlari ve antikor fragmanlari ve bu tür antikorlarin kullanimlari ile ilgilidir. Bu epitopik spesifiklik, özel bir etkinlik profili verir, böylece antikorlar genel olarak CD40'in baglayici ortaklariyla (örnegin, CD154) etkilesime girmesini engeller ve bunu CD40 eksprese eden hücreyi aktive etmeden yapar. Bu aktivite profilinin, bu antikorlari, organ veya doku transplantasyonu ile baglantili komplikasyonlari azaltmak için özellikle faydali hale getirdigi anlasilmaktadir.

CD40 antikorlarinin üretimi ve tanimlanmasi Fareler (AJ susu), resus makagi (ML mulatta) CD40'inin bir füzyon proteini ile immünize edilmistir (amino asit sekansi: EPPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQKLVSDCTEFTETECLPCSESEFLDTWNRETRCHQHKY CDP NLGLRVQQKGTSETDTICTCEEGLHCMSESCESCV; SEQ ID No:5) maltoz baglayici proteine kaynasik (CD40-MBP). Resus makagi CD40 proteininin bu bölgesindeki amino asit sekansi, bes amino asit pozisyonunda insan CD40 proteinden farklidir (insan amino asit sekansi: EPPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQKLVSDCTEFTETECLPCGESEFLDTWNRETHCHQHKY CDP NLGLRVQQKGTSETD TICTCEEGWHCTSEACESCV; SEQ ID No:6). CD40- MBP, farelere birden çok kez tam Freund adjuvani ve tam olmayan Freund adjuvani ile verilir. Immünize edilmis farelerden splenositler, fare miyelom hücre hatti SPZ/O ile ve standart hibridom teknolojisi kullanilarak seçilmis hibridler ile kaynastirilmistir.

Antikorlar, glutamin sentetaz ile kaynasmis ayni resus CD40 domeninden olusan ikinci bir füzyon proteinine reaktivite bakimindan seçilmistir (CD40-GST). ELISA.ile CD40-GST'ye reaktif olan antikorlar, resus makagi kan B hücreleri, insan kan B hücreleri ve resus makagi B-Lenfoblastoit hücre hatlarinda dogal CD4O ekspresine yönelik reaktivite için ayrica akis sitometrisi ile test edilmistir. Nihai bir seçim düzeyi olarak, antikorlar, CD154'ü eksprese eden Jurkat Dl.l hücreleri ile ko-kültürden sonra, insan veya resus makagi B hücresi aktivasyonunu inhibe etme kabiliyetleri açisindan bir in vitro testte analiz edilmistir. anti-CD4O antikorunun stabil bir alt klonu 2ClO sinirlayici dilüsyon ile elde edilmistir. Antikor, bir fare Antikor klonlama Monoklonal antikorlarin degisken bölgeleri, teknikte bilinen herhangi bir yöntem ile klonlanabilir. Hibridoma hücreleri için antikor degisken bölge sekanslarini elde etmek için PCR-bazli yöntemler, örnegin, Larrick ve dig., Nat. Biotechnol. 7:934-8, 1989 yayinlarinda tarif edilmistir. Bu teknikler veya benzer teknikler kullanilarak, monoklonal antikorlarin degisken bölgeleri klonlanlanabilir ve ayrica manipülasyona tabi tutulabilir.

Mevcut vakada, 2ClO antikorunun agir ve hafif zincirlerinden degisken sekanslar, klonlanmis ve sekanslanmistir. 2C10 hibridomundan immünoglobülin agir ve hafif zincir degisken bölgelerini temsil eden DNA, 5' RACE PCR kullanilarak asagidaki DNA primerlerinden yararlanarak klonlanmistir: Fare kappa geri: 5'-CTA ACA CTC ATT CCT GTT GAA GCT CTTGAC (SEQ ID NO:7); Fare kappa ileri: 5'-GCT GAT GCT GCA CCA ACT GTA TCC - 3' (SEQ Fare IgGl geri: 5'-GGC AAC GTT GCA GGT CTC GC - 3' (SEQ ID Fare IgGl ileri: 5' - CTG GAT CTG CTG CCC AAA CTA ACT CC - 3' (SEQ ID NO:10) PCR ürünleri, ticari bir klonlama vektörü halinde klonlanmis ve standart sekanslama teknikleri ile sekanslanmistir. Ortaya çikan sekanslar, Sekil 1'de sunulmustur.

Immünoglobülin degisken bölge genleri, 5' hizli amplifikasyonlu cDNA uçlari-polimeraz zincir reaksiyonu kullanilarak anti-CD40 antikoru klonu 2ClO salgilayan hibridomlardan ve anti-insan CD4O klonu 3A8'den klonlanmistir (Kwekkeboom ve digerleri, Immunology VA). Immünoglobülin agir ve hafif zincir degisken bölgeleri, resus IgGl veya resus IgG4 agir zinciri ve resus kappa hafif zincir sabit bölgesi sekanslari içeren ekspresyon vektörleri halinde alt klonlanmistir.

Rekombinant agir ve hafif zincirler, ekspresyon vektörleri halinde alt klonlanmis ve GPEXm ekspresyon teknolojisi kullanilarak Çin hamsteri yumurtalik hücrelerinin transdüksiyonunda kullanilan retroviral vektörler halinde paketlenmistir (Catalent Pharma Solutions, Middleton, WI). Bir iletilen hücre havuzu, serumsuz ortamda büyütülmüs ve salgilanan antikor bir protein A afinite kromatografisi ile saflastirilmistir. Aritilmis kimerik resus IgGl (2C10R1, 3A8R1) ve IgG4 (2ClOR4) antikorlari, fosfat tamponu halinde diafiltre edilmis; endotoksin. düzeyleri, J_ endotoksin Ibirimi/mg'den az oldugu dogrulanmistir.

Antikor Karakterizasyonu 2C10, CD40'a baglanir ve CD154'in baglanmasini önler 2ClO'un, rekombinant olarak insan veya resus CD40'i eksprese eden hem resus hem de insan CD40'a baglanma kabiliyetini degerlendirmek için, bunlar, ELISA plakalarina adsorbe edilmis ve farkli 2ClO konsantrasyonlariyla reaksiyona sokulmustur. 2ClO'un CD40'a baglanmasi, bir ELISA'da keçi anti-fare IgG-HRP kullanilarak tespit edilmistir. Sekil 2B'deki sonuçlar, 2ClO'un resus ve insan CD40'a benzer baglanma egilimlerine sahip oldugunu göstermektedir, bu, 2C10'un klinik translasyonu için önemlidir. 2ClO'un, onun soydas ligandinin baglanmasini bloke etme kabiliyetini dogrulamak için, CD154, resus ve insan B hücreleri, artan 2ClO konsantrasyonlari veya bir izotip kontrolü ile enkübe edilmis ve ardindan histidin-etiketli çözünür CD ile enkübe edilmis ve histidin ekspresyonu bakimindan analiz edilmistir. 2C10, CDlS4'ün doza bagimli bir tarzda (Sekil 3) baglanmasini bloke etmistir, bu, 2ClO'un T hücresine bagli CD154'ün CD4O ile B hücreleri ve antijen sunan hücreler üzerindeki etkilesimi etkili sekilde bloke ettigini gösterir. 2C10, resus maymunu ve insan çevresel kan mononükleer hücrelerindeki B hücresi aktivasyonuna bloke eder CD4O antikoru 2C10, hem resus maymunu hem insan çevresel kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler) kullanilarak B hücresi aktivasyonunu etkileme kabiliyeti bakimindan karakterize edilmistir. CDZO ekspresyonu, B hücrelerinin ve CD23, CD80'in ekspresyonu için bir gösterge olarak seçilmistir ve CD86, B hücresi aktivasyonu ile iliskilidir. 2C10, ilk olarak CDZO'ye baglanma kabiliyeti açisindan degerlendirilmistir. Resus veya insan PBMC'leri, florokrom ile konjuge edilmis 2ClO ve bir anti- CDZO antikoru ile enkübe edilmistir. Akis sitometrik analizi, 2ClO'un insan ve resus CD20+ B hücrelerine baglanmasini dogrulamak için kullanilmistir (Sekil 2A). Baska bir deney grubunda, ya resus maymunu ya da insanlardan PBMC'ler, ölümsüzlestirilmis bir T limofosit hücre hatti olan CD154+ Jurkat Dl.l hücresinin ya varliginda ya da yoklugunda kültürlenmistir.

B hücrelerinin aktivasyonu, PBMC'ler içinde mevcut olan CD20+ hücrelerindeki üç markörün (CD23, CD80, ve CD86) ekspresyonunun ölçülmesiyle belirlenir. Bu testin genel semasi Sekil 4'te gösterilmektedir. Sekil 4'te gösterilen sekilde, PBMC'lerin Jurkat hücrelerinin varliginda kültürlenmesi, tüm üç markörün yüksek ekspresyonuna neden olmus, bu, B hücrelerinin, CD154+ Jurkat hücreleri ile aktive edildigini göstermistir.

Antikorlarin B hücresi aktivasyonunu bloke etme kabiliyetini test etmek için, PBMC'ler ve Jurkat hücreleri üç antikorun birinin varliginda ya da yoklugunda birlikte kültürlenmistir: antikorudur (ATCC Mevduat No. HB-l2024) ve 5C8, bir anti-CD154 antikorudur (ATCC Mevduat No. CRL-10915). Her biri bir pozitif kontrol olarak kullanilmistir. Es kültürler, bes derece büyüklügündeki konsantrasyonda antikor konsantrasyonu araliginda gerçeklestirilmistir (0,001 ug ila 10 ug). Sekil 5'te gösterilen sekilde, 3A8, CD23 ekspresyonu ile ölçülen sekilde resus PBMC'lerindeki B hücresi aktivasyonunu bloke etmezken, hem 2C10 hem de 5C8 benzer bir verimle aktivasyonu bloke edebilmistir. Karsilik gelen degisimler ayrica CD8O ve CD86 ekspresyonu ile gözlemlenmistir. Bu sonuçlar, 2C10'un CD40'ta 3A8'den farkli bir epitopa baglandigini gösterir. Bu sonuçlar ayrica, 2C10'un, öncelikle 3A8'e zit olarak bir CD40 antagonisti olarak görev yaptigini gösterir, bunun daha önce, zayif uyarim potansiyeline sahip kismi agonistler gibi davrandigi gösterilmistir (Adams ve digerleri, J. Immunol. 174z542-50, 2005, Badell ve dig., Am. J. Transplant. yayin için kabul edilme yili, 2011). Benzer bir deney, resus yerine, insan PBMC'leri kullanilarak gerçeklestirildiginde, hem 2C10 hem de 5C8'in, CD86 ekspresyonu ile ölçülen sekilde, benzer verimlilikle B hücresi aktivasyonunu bloke ettigi gözlenmistir. Burada, 3A8 antikoru, resus PBMC'leri ile olanin tersine, B hücresi aktivasyonunu bloke etmistir (Sekil 6). 2C10 ve 3A8 antikorlari, ayrica Jurkat hücreleri yoklugunda ya resus maymunu ya da insan PBMC'leri kullanilarak B hücrelerini aktive etme kabiliyetleri açisindan test edilmistir. Burada, PBMC'ler ya 2C10 ya da 3A8'in varliginda veya yoklugunda kültürlenmistir. CD23, CD8O ve CD86'nin ekspresyonü daha sonra CDZO+ hücrelerinde ölçülmüstür. Sekil 7'de gösterilen sekilde, resus hücrelerindeki CD23 ekspresyonu 3A8 varliginda artmis, ama 2C10 antikor varliginda artmamistir. Tersine, ne 3A8 ne de 2010 insan B hücrelerini aktive etmistir. 3A8 ve 2C10 antikoru arasinda gözlemlenen etkinlik farki, 2C10 antikorunun 3A8 antikorununkinden farkli olan bir epitopa baglanir. 2C10, bir T hücresi bagimli antikor yanitini önler 2ClO'un CD4O üzerindeki essiz bir epitopa baglandigini, bir antiCD 154 antikoruna benzer sekilde B hücresi aktivasyonunu inhibe ettigini ve agonistik özelliklere sahip olmadigini ortaya koyduktan sonra, 2C10'un in vivo etkilerini karakterize etmis bulunuyoruz. Rekombinant fare resus kimerik formlari 2C10, ya resus IgGl (2C10R1) ya da IgG4 (2C10R4) agir zinciri ve resus kappa hafif zincir sabit bölgesi sekanslari kullanilarak üretilmistir. Bir kimerik resus IgGl biçimi 3A8 (3A8R1) de kontrol olarak kullanilmak üzere üretilmistir.

Resus makaklari, 4-hidroksi-3-nitrofenilasetil konjugeli anahtar deligi limpet. hemosiyanini (KLH, 10 mg IM) antijeni (Biosearch Technologies, Novato, CA) ile sifirinci günde bir kez immünize edilmistir. Bagisiklama öncesi ve bir haftada üç hayvan veya salin verilmistir. Tüm hayvanlar 70 gün süreyle gözlemlenmis ve akis sitometrisi haftalik olarak gerçeklestirilmistir. Her iki rekombinant 2C1O izotipiyle tedavi, 3A8R1 alan hayvanlardan meydana gelen periferik B hücrelerinin daha önce bildirilen önemli ve uzun süreli tükenmesi ile karsilastirildiginda periferik B hücre sayisinda (Sekil 8) mütevazi degisiklikle sonuçlanmistir (Badell ve dig., KLH-NP'ye yönelik T hücresi bagimli antikor yanitlari, ELISA tarafindan test edilmistir. Plakalar, KLH (0,01 mg/ml, Sigma, St. Louis, MO) ile kaplanmis ve Super Block (Thermo Scientific, Woodstock, GA) ile bloke edilmistir. Tedavi öncesi ve sonrasi plazma örnekleri seri halinde seyreltilmis, 1 saat süreyle plakaya kaplanmis ve fosfat tamponlu salin/%0,05 Tween ile yikanmistir. Anti- KLH antikorlari, monoklonal anti-resus IgG- yaban turpu peroksidazi ile 1 saat boyunca enkübe edilerek tespit edilmistir (Klon .

Plakalar ardindan peroksidaz substrat çözeltisi (KPL) ile enkübe edilmistir. Durdurma çözeltisi (KPL) ardindan ilave edilmis ve optik yogunluk bir ELISA plaka okuyucu üzerinde 450 nm'de okunmustur. Tedavi sonrasi plazmanin optik yogunluk okumasi, ayni tedavi sirasinda tedavi öncesi plazma optik yogunlugunu 2 kat asarsa, belirli bir dilüsyonda bir örnegin pozitif oldugu kabul edilmistir. KLH immünizasyonu takip edilerek, kontrol hayvanlari yüksek-titreli KLH-spesifik IgG (Sekil 9) gelistirmistir. 3A8R1 alan hayvanlar, ayrica, anti-KLH yanitlari gelistirmistir, ancak titreler B hücrelerinin tükenmesine ragmen kontrollerden yaklasik 10 kat daha düsük olmustur. Aksine, IgG anti- KLH antikorlarinin üretimi, ya 2C10Rl ya da 2ClOR4 verilen tüm hayvanlarda 56'inCi günde neredeyse tamamen bloke edilmistir. 2C10, allojenik adacik transplantasyonunun bir makak modelinde adacik allogreft sagkalimini önemli ölçüde uzatir Biz ayrica, CD4 ile aritilmis kimerik resus IgG4 antikorlari olan 2C10R4'ü insan disi bir primat allojenik adacik transplantasyonu modelinde test etmis bulunuyoruz (Sekil 10). -20 kg agirligindaki Resus makaklarina, orta hat laparotomi ile transplantasyon isleminden bir gün önce donör pankreatektomi yapilmistir. Pankreas izole edilmis ve hayvanlar terminal olarak kan kaybina ugratildiktan sonra buz üzerine konulmustur. Adacik izolasyonu, Collagenase/Neutral protease kullanilarak yapilmistir (sirasiyla, 950 Wunsch birimi ve 63 birimi; Serva, Heidelberg, Almanya). Sindirilmis pankreas dört tabakali, süreksiz bir Euroficoll gradyani (Mediatech, Manassas, VA) ve üzerinde saflastirilmistir. Nihai adacik hazirliginin örnekleri sayilmis ve adacik esdegeri (IEQ) olarak ifade edilmistir. Izole edilmis adaciklar gece boyunca kültürlenmis, sayilmis ve Transplant Media (Mediatech) içerisinde süspanse edilmistir. 3-5 kg agirligindaki Rhesus makaklari, transplantasyon isleminden dört hafta önce streptozotosin (1250 mg/m2 IV; Zanosar, Teva Parenteral Medicines, Irvin, CA) kullanilarak diyabetik hale getirilmistir. 500 mg/kg bolus dekstroz ve primat C-peptit ölçümü ile diyabet, intravenöz glukoz tolerans testi (IVGTT) ile dogrulanmistir. Glikoz seviyeleri izlenmis ve dekstroz enjeksiyonundan sonra C-peptidi bazal ve 10, 30, 60 ve 90'da ölçülmüstür. Diyabet, saptanabilir serum C-peptit yoklugunda kandaki glikoz seviyelerinin yükselmesiyle dogrulanmistir. Diyabetli alicilara MHC uyumsuz adacik allotransplantasyonu uygulanmistir. Ortalama 15.745 (± 4.063) kanülasyonu yoluyla uygulanmistir.

Kan glukoz düzeyleri, günde iki kez kulak çubugu ile ölçülmüstür; açlik kan glukozunu (FBG) 300 mg/dL'den daha az düzeyde tutmak için NPH (Novolin; Novo Nordisk, Princeton, NJ) ve glargin (LANTUS; Sanofi-Aventis, Bridgewater, NJ) insülini, transplant öncesi ve greft rejeksiyonu sonrasinda uygulanmistir.

Greft fonksiyonunu izlemek için transplantasyon sonrasinda periyodik olarak. IVGTT yapilmistir. Transplant alicilari, T hücresi (CD3 V450, CD4 PerCP-Cy5.5, CD8 PerCp; BD Bioscience) ve B hücresi (CD20 PE, BD Bioscience) popülasyonlarini izlemek için haftalik akis sitometrik analizine tabi tutulmustur. Adacik greftlemesi sonrasinda, iki ardisik günde 130 mg/dL'den büyük FBG olarak tanimlanmistir. Birincil bitim noktasi, rejeksiyonsuz adacik grefti sagkalimi olmustur. Bu deneylerde kullanilan tüm hayvanlara, Emory Üniversitesi IACUC ve Laboratuar Hayvanlarinin Bakim ve Kullanim Kilavuzu ile uyumlu olarak islem yapilmistir.

Nakil alicilarina ya 2C10R4, basiliksimab (Simulect, Novartis, Basel, Isviçre) ve sirolimus ya da sadece basiliksimab ve sirolimus verilmistir. 2C10R4 (50 mg/kg) intravenöz olarak ameliyat sonrasi (POD) O ve 7'nci günde uygulanmistir.

Basiliksimab (0,3 mg/kg) intravenöz olarak POD O ve 3'te verilmistir. Sirolimus, POD 120 boyunca 5-15 ng/ml'lik düsük düzeylerine ulasmak için günlük bazda intramüsküler olarak uygulanmistir. Sadece basiliksimab ve sirolimus alan üç hayvanin tümü tarihsel kontrollerdir (Badell ve dig., J Clin. Invest.

R1b7) pankreatektomi ile diyabet indüklenmis ve oral sirolimus verilmistir.

Yukarida tarif edilen rejimlerle yapilan tedavi, sadece basiliksimab indüksiyonu ve sirolimus idame tedavisi alan kontrollerle karsilastirildiginda (Sekil llB) anlamli ölçüde uzun süreli adacik greft sagkalimi (Sekil llA) ile sonuçlanmistir. 2C10R4 alan hayvanlar için medyan rejeksiyonsuz greft sagkalim süresi kontrol hayvanlari için olan 8 güne kiyasla (p=0,010, Tablo JJ 280 gün olmustur. Farmakokinetik veriler, plazma 2C10R4 seviyelerinin POD 100'e göre 1 ug/ml'den düsük olacagini öngörmektedir. Sirolimus, PODlZO'de kesildiginden, en uzun sagkalim süresi olan (304 gün) alici, rejeksiyonu olmadan yaklasik 24 hafta önce herhangi bir immünospresyon almamistir. 2C10R4 ile tedavi edilen hiçbir hayvanda klinik olarak enfeksiyöz komplikasyon veya kilo kaybi görülmemistir. Bu sonuçlar, 2C1O IgG4 izotipini alan hayvanlari yansitmaktadir.

Basiliksimab ve sirolimus ile kombinasyon halinde IgGl izotipi günlük uzun süreli greft sagkalimi elde etmistir (veriler gösterilmemistir). Indüksiyon tedavisi olarak kullanilan 2C10 ile pozitif sonuçlara bakildiginda, bir sonraki adim, 2C10'u bakim terapisi olarak uygulayarak greft sagkalimi üzerindeki etkileri degerlendirmektir.

Alici Terapi IEQ/kg Greft Yorum Sagkalimi Sirolimus Sirolimus Sirolimus Sirolimus RQz6 Basilliksimab/Siroli 12,980 8 Rejeksiyon RIb7 Basiliksimab/Sirulim 10,903 8 Rejeksiyon RMcll Basiliksimab/Sirolini13.79 10 Rejeksiyon CD28/B7 yolagi ile birlikte CD40/CD154 yolaginin blokaji CD40/CD 154 yolaginin blokaji, diger kostimülasyon blokaj maddeleri ile birlikte yararli olabilir. Belatacept, CD28/B7 kostimülatör yollarini bloke etmek için tasarlanmis CTLA4-Ig'nin yüksek afiniteli bir versiyonu olup, insan disi primat renal ve adacik transplantasyonu modellerinde ve renal transplantasyonda faz II ve III klinik çalismalarinda etkinlik göstermistir belatacept ile tedavi edilen hastalarda üstün böbrek fonksiyonu ortaya çikarmistir; ancak, bu hastalarin insidansi ve biyopsi ile kanitlanan sekilde akut rejeksiyon düzeyleri daha yüksek akut rejeksiyon orani ve CD40 ile B7 blokayi arasindaki Sinerji disi primat böbrek transplantasyonunda kombine 2C10 ve belatacept tedavisinin etkinligini test etmek istiyoruz.

Epitop Eslestirme Bir antikorun baglandigi belirli bir epitopu tanimlamak için yöntemler teknikte uzman kisilerce bilinir. Standart teknikler peptit taramasini içerir, bu teknikte, örtüsen, kisa peptidler (örnegin, 10-30 amino asitlik, örnegin, 20 uzunlugunda) antikorun baglandigi tam uzunluktaki proteinden türetilmis, antikoru baglama yetenekleri açisindan ayri ayri test edilmistir. Bu tür deneylerden, antikorun baglandigi proteinin bölgesi daha sonra belirlenebilir.

Alana özgü mutagenez, ayrica belirli bir proteinin antijenik bölgesini/bölgelerini tanimlamak için de kullanilabilir. Bu yaklasimda nokta mutasyonlari sistematik olarak hedef polipeptide dahil edilir ve antikorun peptidi muhtelif pozisyonlarda mutasyonlarla baglama yetenegi, bu proteinin belirli bir bölgesinin, antikorun baglandigi epitopu. içerip içermedigini belirlemek için kullanilir.

Antikor epitoplari da, ayrica yüksek verimli mutagenez teknikleri, örnegin Shotgun Mutagenesis (Integral Molecular, edilebilir, bu teknik, hedef protein içinde çok sayida mutasyon üretmek için kullanilabilir. Bu gibi metodolojiler, protein içindeki eptitoplarin etkili bir sekilde tanimlanmasina imkan CD40'a yönelik çesitli antikorlarin benzer epitoplara baglanip baglanmadigini belirlemek için, in vitro rekabetçi bir blokaj testi yapilmistir. Testte, 2C10, 3A8 ve Chi220 antikorlari, bir kimerik IgGl CD40-spesifik antikoru, kullanilmistir. 2ClO, allofikosiyanine (APC) Lightning Link antikoru etiketleme kiti (Novus Biologics, Littleton, CO) kullanilarak konjüge edilmistir. Insan PBMC'leri, artan 2ClO, 3A8 veya Chi220 konsantrasyonlari ile enkübe edilmis ve daha sonra APT konjugeli 2ClO ile her bir antikorun 2C10'u çapraz-bloklama yetenegini degerlendirmek üzere boyanmistir. APC konjugeli 2ClO'un baglanmasi, 2ClO'un artan konsantrasyonlariyla azalmis, ancak Sekil 12'de gösterilen sekilde Chi220 veya 3A8 ile azalmamistir.

Sonuç, 2C10'ün Chi220 veya 3A8'den farkli benzersiz bir epitopu bagladigini gösterir.

Ilave antikorlarin üretimi 2ClO ile taninan CD4O epitopuna karsi ilave antikorlar (örnegin, monoklonal, poliklonal, poli-spesifik veya mono- spesifik antikorlari), örnegin, teknikte bilinen çesitli antikor yapma yöntemlerinin herhangi biri kullanilarak da yapilabilir.

Bir örnekte, 2ClO antikoru tarafindan taninan bir epitop için bir kodlama sekansi, glutatyon S-transferaz (GST) ile bir C- terminali füzyonu olarak eksprese edilir (Smith ve digerleri, taneleri üzerinde saflastirilmis, glutatyon ile elüte edilmis, trombin ile bölünmüs (bir gelistirilmis bölünme yerinden) ve tavsanlarin immünizasyonu için saflastirilmistir. Birincil immünizasyonlar, Freund'un tam adjuvani ile yapilir* ve daha sonraki immünizasyonlar Freund'un tam olmayan adjuvani ile gerçeklestirilir. Antikor titreleri, Western blot ve GST füzyon proteininin trombinle bölünmüs protein fragmani kullanilarak immünopresipitasyon analizleri ile izlenir. immün serumlar CNBr- Sepharose ile kenetlenen protein kullanilarak afiniteleri saflastirilir. Antiserum spesifikligi, ilgisiz bir GST proteinleri paneli kullanilarak belirlenebilir.

GST füzyon proteinlerine alternatif veya ilave bir immünojen olarak, açiklanan bir polipeptidin nispeten benzersiz immünojenik bölgelerine karsilik gelen peptitler, sokulan bir C- terminal lizin vasitasiyla anahtar deligi limpet hemosiyanine (KLH) üretilebilir ve baglanabilir. Bu peptidlerin her birine antiserum, benzer sekilde, BSA'ya konjuge edilmis peptitler üzerinde saflastirilmis olan afinitedir ve spesifiklik, peptid konjugatlari kullanilarak ELISA veya Western blot analizi veya GST füzyon proteini olarak eksprese edilen polipeptidi kullanarak Western blot veya immünopresipitasyon ile test Alternatif olarak, 2C10 antikorunu taniyan CD4O epitopunu spesifik olarak baglayan monoklonal antikorlar, standart hibridom teknolojisi kullanilarak hazirlanabilir (bakiniz Eur. J. Immunol 6:511-9, 1976; Kohler ve dig., Eur. J. Immunol. 6:292-5, 1976; Hammerling ve dig., Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, NY, 1981). Üretildikten sonra, monoklonal antikorlar ayrica Western blot veya immünopresipitasyon analizi ile spesifik tanima için test edilebilir. Alternatif olarak, monoklonal antikorlar yukarida açiklanan polipeptit ve bir faj gösterim kütüphanesi kullanilarak hazirlanabilir (Vaughan ve digerleri, Nat.

Epitopik fragmanlar, standart teknikler, örnegin, PCR kullanilarak ve fragmanin bir pGEX ekspresyon vektörü halinde klonlanmasiyla üretilebilir. Füzyon proteinleri E. coli'de eksprese edilir ve bir glutatyon agaroz afinite matrisi kullanilarak saflastirilir. Düsük afinite veya antiserum spesifitesi potansiyel problemlerini en aza indirmek amaciyla, her protein için iki ya da üç füzyon üretilir ve her füzyon en az iki tavsana enjekte edilir. Antiserumlar, bir seri halinde enjeksiyonlar ile yükseltilir ve örnegin en az üç güçlendirici enjeksiyon içerebilir.

Poliklonal antikorlari büyük ölçekte ve düsük maliyetle üretmek için, uygun bir hayvan türü seçilebilir. Poliklonal antikorlar sütten veya örnegin immünize edilmis ineklerin kolostrumundan izole edilebilir. Sigir kolostrumu litre basina 28 g IgG içerirken sigir sütü litre basina 1,5 g IgG içerir (Ontsouka ve antikorlar ayrica immünize edilmis tavuklardan elde edilen yumurta sarisindan izole edilebilir (Sarker ve digerleri, J.

Süt ineklerinde kullanim için çoklu adjuvanlar onaylanmistir.

Mevcut tarifnamede yararli adjuvanlar arasinda, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, Emulsigen®, bir suda yag emülsifiyeli adjuvan, Emulsigen®-D, DDA immünouyaricili bir suda yag emülsifiyeli adjuvan, Emulsigenß-P, bir ko-polimer immünouyaricili suda yag emülsifiyeli adjuvan, Emulsigen®- BCL, bir blok ko-polimer immünouyaricili suda yag emülsifiyeli adjuvan, Carbigenmh bir karbomer bazi ve Polygenm, bir ko- polimer bazi bulunur. Sayilan adjuvanlarin tümü, Omaha, Nebraska'da bulunan MVP Laboratories'den ticari olarak temin edilebilir.

Yararli antikorlar, farkli tarama testinde tespit edilebilir.

Ilk olarak, antikorlar, immünize edici antijen (yani, burada tarif edilen CD4O epitopu) bakimindan spesifik olup olmadiklarini belirlemek için ELISA ile analiz edilir. Standart teknikler kullanarak, ELISA plakalari immünojen ile kaplanir, antikor plakaya eklenir, yikanir ve baglanmis antikorun varligi, antikorun üretildigi türün Ig'sine özgü ikinci bir antikor kullanilarak tespit edilir.

Antikorlari, örnegin monosit türevli dendritik hücrelere dayanan nötrlestirici bir tahlili taramak için fonksiyonel bir in vitro test kullanilabilir.

Insan deneklerdeki ileal sivisinda yapilan dogrudan ölçümler, anlamli miktarlarda immünoglobülinin mide ve ince bagirsaktan sag olarak geçis sagladigini göstermistir (Warny ve digerleri, formüle etme yöntemleri de tarif edilmistir (Kovacs-Nolan ve Insanlastirilmis antikorlar Mevcut bulus istemlerde belirtildigi gibi hümanize antikorlari kapsar. Insan disi antikorlarin insanlastirilmasina yönelik çesitli yöntemler teknikte bilinmektedir. Örnegin insanlastirilmis bir antikor, içine insan olmayan bir kaynaktan sokulan bir ya da daha fazla amino asit kalintisina sahip olabilir. Bu insan disi amino asit kalintilarina ayrica "ithal" kalintilar adi verilmekte olup, bunlar tipik olarak bir "ithal" degisken alandan alinir. Insanlastirma, temel olarak Winter ve meslektaslarinin metodu izlenerek (Jones ve dig., Nature bölge sekanslarinin, bir insan antikorunun karsilik gelen sekanslariyla ikame edilmesi yoluyla gerçeklestirilebilir.

Dolayisiyla bu tür "insanlastirilmis" antikorlar, bozulmamis/bütün bir insan degisken alanindan büyük ölçüde daha azinin, insan olmayan bir türden gelen ilgili sekans ile ornatildigi kimerik antikorlardir (U.S. Patent No. 4,816,567).

Uygulamada, insanlastirilmis antikorlar tipik olarak en az bazi hiperdegisken bölge kalintilarinin yani sira diger degisken bölge kalintilarinin kemirgen antikorlarindaki benzer bölgelerden kalintilar ile ikame edildigi insan antikorlaridir.

Insanlastirilmis antikorlarin yapiminda kullanilacak olan hem hafif hem. de agir insan degisken domenlerinin seçimi antijenikligin azaltilmasi bakimindan çok önemli olabilir. "En iyi uyum" adi verilen metoda göre, bir kemirgen antikorunun degisken domeninin sekansi, insan degisken domen sekanslarinin bilinen tüm kütüphanesine karsi taranir. Kemirgenin sekansina en yakin olan insan sekansi daha sonra insanlastirilmis antikor için insan çerçeve olarak kabul edilir. Bakiniz, örnegin, Sims zincirlerin belirli bir alt grubuna ait tüm insan antikorlarinin konsensus sekansindan türetilen belirli bir çerçeve bölgesi kullanilir. Ayni çerçeve birkaç farkli hümanize antikor için kullanilabilir. Bakiniz, örnegin, Carter ve dig., Proc. Natl.

Ayrica, antikorlarin antijene yönelik yüksek afiniteleri ve diger avantajli biyolojik özellikleri korunarak insanlastirilmasi da genel olarak arzu edilir. Bu amaca ulasmak için bir yönteme göre insanlastirilmis antikorlar, parental ve insanlastirilmis sekanslarin üç boyutlu modellerini kullanmak suretiyle, parental sekanslarin ve çesitli kavramsal, insanlastirilmis ürünler üzerinde bir analiz prosesi ile hazirlanir. Üç boyutlu immünoglobülin modelleri yaygin olarak bulunabilir ve teknikte uzman kisiler tarafindan iyi bilinir.

Seçilen aday immünoglobülin sekanslarinin muhtemel üç boyutlu konformasyonel yapilarini resmeden ve görüntüleyen bilgisayar programlari mevcuttur. Bu görüntülerin incelenmesi, rezidülerin, aday immünoglobülin sekansinin isleyisindeki olasi rolünün analizine, baska bir deyisle, aday immünoglobülin'in kendi antijenini baglama kabiliyetini etkileyen rezidülerin analizine olanak tanir. Bu sayede FR kalintilari alici ve ithal sekanslardan seçilebilir ve birlestirilebilir, böylece istenen antikor Özelligi, Örnegin hedef antijene/antijenlere yönelik afinitenin artirilmasi saglanabilir. Genellikle, asiri degisken bölge kalintilari, antijen baglanmasini dogrudan ve en önemli ölçüde etkilemede rol oynar.

Insan Antikorlari Mevcut bulusun insan antikorlari, insan kaynakli faj gösterim kütüphanelerinden seçilen FV klonu degisken domen sekansi/sekanslarini, bilinen insan sabit domen sekansi/sekanslari ile birlestirerek olusturulabilir (Hoog- monoklonal antikorlari, hibridoma yöntemi ile yapilabilir. Insan monoklonal antikorlarinin üretimi için insan miyelom ve fare- insan heteromiyelom hücre hatlari, örnegin Kozbor, J. Immunol.

Production Techniques and Applications, sf. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); ve Boerner ve dig., J. Immunol.

Günümüzde, immünizasyonun ardindan, endojen immünoglobülin üretiminin yoklugunda tam bir insan antikor repertuvarini üretme kabiliyetine sahip transgenik hayvanlar (örnegin fareler) üretmek mümkündür. Örnegin, kimerik ve germ hatti mutant farelerdeki antikor agir zincir birlesme bölgesi (JH) geninin homozigos silinmesinin, endojen antikor üretiminin tamamen inhibe olmasiyla sonuçlandigi anlatilmistir. Insan germ hatti immünoglobülin gen diziliminin bu tür germ hatti mutant farelere aktarilmasi antijen yüklemesinden sonra insan antikorlarinin üretimiyle sonuçlanir. Bakiniz, örnegin, Jakobovits ve Year Immunol. 7:33-40, 1993.

Insan olmayan, örnegin kemirgen antikorlarindan insan antikorlarinin türetilmesi için gen karistirma da kullanilabilmekte olup, burada insan antikoru, baslangiçtaki insan olmayan antikora benzer afinitelere ve spesifikliklere sahiptir. Ayni zamanda "epitop baskilamasi" olarak da adlandirilan bu yönteme göre, burada anlatilan faj görüntüleme teknikleri ile elde edilen insan olmayan bir antikor fragmaninin agir ya da hafif zincir degisken bölgesi, insan V alani genlerinin bir repertuvari ile degistirilir ve böylece insan olmayan zincir/insan zincir SCFV' veya Fab kimeralarinin. bir popülasyonu yaratilir. Antijen ile seçme, insan olmayan zincir/insan zinciri kimerik scFV veya Fab'sinin izolasyonuna neden olur ve burada, insan zinciri, primer faj görüntüleme klonundaki mukabil insan olmayan zincirin çikarilmasiyla yok edilen antijen baglama bölgesini geri kazandirir; yani epitop, insan zinciri partnerinin seçimini yönetir (baskisini yapar).

Geriye kalan insan olmayan zinciri degistirmek üzere proses tekrarlandiginda, bir insan antikor elde edilir (bakiniz PCT Yayini WO 93/06213). Insan olmayan antikorlarin CDR greftleme ile geleneksel sekilde insanlastirilmasinin aksine, bu teknik, insan kökenli olmayan FR veya CDR kalintilarina sahip olmayan tamamen insan antikorlari saglar.

Antikor fragmanlari Bir intakt antikorun bir kismini, tercihen antijen baglanma bölgesini içeren antikor fragmanlari açiklanmaktadir. Antikor fragmanlarinin örnekleri arasinda Fab, Fab', F(ab')2 ve FV fragmanlari; diakorlar; dogrusal antikorlar; tek Zincirli antikor molekülleri; ve antikor fragmanlarindan olusturulan multispesifik antikorlar bulunur.

Antikorlarin papain ile kesimi, her biri tek bir antijen baglayici bölge içeren "Fab" fragmanlari olarak adlandirilan iki özdes antijen baglayici fragman ve kolayca kristallesebildigi adindan anlasilan bir kalinti "Fc" fragmanini üretir. Pepsin ile muamele, iki antijen birlestirici bölgeye sahip olan ve hala antijeni çapraz baglayabilen bir F(ab')2 fragmani üretir.

FV, tam bir antijen baglanma bölgesi içeren minimum antikor fragmanidir. Bir somut gösterimde, bir iki-Zincirli FV türü, bir siki, kovalent olmayan birlesme içindeki bir agir- ve bir hafif zincir degisken alani dimerinden olusur. Tek Zincirli bir FV (scFV) türünde, bir agir- ve bir hafif-zincir degisken alani, hafif ve agir zincirlerin, iki zincirli bir FV türündekine benzer bir “dimerik” yapi içinde birlesebilecegi sekilde esnek bir peptit baglayici vasitasiyla kovalent olarak baglantilanabilir.

Bu konfigürasyonda, her degisken alanin üç hiper-degisken bölgesi (HVR), VH-VL dimerinin yüzeyinde bir antijen baglayici bölge tanimlamak üzere etkilesime girer. Alti HVR, toplu olarak, antikora antijen baglama spesifikligi kazandirir. Bununla birlikte, tek bir degisken alan (veya bir antijen için spesifik olan yalnizca üç HVR içeren bir Fv'nin yarisi) bile, tüm.baglanma bölgesine göre daha düsük afiniteyle olsa da, antijeni tanima ve baglama yetenegine sahiptir.

Fab fragmani agir ve hafif zincir degisken domenlerini içerir ve ayrica hafif zincirin sabit domeni ve agir zincirin birinci sabit domenini (CHl) içerir. Fab' fragmanlari, antikor mentese bölgesinden bir veya birden fazla sistein içeren agir zincir CHl alaninin karboksi ucuna birkaç rezidünün eklenmesi bakimindan Fab fragmanlarindan farklilik gösterir. Fab'-SH burada, içerisinde sabit alanlarin sistein kalinti(lar)sinin bir serbest tiyol grubu tasidigi Fab' için verilen isimdir. F(ab')2 antikor parçaciklari baslangiçta aralarinda mentese sisteinler bulunan Fab' parçacik çiftleri olarak üretilmistir. Antikor fragmanlarinin diger kimyasal kenetlenmeleri de bilinmektedir.

Tek Zincirli FV veya scFv antikor fragmanlari, antikorun VH ve V1 domenlerini içermekte olup, burada bu domenler bir tek polipeptit zinciri içinde bulunur. Genel olarak, FV polipeptidi ayrica VH ve VL domenleri arasinda, st'nin antijen baglanmasi için istenen yapiyi olusturmasini saglayan bir polipeptit baglayici içerir. scFV ile ilgili bir inceleme için bkz. örnegin, Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Cilt 113, Rosenburg and Moore eds., (SpringerVerlag, New York, 1994), sf. 269-315.

Diyakorlar, iki antijen baglanma bölgesine sahip olan antikor fragmanlarini belirtmekte olup, bu fragmanlar, ayni polipeptit zincirinde (Vwâhj bir hafif zincir degisken domenine (V1) bagli olan bir agir zincir degisken domeni (VH) içerir. Ayni zincir üzerinde iki domen arasinda eslesme saglamak için çok kisa olan bir baglayici kullanilarak domenler baska bir zincirin tamamlayici domenleriyle eslesmeye zorlanir ve böylece iki adet antijen baglanma bölgesi olusturulur. Diyakorlar iki degerli veya bispesifik olabilir. Diyakorlar daha ayrintili olarak, tarif edilmektedir. Trikorlar ve tetrakorlar ayrica Hudson ve edilmistir.

Antikor fragmanlari, geleneksel yollarla, örnegin enzimatik sindirim veya rekombinant tekniklerle üretilebilir. Belirli sartlarda, tüm antikorlar yerine antikor fragmanlari kullanmanin avantajlari vardir. Fragmanlarin daha küçük boyutta olmasi, hizli atilima imkan verir ve kati tümörlere daha iyi erisim saglar. Belirli antikor fragmanlari ile ilgili bir inceleme için Çesitli teknikler, antikor fragmanlarinin üretilmesine yönelik olarak gelistirilmistir. Geleneksel olarak bu fragmanlar, intakt antikorlarin proteolitik sindirimi yoluyla türetilmistir (bkz. örnegin, Morimoto ve dig., J. Biochem. Biophys. Methods 24:107- fragmanlar günümüzde rekombinant konakçi hücreler tarafindan dogrudan üretilebilmektedir. Fab, FV ve SCFV antikor fragmanlarinin tamami E. coli içinde eksprese edilebilir ve E. coli'den salgilanabilir ve bu da büyük miktarlarda fragmanlarin kolaylikla üretilebilmesine imkan verir. Antikor fragmanlari, antikor faj kütüphanelerinden izole edilebilir. Alternatif olarak Fab'-SH fragmanlari, dogrudan E. coli'den geri kazanilabilir ve F(ab')2 fragmanlarini olusturmak üzere kimyasal olarak kenetlendirilebilir (Carter ve dig., Bio/Technology dogrudan, rekombinant konakçi hücre kültüründen izole edilir.

Bir kurtarma reseptörüne baglanan epitop kalintilarini içeren, arttirilmis in vivo yarilanma ömrüne sahip Fab ve F(ab')2 fragmani, U.S. Patent No. 5,869,046 belgesinde tarif edilmistir.

Antikor fragmanlarinin üretimine yönelik diger teknikler ilgili alanin uzmanlarinca bilinmektedir.

Farmasötik Bilesimler Istemlerde belirtilen sekilde farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyici ile birlikte formüle edilmis bir antikor veya bunun antijen baglayici kisim(lar)ini içeren bir bilesim, örnegin, bir farmasötik bilesim ele alinmaktadir. Burada tarif edilen farmasötik bilesimler ayrica kombinasyon terapisinde, diger ajanlarla (örnegin immünobaskilayicilar) kombine olarak da uygulanabilir. Burada kullanildigi sekliyle “farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyici” terimi, fizyolojik olarak uyumlu olan her türlü çözücüler, dagilma ortamlari, kaplamalar, antibakteriyel ve antifungal ajanlar, izotonik ve absorpsiyon geciktirici ajanlar ve benzerlerini içerir. Tercihen, tasiyici intravenöz, intratekal, intramüsküler, subkutan, parenteral, spinal veya epidermal uygulama için uygundur (örn., enjeksiyon veya infüzyon yoluyla). Uygulama yoluna bagli olarak, mevcut bulusun antikorlari, bilesigin inaktive olabilen asitlerin ve diger dogal kosullarin etkisinden korunmasi için bir materyal içinde kaplanabilir.

Mevcut bulusun bir bilesimi, teknik alanda bilinen çesitli yöntemlerle uygulanabilir. Uygulama yolu ve/veya sekli istenen sonuçlara bagli olarak degisecegi, teknikte uzman kisi tarafindan anlasilacaktir. Uygulama, parenteral, intravenöz, intratekal, subkütan, oral, topikal veya lokal, örnegin, serebrospinal siviya direkt enjeksiyon yoluyla olabilir. Sürekli infüzyonla intravenöz uygulama, mevcut bulusun terapötik antikorlarini uygulamakr için örnek bir yöntemdir. Terapötik bilesik, bir çözelti, bir süspansiyon, bir emülsiyon, bir infüzyon aygiti veya implantasyon için bir aktarim aygiti halinde olabilir veya kullanimdan önce suyla veya baska bir uygun araçla sulandirilmak üzere kuru bir toz halinde sunulabilir.

Bilesim, oral uygulama için bir hap, tablet, kapsül, sivi veya sürekli salim tableti halinde; veya intravenöz, intratekal, subkütan veya parenteral uygulama için bir sivi halinde; veya lokal uygulama için bir polimer veya diger sürekli salim araci halinde olabilir. Formülasyonlari yapmak için teknikte iyi bilinen yöntemler, örnegin, "Remington: The Science and Practice of Pharmacy" (20'inci Baski, ed. A.R. Gennaro AR., 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA) referansli yayinda bulunabilir. Parenteral uygulama için formülasyonlar, örnegin, eksipiyanlar, steril su, salin, polialkilen glikoller örnegin polietilen glikol, sebze orijinli yaglar veya hidrojenize naftalenler olabilir. Biyogeçimli, biyolojik olarak bozunabilen laktid polimer, laktid/glikolid kopolimer veya polioksietilen-polioksipropilen kopolimerleri bilesiklerinin salimini kontrol etmek için kullanilabilir. Nanoparçacikli formülasyonlar (örnegin, biyolojik olarak bozunabilen nanoparçaciklar, kati lipid nano parçaciklari, lipozomlar) bilesiklerinin biyodagilimini kontrol etmek için kullanilabilir.

Diger potansiyel olarak yararli aktarim sistemleri arasinda, etilen-Vinil asetat kopolimer parçaciklari, ozmotik pompalar, intratekal pompalar, implante edilebilir infüzyon sistemleri ve lipozomlar bulunur. Formülasyondaki bilesigin konsantrasyonu, uygulanacak ilacin dozu ve uygulama yolunu içeren bir dizi faktöre bagli olarak degisir.

Mevcut bulusa ait bir bilesigin belirli uygulama yollariyla tatbik edilmesi için, bilesigin, etkisiz hale gelmesini önlemek için bir malzeme ile kaplanmasi veya bilesigin birlikte uygulanmasi gerekebilir. Örnegin bilesik, uygun bir tasiyici, örnegin lipozomlar veya bir seyreltici içinde bir kisiye uygulanabilir. Farmasötik olarak kabul edilebilir seyrelticiler, tuzlu su ve sulu tampon çözeltileri içerir. Lipozomlar, su içinde yag içinde su CGF emülsiyonlarini ve ayrica geleneksel lipozomlari içerir (Strejan ve dig., J. Neuroimmunol. 7:27- 4l,l984). Farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyicilar arasinda steril sulu çözeltiler veya dispersiyonlar ve steril enjekte edilebilir çözeltilerin veya dispersiyonun ekstemporan preperati için steril tozlar bulunur. Farmasötik olarak aktif maddeler için bu tür ortamlarin ve ajanlarin kullanimi, teknikte bilinmektedir ve herhangi bir geleneksel ortam veya maddenin, aktif bilesik ile bagdasmadigi durumlar hariç bulusa dahil edilmistir. Tamamlayici etken bilesikler de bu bilesimlere eklenebilir.

Terapötik bilesimler tipik olarak üretim ve depolama kosullari altinda steril ve kararli olmalidir. Bilesim, yüksek ilaç konsantrasyonuna uygun bir çözelti, mikroemülsiyon, lipozom veya baska bir sirali yapi olarak formüle edilebilir. Tasiyici, örnegin su, etanol, poliol (örnegin gliserol, propilen glikol ve sivi polietilen glikol ve benzerleri) ve bunlarin uygun karisimlarini içeren bir çözücü veya dispersiyon ortami olabilir. Uygun akiskanlik, örnegin, lesitin gibi kaplamanin kullanilmasiyla, dispersiyon durumunda gerekli partikül boyutunun korunmasi ve yüzey aktif maddelerin kullanilmasi ile korunabilir. Birçok durumda, Örnegin, sekerler, mannitol gibi polialkoller, sorbitol veya sodyum klorür gibi izotonik ajanlarin bilesime dahil edilmesi tercih edilecektir. Enjekte edilebilir bilesimlerin uzun süreli emilimi, bilesime emilimi geciktiren bir ajan, örnegin monostearat tuzlari ve jelatin dahil ederek saglanabilir.

Steril enjekte edilebilir çözeltiler, aktif bilesigin gereken miktarda uygun bir çözücü içinde, gerektigi sekilde yukarida sayilan bilesenlerin bir veya bir kombinasyonu ile birlestirilmesi, ardindan sterilizasyon mikrofiltrasyonu ile hazirlanabilir. Genel olarak, dispersiyonlar, aktif bilesigin, bazik bir dispersiyon ortami ve yukarida sayilanlardan gerekli diger` bilesenleri içeren steril bir aracar dahilr edilmesiyle hazirlanir. Steril enjekte edilebilir çözeltilerin hazirlanmasi için steril tozlarin kullanilmasi durumunda, hazirlik için tercih edilen yöntemler, etken madde tozu ile birlikte daha önceden steril filtre edilmis sivi ortamindan alinan herhangi bir istenen ilave içerik saglayan vakum kurutma ve dondurarak kurutma(liyofilizasyon) teknikleridir. Dozaj rejimleri, istenen en uygun yaniti (örn., terapötik› bir yanit) saglamak üzere ayarlanir. Örnegin, tek bir bolus seklinde veya birkaç bölünmüs doz zamana yayilarak verilebilir veya doz, terapötik durumun gerektirdigi ölçüde orantili olarak azaltilabilir veya arttirilabilir. Örnegin, bulusa ait antikorlar, subkutan enjeksiyonla haftada bir veya iki kez veya subkutan enjeksiyonla ayda bir veya iki kez uygulanabilir.

Kolay sekilde verilmeleri ve dozajin homojenligi için parenteral bilesimlerin dozaj birim formunda formüle edilmesi özellikle avantajlidir. Burada kullanildigi sekliyle dozaj birim formu, tedavi edilecek olan kisiler için birim dozajlar halinde uygun fiziksel olarak ayri birimleri belirtir; her ünite, gerekli farmasötik tasiyici ile birlikte istenen terapötik etkiyi saglamak için hesaplanan önceden belirlenmis bir miktarda aktif bilesik içerir. Dozaj birim formlari için tarifname, dogrudan (a) aktif bilesigin özgün özellikleri ve elde edilecek belirli terapötik etkiye, ve (b) bireylerde hassasiyetin tedavisi için böyle bir aktif bilesigin bilesiminin teknigindeki kalitimla kazanilan sinirlamalara göre belirlenir. ifadeleri, burada kullanildigi sekilde, enteral ve topikal uygulama disinda genellikle enjeksiyon yoluyla uygulama modlari anlamina gelir ve sinirlayici olmaksizin, intravenöz, intramüsküler, intra-arteriyel, intratekal, intrakapsüler, intraorbital, intrakardiyak, intradermal, intraperitoneal, transtrakeal, subkütan, subkütiküler, intra-artiküler, subkapsüler, subaraknoid, intraspinal, epidural ve intrasternal enjeksiyon ve infüzyon bulunur. Bulusa ait farmasötik bilesimlerde kullanilabilecek uygun sulu ve susuz tasiyicilarin örnekleri arasinda su, etanol, polioller (gliserol, propilen glikol, polietilen glikol ve benzerleri gibi) ve bunlarin uygun karisimlari, zeytin yagi ve etil oleat gibi enjekte edilebilir organik esterler gibi bitkisel yaglar bulunur. Uygun akiskanlik, örnegin, lesitin gibi kaplama malzemelerinin kullanilmasiyla, dispersiyon durumunda gerekli partikül boyutunun korunmasi ve yüzey aktif maddelerin kullanilmasi ile korunabilir.

Mevcut bulusun bilesimleri ayrica, adjuvanlar, örnegin koruyucular, islatici maddeler, emülgatörler ve dagitici maddeler de içerebilir. Mikroorganizmalarin varliginin önlenmesi hem sterilizasyon prosedürleri hem de çesitli antibakteriyel ve antifungal ajanlarin, örnegin paraben, klorobütanol, fenol sorbik asit ve benzerlerinin dahil edilmesiyle saglanabilir.

Bilesimler içine sekerler, sodyum› klorürt ve benzerleri gibi izotonik ajanlarin dahil edilmesi de istenebilir. Ek olarak, enjekte edilebilir farmasötik formun uzun süreli absorpsiyonu, alüminyum monostearat ve jelatin gibi emilimi geciktiren ajanlarin dahil edilmesiyle saglanabilir.

Mevcut bulusa ait bilesikler, farmasötik olarak, insanlara ve hayvanlara uygulandiginda, tek baslarina veya farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyici ile kombinasyon halinde, örnegin, ) arasinda etken madde içeren farmasötik bir bilesim olarak verilebilirler.

Intravenöz veya intratekal aktarim veya dogrudan enjeksiyon için, bilesim, bilesimin Siringa ile verilebilecegi Ölçüde steril ve akiskan olmalidir. Suya ilave olarak, tasiyici, bir izotonik tamponlu salin çözeltisi, etanol, poliol (örnegin, gliserol, propilen glikol ve sivi polietilen glikol ve benzerleri) ve bunlarin uygun karisimlari olabilir. Uygun akiskanlik, örnegin, lesitin gibi kaplamanin kullanilmasiyla, dispersiyon durumunda gerekli partikül boyutunun korunmasi ve yüzey aktif maddelerin kullanilmasi ile korunabilir. Birçok durumda, örnegin, sekerler, mannitol gibi polialkoller veya sorbitol ve sodyum klorür gibi izotonik ajanlarin bilesime dahil edilmesi tercih edilir. Enjekte edilebilir bilesimlerin uzun süreli emilimi, bilesime emilimi geciktiren bir ajan, örnegin alüminyum monostearat veya jelatin dahil ederek saglanabilir.

Seçilen uygulama yolundan bagimsiz olarak, mevcut bulusun uygun bir hidratli formunda ve/veya bu bulusun farmasötik bilesimlerinde kullanilabilecek bilesikleri, teknikte uzman kisilerce bilinen konvansiyonel yöntemlerle farmasötik olarak kabul edilebilir dozaj formlari halinde formüle edilir. Mevcut bulusun farmasötik bilesimlerinde aktif bilesenlerin gerçek dozaj seviyeleri, hasta için toksik olmaksizin, bulusa ait belirli bir hasta, bilesini ve uygulama biçimi için istenen terapötik tepkinin elde edilmesinde etkili olan aktif bilesenin bir miktarinin elde edilmesi için degistirilebilmektedir.

Seçilen dozaj seviyesi, mevcut bulusa ait belirli bilesimlerin aktivitesi veya bunun esteri, tuzu veya amidi, uygulama yolu, uygulama süresi, kullanilan belirli bilesigin salgilanma orani, kullanilan belirli bilesimlerle birlikte kullanilan diger ilaçlar, bilesikler ve/veya malzemeler, tedavi edilen hastanin yasi, cinsiyeti, agirligi, durumu, genel sagligi ve önceki tibbi geçmisi ve tip alaninda iyi bilinen faktörler dahil olmak üzere çesitli farmakokinetik faktörlere bagli olacaktir. Teknikte siradan uzmanliga sahip bir doktor veya veteriner, gerekli farmasötik bilesimin etkili miktarini kolayca belirleyebilir ve reçete edebilir. Örnegin, hekim veya veteriner hekim, istenen terapötik etkiyi elde etmek ve istenen etki elde edilinceye kadar dozu kademeli olarak arttirmak için gerekenden daha düsük seviyelerde farmasötik bilesimde kullanilan bulusa ait bilesiklerin dozlari ile baslayabilir. Genel olarak, mevcut bulusun bir bilesiminin uygun bir günlük dozu, bir terapötik etki üretmek için etkili olan en düsük doz olan bilesik miktari olacaktir. Böyle bir etkili doz, genellikle yukarida tarif edilen faktörlere dayali olacaktir. Arzu edilirse, bir terapötik bilesimin etkili günlük dozu, ayri ayri uygun araliklarla, iki, üç, dört, bes, alti veya daha fazla alt dozlar olarak gün boyunca, tercihe göre, birim dozaj formlari halinde uygulanabilir. Mevcut bulusun bir bilesiginin tek basina verilmesi mümkün olsa da, bilesigin, bir farmasötik formülasyon (mevcut bilesim) olarak uygulanmasi tercih edilebilir.

Terapötik bilesimler, teknikte bilinen tibbi cihazlar ile uygulanabilir. Iyi bilinen implant, aktarim sistemlerinin örnekleri ve mevcut bulusta yararli modüller teknikte yetkin olanlarca bilinmektedir.

Durumlar ve bozukluklar Burada tarif edilen antikorlar ve antikor fragmanlari, immunobaskilamanin istendigi herhangi bir durumda kullanilabilir (örnegin, transplant rejeksiyonu veya otoimmün bozukluklari). Bu antikorlar, transplant rejeksiyonunu tedavi etmek için, örnegin, belirli bir transplantin konakçi tarafindan reddedilme olasiligini azaltmak veya rejeksiyonun olusmasindan önceki süreyi artirmak için özellikle faydalidir. Burada tarif edilen antikorlar, herhangi bir organin transplantasyonu ile veya transplantasyon için uygun herhangi bir doku ile birlikte kullanilabilir. Örnek organlar arasinda kalp, böbrek, akciger, karaciger, pankreas, bagirsak ve timüs; örnek dokular kemik, tendon, kornea, cilt, kalp kapagi, ven ve kemik iligi bulunur.

Antikorlar ve antikor fragmanlari, otoimmün bozukluklarinin, otoantikorlarin hastaligin patogenezinde yer aldigi özel durumlarin tedavi edilmesinde de kullanilabilir. Otoantikor üretimi ile baglantili olan veya olabilen otoimmün hastaliklar arasinda, sistemik lupus eritematozusu (SLE), CREST sendromu (kalsinoz, Raynaud sendromu, özofagal dismotilite, sklerodaktil ve telanjiyektazi), opsoklonus, enflamatuvar miyopati (örnegin, polimiyozit, dermatomiyozit. ve inklüzyon-Vücut miyozidi), sistemik skleroderma, primer biliyer siroz, Çölyak hastaligi (örnegin, gluten duyarli enteropati), dermatitis herpetiformis, Miller Fisher sendromu, akut. motor aksonal nöropati (AMAN), multifokal motor nöropati, iletim. bloklu, otoimmün hepatit, antifosfolipid sendromu, Wegener granülomatozu, mikroskopik polianjihit, Churg-Strauss sendromu, romatoid. artrit, kronik otoimmün hepatit, skleromiyozit, myastenia gravis, Lambert-Eaton miyastenik sendromu, Hashimoto tiroiditi, Graves hastaligi, paraneoplastik serebellari dejenerasyon, kati insan sendromu, limbik ensefalit, Isaac sendromu, Sydenham kora, pediyatrik otoimmün nörokromatopsikiyatrik hastaligi, streptokok (PANDAS) ile iliskili, ensefalit, diabetes mellitus tip 1 ve nöromiyelit optika bulunur.

Diger otoimmün rahatsizliklari arasinda, pernisiyöz anemi, Addison hastaligi, psöriyazis, enflamatuvar bagirsak hastaligi, psoriatik artrit, Sjogren sendromu, lupus eritematozusu (Örnegin, disk biçimli lupus eritematozus, ilaç-kaynakli lupus eritematozus ve neonatal lupus eritematozus), multipl skleroz ve reaktif artrit bulunur.

Mevcut bulusun kullanimlariyla tedavi edilebilecek ilave bozukluklar arasinda örnegin, polimiyozit, dermatomiyozit, çoklu endokrin yetmezligi, Schmidt sendromu, otoimmün üveit, adrenalit, tiroitit, otoimmün tiroit hastaligi, gastrik atrofi, kronik Hepatit, lupoit hepatit, ateroskleroz, erken demans, demiyelinizan hastaliklar, subakut kutanöz lupus eritematozus, hipoparatiroidizm, Dressler sendromu, otoimmün trombositopeni, idiopatikr trombositopenikr purpura, hemolitikr anemi, pemfigus vulgaris, pemfigus, alopesia arcata, pemfigoit, skleroderma, progresif sistemik skleroz, yetiskin baslangiç diabetes mellitus (örnegin, tip II diyabet), erkek ve disi otoimmün infertilitesi, ankilozan spondolit, ülserli kolit, Crohn hastaligi, karisik bag dokusu hastaligi, polyarterit nedosa, sistemik nekroz Olusturucu vaskülit, genç baslangiç romatoid artrit, glomerülonefrit, atopik dermatit, atopik rinit, Goodpasture sendromu, Chagas hastaligi, sarkoidoz, romatik ates, astim, tekrarlayan düsük, anti-fosfolipid sendromu, çiftçi akcigeri, eritema multiforme, post. kardiyotomi sendromu, Cushing sendromu, otoimmün kronik aktif hepatit, Bird-Fancier akcigeri, alerjik hastalik, alerjik ensefalomiyelit, toksik epidermal nekroliz, alopesi, Alport sendromu, alveolit, alerjik alveolit, fibrozlu alveolit, interstisyel akciger hastaligi, eritema nodosum, piyoderma gangrenosum, transfüzyon reaksiyonu, cüzam, sitma, leyismanya, tripanosomiyaz, Takayasu arteriti, polimiyalji romatika, temporal arterit, sistosomiyaz, dev hücreli arterit, askariyazis, aspergillozis, Sampter sendromu, egzama, lenfomatoid granülomatoz, Behçet Hastaligi, Caplan sendromu, Kawasaki hastaligi, denge, endokardit, endomiyokardiyal fibroz, endoftalmit, eritema elevatum et diutinum, eritroblastoz fetalis, eozinofilik fasiit, Shulman sendromu, Felty sendromu, filaryaz, siklit, kronik siklit, heterokronik siklit, Fuch siklit, IgA nefropati, Henoch-Skonlein purpura,greft versus host hastaligi, transplantasyon rejeksiyonu, insan immün yetmezlik Virüsü enfeksiyonu, ekovirüs enfeksiyonu, kardiyomiyopati, Alzheimer hastaligi, parvovirüs enfeksiyonu, rubella Virüs enfeksiyonu, asilama sonrasi sendromlar, konjenital kizamikçik enfeksiyonu, Hodgkin ve non-Hodgkin lenfoma, renal hücre karsinom, multipl miyelom, Eaton-Lambert sendromu, nükslü polikondrit, kötü huylu melanom, kriyoglobülinemi, Waldenstrom makroglobülemi, Epstein-Barr Virüs enfeksiyonu, kabakulak, Evan sendromu ve otoimmün gonadal yetmezligi bulunur.

Immünosupresanlar Burada tarif edilen antikorlar ve antikor fragmanlari, bir immünobaskilayici ile kombinasyon halinde formüle edilebilir veya verilebilir. Immünobaskilayici örnekleri arasinda, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, kalsinörin inhibitörleri (örnegin, siklosporin A (Sandimmune®), siklosporin G takrolimus (Prograf®, Protopic®)), mTor inhibitörleri (örnegin, sirolimus (Rapamune®, Neoral®), temsirolimus (Torisel®), zotarolimus, ve everolimus (Certican®)), fingolimod (Gilenyam), miriosin, alemtuzumab (Campath®, MabCampath®, Campath-1H®), rituksimab (Rituxanß, MabThera®), bir anti-CD4 monoklonal antikoru (örnegin, HuMax- CD4), bir anti-LFAl monoklonal antikoru (örnegin, CDlla), bir anti-LFA3 monoklonal antikoru, bir anti-CD45 antikoru (örnegin, bir anti-CD45RB antikoru), bir anti-CD19 antikoru (Bakiniz, (Orencia®), belatasept, indolil-ASC (takrolimus ve askomisinin 32-indol eter türevleri), azatiyoprin (Azasan®, lmuran®), lenfosit immün globulin ve anti-timosit globulin (ATGAM®), mikofenolat mofetil (Cellcept®), mikofenolat sodyum (Myfortic®), daklizumab (Zenapax®), basiliksimab (Simulect®), siklofosfamid (Endoksan®, Cytoxan®, Neosarm, Prositoxm, Revimmunem), prednizon, prednisolon, leflunomid (Arava®), FK778, FK779, 15- deoksispergualin (DSG), busülfan (Myleran®, Busulfex®), fludarabin (Fludara®), metotreksat (Rheumatrex®, Trexall®), 6- merkaptopurin (Purinthol®), 15-deoksispergualin (Gusperimus), LF15-0195, bredinin, brekinar ve muromonab-CD3 (Orthoclone®) Bir maddenin immünobaskilayici etkinliginin degerlendirilmesi için yöntemler teknikte bilinmektedir. Örnegin, nakledilen organin in Vivo olarak farmakolojik müdahale ile ve müdahalesiz sagkalim süresinin uzunlugu, immün tepkinin baskilanmasi için nicel bir ölçü olma görevi yapar. In vitro testler de, örnegin, bir karma lenfosit tepkimesi (MLR) testi (bakiniz, örnegin, (immün hücrelerin bir anti-CD3 antikoru yoluyla (örnegin, OKT3) spesifik aktivasyonu) (bakiniz, örnegin, Khanna ve digerleri, Transplantation 67:558); ve bir IL-2R testi (eksojen olarak eklenen sitokin IL-2 ile immün hücrelerin spesifik aktivasyonu) (bakiniz, Örnegin, Farrar ve dig., J. Immunol. 126:1120-5, 1981).

Siklosporin A (CsA; CAS No. 59865-13-3; U.S. Patent No. 3,737,433) ve analoglari bir immünobaskilayici olarak kullanilabilir. Immünobaskilayici aktivite sergileyen çok sayida baska siklosporinler ve bunlarin türevleri ve analoglari bilinmektedir. Siklosporinler ve formülasyonlari, örnegin, 2004 Physicians' Desk Reference® (2003) Thomson Healthcare, 58'inci 4,894,235 yayinlarinda tarif edilmektedir.

Takrolimus (FK506), heni moleküler etki sekli heni de klinik etkinligi bakimindan, büyük ölçüde CsA'ya benzer etkiler yapan CsA'dan 20 ila 100 kat daha düsük dozlarda sergilenir (Peters ve örnegin, 2004 Physicians' Desk Reference® (2003) Thomson Healthcare, 58'inci Baski, ve U.S. Patent No'lari 4,894,366; Sirolimus (rapamisin), örnegin, Streptomyces hygroscopicus tarafindan üretilebilen bir immünobaskilayici laktam makroliddir. Çesitli sirolimus türevleri ve analoglari ve formülasyonlari bilinmektedir ve örnegin, içinde 2004 Physicians' Desk Reference® (2003) Thomson Healthcare, 58'inci edilmistir.

CD40 fragmanlari 2C1O antikoru tarafindan spesifik olarak. baglanmis epitopu içeren CD40 fragmanlari da açiklanmaktadir. 2C10 antikoru CD40 polipeptidinin hücre disi bölümüne karsi yükseltilmistir; dolayisiyla, bu antikorun bu sekansin bir kismi ile (SEQ ID No'lariz5 ve 6) reaksiyona girdigine inanilmaktadir. amino asit uzunlugundaki, spesifik olarak 2C10 antikorunca baglanan CD40 fragmanlarini saglamaktadir. Belirli bir baska Füzyon proteinleri Burada tarif edilen bir fragman ve bir heterolog sekansini içeren bir füzyon proteini açiklanmaktadir. Belirli bir açiklamada, füzyon partnerlerinden biri, Fc proteinidir (örnegin, fare Fc veya insan Fc). Füzyon ayrica, Örnegin bir maltoz baglayici protein veya GST gibi antikor üretimi için faydali bir sekans olabilir. Bir baska açiklamada, füzyon proteini, bir saflastirma veya saptama etiketi, örnegin, dogrudan veya dolayli olarak tespit edilebilen proteinlerdir, örnegin, yesil floresan proteini, hemaglütinin veya alkalin fosfataz), DNA baglama domen1eri (örnegin, GAL4 veya LexA), gen aktivasyon domenleri (örnegin, GAL4 veya VP16), saflastirma etiketleri veya salgilama sinyal peptidleridir (örnegin, preprotripsin sinyal sekansi). Bir baska açiklamada, füzyon partneri, bir etiket, örnegin c-mis, poli histidin veya FLAG olabilir. Her füzyon partneri bir veya daha fazla alan, Örnegin bir preprotrisin sinyal sekansi ve FLAG etiketi içerebilir.

CD40 fragmanlari ve füzyon proteinlerinin üretimi CD40 fragmanlari ve burada tarif edilen füzyon proteinleri, polipeptit fragmanini veya füzyon proteinini kodlayan bir polinükleotid molekülü ile uygun bir konakçi hücrenin uygun bir ekspresyon araci içinde transformasyonu ile üretilebilir.

Moleküler biyoloji alaninda uzman olanlar, çesitli ekspresyon sistemlerinden herhangi birinin kullanilabilecegini ve kullanilan kesin sistem veya konakçi hücrenin kritik olmadigini anlayacaktir. Örnek ekspresyon sistemler, arasinda prokaryotik konakçilar (örnegin, E. coli) ve ökaryotik konakçilar (örnegin, S. cerevisiae, böcek hücreleri, örnegin, Sf21 hücreleri veya memeli hücreleri, örnegin, NIH 3T3, HeLa veya tercihen COS hücreleri) bulunur. Bu tür hücreler çok çesitli kaynaklardan temin edilebilir (örnegin, Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu, Manassas, VA). Dönüsüm veya transfeksiyon yöntemi ve ekspresyon araci seçimi, seçilen konakçi sistemine bagli olacaktir. Dönüsüm ve transfeksiyon yöntemleri, örnegin, Kucherlapati ve dig., (CRC Cells (eds., Ravid and Freshney, Wiley-Liss, 1998) yayinlarinda tarif edilmektedir; ve ekspresyon araçlari, örnegin, Vectors: Expression Systems: Essential Techniques (ed., Jones, Wiley & Sons Ltd., 1998) yayinlarinda saglananlardan seçilebilir.

Rekombinant CD40 polipeptid fragmani veya füzyon proteini, eksprese edilince, örnegin, afinite kromatografisi kullanilarak izole edilebilir. Bir örnekte, fragman veya füzyon proteinine (örnegin, 2C1O antikoru) karsi yükseltilmis bir antikor, bir kolona eklenebilir ve polipeptid fragmani veya füzyon proteinini izole etmek için kullanilabilir. Afinite kromatografisinden önce fragman veya füzyon proteini içeren hücrelerin parçalanmasi ve parçalanmasi standart yöntemlerle gerçeklestirilebilir (bakiniz, örnegin, Methods in Enzymology, cilt 182, eds., Abelson, Simon, and Deutscher, Elsevier, 1990).

Izole edilince, CD4O polipeptid fragman veya füzyon proteini, arzu edilirse, ayrica, örnegin, yüksek performansli sivi kromatografisi ile aritilabilir (bakiniz örnegin, Fisher, Laboratory Techniques in Biochemistry enui Molecular Biology, eds., Work and Burdon, Elsevier, 1980; ve Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Üçüncü Baski, ed., Cantor, Springer, 1994).

CD4O polipeptid fragmanlari veya füzyon proteinleri de, kimyasal sentez yoluyla üretilebilir (örnegin, Solid Phase Peptide Synthesis, 2'nci Baski, 1984, The Pierce Chemical Co., Rockford, IL; ve Solid Phase Synthesis: A Practical Guide, ed., Kates and Albericio, Marcel Dekker Inc., 2000 yayinlarinda tarif edilen yöntemlerle).

Claims (14)

ISTEMLER

1. CD40'a spesifik olarak baglanan izole edilmis bir hümanize antikor veya bunun antijen baglayici fragmani olup, özelligi; SEQ ID NO: 2'nin 20-132 amino asitlerinde belirtilenlere karsilik gelen hiperdegisken bölgelerin tümünü ihtiva eden bir agir zincir degisken bölgesi ve SEQ ID NO: 4'ün 23-128 amino asitlerinde belirtilenlere karsilik gelen hiperdegisken bölgelerin tümünü ihtiva eden bir hafif zincir degisken bölgesi içermesi, burada bahsedilen antikor veya bunun antijen baglayici fragmaninin, CD154'ü eksprese eden Jurkat hücreleri vasitasiyla B lenfosit aktivasyonunu in vitro olarak bloke etmesidir.

2. Istem l'in antikoru veya bunun antijen baglayici fragmani olup, Özelligi; burada bahsedilen CD40'in, resus maymunu CD4O veya insan CD4O olmasidir.

3. Istem 1 veya 2'nin antikoru veya bunun antijen baglayici fragmani olup, özelligi; burada bahsedilen antijen baglayici fragmaninin, FC kismina sahip olmayan bir antikor olmasi veya bir F(ab')2, bir Fab, bir FV veya bir scFv yapisi olmasidir.

4. Istemler l-3'ün herhangi birinin bir antikoru veya bunun antijen baglayici fragmanini kodlayan polinükleotid Olup, özelligi; burada, tercihe göre, polinükleotidin, bahsedilen polinükleotidi kodlayan bir vektör olmasidir.

5. Istem 4'ün polinükleotidini içeren bir hücre olup, özelligi; burada, tercihe göre, bahsedilen hücrenin, bir prokaryotik hücre veya bir ökaryotik hücre, örnegin bir nemeli hücresi olmasidir.

6. Istemler l-3'ün herhangi birinin antikoru veya bunun antijen baglayici fragmani olup, özelligi; bir kisideki immün sisteminin baskilanmasinda kullanima yönelik olmasidir.

7. Istemler l-3'ün herhangi birinin antikoru veya bunun antijen baglayici fragmani olup, özelligi; transplant rejeksiyonunu tedavi etmede veya profilaktik olarak tedavi etmede veya ihtiyaç halindeki bir denekte transplant rejeksiyonu olusmadan önceki sürenin arttirilmasinda kullanima yönelik olmasidir.

8. Istan 6 veya 7'ye göre kullanim için antikor veya bunun antijen baglayici fragmani olup, özelligi; burada bahsedilen kisinin bir organ transplanti almis olmasi veya buna ihtiyaç duyuyor olmasi, özellikle burada bahsedilen organin, kalp, böbrek, akciger, karaciger, pankreas, bagirsak, ve timus veya bunlarin bir kismindan olusan gruptan seçilmesi; veya burada bahsedilen kisinin bir doku transplanti almis olmasi veya bir doku transplantina ihtiyaç duyuyor olmasi, özellikle burada bahsedilen dokunun, kemik, tendon, kornea, cilt, kalp valfi, ven veya kemik iligi olmasidir.

9. Istem 8'e göre kullanim için antikor veya bunun antijen baglayici fragmani olup, özelligi; burada: a) bahsedilen kisinin, bahsedilen organ transplanti veya bahsedilen doku transplantina ihtiyaç duymasi; veya b) bahsedilen antikor veya antijen baglayici fragmaninin, bahsedilen organ transplanti veya bahsedilen doku transplantinin sonrasinda en az bir ay süreyle bir tedavi rejiminde uygulama için formüle edilmis olmasi, özellikle burada bahsedilen antikorun veya bunun antijen baglayici fragmaninin bahsedilen organ transplanti veya bahsedilen doku transplantinin sonrasinda en az alti ay süreyle bir tedavi rejiminde uygulama için formüle edilmis olmasidir.

10. Istemler l-3'ün herhangi birinin antikor veya bunun antijen baglayici fragmani olup, özelligi; buna ihtiyaci olan bir denekteki greft-versus-host hastaligini tedavi etme veya profilaktik olarak tedavi etme yönteminde kullanima yönelik olmasidir.

11. Istemler 1-3'ün herhangi birinin antikoru veya bunun antijen baglayici fragmani olup, özelligi; buna ihtiyaci olan bir denekteki bir otoimmün bozuklugunu tedavi etme veya profilaktik olarak tedavi etme yönteminde kullanima yönelik olmasidir.

Istem 11'e göre kullanim için antikor veya bunun antijen baglayici fragmani olup, özelligi; burada bahsedilen otoimmün bozuklugunun asagidaki gibi olmasidir: a) bir otoantikor mevcudiyeti ile baglantili veya bunun neden olmus olmasi; b) sistemik lupus eritematozusu (SLE), CREST sendromu (kalsinoz, Raynaud sendromu, özofagal dismotilite, sklerodaktil ve telanjiyektazi), opsoklonus, enflamatuvar miyopati (örnegin, polimiyozit, dermatomiyozit ve inklüzyon-Vücut miyozidi), sistemik skleroderma, primer biliyer siroz, çölyak hastaligi (örnegin, gluten duyarli enteropati), dermatitis herpetiformis, Miller Fisher sendromu, akut motor aksonal nöropati (AMAN), iletim bloklu multifokal motor nöropati, otoimmün hepatit, antifosfolipid sendromu, Wegener granülomatozu, mikroskopik polianjihit, Churg-Strauss sendromu, romatoid artrit, kronik otoimmün hepatit, skleromiyozit, myastenia gravis, Lambert-Eaton miyastenik sendromu, Hashimoto tiroiditi, Graves hastaligi, paraneoplastik serebellar dejenerasyon, kati insan sendromu, Isaac sendromu, Sydenham kora, streptokok (PANDAS) ile iliskili pediyatrik otoimmün nörokromatopsikiyatrik hastaligi, diabetes mellitus tip 1 ve Nöromiyelit optikadan olusan gruptan seçilmesi; veya c) pernisiyöz anemi, Addison hastaligi, psöriyazis, enflamatuvar bagirsak hastaligi, psoriatik artrit, Sjogren sendromu, lupus eritematozusu (örnegin, disk biçimli lupus eritematozus, ilaç-kaynakli lupus eritematozus ve neonatal lupus eritematozus), multipl skleroz ve reaktif artritten olusan gruptan seçilmesidir.

Istemler 6-12'nin herhangi birine göre kullanima yönelik antikor veya bunun antijen baglayici fragmani olup, özelligi; a) burada bahsedilen kisinin, bir memeli olmasi, özellikle burada bahsedilen kisinin, bir insan olmasi; b) burada bahsedilen antikor veya bunun antijen baglayici fragmaninin, parenteral, intravenöz, subkütan, oral, topikal, intratekal veya lokal uygulama için formüle edilmesi; veya c) burada bahsedilen antikor veya antijen baglayici fragmaninin, ikinci bir ajan ile bir tedavi rejiminde uygulama, örnegin söz konusu antikorun veya antijen baglayici bir fragmaninin alti ay içinde uygulanmasi için formüle edilmis olmasi, burada bahsedilen ikinci maddenin, bir immünobaskilayici olmasi, özellikle burada bahsedilen ikinci maddenin bir kalsinörin inhibitörü, takrolimus, bir mTor inhibitörü, fingolimod, miriosin, alemtuzumab, rituksimab, bir anti-CD4 monoklonal antikoru, bir anti-LFAl monoklonal antikoru, bir anti-LFA3 monoklonal antikoru, bir anti-CD45 antikoru, bir anti-CD19 antikoru, monabatasept, belatasept, indolil-ASC; azatiyoprin, lenfosit immün globülin ve atgil anti-timosit globülini, mikofenolat mofetil, mikofenolat sodyum, daklizumab, basiliksimab, siklofosfamid, prednizon, prednisolon, leflunomid, FK778, FK779, busülfan, fludarabin, metotreksat, 6-merkaptopurin, lS-deoksispergualin, LF15-Ol95, bredinin, brekinar ve muromonab-CD3'ten olusan gruptan seçilmesi, burada tercihe i) bahsedilen kalsinörin inhibitörünün, siklosporin A veya siklosporin G olmasi; ii) bahsedilen mTor inhibitörünun, sirolimus, temsirolimus, zotarolimus veya everolimus olmasi; iii) bahsedilen anti-CD45 antikorunun, bir anti-CD45RB antikoru olmasi; veya iv) bahsedilen ikinci maddenin, belatasept olmasidir.

14. Istem 13'e göre kullanima yönelik antikor veya bunun antijen baglayici fragmani olup, özelligi; burada bahsedilen tedavi rejiminin, bahsedilen antikor veya bunun antijen baglayici fragmaninin, ikinci maddenin bir haftasi veya bir ayi içerisinde uygulanmasini içermesidir.