PL214289B1 - Przeciwcialo monoklonalne lub jego czesc wiazaca antygen przeciwko CD40 i jego zastosowanie do leczenia raka - Google Patents

Przeciwcialo monoklonalne lub jego czesc wiazaca antygen przeciwko CD40 i jego zastosowanie do leczenia raka

Info

Publication number
PL214289B1
PL214289B1 PL370514A PL37051402A PL214289B1 PL 214289 B1 PL214289 B1 PL 214289B1 PL 370514 A PL370514 A PL 370514A PL 37051402 A PL37051402 A PL 37051402A PL 214289 B1 PL214289 B1 PL 214289B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
antibody
antibodies
amino acid
sequence
seq
Prior art date
Application number
PL370514A
Other languages
English (en)
Other versions
PL370514A1 (pl
Inventor
Vahe Bedian
Ronald P. Gladue
Jose Corvalan
Xiao-Chi Jia
Xiao Feng
Original Assignee
Amgen Fremont Inc
Pfizer Prod Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=23370387&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL214289(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Amgen Fremont Inc, Pfizer Prod Inc filed Critical Amgen Fremont Inc
Publication of PL370514A1 publication Critical patent/PL370514A1/pl
Publication of PL214289B1 publication Critical patent/PL214289B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
    • A61N5/00—Radiation therapy
    • A61N5/06—Radiation therapy using light
    • A61N5/0613—Apparatus adapted for a specific treatment
    • A61N5/062—Photodynamic therapy, i.e. excitation of an agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
    • A61N5/00—Radiation therapy
    • A61N5/10—X-ray therapy; Gamma-ray therapy; Particle-irradiation therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/117—Nucleic acids having immunomodulatory properties, e.g. containing CpG-motifs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 214289 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 370514 (51) Int.Cl.
(22) Data zgłoszenia: 08.11.2002 C07K 16/28 (2006.01) A61P 35/00 (2006.01) (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:
08.11.2002, PCT/US02/036107 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:
15.05.2003, WO03/040170
Przeciwciało monoklonalne lub jego część wiążąca antygen przeciwko CD40 i jego zastosowanie do leczenia raka
(73) Uprawniony z patentu:
PFIZER PRODUCTS INC., Groton, US
(30) Pierwszeństwo: AMGEN FREMONT INC., Fremont, US
09.11.2001, US, 60/348,980 (72) Twórca(y) wynalazku:
(43) Zgłoszenie ogłoszono: 30.05.2005 BUP 11/05 VAHE BEDIAN, East Lyme, US RONALD P. GLADUE, Stonington, US JOSE CORVALAN, Foster City, US XIAO-CHI JIA, San Mateo, US
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono: XIAO FENG, Union City, US
31.07.2013 WUP 07/13 (74) Pełnomocnik:
rzecz. pat. Magdalena Tagowska
PL 214 289 B1
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest przeciwciało monoklonalne lub jego część wiążąca antygen przeciwko CD40 i jego zastosowanie
Antygen CD40 jest glikoproteiną o wielkości 50 kDa występującą na powierzchni komórki, należącą do rodziny receptora czynnika martwicy nowotworu (TNF-R) (Stamenkovic i wsp., EMBO J. 8: 1403-10 (1989)). CD40 jest wyrażany w wielu typach komórek prawidłowych i nowotworowych, w tym również w limfocytach B, komórkach dendrytycznych, monocytach, makrofagach, nabłonku grasicy, komórkach śródbłonkowych, fibroblastach i komórkach mięśni gładkich (Paulie S. i wsp., Cancer Immunol. Immunother. 20: 23-8 (1985); Banchereau J. i wsp., Adv. Exp. Med. & Biol. 378: 79-83 (1995); Alderson M. R. i wsp., J. of Exp. Med. 178: 669-74 (1993); Ruggiero G. i wsp., J. of Immunol. 156: 3737-46 (1996); Hollenbaugh D. i wsp., J. of Exp. Med. 182: 33-40 (1995); Yellin M. J. i wsp., J. of Leukocyte Biol. 58: 209-16 (1995); Lazaar A. L. i wsp., J. of Immunol. 161: 3120-7 (1998)). CD40 jest wyrażany we wszystkich chłoniakach typu B i w 70% wszystkich guzów litych. Chociaż jest wyrażany konstytutywnie, wytwarzanie CD40 wzrasta w komórkach prezentujących antygen w wyniku regulacji przez sygnały dojrzewania, takie jak LPS, IL-Ιβ, IFN-γ i GM-CSF.
Aktywacja CD40 pełni kluczową rolę w regulacji humoralnej i komórkowej odpowiedzi immunologicznej. Prezentacja antygenu bez aktywacji CD40 może prowadzić do tolerancji, podczas gdy przekazywanie sygnału przez CD40 może odwrócić taką tolerancję, zwiększyć prezentację antygenu przez wszystkie komórki prezentujące antygen (APC, ang. antigen presenting cell), prowadzić do wydzielania pomocniczych cytokin i chemokin, zwiększyć ekspresję cząsteczek ko-stymulujących i przekazywanie sygnałów oraz stymulować aktywność cytolityczną komórek odpornościowych.
CD40 odgrywa kluczową rolę w proliferacji komórek B, ich dojrzewaniu i zmianie klas. (Foy T. M. i wsp., Ann. Rev of Immunol. 14: 591-617 (1996)). Przerwanie szlaku przekazywania sygnału przez CD40 prowadzi do nieprawidłowej dystrybucji izotypów immunoglobulin surowicy, braku preaktywacji komórek CD4+ T i zaburzeń w drugorzędowych odpowiedziach humoralnych. Przykładowo, sprzężony z chromosomem X zespół hiper-IgM jest chorobą związaną z mutacją w ludzkim genie CD40L, charakteryzującą się niemożnością wytwarzania przez osobniki nią dotknięte przeciwciał innych niż te o izotypie IgM, co wskazuje, że do skutecznej odpowiedzi immunologicznej wymagane jest efektywne współdziałanie pomiędzy CD40 i CD40L.
Rekrutacja CD40 przez CD40L prowadzi do połączenia cytoplazmatycznej domeny CD40 z TRAF (czynniki związane z TNF-R, ang. TNF-R associated factors) (Lee H. H. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 1421-6 (1999); Pullen S. S. i wsp., Biochemistry 37: 11836-45 (1998); Grammar A.C. i wsp., J. of Immunol. 161: 1183-93 (1998); Ishida T. K. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9437-42 (1996); Pullen S. S. i wsp., J. of Biol. Chem. 274: 14246-54 (1999)). Oddziaływanie z TRAF może osiągać punkt kulminacyjny przez aktywację dwóch szlaków NFkB i Jun/APl (Tsukamoto N. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 1234-9 (1999); Sutherland C. L. i wsp., J. of Immunol. 162: 4720-30 (1999)). Zależnie od typu komórki, przekazanie sygnału prowadzi do zwiększenia wydzielania cytokin, takich jak IL-6 (Jeppson J. D. i wsp., J. of Immunol. 161: 1738-42 (1998); Uejima Y. i wsp., Int. Arch, of Allergy & Immunol. 110: 225-32 (1996)), IL-8 (Gruss H. J. i wsp., Blood 84: 2305-14 (1994); von Leoprechting A. i wsp., Cancer Res. 59: 1287-94 (1999); Denfeld R. W. i wsp., Europ. J. of Immunol. 26: 2329-34 (1996)), IL-12 (Celia M. i wsp., J. of Exp. Med. 184: 747-52 (1996); Ferlin W. G. i wsp., Europ. J. of Imunol. 28: 525-31 (1998); Armant M. i wsp., Europ. J. of Immunol. 26: 1430-4 (1996); Koch F. i wsp., J. of Exp. Med. 184: 741-6 (1996); Seguin R. i L. H. Kasper, J. of Infect. Diseases 179: 467-74 (1999); Chaussabel D. i wsp., Infection & Immunity 67: 1929-34 (1999)), IL-15 (Kuniyoshi J. S. i wsp., Cellular Immunol. 193: 48-58 (1999)) i chemokin (ΜΙΡ1α, ΜΙΡΙβ, RANTES i inne), (McDyer J. F. i wsp., J. of Immunol. 162: 3711-7 (1999); Schaniel C. i wsp., J. of Exp. Med. 188: 451--63 (1988); Altenburg A. i wsp., J. of Immunol. 162: 4140-7 (1999); Deckers J. G. i wsp., J. of the Am. Society of Nephrology 9: 1187-93 (1998)), zwiększonej ekspresji MHC klasy I i II (SantosArgumedo L. i wsp., Cellular Immunol. 156: 272-85 (1994)) i zwiększonego wytwarzania cząsteczek adhezyjnych (np. ICAM) (Lee H. H. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 1421-6 (1999); Grousson J. i wsp., Archives of Dermatol. Res. 290: 325-30 (1998); Katada Y. i wsp., Europ. J. of Immunol. 26: 192200 (1996); Mayumi M. i wsp., J. of Allergy & Clin. Immunol. 96: 1136-44 (1995); Flores-Romo L. i wsp., Immunol. 79: 445-51 (1993)) i cząsteczek ko-stymulujących (np. B7) (Roy M. i wsp., Europ. J. of Immunol. 25: 596-603 (1995); Jones K. W. i C. J. Hackett, Cellular Immunol. 174: 42-53 (1996); Caux
PL 214 289 B1
C. i wsp., Journal of Exp. Med. 180: 1263-72 (1994); Kiener P. A. i wsp., J. of Immunol. 155: 4917-25 (1995)). Cytokiny indukowane przez zaangażowanie CD40 zwiększają przeżycie i aktywację komórek T.
Dodatkowo, oprócz zwiększenia funkcji komórkowej i immunologicznej, skutki aktywacji CD40 obejmują: rekrutowanie i różnicowanie przez chemokiny i cytokiny; aktywację monocytów; podniesienie aktywności cytolitycznej limfocytów T cytolitycznych (CTL, ang. cytolytic T lymphocyte) i komórek naturalnych zabójców (NK, ang. natural killer); indukowanie apoptozy w nowotworach dodatnich względem CD40; podniesienie immunogenności nowotworów dodatnich względem CD40 i wytwarzanie przeciwciał specyficznych wobec nowotworu. Rola aktywacji CD40 w odpowiedziach immunologicznych za pośrednictwem komórek jest również dobrze poznana i została opisana w: Grewal i wsp., Ann. Rev. of Immunol. 16: 111-35 (1998); Mackey i wsp., J. of Leukocyte Biol. 63: 418-28 (1998) i Noelle R. J., Agents & Actions - Suppl. 49: 17-22 (1998).
Badania z zastosowaniem układu modelu krzyżowej preaktywacji wykazały, że aktywacja APC przez CD40 może zamienić wymagane pomocnicze komórki T na pokolenie limfocytów T cytolitycznych (CTL) (Bennett i wsp., Nature 393: 478-480 (1998)). Z doświadczeń na myszach z niedoborem CD40L jasno wynika wymóg przekazania sygnału przez CD40 w preaktywacji komórek T pomocniczych. (Grewal I. S. i wsp., Science 273: 1864-7 (1996); Grewal I. S. i wsp., Nature 378: 617-20 (1995)). Aktywacja CD40 przekształca skądinąd tolerogenne, niosące antygeny komórki B w kompetentne APC. (Buhlmann J. E. i wsp., Immunity 2: 645-53 (1995)). Aktywacja CD40 indukuje dojrzewanie i różnicowanie komórek macierzystych krwi z pępowiny do komórek dendrytycznych. (FloresRomo L. i wsp., J. of Exp. Med. 185: 341-9 (1997); Mackey M. F. i wsp., J. of Immunol. 161: 2094-8 (1998)). Aktywacja CD40 indukuje również różnicowanie monocytów do funkcjonalnych komórek dendrytycznych. (Brossart P. i wsp., Blood 92: 4238-47 (1998)). Ponadto, aktywacja CD40 zwiększa aktywność cytolityczną komórek NK przez cytokiny indukowane APC-CD40. (Carbone E. i wsp., J. of Exp. Med. 185: 2053-60 (1997); Martin-Fontecha A. i wsp., J. of Immunol: 162: 5910-6 (1999)). Obserwacje te wskazują na to, że CD40 odgrywa istotną rolę w wywoływaniu i wzmacnianiu odpowiedzi immunologicznych przez indukowanie dojrzewania APC, wydzielanie pomocniczych cytokin, podwyższoną regulację cząsteczek ko-stymulujących i wzmocnienie funkcji efektorowych.
Ważna rola, jaką pełni przekazywanie sygnału przez CD40 w wywoływaniu i dojrzewaniu humoralnych i cytotoksycznych odpowiedzi immunologicznych czyni z tego układu idealny cel do zwiększania odporności. Zwiększanie to może być szczególne ważne we wzmacnianiu skutecznych odpowiedzi immunologicznych wobec antygenów nowotworowych, które są na ogół prezentowane układowi immunologicznemu przez krzyżową preaktywację aktywowanych APC (Huang A. Y. i wsp., Ciba Foundation Symp. 187: 229-44 (1994); Toes R. E. M. i wsp., Seminars in Immunol. 10: 443-8 (1998); Albert M. L. i wsp., Nature 392: 86-9 (1998); Bennett S. R. i wsp., J. of Exp. Med. 186: 65-70 (1997)).
Kilka grup badawczych wykazało skuteczność aktywacji CD40 w odpowiedziach przeciwnowotworowych in vitro i in vivo (Toes R. E. M. i wsp., Seminars in Immunol. 10: 443-8 (1998)). Dwie grupy, stosując modele z przerzutami do płuc raka komórek nerkowych i guzów podskórnych w komórkach transformowanych wirusem, wykazały niezależnie, że aktywacja CD40 może odwrócić tolerancję na antygeny specyficzne dla nowotworów, dając w efekcie skuteczną przeciwnowotworową preaktywację komórek T. (Sotomayor E. M. i wsp., Nature Medicine 5: 780-787 (1999); Diehl L. i wsp., Nature Medicine 5: 774-9 (1999)). Istnieje również doniesienie o aktywności przeciwnowotworowej leczenia za pomocą CD40L i przeciwciałami anty-CD40 w modelu linii ludzkiego raka sutka u myszy SCID, w nieobecności komórek immunologicznych. (Hirano A. i wsp., Blood 93: 2999-3007 (1999)). Ostatnio wykazano, że aktywacja CD40 przez przeciwciała anty-CD40, eliminuje CD40+ i chłoniaki CD40 w modelach mysich. (French R. R. i wsp., Nature Medicine 5: 548-53 (1999)). Ponadto, wcześniejsze badania prowadzone przez Glennie i wsp. wykazały, że aktywność przekazywania sygnału przez przeciwciała anty-CD40 jest skuteczniejsza w indukowaniu klirensu nowotworu in vivo, niż w przypadku innych, zdolnych do rekrutacji efektorów przeciwciał przeciwko markerom powierzchniowym. (Tutt A. L. i wsp., J. of Immunol. 161: 3176-85 (1998)). Zgodnie z tymi obserwacjami, kiedy badano przeciwciała anty-CD40 pod względem aktywności wobec komórek nowotworowych CD40+ in vivo, większość, ale nie cała aktywność nowotworobójcza, była związana raczej z przekazywaniem sygnału przez CD40 niż z ADCC. (Funakoshi S. i wsp., J. of Immunotherapy with Emphasis on Tumor Immunol. 19:93-101 (1996)). W innym badaniu, komórki dendrytyczne (DC) szpiku kostnego poddawano ex vivo działaniu różnych czynników i badano aktywność przeciwnowotworową in vivo. Badania te wykazały, że DC stymulowane przez CD40L były najbardziej dojrzałymi i najbardziej skutecznymi komórkami, wzmagającymi odpowiedź przeciwnowotworową.
PL 214 289 B1
Kluczową rolę CD40 w odporności przeciwnowotworowej wykazano również przez porównanie odpowiedzi myszy typu dzikiego i CD40-/- na szczepionki nowotworowe. Badania te pokazują, że myszy CD40-/- są niezdolne do osiągnięcia odporności przeciwnowotworowej, obserwowanej u myszy prawidłowych (Mackey M. F. i wsp., Cancer Research 57: 2569- 74 (1997)). W innym badaniu, wykazano że splenocyty myszy niosących nowotwór stymulowane komórkami nowotworowymi i traktowane ex vivo aktywującymi przeciwciałami przeciwko CD40, mają podniesioną specyficzną wobec nowotworu aktywność CTL (Donepudi M. i wsp., Cancer Immunol. Immunother. 48: 153-164 (1999)). Badania te wykazały, że CD40 odgrywa kluczową rolę w odporności przeciwnowotworowej, zarówno w nowotworach dodatnich względem CD40 jak i ujemnych.
Ponieważ CD40 jest wyrażany w chłoniakach, białaczkach, szpiczaku mnogim, w większości raków noso-gardzieli, pęcherza, jajnika, wątroby i w niektórych rakach sutka oraz okrężnicy i odbytu, aktywacja CD40 może wykazywać szeroki zakres zastosowań klinicznych.
Aktywujące przeciwciała monoklonalne anty-CD40 mogą przyczyniać się do usuwania nowotworu za pośrednictwem kilku ważnych mechanizmów. Najważniejszy spośród nich to aktywacja komórek dendrytycznych gospodarza, w celu wzmagania przetwarzania antygenów nowotworowych i ich prezentacji, jak również zwiększenia prezentacji antygenu lub immunogenności samych dodatnich względem CD40 komórek nowotworowych, co prowadzi do aktywacji specyficznych wobec nowotworów limfocytów CD4+ i CD8+. Dodatkowa aktywność przeciwnowotworowa może odbywać się zarówno za pośrednictwem innych efektów przekazywania sygnału przez CD40 wzmagających odporność (wytwarzanie chemokin i cytokin, rekrutacja i aktywacja monocytów oraz wzmacnianie aktywności cytolitycznej CTL i NK), jak i przez bezpośrednie zabijanie nowotworów CD40+ przez indukcję apoptozy lub przez stymulowanie humoralnej odpowiedzi prowadzącej do ADCC. Przechodzące apoptozę i obumierające komórki nowotworowe mogą również stać się ważnym źródłem antygenów specyficznych wobec nowotworów, przetwarzanych i prezentowanych przez APC, aktywowane za pośrednictwem CD40.
Zgodnie z tym, istnieje zapotrzebowanie na terapeutyczne, klinicznie istotne, agonistyczne przeciwciała anty-CD4 O.
Krótki opis rysunków
Figury 1A-1H są przyrównaniami przewidywanych sekwencji aminokwasowych izolowanych zmiennych domen lekkiego i ciężkiego łańcucha monoklonalnego przeciwciała anty-CD40 z sekwencjami aminokwasowymi linii zarodkowej (linii germinalnej, ang. germline) odpowiadającymi genowi łańcucha lekkiego i ciężkiego. Różnice pomiędzy sekwencją klonów i linii zarodkowej zaznaczono przez zacieniowanie. Podkreślono sekwencje linii zarodkowej CDR1, CDR2 i CDR3. W przyrównaniu sekwencji łańcucha ciężkiego, oczywiste insercje w regionie CDR3 zaznaczono za pomocą myślnika (-) w sekwencji linii zarodkowej, a oczywiste delecje w regionie CDR3 zaznaczono za pomocą myślnika (-) w sekwencji klonu.
Figura 1A: przewidywane sekwencje aminokwasowe zmiennego regionu lekkiego łańcucha kappa przeciwciała monoklonalnego (mAb) 3.1.1 i 7.1.2 z sekwencjami aminokwasowymi VK = A3/A19 i J = Jk1 genu linii zarodkowej.
Figura 1B: przewidywana sekwencja aminokwasowa zmiennego regionu lekkiego łańcucha kappa z klonu 15.1.1 i sekwencja aminokwasowa linii zarodkowej (VK = A3/A19 i J = JK2);
Figura 1C: przewidywane sekwencje aminokwasowe zmiennego regionu lekkiego łańcucha kappa mAb 10.8.3 i 21.4.1 i sekwencja aminokwasowa linii zarodkowej (VK = L5 (DP5) i J = JK4);
Figura 1D: przewidywana sekwencja aminokwasowa zmiennego regionu łańcucha ciężkiego mAb 3.1.1 i sekwencja aminokwasowa linii zarodkowej (VH = 3+30+(DP-49), D = D4 + DIR3 i J = JH6);
Figura 1E: przewidywana sekwencja aminokwasowa zmiennego regionu łańcucha ciężkiego mAb 7.1.2 i sekwencja aminokwasowa linii zarodkowej (VH = 3+30+(DP-49), D = DIR5+D1-26 i J = JH6);
Figura 1F: przewidywane sekwencje aminokwasowe łańcucha ciężkiego mAb 10.8.3 i sekwencja aminokwasowa linii zarodkowej (VH = 4,35 (VIV-4), D = DIR3 i J = JH6);
Figura 1G: przewidywane sekwencje aminokwasowe zmiennego regionu łańcucha ciężkiego mAb 15.1.1 i sekwencja aminokwasowa linii zarodkowej (VH = 459 (DP-71), D = D4-23 i J = JH4) oraz
Figura 1H: przewidywane sekwencje aminokwasowe zmiennego regionu łańcucha ciężkiego mAb 21.4.1 i sekwencja aminokwasowa linii zarodkowej (VH = 1-02 (DP-75), D = DLR1 i J = JH4).
Figury 2A-2H są przyrównaniami przewidywanych sekwencji aminokwasowych izolowanych zmiennych domen lekkiego i ciężkiego łańcucha monoklonalnego przeciwciała anty-CD40 z sekwenPL 214 289 B1 cjami aminokwasowymi linii zarodkowej odpowiadającymi genowi łańcucha lekkiego i ciężkiego. Różnice pomiędzy sekwencją klonów i linii zarodkowej zaznaczono pogrubioną czcionką. Podkreślono sekwencje linii zarodkowej CDR1, CDR2 i CDR3. W przyrównaniu sekwencji łańcucha ciężkiego, oczywiste insercje w regionie CDR3 zaznaczono za pomocą myślnika (-) w sekwencji linii zarodkowej, a oczywiste delecje w regionie CDR3 zaznaczono za pomocą myślnika (-) w sekwencji klonu.
Figura 2A: przewidywane sekwencje aminokwasowe lekkiego łańcucha kappa mAb 22.1.1, 23.5.1 i 23.29.1 i sekwencja aminokwasowa linii zarodkowej (VK = A3/A19 i J = JK1);
Figura 2B: przewidywana sekwencja aminokwasowa lekkiego łańcucha kappa z mAb 21.2.1 i sekwencja aminokwasowa linii zarodkowej (VK = A3/A19 i J = JK3);
Figura 2C: przewidywane sekwencje aminokwasowe lekkiego łańcucha kappa mAb 23.28.1, 23.28.1L-C92A i 24.2.1 i sekwencja aminokwasowa linii zarodkowej (VK = A27 i J = JK3);
Figura 2D: przewidywana sekwencja aminokwasowa łańcucha ciężkiego mAb 21.2.1 i sekwencja aminokwasowa linii zarodkowej (VH = 3-30+, D = DIR3+D6-19 i J = JH4);
Figura 2E: przewidywana sekwencja aminokwasowa łańcucha ciężkiego mAb 22.1.1, 22.1.1H-C109A i sekwencja aminokwasowa linii zarodkowej (VH = 3-30+, D = D1-1 i J = JH6);
Figura 2F: przewidywana sekwencja aminokwasowa łańcucha ciężkiego mAb 23.5.1 i sekwencja aminokwasowa linii zarodkowej (VH = 3-30+, D = D4-17 i J = JH6);
Figura 2G: przewidywana sekwencja aminokwasowa łańcucha ciężkiego mAb 23.29.1 i sekwencja aminokwasowa linii zarodkowej (VH = 3-30,3, D = D4-17 i J = JH6) i
Figura 2H: przewidywane sekwencje aminokwasowe łańcucha ciężkiego mAb 23.28.1, 23.28.1H-D16E i 24.2.1 i sekwencja aminokwasowa linii zarodkowej (VH = 4-59, D = D1R1+D4-17 i J = JH5).
Figura 3 jest krzywą zależności odpowiedzi od dawki, ilustrującą zdolność przeciwciała antyCD40 według wynalazku (21.4.1) do zwiększenia wytwarzania IL-12p40 przez ludzkie komórki dendrytyczne.
Figura 4 jest krzywą zależności odpowiedzi od dawki, ilustrująca zdolność przeciwciała antyCD40 według wynalazku (21.4.1) do zwiększenia wytwarzania IL-12p70 przez ludzkie komórki dendrytyczne.
Figura 5 jest wykresem ilustrującym zdolność przeciwciała anty-CD40 według wynalazku (21.4.1) do podniesienia immunogenności komórek stymulujących Jy i do wzmocnienia aktywności CTL wobec komórek docelowych Jy.
Figura 6 jest krzywą hamowania wzrostu nowotworu, ilustrującą zredukowany wzrost nowotworów Daudi, dodatnich względem CD40, u beżowych myszy SCID, traktowanych przeciwciałem antyCD40 według wynalazku (21.4.1).
Figura 7 jest krzywą hamowania wzrostu nowotworu, ilustrującą zredukowany wzrost nowotworów K562 ujemnych względem CD40, u beżowych myszy SCID, traktowanych przeciwciałem antyCD40 według wynalazku (21.4.1) oraz ludzkimi komórkami dendrytycznymi i komórkami T.
Figura 8 przedstawia hamowanie wzrostu nowotworów K562 ujemnych względem CD40 u myszy SCID, pod wpływem różnych stężeń agonistycznego mAb 23.29.1 anty-CD40.
Figura 9 przedstawia hamowanie wzrostu CD40 ujemnych nowotworów K562 u myszy SCID, pod wpływem różnych stężeń agonistycznego mAb 3.1.1 anty-CD40.
Figura 10 przedstawia hamowanie wzrostu dodatnich względem CD40 nowotworów Raji, w obecności i pod nieobecność komórek T i komórek dendrytycznych u myszy SCID, pod wpływem agonistycznego mAb anty-CD40.
Figura 11 przedstawia hamowanie wzrostu nowotworów Raji dodatnich względem CD40 u myszy SCID, pod wpływem agonistycznych przeciwciał anty-CD40.
Figura 12 przedstawia hamowanie wzrostu komórek raka sutka BT 474 u beżowych myszy SCID, pod wpływem agonistycznych przeciwciał anty-CD40.
Figura 13 przedstawia hamowanie wzrostu nowotworów prostaty PC-3 u beżowych myszy SCID, pod wpływem agonistycznych przeciwciał anty-CD40.
Figura 14 przedstawia krzywą przeżycia beżowych myszy SCID, którym wstrzyknięto (iv - dożylnie) komórki nowotworowe Daudi i które leczono agonistycznymi przeciwciałami anty-CD40.
Figura 15 przedstawia analizę typu Western biot agonistycznych przeciwciał anty-CD40 względem zredukowanego (R) i nie-redukowanego (NR) ludzkiego CD40.
Figura 16 przedstawia uszeregowanie domen D1-D4 mysiego i ludzkiego CD40.
PL 214 289 B1
Figura 17 przedstawia przyrównanie sekwencji aminokwasowych mysiego i ludzkiego CD40, pokazujące miejsca fuzji w chimerach.
Figura 18 przedstawia grupę schematycznych diagramów konstruktów chimerycznych CD40.
Streszczenie wynalazku
Wynalazek dostarcza przeciwciała monoklonalnego lub jego części wiążącej antygen, które swoiście wiąże się z i aktywuje ludzki CD40, przy czym przeciwciało obejmuje łańcuch ciężki i łańcuch lekki, a łańcuch ciężki zawiera sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha ciężkiego przeciwciała 21.4.1 (nr depozytu ATCC PTA-3605) i łańcuch lekki zawiera sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha lekkiego przeciwciała 21.4.1.
Korzystnie, przeciwciało lub jego część wiążąca antygen według wynalazku obejmuje łańcuch ciężki zawierający domenę zmienną łańcucha ciężkiego przeciwciała 21.4.1 (nr depozytu ATCC PTA-3605) i łańcuch lekki zawierający domenę zmienną łańcucha lekkiego przeciwciała 21.4.1.
Korzystnie, przeciwciało według wynalazku jest przeciwciałem 21.4.1 (nr depozytu ATCC PTA3605) lub przeciwciałem o takich samych sekwencjach aminokwasowych jak 21.4.1.
Korzystnie, sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha ciężkiego przeciwciała według wynalazku stanowią sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 z SEKW. NR ID.: 42, a CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha lekkiego przeciwciała według wynalazku stanowią sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 z SEKW. NR ID.: 44.
W szczególnie korzystnej postaci wykonania przeciwciało lub część wiążąca antygen według wynalazku obejmuje łańcuch ciężki zawierający sekwencję aminokwasową z SEKW. NR ID.: 42 i łańcuch lekki zawierający sekwencję aminokwasową z SEKW. NR ID.: 44.
Korzystnie przeciwciało monoklonalne według wynalazku obejmuje:
a) sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEKW. NR ID.: 46 bez sekwencji sygnałowej oraz
b) sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEKW. NR ID.: 48 bez sekwencji sygnałowej.
Korzystniej, przeciwciało monoklonalne według wynalazku zawiera łańcuch ciężki przeciwciała składający się z SEKW. NR ID.: 46 bez sekwencji sygnałowej i łańcuch lekki przeciwciała składający się z SEKW. NR ID.: 48 bez sekwencji sygnałowej.
Przeciwciało monoklonalne lub jego część wiążąca antygen według wynalazku wykazują przynajmniej jedną właściwość wybraną z następującej grupy:
a) współzawodniczy krzyżowo o wiązanie CD40 z przeciwciałem 21.4.1 (nr depozytu ATCC PTA-3605);
b) wiąże się z tym samym epitopem CD40 co przeciwciało 21.4.1;
c) wiąże CD40 z zasadniczo taką samą stałą KD, co przeciwciało 21.4.1; oraz
d) wiąże CD40 z zasadniczo taką samą stałą Koff, co przeciwciało 21.4.1.
Wynalazek dotyczy także zastosowania przeciwciała lub części wiążącej antygen weług wynalazku do wytwarzania leku do leczenia raka u człowieka tego potrzebującego.
Szczegółowy opis wynalazku
Definicje i ogólne techniki
Naukowe i techniczne terminy zastosowane w odniesieniu do niniejszego wynalazku powinny mieć znaczenie powszechnie rozumiane przez specjalistów w dziedzinie, o ile nie zdefiniowano ich niniejszym w inny sposób. Ponadto, o ile nie wymaga tego kontekst, określenia w liczbie pojedynczej odnoszą się do przedmiotów w liczbie mnogiej, a określenia w liczbie mnogiej obejmują przedmioty w liczbie pojedynczej. Ogólnie, techniki oraz nazewnictwo stosowane niniejszym w odniesieniu do hodowli komórkowej i tkankowej, biologii molekularnej, immunologii, mikrobiologii, genetyki chemii białek i kwasów nukleinowych oraz hybrydyzacji są dobrze znane i powszechnie stosowane w dziedzinie.
Sposoby i techniki przedstawione poniżej są zazwyczaj prowadzone zgodnie z klasycznymi, dobrze znanymi w dziedzinie, sposobami i tak jak to opisano w ogólnej i bardziej szczegółowej literaturze, która jest cytowana w niniejszym szczegółowym opisie, o ile nie zaznaczono inaczej. Zobacz np. Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 wyd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) i Ausubel i wsp., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992) oraz Harlow i Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laoratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1990). Reakcje enzymatyczne i techniki oczyszczania są wykonywane zgodnie z zaleceniami producentów, jak powszechnie wykonuje się je w dziedzinie lub jak to tutaj opisano. Procedury i techniki laboratoryjne oraz nazewnictwo stosowane tutaj w odniesieniu do chemii analitycznej, syntezy organicznej oraz chemii medycznej i farmaceutyczPL 214 289 B1 nej są dobrze znane i powszechnie stosowane w dziedzinie. Zastosowano standardowe techniki syntez chemicznych, analiz chemicznych, przygotowania farmaceutycznych preparatów, formulacji oraz dostarczenia farmaceutycznego i leczenia pacjentów.
Następujące terminy, o ile nie zaznaczono inaczej, powinny być rozumiane w następującym znaczeniu.
Termin „polipeptyd” obejmuje natywne lub sztuczne białka, fragmenty białek i polipeptydowe analogi sekwencji białka. Polipeptyd może być monomeryczny lub polimeryczny.
Termin „wyizolowane białko”, „wyizolowany polipeptyd” lub „wyizolowane przeciwciało” oznacza białko, polipeptyd lub przeciwciało, które ze względu na swoje pochodzenie lub źródła pochodzenia (1) nie jest związane z naturalnie związanymi składnikami, które towarzyszą jemu w jego natywnym stanie, (2) jest wolne od innych białek z tego samego rodzaju, (3) jest wytwarzane przez komórkę innego rodzaju lub (4) nie występuje w naturze. W ten sposób polipeptyd, syntetyzowany chemicznie lub syntetyzowany w układzie komórkowym różniącym się od komórki, z której naturalnie pochodzi, będzie „izolowany” od jego naturalnie dołączonych składników. Ponadto białko można otrzymać w postaci zasadniczo wolnej od naturalnie z nim związanych składników przez izolację, stosując techniki oczyszczania białka dobrze znane specjalistom.
Przykłady wyizolowanych przeciwciał obejmują przeciwciało anty-CD40, oczyszczane przy zastosowaniu powinowactwa z CD40, przeciwciało anty-CD40, które syntetyzowano w komórkach hybrydoma lub w innej linii komórkowej in vitro oraz ludzkie przeciwciało anty-CD40 pochodzące z transgenicznych myszy.
Białko lub polipeptyd jest „zasadniczo czyste”, „zasadniczo homogenne” lub „zasadniczo oczyszczone”, kiedy co najmniej około 60 do 75% próbki stanowi pojedynczy rodzaj polipeptydu. Polipeptyd lub białko mogą być monomeryczne lub multimeryczne. Zasadniczo czysty polipeptyd lub białko będzie typowo obejmować około 50%, 60%, 70%, 80% lub 90% w/w próbki białka, częściej zazwyczaj około 95% i korzystniej będzie czyste w ponad 99%. Czystość białka lub homogenność można określić za pomocą wielu sposobów dobrze znanych w dziedzinie, takich jak elektroforeza próbki białka w żelu poliakryloamidowym, z następującą po niej wizualizacją pojedynczego prążka polipeptydu podczas barwienia żelu barwnikiem dobrze znanym w dziedzinie. Z kilku przyczyn, lepszy rozdział można osiągnąć przez zastosowanie HPLC lub innych sposobów dobrze znanych w dziedzinie oczyszczania.
Zastosowany tutaj termin „fragment polipeptydu” odnosi się do polipeptydu, z delecją na końcu aminowym i/lub końcu karboksylowym, ale w którym pozostała sekwencja aminokwasowa jest identyczna z odpowiadającymi pozycjami w naturalnie występującej sekwencji. W niektórych wykonaniach, fragmenty mają długość co najmniej 5, 6, 8 i 10 aminokwasów. W innych wykonaniach, fragmenty mają długość co najmniej 14, co najmniej 20, co najmniej 50 lub co najmniej 70, 80, 90, 100, 150 lub 200 aminokwasów.
Zastosowany tutaj termin „analog polipeptydu” odnosi się do polipeptydu, który obejmuje segment, zasadniczo identyczny z częścią sekwencji aminokwasowej i który ma co najmniej jedną z następujących właściwości: (1) specyficzne wiązanie do CD40 w warunkach odpowiednich dla wiązania, (2) zdolność aktywowania CD40, (3) zdolność regulowania wytwarzania cząsteczek na powierzchni komórki, takich jak ICAM, MHC-II, B7-1, B7-2, CD71, CD23 i CD83 lub (4) zdolność do zwiększania wytwarzania cytokin, takich jak IFN-βΙ, IL-2, IL-8, IL-12, IL-15, IL-18 i IL-23. Zazwyczaj, analogi polipeptydu obejmują konserwatywną substytucję aminokwasów (lub insercję lub delecję) względem sekwencji występującej naturalnie. Zazwyczaj analogi mają długość co najmniej 20 lub 25 aminokwasów, korzystniej co najmniej 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 lub 200 aminokwasów lub więcej i często mogą być tak długie jak długie, jak długi jest pełnej długości naturalnie występujący polipeptyd.
Korzystnymi substytucjami aminokwasowymi są takie, które: (1) obniżają wrażliwość na proteolizę, (2) obniżaj ą wrażliwość na utlenianie, (3) zmieniają powinowactwo wiązania dla tworzących się kompleksów białkowych i (4) nadają lub zmieniają inne właściwości fizykochemiczne lub funkcjonalne takich analogów. Analogi mogą obejmować różne muteiny sekwencji, inne niż naturalnie występująca sekwencja peptydu. Przykładowo, pojedyncze lub liczne substytucje aminokwasowe (korzystniej konserwatywne substytucje aminokwasowe) można przeprowadzić w naturalnie występującej sekwencji (korzystniej w części polipeptydu poza domeną(-ami) odpowiedzialnymi za oddziaływanie między cząsteczkami). Konserwatywna substytucja aminokwasowa nie powinna w rzeczywistości zmienić strukturalnej charakterystyki sekwencji rodzicielskiej (np. zamiana aminokwasu nie powinna zmierzać do złamania helisy, występującej w rodzicielskiej sekwencji lub do zniszczenia innych typów struktury
PL 214 289 B1 drugorzędowej, charakteryzującej sekwencję rodzicielską). Przykłady rozpoznawanych w dziedzinie drugorzędowych i trzeciorzędowych struktur polipeptydów opisano w Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, wyd., W. H. Freeman and Company, Nowy Jork (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden i J. Tooze. wyd., Garland Publishing, Nowy Jork, N. Y. (1991)); oraz Thornton i wsp., Nature 354:105 (1991).
W przemyśle farmaceutycznym często stosowane są analogi niepeptydowe jako leki o właściwościach analogicznych do tych, które ma wzorcowy peptyd. Takie rodzaje niepeptydowego składnika są określane jako „peptydowe mimetyki” lub „peptydomimetyki”, Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15: 29 (1986); Veber i Freidinger, TINS str. 392 (1985); oraz Evans i wsp., J. Med. Chem. 30: 1229 (1987). Składniki takie są często tworzone przy pomocy komputerowego modelowania molekularnego. Mimetyki peptydowe, strukturalnie podobne do peptydów wykorzystywanych terapeutycznie, mogą być stosowane do wytwarzania równoważnego efektu terapeutycznego lub profilaktycznego. Ogólnie, peptydomimetyki są strukturalnie podobne do polipeptydu wzorcowego (tj. polipeptydu, który ma pożądaną właściwość biochemiczną lub aktywność farmakologiczną), takiego jak ludzkie przeciwciało, ale ma jedną lub więcej grup wiążących peptydu dowolnie zamienionych przez związane grupy wybranej z grupy składającej się z: -CH2NH-,-CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH-(cis i trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2- i -CH2SO-, przy użyciu metod dobrze znanych w dziedzinie. Do tworzenia bardziej stabilnych peptydów może być również wykorzystana systematyczna substytucja jednego lub więcej aminokwasów w sekwencji najwyższej zgodności, D- aminokwasem tego samego typu (np. D-Iizyna w miejsce L-lizyny). Dodatkowo, sposobami znanymi w dziedzinie mogą być otrzymywane peptydy „wymuszone” obejmujące sekwencję najwyższej zgodności lub zasadniczo identyczny wariant sekwencji najwyższej zgodności, (Rizo i Gierasch, Ann. Rev. Biochem. 61: 387 (1992)), na przykład przez dodawanie wewnętrznych reszt cysteinowych zdolnych do tworzenia wewnątrzcząsteczkowych mostków dwusiarczkowych, które sprawiają, że peptyd staje się cykliczny.
Termin „przeciwciało” odnosi się do kompletnego przeciwciała lub jego części wiążącej antygen, która współzawodniczy z nienaruszonym przeciwciałem o specyficzne wiązanie. Zobacz Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul W., red., 2 wyd., Raven Press, N. Y. (1989)). Części wiążące antygen można wytwarzać stosując techniki rekombinacji DNA lub enzymatyczne czy chemiczne rozszczepianie nienaruszonych przeciwciał. Części wiążące antygen obejmują, między innymi, Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb i fragmenty regionu determinującego dopasowanie (CDR, ang. complementarity determining region), przeciwciała o jednym łańcuchu (scFv), przeciwciała chimeryczne, podwójne przeciwciała i polipeptydy, zawierające co najmniej część przeciwciała, która wystarcza do nadania specyficzności wiązania antygenu do polipeptydu.
Od końca N do końca C, domeny zmienne zarówno łańcucha lekkiego jak i ciężkiego obejmują regiony FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. Przypisanie aminokwasów do każdej domeny jest zgodne z definicjami Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Insitutes of Health, Bethesda, Md. (1987 i 1991)) Iub Chothia i Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987); Chothia i wsp., Nature 342: 878- 883 (1989).
Zgodnie z zastosowanym tu systemem, przeciwciało oznaczone numerem jest przeciwciałem monoklonalnym, otrzymywanym z hybrydoma o tym samym numerze. Przykładowo, przeciwciało monoklonalne 3.1.1 jest otrzymywane z hybrydoma 3.1.1.
W stosowanym tu znaczeniu, fragment Fd oznacza fragment przeciwciała, zawierający domeny VH i CH1; fragment Fv obejmuje domeny VL i VH pojedynczego ramienia przeciwciała, a fragment dAb (Ward i wsp., Nature 341: 544-546 (1989)), zawiera domenę VH.
W niektórych postaciach wykonania, przeciwciało jest przeciwciałem o jednołańcuchowym (scFv), w którym domeny VL i VH są sparowane tworząc monowalentne cząsteczki dzięki syntetycznemu łącznikowi, który umożliwia im tworzenie pojedynczego łańcucha białkowego, (Bird i wsp., Science 242: 423-426 (1988) i Huston i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988)). W niektórych wykonaniach, przeciwciała są podwójnymi przeciwciałami, tj. są przeciwciałami biwalentnymi, w których domeny VH i VL są wytwarzane jako pojedynczy łańcuch polipeptydowy, ale dzięki zastosowaniu łącznika, który jest zbyt krótki, aby pozwolić na sparowanie pomiędzy dwiema domenami tego samego łańcucha, narzuca w ten sposób sparowanie domen z komplementarnymi domenami innego łańcucha i tworzy dwa miejsca wiążące antygen (patrz np. Holliger P. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993) i Poljak R. J. i wsp., Structure 2: 1121-1123 (1994)). Jeden lub więcej CDR z przeciwciała według wynalazku może być włączonych do cząsteczki kowalencyjnie lub nie-kowalencyjnie, aby uczynić ją immunoadhezyną, specyficznie wiążącą CD40. W takich wykonaniach, CDR(y) może
PL 214 289 B1 być włączony jako część większego łańcucha polipeptydowego, może być kowalencyjnie połączony z innym łańcuchem polipeptydowym lub może być włączony nie kowalencyjnie.
W postaciach wykonania, w których występuje jedno lub więcej miejsc wiązania, miejsca wiązania mogą być identyczne lub różne.
W stosowanym tu znaczeniu termin „ludzkie przeciwciało” oznacza każde przeciwciało, w którym wszystkie sekwencje domen zmiennych i stałych są sekwencjami ludzkimi. Przeciwciała te mogą być wytworzone wieloma sposobami, jak to opisano poniżej.
W stosowanym tu znaczeniu termin „przeciwciało chimeryczne”, oznacza przeciwciało, które zawiera regiony z dwóch lub większej liczby różnych przeciwciał. W jednym przeciwciele, jedno lub więcej CDR może pochodzić od ludzkiego przeciwciała anty-CD40. W innym przypadku, wszystkie CDR pochodzą od ludzkiego przeciwciała anty-CD40. Możliwe są przypadki w których, CDR od większej liczby różnych ludzkich przeciwciał anty-CD40, są połączone w przeciwciało chimeryczne. Przykładowo, przeciwciało chimeryczne może obejmować CDR1 z lekkiego łańcucha pierwszego ludzkiego przeciwciała anty-CD40, CDR2 z lekkiego łańcucha drugiego ludzkiego przeciwciała anty-CD40 i CDR3 z lekkiego łańcucha trzeciego ludzkiego przeciwciała anty-CD40, a CDR z ciężkiego łańcucha mogą pochodzić z jednego lub większej liczby innych przeciwciał anty-CD40. Dalej, regiony zrębowe mogą pochodzić od jednego z tych samych przeciwciał anty-CD40 lub od jednego lub większej liczby różnych ludzkich przeciwciał.
W stosowanym tu znaczeniu termin „przeciwciało aktywujące” (również określane tutaj jako „przeciwciało agonistyczne”) oznacza przeciwciało, które zwiększa jedną lub więcej aktywności CD40 o co najmniej około 20%, po dodaniu do komórki, tkanki lub organizmu wyrażającego CD40. W niektórych wykonaniach, przeciwciało aktywuje aktywność CD40 o co najmniej 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%. Przeciwciało aktywujące może być dodawane w obecności CD40L. Aktywność przeciwciała aktywującego można określić s\ję stosując test regulacji dodatniej cząsteczek powierzchniowych pełnej krwi. Zobacz Przykład VII. Aktywność przeciwciała aktywującego można także określić stosując test z zastosowaniem komórek dendrytycznych, w celu pomiaru uwalniania IL-12. Zobacz przykład VIII. Aktywność przeciwciała aktywującego można mierzyć stosując nowotworowy model in vivo. Zobacz przykład X.
Fragmenty lub analogi przeciwciał lub cząsteczki immunoglobulin mogą być łatwo wytworzone przez specjalistów w dziedzinie, na podstawie ujawnień zawartych w niniejszym opisie. Korzystne fragmenty lub analogi końców amino- i karboksylowych powstają blisko granic z domenami funkcjonalnymi. Domeny strukturalne i funkcjonalne mogą być rozpoznane przez porównywanie danych o sekwencji nukleotydowej i/lub aminokwasowej z sekwencją znajdującą się w publicznych lub komercyjnych bazach danych.
Korzystnie, stosowane są komputerowe metody porównywania w celu identyfikowania motywów sekwencji lub potwierdzania domen przewidywanego białka, występujących w innych białkach o znanej strukturze i/lub funkcji. Znane są metody identyfikowania sekwencji białka, sfałdowanego w znaną strukturę trzeciorzędową. Zobacz Bowie i wsp., Science 253: 164 (1991)).
W stosowanym tu znaczeniu termin „rezonans plazmonów powierzchniowych” odnosi się do zjawiska optycznego, które pozwala na analizę biospecyficznych oddziaływań w czasie rzeczywistym przez wykrywanie zmian stężenia białka w macierzy biosensorowej, stosując przykładowo system BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Szwecja i Piscataway, N. J.). Dalsze informacje można znaleźć w Jonsson U. i wsp., Ann. Biol. Clin. 51: 19-26 (1993); Jonsson U. i wsp., Biotechniques 11: 620-627 (1991); Jonsson B. i wsp., J. Mol. Recognit. 8: 125-131 (1995); oraz Johnsson B. i wsp., Anal. Blochem. 198: 268-277 (1991)).
Termin „KD” odnosi się do stałej równowagi dysocjacji dla określonego oddziaływania przeciwciało-antygen.
Termin „epitop” obejmuje każdą determinantę białkową zdolną do specyficznego wiązania immunoglobuliny lub receptora komórki T. Determinanty epitopowe składają się zazwyczaj z aktywnych chemicznie ugrupowań na powierzchni cząsteczki, takich jak aminokwasy lub cukrowe łańcuchy boczne, które zazwyczaj mają zarówno specyficzną strukturę trzeciorzędową, jak i specyficzny ładunek.
Uważa się, że przeciwciało wiąże swoiście antygen, kiedy stała równowagi dysocjacji wynosi < 1 μΜ, korzystniej < 100 nM i bardziej korzystnie < 10 nM.
W stosowanym tu znaczeniu dwadzieścia konwencjonalnych aminokwasów i ich skróty są zgodne z tradycyjnym użyciem. Patrz Immunology - A Synthesis (2 wyd., E.S. Golub i D.R. Gren, red., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)).
PL 214 289 B1
W stosowanym tu znaczeniu termin „polinukleotyd” oznacza polimeryczną formę nukleotydów o długości co najmniej 10 zasad, albo rybonukleotydów albo deoksyrybonukleotydów lub modyfikowanych form obu typów nukleotydów. Termin obejmuje formy jedno- i dwuniciowe.
W stosowanym tu znaczeniu termin „izolowany polinukleotyd” oznacza polinukleotyd pochodzący z genomu, c DNA lub syntetyczny lub oznacza pewną ich kombinację, przy czym ze względu na swoje pochodzenie „izolowany polinukleotyd” (1) nie jest związany ze wszystkimi lub częścią polinukleotydów, z którymi „izolowany polinukleotyd” występuje naturalnie, (2) jest funkcjonalnie połączony z polinukleotydem, z którym nie jest połączony w naturze lub (3) nie występuje w naturze jako część większej sekwencji.
W stosowanym tu znaczeniu termin „oligonukleotyd” obejmuje naturalnie występujące i zmodyfikowane nukleotydy, połączone ze sobą wiązaniami występującymi naturalnie lub nie występującymi naturalnie w oligonukleotydach. Oligonukleotydy są podzbiorem polinukleotydów zasadniczo obejmujących długość 200 zasad lub mniej. Korzystnie oligonukleotydy mają długość od 10 do 60 zasad i korzystniej 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 lub 20 do 40 zasad długości. Oligonukleotydy są zazwyczaj jednoniciowe, np. dla starterów i sond; chociaż oligonukleotydy mogą być dwunicowe, np. do stosowania w konstruowaniu zmutowanych genów. Oligonukleotydy tu opisane mogą być oligonukleotydami sensownymi lub anty-sensownymi.
W stosowanym tu znaczeniu termin „naturalnie występujące nukleotydy” obejmuje deoksyrybonukleotydy i rybonukleotydy. W stosowanym tu znaczeniu termin „modyfikowane nukleotydy” obejmuje nukleotydy ze zmodyfikowanymi lub podstawionymi grupami cukrowymi i im podobnymi. W stosowanym tu znaczeniu termin „wiązania oligonukleotydowe” obejmują wiązania występujące w oligonukleotydach, takie jak tiofosforanowe, ditiofosforanowe, selenofosforanowe, diselenofosforanowe, anilotiofosforanowe, anilidofosforanowe, amidofosforanowe i tym podobne. Zobacz np. LaPlanche i wsp., Nuci. Acids Res. 14: 9081 (1986); Stec i wsp., J. Am. Chem. Soc. 106: 6077 (1984); Stein i wsp., Nucl. Acids Res. 16: 3209 (1988); Zon i wsp., Anti-Cancer Drud Design 6: 539 (1991); Zon i wsp., Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, str. 87-108 (F. Eckstein, red., Oxford University Press, Oxford England (1991)); patent USA nr 5 151 510; Uhlmann i Peyman, Chemical Reviews 90: 543 (1990). Jeśli jest to pożądane, oligonukleotyd może zawierać znacznik do wykrywania.
Sekwencje „funkcjonalnie połączone” obejmują zarówno sekwencje kontrolujące ekspresję, sąsiadujące z będącym przedmiotem zainteresowania genem oraz sekwencje kontrolujące ekspresję, działające w pozycji trans lub w oddaleniu od genu, będącego przedmiotem zainteresowania. W stosowanym tu znaczeniu termin „sekwencja kontrolująca ekspresję” oznacza sekwencje polinukleotydowe, konieczne do wdrożenia ekspresji i przetwarzania sekwencji kodujących, z którymi są zligowane. Sekwencje kontrolujące ekspresję obejmują sekwencje inicjacji i terminacji transkrypcji, promotora i enhancera: wydajne sygnały przetwarzania RNA, takie jak sygnały składania i poliadenylacji; sekwencje stabilizujące cytoplazmatyczny mRNA; sekwencje wzmacniające wydajność translacji (tj. sekwencja najwyższej zgodności Kozak); sekwencje wzmacniające stabilność białka i jeśli jest to pożądane sekwencje wzmacniające wydzielanie białka. Cechy takich kontrolujących sekwencji są różne i zależą od organizmu gospodarza; u prokariota, takie sekwencje kontrolujące obejmują zazwyczaj promotor, miejsce wiązania rybosomów i sekwencję germinacji transkrypcji; u eukariota takie kontrolujące sekwencje obejmują zazwyczaj promotory i sekwencję terminacji transkrypcji. Termin „sekwencje kontrolujące” obejmuje przynajmniej wszystkie składniki, których obecność jest konieczna do ekspresji i przetwarzania, i może również obejmować dodatkowe składniki, których obecność jest korzystna, na przykład, sekwencje liderowe i sekwencje partnera fuzji.
W stosowanym tu znaczeniu termin „wektor” oznacza cząsteczkę kwasu nukleinowego zdolną do transportowania innego kwasu nukleinowego, z którym jest połączona. W niektórych wykonaniach, wektor jest plazmidem, tj. kolistą pętlą dwuniciowego DNA, do której można wprowadzić przez ligację dodatkowe segmenty DNA. W niektórych wykonaniach, wektor jest wektorem wirusowym, gdzie dodatkowe segmenty DNA można wprowadzić przez ligację do genomu wirusowego. W niektórych wykonaniach, wektory są zdolne do autonomicznej replikacji w komórce gospodarza, do której je wprowadzono (np. wektory bakteryjne mające bakteryjne miejsce startu replikacji i episomalne wektory ssacze). W innych wykonaniach, wektory (np. nie episomalne wektory ssacze) mogą być włączane do genomu komórki gospodarza po wprowadzeniu do komórki gospodarza i przez to ulegają replikacji razem z genomem gospodarza. Co więcej, pewne wektory są zdolne do kierowania ekspresją genów, z którymi są funkcjonalnie połączone. Wektory takie są tutaj określone jako „zrekombinowane wektory ekspresyjne” (lub prościej „wektory ekspresyjne”).
PL 214 289 B1
W stosowanym tu znaczeniu termin „zrekombinowana komórka gospodarza” (lub prościej „komórka gospodarza”) oznacza komórkę, do której wprowadzono zrekombinowany wektor ekspresyjny. Powinno być rozumiane, że „zrekombinowana komórka gospodarza” i „komórka gospodarza” oznaczają nie tylko określoną komórkę osobnika, ale również potomstwo takiej komórki. Ponieważ w kolejnych pokoleniach, pod wpływem mutacji lub środowiska, mogą zdarzać się pewne modyfikacje, opisywane potomstwo może faktycznie nie być identyczne z komórką rodzicielską, ale nadal mieści się w zakresie zastosowanego tutaj terminu „komórka gospodarza”.
W stosowanym tu znaczeniu termin „selektywnie hybrydyzować” odnosi się do wykrywalnego i specyficznego wiązania. Polinukleotydy, oligonukleotydy i ich fragmenty hybrydyzują selektywnie z nićmi kwasu nukleinowego w warunkach hybrydyzacji i płukania, które znacznie minimalizują ilości wykrywalnych wiązań z niespecyficznymi kwasami nukleinowymi. W celu otrzymania warunków selektywnej hybrydyzacji można zastosować warunki o „wysokiej ostrości” lub „wysoce ostre”, jak to wiadomo w dziedzinie i jak to jest tutaj omówione. Przykładem warunków o „wysokiej ostrości” lub „wysoce ostrych” jest inkubacja polinukleotydu z innym polinukleotydem, w której jeden polinukleotyd może być związany ze stałą powierzchnią, taką jak membrana, w buforze hybrydyzacyjnym 6 x SSPE lub SSC, 50% formamid, 5 x odczynnik Denhardt'a, 0,5% SDS, 100 μg/ml zdenaturowanego, pofragmentowanego DNA ze spermy łososia w temperaturze hybrydyzacji 42°C przez 12-16 godz., a następnie dwukrotne płukanie w temp. 55°C z zastosowaniem buforu płuczącego 1 x SSC, 0,5% SDS. Zobacz również Sambrook i wsp., powyżej, str. 9.50-9.55.
Termin „procent identyczności sekwencji” w kontekście sekwencji kwasu nukleinowego oznacza reszty w dwóch sekwencjach, które są takie same w przyrównaniu z maksymalnym dopasowaniem. Długość identyczności sekwencji w przyrównaniu może obejmować odcinki o co najmniej dziewięciu nukleotydach, zazwyczaj co najmniej około 18 nukleotydach, częściej co najmniej około 24 nukleotydach, typowo co najmniej około 28 nukleotydach, bardziej typowo co najmniej około 32 nukleotydach i korzystniej co najmniej około 36, 48 lub o większej liczbie nukleotydów. Specjalistom znane są liczne różne algorytmy, które można zastosować do pomiaru identyczności sekwencji nukleotydowej. Przykładowo, sekwencje polinukleotydowe można porównywać stosując programy FASTA, Gap lub Bestf it , z pakietu Wisconsin Package Version 10,0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin. FASTA, zawierający np. programy FASTA2 i FASTA3, dostarcza przyrównania i procent identyczności sekwencji regionów najlepiej pokrywających się w sekwencjach badanych i przeszukiwanych (Pearson, Methods Enzymol. 183: 63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132: 185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol. 266: 227-258 (1996); Pearson, J. Mol. Biol. 276: 71-84 (1998)). O ile nie określono inaczej, stosuje się parametry domyślne do konkretnego programu lub algorytmu. Przykładowo, procent identyczności sekwencji pomiędzy sekwencjami kwasów nukleinowych można określać stos u jąc FASTA z jego parametrami domyślnymi (wielkość wyrażenia 6 i czynnik NOPAM do macierzy liczenia) lub stosując Gap z jego parametrami domyślnymi, jak to dostarczono w GCG, wersja 6.1.
Odniesienie do sekwencji nukleotydowej obejmuje jej sekwencję komplementarną, o ile nie określono tego inaczej. Dlatego też odniesienie do kwasu nukleinowego o konkretnej sekwencję powinno być rozumiane jako obejmujące jego komplementarną nić, z jej komplementarną sekwencją.
W dziedzinie biologii molekularnej, naukowcy stosują zamiennie terminy „procent identyczności sekwencji”, „procent podobieństwa sekwencji” i „procent homologii sekwencji”. W niniejszym zgłoszeniu, terminy te mają takie samo znaczenie, ale tylko w stosunku do sekwencji kwasu nukleinowego.
Termin „zasadnicze podobieństwo” lub „zasadnicze podobieństwo sekwencji”, w odniesieniu do kwasu nukleinowego lub jego fragmentu, oznacza, że przy optymalnym przyrównaniu z odpowiednimi insercjami lub delacjami nukleotydu z innym kwasem nukleinowym (lub jego komplementarną nicią), istnieje identyczność sekwencji nukleotydowej w co najmniej około 85%, korzystniej w co najmniej około 90% i bardziej korzystnie w co najmniej około 95%, 96%, 97%, 98% lub 99% par nukleotydowych, jeśli mierzy się ją za pomocą każdego dobrze znanego algorytmu identyczności sekwencji, takiego jak FASTA, BLAST lub Gap, jak to omówiono powyżej.
Termin „zasadnicza identyczność” zastosowany do polipeptydów oznacza, że dwie sekwencje peptydowe, optymalnie przyrównane za pomocą programów GAP lub BESTFIT, stosując wagi za wprowadzenie przerwy, mają co najmniej 70, 75 lub 80 procent identyczności sekwencji, korzystniej co najmniej 90 lub 95 procent identyczności sekwencji i bardziej korzystnie co najmniej 97, 98 lub 99 procent identyczności sekwencji.
Korzystnie, pozostałe pozycje, które nie są identyczne, różnią się konserwatywnymi podstawieniami aminokwasów. „Konserwatywne podstawienie aminokwasowe” jest takim, w którym reszta ami12
PL 214 289 B1 nokwasowa jest podstawiana inną resztą aminokwasową mającą grupę R łańcucha bocznego z podobnymi właściwościami chemicznymi (takimi jak np. ładunek i hydrofobowość). Ogólnie, konserwatywne podstawienie aminokwasowe nie zmieni istotnie funkcjonalnych właściwości białka. W przypadkach, kiedy dwie lub więcej sekwencji aminokwasowych różnią się od siebie konserwatywnymi podstawieniami, procent identyczności sekwencji lub stopień podobieństwa można ustalić z góry, aby skorygować konserwatywną naturę substytucji. Sposoby wykonywania takiego ustalania są dobrze znane specjalistom w dziedzinie. Zobacz np. Pearson, Methods Mol. Biol. 243: 307-31 (1994). Przykłady grup aminokwasów, mających łańcuchy boczne z podobnymi właściwościami chemicznymi obejmują I) alifatyczne łańcuchy boczne: glicyna, alanina, walina, leucyna i izoleucyna; 2) alifatycznohydroksylowe łańcuchy boczne: seryna i treonina; 3) łańcuchy boczne zawierające grupę amidową: asparagina i glutamina; 4) aromatyczne łańcuchy boczne: fenyloalanina, tyrozyna i tryptofan; 5) zasadowe łańcuchy boczne: lizyna, arginina i histydyna; 6) kwasowe łańcuchy boczne: kwas asparaginowy i kwas glutaminowy oraz 7) łańcuchy boczne zawierające siarkę: cysteina i metionina. Korzystnymi grupami podstawień aminokwasów konserwatywnych są: walina-leucyna-izoleucyna, fenyloalaninatyrozyna, lizyna-arginina, alanina-walina, glutaminian-asparaginian i asparagina-glutamina.
Alternatywnie, zastąpienie konserwatywne jest każdą zmianą wykazującą wartość pozytywną w macierzy Iog - prawdopodobieństwa PAM250, przedstawionej w publikacji Gonnet i wsp, Science 256: 1443-45 (1992). „Umiarkowanie konserwatywne” zastąpienie jest każdą zmianą nie wykazującą negatywnej wartości w macierzy log-prawdopodobieństwa PAM250.
Podobieństwo sekwencji dla polipeptydów, określane również jako identyczność sekwencji, typowo mierzy się stosując oprogramowanie do analizy sekwencji. Oprogramowanie do analizy białka odpowiednio dobiera podobne sekwencje stosując pomiary podobieństwa przypisane różnym podstawieniom, delecjom i innym modyfikacjom, w tym konserwatywnym podstawieniom aminokwasowym. Przykładowo, programy zawierające GCG, takie jak „Gap” i „Bestfit”, które można stosować z parametrami domyślnymi w celu określenia homologii sekwencji lub identyczności sekwencji pomiędzy blisko spokrewnionymi polipeptydami, takimi jak homologiczne polipeptydy pochodzące od różnych gatunków lub pomiędzy białkiem typu dzikiego i jego muteiną. Zobacz np. GCG wersja 6.1. Sekwencje polipeptydowe można również porównywać stosując FASTA używając parametrów domyślnych lub zalecanych, programu GCG wersji 6.1. FASTA (np. FASTA2 i FASTA3) dostarcza przyrównania i procent identyczności sekwencji regionów najbardziej się pokrywających, pomiędzy sekwencjami badanymi i przeszukiwanymi (Pearson, Methods Enzymol. 183: 63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132: 185-219 (2000)). Innym korzystnym algorytmem do porównywania sekwencji z bazą danych zawierającą dużą liczbę sekwencji pochodzących od różnych organizmów, jest program komputerowy BLAST, zwłaszcza blastp lub tblastn, z zastosowaniem domyślnych parametrów. Zobacz np. Altschul i wsp., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990); oraz Altschul i wsp., Nucleic Acids Res. 25: 3389-402 (1997).
Długość sekwencji polipeptydowych porównywanych pod względem homologii zazwyczaj wynosi co najmniej około 16 reszt aminokwasowych, zazwyczaj co najmniej około 20 reszt, częściej co najmniej około 24 reszt, typowo co najmniej około 28 reszt i korzystnie więcej niż około 35 reszt. Kiedy przeszukiwana jest baza danych zawierająca sekwencje pochodzące od dużej liczby różnych organizmów, korzystniejsze jest porównywanie sekwencji aminokwasowych.
Zastosowane tutaj terminy „znacznik” lub „wyznakowany” odnoszą się do włączenia innej cząsteczki do przeciwciała. W jednym wykonaniu, znacznik jest wykrywalnym markerem np. włączenie znakowanego radioaktywnie aminokwasu lub dołączenie do polipeptydu cząstek biotynylowych, które można wykrywać znakowaną awidyną (np. streptawidyną zawierającą znacznik fluoroscencyjny lub mającą aktywność enzymatyczną, wykrywalną metodami optycznymi lub kolorymetrycznymi). W innym wykonaniu, znacznik lub marker może być terapeutyczny, np. skoniugowany lek lub toksyna. W dziedzinie są znane i mogą być stosowane różne metody znakowania polipeptydów i glikoprotein. Przykłady znaczników dla polipeptydów obejmują w sposób nieograniczający: radioizotopy lub radionuklidy (np. 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, „Tc, 111In, 125I, 131I), znaczniki fluoroscencyjne (np. FITC, rodamina, fosfory-lantanowcowe), znaczniki enzymatyczne (np. peroksydaza chrzanowa, β-galaktozydaza, lucyferaza, fosfataza alkaliczna), markery chemiluminescencyjne, grupy biotynylowe, określone wcześniej epitopy polipeptydowe rozpoznawane przez drugorzędowy znacznik reporterowy (np. sekwencje par z suwaka leucynowego, miejsca wiązania przeciwciał drugorzędowych, domeny wiążące metal, znaczniki epitopowe), czynniki magnetyczne, takie jak gadolinowe kompleksy chelatowe, toksyny jak toksyna krztuścowa, taksol, cytochalazyna B, gramicydyna D, bromek etydyny, emetyna, mitomycyna, etopozyd, tenopozyd, winkrystyna, winblastyna, kolchicyna, doksorubicyna, daunorubicyna, dihydrokPL 214 289 B1 syantracynodion, mitoksantron, mitramycyna, akinomycyna D, 1-dehydrotestosteron, glukokortykoidy, prokaina, tetrakaina, lidokaina, propranolol i puromycyna i ich analogi lub homologi. W niektórych przypadkach, znaczniki są przyłączane przez różnej długości ramiona łącznikowe, w celu zredukowania potencjalnej zawady przestrzennej.
Termin pacjent obejmuje osobniki ludzkie i zwierzęce.
W szczegółowym opisie i w zastrzeżeniach słowo „obejmować” lub jego odmiany takie jak „obejmuje” lub „obejmujący”, będą rozumiane jako mieszczące w sobie włączenie określoną całość lub grupy całości, a nie jako wyłączenie jakiejkolwiek innej całości lub grupy całości.
Ludzkie przeciwciała anty-CD4-i ich charakterystyka
Przeciwciał ludzkich nie dotyczy kilka problemów związanych z przeciwciałami, posiadającymi inne od ludzkich (np. gryzoni) regiony zmienne i/lub stałe. Problemy te obejmują szybki klirens przeciwciał lub odpowiedź immunologiczną skierowaną przeciwko przeciwciału. Dlatego też niniejszym opisano humanizowane przeciwciała anty-CD40.
Opisane zostały również ludzkie przeciwciała anty-CD40. Ludzkie przeciwciała anty-CD40 mogą być wytwarzane przez immunizowane gryzonie, których genom zawiera geny ludzkiej immu noglobuliny, w ten sposób gryzoń wytwarza ludzkie przeciwciała. Przypuszcza się, że ludzkie przeciwciała anty-CD40 zminimalizują immunogenne i alergiczne odpowiedzi właściwe dla nie będących ludzkimi lub nie pochodzących od ludzi przeciwciał monoklonalnych (mAb) i w ten sposób podniosą skuteczność i bezpieczeństwo podawanych przeciwciał. Można przypuszczać, że używanie w pełni ludzkich przeciwciał dostarcza istotnej korzyści w leczeniu przewlekłych i nawracających chorób człowieka, takich jak zapalenie i rak, które mogą wymagać powtarzania podawania przeciwciała.
Niniejszym ujawniono jedenaście aktywujących ludzkich monoklonalnych przeciwciał (mAb) anty-CD40 i wytwarzających je linii komórkowych hybrydoma. W tabeli A wymieniono identyfikatory sekwencji (SEKW. NR ID.:) kwasów nukleinowych kodujących łańcuchy ciężkie i lekkie o pełnej długości (w tym sekwencje liderowe), odpowiadające im przewidywane sekwencje aminokwasowe o pełnej długości oraz sekwencje nukleotydowe i przewidywane sekwencje aminokwasowe regionów zmiennych łańcucha ciężkiego i lekkiego.
T a b e l a A
Ludzkie przeciwciała anty-CD40
MAb Identyfikator sekwencji (SEKW. NR ID.:)
Region zmienny Cała długość
Ciężki Lekki Ciężki Lekki
DNA Białko DNA Białko DNA Białko DNA Białko
3.1.1 1 2 3 4 5 6 7 8
7.1.2 9 10 11 12 13 14 15 16
10.8.3 17 18 19 20 21 22 23 24
15.1.1 25 26 27 28 29 30 31 32
21.2.1 33 34 35 36 37 38 39 40
21.4.1 41 42 43 44 45 4 6 47 48
22.1.1 49 50 51 52 53 54 55 56
23. 5.1 57 58 59 60 61 62 63 64
23.28.1 65 66 67 68 69 70 71 72
23.29.1 73 74 75 76 77 78 79 80
24.2.1 81 82 83 84 85 86 87 88
Niniejszym opisano ponadto ludzkie mAb 23.25.1 anty-CD40 i wytwarzające je linie komórkowe hybrydoma.
PL 214 289 B1
Niniejszym ujawniono ponadto warianty ciężkiego i/lub lekkiego łańcucha kilku wymienionych wyżej ludzkich mAb anty- CD40, obejmujących jedno lub więcej podstawień aminokwasowych. Ujawniono dwa warianty łańcuchów ciężkich mAb 3.1.1. W jednym, alanina w pozycji 78 jest zamieniona na treoninę. W drugim, alanina w pozycji 78 jest zamieniona na treoninę, a waliny w pozycji 88 i 97 są zamienione na alaniny. Opis wynalazku ujawnia również warianty łańcucha lekkiego mAb 3.1.1, w którym leucyna w pozycji 4 i leucyna w pozycji 83 są odpowiednio zamienione na metioninę i walinę. Kombinacja wariantu łańcucha ciężkiego lub lekkiego z łańcuchem lekkim lub ciężkim typu dzikiego, jest oznaczana odpowiednio przez łańcuch zmutowany. W ten sposób, przeciwciało zawierające łańcuch lekki typu dzikiego i łańcuch ciężki obejmujący mutację, w wyniku której w pozycji 78 zamiast alaniny jest treonina oznaczane jest jako 3.1.1H-A78T. Niniejszym ujawniono także przeciwciała 3.1.1 obejmujące każdą kombinację wariantu ciężkiego łańcucha i wariantu lekkiego łańcucha.
Niniejszym przedstawiono także wariant łańcucha ciężkiego mAb 22.1.1, w którym cysteina w pozycji 109 jest zamieniona na alaninę. Przeciwciało monoklonalne obejmujące wariant łańcucha ciężkiego i łańcuch lekki 22.1.1 jest oznaczane jako mAb 22.1.1H-C109A. Dalej opisane zostały dwa warianty łańcuchów ciężkich i wariant łańcucha lekkiego mAb 23.28.1. W jednym wariancie łańcucha ciężkiego, kwas asparaginowy w pozycji 16 jest zamieniony na kwas glutaminowy. mAb obejmujące wariant wariantu łańcucha ciężkiego i łańcuch lekki 23.28.1 jest oznaczone jako 23.28.1H-D16E. Możliwy do otrzymania jest również wariant lekkiego łańcucha 23.28.1, w którym cysteina w pozycji 92 jest zamieniona na alaninę. mAb obejmujące łańcuch ciężki 23.28.1 I wariant łańcucha lekkiego jest oznaczone jako 23.28.1L-C92A.
Niniejszym ujawniono mAb obejmujące warianty łańcucha ciężkiego 23.28.1 z wariantem łańcucha lekkiego 23.28.1.
Łańcuch lekki wytwarzany przez hybrydoma 23.29.1 obejmuje mutację w regionie stałym, w pozycji 174. Łańcuch lekki wytwarzany przez hybrydoma ma w tej pozycji argininę zamiast kanonicznej lizyny. Zgodnie z tym, przedstawiono tu łańcuch lekki 23.29.1 z kanoniczną lizyną w pozycji 174 i mAb oznaczane jako 23.29.1L-R174K, zawierające łańcuch ciężki 23.29.1 i wariant łańcucha lekkiego.
W korzystnej postaci wykonania przeciwciało anty-CD40 według wynalazku stanowi przeciwciało 21.4.1. Jednakże opisane niniejszym zostały inne przeciwciała anty-CD40: 3.1.1.H-A78T, 3.1.1.H-A7 8T-V8 8A-V97A, 3.1.1.L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1,
23.25.1. 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R17 4K i 24.2.1.
Przedstawione w niniejszym opisie przeciwciała anty-CD40 mogą obejmować łańcuch lekki zawierający sekwencję aminokwasową wybraną spośród SEKW. NR ID.: 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64, 72, 80, 88, 94, 100 lub 102, lub jego region zmienny, lub kodowany przez sekwencję kwasu nukleinowego wybranego spośród SEKW. NR ID.: 7, 15, 23, 31, 39, 47, 55, 63, 71, 79, 87, 93, 99 lub 101. Przeciwciało anty-CD40 może też obejmować łańcuch lekki zawierający co najmniej CDR2 z jednego z wymienionych przeciwciał, jedną z wyżej podanych sekwencji aminokwasowych (jak przedstawiono na fig. 1A-1C I 2A-2C) lub kodowaną przez jedną z wyżej wymienionych sekwencji kwasów nukleinowych. Łańcuch lekki może ponadto obejmować CDR1 i CDR3 niezależnie wybrane ze zmiennego regionu łańcucha lekkiego, który zawiera nie więcej niż 10 aminokwasów z sekwencji aminokwasowej kodowanej przez gen lini zarodkowej VKA3/A19, L5 lub A27, lub obejmuje CDR1 i CDR3 niezależnie wybrane z jednego z CDR1 i CDR3 (1) przeciwciała wybranego z 3.1.1, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2,
10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23,29.1L-R174K lub 24.2.1; (2) sekwencji aminokwasowej z SEKW. NR ID.: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94, 100 lub 102 lub (3) kodowanych przez sekwencję kwasu nukleinowego z SEKW. NR ID.: 3, 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 93, 99 lub 101.
Opisane tu przeciwciało anty-CD4 może obejmować także łańcuch ciężki obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną z SEKW. NR ID.: 6, 14, 22, 30, 38, 46, 54, 62, 70, 78 lub 86, lub jego zmienny region, lub kodowany przez sekwencję kwasu nukleinowego wybranego z SEKW. NR ID.: 5, 13, 21, 29, 37, 45, 53, 61, 69, 77 lub 85. Przeciwciało anty-CD40 może też obejmować łańcuch ciężki zawierający co najmniej CDR3 z jednego spośród wymienionych przeciwciał, jedną z wyżej wymienionych sekwencji aminokwasowych (jak przedstawiono na fig. 1A-1C i 2A-2C) lub kodowaną przez jedną z wyżej wymienionych sekwencji kwasów nukleinowych. Łańcuch ciężki może obejmować dalej CDR1 i CDR2 niezależnie wybrane ze zmiennego regionu łańcucha ciężkiego, który zawiera nie więcej niż osiemnaście aminokwasów z sekwencji aminokwasowej kodowanej przez gen linii zarodkowej VH3-30+, 4-59, 1-02, 4.35 lub 3-30.3, lub obejmuje CDR1 i CDR2 niezależnie wybrane z jednego z CDR1 i CDR2 (1) przeciwciała wybranego z 3.1.1., 3.1.1H-A78T, 3.1. 1H-A78T-V8 8A-V97A, 7.1.2,
PL 214 289 B1
10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.29.1 i 24.2.1; (2) sekwencji aminokwasowej SEKW. NR ID.: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 lub 98, lub (3) kodowanych przez sekwencję kwasu nukleinowego SEKW. NR ID.: 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 91, 95 lub 97. Przeciwciało anty-CD40 zawiera łańcuch ciężki i łańcuch lekki jak zdefiniowano powyżej.
Ujawnione tu przeciwciało 3.1.1H-A78T jest identyczne z 3.1.1 z wyjątkiem pozycji 78 łańcucha ciężkiego, gdzie w miejscu alaniny jest treonina. Podobnie, w przeciwciele 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, pozycja 78 jest zamieniona na A, a w pozycjach 88 i 97 łańcucha ciężkiego walina jest zamieniona na alaninę. Przeciwciało 3.1.1L-L4M-L83V jest identyczne z 3.1.1 z wyjątkiem, w łańcuchu lekkim, pozycji 4, w której zamiast leucyny jest metionina i pozycji 83, w której zamiast leucyny jest walina. Przeciwciało 22.1.1H-C109A jest identyczne z 22.1.1 z wyjątkiem pozycji 109 łańcucha ciężkiego, w której cysteinę zmieniono na alaninę. Przeciwciała 23.28.1H-D16E i 23.28.1L-C92A są identyczne z 23.28.1 z wyjątkiem, odpowiednio, pozycji 16 w łańcuchu ciężkim, w której aspartanian zmieniono na glutaminian i pozycji 92 w łańcuchu lekkim, w której cysteinę zamieniono na alaninę. Przeciwciało 23.29.1L-R174K jest identyczne z 23.29.1 z wyjątkiem pozycji 174 łańcucha lekkiego, w której argininę zamieniono na lizynę.
Klasa i podklasa przeciwciał anty-CD40
Klasę i podklasę przeciwciał anty-CD40 można określać za pomocą każdej metody znanej w dziedzinie. Ogólnie, klasę I podklasę przeciwciał anty-CD40 można określać stosując przeciwciała swoiste dla specyficznej klasy i podklasy przeciwciała. Przeciwciała takie są dostępne na rynku. Klasę i podklasę można określać zarówno za pomocą testów typu ELISA lub Western Blot, jak i innymi technikami. Alternatywnie, klasę i podklasę można określać za pomocą sekwencjonowania wszystkich lub części stałych regionów łańcuchów ciężkich i/lub lekkich przeciwciał, porównywania ich sekwencji aminokwasowych ze znanymi sekwencjami aminokwasowymi immunoglobulin różnych klas i podklas, i określania klasy i podklasy przeciwciał.
Przeciwciało anty-CD40 według wynalazku jest przeciwciałem monoklonalnym. Przeciwciało anty-CD40 może być cząsteczką IgG, IgM, IgE, IgA, lub IgD. Korzystnie, przeciwciało anty-CD40 należy do IgG i do podklasy IgG1, IgG2, IgG3 lub IgG4. W innym korzystnym wykonaniu, przeciwciało antyCD40 należy do podklasy IgG2.
Selektywność gatunkowa i cząsteczkowa
W innym aspekcie przeciwciała anty-CD40 wykazują selektywność zarówno gatunkową, jak i cząsteczkową. Przeciwciało anty-CD40 może wiązać się z CD40 naczelnych i ludzkim CD40. Przeciwciało anty-CD40 może wiązać się z ludzkim, pochodzącym od makaka jawajskiego lub rezusa CD40. Przeciwciało anty-CD40 nie wiąże się natomiast z mysim, szczurzym, psim czy króliczym CD40. Stosując wiedzę tego szczegółowego opisu selektywność gatunkową przeciwciała anty- CD40 można określić za pomocą metod dobrze znanych specjalistom. Przykładowo, można określić selektywność rodzajową stosując testy typu Western blot, FACS, ELISA lub RIA (zobacz np. przykład IV).
W niektórych wykonaniach, przeciwciało anty-CD40 jest 100 razy bardziej selektywne w stosunku do CD40 niż w stosunku do RANK (receptorowy aktywator jądrowego czynnika kappa B), 4-1BB (CD137), TNFR-1 (receptor 1 czynnika martwicy nowotworu) i TNFR-2 (receptor 2 czynnika martwicy nowotworu). W niektórych wykonaniach przeciwciało anty-CD40 nie wykazuje żadnego godnego zauważenia specyficznego wiązania z jakimkolwiek innym białkiem, innym niż CD40. Selektywność przeciwciała anty-CD40 w stosunku do CD40 można określać stosując metody dobrze znane w dziedzinie, postępując zgodnie ze wskazaniami tego szczegółowego opisu. Przykładowo, selektywność można określać stosując Western blot, FACS, ELISA lub RIA (zobacz np. przykład V).
Identyfikacja epitopów CD40 rozpoznawanych przez przeciwciało anty-CD40
Wynalazek dostarcza ludzkie monoklonalne przeciwciało anty-CD40, które wiąże CD40 i konkuruje krzyżowo z i/lub wiąże ten sam epitop, i/lub wiąże się z CD40 z tą samą stałą KD jak ludzkie przeciwciało anty-CD40 21.4.1. Niniejszym opisano także przeciwciało, które wiąże CD40 i konkuruje krzyżowo z i/lub wiąże ten sam epitop, i/lub wiąże się z CD40 z tą samą stałą KD jak ludzkie przeciwciało wybrane spośród przeciwciał 3.1.1, 3.1.1Η-Α78Τ, 3.1.1H-A78 T-V8 8A-V97A, 3.I.1L-L4M-L83V, 7.1.2,
10.8.3, 15.1.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K lub 24.2.1; lub ludzkiego przeciwciała anty-CD40, które obejmuje zmienny region ciężkiego łańcucha, mający sekwencję aminokwasową SEKW. NR ID.: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 lub 98 lub ludzkiego przeciwciała anty-CD40, które obejmuje
PL 214 289 B1 zmienny region lekkiego łańcucha, mający sekwencję aminokwasową SEKW. NR ID.: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94, 100 lub 102.
Stosując jakąkolwiek z metod znaną specjalistom, można określić czy przeciwciało wiąże się z tym samym epitopem lub konkuruje krzyżowo o wiązanie z przeciwciałem anty-CD40. Na przykład, można pozwolić na związanie się przeciwciała anty-CD40 według wynalazku z CD40 w nasyconych warunkach, a następnie mierzyć zdolność badanego przeciwciała do wiązania CD40. Jeśli badane przeciwciało jest zdolne do wiązania się z CD40 w tym samym czasie co przeciwciało anty-CD40, wtedy badane przeciwciało wiąże się z różnymi epitopami, jak przeciwciało anty-CD40. Jednakże, jeśli badane przeciwciało nie jest zdolne do wiązania się z CD40 w tym samym czasie, wtedy badane przeciwciało wiąże się z tym samym epitopem, pokrywającym się częściowo epitopem lub epitopem, który jest w bliskim sąsiedztwie epitopu wiązanego przez ludzkie przeciwciało anty-CD40. Doświadczenie to można wykonać stosując ELISA, RIA, FACS lub rezonans plazmonów powierzchniowych (zobacz np. przykład VI). W bardziej korzystnym wykonaniu stosuje się BIAcore.
Powinowactwo wiązania przeciwciał anty-CD40 z CD40
Według wynalazku, przeciwciało anty-CD40 wiąże CD40 z wysokim powinowactwem. Ujawnione niniejszym przeciwciało przeciwko CD40 wiąże CD40 z K0 wynoszącą 2 x 10-8 M lub mniejszą,
-9 -10 -11 korzystnie z KD wynoszącą 2 x 10-9, 2 x 10-10, 4,0 x 10-11 M lub mniejszą, najkorzystniej z KD wynoszą-12 D D cą 2,5 x 10-12 M lub mniejszą.
Przeciwciało według wynalazku wiąże CD40 z zasadniczo z taką samą KD jak przeciwciało
21.4.1,
Inne przeciwciała tu ujawnione wiążą CD40 z zasadniczo z taką samą KD jak przeciwciała wybrane spośród 3.1.1, 3.1.1H- A78T, 3.1.1H-A78T-V8 8A-V97A, 3.I.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1,
21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.IL- R17 4 K lub 24.2.1.
Przeciwciało ujawnione w niniejszym opisie może także wiązać CD40 z zasadniczo taką samą
K0 jak:
- przeciwciało obejmujące CDR2 lekkiego łańcucha i/lub CDR3 ciężkiego łańcucha z przeciwciała wybranego z 3.1.1, 3.1.1H- A78T, 3.1.1H-A78T-V8 8A-V97A, 3.1.1L-L4M-L8 3V, 7.1.2, 10.8.3,
15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K i 24.2.1;
- przeciwciało obejmujące region zmienny łańcucha ciężkiego o sekwencji aminokwasowej SEKW. NR ID.: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 lub 98 lub przeciwciało obejmujące łańcuch lekki o sekwencji aminokwasowej SEKW. NR ID.: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94, 100 lub 102;
- przeciwciało obejmujące CDR2 zmiennego regionu łańcucha lekkiego o sekwencji aminokwasowej SEKW. NR ID.: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94, 100 lub 102 lub CDR3 zmiennego regionu łańcucha ciężkiego o sekwencji aminokwasowe j SEKW. NR ID.: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 lub 98.
Niektóre z ujawnionych tu przeciwciał anty-CD40 mają niską szybkość dysocjacji. Przeciwciało anty-CD40 ujawnione nieniejszym ma Koff wynoszącą 2,0 x 10-4 lub niższą, korzystniej Koff wynoszącą 2,0 x 10-7 lub jest niższa. Koff dla przeciwciała według wynalazku ma zasadniczo taką samą wartość co dla przeciwciała 21.4.1. W przpadku innych opisanych tu przeciwciał wartość Koff zasadniczo ma taką wartość, jak przeciwciało wybrane spośród 3.1.1, 3.1.1H-A7 8T, 3.1.1H-A78T- V88A-V97A, 3.1.1L-L4M-L8 3V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K i 24.2.1.
Przeciwciało ujawnione w niniejszym opisie może także wiązać CD40 z zasadniczo taką samą Koff jak:
- przeciwciało obejmujące CDR3 ciężkiego łańcucha lub CDR2 lekkiego łańcucha z przeciwciała wybranego z 3.1.1, 3. I.IH- A78T, 3.1.1H-A78T-V8 8A-V97A, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1,
21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.28.1L-C92A,
23.29.1, 23.29.1L-R174K i 24.2.1;
- przeciwciało obejmujące region zmienny ciężkiego łańcucha o sekwencji aminokwasowej SEKW. NR ID.: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 lub 98 lub obejmujące region zmienny lekkiego łańcucha o sekwencji aminokwasowej SEKW. NR ID.: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94, 100 lub 102;
PL 214 289 B1
- przeciwciało obejmujące CDR2 zmiennego regionu lekkiego łańcucha o sekwencji aminokwasowej SEKW. NR ID.: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94, 100 lub 102 lub CDR3 regionu zmiennego ciężkiego łańcucha o sekwencji aminokwasowe j SEKW. NR ID.: 6, 14, 22, 30, 38, 46, 54,
62, 70, 78, 86, 90, 92, 96 lub 98.
Powinowactwo wiązania i szybkość dysocjacji przeciwciała przeciwko CD40 w stosunku do
CD40 można określać za pomocą każdej metody znanej w dziedzinie. Powinowactwo wiązania można mierzyć za pomocą testów współzawodnictwa typu ELISA, RIA lub rezonansu plazmonów powierzchniowych, takiego jak BIAcore. Szybkość dysocjacji można również mierzyć za pomocą rezonansu plazmonów powierzchniowych. Korzystnie powinowactwo wiązania i szybkość dysocjacji mierzy się za pomocą rezonansu plazmonów powierzchniowych. Bardziej korzystnie powinowactwo wiązania i szybkość dysocjacji mierzy się za pomocą BIAcore™. Zobacz np. przykład XIV.
Zastosowanie genu łańcucha lekkiego i ciężkiego
Przeciwciało anty-CD40 może obejmować ludzki lekki łańcuch kappa lub lambda, lub pochodzącą od nich sekwencję aminokwasową. W przypadku lekkiego łańcucha kappa, domena zmienna lekkiego łańcucha (Vl) jest kodowana w części przez ludzki gen VK A3/A19 (DPK-15), L5 (DP5) lub A27 (DPK-22).
VL przeciwciała anty-CD40 może zawierać jedno lub więcej podstawień aminokwasowych w stosunku do sekwencji aminokwasowej linii zarodkowej . VL przeciwciała anty-CD40 może obejmować 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 lub 10 podstawień aminokwasowych w stosunku do sekwencji aminokwasowej linii zarodkowej. W niektórych przypadkach, jedno lub większa liczba tych podstawień w stosunku do linii zarodkowej znajduje się w regionach CDR lekkiego łańcucha. Podstawienia aminokwasowe w stosunku do linii zarodkowej są w jednej lub w większej liczbie tych samych pozycji jak podstawienia względem linii zarodkowej w każdym jednym lub w większej liczbie VL przeciwciał: 3.1.1, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K i 24.2.1. Przykładowo, VL przeciwciała anty-CD40 może zawierać jedno lub więcej podstawień aminokwasowych względem linii zarodkowej, znajdującej się w przeciwciele 21.4.1 i innych podstawień aminokwasowych względem linii zarodkowej, znajdujących się w przeciwciele 10.8.3, które wykorzystuje ten sam gen VK jak przeciwciało 21.4.1. Zmiany aminokwasowe mogą być takie same w jednej lub w większej liczbie pozycji, ale obejmują inną mutację niż ta w przeciwciele refere ncyjnym.
Zmiany aminokwasowe względem linii zarodkowej mogą powstawać w jednej lub w większej liczbie tych samych pozycji jak w każdym VL przeciwciała 3.1.1, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3,
15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K i 24.2.1, ale mogą reprezentować konserwatywne podstawienia aminokwasowe w tej pozycji(ach) w stosunku do aminokwasu w przeciwciele referencyjnym. Przykładowo, jeśli konkretna pozycja w jednym z tych przeciwciał jest zmieniona w stosunku do linii zarodkowej i jest to glutaminian, można w tej pozycji konserwatywnie podstawić asparaginian. Podobnie, jeśli aminokwasowym podstawieniem w stosunku do linii zarodkowej jest seryna, można w tej pozycji konserwatywnie podstawić treoninę zamiast seryny. Konserwatywne podstawienia aminokwasowe są omówione powyżej.
Łańcuch lekki ludzkiego przeciwciała anty-CD40 może obejmować sekwencję aminokwasową, która jest taka sama jak sekwencja aminokwasowa VL przeciwciała 3.1.1 (SEKW. NR ID.: 4), 3.1. 1L-L4M-L83V (SEKW. NR ID.: 94), 7.1.2 (SEKW. NR ID.: 12), 10.8.3 (SEKW. NR ID.: 20), 15.1.1 (SEKW. NR ID.: 28), 21.4.1 (SEKW. NR ID.:), 21.2.1 (SEKW. NR ID.: 36), 21.4.1 (SEKW. NR ID.: 44), 22.1.1 (SEKW. NR ID.: 52), 23.5.1 (SEKW. NR ID.: 60), 23.28.1 (SEKW. NR ID.: 68), 23.28.1L-C92A (SEKW. NR ID.: 100), 23.29.1 (SEKW. NR ID.: 76), 23.29.IL-Rl74K (SEKW. NR ID.: 102) lub 24.2.1 (SEKW. NR ID.: 84) lub omawiana sekwencja aminokwasowa posiadająca do 1, 2, 3, 4, 6, 8 lub 10 konserwatywnych podstawień aminokwasowych i/lub ogółem do 3 nie konserwatywnych podstawień aminokwasowych.
Łańcuch lekki przeciwciała anty-CD40 opisanego niniejszym obejmuje co najmniej CDR2 łańcucha lekkiego i może również obejmować regiony CDR1 i CDR3 sekwencji linii zarodkowej, jak tu opisano. Lekki łańcuch może obejmować CDR1 i CDR2 przeciwciała niezależnie wybranego spośród
3.1.1, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.29.1 i 24.2.1 lub regiony CDR, z których każdy ma mniej niż 8, mniej niż 6, mniej niż 4 lub mniej niż 3 konserwatywne podstawienia aminokwasowe i/lub ogółem trzy lub mniej nie konserwatywne podstawienia aminokwasowe. Łańcuch lekki przeciwciała anty-CD40 może zawierać co najmniej CDR2 łańcucha lekkiego, jak również regiony CDR1 i CDR3, z których każdy jest niezależnie
PL 214 289 B1 wybrany z regionów CDR1 i CDR3 przeciwciała posiadającego zmienny region łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną z SEKW. NR ID.: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94 lub 100 lub kodowaną przez cząsteczkę kwasu nukleinowego wybranego z SEKW. NR ID.: 3, 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 93 lub 99.
Biorąc pod uwagę łańcuch ciężki, sekwencja aminokwasowa regionu zmiennego łańcucha ciężkiego jest kodowana w części przez ludzki gen VH3-30+, VH4-59, VH 1-02, VH4.35 lub VH3-30.3. VH przeciwciała anty-CD40 może zawierać jedno lub więcej podstawień aminokwasowych, delecji lub insereji (addycji) w stosunku do sekwencji aminokwasowej linii zarodkowej. Domena zmienna łańcucha ciężkiego może obejmować 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 lub 18 mutacji względem sekwencji aminokwasowej linii zarodkowej. Mutacja(e) mogą być nie konserwatywnymi podstawieniami w porównaniu z sekwencją aminokwasową linii zarodkowej i mogą występować w regionach CDR łańcucha ciężkiego. W niektórych przypadkach, zmiany aminokwasowe są wykonane w jednej lub w większej liczbie tych samych pozycji co mutacje z linii zarodkowej w dowolnym jednym lub w większej liczbie VH przeciwciał 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 7.1.2, 10.8.3,
15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.29.1 i 24.2.1. Zmiany aminokwasowe występują w jednej lub w większej liczbie tych samych pozycji, ale obejmują inną mutację, niż w przeciwciele referencyjnym.
Łańcuch ciężki może obejmować sekwencję aminokwasową zmiennej domeny (VH) przeciwciała 3.1.1 (SEKW. NR ID.: 2), 3.1.1H-A78T (SEKW. NR ID.: 90), 3.1.1Η-Ά7 8T-V8 8A-V97A (SEKW. NR ID.: 92), 7.1.2 (SEKW. NR ID.: 10), 10.8.3 (SEKW. NR ID.: 18), 15.1.1 (SEKW. NR ID.: 26), 21.2.1 (SEKW. NR ID.: 34), 21.4.1 (SEKW. NR ID.: 42), 22.1.1 (SEKW. NR ID.: 50), 22.1.1H-C109A (SEKW. NR ID.: 96), 23.5.1 (SEKW. NR ID.: 58), 23.28.1 (SEKW. NR ID.: 66), 23.28.1H-D16E (SEKW. NR ID.: 98), 23.29.1 (SEKW. NR ID.: 74) i 24.2.1 (SEKW. NR ID.: 82) lub sekwencję aminokwasową posiadającą do I, 2, 3, 4, 6, 8 lub 10 konserwatywnych podstawień aminokwasowych i/lub ogółem do 3 nie konserwatywnych podstawień aminokwasowych.
Łańcuch ciężki może obejmować regiony CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha ciężkiego przeciwciał
3.1.1, 3.1.1H-A7 8T, 3.I.IH- A7 8T-V8 8A-V97A, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H- D16E, 23.29.1 i 24.2.1 (jak przedstawiono na fig. 1D-1H lub 2D-2H) lub regiony CDR, z których każdy ma mniej niż 8, mniej niż 6, mniej niż 4 lub mniej niż 3 konserwatywne podstawienia aminokwasowe i/lub ogółem trzy lub mniej nie konserwatywnych podstawień aminokwasowych.
Łańcuch ciężki może obejmować CDR3 oraz może również obejmować regiony CDR1 i CDR2 sekwencji linii zarodkowej, jak to opisano powyżej lub może obejmować CDR1 i CDR2 przeciwciała, z których każde jest niezależnie wybrane spośród przeciwciała obejmującego łańcuch ciężki przeciwciała wybranego z 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1,
22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.29.1 i 24.2.1.
Łańcuch ciężki może obejmować CDR3 i również regiony CDR1 i CDR2, z których każdy jest niezależnie wybrany z regionu CDR1 i CDR2 zmiennego regionu łańcucha ciężkiego obejmującego sekwencję aminokwasową wybraną spośród SEKW. NR ID.: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82,
90, 92, 96 lub 98 (jak przedstawiono na fig. 1D-1H lub Fig. 2D-2H) lub kodowanego przez sekwencję kwasu nukleinowego wybranego spośród SEKW. NR ID.: 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89,
91, 95 lub 97. Przeciwciało może również obejmować łańcuch ciężki i łańcuch lekki, jak opisano powyżej.
Jeden typ podstawienia aminokwasowego, który można wykonać, to zmiana jednej lub większej liczby cystein w przeciwciele, które mogą być chemicznie reaktywne, na inną resztę, nieograniczająco, taką jak, alanina lub seryna. Podstawienie cysteiny może być wykonane w regionie zrębowym domeny zmiennej lub w domenie stałej przeciwciała. Cysteina ta może występować w niekanonicznym regionie przeciwciała. Inny typ podstawienia aminokwasowego, który można wykonać to zmiana jakichkolwiek potencjalnych miejsc proteolitycznych w przeciwciele, zwłaszcza tych, które występują w regionie zrębowym domeny zmiennej, w domenie stałej przeciwciała lub w niekanonicznym regionie przeciwciała. Podstawienie reszt cysteinowych i usunięcie miejsc proteolitycznych może obniżyć ryzyko każdej heterogenności w produkcie przeciwciała i w ten sposób zwiększać jego homogenność. Inny typ podstawienia aminokwasowego to eliminacja par asparagina-glicyna, tworzących potencjalne miejsca deamidacji, przez zmianę jednej lub obu reszt.
Korzystnie, jest to wykonywane w regionach zrębowych, domeny stałej lub regionów niekanonicznych przeciwciała.
PL 214 289 B1
Aktywacja CD40 przez przeciwciało anty-CD40
Przeciwciało anty-CD40 według wynalazku jest przeciwciałem aktywującym, tj. agonistą CD40. Przeciwciało aktywujące zwiększa lub zastępuje oddziaływania CD40L na CD40. Przeciwciało aktywujące może być zasadniczo naśladowcą CD40L i konkuruje z CD40L o wiązanie z CD40. W niektórych wykonaniach, przeciwciało nie konkuruje z CD40L o wiązanie z CD40, ale powiela skutek wiązania CD40L z CD40. W niektórych wykonaniach, przeciwciało anty-CD40 aktywuje CD40 w obecności lub przy braku CD40L.
Zahamowanie in vivo wzrostu guza przez przeciwciała anty-CD40
Przeciwciało anty-CD40 według wynalazku hamuje proliferację komórek guza in vitro lub wzrost guza in vivo.
Przeciwciało według wynalazku może hamować wzrost guza o co najmniej 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%. W niektórych wykonaniach, przeciwciało może hamować wzrost guza o co najmniej 75%. Zahamowanie wzrostu guza może być wykrywalne 14 dni po początkowym podaniu przeciwciała lub 7 dni po początkowym podaniu przeciwciała. Przeciwciało przeciwko CD-40 można podawać zwierzęciu wraz z innym przeciwneoplastycznym czynnikiem. Czynnik przeciwneoplastyczny hamuje dalej wzrost guza. W niektórych wykonaniach czynnikiem przeciwneoplastycznym jest adriamycyna lub taksol. Jednoczesne podawanie czynnika przeciwneoplastycznego i przeciwciała anty-CD40 hamuje wzrost guza o co najmniej 50%, po okresie 22-24 dni od początkowego podania, w porównaniu do wzrostu guza u zwierzęcia nie leczonego.
Indukcja apoptozy przez przeciwciała anty-CD40
Inny aspekt wynalazku dostarcza przeciwciało anty-CD40, które indukuje śmierć komórkową komórek dodatnich wględem CD40. W niektórych wykonaniach przeciwciało powoduje apoptozę komórek dodatnich względem CD40 zarówno in vivo, jak i in vitro.
Wzmocnienie wyrażania cząsteczek z powierzchni komórki
W niektórych wykonaniach, przeciwciało anty-CD40 wzmacnia ekspresję cząsteczek na powierzchni komórek B, w tym, ale nie jedynie, ICAM, MHC-II, B7-2, CD71, CD23 i CD83. 1 μg/ml przeciwciała według wynalazku może wzmacniać wyrażanie ICAM, w teście podwyższonej regulacji cząsteczek na powierzchni komórek B w krwi pełnej, co najmniej dwukrotnie lub co najmniej czterokrotnie. 1 μg/ml przeciwciała może też wzmacniać ekspresję MHC-II, w teście podwyższonej regulacji cząsteczek na powierzchni komórek B w krwi pełnej, co najmniej dwukrotnie lub co najmniej trzykrotnie. 1 μg/ml przeciwciała może też wzmacniać ekspresję CD23, w teście podwyższonej regulacji cząsteczek z powierzchni komórek B w krwi pełnej, co najmniej dwukrotnie lub co najmniej pięciokrotnie. Zobacz np. przykład VII, tabela 25.
Ujawnione niniejszym przeciwciało anty-CD40 wzmacnia ekspresję cząsteczek z powierzchni komórki dendrytycznej, w tym lecz nie wyłącznie, MHC-II, ICAM, B7-2, CD83 i B7-1. Zakres regulacji jest podobny do zakresu regulacji obserwowanego w komórkach B. Zobacz np. tabele 25 i 26, poniżej. Przeciwciało korzystnie zwiększa poziom wyrażania cząsteczek, takich jak B7-2 i MHC-II, na powierzchni komórki dendrytycznej w porównaniu do poziomu wyrażania tych cząsteczek z komórek B. Zobacz np. tabela 27.
Wzmocnienie wydzielania cytokin komórkowych
Przeciwciało według wynalazku zwiększa komórkowe wydzielanie cytokin, w tym lecz nie wyłącznie, IL-8, IL-12, IL-I5, IL-I8 i IL-23.
Przeciwciało może zwiększać wydzielanie cytokin przez komórki dendrytyczne i adherentne monocyty. Wytwarzanie cytokin jest ponadto wzmacniane przez ko-stymulację jednym lub większą liczbą LPS, TFN-γ lub IL-Ιβ. Przeciwciało według wynalazku wraz z ko-stymulacją przez LPS wzmaga wytwarzanie IL-12p70 w teście komórek dendrytycznych z EC50 wynoszącym około 0,48 μg/ml. W niektórych wykonaniach, przeciwciało zwiększa wytwarzanie IL-12p40 w komórkach dendrytycznych z EC50 wynoszącym około 0,21 μg/ml. (Zobacz np. przykład VIII).
Przeciwciało może zwiększać wydzielanie IFN-gamma przez komórki T w teście typu allogeniczna komórka T/komórka dendrytyczna, jak opisano w przykładzie VIII. Przeciwciało może zwiększać wydzielanie IFN-gamma w teście typu allogeniczna komórka T/komórka dendrytyczna z EC50 wynoszącym około 0,3 μg/ml, około 0,2 μg/ml około 0,03 μg/ml.
PL 214 289 B1
Sposoby wytwarzania przeciwciał i linie komórkowe wytwarzające przeciwciała
Immunizacja
Ludzkie przeciwciała mogą być wytwarzane przez immunizowane zwierzę, niebędące człowiekiem, zawierające w swoim genomie niektóre lub wszystkie Ioci ciężkiego łańcucha i lekkiego łańcucha ludzkiej immunoglobuliny z antygenem CD40. Niebędącym człowiekiem zwierzę stanowi mysz XenoMouse™.
Myszy XenoMouse™ są skonstruowanymi rodzajami myszy zawierającymi duże fragmenty Ioci łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego ludzkiej immunoglobuliny, a jednocześnie ich zdolność do wytwarzania mysich przeciwciał została upośledzona. Zobacz np. Green i wsp., Nature Genetics 7:13-21 (1994) i patenty USA nr 5 916 771, 5 939 598, 5 985 615, 5 998 209, 6 075 181, 6 091 001, 6 114 598, 6 130 364, 6 162 963 i 6 150 584. Zobacz również nr WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096, WO 96/33735, WO 98/16654, WO 98/24893, WO 98/50433, WO 99/45031, WO 99/53049, WO 00/09560 i WO 00/037504.
Niniejszym opisano sposób wytwarzania przeciwciał anty-CD40 u zwierząt niebędących człowiekiem i niebędących myszą, przez immunizowanie transgenicznych zwierząt, niebędących ludźmi, które zawierają Ioci ludzkiej immunoglobuliny z antygenem CD40. Zwierzęta takie można konstruować stosując sposoby opisane w powyżej cytowanych dokumentach. Sposoby ujawnione w tych dokumentach mogą być modyfikowane, jak to opisano w patencie USA nr 5 994 619. Korzystne zwierzęta stanowią szczury, owce, świnie, kozy, bydło lub konie.
Myszy XenoMouse™ wytwarzają dojrzały jak ludzki zestaw w pełni ludzkich przeciwciał i wytwarzają antygenowo swoiste ludzkie przeciwciała. Myszy XenoMouse™ mogą zawierać około 80% zestawu genów ludzkiego przeciwciała V, dzięki wprowadzeniu fragmentów Ioci ludzkiego ciężkiego łańcucha i Ioci lekkiego łańcucha kappa o konfiguracji linii zarodkowej i wielkości mega par zasad, umieszczonych na sztucznym chromosomie drożdży (YAC). Zobacz Mendez i wsp., Nature Genetics 15: 146-156 (1997), Green i Jakobovits, J. Exp. Med. 188: 483-495 (1998) i WO nr 98/24893.
Zwierzęta niebędące ludźmi zawierające geny ludzkiej immunoglobuliny mogą być zwierzętami mającymi „minilocus” ludzkiej immuniglobuliny. W podejściu z minilocus, egzogenny locus 1 g naśladowany jest przez włączenie indywidualnych genów z locus 1 g. W ten sposób jeden lub więcej genów VH, jeden lub więcej genów DH, jeden lub więcej genów JH, stała domena mu i druga stała domena (korzystnie stała domena gamma) tworzą formę konstruktu do wprowadzenia zwierzętom. Podejście to jest opisane między innymi, w patentach USA nr 5 545 807, 5 545 806, 5 569 825, 5 625 126, 5 633 425, 5 661 016, 5 770 429, 5 789 650, 5 814 318, 5 591 669, 5 612 205, 5 721 367, 5 789 215 i 5 643 763.
Korzyścią podejścia z minilocus jest szybkość z jaką można tworzyć konstrukty zawierające części locus 1 g i wprowadzać do zwierząt. Jednakże, potencjalnie niekorzystna w podejściu z multilocus jest możliwość niewystarczającej różnorodności immunoglobulin, wspierającej pełny rozwój komórek B, tak że poziom wytwarzania przeciwciał może być niższy.
Niniejszym opisano sposób otrzymywania humanizowanych przeciwciał anty-CD40. W tym podejściu, niebędące ludźmi zwierzęta są immunizowane antygenem CD40, jak to opisano poniżej, w warunkach, które pozwalają na wytwarzanie przeciwciała. Komórki wytwarzające przeciwciało są izolowane ze zwierząt, łączone w fuzje z komórkami szpiczaka w celu utworzenia hybrydoma i izolowane są kwasy nukleinowe kodujące ciężkie i lekkie łańcuchy przeciwciała anty-CD40 będącego przedmiotem zainteresowania. Kwasy nukleinowe są następnie poddawane manipulacji z zastosowaniem technik znanych specjalistom w dziedzinie i, jak opisano poniżej, w celu ograniczenia ilości sekwencji niebędących ludzkimi, tj. humanizowania przeciwciał tak, aby ograniczyć odpowiedź immunologiczną u ludzi.
Antygenem CD40 może być izolowany i/lub oczyszczony CD40. W korzystnym wykonaniu, antygen CD40 jest ludzkim CD40. Antygen CD40 może być fragmentem CD40, takim jak zewnątrzkomórkowa domena CD40. Korzystnie, fragment CD40 obejmuje co najmniej jeden epitop CD40. Jednakże antygen CD40 może być komórką, która na swojej powierzchni wyraża lub nadeeksprymuje CD40 lub jego immunogenny fragment. Antygen CD40 może być też białkiem fuzyjnym CD40.
Immunizację zwierząt można przeprowadzać za pomocą każdej metody znanej w dziedzinie. Zobacz np. Harlow i Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990. Sposoby immunizowania niebędących ludźmi zwierząt, takich jak myszy, szczury, owce, kozy, świnie, bydło i konie są dobrze znane w dziedzinie. Zobacz np. Harlow i Lane, powyżej i patent USA nr 5 994 619. Antygen CD40 podawany jest z adiuwantem w celu stymulowania odpowiedzi immunoPL 214 289 B1 logicznej. Przykładowe adiuwanty obejmują kompletny lub niekompletny adiuwant Freunda, RIBI (dipeptydy muramylowe) lub ISCOM (kompleksy immunostymulujące). Adiuwanty takie mogą chronić polipeptyd przed szybkim rozproszeniem przez jego oddzielenie w miejscowym depozycie lub mogą zawierać substancje stymulujące gospodarza do wydzielania czynników chemotaktycznych dla makrofagów i innych czynników układu odpornościowego. Korzystnie polipeptyd jest podawany według schematu immunizacji obejmującego dwa lub większą liczbę podań polipeptydu, na przestrzeni kilku tygodni.
Przykład I opisuje wytwarzanie monoklonalnych przeciwciał anty-C40.
Wytwarzanie przeciwciał i linii komórkowych wytwarzających przeciwciała
Po immunizacji zwierzęcia antygenem CD40, ze zwierzęcia można otrzymywać przeciwciała i/lub komórki wytwarzające przeciwciała. Surowicę zawierającą przeciwciało anty-CD40 otrzymuje się ze zwierzęcia przez skrwawienie lub bezbolesne uśmiercenie zwierzęcia. Surowicę można wykorzystać w formie w jakiej została otrzymana ze zwierzęcia, można też otrzymać frakcję immunoglobulin lub oczyścić z surowicy przeciwciała anty-CD40. Specjalistom w dziedzinie wiadomo, że otrzymane w ten sposób surowica lub immunoglobuliny są poliklonalne. Stosowanie poliklonalnych przeciwciał przygotowanych z surowicy jest niekorzystne, ponieważ ilość przeciwciał, które można otrzymać jest ograniczona, a przeciwciało poliklonalne posiada szereg heterogennych właściwości.
Unieśmiertelnione linie komórkowe wytwarzające przeciwciała przygotowywane są z komórek izolowanych z immunizowanego zwierzęcia. Po immunizacji, zwierzę jest bezboleśnie uśmiercane, a węzły chłonne i/lub komórki B śledziony poddawane są procesom unieśmiertelniania. Sposoby unieśmiertelniania komórek obejmują, między innymi, transfekowanie ich onkogenami, modulowanie wirusem onkogennym przez hodowanie w warunkach selekcjonujących komórki nieśmiertelne, poddawanie ich działaniu czynników rakotwórczych i mutagennych, fuzję z komórką unieśmiertelnioną, np. komórką szpiczaka i inaktywację genu supresorowego nowotworu. Zobacz np. Harlow i Lane, powyżej. Jeśli stosowana jest fuzja komórkami szpiczaka, korzystnie komórki szpiczaka nie wydzielają polipeptydów immunoglobulin (nie-wydzielnicza linia komórkowa). Komórki unieśmiertelnione przeszukiwane są przy użyciu CD40, jego części lub komórki wyrażającej CD40. Wstępne przeszukiwanie można wykonać stosując test enzymo-immunologiczny (ELISA) lub test radioimmunologiczny. Przykład badania testem ELISA dostarcza WO nr 00/37504.
Komórki wytwarzające przeciwciało anty-CD40, np. hybrydoma, są wybrane, klonowane i analizowane dalej pod kątem pożądanych cech charakterystycznych, włączając silny wzrost, wysoki poziom wytwarzania przeciwciała i pożądane cechy charakterystyczne przeciwciała, jak omówiono poniżej. Hybrydoma mogą być namnażane in vivo w zwierzętach syngenicznych, w zwierzętach bez układu odpornościowego, np. w nagich myszach lub in vitro w hodowli tkankowej. Sposoby selekcji, klonowania i namnażania hybrydoma są dobrze znane specjalistom w dziedzinie.
Korzystnie, immunizowane zwierzę jest zwierzęciem, niebędącym człowiekiem, które wyraża geny ludzkich immunoglobulin, a komórki B śledziony są w fuzji z linią komórkową szpiczaka z tego samego gatunku, co zwierzę, niebędące człowiekiem. Korzystniej, immunizowane zwierzę jest myszą XenoMouse™, a linia komórkowa szpiczaka pochodzi z nie- wydzielniczego szpiczaka mysiego. Bardziej korzystnie linia komórkowa szpiczaka jest linią P3-X63-AG8.653. Zobacz np. przykład I.
Niniejszym opisano hybrydoma, wytwarzające przeciwciało anty-CD40. Hybrydoma są korzystnie hybrydoma mysimi, jak to opisano powyżej. Hybrydoma mogą być wytwarzane w gatunkach innych niż człowiek i mysz, a mianowicie w takich jak szczury, owce, świnie, kozy, bydło i konie. W innym wykonaniu, hybrydoma są hybrydoma ludzkimi.
Kwasy nukleinowe, wektory, komórki gospodarza i rekombinacyjne sposoby wytwarzania przeciwciał
Kwasy nukleinowe
Niniejszym ujawniono także cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące przeciwciała anty-CD40. Różne cząsteczki kwasów nukleinowych mogą kodować łańcuch ciężki i łańcuch lekki immunoglobuliny anty-CD40. Jednakże łańcuch ciężki i łańcuch lekki immunoglobuliny anty-CD40 mogą być kodowane tą samą cząsteczką kwasu nukleinowego.
Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca zmienną domenę łańcucha lekkiego obejmuje sekwencję ludzkiego genu VKA3/A19 (DPK-15), L5 (DP5) lub A27 (DPK-22) lub sekwencję pochodną. Cząsteczka kwasu nukleinowego może obejmować sekwencję nukleotydową genu VKA3/A19 i genu Jk1, JK2 lub JK3 lub sekwencje pochodne. Cząsteczka kwasu nukleinowego może również obejmować
PL 214 289 B1 sekwencję nukleotydową genu VKL5 i genu JK4. Cząsteczka kwasu nukleinowego może obejmować ponadto sekwencję nukleotydową genu A27 VK i genu JK3.
Cząsteczka kwasu nukleinowego, kodująca łańcuch lekki koduje sekwencję aminokwasową, która obejmuje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 lub 10 mutacji z sekwencji aminokwasowej linii zarodkowej. Cząsteczka kwasu nukleinowego obejmuje sekwencję nukleotydową, która koduje sekwencję aminokwasową VL obejmującą 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 lub 10 nie konserwatywnych podstawień aminokwasowych i/lub 1, 2 lub 3 nie konserwatywne podstawienia w porównaniu z linią zarodkową. Podstawienia mogą znajdować się w regionach CDR, regionach zrębowych lub w domenie stałej.
Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca domenę zmienną łańcucha lekkiego (VL) koduje sekwencje aminokwasową VL obejmującą jedną lub większą liczbę mutacji w porównaniu z sekwencją linii zarodkowej, które są identyczne z mutacjami znajdującymi się w VL jednego z przeciwciał 3.1.1, 3.I.IL-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A,
23.29.1 i 24.2.1. Cząsteczka kwasu nukleinowego może kodować co najmniej trzy mutacje aminokwasowe w porównaniu z sekwencją linii zarodkowej znalezioną w VL jednego z przeciwciał 3.1.1, 3.1.1L-L4M-L8 3V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.29.1 i 24.2.1.
Ponadto, cząsteczka kwasu nukleinowego może obejmować sekwencję nukleotydową, która koduje sekwencję aminokwasową VL przeciwciała monoklonalnego 3.1.1 (SEKW . NR ID.: 4), 3.I.1L-L4M-L83V (SEKW. NR ID.: 94), 7.1.2 (SEKW. NR ID.: 12), 10.8.3 (SEKW. NR ID.: 20), 15.1.1 (SEKW. NR ID.: 28), 21.2.1 (SEKW. NR ID.: 36), 2.1.4.1 (SEKW. NR ID.: 44), 22.1.1 (SEKW. NR ID.: 52),
23.5.1 (SEKW. NR ID.: 60), 23.28.1 (SEKW. NR ID.: 68), 23.28.1L-C92A (SEKW. NR ID.: 100),
23.29.1 (SEKW. NR ID.: 76) lub 24.2.1 (SEKW. NR ID.: 84) lub jej część. Część ta obejmuje co najmniej region CDR3. Kwas nukleinowy może kodować także sekwencję aminokwasową łańcucha lekkiego regionów CDR omawianego przeciwciała. Wyżej wskazana część sekwencji aminokwasowej jest częścią ciągłą obejmującą CDR1- CDR3.
Cząsteczka kwasu nukleinowego może obejmować sekwencję nukleotydową, która koduje sekwencję aminokwasową z SEKW. NR ID.: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94 lub 100 lub taką sekwencję bez sekwencji sygnałowej. Cząsteczka kwasu nukleinowego korzystnie obejmuje sekwencję nukleotydową z SEKW. NR ID.: 3, 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 93 lub 99 lub jej część, przy czym omawiane sekwencje ewentualnie nie posiadają sekwencji sygnałowej.
Wyżej wskazana część korzystnie koduje region VL lub koduje co najmniej region CDR2. Kwas nukleinowy może kodować sekwencję aminokwasową regionów CDR łańcucha lekkiego omawianego przeciwciała. Korzystnie wyżej wskazana część koduje ciągły region z CDR1-CDR3.
Cząsteczka kwasu nukleinowego może kodować sekwencję aminokwasową VL, która jest co najmniej w 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% lub 99% identyczna z sekwencją aminokwasową VL dowolnego z przeciwciał 3.1.1, 3.I.1L-L4M- L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1,
23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.29.1 lub 24.2.1 lub sekwencją aminokwasową VL dowolnej z SEKW. NR ID.: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94 lub 100. Cząsteczki kwasu nukleinowego obejmują kwasy nukleinowe, które hybrydyzują w ostrych warunkach, takich jak te opisane powyżej, z sekwencją kwasu nukleinowego kodującą sekwencję aminokwasową z SEKW. NR ID.: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94 lub 100 lub posiadającą sekwencję kwasu nukleinowego z SEKW. NR ID.: 3, 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 93 lub 99.
Kwas nukleinowy może kodować łańcuch lekki pełnej długości przeciwciała wybranego spośród
3.1.1, 3.1.1L-L4M- L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.IL-R174K lub 24.2.1, lub łańcuch lekki obejmujący sekwencję aminokwasową z SEKW. NR ID.: 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64, 72, 80, 88, 94, 100 lub 102 lub łańcuch lekki obejmujący mutację, taką jak tu ujawniona. Ponadto, kwas nukleinowy może obejmować sekwencję nukleotydową z SEKW. NR ID.: 7, 15, 23, 31, 39, 47, 55, 63, 71, 79 lub 87 lub cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą łańcuch lekki obejmujący mutację, taką jak tu ujawniona.
Korzystnie, cząsteczka kwasu nukleinowego koduje domenę zmienną łańcucha ciężkiego (VH), która obejmuje sekwencję ludzkiego genu VH 3-30+, 4-59, 1-02, 4.35 lub 3-30.3 lub jej pochodną sekwencję. Cząsteczka kwasu nukleinowego może obejmować ludzki gen VH 3-30+, gen D4 (DIR3) i ludzki gen JH6; ludzki gen VH 3-30+, ludzki gen D1-26 (DIR5) i ludzki gen JH6; ludzki gen VH 4.35, ludzki gen DIR3 i ludzki gen JH6; ludzki gen VH 4-59, ludzki gen D4-23 i ludzki gen JH4; ludzki gen VH 1-02, ludzki gen DIR1 ludzki gen JH4; ludzki gen VH 3-30+, ludzki gen D6-19 (DIR3) i ludzki gen JH4; ludzki gen VH 3-30+, ludzki gen D1-1 i ludzki gen JH6; ludzki gen VH 3-30+, ludzki gen D4-17 i ludzki
PL 214 289 B1 gen JH6; ludzki gen VH 3-30.3, ludzki gen D4-17 i ludzki gen JH 6; ludzki gen VH 4-59, ludzki gen D4-17 (DIR1) i ludzki gen JH5 lub sekwencję pochodzącą z ludzkich genów.
Cząsteczka kwasu nukleinowego może kodować sekwencję aminokwasową obejmującą 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 lub 18 mutacje w porównaniu z sekwencją aminokwasową linii zarodkowej ludzkich genów V, D lub J. Omawiane mutacje mogą występować w regionie VH, a w niektórych wykonaniach omawiane mutacje występują w regionach CDR.
Cząsteczka kwasu nukleinowego koduje jedną lub większą liczbę mutacji aminokwasowych w porównaniu z sekwencją linii zarodkowej, które są identyczne z mutacjami aminokwasowymi obecnymi w VH przeciwciała monoklonalnego 3.1.1, 3.1.^^78^ 3.1.1H-A78T-V8 8A-V97A, 7.1.2, 10.8.3,
15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C10 9A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H- D16E, 23.29.1 lub
24.2.1. Kwas nukleinowy koduje co najmniej trzy mutacje aminokwasowe w porównaniu z sekwencjami linii zarodkowej, które są identyczne z co najmniej trzema mutacjami aminokwasowymi obecnymi w wymienionych powyżej przeciwciałach monoklonalnych.
Cząsteczka kwasu nukleinowego może obejmować sekwencję nukleotydową, która koduje co najmniej część sekwencji aminokwasowej VH z przeciwciała 3.1.1 (SEKW. NR ID.: 2), 3.1.1H-A78T (SEKW. NR ID.: 90), 3. 1.1H-A78T-V88A-V97A (SEKW. NR ID.: 92), 7.1.2 (SEKW. NR ID.: 10), 10.8.3 (SEKW. NR ID.: 18), 15.1.1 (SEKW. NR ID.: 26), 21.2.1 (SEKW. NR ID.: 34), 21.4.1 (SEKW. NR ID.: 42), 22.1.1 (SEKW. NR ID.: 50), 22.I.1H-C109A (SEKW. NR ID.: 96), 23.5.1 (SEKW. NR ID.: 58),
23.28.1 (SEKW. NR ID.: 66), 23.28.1H-D16E (SEKW. NR ID.: 98), 23.29.1 (SEKW. NR ID.: 74) Iub
24.2.1 (SEKW. NR ID.: 82), lub tę sekwencję z konserwatywnymi mutacjami aminokwasowymi i/lub sumarycznie trzema lub mniejszą liczbą nie konserwatywnych podstawień aminokwasowych. Sekwencja może kodować jeden lub większą liczbę regionów CDR, korzystnie region CDR3, wszystkie trzy regiony CDR, ciągłą część obejmującą CDR1-CDR3 lub cały region VH, z lub bez sekwencji sygnałowej.
Cząsteczka kwasu nukleinowego tu opisana obejmuje sekwencję nukleotydową, która koduje sekwencję aminokwasową jednej spośród SEKW. NR ID.: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 lub 98 lub tę sekwencję bez sekwencji sygnałowej. Korzystnie cząsteczka kwasu nukleinowego obejmuje co najmniej część sekwencji nukleotydowej z SEKW. NR ID.: 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 91, 95 lub 97 lub tę sekwencję bez sekwencji sygnałowej. Korzystnie, wyżej wskazana część koduje region VH (z lub bez sekwencji sygnałowej), region CDR3, wszystkie trzy regiony CDR lub ciągły region obejmujący CDR1-CDR3.
Cząsteczka kwasu nukleinowego może kodować sekwencję aminokwasową VH, która jest w co najmniej 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% lub 99% identyczna z sekwencją aminokwasową VH przedstawioną na fig. 1A-1C lub 2A-2C lub z dowolną sekwencją aminokwasową VH z SEKW. NR ID.: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 lub 98. Cząsteczki kwasu nukleinowego tu ujawnione obejmują kwasy nukleinowe, które hybrydyzują w ostrych warunkach, takich jak te opisane powyżej, z sekwencją kwasu nukleinowego kodującą sekwencję aminokwasową z SEKW. NR ID.: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 lub 98 lub mającą sekwencję kwasu nukleinowego z SEKW. NR ID.: 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 91, 95 lub 97. Cząsteczka kwasu nukleinowego korzystnie obejmuje cząsteczkę kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje w ostrych warunkach, takich jak te opisane powyżej, z sekwencją kwasu nukleinowego kodującą VH opisany tu powyżej.
Kwas nukleinowy może kodować łańcuch ciężki pełnej długości przeciwciała wybranego spośród 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A7 8T-V8 8A-V97A, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H- D16E, 23.29.1 i 24.2.1 lub łańcuch ciężki obejmujący sekwencję aminokwasową z SEKW. NR ID.: 6, 14, 22, 30, 38, 46, 54, 62, 70, 78 lub 86 lub łańcuch ciężki obejmujący mutację, taką jak jedna z omówionych tu mutacji. Ponadto, kwas nukleinowy może obejmować sekwencję nukleotydową z SEKW. NR ID.: 5, 13, 21, 29, 37, 45, 53, 61, 69, 77, 85 lub 89 lub cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą łańcuch ciężki zawierający mutację, taką jak jedna z omówionych tu mutacji.
Cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującego łańcuch ciężki lub cały łańcuch lekki przeciwciała anty-CD40 lub jego część można wyizolować z dowolnego źródła wytwarzającego takie przeciwciało. Cząsteczki kwasu nukleinowego mogą być izolowane z komórki B izolowanej ze zwierzęcia immunizowanego CD40 lub z unieśmiertelnionej komórki pochodzącej od takiej komórki B wytwarzającej przeciwciało anty-CD40. Sposoby izolowania mRNA kodującego przeciwciało są dobrze znane w dziedzinie. Zobacz np. Sambrook i wsp. mRNA można użyć do wytworzenia cDNA do zastosowania w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) lub klonowania cDNA genów przeciwciał. Cząsteczka kwasu
PL 214 289 B1 nukleinowego może być korzystnie wyizolowana z hybrydoma, której jednym z partnerów fuzji jest komórka wytwarzająca ludzką immunoglobulinę z transgenicznego zwierzęcia, niebędącego człowiekiem. Ponadto komórka wytwarzająca ludzką immunoglobulinę może być wyizolowana ze zwierzęcia XenoMouse™. Komórka wytwarzająca ludzką immunoglobulinę może także pochodzić z transgenicznego zwierzęcia, niebędącego człowiekiem ani myszą, jak opisano powyżej. Kwas nukleinowy może być także wyizolowany ze zwierzęcia, które nie jest transgeniczne i nie jest człowiekiem. Cząsteczki kwasu nukleinowego wyizolowane ze zwierzęcia, które nie jest transgeniczne i nie jest człowiekiem można zastosować, np. do humanizowanych przeciwciał.
Kwas nukleinowy kodujący łańcuch ciężki przeciwciała anty-CD40 może obejmować sekwencję nukleotydową kodującą domenę VH połączoną w zgodnej ramce odczytu z sekwencją nukleotydową kodującą domenę stałą łańcucha ciężkiego z dowolnego źródła. Podobnie, cząsteczka kwasu nukleinowego kodującego łańcuch lekki przeciwciała anty-CD40 może obejmować sekwencję nukleotydową kodującą domenę VL połączoną w zgodnej ramce odczytu z sekwencją nukleotydową kodującą domenę stałą łańcucha lekkiego z dowolnego źródła.
Cząsteczki kwasu nukleinowego kodującego domenę zmienną łańcuchów ciężkiego (VH) i lekkiego (VL) są „przekształcane” w geny przeciwciał o pełnej długości. Cząsteczki kwasu nukleinowego kodującego domeny VH lub VL są przekształcane w geny przeciwciał o pełnej długości przez wprowadzenie do wektora ekspresyjnego kodującego już, odpowiednio, domenę stałą łańcuch ciężkiego lub domenę stałą łańcucha lekkiego tak, że segment VH jest połączony funkcjonalnie z segmentem(ami) CH w wektorze, a segment VL jest połączony funkcjonalnie z segmentem CL w wektorze. Cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące domeny VH i/lub VL mogą być przekształcane w geny przeciwciał o pełnej długości przez łączenie, np. ligację, cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej domeny VH i/lub VL z cząsteczką kwasu nukleinowego kodującą domenę CH i/lub CL przy użyciu standardowych technik biologii molekularnej. Sekwencje kwasu nukleinowego ludzkich genów domen stałych łańcucha ciężkiego i lekkiego immunoglobuliny są dobrze znane w dziedzinie. Zobacz np. Kabat i wsp., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Wyd. 5., NIH Publ. nr. 91-3242, 1991. Cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące pełnej długości łańcuchy ciężki i/lub lekki mogą następnie ulegać ekspresji w komórce do której zostały wprowadzone i można izolować przeciwciało anty-CD40.
Cząsteczki kwasu nukleinowego można stosować do rekombinacyjnej ekspresji dużych ilości przeciwciał anty- CD40. Cząsteczki kwasu nukleinowego można także stosować do wytwarzania przeciwciał chimerycznych, przeciwciał biswoistych, przeciwciał jednołańcuchowych, immunoadhezyn, diprzeciwciał, przeciwciał zmutowanych i pochodnych przeciwciał, jak opisano poniżej. Jeśli cząsteczki kwasu nukleinowego nie pochodzą od człowieka i nie pochodzą od transgenicznego zwierzęcia, cząsteczki kwasu nukleinowego można stosować do humanizacji przeciwciał, także jak opisano poniżej.
Cząsteczka kwasu nukleinowego opisana niniejszym jest stosowana jako sonda lub starter PCR dla specyficznej sekwencji przeciwciała. Przykładowo, kwas nukleinowy można zastosować jako sondę w sposobach diagnostycznych lub jako starter PCR do amplifikacji regionów DNA, które można użyć, między innymi, do izolacji cząsteczek kwasu nukleinowego kodującego domeny zmienne przeciwciał anty-CD40. Cząsteczki kwasu nukleinowego mogą być oligonukleotydami.
Oligonukleotydy pochodzą z wysoce zmiennych regionów łańcuchów ciężkiego i lekkiego przeciwciała. Oligonukleotydy mogą kodować wszystkie lub część jednego lub większej liczby CDR przeciwciał 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1,
21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C10 9A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H- D16E, 23.28.1L-C92A, 23.29.1 lub 24.2.1.
Wektory
Niniejszym opisano wektory obejmujące cząsteczki kwasu nukleinowego, które kodują łańcuch ciężki przeciwciała anty- CD40 według wynalazku lub jego część wiążącą antygen, oraz wektory obejmujące cząsteczki kwasu nukleinowego, które kodują łańcuch lekki takich przeciwciał lub jego część wiążącą antygen. Niniejszym opisano także wektory obejmujące cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące białka fuzyjne, zmodyfikowane przeciwciała, fragmenty przeciwciał oraz ich sondy.
Przeciwciała anty-CD40 lub części wiążące antygen według wynalazku są wytwarzane przez wprowadzenie cząsteczek DNA kodujących część lub pełnej długości łańcuchy lekkie i ciężkie, uzyskane jak opisano powyżej, do wektorów ekspresyjnych tak, aby geny były funkcjonalnie połączone z koniecznymi do ekspresji sekwencjami kontrolnymi, takimi jak sygnały kontrolujące transkrypcję i translację. Wektory ekspresyjne obejmują plazmidy, retrowirusy, adenowirusy, wirusy towarzyszące adenowirusom (AAV), wirusy roślinne, takie jak wirus mozaiki kalafiora, wirus mozaiki tytoniu, kosmiPL 214 289 B1 dy, YAC, episomy pochodzące z EBV i podobne. Gen przeciwciała jest ligowany z wektorem tak, że sygnały kontrolujące transkrypcję i translację w wektorze pełnią swoją zamierzoną funkcję regulacji transkrypcji i translacji genu przeciwciała. Wektor ekspresyjny i sekwencje kontrolujące ekspresję są wybrane tak, aby były właściwe dla stosowanych komórek gospodarza. Gen łańcucha lekkiego przeciwciała i gen łańcucha ciężkiego przeciwciała można wprowadzać do oddzielnych wektorów, jednakże korzystnie oba geny są wprowadzone do tego samego wektora ekspresyjnego. Geny przeciwciał są wprowadzane do wektora ekspresyjnego przy pomocy standardowych metod (np. Iigacji komplementarnych miejsc restrykcyjnych we fragmencie z genem przeciwciała i w wektorze lub ligacji tępych końców jeśli nie ma miejsc restrykcyjnych).
Korzystnym wektorem jest taki, który koduje funkcjonalnie kompletną sekwencję CH lub CL ludzkiej immunoglobuliny, z odpowiednimi miejscami restrykcyjnymi skonstruowanymi tak, aby można było z łatwością wprowadzić dowolną sekwencję VH lub VL i uzyskać jej ekspresję, jak opisano powyżej. W wektorach takich, splicing (składanie genu) zazwyczaj zachodzi pomiędzy miejscem donorowym splicingu we wprowadzonym regionie J i miejscem akceptorowym splicingu poprzedzającym domenę ludzkiego C, a także w regionach splicingu, które występuje w eksonach ludzkiego CH. Poliadenylacja i terminacja transkrypcji występuje w natywnych miejscach chromosomu poniżej regionów kodujących. Zrekombinowany wektor ekspresyjny także może kodować pojedyncze białko, które ułatwia wydzielanie łańcucha przeciwciała z komórki gospodarza. Gen łańcucha przeciwciała można sklonować w wektorze tak, aby pojedynczy peptyd był połączony w ramce odczytu z końcem N łańcucha immunoglobuliny. Peptyd sygnałowy może być immunoglobulinowym peptydem sygnałowym lub heterologicznym peptydem sygnałowym (tzn. peptydem sygnałowym z białka niebędącego immunoglobuliną).
Oprócz genów łańcucha przeciwciała, rekombinowane wektory ekspresyjne niosą sekwencje regulatorowe, które kontrolują ekspresję genów łańcucha przeciwciała w komórce gospodarza. Specjaliści w dziedzinie wiedzą, że schemat wektora ekspresyjnego, włączając wybór sekwencji regulacyjnych, może zależeć od czynników takich jak wybór komórki gospodarza do transformacji, żądanego poziomu wytwarzania białka itd. Korzystne sekwencje regulacyjne dla ekspresji w ssaczych komórkach gospodarza obejmują elementy wirusowe, które kierują wytwarzaniem wysokich poziomów białka w komórkach ssaka, takie jak promotory i/lub enhancery pochodzące z retrowirusowych LTR, cytomegalowirusa (CMV) (takie jak promotor/enhancer CMV), wirusa małpiego 40 (SV40) (takie jak promotor/enhancer SV40), adenowirusa (np. główny późny promotor adenowirusa (AdMLP)), poliomawirusa i silne promotory ssacze, takie jak promotory natywnej immunoglobuliny i aktyny. Dodatkowy opis wirusowych elementów regulacyjnych i ich sekwencji można znaleźć w np. patencie USA nr 5 168 062, patencie USA nr 4 510 245 i patencie USA nr 4 968 615. Sposoby wytwarzania przeciwciał w roślinach, włączając opis promotorów i wektorów, jak również transformacji roślin są znane specjalistom. Zobacz np. patent USA nr 6 517 529. Sposoby wytwarzania polipeptydów w komórkach bakterii lub w komórkach grzybów, np. komórkach drożdży, są także dobrze znane specjalistom w dziedzinie.
Oprócz genów łańcuchów przeciwciał i sekwencji regulacyjnych, rekombinowane wektory ekspresyjne według wynalazku mogą nieść dodatkowe sekwencje, takie jak sekwencje, które regulują replikację wektora w komórkach gospodarza (np. miejsca początku replikacji) i geny markerów selekcyjnych. Geny markerów selekcyjnych ułatwiają selekcję komórek gospodarza do których wprowadzono wektor (zobacz np. patenty USA nr 4 399 216, 4 634 665 i 5 179 017). Przykładowo, gen markera selekcyjnego zazwyczaj nadaje komórce gospodarza, do której wprowadzono wektor, oporność na leki, takie jak G418, higromycyna lub metotreksat. Korzystne geny markerów selekcyjnych obejmują gen reduktazy dihydrofolianowej (DHFR) (do użycia w komórkach dhfr- z selekcją/amplifikacją z metotreksatem), gen neo (selekcja z G418) i gen syntetazy glutaminianowej.
Komórki gospodarza niebędące hybrydoma i sposoby wytwarzania zrekombinowanego białka
Cząsteczki kwasu nukleinowego kodującego przeciwciała anty-CD40 i wektory obejmujące te cząsteczki kwasu nukleinowego można użyć do transfekcji odpowiedniej ssaczej, roślinnej, bakteryjnej lub drożdżowej komórki gospodarza. Transformację można przeprowadzić dowolnym sposobem wprowadzania polinukleotydów do komórki gospodarza. Sposoby wprowadzania polinukleotydów heterologicznych do komórek ssaczych są dobrze znane specjalistom i obejmują transfekcję za pośrednictem dekstranu, wytrącanie fosforanem wapnia, transfekcję za pośrednictwem polibrenu, fuzję protoplastów, elektroporację, zamykanie polynukleotydu(ów) w liposomach oraz bezpośrednią mikroiniekcję DNA do jądra. Dodatkowo cząsteczki kwasu nukleinowego można wprowadzać do komórek ssaczych za pomocą wektorów wirusowych. Sposoby transformacji komórek są dobrze znane specjalistom. Zobacz np. patenty USA nr 4 399 216, 4 912 040, 4 740 461 i 4 959 455 (które to patenty są tu
PL 214 289 B1 włączone jako odniesienie). Sposoby transformacji komórek roślinnych są dobrze znane specjalistom, i obejmują, np. transformację za pośrednictwem Agrobacterium, transformację biolistyczną, iniekcję bezpośrednią, elektroporację i transformację wirusową. Metody transformacji komórek bakteryjnych i drożdżowych są dobrze znane specjalistom.
Linie komórek ssaczych dostępne jako gospodarze do ekspresji są dobrze znane w dziedzinie i obejmują wiele unieśmiertelnionych linii komórkowych dostępnych z American Type Culture Collection (ATCC). Obejmują one, między innymi, komórki jajnika chomika chińskiego (CHO), komórki NSO, SP2, komórki HeLa, komórki nerki oseska chomika (BHK), komórki nerki małpy (COS), komórki ludzkiego raka wątrobowokomórkowego (np. Hep G2), komórki A549 i szereg innych linii komórkowych. Szczególnie korzystne linie komórkowe są wybrane dzięki określeniu, które linie komórkowe dają wysokie poziomy ekspresji. Innymi liniami komórkowymi, które można zastosować są linie komórkowe owadów, takie jak komórki Sf9. Wówczas, gdy zrekombinowane wektory ekspresyjne kodujące geny przeciwciał są wprowadzane do ssaczych komórek gospodarza, przeciwciała są wytwarzane przez hodowanie komórek gospodarza przez taki okres czasu, który wystarcza na wyrażenie przeciwciała w komórkach gospodarza lub, korzystniej, wydzielenie przeciwciała do pożywki hodowlanej, w której hodowane są komórki gospodarza. Przeciwciała można odzyskiwać z pożywki hodowlanej przy użyciu standardowych metod oczyszczania białek. Komórki gospodarza roślinnego obejmują komórki, np. Nicotiana, Arabidopsis, rzęsy, kukurydzy, pszenicy, ziemniaków itd. Komórki bakteryjnego gospodarza obejmują komórki E. coli i gatunków Streptomyces. Komórki drożdżowego gospodarza obejmują komórki Schizosaccharomyces pombe, Saceharomyces eerevisiae i Piehia pastoris.
Ponadto, ekspresja przeciwciał według wynalazku (lub innych cząstek pochodzących od nich) w produkcyjnych liniach komórkowych można wzmocnić przy użyciu szeregu znanych technik. Przykładowo, powszechnym podejściem wzmocnienia ekspresji w pewnych warunkach jest zastosowanie systemu ekspresji genu syntetazy glutaminianowej (system GS). System GS jest omówiony w całości lub częściowo w połączeniu z patentem europejskim nr 0 216 846, 0 256 055 i 0 323 997 oraz zgłoszeniem patentu europejskiego nr 89 303 964.4.
Należy się spodziewać, że przeciwciała wyrażane w różnych liniach komórkowych lub w zwierzętach transgenicznych będą różniły się wzorem glikozylacji.
Zwierzęta i rośliny transgeniczne
Przeciwciała anty-CD40 według wynalazku można także produkować transgenicznie przez wygenerowanie ssaka lub rośliny, transgenicznych pod względem będących przedmiotem zainteresowania sekwencji łańcucha ciężkiego i lekkiego, oraz przez wytwarzanie przeciwciał w taki sposób, że można je odzyskiwać. W przypadku transgenicznej produkcji u ssaków, przeciwciała anty-CD40 można wytwarzać i odzyskiwać z mleka kóz, krów lub innych ssaków. Zobacz np. patenty USA nr 5 827 690, 5 756 687, 5 750 172 i 5 741 957. W niektórych przypadkach, zwierzęta transgeniczne niebędące człowiekiem, które obejmują Ioci ludzkiej immunoglobuliny mogą być immunizowane CD40 lub jego immunogenną częścią, jak opisano powyżej. Sposoby wytwarzania przeciwciał w roślinach opisano np. w patentach USA nr 6 046 037 i US 5 959 177.
Transgeniczne zwierzęta niebędące człowiekiem lub rośliny są generowane przez wprowadzenie jednej lub większej liczby cząsteczek kwasu nukleinowego kodujących przeciwciało anty-CD40 według wynalazku do zwierzęcia lub rośliny standardowymi technikami transformacji. Zobacz Hogan i patent USA 6 417 429, powyżej. Komórki transgeniczne stosowane do generowania zwierząt transgenicznych mogą być embrionalnymi komórkami macierzystymi lub komórkami somatycznymi. Transgeniczne organizmy, niebędące człowiekiem, mogą być chimerycznymi, niechimerycznymi heterozygotami oraz nie chimerycznymi homozygotami. Zobacz np. Hogan i wsp., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual wyd. 2, Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson i wsp., Mouse Genetics and Transgenics: A Practical Approach, Oxford University Press (2000) oraz Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press (1999). U nie będących człowiekiem transgenicznych zwierząt następuje kierowana dysrupcja i podmiana docelowym konstruktem, który koduje będące przedmiotem zainteresowania łańcuch ciężki i/lub łańcuch lekki. Zwierzęta transgeniczne mogą zawierać i wyrażać cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące łańcuch lekki i ciężki swoiście wiążące CD40, korzystnie ludzkie CD40. Zwierzęta transgeniczne mogą zawierać cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące zmodyfikowane przeciwciało, takie jak przeciwciało jednołańcuchowe, przeciwciało chimeryczne lub przeciwciało humanizowane. Przeciwciała anty-CD40 mogą być wytwarzane w dowolnym zwierzęciu transgenicznym. W korzystnym wykonaniu, zwierzętami niebędącymi człowiekiem są myszy, szczury, owce, świnie, kozy, bydło lub konie. Transgeniczne zwierzę, niebędąPL 214 289 B1 ce człowiekiem, wyraża wyżej wskazane kodowane polipeptydy we krwi, mleku, moczu, ślinie, łzach, śluzie i w innych płynach ustrojowych.
Biblioteki prezentacji na fagu
Niniejszym opisano sposób wytwarzania przeciwciała anty-CD40 lub jego części wiążącej antygen, obejmującego etapy syntetyzowania biblioteki ludzkich przeciwciał na fagu, przeszukiwania biblioteki za pomocą CD40 lub jego części, izolowania faga wiążącego CD40 i uzyskiwania przeciwciał z faga. Przykładowo, jeden ze sposobów przygotowywania biblioteki przeciwciał, do zastosowania w technikach prezentacji na fagu, obejmuje etapy immunizowania niebędącego człowiekiem zwierzęcia, obejmującego Ioci ludzkiej immunoglobuliny, za pomocą CD40 lub jego części antygenowej w celu wytworzenia odpowiedzi odpornościowej, ekstrakcji z immunizowanego zwierzęcia komórek wytwarzających przeciwciało; wyizolowania RNA z wyekstrahowanych komórek, przepisania RNA na drodze odwrotnej transkrypcji w celu wytworzenia cDNA, amplifikowania cDNA przy użyciu startera i wprowadzenia cDNA do wektora do prezentacji na fagu tak, że przeciwciała są wyrażane na fagu. Tą drogą można uzyskiwać zrekombinowane przeciwciała anty-CD40 według wynalazku.
Zrekombinowane ludzkie przeciwciała anty-CD40 według wynalazku można izolować przez przeszukiwanie zrekombinowanej kombinatorycznej biblioteki przeciwciał. Korzystnie, biblioteka jest biblioteką z prezentacją na fagu scFv, generowaną przy użyciu cząsteczek cDNA dla VL i VH wytworzonych z mRNA wyizolowanego z komórek B. Metodologie przygotowywania i przeszukiwania takich bibliotek są znane w dziedzinie. Na rynku dostępne są zestawy do wytwarzania bibliotek z prezentacją na fagu (np. Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, nr kat. 27-9400-01 oraz zestaw prezentacji na fagu Stratagene SurfZAP™, nr kat. 240612). Istnieją również inne metody i odczynniki, które można stosować do wytwarzania i przeszukiwania związanych z przeciwciałami bibliotek z prezentacją na fagu (zobacz, np. patent USA nr 5 223 409; publikacja PCT nr WO 92/18619, WO 91/17271, WO 92/20791, WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047, WO 92/09690; Fuchs i wsp., Bio/Technology 9: 1370-1372 (1991); Hay i wsp., Hum. Antibod. Hybridomas 3: 81-85 (1992); Huse i wsp., Science 246: 1275-1281 (1989); McCafferty i wsp., Nature 348: 552-554 (1990); Griffiths i wsp., EMBO J. 12:7 25-734 (1993); Hawkins i wsp., J. Mol. Biol. 226: 889-896 (19 92); Clackson i wsp., Nature 352: 624-628 (1991); Gram i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3576-3580 (1992); Garrad i wsp., Bio/Technology 9: 1373-1377 (1991); Hoogenboom i wsp., Nuc. Acid Res. 19: 4133-4137 (1991) oraz Barbas i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7978-7982 (1991)).
W celu wyizolowania ludzkich przeciwciał anty-CD40 o pożądanych właściwościach, ludzkie przeciwciało anty-CD40, jak tu opisano, jest najpierw stosowane do wybrania sekwencji ludzkiego łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego posiadających podobną aktywność wiązania z CD40, przy użyciu metod typu mapowania epitopu {ang. epitope imprinting), opisanych w publikacji PCT nr WO 93/06213. Biblioteki przeciwciał stosowane w tej metodzie korzystnie są bibliotekami scFv przygotowanymi i przeszukiwanymi jak opisano w publikacji PCT nr WO 92/01047, McCafferty i wsp., Nature 348: 552-554 (1990) oraz Griffiths i wsp., EMBO J. 12: 725-734 (1993). Biblioteki przeciwciał scFv są korzystnie przeszukiwane przy użyciu ludzkiego CD40 jako antygenu.
Po wyizolowaniu wstępnych domen ludzkich VL i VH, przeprowadzane są eksperymenty typu „mieszania i dopasowywania” (ang. mix and match), w których różne pary wstępnie wybranych segmentów VL i Vh są przeszukiwane pod kątem wiązania z CD40, w celu wyselekcjonowania korzystnych kombinacji par VL/VH. Ponadto, do dalszego polepszenia jakości przeciwciała, segmenty VL i Vh z korzystnych par(y) VL/VH można losowo mutować, korzystnie w regionie CDR3 z VH i/lub VL, w procesie analogicznym do procesu mutacji somatycznej in vivo, odpowiedzialnego za dojrzewanie powinowactwa przeciwciał podczas naturalnej odpowiedzi odpornościowej. To dojrzewanie powinowactwa in vitro można osiągnąć przez amplifikację domen VH i VL, przy użyciu starterów do PCR komplementarnych do VH CDR3 lub VL CDR3, odpowiednio, które to startery zostały „naszpikowane” losową mieszaniną czterech zasad nukleotydowych w pewnych pozycjach, tak że uzyskiwane produkty PCR kodują segmenty VH i VL, w których losowe mutacje są wprowadzone w regiony CDR3 VH i/lub VL. Takie losowo zmutowane segmenty VH i Vl można ponownie przeszukiwać w badaniu przesiewowym pod kątem wiązania z CD40.
Po badaniu przesiewowym i izolacji przeciwciała anty-CD40 według wynalazku, z biblioteki prezentowanych zrekombinowanych immunoglobulin, kwasy nukleinowe kodujące wyselekcjonowane przeciwciało można odzyskiwać z prezentowanego pakietu (np. z genomu faga) i subklonować w wektorach ekspresyjnych z zastosowaniem standardowych technik rekombinacji DNA. Jeśli pożądane, kwas nukleinowy można następnie poddawać manipulacjom w celu otrzymania innych form przeciw28
PL 214 289 B1 ciała, jak opisano poniżej. W celu wyrażenia zrekombinowanego ludzkiego przeciwciała, wyizolowanego przez przeszukiwanie biblioteki kombinatorycznej DNA, kodujące przeciwciało jest klonowane w rekombinowanym wektorze ekspresyjnym i wprowadzane do komórek ssaczego gospodarza, jak opisano powyżej.
Przełączanie klas
Niniejszym opisano sposób przekształcania klas i podklas przeciwciała anty-CD40 w inną klasę lub podklasę. Przy użyciu metod dobrze znanych w dziedzinie, izolowana jest cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca VL lub VH, która nie obejmuje żadnych sekwencji kwasu nukleinowego kodującego CL lub CH. Cząsteczka kwasu nukleinowego jest następnie łączona funkcjonalnie z sekwencją kwasu nukleinowego kodującą CL lub CH z pożądanej klasy lub podklasy immunoglobuliny. Można to osiągnąć przy użyciu wektora lub cząsteczki kwasu nukleinowego, który obejmuje łańcuch CL lub CH, jak opisano powyżej. Przykładowo, przeciwciało anty-CD40, które pierwotnie było IgM można przełączyć w klasę IgG. Ponadto, przełączanie klas można zastosować do przekształcenia jednej podklasy IgG w inną np. IgG1 w IgG2. Inny sposób wytwarzania przeciwciała według wynalazku, obejmującego pożądany izotyp, obejmuje etapy izolowania kwasu nukleinowego, kodującego łańcuch ciężki przeciwciała anty-CD40 i kwasu nukleinowego kodującego łańcuch lekki przeciwciała anty-CD40, izolowania sekwencji kodującej region VH, ligacji sekwencji VH z sekwencją kodującą domenę stałą łańcucha ciężkiego pożądanego izotypu, ekspresji genu łańcucha lekkiego i konstruktu łańcucha ciężkiego w komórce i zebrania przeciwciała anty-CD40 o pożądanym izotypie.
Przeciwciała deimmunizowane
Inną drogą wytwarzania przeciwciał o zredukowanej immunogenności jest deimmunizacja przeciwciał. Przeciwciało może być deimmunizowane przy użyciu technik opisanych np. w publikacji PCT nr WO 98/52976 i WO 00/34317.
Przeciwciała zmutowane
Cząsteczki kwasu nukleinowego, wektory i komórki gospodarza można stosować do wytworzenia zmutowanych przeciwciał anty-CD40. Przeciwciała można mutować w domenach zmiennych łańcuchów ciężkiego i/lub lekkiego np. w celu zmiany właściwości wiążących przeciwciała. Przykładowo, można wytworzyć mutację, w jednym lub większej liczbie regionów CDR, w celu podniesienia lub obniżenia KD przeciwciała wobec CD40, podniesienia lub obniżenia Koff lub zmiany swoistości wiązania przeciwciała. Techniki mutagenezy ukierunkowanej są dobrze znane w dziedzinie. Zobacz np. Sambrook i wsp. oraz Ausubel i wsp., powyżej. Mutacje są wytwarzane w reszcie ife aminokwasowej, o której wiadomo, że jest zmieniona w porównaniu z linią zarodkową w domenie zmiennej przeciwciała anty-CD40. Jedna lub większa liczba mutacji może być wytwarzana w reszcie aminokwasowej, o której wiadomo, że jest zmieniona w porównaniu z linią zarodkową w regionie CDR lub w regionie zrębowym domeny zmiennej lub w domenie stałej przeciwciała monoklonalnego 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T- V88A-V97A, 3.I.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C10 9A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K i 24.2.1. Jedna lub większa liczba mutacji może być otrzymywana w reszcie aminokwasowej, o której wiadomo, że jest zmieniona w porównaniu z linią zarodkową w regionie CDR lub w regionie zrębowym domeny zmiennej o sekwencji aminokwasowej wybranej spośród SEKW. NR ID.: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94, 100, 102, 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96, 98, 100 lub 102, lub której sekwencja nukleotydową jest przedstawiona w SEKW. NR ID.: 3, 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 93, 99, 101, I, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 91, 95, 97, 99 lub 101.
Region zrębowy jest zmutowany tak, że uzyskany region(y) zrębowy posiada sekwencję aminokwasową odpowiadającego genu linii zarodkowej. Mutacje można wytworzyć w regionie zrębowym lub w domenie stałej w celu zwiększenia czasu półtrwania przeciwciała anty-CD40. Zobacz np. publikacja PCT nr WO 00/09560. Mutacja w regionie zrębowym lub w domenie stałej może być także wykonana w celu zmiany immunogenności przeciwciała, w celu dostarczenia miejsca kowalencyjnego lub nie kowalencyjnego wiązania z inną cząsteczką lub w celu zmiany takich właściwości, jak utrwalenie kompleksu, wiązanie FcR i ADCC. Pojedyncze przeciwciało może mieć mutacje w jednym lub większej liczbie regionów zrębowych, w domenie stałej i w regionach zmiennych.
W domenach VH lub VL zmutowanego przeciwciała anty-CD40 może znajdować się od 1 do 18, włączając każdą liczbę pomiędzy, mutacji aminokwasowych w porównaniu z przeciwciałem anty-CD40 przed mutacją. Mutacje mogą wystąpić w jednym lub większej liczbie regionów CDR. Ponadto, każda
PL 214 289 B1 z mutacji może być konserwatywnym podstawieniem aminokwasowym. W domenach zmiennych korzystnie występuje nie więcej niż 5, 4, 3, 2 lub 1 zmiana aminokwasowa.
Przeciwciała zmodyfikowane
Możliwe jest również otrzymanie fuzji przeciwciała lub immunoadhezyny, obejmującej całe lub część przeciwciała anty-CD40 według wynalazku w połączeniu z innym polipeptydem. Fuzja taka może zawierać tylko domeny zmienne przeciwciała anty-CD40 w połączeniu z polipeptydem. Domena VH przeciwciała anty-CD40 może być połączona z pierwszym polipeptydem, podczas gdy domena VL przeciwciała anty-CD40 może być połączona z drugim polipeptydem, który łączy się z pierwszym polipeptydem w taki sposób, że domeny VH i VL mogą oddziaływać ze sobą tworząc miejsce wiązania przeciwciała. Alternatywnie, domena VH może być oddzielona od domeny VL łącznikiem tak, że domeny VH i VL mogą oddziaływać jedna z drugą (zobacz poniżej pod: przeciwciała jednołańcuchowe). Przeciwciało VH-łącznik-VL jest następnie łączone z będącym przedmiotem zainteresowania polipeptydem. Fuzja przeciwciała jest przydatna w kierowaniu polipeptydu do komórki lub tkanki wyrażającej CD40. Polipeptyd może być czynnikiem terapeutycznym, takim jak toksyna, czynnikiem wzrostu lub innym białkiem regulacyjnym lub może być czynnikiem diagnostycznym, takim jak z łatwością uwidaczniany enzym, np. peroksydazą chrzanową. Dodatkowo można tworzyć fuzje przeciwciała, w których dwa (lub większa liczba) przeciwciał jednołańcuchowych jest łączona ze sobą. Jest to przydatne jeśli istnieje potrzeba otrzymania przeciwciała diwalentnego lub poliwalentnego, na pojedynczym łańcuchu polipeptydowym lub jeśli istnieje potrzeba otrzymania przeciwciała biswoistego.
W celu wytworzenia przeciwciała jednołańcuchowego, (scFv), fragmenty DNA kodujące Vh- i VLsą połączone funkcjonalnie z innym fragmentem kodującym elastyczny łącznik, np. kodujący sekwencję aminokwasową (Gly4-Ser)3 tak, że sekwencje VH i VL można wyrażać jako ciągłe białko o pojedynczym łańcuchu, z domenami VL i VH połączonymi elastycznym łącznikiem. Zobacz np. Bird i wsp., Science 242: 423-426 (1988); Huston i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988); McCafferty i wsp., Nature 348: 552-554 (1990). Przeciwciało jednołańcuchowe może być monowalentne, jeśli użyte są tylko pojedyncze VH i VL, biwalentne, jeśli użyte są dwa VH i VL lub poliwalentne, jeśli użytych jest więcej VH i VL. Można wytwarzać przeciwciała bispecyficzne lub poliwalentne, które swoiście wiążą CD40 i inne cząsteczki.
Możliwe jest również przygotowanie innych zmodyfikowanych przeciwciał stosując cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące przeciwciało anty-CD40. Przykładowo, przy użyciu standardowych technik biologii molekularnej, stosując wiedzę ze szczegółowego opisu, można wytwarzać cząsteczki typu „Kappa bodies” (Ill i wsp., Protein Eng. 10: 949-57 (1997)), „Minibodies” (Martin i wsp., EMBO J. 13: 5303-9 (1994)), „Diabodies” (Holliger i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)) lub „Janusins” (Traunecker i wsp., EMBO J. 10: 3655-3659 (1991) i Traunecker i wsp., Int. J. Cancer (Suppl.) 7: 51-52 (1992)).
Biswoiste przeciwciała lub fragmenty wiążące antygen można wytwarzać różnymi sposobami włączając fuzje hybrydoma lub łączenie fragmentów Fab'. Zobacz np. Songsivilai i Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990), Kostelny i wsp., J. Immunol. 148: 154 7-1553 (1992). Dodatkowo, biswoiste przeciwciała można wytwarzać jako „diprzeciwciała” (ang. diabodies) lub „Janusins”. Przeciwciało biswoiste wiąże dwa różne epitopy z CD40. Przeciwciało biswoiste może mieć pierwszy łańcuch ciężki i pierwszy łańcuch lekki z przeciwciała monoklonalnego 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-Dl6E, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K i 24.2.1 oraz dodatkowy łańcuch ciężki i łańcuch lekki przeciwciała. Dodatkowy łańcuch lekki i łańcuch ciężki mogą także pochodzić z jednego z wymienionych powyżej przeciwciał monoklonalnych, lecz są inne od pierwszego łańcucha ciężkiego i lekkiego.
Opisane powyżej zmodyfikowane przeciwciała są przygotowywane przy użyciu jednej lub większej liczby domen zmiennych lub regionów CDR dostarczonego tu ludzkiego monoklonalnego przeciwciała anty-CD40, sekwencji aminokwasowej omawianego przeciwciała monoklonalnego lub łańcucha ciężkiego lub łańcucha lekkiego kodowanego przez sekwencję kwasu nukleinowego kodującą omawiane przeciwciało monoklonalne.
Przeciwciała derywatyzowane i znakowane
Przeciwciało anty-CD40 lub część wiążąca antygen według wynalazku można derywatyzować lub łączyć z inną cząsteczką (np. innym peptydem lub białkiem). Zazwyczaj, przeciwciała lub ich część jest derywatyzowana tak, że derywatyzacja lub znakowanie nie zaburzają niewłaściwie wiązania CD40. Zatem, przeciwciała i części przeciwciała powinny obejmować zarówno niezmienione, jak
PL 214 289 B1 i zmodyfikowane formy opisanych tu ludzkich przeciwciał anty-CD40. Przykładowo przeciwciało lub część przeciwciała według wynalazku mogą być połączone funkcjonalnie (przez sprzęganie chemiczne, fuzję genetyczną, łączenie nie kowaiencyjne lub inaczej) z jedną lub większą liczbą jednostek molekularnych, takich jak inne przeciwciało (np. przeciwciało biswoiste lub diprzeciwciało), czynnik do wykrywania, czynnik cytotoksyczny, czynnik farmace utyczny i/lub białko lub peptyd, który pośredniczy w łączeniu przeciwciała lub części przeciwciała z innymi cząsteczkami (takimi jak region rdzenia streptawidyny lub znacznik polihistydynowy).
Jeden typ derywatyzowanego przeciwciała jest wytwarzany przez sieciowanie dwóch lub większej liczby przeciwciał (tego samego typu lub różnych typów, np. w celu stworzenia przeciwciała biswoistego). Stosowne łączniki sieciujące obejmują te, które są bifunkcyjne, posiadają dwie różnie reaktywne grupy oddzielone odpowiednim łącznikiem (np. estrem m-maleimidobenzoilo-N-hydroksysukcynoimidowym) lub są homobifunkcyjne (np. suberynian disukcynoimidylowy). Łączniki takie są dostępne z Pierce Chemical Company, Rockford, 111.
Innym typem derywatyzowanego przeciwciała jest przeciwciało znakowane. Przydatne wykrywane czynniki, którymi można derywatyzować przeciwciało według wynalazku lub jego część wiążącą antygen, obejmują związki fluorescencyjne, włączając fluoresceinę, izotiocyjanian fluoresceiny, rodaminę, chlorek 5-dimetylamino-1-naftalenosulfonylowy, fikoerytrynę, fosforylantanowcowe i tym podobne. Przeciwciało można także znakować przydatnymi w detekcji enzymami, takimi jak peroksydaza chrzanowa, β-galaktozydaza, lucyferaza, fosfataza alkaliczna, oksydaza glukozy i podobne. Gdy przeciwciało jest wyznakowane możliwym do wykrywania enzymem, jego detekcja odbywa się przez dodanie dodatkowych odczynników, które są wykorzystywane przez enzym do wytworzenia widocznego produktu reakcji. Przykładowo, kiedy obecna jest peroksydaza chrzanowa, dodanie nadtlenku wodoru i diaminobenzydyny prowadzi do powstania barwnego produktu reakcji. Przeciwciało można także wyznakować biotyną i wykrywać przez pośredni pomiar wiązania awidyny lub streptawidyny. Przeciwciało można także wyznakować określonym wcześniej epitopem polipeptydowym rozpoznawanym przez drugorzędową cząsteczkę reporteową (np. sekwencje pary suwaka leucynowego, miejsca wiązania dla drugorzędowych przeciwciał, domeny wiążące metal, znaczniki epitopowe). Znaczniki mogą być podłączone przez ramiona łącznikowe o różnej długości, w celu zredukowania potencjalnej zawady przestrzennej.
Przeciwciało anty-CD40 można także znakować aminokwasami wyznakowanymi radioaktywnie. Znacznik radioaktywny można zastosować zarówno do celów diagnostycznych , jak i terapeutycznych. Przykładowo, znacznik radioaktywny można zastosować do wykrywania guzów, wyrażających CD40, za pomocą promieniowania X lub innych technik diagnostycznych. Ponadto, znacznik radioaktywny można zastosować terapeutycznie jako toksynę dla komórki rakowej lub dla guzów. Przykłady znacz3 14 ników dla polipeptydów obejmują nieograniczająco następujące radioizotopy lub radionuklidy - 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, „Tc, 111In, 125I, 131I.
Przeciwciało anty-CD40 może być poddane derywatyzacji grupą chemiczną taką jak glikol polietylenowy (PEG), grupą metylową lub etylową, lub grupą węglowodanową. Grupy te są przydatne w polepszaniu właściwości biologicznych przeciwciała, np. w wydłużaniu okresu półtrwania w surowicy lub w polepszaniu wiązania z tkanką.
Kompozycje farmaceutyczne i zestawy
Ludzkie przeciwciało agonistyczne, anty-CD40, może stanowić składnik aktywny kompozycji do leczenia osobników wymagających immunostymulacji. Kompozycje takie są przydatne do leczenia, zapobiegania, redukcji częstości lub ciężkości zakażenia, włączając zakażenia wirusowe i bakteryjne, do leczenia zaburzeń hiperproliferacyjnych, włączając stany nowotworowe i przed nowotworowe, do leczenia stanów genetycznego niedoboru odpornościowego, takich jak zespół hiper-IgM oraz do leczenia pierwotnych i mieszanych stanów niedoboru odpornościowego, włączając stany charakteryzujące się neutropenią u ssaków, w tym ludzi. Osobniki poddawane terapii agonistycznym przeciwciałem anty-CD40 obejmują dowolnego osobnika potrzebującego wzmocnienia odporności, w tym lecz nie wyłącznie, w podeszłym wieku oraz osobniki z obniżoną odpornością, przykładowo po chemioterapii.
Zaburzenia hiperproliferacyjne, które można leczyć przeciwciałem agonistycznym anty-CD40 według wynalazku, mogą dotyczyć dowolnej tkanki lub narządu i obejmują, lecz nie ograniczają się do, raka mózgu, płuc, komórki płaskiej nabłonka, pęcherza, żołądka, trzustki, sutka, głowy, szyi, wątroby, nerki, jajnika, prostaty, okrężnico-odbytnicy, przełyku, ginekologicznego, nosogardła lub tarczycy, czerniaka, chłoniaka, białaczki lub czerniaka mnogiego. W szczególności, ludzkie przeciwciała
PL 214 289 B1 agonistyczne anty-CD40 według wynalazku są przydatne do leczeniu raków sutka, prostaty, okrężnicy i płuc.
Leczenie może wymagać podawania jednego lub większej liczby monoklonalnych przeciwciał agonistycznych anty-CD40 według wynalazku lub jego fragmentów wiążących antygen, samego lub z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem. W użytym tu znaczeniu „farmaceutycznie dopuszczalny nośnik” oznacza dowolny i wszystkie rozpuszczalniki, podłoża dyspersyjne, środki opłaszczające, czynniki przeciwbakteryjne i przeciwgrzybicze, czynniki izotoniczne i opóźniające absorpcję i im podobne, które są fizjologicznie zgodne. Wybranymi przykładami farmaceutycznie dopuszczalnych nośników są woda, sól fizjologiczna, sól fizjologiczna buforowana fosforanem, dekstroza, glicerol, etanol i podobne, jak również ich kombinacje. W wielu przypadkach, korzystne będzie włączenie do kompozycji czynników izotonicznych, przykładowo, cukrów, polialkoholi, takich jak mannitol, sorbitol lub chlorku sodowego. Dodatkowymi przykładami substancji dopuszczalnych farmaceutycznie są czynniki zwilżające lub niewielkie ilości substancji pomocniczych, takich jak czynniki zwilżające lub emulgujące, środki konserwujące lub bufory, które wydłużają czas przechowywania lub skuteczność przeciwciała.
Przeciwciała agonistyczne anty-CD40 według wynalazku i kompozycje je obejmujące można podawać w kombinacji z jednym lub większą liczbą czynników terapeutycznych, diagnostycznych lub profilaktycznych. Dodatkowe czynniki terapeutyczne obejmują inne czynniki przeciwneoplastyczne, przeciwnowotworowe, przeciwangiogeniczne lub chemioterapeutyczne. Takie dodatkowe czynniki mogą znajdować się w tej samej kompozycji lub mogą być podawane oddzielnie. Jedno lub większą liczbę przeciwciał agonistycznych anty-CD40 można stosować jako szczepionkę lub adiuwanty do szczepionki.
Kompozycje farmaceutyczne mogą występować w różnych postaciach, przykładowo, w postaci ciekłej, pół-stałej i stałej, jak ciekłe roztwory (np., roztwory do iniekcji i infuzji), w postaci rozproszonej lub w formie zawiesiny, jako tabletki, pigułki, proszki, liposomy i czopki. Korzystna forma zależy od zamierzonego trybu podawania i zastosowania terapeutycznego. Zazwyczaj korzystne kompozycje występują w postaci roztworów do iniekcji i infuzji, jak kompozycje podobne do tych stosowanych w biernej immunizacji ludzi. Korzystnym trybem podawania jest podawanie pozajelitowe (np. dożylne, podskórne, dootrzewnowe, domięśniowe). W korzystnym wykonaniu, przeciwciało jest podawane przez dożylne infuzje lub iniekcje. W innym korzystnym wykonaniu, przeciwciało jest podawane przez domięśniową lub podskórną iniekcję.
Kompozycje farmaceutyczne zazwyczaj muszą być sterylne i stabilne w warunkach produkcji i przechowywania. Kompozycja może być przygotowana w postaci roztworu, mikroemulsji, dyspersji, liposomu lub w innej uporządkowanej strukturze, odpowiedniej dla leków o wysokim stężeniu. Sterylne roztwory do iniekcji można przygotowywać przez wprowadzenie wymaganej ilości przeciwciała anty-CD40 do odpowiedniego rozpuszczalnika, z jednym lub z kombinacją większej liczby składników wymienionych powyżej, o ile konieczne, a następnie sterylizowanie przez filtrację. Zazwyczaj, dyspersje są wytwarzane przez wprowadzenie aktywnego składnika do sterylnego nośnika, który zawiera podstawowe podłoże dyspergujące i wymagane inne składniki z wymienionych powyżej. W przypadku sterylnych proszków do wytwarzania sterylnych roztworów do iniekcji, korzystnymi sposobami wytwarzania są suszenie w próżni i liofilizacja w wyniku których otrzymywany jest aktywny składnik w postaci proszku, plus dowolny dodatkowy, pożądany składnik z jego wysterylizowanego przez filtrację roztworu. Prawidłową płynność roztworu można utrzymać, przykładowo, przez stosowanie środków opłaszczających, takich jak lecytyna, przez podtrzymanie cząsteczek o odpowiednim rozmiarze, w przypadku dispersji, oraz zastosowanie środków powierzchniowo czynnych. Przedłużenie absorpcji kompozycji do iniekcji można osiągnąć przez włączenie do kompozycji czynnika, który opóźnia absorpcję, przykładowo, soli monostearynianu i żelatyny.
Przeciwciała według niniejszego wynalazku można podawać różnymi sposobami znanymi specjalistom, chociaż dla wielu zastosowań terapeutycznych korzystną drogą/trybem podawania jest infuzja podskórna, domięśniowa lub dożylna. Specjalistom w dziedzinie wiadomo, że droga i/lub tryb podawania będą różne w zależności od pożądanych wyników.
Aktywny składnik kompozycji przeciwciał można przygotować z nośnikiem, który będzie chronić przeciwciało przed gwałtownym uwalnianiem, tak jak w przypadku preparatów z kontrolowanym uwalnianiem, włączając implanty, przezskórne plastry i systemy dostarczania wykorzystujące mikrokapsułki. Można zastosować biodegradowalne, biokampatybilne polimery, takie jak kopolimer etylenu z octanem winylu, polibezwodniki, polikwas glikolowy, kolagen, poliortoestry i polikwas mlekowy. Wiele sposobów wytwarzania takich preparatów jest opatentowanych lub ogólnie znanych specjalistom
PL 214 289 B1 w dziedzinie. Zobacz np. Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems (J. R. Robinson, red., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978).
Przeciwciało anty-CD40 według wynalazku można podawać doustnie, przykładowo z obojętnym rozcieńczalnikiem lub z przyswajalnym, jadalnym nośnikiem. Związek (i inne składniki, jeśli pożądane) można także umieścić w twardej lub miękkiej żelatynowej kapsułce, w sprasowanej tabletce lub wprowadzić bezpośrednio do diety osobnika. Do doustnego podawania terapeutycznego, przeciwciało anty-CD40 można wprowadzać z zarobkami i stosować w odpowiedniej do przyjmowania postaci tabletek, tabletek policzkowych, kołaczyków, kapsułek, eliksirów, zawiesin, syropów, opłatków do leków i podobnych. Do podawania związku według wynalazku, innego niż podawanie pozajelitowe, może być konieczne opłaszczenie składnika za pomocą lub jednoczesne podanie, składnika z materiałem zapobiegającym jego inaktywację.
Do kompozycji można także wprowadzić dodatkowe aktywne składniki. Przeciwciało anty-CD40 według wynalazku może być wytworzone w postaci jednego preparatu z i/lub jednocześnie podawane z jednym lub większą liczbą dodatkowych czynników terapeutycznych. Czynniki te obejmują, ale bez ograniczeń, przeciwciała, które wiążą inne czynniki docelowe (np. przeciwciała, które wiążą jeden lub więcej czynników wzrostu lub cytokiny lub ich receptory powierzchniowe, takie jak anty-CTL4-przeciwciało), czynniki przeciwneoplastyczne, czynniki przeciwnowotworowe, czynniki chemioterapeutyczne, analogi peptydów, które aktywują CD40, rozpuszczalne CD40L, jeden lub większą liczbę czynników chemicznych, które aktywują CD40 i/lub inne znane w dziedzinie czynniki, które mogą wzmocnić odpowiedź immunologiczną przeciwko komórkom nowotworowym, np. IFN^! IL-2, IL-8, IL-12, IL-15, IL-18, IL-23, IFN-γ i GM-CSF. Takie terapie złożone mogą wymagać niższych dawek przeciwciała anty-CD40, jak również czynników podawanych jednocześnie, w celu uniknięcia możliwych działań toksycznych lub komplikacji towarzyszących różnym monoterapiom.
Przeciwciała agonistyczne anty-CD40 według wynalazku i obejmujące je kompozycje można także stosować w kombinacji z innymi trybami terapeutycznymi, w szczególności z radioterapią.
Kompozycje mogą obejmować „skuteczną terapeutycznie ilość” lub „skuteczną profilaktycznie ilość” przeciwciała lub fragmentu wiążącego antygen według wynalazku. „Skuteczna terapeutycznie ilość” odnosi się do skutecznej ilości, w dawkach i przez okres czasu, koniecznej do osiągnięcia pożądanego efektu terapeutycznego. Skuteczna terapeutycznie ilość przeciwciała lub części przeciwciała może być różna, w zależności od czynników takich jak stadium choroby, wiek, płeć i waga osobnika oraz zdolność przeciwciała lub części przeciwciała do wywoływania pożądanej odpowiedzi u osobnika. Skuteczna terapeutycznie ilość jest także taka przy której korzystne efekty terapeutyczne przeciwciała lub części przeciwciała przeważają nad efektami toksycznymi lub przynoszącymi szkodę. „Skuteczna profilaktycznie ilość” odnosi się do skutecznej ilości, w dawkach i przez okres czasu, koniecznej do osiągnięcia pożądanego efektu profilaktycznego. Zazwyczaj, ponieważ dawka profilaktyczna jest stosowana u osobnika przed lub we wczesnych stadiach choroby, skuteczna profilaktycznie ilość będzie mniejsza od ilości skutecznej terapeutycznie.
Tryby dawkowania można ustalić tak, aby dostarczały optymalną pożądaną odpowiedź (np. odpowiedź terapeutyczną lub profilaktyczną). Przykładowo, można podawać pojedynczy bolus, można podawać szereg podzielonych dawek przez pewien czas lub dawkę można proporcjonalnie redukować lub podnosić, w zależności od krytycznej sytuacji terapeutycznej. Szczególnie korzystne jest przygotowywanie kompozycji do podawania pozajelitowego w formie jednostki dawkowania do łatwego podawania i ujednolicenia dawek. W użytym tu znaczeniu, postać jednostki dawkowania odnosi się do fizycznie osobnych jednostek, stosownych jako jednostkowe dawki do leczenia osobników ssaczych; każda jednostka zawiera ustaloną wcześniej ilość aktywnego składnika obliczoną tak, aby dawała pożądany efekt terapeutyczny, w połączeniu z wymaganym nośnikiem farmaceutycznym. Szczegółowy opis postaci jednostek dawkowania jest podyktowany przez i bezpośrednio zależy od:
(a) unikatowych cech charakterystycznych przeciwciała anty-CD40 lub części przeciwciała, a także określonego do osiągnięcia efektu terapeutycznego lub profilaktycznego oraz (b) ograniczeń właściwych dziedzinie łączenia takiego przeciwciała do leczenia wrażliwości u osobników.
Przykładowy, lecz nie jedyny, zakres skutecznych terapeutycznie lub profilaktycznie ilości przeciwciała lub części przeciwciała według wynalazku wynosi 0,025 do 50 mg/kg, korzystniej 0,1 do 50 mg/kg, korzystniej 0,1-25, 0,1 do 10 lub 0,1 do 3 mg/kg. Należy zaznaczyć, że wartości dawki mogą różnić się w zależności od typu i ciężkości stanu, który ma być złagodzony. Należy ponadto rozumieć, że specyficzne tryby dawkowania dla danego dowolnego osobnika powinny być dostosowane do czaPL 214 289 B1 su zgodnego z zapotrzebowaniem osobnika i profesjonalnej opinii osoby podającej lub nadzorującej podawania kompozycji oraz, że podane tu zakresy dawek są jedynie przykładowymi i nie mają na celu ograniczenia zakresu i praktycznego wykorzystania zastrzeżonej kompozycji.
Niniejszym opisano zestawy obejmujące przeciwciało anty-CD40 lub część przeciwciała według wynalazku lub kompozycję obejmującą takie przeciwciało. Zestaw może zawierać, oprócz przeciwciała lub kompozycji, czynniki diagnostyczne lub terapeutyczne. Zestaw może także zawierać instrukcje użycia w metodzie diagnostycznej lub terapeutycznej. Korzystnie, zestaw zawiera przeciwciało lub obejmującą je kompozycję oraz czynnik diagnostyczny, który można zastosować w metodzie opisanej poniżej. Również korzystnie zestaw zawiera przeciwciało lub obejmującą je kompozycję oraz jeden lub większą liczbę czynników terapeutycznych, które można zastosować w metodzie opisanej poniżej.
Zgodnie z niniejszym ujawnieniem, kompozycje hamujące nieprawidłowy wzrost komórki u ssaka obejmują pewną ilość przeciwciała według wynalazku w kombinacji z pewną ilością czynnika chemoterapeutycznego, przy czym ilości związku, soli, solwatu lub proleku i czynnika chemioterapeutycznego są razem skuteczne w hamowaniu nieprawidłowego wzrostu komórki. W dziedzinie znanych jest obecnie wiele czynników chemioterapeutycznych. Czynnik chemioterapeutyczny może być wybrany z grupy obejmującej: inhibitory mitotyczne, czynniki alkilujące, anty-metabolity, interkalujące antybiotyki, inhibitory czynników wzrostu, inhibitory cyklu komórkowego, enzymy, inhibitory topoizomeraz, modyfikatory odpowiedzi biologicznych, anty-hormony, np. anty-androgeny i czynniki anty-angiogenne.
W kombinacji z przeciwciałem anty-CD40 według wynalazku można stosować czynniki antyangiogenne, takie jak inhibitory MMP-2 (metaloproteinaza macierzy 2), inhibitory MMP-9 (metaloproteinaza macierzy 9) oraz inhibitory COX-II (cyklooksygenazy II). Przykłady przydatnych inhibitorów COX-II obejmują CELEBREXTM (alecoxib), valdecoxib i rofecoxib. Przykłady przydatnych inhibitorów metaloproteinazy macierzy opisano w WO nr 96/33172 (opublikowany 24 października 1996), WO nr 96/27583 (opublikowany 7 marca 1996), europejskim zgłoszeniu patentowym nr 97 304 971.1 (zgłoszone 8 lipca 1997), europejskim zgłoszeniu patentowym nr 99 308 617.2 (zgłoszone 29 października 1999), WO nr 98/07697 (opublikowany 26 lutego 1998), WO nr 98/03516 (opublikowany 29 stycznia 1998), WO nr 98/34918 (opublikowany 13 sierpnia 1998), WO nr 98/34915 (opublikowany 13 sierpnia 1998), WO nr 98/33768 (opublikowany 6 sierpnia 1998), WO nr 98/30566 (opublikowany 16 lipca
1998) , europejskiej publikacji patentowej nr 606 046 (opublikowanej 13 lipca 1994), europejskiej publikacji patentowej nr 931 788 (opublikowanej 28 lipca 1999), WO nr 90/05719 (opublikowany 31 maja 1990), WO nr 99/52910 (opublikowany 21 października 1999), WO nr 99/52889 (opublikowany 21 października 1999), WO nr 99/29667 (opublikowany 17 czerwca 1999), międzynarodowym zgłoszeniu PCT nr PCT/IB98/01113 (zgłoszone 21 lipca 1998), europejskim zgłoszeniu patentowym nr 99 302 232.1 (zgłoszone 25 marca 1999), zgłoszeniu patentowym Wielkiej Brytanii nr 9 912 961.1 (zgłoszone 3 czerwca 1999), tymczasowym zgłoszeniu USA nr 60/148 464 (zgłoszone 12 sierpnia 1999), patencie USA nr 5 863 949 (wydany 26 stycznia 1999), patencie USA nr 5 861 510 (wydany 19 stycznia
1999) i europejskiej publikacji patentowej nr 780 386 (opublikowanej 25 czerwca 1997).
Korzystnymi inhibitorami MMP są te, które nie powodują bólu stawów. Korzystniejsze są te, które selektywnie hamują MMP-2 i/lub MMP-9 w porównaniu z innymi metaloproteinazami macierzy (tzn. MMP-1, MMP-3, MMP-4, MMP-5, MMP-6, MMP-7, MMP-8, MMP-10, MMP-11, MMP-12 i MMP-13). Specyficznymi przykładami inhibitorów MMP są: AG-3340, RO 32-3555, RS 13-0830 i związki wymienione poniżej: kwas 3-[[4-(4-fluorofenoksy)benzenosulfonylo]-(1-hydroksykarbamoilocyklopentylo)amino]propionowy; hydroksyamid kwasu 3-egzo-3-[4-(4-fluorofenoksy)benzenosulfonyloamino]-8-oksa-bicyklo-[3.2.1]oktano-3-karboksylowego; hydroksyamid kwasu (2R,3R)-1-[4-(2-chloro-4-fluorobenzyloksy)benzenosulfonylo]-3-hydroksy-3-metylopiperydyno-2-karboksylowego; hydroksyamid kwasu 4-[4-(4-fluorofenoksy)benzenosuIfonyloamino]tetrahydropirano-4-karboksylowego; kwas 3-[[4-(4-fluorofenoksy)benzenosulfonylo]-(1-hydroksykarbamoilocyklobutylo)amino]propionowy; hydroksyamid kwasu 4-[4-(4-chlorofenoksy)benzenosulfonyloamino]tetrahydropirano-4-karboksylowego; hydroksyamid kwasu (R)-3-[4-(4-chlorofenoksy)benzenosulfonyloamino]tetrahydropirano-3-karboksylowego; hydroksyamid kwasu (2R,3R)-1-[4-(4-fluoro-2-metylobenzyloksy)benzenosulfonylo]-3-hydroksy-3-metylopiperydyno-2-karboksylowego; kwas 3-[[4-(4-fluorofenoksy)benzenosulfonylo]-(1-hydroksykarbamoilo-1-metyloetylo)amino]-propionowy; kwas 3-[[4-(4-fluorofenoksy)benzenosulfonylo]-(4-hydroksykarbamoilotetrahydropirano-4-ylo)amino]propionowy; hydroksyamid kwasu 3-egzo-3-[4-(4-chlorofenoksy)benzenosulfonyloamino]-8-oksa-bicyklo[3.2.1]oktano-3-karboksylowego; hydroksyamid kwasu 3-endo-3-[4-(4-fluorofenoksy)benzenosulfonyloamino]-8-oksa-bicyklo[3.2.1]oktano-3-karboksylowego
PL 214 289 B1 i hydroksyamid kwasu (R)-3-[4-(4-fluorofenoksy)benzenosulfonyloamino]tetrahydrofurano-3-karboksylowego oraz farmaceutycznie dopuszczalne sole i solwaty tych związków.
Związek według wynalazku można także użyć z inhibitorami transdukcji sygnału, takimi jak czynniki, które hamują odpowiedzi EGF-R (receptora epidermalnego czynnika wzrostu), jak przeciwciała EGF-R, przeciwciała EGF i cząsteczki, które są inhibitorami EGF-R; inhibitorami VEGF (naczyniowy śródbłonkowy czynnik wzrostu), takimi jak receptory VEGF i cząsteczki, które hamują VEGF oraz inhibitorami receptora erbB2, takimi jak organiczne cząsteczki lub przeciwciała, które wiążą się z receptorem erbB2, przykładowo, HERCEPTINTM (Genentech, Inc.). Inhibitory EGF-R opisano przykładowo w WO nr 95/19970 (opublikowany 27 lipca 1995), WO nr 98/14451 (opublikowany 9 kwietnia 1998), WO nr 98/02434 (opublikowany 22 stycznia 1998) i patencie USA nr 5 747 498 (wydany 5 maja
1998) i substancje takie można zastosować w rozwiązaniach tu opisanych. Czynniki hamujące EGFR obejmują, ale bez ograniczeń, przeciwciała monoklonalne C225 i anty-EGFR 22Mab (ImClone Systems Incorporated), ABX-EGF (Abgenix/Cell Genesys), EMD-7200 (Merck KgaA), EMD-5590 (Merck KgaA), MDX- 447/H-477 (Medarex Inc. i Merck KgaA) oraz związki ZD-1834, ZD-1838 i ZD-1839 (AstraZeneca), PKI-166 (Novartis), PKI-166/CGP-75166 (Novartis), PTK 787 (Novartis), CP 701 (Cephalon), leflunomide (Pharmacia/Sugen), CI-1033 (Warner Lambert Parke Davis), CI-1033/PD 183,805 (Warner Lambert Parke Davis), CL-387,785 (Wyeth-Ayerst), BBR-1611 (Boehringer Mannheim GmbH/Roche), Naamidine A (Bristol Myers Squibb), RC-3940-11 (Pharmacia), BIBX-1382 (Boehringer Ingelheim), OLX-103 (Merck & Co.), VRCTC-310 (Ventech Research), EGF fusion toxin (Seragen Inc.), DAB-389 (Seragen/Lilgand), ZM-252808 (Imperial Cancer Research Fund), RG-50864 (INSERM), LFM-A12 (Parker Hughes Cancer Center), WHI-P97 (Parker Hughes Cancer Center), GW-282974 (Glaxo), KT-8391 (Kyowa Hakko) i szczepionkę EGF-R (York Medical/Centro de Immunologia Molecular (CIM)). Możliwe jest zastosowanie tych i innych czynników hamujących EGF-R.
Inhibitory VEGF, przykładowo, SU-5416 i SU-6668 (Sugen Inc.), SH-268 (Schering) oraz NX1838 (NeXstar) można także łączyć ze związkiem według wynalazku. Inhibitory VEGF opisano przykładowo w WO 99/24440 (opublikowany 20 maja 1999), międzynarodowym zgłoszeniu PCT nr PCT/IB99/00797 (złożony 3 maja 1999), w WO nr 95/21613 (opublikowany 17 sierpnia 1995), WO nr 99/61422 (opublikowany 2 grudnia 1999), patencie USA nr 5 834 504 (wydany 10 listopada 1998), WO nr 98/50356 (opublikowany 12 listopada 1998), patencie USA nr 5 883 113 (wydany 16 marca
1999) , patencie USA nr 5 886 020 (wydany 23 marca 1999), patencie USA nr 5 792 783 (wydany 11 sierpnia 1998), WO nr 99/10349 (opublikowany 4 marca 1999), WO nr 97/32856 (opublikowany 12 września 1997), WO nr 97/22596 (opublikowany 26 czerwca 1997), WO nr 98/54093 (opublikowany 3 grudnia 1998), WO nr 98/02438 (opublikowany 22 stycznia 1998), WO nr 99/16755 (opublikowany 8 kwietnia 1999) i WO nr 98/02437 (opublikowany 22 stycznia 1998).
Innymi przykładami specyficznych inhibitorów VEGF są: IM862 (Cytran Inc.); przeciwciało monoklonalne anty-VEGF z Genentech, Inc.; i angiozym, syntetyczny rybozym z Ribozyme i Chiron. Te i inne inhibitory VEGF można stosować jak tu opisano. Inhibitory receptora ErbB2, jak GW-282974 (Glaxo Wellcome pic) i przeciwciała monoklonalne AR-209 (Aronex Pharmaceuticals Inc.) i 2B-1 (Chiron) mogą ponadto występować w kombinacji ze związkiem według wynalazku, przykładowo te wskazane w WO nr 98/02434 (opublikowany 22 stycznia 1998), WO nr 99/35146 (opublikowany 15 lipca 1999), WO nr 99/35132 (opublikowany 15 lipca 1999), WO nr 98/02437 (opublikowany 22 stycznia 1998), WO nr 97/13760 (opublikowany 17 kwietnia 1997), WO nr 95/19970 (opublikowany 27 lipca 1995), patencie USA nr 5 587 458 (wydany 24 grudnia 1996) i patencie USA nr 5 877 305 (wydany 2 marca 1999).
Przydatne inhibitory receptora ErbB2 są także opisane w tymczasowym zgłoszeniu USA nr 60/117341, złożonym 27 stycznia 1999 i w tymczasowym zgłoszeniu USA nr 60/117346, złożonym 27 stycznia 1999. Związki i substancje inhibitorowe dla receptora erbB2 opisano we wspomnianych wcześniej zgłoszeniach PCT, patentach USA i tymczasowych zgłoszeniach USA. Jednakże ze związkiem według wynalazku można zastosować również inne związki i substancje, które hamują receptor erbBm.
Czynniki anty-przeżyciowe (ang. anti-survival agents) obejmują przeciwciała anty-IGF-IR i czynniki anty-integrynowe, takie jak przeciwciała anty-integrynowe.
Zastosowanie sposobów diagnostycznych
Niniejszym opisano również sposoby diagnostyczne. Przeciwciała anty-CD40 można użyć do wykrywania CD40 w próbce biologicznej in vitro lub in vivo. Sposób diagnozowania obecności lub lokalizacji guza wyrażającego CD40 u pacjenta tego potrzebującego, obejmuje etapy wstrzyknięcia
PL 214 289 B1 osobnikowi przeciwciała, określenia poziomu wyrażania CD40 u osobnika przez ustalenie miejsca związania przeciwciała, porównania ekspresji u osobnika z tą u stanowiącego odniesienie osobnika prawidłowego lub ze standardem oraz zdiagnozowania obecności lub lokalizacji nowotworu.
Przeciwciała anty-CD40 można stosować w konwencjonalnych testach immunologicznych, w tym, ale bez ograniczeń, w ELISA, RIA, FACS, tkankowym teście immunohistochemicznym, teście typu Western biot lub immunoprecypitacyjnym. Przeciwciała anty-CD40 według wynalazku można stosować do wykrywania CD40 od ludzi. Przeciwciała anty-CD40 można stosować do wykrywania CD40 pochodzących od gatunków naczelnych ze Starego Świata, takich jak makaki jawajskie i rezusy, szympansy i małpy bezogonowe. Sposób wykrywania CD40 w próbce biologicznej może obejmować kontaktowanie próbki biologicznej z przeciwciałem anty-CD40 według wynalazku i wykrywanie związanego przeciwciała. Przeciwciało anty-CD40 może być bezpośrednio wyznakowane wykrywalnym znacznikiem. Alternatywnie, przeciwciało anty-CD40 (pierwszorzędowe przeciwciało) nie jest wyznakowane, a wyznakowane jest drugorzędowe przeciwciało lub inna cząsteczka, która może wiązać przeciwciało anty-CD40. Jak dobrze wiadomo specjaliście w dziedzinie, drugorzędowe przeciwciało jest tak dobrane, aby swoiście wiązać określoną klasę pierwszorzędowego przeciwciała, uwzględniając gatunek z którego ono pochodzi. Przykładowo, jeśli przeciwciało anty-CD40 jest ludzkim IgG, drugorzędowe przeciwciało powinno być anty-ludzkie-IgG. Inne cząsteczki, które mogą wiązać przeciwciała obejmują, ale bez ograniczeń, Białko A i Białko G, oba dostępne handlowo, np. z Pierce Chemical Co.
Stosowne znaczniki przeciwciała lub drugorzędowego przeciwciała zostały ujawnione powyżej i obejmują różne enzymy, grupy prostetyczne, materiały fluorescencyjne, materiały luminescencyjne i materiały radioaktywne. Przykłady stosownych enzymów obejmują peroksydazę chrzanową, fosfatazę alkaliczną, β-galaktozydazę lub acetylocholinoesterazę; przykłady stosownych kompleksów grup prostertycznych obejmują streptawidynę/biotynę i awidynę/biotynę; przykłady stosownych materiałów fluorescencyjnych obejmują umbeliferon, fluoresceinę, izotiocyjanian fluoresceinowy, rodaminę, fluoresceinę dichlorotriazynyloaminową, chlorek danzylu lub fikoerytrynę; przykład stosownego materiału
125 luminescencyjnego obejmuje luminol; przykłady stosownego materiału radioaktywnego obejmują 125I, 131I, 35S lub 3H.
CD40 można analizować w próbce biologicznej za pomocą kompetycyjnego testu immunologicznego wykorzystującego standardy CD40 wyznakowane wykrywalną substancją I niewyznakowane przeciwciała anty-CD40. W teście tym, próbka biologiczna, wyznakowane standardy CD40 i przeciwciało anty-CD40 są mieszane i określana jest ilość wyznakowanego standardu CD40 związanego z niewyznakowanym przeciwciałem. Ilość CD40 w próbce biologicznej jest odwrotnie proporcjonalna do ilości wyznakowanego standardu CD40 związanego z przeciwciałem anty-CD40.
Ujawnione tu testy immunologiczne można zastosować do wielu celów. Przykładowo, przeciwciała anty-CD40 można stosować do wykrywania CD40 w komórkach w hodowli komórkowej. Przeciwciała anty-CD40 mogą być stosowane do określania ilości CD40 na powierzchni komórek, które traktowano różnymi związkami. Sposób ten można zastosować do identyfikacji związków, które są przydatne w aktywowaniu lub hamowaniu CD40. Zgodnie z tym sposobem, jedna próbka komórek jest traktowana badanym związkiem przez pewien okres czasu podczas gdy inna próbka nie jest poddawana jego działaniu. Jeśli ma być mierzony całkowity poziom CD40, komórki są poddawane lizie i całkowity poziom CD40 jest określany przy użyciu jednego z opisanych powyżej testów immunologicznych. W celu określenia wpływu badanego związku, porównywany jest całkowity poziom CD40 w komórkach poddawanych działaniu badanego związku względem komórek nie poddawanych działaniu.
Korzystnym testem immunologicznym do pomiaru całkowitych poziomów CD40 jest ELISA lub test typu Western blot. Jeśli ma być mierzony poziom CD40 na powierzchni komórek, komórki nie są poddawane lizie i poziomy CD40 na powierzchni komórek są określane przy użyciu jednego z opisanych powyżej testów immunologicznych. Korzystny test immunologiczny, do określania poziomów CD40 na powierzchni komórek, obejmuje etapy znakowania białek na powierzchni komórek wykrywal125 nym znacznikiem, takim jak biotyna lub 125I, immunoprecypitacji CD40 z przeciwciałem anty-CD40, a następnie wykrywania wyznakowanego CD40. Innym korzystnym testem immunologicznym do określania lokalizacji CD40, np. poziomów na powierzchni komórkowej, jest zastosowanie immunohistochemii. Sposoby takie jak ELISA, RIA, test typu Western blot, test immunohistochemiczny, znakowanie na powierzchni komórek integralnych białek błonowych i immunoprecypitacja są dobrze znane w dziedzinie. Zobacz np. Harlow i Lane, powyżej. Dodatkowo, można zwiększać skalę testów immu36
PL 214 289 B1 nologicznych w celu zwiększenia wydajności badań przesiewowych, aby możliwe było badanie dużej liczby związków pod kątem ich aktywacji lub hamowania CD40.
Przeciwciała anty-CD40 według wynalazku można także stosować do określania poziomów CD40 w tkance lub w komórkach pochodzących z tkanki, np. tkanki chorobowej. Tkanka taka może być guzem lub jego biptatem, które są korzystnie pobrane od pacjenta. Tkanka lub bioptat jest następnie użyty w teście immunologicznym w celu określenia np. całkowitych poziomów CD40, poziomów CD40 na powierzchni komórek lub lokalizacji CD40 przy użyciu sposobów opisanych powyżej.
Opisany powyżej sposób diagnostyczny można stosować do określenia czy CD40 jest wyrażane w guzie na wysokim poziomie. Informacja ta pozwoli na określenie, czy guz ten mógłby być celem w leczeniu przeciwciałem anty-CD40. Ponadto, ten sam sposób można także stosować do monitorowania wyników leczenia przeciwciałem anty-CD40 przez wykrywanie śmierci komórek w guzie. Sposób diagnostyczny można także stosować do określenia czy tkanka lub komórka wyraża CD40 lub aktywowany CD40 na niewystarczającym poziomem, a zatem jest kandydatem do leczenia aktywującymi przeciwciałami anty-CD40, CD40L i/lub innymi czynnikami terapeutycznymi podnoszącymi poziomy CD40 lub jego aktywność.
Przeciwciała według niniejszego wynalazku można także stosować in vivo do identyfikowania tkanek i narządów, które wyrażają CD40. Przeciwciała anty-CD40 mogą być stosowane do identyfikowania guzów wyrażających CD40. Jedną z korzyści stosowania ludzkich przeciwciał anty-CD40 według wynalazku jest to, że odmiennie niż przeciwciała niepochodzące od człowieka lub przeciwciała humanizowane, można je stosować bezpiecznie in vivo bez wywołania odpowiedzi odpornościowej na podawane przeciwciało.
Sposób obejmuje etapy podawania znakowanego przeciwciała anty-CD40, które można wykryć, lub obejmującej je kompozycji pacjentowi potrzebującemu takiego testu diagnostycznego i poddania pacjenta analizie obrazowej, w celu określenia lokalizacji tkanek wyrażających CD40. Analiza obrazowa jest dobrze znana w medycynie i obejmuje, ale bez ograniczeń, promieniowanie rentgenowskie, obrazowanie za pomocą rezonansu magnetycznego (MRI) lub tomografii komputerowej (CE). Przeciwciało można wyznakować dowolnym czynnikiem stosownym dla obrazowania in vivo, przykładowo czynnikiem kontrastującym, takim jak bar, który można stosować przy analizie promieniowaniem rentgenowskim lub magnetycznym czynnikiem kontrastującym, takim jak kompleks chelatowy gadolinu, który można stosować w MRI lub CE. Inne znaczniki obejmują, ale bez ograniczeń, radioizotopy takie jak 99Tc. Alternatywnie, przeciwciało anty-CD40 nie będzie wyznakowane i będzie obrazowane przez podanie przeciwciała drugorzędowego lub innej cząsteczki, którą można wykryć i która wiąże przeciwciało anty-CD40. W wykonaniu, bioptat jest pozyskiwany od pacjenta, w celu ustalenia, czy tkanka będąca przedmiotem zainteresowania wyraża CD40.
Zastosowanie sposobów terapeutycznych
Niniejszym opisano sposoby terapeutyczne wykorzystujące przeciwciało anty-CD40 według wynalazku.
Ludzkie przeciwciało agonistyczne anty-CD40 według wynalazku można podawać ludziom lub ssakowi niebędącemu człowiekiem, który wytwarza CD40 reagujący krzyżowo. Przeciwciało można podać takiemu ssakowi niebędącemu człowiekiem (tzn. naczelnemu, makakowi jawajskiemu lub rezusowi), w celu weterynaryjnym lub jako modelowi choroby ludzkiej. Takie modele zwierzęce są przydatne w ocenie skuteczności terapeutycznej przeciwciał według wynalazku.
Przeciwciało anty-CD40 może być podawane osobnikowi, który cierpi na pierwotne i/lub mieszane stany niedoboru odpornościowego, włączając zależny od CD40 niedobór odpornościowy z zespołem Hiper-IgM, zwykły zmienny niedobór odpornościowy, agammaglobulinemię Brutona, niedobory podklasy IgG oraz SCID sprężony z X (pospolite mutacje łańcucha gamma). Przeciwciało anty-CD40 może być podawane do leczenia osobnika z obniżoną odpornością, przykładowo po chemioterapii lub z wycieńczającą chorobą odpornościową, włączając chorobę nabytego niedoboru odpornościowego, taką jak HIV. Przeciwciało anty-CD40 może być podawane do wzmocnienia odporności osobnika w podeszłym wieku. Alternatywnie, przeciwciało anty-CD40 może być podawane w celu leczenia osobnika, który posiada zakażenie bakteryjne, wirusowe, wywołane grzybami lub pasożytami. Ludzkie przeciwciało agonistyczne anty-CD40 według wynalazku można podawać profilaktycznie osobnikowi, który ze względu na wiek, chorobę lub ogólnie zły stan zdrowia jest podatny na infekcję, w celu zapobiegania lub redukcji liczby zakażeń lub ciężkości zakażenia.
Przeciwciało anty-CD40 może być podawane osobnikowi z zaburzeniem hiperproliferacyjnym.
PL 214 289 B1
Przeciwciało anty-CD40 może być podawane w celu leczenia osobnika z guzem. Guz jest dodatni względem CD40. Alternatywnie guz może być CD40 ujemny. Guz może być lity lub nie, jak chłoniak. Przeciwciało anty-CD40 może być podawane pacjentowi z guzem, który jest rakowaty. Przeciwciało hamuje proliferacje komórek rakowych, hamuje lub zapobiega wzrostowi wagi lub objętości guza i/lub powoduje obniżenie wagi lub objętości guza.
Pacjenci, których można leczyć przeciwciałami anty-CD40 lub częściami przeciwciała według wynalazku obejmują, ale bez ograniczeń, pacjentów zdiagnozowanych z rakiem mózgu, rakiem płuc, rakiem kości, rakiem trzustki, rakiem skóry, rakiem głowy I szyi, czerniakiem skóry lub wewnątrzgałkowym, rakiem macicy, rakiem jajnika, rakiem odbytu, rakiem regionu odbytu, rakiem żołądka, rakiem gastrycznym, rakiem okrężnicy i odbytu, rakiem okrężnicy, rakiem sutka, guzem ginekologicznym (np. mięsakiem macicy, rakiem jajowodów, rakiem śluzówki macicy, rakiem szyjki macicy, rakiem pochwy lub rakiem sromu), rakiem przełyku, rakiem jelita cienkiego, rakiem układu wewnątrzwydzielniczego (np. rakiem tarczycy, przytarczycy lub gruczołów nadnercza), mięsakiem tkanki miękkiej, białaczką, szpiczakiem, szpiczakiem mnogim, rakiem cewki moczowej, rakiem penisa, rakiem gruczołu krokowego, białaczką przewlekłą lub ostrą, guzem litym wieku dziecięcego, chorobą Hodgkina, chłoniakiem limfocytowym, chłoniakiem nieziarniczym, rakiem pęcherza, rakiem wątroby, rakiem nerkowym, rakiem nerki lub moczowodu (np. gruczolakorakiem nerki, rakiem miedniczki nerkowej) lub z nowotworem ośrodkowego układu nerwowego (np. pierwotnym chłoniakiem CNS, guzem rdzenia kręgowego, glejakiem pnia mózgu lub gruczolakiem przysadki mózgowej), glejakiem lub włókniakomięsakiem.
Przeciwciało może być podawane od trzech razy dziennie do jednorazowego podania co każde sześć miesięcy i korzystnie może być podawane doustnie, dośluzówkowo, dopoliczkowo, donosowo, przez inhalację, dożylnie, podskórnie, domięśniowo, pozajelitowo, do guza, przezskórnie lub domiejscowo. Przeciwciało można także podawać w sposób ciągły za pomocą minipompy. Przeciwciało zazwyczaj będzie podawane tak długo jak długo obecny jest guz co powoduje, że przeciwciało wpływa na zahamowanie wzrostu guza lub raka lub na obniżenie jego ciężaru lub objętości. Dawka przeciwciała zazwyczaj będzie mieścić się w zakresie od 0,025 do 50 mg/kg, korzystniej 0,1 to 50 mg/kg, jeszcze korzystniej 0,1-20 mg/kg, 0,1-10 mg/kg, 0,1-5 mg/kg lub nawet jeszcze korzystniej 0,1-2 mg/kg. Przeciwciało można także podawać profilaktycznie.
Przeciwciało anty-CD40 jest podawane, jako część postępowania terapeutycznego, które obejmuje jedno lub większą liczbę dodatkowych przeciwneoplastycznych leków lub cząsteczek, dla pacjenta z zaburzeniem hiperproliferacyjnym, takim jak rak lub guz. Przykłady czynników przeciwnowotworowych obejmują, ale bez ograniczeń, inhibitory mitotyczne, czynniki alkilujące, anty-metabolity, czynniki interkalujące, inhibitory czynników wzrostu, inhibitory cyklu komórkowego, enzymy, inhibitory topoizomeraz, modyfikatory odpowiedzi biologicznych, anty-hormony, inhibitory kinaz, inhibitory metaloproteinaz macierzy, terapeutyki genetyczne i anty-androgeny. Korzystnie, przeciwciało anty-CD40 może być podawane z czynnikiem przeciwneoplastycznym, takim jak adriamycyna lub taksol. Również korzystnie, terapia anty-CD40 jest prowadzona wraz z radioterapią, chemioterapią, terapią fotodynamiczną, zabiegami chirurgicznymi lub inną immunoterapią. Przeciwciało anty-CD40 może być podawane z jednym lub większą liczbą dodatkowych przeciwciał. Przykładowo, przeciwciało anty-CD40 można podawać z przeciwciałami o których wiadomo, że hamują proliferację komórek guza lub raka. Przeciwciała takie obejmują, ale bez ograniczeń, przeciwciało, które hamuje CTLA4, receptor erbB2, EGF-R, IGF-IR, CD20 lub VEGF.
Przeciwciało anty-CD40 może być wyznakowane znacznikiem radioaktywnym, immunotoksyną lub toksyną lub jest białkiem fuzyjnym obejmującym toksyczny peptyd. Przeciwciało anty-CD40 lub białko fuzyjne przeciwciała anty-CD40 kieruje radioaktywny znacznik, immunotoksynę lub toksynę do komórki guza lub raka. Znacznik radioaktywny, immunotoksyną lub toksyna jest wprowadzana do wnętrza komórki guza lub raka po tym, jak przeciwciało anty-CD40 zwiąże się z CD40 na powierzchni komórki.
Przeciwciało anty-CD40 może być też użyte do celów terapeutycznych, do zaindukowania apoptozy specyficznych komórek u pacjenta. W wielu przypadkach komórki przeznaczone do apoptozy są komórkami pochodzącymi z raka lub guza. Zatem, opisany tu sposób indukuje apoptozę u pacjenta, który tego potrzebuje, przez podawanie przeciwciała anty-CD40.
Niniejszym opisano sposób podawania pacjentowi aktywującego przeciwciała anty-CD40, które zwiększa aktywność CD40. Przeciwciało anty-CD40 jest podawane z jednym lub większą liczbą innych czynników, które zwiększają aktywność CD40. Czynniki takie obejmują CD40L i/lub analogi CD40L, które aktywują CD40.
PL 214 289 B1
Przeciwciało anty-CD40 jest podawane z jednym lub większą liczbą dodatkowych czynników wzmacniających układ immunologiczny obejmujących, ale bez ograniczeń, IFN-βΙ, IL-2, IL-8, IL-12, IL-15, IL-18, IL-23, IFN-γ i GM-CSF.
Ludzkie przeciwciało agonistyczne anty-CD40 według wynalazku jest stosowane jako adiuwant do wzmocnienia skuteczności szczepionki. Stosowane w ten sposób przeciwciało anti-CD-40 aktywuje CD40 na komórkach prezentujących antygen, włączając komórki B, komórki dendrytyczne i monocyty, jak również wzmacnia wytwarzanie cząsteczek immunomodulujących, takich jak cytokiny i chemokiny. Efekt immunostymulacji przeciwciała wzmacnia odpowiedź odpornościową zaszczepionego osobnika na antygen szczepionki.
Niniejszym ujawniono sposób wytwarzania szczepionki opartej na komórkach dendrytycznych do immunoterapii komórek rakowych lub dendrytycznych. Zgodnie z tym sposobem, komórki dendrytyczne od pacjenta z rakiem są hodowane przez 1-5 dni z lizatem lub homogenatem nowotworowym, komórkami nowotworowymi uśmierconymi promieniowaniem lub w inny sposób lub z antygenem swoistym dla guza (np. peptydy, idiotypy) i 1-10 μg/ml przeciwciała anty-CD40. Komórki dendrytyczne poddane działaniu antygenu nowotworowego są ponownie wprowadzone do pacjenta, w celu zastymulowania przeciwnowotworowych odpowiedzi odpornościowych, w szczególności odpowiedzi przeciwnowotworowych CTL. Pochodzące od monocytów komórki dendrytyczne, do zastosowania w tym sposobie, można otrzymać z próbki krwi obwodowej przez hodowanie w IL-4 i GM-CSF. Komórki dendrytyczne można także odzyskać ze szpiku kostnego pacjenta przez oczyszczanie magnetyczne lub sortowanie komórek pozytywnych CD34 po hodowaniu w IL-4 i GM-CSF.
Terapia genowa
Cząsteczki kwasu nukleinowego ujawnione niniejszym można podawać pacjentowi tego potrzebującego przez terapię genową. Terapia może być prowadzona in vivo lub ex vivo. Pacjentowi są podawane cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące zarówno łańcuch ciężki i łańcuch lekki. Korzystnie cząsteczki kwasu nukleinowego są podawane tak, że stabilnie integrują do chromosomów komórek B, ponieważ to te komórki są wyspecjalizowane do wytwarzania przeciwciał. Prekursorowe komórki B są transfekowane lub infekowane ex vivo i ponownie przenoszone do pacjenta tego potrzebującego. W innym wykonaniu, prekursorowe komórki B lub inne komórki są infekowane in vivo przy użyciu wirusa o którym wiadomo, że infekuje interesujący rodzaj komórek. Zazwyczaj wektory stosowane w terapii genowej obejmują Iiposomy, plazmidy i wektory wirusowe. Przykładowymi wektorami wirusowymi są retrowirusy, adenowirusy i wirusy towarzyszące adenowirusom. Po infekcji in vivo lub ex vivo, poziomy wytwarzania przeciwciała można monitorować przez pobranie próbki od leczonego pacjenta i użycie dowolnego testu immunologicznego, znanego w dziedzinie lub tu omówionego.
Sposób terapii genowej obejmuje etapy podawania wyizolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej łańcuch ciężki lub jego część wiążącą antygen z przeciwciała anty-CD40 i ekspresji cząsteczki kwasu nukleinowego. Sposób terapii genowej obejmuje etapy podawania wyizolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej łańcuch lekki lub jego część wiążącą antygen z przeciwciała anty-CD40 i ekspresji cząsteczki kwasu nukleinowego. Korzystnie, sposób terapii genowej obejmuje etapy podawania wyizolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej łańcuch ciężki lub jego część wiążącą antygen i wyizolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej łańcuch lekki lub jego część wiążącą antygen z przeciwciała anty-CD40 według wynalazku i ekspresji cząsteczki kwasu nukleinowego. Sposób terapii genowej może także obejmować etap podawania innego czynnika antynowotworowego, takiego jak taksol lub adriamycyna.
W celu lepszego zrozumienia wynalazku przedstawione poniżej zostały przykłady. Przykłady te podane są tylko w celu zilustrowania i nie należy ich interpretować w żaden taki sposób, który ograniczałby zakres wynalazku.
P r z y k ł a d I
Tworzenie hybrydoma wytwarzających przeciwciało anty-CD40
Przeciwciała tu opisane, w tym przeciwciało według wynalazku, wytwarzano, selekcjonowano i badano w następujący sposób.
Immunizacja i tworzenie hybrydoma
Myszy XenoMice™, w wieku od ośmiu do dziesięciu tygodni, immunizowano przez podanie, dootrzewnowe lub w poduszki tylnych łap, białka fuzyjnego CD40-IgG (10 μg/dawkę/mysz) albo komórek 300.19-CD40, będących transfekowaną linią komórkową, wyrażającą ludzkie CD40 na swojej błonie plazmatycznej (10 x 106 komórek/dawkę/mysz). Podawanie tej dawki powtarzano pięć do siedmiu
PL 214 289 B1 razy przez okres od trzech do ośmiu tygodni. Cztery dni przed fuzją, myszom podawano końcową iniekcję z zewnątrzkomórkowej domeny ludzkiego CD40 w PBS. Przeprowadzano fuzję limfocytów śledziony i węzłów chłonnych z myszy immunizowanych z nie-wydzielniczą linią komórkową szpiczaka P3-X63-Ag8.653, a fuzje komórkowe podano selekcji typu HAT, jak to uprzednio opisano (Galfre i Milstein, Methods Enzymol. 73:3-46, 1981). Ustalono panel hybrydoma, z których wszystkie wydzielały ludzkie przeciwciała IgG2x swoiste wobec CD40. Do dalszego badania wybrano jedenaście hybrydoma i określono je jako 3.1.1, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.29.1 i 24.2.1.
Hybrydoma 3.1.1, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1 i 21.4.1, zgodnie z Traktatem Budapeszteńskim zdeponowano w American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, 6 sierpnia 2001. Hybrydoma 21.2.1, zdeponowano w ATCC 16 lipca 2002. Hybrydoma
nadano następujące numery depozytowe:
hybrydoma nr depozytu
3.1.1 (LN 15848) PTA-3600
7.1.2 (LN 15849) PTA-3601
10.8.3 (LN 15850) PTA-3602
15. 1.1 (LN 15851) PTA-3603
21.4.1 (LN 15853) PTA-3605
21.2.1 (LN 15874) PTA-4549
22.1.1 (LN 15875) PTA-4550
23.5.1 (LN 15855) PTA-4548
23.25.1 (LN 15876) PTA-4551
23.28.1 (LN 15877) PTA-4552
23.29.1 (LN 15878) PTA-4553
24.2.1 (LN 15879) PTA-4554
P r z y k ł a d II
Sekwencje przeciwciał anty-CD40
Aby zanalizować struktury przeciwciał wytwarzanych opisanym tu sposobem, w tym przeciwciała według wynalazku, sklonowano kwasy nukleinowe kodujące fragmenty łańcucha ciężkiego i lekkiego z hybrydoma, wytwarzających monoklonalne przeciwciała anty-CD40. Klonowanie i sekwencjonowanie wykonywano w następujący sposób.
+5
Poli(A)+ mRNA izolowano z około 2 x 105 komórek hybrydoma, pochodzących od myszy XenoMouse™ immunizowanych ludzkim CD40, jak to opisano w przykładzie I, stosując zestaw Fast-Track (Invitrogen). Następnie, za pomocą PCR wytworzono losowo powielane cDNA. Stosowano startery specyficzne do zmiennego regionu ludzkiego VH lub ludzkiej rodziny VK (Marks i wsp., „Oligonucleotide primers for polymerase chain reaction amplification of human immunoglobulin variable genes and design of familyspecific oligonucleotide probes.” Eur. J. Immunol. 21: 985-991 (1991)) lub uniwersalny starter dla ludzkiego VH, MG-30, CAGGTGCAGCTGGAGCAGTCIGG (SEKW. NR ID.: 118), w połączeniu ze starterami specyficznymi dla stałego regionu ludzkiego Cj2, MG-40d, 5'-GCTGAGGGAGTAGAGTCCTGAGGA-3' (SEKW. NR ID.: 119) lub stałego regionu CK (hKP2; jak to uprzednio opisano w Green I wsp., 1994). Stosując startery opisane powyżej, z hybrydoma wytwarzających antyCD40, otrzymano cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące transkrypty ludzkiego łańcucha ciężkiego i lekkiego kappa, przez bezpośrednie sekwencjonowanie produktów PCR wytworzonych z poli(A+) RNA. Sklonowano również produkty PCR w PCRII, stosując zestaw do klonowania TA (Invitrogen) i zsekwencjonowano obie nici stosując zestawy do sekwencjonowania Prism dye-terminator i sekwenator ABI 377. Wszystkie sekwencje analizowano przez przyrównanie ich do „V BASE sequence directory” (Tomlinson i wsp., MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK) stosując oprogramowania MacVector i Geneworks.
Następnie, przeprowadzono klonowanie i sekwencjonowanie DNA pełnej długości z przeciwciał monoklonalnych 3.1.1, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.28.1, 23.29.1 i 24.2.1. Do sekwencjonowania tego, wyizolowano RNA z około 4 x 106 komórek hybrydoma, stosując zestaw do izolacji RNA QIAGEN RNeasy (QIAGEN). mRNA przepisano na drodze odwrotnej transkrypcji stosując oligo-dT(18) i zestaw Advantage RT/PCR (Cloneteeh). V Base zastosowano do zaprojektowania zgodnych starterów do amplifikacji, zawierających miejsca restrykcyjne, optymalną sekwencję Kozak, miejsce startu ATG i część sekwencji sygnałowej łańcucha ciężkiego. Tabela 1 przedstawia listę zgodnych starterów do amplifikacji, stosowanych do sekwencjonowania klonów przeciwciał.
PL 214 289 B1
T a b e l a 1
Klon Zgodny starter łańcucha ciężkiego
3.1.1 5'-TATCTAAGCTTCTAGACTCGACCGCCACCATGGAGTTT GGGCTGAGCTG-3' (SEKW. NR ID.: 120)
7.1.2 5'-TATCTAAGCTTCTAGACTCGACCGCCACCATGGAGTTT GGGCTGAGCTG-3' (SEKW. NR ID.: 121)
10.8.3 5'-TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGAAACAC CTGTGGTTCTTCC-3' (SEKW. NR ID.: 122)
15.1.1 5'-TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGAAACAT CTGTGGTTCTTCC 3' (SEKW. NR ID.: 123)
21.4.1 5'-TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGGACTGG ACCTGGAGGATCC-3' (SEKW. NR ID.: 124)
21.2.1 5'-TATCTAAGCTTCTAGACTCGACCGCCACCATGGA GTTTGGGCTGAGCTG-3' (SEKW. NR ID.:128)
22.1.1 5'-TATCTAAGCTTCTAGACTCGACCGCCACCATGGAG TTTGGGCTGAGCTG-3' (SEKW. NR ID.:129)
23.5.1 5'-TATCTAAGCTTCTAGACTCGACCGCCACCATGGAG TTTGGGCTGAGCTG-3' (SEKW. NR ID.:130)
23.28.1 5'-TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGAAA CATCTGTGGTTCTTCC-3' (SEKW. NR ID.:131)
23.29.1 5'-TATCTAAGCTTCTAGACTCGACCGCCACCATGGAG TTTGGGCTGAGCTG-3' (SEKW. NR ID.:132)
24.2.1 5'-TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGAA ACATCTGTGGTTCTTCC-3' (SEKW. NR ID.:133)
Tę samą metodę zastosowano do zaprojektowania startera zawierającego sekwencje kodujące 3', kodon stop stałego obszaru IgG2, (5'-TTCTCTGATCAGAATTCCTATCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3') (SEKW. NR ID.: 125) i miejsca restrykcyjne.
Tę samą metodę zastosowano również do zaprojektowania startera wokół miejsca startu ATG łańcucha kappa: (5'-CTTCAAGCTTACCCGGGCCACCATGAGGCTCCCTGCTCAGC-3') (SEKW. NR ID.: 126). Dodano optymalną sekwencję Kozak (CCGCCACC) do 5' miejsca startu ATG.
Starter ten zastosowano do PCR w celu sklonowania lekkich łańcuchów następujących klonów przeciwciał: 3.1.1, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1 i 23.29.1.
Do sekwencjonowania lekkich łańcuchów klonów 23.28.1 i 24.2.1. stosowano drugi zgodny starter 5'-TCTTCAAGCTTGCCCGGGCCCGCCACCATGGAAACCCCAGCGCAG-3' (SEKW. NR ID.: 134).
Te samą metodę zastosowano również do zaprojektowania startera wokół kodonu stop obszaru stałego kappa (5'-TTCTTTGATCAGAA-TTCTCACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGC-3') (SEKW. NR ID.: 127).
W celu amplifikacji cDNA użyto pary starterów, stosując zestaw do PCR Advantage High Fidelity PCR Kit (Clonetech).
Sekwencję produktu PCR otrzymano przez bezpośrednie sekwencjonowanie stosując standardowe techniki (np. chodzenie starterem, ang. starter walking), korzystając z zestawów do sekwencjonowania dye-terminator i sekwenatora ABI.
Produkt PCR sklonowano w ssaczym wektorze ekspresyjnym i aby potwierdzić mutacje somatyczne, klony zsekwencjonowano.
Sekwencje obu nici dla każdego klonu potwierdzano w co najmniej w trzech reakcjach.
Analiza wykorzystania genu
Tabela 2 przedstawia wykorzystanie genu, o którym świadczą klony przeciwciał tu ujawnionych, w tym przeciwciała według wynalazku, z wybranych hybrydoma.
PL 214 289 B1
T a b e l a 2
Wykorzystanie genów łańcucha ciężkiego i lekkiego
Klon Łańcuch ciężki Łańcuch lekki kappa
VH D JH VK JK
3.1.1 (3-30+) DP-49 D4 + DIR3 JH6 A3/A19 (DPK-15) JK1
7.1.2 (3-30+) DP-49 DIR5 + D1-26 JH6 A3/A19 (DPK-15) JK1
10.8.3 (4.35) VIV-4 DIR3 JH6 L5 (DP5) JK4
15.1.1 (4-59) DP-71 D4-23 JH4 A3/A19 (DPK-15) JK2
21.4.1 (1-02) DP-7 5 DLR1 JH4 L5 (DP5) JK4
21.2.1 (3-30+) DP-49 DIR3 + D6-19 JH4 A3/A19 (DPK-15) JK3
22.1.1 (3-30+) DP-49 D1-1 JH6 A3/A19 (DPK-15) JK1
23.5.1 (3-30+) DP-49 D4-17 JH6 A3/A19 (DPK-15) JK1
23.28.1 (4-59) DP-71 DIR1 + D4-17 JH5 A27 (DPK-22) JK3
23.29.1 (3-30.3) DP-46 D4-17 JH6 A3/A19 (DPK-15) JK1
24.2.1 (4-59) DP-71 DIR1 + D4-17 JH5 A27 (DPK-22) JK3
Analiza sekwencji i mutacji
Wiadomo, że analiza wykorzystania genu dostarczyła jedynie ograniczonego spojrzenia na strukturę przeciwciała.
Ponieważ komórki B w zwierzętach XenoMouse™ wytwarzają przypadkowe transkrypty ciężkiego łańcucha V-D-J lub lekkiego V-J kappa, występują liczne wtórne procesy, w tym, ale bez ograniczeń, somatyczne hipermutacje, delecje, N-addycje i wydłużanie CDR3. Zobacz przykładowo Mendez i wsp., Nature Genetics 15: 146-156 (1997) i międzynarodowa publikacja patentowa WO 98/24893. Zgodnie z tym, aby dalej badać strukturę przeciwciała, na podstawie cDNA otrzymanych z klonów przewidziano sekwencje aminokwasowe przeciwciał.
Tabela A przedstawia identyfikatory sekwencyjne dla każdego nukleotydu oraz przewidywane sekwencje aminokwasowe zsekwencjonowanych przeciwciał.
Tabele 3-7 przedstawiają sekwencje nukleotydowe i przewidywane sekwencje aminokwasowe łańcuchów ciężkiego i lekkiego kappa przeciwciał 3.1.1 (tabela 3), 7.1.2 (tabela 4), 10.8.3 (tabela 5),
15.1.1 (tabela 6) i 21.4.1 (tabela 7).
Tabele 8-13 przedstawiają sekwencje nukleotydowe i przewidywane sekwencje aminokwasowe domeny zmiennej łańcuchów ciężkiego i lekkiego kappa przeciwciał 21.2.1 (tabela 8), 22.1.1 (tabela 9),
23.5.1 (tabela 10), 23.28.1 (tabela 11), 23.29.1 (tabela 12) i 24.2.1 (tabela 13).
Sekwencja DNA zsekwencjonowanego pełnej długości przeciwciała monoklonalnego 23.28.1 różni się jedną parą zasad (C w G) od sekwencji DNA otrzymanych z zsekwencjonowania obszaru VH pierwotnego produktu PCR, co daje w rezultacie zmianę w pozycji 16 naturalnego łańcucha ciężkiego z D na E.
Tabele 14-19 przedstawiają sekwencje nukleotydowe i przewidywane sekwencje aminokwasowe łańcuchów ciężkiego i lekkiego kappa przeciwciał 21.2.1 (tabela 14), 22.1.1 (tabela 15), 23.5.1 (tabela 16), 23.28.1 (tabela 17), 23.29.1 (tabela 18) i 24.2.1 (tabela 19). W tabelach podkreślono peptydową sekwencję sygnałową (lub zasady ją kodujące).
Skonstruowano dwa zmutowane przeciwciała 22.1.1 i 23.28.1.
Ciężki łańcuch przeciwciała 22.1.1 zmutowano, aby zmienić resztę cysteinową w pozycji 109 w resztę alaninową.
Zmutowany klon oznaczono jako 22.1.1H-C019A.
Zmutowano także lekki łańcuch przeciwciała 23.28.1 w pozycji 92, aby zmienić resztę cysteinową w resztę alaninową.
Zmutowany klon oznaczono jako 23.28.1L-C92A.
Mutagenezę specyficznych reszt wykonywano za pomocą zaprojektowanych starterów i zestawu do mutagenezy ukierunkowanej QuickChange Site Directed Mutagenesis Kit firmy Stratagene,
PL 214 289 B1 postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Mutacje potwierdzano za pomocą automatycznego sekwencjonowania, a zmutowane wstawki subklonowano do wektorów ekspresyjnych.
Tabela 20 przedstawia sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe zmutowanego łańcucha ciężkiego przeciwciała 22.1.1H-C109A.
Tabela 21 dostarcza sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe zmutowanego łańcucha lekkiego przeciwciała 23.28.1.
Zmutowane kodony DNA zaznaczono kursywą.
Zmutowaną resztę aminokwasową zaznaczono pogrubioną czcionką.
Tabela 3: Sekwencje DNA i białkowe przeciwciała 3.1.1
Opis: Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
Sekwencja DNA łańcucha ciężkiego ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTT
TAAGAGGTGTCCAGTGTCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG GGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCC TGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTATGGCATGC ACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGT GGCAGTTATATCAAAGGATGGAGGTAATAAATACCATGCA GACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATT CCAAGAATGCGCTGTATCTGCAAATGAATAGCCTGAGAGT TGAAGACACGGCTGTGTATTACTGTGTGAGAAGAGGGCAT CAGCTGGTTCTGGGATACTACTACTACAACGGTCTGGACG TCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTC CACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCGTGCTCC AGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGG TCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAA CTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCT GTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGG TGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACAC CTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGAC
PL 214 289 B1
Opis: Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
AAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGT GCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTT CCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACC CCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAG ACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGA GGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTC AACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGC ACCAGGACTGGCTGAAGGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGT CTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATC TCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACA CCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGT CAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGAC ATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACA ACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTC CTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGG TGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATG AGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCT GTCTCCGGGTAAATGA
Sekwencja białkowa łańcucha ciężkiego MEFGLSWVFLVALLRGVQCQVQLVESGGGVVQPGRSLRLS CAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISKDGGNKYHA DSVKGRFTISRDNSKNALYLQMNSLRVEDTAVYYCVRRGH QLVLGYYYYNGLDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCS RSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVD KTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQF NSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTI SKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Sekwencja DNA łańcucha lekkiego ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAATGCTCT
GGGTCTCTGGATCCAGTGGGGATATTGTGCTGACTCAGTC TCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCC ATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCTTGTATAGTAATG GATACAACTTTTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCA GTCTCCACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCC TCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCA CAGAT TTT ACACTGAAAATCAGCAGAT T GGAGGC T GAGGA TGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGCTCTACAAACTCCT CGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGAA CTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGA TGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTG CTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGA AGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAG TGTCACAGAGCAGGAGAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTC AGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAAC ACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAG CTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
PL 214 289 B1
Opis : Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
Sekwencja białkowa łańcucha lekkiego MRLPAQLLGLLMLWVSGSSGDIVLTQSPLSLPVTPGEPAS ISCRSSQSLLYSNGYNFLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRA SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDVGVYYCMQALQTP RTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCL LNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Sekwencja DNA dojrzałej domeny zmiennej łańcucha ciężkiego CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGC CTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATT CACCTTCAGTAGTTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCT CCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCAAAGG ATGGAGGTAATAAATACCATGCAGACTCCGTGAAGGGCCG ATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAATGCGCTGTAT CTGCAAATGAATAGCCTGAGAGTTGAAGACACGGCTGTGT ATTACTGTGTGAGAAGAGGGCATCAGCTGGTTCTGGGATA CTACTACTACAACGGTCTGGACGTCTGGGGCCAAGGGACC ACGGTCACCGTCTCCTCA
Sekwencj a białkowa dojrzałej domeny zmiennej łańcucha ciężkiego QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQA PGKGLEWVAVISKDGGNKYHADSVKGRFTISRDNSKNALY LQMNSLRVEDTAVYYCVRRGHQLVLGYYYYNGLDVWGQGT TVTVSS
Sekwencja DNA dojrzałej domeny zmiennej łańcucha lekkiego GATATTGTGCTGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCA CCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCA GAGCCTCTTGTATAGTAATGGATACAACTTTTTGGATTGG TACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCT ATTTGGGTTCTAATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTT CAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATC AGCAGATTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCA TGCAAGCTCTACAAACTCCTCGGACGTTCGGCCAAGGGAC CAAGGTGGAAATCAAA
Sekwencj a białkowa dojrzałej domeny zmiennej łańcucha lekkiego DIVLTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLYSNGYNFLDW YLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKI S RLEAE DVGVYYCMQALQT PRT FGQGTKVEIK
DNA łańcucha ciężkiego(domena zmienna) (3.1.1H-A78T) SEKW. NR ID.: 89 CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGC CTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATT CACCTTCAGTAGTTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCT CCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCAAAGG ATGGAGGTAATAAATACCATGCAGACTCCGTGAAGGGCCG ATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAATaCGCTGTAT CTGCAAATGAATAGCCTGAGAGTTGAAGACACGGCTGTGT ATTACTGTGTGAGAAGAGGGCATCAGCTGGTTCTGGGATA CTACTACTACAACGGTCTGGACGTCTGGGGCCAAGGGACC ACGGTCACCGTCTCCTCA
PL 214 289 B1
Opis : Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
Białko łańcucha ciężkiego (domena zmienna) (3.1.1H-A78T) SEKW. NR ID.: 90 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQA PGKGLEWVAVISKDGGNKYHADSVKGRFTISRDNSKNTLY LQMNSLRVEDTAVYYCVRRGHQLVLGYYYYNGLDVWGQGT TVTVSS
DNA łańcucha ciężkiego (domena zmienna) (3.1.1H-A78TV88A-V97A) SEKW. NR ID.: 91 CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGC CTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATT CACCTTCAGTAGTTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCT CCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCAAAGG ATGGAGGTAATAAATACCATGCAGACTCCGTGAAGGGCCG ATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAATaCGCTGTAT CTGCAAATGAATAGCCTGAGAGcTGAAGACACGGCTGTGT ATTACTGTGcGAGAAGAGGGCATCAGCTGGTTCTGGGATA CTACTACTACAACGGTCTGGACGTCTGGGGCCAAGGGACC ACGGTCACCGTCTCCTCA
Białko łańcucha ciężkiego (domena zmienna) (3.1.1H-A78TV88A-V97A) SEKW. NR ID.: 92 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQA PGKGLEWVAVISKDGGNKYHADSVKGRFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAVYYCARRGHQLVLGYYYYNGLDVWGQGT TVTVSS
DNA łańcucha lekkiego (domena zmienna) (3.1.1L-L4M-L83V) SEKW. NR ID.: 93 GATATTGTGaTGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCA CCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCA GAGCCTCTTGTATAGTAATGGATACAACTTTTTGGATTGG TACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCT ATTTGGGTTCTAATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTT CAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATC AGCAGAgTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCA TGCAAGCTCTACAAACTCCTCGGACGTTCGGCCAAGGGAC CAAGGTGGAAATCAAA
Białko łańcucha lekkiego (domena zmienna) (3.1.1 L-L4ML83V) SEKW. NR ID.: 94 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLYSNGYNFLDW YLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKI SRVEAE DVGVYYCMQALQTPRTFGQGTKVEIK
PL 214 289 B1
Tabela 4: Sekwencje DNA i białkowe przeciwciała 7.1.2
Opis: Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
Sekwencja DNA łańcucha ciężkiego ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAG
GTGTCCAGTGTCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGT CCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTC ACCTTCAGTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCA AGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCAAATGATGGAGATAATAA ATACCATGCAGACTCCGTGTGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGAC AATTCCAGGAGCACGCTTTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTG AGGACACGGCTGTATATTACTGTGCGAGAAGAGGCATGGGGTCTAG TGGGAGCCGTGGGGATTACTACTACTACTACGGTTTGGACGTCTGG GGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCC CATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAG CACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCG GTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACA CCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAG CGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACC TGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAG TTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACC TGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGAC ACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGG ACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGA CGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAG TTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACC AGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAA AGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGG CAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGG AGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTT CTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCG GAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCT CCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCA GCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCAC AACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
Sekwencja białkowa łańcucha ciężkiego MEFGLSWVFLVALLRGVQCQVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGF TFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISNDGDNKYHADSVWGRFTISRD NSRSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGMGSSGSRGDYYYYYGLDVW GQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYT CNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ FNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPGK
PL 214 289 B1
Opis : Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
Sekwencj a DNA łańcucha lekkiego ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAATGCTCTGGGTCT CTGGATCCAGTGGGGATATTGTGATGACTCAGTCTOCACTCTCCCT GCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGT CAGAGCCTCTTGTATAGTAATGGATACAACTTTTTGGATTGGTACC TGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTC TAATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCA GGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATG TTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGCTCTACAAACTCCTCGGACGTT CGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGAACTGTGGCTGCACCA TCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAA CTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGC CAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCC CAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCC TCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAA AGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTC ACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
Sekwencj a białkowa łańcucha lekkiego MRLPAQLLGLLMLWVSGSSGDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSS QSLLYSNGYNFLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGS GT DFTLKISRVEAE DVGVYYCMQALQTPRT FGQGT KVEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPV TKSFNRGEC
Sekwencj a DNA doj rzałej domeny zmiennej łańcucha ciężkiego CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGA GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAG CTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAG TGGGTGGCAGTTATATCAAATGATGGAGATAATAAATACCATGCAG ACTCCGTGTGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAGGAG CACGCTTTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCT GTATATTACTGTGCGAGAAGAGGCATGGGGTCTAGTGGGAGCCGTG GGGATTACTACTACTACTACGGTTTGGACGTCTGGGGCCAAGGGAC CACGGTCACCGTCTCCTCA
Sekwencja białkowa doj rzałej domeny zmiennej łańcucha ciężkiego QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLE WVAVISNDGDNKYHADSVWGRFTISRDNSRSTLYLQMNSLRAEDTA VYYCARRGMGSSGSRGDYYYYYGLDVWGQGTTVTVSS
Sekwencja DNA dojrzałej domeny zmiennej łańcucha lekkiego GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTG GAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCTTGTA TAGTAATGGATACAACTTTTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGG CAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCCTCCG GGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTAC ACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTAC TGCATGCAAGCTCTACAAACTCCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCA AGGTGGAAATCAAA
PL 214 289 B1
Opis: Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
Sekwencja białkowa doj rzałej domeny zmiennej łańcucha lekkiego DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLYSNGYNFLDWYLQKPG QSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYY CMQALQTPRTFGQGTKV£IK
Tabela 5: Sekwencje DNA i białkowe przeciwciała 10.8.3
Opis: Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
Sekwencj a DNA łańcucha ciężkiego ATGAAACACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCAGCTCCCAGAT
GGGTCCTGTCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGT GAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGC TCCATCAGTAGTTACTACTGGATCTGGATCCGGCAGCCCGCCGGGA AGGGACTGGAATGGATTGGGCGTGTCTATACCAGTGGGAGCACCAA CTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATGTCAGTAGACACG TCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCGG ACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATGGTCTTTACAGGGGGTA CGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCA GGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGA CTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTG ACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGAC TCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGG CACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACC AAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCAC CGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCC CCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTC ACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGT TCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAA GCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTC CTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGT GCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCAT CTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTG CCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCT GCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGA GAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATG CTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGG ACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGAT GCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTG TCTCCGGGTAAATGA
PL 214 289 B1
Opis : Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
Sekwencj a białkowa łańcucha ciężkiego MKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGG SISSYYWIWIRQPAGKGLEWIGRVYTSGSTNYNPSLKSRVTMSVDT SKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDGLYRGYGMDVWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNT KVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV TCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSV LTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTL PPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPM LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK
Sekwencj a DNA łańcucha lekkiego ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGTTCC CAGGTTCCAGATGCGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGT GTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGT CAGCCTATTAGCAGCTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGA AAGCCCCTAAACTCCTGATTTATTCTGCCTCCGGTTTGCAAAGTGG GGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACT CTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTATT GTCAACAGACTGACAGTTTCCCGCTCACTTTCGGCGGCGGGACCAA GGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTC CCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGT GCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAA GGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACA GAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGA CGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGA AGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAAC AGGGGAGAGTGTTAG
Sekwencj a białkowa łańcucha lekkiego MRLPAQLLGLLLLWFPGSRCDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRAS QPISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYSASGLQSGVPSRFSGSGSGTDFT LTISSLQPEDFATYYCQQTDSFPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVT EQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC
Sekwencj a DNA dojrzałej domeny zmiennej łańcucha ciężkiego CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGG AGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTAG TTACTACTGGATCTGGATCCGGCAGCCCGCCGGGAAGGGACTGGAA TGGATTGGGCGTGTCTATACCAGTGGGAGCACCAACTACAACCCCT CCCTCAAGAGTCGAGTCACCATGTCAGTAGACACGTCCAAGAACCA GTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTG TATTACTGTGCGAGAGATGGTCTTTACAGGGGGTACGGTATGGACG TCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
Sekwencja białkowa dojrzałej domeny zmiennej łańcucha ciężkiego QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWIWIRQPAGKGLE WIGRVYTSGSTNYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAV YYCARDGLYRGYGMDVWGQGTTVTVSS
PL 214 289 B1
Opis: Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
Sekwencja DNA dojrzałej domeny zmiennej łańcucha lekkiego GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTAG GAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGCCTATTAGCAG CTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAACTC CTGATTTATTCTGCCTCCGGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGT TCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAG CCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAGACTGAC AGTTTCCCGCTCACTTTCGGCGGCGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
Sekwencj a białkowa dojrzałej domeny zmiennej łańcucha lekkiego DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQPISSWLAWYQQKPGKAPKL LIYSASGLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTD SFPLTFGGGTKVEIK
Tabela 6: Sekwencje DNA i białkowe przeciwciała 15.1.1
Opis: Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową);
Sekwencj a DNA łańcucha ciężkiego ATGAAACATCTGTGGTTCTTCCTTCTCCTGGTGGCAGCTCCCAGAT GGGTCCTGTCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGT GAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGC TCCATCAGAAGTTACTACTGGACCTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGA AGGGACTGGAGTGGATTGGATATATCTATTACAGTGGGAGCACCAA CTACAATCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACATG TCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGTTCTGTGACCGCTGCGG ACACGGCCGTTTATTACTGTGCGAGAAAGGGTGACTACGGTGGTAA TTTTAACTACTTTCACCAGTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTC TCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCT GCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGT CAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGC GCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCT CAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAA CTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGC AACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGT GCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCT CTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCT GAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGTCACGAAGACCCCGAGG TCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAA GACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTC AGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGT ACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAA AACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTAC ACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCC TGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGA GTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCT CCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCA CCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTC CGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTC TCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
PL 214 289 B1
PL 214 289 B1
Opis: Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
Sekwencja DNA doj rzałej domeny zmiennej łańcucha lekkiego GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTG GAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCCTACA TACTAATGGATACAACTATTTCGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGG CAGTCTCCACAACTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCCTCCG GGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTAC ACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTAC TGCATGCAAGCTCTACAAACTCCGTACAGTTTTGGCCAGGGGACCA AGCTGGAGATCAAA
Sekwencja białkowa dojrzalej domeny zmiennej łańcucha lekkiego DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHTNGYNYFDWYLQKPG QSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYY CMQALQTPYSFGQGTKLEIK
Tabela 7: Sekwencje DNA i białkowe przeciwciała 21.4.1
Opis: Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
Sekwencj a DNA łańcucha ciężkiego ATGGACTGGACCTGGAGGATCCTCTTCTTGGTGGCAGCAGCCACAG GAGCCCACTCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAA GAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATAC ACCTTCACCGGCTACTATATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGAC AAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACCCTGACAGTGGTGGCAC AAACTATGCACAGAAGTTTCAGGGCAGGGTCACCATGACCAGGGAC ACGTCCATCAGCACAGCCTACATGGAGCTGAACAGGCTGAGATCTG ACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATCAGCCCCTAGGATA TTGTACTAATGGTGTATGCTCCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGA ACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCT TCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGC CCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTG TCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAG CTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGAC CGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTA GATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCA AATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGG ACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATG ATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCC ACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGA GGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGC ACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGC TGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCC AGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGA GAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCA AGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAACGCTTCTACCCCAG CGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAAC TACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCC TCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAA CGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTAC ACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
PL 214 289 B1
Opis: Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
Sekwencja białkowa łańcucha ciężkiego MDWTWRILFLVAAATGAHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGY TFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRD TSISTAYMELNRLRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQG TLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNV DHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNS TFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPR EPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSLSPGK
Sekwencja DNA łańcucha lekkiego ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGTTCC CAGGTTCCAGATGCGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGT GTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGT CAGGGTATTTACAGCTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGA AAGCCCCTAACCTCCTGATCTATACTGCATCCACTTTACAAAGTGG GGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACT CTCACCATCAGCAGCCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTATT GTCAACAGGCTAACATTTTCCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAA GGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTC CCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGT GCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAA GGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACA GAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGA CGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGA AGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAAC AGGGGAGAGTGTTAG
Sekwencja białkowa łańcucha lekkiego MRLPAQLLGLLLLWFPGSRCDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRAS QGIYSWLAWYQQKPGKAPNLLIYTASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFT LTISSLQPEDFATYYCQQANIFPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVT EQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC
Sekwencj a DNA dojrzalej domeny zmiennej łańcucha ciężkiego CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGG CCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCGG CTACTATATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAG TGGATGGGATGGATCAACCCTGACAGTGGTGGCACAAACTATGCAC AGAAGTTTCAGGGCAGGGTCACCATGACCAGGGACACGTCCATCAG CACAGCCTACATGGAGCTGAACAGGCTGAGATCTGACGACACGGCC GTGTATTACTGTGCGAGAGATCAGCCCCTAGGATATTGTACTAATG GTGTATGCTCCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCAC CGTCTCCTCA
Sekwencja białkowa dojrzałej domeny zmiennej łańcucha ciężkiego QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLE WMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELNRLRSDDTA VYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSS
PL 214 289 B1
Opis: Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
Sekwencja DNA doj rzałej domeny zmiennej łańcucha lekkiego GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTAG GAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTATTTACAG CTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAACCTC CTGATCTATACTGCATCCACTTTACAAAGTGGGGTCCCATCAAGGT TCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAG C C T G CAAC C T GAAGAT T T T GCAAC T TAC TAT T G T CAACAG G C TAAC ATTTTCCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
Sekwencja białkowa doj rzałej domeny zmiennej łańcucha lekkiego DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIYSWLAWYQQKPGKAPNL LIYTASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAN IFPLTFGGGTKVEIK
Tabela 8: Sekwencje DNA i białkowe dojrzałych domen zmiennych przeciwciała 21.2.1
Opis: Sekwencj a:
DNA łańcucha ciężkiego CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGA GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAG CTATGTCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAG TGGGTGGCAGTTATGTCATATGATGGAAGTAGTAAATACTATGCAA ACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAA CACGCTGTATCTGCAAATAAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCT GTGTATTACTGTGCGAGAGATGGGGGTAAAGCAGTGCCTGGTCCTG ACTACTGGGGCCAGGGAATCCTGGTCACCGTCTCCTCAG
Białko łańcucha ciężkiego QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYVMHWVRQAPGKGLE WVAVMSYDGSSKYYANSVKGRFTISRDNSKNTLYLQINSLRAEDTA VYYCARDGGKAVPGPDYWGQGILVTVSS
DNA łańcucha lekkiego GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTG GAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGTGTTCTGTA TAGTAATGGATACAACTATTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGG CAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCCTCCG GGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTAC ACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTAC TGCATGCAAGTTTTACAAACTCCATTCACTTTCGGCCCTGGGACCA AAGTGGATATCAAAC
Białko łańcucha lekkiego DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSVLYSNGYNYLDWYLQKPG QSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYY CMQVLQTPFTFGPGTKVDIK
PL 214 289 B1
Tabela 9; Sekwencje DNA i białkowe dojrzałych domen zmiennych przeciwciała 22.1.1
Opis: Sekwencj a:
DNA łańcucha ciężkiego CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGA GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTCG CTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAG TGGGTGGCAGTTATATCATCTGATGGAGGTAATAAATACTATGCAG ACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAA CACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCT GTGTATTACTGTACGAGAAGAGGGACTGGAAAGACTTACTACCACT ACTGTGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTC CTCAG
Białko łańcucha ciężkiego QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSRYGMHWVRQAPGKGLE WVAVISSDGGNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA VYYCTRRGTGKTYYHYCGMDVWGQGTTVTVSS
DNA łańcucha lekkiego GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTG GAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGTA TAGTAATGGATATAACTATTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGG CAGTCTCCACACCTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCCTCCG GGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGTTCAGGCACTGATTTTAC ACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTAC TGCATGCAAGCTCTACAAACTCCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCA AGGTGGAAATCAAAC
Białko łańcucha lekkiego DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLYSNGYNYLDWYLQKPG QSPHLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYY CMQALQTPRTFGQGTKVEIK
Tabela 10; Sekwencje DNA i białkowe dojrzałych domen
zmiennych przeciwciała 23.5.1
Opis: Sekwencja:
DNA łańcucha ciężkiego CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGA GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGTAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAA CTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAG TGGGTGGCAATTATATCATATGATGGAAGTAATAAATACTATGCAG ACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAA CACGCTGTATGTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCT GTGTATTACTGTGCGAGACGCGGTCACTACGGGAGGGATTACTACT CCTACTACGGTTTGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGT CTCCTCAG
Białko łańcucha ciężkiego QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCVASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLE WVAIISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYVQMNSLRAEDTA VYYCARRGHYGRDYYSYYGLDVWGQGTTVTVSS
PL 214 289 B1
Opis: Sekwencj a:
DNA łańcucha lekkiego GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTG GAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGCC TGGTAATGGATACAACTATTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGG CAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCCTCCG GGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTAC ACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTAC TGCATGCAAGCTCTACAAACTCCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCA AGGTGGAAATCAAAC
Białko łańcucha lekkiego DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLPGNGYNYLDWYLQKPG QSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYY CMQALQTPRTFGQGTKVEIK
Tabela 11: Sekwencje DNA i białkowe dojrzałych domen zmiennych przeciwciała 23.28.1
Opis: Sekwencj a:
DNA łańcucha ciężkiego CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCC TTCGGACACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCT CCATCAGAGGTTACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCCCCT GGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGTATATCTATTACAGTGG GAGCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCA TATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTG AACTCTGTGACCGCTGCGGACACGGCCGTGTATTATTGTGC GAGAAAGGGGGGCCTCTACGGTGACTACGGCTGGTTCGCCC CCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAG
Białko łańcucha ciężkiego QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCTVSGGSIRGYYWSWIRQPP GKGLEWIGYIYYSGSTNYNRSLKSRVTISVDTSKNQFSLKL NSVTAADTAVYYCARKGGLYGDYGWFAPWGQGTLVTVSS
DNA łańcucha lekkiego GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTC TCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGA GTGTTAGCAGCAGCGACTTAGCCTGGCACCAGCAGAAACCT GGCCAGGCTCCCAGACTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAG GGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTG GGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAA GATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCACTGTCGTAGCTTATT CACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAAC
Białko łańcucha lekkiego EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSDLAWHQQKP GQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPE DFAVYYCQHCRSLFTFGPGTKVDIK
PL 214 289 B1
Opis: Sekwencj a:
DNA łańcucha ciężkiego (domena zmienna) (23.28.1H-D16E) (SEKW. NR ID.: 97) CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCC TTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCT CCATCAGAGGTTACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCCCCT GGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGTATATCTATTACAGTGG GAGCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCA TATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTG AACTCTGTGACCGCTGCGGACACGGCCGTGTATTATTGTGC GAGAAAGGGGGGCCTCTACGGTGACTACGGCTGGTTCGCCC CCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAG
Białko łańcucha ciężkiego (domena zmienna) (23.28.1H-D16E) (SEKW. NR ID.: 98} QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIRGYYWSWIRQPP GKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKL NSVTAADTAVYYCARKGGLYGDYGWFAPWGQGTLVTVSS
Tabela 12: Sekwencje DNA i białkowe dojrzałych domen zmiennych przeciwciała 23.29.1
Opis: Sekwencj a:
DNA łańcucha ciężkiego CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGA GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAG CTATGCCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAG TGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTAATAAATACTATGCAG ACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTACAGAGACAATTCCAAGAA CACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCT GTGTATTACTGTGCGAGACGCGGTCACTACGGGAATAATTACTACT CCTATTACGGTTTGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGT CTCCTCAG
Białko łańcucha ciężkiego QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLE WVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTIYRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA VYYCARRGHYGNNYYSYYGLDVWGQGTTVTVSS
DNA łańcucha lekkiego GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTG GAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGCC TGGTAATGGATACAACTATTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGG CAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCCTCCG GGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGCTCAGGCACAGATTTTAC AC T GAAAAT CAGCAGAGT GGAGGC T GAGGAT GTTGGGAT T TAT TAC TGCATGCAAGCTCTACAAACTCCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCA AGGTGGAAATCAAAC
Białko łańcucha lekkiego DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLPGNGYNYLDWYLQKPG QSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYY CMQALQTPRTFGQGTKVEIK
PL 214 289 B1
Tabela 13: Sekwencje DNA i białkowe dojrzałych domen zmiennych przeciwciała 24.2.1
Opis: Sekwencj a:
DNA łańcucha ciężkiego CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGG AGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGAGG TTACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAG TGGATTGGGTATATCTATTACAGTGGGAGCACCAACTACAACCCCT CCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCA GTTCTCCCTGAAGCTGAGTTCTGTGACCGCTGCGGACACGGCCGTG TATTACTGTGCGAGAAGGGGGGGCCTCTACGGTGACTACGGCTGGT TCGCCCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAG
Białko łańcucha ciężkiego QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIRGYYWSWIRQPPGKGLE WIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAV YYCARRGGLYGDYGWFAPWGQGTLVTVSS
DNA łańcucha lekkiego GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAG GGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAG CACCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGG CTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACA GGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAG CAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTAT AGTAGCTTATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAAC
Białko łańcucha lekkiego EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSTYLAWY<2QKPGQAPR LLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQY SSLFTFGPGTKVDIK
Tabela 14: Sekwencje DNA i białkowe przeciwciała 21.2.1
Opis: Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
DNA łańcucha ciężkiego ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAG GTGTCCAGTGTCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGT CCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTC ACCTTCAGTAGCTATGTCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCA AGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATGTCATATGATGGAAGTAGTAA ATACTATGCAAACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGAC AATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATAAACAGCCTGAGAGCTG AGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATGGGGGTAAAGCAGT GCCTGGTCCTGACTACTGGGGCCAGGGAATCCTGGTCACCGTCTCC TCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCT CCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAA GGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCT CTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAG GACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTT CGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAAC ACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCC CACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTT CCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAG
PL 214 289 B1
Opis : Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
GTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCC AGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGAC AAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGC GTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACA AGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAAC CATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACC CTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGA CCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTG GGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCC ATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCG TGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGT GATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCC CTGTCTCCGGGTAAATGA
Białko łańcucha ciężkiego MEFGLSWVFLVALLRGVQCQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGF
TFSSYVMHWVRQAPGKGLEWVAVMSYDGSSKYYANSVKGRFTISRD NSKNTLYLQINSLRAEDTAVYYCARDGGKAVPGPDYWGQGILVTVS SASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGA LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSN TKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVS VLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTIS KTKGQ PREPQVYT LPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP MLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSPGK
DNA łańcucha lekkiego ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAATGCTCTGGGTCT
CTGGATCCAGTGGGGATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCT
GCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGT CAGAGTGTTCTGTATAGTAATGGATACAACTATTTGGATTGGTACC TGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTC TAATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCA GGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATG TTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGTTTTACAAACTCCATTCACTTT CGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAACGAACTGTGGCTGCACCA TCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAA CTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGC CAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCC CAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCC TCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAA AGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTC ACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
Białko łańcucha lekkiego MRLPAQLLGLLMLWVSGSSGDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSS
QSVLYSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGS GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQVLQTPFTFGPGTKVDIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPV TKSFNRGEC
PL 214 289 B1
Tabela 15: Sekwencje DNA i białkowe przeciwciała 22.1.1
Opis: Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
DNA łańcucha ciężkiego ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAG
GTGTCCAGTGTCAGGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGT CCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTC ACCTTCAGTCGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCA AGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATCTGATGGAGGTAATAA ATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGAC AATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTG AGGACACGGCTGTGTATTACTGTACGAGAAGAGGGACTGGAAAGAC TTACTACCACTACTGTGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACG GTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCC TGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGG CTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGG AACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCC TACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCC CTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCAC AAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTT GTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTC AGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCC CGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAG ACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCA TAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTC CGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACG GCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCC CATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCA CAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACC AGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACAT CGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAG ACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACA GCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTT CTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAG AAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
Białko łańcucha ciężkiego MEFGLSWVFLVALLRGVQCQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGF T FSRYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIS S DGGNKYYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRRGTGKTYYHYCGMDVWGQGTT VTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTF RVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREP QVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSLSLSPGK
PL 214 289 B1
Opis: Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
DNA łańcucha lekkiego ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAATGCTCTGGGTCT
CTGGATCCAGTGGGGATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCT
GCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGT CAGAGCCTCCTGTATAGTAATGGATATAACTATTTGGATTGGTACC TGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACACCTCCTGATCTATTTGGGTTC TAATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGTTCA GGCACTGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATG TTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGCTCTACAAACTCCTCGGACGTT CGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGAACTGTGGCTGCACCA TCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAA CTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGC CAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCC CAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCC TCAGCAGCACCYTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAA AGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTC ACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
Białko łańcucha lekkiego MRLPAQLLGLLMLWVSGSSGDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSS
QSLLYSNGYNYLDWYLQKPGQSPHLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGS GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPRTFGQGTKVEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPV TKSFNRGEC
Tabela 16: Sekwencje DNA i białkowe przeciwciała 23.5.1
Opis: Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
DNA łańcucha ciężkiego ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAG
GTGTCCAGTGTCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGT CCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGTAGCCTCTGGATTC ACCTTCAGTAACTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCA AGGGGCTGGAGTGGGTGGCAATTATATCATATGATGGAAGTAATAA ATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGAC AATTCCAAGAACACGCTGTATGTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTG AGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACGCGGTCACTACGGGAG GGATTACTACTCCTACTACGGTTTGGACGTCTGGGGCCAAGGGACC ACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCC CCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCT GGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCG TGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTG TCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGT GCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGAT C AC AAGC CC AGC AAC AC C AAGGT GGAC AAG AC AGTTGAGCGC AAAT GTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACC GTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATC TCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACG AAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGT GCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACG
PL 214 289 B1
Opis : Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
TTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGA ACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGC CCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAA CCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGA ACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGA CATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTAC AAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCT ACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGT CTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACG CAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
Białko łańcucha ciężkiego MEFGLSWVFLVALLRGVQCQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCVASGF
TFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAIISYDGSNKYYADSVKGRFTISRD NSKNTLYVQMNSLRAEDTAVYYCARRGHYGRDYYSYYGLDVWGQGT TVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVD HKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNST FRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPRE PQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK
DNA łańcucha lekkiego ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAATGCTCTGGGTCT
CTGGATCCAGTGGGGATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCT
GCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGT CAGAGCCTCCTGCCTGGTAATGGATACAACTATTTGGATTGGTACC TGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTC TAATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCA GGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATG TTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGCTCTACAAACTCCTCGGACGTT CGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGAACTGTGGCTGCACCA TCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAA CTGCCTSTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGC CAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCC CAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCC TCAGCAGCACCYTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAA AGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTC ACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA
Białko łańcucha lekkiego MRLPAQLLGLLMLWVSGSSGDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSS
QSLLPGNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGS GT DFTLKIS RVEAE DVGVYYCMQALQT PRT FGQGTKVEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTAXVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPV TKSFNRGEC
PL 214 289 B1
Tabela 17: Sekwencje DNA i białkowe przeciwciała 23.28.1
Opis: Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
DNA łańcucha ciężkiego ATGAAACATCTGTGGTTCTTCCTTCTCCTGGTGGCAGCTCCCAGAT
GGGTCCTGTCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGT GAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGC TCCATCAGAGGTTACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCCCCTGGGA AGGGACTGGAGTGGATTGGGTATATCTATTACAGTGGGAGCACCAA CTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACG TCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAACTCTGTGACCGCTGCGG ACACGGCCGTGTATTATTGTGCGAGAAAGGGGGGCCTCTACGGTGA CTACGGCTGGTTCGCCCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTC TCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCT GCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGT CAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGC GCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCT CAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAA CTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGC AACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGT GCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCT CTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCT GAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGG TCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAA GACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTC AGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGT ACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAA AACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTAC ACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCC TGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGA GTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCT CCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCA CCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTC CGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTC TCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
Białko łańcucha ciężkiego MKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGG SIRGYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDT SKNQFSLKLNSVTAADTAVYYCARKGGLYGDYGWFAPWGQGTLVTV SSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPS NTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP EVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVV SVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVY TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSPGK
PL 214 289 B1
Opis: Sekwencja {podkreślono sekwencję sygnałową):
DNA łańcucha lekkiego ATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCC
CAGAATCCACCGGAGAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCT GTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGT CAGAGTGTTAGCAGCAGCGACTTAGCCTGGCACCAGCAGAAACCTG GCCAGGCTCCCAGACTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCAC TGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTC ACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATT ACTGTCAGCACTGTCGTAGCTTATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAA AGTGGATATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTC CCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGT GCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAA GGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACA GAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGA CGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGA AGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAAC AGGGGAGAGTGTTAG
Białko łańcucha lekkiego METPAQLLFLLLLWLPESTGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRAS QSVSSSDLAWHQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDF TLTISRLEPEDFAVYYCQHCRSLFTFGPGTKVDIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVT EQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC
Tabela 18: Sekwencje DNA i białkowe przeciwciała 23.29.1
Opis: Sekwencja {podkreślono sekwencję sygnałową):
DNA łańcucha ciężkiego ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAG
GTGTCCAGTGTCAGGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGT CCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTC ACCTTCAGTAGCTATGCCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCA AGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTAATAA ATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTACAGAGAC AATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTG AGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACGCGGTCACTACGGGAA TAATTACTACTCCTATTACGGTTTGGACGTCTGGGGCCAAGGGACC ACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCC CCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCT GGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCG TGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTG TCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGT GCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGAT CACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAAT GTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACC GTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATC TCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACG AAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGT GCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACG
PL 214 289 B1
Opis : Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
TTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGA ACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGC CCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAA CCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGA ACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGA CATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTAC AAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCT ACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGT CTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACG CAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
Białko łańcucha ciężkiego MEEGLSWVFLVALLRGVQCQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGF
TFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTIYRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGHYGNNYYSYYGLDVWGQGT TVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVD HKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNST FRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPRE PQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK
DNA łańcucha lekkiego ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAATGCTCTGGGTCT
CTGGATCCAGTGGGGATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCT
GCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGT CAGAGCCTCCTGCCTGGTAATGGATACAACTATTTGGATTGGTACC TGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTC TAATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGCTCA GGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATG TTGGGATTTATTACTGCATGCAAGCTCTACAAACTCCTCGGACGTT CGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGAACTGTGGCTGCACCA TCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAA CTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGC CAAAGTTCAGTGGAGGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCC CAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCC TCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAA AGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTC ACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
Białko łańcucha lekkiego MRLPAQLLGLLMLWVSGSSGDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSS
QSLLPGNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGS GT D FTLKISRVEAEDVGIYYCMQALQTPRT FGQGTKVEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWRVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPV TKSFNRGEC
PL 214 289 B1
Opis: Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
DNA łańcucha lekkiego ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAATGCTCTGGGTCT CTGGATCCAGTGGGGATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCT GCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGT
(23.29.1LR1 74K) CAGAGCCTCCTGCCTGGTAATGGATACAACTATTTGGATTGGTACC TGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTC TAATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGCTCA
(SEKW. NR ID.:101) GGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATG TTGGGATTTATTACTGCATGCAAGCTCTACAAACTCCTCGGACGTT CGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAAT CAAAC GAACT GT GGCT GCACCA TCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAA CTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGC CAAAGTTCAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCC CAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCC T CAGCAGCACCC T GACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAA AGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTC ACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
Białko łańcucha lekkiego MRLPAQLLGLLMLWVSGSSGDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSS QSLLPGNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGS GTDFTLKISRVEAEDVGIYYCMQALQTPRTFGQGTKVEIKRTVAAP
(23.29.1LR1 74K) SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSRV TKSFNRGEC
(SEKW. NR ID.:101)
Tabela 19: Sekwencje DNA i białkowe przeciwciała 24.2.1
Opis: Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
DNA łańcucha ciężkiego ATGAAACATCTGTGGTTCTTCCTTCTCCTGGTGGCAGCTCCCAGAT GGGTCCTGTCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGT GAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGC TCCATCAGAGGTTACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGA AGGGACTGGAGTGGATTGGGTATATCTATTACAGTGGGAGCACCAA CTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACG TCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGTTCTGTGACCGCTGCGG ACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAAGGGGGGGCCTCTACGGTGA CTACGGCTGGTTCGCCCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTC TCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCT GCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGT CAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGC GCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCT CAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAA CTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGC AACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGT GCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCT CTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCT GAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGG
PL 214 289 B1
Opis : Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
TCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAA GACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTC AGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGT ACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAA AACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTAC ACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCC TGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGA GTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCT CCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCA CCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTC CGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTC TCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
Białko łańcucha ciężkiego MKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGG
SIRGYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDT SKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARRGGLYGDYGWFAPWGQGTLVTV SSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPS NTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP EVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVV SVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVY TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSPGK
DNA łańcucha lekkiego ATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCC
CAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCT
GTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGT CAGAGTGTTAGCAGCACCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTG GCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCAC TGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTC ACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATT ACTGTCAGCAGTATAGTAGCTTATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAA AGTGGATATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTC CCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGT GCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAA GGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACA GAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGA CGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGA AGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAAC AGGGGAGAGTGTTAG
Białko łańcucha lekkiego METPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRAS
QSVSSTYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDF TLTISRLEPEDFAVYYCQQYSSLFTFGPGTKVDIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVT EQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC
PL 214 289 B1
Tabela 20: Sekwencje DNA i białkowe dojrzałych domen zmiennych przeciwciała 22.1.lH-CłO9A
Opis: Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
DNA łańcucha ciężkiego (SEKW. NR ID.: 95) CAGGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGA GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTCG CTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAG TGGGTGGCAGTTATATCATCTGATGGAGGTAATAAATACTATGCAG ACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAA CACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCT GTGTATTACTGTACGAGAAGAGGGACTGGAAAGACTTACTACCACT ACGCCGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTC CTCAG
Białko łańcucha ciężkiego (SEKW. NR ID.: 96) QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSRYGMHWVRQAPGKGLE WVAVIS S DGGNKYYADSVKGRFTIS RDN SKNTLYLQMNSLRAEDTA VYYCTRRGTGKTYYHYAGMDVWGQGTTVTVSS
Tabela 21: Sekwencje DNA i białkowe dojrzałych domen zmiennych przeciwciała 23.28.1L-C92A
Opis: Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
DNA łańcucha lekkiego (SEKW. NR ID.: 99) GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTC CAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGT TAGCAGCAGCGACTTAGCCTGGCACCAGCAGAAACCTGGCCAG GCTCCCAGACTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTG GCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTT CACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTG TATTACTGTCAGCACGCCCGTAGCTTATTCACTTTCGGCCCTG GGACCAAAGTGGATATCAAAC
Białko łańcucha lekkiego (SEKW. NR ID.:100) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSDLAWHQQKPGQ APRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAV YYCQHARSLFTFGPGTKVDIK
P r z y k ł a d III
Analiza podstawień aminokwasowych łańcucha ciężkiego i lekkiego
Figury 1D-1H i 2D-2H przedstawiają przyrównanie sekwencji pomiędzy przewidywanymi sekwencjami aminokwasowymi domeny zmiennej łańcucha ciężkiego przeciwciał monoklonalnych 3.1.1,
7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.28.1, 23.28.IH-Dl6E, 23.29.1 i 24.2.1 oraz sekwencjami aminokwasowymi ich odpowiednich genów z linii zarodkowej. Większość obszarów CDR3 łańcucha ciężkiego zawiera insercje aminokwasowe.
PL 214 289 B1
Gen DLR1 stosowany w domenie VH przeciwciała 21.4.1 koduje 2 reszty cysternowe (Cys). Analiza za pomocą spektrometrii mas i modelowanie homologiczne pokazało, że dwie reszty cysteinowe łączą się mostkiem dwusiarczkowym i że to połączenie dwusiarczkowe nie niszczy struktury przeciwciała.
Figury 1A-1C i 2A-2C przedstawiają przyrównanie sekwencji pomiędzy przewidywanymi sekwencjami aminokwasowymi domeny zmiennej łańcucha lekkiego przeciwciał monoklonalnych 3.1.1, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.29.1 i klonów 24.2.1 oraz sekwencjami aminokwasowymi ich odpowiednich genów z linii zarodkowej.
Łańcuchy lekkie tych przeciwciał pochodzą od trzech różnych genów VK. Siedem z jedenastu przeciwciał wykorzystuje gen A3/A19 VK, z których sześć ma dwie mutacje w obszarze CDR1.
Dalej, pięć z siedmiu przeciwciał wykorzystujących gen A3/A19 Vk, korzysta również z genu Jk1; we wszystkich tych przeciwciałach pierwszy aminokwas pochodzący z genu Jk1, jest zgodnie zamieniony z W na R.
Należy zdawać sobie sprawę z tego, że wiele zidentyfikowanych powyżej substytucji aminokwasowych lub insercji znajduje się w pobliżu lub w obszarze CDR.
Wydaje się, że substytucje takie mają pewien wpływ na wiązanie przeciwciała z cząsteczka CD40. Ponadto, substytucje takie mogą mieć znaczący wpływ na powinowactwo przeciwciał.
P r z y k ł a d IV
Gatunkowa reaktywność krzyżowa przeciwciał
W celu określenia wiązania i powinowactwa przeciwciał tu ujawnionych, w tym przeciwciała według wynalazku, w stosunku do CD40, przeprowadzono analizy FACS dla różnych gatunków, zwłaszcza pewnych małp Starego Świata.
Porcje całkowitej krwi ludzkiej i małpiej inkubowano przez 1 godz. w lodzie z wzrastającymi stężeniami przykładowych przeciwciał anty-CD40 lub z przeciwciałem anty-hemocyjanina skałoczepu (KLH), użytym jako kontrola ujemna.
Następnie, próbki inkubowano przez 30 min. w lodzie z anty-ludzkim IgG2 skoniugowanym z RPE (fikoerytryna).
Wiązanie mierzono za pomocą cytometrii przepływowej komórek B dodatnich względem
CD19/CD20, a histogramy intensywności fluorescencji (F12-H) analizowano w stosunku do liczby komórek (zliczenia), stosując oprogramowanie CellQuest.
Dla każdego przeciwciała z wykresu szacowano wiązanie (KD), jako średnia intensywności fluorescencji w stosunku do stężenia przeciwciała. Ubytek przeciwciała kontrolowano przez pomiar wiązania w zakresie stężeń komórkowych.
Przeciwciała 3.1.1, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1 i 21.4.1 badano pod kątem wiązania z ludzkimi, rezusowymi i makaka jawajskiego komórkami B.
Badano również przeciwciała 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.29.1 i 24.2.1 pod kątem wiązania z komórkami B ludzkimi i makaka jawajskiego.
Zaobserwowano, że maksymalny sygnał i stężenie dla połowy maksimum wiązania z komórkami małpimi, miały współczynnik dwa, w stosunku do odpowiadających sobie parametrów dla ludzkich komórek B. Nie obserwowano wiązania w podobnych doświadczeniach z krwią myszy, szczura, królika i psa.
P r z y k ł a d V
Selektywność przeciwciał wobec CD40
W celu określenia selektywności wobec CD40 przeciwciał tu ujawnionych, w tym przeciwciała według wynalazku, przeprowadzono inny test in vitro.
Selektywność CD40 w teście typu ELISA: materiały i metody
Płytki FluroNUNC (Nunc nr kat. 475515) z 96 studzienkami opłaszczono czterema antygenami: CD40/Ig, CD44/Ig, RANK/Ig, 4-lBB/Ig, TNFR-1/Ig i TNFR-2/Ig (antygeny przygotowane we własnym zakresie) przez noc w temp. +4°C, w stężeniu g/ml przy 100 μΙ/studzienkę, w 0,1M buforze wodorowęglanu sodu o pH 9,6.
Płytkę płukano następnie trzykrotnie stosując PBST (PBS + 0,1% Tween-20) i blokowano PBST + 0,5% BSA, stosując 150 μΐ/studzienkę.
Płytkę inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 godz., a następnie płukano trzykrotnie PBST. Następnie, rozcieńczano przeciwciała anty-CD40, wytworzone w przykładzie I w bloku przy stężeniu 1 μg/ml i rozcieńczone przeciwciała dodawano do płytki.
PL 214 289 B1
Płytkę inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 godz., a następnie płukano trzykrotnie PBST. Następnie, studzienki zawierające przeciwciała wytworzone w przykładzie I traktowano antyludzkim IgG2-HRP (Southern Biotech nr kat. 9070-05) w ilości 100 ml/studzienkę, w rozcieńczeniu 1:4000 w bloku.
Jeden rząd traktowano również anty-ludzkim IgG (Jackson nr kat. 209--035-088) rozcieńczonym 1:5000 w bloku i dodawano 100 μl/studzienkę w celu normalizacji opłaszczenia płytki. Jeden rząd traktowano również anty-ludzkim CD40-HRP (Pharmingen nr kat. 345815/Custom HRP koniugowany) w rozcieńczeniu 0,05 μg/ml w bloku, jako kontrolę dodatnią.
Płytkę inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 godz., a następnie płukano trzykrotnie PBST.
Dodawano 100 μl/studzienkę substratu TMB (K & P Labs) i płytkę inkubowano przez 5 do 10 min. Następnie, odczytywano wyniki z płytki, stosując czytnik do płytek Spectra-Max™.
Wyniki pokazały, że przeciwciała wykazują selektywność w stosunku do CD40, która jest co najmniej 100 razy większa niż ich selektywność w stosunku do RANK, 4-1BB, TNFR-1 i TNFR-2, w tym specyficzny sygnał CD40 (sygnał CD40 pomniejszony o tło) jest co najmniej 100 razy mocniejszy niż odpowiadający sygnał dla innych cząsteczek.
P r z y k ł a d VI
Badania klasyfikacji epitopów
Po wykazaniu, że przeciwciała tu ujawnione, w tym przeciwciało według wynalazku, są selektywne wobec CD40, przeprowadzono analizę współzawodnictwa w wiązaniu, stosując BIAcore i FACS.
Badania współzawodnictwa BIAcore
Badania konkurencyjności BIAcore przeprowadzono w celu określenia czy ludzkie przeciwciała anty-CD40, w tym przeciwciało według wynalazku, wiążą się z tymi samymi lub różnymi miejscami w cząsteczce CD40.
W doświadczeniach tych zastosowano aparaturę BIAcore 2000, postępując zgodnie z protokołami producenta. Białko A unieruchamiano na powierzchniach sensorowych chipów BIAcore. Nasycone stężenie CD40-Ig, obejmujące zewnątrzkomórkową domenę CD40 wiązano z chipem sensorowym.
Następnie, chipa sensorowego związanego z CD40 w warunkach nasyconych, wiązano z pierwszym ludzkim agonistycznym przeciwciałem anty-CD40 tu ujawnionym, komercyjnym przeciwciałem anty-CD40 lub CD40L.
Następnie, mierzono zdolność drugiego ludzkiego agonistycznego przeciwciała anty-CD40 tu ujawnionego do współzawodnictwa z pierwszym przeciwciałem, komercyjnym przeciwciałem lub CD40L o wiązanie się z CD40.
Technika ta umożliwia przypisanie przeciwciał do różnych grup wiążących.
Wiązanie z CD40 wskazuje na rozpoznanie niezależnego epitopu.
Brak wiązania może wskazywać na rozpoznanie tego samego epitopu lub na zachodzenie na siebie epitopów.
Badania FACS
Badania FACS przeprowadzono w celu określenia, czy ludzkie przeciwciała anty-CD40 tu ujawnione wiążą się z tym samym, czy z innym miejscem na cząsteczce CD40 i w celu określenia czy wiążą się one z tym samym, czy z innym miejscem na cząsteczce CD40 co komercyjnie dostępne przeciwciała anty-CD40 EA5 (Alexis nt kat. ANC-300-050), LOB7/6 (Serotec MCA/590PE) i 5C3 (Pharmingen # 555458 (niewyznakowane) i 555460 (wyznakowane PE dla FACS).
Komórki dendrytyczne, traktowane przeciwciałami anty-CD40 tu ujawnionymi z przeciwciałem EA5 wyznakowanym PE lub LOB7/6 wyznakowanym PE barwiono przeciwstawnie w lodzie przez 30 min. Po płukaniu barwienie komórek analizowano w cytometrze typu B-D caliber cytometer.
Słabsze wiązanie przeciwciał komercyjnych interpretowano jako oznakę tego, że badane przeciwciało wiąże się z tym samym lub z pokrywającym się epitopem.
Analiza współzawodnictwa wiązania przeprowadzona za pomocą BIAcore i FACS wykazała, że epitopy rozpoznawane przez przeciwciała mAb 21.4.1 zachodzą na epitop rozpoznawany przez przeciwciało EA5, nie zachodzą na epitop rozpoznawany przez komercyjnie dostępne przeciwciało LOB7/6 i nie zachodzą na miejsce wiązania dla CD40L.
Epitopy rozpoznawane przez pozostałe przeciwciała nie zachodzą na miejsce wiązania dla CD40L.
Tabela 22 podsumowuje wyniki badań klasyfikacji tych epitopów.
PL 214 289 B1
T a b e l a 22
Klasyfikacja BIAcore współzawodnictwa epitopów niektórych z ujawnionych niniejszym przeciwciał anty-CD40
EA5 5C3 L0B7/6 3.1.1, 21.2.1, 22.1.1, 3.5.1, 23.29.1 21.4.1 23.25.1, 23.28.1, 24.2.1 CD40L
EA5 x x x x
5C3 x x x x x
LOB7/6 x x x x
3.1.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.29.1 x x x
21.4.1 x x x
23.25.1, 23.28.1, 24.2.1 x x x x
CD40L x x x x x x
P r z y k ł a d VII
Podwyższenie ekspersji cząsteczek powierzchniowych przez przeciwciała anty-CD40
W celu określenia czy ujawnione niniejszym ludzkie przeciwciała anty-CD40 podwyższają ekspresję cząsteczek powierzchniowych na komórkach B, przeprowadzono test z krwią pełną. Pełną krew ludzką lub naczelnych rozcieńczano 1:1 podłożem RPMI i inkubowano 24 godz. z różnymi stężeniami przeciwciał agonistów CD40 lub z kontrolami.
Komórki barwiono przez 30 min. (w lodzie, w ciemności) pod kątem HLA-DR, ICAM, B7-1, B7-2, CD19/CD20, CD40, CD23 i CD71, stosując komercyjnie dostępne odczynniki będące przeciwciałami znakowanymi fluorochromem.
Komórki analizowano następnie w aparacie FACS-Caliber (Becton-Dickinson). Komórki B identyfikowano przez bramkowanie na komórki dodatnie względem CD19 lub CD20, a markery aktywacji określano dla danej bramki.
Maksymalną krotność wzrostu średniej fluorescencji (przy 1 μg/ml przeciwciała) i średnie EC50 otrzymane przy zastosowaniu przeciwciała anty-CD40 według wynalazku (21.4.1), przedstawiono w tabeli 23.
T a b e l a 23
Podwyższenie ekspresji cząsteczek powierzchniowych komórki B przez przeciwciało anty-CD40 według wynalazku
Maksymalna krotność wzrostu EC50 (ng/ml)
Średnia ± odchylenie stand. Średnia ± odchylenie stand.
MHC II 4,50 ± 0,52 3,85 ± 0,35
CD71 2,30 ± 0,77 0,73 ± 0,28
ICAM 4,52 ± 2,42 15,3 ± 7,3
CD23 69,9 ± 25,8 19,0 ± 4,4
B7-2 2,74 ± 0,14 16,0 ± 21,9
Doświadczenia prowadzono również w celu określenia czy ludzkie przeciwciała anty-CD40 tu ujawnione zwiększają wyrażanie cząsteczek powierzchniowych komórek dendrytycznych pochodzących od monocytów.
Przygotowywanie komórek dendrytycznych pochodzących od monocytów
Krew obwodową pobierano od zdrowych ludzkich ochotników. Komórki jednojądrzaste izolowano stosując probówki Sigma Accuspin (St. Louis, MO), płukano stosując podłoża RPMI (Gibco BRL, Rockville, MD) i umieszczano w stężeniu 5 x 106/ml w kolbach do hodowli tkankowej, w pełnej pożywce RPMI (zawierającej 100 U/ml penicyliny/streptomycyny, 10 mM buforu HEPES, 2 mM glutaminy,
PL 214 289 B1
0,1 mM aminokwasów niebędących podstawowymi; wszystko z Gibco BRL); i 10% płodowej surowicy cielęcej (Hyclone, Logan, Utah). Po 3 godz. inkubacji w temp. 37°C (5% CO2), usuwano nieprzylegające komórki, a komórki T izolowano stosując kolumny selekcjonujące (R & D Systems, Minneapolis, MN). Komórki przylegające płukano stosując podłoże RPMI i inkubowano przez 7 dni w pełnym podłożu RPMI z dodatkiem 10 ng/ml IL-4 (R & D Systems) i 100 ng/ml GM-CSF (R & D Systems). Następnie, izolowano komórki nieprzylegające, płukano i stosowano jako komórki dendrytyczne pochodzące od monocytów (mDCs) we wszystkich doświadczeniach. Pozostałe komórki adherentne usuwano stosując trypsynę/EDTA i używano w doświadczeniach z adherentnymi monocytami. W celu określenia czy ujawnione niniejszym przeciwciała anty-CD40 zwiększają ekspresję markerów powierzchniowych komórki, komórki dendrytyczne pochodzące od monocytów hodowano z różnymi stężeniami przeciwciał agonistycznych przez 48-72 godz., a następnie barwiono (30 min. w lodzie, w ciemności) pod kątem HLA-DR, ICAM, B7-1, B7-2, CD40 i CD83, stosując komercyjnie dostępne odczynniki będące przeciwciałami znakowanymi fluorochromem. Komórki analizowano następnie na aparacie FACS-Caliber (Becton-Dickinson). Maksymalną krotność wzrostu średniej fluorescencji (przy 1 μg/ml przeciwciała) i średnie EC50 otrzymane przy zastosowaniu przeciwciała anty-CD40 według (21.4.1), przedstawiono w tabeli 24.
T a b e l a 24
Podwyższenie ekspresji cząsteczek powierzchniowych komórki dendrytycznej przez przeciwciało anty-CD40 według wynalazku
Maksymalna krotność wzrostu EC50 (ng/ml)
Średnia ± odchylenie stand. Średnia ± odchylenie stand.
MHC II 7,7 ± 5,6 252 ± 353
CD83 36,3 ± 42,2 233 ± 262
ICAM 10,4 ± 4,8 241 ±140
B7-2 21,9 ± 9,4 71,4 ± 44,4
Podobne doświadczenia przeprowadzono z komórkami B i mDC stosując różne ujawnione niniejszym przeciwciała anty-CD40 i dodatkowe markery. Mierzono ekspresję cząsteczek powierzchniowych komórek B (MHC-II, ICAM, B7-1, B7-2 i CD23) jak to opisano powyżej, ale stosując 1 μg/ml przeciwciała anty-CD40. Wyniki tego doświadczenia przedstawiono w tabeli 25. Mierzono ekspresję cząsteczek powierzchniowych komórki dendrytycznej (MHC-II, ICAM, B7-1, B7-2 i CD83) po 72 godz., jak wskazano powyżej, ale stosując 1 μg/ml przeciwciała anty-CD40.
Wyniki tego doświadczenia przedstawiono w tabeli 26. Tabele 25-26 pokazują krotność wzrostu w średniej intensywności ± odchylenie standardowe.
T a b e l a 25
Podwyższenie ekspresji cząsteczek powierzchniowych komórki B przez przeciwciała anty-CD40, w tym przeciwciała według wynalazku
MHC klasy II ICAM (CD5 4) B7-1 (CD 80) B7-2 (CD86) CD23
Komórka B Komórka B Komórka B Komórka B Komórka B
3.1.1 3,2 ± 2,6 1,3 ± 0,2 1,7 ± 0,2 1,2 ± 0,4 5,6 ± 4,8
21.2.1 1,2 ± 0,2 1,3 ± 0,9 0,9 ± 0,5 1,0 ± 0,04 1,0 ± 0,1
21.4.1 3,6 ± 3,0 5,0 ± 3,0 1,9 ± 0,8 1,8 ± 0,7 21,5 ± 34,8
22.1.1 1,4 ± 0,5 1,1 ± 0,2 1,2 ± 0,3 1,0 ± 0,1 3,3 ± 0,2
23.5.1 1,4 ± 0,5 1,1 ± 0,2 1,4 ± 0,6 1,0 ± 0,1 1,1 ± 0,2
23.25.1 2,5 ± 1,1 2,5 ± 0,9 1,6 ± 0,4 1,3 ± 0,2 4,3 ± 2,3
23.28.1 1,1 ± 0,2 1,1 ± 0,2 1,8 ± 0,6 1,0 ± 0,1 1,1 ± 0,4
23.29.1 1,2 ± 0,2 1,0 ± 0,2 1,3 ± 0,6 0,9 ± 0,2 1,1 ± 0,1
24.2.1 1,8 ± 1,0 1,6 ± 0,8 1,1 ± 0,4 1,1 ± 0,2 0,9 ± 0,6
PL 214 289 B1
T a b e l a 26
Podwyższenie ekspresji cząsteczek powierzchniowych komórki dendrytycznej przez przeciwciała anty-CD40, w tym przeciwciała według wynalazku
MHC klasy 11 1CAM (CD54) B7-1 (CD 80) B7-2 (CD86) CD83
DC DC DC DC DC
3.1.1 4,4 ± 2,4 1,5 ± 0,7 1,8 ± 0,9 23,7 ± 33,5 15,2 ± 18,2
21.2.1 1,8 ± 1,3 1,5 ± 0,9 0,9 ± 0,4 7,4 ± 10,5 10,8 ± 16,5
21.4.1 5,0 ± 3,8 3,7 ± 1,4 1,5 ± 1,1 12,9 ± 13,3 48,6 ± 49,5
22.1.1 2,3 ± 1,2 1,6 ± 0,7 1,4 ± 1,0 16,3 ± 25,5 12,0 ± 17,0
23.5.1 2,3 ± 1,8 1,2 ± 0,5 1,1 ± 0,6 10,7 ± 17,5 9,2 ± 11,1
23.25.1 2,1 ± 1,8 2,4 ± 1,0 1,1 ± 0,5 3,3 ± 4,2 13,6 ± 28,9
23.28.1 2,4 ± 1,7 2,7 ± 2,1 1,3 ± 0,6 10,6 ± 17,5 18,3 ± 22,6
23.29.1 2,0 ± 1,5 1,2 ± 0,4 0,9 ± 0,5 8,4 ± 10,6 10,6 ± 13,1
24.2.1 4,7 ± 3,0 2,1 ± 1,2 3,8 ± 3,8 56,6 ± 95,8 31,2 ± 28,4
Tabela 27 porównuje podwyższenie ekspresji cząsteczek powierzchniowych komórki w komórkach dendrytycznych i komórkach B jako proporcję średniej krotności w komórkach dendrytycznych do średniej krotności w komórkach B.
T a b e l a 27
Podwyższenie ekspresji cząsteczek powierzchniowych w komórkach dendrytycznych i komórkach B
B7-1 (CD80) B7-2 (CD86) MHC klasy II ICAM (CD54)
3.1.1 1,08 19,40 1,38 1,15
21.2.1 1,01 7,37 1,49 1,12
21.4.1 0,77 7,04 1,37 0,74
22.1.1 1,18 16,36 1,61 1,44
23.5.1 0,83 10,54 1,59 1,06
23.25.1 0,66 2,57 0,85 0,98
23.28.1 0,71 10,81 2,16 2,57
23.29.1 0,73 9,07 1,66 1,23
24.2.1 3,48 52,30 2,64 1,35
P r z y k ł a d VIII
Wzmacnianie wydzielania cytokin
W celu określenia czy ludzkie przeciwciała anty-CD40 ujawnione niniejszym, w tym przeciwciało według wynalazku, wzmacniają wydzielanie IL-12p40, IL-12p70 i IL-8, przeprowadzono test komórek dendrytycznych pochodzących od monocytów.
Komórki dendrytyczne pochodzące od monocytów i monocyty adherentne przygotowywano w sposób, jak opisano powyżej. Komórki hodowano w obecności przeciwciała anty-CD40 według wynalazku (21.4.1) lub z przeciwciałem anty-hemocyjaninowym skałoczepu (KLH), stosowanym jako kontrola ujemna. Cytokiny mierzono w supernatantach po 24 godz., przy pomocy testu ELISA (R & D Systems). W niektórych badaniach (zobacz tabela 28), komórki dendrytyczne pochodzące od monocytów, traktowane przeciwciałem poddawano również ko-stymulacji 100 ng/ml LPS (Sigma), 1000 U/ml IFNy (R & D Systems) lub 25 ng/ml IL-Ιβ (R & D Systems). Przeciwciało anty-CD40 wzmacnia wytwarzanie IL-12p40, IL-12p70 i IL-8 zarówno w komórkach dendrytycznych pochodzących od monocytów, jak i w monocytach adherentnych. Obecność LPS dodatkowo wzmacnia wytwarzanie IL-12p40 i IL-12p70. W supernatantach komórek dendrytycznych inkubowanych z izotypowym przeciwciałem kontrolnym anty-KLH, wykrywano tylko minimalne poziomy cytokin. Reprezentatywne wyniki przedstawio74
PL 214 289 B1 no w tabeli 28 i na fig. 3 i 4. Tabela 28 przedstawia główne cytokiny wytwarzane przez komórki dendrytyczne lub monocyty adherentne przy 1 μg/ml przeciwciała anty-CD40 według wynalazku (21.4.1) ± 100 ng/ml LPS. Jak przedstawiono na fig. 3, przeciwciało anty-CD40 wzmacnia wytwarzanie IL-12p40 przez ludzkie komórki dendrytyczne. Fig. 4 przedstawia wzmocnienie wytwarzania IL-12p70 przez ludzkie komórki dendrytyczne w obecności przeciwciała i 100 ng/ml LPS.
T a b e l a 28
Wzmacnianie wydzielania IL-12p40, IL-12p70 i IL-8 przez przeciwciało anty-CD40
Podawanie Indukowana cytokina
Typ komórki Przeciwciało 1 μg/ml LPS 100 ng/ml IL-12p40 pg/ml IL-12p70 pg/ml IL-8 pg/ml
Komórka dendrytyczna 21.4.1 + 32252 1000 ND
21.4.1 - 1200 76 1200
anty-KLH + 14280 352 ND
anty-KLH - 200 4 150
Monocyt adherentny 21.4.1 - ND ND 7000
21.4.1 + ND 425 ND
anty-KLH - ND ND 400
anty-KLH + ND 30 ND
ND = nie określane
Podobne doświadczenia przeprowadzono stosując złożone przeciwciała anty-CD40. Komórki dendrytyczne pochodzące od monocytów przygotowywano jak to opisano powyżej i hodowano w obecności różnych stężeń przeciwciała anty-CD40 i ko-stymulowano 100 ng/ml LPS (Sigma). W supernatancie mierzono IL-12p70 po 24 godz. stosując test ELISA (R & D Systems) i dla każdego przeciwciała określano EC50. Wyniki doświadczeń przedstawiono w tabeli 29.
T a b e l a 29
Wzmacnianie wydzielania IL-12p70 w komórkach dendrytycznych
Klon przeciwciała DC IL-12p70
EC50 pg/ml Maks. pg/ml
21.4.1 0,3 1796-7004
22.1.1 0,1 720-1040
23.25.1 0,2 540-960
23.5.1 0,1 676-1112
24.2.1 0,2 754-3680
3.1.1 0,2 6 68-960
23.28.1 0,2 1332-1404
23.29.1 0,1 852-900
21.2.1 0,03 656-872
Badano również zdolność przeciwciał anty-CD40 do wzmacniania wydzielania IFN-gamma z komórek T w teście typu allogeniczna komórka T/komórka dendrytyczna. Aby wykonać ten test, komórki T i monocyty izolowano z krwi obwodowej zdrowych ochotników. Monocyty różnicowano do 5 komórek dendrytycznych stosując metody opisane powyżej. 1 x 105 komórek T otrzymanych od osob5 nika hodowano z 1 x 105 komórek dendrytycznych otrzymanych od innego osobnika w obecności przeciwciała anty-CD40 według wynalazku lub przeciwciała kontrolnego. Po 4 dniach hodowli, supernatanty testowano pod kątem wydzielania IFN-gamma stosując test ELISA. Wyniki testu przedstawiono w tabeli 30.
PL 214 289 B1
T a b e l a 30
Wzmacnianie wydzielania IFN-gamma przez przeciwciała anty-Cd40 według wynalazku
Klon przeciwciała allo DC/T IFNy
EC50 pg/ml Maks. pg/ml
21.4.1 0,30 212
22.1.1 0,30 110-180
23.25.1 0,30 180-232
23. 5.1 0,20 150-240
24.2.1 0,20 111-194
3.1.1 0,10 100-195
23.28.1 0,20 120-190
23.29.1 0,30 134-150
21.2.1 0,03 230-256
P r z y k ł a d IX
Indukcja cytokin zapalnych przez przeciwciała anty-CD40 ujawnione niniejszym, w tym przeciwciała według wynalazku
W celu określenia czy cytokiny zapalne są indukowane przez przeciwciała w stężeniu 1, 10 i 100 μg/ml, przeciwciała 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1 i 3.1.1 badano w teście uwalniania cytokin we krwi pełnej, opisanym przez Wing i wsp., Therapeutic. Immunol. 2: 183-90 (1995). Nie obserwowano znaczącego wydzielania TNF-a, IL-Ιβ, IFN-γ, czy IL-6 z tymi przeciwciałami we wskazanych stężeniach we krwi pochodzącej od 10 zdrowych dawców.
P r z y k ł a d X
Wzmacnianie immunogenności linii komórkowej Jy przez przeciwciała anty-CD40
Komórki dodatnie względem JIYOYE CD40 (ATCC CCL 87) („komórki Jy) hodowano i utrzymywano w podłożu RPMI. Komórki JIYOYE inkubowano 24 godz. z przeciwciałem anty-CD40 według wynalazku (21.4.1) lub z przeciwciałem pasującym izotypowo (anty-KLH), w pełnym podłożu RPMI. Następnie komórki płukano i traktowano 25 mg mitomycyny C (Sigma)/7 ml podłoża przez 60 min. Następnie komórki te inkubowano z wyizolowanymi ludzkimi komórkami T w stosunku 1:100 przez 6 dni w temperaturze 37°C (5% CO2). Następnie, komórki T zbierano, płukano i określano poziom aktywności CTL wobec komórek JIYOYE znakowanych świeżym chromem 51 (New England Nuclear, Boston, MA). Swoistą aktywność CTL obliczano jako % specyficznej cytolizy = (cytoliza Jy (cpm) spontaniczna cytoliza (cpm)) / (cytoliza całkowita (cpm) - spontaniczna cytoliza (cpm)).
Jak to przedstawiono na fig. 5, przeciwciało anty-CD40 według wynalazku (21.4.1) znacząco wzmacnia immunogenność wobec komórek Jy, traktowanych przeciwciałem.
P r z y k ł a d XI
Zwierzęcy model guza
W celu dalszego badania aktywności anty-nowotworowej przeciwciał anty-CD40 ujawnionych niniejszym, w tym przeciwciała według wynalazku, zaprojektowano model myszy beżowej SCID do testowania wpływu przeciwciała na wzrost guza in vivo.
Beżowe myszy SCID otrzymano z Charles River i przed wykorzystaniem pozwolono im na tygodniową aklimatyzację. Komórki guza (komórki Daudi (ATCC CCL 213), CD40(-) komórki K562 (ATCC CCL 243) i CD4O(+) komórki Raji (ATCC CCL 86), komórki raka piersi BT474 (ATCC HTB 20) lub komórki prostaty PC-3 (ATCC CRL 1435)) wstrzykiwano podskórnie w stężeniu 1 x 107 komórek/zwierzę.
W niektórych przypadkach wstrzykiwano komórki T (5 x 105) i komórki dendrytyczne (1 x 105) od tego samego ludzkiego dawcy wraz z komórkami guza. Wstrzykiwano również dootrzewnowo przeciwciało anty-CD40 lub kontrolę dopasowaną izotypowo (anty-KLH), tuż przed wstrzyknięciem komórek guza (tylko jedno wstrzyknięcie). Następnie, mierzono wzrost guza. Specyficzne doświadczenia opisano poniżej.
PL 214 289 B1
W jednym doświadczeniu, wstrzykiwano dootrzewnowo przeciwciało anty-CD40 według wynalazku (21.4.1) lub kontrolę dopasowaną izotypowo (anty-KLH), w dawce 10 mg/kg tuż przed wstrzyknięciem komórek guza (tylko jedno wstrzyknięcie). Komórki guza (komórki Daudi) wstrzykiwano podskórnie w stężeniu 1 x 107 komórek/zwierzę. Wzrost guza mierzono za pomocą cyrkla do pomiaru średnicy w dniach 17, 19, 20, 21, 25, 26, 27 i 28 po implantacji, w obecności ludzkich komórek T i komórek dendrytycznych. Jak pokazano na fig. 6, przeciwciało anty-CD40 hamowało wzrost guza o około 60%.
W innym doświadczeniu, wstrzykiwano dootrzewnowo przeciwciało anty-CD40 według wynalazku (21.4.1) lub kontrolę dopasowaną izotypowo (anty-KLH), w dawce 0,1 mg/kg, 1 mg/kg lub 10 mg/kg tuż przed wstrzyknięciem komórek guza (tylko jedno wstrzyknięcie). Komórki guza (komórki K562) wstrzykiwano podskórnie w stężeniu 1 x 107 komórek/zwierzę. W doświadczeniu tym wstrzyki55 wano komórki T (5 x 105) i komórki dendrytyczne (1 x 105) od tego samego ludzkiego dawcy wraz z komórkami guza. Wzrost guza mierzono za pomocą cyrkla do pomiaru średnicy w dniach 17, 19, 20, 21, 25, 26, 27 i 28 po implantacji. Jak pokazano na fig. 7, przeciwciało anty-CD40 hamowało wzrost guza o około 60-85%.
W innym doświadczeniu, wstrzykiwano dootrzewnowo przeciwciało anty-CD40 według wynalazku (21.4.1, 23.29.1 lub 3.1.1) lub kontrolę dopasowaną izotypowo (anty-KLH), tuż przed wstrzyknięciem komórek guza (tylko jedno wstrzyknięcie). Izotypowo dopasowane przeciwciało kontrolne i przeciwciało 21.4.1 wstrzykiwano w dawce 1 mg/ml. Przeciwciała 23.29.1 i 3.1.1 wstrzykiwano w dawce 1, 0,1, 0,01, 0,001 lub 0,0001 mg/kg. Komórki guza (komórki K562) wstrzykiwano podskórnie w stężeniu 1 x 107 komórek/zwierzę. W doświadczeniu tym wstrzykiwano komórki T (5 x 105) i komórki 5 dendrytyczne (1 x 105) od tego samego ludzkiego dawcy wraz z komórkami guza. Wzrost guza mierzono za pomocą cyrkla do pomiaru średnicy w 28 dniu po implantacji. Wyniki tego doświadczenia przedstawiono na fig. 8 i 9. Na wykresach każdy punkt reprezentuje pomiar otrzymany dla pojedynczego zwierzęcia.
W innym doświadczeniu, wstrzykiwano dootrzewnowo przeciwciało anty-CD40 według wynalazku (21.4.1) lub kontrolę dopasowaną izotypowo (anty-KLH), tuż przed wstrzyknięciem komórek guza (tylko jedno wstrzyknięcie). Przeciwciała wstrzykiwano w dawce 1, 0,1, 0,01, 0,001 lub 0,0001 mg/kg. Komórki guza (komórki Raji) wstrzykiwano podskórnie w stężeniu 1 x 107 komórek/zwierzę.
Tym samym zwierzętom wstrzykiwano komórki T (5 x 103) i komórki dendrytyczne (1 x 105) od tego samego ludzkiego dawcy wraz z komórkami guza. Następnie mierzono wzrost guza za pomocą cyrkla do pomiaru średnicy w 28 dniu po implantacji. Wyniki tego doświadczenia przedstawiono na fig. 10. Na wykresie każdy punkt reprezentuje pomiar otrzymany dla pojedynczego zwierzęcia.
W jeszcze innym doświadczeniu, wstrzykiwano dootrzewnowo przeciwciało anty-CD40 (21.4.1,
23.28.1, 3.1.1 lub 23.5.1) lub kontrolę dopasowaną izotypowo (anty-KLH), tuż przed wstrzyknięciem komórek guza (tylko jedno wstrzyknięcie). Przeciwciała wstrzykiwano w dawce 1 lub 0,1, mg/kg. Komórki guza (komórki Raji) wstrzykiwano podskórnie w stężeniu 1 x 107 komórek/zwierzę. Następnie, mierzono wzrost guza za pomocą cyrkla do pomiaru średnicy w 28 dniu po implantacji. Wyniki tego doświadczenia przedstawiono na fig. 11. Na wykresie każdy punkt reprezentuje pomiar otrzymany dla pojedynczego zwierzęcia.
W jeszcze innym doświadczeniu, dootrzewnowo wstrzykiwano przeciwciało anty-CD40 (21.4.1, 23.29.1 lub 3.1.1) lub kontrolę dopasowaną izotypowo (anty-KLH), tuż przed wstrzyknięciem komórek guza (tylko jedno wstrzyknięcie). Przeciwciała wstrzykiwano w dawce 1 mg/kg. Komórki guza (komórki raka piersi BT474) wstrzykiwano podskórnie w stężeniu 1 x 107 komórek/zwierzę. Komórki T (5 x 105) 5 i komórki dendrytyczne (1 x 105) wstrzykiwano od tego samego ludzkiego dawcy wraz z komórkami guza. Następnie, mierzono wzrost guza za pomocą cyrkla do pomiaru średnicy w 39 dniu po implantacji. Jak przedstawiono na fig. 12 wszystkie przeciwciała hamowały wzrost guza raka piersi. Na wykresie każdy punkt reprezentuje pomiar otrzymany dla pojedynczego zwierzęcia.
W jeszcze innym doświadczeniu, dootrzewnowo wstrzykiwano przeciwciało anty-CD40 (3.1.1) lub kontrolę dopasowaną izotypowo (anty-KLH), tuż przed wstrzyknięciem komórek guza (tylko jedno wstrzyknięcie). Przeciwciała wstrzykiwano w dawce 1 mg/kg. Komórki guza (komórki guza prostaty PC-3) wstrzykiwano podskórnie w stężeniu 1 x 107 komórek/zwierzę. Następnie, mierzono wzrost guza za pomocą cyrkla do pomiaru średnicy w 41 dniu po implantacji. Jak przedstawiono na fig. 13 przeciwciało anty-CD40 hamowało wzrost guza prostaty o około 60%. Na wykresie każdy punkt reprezentuje pomiar otrzymany dla pojedynczego zwierzęcia
PL 214 289 B1
P r z y k ł a d XII
Przeżywalność beżowych myszy SCID, którym wstrzyknięto komórki guza Daudi i podano przeciwciała anty-CD40
W innym doświadczeniu, wstrzykiwano dootrzewnowo przeciwciało anty-CD40, w tym przeciwciało według wynalazku, lub kontrolę dopasowaną izotypowo (jedno wstrzyknięcie), tuż przed wstrzyknięciem komórek guza. Przeciwciała wstrzykiwano w dawce 1 lub 0,1 mg/kg. Komórki guza (komórki Daudi) wstrzykiwano dożylnie w dawce 5 x 106 komórek/zwierzę. Następnie, monitorowano przeżywalność zwierząt. Jak przedstawiono na fig. 14, wszystkie badane przeciwciała anty-CD40 przedłużały przeżywalność myszy, którym wstrzyknięto komórki guza o co najmniej 6 dni.
Tabela 31 przedstawia wartości ED50 przeciwciał anty-CD40 w różnych modelach guza litego przedstawionych w Przykładzie XI. Tabela 31 przedstawia aktywność przeciwnowotworową niektórych przeciwciał anty-CD40, w tym przeciwciała według wynalazku, u myszy SCID. Dodatkowo tabela przedstawia wartości ED50 przeciwciał anty-CD40 w modelu narządowego guza Daudi, opisanym powyżej w przykładzie XII.
T a b e l a 31
Wartości ED50 przeciwciał anty-CD40 przy zastosowaniu różnych modeli guza in vivo w myszach SCID
Przeciwciało CD40(-) K562 & T/DC podskórnie (mg/kg) CD40(+) Raji & T/DC podskórnie (mg/kg) CD40(+) Raji podskornie (mg/kg) CD40(+) Daudi dożylnie (mg/kg)
21.4.1 0,005 0,0008 0,016 0,1
22.1.1 0,01 ND > 1,0 0,1
2 3.25.1 > 1,0 ND >1,0 ND
23.5.1 >1,0 ND > 1,0 ND
24.2.1 >1,0 ND > 1,0 ND
3.1.1 0,02 ND > 0,1 < 0,1
23.28.1 > 1,0 ND > 1,0 0,1
23.29.1 0,009 ND >1,0 < 0,1
21.2.1 < 1,0 ND ND ND
ND= nie wykonano
P r z y k ł a d XIII
Określenie stałych powinowactwa (KD) całkowicie ludzkich przeciwciał anty-CD40 z zastosowaniem aparatury BIAcore
Pomiary powinowactwa oczyszczonych przeciwciał przeprowadzono za pomocą rezonansu plazmonów powierzchniowych stosując urządzenie BIAcore 3000, postępując zgodnie z protokołami producenta.
Biosensorowa aparatura do analizy biospecyficznego oddziaływania (BIAcore) wykorzystuje rezonans plazmonów powierzchniowych do mierzenie oddziaływań molekularnych na chipie sensorowym CM5. Zmiany w indeksacń refrakcyjnych pomiędzy dwoma podłożami, szklanym i karboksymetylowanym dekstranem, powodowane przez oddziaływanie cząsteczek z miejscem dekstranowym chipa sensorowego, mierzy się i rejestruje jako zmiany w arbitralnych jednostkach współczynnika odbicia (RU, ang. reflectance units), jak to wyszczególniono w zaleceniach producenta.
Karboksymetylowaną dekstranową powierzchnię kuwety przepływowej na chipie sensorowym aktywowano przez derywatyzację 0,05M N-hydroksysukcynoimidem za pośrednictwem 0,2 M N-etylo-N'-(dimetyloaminopropylo)karbodiimidu przez 7 min. Białko fuzyjne CD40-Ig (opisane w przykładzie I) w stężeniu 5 pg/ml, w 10 mM octanie sodu, pH 3,5, wstrzykiwano manualnie do kuwety przepływowej z szybkością 5 pl/min i unieruchamiano kowalencyjnie na powierzchni kuwety przepływowej przy pożądanej wartości RU. Dezaktywację niereaktywnych estrów N-hydroksysukcynoimidowych przeprowadzano stosując 1M chlorowodorek etanoloaminy, pH 8,5. Po immobilizacji, kuwety przepływowe są oczyszczane z nie przereagowanego lub słabo związanego materiału za pomocą 5 regenerujących wstrzyknięć 5 pl 50 mM NaOH do czasu otrzymania stabilnej linii podstawowej. Kuweta przepływowa 2, powierzchnia o wysokiej gęstości, mierzyła w przybliżeniu 300 RU po przygotowaniu powierzchni
PL 214 289 B1 i kuweta przepływowa 3, powierzchnia o niskiej gęstości, mierzyła w przybliżeniu 150 RU. Do kuwety przepływowej 1, aktywowana pusta powierzchnia, 35 μl buforu 10 mM octanu sodu nastrzykiwano podczas unieruchomienia w miejscu antygenu. Kuweta przepływowa 4 zawierała w przybliżeniu 450 RU unieruchomionego CTLA4-Ig, nieistotna kontrola antygenu.
Serie rozcieńczeń każdego przeciwciała przygotowano w zakresie stężeń od 100 μg/ml do 0,1 μg/ml przez połowiczne rozcieńczenie. Szybkość przepływu ustalono na 5 μl/min. i 25 μl próbki każdego punktowego stężenia nastrzykiwano na chip sensorowy z nastrzyknięciem regeneracyjnym 5 μl 50 mM NaOH pomiędzy każdym stężeniem nastrzykiwanego przeciwciała. Dane analizowano stosując oprogramowanie BIAevaluation 3.0.
W doświadczeniach kinetycznych odwróconej orientacji, przeciwciało 21.4.1 unieruchamiano na powierzchni chipa sensorowego stosując protokół opisany powyżej. Jako kontrolę przeciwciał powierzchni zastosowano anty-KLH. Antygen, białko fuzyjne CD40-Ig, nastrzykiwano w zakresie stężeń od 100 μg/μl do 0,1 μg/ml.
Tabela 32 przedstawia pomiary powinowactwa dla reprezentatywnych przeciwciał anty-CD40, w tym przeciwciała według wynalazku.
T a b e l a 32
Pomiary powinowactwa dla przeciwciał anty-CD40
Przeciwciało Kon (1/Ms) Koff (1/s) Kd (M)
3.1.1 1,12 x 106 3,31 x 10'5 3,95 x 10'11
10.8.3 2,22 x 105 4,48 x 10'7 2,23 x 10'12
15.1.1 8,30 x 104 2,83 x 10'7 4,05 x 10'12
21.4.1 8,26 x 104 2,23 x 10'5 3,48 x 10-10
22.1.1 9, 55 x 105 1,55 x 10'4 2,79 x 10'10
23.25.1 3,83 x 105 1,65 x 10'7 7,78 x 10'12
23.28. 1 1,30 x 105 8,11 x 10'5 1,61 x 10'10
23.29.1 3,54 x 105 3,90 x 10'5 1,04 x 10'11
P r z y k ł a d XIV
Mapowanie epitopów przeciwciał anty-CD40
Testy wiązania przeprowadzono stosując fuzję antygenową oczyszczonego, przy użyciu białka A, ludzkiego CD40 z Fe IgGl. Białko fuzyjne ludzkiego CD40-IgGl Fe sklonowano w firmie Pfizer. Białko fuzyjne ludzkiego CD40 IgGl było wytwarzane w ssaczej linii komórkowej i oczyszczane na kolumnie z białkiem A. Czystość fuzji antygenowej oceniano stosując SDS/PAGE.
CD40 posiada strukturę typowego białka transbłonowego typu I. Dojrzała cząsteczka składa się z 277 aminokwasów. Zewnątrz komórkowa domena CD40 składa się z czterech bogatych w cysteinę domen typu TNFR. Zobacz np. Neismith i Sprang, TIBS 23: 74-79 (1998); van Kooten i Banchereau, J. Leukocyte Biol. 67: 2-17 (2000); Stamenkovic i wsp., EMBO J. 8: 1403- 1410(1989).
Wiązanie przeciwciał anty-CD40 ze zredukowanym i nie- zredukowanym ludzkim CD40.
Ponieważ zewnątrzkomórkowa domena CD40 składa się z czterech bogatych w cysteinę domen, przerwanie wewnątrzcząsteczkowych wiązań przez czynnik redukujący, może zmienić reaktywność przeciwciała. W celu określenia czy przerwanie wewnątrzcząsteczkowych wiązań przez czynnik redukujący, zmienia reaktywność wybranych przeciwciał anty-CD40, oczyszczone CD40-hIgG nanoszono w SDS/PAGE (4-20% żel) w warunkach nieredukujących (NR) lub redukujących (R). SDS/PAGE przeprowadzano stosując metodę Laemmli, za pomocą systemu mini-żelu. Rozdzielone białka przenoszono na błonę nitrocelulozową. Błony blokowano stosując PBS zawierający 5% (wag./obj.) odtłuszczonego mleka w proszku przez co najmniej 1 godz. przed wywołaniem i analizowano przez 1 godz. z każdym przeciwciałem jako sondą. Przeciwciała anty-CD40 wykrywano stosując skoniugowane z HRP kozie anty-ludzkie immunoglobuliny (rozcieńczenie 1:8000; nr kat. A-8667, Sigma). Błony wywoływano stosując wzmocnioną chemiluminescencję (ECL©; Amersham Bioscience), zgodnie z instrukcjami producenta. Western Blot analizowano następnie przy użyciu czterech przeciwciał anty-CD40, w tym przeciwciałem według wynalazku, stosowanych jako sondy: 21.4.1, 23.25.1,
PL 214 289 B1
23.29.1 i 24.2.1 (1 μg/ml), a następnie skoniugowanym z HRP kozim anty-ludzkim IgG (rozcieńczenie 1:8000). Wyniki doświadczenia przedstawiono na fig. 15. Wyniki wskazują na to, że przeciwciała
21.4.1, 23.25.1, 23.29.1 i 24.2.1 wiążą niezredukowane, ale nie wiążą zredukowanego CD40, tak więc przeciwciała rozpoznają epitop konformacyjny.
Wiązanie przeciwciał anty-CD40 z białkami ludzkiego CD40 z deletowaną domeną
Zewnątrzkomórkowy obszar CD40 zawiera cztery powtarzające się domeny typu TNFR (określane jako D1-D4). Zobacz np. Neismith i Sprang, TIBS 23: 74-79 (1998); van Kooten i Banchereau, J. Leukocyte Biol. 67: 2-17 (2000); Stamenkovic i wsp., EMBO J. 8: 1403-1410(1989). Fig. 16 przedstawia sekwencje aminokwasowe domen D1-D4 mysiego i ludzkiego CD40. W celu zbadania udziału różnych obszarów cząsteczki CD40 w prezentowaniu epitopu, skonstruowano liczne mutanty z deletowanymi domenami.
W celu utworzenia konstruktów delecyjnych ludzkiego CD40, całą zewnątrzkomórkową domenę ludzkiego CD40 (aminokwasy 1-193) amplifikowano z cDNA ludzkich komórek B (CD19+) (Multiple tissue cDNA panels, nr kat. K1428-1, Clontech), za pomocą PCR stosując startery o specyficznej sekwencji i dodawano znacznik 6XHis-tag na C-końcu. Starter 5', ludzkiego CD40, 5'-GCAAGCTTCACCAATGGTTCGTCTGCCTCTGCAGTG-3' (SEKW. NR ID.: 135) zastosowano z różną kombinacją starterów 3', do klonowania cząsteczek CD40 pełnej długości i skróconych. Starter 3', do klonowania pełnej długości zewnątrz komórkowej domeny ludzkiego CD40, miał sekwencję: 5'-TCAGTGATGGTGATGGTGATGTCTCAGCCGATCCTGGGGACCA-3' (SEKW. NR ID.: 136). Starter 3', zastosowany do klonowania domen D1-D3 ludzkiego CD40, miał sekwencję: 5'-TCAGTGATGGTGATGGTGATGTGGGCAGGGCTCGCGATGGTAT-3' (SEKW. NR ID.: 137) Starter 3', zastosowany do klonowania domen D1-D2 CD40, miał sekwencję: 5'-TCAGTGATGGTGATGGTGATGACAGGTGCAGATGGTGTCTGTT-3' (SEKW. NR ID.: 138). Po utworzeniu tych skróconych konstruktów cDNA CD40, doprowadzano do ich ekspresji w linii komórkowej 293F, stosując wektor pCR3.1 (Invitrogen). Białka fuzyjne CD40- 6XHis oczyszczano stosując wymywanie z kolumny niklowej.
Sekwencje aminokwasowe czterech mutantów delecyjnych przedstawiono w tabeli 33.
T a b e l a 33
Fuzje białkowe CD40 ze znacznikiem His-Tag
Mutant delecyjny: Sekwencja aminokwasowa (podkreślono sekwencję liderową)
Ludzki CD40-6XHis (cała długość zewnątrzkomórkowej domeny)- MVRLPLQCVLWGCLLTAVHPEPPTACREKQYLINSQCCS LCQPGQKLVSDCTEFTETECLPC GESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDT ICTCEEGWHCTSEACESCVLHRS CSPGFGVKQIATGVSDTICEPCPVGFFSNVSSAFEKCHP WTSCETKDLVVQQAGTNKTDVVC GPQDRHHHHHH (SEKW. NR ID.: 139)
Ludzki CD4O (D1-D3)-6xHis MVRLPLQCVLWGCLLTAVHPEPPTACREKQYLINSQCCS LCQPGQKLVSDCTEFTETECLPC GESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDT ICTCEEGWHCTSEACESCVLHRS CS PGFGVKQIATGVSDTICEPCPHHHHHH (SEKW. NR ID.:140)
Ludzki CD40 (D1-D2)-6Xhis MVRLPLQCVLWGCLLTAVHPEPPTACREKQYLINSQCCS LCQPGQKLVSDCTEFTETECLPC GESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDT ICTCHHHHHH (SEKW. NR ID.: 141)
Do ekspresji tych delecyjnych konstruktów ludzkiego CD40, konstrukty klonowano w wektorze pCR3.1 (Invitrogen), a ekspresję oceniano na różnych stabilnie i przejściowo transfekowanych liniach komórkowych 293F. Supernatanty z przejściowo transfekowanych komórek 293F analizowano pod kątem wiązania przeciwciał 21.4.1, 23.25.1, 23.29.1 i 24.2.1, stosując testy ELISA i Western Blot.
Testy ELISA przeprowadzono stosując supernatant z komórek 293F transfekowanych różnymi konstruktami CD40. Płytki ELISA opłaszczano poliklonalymi kozimi przeciwciałami anty-ludzkimi CD40 (R & D nr kat. AF 632) lub poliklonalymi przeciwciałami kozimi anty-mysimi CD40 (R & D nr kat. AF 440) rozcieńczonymi do 1 μg/ml w buforze ELISA do opłaszczania płytek. Ekspresję konstruktów CD40 w komórkach 293F potwierdzano przez wykrywanie z biotynylowanym kozim anty-ludzkim
PL 214 289 B1
CD40 (R&D nr kat. BAF 632), kozim anty-mysim CD40 (R & D nr kat. BAF 440) lub z przeciwciałem skoniugowanym z HRP anty-His (C koniec) (Invitrogen, nr kat. 46-0707). Wiązanie ludzkich przeciwciał anty-CD40 wykrywano skoniugowanym z HRP kozim anty-ludzkim IgG (FC swoisty Caltag H10507), rozcieńczonym 1:2000. Wyniki, jak przedstawiono w tabeli 34, wskazują, że większość jeśli nie wszystkie epitopy rozpoznawane przez mAb 21.4.1, 23.28.1 i 23.29.1 mieszczą się w obszarze D1-D2 CD40, podczas gdy epitop dla mAb 24.2.1 mieści się, przynajmniej częściowo, w domenie D3D4. Jako kontrolę zastosowano fuzję białkową ludzkie CD40-królicze Fe, w celu potwierdzenia swoistości wiązania przeciwciała.
T a b e l a 34
ELISA: Wiązanie przeciwciała z mutantami delecyjnymi CD4O
Ludzki CD40 (D1-D2)-6Xhis Ludzki CD40 (D1-D3)-6XHis Ludzki CD40-6XHis
21.4.1 + + +
23.25.1 + + +
23.29.1 + + +
24.2.1 - + +
anty-His + + +
anty-Rblg ND ND ND
ND = nie wykryto
Konstrukty delecyjne CD40 analizowano również stosując analizę typu Western Blot. Wyniki przedstawiono w tabeli 35. Wyniki ELISA wykazują, że miejsce wiązania dla przeciwciał 21.4.1,
23.25.1, 23.29.1 i 24.2.1 wymaga domen D1-D3. Wyniki pokazują również, że miejsce wiązania dla przeciwciał 21.4.1, 23.25.1 i 23.29.1 wymaga domen D1-D2 i że miejsce wiązania przeciwciała 24.2.1 wymaga domeny D3.
T a b e l a 35
Western Biot: wiązanie przeciwciała z mutantem delecyjnym CD40
Ludzki CD40 (D1- D3)-6Xhis Ludzki CD40-6Xhis
21.4.1 + +
23.25.1 + +
23.29.1 + +
24.2.1 + +
anty-His + +
Anty-RbIg ND ND
ND = nie wykryto
Wiązanie przeciwciał anty-CD40 z mysim CD40
Ustalono zdolność przeciwciał 21.4.1,23.25.1,23.29.1 i 24.2.1 do wiązania z mysim CD40.
Dla celów tego doświadczenia, mysie CD40 amplifikowano z cDNA mysich komórek B. Fuzję białkową mysiego CD40 (D1-D3)-6xHis sklonowano w pCR3.1, wykorzystującym promotor CMV, w celu kierowania transkrypcją. Starter 5', zastosowany do klonowania zewnątrzkomórkowej domeny mysiego CD40, miał sekwencję: S'-TGCAAGCTTCACCATGGTGTCTTTGCCTCGGCTGTG-3'. Starter 3', zastosowany do klonowania domen D1-D3 mysiego CD40, miał sekwencję: 5'-GTCCTCGAGTCAGTGATGGTGATGGTGATGTGGGCAGGGATGACAGAC-3'. Komórki 293F transfekowano przejściowo mysimi i ludzkimi konstruktami cDNA. Ekspresję zrekombinowanego CD40 wykrywano za pomocą testu ELISA stosując przeciwciała poliklonalne przeciw mysiemu i ludzkiemu CD40, przeciwciała antyHis i przeciwciała anty-CD40 21.4.1, 23.25.1, 23.29.1 i 24.2.1. Wyniki tych doświadczeń przedstawiono w tabeli 36. Doświadczenie pokazuje, że wszystkie przeciwciała są swoiste wobec ludzkiego CD40 i nie reagują krzyżowo z mysim CD40.
PL 214 289 B1
T a b e l a 36
Reaktywność krzyżowa mysiego i ludzkiego CD40
Mysi CD40 (D1-D3)-6Xhis Ludzki CD40 (D1-D3)-6XHis
21.4.1 Nie Tak
23.25.1 Nie Tak
23.29.1 Nie Tak
24.2.1 Nie Tak
Kozi anty-ludzki CD40 Nie Tak
Kozi anty-mysi CD40 Tak Nie
Anty-His Tak Tak
Wiązanie przeciwciał anty-CD40 z ludzkim/mysim chimerycznym CD40
Ponieważ przeciwciała 21.4.1, 23.25.1, 23.29.1 i 24.2.1 nie wiążą mysiego CD40, w celu bardziej precyzyjnego zmapowania epitopów tych przeciwciał, skonstruowano ludzkie/mysie chimeryczne białka CD40.
Do skonstruowania fuzji, w zgodnej ramce odczytu, ludzkich i mysich białek chimerycznych CD40, wykorzystano unikatowe miejsca restrykcyjne na granicach domen CD40, w identycznych pozycjach cDNA zarówno ludzkiego jak i mysiego CD40. Utworzono różne konstrukty cDNA CD40 stosując miejsce restrykcyjne EcoRI na końcu domeny 1 (nukleotyd 244, aminokwas 64) i miejsce restrykcyjne BanI na końcu domeny 2 (nukleotyd 330, aminokwas 94) (fig. 17).
Amplifikowano różne domeny CD40 stosując PCR i ligowano. Podejście to pozwoliło na zastąpienie różnych domen mysiego CD40 przez homologiczne domeny z ludzkiego CD40. Otrzymane konstrukty przedstawiono na fig. 18.
Następnie, stosując test ELISA określono, czy przeciwciała 21.4.1, 23.25.1, 23.29.1 i 24.2.1 były zdolne do wiązania mysich/ludzkich chimerycznych białek CD40. Wyniki doświadczenia przedstawiono w tabeli 37. Z danych zamieszczonych w tabeli 37 wynika, że mAb 21.4.1 i 23.25.1 rozpoznają epitop, położony częściowo w D1 i częściowo w D2; mAb 23.29.1 rozpoznaje epitop położony głównie, jeśli nie całkowicie, w D2; i mAb 24.2.1 rozpoznaje epitop położony w D2 i D3.
T a b e l a 37
Wiązanie przeciwciała z białkami chimerycznymi CD40
Przeciwciało HuD1 HuD2 HuD3 HuD1, D2 HuD2, D3 HuD1, D3
21.4.1 Nie Nie Nie Tak Nie Nie
23.25.1 Nie Nie Nie Tak Nie Nie
23.29.1 Nie Tak Nie Tak Tak Nie
24.2.1 Nie Nie Nie Nie Tak Nie
Wszystkie publikacje i aplikacje patentowe cytowane w tym szczegółowym opisie są tutaj włączone na drodze odniesienia.

Claims (9)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Przeciwciało monoklonalne lub jego część wiążąca antygen, które swoiście wiąże się z i aktywuje ludzki CD40, przy czym przeciwciało obejmuje łańcuch ciężki i łańcuch lekki, a łańcuch ciężki zawiera sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha ciężkiego przeciwciała 21.4.1 (nr depozytu ATCC PTA-3605) i łańcuch lekki zawiera sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha lekkiego przeciwciała 21.4.1.
  2. 2. Przeciwciało lub jego część wiążąca antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że łańcuch ciężki zawiera domenę zmienną łańcucha ciężkiego przeciwciała 21.4.1 (nr depozytu ATCC PTA-3605), a łańcuch lekki zawiera domenę zmienną łańcucha lekkiego przeciwciała 21.4.1.
    PL 214 289 B1
  3. 3. Przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że jest przeciwciałem 21.4.1 (nr depozytu ATCC PTA-3605) lub przeciwciałem o takich samych sekwencjach aminokwasowych jak 21.4.1.
  4. 4. Przeciwciało lub jego część wiążąca antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha ciężkiego stanowią sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 z SEKW. NR ID.: 42, a CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha lekkiego stanowią sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 z SEKW. NR ID.: 44.
  5. 5. Przeciwciało lub część wiążąca antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że łańcuch ciężki obejmuje sekwencję aminokwasową z SEKW. NR ID.: 42 i łańcuch lekki obejmuje sekwencje aminokwasową z SEKW. NR ID.: 44.
  6. 6. Przeciwciało monoklonalne według zastrz. 1, znamienne tym, że obejmuje:
    a) sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEKW. NR ID.: 46 bez sekwencji sygnałowej oraz
    b) sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEKW. NR ID.: 48 bez sekwencji sygnałowej.
  7. 7. Przeciwciało monoklonalne według zastrz. 1, znamienne tym, że łańcuch ciężki przeciwciała składa się z SEKW. NR ID.: 46 bez sekwencji sygnałowej, a łańcuch lekki przeciwciała składa się z SEKW. NR ID.: 48 bez sekwencji sygnałowej.
  8. 8. Przeciwciało monoklonalne lub jego część wiążąca antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że wykazuje przynajmniej jedną właściwość wybraną z następującej grupy:
    a) współzawodniczy krzyżowo o wiązanie CD40 z przeciwciałem 21.4.1 (nr depozytu ATCC PTA-3605);
    b) wiąże się z tym samym epitopem CD40, co przeciwciało 21.4.1;
    c) wiąże CD40 z zasadniczo taką samą stałą KD, co przeciwciało 21.4.1; oraz
    d) wiąże CD40 z zasadniczo taką samą stałą Koff, co przeciwciało 21.4.1.
  9. 9. Zastosowanie przeciwciała lub części wiążącej antygen, jak określone w jednym z zastrz. 1 do 8 do wytwarzania leku do leczenia raka u człowieka tego potrzebującego.
PL370514A 2001-11-09 2002-11-08 Przeciwcialo monoklonalne lub jego czesc wiazaca antygen przeciwko CD40 i jego zastosowanie do leczenia raka PL214289B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US34898001P 2001-11-09 2001-11-09

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL370514A1 PL370514A1 (pl) 2005-05-30
PL214289B1 true PL214289B1 (pl) 2013-07-31

Family

ID=23370387

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL392809A PL214634B1 (pl) 2001-11-09 2002-11-08 Przeciwcialo monoklonalne przeciwko CD40 i jego czesc wiazaca antygen, zawierajaca go kompozycja i jego zastosowanie, oraz wyizolowana linia komórkowa, czasteczka wyizolowanego kwasu nukleinowego, wektor, komórka gospodarza i sposób wytwarzania
PL370514A PL214289B1 (pl) 2001-11-09 2002-11-08 Przeciwcialo monoklonalne lub jego czesc wiazaca antygen przeciwko CD40 i jego zastosowanie do leczenia raka

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL392809A PL214634B1 (pl) 2001-11-09 2002-11-08 Przeciwcialo monoklonalne przeciwko CD40 i jego czesc wiazaca antygen, zawierajaca go kompozycja i jego zastosowanie, oraz wyizolowana linia komórkowa, czasteczka wyizolowanego kwasu nukleinowego, wektor, komórka gospodarza i sposób wytwarzania

Country Status (47)

Country Link
US (9) US7288251B2 (pl)
EP (2) EP2343086A3 (pl)
JP (3) JP4616555B2 (pl)
KR (1) KR100830086B1 (pl)
CN (2) CN103450360B (pl)
AP (1) AP1918A (pl)
AR (1) AR039067A1 (pl)
AU (1) AU2002356926B2 (pl)
BR (1) BRPI0214137B8 (pl)
CA (1) CA2466128C (pl)
CL (1) CL2009001779A1 (pl)
CR (2) CR7343A (pl)
CU (1) CU23745A3 (pl)
CY (1) CY1115675T1 (pl)
DK (1) DK1476185T3 (pl)
DO (1) DOP2002000507A (pl)
EA (1) EA011449B1 (pl)
EC (1) ECSP045093A (pl)
EG (1) EG25801A (pl)
ES (1) ES2432968T3 (pl)
GE (1) GEP20074222B (pl)
GT (1) GT200200228A (pl)
HK (1) HK1069122A1 (pl)
HN (1) HN2002000318A (pl)
HR (1) HRP20040525B1 (pl)
HU (1) HU229829B1 (pl)
IL (2) IL161823A0 (pl)
IS (1) IS2940B (pl)
MA (1) MA27139A1 (pl)
ME (1) ME00503B (pl)
MX (1) MXPA04004467A (pl)
MY (1) MY137641A (pl)
NI (1) NI200200128A (pl)
NO (1) NO334339B1 (pl)
NZ (1) NZ533180A (pl)
OA (1) OA12725A (pl)
PA (1) PA8557701A1 (pl)
PE (1) PE20030846A1 (pl)
PL (2) PL214634B1 (pl)
PT (1) PT1476185E (pl)
RS (1) RS52484B (pl)
SI (1) SI1476185T1 (pl)
TN (1) TNSN04078A1 (pl)
TW (2) TWI331040B (pl)
UY (1) UY27537A1 (pl)
WO (1) WO2003040170A2 (pl)
ZA (1) ZA200404207B (pl)

Families Citing this family (253)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7244827B2 (en) 2000-04-12 2007-07-17 Agensys, Inc. Nucleic acid and corresponding protein entitled 24P4C12 useful in treatment and detection of cancer
US6943235B1 (en) * 1999-04-12 2005-09-13 Agensys, Inc. Transmembrane protein expressed in prostate cancer
US20050255106A1 (en) * 1999-05-22 2005-11-17 Linda Diehl Induction of anti-tumor ctl immunity through in vivo triggering of 4-1bb and/or cd40
US20030059427A1 (en) * 2000-04-28 2003-03-27 Force Walker R. Isolation and characterization of highly active anti-CD40 antibody
CA2422204A1 (en) 2000-09-07 2002-03-14 John R. Schreiber Human antibodies against pseudomonas aeruginosa lps derived from transgenic mice
PT1391464E (pt) 2001-04-27 2007-11-15 Kirin Pharma Kk Anticorpo monoclonal anti-cd40
US7658924B2 (en) * 2001-10-11 2010-02-09 Amgen Inc. Angiopoietin-2 specific binding agents
AR039067A1 (es) * 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
CA2466845A1 (en) 2001-11-21 2003-06-05 Fred Ramsdell Manipulation of cytokine levels using cd83 gene products
US20040185040A1 (en) 2001-11-21 2004-09-23 Celltech R & D Limited Modulating immune responses
EP2377549A1 (en) * 2002-06-07 2011-10-19 ZymoGenetics, Inc. Use of IL-21 for treating viral infections
US7052694B2 (en) * 2002-07-16 2006-05-30 Mayo Foundation For Medical Education And Research Dendritic cell potentiation
HN2004000285A (es) 2003-08-04 2006-04-27 Pfizer Prod Inc ANTICUERPOS DIRIGIDOS A c-MET
DK1680140T3 (da) * 2003-10-16 2011-06-14 Imclone Llc Fibrolast-vækstfaktorreceptor-1-inhibitorer og fremgangsmåde til behandling deraf
US8277810B2 (en) 2003-11-04 2012-10-02 Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc. Antagonist anti-CD40 antibodies
ZA200604419B (en) 2003-11-04 2008-06-25 Novartis Vaccines & Diagnostic Antagonist anti-CD40 monoclonal antibodies and methods for their use
CA2548015A1 (en) 2003-12-05 2005-06-23 John R. Schreiber Human anti-pseudomonas-aeruginosa antibodies derived from transgenic xenomouse
US20050136055A1 (en) * 2003-12-22 2005-06-23 Pfizer Inc CD40 antibody formulation and methods
BRPI0417266B8 (pt) 2003-12-25 2021-05-25 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd anticorpo monoclonal, seu uso e composição farmacêutica
NL1027975C2 (nl) 2004-01-09 2005-12-23 Pfizer Antilichamen tegen MAdCAM.
WO2005092927A1 (en) 2004-03-23 2005-10-06 Biogen Idec Ma Inc. Receptor coupling agents and therapeutic uses thereof
US20060099203A1 (en) * 2004-11-05 2006-05-11 Pease Larry R B7-DC binding antibody
WO2006004988A2 (en) * 2004-06-30 2006-01-12 Mayo Foundation For Medical Education And Research B7-dc binding antibody
CA2601417C (en) 2004-07-01 2018-10-30 Novo Nordisk A/S Human anti-kir antibodies
US20070286855A1 (en) * 2004-08-03 2007-12-13 Mayo Foundation For Medical Education And Research Improving treatments
US7563443B2 (en) * 2004-09-17 2009-07-21 Domantis Limited Monovalent anti-CD40L antibody polypeptides and compositions thereof
JP5295568B2 (ja) 2005-01-06 2013-09-18 ノヴォ ノルディスク アー／エス Ｋｉｒ結合剤およびその使用方法
WO2006075668A1 (ja) * 2005-01-12 2006-07-20 Kirin Beer Kabushiki Kaisha 安定化されたヒトIgG2およびIgG3抗体
MX2007011064A (es) * 2005-03-23 2008-02-19 Genmab As Anticuerpos contra cd38 para tratamiento de mieloma multiple.
EA012970B1 (ru) 2005-04-26 2010-02-26 Пфайзер Инк. Антитела против р-кадгерина
WO2006125117A2 (en) 2005-05-18 2006-11-23 Novartis Ag Methods for diagnosis and treatment of diseases having an autoimmune and/or inflammatory component
EP1894012A2 (en) * 2005-05-18 2008-03-05 Novartis AG Methods for diagnosis and treatment of proliferative disorders mediated by cd40 signaling
GB0512225D0 (en) * 2005-06-16 2005-07-27 Univ Sheffield Immunoglobulin molecules
EP4026840A1 (en) 2005-07-18 2022-07-13 Seagen Inc. Beta-glucuronide-linker drug conjugates
AP2013006963A0 (en) 2005-09-07 2013-07-31 Amgen Fremont Inc Human monoclonal antibodies to activin receptor-like Kinase-1
WO2007103048A2 (en) * 2006-03-01 2007-09-13 Regents Of The University Of Colorado Tlr agonist (flagellin)/cd40 agonist/antigen protein and dna conjugates and use thereof for inducing synergistic enhancement in immunity
CN104357469B (zh) 2006-05-03 2018-10-26 科罗拉多州立大学董事会 Cd40激动剂抗体/1型干扰素协同佐剂组合、包含前述的结合物及其用途
EP2021338A1 (en) 2006-05-09 2009-02-11 Pfizer Products Inc. Cycloalkylamino acid derivatives and pharmaceutical compositions thereof
EP1854810A1 (en) * 2006-05-09 2007-11-14 PanGenetics B.V. Deimmunized antagonistic anti-human CD40 monoclonal antibody from the ch5D12 antibody
US9234174B2 (en) * 2006-05-12 2016-01-12 Ospedale San Raffaele S.R.L. Tolerogenic dendritic cells, method for their production and uses therof
US20090074711A1 (en) * 2006-09-07 2009-03-19 University Of Southhampton Human therapies using chimeric agonistic anti-human cd40 antibody
CA2672581A1 (en) * 2006-12-14 2008-06-19 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Anti-claudin 3 monoclonal antibody and treatment and diagnosis of cancer using the same
CN101663320A (zh) * 2007-02-23 2010-03-03 先灵公司 工程改造的抗IL-23p19抗体
MX2009009079A (es) * 2007-02-23 2009-08-31 Schering Corp Anticuerpos anti-il-23p19 de ingenieria.
WO2008150494A1 (en) 2007-05-30 2008-12-11 Xencor, Inc. Methods and compositions for inhibiting cd32b expressing cells
EP1997830A1 (en) 2007-06-01 2008-12-03 AIMM Therapeutics B.V. RSV specific binding molecules and means for producing them
US8039597B2 (en) * 2007-09-07 2011-10-18 Agensys, Inc. Antibodies and related molecules that bind to 24P4C12 proteins
WO2009062125A1 (en) 2007-11-07 2009-05-14 Genentech, Inc. Methods and compositions for assessing responsiveness of b-cell lymphoma to treatment with anti-cd40 antibodies
BRPI0820875B1 (pt) 2007-12-14 2021-10-19 Bristol-Myers Squibb Company Molécula de ligação isolada, anticorpo monoclonal humano, composição, molécula de ácido nucleico, vetor e célula hospedeira
JO2913B1 (en) 2008-02-20 2015-09-15 امجين إنك, Antibodies directed towards angiopoietin-1 and angiopoietin-2 proteins and their uses
AU2010222929B2 (en) * 2008-07-16 2013-07-25 Baylor Research Institute Antigen presenting cell targeted anti-viral vaccines
EP2328890B1 (en) 2008-08-06 2012-01-25 Pfizer Inc. 6 substituted 2-heterocyclylamino pyrazine compounds as chk-1 inhibitors
EP2323690A1 (en) * 2008-08-29 2011-05-25 Academisch Ziekenhuis Leiden h.o.d.n. LUMC Delivery of a cd40 agonist to a tumor draining lymph node of a subject
EP2198878A1 (en) 2008-12-18 2010-06-23 University Of Miami Polypeptide bombesin antagonists
AU2016244220B2 (en) * 2008-12-23 2018-05-17 Amgen Inc. Human CGRP receptor binding proteins
JO3382B1 (ar) * 2008-12-23 2019-03-13 Amgen Inc أجسام مضادة ترتبط مع مستقبل cgrp بشري
RU2011140491A (ru) * 2009-03-06 2013-04-20 Эдженсис, Инк. Конъюгаты антитело-лекарственное средство, которые связывают белки 24р4с12
AU2010222942B2 (en) * 2009-03-10 2013-01-10 Baylor Research Institute Anti-CD40 antibodies and uses thereof
CA2754743C (en) 2009-03-10 2020-08-25 Baylor Research Institute Antigen presenting cell targeted anti-viral vaccines
MX2011010938A (es) 2009-04-18 2012-01-12 Genentech Inc Metodos para determinar la sensibilidad de linfoma de celula b al tratamiento con anticuerpos anti-cd40.
EP2993188B1 (en) * 2009-04-20 2020-08-19 Kyowa Kirin Co., Ltd. Anti cd40 antibody containing igg2 having three amino acid mutations introduced therein
TW201138843A (en) 2009-12-18 2011-11-16 Colgate Palmolive Co Biguanide preservation of precipitated calcium carbonate
WO2011083391A2 (en) 2010-01-05 2011-07-14 Pfizer Inc. Biomarkers for anti-igf-ir cancer therapy
GEP20166486B (en) 2010-03-31 2016-06-10 Boehringer Ingelheim Int Anti-cd40 antibodies
GB201006096D0 (en) * 2010-04-13 2010-05-26 Alligator Bioscience Ab Novel compositions and uses thereof
FR2959994B1 (fr) 2010-05-12 2012-08-24 Lfb Biotechnologies Nouveaux anticorps humanises 12g4 mutes et leurs fragments diriges contre le recepteur humain de l'hormone anti-mullerienne de type ii
RU2710717C2 (ru) 2010-09-09 2020-01-10 Пфайзер Инк. Молекулы, связывающиеся с 4-1ВВ
WO2012041635A1 (en) * 2010-09-29 2012-04-05 Universite De Liege Combination of an agonistic anti-cd40 monoclonal antibody or a cd40 ligand and inactivated or attenuated bacteria for use in the treatment and/or prevention of mastitis
AR083847A1 (es) 2010-11-15 2013-03-27 Novartis Ag Variantes de fc (fragmento constante) silenciosas de los anticuerpos anti-cd40
WO2012066058A1 (en) * 2010-11-16 2012-05-24 Boehringer Ingelheim International Gmbh Agents and methods for treating diseases that correlate with bcma expression
US20130295091A1 (en) * 2011-01-10 2013-11-07 University Of Zurich Combination therapy including tumor associated antigen binding antibodies
GB201103578D0 (en) 2011-03-02 2011-04-13 Sabrepharm Ltd Dipyridinium derivatives
DK2683406T3 (da) 2011-03-11 2019-07-08 Beth Israel Deaconess Medical Ct Inc Anti-cd40-antistoffer og anvendelser deraf
EP3536708A1 (en) 2011-04-19 2019-09-11 Pfizer Inc Combinations of anti-4-1bb antibodies and adcc-inducing antibodies for the treatment of cancer
CN103702682A (zh) * 2011-04-21 2014-04-02 科罗拉多州立大学董事会法人团体 治疗视神经脊髓炎的组合物和方法
ES2664619T3 (es) 2011-04-21 2018-04-20 Bristol-Myers Squibb Company Polipéptidos de anticuerpos que antagonizan CD40
AU2012249454B2 (en) * 2011-04-29 2016-03-24 Apexigen, Inc. Anti-CD40 antibodies and methods of use
CN107903325B (zh) 2011-05-16 2021-10-29 埃泰美德(香港)有限公司 多特异性fab融合蛋白及其使用方法
GB201115280D0 (en) * 2011-09-05 2011-10-19 Alligator Bioscience Ab Antibodies, uses and methods
GB201116092D0 (en) 2011-09-16 2011-11-02 Bioceros B V Antibodies and uses thereof
PE20141151A1 (es) * 2011-09-22 2014-09-25 Amgen Inc Proteinas de union al antigeno cd27l
KR102096224B1 (ko) 2011-10-28 2020-04-03 테바 파마슈티컬즈 오스트레일리아 피티와이 엘티디 폴리펩티드 구축물 및 이의 용도
WO2013091661A2 (en) * 2011-12-23 2013-06-27 Aarhus Universitet Proteolytic resistant protein affinity tag
CA2862332C (en) 2012-01-31 2021-05-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-asic1 antibodies and uses thereof
AR090263A1 (es) 2012-03-08 2014-10-29 Hoffmann La Roche Terapia combinada de anticuerpos contra el csf-1r humano y las utilizaciones de la misma
EP2837387B1 (en) * 2012-03-08 2020-07-29 Japan Science and Technology Agency Anticancer agent
US20140004131A1 (en) 2012-05-04 2014-01-02 Novartis Ag Antibody formulation
SG10201603896RA (en) 2012-05-04 2016-07-28 Pfizer Prostate-associated antigens and vaccine-based immunotherapy regimens
WO2013192215A1 (en) 2012-06-18 2013-12-27 Yale University Compositions and methods for diminishing an immune response
EP2914627B1 (en) * 2012-10-30 2021-04-07 Apexigen, Inc. Anti-cd40 antibodies and methods of use
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
PT2951208T (pt) * 2013-02-01 2019-12-30 Univ California Anticorpos anti-cd83 e sua utilização
WO2014144817A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Amgen Inc. Inhibitory polypeptides specific to wnt inhibitors
SI2976361T1 (sl) 2013-03-18 2018-11-30 Biocerox Products B.V. Humanizirana ANTI-CD134 (OX40) protitelesa in njih uporaba
US11117975B2 (en) 2013-04-29 2021-09-14 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-CD38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2B
MX370377B (es) 2013-04-29 2019-12-11 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anticuerpos anti-cd38 y fusiones con interferón alfa-2b atenuado.
JP6450750B2 (ja) 2013-06-17 2019-01-09 コーニンクレッカ フィリップス エヌ ヴェＫｏｎｉｎｋｌｉｊｋｅ Ｐｈｉｌｉｐｓ Ｎ．Ｖ． 磁気共鳴画像化被験者支持器
GB201311487D0 (en) * 2013-06-27 2013-08-14 Alligator Bioscience Ab Bispecific molecules
KR102364523B1 (ko) 2013-08-08 2022-02-18 싸이튠 파마 Ｉｌ―１５ 및 ｉｌ―１５ｒ 알파 스시 도메인 기반 모듈로카인
AU2014318017B2 (en) 2013-09-05 2020-02-06 Amgen Inc. Fc-containing molecules exhibiting predictable, consistent, and reproducible glycoform profiles
AR097584A1 (es) 2013-09-12 2016-03-23 Hoffmann La Roche Terapia de combinación de anticuerpos contra el csf-1r humano y anticuerpos contra el pd-l1 humano
DK3021859T3 (en) 2013-10-25 2018-03-05 Psioxus Therapeutics Ltd ONCOLYTIC ADENOVIRA EQUIPPED WITH HETEROLOGICAL GENES
GB201322583D0 (en) * 2013-12-19 2014-02-05 Alligator Bioscience Ab Antibodies
PE20160753A1 (es) * 2013-12-20 2016-08-01 Hoffmann La Roche Terapia combinada con un anticuerpo anti-ang2 y un agonista de cd40
EP3094652B1 (en) 2014-01-13 2021-09-29 Baylor Research Institute Novel vaccines against hpv and hpv-related diseases
WO2015134988A1 (en) 2014-03-07 2015-09-11 Bristol-Myers Squibb Company Method of using antibody polypeptides that antagonize cd40 to treat ibd
RU2016142476A (ru) 2014-03-31 2018-05-07 Дженентек, Инк. Комбинированная терапия, включающая антиангиогенезные агенты и агонисты, связывающие ох40
NZ725701A (en) * 2014-04-30 2023-09-29 Max Delbrueck Centrum Fuer Molekulare Medizin Helmholtz Gemeinschaft Humanized antibodies against cd269 (bcma)
UA119352C2 (uk) 2014-05-01 2019-06-10 Тева Фармасьютикалз Острейліа Пті Лтд Комбінація леналідоміду або помалідоміду і конструкції анти-cd38 антитіло-атенуйований інтерферон альфа-2b та спосіб лікування суб'єкта, який має cd38-експресуючу пухлину
EP3467501B1 (en) 2014-05-16 2020-11-04 Amgen Inc. Assay for detecting th1 and th2 cell populations
GB201413665D0 (en) 2014-07-03 2014-09-17 Transimmune Ag And Yale University Method for obtaining globally activated monocytes
SG11201701070WA (en) 2014-08-12 2017-03-30 Alligator Bioscience Ab Combination therapies with anti cd40 antibodies
EP3070102A1 (en) 2015-03-18 2016-09-21 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of antibodies human cd40 activating antibodies and anti human pld-1 antibodies
KR20170035945A (ko) * 2014-08-14 2017-03-31 에프. 호프만-라 로슈 아게 인간 cd40을 활성화시키는 항체 및 인간 pd-l1에 대한 항체의 병용 요법
MX2017003247A (es) 2014-09-15 2017-11-30 Amgen Inc Proteina de union a antigenos, bi-especificos del receptor anti-cgrp/receptor pac1 y usos de las mismas.
US10870704B2 (en) 2014-10-23 2020-12-22 Kira Biotech Pty Limited CD83 binding proteins and uses thereof
US9815886B2 (en) 2014-10-28 2017-11-14 Adma Biologics, Inc. Compositions and methods for the treatment of immunodeficiency
EP3212230B1 (en) 2014-10-29 2021-01-20 Seagen Inc. Dosage and administration of non-fucosylated anti-cd40 antibodies
JP6730271B2 (ja) 2014-10-29 2020-07-29 テバ・ファーマシューティカルズ・オーストラリア・ピーティワイ・リミテッド インターフェロンα２Ｂバリアント
TWI595006B (zh) 2014-12-09 2017-08-11 禮納特神經系統科學公司 抗ｐｄ－１抗體類和使用彼等之方法
BR112017020952A2 (pt) 2015-04-13 2018-07-10 Five Prime Therapeutics Inc método de tratamento de câncer, composição e uso da composição
JOP20200116A1 (ar) 2015-04-24 2017-06-16 Amgen Inc طرق لعلاج أو الوقاية من الصداع النصفي
MX2017013684A (es) 2015-04-30 2018-08-28 Psioxus Therapeutics Ltd Adenovirus oncolitico que codifica una proteina b7.
CA2985718A1 (en) 2015-06-24 2016-12-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-transferrin receptor antibodies with tailored affinity
UY36757A (es) * 2015-06-29 2016-12-30 Bristol Myers Squibb Company Una Corporación Del Estado De Delaware Anticuerpos monoclonales murinos contra cd40 con actividad agonista mejorada
BR112017027549A2 (pt) * 2015-06-29 2018-09-11 Bristol-Myers Squibb Company anticorpo para cd40
US10682390B2 (en) 2015-07-16 2020-06-16 Biokine Therapeutics Ltd. Compositions and methods for treating cancer
JP6976931B2 (ja) * 2015-09-04 2021-12-08 プリマトープ・セラピューティクス・インコーポレイテッド ヒト化抗ｃｄ４０抗体及びその使用
CN108368510B (zh) * 2015-09-30 2023-09-01 詹森生物科技公司 特异性结合人cd40的激动性抗体和使用方法
AR106189A1 (es) 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO
JP6657392B2 (ja) 2015-10-02 2020-03-04 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 二重特異性抗ヒトｃｄ２０／ヒトトランスフェリン受容体抗体及び使用方法
GB2543550A (en) 2015-10-21 2017-04-26 Hox Therapeutics Ltd Peptides
WO2017079112A1 (en) 2015-11-03 2017-05-11 Janssen Biotech, Inc. Antibodies specifically binding pd-1 and their uses
JP2018538271A (ja) * 2015-11-16 2018-12-27 ユビプロテイン， コーポレーションＵｂｉｐｒｏｔｅｉｎ， Ｃｏｒｐ． タンパク質の半減期延長方法
EP3386536A4 (en) * 2015-12-07 2019-07-31 Opi Vi- IP Holdco LLC COMPOSITION OF ANTIBODY CONSTRUCT AGONIST CONJUGATES AND METHOD FOR USE THEREOF
JP7064437B2 (ja) 2015-12-17 2022-05-10 サイオクサス セラピューティクス リミテッド 抗ｔｃｒ複合体抗体又は断片をコードするｂ群アデノウイルス
SG11201807677YA (en) 2016-03-04 2018-10-30 Univ Rockefeller Antibodies to cd40 with enhanced agonist activity
EP3426271A4 (en) 2016-03-10 2019-10-16 Cold Genesys, Inc. METHODS OF TREATING SOLID OR LYMPHATIC TUMORS BY POLYTHERAPY
CA3017776A1 (en) 2016-03-15 2017-09-21 Generon (Shanghai) Corporation Ltd. Multispecific fab fusion proteins and use thereof
WO2017165681A1 (en) 2016-03-24 2017-09-28 Gensun Biopharma Inc. Trispecific inhibitors for cancer treatment
EA201892040A1 (ru) 2016-03-25 2019-04-30 Сиэтл Дженетикс, Инк. Способ получения пегилированных соединений лекарственный препарат - линкер и их промежуточных соединений
SG11201810591VA (en) 2016-05-27 2018-12-28 Abbvie Biotherapeutics Inc Bispecific binding proteins binding an immunomodulatory protein and a tumor antigen
RS62726B1 (sr) 2016-05-27 2022-01-31 Abbvie Biotherapeutics Inc Anti-cd40 antitela i njihove upotrebe
JP2019528082A (ja) * 2016-06-08 2019-10-10 シャンハイ ジャオ トン ユニバーシティ スクール オブ メディシン アゴニスト抗体の活性を増強する抗体重鎖定常領域配列
HUE064454T2 (hu) 2016-06-08 2024-03-28 Xencor Inc IgG4-gyel kapcsolatos betegségek kezelése CD32B-vel keresztkötõ, CD-19 elleni ellenanyagokkal
CN109475602B (zh) 2016-06-20 2023-05-16 科马布有限公司 抗pd-l1和il-2细胞因子
CN117247458A (zh) 2016-07-14 2023-12-19 健玛保 针对cd40和cd137的多特异性抗体
JP7241677B2 (ja) 2016-07-19 2023-03-17 テバ・ファーマシューティカルズ・オーストラリア・ピーティワイ・リミテッド 抗ｃｄ４７併用療法
MA45919A (fr) 2016-08-12 2019-06-19 Janssen Biotech Inc Conception d'anticorps modifiés et d'autres molécules contenant un domaine fc présentant des fonctions d'agonisme et d'effecteur améliorées
CA3033665A1 (en) 2016-08-12 2018-02-15 Janssen Biotech, Inc. Fc engineered anti-tnfr superfamily member antibodies having enhanced agonistic activity and methods of using them
WO2018036852A1 (en) 2016-08-25 2018-03-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Intermittent dosing of an anti-csf-1r antibody in combination with macrophage activating agent
GB201713765D0 (en) 2017-08-28 2017-10-11 Psioxus Therapeutics Ltd Modified adenovirus
WO2018041827A1 (en) 2016-08-29 2018-03-08 Psioxus Therapeutics Limited Adenovirus armed with bispecific t cell engager (bite)
CN110546164B (zh) 2016-11-11 2023-10-20 锦湖Ht株式会社 特异性结合cd40的抗体及其用途
MX2019007144A (es) 2016-12-19 2019-10-07 Glenmark Pharmaceuticals Sa Nuevos agonistas de tnfr y sus usos.
WO2018115051A1 (en) 2016-12-22 2018-06-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Treatment of tumors with an anti-csf-1r antibody in combination with an anti-pd-l1 antibody after failure of anti-pd-l1/pd1 treatment
US10537637B2 (en) 2017-01-05 2020-01-21 Gensun Biopharma Inc. Checkpoint regulator antagonists
CA3049842A1 (en) * 2017-02-02 2018-08-09 Silverback Therapeutics, Inc. Construct-peptide compositions and methods of use thereof
US20200181277A1 (en) 2017-02-10 2020-06-11 Genmab B.V. Polypeptide variants and uses thereof
SG11201908328XA (en) 2017-03-14 2019-10-30 Amgen Inc Control of total afucosylated glycoforms of antibodies produced in cell culture
US10259865B2 (en) 2017-03-15 2019-04-16 Adma Biologics, Inc. Anti-pneumococcal hyperimmune globulin for the treatment and prevention of pneumococcal infection
IL269398B2 (en) 2017-03-24 2024-05-01 Seagen Inc A process for the preparation of glucuronide-drug binders and their intermediates
CN110382541A (zh) * 2017-03-29 2019-10-25 葛莱高托普有限公司 人源化抗cd40抗体
JP6990355B2 (ja) 2017-03-30 2022-01-12 日油株式会社 ヘテロ二官能性単分散ポリエチレングリコール及びそれを用いた複合体
JP7022328B2 (ja) 2017-03-30 2022-02-18 日油株式会社 自壊性アセタールリンカーを有する親水性ポリマー誘導体及びそれを用いた複合体
TWI704158B (zh) * 2017-04-04 2020-09-11 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 能夠特異性結合至cd40及fap之新穎雙特異性抗原結合分子
CN110505883A (zh) 2017-04-13 2019-11-26 豪夫迈·罗氏有限公司 供治疗癌症的方法中使用的白介素-2免疫缀合物,cd40激动剂,和任选地pd-1轴结合拮抗剂
US11525005B2 (en) 2017-06-01 2022-12-13 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Anti-CD40 antibody, antigen binding fragment thereof and medical use thereof
JP7394628B2 (ja) 2017-06-01 2023-12-08 アカミス バイオ リミテッド 腫瘍溶解性ウイルスおよび方法
EP3630827A1 (en) * 2017-06-02 2020-04-08 H. Hoffnabb-La Roche Ag Administration routes for immune agonists
EP3418302A1 (en) 2017-06-19 2018-12-26 F. Hoffmann-La Roche AG Administration routes for immune agonists
CU20200002A7 (es) 2017-07-14 2020-11-30 Pfizer Anticuerpos contra madcam
WO2019036855A1 (en) 2017-08-21 2019-02-28 Adagene Inc. ANTI-CD137 MOLECULES AND THEIR USE
WO2019057792A1 (en) * 2017-09-19 2019-03-28 Mab Discovery Gmbh CD40 ANTIBODY AGONISTS
US10610585B2 (en) 2017-09-26 2020-04-07 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Methods and compositions for treating and preventing HIV
CA3081854A1 (en) 2017-11-08 2019-05-16 Kyowa Kirin Co., Ltd. Bispecific antibody which binds to cd40 and epcam
US11306149B2 (en) 2017-12-27 2022-04-19 Bristol-Myers Squibb Company Anti-CD40 antibodies and uses thereof
CN109971723B (zh) * 2017-12-28 2023-07-07 上海细胞治疗研究院 包含CD40抗体与muc1特异性嵌合抗原受体基因的T细胞及其用途
CN109971717B (zh) * 2017-12-28 2023-06-20 上海细胞治疗研究院 共表达cd40抗体与间皮素特异性嵌合抗原受体的t细胞及其用途
GB201801614D0 (en) 2018-01-31 2018-03-14 Psioxus Therapeutics Ltd Formulation
WO2019148445A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Precision/context-dependent activatable antibodies, and methods of making and using the same
WO2019148444A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Anti-ctla4 antibodies and methods of making and using the same
WO2019176875A1 (ja) 2018-03-13 2019-09-19 日油株式会社 主鎖および側鎖に単分散ポリエチレングリコールを有するヘテロ二官能性化合物
EA202092286A1 (ru) 2018-03-26 2021-03-18 Эмджен Инк. Общие афукозилированные гликоформы антител, полученные в культуре клеток
EP3774881A1 (en) 2018-04-02 2021-02-17 Amgen Inc. Erenumab compositions and uses thereof
US11976123B2 (en) 2018-04-20 2024-05-07 Lyvgen Biopharma Holdings Limited Anti-CD40 antibodies and uses thereof
US20200017596A1 (en) * 2018-05-10 2020-01-16 Abvision, Inc. Monoclonal antibodies activating cd40 and uses thereof
WO2019232533A1 (en) * 2018-06-01 2019-12-05 Massachusetts Institute Of Technology Combination treatments of hsp90 inhibitors for enhancing tumor immunogenicity and methods of use thereof
AU2019287765A1 (en) 2018-06-15 2021-01-07 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Increasing immune activity through modulation of postcellular signaling factors
CN113056285A (zh) 2018-06-29 2021-06-29 璟尚生物制药公司 抗肿瘤免疫检查点调节剂拮抗剂
EP3841121A2 (en) 2018-08-20 2021-06-30 Pfizer Inc. Anti-gdf15 antibodies, compositions and methods of use
WO2020070288A1 (en) 2018-10-05 2020-04-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and systems for controlling the agonistic properties of antibody variable domains by light
TW202021620A (zh) 2018-11-30 2020-06-16 大陸商江蘇恒瑞醫藥股份有限公司 一種cd40抗體藥物組合物及其用途
CA3120793A1 (en) 2018-11-30 2020-06-04 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Anti-cd40 antibody, antigen binding fragment and pharmaceutical use thereof
US20220089758A1 (en) * 2019-01-22 2022-03-24 Revmab Biosciences Usa, Inc. Novel anti-cd40 antibodies
US10570210B1 (en) 2019-03-04 2020-02-25 Beijing Mabworks Biotech Co.Ltd Antibodies binding CD40 and uses thereof
CN113811547B (zh) 2019-03-27 2024-06-25 国家医疗保健研究所 具有cd40激活特性的重组蛋白
EP3954705A4 (en) 2019-04-10 2023-06-07 Nankai University ANTI-CD40 ANTIBODIES AND ITS USE
MA55805A (fr) 2019-05-03 2022-03-09 Flagship Pioneering Innovations V Inc Métodes de modulation de l'activité immunitaire
TW202108625A (zh) 2019-05-15 2021-03-01 日商協和麒麟股份有限公司 與cd40及gpc3結合之雙專一性抗體
CA3140385A1 (en) 2019-05-15 2020-11-19 Kyowa Kirin Co., Ltd. Bispecific antibody binding to cd40 and fap
CN114340735A (zh) 2019-06-28 2022-04-12 璟尚生物制药公司 突变的TGFβ1-RII胞外域和免疫球蛋白支架组成的抗肿瘤拮抗剂
WO2021048135A1 (en) 2019-09-09 2021-03-18 Basilea Pharmaceutica International AG Pharmaceutical combinations comprising a furazanobenzimidazoles and a cd40 agonist for use in the treatment of neoplastic diseases
BR112022005583A2 (pt) 2019-09-26 2022-09-20 Amgen Inc Métodos para a produção de composições de anticorpos
JPWO2021060439A1 (pl) 2019-09-26 2021-04-01
US20230242655A1 (en) * 2019-12-03 2023-08-03 Evotec International Gmbh Interferon-associated antigen binding proteins and uses thereof
WO2021127217A1 (en) 2019-12-17 2021-06-24 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Combination anti-cancer therapies with inducers of iron-dependent cellular disassembly
CN115175936A (zh) 2019-12-20 2022-10-11 安进公司 用于治疗实体瘤的靶向间皮素的cd40激动性多特异性抗体构建体
AR121013A1 (es) * 2020-01-10 2022-04-06 Symphogen As Anticuerpos anti-cd40 y composiciones
IL272194A (en) 2020-01-22 2021-07-29 Yeda Res & Dev Multi-target antibodies for use in the treatment of diseases
CN115702002A (zh) 2020-04-23 2023-02-14 朝途生物疗法株式会社 改良肽疫苗
WO2021229076A1 (en) 2020-05-14 2021-11-18 Molecular Partners Ag Recombinant cd40 binding proteins and their use
IL298168A (en) 2020-05-14 2023-01-01 Molecular Partners Ag Multispecific proteins
US20230212231A1 (en) 2020-05-26 2023-07-06 Institut National De La Santé Et De La Recherche Médicale (Inserm) Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (sars-cov-2) polypeptides and uses thereof for vaccine purposes
GB202008003D0 (en) 2020-05-28 2020-07-15 Quine Medical Ab Anti-CD40 antibody
US20230273126A1 (en) 2020-06-04 2023-08-31 Amgen Inc. Assessment of cleaning procedures of a biotherapeutic manufacturing process
US20230355804A1 (en) 2020-06-29 2023-11-09 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Viruses engineered to promote thanotransmission and their use in treating cancer
KR20230048112A (ko) * 2020-08-21 2023-04-10 우시 바이올로직스 (상하이) 컴퍼니 리미티드 Cd40 효능성 항체 및 이의 사용 방법
MX2023004364A (es) 2020-10-15 2023-05-03 Amgen Inc Glucanos no emparejados relativos en metodos de produccion de anticuerpos.
JP2023554587A (ja) 2020-11-12 2023-12-28 アンセルム（アンスティチュート・ナシオナル・ドゥ・ラ・サンテ・エ・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・メディカル） Ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２ スパイクタンパク質の受容体結合ドメインにコンジュゲートまたは融合している抗体およびワクチン目的でのそれらの使用
KR20230124672A (ko) 2020-12-23 2023-08-25 인쎄름 (엥스띠뛰 나씨오날 드 라 쌍떼 에 드 라 흐쉐르슈 메디깔) 항원 제시 세포에 대한 momp vs4 항원의 표적화에 기반한클라미디아 백신
TW202241479A (zh) 2020-12-30 2022-11-01 美商安迅生物製藥公司 遞送外來抗原之溶瘤病毒及表現靶向外來抗原之嵌合受體之經工程化免疫細胞之組合療法
TW202241964A (zh) * 2021-01-08 2022-11-01 美商必治妥美雅史谷比公司 因子xia抑制劑之抗體及抗原結合肽及其用途
US20240173442A1 (en) 2021-01-13 2024-05-30 Hoffmann-La Roche Inc. Combination therapy
JP2024506557A (ja) 2021-01-29 2024-02-14 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 修飾された腫瘍浸潤リンパ球を作製する方法及び養子細胞療法におけるそれらの使用
JP2024504195A (ja) 2021-01-29 2024-01-30 アンセルム（アンスティチュート・ナシオナル・ドゥ・ラ・サンテ・エ・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・メディカル） クラミジア・トラコマチス抗原性ポリペプチドおよびワクチン目的のためのその使用
JP2024509915A (ja) 2021-03-09 2024-03-05 ジェンマブ エー／エス 治療におけるｃｄ４０およびｃｄ１３７に対する多重特異性結合物質
AU2022246895A1 (en) 2021-03-31 2023-10-19 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Thanotransmission polypeptides and their use in treating cancer
WO2022261021A1 (en) 2021-06-07 2022-12-15 Amgen Inc. Using fucosidase to control afucosylation level of glycosylated proteins
BR112023026111A2 (pt) * 2021-06-28 2024-03-05 Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co Ltd Anticorpo anti-cd40, fragmento de ligação ao antígeno e uso médico do mesmo
EP4363059A1 (en) 2021-06-29 2024-05-08 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Immune cells engineered to promote thanotransmission and uses thereof
JP2024525758A (ja) 2021-07-13 2024-07-12 ビオンテック・ソシエタス・エウロパエア がんのための併用療法におけるｃｄ４０およびｃｄ１３７に対する多重特異性結合剤
EP4402174A1 (en) * 2021-09-17 2024-07-24 Novartis AG Methods for prevention of graft rejection in xenotransplantation
CN118139886A (zh) * 2021-10-01 2024-06-04 Mab发现股份有限公司 作为免疫刺激剂的激动性cd40抗体
CA3233279A1 (en) 2021-10-05 2023-04-13 Amgen Inc. Fc-gamma receptor ii binding and glycan content
MX2024006003A (es) 2021-11-17 2024-08-06 Inst Nat Sante Rech Med Vacunas universales contra el sarbecovirus.
WO2023147488A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 Iovance Biotherapeutics, Inc. Cytokine associated tumor infiltrating lymphocytes compositions and methods
WO2023172890A2 (en) * 2022-03-07 2023-09-14 Agenus Inc. Anti-ilt2 antibodies and uses thereof
WO2023193239A1 (en) 2022-04-08 2023-10-12 Peter Peizhi Luo Anti-cd28 antibodies and methods of use thereof
WO2023198851A1 (en) 2022-04-14 2023-10-19 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for controlling the tumor cell killing by light
WO2023215725A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
WO2024054992A1 (en) 2022-09-09 2024-03-14 Bristol-Myers Squibb Company Methods of separating chelator
WO2024059899A1 (en) * 2022-09-20 2024-03-28 Currus Biologics Pty Ltd Bispecific polypeptides and uses thereof
WO2024076969A1 (en) * 2022-10-04 2024-04-11 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Anti-cd40 antibodies and uses thereof
WO2024077191A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Nucleic acid molecules encoding trif and additionalpolypeptides and their use in treating cancer
WO2024074571A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Dc-targeting vaccine against nipah virus infection
WO2024118836A1 (en) 2022-11-30 2024-06-06 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes with shortened rep step
WO2024115725A1 (en) 2022-12-01 2024-06-06 BioNTech SE Multispecific antibody against cd40 and cd137 in combination therapy with anti-pd1 ab and chemotherapy
CN115969997B (zh) * 2022-12-19 2024-02-13 华润生物医药有限公司 一种靶向cldn18.2的抗体药物偶联物及其应用
CN116375870B (zh) * 2022-12-30 2023-09-15 优睿赛思(武汉)生物科技有限公司 抗人cd40蛋白的人源化抗体、制备方法及其应用
WO2024151687A1 (en) 2023-01-09 2024-07-18 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Genetic switches and their use in treating cancer
WO2024213635A1 (en) * 2023-04-12 2024-10-17 Evotec International Gmbh Interferon-associated antigen binding proteins for use for the treatment or prevention of hepatitis delta virus infection
WO2024220916A1 (en) 2023-04-20 2024-10-24 Amgen Inc. Methods of determining relative unpaired glycan content

Family Cites Families (138)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US59427A (en) * 1866-11-06 Improvement in fences
US142358A (en) * 1873-09-02 Improvement in the purification of illuminating-gas
US439216A (en) * 1890-10-28 Maker
US4399216A (en) * 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) * 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) * 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US5168062A (en) * 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
JP2532858B2 (ja) 1985-04-01 1996-09-11 セルテツク リミテツド 形質転換したミエロ―マ細胞系
US4735210A (en) 1985-07-05 1988-04-05 Immunomedics, Inc. Lymphographic and organ imaging method and kit
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4959455A (en) * 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
US5750172A (en) * 1987-06-23 1998-05-12 Pharming B.V. Transgenic non human mammal milk
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) * 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
GB8827305D0 (en) 1988-11-23 1988-12-29 British Bio Technology Compounds
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US5633076A (en) * 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
US6713610B1 (en) * 1990-01-12 2004-03-30 Raju Kucherlapati Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) * 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
WO1991010741A1 (en) 1990-01-12 1991-07-25 Cell Genesys, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6075181A (en) * 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6673986B1 (en) * 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5151510A (en) * 1990-04-20 1992-09-29 Applied Biosystems, Inc. Method of synethesizing sulfurized oligonucleotide analogs
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
AU665190B2 (en) 1990-07-10 1995-12-21 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
CA2089661C (en) * 1990-08-29 2007-04-03 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) * 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) * 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5612205A (en) 1990-08-29 1997-03-18 Genpharm International, Incorporated Homologous recombination in mammalian cells
US5789650A (en) * 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5814318A (en) * 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) * 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
DE69129154T2 (de) 1990-12-03 1998-08-20 Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
ATE439435T1 (de) 1991-03-01 2009-08-15 Dyax Corp Chimäres protein mit mikroprotein mit zwei oder mehr disulfidbindungen und ausgestaltungen davon
US5416367A (en) * 1991-03-06 1995-05-16 Quicklogic Corporation Programmable application specific integrated circuit and logic cell therefor
DE69233367T2 (de) 1991-04-10 2005-05-25 The Scripps Research Institute, La Jolla Bibliotheken heterodimerer rezeptoren mittels phagemiden
US6407213B1 (en) 1991-06-14 2002-06-18 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
AU2515992A (en) * 1991-08-20 1993-03-16 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
ATE181571T1 (de) 1991-09-23 1999-07-15 Medical Res Council Methoden zur herstellung humanisierter antikörper
US5587458A (en) * 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
JPH05242071A (ja) * 1991-11-20 1993-09-21 Mitsubishi Electric Corp 対象システムを制御または決定・推定する方法、およびその装置
DE69334351D1 (de) 1992-02-06 2011-05-12 Novartis Vaccines & Diagnostic Biosynthetisches Bindeprotein für Tumormarker
US5874082A (en) * 1992-07-09 1999-02-23 Chiron Corporation Humanized anti-CD40 monoclonal antibodies and fragments capable of blocking B cell proliferation
US5397703A (en) * 1992-07-09 1995-03-14 Cetus Oncology Corporation Method for generation of antibodies to cell surface molecules
ES2301158T3 (es) 1992-07-24 2008-06-16 Amgen Fremont Inc. Produccion de anticuerpos xenogenicos.
US6177401B1 (en) 1992-11-13 2001-01-23 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften Use of organic compounds for the inhibition of Flk-1 mediated vasculogenesis and angiogenesis
US5455258A (en) 1993-01-06 1995-10-03 Ciba-Geigy Corporation Arylsulfonamido-substituted hydroxamic acids
AU693436B2 (en) 1993-03-09 1998-07-02 Genzyme Corporation Isolation of components of interest from milk
KR960704576A (ko) 1993-10-01 1996-10-09 크리스토퍼 엘. 와이트 CD40에 대한 항체(Antibodies to CD40)
US5827690A (en) * 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
WO1995017202A1 (en) * 1993-12-23 1995-06-29 Immunex Corporation Method of preventing or treating disease characterized by neoplastic cells expressing cd40
US5612126A (en) * 1994-01-19 1997-03-18 Burlington Industries, Inc. Stiff fabric and method of forming the stiff fabric
IL112248A0 (en) 1994-01-25 1995-03-30 Warner Lambert Co Tricyclic heteroaromatic compounds and pharmaceutical compositions containing them
JPH0812700A (ja) 1994-07-01 1996-01-16 Sumitomo Electric Ind Ltd マウスｃｄ４０に対するモノクローナル抗体
US5643763A (en) 1994-11-04 1997-07-01 Genpharm International, Inc. Method for making recombinant yeast artificial chromosomes by minimizing diploid doubling during mating
GB9425060D0 (en) * 1994-12-13 1995-02-08 Univ Birmingham Carcinoma treatment
US6046037A (en) 1994-12-30 2000-04-04 Hiatt; Andrew C. Method for producing immunoglobulins containing protection proteins in plants and their use
US5863949A (en) 1995-03-08 1999-01-26 Pfizer Inc Arylsulfonylamino hydroxamic acid derivatives
US6091001A (en) 1995-03-29 2000-07-18 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US6130364A (en) * 1995-03-29 2000-10-10 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
JPH11503360A (ja) * 1995-04-11 1999-03-26 ローベルト ボツシユ ゲゼルシヤフト ミツト ベシユレンクテル ハフツング 燃焼排ガス中の有害物質、特に窒素酸化物を減少させる方法および装置
WO1996033172A1 (en) * 1995-04-20 1996-10-24 Pfizer Inc. Arylsulfonyl hydroxamic acid derivatives as mmp and tnf inhibitors
AU705616B2 (en) 1995-04-21 1999-05-27 Cell Genesys, Inc. Generation of large genomic DNA deletions
CA2761116A1 (en) 1995-04-27 1996-10-31 Amgen Fremont Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5747498A (en) 1996-05-28 1998-05-05 Pfizer Inc. Alkynyl and azido-substituted 4-anilinoquinazolines
US5880141A (en) 1995-06-07 1999-03-09 Sugen, Inc. Benzylidene-Z-indoline compounds for the treatment of disease
US5780215A (en) * 1995-07-26 1998-07-14 Konica Corporation Silver halide color photographic light-sensitive material
GB9520822D0 (en) 1995-10-11 1995-12-13 Wellcome Found Therapeutically active compounds
US6440418B1 (en) 1995-11-07 2002-08-27 Idec Pharmaceuticals Corporation Methods of treating autoimmune diseases with gp39-specific antibodies
GB9624482D0 (en) 1995-12-18 1997-01-15 Zeneca Phaema S A Chemical compounds
ATE225343T1 (de) 1995-12-20 2002-10-15 Hoffmann La Roche Matrix-metalloprotease inhibitoren
DK0885198T3 (da) 1996-03-05 2002-03-25 Astrazeneca Ab 4-Anilinoquinazolinderivater
US5714352A (en) * 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
US5994619A (en) * 1996-04-01 1999-11-30 University Of Massachusetts, A Public Institution Of Higher Education Of The Commonwealth Of Massachusetts, As Represented By Its Amherst Campus Production of chimeric bovine or porcine animals using cultured inner cell mass cells
EP0818442A3 (en) 1996-07-12 1998-12-30 Pfizer Inc. Cyclic sulphone derivatives as inhibitors of metalloproteinases and of the production of tumour necrosis factor
HRP970371A2 (en) 1996-07-13 1998-08-31 Kathryn Jane Smith Heterocyclic compounds
DE69718472T2 (de) 1996-07-13 2003-11-06 Glaxo Group Ltd., Greenford Bicyclische heteroaromatische verbindungen als protein tyrosine kinase inhibitoren
AR007857A1 (es) 1996-07-13 1999-11-24 Glaxo Group Ltd Compuestos heterociclicos fusionados como inhibidores de proteina tirosina quinasa, sus metodos de preparacion, intermediarios uso en medicina ycomposiciones farmaceuticas que los contienen.
KR20000067904A (ko) 1996-07-18 2000-11-25 디. 제이. 우드, 스피겔 알렌 제이 매트릭스 메탈로프로테아제의 포스피네이트계 억제제
JP2000501423A (ja) 1996-08-23 2000-02-08 ファイザー インク． アリールスルホニルアミノヒドロキサム酸誘導体
US5817690A (en) * 1996-08-27 1998-10-06 American Home Products Corporation 4-aminoethoxy indolone derivatives
ID18494A (id) 1996-10-02 1998-04-16 Novartis Ag Turunan pirazola leburan dan proses pembuatannya
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
PT1500329E (pt) 1996-12-03 2012-06-18 Amgen Fremont Inc Anticorpos humanos que se ligam especificamente ao tnf alfa humano
CA2277100C (en) 1997-01-06 2005-11-22 Pfizer Inc. Cyclic sulfone derivatives
JP3765584B2 (ja) 1997-02-03 2006-04-12 ファイザー・プロダクツ・インク アリールスルホニルアミノヒドロキサム酸誘導体
AU5493598A (en) 1997-02-07 1998-08-26 Pfizer Inc. N-hydroxy-beta-sulfonyl-propionamide derivatives and their use as inhibitors of matrix metalloproteinases
ID22809A (id) 1997-02-11 1999-12-09 Pfizer Turunan-turunan asam arilsulfonil hidroksamat
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
ATE292623T1 (de) 1997-05-07 2005-04-15 Sugen Inc 2-indolinonderivate als modulatoren der proteinkinase-ativität
EP1724282B1 (en) 1997-05-21 2013-05-15 Merck Patent GmbH Method for the production of non-immunogenic proteins
CA2291709A1 (en) 1997-05-30 1998-12-03 Merck & Co., Inc. Novel angiogenesis inhibitors
EP1005470B1 (en) 1997-08-22 2007-08-01 AstraZeneca AB Oxindolylquinazoline derivatives as angiogenesis inhibitors
CA2303830A1 (en) 1997-09-26 1999-04-08 Merck & Co., Inc. Novel angiogenesis inhibitors
UA72881C2 (uk) 1997-11-11 2005-05-16 Пфайзер Продактс Інк. Похідні тієнопіридину, фармацевтична композиція з використанням таких сполук (варіанти), проміжна сполука
GB9725782D0 (en) 1997-12-05 1998-02-04 Pfizer Ltd Therapeutic agents
GB9800575D0 (en) 1998-01-12 1998-03-11 Glaxo Group Ltd Heterocyclic compounds
GB9800569D0 (en) 1998-01-12 1998-03-11 Glaxo Group Ltd Heterocyclic compounds
GB9801690D0 (en) 1998-01-27 1998-03-25 Pfizer Ltd Therapeutic agents
US6051228A (en) * 1998-02-19 2000-04-18 Bristol-Myers Squibb Co. Antibodies against human CD40
AU2978899A (en) 1998-03-03 1999-09-20 Abgenix, Inc. Cd147 binding molecules as therapeutics
JP4462654B2 (ja) 1998-03-26 2010-05-12 ソニー株式会社 映像素材選択装置及び映像素材選択方法
PA8469401A1 (es) 1998-04-10 2000-05-24 Pfizer Prod Inc Derivados biciclicos del acido hidroxamico
PA8469501A1 (es) 1998-04-10 2000-09-29 Pfizer Prod Inc Hidroxamidas del acido (4-arilsulfonilamino)-tetrahidropiran-4-carboxilico
US20020029391A1 (en) 1998-04-15 2002-03-07 Claude Geoffrey Davis Epitope-driven human antibody production and gene expression profiling
AU4009899A (en) * 1998-05-23 1999-12-13 Tanox, Inc. Molecules targeting cd40 and tumor cells
SK287132B6 (sk) 1998-05-29 2009-12-07 Sugen, Inc. Farmaceutická kompozícia obsahujúca pyrolom substituovaný 2-indolinón, súprava obsahujúca uvedenú kompozíciu a použitie pyrolom substituovaného 2-indolinónu
US20020142374A1 (en) 1998-08-17 2002-10-03 Michael Gallo Generation of modified molecules with increased serum half-lives
ES2213985T3 (es) 1998-11-05 2004-09-01 Pfizer Products Inc. Derivados de hidroxiamida de acido 5-oxo-pirrolidin-2-carboxilico.
CA2342967A1 (en) 1998-12-08 2000-06-15 Biovation Limited Modifying protein immunogenicity
ES2340745T3 (es) 1998-12-23 2010-06-08 Pfizer Inc. Anticuerpos monoclonales humanos contra ctla-4.
WO2000066155A1 (en) * 1999-04-30 2000-11-09 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Methods for preventing reactivation of latent virus and controlling virus replication
US20030118588A1 (en) * 1999-05-22 2003-06-26 Linda Diehl Induction of anti-tumor CTL immunity through in vivo triggering of 4-1BB and/or CD40
US6946129B1 (en) * 1999-06-08 2005-09-20 Seattle Genetics, Inc. Recombinant anti-CD40 antibody and uses thereof
WO2001016180A2 (en) * 1999-08-27 2001-03-08 Board Of Regents, The University Of Texas System Cd40 agonist compositions and methods of use
US6517529B1 (en) * 1999-11-24 2003-02-11 Radius International Limited Partnership Hemodialysis catheter
GB9927757D0 (en) * 1999-11-25 2000-01-26 Kennedy Rheumatology Inst Treatment of autoimmune diseases
MXPA02007473A (es) * 2000-02-01 2003-09-22 Tanox Inc Moleculas activadoras de celulas presentadoras de antigenos (apc) que se unen a cd40.
US7063845B2 (en) 2000-04-28 2006-06-20 Gemini Science, Inc. Human anti-CD40 antibodies
AU2001259215A1 (en) * 2000-04-28 2001-11-12 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Human anti-cd40 antibodies and methods of making and using same
US20030059427A1 (en) 2000-04-28 2003-03-27 Force Walker R. Isolation and characterization of highly active anti-CD40 antibody
HUP0302525A2 (hu) 2001-01-05 2003-10-28 Abgenix, Inc. Az inzulinszerű növekedési faktor I receptor elleni ellenanyagok
AR039067A1 (es) * 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
NL1027975C2 (nl) 2004-01-09 2005-12-23 Pfizer Antilichamen tegen MAdCAM.
US9665874B2 (en) 2012-03-13 2017-05-30 American Express Travel Related Services Company, Inc. Systems and methods for tailoring marketing
US10884952B2 (en) 2016-09-30 2021-01-05 Intel Corporation Enforcing memory operand types using protection keys

Also Published As

Publication number Publication date
TNSN04078A1 (fr) 2006-06-01
ES2432968T3 (es) 2013-12-05
EG25801A (en) 2012-08-08
PE20030846A1 (es) 2003-10-11
EP1476185A4 (en) 2007-04-04
GEP20074222B (en) 2007-10-25
CN103450360A (zh) 2013-12-18
CN103450360B (zh) 2016-11-02
PL370514A1 (pl) 2005-05-30
BRPI0214137B1 (pt) 2019-03-19
US7626012B2 (en) 2009-12-01
CY1115675T1 (el) 2017-01-25
CU23745A3 (es) 2012-01-31
TWI338579B (en) 2011-03-11
AU2002356926C1 (en) 2003-05-19
US20060093600A1 (en) 2006-05-04
HRP20040525A2 (en) 2005-04-30
JP2005508176A (ja) 2005-03-31
IS7253A (is) 2004-05-06
PL214634B1 (pl) 2013-08-30
CN1582165A (zh) 2005-02-16
JP2010213704A (ja) 2010-09-30
HUP0402247A3 (en) 2012-09-28
EA200400654A1 (ru) 2004-12-30
US20160152713A1 (en) 2016-06-02
WO2003040170A9 (en) 2004-06-10
DK1476185T3 (da) 2013-10-14
RS52484B (en) 2013-02-28
GT200200228A (es) 2008-09-26
BRPI0214137B8 (pt) 2021-05-25
EP2343086A2 (en) 2011-07-13
JP4616555B2 (ja) 2011-01-19
US8388971B2 (en) 2013-03-05
AR039067A1 (es) 2005-02-09
RS39204A (en) 2006-12-15
OA12725A (en) 2006-06-28
PT1476185E (pt) 2013-11-05
MA27139A1 (fr) 2005-01-03
DOP2002000507A (es) 2003-05-15
TWI331040B (en) 2010-10-01
AU2002356926A2 (en) 2003-05-19
NO334339B1 (no) 2014-02-10
TW200306204A (en) 2003-11-16
EP2343086A3 (en) 2012-02-22
US7563442B2 (en) 2009-07-21
CL2009001779A1 (es) 2010-02-05
SI1476185T1 (sl) 2013-12-31
KR20050063749A (ko) 2005-06-28
JP5547532B2 (ja) 2014-07-16
AU2002356926B2 (en) 2007-01-04
EA011449B1 (ru) 2009-02-27
NZ533180A (en) 2008-03-28
WO2003040170A2 (en) 2003-05-15
CR10878A (es) 2011-01-12
ME00503B (me) 2011-10-10
IL161823A0 (en) 2005-11-20
WO2003040170A3 (en) 2003-10-09
PA8557701A1 (es) 2003-12-19
UY27537A1 (es) 2003-02-28
US7338660B2 (en) 2008-03-04
EP1476185A2 (en) 2004-11-17
ECSP045093A (es) 2004-07-23
IL161823A (en) 2014-02-27
EP1476185B1 (en) 2013-07-31
PL392809A1 (pl) 2011-03-14
TW201034686A (en) 2010-10-01
IS2940B (is) 2016-03-15
US20120225014A1 (en) 2012-09-06
US7288251B2 (en) 2007-10-30
JP5848232B2 (ja) 2016-01-27
US7618633B2 (en) 2009-11-17
US20070190051A1 (en) 2007-08-16
NI200200128A (es) 2010-01-11
AP2004003034A0 (en) 2004-06-30
NO20042388L (no) 2004-08-09
JP2013099333A (ja) 2013-05-23
US20100098694A1 (en) 2010-04-22
KR100830086B1 (ko) 2008-05-20
CN1582165B (zh) 2013-05-29
ZA200404207B (en) 2005-08-31
CA2466128A1 (en) 2003-05-15
CR7343A (es) 2004-10-28
AP1918A (en) 2008-11-13
MY137641A (en) 2009-02-27
US20090169563A1 (en) 2009-07-02
CA2466128C (en) 2013-10-29
HRP20040525B1 (hr) 2017-06-02
BR0214137A (pt) 2004-09-14
HK1069122A1 (en) 2005-05-13
HUP0402247A2 (hu) 2005-01-28
US20090130715A1 (en) 2009-05-21
US20030211100A1 (en) 2003-11-13
US20130024956A1 (en) 2013-01-24
HN2002000318A (es) 2003-03-10
MXPA04004467A (es) 2005-05-16
HU229829B1 (en) 2014-09-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100830086B1 (ko) Ｃｄ４０에 대한 항체
AU2002356926A1 (en) Antibodies to CD40
KR20150061041A (ko) 인간 ｏｘ４０ 수용체에 대한 결합 분자
EP1660127A1 (en) Antibodies to c-met