CN101970003A

CN101970003A - 抗cd40抗体的应用

Info

Publication number: CN101970003A
Application number: CN2008801246143A
Authority: CN
Inventors: M·卢克曼; Y·王; S·坎塔克; S·J·徐; A·M·莫扎
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics AG; Xoma Technology Ltd USA
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics AG; Xoma Technology Ltd USA
Priority date: 2007-11-09
Filing date: 2008-11-07
Publication date: 2011-02-09
Also published as: RU2010123363A; JP5559695B2; JP2011503098A; RU2491095C2; KR20100088621A; AU2008323815A1; EP2211902A1; BRPI0820407A2; US20110002934A1; WO2009062054A1; MX2010005099A; AU2008323815B2; CA2705263A1

Abstract

本发明涉及抗CD40抗体在治疗B细胞肿瘤生长相关疾病或病症中的新应用。本发明特别可用于治疗先前曾给予过(i)CHOP，(ii)嵌合型抗-CD20单克隆抗体利妥昔单抗，或(iii)CHOP与利妥昔单抗联合治疗的患者。

Description

抗CD40抗体的应用

发明领域

本发明涉及抗CD40抗体在治疗B细胞肿瘤生长相关疾病或病症中的新应用。本发明特别可用于治疗先前曾给予过(i)CHOP，(ii)嵌合抗-CD20单克隆抗体利妥昔单抗，或(iii)CHOP与利妥昔单抗联用治疗过的患者。

发明背景

CD40是存在于人正常B细胞和肿瘤B细胞表面的一种50-55kDa细胞表面抗原。B-细胞系的肿瘤恶性B细胞表达CD40，其存活和增殖看来依赖于CD40信号传导。低级和高级B细胞淋巴瘤、急性B细胞淋巴母细胞白血病、多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病和霍奇金病患者的转化细胞均表达CD40。在急性髓母细胞性白血病和50％AIDS相关性淋巴瘤中也检测到CD40表达。

抗CD40抗体及其应用已有描述，例如，已公开的WO 2005/044294、WO2005/044304、WO 2005/044305、WO 2005/044306、WO 2005/044307、WO2005/044854、WO 2005/044855、WO 2006/073443、WO 2006/125117、WO2006/125143、WO 2007/053661和WO 2007/053767共有国际专利申请。这些申请特别公开了人抗CD40单克隆IgG₁抗体，其中称为CHIR-12.12(但现在称为HCD122)的单克隆抗体系通过免疫接种携带人IgG₁重链基因座和人κ轻链基因座的转基因小鼠而产生(捷诺小鼠技术公司(

technology)；加州阿布吉尼克斯(Abgenix，California))。这些申请还披露了抗CD40抗体如HCD122在治疗B细胞肿瘤生长相关疾病或病症中的应用。

尽管任何一种现有治疗剂对患者可能有益，但还需要降低毒性以及改善治疗结果的方法。此外，由于原始耐药性或治疗过程产生的耐药性，许多疾病或病症单用一种药物治疗常常变得难治。因此，能改善单用一种药物治疗疗效的任何联合疗法的发现都是最令人感兴趣的。

附图简述

图1显示了RL DLBCL异种移植模型中不同处理提供的抗肿瘤活性的研究结果(见实施例1)。

图2显示了CD40L和HCD122对SU-DHL-4细胞的CHOP细胞毒性影响的研究结果。

图3显示了CD40L和HCD122对RL和SU-DHL-4细胞系NFkB信号传导影响的研究结果。

图4显示了CD40L和HCD122对RL细胞中某些细胞表面粘附分子表达影响的研究结果。

图5显示了CD40L和HCD122对SU-DHL-4细胞中某些细胞表面粘附分子表达影响的研究结果。

图6显示了CD40L和HCD122对SU-DHL-4细胞体外聚集影响的研究结果。

发明详述

本发明提供治疗B细胞肿瘤生长相关疾病或病症人类患者的方法。所述方法包括用(i)抗-CD40抗体和(ii)环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和强的松(CHOP)联合治疗。发明人发现，体内联合给予这两种已知的治疗药物获得了出乎预料强的治疗效果。发明人发现，这两种疗法联用的效果高于每种疗法各自效果之和，即抗-CD40抗体(如HCD122)和CHOP联用能提供协同疗效。不想受理论的束缚，发明人认为这种出乎预料强的疗效是由于抗CD40抗体能通过下调NF-kB活性和/或抑制CD40L-诱导的粘附分子表达，从而使B细胞对CHOP细胞毒性敏感所致。

本发明提供了一种治疗B细胞肿瘤生长相关疾病或病症人类患者的方法，所述方法包括给予所述患者环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和强的松(CHOP)并联用抗-CD40抗体。

在一些实施方式中，同时给予患者抗-CD40抗体(本文称为“抗体疗法”)和环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和强的松(CHOP；本文称为“化学疗法”)。在这些实施方式中，抗体疗法可以与化学疗法准确地同时给予(同时给予即两种疗法)。或者，可以与化学疗法大致相同的时间给予抗体疗法(即两种疗法不是精确地同时给予)，例如，在同一次访问医生或其他健康护理专家时。

在其他实施方式中，不同时给予患者抗体疗法和化学疗法，而是以任何顺序依次(连续)给予。在这些实施方式中，本发明方法包括给予患者第一轮化学疗法，然后给予患者第一剂抗-CD40抗体。或者，所述方法包括给予患者第一剂抗-CD40抗体后，再给予患者第一轮化学疗法。在依次给予抗体疗法和化学疗法的实施方式中，给予两种疗法的方式可使两种疗法同时对患者产生疗效(即每种疗法效果重叠期间)，虽然不一定如此。

因此，本发明提供了一种治疗B细胞肿瘤生长相关疾病或病症人类患者的方法，所述方法包括在给予环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和强的松中的一种或多种之前、期间或之后给予患者抗-CD40抗体。本文中提及使用环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和强的松中的一种或多种时表示使用环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和强的松中的一种或一种以上、两种或两种以上、三种或三种以上、或全部四种。

在给予患者第一轮化学疗法然后给予第一剂抗-CD40抗体的实施方式中，在第一轮化学疗法给药约1周至约1年、约1周至约10个月、约1周至约8个月、约1周至约6个月、约1周至约4个月、约1周至约2个月、约1周至约1个月、约1周至约3周、约1周至约2周、或约1周时，给予患者第一剂抗-CD40抗体。换句话说，在第一轮化学疗法后约1周至约1年、约1周至约10个月、约1周至约8个月、约1周至约6个月、约1周至约4个月、约1周至约2个月、或约1周至约1个月、约1周至约3周、约1周至约2周、或约1周时，给予抗体疗法。

在第一剂抗-CD40抗体后给予患者第一轮化学疗法的实施方式中，在给予患者第一剂抗-CD40抗体后约1周至约1年、约1周至约10个月、约1周至约8个月、约1周至约6个月、约1周至约4个月、约1周至约2个月、约1周至约1个月、约1周至约3周、约1周至约2周、或约1周时，给予第一轮化学疗法。换句话说，在第一轮化学疗法之前约1周至约1年、约1周至约10个月、约1周至约8个月、约1周至约6个月、约1周至约4个月、约1周至约2个月、或约1周至约1个月、约1周至约3周、约1周至约2周、或约1周时，给予抗体疗法。

当同时给予二种疗法时，它们可作为一种药物制剂或作为两种或多种药物制剂分开给予。当不是同时给予二种疗法时，它们是作为两种或多种药物制剂分开给予。

当采用两种或多种药物制剂分开时，可采用抗体疗法和化学疗法的任何合适联合。例如，一种药物制剂可含有抗体药物，而其他药物制剂含有化疗剂环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和强的松。或者，一种药物制剂可含有抗体药物和一种或多种化疗剂，而其他药物制剂含有其他化疗剂。在药物制剂含有抗体药物和一种或多种化疗剂的实施方式中，这种药物制剂可通过包括以下步骤的方法获得：(i)获得冻干的抗-CD40抗体组合物，(ii)获得包含一种或多种用无菌稀释剂稀释的化疗剂的组合物，和(iii)用包含一种或多种化疗剂的组合物重建该冻干的抗体组合物。

因此，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含：(i)环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和强的松中的一种或多种，(ii)抗-CD40抗体，和(iii)药学上可接受的运载体或赋形剂。

本发明还提供了(i)环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和强的松中的一种或多种和(ii)抗-CD40抗体在制造用于治疗B细胞肿瘤生长相关疾病或病症人类患者的药物中的应用。在其他实施方式中，本发明提供了(i)环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和强的松中的一种或多种和(ii)抗-CD40抗体在制造通过联合疗法治疗B细胞肿瘤生长相关疾病或病症人类患者的至少两种不同药物(两种、三种、四种或五种药物)中的应用。环磷酰胺、长春新碱、强的松、多柔比星以及抗-CD40抗体可用于制造至少三种、至少四种、或至少五种不同药物。

本发明还提供了治疗B细胞肿瘤生长相关疾病或病症人类患者的药盒，所述药盒中装有(i)环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和强的松中的一种或多种，和(ii)抗-CD40抗体。所述药盒还装有一种或多种给予人类患者这种联合治疗的装置，例如：(i)无菌针头和注射器，(ii)无菌容器(例如，玻璃瓶，塑料瓶或塑料袋)和滴注器，(iii)带有调节夹的无菌管，和(iv)导管的一种或多种。

本发明提供一种治疗B细胞肿瘤生长相关疾病或病症人类患者的方法，所述方法包括给予患者环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和强的松中的一种或多种，其中所述患者先前曾用抗-CD40抗体治疗过。本发明还提供一种治疗B细胞肿瘤生长相关疾病或病症人类患者的方法，所述方法包括给予患者抗-CD40抗体，其中所述患者先前曾用环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和强的松中的一种或多种治疗过。

本发明进一步提供抗-CD40抗体在制造用于治疗B细胞肿瘤生长相关疾病或病症人类患者的药物中的应用，其中所述人类患者先前曾用环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和强的松中的一种或多种治疗过。本发明还提供环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和强的松中的一种或多种在制造用于治疗B细胞肿瘤生长相关疾病或病症人类患者的药物中的应用，其中所述人类患者先前曾用抗-CD40抗体治疗过。

“先前曾治疗过”或“曾治疗过”表示对象在第二疗法之前已经接受过一剂或多剂第一疗法药物。“先前曾治疗过”或“曾治疗过”包括在用第二疗法治疗开始前的2年、18个月、1年、6个月、2个月、6周、1个月、4周、3周、2周、1周、6天、5天、4天、3天、2天或1天，曾采用第一疗法治疗过的患者：。在本发明的联合方法中，因此“先前曾治疗过”或“曾治疗过”包括在用化学疗法治疗开始前的2年、18个月、1年、6个月、2个月、6周、1个月、4周、3周、2周、1周、6天、5天、4天、3天、2天或1天，曾采用抗CD40抗体治疗过的患者。在本发明的联合方法中，“先前曾治疗过”或“曾治疗过”还包括在用抗CD40抗体治疗开始前的2年、18个月、1年、6个月、2个月、6周、1个月、4周、3周、2周、1周、6天、5天、4天、3天、2天或1天，曾采用化学疗法治疗过的患者。

例如，可通过询问患者的医疗记录或进行合适的体外试验将曾用抗-CD40抗体治疗过的患者与其他患者区分开。例如，可通过询问患者的医疗记录或进行合适的体外试验将先前曾用环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和强的松中的一种或多种治疗过的患者与其他患者区分开。

本发明还提供抗-CD40抗体在制造用于治疗B细胞肿瘤生长相关疾病或病症人类患者的药物中的应用，其中在环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和强的松之前给予所述药物。在其他实施方式中，本发明提供抗-CD40抗体在制造用于治疗B细胞肿瘤生长相关疾病或病症人类患者的药物中的应用，其中在环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和强的松之后给予所述药物。本发明还提供环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和强的松中的一种或多种在制造用于治疗B细胞肿瘤生长相关疾病或病症人类患者的药物中的应用，其中在抗-CD40抗体之前给予所述药物。在另一实施方式中，本发明提供环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和强的松中的一种或多种在制造用于治疗B细胞肿瘤生长相关疾病或病症人类患者的药物中的应用，其中在抗-CD40抗体之后给予所述药物。

本发明还提供抗-CD40抗体与环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和强的松中的一种或多种进行联合治疗，同时、分别或依次用于治疗B细胞肿瘤生长相关疾病或病症的人类患者。本发明还提供抗-CD40抗体在药物制造中的应用，用所述药物同时或依次与磷酰胺、多柔比星、长春新碱和强的松中的一种或多种联合治疗B细胞肿瘤生长相关疾病或病症的人类患者。本发明还提供磷酰胺、多柔比星、长春新碱和强的松中的一种或多种在药物制造中的应用，用所述药物同时或依次与抗-CD40抗体联合治疗B细胞肿瘤生长相关疾病或病症的人类患者。

本发明的方法包括在第一轮或随后轮次化疗期间的任何时刻，给予一剂抗-CD40抗体。或者，本发明的方法包括在各轮化疗之间给予一剂抗-CD40抗体。

如上所述，发明人发现抗-CD40抗体与CHOP的联合治疗能提供协同疗效。因此，在本文所述方法、应用、组合物和药盒的一些实施方式中，相对于单独给予各自治疗剂，这种联合治疗提供了更好的协同疗效。术语“协同”用于描述两种或多种活性药物联用的效力大于各活性药物单用之和。因此，当两种或多种药物联用导致对某种活性或过程(如肿瘤生长)的“协同抑制”时，意味着对该活性或过程的抑制作用大于各活性药物抑制作用之和。因此，术语“协同疗效”指两种或多种治疗联用时观察到的疗效(通过任何一种参数测定，如本文实施例1的肿瘤生长延迟)大于用各自治疗观察到的各自疗效之和。

如上所述，发明人认为本发明联合治疗提供的这种出乎预料的疗效是由于抗CD40抗体能通过下调NF-kB活化和/或抑制CD40L-诱导的粘附分子表达，从而使肿瘤B细胞对CHOP细胞毒性敏感(见本文的实施例2-4)所致。本文的实施例证明，CD40的信号传导有助于B细胞对CHOP细胞毒性产生耐药，用拮抗性-CD40抗体(如HCD122)降低CD40信号传导能防止或降低这种耐药性。本文的实施例还证明，CD40信号传导诱导B细胞表达细胞表面粘附分子，使B细胞聚集与它们的微环境相互作用，从而使B细胞对CHOP细胞毒性产生耐药。该实施例说明，可用拮抗性抗-CD40抗体(如HCD122)来防止或降低B细胞表面粘附分子的表达。

因此，本发明提供抗-CD40抗体在防止或降低人肿瘤B细胞对CHOP细胞毒产生耐药(即使肿瘤B细胞对CHOP细胞毒性敏感)的应用。本发明还提供一种防止或降低人肿瘤B细胞对CHOP细胞毒产生耐药(即使瘤性B细胞对CHOP细胞毒性敏感)的方法，所述方法包括使一个或多个人肿瘤B细胞体外接触抗-CD40抗体的步骤。

本发明还提供防止或降低人患者B细胞对CHOP细胞毒产生耐药的方法，所述方法包括给予患者抗-CD40抗体的步骤。本发明还提供一种治疗B细胞肿瘤生长相关疾病或病症人类患者的方法，所述方法包括给予患者抗-CD40抗体以降低患者B细胞对CHOP细胞毒产生耐药(即使患者的肿瘤B细胞对CHOP细胞毒性敏感)的步骤。

本发明也提供用抗-CD40抗体，在体外(即，使肿瘤B细胞对CHOP细胞毒性敏感)或人类患者体内(即，使患者的肿瘤B细胞对CHOP细胞毒性敏感)防止或降低人肿瘤B细胞对CHOP细胞毒性产生耐药。本发明还提供抗-CD40抗体在药物制造中的应用，所述药物用于防止或降低人类患者体内B细胞对CHOP细胞毒产生耐药(即使患者的肿瘤B细胞对CHOP细胞毒性敏感)。

用于这些实施方式的抗-CD40抗体优选能下调NF-kB活化。具体说，所述抗体能下调B细胞通过CD40信号传导所诱导的NF-kB活化，而这种活化使B细胞对CHOP细胞毒性产生耐药。

用于这些实施方式的抗-CD40抗体优选能抑制B细胞的一种或多种细胞表面粘附分子表达。具体说，所述抗体能抑制B细胞通过CD40信号传导所诱导的一种或多种细胞表面粘附分子表达，这种表达使B细胞对CHOP细胞毒产生耐药。在一些实施方式中，所述抗-CD40抗体抑制CD40-L诱导的CD54、CD80、CD86和CD95中的一种或多种(或者CD54，CD80，CD86and CD95中的两种或两种以上、三种或三种以上、或全部四种)表达。

因此，本发明的组合物、应用和药盒采用抗-CD40抗体来下调NF-kB活化和/或抑制B细胞的一种或多种细胞表面粘附分子表达。

本发明所用标准技术和方法的小结见下文。应理解，本发明不限于所述的具体方法、方案、细胞系、载体和试剂。还应理解，本文所用术语只是为了描述具体实施方式，这些术语不是限制本发明的范围。本发明的范围仅受所附权利要求书的术语的限制。

本说明书中采用了核苷酸和氨基酸的标准缩写。除非另有说明，本发明的实施将采用分子生物学、微生物学、重组DNA技术和免疫学的常规技术，这些技术属于本领域技术人员的知识范围。文献中充分描述了这些技术。

本发明涉及抗CD40抗体在治疗B细胞肿瘤生长相关疾病或病症人类患者中的应用。“CD40”、“CD40抗原”或“CD40受体”指肿瘤坏死因子(TNF)受体家族的50-55kDa跨膜糖蛋白(参见例如，美国专利号5,674,492和4,708,871；Stamenkovic等(1989)EMBO 8：1403；Clark(1990)Tissue Antigens(组织抗原)36：33；Barclay等(1997)The Leucocyte Antigen Facts Book(白细胞抗原文献)(第2版；学术出版社，圣地亚哥))。已经鉴定到人CD40基因旁路剪接转录变体编码的两种人CD40同种型。、第一种同种型(也称为“长同种型”或“同种型1”)表达产生长277个氨基酸的前体多肽(SEQ ID NO：9；首先报道为GenBank登录号CAA43045，和鉴定为GenBank登录号NP_001241的同种型1)，它由SEQ IDNO：8(见GenBank登录号X60592和NM_001250)编码，含有前19个残基代表的信号序列。第二种同种型(也称为“短同种型”或“同种型2”)表达产生长203个氨基酸的前体多肽(SEQ ID NO：7；GenBank登录号NP_690593)，它由SEQ IDNO：6(GenBank登录号NM_152854)编码，也含有前19个残基代表的信号序列。人CD40的这两种同种型的前体多肽中前165个残基相同(即SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9的残基1-165)。所述短同种型前体多肽(SEQ ID NO：7所示)由缺少一编码区段(导致翻译框移位)的转录变体(SEQ ID NO：6)编码；与CD40的长同种型所含的C末端(SEQ ID NO：9的残基166-277中所示的C末端)相比，产生的这种CD40同种型所含的C-末端(SEQ ID NO：7的残基166-203)较短且不相同。对于本发明目的，术语“CD40”或“CD40抗原”、“CD40细胞表面抗原”或“CD40受体”包括CD40的长同种型和短同种型二者。

本文中“CD40表达细胞”指表达可检测水平CD40抗原的任何正常或恶性细胞。本领域熟知检测细胞中CD40抗原表达的方法，包括但不限于：PCR技术、免疫组化、流式细胞术、Western印迹、ELISA等。这些方法能够检测CD40mRNA、CD40抗原和细胞表面CD40抗原。优选CD40表达细胞是表达可检测水平细胞表面CD40抗原的细胞。

“CD40配体”或“CD40L”指该32-33kDa跨膜蛋白分别存在的两种较小生物学活性可溶形式18kDa和31kDa(Graf等(1995)Eur.J.Immunol.25：1749-1754；Mazzei等(1995)J Biol.Chem.270：7025-7028；Pietravalle等(1996)J BiolChem.271：5965-5967)。人CD40L也称为CD154或gp39。

“人类患者”指有发生或复发B细胞肿瘤生长相关疾病或病症风险的人。

“B细胞肿瘤生长相关疾病或病症”表示与B细胞系细胞生长不受控制相关的任何疾病或病症(包括恶化前疾病)。这种疾病和病症包括但不限于：急性淋巴母细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、幼淋巴细胞白血病(PLL)、小淋巴细胞白血病(SLL)、弥散性小淋巴细胞白血病(DSLL)、弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、毛细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、EB病毒(EBV)诱导的淋巴瘤、骨髓瘤如多发性骨髓瘤、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链病、粘膜相关淋巴样组织淋巴瘤、单核细胞样B细胞淋巴瘤、脾脏淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病、血管内淋巴瘤病、免疫母细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤等。

可用本发明方法治疗B细胞增殖或聚集异常相关的非霍奇金淋巴瘤的对象。对于本发明目的，按照工作分类法(Working Formulation classification)将这类淋巴瘤分类为B细胞淋巴瘤，再分为低级、中级和高级(参见“TheNon-Hodgkin’s Lymphoma Pathologic Classification Project”(非霍奇金淋巴瘤病理分类方案)，Cancer 49(1982)：2112-2135)。因此，低级B细胞淋巴瘤包括小淋巴细胞、滤泡小分裂细胞和滤泡混合性小分裂细胞和大细胞淋巴瘤；中级淋巴瘤包括滤泡大细胞、弥散性小分裂细胞、弥散混合性小细胞和大细胞以及弥散性大细胞淋巴瘤；高级淋巴瘤包括大细胞免疫母细胞、淋巴母细胞以及伯基特和非伯基特类型的非分裂小细胞淋巴瘤。可用本发明的方法治疗低级、中级和高级B细胞淋巴瘤。

可用本发明方法治疗性处理按照修订的欧洲和美国淋巴瘤分类(REAL)系统分类的B细胞淋巴瘤。这类B细胞淋巴瘤包括但不限于以下分类的淋巴瘤：前体B细胞瘤，如B淋巴母细胞白血病/淋巴瘤；外周B细胞瘤，包括慢性B细胞淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞样淋巴瘤/免疫细胞瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡中心淋巴瘤(滤泡性)(包括弥散性小细胞、弥散混合性小细胞和大细胞以及弥散性大细胞淋巴瘤)、边缘区B细胞淋巴瘤(包括结外、结内和脾内类型，例如粘膜相关淋巴组织的结外边缘区B细胞淋巴瘤)、浆细胞瘤/骨髓瘤、原发性纵隔(胸腺)亚型弥散性大细胞B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和伯基特样高级B细胞淋巴瘤；不可分类的低级或高级B细胞淋巴瘤。

在本发明的方法中，用联合治疗来提供对疾病或病症的阳性治疗反应。“阳性治疗反应”表示联合冶疗的治疗活性导致疾病或病症改善，和/或疾病或病症相关症状改善。即，可观察到抗增殖作用、防止肿瘤进一步生长、肿瘤体积减小、瘤细胞数量减少和/或CD40表达细胞相关的一种或多种症状减轻。因此，例如，阳性治疗反应指该疾病有以下一种或多种改善：(1)肿瘤体积减小；(2)瘤细胞数量减少；(3)瘤细胞死亡增加；(4)抑制了瘤细胞存活；(4)抑制了(即减缓至某种程度，优选停止)肿瘤生长；(5)抑制(即减缓至某种程度，优选停止)了瘤细胞浸润周围器官；(6)抑制(即减缓至某种程度，优选停止)了肿瘤转移；(7)防止了肿瘤进一步生长；(8)患者存活率提高；和(9)一定程度缓解了所述疾病或病症的一种或多种相关症状。

可采用针对所述疾病或病症的标准化反应标准来确定任何给定疾病或病症的阳性治疗应答反应。可以采用以下筛检技术确定肿瘤形态(即肿瘤总负荷、肿瘤大小等)的改变来评估肿瘤的反应，这些技术有磁共振成像(MRI)扫描、x-射线成像、计算机断层(CT)扫描、骨扫描成像、内窥镜检查和肿瘤取样活检，包括抽吸骨髓(BMA)和计数循环系统中的肿瘤细胞。除了这些阳性治疗反应外，接受治疗的对象可能显示疾病相关症状改善的有益效果。因此对B细胞肿瘤而言，对象可以有所谓的B症状减轻，即盗汗、发热、体重降低和/或荨麻疹减轻。对于癌前疾病而言，用抗CD40治疗剂治疗可阻断和/或推迟相关性恶性疾病的发生，例如，推迟显著性不确定的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)患者发生多发性骨髓瘤。

疾病改善的特征是恢复完全反应。“完全反应”指骨髓瘤病例先前放射研究、骨髓和脑脊液(CSF)异常或单克隆蛋白异常已恢复正常，没有临床上可检测的疾病。按照本发明方法治疗后，这种反应可持续至少4-8周，或者有时持续6-8周。或者，疾病改善可分类为部分反应。“部分反应”指没有出现新病灶，而所有可测定的肿瘤负荷(即对象中存在的恶性细胞数量，或检测的瘤块大小或异常单克隆蛋白含量)降低至少约50％，这种现象可持续4-8周或6-8周。

本发明的方法和产品涉及采用治疗或预防有效量的抗-CD40抗体以及四种CHOP组分中的每一种。“有效量”或“治疗或预防有效量”表示当作为联合治疗的一部分给予时，对患者治疗带来阳性治疗反应的抗体用量或化疗药物用量。本文在其它地方更详细地描述了合适的用量。

本文所用“肿瘤”(或“肿块”)指所有的肿瘤细胞生长和增殖(无论恶性或良性)，以及所有的癌前细胞、癌细胞和癌组织。本文所用“肿瘤”指导致异常生长的任何形式的细胞生长调节异常或调节失常(无论恶性或良性)。因此，“肿瘤细胞”包括调节异常或调节失常的恶性和良性细胞生长。术语“癌症”和“癌”指或描述哺乳动物的特征一般为细胞生长失调的生理疾病。

在本文中，“治疗”定义为施加或给予患者联合治疗，施加或给予患者的分离组织联合治疗，其中所述患者患有疾病、有疾病症状或对疾病易感，目的是为了治愈、治疗、缓解、减轻、改变、补救、改善、消除，或影响患者的疾病、疾病症状或对疾病的易感性。

本发明的方法对于治疗之前曾给予过其他抗肿瘤治疗药物的患者特别有效。其中包括在开始本发明所述联合治疗之前任何时候，例如在开始本发明联合治疗之前15年内、14年内、13年内、12年内、11年内、10年内、9年内、8年内、7年内、6年内、5年内、4年内、3年内、2年内、18个月内、1年内、6个月内、2个月内、6周内、1个月内、4周内、3周内、2周内、1周内、6天内、5天内、4天内、3天内、2天内或1天内，曾给予过其他抗肿瘤治疗药物的患者。

具体说，本发明的联合治疗可用于治疗先前曾用过以下疗法的人类患者：(i)单用CHOP，(ii)单用抗-CD40抗体(如HCD122)，(iii)单用抗-CD20抗体(如嵌合型抗-CD20抗体利妥昔单抗)，或(iv)用CHOP与抗-CD20抗体联合治疗(如利妥昔单抗，此种联合治疗通常称为R-CHOP)。

本发明对用其他抗肿瘤治疗方法难治的疾病或病症特别有用。因此，可用本发明来治疗用以下疗法难治的疾病或病症：(i)单用CHOP，(ii)单用抗-CD40抗体(如HCD122)，(iii)单用抗-CD20抗体(如嵌合抗-CD20抗体利妥昔单抗)，或(iv)用CHOP与抗-CD20抗体联合治疗(R-CHOP)。“难治”指对用特定抗癌治疗药物治疗有耐药性或无反应的具体疾病或病症。这种疾病或病症可能是在用特定治疗剂开始治疗时即为该特定治疗剂难治(即对初次接触该治疗剂无反应)，或者曾用该治疗剂治疗一段时间或在该治疗剂后续治疗期间对该治疗剂产生耐药。因此，本发明提供了用于治疗B细胞肿瘤生长相关疾病或病症人类患者的方法、组合物、应用和药盒，其中所述疾病或病症为除本发明联合治疗外的癌症治疗方法难治疾病。术语“抗癌症治疗”指对疾病或病症的任何治疗，如化疗、抗体疗法、手术、放疗和它们的联合。

本发明对于治疗用其他抗肿瘤治疗方法治疗后复发的患者也特别有用。因此，可用本发明来治疗用以下疗法治疗后复发的患者：(i)单用CHOP，(ii)单用抗-CD40抗体(如HCD122)，(iii)单用抗-CD20抗体(如嵌合抗-CD20抗体利妥昔单抗)，或(iv)用CHOP与抗-CD20抗体联合治疗(R-CHOP)。“复发”表示患者对先前的癌症治疗方法有部分或有完全反应，但随后又发生了此疾病或病症。因此，本发明提供用于治疗B细胞肿瘤生长相关疾病或病症人类患者的方法、组合物、应用和药盒，其中所述患者用除本发明联合治疗外的癌症治疗方法治疗后疾病复发。

本发明的联合治疗可解决用利妥昔单抗(以商品名

出售的IDEC-C2B8单克隆抗体(BI公司(Biogen Idec)或基因技术公司(Genentech)))治疗带来的问题。利妥昔单抗是含有人IgG1和κ恒定区以及分离自鼠抗-CD20单克隆抗体可变区的一种嵌合型抗-CD20单克隆抗体(Reff等(1994)Blood83：435-445)。本发明的方法能治疗表达CD40的B细胞相关疾病或病症的患者，所述患者可能已经用利妥昔单抗或者用利妥昔单抗和化疗剂(例如，CHOP)联合治疗治疗过。

因此，本发明还提供通过联合治疗治疗B细胞肿瘤生长相关疾病或病症人类患者的方法、组合物、应用和药盒，其中所述患者先前曾给予过嵌合型抗-CD20抗体利妥昔单抗。可用本发明治疗：(i)单用利妥昔单抗，或(ii)用CHOP与利妥昔单抗联合治疗(R-CHOP)难治的疾病或病症。还可用本发明治疗：(i)单用利妥昔单抗，或(ii)用CHOP与利妥昔单抗联合治疗(R-CHOP)后复发的患者。

例如，可通过询问患者的医疗记录或进行合适的体外试验将先前曾用利妥昔单抗治疗过的患者与其他患者区分开。例如，可用合适的方法，如FACS，监测用利妥昔单抗治疗的患者体内被去除的循环性CD19⁺B细胞数目，以及现存循环性CD19⁺B细胞数目(McLaughlin等，(1998)J.Clin.Oncol.16(8)：2825-2833；Maloney等，(1997)Blood 90(6)：2188-2195)。

本发明方法包括采用抗CD40抗体。天然抗体通常是约150,000道尔顿的异质四聚体糖蛋白，由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而二硫键的数目视不同同种型的重链而不同。每条重链和轻链也含有规律性隔开的链内二硫桥。每条重链的一端为可变区(V_H)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端为可变区(V_L)，另一端为恒定区；轻链的恒定区与重链的第一恒定区相对，轻链可变区与重链的可变区相对。认为由特定的氨基酸残基在轻链与重链可变区之间形成界面。术语“可变”指抗体中可变区某些部分的序列差异很大。可变区赋予抗原结合特异性。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但具有各种效应器功能，如Fc受体(FcR)结合、参与抗体依赖性细胞毒性、启动补体依赖性细胞毒性和肥大细胞脱颗粒。

可根据抗体恒定区的氨基酸序列将任何一种脊椎动物的抗体“轻链”分为明显不同的称为κ和λ轻链的两种类型。

根据“重链”恒定区的氨基酸序列，可将抗体分为不同类型。人抗体主要有五类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中几类可进一步分为亚类(同种型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。不同抗体类型对应的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。已知不同抗体类型的亚基结构和三维构型。不同同种型具有不同的效应器功能。例如，人IgG1和IgG3同种型具有ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)活性。IgG1抗体，具体是人IgG1抗体，特别可用于本发明方法。

“人效应细胞”是表达一种或多种FcR并具有效应功能的白细胞。该细胞优选至少表达FcγRIII，并具有抗原依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)效应器功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单个核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性白细胞和中性粒细胞，优选PBMC和NK细胞。具有ADCC活性的抗体通常是IgG1或IgG3同种型。需要注意，除分离的IgG1和IgG3抗体以外，可通过将非ADCC抗体的可变区与IgG1或IgG3同种型恒定区组合来制备这类ADCC介导抗体。

使用术语“Fc受体”或“FcR”来描述能结合抗体Fc区的受体。优选的FcR是天然序列的人FcR。此外，优选的FcR可结合IgG抗体(γ受体)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类受体，包括这些受体的等位基因变体或者旁路剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，主要差别在于其胞质结构域不同。活化性受体FcγRIIA在其胞质结构域中含有免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。抑制性受体FcγRIIB在其细胞质结构域中含有免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)(参见Daeron(1997)Annu.Rev.Immunol.15：203-234)。FcR综述见Ravetch和Kinet(1991)Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)；Capel等，(1994)Immunomethods 4：25-34和de Haas等，(1995)J.Lab.Clin.Med.126：330-341。本文所用术语“FcR”还涵盖其他FcR，包括那些将来鉴定的FcR。该术语也包括负责将成熟IgG转移给胎儿的新生受体FcRn(Guyer等，(1976)J.Immunol.117：587和Kim等，(1994)J.Immunol.24：249(1994))。

本文所用术语“抗体”广义包括能特异性结合CD40抗原的全装配抗体、抗体片段(如Fab、F′(ab)₂、Fv和其它片段)、单链抗体(scFv)、双抗体、双特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体等)和含有上述物质的重组肽。术语“抗体”涵盖多克隆和单克隆抗体。

本文所用“抗CD40抗体”包括能特异性识别CD40抗原的任何抗体。在一些实施方式中，用于本发明方法的抗CD40抗体，特别是单克隆抗CD40抗体对CD40抗原具有强烈的单位点结合亲和力。用标准试验如Biacore^TM测定时，这类单克隆抗体与CD40的亲和力(K_D)为至少10^-5M，优选至少10^-6M，至少10^-7M，至少10^-8M，至少10^-9M，至少10^-10M，至少10^-11M或至少10^-12M。本领域知道Biacore分析，在“BIA应用手册”中提供了详细内容。

“特异性识别”或“特异性结合于”表示所述抗CD40抗体结合人B细胞表面的CD40抗原，但不以显著程度结合人B细胞表面的其他抗原，如CD20抗原。

可以采用本领域技术人员已知的合适抗体生产方法来产生用于本发明方法的抗-CD40抗体。

用于本发明方法的抗CD40抗体可以是单克隆抗体。本文所用术语“单克隆抗体”(和“mAb”)指获自基本均一抗体群的抗体，即，该群中的各个抗体相同，除了可能存在少量天然产生的突变外。该术语不限制产生抗体的动物种类，并且不需要通过任何具体方法产生抗体。与一般包含针对多个不同抗原决定簇(表位)的不同抗体群的多克隆抗体制剂相反，各种单克隆抗体只针对抗原上的一个决定簇(表位)。

术语“单克隆”最初用来指由单克隆免疫细胞系所产生的抗体，尽管都识别相同的靶蛋白，但与“多克隆”抗体不同，后者是由不同B细胞产生的针对蛋白质的不同表位。本文中，术语“单克隆”不暗示任何特定的细胞来源，而指具有相同氨基酸序列并识别同一靶蛋白上相同表位的任何抗体群。因此，可采用任何合适的蛋白质合成系统，包括免疫细胞、非免疫细胞、无细胞系统等来制造单克隆抗体。这种用法在本领域是常见的，例如，用小鼠骨髓瘤NS0细胞系表达的CDR-移植人源化抗体Synagis^TM，CHO细胞系表达的人源化抗体Herceptin^TM，以及CHO细胞系表达的噬菌体展示抗体Humira^TM都可称为单克隆抗体。

“表位”指抗原分子中能诱导产生抗体和结合抗体的那个部分。表位可包含线性氨基酸残基(即表位中的残基以线性方式依次排列)、非线性氨基酸残基(本文中称为“非线性表位”；这些表位不是依次排列的)、或包含线性和非线性氨基酸残基。

可利用Kohler等，(1975)Nature，256：495所描述的杂交瘤方法或重组DNA方法(参见，例如，美国专利号4,816,567)制备单克隆抗体。也可从例如McCafferty等(1990)Nature 348：552-554(1990)和美国专利号5,514,548所述技术产生的抗体噬菌体文库分离单克隆抗体。Clackson等(1991)Nature352：624-628和Marks等(1991)J Mol.Biol.222：581-597分别描述了用噬菌体文库分离鼠和人抗体。后续发表物描述了通过链改组(Marks等(1992)Bio/Technology 10：779-783)，以及组合感染和体内重组产生高亲和力(nM级)人抗体，作为构建极大噬菌体文库的方法(Waterhouse等(1993)Nucleic.Acids Res.21：2265-2266)。21：2265-2266).因此，这些技术是分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方法。

当采用重组DNA法制备用于本发明方法的抗CD40抗体时，采用常规方法不难分离单克隆抗体的编码DNA和测序。一旦分离后，可将该DNA放入表达载体中，然后转染入本身不产生免疫球蛋白的宿主细胞如大肠杆菌(E.coli)细胞、猿COS细胞、中华仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞中，在该重组宿主细胞中合成获得单克隆抗体。有关在含有编码抗体DNA的细菌中重组表达的综述文献包括Skerra等(1993)Curr.Opinion in Immunol.5：256和Phickthun(1992)Immunol.Revs.130：151。或者，可以在细胞系如CHO细胞系中产生抗体，如美国专利号5,545,403；5,545,405；和5,998,144所述。简言之，用能够表达轻链和重链的载体分别转染该细胞系。可将两种蛋白质转染不同载体而产生嵌合抗体。另一优点是抗体在哺乳动物CHO细胞内可糖基化。用于本发明联合治疗的重组抗体的优选来源是CHO细胞。

本文所用“宿主细胞”指培养成单细胞实体的微生物或者真核细胞或细胞系，它们可能是、或已经用作重组载体或其它转运多核苷酸的接受体，包括已被转染的原始细胞的后代。应理解，由于存在天然、偶发性或有意的突变，单个细胞的后代与其初始亲代细胞的形态或者基因组或总DNA组成不一定完全相同。

本领域已知CD40的单克隆抗体。参见例如，McMichael编(1987；1989)Leukocyte Typing III and IV(白细胞分型III和IV)(牛津大学出版社，纽约)中关于B细胞抗原的章节；美国专利号5,674,492；5,874,082；5,677,165；6,056,959；WO 00/63395；国际公开号WO 02/28905和WO 02/28904；Gordon等(1988)J.Immunol.140：1425；Valle等(1989)Eur.J.Immunol.19：1463；Clark等(1986)PNAS 83：4494；Paulie等(1989)J.Immunol.142：590；Gordon等(1987)Eur.J.Immunol.17：1535；Jabara等(1990)J.Exp.Med.172：1861；Zhang等(1991)J.Immunol.146：1836；Gascan等(1991)J.Immunol.147：8；Banchereau等(1991)Clin.Immunol.Spectrum 3：8；和Banchereau等(1991)Science 251：70。

如上所述，本文所用术语“抗体”包括嵌合抗体。“嵌合”抗体指最优选用重组DNA技术产生的包含人(包括免疫“相关”动物，如黑猩猩)和非人组分的抗体。因此，嵌合抗体的恒定区最优选与天然人抗体恒定区基本相同；嵌合抗体的可变区最优选衍生自对CD40具有所需抗原特异性的非人来源的抗体。非人来源可以是可用来产生抗CD40抗原的抗体的任何脊椎动物来源。这种非人来源包括但不限于：啮齿类(例如，家兔、大鼠、小鼠等；参见，例如，美国专利号4,816,567)和非人灵长类(例如，古猴(Old World Monkey)、类人猿等；参见例如美国专利号5,750,105和5,756,096)。短语“恒定区”指抗体分子中赋予效应器功能的那部分。在以前制备用于治疗人类疾病的无免疫原性抗体的研究中，小鼠恒定区被人恒定区取代。这些人源化抗体的恒定区衍生自人抗体。然而，这些抗体仍能在人中引发不良的可能有潜在危险的免疫应答并且丧失亲和力。

如上所述，本文所用术语“抗体”包括人源化抗体。“人源化”指含有最少非人抗体序列的抗体形式。人源化抗体的大部分序列是人抗体(受者抗体)，但该受者抗体的超变区(也称为互补决定区或CDR)残基被具有所需特异性、亲和力或活性的非人动物，例如小鼠、大鼠、家兔或非人灵长类的(供者抗体)超变区残基取代。短语“互补决定区”指共同确定了含天然抗体结合位点的天然Fv区结合亲和力和特异性的氨基酸序列。参见例如，Chothia等，(1987)J.Mol.Biol.196：901-917；Kabat等，(1991)美国健康与人类服务部(U.S.Dept.of Health and人Services)，NIH公布号91-3242)。

人源化可根据Winter及其同事(Jones等，(1986)Nature 321：522-525；Riechmann等，(1988)Nature 332：323-327；Verhoeyen等，(1988)Science 239：1534-1536)的方法用啮齿类CDR或突变型啮齿类CDR序列取代人抗体的相应序列。也可见美国专利号5,225,539；5,585,089；5,693,761；5,693,762；5,859,205。在一些例子中，人抗体一个或多个可变区的框架区内的残基为对应的非人残基所取代(参见，例如美国专利号5,585,089；5,693,761；5,693,762和6,180,370)。此外，人源化抗体可含有在受者抗体或供者抗体中没有发现的残基。制备这些修饰可进一步精制抗体的性能(例如，获得所需的亲和力)。总之，人源化抗体所含的所有可变区、至少一个通常两个可变区中所有或基本上所有的超变区对应于非人抗体序列的超变区，所有或基本上所有的框架区对应于人抗体的框架区。人源化抗体也任选包含抗体的恒定区(Fc)，通常是人抗体恒定区的至少一部分。更多的细节见Jones等，(1986)Nature 331：522-525；Riechmann等，(1988)Nature 332：323-329；和Presta(1992)Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596。因此，这种“人源化”抗体可包括基本上不是完整的人可变区而是被非人动物的相应序列取代的抗体。实际上，人源化抗体通常是其中一些CDR残基和可能的一些框架残基被啮齿类抗体中类似位点的残基取代的人抗体。参见，例如，美国专利号5,225,539；5,585,089；5,693,761；5,693,762；5,859,205。也参见美国专利号6,180,370，和国际公布号WO 01/27160，其中公开了人源化抗体和如何产生对预定抗原具有改进亲和力的人源化抗体的制备方法。

也可采用Human Engineering^TM技术(加州伯克利爱克索马有限公司(Xoma Ltd.，Berkeley，California))来制造人源化抗CD40抗体，用其描述的方法来降低抗体分子的免疫原性同时维持其结合活性(例如，见Studnicka等，(1994)Protein Engineering 7：805-814和美国专利号5,766,886)。

人源化抗CD40单克隆抗体包括抗体例如有SGN-40(Tai等(2004)Cancer Res.64：2846-52；美国专利号6,838,261)，它是鼠抗CD40抗体SGN-14的人源化形式(Francisco等(2000)Cancer Res.60：3225-31)，和美国专利申请公开号2004/0120948所述的抗体。

也可采用非人哺乳动物宿主，更具体说是用灭活了内源性免疫球蛋白(Ig)基因座为特征的转基因小鼠所产生的异种或修饰的抗-CD40抗体来实施本发明。这种转基因动物原先表达宿主免疫球蛋白轻链和重链的内源活性基因失去功能而被同类人免疫球蛋白基因座取代。这些转基因动物可产生基本上没有宿主(动物)免疫球蛋白轻链或重链亚基的人抗体。例如参见美国专利第5,877,397号和第5,939,598号。

因此，在一些实施方式中，通过(例如)免疫转基因小鼠获得抗CD40的完全人抗体。用捷诺小鼠

技术(阿布吉尼克斯公司(Abgenix)；加州弗里蒙特(Fremont，California))获得一只这类小鼠，参见美国专利号6,075,181、6,091,001和6,114,598。例如，用表达人CD40的Sf9细胞免疫含有人IgG₁重链基因座和人κ轻链基因座的转基因小鼠产生了HCD122抗体，。小鼠也可以是其它同种型的转基因小鼠。

在一些实施方式中，所述抗CD40抗体的轻链可变区(V_L)包含HCD122的轻链CDR序列。因此，在一些实施方式中，抗-CD40抗体的轻链可变区包含SEQ ID NO：10所示的CDR-L1氨基酸序列，SEQ ID NO：11所示的CDR-L2氨基酸序列，以及SEQ ID NO：12所示的CDR-L3氨基酸序列。在其他实施方式中，所述抗CD40抗体的重链可变区(V_H)包含HCD122的重链CDR序列。因此，在一些实施方式中，抗-CD40抗体的重链可变区包含SEQ ID NO：13所示的CDR-H1氨基酸序列，SEQ ID NO：14所示的CDR-H2氨基酸序列以及SEQID NO：15所示的CDR-H3氨基酸序列。

在进一步的实施方式中，所述抗CD40抗体的轻链可变区(V_L)包含HCD122的轻链CDR序列，重链可变区(V_H)包含HCD122的重链CDR序列。因此，在一些实施方式中，抗-CD40抗体的轻链可变区(V_L)包含SEQ ID NO：10所示的CDR-L1氨基酸序列，SEQ ID NO：11所示的CDR-L2氨基酸序列以及SEQ IDNO：12所示的CDR-L3氨基酸序列，其重链可变区(V_H)包含SEQ ID NO：13所示的CDR-H1氨基酸序列，SEQ ID NO：14所示的CDR-H2氨基酸序列以及SEQID NO：15所示的CDR-H3氨基酸序列。

定义给定抗体可变区中CDR残基的方法有许多(例如，参见以下万维网(www)地址“bioinf.org.uk/abs”)。最常使用的是Kabat编号体系(Kabat等，1991，免疫学感兴趣的蛋白序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版，马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院公共卫生署(Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD))。根据Kabat编号体系，轻链可变区内的CDR是氨基酸24-34(CDR-L1)、50-56(CDR-L2)和89-97(CDR-L3)，重链可变区内的CDR是氨基酸31-35(CDR-H1)、50-65(CDR-H2)和95-102(CDR-H3)。另一种熟知体系是Chothia编号体系(Chothia和Lesk(1987)MoI.Biol.196：901-917)。根据Chothia编号体系，轻链可变区内的CDR是氨基酸26-32(CDR-L1)、50-52(CDR-L2)和91-96(CDR-L3)，重链可变区内的CDR是氨基酸26-32(CDR-H1)、53-55(CDR-H2)和96-101(CDR-H3)。采用一种或多种已知体系，技术人员不难确定某给定抗体是否符合上述轻链和重链CDR序列的要求。

“抗体片段”指完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、F(ab′)2和Fv片段。

“Fab”指包含抗体的轻链恒定区和重链第一恒定区(C_H1)的单价抗原结合片段。用木瓜蛋白酶消化抗体产生了两个相同的Fab片段和残留的“Fc”片段，后一名称反映了其易于结晶的能力。F(ab′)₂指含有抗体两条轻链和两条重链的一部分并保留了交联抗原能力的二价抗原结合片段。胃蛋白酶处理产生了F(ab′)₂片段。“Fv”是含有完整的抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该区由非共价紧密结合的一条重链可变区和一条轻链可变区的二聚体组成。在这种构型中，每个可变区的3个CDR相互作用从而确定了V_H-V_L二聚体表面上的抗原结合位点。6个CDR共同赋予了该抗体的抗原结合特异性。然而，即使一个可变区(或仅含有3个抗原特异性CDR的半个Fv)也能识别并结合抗原，虽然亲和力低于完整的结合位点。

本发明也可采用单链Fv(scFv)，这是一种含有抗体V_H和V_L结构域的多肽，其中这些结构域以一条多肽链的形式存在(参见，例如，美国专利4,946,778、5,260,203、5,455,030和5,856,456)。scFv多肽通常在V_H与V_L结构域之间含有一多肽接头使scFv能形成与抗原结合的所需结构。scFv的综述见Pluckthun，刊于Rosenburg和Moore编的《单克隆抗体的药理学》(The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies)，第113卷，斯普林格韦格出版社(Springer-Verlag)，纽约，第269-315页，1994。

抗CD40抗体的片段适合用于本发明方法，只要它们保留了结合人B细胞表面CD40抗原的能力。在本文中将这类片段称为“抗原结合”片段。这类片段的优选特征是功能特性类似于对应的全长抗体。因此，例如，全长抗CD40抗体的片段优选能够特异性结合人细胞表面表达的人CD40抗原，并且没有本文其他地方所述的显著激动活性。在某些情况下，用于本发明方法的抗CD40抗体片段保留了结合相关FcR的能力。

已经开发了产生抗体片段的各种技术。传统上，通过蛋白酶水解消化完整抗体产生这些片段(参见例如，Morimoto等(1992)Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24：107-117(1992)和Brennan等(1985)Science 229：81)。然而，现在可通过重组宿主细胞直接产生这些片段。例如，可从上述抗体噬菌体文库分离得到这种抗体片段。或者，可从大肠杆菌直接回收Fab′-SH片段，并化学偶联形成F(ab′)₂片段(Carter等(1992)Bio/Technology 10：163-167)。按照另一种方法，可从重组宿主细胞培养物直接分离得到F(ab′)₂片段。本领域技术人员明白产生抗体片段的其它技术。

用于本发明联合治疗的抗-CD40抗体当与人B细胞表面CD40抗原结合时没有显著的激动活性。在一些实施方式中，它们与人细胞表面CD40结合可导致抑制B细胞的增殖和分化。适合用于本发明方法的抗CD40抗体包括那些可显示“激动”活性的抗体，“激动剂”可与细胞上的受体结合，并启动相似或相同于受体天然配体所启动的反应或活性。CD40激动剂能诱导以下任何一种反应(但不限于)或所有反应：B细胞增殖和/或分化；通过诸如ICAM-1、E-选择素、VCAM等分子上调细胞间粘附；分泌促炎细胞因子如IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、TNF等；通过CD40受体经由TRAF(如TRAF2和/或TRAF3)、MAP激酶如NIK(NF-κB诱导激酶)、I-κB激酶(IKKα/β)、转录因子NF-κB、Ras和MEK/ERK途径、PI3K/AKT途径、P38MAPK途径等进行信号转导；通过诸如XIAP、mcl-1、bcl-x等分子转导抗凋亡信号；产生B和/或T记忆细胞；B细胞产生抗体；B细胞同种型转换，上调细胞表面II类MHC和CD80/86表达等。

“显著”激动活性指经过B细胞应答试验测定，比阴性对照诱导的激动活性高至少30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。“显著”激动活性优选经过B细胞应答试验测定，比阴性对照诱导的激动活性高至少2倍或至少3倍。因此，例如，当感兴趣的B细胞应答是B细胞增殖时，“显著”激动活性所诱导的B细胞增殖水平比阴性对照诱导的B细胞增殖水平高至少2倍或至少3倍。在一个实施方式中，不结合CD40的抗体用作阴性对照。经B细胞应答试验测定，“无显著激动活性”抗体所显示的激动活性不高于阴性对照诱导的激动活性约25％，优选不高于约20％、15％、10％、5％、1％、0.5％，或者甚至不高于阴性对照诱导的激动活性约0.1％。

CD40的“拮抗剂”防止或降低了CD40受体与激动剂配体(具体是CD40L)结合所诱导的任何反应。这种拮抗剂可降低对CD40L结合所诱导的应答5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％，优选40％、45％、50％、55％、60％，更优选降低70％、80％、85％，最优选降低90％、95％、99％或100％。

用于本发明方法的优选抗体和片段是当与人B细胞CD40抗原结合时没有显著激动活性，以及当与人B细胞CD40抗原结合时显示有拮抗活性的抗CD40抗体。在一些实施方式中，所述抗CD40抗体在一种B细胞应答中没有显著的激动活性。在其他实施方式中，所述抗CD40抗体在一种以上B细胞应答(如增殖和分化，或者增殖、分化和抗体生产)的试验中没有显著的激动活性。

测定抗CD40治疗剂(如抗CD40抗体)拮抗活性的方法是本领域已知的，包括但不限于：标准的竞争性结合试验、监测B细胞分泌抗体的试验、B细胞增殖试验、Banchereau样-B细胞增殖试验、抗体产生的T辅助细胞试验、共同刺激B细胞增殖试验和上调B细胞激活标记的试验。相关试验的描述可参见，例如，美国专利号6,087,329和作为WO 00/75348、WO 2005/044294、WO2005/044304、WO 2005/044305、WO 2005/044306、WO 2005/044307、WO2005/044854、WO 2005/044855、WO 2006/073443、WO 2006/125117、WO2006/125143、WO 2007/053661和WO 2007/053767公布的国际专利申请。

可采用本领域已知的任何试验确定抗CD40抗体是否可用作一种或多种B细胞应答的拮抗剂。在一些实施方式中，抗CD40抗体用作选自以下至少一种B细胞应答的拮抗剂：B细胞增殖、B细胞分化、抗体生产、细胞间粘附、产生记忆B细胞、同种型转换、上调II类MHC和CD80/86的细胞表面表达和分泌促炎细胞因子如IL-8、IL-12和TNF。特别感兴趣的是结合于人B细胞表面CD40抗原时对B细胞增殖无显著激动活性的拮抗性抗CD40抗体。

如用B细胞增殖试验测定的那样，抗CD40抗体可以是可溶性或细胞表面CD40L诱导B细胞增殖的拮抗剂。本领域知道合适的B细胞增殖试验。下文也描述了合适的B细胞增殖试验。在一些实施方式中，拮耐性抗CD40抗体刺激B细胞增殖的水平不高于阴性对照诱导B细胞增殖的约25％(即至少75％抑制)，优选不高于约20％、15％、10％、5％、1％、0.5％，或者甚至不高于阴性对照诱导B细胞增殖高的约0.1％。

在其它实施方式中，如用B细胞增殖试验测定的那样，所述抗CD40抗体是另一种抗CD40抗体(如S2C6抗CD40抗体；Kwekkeboom等(1993)Immunology 79：439-444)诱导B细胞增殖的拮抗剂，在该拮抗性抗CD40抗体存在时其它抗CD40抗体刺激的B细胞增殖水平不高于没有拮抗性抗CD40抗体时其它抗CD40抗体诱导B细胞增殖的约25％(即至少抑制75％)，优选不高于约20％、15％、10％、5％、1％、0.5％，或者甚至不高于没有拮抗性抗CD40抗体时其它抗CD40抗体诱导的B细胞增殖的约0.1％。

在其它实施方式中，如用B细胞活化试验测定的那样，抗CD40抗体是细胞系EL4B5

(Kwekkeboom等(1993)Immunology 79：439-444)诱导B细胞增殖的拮抗剂，在拮抗性抗CD40抗体存在时EL4B5细胞系刺激的B细胞增殖水平不高于没有拮抗性抗CD40抗体时此细胞系诱导B细胞增殖的约25％(即至少抑制75％)，优选不高于约20％、15％、10％、5％、1％、0.5％，或者甚至不高于没有拮抗性抗CD40抗体时该细胞系诱导B细胞增殖的约0.1％。

在其它实施方式中，如用人T细胞辅助B细胞产生抗体试验测定的那样，所述抗CD40抗体是人T细胞诱导B细胞产生抗体的拮抗剂。以此方式，存在拮抗性抗CD40抗体时，T细胞刺激B细胞产生IgG抗体、产生IgM抗体或者产生IgG和IgM二种抗体的水平不高于缺乏该拮抗性抗CD40抗体时T细胞刺激B细胞产生各种抗体的约50％(即至少抑制了75％)，优选不高于约25％、20％、15％、10％、5％、1％、0.5％，或者甚至更优选不高于缺乏该拮抗性抗CD40抗体时T细胞刺激B细胞产生各种抗体的约0.1％。

例如，可采用以下试验评估抗CD40抗体的拮抗活性。基本上如De Groot等(1990)Lymphokine Research(1990)9：321所述，可从(例如)获自扁桃腺切除术个体的扁桃腺分离获得这些试验用的人B细胞。简要说，用手术刀切割分散扁桃腺组织，用5mM L-亮氨酸甲酯处理以消除吞噬细胞和NK细胞，通过一轮2-氨基乙基异硫脲溴处理绵羊红细胞(SRBC)形成花结去除T细胞。用间接免疫荧光标记法和FACS分析核查所得到的B淋巴细胞制品的纯度，间接免疫荧光标记法采用抗-(CD20)mAb B1(康特克隆公司(Coulter Clone)，佛罗里达州海尔勒阿(Hialeah，FA))或抗-(CD3)mAb OKT3(奥索公司(Ortho)，新泽西州拉里坦(Raritan，NJ))和FITC偶联的兔抗-(小鼠Ig)的F(ab′)₂片段(甾麦公司(Zymed)，加州旧金山(San Francisco，CA))。

B-细胞增殖试验

在平底96孔微量滴定板中，用补充有10％胎牛血清的200μl IMDM培养B细胞(每孔4x10⁴个)。加入固定的抗-(IgM)抗体(免疫珠5μg/ml；伯乐公司(BioRad)，加州里士满(Richmond，California))刺激B细胞。需要时，加入100U/ml重组IL-2。在开始微量培养时加入不同浓度的测试单克隆抗体(mAb)，第3天测定18小时脉冲后(³H)-胸苷的掺入评估细胞增殖。在固定的抗-IgM存在下或者固定的抗-IgM和IL-2存在下拮抗性抗CD40抗体不会显著地共同刺激人B-细胞增殖。

Banchereau-样B-细胞增殖试验

为了在类似于Banchereau等(1991)Science(1991)251：70所述的培养系统中测定抗CD40单克隆抗体刺激B-细胞增殖的能力，采用了表达人FcγRII的HR等位基因形式的小鼠3T6转染细胞。在平底微孔板中存在1x10⁴个转染细胞(用5000镭辐射过)时用补充有10％胎牛血清和100U/ml重组IL-4的200μlIMDM培养B细胞(每孔2x10⁴个)。加入B细胞之前，使3T6细胞贴附于塑料培养板至少5小时。加入的抗CD40mAb的浓度为15ng/ml至2000ng/ml，测定第7天用[³H]胸苷脉冲处理18小时后的胸苷掺入评估B细胞的增殖。

用拮抗性抗CD40mAb抑制S2C6-刺激的B细胞增殖

也可采用上述B-细胞增殖试验，通过抑制抗CD40抗体如S2C6(也称为SGN-14，据报道它是CD40刺激正常B细胞增殖的激动剂；Francisco等(2000)Cancer Res.60：3225-3231)刺激B-细胞增殖的能力，鉴定拮抗性抗CD40单克隆抗体(mAb)。在偶联抗-IgM(5μg/ml)和抗CD40mAb S2C6(1.25μg/ml)的琼脂糖珠存在下，在200μl微孔中培养人扁桃腺B细胞(每孔4x10⁴个)。加入不同浓度的感兴趣抗CD40mAb，3天后评估[³H]-胸苷掺入。作为对照，可加入相似浓度的抗-(葡糖脑苷脂酶)mAb 8E4。Barneveld等(1983)Eur.J.Biochem.134：585。拮抗性抗CD40抗体可抑制抗-IgM和mAb S2C6共同刺激诱导的人B-细胞增殖(例如)至少75％或更多(即拮抗性抗CD40抗体存在下S2C6-刺激的增殖不高于没有拮抗性抗CD40抗体时观察到的25％)。相反，用等量无关mAb8E4(抗β-葡糖脑苷脂酶抗体)没有观察到显著抑制。Bameveld等，同上。这一结果表明，抗CD40mAb不能为人B细胞增殖递送刺激信号，但相反，可抑制用另一种mAb触发CD40产生的刺激信号。

用EL4B5细胞激活B-细胞的试验

Zubler等(1985)J.Immunol.(1985)134：3662观察到，小鼠胸腺瘤EL-4细胞系(称为EL4B5)的突变亚克隆能强烈刺激小鼠和人来源的B细胞体外增殖和分化成免疫球蛋白-分泌性浆细胞。发现这种激活为抗原非依赖性，不受MHC限制。为了最优地刺激人B细胞，需要存在活化人T细胞的培养上清液，但用佛波醇-12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(PMA)或IL-I预先激活EL4B5细胞时也能发生B-细胞应答。Zubler等(1987)Immunological Reviews 99：281；和Zhang等(1990)J.Immunol.144：2955。此培养系统能有效激活B细胞-有限稀释实验证明可激活大多数人B细胞增殖和分化成抗体-分泌细胞。Wen等(1987)Eur.J.Immunol17：887。

在平底微量滴定板中用补充有10％热灭活胎牛血清、5ng/ml佛波醇-12-肉豆蔻酸13-乙酸酯和5％人T细胞培养上清液的200μl IMDM培养B细胞(每孔1000个)与经过辐射(5000镭)的EL4B5细胞(每孔5x10⁴个)。在开始培养时加入不同浓度的mAb，第6天用³[H]-胸苷脉冲处理18小时后评估胸苷掺入。为了制备T-细胞上清液，在1μg/ml PHA和10ng/ml PMA存在下以10⁶个/ml的密度培养纯化的T细胞36小时。Wen等(1987)Eur.J.Immunol(1987)17：887。离心细胞获得T-细胞上清液，储存于-20℃。检测了T细胞上清液提高EL4B5-B细胞培养物中人B细胞增殖的效率，合并最有效的上清液用于实验。评估抗CD40抗体对EL4B5诱导人B-细胞增殖的影响时，可加入单克隆抗体如MOPC-141(IgG2b)作为对照。

人T细胞辅助B细胞产生抗体的试验

拮抗性抗CD40抗体可用作B细胞产生抗体的拮抗剂。可在T细胞辅助试验中评估抗体抑制活化T细胞以接触依赖性方式刺激B细胞产生抗体的能力，来检测抗CD40抗体的这种类型拮抗活性。在此方式中，用1∶500稀释的抗-CD3mAb CLB-T3/3腹水(CLB，荷兰阿姆斯特丹)包被96孔组织培养板。加入如下所示的共刺激mAb：抗CD2mAb CLB-T11.1/1和CLB-T11.2/1(CLB，荷兰阿姆斯特丹)，两种为1∶1000稀释的腹水和抗CD28mAb CLB-28/1(CLB，荷兰阿姆斯特丹)。随后，加入扁桃腺T细胞(经3000拉德辐射；每孔10⁵个)、扁桃腺B细胞(每孔10⁴个)和rIL-2(20U/ml)。各孔细胞培养物的最终体积为200μl。8天后，离心细胞，收获无细胞上清液。如下所述用ELISA评估(稀释)样品中的人IgM和IgG浓度。

在一个实施方式中，在包被有抗-CD3mAb和含或不含用于共刺激T细胞的不同mAb的96孔板中一起培养人扁桃腺B细胞(10⁴个/孔)与经辐射的纯化T细胞(3000拉德，10⁵个/孔)。培养8天后，收获上清液测定B细胞产生的抗体。通过下述ELISA试验评估B细胞产生的抗体。从培养开始时，加入不同浓度的感兴趣抗CD40抗体。作为对照可加入mAb MOPC-141。

拮抗性抗CD40抗体可抑制人T细胞刺激B细胞产生IgG和IgM抗体至少50％或更多(即在拮抗性抗CD40抗体存在下T细胞诱导B细胞产生的抗体量不高于没有拮抗性抗CD40抗体时观察到的50％)。相反，对照抗体如MOPC-141对T细胞诱导的B细胞产生抗体没有显著影响。

用于抗体定量的ELISA试验

用ELISA评估人IgM和IgG的浓度。用0.05M碳酸盐缓冲液(pH＝9.6)配制的4μg/ml小鼠抗人IgGmAb MH 16-01(CLB，荷兰阿姆斯特丹)或1.2μg/ml小鼠抗-人IgMmAb 4102(太勾公司(Tago)，加州伯林盖姆(Burlingame，CA))包被96孔ELISA平板，4℃培育16小时。用PBS-0.05％吐温-20(PBS-吐温)洗涤平板3次，用BSA饱和1小时。洗涤2次后，用不同稀释度的测试样品37℃培育该平板1小时。洗涤3次后，与1μg/ml过氧化物酶标记的小鼠抗-人IgGmAb MH 16-01(CLB)或小鼠抗-人IgMmAb MH 15-01(CLB)37℃培育1小时以检测结合的Ig。洗涤平板4次，加入底物邻苯二胺显示结合的过氧化物酶的活性。用人标准血清(H00，CLB)建立各次试验的标准曲线。

本领域知道拮抗性抗CD40抗体。参见例如，美国专利申请公开号20020142358和20030059427公开的称为F4-465的杂交瘤产生的人抗CD40抗体。F4-465获自HAC小鼠(Kuroiwa等(2000)Nature Biotech 10：1086(2000))，因此表达人λ轻链。

除拮抗活性外，用于本发明方法的抗CD40抗体优选具有另一种作用于靶细胞的机制。抗CD40抗体优选具有ADCC活性。

本发明特别感兴趣的抗CD40抗体具有HCD122(用2003年9月17号保藏于ATCC(美国模式培养物保藏所；大学大道10801号(10801 UniversityBlvd.)，马纳萨斯(Manassas)，弗吉尼亚州(Virginia)20110-2209(USA))的专利保藏物编号PTA-5543的杂交瘤细胞系产生)的结合特征。这些抗体包括但不限于：

a)单克隆抗体HCD122，由ATCC保藏的专利保藏物编号PTA-5543的杂交瘤细胞系产生；

b)包含选自以下氨基酸序列的抗体：SEQ ID NO：2所示序列、SEQ ID NO：4所示序列、SEQ ID NO：5所示序列、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4所示的二序列以及SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5所示的二序列；

c)包含选自以下氨基酸序列的抗体：SEQ ID NO：17所示序列、SEQ IDNO：19所示序列、SEQ ID NO：20所示序列、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：19所示的二序列以及SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：20所示的二序列；

d)包含选自以下氨基酸序列的抗体：SEQ ID NO：16所示序列、SEQ IDNO：18所示序列以及SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：18所示的二序列；

e)含有选自由以下核苷酸序列的核酸分子编码的氨基酸序列的抗体：SEQID NO：1所示序列、SEQ ID NO：3所示序列以及SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示的二序列；

f)含有包含SEQ ID NO：10所示的CDR-L1氨基酸序列、SEQ ID NO：11所示的CDR-L2氨基酸序列以及SEQ ID NO：12所示的CDR-L3氨基酸序列的轻链可变区(V_L)的抗体。

g)含有包含SEQ ID NO：13所示的CDR-H1氨基酸序列、SEQ ID NO：14所示的CDR-H2氨基酸序列以及SEQ ID NO：15所示的CDR-H3氨基酸序列的重链可变区(V_H)的抗体；

h)含有包含SEQ ID NO：10所示CDR-L1氨基酸序列、SEQ ID NO：11所示CDR-L2氨基酸序列和SEQ ID NO：12所示CDR-L3氨基酸序列的轻链可变区(V_L)，以及含有包含SEQ ID NO：13所示CDR-H1氨基酸序列、SEQ ID NO：14所示CDR-H2氨基酸序列和SEQ ID NO：15所示CDR-H3氨基酸序列的重链可变区(V_H)的抗体；

i)结合人CD40抗原结构域2的抗体；

j)结合能够与单克隆抗体HCD122结合的CD40表位的抗体；

k)结合含有SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9所示人CD40序列残基82-87表位的抗体；和

l)在竞争性结合试验中能与单克隆抗体HCD122竞争的抗体。

从含有一种或多种编码CD40抗体的表达载体的CHO细胞获得的抗-CD40抗体可用于本发明的方法。

尤其优选保藏于ATCC的专利保藏物编号PTA-5543的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体HCD122用于本发明的方法。

单克隆抗体HCD122能结合人CD40抗原的结构域2，而发现具有拮抗特性的早期抗-CD40抗体能结合人CD40的其他结构域。

如流式细胞术试验测定的那样，在ELISA类型试验中能结合可溶性CD40

的HCD122单克隆抗体可防止CD40-配体与细胞表面CD40结合，并取代先前已结合的CD40-配体。体外检测对正常人B细胞增殖的影响时，HCD122的作用是拮抗性抗CD40抗体。而且，HCD122不诱导正常人淋巴细胞强烈增殖。该抗体能够通过抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)杀伤表达CD40的靶细胞。经Biacore^TM试验测定，HCD122对人CD40的结合亲和力为5x10^-10M。

已知HCD122抗体的核苷酸和氨基酸序列(例如，参见WO 2005/044854)。此外，已于2003年9月13日将表达HCD122抗体的小鼠杂交瘤细胞系153.8E2.D10.D6.12.12(CMCC#12056)保藏到美国典型培养物保藏中心[ATCC；大学大道10801号，弗吉尼亚州马纳萨斯20110-2209(USA)]，专利保藏物编号为PTA-5543。

HCD122轻链的完整序列见SEQ ID NO：2，其中包括前导序列(SEQ IDNO：2的残基1-20)、可变区(SEQ ID NO：2的残基21-132)以及恒定区(SEQ IDNO：2的残基133-239)。HCD122重链的完整序列见SEQ ID NO：4，其中包括前导序列(SEQ ID NO：4的残基1-19)、可变区(SEQ ID NO：4的残基20-139)以及恒定区(SEQ ID NO：4的残基140-469)。HCD122一种变体的完整序列见SEQ IDNO：5，其中包括前导序列(SEQ ID NO：5的残基1-19)、可变区(SEQ ID NO：5的残基20-139)以及恒定区(SEQ ID NO：5的残基140-469)。该变体与HCD122不同之处在于SEQ ID NO：4中位于恒定区内的第153位丙氨酸残基被丝氨酸残基取代。编码HCD122轻链和重链的核苷酸序列见SEQ ID NO：1(HCD122轻链的编码序列)和SEQ ID NO：3(HCD122重链的编码序列)。

不含前导序列的HCD122轻链可变区的氨基酸序列见SEQ ID NO：16(即SEQ ID NO：2的残基21-132)。不含前导序列的HCD122轻链可变区和恒定区的氨基酸序列见SEQ ID NO：17(即SEQ ID NO：2的残基21-239)。不含前导序列的HCD122重链可变区的氨基酸序列见SEQ ID NO：18(即SEQ ID NO：4的残基20-139)。不含前导序列的HCD122重链可变区和恒定区的氨基酸序列见SEQID NO：19(即SEQ ID NO：4的残基20-469)。HCD122重链变体可变区和恒定区的氨基酸序列见SEQ ID NO：20(即SEQ ID NO：5的残基20-469)。

用于本发明方法的抗CD40抗体包括与HCD122单克隆抗体不同但保留了其CDR的抗体，和含有一个或多个氨基酸加入、缺失或取代的抗体。HCD122是完全的人抗体，但如果需要可进一步去免疫原性(de-immunized)。可用已知方法制备去免疫原性的抗CD40抗体，例如WO 98/52976和WO 00/34317所述。用这种方式可修饰抗CD40抗体内的残基以降低该抗体对人的免疫原性同时保留其治疗活性。

可用例如，EP 0983303 A1、WO 00/34317和WO 98/52976所述方法，产生任何已知抗体的具有感兴趣结合特异性的变体序列。例如，已证明CDR内的序列在某些患者中可导致抗体结合II类MHC触发不良T辅助细胞应答。保守性取代可能使抗体保留结合活性但除去触发不良T细胞应答的能力。可以用本领域公知的方法进行这类保守或非保守取代，如本文其它地方所述，得到的抗体也可用于本发明方法。可用本文所述方法常规检测变异抗体有无特定活性，例如，拮抗活性、亲和力和特异性。

例如，可通过突变编码感兴趣抗体的克隆DNA序列制备拮抗性抗CD40抗体，如HCD122单克隆抗体的氨基酸序列变体。本领域熟知诱变和改变核苷酸序列的方法。参见例如，Walker和Gaastra编(1983)Techniques in Molecular Biology(分子生物学技术)(麦克米兰出版公司(MacMillan Publishing Company)，纽约)；Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492；Kunkel等(1987)Methods Enzymol.154：367-382；Sambrook等(1989)Molecular Cloning：ALaboratory Manual(分子克隆：试验室手册)(冷泉港，纽约)；美国专利号4,873,192；和其中引用的参考文献。不影响感兴趣多肽生物学活性的合适氨基酸取代的指南可参见Dayhoff等，(1978)《蛋白质序列和结构图》(Atlas of Protein Sequence and Structure)，(Natl.Biomed.Res.Found.，华盛顿特区)中的模型。优选保守性取代，例如用特性相似的另一氨基酸取代一个氨基酸。保守性取代的例子包括，但不限于，

和

在构建感兴趣抗体，如感兴趣的拮抗性抗-CD40抗体多肽的变体时，所作的修饰应使变体继续具有所需活性，即结合亲和力相似并且拮抗性抗CD40抗体仍能特异性结合人细胞表面表达的CD40抗原，当与人CD40表达细胞的CD40抗原结合时无显著激动活性而显示拮抗活性。显然，制作编码这种变体多肽DNA中的任何突变都必须不将其序列置于读码框外并且优选不产生可能导致二级mRNA结构的互补区(例如，参见，EP 0075444)。

此外，可用许多方法突变拮抗性抗-CD40抗体的恒定区从而改变其效应器功能。例如，参见美国专利6,737,056B1和美国专利申请公布号2004/0132101A1所述的Fc突变从而优化抗体与Fc受体的结合。

参比抗体如拮抗性抗CD40抗体变体的氨基酸序列与参比抗体如拮抗性抗CD40抗体分子，如本文所述HCD122单克隆抗体的序列相同性，优选至少70％或75％，优选至少80％或85％，更优选至少90％、91％、92％、93％、94％或95％。更优选这些分子共享至少96％、97％、98％或99％的序列相同性。对于本发明的目的，可用Smith-Waterman的同源性检索算法以仿射空格(affine gap)检索，确定序列相同性百分比，所用参数为空格开放罚分12、空格延伸罚分2和BLOSUM矩阵62。Smith-Waterman同源性检索算法的说明见Smith和Waterman，(1981)，Adv.Appl.Math.2：482-489。例如，变体与参比抗体如拮抗性抗-CD40抗体有少至1-15个氨基酸残基、少至1-10个氨基酸残基，如6-10，少至5个、少至4个、3个、2个、甚至1个氨基酸残基不相同。

就两条氨基酸序列的最佳比对而言，与参比氨基酸序列相比，氨基酸序列变体的毗连区段可含有添加的氨基酸残基或删除的氨基酸残基。用于与参比氨基酸序列比较的毗连区段包括至少20个毗连氨基酸残基，可以是30、40、50或更多个氨基酸残基。可校正与保守残基取代或空格相关的序列相同性(参见Smith-Waterman同源性检索算法)。

能特异性结合CD40，尤其是结合恶性B细胞的CD40抗原时，保留拮抗活性的抗体的精确化学结构取决于众多因素。由于抗体分子中存在可电离的氨基和羧基，获得的特定多肽可以是酸性盐或碱性盐，或中性盐形式。能在合适的环境中保留其生物活性的所有这种制剂都包括在本文所用的拮抗性抗-CD40抗体的定义中。此外，可通过用糖组分衍生(糖基化)或用其它补充分子，例如脂质、磷酸、乙酰基等加强该多肽的一级氨基酸序列。也可通过与糖偶联来加强。这种加强的某些方面内容可通过生产宿主的翻译后加工系统来实现；可在体外引入其它这种修饰。在任何情况下，本文所用的抗CD40抗体的定义包括这种修饰。在各种试验中，期望这种修饰可提高或降低该多肽的活性而定量或定性地影响其活性。此外，可通过氧化、还原或其它衍生方式修饰链中各氨基酸残基，可切割该多肽得到保留活性的片段。

本领域提供了关于制备和使用抗体变体的基本指南。在制备抗-CD40抗体变体过程中，本领域技术人员不难确定对天然蛋白核苷酸或氨基酸序列的哪种修饰导致产生的变体将适合用作本发明方法药物组合物中的治疗活性组分。

用于本发明方法的抗CD40抗体在体外和/或体内优选具有至少一种以下生物学活性：抑制T细胞刺激的正常人外周B细胞分泌抗体；抑制CD40L表达细胞或可溶性CD40配体(sCD40L)刺激正常人外周B细胞存活和/或增殖；抑制Jurkat T细胞刺激正常人外周B细胞存活和/或增殖；抑制sCD40L或固相CD40L刺激任何细胞产生“存活”抗-凋亡胞内信号；抑制与sCD40L或固相CD40L连接、缺失、无反应(anergy)和/或诱导携带CD40的靶细胞或携带CD40相关配体的细胞(包括但不限于T细胞和B细胞)耐受时任何细胞中的CD40信号转导，诱导CD4⁺CD25⁺调节性T细胞的扩增和激活(参见例如，供者同种抗原通过CD40-CD40L干扰的-特异性组织排斥，van Maurik等(2002)J.Immunol.169：5401-5404)，通过任何机制(包括但不限于：对靶细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)、下调增殖和/或凋亡)产生的细胞毒性、调节靶细胞的细胞因子分泌和/或细胞表面分子的表达和它们的组合。可按照本文的描述进行这种生物学活性试验。也参见Schultze等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：8200-8204；Denton等(1998)Pediatr.Transplant.2：6-15；Evans等(200O)J.Immunol.164：688-697；Noelle(1998)Agents Actions Suppl.49：17-22；Lederman等(1996)Curr.Opin.Hematol.3：77-86；Coligan等(1991)Current Protocols in Immunology 13：12；Kwekkeboom 等(1993)Immunology 79：439-444；和美国专利号5,674,492和5,847,082所述的试验。

可工程改造抗体提高其ADCC活性。具体说，CH2结构域的羧基端一半对FcRIII受体介导的ADCC至关重要。由于CH2和绞链区对效应器功能有重要作用，故可制备含有额外CH2和/或绞链区的一系列多结构域抗体，以研究其效应器功能的改变(参见Greenwood等(1994)Ther.Immunol.1(5)：247-55)。另一种方法是平行工程改造额外结构域，例如，工程改造将半胱氨酸加入到嵌合性Ig的H链中产生二聚体(参见Shopes(1992)J.Immunol.148(9)：2918-2922)。而且，可经工程改造将突变引入Fc区(参见例如，美国专利号6,737,056B1)、在岩藻糖基转移酶缺陷细胞系的细胞中表达(参见例如，美国专利申请公布号US2003/0115614)，或对抗体糖基化实施其它改变(参见例如，美国专利号6,602,684)而提高ADCC活性。

检测本文鉴定的CD40-抗原表位的特异性拮抗性抗CD40抗体的代表性试验是“竞争性结合试验”。竞争性结合试验是通过未知物质抑制已知的标记配体与其特异性抗体结合的能力来检测和定量未知物质的血清学试验。也称为竞争性抑制试验。在代表性的竞争性结合试验中，标记的CD40多肽被样品中的候选抗体沉淀，例如与制备的针对抗CD40单克隆抗体的一个或多个表位的单克隆抗体结合而沉淀。可通过筛选针对CD40蛋白或含有感兴趣CD40蛋白特定表位的蛋白片段而制备的一系列抗体来鉴定能与某感兴趣表位发生特异性反应的抗-CD40抗体。例如，就人CD40而言，感兴趣表位包括含有以下同种型的线性和/或非线性氨基酸残基的表位人CD40的短同种型(SEQ ID NO：7所示，参见GenBank登录号NP_690593，由SEQ ID NO：6所示序列编码；也参见GenBank登录号NM_152854)，或人CD40的长同种型(SEQ ID NO：9所示，参见GenBank登录号CAA43045和NP_001241，由SEQ ID NO：8所示序列编码；参见GenBank登录号X60592和NM_001250)。或者，可用以前鉴定的合适的拮抗性抗-CD40抗体进行竞争性结合试验来选择与以前鉴定抗体相当的单克隆抗体。

这种免疫试验采用的抗体可以是标记或未标记的抗体。未标记抗体可用于凝结试验；采用各种各样标记物的标记抗体可用于各种试验。使可检测物质与抗体结合有助于检测抗-CD40抗体与感兴趣表位之间形成的抗体-抗原复合物。合适的检测方式包括采用例如放射性核素、酶、辅酶、荧光剂、化学发光剂、色原、酶底物或辅助因子、酶抑制剂、辅基复合物、自由基、颗粒、染料等标记。酶的合适例子包括：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物例子包括：链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光物质例子包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质的例子是鲁米诺；生物发光物质的例子包括萤光素酶、萤光素和水母蛋白；合适的放射性物质的例子包括¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S或³H。这种标记的试剂可用于各种熟知的试验，例如放射性免疫试验，酶免疫试验如ELISA、荧光免疫试验等。参见，例如美国专利号3,766,162；3,791,932；3,817,837和4,233,402。

如上所述，本发明的联合治疗能解决与B细胞肿瘤生长相关疾病或病症的已知疗法，包括用利妥昔单抗(以商品名市售)治疗相关的问题。利妥昔单抗已经显示能有效治疗低级、中级和高级非霍奇金淋巴瘤(NHL)，并且在其它B细胞恶性肿瘤中具有活性(参见例如，Maloney等(1994)Blood84：2457-2466)，McLaughlin等(1998)J Clin.Oncol 16：2825-2833，Maloney等(1997)Blood 90：2188-2195，Hainsworth等(2000)Blood 95：3052-3056，Colombat等(2001)Blood 97：101-106，Coiffer等(1998)Blood 92：1927-1932)，Foran等(2000)J.Clin.Oncol.18：317-324，Anderson等(1997)Biochem.Soc.Trans.25：705-708，或Vose等(1999)Ann.Oncol.10：58a)。利妥昔单抗被批准用于治疗复发性低级B细胞瘤或滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)。然而，一些患者逐渐对利妥

治疗产生耐药性(参见Witzig等(2002)；J Clin.Oncol.20：3262，Grillo-Lopez等(1998)J Clin.Oncol.16：2825，或Jazirehi等(2003)Mol.CancerTher.2：1183-1193)。例如，经抗-CD20抗体治疗后，一些患者的恶性B细胞不表达CD20(Davis等(1999)Clin.Cancer Res.5：611)。而且，30％-50％低级NHL患者对此单克隆抗体没有临床反应(Hainsworth等(2000)Blood 95：3052-3056；Colombat等(2001)Blood97：101-106)。对此种单克隆抗体产生耐药性的患者，或对此抗体初次治疗即有耐药性的B-细胞淋巴瘤患者需要采用其它形式的治疗干预。用利妥昔单抗治疗后复发的患者也需要其他疗法。发现与利妥昔单抗相比，治疗活性、特别是抗肿瘤活性优异的抗体可显著改善B细胞肿瘤生长相关的疾病或病症，如B细胞淋巴瘤，尤其是B细胞非霍奇金淋巴瘤的治疗方法。

在一些实施方式中，例如，当在人淋巴瘤或骨髓瘤细胞系的裸小鼠异种移植瘤模型中用等量的抗体测定抗肿瘤活性时，本发明联合治疗提供的治疗效果远高于利妥昔单抗。在其他实施方式中，例如，当在人淋巴瘤或骨髓瘤细胞系的裸小鼠异种移植瘤模型中用等量的抗体测定抗肿瘤活性时，本发明联合治疗提供的治疗效果远高于利妥昔单抗和CHOP联合治疗(通常称为R-CHOP)。

合适的裸小鼠异种移植肿瘤模型包括采用人伯基特淋巴瘤细胞系(称为纳玛(Namalwa)和道迪)模型。优选的实施方式在用人道迪淋巴瘤细胞系产生各种阶段的裸小鼠异种移植肿瘤模型中检测抗肿瘤活性。与不分阶段的模型相比，采用道迪淋巴瘤细胞系产生的各种阶段裸小鼠异种移植肿瘤模型能更有效地区分给定抗体的疗效，因为在分阶段模型中，只在肿瘤达到可测定大小后开始给予抗体。在不分阶段的模型中，通常约在肿瘤接种1天内至出现可触知肿瘤之前开始给予抗体。在分阶段模型中某抗体效力若优于利妥昔单抗或R-CHOP(即治疗活性提高)则强烈表明该抗体比利妥昔单抗疗效更好。而且，在道迪模型中，利妥昔单抗靶向的抗-CD20在细胞表面的表达水平高于CD40。

在本文的实施例中，发明人采用了RL(ATCC；CRL-2261)和SU-DHL-4(DSMZ；ACC 495)人B细胞淋巴瘤细胞系。据报道，这些细胞系为EB病毒基因组阴性，不同于本领域所用的许多常见淋巴瘤细胞系。当解释实验数据时，由于对这些细胞系中的致癌性EBV信号传导的影响，采用EB病毒阳性细胞系可能产生问题。发明人专门选择了EBV阴性的RL和SU-DHL-4淋巴瘤细胞系，这样可更好地保证结果，即对人类治疗效果预测的真实性。

因此，在一些实施方式中，例如，当在对EB病毒基因组阴性的人淋巴瘤细胞系的裸小鼠异种移植肿瘤模型中用等量的抗体测定抗肿瘤活性时，本发明联合治疗提供的治疗效果远高于利妥昔单抗。在进一步的实施方式中，例如，当在对EB病毒基因组阴性的人淋巴瘤细胞系的裸小鼠异种移植肿瘤模型中用等量的抗体测定抗肿瘤活性时，本发明联合治疗提供的治疗效果远高于利妥昔单抗和CHOP联合治疗。在这些实施方式中可用RL或SU-DHL-4淋巴瘤细胞系。

“等量”的抗CD40抗体和利妥昔单抗指每单位体重或每单位体积给予相同的毫克剂量。因此，当肿瘤模型小鼠每kg体重给予0.01mg该抗CD40抗体时，也可给予小鼠每kg体重0.01mg的利妥昔单抗。

抗体效力的另一种差异是在体外测定NK细胞存在时获得肿瘤细胞最大裂解所需的抗体浓度。例如，抗CD40抗体最大裂解道迪细胞的EC50低于利妥昔单抗浓度的1/2，优选低于1/4，最优选低于1/10。因此，在抗体依赖性细胞毒性(ADCC)试验中，抗CD40抗体或其抗原结合片段的效力远高于等量利妥昔单抗，如WO 2007/053767所述，试验包括在相关抗体存在下培育CD40表达细胞和CD20表达细胞与分离的人自然杀伤(NK)细胞的试验。

本发明采用抗CD40抗体治疗B细胞肿瘤生长相关疾病或病症。

给予治疗有效浓度的本发明抗CD40抗体来治疗表达CD40的肿瘤B细胞相关疾病或病症。为了实现这一目标，可用本领域已知的各种可接受的运载体和/或赋形剂配制该抗体。通过胃肠道外给药途径给予抗CD40抗体。一般通过静脉内或皮下注射给予该抗体。本领域普通技术人员知道进行这种给药的方法。

优选静脉内输注给药一段时间，此时间约少于1小时至10小时(更优选少于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10小时)。可在一段时间，即约少于1小时至6小时，包括例如，约1-4小时，约1-3小时，或者约1-2小时后继续输注给药。或者，可皮下给药。

配制本发明药物组合物使其与预计的给药途径相容。用于胃肠道外给药的溶液或悬液可包含以下组分：无菌稀释液如注射用水、盐水溶液；抗菌剂如苄基醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐以及调节张力的物质如氯化钠或右旋糖。可用酸或碱如盐酸或氢氧化钠调节pH。可将胃肠道外制剂装在玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小药瓶中。

一般用标准技术提供用药学上可接受的缓冲液，如无菌盐水、无菌缓冲液或其组合等配制的抗CD40抗体。制备胃肠外给药药剂的方法描述见《雷明顿药物科学与实践》(Remington：The Science and Practice of Pharmacy)(第21版，LWW出版社(Lippincott Williams & Wilkins)，2005年5月)。也参见例如WO98/56418，它描述了适合用于本发明方法的稳定抗体药物制剂。

本领域普通技术人员不难确定至少一种抗CD40抗体的给药剂量。影响给药方式和至少一种抗CD40抗体的给药剂量的因素包括但不限于：疾病严重程度、所治疗个体的病史、年龄、身高、体重、健康状况、疾病类型和身体状况对抗体输注的反应。相似地，抗CD40抗体的给药量将取决于给药方式和给予此种抗肿瘤药物是单剂量还是多剂量。通常，随着所治疗对象的体重增加，优选给予更高剂量的抗CD40抗体。

给予抗CD40抗体的单剂量范围是从约0.1mg/kg至约35mg/kg、从约0.5mg/kg至约30mg/kg、从约1mg/kg至约30mg/kg、从约3mg/kg至约30mg/kg、从约3mg/kg至约25mg/kg、从约3mg/kg至约20mg/kg、或从约5mg/kg至约15mg/kg。因此，例如，该剂量可以是0.3mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、7mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg或35mg/kg，或者属于约0.3mg/kg-50mg/kg范围内的其它剂量。

用治疗有效量的抗体治疗对象，包括一次治疗，或者优选包括一系列治疗。因此，本发明所述方法可包括给予多次剂量的抗CD40抗体。该方法包括给予1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40或更多次治疗有效的分开给药的含抗CD40抗体的药物组合物。本领域技术人员无需过多试验即可容易地确定给予多剂量含抗CD40抗体的药物组合物的频率和持续时间。在治疗过程中可给予相同治疗有效量的抗CD40抗体。或者，在治疗过程中可给予不同治疗有效量的抗CD40抗体。

在一个实施例中，用抗CD40抗体治疗对象，剂量范围是约0.1-20mg/kg体重，在约1-10周，优选约2-8周，更优选约3-7周，更优选约4、5或6周中每周给药一次。可以每间隔2-12个月进行治疗以防止复发，或者一旦有复发迹象立即给药。应理解，在具体治疗过程中可能提高或降低用于治疗的抗体有效剂量。可根据诊断试验结果而改变剂量。

因此，在一个实施方式中，给药方案包括先在治疗期间的第1、8、15和22天给予治疗有效剂量的至少一种抗CD40抗体。

在另一实施方式中，给药方案包括先在治疗期间每天，或一周的第1、3、5和7天给予治疗有效剂量的至少一种抗CD40抗体；包括先在治疗期间一周的第1和3-4天给予治疗有效剂量的至少一种抗CD40抗体的给药方案；和先在治疗期间一周的第1天给予治疗有效剂量的至少一种抗CD40抗体的优选给药方案。治疗时间包括至少1周、至少2周、至少3周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少6个月或至少1年。治疗时间可以是连续的，或者互相间隔至少1周、至少2周、至少1个月、至少3个月、至少6个月或至少1年。

在其它实施方式中，如本文所述抗CD40抗体的初始治疗有效剂量可以是较低剂量范围(即约0.3mg/kg-20mg/kg)，后续剂量为较高剂量范围(即约20mg/kg-50mg/kg)。

在其它实施方式中，如本文所述抗CD40抗体的初始治疗有效剂量可以是较高剂量范围(即约20mg/kg-50mg/kg)，后续剂量为较低剂量范围(即0.3mg/kg-约20mg/kg)。因此，在本发明的一些实施方式中，可通过将“加载剂量”的抗体给予需要治疗的对象启动抗CD40抗体治疗。“加载剂量”指给予对象的抗CD40抗体的初始剂量，其所给抗体的剂量属于较高剂量范围(即约20mg/kg-50mg/kg)。可通过一次给药(例如IV一次输注给予该抗体)或多次给药(例如IV多次输注给予该抗体)给予“加载剂量”，只要在约24小时内给予所有“加载剂量”。给予“加载剂量”后，再给予该对象一次或多次治疗有效剂量的抗CD40抗体。可按照每周给药方案，或者每两周一次、每三周一次、每四周一次给予后续治疗有效剂量。在这类实施方式中，后续治疗有效剂量通常属于较低剂量范围(即0.3mg/kg-约20mg/kg)。

或者，在一些实施方式中，在给予“加载剂量”后按照“维持方案”给予后续治疗有效剂量的抗CD40抗体，所述治疗有效剂量的抗体每月给予一次、每6周给予一次、每两个月给予一次、每10周给予一次、每三个月给予一次、每14周给予一次、每4个月给予一次、每18周给予一次、每5个月给予一次、每22周给予一次、每六个月给予一次、每7个月给予一次、每8个月给予一次、每9个月给予一次、每10个月给予一次、每11个月给予一次或者每12个月给予一次。在这类实施方式中，抗CD40抗体的治疗有效剂量为较低剂量范围(即0.3mg/kg-约20mg/kg)，特别是以较高频率间隔(如每2周一次至每月一次)，或者属于较高剂量范围(即约20mg/kg-约50mg/kg)给予后续剂量；特别是以较低频率间隔(如给药间隔约为1个月-12个月)给予后续剂量。

用于本发明方法的本文所述药物组合物中存在的抗CD40抗体可以是天然抗体，或重组技术获得的抗体，也可来自任何来源，包括哺乳动物来源，如，小鼠、大鼠、兔、灵长动物、猪和人。这类多肽优选衍生自人来源，更优选杂交瘤细胞系产生的重组人蛋白。

本发明方法可采用含有作为治疗活性组分的具有本文所述结合特性的抗CD40抗体的任何药物组合物。因此，可将含有一种或多种抗CD40抗体的液体、冻干或喷雾干燥的组合物制备成水性或非水性溶液或悬液，便于随后按照本发明方法给予对象。这些组合物各自包含至少一种抗CD40抗体，作为治疗或预防活性组分。“治疗或预防活性组分”指将抗CD40抗体特地掺入组合物中以产生所需的治疗或预防反应，将该药物组合物给予对象，治疗、预防或诊断该对象的疾病或病症。所述药物组合物优选包含合适的稳定剂、填充剂或二者，以最大程度减少制备和储存期间与蛋白质稳定性和生物学活性损失有关的问题。

可将配方制剂(formulant)加入到含有抗CD40抗体的药物组合物中。这些配方制剂可包括但不限于：油、聚合物、维生素、糖、氨基酸、盐、缓冲剂、白蛋白、表面活性剂或填充剂。糖优选包括糖或糖醇，如单糖、二糖或多糖，或者水溶性葡聚糖。糖或葡聚糖可包括果糖、葡萄糖、海藻糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、蔗糖、右旋糖苷、支链淀粉、糊精、α和β环糊精、可溶性淀粉、羟乙基淀粉和羧甲基纤维素，或它们的混合物。“糖醇”定义为含有羟基的C4-C8烃，包括半乳糖醇、肌醇、甘露醇、木糖醇、山梨糖醇、甘油和阿拉伯糖醇。这些糖或糖醇可单独或联合使用。糖或糖醇浓度为1.0％-7％w/v，更优选2.0％-6.0％w/v。氨基酸优选包括肉毒碱、精氨酸和甜菜碱的左旋(L)形式；然而，可加入其它氨基酸。优选的聚合物包括平均分子量为2,000-3,000的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，或平均分子量为3,000-5,000的聚乙二醇(PEG)。可加入该制剂的表面活性剂见EP号270,799和268,110。

掺入药物组合物的配方制剂应为抗CD40抗体提供稳定作用。即抗CD40抗体应保留其物理和/或化学稳定性并具有所需生物学活性，即一种或多种本文所定义的拮抗剂活性。

本领域熟知监测蛋白质稳定性的方法。参见例如，Jones(1993)Adv.Drug Delivery Rev.10：29-90；Lee编(1991)Peptide and Protein Drug Delivery(肽和蛋白质药物递送)(马赛代克公司(Marcel Dekker，Inc.)，纽约州纽约)；以及下文所述的稳定性试验。通常，测定蛋白质在所选温度下特定时间内的稳定性。在优选实施方式中，稳定的抗体药物制剂室温(约25℃)储存可提供稳定的抗CD40抗体至少1个月、至少3个月或至少6个月，和/或约2-8℃储存可稳定至少6个月、至少9个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月。

配制在药物组合物中时，如果在给定时间点该药物组合物不出现可见的沉淀、聚集和/或变性现象(如褪色或不澄清)或可检测迹象(例如，用分子大小排阻层析(SEC)或UV光散射检测)，则认为该蛋白质如抗体保持了其物理稳定性。就化学稳定性而言，如果配制在药物组合物中时，在给定时间点化学稳定性的测定表明该蛋白质(即抗体)在药物组合物中保持了感兴趣的生物学活性，则认为该蛋白质如抗体保持了其化学稳定性。监测化学稳定性改变的方法是本领域众所周知的，包括但不限于：检测蛋白质化学形式改变的方法，例如采用(如)SDS-PAGE、SEC和/或基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱检测蛋白质剪切的结果；和采用(如)离子交换色谱检测与分子电荷改变有关(例如，与脱酰胺有关)的降解。参见例如，下文所述方法。

当配制在药物组合物中时，如果经过所需生物学活性的合适试验测定，在给定时间点所需生物学活性是制备该药物组合物时所需生物学活性的约30％、优选约20％以内，则认为抗CD40抗体保持了所需的生物学活性。可以如本文实施例所述测定抗CD40抗体的所需生物学活性。也参见Schultze等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：8200-8204；Denton等(1998)Pediatr.Transplant.2：6-15；Evans等(200O)J.Immunol.164：688-697；Noelle(1998)Agents Actions Suppl.49：17-22；Lederman等(1996)Curr.Opin.Hematol.3：77-86；Coligan等(1991)Current Protocols in Immunology 13：12；Kwekkeboom等(1993)Immunology 79：439-444；和美国专利号5,674,492和5,847,082所述的试验。

在本发明的一些实施方式中，将抗CD40抗体配制成液体药物制剂。可采用本领域已知方法，包括上文公开的方法制备抗CD40抗体。可在CHO细胞系中重组产生抗CD40抗体。

在配制成制剂之前储存抗CD40抗体期间，可冻存(如≤20℃)该抗体，然后室温融化进一步配制成制剂。所述液体药物制剂包含治疗有效量的抗CD40抗体。此制剂中的抗体含量需要考虑给药途径和所需的剂量体积。

以此方式，该液体药物组合物包含浓度为约0.1mg/ml-50.0mg/ml、约0.5mg/ml-40.0mg/ml、约1.0mg/ml-30.0mg/ml、约5.0mg/ml-25.0mg/ml、约5.0mg/ml-20.0mg/ml或约15.0mg/ml-25.0mg/ml的抗CD40抗体。在一些实施方式中，该液体药物组合物包含浓度为约0.1mg/ml-5.0mg/ml、约5.0mg/ml-10.0mg/ml、约10.0mg/ml-15.0mg/ml、约15.0mg/ml-20.0mg/ml、约20.0mg/ml-25.0mg/ml、约25.0mg/ml-30.0mg/ml、约30.0mg/ml-35.0mg/ml、约35.0mg/ml-40.0mg/ml、约40.0mg/ml-45.0mg/ml或约45.0mg/ml-50.0mg/ml的抗CD40抗体。在其它实施方式中，该液体药物组合物包含浓度为约15.0mg/ml、约16.0mg/ml、约17.0mg/ml、约18.0mg/ml、约19.0mg/ml、约20.0mg/ml、约21.0mg/ml、约22.0mg/ml、约23.0mg/ml、约24.0mg/ml或约25.0mg/ml的抗CD40抗体。该液体药物组合物包含抗CD40抗体和缓冲液，将该制剂的pH维持在约pH 5.0-pH 7.0的范围，包括约pH 5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0。在一些实施方式中，所述缓冲液将该制剂的pH保持在约pH 5.0-pH 6.5、约pH 5.0-pH 6.0、约pH 5.0-pH 5.5、约pH 5.5-7.0、约pH 5.5-pH 6.5或约pH 5.5-pH 6.0的范围内。

该制剂中可采用将液体抗CD40抗体制剂的pH维持在约pH 5.0-pH 7.0范围内的任何合适缓冲剂，只要如上所述保持该抗体的理化稳定性和所需生物学活性。合适的缓冲剂包括但不限于：常用酸和其盐，其中抗衡离子可以是(例如)钠、钾、铵、钙或镁。可用于缓冲该药物液体制剂的常用酸和其盐的例子包括但不限于：琥珀酸或琥珀酸盐、柠檬酸或柠檬酸盐、乙酸或乙酸盐、酒石酸或酒石酸盐、磷酸或磷酸盐、葡糖酸或葡糖酸盐、谷氨酸或谷氨酸盐、天冬氨酸或天冬氨酸盐、马来酸或马来酸盐以及苹果酸或苹果酸盐缓冲剂。该制剂内的缓冲液浓度可以是约1mM-50mM，包括约1mM、2mM、5mM、8mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM或者约1mM-50mM范围内的其它值。在一些实施方式中，该制剂内的缓冲液浓度为约5mM-15mM，包括约5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM，或者约5mM-15mM范围内的其它值。

在本发明的一些实施方式中，该液体药物制剂包含治疗有效量的抗CD40抗体和浓度能使制剂pH维持在约pH 5.0-pH 7.0，优选约pH 5.0-pH 6.5范围内的琥珀酸盐缓冲剂或柠檬酸盐缓冲剂。“琥珀酸盐缓冲液”或“柠檬酸盐缓冲液”分别指含有琥珀酸盐或柠檬酸盐的缓冲液。在一优选实施方式中，琥珀酸或柠檬酸盐抗衡离子是钠阳离子，因此该缓冲液分别是琥珀酸钠或柠檬酸钠。然而，预计任何阳离子均有效。其它可能的琥珀酸盐或柠檬酸盐阳离子包括但不限于：钾、铵、钙和镁。如上所述，该制剂内琥珀酸盐或柠檬酸盐缓冲液浓度可以为约1mM-50mM，包括约1mM、2mM、5mM、8mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM或约1mM-50mM范围内的其它值。在一些实施方式中，该制剂内的缓冲液浓度为约5mM-15mM，包括约5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM或约15mM。在其它实施方式中，该液体药物制剂包含浓度为约0.1mg/ml-50.0mg/ml或约5.0mg/ml-25.0mg/ml的抗CD40抗体，和浓度为约1mM-20mM、约5mM-15mM，优选约10mM的琥珀酸盐或柠檬酸盐缓冲液，如琥珀酸钠或柠檬酸钠缓冲液。

理想地该液体药物制剂接近等渗，含有抗CD40抗体和缓冲液的液体药物制剂还可包含可使该制剂接近等渗的足量等渗剂。“接近等渗”指水性制剂的摩尔渗透压为约240mmol/kg-360mmol/kg，优选约240-340mmol/kg，更优选约250-330mmol/kg，甚至更优选约260-320mmol/kg，还要优选约270-310mmol/kg。本领域技术人员了解测定溶液等渗的方法。

本领域技术人员熟悉用于向药物组合物提供等渗性的各种药学上可接受的溶质。等渗剂可以是能调节本发明液体药物制剂的渗透压至接近体液相同值的任何试剂。需要使用生理上可接受的等渗剂。因此，含有治疗有效量的抗CD40抗体和缓冲液的液体药物制剂还可包含可用于提供等渗性的组分，如氯化钠；氨基酸如丙氨酸、缬氨酸和甘氨酸；糖和糖醇(多元醇)，包括但不限于：葡萄糖、右旋糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、海藻糖、甘油、山梨糖醇和木糖醇；乙酸、其它有机酸或其盐，以及相对少量的柠檬酸盐或磷酸盐。本领域普通技术人员知道适合提供液体制剂的最优等渗强度的其它试剂。

在一些优选实施方式中，含有抗CD40抗体和缓冲液的液体药物制剂还含有氯化钠作为等渗剂。该制剂中的氯化钠浓度取决于其它组分对渗透性的贡献。在一些实施方式中，氯化钠浓度为约50mM-300mM、约50mM-250mM、约50mM-200mM、约50mM-175mM、约50mM-150mM、约75mM-175mM、约75mM-150mM、约100mM-175mM、约100mM-200mM、约100mM-150mM、约125mM-175mM、约125mM-150mM、约130mM-170mM、约130mM-160mM、约135mM-155mM、约140mM-155mM或约145mM-155mM。在一个这类实施方式中，氯化钠浓度为约150mM。在其它这类实施方式中，氯化钠浓度为约150mM，缓冲液是浓度约为5mM-15mM的琥珀酸钠或柠檬酸钠缓冲液，该液体药物制剂含有治疗有效量的抗CD40抗体，该制剂的pH为约pH 5.0-pH 7.0、约pH 5.0-pH 6.0或约pH 5.5-pH 6.5。在其它实施方式中，该液体药物制剂含有浓度为约0.1mg/ml-50.0mg/ml或约5.0mg/ml-25.0mg/ml的抗CD40抗体、约150mM氯化钠和约10mM琥珀酸钠或柠檬酸钠，pH为约pH 5.5。

可将表面活性剂掺入本发明液体药物制剂中，以降低溶液-空气界面上的表面张力，从而抑制加工该制剂期间冻融或机械剪切引起的蛋白质降解。因此，在一些实施方式中，该液体药物制剂含有治疗有效量的抗CD40抗体、缓冲液，还包含表面活性剂。在其它实施方式中，该液体药物制剂含有抗CD40抗体、缓冲液、等渗剂，还含有表面活性剂。

所用的表面活性剂一般是非离子型表面活性剂，包括聚氧乙烯山梨糖醇酯，如聚山梨酯80(吐温80)和聚山梨酯20(吐温20)；聚氧丙烯-聚氧乙烯酯如普朗尼克F68；聚氧乙烯醇如Brij35；硒甲硅油；聚乙二醇如PEG400；溶血磷脂酰胆碱；和聚氧乙烯-对-叔-辛基酚如Triton X-100。用表面活性剂或乳化剂使药物稳定的经典方法参见例如，Levine等(1991)J Parenteral Sci.Technol.45(3)：160-165。用于实施本发明的优选表面活性剂是聚山梨酯80。当包含表面活性剂时，加入量一般为约0.001％-1.0％(w/v)、约0.001％-0.5％、约0.001％-0.4％、约0.001％-0.3％、约0.001％-0.2％、约0.005％-0.5％、约0.005％-0.2％、约0.01％-0.5％、约0.01％-0.2％、约0.03％-0.5％、约0.03％-0.3％、约0.05％-0.5％或约0.05％-0.2％。

因此，在一些实施方式中，该液体药物制剂含有治疗有效量的抗CD40抗体，和浓度为约1mM-50mM、约5mM-25mM或约5mM-15mM的琥珀酸钠或柠檬酸钠缓冲液；该制剂的pH为约pH 5.0-pH 7.0、约pH 5.0-pH 6.0或约pH 5.5-pH 6.5；该制剂还包含含量为约0.001％-1.0％或约0.001％-0.5％的表面活性剂，如聚山梨酯80。这类制剂可任选地含有等渗剂，如浓度为约50mM-300mM、约50mM-200mM或约50mM-150mM的氯化钠。在其它实施方式中，该液体药物制剂含有浓度为约0.1mg/ml-50.0mg/ml或约5.0mg/ml-25.0mg/ml的抗CD40抗体，包括约20.0mg/ml的抗CD40抗体；约50mM-200mM的氯化钠，包括约150mM氯化钠；约5mM-20mM的琥珀酸钠或柠檬酸钠，包括约10mM琥珀酸钠或柠檬酸钠；浓度为约50mM-200mM的氯化钠，包括约150mM氯化钠；和任选的表面活性剂，如含量为约0.001％-1.0％的聚山梨酯80，包括约0.001％-0.5％聚山梨酯80；该液体药物制剂的pH为约pH 5.0-pH 7.0、约pH 5.0-pH 6.0、约pH 5.0-pH 5.5、约pH 5.5-pH 6.5或约pH 5.5-pH 6.0。

该液体药物制剂可基本不含如上所述的任何防腐剂和其它运载体、赋形剂或稳定剂。或者，该制剂可含有一种或多种防腐剂，例如，上文所述的抗菌剂、药学上可接受的运载体、赋形剂或稳定剂，只要它们不会对抗CD40抗体的理化稳定性造成不良影响。可接受的运载体、赋形剂和稳定剂的例子包括但不限于：其它缓冲剂、助溶剂、表面活性剂、抗氧化剂(包括抗坏血酸和甲硫氨酸)、螯合剂如EDTA、金属络合物(如锌-蛋白质络合物)和可生物降解的聚合物如聚酯。关于药学上可接受的运载体、稳定剂和等渗剂(isomolyte)的配方和选择的充分讨论可参见《雷明顿药物科学与实践》(第21版，LWW(Lippincott Williams& Wilkins)出版社，2005年5月)。

本文所用的“运载体”包括在所用剂量和浓度对接触的细胞或哺乳动物无毒性的药学上可接受的运载体、赋形剂或稳定剂。生理上可接受的运载体常常是pH缓冲水溶液。生理上可接受的运载体的例子包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐和其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷胺酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它糖，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨糖醇；形成盐的抗衡离子如钠；和/或非离子型表面活性剂如吐温、聚乙二醇(PEG)和普朗尼克。

制备本文所述的液体药物制剂或其它药物组合物后，可将其冻干以防止降解。本领域普通技术人员知道冻干液体组合物的方法。临用前，可用无菌稀释液(如林格氏溶液、蒸馏水或无菌盐水)重建该组合物，所述无菌稀释液可含有其它成分。重建后，优选用本领域技术人员已知的方法将该组合物给予对象。

含有抗CD40抗体的药物组合物可以是如以WO 2007/124299公开的共有国际专利申请号PCT/US2007/066757中所述的组合物。具体说，用于本发明联合治疗的药物组合物可包含：(i)抗-CD40抗体，(ii)将组合物的pH维持在约pH 5.0和pH 7.0之间的缓冲剂，和(iii)含量足以使液体组合物接近等渗的精氨酸-HCl。这些组合物中的缓冲剂可以是柠檬酸盐/柠檬酸缓冲剂。所述组合物可进一步包含非离子表面活性剂和/或L-甲硫氨酸作为进一步的稳定剂。该组合物的摩尔渗透压约为240-360mmol/kg。缓冲剂的浓度可以为约5mM至约100mM，约5mM至约20mM，或约5mM至约15mM(例如，10mM)。该组合物的pH为pH 5.0--pH 6.0(例如，约pH 5.5)。该组合物可含有浓度约50mM至约200mM或从100mM至约175mM(例如，约150mM)的精氨酸-HCl。该组合物还可包含表面活性剂，例如，浓度为约0.001％至约1.0％(w/v)，或者约0.025％至约0.1％(w/v)的聚山梨酯。该组合物可进一步含有浓度约0.5mM至约20.0mM或约1.0mM至约20.0mM(例如，约5.0mM)的甲硫氨酸。所述抗-CD40抗体在组合物中的含量为约0.1mg/ml至约50.0mg/ml，或约1.0mg/ml至约35.0mg/ml，或约10.0mg/ml至约35.0mg/ml。

本发明还涉及采用化疗剂环磷酰胺(商品名Cytoxan)、多柔比星(商品名Adriamycin)，长春新碱(商品名Oncovin)和强的松(商品名Deltasone)。这四种化疗剂联用称为CHOP。通常用CHOP方案治疗非霍奇金淋巴瘤患者，将CHOP作为弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者的标准疗法已有25年以上(Feugier等(2005)J.Clin.Oncol.23(18)：4117-4126；Habermann等(2006)J.Clin.Oncol.24(19)：3121-3127)。已联用CHOP与利妥昔单抗来治疗DLBCL(Feugier等(2005)J.Clin.Oncol.23(18)：4117-4126；Habermann等(2006)J.Clin.Oncol.24(19)：3121-3127)。

CHOP是三种化疗药物(环磷酰胺、多柔比星和长春新碱)与一种类固醇(强的松)联用。CHOP化学疗法伴有许多副作用，最常见的是疲劳、血细胞计数减少(由于影响骨髓)、恶心、脱发、不孕、口疮和溃疡、食欲丧失和神经系统症状(例如，发麻和针刺感或腹痛)。本发明方法采用较低剂量的CHOP方案从而能减轻或消除这些副作用中的一种或多种。因此，在一些实施方式中，本发明的方法、应用、组合物和药盒可用于治疗人类患者的B细胞肿瘤生长相关疾病或病症，同时可避免或减轻与CHOP给药通常相关的一种或多种副作用。

本发明的联合治疗采用较低剂量的抗CD40抗体从而能减轻或消除与抗CD40抗体给药相关的一种或多种副作用。因此，在一些实施方式中，本发明的方法、应用、组合物和药盒可用于治疗人类患者的B细胞肿瘤生长相关疾病或病症，同时避免或减轻与抗CD40抗体给药通常相关的一种或多种副作用。

本发明方法可采用含有CHOP组分作为治疗活性组分的任何药物组合物。这些组合物将含有一种或多种CHOP组分以及药学上可接受的运载体或赋形剂，例如，本文其他地方所述的药学上可接受的运载体或赋形剂。合适的药物组合物是本领域众所周知的。“治疗活性组分”指将相关治疗剂特地掺入该组合物中以产生所需的治疗反应，从而将该药物组合物给予对象时可治疗该对象的疾病或病症。可给予“治疗有效”浓度的CHOP组分以治疗肿瘤B细胞生长相关的疾病或病症。

可通过任何合适的给药途径给予CHOP组分。通常静脉内给予环磷酰胺、多柔比星和长春新碱药，而强的松通常口服给药。本领域普通技术人员知道这种给药的方法。

通常循环治疗给予CHOP，每轮循环包括第1天给予750mg/m²环磷酰胺，第1天给予50mg/m²多柔比星，第1天给予1.4mg/m²长春新碱，以及第1-5天给予100mg/m²强的松。通常每3周(21天)重复一次这种循环。常规疗程总共包括6-8轮循环。

在本发明的方法、应用、组合物和药盒中，环磷酰胺的用量为75-1000mg/m²，或185-1000mg/m²，或500-1000mg/m²，或700-800mg/m²(例如，750mg/m²)。多柔比星的用量为5-70mg/m²，或12-70mg/m²，或35-70mg/m²，或45-55mg/m²(例如，50mg/m²)。长春新碱的用量为0.1-2.0mg/m²，或0.7-2.0mg/m²，或1.0-2.0mg/m²，或1.0-1.6mg/m²(例如，1.4mg/m²)。强的松的用量为10-130mg/m²，或50-130mg/m²，或65-130mg/m²，或85-125mg/m²(例如，100mg/m²)。本领域技术人员能够容易地选择本发明联合治疗所用的合适的CHOP方案。

在本发明的方法、应用、组合物和药盒中，优选每3周重复一次CHOP方案，但如果需要也可每4周、每5周、每6周、每7周、每8周、每9周、甚至每10周重复一次。本发明的联合治疗可降低所用的CHOP剂量同时保持疗效，从而能够更加频繁地重复该CHOP方案，如每周或者每两周重复一次。可给予任何所需轮次的CHOP，例如1-20轮，优选3-15轮，更优选5-10轮。

术语“包括”包括“含有”以及“由...构成”。例如，“含有”X的组合物可仅由X组成或可包含其它物质，例如X+Y。

词语“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含”Y的组合物可能完全不含Y。必要时，可从本发明定义中删去词语″基本上″。

与数值x相关的术语“约”表示，例如，x±10％。

现在只通过实施例方式更详细地描述本发明的各个方面和实施方式。应理解，可修改细节，但不背离本发明的范围。

实验

以下实施例所用的抗-CD40抗体是单克隆抗体HCD122(以前称为CHIR-12.12)。已经描述过HCD122的制造、测序和特征。

实施例1：HCD122联用CHOP(H-CHOP)的抗肿瘤活性

人单克隆抗体HCD122和CHOP当单独使用时已在RL和SU-DHL-4淋巴瘤模型中各自显示出有抗肿瘤效力。RL细胞系(ATCC；CRL-2261)是从一名52岁白种男性NHL患者建立的一种人B细胞淋巴瘤细胞系。SU-DHL-4细胞系(DSMZ；ACC 495)是从一名38岁男性B-NHL(弥散性大细胞、核裂细胞型)患者建立的一种人B细胞淋巴瘤细胞系。据报道，这些细胞系为EB病毒基因组阴性，不同于本领域使用的许多常见淋巴瘤细胞系。当解释实验数据时，由于对这些细胞系中致癌性EBV信号传导的影响，采用EB病毒阳性细胞系可能会带来问题。发明人专门选择了EBV阴性的RL和SU-DHL-4淋巴瘤细胞系，这样可更好地保证结果的真实性。

在RL弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)异种移植模型中评价了HCD122与CHOP联用的活性，并与单用HCD122或单用CHOP的活性比较。HCD122和CHOP联用下文称为H-CHOP。还将H-CHOP的疗效与通常称为R-CHOP的已知CHOP和嵌合型抗-CD20单克隆抗体利妥昔单抗联用的疗效进行了比较。

材料和方法

在CB17/SCID小鼠RL DLBCL异种移植模型中检测了HCD122与CHOP联用的抗肿瘤活性。将10x10⁶个RL细胞与等体积Matrigel^TM植入动物胸椎中线区域皮下，植入体积为200μl。当平均肿瘤体积达到150-200mm³时开始给予抗体(在图1中表示为第1天)。腹膜内注射分别给予HCD122、利妥昔单抗和阴性对照人IgG1抗体。所有单克隆抗体一周给予一次，治疗时间长度为4周。CHOP方案给药的剂量和时间如下：强的松0.2mg/kg口服(p.o.)第1-5天；环磷酰胺40mg/kg静脉内(i.v.)第1天；多柔比星3.3mg/kg，i.v.第1天；长春新碱0.5mg/kg，i.v.第1天。各组n＝12。用数字卡尺测量肿瘤体积，先长度后宽度。一旦看见肿瘤每周测量记录两次。用以下公式计算肿瘤体积和倍增时间，体积＝LxW²/2。记录动物体重计算每组的平均值。

结果

这些实验的结果显示于图1和下表1和2。

表1：第25天时的肿瘤生长抑制

与用人IgG1对照抗体治疗相比，第25天时所有治疗都显示肿瘤生长显著降低。观察到单用CHOP或单用HCD122(1mg/kg)的肿瘤生长抑制(TGI)分别为77％和71％(p＜0.001；图基(Tukey)检验)。相反，观察到H-CHOP联用(采用1mg/kg HCD122)的TGI为95％(p＜0.001；图基检验)。观察到R-CHOP联用(采用10mg/kg利妥昔单抗)的TGI为90％(p＜0.001；图基检验)。

表2：肿瘤生长延迟

	肿瘤生长延迟(天)
		KLH(1mg/kg)	0
利妥昔单抗(10mg/kg)	4
		CHOP	8
利妥昔单抗(10mg/kg)+CHOP	12.5

H-CHOP的肿瘤生长延迟(肿瘤体积达到500mm³的时间，17.5天)显著长于单用CHOP(8天)或单用HCD122(6天)(p＜0.001)。未观察到H-CHOP联用有毒性。在研究结束时(第35天)，接受H-CHOP(1mg/kg HCD122)的治疗组肿瘤生长降低显著高于接受R-CHOP(10mg/kg利妥昔单抗，p＜0.05；图基检测)或单用CHOP(p＜0.001；图基检测)的治疗组。

这些数据显示，用H-CHOP联合治疗导致抗肿瘤效力远高于单用HCD122或单用CHOP治疗。当采用1mg/kg的HCD122时，H-CHOP联合提供的疗效高于各药物疗效的简单相加，即H-CHOP联用能提供协同治疗效果。因此，这些数据提示，H-CHOP联合可用于改善先前已经单用CHOP或单用HCD122治疗过的人类患者的抗肿瘤治疗，例如，通过提供增强的疗效，或减少CHOP剂量从而降低或消除与CHOP给药相关的一种或多种副作用。

这些数据还显示，用H-CHOP联合治疗可导致抗肿瘤效力远高于单用利妥昔单抗或已知的利妥昔单抗与CHOP联合(R-CHOP)治疗。因此，这些数据提示，H-CHOP联合可用于改善先前已经单用利妥昔单抗或R-CHOP治疗过的人类患者的抗肿瘤治疗，提供通过增强的疗效，或减少CHOP剂量从而降低或消除与CHOP给药相关的一种或多种副作用。

实施例2：HCD122逆转了CD40L诱导的对CHOP的耐药性

进行实验以阐明H-CHOP联用提供出乎预料强的体内抗肿瘤效力的机制。在存在(i)阴性对照人IgG1抗体，(ii)HCD122，(iii)人IgG1和CD40L，或(iv)HCD122和CD40L时培养SU-DHL-4细胞。以每孔30,000个细胞接种SU-DHL-4细胞。所用的所有抗体为10μg/ml。所用的重组人可溶性CD40L为1μg/ml，配体增强子为2μg/ml。用1mg/ml环磷酰胺、15μg/ml强的松、2.5ng/ml多柔比星和1pg/ml长春新碱处理所有细胞。培养细胞3天，用CellTiter-Glo测定活细胞百分比。这些实验的结果见图2。这些数据显示，CD40L诱导了SU-DHL-4细胞对CHOP细胞毒性的耐药性，但采用HCD122能克服这种耐药性，从而使得CHOP能完整发挥其细胞毒效应。这些数据有助于解释H-CHOP出乎预料强的抗肿瘤效力。

实施例3：HCD122对NFkB活化的影响

用CD40L刺激RL和SU-DHL-4细胞0、10、30和90分钟，并进行Western印迹(图3)。发现在用CD40L刺激RL和SU-DHL-4细胞几分钟内诱导了p65磷酸化。这些细胞系内的磷酸化持续了至少90分钟。此外，发现在存在HCD122时，用CD40L刺激RL和SU-DHL-4细胞的p65磷酸化受到极大抑制(图3)。这些数据证明，RL和SU-DHL-4细胞CD40L诱导的NF-kB活化受到HCD122的完全阻断。下调细胞的NF-kB活化可能使细胞对CHOP细胞毒性敏感(Chuang等(2002)Biochemical Pharmacology 63：1709-1716；Cheng等(2000)Oncogene 19：4936-4940)。这些数据显示，HCD122下调NF-kB活化有助于解释为什么用HCD122能克服CD40L诱导的对CHOP细胞毒性产生耐药。

实施例4：HCD122对细胞表面粘附分子的影响

为进一步阐明H-CHOP联用导致出乎预料强的体内抗肿瘤效力的机制，进行了进一步的实验。B细胞能否聚集与它们的微环境相互作用可能会影响治疗效果。因此检测了HCD122对RL和SU-DHL-4细胞系粘附分子表达的影响。在这些研究中，发现HCD122能抑制CD40L诱导RL和SU-DHL-4细胞系的CD54、CD86和CD95表达。RL细胞系的结果见图4。SU-DHL-4细胞系的结果见图5。

用显微术分析HCD122对CD40L诱导SU-DHL-4细胞聚集的影响，发现HCD122能抑制这种聚集。这些实验的结果见图6A-6D。图6A显示用人IgG1处理的细胞。图6B显示用HCD122处理的细胞。图6C显示用人IgG1和CD40L处理的细胞。图6D显示用HCD122和CD40L处理的细胞。

这些数据提示，CD40L可通过引起B细胞聚集而降低治疗药物例如CHOP的体内疗效，而用HCD122能防止这种聚集。这些数据有助于进一步阐明为什么H-CHOP联用能导致出乎预料强的体内抗肿瘤效力。

本发明所属领域的技术人员可从前文描述和相关附图中获益进而设想对这些发明作出许多改进和其它实施方案。因此，应该理解本发明不仅限于所公开的具体实施方案，这些改进形式和其它实施方案均包括在实施方式列表和所附权利要求书的范围内。虽然本文使用了特定的术语，但它们仅是以通用含义和描述含义使用而非限制目的。

将说明书中述及的所有出版物和专利申请全部纳入本文作参考，如同将每篇单独的出版物或专利申请特别和单独地纳入本文用作参考一样。

Claims

1.一种治疗B细胞肿瘤生长相关疾病或病症人类患者的方法，所述方法包括给予所述患者环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和强的松(CHOP)并联用抗-CD40抗体，其中所述抗-CD40抗体当与人B细胞表面CD40抗原结合时没有显著的激动活性，所述患者先前曾给予(i)CHOP，(ii)嵌合型抗-CD20单克隆抗体利妥昔单抗，或(iii)CHOP与利妥昔单抗联合治疗。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述疾病或病症是用(i)CHOP，(ii)嵌合型抗-CD20单克隆抗体利妥昔单抗，或(iii)CHOP与利妥昔单抗联合治疗难治的疾病。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述患者用(i)CHOP，(ii)嵌合型抗-CD20单克隆抗体利妥昔单抗治疗，或(iii)CHOP与利妥昔单抗联合治疗后疾病复发。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，同时给予患者CHOP和抗-CD40抗体。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，依次给予患者CHOP和抗-CD40抗体。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，给予患者第一轮CHOP，然后给予患者第一剂抗-CD40抗体。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，给予患者第一剂抗-CD40抗体，然后给予患者第一轮CHOP。

8.一种药物组合物，其包含(i)环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和强的松中的一种或多种，(ii)抗-CD40抗体，和(iii)药学上可接受的运载体或赋形剂，其中所述抗-CD40抗体当与人B细胞表面CD40抗原结合时没有显著的激动活性。

9.(i)环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和强的松中的一种或多种和(ii)抗-CD40抗体在制造用于治疗B细胞肿瘤生长相关疾病或病症人类患者的药物中的应用，其中所述抗-CD40抗体当与人B细胞表面CD40抗原结合时没有显著的激动活性，所述患者先前曾给予(i)CHOP，(ii)嵌合型抗-CD20单克隆抗体利妥昔单抗，或(iii)CHOP与利妥昔单抗联合治疗。

10.(i)环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和强的松中的一种或多种和(ii)抗-CD40抗体在制造用于B细胞肿瘤生长相关疾病或病症人类患者联合治疗的至少两种单独药物中的应用，其中所述抗-CD40抗体当与人B细胞表面CD40抗原结合时没有显著的激动活性，所述患者先前曾给予(i)CHOP，(ii)嵌合型抗-CD20单克隆抗体利妥昔单抗，或(iii)CHOP与利妥昔单抗联合治疗。

11.一种治疗B细胞肿瘤生长相关疾病或病症人类患者的药盒，所述药盒装有：

(i)环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和强的松中的一种或多种；和(ii)抗-CD40抗体，其中所述抗-CD40抗体当与人B细胞表面CD40抗原结合时没有显著的激动活性

12.如上述权利要求中任一项所述的方法、组合物、应用或药盒，其特征在于，所述疾病或病症选自：急性淋巴母细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、幼淋巴细胞白血病(PLL)、小淋巴细胞白血病(SLL)、弥散性小淋巴细胞白血病(DSLL)、弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、毛细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、EB病毒(EBV)诱导的淋巴瘤、骨髓瘤如多发性骨髓瘤、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链病、粘膜相关淋巴样组织淋巴瘤、单核细胞样B细胞淋巴瘤、脾脏淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病、血管内淋巴瘤病、免疫母细胞淋巴瘤和AIDS相关淋巴瘤。

13.如权利要求12所述的方法、组合物、应用或药盒，其特征在于，所述疾病或病症是非霍奇金淋巴瘤。

14.如权利要求13所述的方法、组合物、应用或药盒，其特征在于，所述非霍奇金淋巴瘤是弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。

15.如上述权利要求中任一项所述的方法、组合物、应用或药盒，其特征在于，所述抗-CD40抗体是结合人CD40抗原结构域2的单克隆抗体。

16.如上述权利要求中任一项所述的方法、组合物、应用或药盒，其特征在于，所述抗-CD40抗体是结合含有SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9所示人CD40序列残基82-87表位的单克隆抗体。

17.如上述权利要求中任一项所述的方法、组合物、应用或药盒，其特征在于，所述抗-CD40抗体选自：

a)保藏于ATCC的专利保藏物编号PTA-5543的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体HCD122，；

b)包含选自以下氨基酸序列：SEQ ID NO：2所示序列、SEQ ID NO：4所示序列、SEQ ID NO：5所示序列、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4所示二序列以及SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5所示二序列的抗体；

c)包含选自以下氨基酸序列：SEQ ID NO：17所示序列、SEQ ID NO：19所示序列、SEQ ID NO：20所示序列、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：19所示二序列以及SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：20所示二序列的抗体；

d)包含选自以下氨基酸序列：SEQ ID NO：16所示序列、SEQ ID NO：18所示序列以及SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：18所示二序列的抗体；

e)含有选自以下核苷酸序列：SEQ ID NO：1所示序列、SEQ ID NO：3所示序列以及SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示二序列的核酸分子编码的氨基酸序列的抗体；

g)含有包含SEQ ID NO：13所示的CDR-H1氨基酸序列、SEQ ID NO：14所示的CDR-H2氨基酸序列以及SEQ ID NO：15所示的CDR-H3氨基酸序列的重链可变区(V_H)的抗体；和

h)含有包含SEQ ID NO：10所示CDR-L1氨基酸序列、SEQ ID NO：11所示CDR-L2氨基酸序列和SEQ ID NO：12所示CDR-L3氨基酸序列的轻链可变区(V_L)，和包含SEQ ID NO：13所示CDR-H1氨基酸序列、SEQ ID NO：14所示CDR-H2氨基酸序列和SEQ ID NO：15所示CDR-H3氨基酸序列的重链可变区(V_H)的抗体。

18.如权利要求1-17中任一项所述的方法、组合物、应用或药盒，其特征在于，所述抗-CD40抗体获自含有一种或多种编码该抗体的表达载体的CHO细胞。

19.如上述权利要求中任一项所述的方法、组合物、应用或药盒，其特征在于，所述抗-CD40抗体是保藏于ATCC的专利保藏物编号PTA-5543的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体HCD122(CHIR-12.12)。

20.如权利要求1-18中任一项所述的方法、组合物、应用或药盒，其特征在于，所述抗-CD40抗体是选自以下的抗原结合抗体片段：Fab片段、F(ab′)₂片段和Fv片段，其中所述片段当与人B细胞表面CD40抗原结合时没有显著的激动活性。

21.一种防止或降低人B肿瘤细胞对CHOP细胞毒性产生耐药方法，所述方法包括使一种或多种人B肿瘤细胞接触抗-CD40抗体的步骤，其中所述抗-CD40抗体当与人B细胞表面CD40抗原结合时没有显著的激动活性。

22.一种防止或降低人类患者B细胞对CHOP细胞毒性产生耐药方法，所述方法包括给予所述患者抗-CD40抗体的步骤，其中所述抗-CD40抗体当与人B细胞表面CD40抗原结合时没有显著的激动活性。

23.如上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述抗CD40抗体能下调B细胞中CD40信号传导所诱导的有助于B细胞对CHOP细胞毒性产生耐药的NF-kB活化。

24.如上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述抗CD40抗体能抑制B细胞中CD40信号传导诱导的有助于B细胞对CHOP细胞毒性产生耐药的一种或多种细胞表面粘附分子的表达。

25.如上述权利要求中任一项所述的组合物、应用或药盒，其特征在于，所述抗CD40抗体是能够下调B细胞中CD40信号传导诱导的有助于B细胞对CHOP细胞毒性产生耐药的NF-kB活化的抗CD40抗体。

26.如上述权利要求中任一项所述的组合物、应用或药盒，其特征在于，所述抗CD40抗体是能够抑制B细胞中CD40信号传导诱导的有助于B细胞对CHOP细胞毒性产生耐药的一种或多种细胞表面粘附分子表达的抗CD40抗体。