ME00503B - Antitjela za cd40 - Google Patents

Antitjela za cd40

Info

Publication number
ME00503B
ME00503B MEP-2008-814A MEP81408A ME00503B ME 00503 B ME00503 B ME 00503B ME P81408 A MEP81408 A ME P81408A ME 00503 B ME00503 B ME 00503B
Authority
ME
Montenegro
Prior art keywords
amino acid
seq
acid sequence
antibody
sequence
Prior art date
Application number
MEP-2008-814A
Other languages
English (en)
Inventor
Ronald P Gladue
Jose Corvalan
Xiao-Chi Jia
Xiao Feng
Vahe Bedian
Original Assignee
Pfizer Prod Inc
Amgen Fremont Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=23370387&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ME00503(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Pfizer Prod Inc, Amgen Fremont Inc filed Critical Pfizer Prod Inc
Publication of ME00503B publication Critical patent/ME00503B/me

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
    • A61N5/00—Radiation therapy
    • A61N5/06—Radiation therapy using light
    • A61N5/0613—Apparatus adapted for a specific treatment
    • A61N5/062—Photodynamic therapy, i.e. excitation of an agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
    • A61N5/00—Radiation therapy
    • A61N5/10—X-ray therapy; Gamma-ray therapy; Particle-irradiation therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/117—Nucleic acids having immunomodulatory properties, e.g. containing CpG-motifs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Pronalazak se odnosi na antitela i njihove delove za vezivanje antigena, koji se specifično vezuju za CD40, poželjno humani CD40, i koji funkcionišu kao agonisti CD40. Pronalazak se takođe odnosi na humana antitela na CD40 i njihove delove koji vezuju antigen. Pronalazak se takođe odnosi na antitela koja su himema, bispecifična., derivirana., jednolančana antitela ili delove fuzionih proteina. Pronalazak se takođe odnosi na izolovane teške i lake lance imunoglobulina derivirane iz humanih antitela na CD40 i molekule nukleinskib kiselina koji kodiraju takve imunoglobuline. Pronalazak se takođe odnosi na postupke pravljenja humanih antitela na CD40, kompozicije koje sadrže ova antitela i postupke upotrebe antitela i kompozicija za dijagnozu i lečenje. Pronalazak takođe obezbeđuje postupke genske terapije koji koriste molekule nukleinskih kiselina koji kodiraju teške i/ili lake molekule imunoglobulina koji sadrže humana antitela na CD40. Pronalazak se takođe odnosi na transgene životinje koje sadrže molekule nukleinskih kiselina iz ovog pronalaska.

Description

ANTITELA NA CD40
Ova prijava traži prioritet Privremene prijave Sjedinjenih Država (United States Provisional Application) 60/348, 980, podnete 9. novembra, 2001.
Stanje tehnike
Antigen CD40 je glikoprotein sa površine ćelije od 50 kDa koji pripada porodici receptora za faktor nekroze tumora (TNF-R). (Stamenkovic et al., EMBO J. 8: 1403-10 (1989). ) CD40 je eksprimiran u mnogim tipovima normalnih i tumorskih ćelija, uključujući B limfocite, đenđritske ćelije, monocite, makrofage, timusni epitet, endotelne ćelije, fibroblaste i glatke ćelije mišića. (Paulie S. et al., Cancer Immunol. Immunother. 20: 23-8 (1985); Banchereau J. et al., Adv. Exp. Med. & Biol. 378: 79-83 (1995); Alderson M. R. et al., J. of Exp. Med. 178: 669-74 (1993); Ruggiero G. et al., J. of Immunol. 156: 3737-46 (1996); Hollenbaugh D. et al., J of Exp. Med. 182: 33-40 (1995); Yellin M. J, et al., J. of Leukocyte Biol 58: 209-16 (1995); i Lazaar A. L. et al., J of Immunol. 161: 3120-7 (1998). CD40 je eksprimiran u svim B-limfomima i u 70% svih čvrstih tumora. Mada je konstitutivno eksprimiran, u ćelijama koje prikazuju antigen CD40 ima pozitivnu regulaciju (upregulation) pomoću signala za sazrevanje, kao što su LPS, IL-lfl, IFN-γ i GM-CSF.
Aktivacija CD40 igra kritičnu ulogu u regulaciji humoralnih i ćelijskih imunskih odgovora. Prezentacija antigena bez aktivacije CD40 može da dovede do tolerancije, dok CD40 može da poništi tu toleranciju, da pojača prezentaciju antigena u svim ćelijama koje prikazuju antigen (APC - antigen presenting celi), da dovede do sekrecije pomoćničkih (helper) citokina i hemokina, da poveća ekspresiju ko-stimulišućih molekula i signaliziranje i da stimuliše citolitičku aktivnost imunskih ćelija.
CD40 igra kritičnu ulogu u proliferaciji, maturaciji i promeni klase B ćelija. (Foy T. M. et al., Ann. Rev. of Immunol. 14: 591-617 (1996). ) Prekid puteva signalizacije CD40 dovodi do abnormalne distribucije serumskih imunoglobulinskih izotipova, nedostatka aktivacije CD4+ T ćelija i defekata u sekundarnim humoralnim odgovorima. Na primer, X-vezani hiper-IgM sindrom je bolest vezana za mutaciju humanog gena CD40L i odlikuje se nemogućnošću pogođenih osoba da proizvode druga antitela osim onili izotipa IgM, što ukazuje na to daje za efektivan imunski odgovor potrebna produktivna interakcija između CD40 i CD40L.
Uključivanje CD40 pomoću CD40L dovodi do asocijacije citoplazmatskog domena CD40 sa TRAF (asociram faktori sa TNF-R). (Lee H. H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 1421-6 (1999); Pullen S. S. et al„ Biochemistry 37: 11836-45 (1998); Grammar A. C. et al., J. of Immunol. 161: 1183-93 (1998); Ishida T. K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9437-42 (1996); Pullen S. S. et al, J. of Biol. Chem. 274: 14246-54 (1999)). Interakcija sa TRAFs može da kulminira u aktivaciji putanja i NFkB i Jun/APl. (Tsukamoto N. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 1234-9 (1999); Sutherlanđ C. L. et al, J. of Immunol. 162: 4720-30 (1999). ) U zavisnosti od ćelijskog tipa, ovo signaliziran]e dovodi do pojačane sekrecije citokina kakvi su IL-6 (Jeppson J. D. et al, J. of Immunol. 161: 1738-42 (1998); Uejima Y. et al, Int. Arch. of Allergy & Immunol. 110: 225-32, (1996), IL-8 (Gruss H. J. et al, Blood 84: 2305-14 (1994); von Leoprechting A. et al, Cancer Res. 59: 1287-94 (1999); Denfeld R. W. et al, Europ. J. of Immunol. 26: 2329-34 (1996)), IL-12 (Cella M. et al, J of Exp. Med, 184: 747-52 (1996); Ferlin W. G. et al, Europ. J. of Immunol. 28: 525-31 (1998); Armant M. et al, Europ. J. of Immunol. 26: 1430-4 (1996); Koch F. et al., J. of Exp. Med. 184: 741-6 (1996); Seguin R. and L. H. Kasper, J. oflnfect. Diseases 179: 467-74 (1999); Chaussabel D, et al, Infection & Immunity 67: 1929-34 (1999)), 1L-15 (Kuniyoshi J. S. et al, Cellular Immunol. 193: 48-58 (1999)) i hemokina (MlPla, MIPip, RANTES i drugih) (McDyer J. F. et al, J. of Immunol. 162: 3711-7 (1999); Schaniel C. et al, J. ofExp. Med. 188: 451-63 (1998); Altenburg A. et al, J of Immunol. 162: 4140-7 (1999); Deckers J. G. et al, J. of the Am. Society of Nephrology 9: 1187-93 (1998)), povećane ekspresije MHC klasa I i II (Santos-Argumedo L. ct al, Cellular Immunol. 156: 272-85 (1994)), povećane ekspresije adhczivnih molekula (npr, ICAM) (Lee H. H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 1421-6 (1999); Grousson J. et al, Archives of Dennatol. Res. 290: 325-30 (1998); Katada J. ct al, Europ. J. Of Immunol. 26: 192-200 (1996); Mayumi M. et al,, J. of Allergy & Clin. Immunol. 96: 1136-44 (1995); Flores-Romo L. et al., Immunol. 79: 445-51 (1993)) i ko-stimulišućih molekula (npr., B7) (Roy M. et al., Europ. J of Immunol. 25: 596-603 (1995); Jones K. W. i C. J. Hackett, Cellular Immunol. 174: 42-53 (1996); Caux C. et al., Journal of Exp. Med. 180: 1263-72 (1994) ; Kiener P. A. et al., J. of Immunol. 155: 4917-25 (1995)). Citokini indukovani uključivanjem CD40 pojačavaju preživljavanje i aktivaciju T ćelija.
Pored pojačavanja ćelijske i imunske funkcije, efekti CD40 uključuju: regrutaciju i diferencijaciju ćelija pomoću hemokina i citokina; aktivaciju monocita; povećanu citolitičku aktivnost citolitičlđh T limfocita (CTL) i prirodnih ćelija ubica (NK = killer cells); indukciju apoptoze u tumorima sa CD40; povećanje imunogenosti tumora sa CD40 i proizvodnju antitela specifičnih za tumor. Uloga aktivacije CD40 u ćelijski posredovanim imunskim odgovorima je takođe dobro utvrđena i dati su pregledi u: Grewal et al., Ann. Rev. of Immunol. 16: 111-35 (1998); Mackey et al., / of Leukocyte Biol. 63: 418-28 (1998) iNoelleR, J., Agents & Actions - Suppl. 49: 17-22 (1998).
Studije na model-sistemu unakrsne aktivacije su pokazale da aktivacija APC pomoću CD40 može đa zameni potrebu pomoćničkih T ćelija za proizvodnjom citolitičkih T limfocita (CTL). (Bennett et al., Nature 393: 478-480 (1998). ) Podaci na miševima sa nedostatkom CD40L ukazuju na jasnu potrebu za signalizacijom pomoću CD40 u aktivaciji pomoćničkih T ćelija. (Grevval I. S. et al., Science 273: 1864-7 (1996); Grevval I. S. et al., Nature 378: 617-20(1995) Aktivacija CD40 konvertuje inače tolerogene B ćelije sa antigenima u kompetentne APC. (Buhlmann J. E. et al., Immunity 2: 645-53 (1995). ) Aktivacija CD40 inđukuje sazrevanje i diferencijaciju progenitora krvi iz pupčanika u dendritske ćelije. (Flores-Romo L. et al., J. of Exp. Med. 185: 341-9 (1997); Mackey M. F. et al., /. of Immunol. 161: 2094-8 (1998). ) Aktivacija CD40 takođe inđukuje diferencijaciju monocita u funkcionalne dendritske ćelije. (Brossart P. et al., Blood 92: 4238-47 (1998). ) Dalje, aktivacija CD40 pojačava citolitičku aktivnost NK ćelija preko citokina indukovanih pomoću APC-CD40. (Carbone E. et al., J. of Exp. Med. 185: 2053-60 (1997); Martm-Fontecha A. et al., J. of Immunol. 162: 5910-6 (1999). Ove opservacije ukazuju na to da CD40 igra suštinsku ulogu u inicijaciji i pojačanju imunskog odgovora indukovanjem maturacije APC, lučenja pomoćničkih citokina, pozitivne regulacije kostimulišućih molekula i pojačanja efektorskih funkcija.
Kritična uloga signalizacije pomoću CD40 u inicijaciji i maturaciji humoralnih i citotoksičnih imunskih odgovora pravi ovaj sistem idealnom metom za imunsko pojačavanje. Takvo pojačavanje može da bude naročito važno za podizanje efektivnih imunskih odgovora na tumorske antigene, koji se obično prikazuju imunskom sistemu putem unakrsne aktivacije aktiviranih APC. (Huang A. Y. et al., Ciba Foundation Symp. 187: 229-44 (1994); Toes R. E. M. et al., Seminars in Immunol.. 10: 443-8 (1998); Albert M. L. et al., Nature 392: 86-9 (1998); Bennett S. R. et al., J ofExp. Med. 186: 65-70 (1997). )
Nekoliko grupa je pokazalo efektivnost aktivacije CD40 za antitumorske odgovore in vitro i in vivo. (Toes R. E. M. et al., Seminars in Immunol. 10: 443-8 (1998). ) Dve grupe, koje su koristile model karcinoma renalnih ćelija sa metastazama na plućima i subkutanih tumora pomoću virusno transformisanih ćelija, nezavisno su pokazale da aktivacija CD40 može da obnovi toleranciju na tumor-specifične antigene što rezultira u efikasnom antitumorskoj aktivaciji T ćelija. (Sotomayor E. M. et al., Nature Medicine 5: 780-787 (1999); Diehl L. et al., Nature Medicine 5: 774-9 (1999). ) Antitumorska aktivnost u odsustvu imunskih ćelija je takođe viđena prilikom tretmana CD40L i antitelima na CD40 u modelu ćelijske linije humanog kancera doJκe u SCID miševima, (Hirano A. et al., Blood 93: 2999-3007 (1999). ) Nedavno je pokazano da aktivacija CD40 pomoću antitela na CD40 uništava CD40+ i CD40-limfome u mišjim modelima. (French R. R. et al., Nature Medicine 5: 548-53 (1999). ) Štaviše, prethodne studije Glennie-ja i saradnika zaključuju da je signalna aktivnost antitela na CD40 efektivnija za indukciju uklanjanja tumora in vivo nego aktivnost drugih antitela na površinske markere, sposobnih za regrutaciju efektora. (Tutt A, L. et al., J. of Immunol. 161: 3176-85 (1998). ) U saglasnosti sa ovim opservacijama, kad su antitela na CD40 testirana na aktivnost protiv CD40+ tumorskih ćelija in vivo, glavnina tumoricidne aktivnosti, ali ne sva, je bila vezana za signalizaciju pomoću CD40 pre nego za ADCC. (Funakoshi S. et al., J. of lmmunotherapy with Emphasis on Tumor Immunol. 19: 93-101 (1996). ) U jednoj drugoj studiji, dendritske ćelije koštane srži su tretirane ex vivo različitim agensima i testirane na in vivo antitumorsku aktivnost. Ove studije su pokazale da su DC stimulisane pomoću CD40 bile najzrelije i najefektivnije ćelije u podizanju antitumorskog odgovora.
Suštinska uloga CD40 u antitumorskom imunitetu je takođe pokazana poređenjem odgovora prirodnih i CD40-/- miševa na tumorske vakcine. Ova ispitivanja pokazuju da su CD40-/- miševi nesposobni da postignu tumorski imunitet uočen kod normalnih miševa.
(Mackey M. F. et al., Cancer Research 57: 2569-74 (1997). ) U jednoj drugoj studiji, splenociti iz miševa sa tumorom su stimulisani tumorskim ćelijama i tretirani aktivirajućim antitclima na CD40 ex vivo i pokazano je da imaju povišenu CTL aktivnost specifičnu za tumor. (Doncpudi M. et al, Cancer Immunol. Immunother. 48: 153-164 (1999). ) Ova ispitivanja pokazuju da CD40 zauzima kritičnu poziciju u antitumorskom imunitetu, i u CD40 pozitivnim i u CD40 negativnim tumorima. Pošto su CD40 eksprimirani u limfomima, leukemijama, multiplim mijelomima, u većini karcinoma nazofarinksa, bešike, jajnika i jetre, i u nekim kancerima doJκe i kolorektalnim kancerima, aktivacija CD40 može da ima širok opseg kliničke primene.
Aktivirajuća monoklonska antitela na CD40 mogu da doprinesu uništavanju tumora pomoću nekoliko važnih mehanizama. Najvažniji među njima je aktivacija dendritskih ćelija domaćina na pojačanu obradu i prezentaciju tumorskih antigena, kao i pojačanu prezentaciju antigena ili imunogenosti samih CD40 pozitivnih tumorskih ćelija, što dovodi do aktivacije tumor-specifiČnih CD4+ i CD8+ limfocita. Dodatna antitumorska aktivnost može da bude posredovana drugim imuno-pojacavajućim efektima CD40 signalizacije (proizvodnja hemokina i citokina, regrutaciju i aktivacija monocita i pojačana citolitička aktivnost CTL i NK), kao i direktno uništavanje CD40+ tumora indukcijom apoptoze ili stimulacijom humoralnog odgovora koji dovodi do ADCC. Apoptotične ili umiruće tumorske ćelije mogu takođe da postanu važan izvor tumor-specifičnih antigena koje obrađuju i prezentiraju APC, aktivirani pomoću CD40. U skladu s tim, postoji kritična potreba za terapijskim, klinički relevantnim agonističkim antitelima na CD40.
KRATAK OPIS CRTEŽA
Slike 1A-1H su poređenja predviđenih sekvenci aminokiselina varijabilnih domena lakih i teških lanaca izolovanih monoklonskih antitela na CD40 sa embrionalnim sekvencama aminokiselina odgovarajućih gena za lake i teške lance. Razlike između klonova i embrionske sekvence su zasenčene. Embrionske sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 su podvučene. U sekvencama teških lanaca, očigledne insercije u CDR3 regionu su označene povlakom (-) u embrionskoj sekvenci, a očigledne dclecije u CDR3 regionu su označene povlakom (-) u sekvenci klona.
Slika 1A: Predviđena aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog kapa lanca mAb 3. 1. 1 i 7. 1. 2 sa aminokiselinskim sekvencama embrionskili gena za Vk=A3/A19 i J-Jtcl.
Slika 1B: Predviđena aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog kapa lanca klona 15. 1. 1 i embrionska aminokiselinska sekvenca (Vk=A3/A19 i J=Jκ2)
Slika 1C: Predviđena aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog kapa lanca mAbs 10. 8. 3 i 21. 4. 1 i embrionalna aminokiselinska sekvenca (Vk=L5 (DP5) i J=Jκ4);
Slika 1D: Predviđena aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca mAb 3. 1. 1 i embrionalna aminokiselinska sekvenca (Vh=3-30+(DP-49), D=D4+DIR3 i J=JH6);
Slika 1E: Predviđena aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca mAb 7. 1. 2 i embrionalna aminokiselinska sekvenca (Vh=3-30+(DP-49), D= DIR5+D1-26 i J=Jh6);
[0018] Slika 1F: Predviđena aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca mAb 10. 8. 3 i embrionalna aminokiselinska sekvenca (Vh=4. 35 (VTV-4), D=DIR3 i J=JH6);
Slika 1G: Predviđena aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca mAb 15. 1. 1 i embrionalna aminokiselinska sekvenca (Vh=4-59 (DP-71), D=D4-23 i J=Jh4); i
Slika 1H: Predviđena aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca mAb 21. 4. 1 i embrionalna aminokiselinska sekvenca (Vh=1-02 (DP-75), D=DLRl i J=Jh4);
Slike 2A-2H su poređenja predviđenih aminokiselinskih sekvenci varijabilnih domena lakog i teškog lanca izolovanog monoklonskog antitela na CD40 i aminokiselinskih sekvenci odgovarajućih embrionskih gena za lak i težak lanac. Razlike između sekvenci klona i embriona označene su masnim slovima. Embrionalne CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence su podvučene. U sekvencama teških lanaca, očigledne insercije u CDR3 regionu su označene povlakom (-) u embrionskoj sekvenci, a očigledne delecije u CDR3 regionu su označene povlakom (-) u sekvenci klona.
Slika 2A: Predviđene aminokiselinske sekvence lakog kapa lanca mAbs 22. 1. 1, 23. 5. 1 i 23. 29. 1 i embrionalna aminokiselinska sekvenca (Vk=A3/A19 i J=Jκ1);
Slika 2B: Predviđene aminokiselinske sekvence lakog kapa lanca mAbs 21. 2. 1 i embrionalna aminokiselinska sekvenca (Vκ
=A3/A19 i J=Jκ3);
[0024] Slika 2C: Predviđene aminokiselinske sekvence lakog kapa lanca mAbs 23.28.1, 23.28.1L-C92A i 24.2.1 i embrionska aminokiselinska sekvenca (Vtc=A27 i J=Jκ3);
Slika 2D: Predviđena aminokiselinska sekvenca teškog lanca mAb 21.2.1 i
embrionska aminokiselinska sekvenca (VH=3-30+, D=DIR3+D6-19 i J=Jh4);
[0026] Slika 2E: Predviđena aminokiselinska sekvenca teškog lanca mAbs 22.1.1, 22.1.1 H-C109A i embrionska aminokiselinska sekvenca (Vh=3-30+, D=D1-1 i J=Jh6);
Slika 2F: Predviđena aminokiselinska sekvenca teškog lanca mAb 23.5.1 i
embrionska aminokiselinska sekvenca (Vh=3-30+, D=D4-17 i J=Jh6);
Slika 2G: Predviđena aminokiselinska sekvenca teškog lanca mAb 23.29.1 i
embrionska aminokiselinska sekvenca (Vh=3-30+, D=D4-17 i J=Jh6); i
Slika 2G: Predviđene aminokiselinske sekvence teških lanaca mAb 23.28.1,
23.28.1H-D16E i 24.2.1 i embrionska aminokiselinska sekvenca (VH=4-59, D=DIR1+Đ4-17 i J=Jh5).
Slika 3 predstavlja krivu zavisnosti odgovora od doze i ilustruje sposobnost antitela na CD40 iz ovog pronalaska (21.4.1) da stimuliše proizvodnju IL-12p40 u đentritskim delijama čoveka.
Slika 4 predstavlja krivu zavisnosti odgovora od doze i ilustruje sposobnost antitela na CD40 iz ovog pronalaska (21. 4. 1) da stimuliše proizvodnju IL-12p70 u đentritskim ćelijama čoveka.
Slika 5 predstavlja grafik koji ilustruje sposobnost antitela na CD40 iz ovog pronalaska (21. 4. 1) da poveća imunogenost Jy stimulatorskih ćelija i podstrekne aktivnost CTL protiv Jy ciljnih ćelija.
Slika 6 predstavlja krivu inhibicije rasta tumora koja ilustruje smanjeni rast Daudi-jevih tumora sa CD40 u SCID-bež miševima tretiranim antitelima na CD40 iz ovog pronalaska (21. 4. 1).
Slika 7 predstavlja krivu inhibicije rasta tumora koja ilustruje smanjeni rast K562 tumora bez CD40 u SCID-bež miševima tretiranim antitelima na CD40 iz ovog pronalaska (21. 4. 1) i dendritske ćelije i T ćelije čoveka.
Slika 8 prikazuje inhibiranje rasta K562 tumora bez CD40 u SCID miševima različitim koncentracijama anti-CD40 agonista mAb 23. 29. 1.
Slika 9 prikazuje inhibiranje rasta K562 tumora bez CD40 u SCID miševima različitim koncentracijama anti-CD40 agonista mAb 3. 1. 1.
Slika 10 prikazuje inhibiciju rasta Raji tumora sa CD40 u prisustvu i odsustvu T ćelija i dendritskih ćelija u SCID miševima anti-CD40 agonistom mAb.
Slika 11 prikazuje inhibiciju rasta Raji tumora sa CD40 u SCID miševima agonističnim antitelima na CD40,
Slika 12 prikazuje inhibiciju rasta BT474 ćelija kancera doje u SCID-bež miševima agonističnim antitelima na CD40.
Slika 13 prikazuje inhibiciju rasta PC-3 tumora prostate u SCID-bež miševima agonističnim antitelima na CD40.
Slika 14 predstavlja krivu preživljavanja SCID-bež miševa kojima su injecirane (iv) ćelije Daudi-jevog tumora i koji su tretirani agonističnim antitelima na CD40.
Slika 15 prikazuje Westem blot analizu anti-CD40 agonističnih antitela na redukovani (R) i neređukovanj (NR) humani CD40.
Slika 16 predstavlja poređenje D1-D4 domena CD40 miša i čoveka.
Slika 17 predstavlja poređenje aminokiselinskih sekvenci CD40 miša i čoveka, pokazujući položaje fuzije himera.
Slika 18 prikazuje grupu shematizovanih dijagrama himemih konstrukata CD40.
KRATAK PREGLED PRONALASKA
Ovaj pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena koji vezuje CD40 i deluje kao agonist CD40.
Pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja obuhvata antitelo na CD40 ili njegov deo za vezivanje antigena i farmaceutski prihvatljiv nosač. Kompozicija može dalje da ima neku drugu komponentu, kao što je anti-tumorski agens ili agens za snimanje (imaging). Dijagnostički i terapijski metodi su takođe obezbeđeni pronalaskom.
Pronalazak obezbeđuje izolovanu ćelijsku liniju, kao što je hibridom, koja proizvodi antitelo na CD40 ili njegov deo za vezivanje antigena.
Pronalazak takođe obezbeđuje molekule nukleinskih kiselina koji kodiraju teške i/ili lake lance antitela na CD40 ili njihove đelove za vezivanje antigena.
Pronalazak obezbeđuje vektore i ćelije domaćine koji sadrže molekule nukleinskih kiselina, kao i metode za rekombinantnu proizvodnju polipeptida koje kodiraju molekuli nukleinskih kiselina.
Transgene životinje koje eksprimiraju teške i/ili lake lance antitela na CD40 ili njihove đelove za vezivanje antigena su takođe obezbeđene.
Pronalazak takođe obezbeđuje metod za lečenje subjekta kome je to potrebno efektivnom količinom molekula nukleinske kiseline koji kodiraju teške i/ili lake lance antitela na CD40 ili njihove delove za vezivanje antigena.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
Definicije i opšte tehnike
Ako ovde nije drukčije definisano, naučni i tehnički termini korišćeni u vezi ovog pronalaska hnaće značenja koja su opšte prihvaćena kod stručnjaka uobičajenog stepena znanja. Dalje, ukoliko kontekst ne zahteva drukčije, termini u jednini će uključivati množinu i tennini u množini će uključivati jedninu. Uopšteno, nomenklature korišćene u vezi sa kulturama ćelija i tkiva, molekularnom biologijom, imunologijom, mikrobiologijom, genetikom i hernijom proteina i nukleinskih kiselina i hibridizacijom, kao i sa njihovim tehnikama, opisanim ovde, su one dobro poznate i obično korišćene u struci.
Metode i tehnike ovog pronalaska se obično izvode prema konvencionalnim metodama dobro poznatim u struci i kao što su opisane u različitim opštim i specifičnijim referencama koje su citirane i diskutovane kroz ćelu specifikaciju, osim ako nije naznačeno drukčije. Videti, npr., Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) i Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992) i Harlow i Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1990), koji su ovde dati kao reference. Enzimske reakcije i tehnike prečišćavanja su izvođene prema uputstvima proizvođača, kao što se obično radi u struci ili kao što je ovde opisano. Nomenklature korišćene u vezi sa analitičkom hernijom, sintetičkom organskom hernijom i medicinskom i farmaceutskom hernijom i njihovim laboratorijskim procedurama i tehnikama, koje su ovde opisane, su one dobro poznate i obično korišćene u struci. Standardne tehnike su korišćene za hemijske sinteze, hemijske analize, farmaceutske preparate, formulacije i pakovanje leka, kao i u lečenju pacijenata.
Podrazumeva se da sledeći termini imaju sledeća značenja, osim ako je drukčije naznačeno:
Termin "polipeptid" obuhvata nativne ili veštačke proteine, proteinske fragmente i polipeptidne analoge proteinskih sekvenci. Polipeptid može biti monomer ili polimer.
Termin "izolovani protein", "izolovani polipeptid" ili "izolovano antitelo" je protein, polipeptid ili antitelo koje po svom poreklu ili nastanku (1) nije vezano sa prirodno pridruženim komponentama koje ga prate u njegovom nativnom stanju, (2) je slobodno od drugih proteina iste vrste, (3) je eksprimirano u ćeliji različite biološke vrste ili (4) se ne pojavljuje u prirodi. Dakle, polipeptid koji je hemijski sintetisan, ili je sintetisan u ćelijskom sistemu različitom od ćelije iz koje prirodno potiče, će biti "izolovan” od svojih prirodno pridruženih komponenata. Protein takođe može suštinski biti oslobođen od prirodno pridruženih komponenata izolovanjem pomoću telmika prečišćavanja proteina, dobro poznatih u struci.
Primeri izolovanih antitela uključuju antitelo na CD40 koje je afimtetno prečišćeno uz pomoć CD40, antitelo na CD40 koje je sintetisano u hibridomu ili nekoj drugoj ćelijskoj liniji in vitro i humano antitelo na CD40 dobijeno iz transgenog miša.
Protein ili polipeptid je “suštinski čist”, “suštinski homogen” ili “suštinski prečišćen” kad se bar 60 do 75% uzorka ponaša kao jedna vrsta polipeptida. Polipeptid može biti monomer ili multimer. “Suštinski prečišćen” polipeptid ili protein će tipično imati oko 50%, 60%, 70%, 80% ili 90% (težinskih) proteinskog uzorka, Češće 95%, a poželjno će biti preko 99% čist. Čistoća ili homogenost proteina može da bude određena na mnogo načina dobro poznatih u struci, kao što je elektroforeza proteinskog uzorka na poliakrilamidnom gelu, praćena uočavanjem pojedinačne polipeptidne trake posle bojenja gela bojom dobro poznatom u struci. Za određene svrhe, veća rezolucija može biti obezbeđena upotrebom HPLC ili drugim sredstvom dobro poznatim u tehnikama prečišćavanja.
Termin "polipeptidni fragment", kao što se ovde koristi, odnosi se na polipeptid koji ima deleciju amino kraja i/ili karboksi kraja, ali gde je preostala aminokiselinska sekvenca identična odgovarajućim pozicijama sekvence koja se javlja u prirodi. U nekim izvođenjima, fragmenti su dugi najmanje 5, 6, 8 ili 10 aminokiselina. U nekim drugim izvođenjima, fragmenti su dugi najmanje 14, najmanje 20, najmanje 50 ili najmanje 70, 80, 90, 100, 150 ili 200 aminokiselina.
Termin "polipeptiđni analog", kao što se ovde koristi, odnosi se na polipeptid koji sadrži segment koji ima suštinski identičan deo aminokiselinske sekvence i koji ima bar jednu od sledećih osobina: (1) specifično vezivanje za CD40 u pogodnim uslovima za vezivanje, (2) sposobnost da aktivira CD40, (3) sposobnost da pozitivno reguliše ekspresiju molekula sa ćelijske površine, kao što su ICAM, MHC-n, B7-1, B7-2, CD71, CD23 i CD83 ili (4) sposobnost da pojača sekreciju citokina kao što su IFN-β1, EL-2, IL-8, IL-12, IL-15, IL-18 i IL-23. Tipično, analozi polipeptida sadrže konzervativnu supstituciju (ili inserciju ili deleciju) aminokiselina u odnosu na sekvencu koja se javlja u prirodi. Analozi su tipično dugi bar 20 ili 25 aminokiselina, poželjno bar 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 ili 200 aminokiselina ili više i često mogu imati punu dužinu polipeptida koji se javlja u prirodi.
Poželjne supstitucije aminokiselina su one koje: (1) smanjuju podložnost proteolizi, (2) smanjuju podložnost oksidaciji, (3) menjaju afinitet vezivanja pri formiranju proteinskih kompleksa i (4) dodaju ili mođifikuju druge fizičko-hemijske ili funkcionalne osobine takvih analoga. Analogoni mogu da uključe muteine sekvenci različite od peptidnih sekvenci koje se javljaju u prirodi. Na primer, jednostruke ili višestruke supstitucije aminokiselina (poželjno, konzervativne supstitucije aminokiselina) mogu da se prave u prirodnoj sekvenci (poželjno u delu polipeptida van domena koji prave međumolekulske kontakte). Konzervativna supstitucija aminokiselina ne bi trebalo suštinski da promeni strukturne karakteristike izvorne sekvence (npr., zamena aminokiseline ne bi trebalo da pokazuje sklonost ka prekidanju spirale koja se javlja u izvornoj sekvenci, niti da narušava druge tipove sekundarne strukture koji karakterišu izvornu sekvencu). Primeri polipeptidnili sekundarnih i tercijemih struktura poznatih u struci su opisani u Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branđen and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N. Y. (1991)); i Thomton et al., Nature 354: 105 (1991), od kojih je svaka ovde inkorporisana referencom.
Nepeptidni analogoni se obično koriste u farmaceutskoj industriji kao lekovi sa osobinama analognim onima peptida-obrasca. Ovi tipovi nepeptidnih jedinjenja su nazvani "peptidni mimetici" ili "peptidomimctici". Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15: 29 (1986), Veber i Freidinger, TJNS str. 392 (1985) i Evans et al., J. Med. Chem. 30: 1229 (1987), koji su ovde inkoiporisani referencom. Takva jedinjenja su često razvijena uz pomoć kompjuterskog molekulskog modelovanja. Peptidni mimetici, koji su strukturno slični terapijski upotrebnim peptidima, mogu da se koriste za izazivanje ekvivalentnih terapijskih ili profilaktičkih efekata. Uopšteno, peptidonaimetici su strukturno slični paradigmatskom polipeptidu (tj., polipeptid koji ima željenu biohemijsku osobinu ili farmakološku aktivnost), kao što je humano antiteio, ali ima jednu ili više peptidnih veza po izboru zamenjenih vezom odabranom iz grupe koju čine: -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH-(cis i trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2-i -CH2SO"-, metodama dobro poznatim u struci. Sistematska supstitucija jedne ili više aminokiselina koncenzusne sekvence sa D-aminokiselinom istog tipa (npr., D-lizin umesto L-lizina) može se takođe koristiti za pravljenje stabilnijih peptida. Pored toga, kompaktni peptidi koji sadrže koncenzusnu sekvencu ili suštinski istu varijaciju koncenzusne sekvence mogu se praviti metodama poznatim u struci (Rizo and Gierasch, Ann. Rev. Biochem. 61: 387 (1992), ovde inkorporisan referencom); na primer, dodatkom internih cisteinskih ostataka sposobnih za fonniranje intramolekulskih đisulfidnih mostova koji ciklizuju peptid.
“Antiteio" se odnosi na celokupno antiteio ili na njegov deo za vezivanje antigena koje je u kompeticiji sa intaktnim antitelom za specifično vezivanje. Videti, generalno, Fundamental Immunology, Pog. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N. Y. (1989)) (inkorporisan referencom u svojoj celosti u sve svrhe). Delovi koji vezuju antigene mogu da se proizvode tehnikama rekombinantne DNK ili enzimskom ili hemijskom razgradnjom intaktnih antitela. Delovi koji vezuju antigene uključuju, između ostalog, Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb i fragmente regiona koji određuju komplementarnost (CDR), jednolančana antitela (scFv), himema antitela, dijatela i polipeptide koji sadrže bar deo antitela dovoljan da da polipeptidu sposobnost vezivanja za specifičan antigen.
Od N-tenninusa do C-terminusa, varijabilni domeni i lakih i teških lanaca sadrže regione FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. Dođeljivanje aminokiselina svakom domenu je u saglasnosti sa definicijama iz Kabat, Sekvences of Proteins of Immunological Interesi (National Instilutes of Health, Bethesda, Md. (1987 i 1991)), ili Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987); Chothia et al., Nature 342: 878-883 (1989).
Kao što se ovde koristi, antitelo na koje se poziva brojem je monoklonsko antitclo koje je dobijeno iz kibriđoma istog broja. Na primer, monoklonsko antitelo 3. 1, 1 je dobijeno iz hibridoma 3. 1. 1.
Kao što se ovde koristi, Fd fragment znači fragment antitela koji se sastoji od VH i Cnl domena; Fv fragment se sastoji od Vl i Vh jednog kraka antitela; a dAb fragment (Ward et al., Nature 341: 544-546 (1989)) se sastoji od Vh domena.
U nekim izvođenjima, antitelo je jednolančano antitelo (scFv) u kome su Vl i Vh domeni spareni da formiraju monovalentne molekule preko sintetičkog linkera koji im omogućava da budu napravljeni kao jedan proteinski lanac. (Bird et al., Science 242: 423-426 (1988) i Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988). ) U nekim drugim izvođenjima, antitela su dijatela, tj, dvovalentna antitela u kojima su Vh i Vl domeni eksprimirani na jednom polipeptidnom lancu, ali korišćenjem linkera koji je suviše kratak da dozvoli sparivanje dva domena na istom lancu, domeni se nagone na sparivanje sa komplementarnim domenima drugog lanca i kreiraju dva mesta za vezivanje antigena (Videti npr., Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993), i Poljak R, J. et al., Structure 2: 1121-1123 (1994). U nekim izvođenjima, jedan ili više CDR antitela ovog pronalaska može biti ugrađeno u molekul bilo kovalentno, bilo nekovalentno, da bi se napravio imunoadhezin koji specifično vezuje CD40. U takvim izvođenjima, CDR-ovi mogu biti ugrađeni kao deo većeg polipeptidnog lanca, mogu biti kovalentno vezani sa drugim polipeptidnim lancem ili mogu biti ugrađeni nekovalentno.
U izvođenjima koji imaju jedno ili više vezivnih mesta, vezivna mesta mogu biti identična među sobom ili mogu biti različita.
Kao što se ovde koristi, termin “humano antitelo” označava bilo koje antitelo u kome su sve sekvence varijabilnih i konstantnih domena humane sekvence. Ova antitela se mogu dobiti na mnogo načina, kao što je dole opisano.
Termin “himemo antitelo”, kao što se ovde koristi, označava antitelo koje sadrži regione iz dva ili više različitih antitela. U jednom izvođenju, jedan ili više CDR su dobijeni iz humanog antitela na CD40. U drugom izvođenju, svi CDR su dobijeni iz humanog antitela na CD40. U još jednom izvođenju, CDR iz više od jednog humanog antitela na CD40 su kombinovani u himemo antitelo. Na primer, himemo antitelo može da sadrži CDR1 lakog lanca iz prvog humanog antitela na CD40, CDR2 lakog lanca iz drugog humanog antitela na CD40, a CDR3 i CDR3 lakog lanca iz trećeg humanog antitela na CD40, a CDR-ovi teškog lanca mogu biti dobijeni iz jednog ili više drugih antitela na CD40. Dalje, regioni okvira mogu da se dobiju iz jednog od istih antitela na CD40 ili iz jednog ili više različitih čovečijih.
“Aktivirajuće antitelo” (koje se ovde pominje i kao “agonističko antitelo”), kao što se ovđe koristi, označava antitelo koje pojačava jednu ili više aktivnosti CD40 za najmanje 20% kad se doda ćeliji, tkivu ili organizmu koji eksprimira CD40. U nekim izvođenjima, antitelo aktivira aktivnost CD40 za najmanje 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%. U nekim izvođenjima, aktivirajuće antitelo se dodaje u prisustvu CD40L. U nekim izvođenjima, aktivnost aktivirajućeg antitela se meri pomoću testa na pozitivnu regulaciju površinskih molekula iz pune krvi. Viđeti Primer VII. U jednom drugom izvođenju, za aktivnost aktivirajućeg antitela se koristi test sa dendritskim ćelijama kojim se meri oslobađanje IL-12. Videti Primer VIII. U trećem izvođenju, aktivnost aktivirajućeg antitela se meri pomoću in vivo tumorskog modela. Videti Primer X.
Stručnjaci uobičajenog nivoa lako mogu dobiti fragmente ili analogone antitela ili imunoglobulinske molekule prateći uputstva iz ove specifikacije. Poželjni amino- i karboksi-krajevi fragmenata ili analogona se javljaju blizu granica funkcionalnih domena. Strukturni i funkcionalni domeni mogu da se identifikuju poređenjem podataka o nukleotidima i/ili sekvencama aminokiselina sa javnim ili sopstvenim bazama podataka. Poželjno, kompjuterske metode poređenja se koriste da se identifikuju motivi sekvenci ili predviđeni domeni proteinskih konfomiacija koji se javljaju u drugim proteinima poznate strukture i/ili funkcije. Metode za identifikovanje proteinskih sekvenci koje se pakuju u poznate trodimenzione strukture su poznate. Videti Bowie et ah, Science 253: 164 (1991).
Termin "površinska plazmonska rezonanca”, kao što se ovde koristi, odnosi se na optički fenomen koji omogućava analizu biospecifičnih interakcija u realnom vremenu (real-time) detekcijom promena koncentracija proteina unutar biosenzorske matrice, na primer, BIAcore sistema (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscata\vay, N. J. ). Za dalje opise, videti Jonsson U. et al., Ann. Biol. Clin. 51: 19-26 (1993); Jonsson U. et ah, Biotechniques 11: 620-627 (1991); Jonsson B. et al., J. Mol. Recognit. 8: 125-131 (1995); i JohnssonB, et al., Anal. Biochem. 198: 268-277 (1991).
Termin "Kd" se odnosi na ravnotežnu konstantu disocijacije određene interakcije između antitela i antigena.
Termin "epitop" obuhvata bilo koju determinantu proteina sposobnu za specifično vezivanje za imunoglobulin ili receptor T ćelija. Epitopske determinante se obično sašto je od hemijski aktivnih površinskih grupacija molekula kao što su aminokiseline ili bočni lanci šećera i obično imaju specifične osobine trodimenzione strukture, kao i specifične osobine naelektrisanja. Za antitelo se kaže da se specifično vezuje za antigen kad je ravnotežna konstanta disocijacije < 1 µM, poželjno ≤ 100 nM, a najpoželjnije ≤ 10 nm.
Kao što se ovde koristi, dvadeset konvencionalnih aminokiselina i njihove skraćenice su one u konvencionalnoj upotrebi. Videti Immunology-A Synthesis (2nd Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), koja je ovde inkorporisana referencom.
Termin "polinukleotid", kao što se ovde koristi, označava polimemu formu nukleotida od najmanje 10 baza dužine, bilo ribonukleotida, bilo dezoksinukleotida, bilo modifikovanog oblika bilo kog tipa nukleotida. Termin obuhvata jednolančane i dvolančane oblike.
Termin "izolovani polinukleotid", kao što se ovde koristi, označava polinukleotid genomskog, cDNK ili sintetičkog porekla ili neke njihove kombinacije, koji po svom poreklu (1) nije vezan sa svim ili sa deloni polinukleotida sa kojim se izolovani polinukleotid nalazi u u prirodi, (2) operabilno je vezan za polinukleotid za koji nije vezan u prirodi ili (3) se ne pojavljuje u prirodi kao deo veće sekvence.
Termin "oligonukleotid", kao što se ovde koristi, uključuje prirodne i modifikovane nukleotide vezane zajedno vezama koje se javljaju ili se ne javljaju u prirodi. Oligonukleotidi čine podskup polinukleotida koji obično sadrže 200 baza ili manje. Poželjno je da oligonukleotidi imaju 10 do 60 baza u dužinu, a najpoželjnije 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ili 20 do 40 baza u dužinu. Oligonukleotidi su obično jednolančani, npr. za prajmere i probe;
mada oligonukleotidi mogu biti dvolančani, npr. za korišćenje u konstruisanju genskog mutanta. Oligonukleotidi ovog pronalaska mogu biti bilo sens, bilo antisens oligonukleotidi.
Termin "nukleotidi koji se javljaju u prirodi”, kao što se ovde koristi, obuhvata đezoksiribonuldeotide i ribonukleotide. Termin “modifikovani nukleotidi”, kao što se ovde koristi, obuhvata nukleotide sa modifikovanim ili supstituisanim šećernim grupama i slično. Temiin "oligonukleotidne veze”, navođen ovde, obuhvata oligonukleotidne veze kao što su fosforotioat, fosforoditioat, fosforoselenoat, fosforođiselenoat, fosforoanilotioat, fosforaniladat, fosforoamidat, i slične. Videti, npr., LaPlanche et al., Nucl. Acids Res. 14: 9081 (1986), Stec et ah, J. Am. Chem. Soc. 106: 6077 (1984), Stein et ah, Nucl, Acids Res, 16: 3209 (1988), Zon et ah, Anti-Cancer Drug Design 6: 539 (1991), Zon et ah, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, str. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)), U. S. Patent No. 5, 151, 510, Uhhnann and Peyman, Chemical Reviews 90: 543 (1990), čiji su opisi ovde inkorporisani referencama. Oligonukleotid može, po želji, da sadrži obeleživač za detekciju.
"Operativno vezane" sekvence obuhvataju i sekvence za kontrolu ekspresije koje se nalaze uz gen od interesa i sekvence za kontrolu ekspresije koje deluju sa drugog ili udaljenog dela lanca da bi kontrolisale gen od interesa. Termin “sekvenca za kontrolu ekspresije”, kao što se ovde koristi, označava polinukleotidne sekvence za koje je neophodno da utiču na ekspresiju i obradu kodirajućih sekvenci za koje su vezane. Sekvence za kontrolu ekspresije uključuju odgovarajuće sekvence za počinjanje i završavanje transkripcije, promotorske i stimulatorske (enhancer) sekvence; efikasne signale za obradu RNK, kao što su signali za iskrajanje (splicing) i poliađenilaciju; sekvence koje stabilizuju citoplazmatsku iRNK; sekvence koje pojačavaju efikasnost translacije (tj., koncenzusna sekvenca Kozak-ove); sekvence koje pojačavaju stabilnost proteina i, kad je poželjno, pojačavaju sekreciju proteina. Priroda takvih kontrolnih sekvenci se razlikuje u zavisnosti od organizma domaćina; u prokariotama, takve kontrolne sekvence obično uključuju promotor, mesto za vezivanje ribozoma i sekvencu za završavanje transkripcije; u eukariotama, obično, takve kontrolne sekvence obično uključuju promotore i sekvencu za završavanje transkripcije. Predviđeno je da termin “kontrolne sekvence” uključi, kao minimum, sve komponente čije prisustvo je suštinsko za ekspresiju i obradu, a može da uključi i dodatne komponente čije prisustvo daje neku prednost, na primer, čeone (leader) sekvence i sekvence za fuziju sa partnerom.
Termin "vektor", kako se ovde koristi, označava molekul nukleinske kiseline sposoban da nosi drugu nukleinsku kiselinu z, a koju je vezan. U nekim izvođenjima, vektor je plazmid, tj., kružna dvolančana petlja DNK, u koju se mogu ugraditi dodatni segmenti DNK. U nekim izvođenjima, vektor je virusni vektor, gde dodatni segmenti DNK mogu biti vezani za virusni genom. U nekim izvođenjima, vektori su sposobni za autonomnu replikaciju u ćeliji domaćinu u koju su uvedeni (npr., bakterijski vektori koji imaju bakterijski start replikacije i epizomalni sisarski vektori). U nekim drugim izvođenjima, vektori (npr., neepizomalni sisarski vektori) mogu biti integrisani u genom ćelije domaćina po uvođenju u ćeliju domaćina i time se replikuju zajedno sa genomom domaćina. Štaviše, određeni vektori su sposobni da upravljaju ekspresijom gena za koje su operativno vezani. Takvi vektori se ovde spominju kao “rekombinantni ekspresioni vektori” (ili, prosto, “ekspresioni vektori”).
Termin "rekombinantna ćelija domaćin (ili, prosto, “ćelija domaćin"), kao što se ovde koristi, označava ćeliju u koju je uveden rekombinovan ekspresioni vektor. Podrazumeva se da se "rekombinantna ćelija domaćin" i "ćelija domaćin" ne odnose samo na takvu ćeliju, nego i na njeno potomstvo. Pošto u sledećim generacijama mogu da se jave određene modifikacije ili zbog mutacija ili zbog uticaja okoline, takvo potomstvo ne mora, u stvari, da bude identično sa roditeljskom ćelijom, ali je ipak uključeno u okvir termina “ćelija domaćin", kao što se ovde koristi.
Termin "selektivno hibridizovati”, koji se koristi ovde, znači detektabilno i specifično vezati. Polinukleotiđi, oligonukleotidi i njihovi fragmenti se, prema ovom pronalasku, selektivno hibridizuju sa lancima nukleinskih kiselina pod uslovima za hibridizaciju i pranje, koji minimizuju znatne količine detektabilnog vezivanja za nespecifične nukleinske kiseline. Uslovi “velike strogosti” ili “vrlo strogi” uslovi mogu da se koriste za postizanje selektivne hibridizacije, kao što je poznato u struci i u ovdašnjoj diskusiji. Jedan primer “velike strogosti” ili “vrlo strogih” uslova je inkubacija jednog polinukleotida sa drugim polinukleotiđom, gde jedan polinukleotid može biti pričvršćen za čvrstu površinu kao što je membrana, u puferu za hibridizaciju od 6X SSPE ili SSC, 50% formamida, 5X Denhardt-ovog reagensa, 0, 5% SDS, 100 µg/ml đenaturisane, fragmentisane DNK iz sperme lososa, na temperaturi hibridizacije od 42°C 12-16 sati, posle čega se dvaput opere na 55°C pomoću pufera za pranje od 1X SSC, 0, 5% SDS. Videti i Sambrook et ah, supra, str. 9. 50-9. 55.
Termin “procenat sekvencijske identičnosti”, u kontekstu sekvenci nukleinskili kiselina, označava mikleotiđe u dve sekvence koji su isti kad se one postave tako da pokazuju maksimalnu korespondenciju. Dužina poređenih identičnih sekvenci može se protezati preko bar devet nukleotida, obično bar oko 18 nukleotida, još češće bar oko 24 nukleotida, tipično bar oko 28 nukleotida, još tipičnije bar oko 32 nukleotida, a poželjno bar oko 36, 48 ili više nukleotida. Postoji veliki broj različitih algoritama poznatih u struci koji se mogu koristiti za merenje identičnosti nukleotidnih sekvenci. Na primer, polinukleotiđne sekvence mogu da se porede pomoću FASTA, Gap ili Bestfit, koji su programi iz Wisconsin Package Version 10. 0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin. FASTA, koja uključuje, npr., programe FASTA2 i FASTA3, omogućava poređenja i procente identičnosti sekvenci regiona pri najboljem preklapanju ponuđenih i traženih sekvenci (Pearson, Methods Enzymol. 183: 63-98 (1990), Pearson, Methods Mol. Biol. 132: 185-219 (2000), Pearson, Methods Enzymol. 266: 227-258 (1996), Pearson, J. Mol Biol. 276: 71-84 (1998), ovde inkorporisani referencom). Ako nije drukčije specifikovano, korišćeni su standardni parametri za određeni program ili algoritam. Na primer, procenat sekvencijalne identičnosti između sekvenci nukleinskili kiselina mogu da se odrede pomoću FASTA sa njenim standardnim parametrima (reč od 6 slova i NOPAM faktor za matricu ocenjivanja) ili upotrebom Gap sa njegovim standardnim parametrima, koji su dati u GCG Version 6. 1, ovde inkorporisanim referencom.
Referenca na nukleotidnu sekvencu uključuje njen komplement osim ako je drukčije specifikovano. Prema tome, pođrazumeva se da referenca na nukleinsku kiselinu koja ima određenu sekvencu obuhvata i njen komplementaran lanac sa komplementarnom sekvencom.
U molekularnoj biologiji, istraživači koriste temiine “procenat sekvencijalne identičnosti”, “procenat sekvencijalne sličnosti” i “procenat sekvencijalne homologije” u istom značenju. U ovoj prijavi, ovi termini će imati isto značenje samo u odnosu na sekvence nukleinskili kiselina.
Termin "suštinska sličnost" ili " suštinska sekvencijska sličnost", kad se odnosi na nukleinsku kiselinu ili njen fragment, znači da kad se sa odgovarajućim nukleotidnim insercijama i delecijama optimalno uporedi sa drugom nukleinskom kiselinom (ili njenim komplementarnim lancem), postoji identičnost nukleotidnih sekvenci u najmanje oko 85%, poželjno najmanje oko 90%, a još poželjnije u najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% nukleotidnih baza, mereno bilo kojim dobro poznatim algoritmom za sekvencijsku identičnost, kao što je FASTA, BLAST ili Gap, kao što je diskutovano gore.
Kad se primeni na polipeptiđe, termin "suštinska identičnost" znači da dve peptidne sekvence, kad se optimalno uporede, kao što se to radi programom GAP ili BESTFIT koristeći uobičajene gap težine, dele najmanje 70, 75 ili 80 procenata sekvencijalne identičnosti, poželjno najmanje 90 ili 95 procenata sekvencijalne identičnosti, a još poželjnije najmanje 97, 98 ili 99 procenata sekvencijalne identičnosti. Poželjno je da se pozicije ostataka koji nisu identični razlikuju zbog konzervativnih aminokiselinskih supstitucija. "Konzervativna aminokiselinska supstitucija" je ona u kojoj je aminokiselinski ostatak supstituisan drugim aminokiselinskim ostatkom (sa R grupom u bočnom lancu) sa sličnim hemijskim osobinama (npr., naelektrisanje ili hidrofobnost). U opstem slučaju, konzervativna aminokiselinska supstitucija neće suštinski izmeniti funkcionalne osobine proteina. U slučajevima gde se dve ili više amino kiseline razlikuju među sobom zbog konzervativnih supstitucija, povećanje procentualne sekvencijalne identičnosti ili stepena sličnosti može da se postigne korigovanjem za konzervativnu prirodu supstitucije. Sredstva za postizanje ovog podešavanja su dobro poznata stručnjacima. Videti, npr., Pearson, Methods Mol. Biol. 243: 307-31 (1994). Primeri grupa aminokiselina koje imaju bočne lance sličnih hemijskih osobina uključuju: 1) alifatiČne bočne lance: glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin; 2) alifatične-hidroksil bočne lance: serin i treonin; 3) bočne lance sa amidom: asparagin i glutamin; 4) aromatične bočne lance: fcnilalanin, tirozin i triptofan; 5) bazne bočne lance: lizin, arginin i histidm; 6) kisele bočne lance: asparaginska kiselina i glutaminska kiselina i 7) bočne lance sa sumporom: cistein i metionin. Poželjne grupe za konzervativne aminokiselinske supstitucije su: valin - leucin - izoleucin, fenilalanin - tirozin, lizin - arginin, alanin - valin, glutamat - aspartat i asparagin - glutamin.
Alternativno, konzervativna zamena je bilo koja zamena koja ima pozitivnu vrednost u PAM250 “log-likelihoođ” matrici opisanoj u Gonnet et al., Science 256: 1443-45 (1992), ovde inkorporisanoj referencom. “Umoreno konzervativna” zamena je bilo koja zamena koja ima nenegativnu vrednost u PAM250 “log-likelihood” matrici.
Sekvencijalna sličnost za polipeptiđe, o kojoj se takođe govori kao o sekvencijalnoj identičnosti, tipično se meri softverima za analizu sekvenci. Softver za proteinsku analizu upoređuje slične sekvence koristeći mere sličnosti đodeljene različitim supstitucijama, delecijama i drugim modifikacijama, uključujući konzervativne aminokiselinske supstitucije. Na primer, GCG sadrži programe kakav je "Gap" i "Bestfit", koji mogu da se koriste sa svojim standardnim parametrima da bi se odredila sekvencijalna homologija ili sekvencijalna identičnost između vrlo srodnih polipeptida, kao što su homologi polipeptidi iz različitih vrsta organizama ili između prirodnog proteina i njegovog muteina. Videti, npr., GCG Version 6. 1. Polipeptidne sekvence se takođe mogu porediti pomoću FASTA uz upotrebu uobičajenih ili preporučenih parametara, program u GCG Version 6. 1. FASTA (npr., FASTA2 i FASTA3) obezbeđuje poređenja i procentualnu sekvencijalnu identičnost regiona najboljeg preklapanja između ponuđenih i traženih sekvenci. (Pearson, Methods Enzymol. 183: 63-98 (1990), Pearson, Methods Mol. Biol. 132: 185-219 (2000)). Drugi poželjan algoritam za poređenje sekvence iz pronalaska sa bazom podataka koja sadrži veliki broj sekvenci iz različitih organizama je kompjuterski program BLAST, posebno blastp ili tblastn, uz korišćenje njegovih standardnih parametara. Videti, npr., Altschul et al., JMol Biol 215: 403-410 (1990), Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-402 (1997), ovde inkorporisane referencom.
Dužina polipeptidnih sekvenci koje se upoređuju na homologiju će generalno imati ostatke od bar oko 16 aminokiselina, obično bar oko 20 aminokiselina, još češće bar oko 24 aminokiselina, tipično bar oko 28 aminokiselina, a poželjno više od oko 35 aminokiselina. U pretraživanju baze podataka koja sadrži sekvence iz velikog broja različitih organizama, poželjno je da se porede aminokiselinske sekvence.
Kao što se ovde koriste, termini "obeleživač" ili "obeležen" se odnose na ugrađivanje nekog drugog molekula u antitelo. U jednom izvođenju, obeleživač je detektabilni marker, npr., ugrađivanje radioaktivne aminokiseline ili vezivanje za polipeptid biotinil grupa koje se mogu detektovati obeleženim avidinom (npr., streptavidin koji sadrži fluorescentni marker ili enzimsku aktivnost koja se može detektovati optičkim ili koLorimetrijskim metodama). U jednom drugom izvođenju, obeleživač ili marker može biti terapijski, npr., konjugat leka ili toksin. U struci su poznate i mogu se koristiti različite metode obeležavanja polipeptida i glikoproteina. Primeri obeleživača za polipeptide uključuju, ali nisu ograničeni na, sledeće: radioizotopi ili rađionuklidi (npr., 3H, 14C, 15N, 35S, 99Tc, 111In, 125I, 131I), fluorescentni obeleživači (npr., FITC, rodamin, fosfolantanidi), enzimski obeleživači (npr., peroksidaza iz rena, p-galaktozidaza, luciferaza, alkalna fosfataza), hcmiluminescentni markcri, biotinil grupe, unapred određeni polipeptidni epitopi koje prepoznaje sekundarni reporter (npr., par sekvenci leucinskog rajsferšlusa, vezivna mesta za sekundama antitela, domeni za vezivanje metala, epitopske oznake), magnetni agensi, kao što su gadolinijum helati, toksini kao što su pertusis toksin, taksol, citohalazin B, gramicidin D, etidijum bromid, emetin, mitomicin, etoposid, tenoposid, vinkristin, vinblastin, kolhicin, doksombicin, daunorubicin, dihidroksi antracin dion, mitoksantron, mitramicin, aktinomicin D, 1-deliidrotestosteron, glukokortikoidi, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol i puromicin i njihovi analozi ili homolozi. U nekim izvođenjima, obeleživači su prikačeni pomoću lanaca-nosača različitih dužina da bi se smanjile potencijalne sterične smetnje
Termin pacijent uključuje humane i veterinarske subjekte.
Kroz ovu ćelu prijavu i zahteve, podrazumeva se da reč “obuhvata” ili varijacije kao što su "obuhvataju” ili "obuhvatajući” implicira uključivanje navedenog entiteta ili grupe entiteta, ali ne isključivanje bilo kog drugog entiteta ili grupe entiteta.
Humana antitela na CD40 i njihova karakterizacija
Humana antitela nemaju određene probleme koje imaju antitela sa varijabilnim i/ili konstantnim regionima životinjskog porekla (npr., glodarskog). Takvi problemi uključuju brzo nestajanje (clearance) antitela ili imunski odgovor na antitelo. Prema tome, u jednom izvođenju, pronalazak obezbeđuje humanizovana antitela na CD40. U jednom drugom izvođenju, pronalazak obezbeđuje humana antitela na CD40. U nekim izvođenjima, humana antitela na CD40 se proizvode imunizacijom glodara čiji genom sadrži humane imunoglobulinske gene, tako da glodar proizvodi humana antitela. Očekuje se da humana antitela na CD40 minimizuju imunogene i alergijske odgovore intrinsične monoklonskim antitelima dobijenim iz drugih izvora (Mabs) i da time povećavaju efikasnost i bezbednost administriranih antitela. Može da se očekuje da upotreba potpuno humanih antitela omogućuje suštinsku prednost u lečenju hroničnih i rekurentnih humanih oboljenja, kao što su upala i kancer, koja mogu da zalitevaju ponavljano davanje antitela.
Pronalazak obezbeđuje jedanaest aktivirajućih humanih monoklonskih antitela na CD40 (mAbs) i ćelijske linije hibridoma koje ih proizvode. U Tabeli A je lista identifikatora sekvenci (SEQ ID NOS: ) nukleinskih kiselina koje kodiraju ćelu dužinu (uključujući čeonu sekvencu), odgovarajuću ćelu dužinu sekvenci izvedenih aminokiselina i nukleotidne i izvedene aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona teških i lakih lanaca.
Tabela A
HUMANA ANTITELA NA CD40
Pronalazak još obezbeđuje humana anti-CD40 mAb 23. 25. 1 i ćelijsku liniju hibriđoma koja ga proizvodi.
Pronalazak dalje obezbeđuje varijante teških i/ili lakih lanaca nekih od gore nabrojanih humanih anti-CD40 mAb, koje sadrže jednu ili više aminokiselinskih supstitucija. Pronalazak obezbeđuje dve varijante teških lanaca mAb 3. 1. 1. U jednoj, alanin na ostatku 78 je zamenjen treoninom. U drugoj, alanin na ostatku 78 je zamenjen treoninom, a valini na ostacima 88 i 97 su zamenjeni alaninima. Pronalazak takođe obezbeđuje varijantu lakog lanca mAb 3. 1. 1 u kojoj su leucin na ostatku 4 i leucin na ostatku 83 zamenjeni metioninom odnosno valinom. Kombinacija sa varijantom teškog ili lakog lanca sa prirodnim lakim ili teškim lancem, respektivno, je određena mutantnim lancem. Na taj način, antitelo koje sadrži prirodan lak lanac i čiji težak lanac sadrži mutaciju alanina u treonin na ostatku 78, označen je kao 3. 1. 1H-A78T. Međutim, u druga izvođenja pronalaska uključena su i antitela sa bilo kojom kombinacijom varijanti teškog i lakog lanca iz 3. 1. 1.
Dalje, pronalazak obezbeđuje varijantu teškog lanca mAb 22. 1. 1 u kojoj je cistein na ostatku 109 zamenjen alaninom. Monoklonsko antitelo koje sadrži varijantu teškog lanca i 22. 1. 1 lak lanac označeno je kao mAb 22. 1. 1 H-C109A. Pronalazak dalje obezbeđuje dve varijante teških lanaca i varijantu lakog lanca mAb 23. 28. 1. U jednoj varijanti teškog lanca, asparaginska kiselina na ostatku 16 je zamenjena glutaminskom kiselinom. mAb koje sadrži varijantu teškog lanca i 23. 28. 1 lak lanac označeno je kao 23. 28. 1 H-D16E. Pronalazak takođe uključuje varijantu lakog lanca 23. 28. 1 u kojoj je cistein na ostatku 92 zamenjen alaninom. mAb koje sadrži 23. 28. 1 težak lanac i varijantu lakog lanca označeno je kao 23. 28. 1 L C92A. Pronalazak takode obezbeđuje mAb koja sadrže bilo koju od varijanti 23. 28. 1 teškog lanca i varijantu 23. 28. 1 lakog lanca.
Lak lanac koji je proizveo hibridom 23. 29. 1 sadrži mutaciju u konstantnom regionu na ostatku 174. Lak lanac koji je proizveo hibridom ima arginin na ovoj poziciji umesto kanoničnog lizina. U skladu s tim, pronalazak takođe obezbeđuje 23. 29. 1 lak lanac sa kanoničnim lizinom na ostatku 174 i mAb, označeno kao 23. 29. 1L-R174K, koje sadrži 23. 29. 1 težak lanac i varijantu lakog lanca.
U poželjnom izvođenju, antitelo na CD40 je 3. 1. 1, 3. 1. 1H-A78T, 3. 1. 1H-A78T-V88A-V97A, 3. 1. 1L-L4M-L83V, 7. 1. 2, 10. 8. 3, 15. 1. 1, 21. 4. 1, 21. 2. 1, 22. 1. 1, 22. 1. 1H-C109A, 23. 5. 1, 23. 25. 1, 23. 28. 1, 23. 28. 1H-D16E, 23. 28. 1L-C92A, 23. 29. 1, 23. 29. 1M1174K i 24. 2. 1. U nekim izvođenjima, antitelo na CD40 sadrži lak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine: SEQ ID NO: 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64, 72, 80, 88, 94, 100 ili 102 ili njihov varijabilni region, ili koju kodira sekvenca nukleinske kiseline odabrane iz SEQ ID NO: 7, 15, 23, 31, 39, 47, 55, 63, 71, 79, 87, 93, 99 ili 101. U nekim izvođenjima, antitelo na CD40 sadrži lak lanac koji sadrži najmanje CDR2 iz jednog od nabrojanih antitela, jednu od navedenih aminokiselinskih sekvenci (kao što je pokazano na Sl. 1A-1C i 2A-2C) ili neku koju kodira jedna od gore identiflkovanih sekvenci nukleinskih kiselina. U jednom drugom izvođenju, lak lanac dalje sadrži CDR1 i CDR3 nezavisno odabrane iz varijabilnog regiona lakog lanca koji sadrži ne više od deset amino kiselina iz aminokiselinske sekvence kodirane embrionskini genom za VkA3/A19, L5 ili A27, ili sadrži CDR1 i CDR3 nezavisno odabrane od jednog od CDR1 i CDR3 (1) antitela odabranog iz 3. 1. 1, 3. 1. 1L-L4M-L83V, 7. 1. 2, 10. 8. 3, 15. 1. 1, 21. 4. 1, 21. 2. 1, 22. 1. 1, 23. 5. 1, 23. 25. 1, 23. 28. 1, 23. 28. 1L-C92A, 23. 29. 1, 23. 29. 1L-R174K ili 24. 2. 1; (2) aminokiselinske sekvence iz SEQ ID NO: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94, 100 ili 102 ili (3) kodirane sekvencom nukleinske kiseline iz SEQ ID NO: 3, 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 93, 99 ili 101.
U jednom drugom poželjnom izvođenju, antitelo na CD40 sadrži težak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz SEQ ID NOS: 6, 14, 22, 30, 38, 46, 54, 62, 70, 78 ili 86 ili iz njenog varijabilnog regiona ili kodiranu sekvencom nukleinske kiseline iz SEQ ID NOS; 5, 13, 21, 29, 37, 45, 53, 61, 69, 77 ili 85. U nekim izvođenjima, antitelo na CD40 sadrži težak lanac koji sadrži bar CDR3 iz jednog od nabrojanih antitela, jedne od gore identifikovanih aniinokiselinskih sekvenci (kao što je pokazano na Sl. 1A-1C i 2A-2C) ili koji je kodiran jednom od gore identifikovanih sekvenci nukleinske kiseline. U jednom drugom izvođenju, težak lanac dalje sadrži CDR1 i CDR2 nezavisno odabrane od varijabilnih regiona teškog lanca koji sadrži ne više od osamnaest aminokiselina iz aminokiselinske sekvence kodirane embrionskim genom za VH 3-30+, 4-59, 1-02, 4. 35 ili 3-30. 3, ili sadrži CDR1 i CDR2 nezavisno odabrane od jednog od CDR1 i CDR2 (1) antitela odabranog iz 3. 1. 1, 3. 1. 1H-A78T, 3. 1. 1H-A78T-V88A-V97A, 7. 1. 2, 10. 8. 3, 15. 1. 1, 21. 4. 1, 21. 2. 1, 22. 1. 1, 22. 1. 1H-C109A, 23. 5. 1, 23. 25. 1, 23, 28. 1, 23. 28. 1H-D16E, 23. 29. 1 i 24. 2. 1; (2) aminokiselinske sekvence iz SEQ ID NO: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 ili 98 ili (3) kodiranih sekvencom nukleinske kiseline iz SEQ ID NO: 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 91, 95 ili 97. U jednom drugom izvođenju, antitelo na CD40 sadrži težak lanac i lak lanac kao što su definisani gore.
Kao što se ovde koristi, antitelo 3. 1. 1H-A78T je identično onom iz 3. 1. 1, osim što je 78. aminokiselina teškog lanca treonin umesto alanina. Slično, u antitelu 3. 1. 1H-A78T-V88A-V97A, ostatak 78 je zamenjen sa A, a na mestima 88 i 97 alanin zamenjuje valin u teškom lancu. Antitelo 3. 1. 1L-L4M-L83V je identično onom iz 3. 1. 1, osim što je u lakom lancu na mestu 4 metionin umesto leucina, a na mestu 83 je valin umesto leucina. Antitelo 22. 1. 1H-C109A je identično onom iz 22. 1. 1, osim što je ostatak 109 teškog lanca zamenjen alaninom umesto cisteina. Antitela 23. 28. 1H-D16E i 23. 28. 1L-C92A su identična onom iz 23. 28. 1, osim što je aspartat na 16. mestu teškog lanca zamenjen glutamatom, a cistcin na mestu 92 lakog lanca zamenjen alaninoni. Antitelo 23. 29. 1L-R174K je identično onom iz 23. 29. 1, osim što je arginin na mestu 174 lakog lanca zamenjen lizinom.
Klasa i podklasa antitela na CD40
Klasa i podklasa antitela na CD40 mogu biti određene bilo kojim metodom poznatim u struci. U opštem slučaju, klasa i podklasa antitela mogu da se odrede pomoću antitela koja su specifična za određenu klasu i podklasu antitela. Takva antitela su dostupna komercijalno. Klasa i podklasa mogu da se odrede pomoću ELISA ili Westem Blot, kao i drugim tehnikama. Alternativno, klasa i podklasa mogu da se odrede sekvenciranjem svili ili dela konstantnih domena teških i/ili lakih lanaca antitela, upoređujući njihove aminokiselinske sekvence sa poznatim aminokiselinskim sekvencama različitih klasa i podklasa imunoglobulina i određujući klasu i podklasu antitela.
U nekim izvođenjima, antitelo na CD40 je monoklonsko antitelo. Antitelo na CD40 može biti IgG, IgM, IgE, IgA ili IgD molekul. U jednom poželjnom izvođenju, antitelo na CD40 je IgG i IgGl, IgG2, IgG3 ili IgG4 podklasa. U jednom drugog poželjnom izvođenju, antitela na CD40 su podklasa IgG2.
Vrste i molekulska selektivnost
U jednom drugom aspektu pronalaska, antitela na CD40 ispoljavaju i molekulsku selektivnost i selektivnost vrste. U nekim izvođenjima, antitelo na CD40 se vezuje za CD40 primata i Čoveka. U nekim izvođenjima, antitelo na CD40 se vezuje za CD40 čoveka, cinomolgusa ili rezusa. U drugim izvođenjima, antitelo na CD40 se ne vezuje za mišji, pacovski, pseći ili zečji CD40, Sledeći uputstva iz specifikacije, može se odrediti selektivnost vrste za antitelo na CD40 koristeći metode dobro poznate u struci. Na primer, može se odrediti selektivnost vrste koristeći Westem blot, FACS, ELISA ili RIA. (Viđeti, npr., Primer IV. )
U nekim izvođenjima, antitelo na CD40 ima selektivnost za CD40 koja je više od 100 puta veća nego njegova selektivnost za RANK (aktivator receptora jedamog faktora-kapa B), 4-1BB (CD137), TNFR-1 (receptor-1 faktora nekroze tumora) i TNFR-2 (Receptor-2 tumor necrosis faktora). U nekim izvođenjima, antitelo na CD40 ne pokazuje nikakvo naročito specifično vezivanje za bilo koji drugi protein osim za CD40. Može se odrediti selektivnost antitela na CD40 za CD40 koristeći metode dobro poznate u struci sledeći uputstva iz specifikacije. Na primer, može se odrediti selektivnost koristeći Westem blot, FACS, ELISA ili RIA. (Videti, npr., Primer V. )
Identifikacija CD40 epitopa koie ie prepoznalo antitelo na CD40
Dalje, pronalazak obezbeđuje humano monoklonsko antitelo na CD40 koje vezuje CD40 i unakrsno kompetira za i/ili se vezuje za isti epitop i/ili se vezuje za CD40 sa istom Kd kao humano antitelo na CD40 odabrano između antitela 3. 1. 1, 3. 1. 1H-A78T, 3. 1. 1H-A78T-V88A-V97A, 3. 1. 1L-L4M-L83V, 7. 1. 2, 10. 8. 3, 15. 1. 1, 21. 4. 1, 21. 2. 1, 22. 1. 1, 22. 1. 1H-C109A, 23. 5. 1, 23. 25. 1, 23. 28. 1, 23. 28. 1H-D16E, 23. 28. 1L-C92A, 23. 29. 1, 23. 29. 1L-R174K i 24. 2. 1; ili humano antitelo na CD40 koje sadrži varijabilni region teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SBQ ID NO: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 ili 98 ili humano antitelo na CD40 koje sadrži varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94, 100 i 102.
Može se odrediti da li se antitelo vezuje za isti epitop ili unakrsno kompetira za vezivanje za antitelo na CD40 pomoću bilo koje metode poznate u struci. U jednom izvođenju, može se dozvoliti antitelu na CD40 iz pronalaska da se veže za CD40 u uslovima zasićenja, a onda meriti sposobnost testiranog antitela da se veže za CD40. Ako je testirano antitelo sposobno da se veže za CD40 u isto vreme kad i antitelo na CD40, onda se testirano antitelo vezuje za različit epitop nego što se vezuje antitelo na CD40. Međutim, ako testirano antitelo nije sposobno da se veže za CD40 u isto vreme, onda se testirano antitelo vezuje za isti epitop, za epitop koji se preklapa ili za epitop koji je u bliskom susedstvu epitopa vezanog za humano antitelo na CD40. Ovaj eksperiment se može izvesti pomoću ELISA, RIA, FACS ili površinske plazmonske rezonance. (Videti, npr., Primer VI. ) U poželjnom izvođenju, eksperiment se izvodi pomoću površinske plazmonske rezonance. U poželjnijem izvođenju, koristi se BIAcore.
Afinitet vezivanja antitela na CD40 za CD40
U nekim izvođenjima pronalaska, antilelo na CD40 se vezuje za CD40 sa visokim afinitetom. U nekim izvođenjima, antitelo na CD40 se vezuje za CD40 sa Kd - 2 x 10-8 M ili manjom. U drugom poželjnom izvođenju, antitelo se vezuje za CD40 sa KD 2 x 10-9, 2 x 10-10, 4, 0 x 10-11 M ili manjom. U još poželjnijem izvođenju, antitelo se vezuje za CD40 sa KD 2, 5 x 10-12 M ili manjom. U nekim izvođenjima, antitelo se vezuje za CD40 sa suštinski istom KD kao antitelo odabrano među 3. 1. 1, 3. 1. 1H-A78T, 3, 1. 1H-A78T-V88A-V97A, 3. 1. 1L-L4M-L83V, 7. 1. 2, 10. 8. 3, 15. 1. 1, 21. 4. 1, 21. 2. 1, 22. 1. 1, 22. 1. 1H-CI09A, 23. 5. 1, 23. 25. 1, 23. 28. 1, 23. 28. 1H-D16E, 23. 28. 1L-C92A, 23. 29. 1, 23. 29. 1L-R174K ili 24. 2. 1. U jednom drugom poželjnom izvođenju, antitelo se vezuje za CD40 sa suštinski istom Kn kao antitelo koje sadrži CDR2 lakog lanca i/ili CDR3 teškog lanca iz antitela odabranog među 3. 1. 1, 3. 1. 1 H-A78T, 3. 1. 1H-A78T-V88A-V97A, 3. 1. 1L-L4M-L83V, 7. 1. 2, 10. 8. 3, 15. 1. 1, 21. 4. 1, 21. 2. 1, 22. 1. 1, 22. 1. 1H-C109A, 23. 5. 1, 23. 25. 1, 23. 28. 1, 23. 28. 1H-D16E, 23. 28. 1L-C92A, 23. 29. 1, 23. 29. 1L-R1 74K i 24. 2. 1. A u još jednom drugom poželjnom izvođenju, antitelo se vezuje za CD40 sa suštinski istom Kd kao antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ED NO: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 ili 98 ili koje sadrži lak lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94, 100 ili 102. U jednom drugom poželjnom izvođenju, antitelo se vezuje za CD40 sa suštinski istom Kd kao antitelo koje sadrži CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca koji ima aminokiseliiisku sekvencu iz SEQ ID NOS: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94, 100 ili 102 ili CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ED NOS: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 ili 98.
U nekim izvođenjima, antitelo na CD40 ima malu brzinu disocijacije. U nekim izvođenjima, antitelo na CD40 ima Koff 2, 0 x 10-4 ili manju. U nekim izvođenjima, Koff je 2, 0 x 10-7 ili manja. U nekim izvođenjima, Koff je suštinski ista kao kod ovde opisanog antitela, uključujući antitelo odabrano među 3. 1. 1, 3. 1. 1H-A78T, 3. 1. 1H-A78T-V88A-V97A, 3. 1. 1L-L4M-L83V, 7. 1. 2, 10. 8. 3, 15. 1. 1, 21. 4. 1, 21. 2. 1, 22. 1. 1, 22. 1. 1H-C109A, 23. 5. 1, 23. 25. 1, 23. 28. 1, 23. 28. 1H-D16E, 23. 28. 1L-C92A, 23. 29. 1, 23. 29. 1L-R174K i 24. 2. 1. U nekim izvođenjima, antitelo na CD40 se vezuje za CD40 sa suštinski istom Koff- kao antitelo koje sadrži CDR3 teškog lanca ili CDR2 lakog lanca iz antitela odabranog među 3. 1. 1, 3. 1. IH-
A78T, 3. 1. 1H-A78T-V88A-V97A, 3. 1. 1L-L4M-L83V, 7. 1. 2, 10. 8. 3, 15. 1. 1, 21. 4. 1, 21. 2. 1, 22. 1. 1, 22. 1. 1H-CI09A, 23. 5. 1, 23. 25. 1, 23. 28. 1, 23. 28. 1H-D16E, 23. 28. 1L-C92A, 23. 29. 1, 23. 29. 1L-R174K i 24. 2. 1. U nekim izvođenjima, antitelo na CD40 se vezuje za CD40 sa suštinski istom K^rr kao antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu iz SEQID NOS: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 ili 98 ili koje sadrži varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94, 100 ili 102. U jednom drugom poželjnom izvođenju, antitelo na CD40 se vezuje za CD40 sa suštinski istom Koff- kao antitelo koje sadrži CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94, 100 ili 102 ili CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 6, 14, 22, 30, 38, 46, 54, 62, 70, 78, 86, 90, 92, 96 ili 98.
Afinitet vezivanja i brzina disocijacije antitela na CD40 za CD40 mogu da se odrede bilo kojom metodom poznatom u struci. Afinitet vezivanja može da se meri pomoću kompetitivnih ELISA, RIA ili pomoću površinske plazmonske rezonance, kao što je BIAcore. Brzina disocijacije se takođe može meriti površinskom plazmonskom rezonancom. Poželjno je da se afinitet vezivanja i brzina disocijacije mere pomoću površinske plazmonske rezonance. Poželjnije je da se afinitet vezivanja i brzina disocijacije mere pomoću BTAcore™. Videti, npr., Primer XIV,
Upotreba gena za lake i teške lance
Antitelo na CD40 iz ovog pronalaska može da sadrži humani kapa ili humani lambda lak lanac ili aminokiselinsku sekvencu izvedenu iz njega. U nekim izvođenjima koja sadrže kapa lak lanac, varijabilni domen lakog lanca (Vl) delimično kodira humani gen za A3/A19 (DPK-15), L5 (DP5), ili A27 (DPK-22) Vk.
U nekim izvođenjima, Vl antitela na CD40 sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija u odnosu na embrionsku aminokiselinsku sekvencu. U nekim izvođenjima, Vl antitela na CD40 sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 aminokiselinskih supstitucija u odnosu na embrionsku aminokiselinsku sekvencu. U nekim izvođenjima, jedna ili više ovih supstitucija iz embriona je u CDR regionima Lakog lanca. U nekim izvođenjima, aminokiselinske supstitucije u odnosu na embrion su na jednoj ili vise istih pozicija kao supstitucije u odnosu na embrion bilo u kom, jednom ili više, Vl antitela 3. 1. 1, 3. 1. 1L-L4M-L83V, 7. 1. 2, 10. 8. 3,
15. 1. 1, 21. 4. 1, 21. 2. 1, 22. 1. 1, 23. 5. 1, 23. 25. 1, 23. 28. 1, 23. 28. 1L-C92A, 23. 29. 1, 23. 29. 1L-R174K i 24. 2. 1. Na primer, Vl antitela na CD40 može da sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija u poređenju sa embrionskim nađenim u antitelu 21. 4. 1 i druge aminokiselinske supstitucije u poređenju sa embrionskim nađenim u antitelu 10. 8. 3, koje koristi isti gen za VK kao antitelo 21. 4. 1. U nekim izvođenjima, aminokiselinske promene su na jednoj ili više istih pozicija, ali uključuju različitu mutaciju od one u referentnom antitelu.
U nekim izvođenjima, aminokiselinske promene u odnosu na embrionske se javljaju na jednoj ili više istih pozicija kao u bilo kom od Vl antitela 3. 1. 1, 3. 1. 1L-L4M-L83V, 7. 1. 2, 10. 8. 3, 15. 1. 1, 21. 4. 1, 21. 2. 1, 22. 1. 1, 23. 5. 1, 23. 25. 1, 23. 28. 1, 23. 28. 1L-C92A, 23. 29. 1, 23. 29. 1L-R174K i 24. 2. 1, ali promene mogu da predstavljaju konzervativne aminokiselinske supstitucije na takvoj poziciji(-ama) relativnoj (-im) u odnosu na aminokiselinu u referentnom antitelu. Na primer, ako je određena pozicija u jednom od ovih antitela promenjena u odnosu na embrionsku i ako je to glutamat, može se konzervativno supstituisati aspartatom na tom mestu. Slično, ako je aminokiselinska supstitucija u odnosu na embrionsku serin, serin se može konzervativno supstituisati treoninom na tom mestu. Konzervativne aminokiselinske supstitucije su diskutovane supra.
U nekim izvođenjima, lak lanac humanog antitela na CD40 sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je ista kao aminokiselinska sekvenca Vl antitela 3. 1. 1 (SEQ. ID NO: 4), 3. 1. 1L-L4M-L83V (SEQ ED NO: 94), 7. 1. 2 (SEQ. ID NO: 12), 10. 8. 3 (SEQ. ID NO: 20), 15. 1. 1 (SEQ. ID NO: 28), 21. 4. 1 (SEQ. ID NO: ), 21. 2. 1 (SEQ. ID NO: 36), 21. 4. 1 (SEQ ID NO: 44), 22. 1. 1 (SEQ. ID NO: 52), 23. 5. 1 (SEQ. ID NO: 60), 23. 28. 1 (SEQ. ID NO: 68), 23. 28. IL-C92A (SEQ. ID NO: 100), 23. 29. 1 (SEQ. ID NO: 76), 23. 29. 1L-R174K (SEQ ID NO: 102) ili 24. 2. 1 (SEQ. ID NO: 84) ili pomenuta aminokiselinska sekvenca ima do 1, 2, 3, 4, 6, 8 ili 10 konzervativnih aminokiselinskih supstitucija i/ili ukupno do 3 nekonzervativne aminokiselinske supstitucije.
U nekim izvođenjima, lak lanac humanog antitela na CD40 sadrži bar CDR2 lakog lanca, a može da sadrži i CDR1 i CDR3 regione embrionske sekvence, kao što je ovde opisano. U jednom drugom izvođenju, lak lanac može da sadrži CDR1 i CDR2 antitela nezavisno odabranog među 3. 1. 1, 3. 1. 1L-L4M-L83V, 7. 1. 2, 10. 8. 3, 15. 1. 1, 21. 4. 1, 21. 2. 1, 22. 1. 1, 23. 5. 1, 23. 25. 1, 23. 28. 1, 23. 28. 1L-C92A, 23. 29. 1 i 24. 2. 1 ili CDR regione od kojih svaki ima manje od 8, manje od 6, manje od 4 ili manje od 3 konzervativne aminokiselinske supstitucije i/ili ukupno tri ili manje nekonzervativnih aminokiselinskih supstitucija. U drugim izvođenjima, lak lanac antitela na CD40 sadrži bar CDR2 lakog lanca, a može da sadrži i CDR1 i CDR3 regione, od kojih je svaki nezavisno odabran od CDR1 i CDR3 regiona antitela koje ima varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz SEQ ID NOS: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94 i 100 ili koju kodira molekul nukleinske kiseline odabran iz SEQ ID NOS: 3, 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 93 i 99.
U odnosu na težak lanac, u nekim izvođenjima, aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca kodira delimično humani gen za VH3-30+, Vh 4-59, VH 1-02, Vh 4, 35 ili VH 3-30, 3. U nekim izvođenjima, Vh antitelo na CD40 sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, delecija ili insercija (adicija) u odnosu na embrionsku aminokiselinsku sekvencu. U nekim izvođenjima, varijabilni domen teškog lanca sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ili 18 mutacija iz embrionske aminokiselinske sekvence. U nekim izvođenjima, mutacija(e) je (su) nekonzervativna(e) supstitucija(e) u poređenju sa embrionskom aminokiselmskom sekvencom. U nekim izvođenjima, mutacije su u CDR regionima teškog lanca. U nekim izvođenjima, aminokiselinske promene su urađene na jednoj ili više istih pozicija kao mutacije bilo u kom embrionskom, jednom ili više, Vh antitela 3. 1. 1, 3. 1. 1H-A78T, 3. 1. 1H-A78T-V88A-V97A, 7. 1. 2, 10. 8. 3, 15. 1. 1, 21. 4. 1, 21. 2. 1, 22. 1. 1, 22. 1. 1H-C109A, 23. 5. 1, 23. 25. 1, 23. 28. 1, 23. 28. 1H-D16E, 23. 29. 1 i 24. 2. 1. U drugim izvođenjima, aminokiselinske promene su na jednoj ili vise istih pozicija, ali uključuju različitu mutaciju od one u u referentnom antitelu.
U nekim izvođenjima, težak lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena (VH) antitela 3. 1. 1 (SEQ ID NO: 2), 3. 1.1H-A78T (SEQ ID NO: 90), 3. 1. 1H-A78T-V88A-V97A (SEQ ID NO: 92), 7. 1. 2 (SEQ ID NO: 10), 10. 8. 3 (SEQ ID NO: 18), 15. 1. 1 (SEQ ID NO: 26), 21. 2, 1 (SEQ ID NO: 34), 21. 4. 1 (SEQ ID NO: 42), 22. 1. 1 (SEQED NO: 50), 22. 1. 1H-C109A (SEQ ID NO: 96), 23. 5. 1 (SEQID NO: 58), 23. 28. 1 (SEQ ID NO: 66), 23. 28. 1H-D16E (SEQ ID NO: 98), 23. 29. 1 (SEQID NO: 74) i 24. 2. 1 (SEQED NO: 82), ili pomenuta aminokisetinska sckvenca iina do 1, 2, 3, 4, 6, 8 ili 10 konzervativnih aminokiselinskih supstitucija i/ili ukupno do 3 nekonzervativne aminokiselinske supstitucije.
U nekim izvođenjima, težak lanac sadrži CDR1, CĐR2 i CDR3 regione teškog lanca antitela 3. 1. 1, 3. 1. 1H-A78T, 3. I. 1H-A78T-V88A-V97A, 7. 1. 2, 10. 8. 3, 15. 1. 1, 21. 4. 1, 21. 2. 1, 22. 1. 1, 22. 1. 1H-C109A, 23. 5. 1, 23. 25. 1, 23. 28. 1, 23. 28. 1H-D16E, 23. 29. 1 i 24. 2. 1 (kao što je pokazano na Sl. 1D-1H ili 2D-2H), ili navedene CDR regione od kojih svaki ima manje od 8, manje od 6, manje od 4 ili manje od 3 konzervativne aminokiselinske supstitucije i/ili ukupno 3 ili manje nekonzervativne aminokiselinske supstitucije.
U nekim izvođenjima, težak lanac sadrži CDR3, a može da sadrži i CDR1 i CDR2 regione embrionske sekvence, kao što je opisano gore, ili može da sadrži CDR1 i CDR2 antitela, od kojih je svako nezavisno odabrano od antitela koja sadrže težak lanac antitela odabranog od 3. 1. 1, 3. UH-A78T, 3. 1. 1H-A78T-V88A-V97A, 7. 1. 2, 10. 8. 3, 15. 1. 1, 21. 4. 1, 21. 2. 1, 22. 1. 1, 22. 1. 1H-C109A, 23. 5. 1, 23. 25. 1, 23. 28. 1, 23. 28. 1H-D16E, 23. 29. 1 i 24. 2. 1. U jednom drugom izvođenju, težak lanac sadrži CDR3, a može da sadrži i CDR1 i CDR2 regione, od kojih je svaki nezavisno odabran od CDR1 i CDR2 regiona varijabilnih regiona teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz SEQ ID NOS: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 i 98 (kao što je pokazano na Sl. 1D-1H ili 2D-2H) ili koji kodira sekvenca nukleinske kiseline odabrana iz SEQ ID NOS: 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 91, 95 i 97. U jednom drugom izvođenju, antitelo sadrži težak lanac kao što je izloženo gore i lak lanac kao što je izloženo gore.
Jedan tip aminokiselinske supstitucije koji može da se uradi je da se promeni jedan ili više cisteina u antitelu, koji mogu biti hemijski reaktivni, drugim ostatkom kao što je, bez ograničenja, alanin ili serin. U jednom izvođenju, supstitucija cisteina je urađena u okvirnom regionu varijabilnog domena ili u konstantnom domenu antitela. U jednom drugom izvođenju, cistein je u nekanoničnom regionu antitela. Drugi tip aminokiselinske supstitucije koji može da se uradi je da se zameni bilo koje proteolitičko mesto u antitelu, naročito ona koja su u okvirnom regionu varijabilnog domena, u konstantnom domenu antitela ili u nekanoničkom regionu antitela. Supstitucija cisteinskih ostataka i uklanjanje proteolitičkih mesta može da smanji rizik od bilo kakve heterogenosti u proizvodu antitela i time poveća njegovu homogenost. Drugi tip aminokiselinske supstitucije je da se eliminišu parovi asparagin-glicin, koji obrazuju potencijalna mesta dezamidacije, menjanjem jednog ili oba ostatka. Poželjno je da se ovo radi u okvirnim regionima, konstantnom domenu ili u nekanoničkim regionima antitela.
Aktivacija CP40 pomoću antitela na CD40
Jedan drugi aspekt ovog pronalaska uključuje antitelo na CD40 koje je aktivirajuće antitelo, tj., CD40 agonist. Aktivirajuće antitelo amplifikuje ili zamenjuje efekte CD40L na CD40. U nekim izvođenjima, aktivirajuće antitelo u suštini imitira CD40L i konkuriše CD40L za vezivanje za CD40. U nekim izvođenjima, antitelo ne konkuriše CD40L za vezivanje za CD40, nego amplifikuje efekat vezivanja CD40L za CD40. U nekim izvođenjima, antitelo na CD40 aktivira CD40 u prisustvu ili odsustvu CD40L.
Inhibicija rasta tumora in vivo pomoću antitela na CD40
Prema nekim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje antitelo na CD40 koje inhibira proliferaciju ćelija tumora in vitro ili rast tumora in vivo.
U nekim izvođenjima, antitelo inhibira rast tumora za najmanje 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%. U nekim izvođenjima, antitelo inhibira rast tumora za 75%. U jednom izvođenju, inhibicija rasta tumora je detektabilna 14 dana posle početnog tretmana antitelom, U drugim izvođenjima, inhibicija rasta tumora je detektabilna 7 dana posle početnog tretmana antitelom. U nekim izvođenjima, jedan drugi antineoplastični agens se daje životinji sa antitelom na CD40m. U nekim izvođenjima, antineoplastični agens dalje inhibira rast tumora. U nekim izvođenjima, antineoplastični agens je adriamicin ili taksol. U nekim izvođenjima, koađministracija antineoplastičnog agensa i antitela na CD40 inhibira rast tumora za najmanje 50%, posle perioda od 22-24 dana od početka tretmana u poređenju sa rastom tumora na netretiranoj životinji.
Indukcija apoptoze antitelima na CD40
Jedan drugi aspekt pronalaska obezbeđuje antitelo na CD40 koje indukuje ćelijsku smrt CD40 pozitivnih ćelija. U nekim izvođenjima, antitelo izaziva apoptozu CD40 pozitivnih ćelija bilo in vivo bilo in vitro.
Pojačavanje ekspresije molekula ćelijske površine
U nekim izvođenjima, antitelo na CĐ40 pojačava ekspresiju površinskih molekula B ćelija, uključujući, ali bez ograničenja, ICAM, MHC-II, B7-2, CD71, CD23 i CD83. U nekim izvođenjima, 1 µg/ml antitela pojačava ekspresiju ICAM u testu na pozitivnu regulaciju površinskih molekula B-ćelija iz pune krvi bar 2 puta ili, poželjnije, bar 4 puta. U nekim izvođenjima, 1 µg/ml antitela pojačava ekspresiju MHC-II u testu na pozitivnu regulaciju površinskih molekula B-ćelija iz pune krvi bar 2 puta ili, poželjnije, bar 3 puta. U nekim izvođenjima, 1 µg/ml antitela pojačava ekspresiju CD23 u testu na pozitivnu regulaciju površinskih molekula B-ćelija iz pune krvi bar 2 puta, ili, poželjnije, bar 5 puta. Videti, npr., Primer VII, Tabela 25.
U nekim izvođenjima, antitelo na CT)40 pojačava ekspresiju površinskih molekula dendritskih ćelija uključujući, ali bez ograničenja, MHC-II, ICAM, B7-2, CD83 i B7-1. U nekim izvođenjima, opseg pozitivne regulacije je sličan opsegu pozitivne regulacije nađenom u B ćelijama. Viđeti, npr., Tabele 25 i 26, infra. U nekim izvođenjima, antitelo preferencijalno pozitivno reguliše ekspresiju površinskih molekula dendritskih ćelija, kakvi su B7-2 i MHC-11, u poređenju sa ekspresijom ovih molekula u B-ćelijama. Videti, npr., Tabelu 27.
Pojačavanje sekrecije ćeliiskih citokina
U nekim izvođenjima, antitelo pojačava ćelijsku sekreciju citokina, uključujući, ali bez ograničenja, IL-8, EL-12, IL-15, IL-18 i IL-23.
U nekim izvođenjima, antitelo pojačava sekreciju citokina u dendritskim ćelijama i adherovanim monocitima. U nekim izvođenjima, proizvodnja citokina se dalje pojačava kostimulacijom sa jednim ili više LPS, IFN-γ ili LL-1β. A u jednom drugom aspektu pronalaska, kostimulacija antitelom sa LPS pojačava proizvodnju IL-12p70 u testu sa dendritskim ćelijama sa EC50 od oko 0, 48 µg/ml. U nekim izvođenjima, antitelo pojačava proizvodnju IL-12p40 u dendritskim ćelijama sa EC50 od oko 0, 21 µg/ml. (Videti, npr., Primer VIII. )
U nekim izvođenjima, antitelo pojačava ćelijsku sekreciju IFN-gama u T ćelijama u testu sa alogenim T ćelijama/dendritskim ćelijama, kao što je opisano u Primem VIII. U nekim izvođenjima, antitelo pojačava sekreciju IFN-gama u testu sa alogenim T ćelijama/dendritskim ćelijama sa EC50 od oko 0, 3 µg/ml. U nekim izvođenjima, antitelo pojačava sekreciju IFN-gama u testu sa alogenim T ćelijama/dendritskim ćelijama sa EC50 od oko 0, 2 µg/ml. U jednom izvođenju, antitelo pojačava sekreciju IFN-gama u testu sa alogenim T ćelijama/dendritskim ćelijama sa EC50 od oko 0, 03 µg/ml.
Metode proizvodnje antitela i imunizaciia ćeliiskih linija koje proizvode antitela
U nekim izvođenjima, imunizovane životinje proizvode humana antitela, pri čemu one u svom genomu imaju neka ili sva mesta humanih imunoglobulinskili teških i lakih lanaca, sa CD40 antigenom. U jednom poželjnom izvođenju, životinja je XenoMouse.
XenoMouse™ miševi su “inženjerisani” sojevi miševa koji sadrže velike fragmente lokusa humanih imunoglobulinskih teških i lakih lanaca i deficijentni su u proizvodnji mišjih antitela. Videti, npr., Green et ah, Nature Genetics 7: 13-21 (1994) i U. S. Patente 5, 916, 771, 5, 939, 598, 5, 985, 615, 5, 998, 209, 6, 075, 181, 6, 091, 001, 6, 114, 598, 6, 130, 364, 6, 162, 963 i 6, 150, 584. Videti takođe WO91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096, WO 96/33735, WO 98/16654, W098/24893, WO 98/50433, WO 99/45031, WO 99/53049, WO 00/09560, i WO 00/037504.
U jednom drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje metod za pravljenje antitela na CD40 iz životinja (osim miševa) imunizovanjem transgenih životinja koje sadrže lokuse humanog imunoglobulina sa antigenom CD40. Takve životinje se mogu proizvoditi pomoću metoda opisanih u gore navedenim dokumentima. Metode izložene u ovim dokumentima mogu da se mođifikuju kao što je opisano u U. S. Patent 5, 994, 619. U poželjnim izvođenjima, životinje su pacovi, ovce, svinje, koze, goveda ili konji.
XenoMouse™ miševi proizvode repertoar potpuno humanih antitela kao kod odraslog čoveka i generišu antigen-specifična humana antitela. U nekim izvođenjima, XenoMouse™ miševi sadrže približno 80% gena humanog repertoara antitela V dobijenih uvođenjem kvaščevih veštačkih hromozomskih fragmenata (YAC) veličine megabaza, sa embrionskim lokusima humanog teškog lanca i kapa lakog lanca. Videti Mendez et al., Nature Genetics 15: 146-156 (1997), Green and Jakobovits, J Exp. Med 188: 483-495 (1998), i W0 98/24893, čija su izlaganja ovde inkorporisana referencama.
U nekim izvođenjima, životinje koje sadrže humane imunoglobulinske gene su životinje koje imaju humani imunoglobulinski "minilokus". U minilokusnom pristupu, egzogeni Ig lokus se podražava inkluzijom individualnih gena iz Ig lokusa. Dakle, od jednog ili više gena za Vh, jednog ili više gena za Dh, jednog ili više gena za Jh, konstantnog domena mi i drugog konstantnog domena (poželjno, konstantnog domena gama) formira se konstrukt za inserciju u životinju. Ovaj pristup je opisan, inter alia, u U. S. Patent Nos. 5, 545, 807, 5, 545, 806, 5, 569, 825, 5, 625, 126, 5, 633, 425, 5, 661, 016, 5, 770, 429, 5, 789, 650, 5, 814, 318, 5, 591, 669, 5, 612, 205, 5, 721, 367, 5, 789, 215, i 5, 643, 763, ovde inkorporisanih referencama.
Prednost minilokusnog pristupa je brzina kojom konstrukti koji uključuju delove Ig lokusa mogu da se generišu i uvedu u životinje. Međutim, potencijalni nedostatak minilokusnog pristupa je što može da ne bude dovoljno imunoglobulinske raznovrsnosti da podrži pun razvoj B-ćelija, tako da proizvodnja antitela može da bude manja.
U jednom drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje metod za pravljenje humanizovanih antitela na CD40. U nekim izvođenjima, životinje se imunizuju CD40 antigenom kao što je opisano niže, u uslovima koji dozvoljavaju proizvodnju antitela. Ćelije koje proizvode antitela se izoluju iz životinja, fuzioniŠu sa mijelomima da bi se napravili hibriđomi i izoluju se nukleinske kiseline koje kodiraju teške i lake lance antitela na CD40 od interesa. Ove nukleinske kiseline se zatim obrađuju pomoću tehnika poznatih stručnjacima, kao što je opisano niže u tekstu, da bi se smanjila količina sekvenci drugog porekla, tj., da bi se dobilo humanizovano antitelo da redukuje imunski odgovor u čoveku.
U nekim izvođenjima, CD40 antigen se izoluje i/ili se prečišćava CD40. U jednom poželjnom izvođenju, CD40 antigen je humani CD40. U nekim izvođenjima, CD40 antigen je fragment CD40. U nekim izvođenjima, fragment CD40 je vanćelijski domen CD40. U nekim izvođenjima, CD40 fragment sadrži bar jedan epitop CD40. U drugim izvođenjima, CD40 antigen je ćelija koja eksprimira ili eksprimira u višku CD40 ili njegov imunogeni fragment na svojoj površini. U nekim izvođenjima, CD40 antigen je CD40 fiizioni protein.
Imunizacija životinja može se raditi bilo kojim metodom poznatom u struci. Videti, npr., Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990. Metodi za imunizaciju životinja, kao što su miševi, pacovi, ovce, koze, svinje, goveda ili konji, su dobro poznati u struci. Videti, npr., Harkrvv and Lane, supra, i U. S. Patent 5, 994, 619. U jednom poželjnom izvođenju, CD40 antigen se daje sa adjuvansom da bi se stimulisao imunski odgovor. Tipični adjuvansi uključuju kompletan ili nekompletan Freund-ov adjuvans, RIBI (muramil dipeptidi) ili ISCOM (imunostimulišući kompleksi). Takvi adjuvansi mogu da štite polipeptid od brzog dispergovanja njegovim sklanjanjem u lokalni depo ili mogu da sadrže supstance koje stimulišu domaćina da luči faktore koji su hemotaktični za makrofage i druge komponente imunskog sistema. Poželjno je da, ako je dat polipeptid, raspored imunizacije uključi dva ili više davanja polipeptida tokom nekoliko neđelja.
Primer I opisuje proizvodnju anti-CD40 monoklonskih antitela.
Proizvodnja antitela i ćelijskih linija koje proizvode antitela
Posle imunizacije životinje CD40 antigenom, antitela i/ili ćelije koje proizvode antitel mogu da se dobiju iz životinje. U nekim izvođenjima, serum koji sadrži antitela na CD40 se đobija iz životinje krvavljenjem ili žrtvovanjem životinje. Serum se može koristiti takav kakav je dobijen iz životinje, iz seruma se može dobiti imunoglobulinska frakcija ili se iz seruma mogu prečistiti antitela na CD40. Stručnjaku uobičajenog nivoa je dobro poznato da će serum ili imunoglobulini dobijeni na ovaj način biti poliklonski. Nedostatak upotrebe poliklonskih antitela dobijenih iz seruma je u tome što je količina antitela koja se mogu dobiti ograničena i što poliklonsko antitelo ima heterogen skup osobina.
U nekim izvođenjima, imortalizovane ćelijske linije koje proizvode antitela se dobijaju iz ćelija izolovanih iz imunizovanih životinja. Posle imunizacije, životinja se žrtvuje i limfni čvor i/ili B ćelije iz slezine se imortalizuju. Metode imortalizovanja ćelija uključuju, ali nisu ograničene na, prenošenje ćelija sa onkogenima, inficiranje ćelija onkogenim virusom, gajenjem ćelija u uslovima koji selektuju imortalizovane ćelije, podvrgavanjem ćelija karcinogenim ili mutagenim jedinjenjima, fuzionisanjem ćelija sa imortalizovanom ćelijom, npr., ćelijom mijeloma i inaktiviranjem gena za supresiju tumora. Viđeti, npr., Harlow and Lane, supra. Ako se koristi fiizionisanje sa ćelijama mijeloma, poželjno je da one ne luče imunoglobulinske polipeptide (ćelijska linija koja nema sekreciju), Imortalizovane ćelije se detektuju pomoću CD40, njegovim delom ili ćelijom koja eksprimira CD40. U jednom poželjnom izvođenju, početno detektovanje se vrši pomoću enzimskog (ELISA) ili radioimunoeseja. Prhner pretrage pomoću ELISA je dat u WO 00/37504, koji je ovde inkorporisan referencom.
Ćelije koje proizvode antitela na CD40, npr., hibridomi, se selektuju, kloniraju i dalje “skrinuju” na željene osobine, uključujući robustan rast, visoku proizvodnju antitela i željene osobine antitela, kao što je điskutovano niže. Hibridomi se mogu umnožavati irt vivo u singenim životinjama, u Životinjama koje nemaju imunski sistem, npr., goli (nude) miševi, ili u kulturi ćelija in vitro. Metode selektovanja, kloniranja i umnožavanja hibriđoma su dobro poznate stručnjaku uobičajenog nivoa.
U jednom poželjnom izvođenju, imunizovana životinja je životinja koja eksprimira humane imunoglobulinske gene i B ćelije slezine se fuzionišu sa ćelijskom linijom mijeloma iz iste životinjske vrste. U poželjnijem izvođenju, imunizovana životinja je XENOMOUSE™, a ćelijska linija mijeloma je mišji mijelom koji nema sekreciju. U još poželjnijem izvođenju, ćelijska linija mijeloma je P3-X63-AG8. 653. Videti, npr., Primer I.
U jednom drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje hibridome koji proizvode humano antitelo na CD40. U jednom poželjnom izvođenju, hibridomi su mišji hibridomi, kao što je opisano gore. U drugim izvođenjima, hibridomi se proizvode u vrsti koja nije ni čovek, ni miš, kao što su pacovi, ovce, svinje, koze, goveda ili konji. U jednom drugom izvođenju, hibridomi su humani hibridomi.
Nukleinske kiseline, vektori, ćelije domaćini i rekombinantne metode pravljenja antitela Nukleinske kiseline
Ovaj pronalazak takođe obuhvata molekule nukleinskih kiselina koji kodiraju antitela na CD40. U nekim izvođenjima, različiti molekuli nukleinskih kiselina kodiraju težak lanac i lak lanac anti-CD40 imunoglobulina. U drugim izvođenjima, isti molekuli nukleinskih kiselina kodiraju težak lanac i lak lanac anti-CD40 imunoglobulina.
U nekim izvođenjima, molebul nukleinske kiseline koji kodira varijabilni domen lakog lanca sadrži humanu gensku sekvencu za A3/A19 (DPK-15), L5 (DP5) ili A27 (DPK-22)Vk ili sekvencu izvedenu iz nje. U nekim izvođenjima, molekul nukleinske kiseline sadrži nukleotidnu sekvencu gena za A3/A19Vk i gena za Jκ1, Jκ2 ili Jκ3 ih sekvence izvedene iz nje. U nekim izvođenjima, molekul nukleinske kiseline sadrži nukleotidnu sekvencu gena za L5Vk i gena za Jκ4. U nekim izvođenjima, molekul nukleinske kiseline sadrži nukleotidnu sekvencu gena za A27Vk i gena za Jκ3.
U nekim izvođenjima, molekul nukleinske kiseline koji kodira lak lanac, kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ih 10 mutacija iz embrionske aminokiselinske sekvence. U nekim izvođenjima, molekul nukleinske kiseline sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira Vl aminokiselinsku sekvencu koja sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 nekonzervativnih aminokiselinskih supstitucija i/ili 1, 2 ili 3 nekonzervativne supstitucije u poređenju sa embrionskom sekvencom. Supstitucije mogu da budu u CDR regionima, okvirnim regionima ili u konstantnom domenu.
U nekim izvođenjima, molekul nukleinske kiseline koji kodira varijabilni domen lakog lanca (VL), kodira VL aminokiselinsku sekvencu koja sadrži jednu ili više mutacija u poređenju sa embrionskom sekvencom koje su identčne sa mutacijama nađenim u Vl jednog od antitela 3.1.1, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.29.1 i 24.2.1. U nekim izvođenjima, molekul nukleinske kiseline kodira najmanje tri aminokiselinske mutacije u poređenju sa embrionskom sekvencom nađenom u Vl jednog od antitela 3,1.1, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1,23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.29.1 i 24.2.1.
U nekim izvođenjima, molekul nukleinske kiseline sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira Vl aminokiselinsku sekvencu monoklonskog antitela 3.1.1 (SEQ ID NO: 4), 3.1.1L-L4M-L83V (SEQ ID NO: 94), 7.1.2 (SEQ NO: 12), 10.8.3 (SEQ ID NO: 20), 15.1.1 (SEQ ID NO: 28), 21.2.1 (SEQID NO: 36), 2.1.4.1 (SEQ ID NO: 44), 22.1.1 (SEQ ED NO: 52), 23.5.1 (SEQ ID NO: 60),23. 28.1 (SEQ1D NO:68), 23.28.1L-C92A (SEQ ID NO: 100), 23.29.1 (SEQ ID NO: 76) ili 24.2.1 (SEQ ED NO:84) ili njen deo. U nekim izvođenjima, navedeni deo sadrži najmanje CDR3 region. U nekim izvođenjima, molekul nukleinske kiseline kodira aminokiselinsku sekvencu CDR lakog lanca pomenutog antitela. U nekim izvođenjima, navedeni deo je kontinuirani deo koji sadrži CDR1-CDR3.
U nekim izvođenjima, molekul nukleinske kiseline sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira aminokiselinsku sekvencu jedne od SEQ ID NOS: 4,12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94 ili 100, ili pomenuta sekvenca nema signalnu sekvencu. U nekim poželjnim izvođenjima, molekul nukleinske kiseline sadrži nukleotidnu sekvencu iz SEQ ID NOS: 3,11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 93 ili 99, ili njen deo, gđe pomenute sekvence mogu da budu bez signalne sekvence.
U nekim izvođenjima, navedeni deo kodira Vl region. U nekim izvođenjima, navedeni deo kodira bar CDR2 region. U nekim izvođenjima, nukleinska kiselina kodira aminokiselinsku sekvencu CDR lakog lanca pomenutog antitela. U nekim izvođenjima, pomcnuti deo kodira kontinuirani region u CDR1-CDR3.
U nekim izvođenjima, molekul nukleinske kiseline kodira Vl aminokiselinsku sekvencu koja je bar 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ili 99% identična sa Vl aminokiselinskom sekvencom bilo kog od antitela 3.1.1, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.29.1 ili 24.2.1, ili VL aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NOS: 4,12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94 ili 100. Molekuli nukleinske kiseline iz pronalaska uključuju nukleinske kiseline koje se hibridizuju u jako strogim uslovima, kao što su oni opisani gore, sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NOS: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94 ili 100, ili koja ima sekvencu nukleinske kiseline iz SEQ ID NOS: 3,11,19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 93 ili 99.
U jednom drugom izvođenju, nukleinska kiselina kodira ćelu dužinu lakog lanca antitela odabranog među 3.1.1, 3.1.1 L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1,
22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K ili 24.2.1, ili lak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NOS: 8, lć, 24, 32, 40, 48, 56, 64, 72, 80, 88, 94,100 ili 102, ili lak lanac koji sadrži mutaciju, kao što je ona izložena ovde. Dalje, nukleinska kiselina može da sadrži nukleotiđnu sekvencu iz SEQ ID NOS: 7, 15, 23, 31, 39, 47, 55, 63, 71, 79 ili 87, ili molekul nukleinske kiseline koji kodira lak lanac koji sadrži mutaciju, kao što je ona izložena ovde.
U jednom drugom poželjnom izvođenju, molekul nukleinske kiseline kodira varijabilni domen teškog lanca (Vn) koji sadrži humanu gensku sekvencu za Vh 3-304-, 4-59,1-02, 4.35 ili 3-30.3 ili sekvencu izvedenu iz nje. U raznim izvođenjima, molekul nukleinske kiseline sadrži humani gen za Vu 3-304-, a gen za D4 (DER3) i humani gen za Ju6; humani gen za Vh 3-30+, humani gen za Dl-26 (DIR5) i humani gen za Jh6; humani gen za Vh 4.35, humani gen za DIR3 i humani gen za JH6; humani gen za VH 4-59, humani gen za D4-23 i humani gen za Jh4; humani gen za VH 1-02, humani gen za DLR1 i humani gen za JH4; humani gen za VH 3-30+, humani gen za D6-19 (DIR3) i humani gen za Jh4; humani gen za Vh 3-30+, humani gen za Dl-1 i humani gen za JH6; humani gen za Vh 3-304-, humani gen za D4-17 i humani gen za Jh6; humani gen za Vh 3-30.3, humani gen za D4-17 i humani gen za Jh6; humani gen za Vh 4-59, humani gen za D4-17(DIR1) i humani gen za Jh5, ili sekvencu izvedenu iz humanih gena.
U nekim izvođenjima, molekul nukleinske kiseline kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, U, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ili 18 mutacija u poređenju sa embrionskom aminokiselinskom sekvencom humanih gena za V, D ili J. U nekim izvođenjima, pomenute mutacije su u VH regionu. U nekim izvođenjima, pomenute mutacije su u CDR regionima.
U nekim izvođenjima, molekul nukleinske kiseline kodira jednu ili više aminokiselinskih mutacija u poređenju sa embrionskom sekvencom koja je identična aminokiselinskim mutacijama nađenim u Vh monoklonskog antitela 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1.23.25.1, 23.28.1,23.28.1H-D16E, 23.29.1 ili 24.2.1. U nekim izvođenjima, nukleinska kiselina kodira bar tri aminokiselinske mutacije u poređenju sa embrionskim sekvencama koje su identične sa bar tri aminokiselinske mutacije nađene u jednom od gore nabrojanih monoklonskih antitela.
U nekim izvođenjima, molekul nukleinske kiseline sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira bar deo Vh aminokiselinske sekvence antitela 3.1.1 (SEQ ID NO: 2), 3.1.1H-A78T (SEQ ID NO: 90), 3.1.1H-A78T-V88A-V97A (SEQ ID NO: 92), 7.1.2 (SEQ ID NO: 10), 10.8.3 (SEQ ID NO:18), 15.1.1 (SEQ ID NO: 26), 21.2.1 (SEQ ID NO: 34), 21.4.1 (SEQ ID NO: 42), 22.1.1 (SEQ ED NO: 50), 22.1.1H-C109A (SEQ ID NO: 96), 23.5.1 (SEQ ID NO: 58), 23.28.1 (SEQ ID NO: 66), 23.28.1H-D16E (SEQ ID NO: 98), 23.29.1 (SEQ ID NO: 74) ili 24.2.1 (SEQ ID NO: 82), ili pomenuta sekvenca ima konzervativne aminokiselinske mutacije i/ili ukupno tri ili manje nekonzervativnih aminokiselinskih supstitucija. U raznim izvođenjima, sekvenca kodira jedan ili više CDR regiona, poželjno CDR3 region, sva tri CDR regiona, susedni deo uključujući CDR1-CDR3, ili ceiokupan Vh region, sa ili bez signalne sekvence.
U nekim izvođenjima, molekul nukleinske kiseline sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira aminokiselinsku sekvencu jedne od SEQ ID NOS: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 ili 98, ili pomenuta sekvenca nema signalnu sekvencu. U nekim poželjnim izvođenjima, molekul nukleinske kiseline sadrži bar deo nukleotidne sekvence iz SEQ ID NO: 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 91, 95 ili 97, ili pomenuta sekvenca nema signalnu sekvencu. U nekim izvođenjima, pomenuti deo kodira VH region (sa ili bez signalne sekvence), CDR3 region, tri CDR regiona ili susedni region uključujući CDR1-CDR3.
U nekim izvođenjima, molekul nukleinske kiseline kodira Vh aminokiselinsku sekvencu koja jc bar 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ili 99% identična sa VH aminokiselinskim sekvencama pokazanim na Sl. 1A-1C ili 2A-2C ili sa Vh aminokiselinskom sekvencom bilo koje od SEQ ID NOS: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 ili 98. Molekuli nukleinske kiseline ovog pronalaska uključuju nukleinske kiseline koje hibriđizuju u vrlo strogim uslovima, kao što su oni opisani gore, sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NOS: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 ili 98, ili koja ima sekvencu nukleinske kiseline iz SEQ ID NOS: 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 91, 95 ili 97. Molekuli nukleinske kiseline ovog pronalaska uključuju molekul nukleinske kiseline koji hibridizuje u vrlo strogim uslovima, kao što su oni opisani gore, sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira Vh opisan u ovom članu.
U jednom drugom izvođenju, nukleinska kiselina kodira ćelu dužinu teškog lanca antitela odabranog među 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H'A78T-V88A-V97A, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.29.1 i 24.2.1, ili težak lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NOS: 6, 14, 22, 30, 38, 46, 54, 62, 70, 78 ili 86, ili težak lanac koji sadrži mutaciju, kao što je neka od mutacija diskutovanih ovde. Dalje, nukleinska kiselina može da sadrži nukleotidnu sekvencu iz SEQ ID NOS: 5, 13, 21, 29, 37, 45, 53, 61, 69, 77, 85 ili 89, ili molekul nukleinske kiseline koji kodira težak lanac sa mutacijom, kao što je neka od mutacija diskutovanih ovde.
Molekul nukleinske kiseline koji kodira težak lanac ili ceo laki lanac antitela na CD40 ili njihove delove može da se izoluje iz bilo kog izvora koji proizvodi takvo antitelo. U raznim izvođenjima, molekuli nukleinske kiseline se izoluju iz B ćelije izolovane iz životinje imunizovane pomoću CD40 ili iz imortalizovane ćelije izvedene iz takve B ćelije koja eksprimira antitelo na CD40. Metode izolovanja iRNK koja kodira antitelo su dobro poznate u struci. Videti, npr., Sambrook et al. iRNK može da se koristi za proizvodnju cDNK za korišćenje u lančanoj reakciji polimerizacije (PCR) ili za kloniranje cDNK gena za antitela. U jednom poželjnom izvođenju, molekul nukleinske kiseline se izoluje iz hibridoma, koji za jednog od svojih partnera u fuzionisanju ima humanu ćeliju koja proizvodi imunoglobulin iz transgene životinje. U još poželjnijem izvođenju, humana ćelija koja proizvodi imunoglobulin se izoluje iz životinje XenoMouse™. U jednom drugom izvođenju, humana ćelija koja proizvodi imunoglobulin je iz transgene životinje (koja nije miš), kao što je opisano gore. U jednom drugom izvođenju, nukleinska kiselina je izolovana iz transgene životinje. Molekuli nukleinske kiseline izolovani iz transgene životinje (koja nije miš) mogu da se koriste, npr., za humanizovana antitela.
U nekim izvođenjima, nukleinska kiselina koja kodira težak lanac antitela na CD40 iz ovog pronalaska može da sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira Vh domen pronalaska spojen u odgovarajućem okviru čitanja sa nukleotiđnom sekvencom koja kodira konstantan domen teškog lanca iz bilo kog izvora. Slično, molekul nukleinske kiseline koji kodira lak lanac antitela na CD40 iz pronalaska može da sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira VL dometi ovog pronalaska spojen u odgovarajućem okviru čitanja sa nukleotidnom sekvencom koja kodira konstantan domen lakog lanca iz bilo kog izvora.
U još jednom aspektu pronalaska, molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju varijabilne domene teškog (Vu) i lakog (Vl) lanca su "konvertovani" u ćele gene antitela. U jednom izvođenju, molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju Vh ili Vl domen su "konvertovani" u ćele gene antitela insercijom u ekspresioni vektor koji već kodira konstantan domen teškog ili lakog lanca, tako da je Vh segment operativno zakačen za Ch segment(e) unutar vektora, a Vl segment je operativno zakačen za Cl segment unutar vektora. U jednom drugom izvođenju, molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju Vh i/ili Vl domene su "konvertovani" u ćele gene antitela vezivanjem, npr., ligacijom, molekula nukleinske kiseline koji kodira VH i/ili Vl domene za molekul nukleinske kiseline koji kodira CH i/ili CL domen korišćenjem standardnih molekularno bioloških telmika. Sekvence nukleinskih kiselina konstantnih domena teškog i lakog lanca humanih gena za imunoglobuline su poznate u struci. Videti, npr., Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interesi, 5th Ed., NIH Publ. No. 91-3242,1991. Molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju ćele teške i/ili lake lance mogu zatim da se eksprimiraju u ćeliji u koju su uvedeni i antitela na CD40 se izoluju.
Molekuli nukleinske kiseline mogu da se koriste za rekombinantnu ekspresiju velikih količina antitela na CD40. Molekuli nukleinske kiseline takođe mogu da se koriste za proizvodnju himemih antitela, bispecifičnih antitela, jednolančanih antitela, imunoadhezina, dijatela, mutiranih antitela i derivata antitela, kao što je opisano dalje dole. Ako su molekuli nukleinske kiseline izvedeni iz životinje koja nije transgcna. molekuli nukleinske kiseline mogu da se koriste za humanizaciju antitela, takođe kao što je opisano niže.
U jednom drugom izvođenju, molekul nukleinske kiseline iz pronalaska se koristi kao proba ili PCR prajmer za specifičnu sekvencu antitela. Na primer, nukleinska kiselina može da se koristi kao proba u dijagnostičkim metodama ili kao PCR prajmer za umnožavanje regiona DNK koji bi mogli da se koriste, između ostalog, za izolovanje dodatnih molekula nukleinske kiseline koji kodiraju varijabibie domene antitela na CD40. U nekim izvođenjima, molekuli nukleinske kiseline su oligonukleotidi. U nekim izvođenjima, oligonukleotidi su iz vrlo varijabilnih regiona teških i lakih lanaca antitela od interesa. U nekim izvođenjima, oligonukleotidi kodiraju ćele ili deo jednog ili više CDR antitela 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1,21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-009A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.28.1L-C92A, 23.29.1 ili 24.2.1.
Vektori
Pronalazak obezbeđuje vektore koji sadrže molekule nukleinske kiseline koji kodiraju težak lanac antitela na CD40 iz pronalaska ili njegov deo za vezivanje antigena. Pronalazak takođe obezbeđuje vektore koji sadrže molekule nukleinske kiseline koji kodiraju lak lanac takvih antitela ili njegov deo za vezivanje antigena. Pronalazak dalje obezbeđuje vektore koji sadrže molekule nukleinske kiseline koji kodiraju fuzione proteine, modifikovana antitela, fragmente antitela i njihove probe.
U nekim izvođenjima, antitela na CD40, ili delovi za vezivanje antigena iz pronalaska su eksprimirani insercijom DNK koje kodiraju delove ili ćele lake i teške lance, dobijene kao što je opisano gore, u ekspresione vektore tako da su geni operativno vezani za sekvence neophodne za kontrolu ekspresije, kao što su kontrolne sekvence za transkripciju i translaciju. Ekspresioni vektori uključuju plazmide, retroviruse, adenoviruse, adeno-asocirane viruse (AAV), biljne viruse kao što su virus mozaika karfiola, virus mozaika duvana, kozmiđi, YACs, epizomi izvedeni iz EBV i slični. Gen antitela je ligiran u vektor tako da transkripcione i translacione kontrolne sekvenca unutar vektora obavljaju svoju predviđenu funkciju regulsanja transkripcije i translacije gena antitela, Ekspresioni vektor i sekvence za kontrolu ekspresije su izabrane tako da budu kompatibilne sa ekspresijom korišćene ćelije domaćina. Gen lakog lanca antitela i gen teškog lanca antitela mogu da se insertuju u odvojene vektore. U jednom poželjnom izvođenju, oba gena su insertovana u isti ekspresioni vektor. Geni antitela su insertovani u ekspresioni vektor standardnim metodama (npr., iigacijom komplementarnih restrikcionih mesta na genskom fragmentu antitela i vektora, ili ligacijom ravnih krajeva ako restrikciona mesta nisu prisutna).
Pogodan vektor je onaj koji kodira funkcionalno kompletnu humanu Ch ili Cl imunoglobulinsku sekvencu, sa odgovarajućim restrikcionim mestima izabranim tako da bilo
vh ili vl sekvenca mogu lako da se insertuju i eksprimiraju, kao što je opisano gore. u takvim vektorima, obrada pre-irnk se obično javlja između donorskog mesta u insertovanom j regionu i akceptorskog mesta koje prethodi humanom c domenu, a takođe i u regionima iskrajanja koji se javljaju unutar humanih ch egzona. terminacija poliadenilacije i transkripcije se javljaju na nativnim hromozomskim mestima naniže od kodirajućih regiona. rekombinantni ekspresioni vektor takođe može da kodira signalni peptid koji olakšava sekreciju lanca antitela iz ćelije domaćina. gen za lanac antitela može da se klonira u vektor tako da se signalni peptid poveže u odgovarajućem okviru čitanja sa amino krajem imunoglobulinskog lanca. signalni peptid može da bude imunoglobulinski signalni peptid ili heterologan signalni peptid (tj., signalni peptid iz ne-imunoglobulinskog proteina).
Pored gena za lanac antitela, rekombinantni ekspresioni vektori iz pronalaska nose regulatorne sekvence koje kontrolišu ekspresiju gena za lanac antitela u ćeliji domaćinu. Stručnjaci će podrazumevati da dizajn ekspresionog vektora, uključujući izbor regulatorne sekvence, može da zavisi od takvih faktora kao što je izbor ćelije domaćina koja treba da se tranformiše, nivo ekspresije željenog proteina, itd. Poželjne regulatorne sekvence za ekspresiju sisarske ćelije domaćina uključuju virusne elemente koji dovode do visokih nivoa proteinske ekspresije u sisarskim ćelijama, kao što su promotori i/ili stimulatori (enhacers) izvedeni iz retrovirusnih LTR, citomegalovirus (CMV) (kao što je CMV promotor/stimulator), Simian virus 40 (SV40) (kao što je SV40 promotor/stimulator), adenovirus, (npr., adenovirusni glavni kasni promotor (AdMLP)), polioma virusi i jaki sisarski promotori kao što su nativni imunoglobulin i promotori aktina. Za dalji opis virusnih rcgulatoniih elemenata, i njihovih sekvenci, videti, npr., U.S. Patent No. 5,168,062, U.S. Patent No. 4,510,245 i U.S. Patent No. 4,968,615. Metode za eksprimiranje antitela u bilJκama, uključujući opis promotora i vektora, kao i transformacije biljaka, su poznati u struci. Videti, npr., United States Patents 6,517,529, ovde inkorporisan referencom. Metode eksprimiranja polipeptida u bakterijskim ćelijama ili gljivičnim, tj., ćelijama kvasca, su takođe dobro poznati u struci.
Kao dodatak genima za lance antitela i regulatomim sekvencama, rekombinantni ekspresioni vektori iz pronalaska mogu da nose dodatne sekvence, kao što su sekvence koje regulišu replikaciju vektora u ćelijama domaćina (npr., ishodišta, oridžini replikacije) i selektabilne marker gene. Selektabilni marker gen facilitira izbor ćelija domaćina u koje je vektor uveden (videti, npr., U.S. Patent Nos. 4,399,216, 4,634,665 i 5,179,017). Na primer, tipično selektabilni marker gen pruža otpornost na lekove, kao što su G418, higromicin ili metotreksat, ćeliji domaćinu u koju je vektor uveden. Poželjni selektabilni marker geni uključuju gen za dihidrofolat reduktazu (DHFR) (za korišćenje u DHFR ćelijama domaćina sa selekcijom/ amplifikacijom sa metotreksatom), neo gen (za selekciju sa G418) i gen za glutamat sintetazu.
Ne-hibridomske ćelije domaćini i metode za rekombinantnu proizvodnju proteina
Molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju antitela na CD40 i vektori koji sadrže ove molekule nukleinske kiseline mogu da se koriste za transfekciju pogodnih sisarskih, biljnih, bakterijskih ili kvaščevih ćelija domaćina. Transformacija se može izvesti bilo kojim poznatim metodom za uvođenje polinukleotiđa u ćeliju domaćina. Metodi za uvođenje heterolognih polinukleotiđa u sisarske ćelije su dobro poznati u struci i uključuju transfekciju posredovanu dekstranom, precipitaciju kalcijum fosfatom, transfekciju posredovanu polibrenom, fuziju protoplasta, elektroporaciju, enkapsulaciju polinukleotiđa u lipozomima i direktnu mikroinjekciju DNK u jedra. Pored toga, molekuli nukleinske kiseline mogu da se uvedu u sisarske ćelije virusnim vektorima. Metodi transformisanja ćelija su dobro poznati u struci. Videti, npr., U.S. Patent Nos. 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461, i 4,959,455 (koji su ovđe inkorporisani referencom). Metodi transformisanja biljnih ćelija su dobro poznati u struci, uključujući, npr., transformaciju Agrobacteriumom, biolističku transformaciju, direktnu injekciju, elektroporaciju i virusnu transformaciju. Metodi transformisanja bakterijskih i kvaščevih ćelija su takođe dobro poznati u struci.
Sisarske ćelijske linije dostupne kao domaćini za ekspresiju dobro su poznate u struci i uključuju mnoge imortalizovane ćelijske linije dostupne od American Type Culture Collection (ATCC). Ove uključuju, između ostalog, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), NSO, SP2 ćelije, HeLa ćelije, ćelije bubrega mladog hrčka (BHK), ćelije bubrega majmuna (COS), ćelije humanog hepatocelulamog karcinoma (npr., Hep G2), A549 ćelije i mnoge druge ćelijske linije. Ćelijske linije koje su posebno poželjne su odabrane tako Što je ustanovljeno koje ćelijske linije imaju visok nivo ekspresije. Druge ćelijske linije koje mogu da se koriste su ćelijske linije insekata, kao što su Sf9 ćelije. Kad se rekombinantni ekspresioni vektori koji sadrže gene antitela uvedu u sisarske ćelije domaćine, antitela se proizvode gajenjem ćelija domaćina dovoljno dugo da se dozvoli ekspresija antitela u ćelijama domaćina ili, poželjnije, sekrecija antitela u medijum u kome se ćelije domaćini gaje. Antitela se mogu ekstrahovati iz medijuma za kulture pomoću standardnih metoda prečišćavanja proteina. Biljne ćelije domaćini uključuju, npr., Nicotiana, Arabidopsis, Lemnaceae, kukuruz, pšenicu, krompir, itd. Bakterijske ćelije domaćini uključuju E. coli i vrste Streptomyces. Kvaščeve ćelije domaćini uključuju Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae i Fichia pastoris.
Dalje, ekspresija antitela iz pronalaska (ili drugih grupa deriviranih iz njega) u proizvodnim ćelijskim linijama može da se poveća korišćenjem brojnih poznatih tehnika. Na primer, sistem ekspresije gena glutamin sintetaze (GS sistem) je uobičajen pristup za povećanje ekspresije u određenim uslovima. GS sistem je diskutovan u celini ili delimično u vezi sa European Patent Nos. 0 216 846, 0 256 055, i 0 323 997 i European Patent Application No. 89303964.4.
Verovatno je da će antitela eksprimirana u različitim ćelijskim linijama ili u transgenim životinjama imati različite glikozilacije. Međutim, sva antitela koja kodiraju molekuli nukleinske kiseline dati ovde ili koja sadrže aminokiselinske sekvence date ovde su deo pronalaska, bez obzira na glikozilaciju antitela.
Transgene životinje i bilJκe
antitela na CD40 iz pronalaska mogu se takođe proizvoditi transgenski kroz generisanje sisara ili bilJκe transgene za sekvence teškog i lakog imunoglobulinskog lanca od interesa i proizvodnju antitela koja se iz njih mogu ekstrahovati. U vezi sa transgenskom proizvodnjom u sisarima, antitela na CD40 mogu da se proizvedu u, i da se ekstrahuju iz, mleka koze, krave ili drugih sisara. Videti, npr., U.S. Patent Nos. 5,827,690, 5,756,687, 5,750,172, i 5,741,957. U nekim izvođenjima, transgene životinje koje sadrže humane imunoglobulinske lokuse su imunizovane sa CD40 ili njegovim imunogenim delom, kao što je opisano gore. Metode za pravljenje antitela u bilJκama su opisane, npr., u US patents 6,046,037 i US 5,959,177. da se ovo radi u okvirnim regionima, konstantnom domenu ili u nekanoničkim regionima antitela.
Aktivacija CD40 pomoću antitela na CD40
Jedan drugi aspekt ovog pronalaska uključuje antitelo na CD40 koje je aktivirajuće antitelo, tj., CD40 agonist. Aktivirajuće antitelo amplifikuje ili zamenjuje efekte CD40L na CIMO. U nekim izvođenjima, aktivirajuće antitelo u suštini imitira CD40L i konkuriše CD40L za vezivanje za CD40. U nekim izvođenjima, antitelo ne konkuriše CD40L za vezivanje za CD40, nego amplifikuje efekat vezivanja CD40L za CD40. U nekim izvođenjima, antitelo na CD40 aktivira CD40 u prisustvu ili odsustvu CD40L.
Inhibicija rasta tumora in vivo pomoću antitela na CD40
Prema nekim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje antitelo na CD40 koje inhibira proliferaciju ćelija tumora in vitro ili rast tumora in vivo.
U nekim izvođenjima, antitelo inhibira rast tumora za najmanje 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%. U nekim izvođenjima, antitelo inhibira rast tumora za 75%. U jednom izvođenju, inhibicija rasta tumora je detektabilna 14 dana posle početnog tretmana antitelom. U drugim izvođenjima, inhibicija rasta tumora je detektabilna 7 dana posle početnog tretmana antitelom. U nekim izvođenjima, jedan drugi antineoplastični agens se daje životinji sa antitelom na CD40m. U nekim izvođenjima, antineoplastični agens dalje inhibira rast tumora. U nekim izvođenjima, antineoplastični agens je adriamicin ili taksol. U nekim izvođenjima, koađministracija antineoplastičnog agensa i antitela na CD40 inhibira rast tumora za najmanje 50%, posle perioda od 22-24 dana od početka tretmana u poređenju sa rastom tumora na netretiranoj životinji.
Indukcija apoptoze antitelima na CD40
Jedan drugi aspekt pronalaska obezbeđuje antitelo na CD40 koje indukuje ćelijsku smrt CD40 pozitivnih ćelija. U nekim izvođenjima, antitelo izaziva apoptozu CD40 pozitivnih ćelija bilo in vivo bilo in vitro.
U nekim izvođenjima, transgene životinje ili bilJκe se prave uvođenjem jednog ili više molekula nukleinske kiseline koja kodira antitelo na CD40 iz pronalaska u životinju ili bilJκu standardnim transgenskim tehnikama. Videti Hogan i United States Patent 6,417,429, supra. Transgene ćelije koje se koriste za pravljenje transgenih životinja mogu biti embrionske matične ćelije ili somatske ćelije. Transgeni organizmi (isključujući ljude) mogu biti himemi, nehimemi heterozigoti i nehimerai hoinozigoti. Videti, npr., Hogan et ak, Manipulating the Mouse Embijo: A Laboratory Manual 2 cd., Cold Spring Harbor Press (1999), Jackson et al., Mouse Genetics and Transgenics: A Practical Approach, Oxford University Press (2000) i Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Acađemic Press (1999). U nekim izvođenjima, transgene životinje imaju ciljani prekid i zamenu ciljanim konstruktom koji kodira težak i/ili lak lanac od interesa. U jednom poželjnom izvođenju, transgene životinje sadrže i eksprimiraju molekule nukleinske kiseline koji kodiraju težak i lak lanac koji se specifično vezuju za CD40, poželjno, za humani CD40. U nekim izvođenjima, transgene živo trnje sadrže molekule nukleinske kiseline koji kodiraju mođifikovano antitelo kao što je jeđnolančano antitelo, himemo antitelo ili humanizovano antitelo. Anli-CD40 antitela mogu da se prave u bilo kojoj transgenoj životinji. U poželjnom izvođenju, životinje su miševi, pacovi, ovce, svinje, koze, goveda ili konji. Transgene životinje eksprimiraju navedene polipeptide u krvi, mleku, urinu, pljuvačci, suzama, mukusu i drugim telesnim tečnostima.
Biblioteke eksponirane na faiima (Phage display libraries)
Pronalazak obezbeđuje metod za proizvodnju antitela na CD40 ili njegovog dela za vezivanje antigena, koji se sastoji od koraka sintetisanja biblioteke humanili antitela na fagu, pretraživanja biblioteke pomoću CD40 ili njegovog dela, izolovanja faga koji vezuje CD40 i dobijanja antitela iz faga. Na primer, jedan metod za dobijanje biblioteke antitela za upotrebu u tehnikama eksponiranja na fazima se sastoji od koraka imunizovanja životinje koja sadrži humana imunoglobulinska lokusa pomoću CD40 ili njegovim antigenskim delom, da bi se stvorio imunski odgovor, ekstrahovanja ćelija koje proizvode antitela iz imunizovane životinje; izolovanja RNK iz ekstrahovanih ćelija, reverzne transkripcije RNK da bi se napravila cDNK, umnožavanja cDNK uz upotrebu prajmera i insertovanja cDNK u vektor za eksponiranje na fagu tako da se antitela eksprimiraju na fagu. Rekombinantna antitela na CD40 iz pronalaska se mogu clobijati na ovaj način.
Rekombinantna anti-CD40 humana antitela iz pronalaska se mogu izolovati pretraživanjem kombinatome biblioteke rekombinantnih antitela. Poželjno je daje biblioteka bude biblioteka od scFv eksponiranog na fazima, generisana pomoću humanih Vl i Vh cDNK, dobijenih iz iRNK izolovanih iz B ćelija. Metodologije za dobijanje i pretraživanje takvih biblioteka su poznate u struci. Pošto je komercijalno dostupni kompleti (kitovi) za generisanje biblioteka eksponiranja na fazima (npr., Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, katalog no. 27-9400-01 i Stratagene SurfZAP™ komplet za eksponiranje na fazima, katalog no. 240612). Pošto je i drugi metodi i reagensi koji se mogu koristiti za generisanje i pretraživanje biblioteka sa eksponiranim antitelima (videti, npr., U.S. Patent No. 5,223,409; PCT Publication Nos. WO 92/18619, WO 91/17271, WO 92/20791, WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047, WO 92/09690; Fuchs et al., Bio/Technology 9:1370-1372 (1991); Hay et ah, Huni. Antibod. Hybridomas 3:81-85 (1992); Huse et ah, Science 246:1275-1281 (1989); McCafTerty et ah, Nature 348:552-554 (1990); Griffiths et ah, EMBO J. 12:725-734 (1993); Hawkins et ah, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992); Clackson et ah, Nature 352: 624628 (1991); Gram et ah, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580 (1992); Garrad et ah , Bio/Technology 9:1373-1377 (1991); Hoogenboom et ah, Nuc. Acid Res. 19:4133-4137 (1991); i Barbas et ah, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7978-7982 (1991)).
U jednom izvođenju, da bi se izolovala humana antitela na CD40 sa željenim osobinama, humano antitelo na CD40, kao što je opisano ovde, prvo je korišćeno za selekciju humanih sckvcnci teškog i lakog lanca koje imaju sličnu vezujuću aktivnost prema CD40, korišćenjem metoda utiskivanja epitopa, opisanog u PCT Publication No. WO 93/06213. Poželjno je da biblioteke antitela korišćene u ovom metodu budu scFv biblioteke dobijene i pretražene kao što je opisano u PCT Publication No. WO 92/01047, McCafferty et ah, Nature 348: 552-554 (1990); i Griffiths et ah, EMBO J 12:725-734 (1993). Biblioteke scFv antitela pretežno se pretražuju pomoću humanog CD40 kao antigena.
Kad su početni humani Vl i Vh domeni odabrani, izvedeni su eksperimenti "mešaj i sparuj" ("miK and mateh"), u kojima se različiti parovi početno odabranih VL i VH segmenata pretražuju na vezivanje CD40 da bi se odabrale poželjne kombinacije Vl/Vh parova. Pored toga, da bi se dalje poboljšao kvalitet antitela, VL i VH segmenti poželjnih Vl/Vh parova mogu biti nasumično mutirani, poželjno unutar CDR3 regiona Vh i/ili Vl, u procesu analognom in vivo procesu somatske mutacije, odgovornom za sazrevanje afiniteta antitela tokom prirodnog imunskog odgovora. Ovo in vitro sazrevanje afiniteta može se postići umnožavanjem VH i VL domena pomoću PCR prajmera komplementarnih VH CDR3, odnosno, Vl CDR3, gde su ti prajmeri "prošarani" nasumičnom smesom od četiri nukleotidne baze na određenim pozicijama tako da dobijeni proizvodi PCR kodiraju Vi( i Vl segmente u koje su nasumične mutacije uvedene u VH i/ili VL CDR3 regione. Ovi nasumično mutirani Vh i Vl segmenti mogu se ponovo pretražiti na vezivanje za CD40.
Posle pretraživanja i izolovanja antitela na CD40 iz pronalaska iz biblioteke sa eksponiranim rekombinantnim imunoglobulinima, nukleinske kiseline koje kodiraju odabrano antitelo mogu se povratiti iz tog paketa (npr., iz genoma faga) i subklonirati u druge ekspresione vektore standardnim tehnikama rekombinantne DNK. Po želji, može se dalje manipulisati nukleinskom kiselinom da bi se napravili drugi oblicii antitela iz pronalaska, kao što je opisano dole. Da bi se eksprimiralo rekombinantno humano antitelo izolovano pomoću pretraživanja kombinatome biblioteke, DNK koja kodira antitelo se klonira u rekombinantni ekspresioni vektor i uvodi u a sisarske ćelije domaćine, kao što je opisano gore.
Promene klase
Jedan drugi aspekt pronalaska obezbeđuje metod za konvertovanje klase ili podklase antitela na CD40 u drugu klasu ili podklasu. U nekim izvođenjima, molekul nukleinske kiseline koji kodira Vl ili Vh, koji ne uključuje nijednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira Cl ili Ch, je izolovan pomoću metoda dobro poznatih u struci. Molekul nukleinske kiseline se zatim operativno vezuje za sekvencu nukleinske kiseline koja kodira Cl ili CH iz željene imunoglobulinske klase ili podklase. Ovo se može postići upotrebom vektora ili molekula nukleinske kiseline koji sadrži Cl ili Ch lanac, kao što je opisano gore. Na primer, antitelo na CD40 koje je prvobitno bilo IgM, može se promeniti u IgG. Dalje, menjanje klase se može koristiti za konvertovanje jedne IgG podklase u drugu, npr., iz IgGl u IgG2. Drugi metod za proizvodnju antitela iz pronalaska, koja sadrže željeni izotip, sastoji se od koraka izolovanja nukleinske kiseline koja kodira težak lanac antitela na CD40 i nukleinske kiseline koja kodira lak lanac antitela na CD40, izolovanja sekvence koja kodira VH region, ligiranja Vh sekvence za sekvencu koja kodira konstantan domen teškog lanca željenog izotipa,
eksprimiranja gena lakog lanca i konstrukta teškog lanca u ćeliji i skupljanja antitela na CD40 sa željenim izotipom.
Deimunizovana antitela
Drugi način proizvodnje antitela sa redukovanom imunogenošću je deitminizacija antitela. U jednom drugom aspektu pronalaska, antitelo može biti deimunizovano pomoću tehnika opisanih u, npr., PCT Publication Nos. W0 98/52976 i WO 00/34317 (koji su ovde u celini inkorporisani referencom).
Mutirana antitela
U jednom drugom izvođenju, molekuli nukleinske kiseline, vektori i ćelije domaćini mogu da se koriste za pravljenje imitiranih antitela na CD40. Antitela mogu da se mutiraju u varijabilnim domenima teškog i/ili lakog lanca, npr., da bi se izmenila osobina vezivanja antitela. Na primer, mutacija može da se napravi u jednom ili više CDR regiona da bi se povećala ili smanjila KD antitela za CD40, da bi se povećala ili smanjila K^, ili da bi se izmenila specifičnost vezivanja antitela. Tehnike u lokalno usmerenoj (site-đirected) mutagenezi su dobro poznate u struci. Videti, npr., Sambrook et al. i Ausubel et al., supra. U jednom poželjnom izvođenju, mutacije su napravljene na aminokiselinskom ostatku za koji se zna da je promenjen u odnosu na embrionalni u varijabilnom domenu antitela na CD40. U jednom drugom izvođenju, jedna ili više mutacija je napravljeno na aminokiselinskom ostatku za koji se zna da je promenjen u odnosu na embrionalni u CDR regionu ili u okvirnom regionu varijabilnog domena, ili u konstantnom domenu monoklonskog antitela 3.1.1, 3.1.1 H-A78T, 3.1.1 H-A78T-V88A-V97A, 3.1.IL-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K i 24.2.1. U jednom drugom izvođenju, jedna ili više mutacija je napravljeno na aminokiselinskom ostatku za koji se zna daje promenjen u poređenju sa embrionalnim u CDR regionu ili u okvirnom regionu varijabilnog domena aminokiselinske sekvence odabrane iz SEQ ID NOS: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94, 100, 102, 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96, 98, 100 ili 102, ili čija je sekvenca nukleinske kiseline predstavljena u SEQ ID NOS: 3, 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 93, 99, 101, 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 91,95, 97, 99 ili 101,
U jednom izvođenju, okvirni region je mutiran tako da dobijeni okvirni region(i) ima(ju) aminokiselinsku sekvencu odgovarajućeg embrionskog gena. Mutacija može da se napravi u okvirnom regionu ili u konstantnom domenu da bi se povećao poluživot antitela na CD40. Videti, npr., PCT Publication No. WO 00/09560, ovde inkoiporisan referencom. Mutacija u okvirnom regionu ili u konstantnom domenu može da se napravi da izmeni imunogenost antitela, da obezbedi mesto za kovalentno ili nekovalentno vezivanje za drugi molekul, ili da izmeni takve osobine kao što su fiksacija komplementa, vezivanje FcR i ADCC. Prema pronalasku, jedno antitelo može da ima mutacije na bilo kom jednom ili više okvirnih regiona, konstantnom domenu i u varijabilnim regionima.
U nekim izvođenjima, ima od 1 do 18, uključujući bilo koji broj između, aminokiselinskih mutacija u bilo kom od Vh ili Vl domena mutiranog antitela na CD40 u poređenju sa antitelo na CD40m pre mutacije. U bilo kom slučaju, mutacije mogu da se jave u jednom ili više CDR regiona. Dalje, bilo koja od mutacija može da bude konzervativna aminokiselinska supstitucija. U nekim izvođenjima, nema više od 5, 4, 3, 2, ili 1 aminokiselinska promena u konstantnim domenima.
Modifikovana antitela
U jednom drugom izvođenju, fuziono antitelo ili imunoadhezin može daše napravi da sadrži ćelo ili deo antitela na CD40 iz pronalaska zakačen za drugi polipeptid. U jednom poželjnom izvođenju, samo su varijabilni domeni antitela na CD40 zakačeni za polipeptid. U jednom drugom poželjnom izvođenju, Vh domen antitela na CD40 je zakačen za prvi polipeptid, dok je Vl domen antitela na CD40 zakačen za drugi polipeptid koji je pridružen prvom polipeptidu na takav način da VH i Vl domeni mogu da interaguju među sobom da bi obrazovali vezivno mesto antitela. U jednom drugom poželjnom izvođenju, Vh domen je odvojen od VL domena takvim linkerom da V« i VL domeni mogu da interaguju među sobom (videti niže pod Jednolančana antitela). Vn-linker-VL antitelo se zatim vezuje za polipeptid od interesa. Fuziono antitelo je korisno za usmeravanje polipeptida na ćeliju ili tkivo koje eksprimira CD40, Polipeptid može biti terapijski agens, kao što je toksin, faktor rasta ili neki drugi regulatomi protein, ili može biti dijagnostički agens, kao što je enzim koji se može lako videti, kao što je peroksidaza rena. Pored toga, fuziona antitela mogu da se naprave tako da su dva (ili više) jednolančana antitela spojena među sobom. Ovo je korisno ako se želi napraviti dvovalentno ili polivalentno antitelo najednom polipeptidnom lancu, ili ako se želi napraviti bispecifično antitelo.
Da bi se napravilo jednolančano antitelo, (scFv) the Vh- i Vu-kodirajući fragmenti DNK se operativno vezuju za drugi fragment koji kodira fleksibilan linker, npr., koji kodira aminokiselinsku sekvencu (Gly4-Ser)j, tako da Vh i Vl sekvence mogu da se eksprimiraju kao kontinuirani jedno lančan i protein, sa VL i Vh domenima spojenim fleksibilnim linkerom. Videti, npr., Bird et aL, Science 242:423-426 (1988); Huston et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988); McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990). Jednolančano antitelo može biti jednovalentno, ako je korišćen samo po jedan Vh i Vl, dvovalentno, ako su korišćena dva Vh i VL, ili polivalentno, ako je korišćeno više od dva VH i Vl- Mogu se napraviti i bispecifična ili polivalentna antitela koja specifično vezuju CD40 i neki drugi molekul.
U drugim izvođenjima, druga modifikovana antitela mogu da se dobiju pomoću molekula nukleinske kiseline koji kodiraju antitelo na CD40. Na primer, "Kappa bodies" (111 et al., Protein Eng. 10:949-57 (1997)),"Minibodies" (Martin et al., EMBO J. 13:5303-9 (1994)), "Diabodies" (Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)) ili "Janusins" (Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991) i Traunecker et al., Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51-52 (1992)) mogu da se dobiju pomoću standardnih molekularno bioloških tehnika sledeći uputstva iz specifikacije.
Bispecifična antitela ili fragmenti koji vezuju antigen mogu da se proizvode nizom metoda uključujući fuziju hibridoma ili vezivanje Fab' fragmenata. Videti, npr., Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990), Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553 (1992). Pored toga, bispecifična antitela mogu da se prave kao "dijatela" ili "janusini". U nekim izvođenjima, bispecifično antitelo se vezuje za dva različita epitopa CD40. U nekim izvođenjima, bispecifično antitelo ima prvi težak lanac i prvi lak lanac iz monoklonskog antitela 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1 H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K i 24.2.1, i dodatni težak lanac i lak lanac antitela.
U nekim izvođenjima, dodatni lak lanac i težak lanac su takođe iz jednog od gore identifikovanih monoklonskih antitela, ali su različiti od prvog teškog i lakog lanca.
U nekim izvođenjima, modifikovana antitela, opisana gore, dobijaju se pomoću jednog ili više varijabilnih domena ili CDR regiona iz humanog anti-CD40 monoklonskog antitela obezbeđenog ovde, iz aminokiselinske sekvence pomenutog monoklonskog antitela ili iz teškog lanca ili lakog lanca kodiranih sekvencama nukleinskih kiselina koje kodiraju pomenuto monoklonsko antitelo.
Derivirana i obeležena antitela
Može se dobili derivat antitela na CD40 ili njegovog dela za vezivanje antigena iz pronalaska ili vezati za drugi molekul (npr., drugi peptiđ ili protein). U opštem slučaju, antitelo ili njegov deo se proizvodi tako da vezivanje CD40 nije pogođeno derivatizacijom ni obeležavanjem. Prema tome, predviđeno je da antitela i delovi antitela iz pronalaska uključe i intaktne i mođifikovane oblike humanih antitela na CD40 opisanih ovde. Na primer, antitelo ili deo antitela iz pronalaska može se funkctionalno vezati (hemijskim kuplovanjem, genetskom fuzijom, nekovalentnom vezom ili na drugi način) za jednu ili više drugih molekulskih celina, kao što su drugo antitelo (npr., bispecifično antitelo ili dijatelo), agens za detekciju, citotoksični agens, farmaceutski agens, i/ili protein ili peptid, koje mogu da posreduju pri udruživanju antitela ili dela antitela sa drugim molekulom (kao što je streptavidinsko jezgro ili polihistidinski dodatak).
Jedan tip deriviranog antitela se proizvodi povezivanjem (crosslinking) dva ili više antitela (istog ili različitog tipa, npr., da bi se napravila bispccifiena antitela). Povezivanje se vrši jedinjenjima koja su heterobifunkcionalna, jer imaju dve različite reaktivne grupe na određenom rastojanju (npr., m-nialeimiđobcnzoil-N-hidroksisukcinimid estar) ili homo-bifunkcionalna (npr., disukcinimidil suberat). Takva jedinjenja se mogu dobiti od Pierce Chemical Company, Rockforđ, 111,
Drugi tip deriviranih antitela je obeleženo antitelo. Korisni agensi za detekciju kojim antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena iz pronalaska može da se derivatizuje uključuju fluorescentna jedinjenja, uključujući fluoresceiu, fluoresccin izotiocijanat, rodainin, 5-dimetilamin-l-naftalensulfonil hlorid, fikocritrin, fosfolantanide i slično. Antitelo se može obeležiti i enzimima koji su korisni za detekciju, kakva je peroksidaza rena, p-galaktozidaza, luciferaza, alkalna fosfataza, glukozna oksidaza i slično. Kad se antitelo obeleži detektabilnim enzimom, detektuje se dodavanjem dodatnih reagenasa koje enzim koristi da proizvede reakcioni proizvod koji se može razlikovati. Na primer, kad je agens peroksidaza rena prisutna, dodavanje vodonik peroksida i diaminobenzidina dovodi do obojenog proizvoda reakcije, koji se može uočiti. Antitelo se takođe može obeležiti biotinom i đetektovati indirektnim merenjem vezivanja avidina ili streptavidina. Antitelo se takođe može obeležiti unapred određenim polipeptidnim epitopom, koji prepoznaje sekundarni reporter (npr., sekvence za "leucinski rajsferšlus", vezivna mesta za sekundama antitela, domeni za vezivanje metala, epitopne oznake). U nekim izvođenjima, obeleživači su spojeni bočnim lancima različitih dužina da bi se smanjila potencijalna sterična smetnja.
Antitelo na CD40 se takođe može obeležiti radioaktivnom aminokiselinom. Radioaktivni obeleživač se može koristiti i za dijagnostičke i za terapijske svrhe. Na primer, radioaktivni obeleživač se može koristiti za detektovanje tumora koji eksprimiraju CD40 x-zracima ili drugim dijagnostičkim tehnikama. Dalje, radioaktivni obeleživač se može koristiti terapijski, kao toksin za kancerozne ćelije ili tumore. Primeri obeleživača za polipeptide uključuju, ali nisu ograničeni na, sledeće radioizotope ili radionuklide - 3H, 14C, l5N, 35S, wY, 99Tc, mIn, 125I, t31L
Antitelo na CD40 se takođe može derivatizovati hemijskom grupom kao što su polietilen glikol (PEG), metil ili etil grupa ili ugljovodonična grupa. Ove grupe su korisne da poboljšaju biološke karakteristike antitela, npr., da povećaju poluživot seruma ili da povećaju vezivanje tkiva.
Farmaceutske kompozicije i kompleti
Pronalazak se takođe odnosi na kompozicije koje sadrže humano anti-CD40 agonističko antitelo za lečenje subjekata kojima je potrebna imunostimulacija. Takve kompozicije su korisne za lečenje, prevenciju, redukovanje učestalosti ili jačine infekcije, uključujući virusnu i bakterijsku infekciju, za lečenje hiperproliferativnog poremećaja, uključujući kancerozna i pre-kancerozna stanja, za lečenje stanja genetske imunodeficijencije, kao što je hiper-IgM sindrom i za lečenje stanja primame ili kombinovane imunodeficijencije, uključujući stanja koja karakteriše neutropenija, u sisaru, uključujući ljude. Subjekti za lečenje terapijom pomoću agonističkog antitela na CD40 uključuju bilo kog subjekta kome je potrebno povećanje imuniteta, uključujući, ali ne ograničavajući se na starije i osobe koje su itnunosuprimirane, na primer, zbog hemoterapije.
Hiperproliferativni poremećaji koji se mogu lečiti pomoću agonističkog antitela na CD40 iz pronalaska mogu da obuhvate bilo koje tkivo ili organ i da uključe, ali da ne budu ograničena na, kancere mozga, pluća, skvamoznih ćelija, bešike, gastričnog trakta, pankreasa, doJκe, glave, vrata, jetre, bubrega, jajnika, prostate, kolorektalni, ezofagusni, ginekološki, nazofarinksa ili tiroidee, melanome, limfome, leukemije ili multiple mijelome. BConkretno, humana agonistička antitela na CD40 iz pronalaska su korisna za lečenje karcinoma doJκe, prostate, debelog creva i pluća.
Lečenje može da uključi administraciju jednog ili više agonističkih anti-CD40 monoklonskih antitela iz pronalaska, ili njihovih fragmenata za vezivanje antigena, samog ili sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. Kao što se ovde koristi, "farmaceutski prihvatljiv nosač" označava bilo koji i sve rastvarače, disperzione medijume, obloge, antibakterijske i antimikotičke agense, izotonične agense i one za odlaganje apsorpcije i slične, koji su fiziološki kompatibilni. Neki primeri farmaceutski prihvatljivih nosača su voda, fiziološki rastvor, fosfatno puferisan fiziološki rastvor, dekstroza, glicerol, elanol i slični, kao i njihove kombinacije. U mnogim slučajevima, biće poželjno da se u kompoziciju uključe izotonični agensi, na primer, šećeri, polialkoholi kao što su manitol i sorbitol ili natrijum hlorid. Dodatni primeri farmaceutski prihvatljivih supstanci su agensi za kvašenje ili manje količine pomoćnih supstanci kao što su agensi za kvašenje ili emulzifikatori, prezervativi ili puferi, koji povećavaju trajnost ili efektivnost antitela.
Agonistička antitela na CD40 iz pronalaska i kompozicije koje ih sadrže, mogu da se daju u kombinaciji sa jednim ili više drugih terapijskih, dijagnostičkih ili profilaktičkih agenasa. Dodatni terapijski agensi uključuju druge anti-neoplastične, anti-tumorske, anti-angiogenične ili hemoterapijske agense. Takvi dodatni agensi mogu da budu uključeni u istu kompoziciju ili da se daju odvojeno. U nekim izvođenjima, jedno ili više agonističkili antitela na CD40 iz pronalaska može da se koristi kao vakcina ili kao adjuvans za vakcinu.
Kompozicije iz ovog pronalaska mogu biti u raznim izvođenjima, na primer, u tečnim, polučvrstim i čvrstim oblicima doze, kao što su tečni rastvori (npr., injektabilni i infuzibilni rastvori), disperzije ili suspenzije, tablete, pilule, praškovi, lipozomi i supozitorije. Poželjni oblik zavisi od predviđenog načina davanja i terapijske primene. Tipične poželjne kompozicije su u vidu injektabilnih i infuzibilnih rastvora, kakve su kompozicije slične onima koji se koriste za pasivnu imunizaciju ljudi. Poželjan način davanja je parenteralan (npr,, intravenozno, subkutano, intraperitonealno, intramuskulamo). U jednom poželjnom izvođenju, antitelo se daje intravenoznom infuzijom ili injekcijom. U jednom drugom poželjnom izvođenju, antitelo se daje intramuskulamom ili subkutanom injekcijom.
Terapijske kompozicije tipično moraju da budu sterilne i stabilne u uslovima proizvodnje i skladištenja. Kompozicija se može formulisati kao rastvor, mikroemulzija, disperzija, lipozom ili neka druga uređena struktura pogodna za visoke koncentracije leka. Sterilni injektabilni rastvori se mogu praviti ubacivanjem antitela na CD40 u potrebnu količinu odgovarajućeg rastvarača sa jednim ili kombinacijom sastojaka nabrojanih gore, po potrebi, praćenim sterilizacijom preko filtra, U opštem slučaju, disperzije se prave ubacivanjem aktivnog jedinjenja u sterilan nosač koji sadrži osnovni disperzioni medijum i druge potrebne sastoJκe od onih nabrojanih gore. U slučaju sterilnog praha za dobijanje sterilnih injektabilnih rastvora, poželjne metode đobijanja su sušenje na vakuumu i sušenje zamrzavanjem koje daje prali aktivnog sastoJκa plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz njegovog prethodno sterilisanog (preko filtra) rastvora. Odgovarajuća fluidnost rastvora se može održati, na primer, upotrebom obloge kao što je lecitin, održavanjem željene veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata. Produžena apsorpcija injektabilnih kompozicija se može omogućiti uključivanjem u kompoziciju agensa koji odgađa apsorpciju, na primer, monostearatne soli i želatina.
Antitela iz ovog pronalaska mogu se davati pomoću niza metoda poznatih u struci, mada je za mnoge terapijske primene poželjan put/način davanja subkutana, intramuskulama ili intravenozna infuzija. Kao što će iskusan stručnjak shvatiti, put i/ili način davanja će zavisiti od željenih rezultata.
U određenim izvođenjima, aktivno jedinjenje iz kompozicije sa antitelima može da se priprema sa nosačem koji će zaštiti anlitelo od brzog oslobađanja, kao što je u formulaciji sa kontrolisanim oslobađanjem, uključujući implante, transdermalne flastere i mikroinkapsuli-rane sisteme. Mogu se koristiti biorazgradljivi, biokompatibilni polimeri, kao što su etillen vinil acetat, polianhiđridi, poliglikolina kiselina, kolagen, poliortoestri i polimlečna kiselina. Mnoge metode za dobijanje takvih formulacija su patentirane ili su opšte poznate stručnjacima. Videti, npr., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems (J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Ine., New York, 1978).
U određenim izvođenjima, antitelo na CD40 iz pronalaska može da se daje oralno, na primer, sa inertnim razblaživačem ili sa jestivim nosačem koji se može asimilovati. Jedinjenje (i drugi sastojci, po želji) može takođe biti uključeno u tvrdu ili meku želatinsku kapsulu, komprimovani u tablete ili direktno uvršćeno u dijetu subjekta. Za oralno terapijsko davanje, antitela na CD40 mogu se inkorporisati sa ekscipjientima i koristiti u vidu tableta, bukalnih tableta, pastila, kapsula, eliksira, suspenzija, sirupa, oribleta i slično. Za davanje jedinjenja iz pronalaska na neki drugi način osim parenteralnog, može da bude neophodno da se jedinjenje prevuče, ili daje zajedno sa, materijalom za sprečavanje njegove inaktivacije.
Dodatna aktivna jedinjenja se takođe mogu ugraditi u kompozicije. U određenim izvođenjima, antitelo na CD40 iz pronalaska se formuliše ili daje zajedno sa jednim ili više dodatnih terapijskih agenasa. Ovi agensi uključuju, bez ograničenja, antitela koja vezuju druge mete (npr., antitela koja vezuju jedan ili više faktora rasta ili citokina ili njihovih receptora sa površine ćelije, kao što je anti-CTL4-antitelo), antineoplastične agense, antitumorske agense, hemoterapijske agense, peptidne analoge koji aktiviraju CD40, rastvorljive CD40L, jedan ili više hemijskih agenasa koji aktiviraju CD40, i/ili druge agense poznate u struci koji mogu da pojačaju imunski odgovor protiv ćelija tumora, npr., IFN-pi, IL-2, IL-8, 1L-12,1L-15,1L-18, IL-23, IFN-γ i GM-CSF. Takve kombinovane terapije mogu zahtevati niže doze antitela na CD40, kao i dodatnih agenasa, čime se izbegava moguća toksičnost ili komplikacije vezane za različite monoterapije.
Agonistička antitela na CD40 iz pronalaska i kompozicije koje ih sadrže takođe se mogu davati u kombinaciji sa drugim terapijskim režimom, naročito u kombinaciji sa tretmanom zračenjem.
Kompozicijie iz pronalaska mogu da uključe "terapijski efektivnu količinu" ili "profilaktički efektivnu količinu" antitela ili dela za vezivanje antigena iz pronalaska. "Terapijski efektivna količina" se odnosi na količinu efektivnu, u dozama i u periodima koji su neophodni, da se postigne željeni terapijski rezultat. Terapijski efektivna količina antitela ili dela antitela može da varira u zavisnosti od faktora kao što su stanje oboljenja, starost, pol i težina osobe i sposobnosti antitela ili dela antitela da podigne željeni odgovor u osobi. Terapijski efektivna količina je takođe ona u kojoj su bilo koji toksični ili štetni efekti antitela ili dela antitela nadmašeni terapijski korisnim efektima. "Profilaktički efektivna količina" se odnosi na količinu efektivnu, u dozama i u periodima koji su neophodni, da se postigne željeni profilaktički rezultat. Tipično, pošto se profilaktička doza koristi u subjektima pre ili na ranijem stupnju oboljenja, profilaktički efektivna količina će biti manja nego terapijski efektivna količina.
Režimi doziranja mogu se podesiti da pruže optimalan željeni ođogovor (npr., terapijski ili profilaktički odgovor). Na primer, može se dati jedan bolus, može se dati pođeljeno u nekoliko doza tokom vremena ili se doza može proporcionalno smanjiti ili povećati u skladu sa potrebama terapijske situacije. Naročito je pogodno formulisati parenteralne kompozicije u jedinične doze zbog lakoće davanja i uniformnosti doza. Jedinična doza, kao što se ovde koristi, odnosi se na fizički diskretne jedinice pogodne za jedinične doze za lečenje sisarskih subjekata; svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu aktivnog jedinjenja, izračunatu da proizvede željeni terapijski efekat u spoju sa potrebnim farmaceutskim nosačem. Specifikacija za jedinične doze iz pronalaska je diktirana i direktno zavisi od (a) jedinstvenih osobina antitela na CD40 ili dela antitela i određenog terapijskog ili profilaktičkog efekta koji se želi postići i (b) ograničenja inherentnih načinu pravljenja takvog antitela za lečenje senzitivnosti kod pojedinaca.
Primer neograničavajućeg opsega za terapijski ili profilaktički efektivnu količinu antitela ili dela antitela iz pronalaska je 0,025 do 50 mg/kg, poželjnije 0,1 do 50 mg/kg, još poželjnije 0,1-25, 0,1 do 10 ili 0,1 do 3 mg/kg. Treba napomenuti da vrcdnosii doza mogu da variraju sa tipom i jačinom stanja koje se olakšava. Podrazumeva se, dalje, da se za svakog pojedinačnog subjekta, specifični režimi doziranja podešavaju tokom vremena u skladu sa potrebama pojedinca i profesionalnom procenom osobe koja daje ili nadgleda davanje kompozicija i da su opsezi doza prethodno dati ovde samo primer, bez namere da se ograniči opseg ili praksa davanja kompozicija o kojoj se govori.
Jedan drugi aspekt ovog pronalaska obezbeđuje komplete koji sadrže antitelo na CD40 ili dco antitela iz pronalaska ili kompoziciju koja sadrži takvo antitelo. Komplet može da obuhvati, kao dodatak na antitelo ili kompoziciju, dijagnostičke ili terapijske agense. Komplet takođe može da obuhvati uputstva za upotrebu u dijagnostičkom ili terapijskom metodu, U poželjnom izvođenju, komplet obuhvata antitelo ili kompoziciju koja ga sadrži i dijagnostički agens koji se može koristiti u metodu opisanom niže. U jednom drugom poželjnom izvođenju, komplet obuhvata antitelo ili kompoziciju koji ga sadrži ijedan ili više terapijskih agenasa koji se mogu koristiti u metodu opisanom niže.
Ovaj pronalazak se takođe odnosi na kompozicije za inhibiranje abnormalnog rasta ćelija u sisaru, koje sadrže količinu antitela iz pronalaska u kombinaciji sa nekom količinom hemoterapeutika, gde su količine jedinjenja, soli, solvata ili proleka i hemoterapeutika zajedno efektivne u inhibiranju abnormalnog rasta ćelija. Mnogi hemoterapeutici su danas poznati u struci. U nekim izvođenjima, hemoterapeutik je odabran iz grupe koju čine milotički inhibitori, agensi za alkilovanje, anti-metaboliti, antibiotici koji se interkaliraju, inhibitori faktora rasta, inhibitori ćelijskog ciklusa, enzimi, inhibitori topoizomeraze, modifikatori biološkog odgovora, anti-hormoni, tj. anti androgcni i anti-angiogenični agenSl.
Anti-angiogenični agensi, kakvi su inhibitori MMP-2 (matriks-metaloproteinaza 2), inhibitori MMP-9 (matriks-metaloproteinaza 9), i inhibitori COX-Il (ciklooksigenaza II), mogu se koristiti u sprezi sa antitelom na CD40 iz pronalaska. Primeri korisnih inhibitora COX-II uključuju CELEBREX™ (alekoksib), valdekoksib, i rofekoksib. Primeri korisnih inhibitora nietaloproteinaze matriksa su opisani u WO 96/33172 (objavljen 24. oktobra, 1996), WO 96/27583 (objavljen 7. marta,1996), European Patent Application No. 97304971.1 (podneta 8. jula, 1997), European Patent Application No.99308617. 2 (podneta 29. oktobra, 1999), WO 98/07697 (objavljen 26. februara,1998), WO 98/03516 (objavljen 29. januara, 1998), WO 98/34918 (objavljen 13. avgusta,1998), W098/34915 (objavljen 13. avgusta,1998), W098/33768 (objavljen 6. avgusta,1998), WO 98/30566 (objavljen 16. jula,1998), European Patent Publication 606,046 (objavljen 13. jula,1994), European Patent Publication 931,788 (objavljen 28. jula, 1999), WO 90/05719 (objavljen 31. maja,1990), WO 99/52910 (objavljen 21. oktobra, 1999), WO 99/52889 (objavljen 21. oktobra, 1999), WO 99/29667 (objavljen 17. juna,1999), PCT International Application No. PCT/IB98/01113 (podneta 21. jula, 1998), European Patent Application No. 99302232.1 (podneta 25. marta,1999), patentna prijava u Velikoj Britaniji broj 9912961.1 (podneta 3. juna,1999), U.S. Provisional Application No. 60/148,464 (podneta 12. avgusta,1999), U.S. Patent 5,863,949 (izdat 26. januara, 1999), U.S. Patent 5,861,510 (izdat 19. januara,1999) i European Patent Publication 780,386 (objavljena 25. juna,1997), koji su svi ovde u celini inkorporisani referencama. Poželjni inhibitori MMP su oni koji ne pokazuju artralgiju. Poželjniji su oni koji selektivno inhibiraju MMP-2 i/ili MMP 9 u odnosu na druge matriks melaloproteinaze (tj. MMP-1, MMP-3, MMP-4, MMP-5, MMP-6, MMP-7, MMP-8, MMP-10, MMP-11, MMP-12 i MMP-13). Neki specifični primeri inhibitora MMP korisni u ovom pronalasku su AG-3340, RO 32-3555, RS 13-0830 i jedinjenja navedena u sledcćoj listi: 3-[[4-(4-fluoro-fenoksi)-benzensuIfonil]-(l -hidroksikarbamoiI-ciklopentil)-amino]-propionska kiselina; hidroksiamid 3-egzo-3-[4-(4-fluoro-fenoksi)-benzensulfonilamino]-8-oksa-biciklo[3.2.1]oktan-3-karboksil-ne kiseline; hidroksiamid (2R.3R) l-[4-(2-hloro-4-fluoro-benziloksi)-benzensulfonil]-3-hidroksi-3-metil-piperidin-2-karboksiIne kiseline; hidroksiamid 4-[4-(4-fluoro-fenoksi)-benzensulfonilamino]-tetrahidro-piran-4-karboksilne kiseline; 3-[[4-(4-fluoro-fenoksi)-benzensulfonil]-(l-hidroksikarbamoil-ciklobutil)-amino]-propionska kiselina; hidroksiamid 4-[4-(4-hloro-fenoksi)-benzensulfonilamino]-tetrahidro-piran-4-karboksilne kiseline; liidroksi-amid (R)3-[4-(4-hloro-fenoksi)-benzensulfonilamino]-tetraliidro-piran-3-karboksiIne kiseline; hidroksiamid (2R,3R)l-[4-(4-fluoro-2-methil-benziloksi)-benzensulfonil]-3-hidroksi-3-metil-piperidin-2-karboksilne kiseline; 3-[[4-(4-fluoro-fenoksi)-benzensulfonil]-(l-hidroksi-karbamoil-l-metil-etil)-amino] propionska kiselina; 3-[[4-(4-fluoro-fenoksi)-benzensulfonil]-(4-hidroksikarbamoil-tetrahiđro-piran-4-il)-ammo]-propionska kiselina; hidroksiamid 3-egzo-3-14-(4-hloro-fenoksi)-benzensulfonilamino]-8-oksa-biciklo[3.2.1]oktan-3-karboksilne kiseline; hidroksiamid 3-endo-3-[4-(4-fluoro-fenoksi)-benzensulfonilamino]-8-oksa-biciklo[3.2.1] oktan-3-karboksilne kiseline i hidroksiamid (R)3-[4-(4-fluoro-fenoksi)-benzensulfonil amino]-tetrahidro-furan-3-karboksilne kiseline i farmaceutski prihvatljive soli i solvati navedenih jeđinjenj a.
Jedinjenje iz pronalaska se može koristiti i sa inhibitorima signalne transdukcije, kao što su agensi koji mogu da inhibiraju odgovore EGF-R (receptor epidermijskog faktora rasta), kao što su EGF-R antitela, EGF antitela i molekuli koji su inhibitori EGF-R; inhibitori VEGF (vaskulami endotelijski faktor rasta), kao što su receptori VEGF i molekuli koji mogli da inhibiraju VEGF i inhibitori erbB2 receptora, kao što su organski molekuli ili antitela koja se vezuju za receptor erbB2, na primer, HERCEPTIN™ (Genentech, Ine.). Inliibitori EGF-R su opisani u, na primer, WO 95/19970 (objavljen 27. jula, 1995), WO 98/14451 (objavljen 9. aprila, 1998), WO 98/02434 (objavljen 22. januara, 1998) i United States Patent 5,747,498 (izdat 5. maja, 1998) i takve supstance mogu da se koriste u ovom pronalasku kao što je ovde opisano. Agensi za inhibiranje EGFR uključuju, ali nisu ograničeni na, monoklonska antitela C225 i anti-EGFR 22Mab (ImClone Systems Incorporated), ABX-EGF (Abgenix/Cell Genesys), EMD-7200 (Merck KgaA), EMD-5590 (Merck KgaA), MDX-447/H-477 (Medarex Ine. i Merck KgaA), i jedinjenja ZD-1834, ZD-1838 i ZD-1839 (AstraZeneca), PKI-166 (Novartis), PKI-166/CGP-75166 (Novartis), PTK 787 (Novartis), CP 701 (Cephalon), leflunomid (Pharmacia/Sugen), CI-1033 (Wamer Lambert Parke Daviš), CI-1033/PD 183,805 (Wamer Lambert Parke Daviš), CL-387,785 (Wyeth-Ayerst), BBR-1611 (Boehringer Mannheim GmbH/Roche), Naamiđine A (Bristol Myers Squibb), RC-3940-II (Pharmacia), BIBX-1382 (Boehringer Ingetheim), OLX-103 (Merck & Co.), VRCTC-310 (Ventech Research), toksin EGF fuzije (Seragen Ine.), DAB-389 (Seragen/Lilgand), ZM-252808 (Imperial Cancer Research Fund), RG-50864 (INSERM), LFM-A12 (Parker Hughes Cancer Center), WHI-P97 (Parker Hughes Cancer Center), GW-282974 (Glaxo), KT-8391 (Kyowa Hakko) i EGF-R vakcina (VorkMedical/Centro del hnmimologia Molecular (C1M)). Ovi i drugi agensi koji inhibiraju EGF-R mogu se koristiti u ovom pronalasku.
Inhibitori VEGF, na primer SU-541Ć i SU-6668 (Sugen Ine.), SH- 268 (Schering), i NX-1838 (NeXslar) mogu se takođe kombinovati sa jedinjenjima iz ovog pronalaska. Inhibitori VEGF su opisani u, na primer, WO 99/24440 (objavljen 20. maja, 1999), PCT International Application PCT/IB99/00797 (podneta 3. maja,1999), WO 95/21613 (objavljen 17. avgusta, 1995), WO 99/61422 (objavljen 2. decembra,1999), United States Patent 5,834,504 (izdat 10. novembra, 1998), WO 98/50356 (objavljen 12. novembra, 1998), United States Patent 5,883,113 (izdat 16. marta,1999), United States Patent 5,886,020 (izdat 23. marta,1999), United States Patent 5,792,783 (izdat 11. avgusta, 1998), WO 99/10349 (objavljen 4. marta,1999), WO 97/32856 (objavljen 12. septembra, 1997), WO 97/22596 (objavljen 26. juna, 1997), WO 98/54093 (objavljen 3. decembra, 1998), WO 98/02438 (objavljen 22. januara, 1998), WO 99/16755 (objavljen 8. aprila,1999), i WO 98/02437 (objavljen 22. januara, 1998), koji su svi ovde u celini inkorporisani referencama. Drugi primeri nekih specifičnih iiihibitora VEGF korisnih u ovom pronalasku su IM862 (Cytran Ine.); anti-VEGF monoklonsko antitelo od Genentech, Ine. i angiozim, sintetički ribozim od Ribozyme i Chiron. Ovi i drugi inhibitori VEGF mogu se koristiti u ovom pronalasku kao što je ovde opisano. Inhibitori receptora erbB2, kao što je GW-282974 (GIaxo Wellcome plc) i monoklonska antitela AR-209 (Aronex Phannaceuticals Ine.) i 2B-1 (Chiron), se mogu dalje kombinovati sa jedinjenjima iz pronalaska, na primer, oni na koje je ukazano u WO 98/02434 (objavljen 22. januara, 1998), WO 99/35146 (objavljen 15. jula,1999), W099/35132 (objavljen 15. jula,1999), WO 98/02437 (objavljen januara 22, 1998), WO 97/13760 (objavljen April 17, 1997), WO 95/19970 (objavljen 27. jula, 1995), United States Patent 5,587,458 (izdat 24. decembra, 1996), i United States Patent 5,877,305 (izdat 2. marta, 1999), koji su svi ovde u celini inkorporisani referencama. Inhibitori receptora erbB2 korisni u ovom. pronalasku su takođe opisani u United States Provisional Application No. 60/117,341, pođnetoj 27. januara, 1999, i u United States Provisional Application No. 60/117,346, podnetoj 27. januara, 1999, koje su obe ovde u celini inkorporisane referencama. Jedinjenja inhibitori erbB2 receptora i supstance opisane u prethodno pomenutim PCT prijavama, patentima u SAD, i privremenim prijavama u SAD, kao i druga jedinjenja i supstance koje inhibiraju receptor erbB2, mogu se koristiti sa jedinjenjem iz ovog pronalaska u skladu sa sadašnjim pronalaskom.
Agensi protiv preživljavanja uključuju anti-IGF-lR antitela i anti-integrinske agense, kao što su anti-integrin antitela.
Dijagnostičke metode u upotrebi
U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje dijagnostičke metode. Anti-CD40 antitela se mogu koristiti za detekciju CD40 u biološkom uzorku in vitro ili in vivo, U jednom izvođenju, pronalazak obezbeđuje postupak za dijagnostikovanje prisustva ili lokacije tumora koji eksprimira CD40 u subjektu kome je to potrebno, koji sadrži korake injektiranja antitela u subjekta, određivanja ekspresije CD40 u subjektu lokalizovanjem gde se vezalo antitelo, upoređivanja ekspresije u subjektu sa onom kod normalnog referentnog subjekta ili sa standardom i dijagnostikovanja prisustva ili lokacije tumora.
Anti-CD40 antitela se mogu koristiti u uobičajenom imunoeseju, uključujući, bez ograničenja, ELISA, RIA, FACS, imunohistohemiju tkiva, Westem blot ili imunoprecipitaciju. Anti-CD40 antitela iz pronalaska mogu se koristiti za detekciju CD40 čoveka. U jednom drugom izvođenju, antitela na CD40 mogu se koristiti za detekciju CD40 primata Starog sveta, kao što su cinomolgus i rezus majmuni, šimpanze i čovekolikilr majmuna. Pronalazak obezbeđuje metod za detekciju CD40 u biološkom uzorku koji obuhvata dovođenje biološkog uzorka u kontakt sa antitelom na CD40m iz pronalaska i detektovanjem vezanog antitela. U jednom izvođenju, antitelo na CD40 je direktno obeleženo detektabilnim obeleživačem. U jednom drugom izvođenju, antitelo na CĐ40 (prvo antitelo) je neobeleženo, a drugo antitelo ili drugi molekul koji može da veže antitelo na CD40 je obeležen. Kao što je stručnjaku dobro poznato, drugo antitelo se bira tako da je sposobno da specifično veže određenu vrstu i klasu prvog antitela. Na primer, ako je antitelo na CD40 humani IgG, onda sekundarno antitelo može da bude anti-humani IgG. Drugi molekuli koji mogu da se vežu za antitela uključuju, bez ograničenja, Protein A i Protein G, oba komercijalno dostupna, npr., od Pierce Chemical Co.
Pogodni obeleživači za antitelo ili sekundarno antitelo su opisani gore i uključuju razne enzime, prostetičke grupe, fluorescentne materijale, luminescentne materijale i radioaktivne materijale. Primeri pogodnih enzima uključuju peroksidazu iz rena, alkalnu fosfatazu, p-galaktozidazu ili acetilholineslerazu; primeri pogodnih kompleksa prostetičkih grupa uključuju streptavidin/biotin i avidin/biotin; primeri pogodnih fluorescentnih materijala uključuju umbeliferon, fluorescein, fluorescein izotiocijanat, rodamin, đihlorotriazinilamin fluorescein, dansil hlorid ili fikoeritrin; primer luminescentnog materijala je luminol i primeri pogodnih radioaktivnih materijala n\ 13lI, 3SS ili 3H.
U drugim izvođenjima, CD40 se može testirati u biološkom uzorku kompeticionim imunoesejem koristeći CD40 standarde obeležcne supstancama i neobeleženo antitelo na CD40. U ovom testu, biološki uzorak, obeleženi CD40 standardi i antitelo na CD40 se kombinuju i određuje se količina obeleženenog CD40 standarda vezanog za neobeleženo antitelo. Količina CD40 u biološkom uzorku je obrnuto proporcionalna količini obeleženenog CD40 standarda vezanog za antitelo na CD40.
Imunoeseji izloženi gore se mogu koristiti u mnoge svrhe. Na primer, antitela na CD40 se mogu koristiti za detekciju CD40 u ćelijama ćelijske kulture. U jednom poželjnom izvođenju, antitela na CD40 se koriste za određivanje količine CD40 na površini ćelija koje su tretirane raznim jedinjenjima. Ovaj metođ se može koristiti za identifikaciju jedinjenja koja su korisna za aktivaciju ili inhibiciju CD40. Prema ovom metodu, jedan uzorak ćelija se neko vreme tretira testiranim jedinjenjem, dok se drugi uzorak ostavlja netretiran. Ako se meri ukupan nivo CD40, ćelije se liziraju i ukupan nivo CD40 se meri pomoću jednog od imunoesej a opisanih gore, Upoređuju se ukupni nivoi CD40 u tretiranim i netretiranim ćelijama da bi se odredio efekat testiranog jedinjenja.
Poželjan imunoesej za merenje ukupnih nivoa CD40 je ELISA ili Westem blot. Ako se meri nivo CD40 na ćelijskoj površini, ćelije se ne liziraju i ukupni nivoi CD40 se mere pomoću jednog od imunoeseja opisanih gore. Poželjan imunoesej za određivanje nivoa CD40 na ćelijskoj površini uključuje stupnjeve obeležavanja proteina sa ćelijske površine detektabilnim obeleživačem, kao što je biotin ili t25I, imunoprecipitiranja CD40 antitelo na CD40m i zatim detektovanja obeleženog CD40. Drugi poželjan imunoesej za određivanje lokalizacije CD40, npr., nivoa na ćelijskoj površini, je pomoću imunohistohemije. Metodi kao što su ELISA, RIA, Westem blot, imunohistohemija, obeležavanje integralnih membranskih proteina sa ćelijske površine i imunoprecipitacija su dobro poznati u struci. Videti, npr., Harlow i Lane, supra. Pored toga, imunoeseji se mogu prilagoditi za rad na velikoj skali tokom celog pretraživanja da bi se testirao veliki broj jedinjenja bilo na aktivaciju, bilo na inhibiciju CD40.
Anti-CD40 antitela iz pronalaska se mogu koristiti i za određivanje nivoa CD40 u tkivu ili u ćelijama iz tkiva. U nekim izvođenjima, tkivo je bolesno tkivo. U nekim izvođenjima, tkivo je tumor ili njegova biopsija. U nekim izvođenjima postupka, tkivo ili njegova biopsija se iseca iz pacijenta. Tkivo ili biopsija se zatim koristi u imunoeseju da bi se odredili, npr., ukupni nivoi CD40, nivoi CD40 na površini ćelija ili lokalizacija CD40 metodima koji su diskutovani gore.
Gore opisan dijagnostički postupak se može koristiti za utvrđivanje da )i tumor eksprimira visoke nivoe CD40, koji bi mogli ukazati na tumor kao metu za tretman antitelom na CD40. Dalje, isti metod se može koristiti i za praćenje efekta tretmana antitelo na CD40m enđometrijuma, karcinomi cerviksa, karcinomi vagine ili karcinomi vulve), kancer ezofagusa, kancer tankog creva, kancer endokrinog sistema (npr., kancer tiroidee, paratiroidee ili adrenalnih žlezda), sarkomi mekih tkiva, leukemija, mijelom, multipli mijelom, kancer uretre, kancer penisa, kancer prostate, hronična ili akutna leukemija, solidni tumori detinjstva, Hodgkin-ova bolest, limfomi limfocita, nehoćkinski limfom, kancer bešike, kancer jetre, renalni kancer, kancer bubrega ili mokraćnih puteva (npr., karcinom renalnih ćelija, karcinom renahiog pelvisa) ili neoplazme centralnog nervnog sistema (npr., primami CNS limfom, tumori kičmene osovine, gliomi moždanog stabla ili adenomi hipofize), gliomi ili fibro sarkomi.
Antitelo se može davati od tri puta na dan do jednom u šest meseci i poželjno se može davati oralnim, mukoznim, bukalnim, intranazalnim, inhalacijskim, intravenoznim, subkutanim, intramuskulamim, parenteralnim, intratumorskim, transdermalnim ili topičnim putem. Antitelo se takođe može davati kontinualno preko mini pumpe. Antitelo će se obično davati dok god je tumor prisutan, uz uslov da antitelo izaziva prestanak rasta ili smanjenje težine ili zapremine tumora. Doze antitela će obično biti u opsegu od 0,025 do 50 mg/kg, poželjnije, od 0,1 do 50 mg/kg, još poželjnije, od 0,1-20 mg/kg, 0,l-10mg/kg, 0,l-5mg/kg ili čak, još poželjnije, od 0,1-2 mg/kg. Antitelo se takođe može davati profilaktički.
U nekim izvođenjima, antitelo na CD40 se daje kao deo terapijskog režima koji uključuje jedan ili više dodatnih antineoplastičkih lekova ili molekula pacijentu koji ima hiperproliferativni poremećaj, kao što je kancer ili tumor. Tipični antitumorski agensi uključuju, ali nisu ograničeni na, mitotičke inhibitore, agense za alkilovanje, anti-metabolite, agense za interkalaciju, inhibitore faktora rasta, inhibitore ćelijskog ciklusa, enzime, inhibitore topoizomeraza, modifikatore bioloških odgovora, anti-hormone, inhibitore kinaza, inhibitore matriks metaloproteaze, genetske terapeutike i anti-androgene. U poželjnijim izvođenjima, antitelo na CD40 se daje sa nekim neoplastičkim agensom, kao što je adriamicin ili taksol. U poželjnim izvođenjima, anti-CD40 terapija se izvodi paralelno sa radioterapijom, hemoterapijom, fotodinamskom terapijom, hirurgijom ili nekom drugom imunoterapijom. U nekim izvođenjima, antitelo na CD40 se daje sa jednim ili više dodatnih antitela. Na primer, antitelo na CD40 se može davati sa antitelima za koja se zna da inhibiraju proliferaciju ćelija tumora ili kancera. Takva antitela uključuju, ali nisu ograničena na, antitelo koje inhibira CTLA4, receptor erbB2, EGF-R, IGF-1R, CD20 ili VEGF.
U nekim izvođenjima, antiteio na CD40 se obeležava radioaktivnim obeleživačem, imunotoksinom ili toksinom, ili fuzionim proteinom koji sadrži toksičan peptid. Antiteio na CD40 ili fuzioni protein antitela na CD40 usmerava radioaktivni obeleživač, imunotoksin, toksin ili toksični peptid na tumor ili na ćelije kancera. U jednom poželjnom izvođenju, tumor ili ćelije kancera intemalizuju radioaktivni obeleživač, imunotoksin, toksin ili toksični peptid pošto se antiteio na CD40 veže za CD40 na površini ćelija.
U jednom drugom aspektu, antiteio na CD40 se može koristiti terapijski da indukuje apoptozu specifičnih ćelija u pacijentu. U mnogim slučajevima, ćelije ciljane za apoptozu su kancerozne ili ćelije tumora. Prema tome, pronalazak obezbeđuje metod inđukovanja apoptoze davanjem antitela na CD40 pacijentu kome je to potrebno.
U jednom drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje metod davanja aktivirajućeg antitela na CD40 pacijentu za povećanje aktivnosti CD40. Antiteio na CD40 se daje sa jednim ili više drugih faktora koji povećavaju aktivnost CD40. Takvi faktori uključuju CD40L i/ili analoge CD40L koji aktiviraju CD40.
U nekim izvođenjima, antiteio na CD40 se daje sa jednim ili više dodatnih agenasa koji poboljšavaju imunu funkciju, uključujući, bez ograničenja, IFN-pi, IL-2, IL-8, IL-12, IL-15, IL-18, EL-23, !FN-y i GM-CSF.
U nekim izvođenjima, humano agonističko antiteio na CD40 iz pronalaska se koristi kao adjuvans za povećanje efikasnosti vakcine. Kad se koristi na ovaj način, anti-CD-40 antiteio aktivira CD40 na ćelijama koje prezentuju antigen, uključujući B ćelije, dendritske ćelije i monocite, a i povećava proizvodnju imunomodulatomih molekula, kao što su citokini i hemokini. Imunostimulatoran efekat antitela pojačava imuni odgovor vakcinisanog subjekta na antigen iz vakcine.
U jednom drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje metod za pravljenje vakcine za dendritske ćelije za kancer ili za imunoterapiju dendritskih ćelija. Prema metodu, dendritske ćelije iz pacijenta sa kancerom se gaje 1-5 dana sa lizatom ili homogenatom tumora, ćelijama tumora ubijenim zračenjem ili na neki drugi način, iii sa antigenima specifičnim za tumor (npr., peptidima, idiotipovima) i sa 1-10 µg/ml antitela na CD40. Dendritske ćelije stimulisane tumorskim antigenom se vrate injekcijom u pacijenta da bi se stimulisali anti-tumorski imuni odgovori, naročito anti-tumorski CTL odgovori. Dendritske ćelije izvedene iz monocita za korišćenje u ovom metodu mogu se dobiti iz uzorka periferne krvi gajenjem u IL-4 i GM-CSF. Dendritske ćelije se takođe mogu dobiti iz koštane srži pacijenta magnetnim prečišćavanjem ili sortiranjem CD34 pozitivnih ćelija, posle čega se gaje u IL-4 i GM-CSF.
Genska terapija
Molekuli nukleinske kiseline ovog pronalaska mogu se davati pacijentu kome su oni potrebni genskom terapijom. Terapija može biti bilo in vivo, bilo ex vivo. U jednom poželjnom izvođenju, molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju i težak lanac i lak lanac se daju pacijentu. U poželjnijem izvođenju, molekuli nukleinske kiseline se daju u takvom obliku u kom su stabilno integrisani u hromozome B ćelija, zato što su ove ćelije specijalizovane za proizvodnju antitela. U jednom poželjnom izvođenju, prekursorske B ćelije su transfektovane ili inficirane ex vivo i vraćene transplantacijom u pacijenta kome su potrebne. U jednom drugom izvođenju, prekursorske B ćelije ili druge ćelije su inficirane in vivo virusom za koji se zna da inficira tip ćelija od interesa. Tipični vektori koji se koriste za gensku terapiju uključuju lipozome, plazmide i virusne vektore. Tipični virusni vektori su retrovimsi, ađenovirusi i adeno-asocirani viruSl. Posle inficiranja bilo in vivo, bilo ex vivo, nivoi ekspresije antitela se mogu pratiti uzimanjem uzorka iz tretiranog pacijenta i upotrebom bilo kog imunoeseja poznatog u struci ili diskutovanog ovde.
U jednom poželjnom izvođenju, metod genske terapije sadrži stupnjeve davanja izolovanog molekula nukleinske kiseline koji kodira težak lanac ili njegov deo koji vezuje antigen antitela na CD40 i eksprimiranja molekula nukleinske kiseline. U jednom drugom izvođenju, metod genske terapije sadrži stupnjeve davanja izolovanog molekula nukleinske kiseline koji kodira lak lanac ili njegov deo koji vezuje antigen antitela na CD40 i eksprimiranja molekula nukleinske kiseline. U poželjnijem metodu, metod genske terapije sadrži stupnjeve davanja izolovanog molekula nukleinske kiseline koji kodira težak lanac ili njegov deo koji vezuje antigen antitela na CD40 i eksprimiranja molekula nukleinske kiseline
i izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira lak lanac ili njegov deo koji vezuje antigen antitela na CD40 iz pronalaska i eksprimiranja molekula nukleinske kiseline. Metod genske terapije može da sadrži i korak davanja drugog agensa protiv kancera, kakv je taksol ili adriamicin.
Da bi se ovaj pronalazak mogao bolje razumeti, dati su sledeći primeri. Svrha ovih primera je isključivo ilustracija i ne treba ih shvatiti kao ograničenje opsega pronalaska ni na koji način.
PRIMERI
Generisanje hibridoma koji proizvode antitela na CD40
Antitela iz pronalaska su dobijena, odabrana i testirana na sledeći način.
Imunizacija i dobijanje hibridoma
Imunizirali smo osam do deset neđelja stare miševe XenoMice™ intraperitonealno ili u jastučiće zadnjih šapa, ili CD40-IgG fuzionim proteinom (10 pg/doza/miš) ili 300.19-CD40 ćelijama iz transfektovane ćelijske linije koja eksprimira humani CD40 na svojoj plazma membrani (10 xl06 ćelija/doza/miš). Ponavljali smo ovu dozu pet do sedam puta u periodu od tri do osam nedelja. Četiri dana pre fuzije, dali smo miševima poslednju injekciju vanćelijskog domena humanog CD40 in PBS. Fuzionisali smo limfocite iz slezine i limfnog čvora iz imunizovanih miševa sa ne-sekretomim mijelomima ćelijske linije P3-X63-Ag8.653 i podvrgli fuzionisane ćelije HAT selekciji kao što je prethodno opisano (Galfire and Milstein, Methods Enzymol. 73:3-46, 1981). Dobili smo panel hibridoma, koji svi luče CD40 specifična humana lgG2tc antitela. Odabrali smo jedanaest hibridoma za dalje ispitivanje i označili ih sa 3.1.1,7.1.2, 10.8.3,15.1.1,21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.29.1 i 24.2.1.
Deponovali smo hibridome 3.1.1, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1 i 21.4.1 u American Type Culture Collection (ATCC), saglasno budimpeštanskom ugovoru Budapest Treaty, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, 6. avgusta, 2001. Deponovali smo hibridome 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.29.1 i 24.2.1 u ATCC 16. jula, 2002. Hibridomima su dodeljeni sledeći depozitni brojevi:
PRIMER II
Sekvence antitela na CD40 dobiiene u skladu sa pronalaskom
Da bismo analizirali strukturu antitela napravljenih u skladu sa pronalaskom, klonirali smo nukleinske kiseline koje kodiraju fragmente teškog i lakog lanca iz hbridoma koji proizvode anti-CD40 monoklonska antitela. Kloniranje i sekvenciranje je postignuto na sledeći način.
Izolovali smo Poly(A)+ iRNK iz približno 2 x 10s ćelija hibridoma dobijenih iz
XenoMouse™ miševa imunizovanih humanim CD40, kao što je opisano u Primeru I pomoću kompleta Fast-Track (Invitrogen). Pratili smo pomoću PCR sintezu cDNK pomoću nasumičnih prajmera. Koristili smo prajmere varijabilnih regiona humanog Vh ili humanog Vk specifične za porodice (Marks et al., "Oligonucleotide primers for polymerase chain reaction amplification of human immunoglobulin variable genes and design of family-specific oligonucleotide probes." Eur. J. Immunol. 21:985-991 (1991)) ili univerzalni humani Vh prajmer, MG-30, CAGGTGCAGCTGGAGCAGTCIGG (SEQ ID NO: 118), u sprezi sa prajmerima specifičnim za humani Cj2 konstantni region, MG-40d, 5'-GCTGAGGGAGTAGAGTCCTGAGGA-3' (SEQ fD NO: 119) ili Ck konstantni region (hicP2; kao što je prethodno opisano u Green et al., 1994). Dobili smo molekule nukleinskih kiselina koji kodiraju transkripte humanog teškog i kapa lakog lanca iz hibridoma koji proizvode anti-CĐ40, direktnim sekvenciranjem PCR produkata dobij enih iz poly(A+) RNK pomoću prajmera opisanih gore. Klonirali smo i PCR produkte u pCRII pomoću kompleta za kloniranje TA (Invitrogen) i sekvencirali oba lanca pomoću Prism kompleta za sekvenciranje sa obojenim didezoksiribonukleotidima i ABI 377 mašine za sekvenciranje. Analizirali smo sve sekvence njihovim poređenjem sa "V BASE sequence directory’' (Tomlinson et ah, MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK) koristeći MacVector i Geneworks softverske programe.
Dalje, podvrgli smo monoklonska antitela 3.1.1, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.28.1, 23.29.1 i 24.2.1 kloniranju i sekvenciranju ćele DNK. Za takvo sekvenciranje, izolovali smo RNK iz oko 4 x IO6 ćelija hibridoma pomoću QIAGEN RNeasy RNA kompleta za izolovanje (QIAGEN). Reverzno smo transkribovali iRNK pomoću oligo-dT (18) i Advantage RT/PCR kompleta (Clonetech). Za umnožavanje smo koristili V Base da dizajniramo prajmere za kodirajući lanac (forvvard primers), koji su obuhvatali restrikciona mesta, optimalnu sekvencu Kozakove, ATG početno mesto i deo signalne sekvence teškog lanca. Tabela 1 nabraja prajmere za kodirajući lanac za umnožavanje korišćene za sekvenciranje klonova antitela.
TABELA I
Koristili smo isti metod za dizajniranje prajmera koji uključuje 3' kodirajuće sekvence, stop kodon IgG2 konstantnog regiona, (5'-TTCTCTGATCAGAATTCCTATCATTTAC CCGGAGACAGGGAGAG-3') (SEQ ID NO: 125) i restrikciona mesta.
Koristili smo ponovo isti metod da dizajniramo prajmer oko ATG početnog mesta kapa lanca: (5'-CTTCAAGCTTACCCGGGCCACCATGAGGCTCCCTGCTCAGC-3') (SEQ ID NO: 126). Optimalna sekvenca Kozakove (CCGCCACC) je dodala 5‘ u odnosu na početni ATG. Ovaj prajmer je korišćen za kloniranje PCR-om lakih lanaca sleđećih klonova antitela:
3.1.1, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1,21.4.1,21.2.1,22.1.1, 23.5.1 i 23.29.1, Koristili smo drugi prajmer za kodirajući lanac S’-TCTTCAAGCTTGCCCGGGCCCGCCACCATGGAAACCCCAGC GCAG-31 (SEQ ED NO: 134) da kloniramo lake lance klonova 23.28.1 i 24.2.1. Opet smo koristili isti metod da dizajniramo prajmer oko stop kodona kapa konstantnog regiona (5'-TTCTTTGATCAGAATTCTCACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGC-3') (SEQ ID NO: 127). Koristili smo parove prajmera da amplifikujemo cDNK pomoću Advantage High Fidelity PCR Kit (Clonetech). Dobili smo sekvencu PCR produkta direktnim sekvenciranjem pomoću standardnili telmika (npr., šetanjem pomoću prajmera) i kompleta za sekvenciranje sa obojenim didezoksiribonukleotidima i ABI mašine za sekvenciranje. Klonirali smo proizvod PCR u sisarski ekspresioni vektor i sekvencirali smo klonove da potvrdimo somatske mutacije. Za svaki klon, proverili smo sekvencu na oba lanca u najmanje tri reakcije.
Analiza upotrebe gena
Tabela 2 prikazuje upotrebu gena pokazanu pomoću odabranih hibridomskih klonova antitela u skladu sa pronalaskom:
TABELA 2
Upotreba gena lakih i teških lanaca
Analiza sekvenci i mutacija
Jasno je da analiza upotrebe gena daje samo ograničen pregled strukture antitela. Pošto B ćelije u XenoMouse™ životinjama stohastički generišu transkripte za V-D-J teške ili V-J kapa lake lance, postoji niz sekundarnih procesa koji se javljaju, uključujući, bez ograničenja, somatsku hipemmtaciju, delecije, N-adicije i ekstenzije CDR3. Videti, na primer, Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997) i International Patent Publication WO 98/24893. U skladu s tim, da bismo dalje ispitali strukturu antitela, generisali smo predviđene amino-kiselinske sekvence antitela iz cDNK dobijenih iz klonova Tabela A prikazuje identifikatore sekvenci za svaki od nukleotida i predviđene aminokiselinske sekvence sekvenciranih antitela.
Tabele 3-7 prikazuju nukleotidne i predviđene aminokiselinske sekvence teških i kapa lakih lanaca antitela 3.1.1 (Tabela 3), 7.1.2 (Tabela 4), 10.8.3 (Tabela 5), 15.1.1 (Tabela 6) i 21.4.1 (Tabela 7).
Tabele 8-13 prikazuju nukleotidne i predviđene aminokiselinske sekvence variabilnih domena teških i kapa lakih lanaca antitela 21.2.1 (Tabela 8), 22.1.1 (Tabela 9), 23.5.1 (Tabela 10), 23.28.1 (Tabela 11), 23.29.1 (Tabela 12) i 24.2.1 (Tabela 13).
Sekvenca DNK iz sekvenciranja ćele dužine monoklonskog antitela 23.28.1 se razlikuje od sekvenci DNK dobijenih sekvenciranjem Vh regiona početnog proizvoda PCR za jedan par baza (C u G), što ima za rezultat promenu ostatka 16 prirodnog teškog lanca iz D u E.
Tabele 14-19 prikazuju nukleotidne i predviđene aminokiselinske sekvence teških i kapa lakih lanaca antitela 21.2.1 (Tabela 14), 22.1.1 (Tabela 15), 23.5.1 (Tabela 16), 23.28.1 (Tabela 17), 23.29.1 (Tabela 18) i 24.2.1 (Tabela 19). U Tabelama, signalne peptiđne sekvence (ili baze koje ih kodiraju) su podvučene.
Generisali smo dva mutirana antitela, 22.1.1 i 23.28.1. Težak lanac antitela 22.1.1 je mutirano da mu se promeni cisteinski ostatak na poziciji 109 u alaninski ostatak. Označili smo mutirani klon sa 22.1.1H-C019A. Lak lanac antitela 23.28.1 na poziciji 92 je takođe mutiran tako da mu se promeni cisteinski ostatak u alaninski ostatak. Označili smo mutirani klon sa 23.28.1L-C92A.
Mutageneza specifičnih ostataka je rađena tako što su dizajnirani prajmeri i korišćenje QuickChange Site Directed Mutagenesis Kit od Slratagene, prema uputstvima proizvođača. Mutacije su potvrđene automatizovanim sekvenciranjem i mutagenizovani inserti su subklonirani u ekspresione vektore.
Tabela 20 prikazuje nukleotidne i aminokiselinske sekvence mutiranog teškog lanca antitela 22.1.1H-C109A. Tabela 21 prikazuje nukleotidne i aminokiselinske sekvence mutiranog lakog lanca antitela 23.28.1. Mutirani kodoni DNK su obeleženi kurzivom. Mutiran aminokiselinski ostatak je obeležen masnim slovima.
Tabela 3: Sekvence DNK i proteina antitela 3,1.1
Tabela 4: Sekvence DNK i proteina antitela 7,1.2
Tabela 5: Sekvence DNK i proteina antitela 10. 8. 3
Tabela 6: Sekvence DNK i proteina antitela 15.1.1
Tabela 7: Sekvence DNK i proteina antitela 21.4.1 OPIS: SEKVENCA (signalna sekvenca podvučena):
Tabela 12: Sckvcnce DNK i proteina zrelih varijabilnih domena antjtela 23.29.1
Tabela 20: Sekvence DNK i proteina zrelih varijabilnih domena antiteU22.1.1H-C109A
PRIMER III
Analiza aminokiselinskih supstitucija u teškim i lakim lancima
Slike 1D-1H i 2D-2H prikazuju poređenja između predviđenih aminokiselinskih sekvenci varijabilnih domena teških lanaca monoklonskih antitela 3.1.1, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1,
21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.29.1 i 24.2.1 antitela i embrionskih aminokiselinskih sekvenci njihovih odgovarajućih gena. Većina CDR3 regiona teških lanaca sadrže aminokiselinske insercije.
DLRl gen korišćen u VH domenu antitela 21.4.1 kodira dva cisteinska (Cys) ostatka. Analiza masenom spektrometrijom i mođelovanje homologije su pokazali da su dva Cys ostatka vezana kao disulfid i da ova đisulfidna veza ne narušava strukturu antitela.
Slike 1A-1C i 2A-2C pokazuju poređenje sekvenci između predviđenih amino-kiselinskih sekvenci varijabilnih domena lakih lanaca klonova monoklonskih antitela 3.1.1, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1,21.4.1,21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.29.1 i 24.2.1 i embrionskih aminokiselinskih sekvenci njihovih odgovarajućih gena. Laki lanci ovih antitela su dobijeni iz tri različita gena za VK. Sedam od jedanaest antitela koriste gen za VK A3/A19, od kojih šest imaju mutacije u CDR1 regionu. Dalje, pet od sedam antitela koja koriste gen za VK A3/AI9, takođe koriste gen za Jκ1; u svim ovim antitelima prva aminokiselina, koja je dobijena iz gena za Jκ1, se sistematski menja iz W u R.
Razume se da mnoge od gore identifikovanih aminokiselinskih supstitucija ili insercija pošto je u bliskom susedstvu sa CDR ili unutar njega. Izgleda da bi takve supstitucije imale neki efekat na vezivanje antitela za molekul CD40. Dalje, takve supstitucije bi mogle da imaju značajan efekat na afinitet antitela.
PRIMER IV
Reaktivnost antitela iz pronalaska između bioloških vrsta
Uradili smo FACS analize da odredimo vezivanje i afinitet antitela iz pronalaska za CD40 iz različitih bioloških vrsta, posebno određenih majmuna starog sveta. Irikubirali smo alikvotc pune krvi čovcka i majmuna 1 sat na ledu, sa rastućim koncentracijama antitela na
CD40 iz pronalaska, prikazanih ovde, ili sa antitelom na KLH (keyhole limpet hemocyanin) kao negativnom kontrolom. Zatim smo inkubirali uzorke 30 minuta na ledu sa anti-humanim RPE (fikoeritrin), konjugovanim sa IgG2. Merili smo vezivanje protočnom citometrijom CD19/CD20 pozitivnih B ćelija i analizirali histograme intenziteta fluorescencije (F12-H) u zavisnosti od broja ćelija (Coimts) CellQuest softverom. Procenjivali smo vezivanje (Kd) za svako antitelo iz grafika srednjeg intenziteta fluorescencije u zavisnosti od koncentracije antitela. Kontrolisali smo nestajanje antitela merenjem vezivanja u opsegu koncentracija ćelija.
Testirali srao antitela 3.1.1, 7.1.2, 10.8.3, 15,1,1 i 21.4.1 na vezivanje za B ćelije čoveka, rezusa i cinomolgusa. Takođe smo testirali antitela 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1,
23.28.1, 23.29.1 i 24.2.1 na vezivanje za B ćelije čoveka i cinomolgusa.
Uočili smo da su maksimalan signal i koncentracija za pola maksimalnog vezivanja za majmunske ćelije, unutar faktora dva prema odgovarajućim parametrima za humane B ćelije. Nije nađeno vezivanje u sličnim eksperimentima sa krvlju miša, pacova, kunića i psa.
PRIMERV
Selektivnost antitela za CD40
Uradili smo još jedan in vitro test da odredimo selektivnost antitela iz pronalaska u odnosu na CD40.
ELISA za selektivnost na CD40: materijali i metode
Obložili smo ploču sa 96 ležišta FluroNUNC (Nunc CatNo. 475515) sa četiri antigena (lµg/ml, 100 pl/ležište, u 0,1M puferu natrijum bikarbonata, pH 9,6): CD40/Ig, CD44/Ig, RANK/Ig, 4-lBB/Tg, TNFR-l/Ig i TNFR-2/Ig (antigeni koje smo sami napravili) i ostavili preko noći na +4°C. Zatim smo oprali ploču tri puta PBST-om (PBS + 0,1% Tween-2Q) i blokirali je pomoću 150pl/ležište PBST+0,5% BSA. Inkubirali smo ploču na sobnoj temperaturi 1 sat, a onda je oprali PBST-om tri puta. Dalje, razblažili smo antitela na CD40 generisana u Primeru I u puferu za blokiranje do lµg/ml i dodali razblažena antitela ploči. Inkubirali smo ploču na sobnoj temperaturi I sat, a onda je oprali PBST-om tri puta. Zatim smo obradili ležišta koja sadrže antitela generisana u Primeru I pomoću i00 pl/ležište anli-humanim IgG2-HRP (Southern Biotech Cat No.9070-05) pri razblaženju 1:4000 u puferu za blokiranje. Takode, obradili smo jedan red anti-humanim IgG (Jackson Cat No, 209-035-088), razblaženim 1:5000 u puferu za blokiranje i dodali 100 pl/ležište da normalizujerao za oblaganje ploče. Takode smo, kao pozitivnu kontrolu, obradili jedan red anti-humanim CD40-HRP (Pharmingen Cat No. 345815/Custom konjugovan sa HRP), u koncentraciji 0,05, µg/ml, razblaženim u puferu za blokiranje. Inkubirali smo ploču na sobnoj temperaturi I sat, a onda je oprali PBST-om tri puta. Dodali smo supstrat TMB (K & P Labs), 100 pl/ležište, i inkubirali ploču 5 do 10 minuta. Zatim smo pročitali ploču pomoću Speckra-Max™ čitača ploče. Rezultati su pokazali da antitela imaju selektivnost za CD40 koja je bar 100 puta veća nego njihova selektivnost za RANK, 4-1BB, TNFR-1 i TNFR-2, tako Što je signal specifičan za CD40 (CD40 signal minus šum) bar 100 x veći nego odgovarajući signal za druge molekule.
PRIMER VI
Ispitivanja klasifikacije epitopa
Pokazavši da su antitela iz pronalaska selektivna za CD40, sproveli smo analizu kompetitivnog vezivanja pomoću BIAcore i FACS.
Ispitivanja kompeticije pomoću BIAcore
Sproveli smo ispitivanja kompeticije pomoću BIAcore da bismo odredili da li se humana antitela na CD40 iz pronalaska vezuju za isto ili različita mesla na CD40 molekulu.
U ovim eksperimentima, koristili smo instrument BIAcore 2000, sledeći protokole proizvođača. Protein-A je imobilisan na površinama senzorskih čipova BIAcore. Koncentracija zasićenja CD40-Ig koja sadrži vanćelijski domen CD40 je vezana za senzorski čip. Zatim smo vezali prvo humano agonističko antitelo na CD40 iz pronalaska, komercijalno antitelo na CD40 ili CD40L za CD40 koji je vezan za senzorski čip u uslovima zasićenja. Zatim smo merili sposobnost drugog humanog agonističkog antitela na CD40 iz pronalaska da kompetira sa prvim antitelom, komercijalnim antitelom ili CD40L u vezivanju za CD40. Ova tehnika nam je omogućila da rasporedimo antitela prema vezivnim grupama. Vezivanje za CD40 je ukazalo na prepoznavanje nezavisnog epitopa. Nedostatak vezivanja može da ukaže na prepoznavanje i3tog epitopa ili preklopljenih epitopa.
Sproveli smo ispitivanja pomoću FACS da bismo odredili da li se humana antitela na CD40 iz pronalaska vezuju za isto ili različita mesta na CD40 molekulu i da bismo odredili da li se ona vezuju za isto ili različito mesto na CD40 molekulu kao komercijalno dostupna antitela na CD40 EA5 (Alexis Cat. No. ANC-300-050), LOB7/6 (Serotec MCA/590PE) i 5C3 (Pharmingen # 555458 (neobeležena) i 555460 (PE obeležena za FACS).
Kontrastno smo obojili denđritske ćelije tretirane antitelima na CD40 iz pronalaska pomoću EA5 antitela obeleženih PE-om ili LOB7/6 antitela obeleženih PE-om na ledu 30 minuta. Posle pranja, bojenje ćelija je analizirano na citometru B-D kalibra. Smanjeno vezivanje komercijalnih antitela je interpretirano kao indikacija da se testirano antitelo vezalo za isti ili preklopljeni epitop.
Analiza kompcticije pomoću BLAcore i FACS je pokazala da se epitop koji prepoznaju mAb 21.4.1 antitela preklapa sa epitopom koji prepoznaju EA5 antitela, ne preklapa sa epitopom koji prepoznaju komercijalno dostupna LOB7/6 antitela i da se ne preklapa sa vezivnim mestom CD40L. Epitopi koje prepoznaju preostala antitela se preklapaju sa vezivnim mestom za CD40L.
Tabela 22 sumira rezultate ovih ispitivanja klasifikacije epitopa.
Klasifikacija određenih antitela na CD40 iz pronalaska na osnovu kompeticije za epitope,
rađena pomoću BIAcore
PR1MER VII
Pozitivna regulacija površinskih molekula antitelima na CD40
Sproveli smo test pune krvi da bismo odredili da li humana antitela na CD40 iz pronalaska pozitivno regulišu ekspresiju površinskih molekula na B ćelijama.
Puna krv čoveka ili primata je razblažena 1:1 RµMI medijumom i inkubirana 24 sata sa različitim koncentracijama CD40 agonističkog antitela ili sa kontrolama. Ćelije su bojene u toku 30 minuta (na ledu, u mraku) za HI.A-DR, 1CAM, B7-L, B7-2, CD19/CD20, CD40, CD23 i CD71, pomoću komercijalno dostupnih reagenasa za antitelo obeleženih fluorohromom. Ćelije su zatim analizirane na FACS-Caliber-u (Becton-Dickinson). B ćelije su identifikovane vezivanjem za CD 19 ili CD20 pozitivne ćelije i markeri aktivacije su određivani za ovo vezivno mesto.
Faktor maksimalnog povećanja (koliko puta je veća) medijane fluorescencije (za ≤ 1 j-ig/ml antitela) i srednje EC50, dobijeni zajedno od antitela na CD40 ovog pronalaska (21.4.1) su prikazani u Tabeli 23.
TABELA 23
Pozitivna regulacija površinskih molekula B ćelija antitelima na CD40
[0283] Sproveli smo i eksperimente da odredimo da li humana antitela na CD40 iz pronalaska pozitivno regulišu ekspresiju površinskih molekula dendritskih ćelija izvedenih iz monocita.
Dobijanje dendritskih ćelija iz monocita
Sakupljena je periferna krv iz normalnih humanih volontera. Mononukleame ćelije su izolovane korišćenjem Sigma Accuspin epruveta (St. Louis, MO), opranih RµMI medijumom (Gibco BRL, Rockville, MD) i stavljene u flašice za ćelijske kulture u koncentraciji 5 x 106/ml u kompletan RµMI medijum (koji sadrži 100 U/ml penicilina/streptomicina, 10 mM HBPES pufera, 2 mM glutamina, 0,1 mM neesencijalnih aniinokiselina; sve od Gibco BRL) sa 10% fetalnog govedjeg seruma (Hyclone, Logan, Utah). Posle inkubacije od 3 sata na 37°C (5% C02), ncadherovane ćelije su uklonjene i T ćelije su izolovane na selekcionim kolonama (R&D systems, Minneapolis, MN). Adherovane ćelije su oprane RµMI medijumom i inkubirane 7 dana u kompletnom RµMI medijumu, obogaćenom sa 10 ng/ml IL-4 (R&D systems) i 100 ng/ml GM-CSF (R&D systems). Neadherovane ćelije su zatim izolovane, oprane i korišćene kao dendritske ćelije izvedene iz monocita (mDC) za sve eksperimente. Preostale adherovane ćelije su uklonjene pomoću tripsin/EDTA i korišćene u eksperimentima gde su potrebni adherovani monociti.
Da bi se odredilo da li humana antitela na CD40 iz pronalaska pozitivno regulišu ekspresiju ćelijskih površinskih markera, dendritske ćelije izvedene iz monocita su gajene sa različitim koncentracijama agonističkih antitela 48-72 sata, a zatim obeležavana (30 minuta, na ledu, u mraku) za HLA-DR, ICAM, B7-1, B7-2, CD40 i CD83, pomoću komercijalno dostupnih reagenasa za antitelo obeleženih fluorohromom. Ćelije su zatim analizirane na FACS-Caliber-u (Becton-Dickinson).
Faktor maksimalnog povećanja medijane fluorescencije (za ≤ 1 µg/ml antitela) i srednja EC50, dobijeni zajedno od antitela na CD40 ovog pronalaska (21.4.1) su prikazani u Tabeli 24.
TABELA 24
Pozitivna regulacija površinskih molekula dendritskih ćelija antitelima na CD40 iz pronalaska
[0287] Sproveli smo slične eksperimente sa B ćelijama i mDC uz upotrebu različitih antitela na CD40 iz pronalaska i dodatnih markera. Merili smo ekspresiju površinskih molekula B ćelija (MHC-11, ICAM, B7-1, B7-2 i CD23) kao što je opisano gore, ali koristeći 1 µg/ml antitela na CD40. Rezultati ovog eksperimenta su prikazani u Tabeli 25. Merili smo ekspresiju površinskih molekula dendritskih ćelija (MHC-H, ICAM, B7-1, B7-2 i CD83) posle 72 sata kao što je prikazano gore, ali koristeći I (.ig/ml antitela na CD40. Rezultati ovog eksperimenta su prikazani u Tabeli 26. Tabele 25-26 prikazuju faktor povećanja srednjeg intenziteta ± standardna devijacija.
TABELA 25
Pozitivna regulacija površinskih molekula B ćelija antitelima na CD40 iz pronalaska
Pozitivna regulacija površinskih molekula denđritskih ćelija antitelima na CD40 iz pronalaska
Tabela 27 upoređuje pozitivnu regulaciju površinskih molekula u đendritskim ćelijama i u B ćelijama kroz odnos faktora povećanja na dendritskim ćelijama i faktora povećanja na B ćelijama.
TABELA 27
Pozitivna regulacija površinskih molekula na dendritskim ćelijama u odnosu na onu na B ćelijama
PRJMER VIII
Povećanje sekrecije citokina
Sproveli smo test sa dendritskim ćelijama izvedenim iz nionocita da bismo odredili da li humana antitela na CD40 iz pronalaska povećavaju sekreciju IL-12p40, IL-12p70 i IL-8.
Dendritske ćelije izvedene iz monocita i adherovani monociti su dobijeni kao što je opisano gore. Ćelije su gajene u prisustvu antitela na CD40 iz pronalaska (21.4.1) ili sa antitelom na KLH kao negativnom kontrolom. Citokini su mereni u supematantima na 24 sata pomoću ELISA (R&D systems). U nekim ispitivanjima (videti Tabelu 28), dendritske ćelije izvedene iz monocita tretirane antitelom su takođe bile ko-stimulisane bilo sa 100 ng/ml LPS (Sigtna), 1000 U/ml EFN-y (R&D systems), bilo sa 25 ng/ml IL-ip R&D systems.
Antitelo na CD40 je povećalo proizvodnju IL-I2p40,1L-I2p70 i IL-8 i u dendritskim ćelijama izvedenim iz monocita i u ađherovanim monocitima. Prisustvo LPS je dalje povećalo proizvodnju IL-12p40 i IL-12p70. Samo su minimalni nivoi citokina detektovani u super-natantima dendritskih ćelija inkubiranih sa antitelom za kontrolu izotipa, anti-KLH. Reprezentativni rezultati su prikazani u Tabeli 28 i na Slikama 3 i 4. Tabela 28 sumira glavne citokine koje su proizvele dendritske ćelije ili adherovani monociti pomoću 1 µg/ml antitela na CD40 iz pronalaska (21.4.1) ± 100 ng/ml LPS. Kao što je pokazano na Slici 3, antitelo na CD40 je povećalo proizvodnju IL-12p40 humanih dendritskih ćelija. Slika 4 ilustruje povećanu proizvodnju IL-12p70 humanih dendritskih ćelija u prisustvu antitela i 100 ng/ml LPS.
TABELA 28
Povećanje sekrecije IL-12p40, IL-12p70 i IL-8 pomoću antitela na CD40 iz pronalaska
Slični eksperimenti su sprovedeni uz upotrebu više antitela na CD40 iz pronalaska. Dendritske ćelije izvedene iz monocita su đobijene kao što je opisano gore i gajene u prisustvu različitih koncentracija antitela na CD40 i ko-stimulisane sa 100 ng/ml LPS (Sigma). IL-12p70 u supematantu je meren na 24 sata pomoću ELISA (R&D systems) i za svako antitelo je određena EC50. Rezultati eksperimenata su prikazani u Tabeli 29.
TABELA 29
Povećanje sekrecije IL-12p70 u dendritskim ćelijama
[0293] Testirali smo i sposobnost antitela na CD40 iz pronalaska da povećaju sekreciju IFN-gama iz T ćelija u testu sa alogenim T ćelijama/dendritskim ćelijama. Da bi se izveo ovaj test, T ćelije i monociti su izolovani iz periferne krvi zdravih dobrovoljaca. Monociti su diferencirani u denđritske ćelije korišćenjeni gore opisanih metoda. 1 x IO5 T ćelija dobijenih iz jedne osobe je gajeno sa 1 x IO5 dendritskih ćelija dobijenih iz druge osobe u prisustvu antitela na CD40 iz pronalaska ili kontrolnog antitela. Posle 4 dana gajenja kulture, supematanti su testirani na sekreciju IFN-gama pomoću ELISA. Rezultati ovog testa su prikazani u Tabeli 30.
TABELA 30
Povećanje sekrecije IFN-gama pomoću antitela na CD40 iz pronalaska
PRIMER IX
Indukcija inflamatomih citokina pomoću antitela na CD40 iz pronalaska
Antitela 10,8.3, 15.1.1, 21.4.1 i 3.1.1 su testirana u teslu oslobađanja citokina iz pune krvi, opisanom u Wing et aL, Therapeutic. Immunol. 2:183-90 (1995) da bi se odredilo da li antitela indukuju inflamatome citokine u koncentracijama od 1, 10 i 100 µg/ml. Nije primećeno značajno oslobađanje TNP-ct, IL-lp, LFN-y ili IL-6 sa ovim antitelima u navedenim koncentracijama u krvi iz 10 normalnih donora.
PRIMER X
Povećanje imunogenosti ćelijske linije Jv pomoću antitela na CD40
CD40 pozitivne JIYOYE ćelije (ATCC CCL 87) ("Jy cells") su gajene i održavane u RµMI medijumu. JIYOYE ćelije su inkubirane 24 sata sa antitelo na CD40m iz pronalaska (21.4,1), ili sa antitelom koje odgovara po izotipu (anti-KLH), u kompletnom RµMI medijumu. Ćelije su zatim oprane i tretirane sa 25 mg mitomicina C (Sigma) /7 ml medijuma 60 minuta. Ove ćelije su zatim inkubirane sa izolovanim humanim T ćelijama u odnosu 1:100 6 dana na 37°C (5% C02). T ćelije su zatim sakupljene, oprane i određivan je nivo CTL aktivnosti u odnosu na sveže JIYOYE ćelije obeležene hromom 51 (New England Nuclear, Boston, MA). Specifična CTL aktivnost je računata kao % specifične citolize = (citoliza Jy (cµM) - spontana citoliza (cµM)) / (ukupna citoliza (cµM) - spontana citoliza (cµM)).
Kao što Slika 5 ilustmje, antitelo na CD40 iz pronalaska (21.4.1) značajno povećava imunogenost prema Jy ćelijama tretiranim antitelom.
PRIMER XI Animalni model tumora
Da bi se dalje ispitala anti-tumorska aktivnost antitela na CD40 napravljenih u skladu sa pronalaskom, dizajnirali smo model SCID-bež miša da testiramo in vivo efekat antitela na rast tumora.
Dobili smo SCID-bež miševe od Charles River i ostavili smo ih da se aklimatizuju jednu nedelju pre upotrebe. Injektirali smo tumorske ćelije (Daudi ćelije (ATCC CCL 213), CD40(-) K562 ćelije (ATCC CCL 243) i CĐ40(+) Raji ćelije (ATCC CCL 86), BT474 ćelije kancera doJκe (ATCC HTB 20) ili PC-3 ćelije prostate (ATCC CRL 1435)) subkutano u koncentraciji od lxl07 ćelija/životinja, U nekim slučajevima, injektirali smo T ćelije (5 x 105) i dendritske ćelije (1 x 105) iz istog humanog donora zajedno sa tumorskim ćelijama. Takođe smo injektirali antitelo na CD40 iz pronalaska, ili kontrolu koja odgovara po izotipu (anti-KLH), intraperitonealno, neposredno pred injektiranje tumora (samo jedna injekcija). Zatim smo merili rast tumora. Specifični eksperimenti su opisani niže.
U jednom eksperimentu, injektirali smo antitelo na CD40 iz pronalaska (21.4.1), ili kontrolu koja odgovara po izotipu (anti-KLH), intraperitonealno, u dozi od IO mg/kg neposredno pred injeciranje tumora (samo jedna injekcija). Tumorske ćelije (Daudi ćelije) su injektirane subkutano u koncentraciji od 1 x IO7 ćelija/životinja. Merili smo rast tumora šestarom za merenje debljine 17., 19., 20., 21., 25., 26., 27. i 28. dana posle implantacije u prisustvu humanih T ćelija i dendritskih ćelija. Kao što je pokazano na Slici 6, antitelo na CD40 inhibira rast tumora za oko 60%.
U drugom eksperimentu, injektirali smo antitelo na CD40 iz pronalaska (21.4.1) ili kontrolu koja odgovara po izotipu (anti-KLH), intraperitonealno, u dozi od 0,1 mg/kg, 1 mg/kg ili 10 mg/kg neposredno pred injekciju tumora (samo jedna injekcija). Ćelije tumora (K562 ćelije) su injektirane subkutano u koncentraciji od 1 x IO7 ćelija/životinja. U ovom eksperimentu, injektirali smo T ćelije (5 x 105) i dendritske ćelije (1 x 105) iz istog humanog donora zajedno sa ćelijama tumora. Merili smo rast tumora šestarom za merenje debljine 17., 19., 20., 21., 25., 26., 27. i 28. dana posle implantacije. Kao što je pokazano na Slici 7, antitelo na CD40 inhibira rast tumora za oko 60-85%.
U još jednom eksperimentu, injektirali smo antitelo na CĐ40 iz pronalaska (21.4.1, 23.29.1 ili 3.1.1), ili kontrolu koja odgovara po izotipu (anti-KLH), intraperitonealno, neposredno pred injekciju tumora (samo jedna injekcija). Antitelo - kontrola koja odgovara po izotipu i antitelo 21.4.1 su injektirani u dozi od 1 mg/ml. Antitela 23.29.1 i 3.1.1 su injektirana u dozi od 1, 0,1, 0,01, 0,001 ili 0,0001 mg/kg. Ćelije tumora (K562 ćelije) su injektirane subkutano u koncentraciji od 1 x IO7 ćelija/životinja. U ovom eksperimentu, injektirali smo T ćelije (5 x 105) i dendritske ćelije (1 xl05) iz istog humanog donora zajedno sa ćelijama tumora. Zatim smo merili rast tumora šestarom za merenje debljine 28. dana posle implantacije. Rezultati ovog eksperimenta su prikazani na Slikama 8 i 9. Svaka tačka na slikama predstavlja merenje iz pojedinačne životinje.
U jednom drugom eksperimentu, injektirali smo antitelo na CD40 iz pronalaska (21.4,1) ili kontrolu koja odgovara po izotipu (anti-KLH), intraperitonealno, neposredno pred injekciju tumora (samo jedna injekcija). Antitela su injektirana u dozi od 1, 0,1, 0,01, 0,001 ili 0,0001 mg/kg. Ćelije tumora (Raji ćelije) su injektirane subkutano u koncentraciji od 1 x IO7 ćelija/životinja. U neke životinje smo injektirali T ćelije (5 x 105) i đendritske ćelije (1 x IO5) iz istog humanog donora zajedno sa ćelijama tumora Zatim smo metili rast tumora šestarom za merenje debljine 28. dana posle implantacije. Rezultati ovog eksperimenta su prikazani na Slici 10. Svaka tačka na slici predstavlja merenje iz pojedinačne životinje.
U još jednom eksperimentu, injektirali smo antitelo na CD40 iz pronalaska (21.4.1, 23.28.1, 3.1.1 ili 23.5.1), ili kontrolu koja odgovara po izotipu (anti-KLH), intraperitonealno, neposredno pred injekciju tumora (samo jedna injekcija). Antitela su injektirana u dozi od 1 ili 0,1, mg/kg. Ćelije tumora (Raji ćelije) su injektirane subkutano u koncentraciji od 1 x IO7 ćelija/životinja. Zatim smo merili rast tumora šestarom za merenje debljine 28. dana posle implantacije. Rezultati ovog eksperimenta su prikazani na Slici 11. Svaka tačka na slici predstavlja merenje iz pojedinačne životinje.
U još jednom eksperimentu, injektirali smo antitelo na CD40 iz pronalaska (21.4.1, 23.29.1, ili 3.1.1) ili kontrolu koja odgovara po izotipu (anti-KLH), intraperitonealno, neposredno pred injekciju tumora (samo jedna injekcija). Antitela su injektirana u dozi od 1 mg/kg. Ćelije tumora (BT474 ćelije kancera doJκe) su injektirane subkutano u koncentraciji od 1 x 107 ćelija/životinja. Injektirali smo T ćelije (5 x 105) i dendritske ćelije (1 x IO5) iz istog humanog donora zajedno sa ćelijama tumora. Zatim smo merili rast tumora šestarom za merenje debljine 39. dana posle implantacije. Kao što je pokazano na Slici 12, sva antitela inhibiraju rast tumora kancera doJκe. Svaka tačka na slici predstavlja merenje iz pojedinačne životinje.
U još jednom eksperimentu, injektirali smo antitelo na CD40 iz pronalaska (3.1.1), ili kontrolu koja odgovara po izotipu (anti-KLH), intraperitonealno, neposredno pred injekciju tumora (samo jedna injekcija). Antitela su injektirana u dozi od 1 mg/kg, Ćelije tumora (PC-3 ćelije tumora prostate) su injektirane subkutano u koncentraciji od 1 x IO7 ćelija/životinja. Zatim smo merili rast tumora šestarom za merenje debljine 41. dana posle implantacije. Kao što je pokazano na Slici 13, antitelo na CD40 inhibira rast tumora prostate za oko 60%. Svaka tačka na slici predstavlja merenje iz pojedinačne životinje.
PRIMER XII
Preživljavanje SCID-bež miševa kojima su injektirane Daudi ćelije tumora i koji su tretirani antitelima na CD40 iz pronalaska
U jednom drugom eksperimentu, injektirali smo antitelo na CD40 iz pronalaska, ili kontrolu koja odgovara po izotipu (jednu injekciju), intraperitonealno, neposredno pred injekciju tumora. Antitela su injektirana u dozi od 1 ili 0,1, mg/kg. Ćelije tumora (Daudi ćelije) su injektirane intravenozno u dozi od 5 x IO6 ćelija/životinja. Zatim smo pratili preživljavanje životinja. Kao što je pokazano na Slici 14, sva testirana antitela na CD40 su produžila opstanak miševa sa injektirarum tumorima za najmanje šest dana.
Tabela 31 daje spisak ED50 antitela na CD40 u različitim modelima čvrstih tumora opisanih u Primeru XI. Tabela 31 sumira in vivo anti-tumorsku aktivnost nekih od antitela na CD40 iz pronalaska u SCID miševima. Pored toga, daje spisak ED50 antitela na CD40 u modelu Daudi-jevog sistemskog tumora opisanog gore, u Primeru XII.
TABELA 31
ED50 antitela na CD40 iz pronalaska korišćeniem različitih in vivo modela TUMORA u SCID miševima
Određivanje konstanti afiniteta (Kp) potpuno humanih antitela na CD40 pomoću BIAcore
Uradili smo merenja afiniteta prečišćenih antitela pomoću površinske plazmonske rezonance instrumentom BIAcore 3000, sledeći protokole proizvođača.
Instrument za biosenzorsku analizu biospecifičnih interakcija (BIAcore) radi na principu površinske plazmonske rezonance da meri molekulske interakcije na CM5 senzorskom čipu. Promene indeksa prelamanja između dve sredine, stakla i karboksmetilovanog dekstrana, izazvane interakcijama molekula na dekstranskoj strani senzorskog čipa, su merene i prikazane kao promene u arbitrarnim jedinicama reflektanse (RU), kao što je detaljno objašnjeno u uputstvu proizvođača
Površina karboksmetilovanog dekstrana protočne ćelije na senzorskom Čipu je aktivirana derivatizacijom 0,05 M N-Mdroksisukcinimidom, posredovanom 0,2 M N-etil-N'-(đimetilaminopropil) karbodiimidom tokom 7 minuta. Fuzionisani protein CD40-Ig (opisan u Primem I) u koncentraciji od 5 µg/ml, u 10 inM Na acetata, pH 3,5, je ručno injektiran u protočnu ćeliju pri brzini od 5 pl/rain i kovalentno imobilizovan na površini protočne ćelije sa željenom količinom RU. Deaktivacija neizreagovanih N-hidroksisukcinimid estara je urađena pomoću IM etanolamin hidrohloriđa, pH 8,5. Posle imobilizacije, protočne ćelije su očišćene od neizreagovanog ili slabo vezanog materijala pomoću 5 regeneracionih injekcija od 5 pl 50 mM NaOH, dok se nije postigla stabilna osnovna linija. Protočna ćelija 2, sa površinom velike gustine, metila je oko 300 RU posle pripreme površine, a protočna ćelija 3, sa površinom male gustine, metila je oko 150 RU. Za protočnu ćeliju 1, aktivirane prazne površine, 35 pl 10 mM Na acetatnog pufera je injektirano tokom imobilizacije umesto antigena. Protočna ćelija 4 je sadržala približno 450 RU imobilizovanog CTLA4-Ig, irelevantne antigenske kontrole.
Napravljena je serija razblaženja svakog antitela u opsegu koncentracija od 100 µg/ml to 0,1 µg/ml u polovinama logaritma. Brzina protoka je podešena na 5 pl/min i 25 pl uzorka svake koncentracije je injektirana preko senzorskog čipa uz regeneracionu injekciju od 5 jrl 50 mM NaOH između svake dve injektirane koncentracije antitela. Podaci su analizirani BIAevaluation 3.0 softverom.
U eksperimentima sa ođredjivanjem kinetike u suprotnom smeru, antitelo 21.4.1 je imobilisano na površini senzorskog čipa, koristeći gore opisani protokol. Anti-KLH je korišćen kao površina kontrolnog antitela. Antigen, CD40-Ig fiizionisani protein, je injektiran u opsegu koncentracija od 100 µg/ml to 0,1 µg/ml.
Tabela 32 prikazuje merenja afiniteta za reprezentativna antitela na CD40 iz ovog pronalaska:
TABELA 32
Merenja afiniteta za antitela na CD40 iz pronalaska
PRIMER XIV
Mapiranie epitopa antitela na CD40
Testovi vezivanja su rađeni sa fiizionim antigenom CD40-humani IgGl Fc, prečišćenim Proteinom A. Humani CD40-IgGl Fc fuzionisani protein je kloniran u Pfizer-u. Humani CD40-IgGl fuzionisani protein je eksprimiran u sisarskoj ćelijskoj liniji i prečišćen preko kolone od Proteina A. Čistoća fuzionisanog antigena je određena pomoću SDS/PAGE.
CD40 ima strukturu tipičnog transmembranskog proteina tipa I. Zreo molekul je sastavljen od 277 amino kiselina. Vanćelijski domen CD40 se sastoji od četiri domena bogatih cisteinom sličnim TNFR. Videti, npr., Neismith and Sprang, TIBS 23:74-79 (1998); van Kooten and Banchereau, J. Leukocyte Biol. 67:2-17 (2000); Stamenkovic et al., EMBO J. 8:1403-1410(1989).
Vezivanje antitela na CD40 za redukovane i neredukovane humane CD40
Pošto se vanćelijski domen CD40 sastoji od četiri domena bogata cisteinom, kidanje unutarmolekulskih veza ređukujućim agensom može da promeni reaktivnost antitela. Da bi s odredilo da li je kidanje unutarmolekulskih veza pomoću redukcionog agensa promenil reaktivnost odabranog antitela na CD40 iz pronalaska, prečišćen CD40-hIgG je stavljen n SDS/PAGE (4-20% gel) u neredukujućim (NR) ili redukujućim (R) uslovima. SDS/PAGE j izvedena metodom Laemmli-ja na mini-gel sistemu. Razdvojeni proteini su prebačeni n nitroceluloznu membranu. Membrane su blokirane pomoću PBS sa 5%(w/v) nemasnog mlek; u prahu najmanje 1 sat pre razvijanja i testirane 1 sat sa svakim antitelom. Anti-CD40 antitel, su detektovana pomoću kozjih anti-humanih imunoglobulina konjugovanih sa HRI (razblaženje 1:8000; Katalog br. A-8667 od Sigma). Membrane su razvijene pomoću pojačane Chcmiluminescence (ECL®; Amersham Bioscience) prema uputstvima proizvođača.
Westem Blot je zatim testirati sa četiri antitela na CD40 iz pronalaska: 21.4.1, 23.25.1,
23.29.1 i 24.2.1 (lµg/ml), praćen kozjim anti-humanim imunoglobulinom konjugovanim sa HRP (razblaženje 1:8000). Rezultati ovog eksperimenta su prikazani na Slici 15. Rezultati ukazuju da se antitela 21.4.1, 23.25.1, 23.29.1 i 24.2.1 vezuju za neredukovane, ali se ne vezuju za redukovane CD40; antitela, dakle, prepoznaju konfomiacioni epitop.
Vezivanje antitela na CD40 za humane proteine bez CD40 domena
Vanćelijski region CD40 uključuje četiri ponovljena domena slična TNFR (označena kao D1-D4). Videti, npr., Neismith and Sprang, TIBS 23:74-79 (1998); van Kooten and Banchereau, J. Leukocyte Biol. 67:2-17 (2000); Stamenkovic et al., EMBO J. 8:1403-1410 (1989). Slika 16 prikazuje aminokiselinske sekvence miša i humane CD40 domene D1-D4. Da bi se ispitao doprinos različitih regiona CD40 molekula u prikazivanju epitopa, konstruisan je jedan broj mutanata sa deletiranim domenima.
Da bi se napravili konstrukti bez humanih CD40, celokupan vanćelijski domen humanog CD40 (aminokiseline 1-193) je umnožen na cDNK iz humanih B ćelija (CD 19+) (Multiple tissue cDNA panels, Catalog No.Kl428-1, od Clontech) PCR-om pomoću prajmera specifičnih za date sekvence, i 6XHis-marker je dodat na C-kraj. Humani CD40 5' prajmer 5'-GCAAGCTTCACCAATGGTTCGTCTGCCTCTGCAGTG-3' (SEQ ID NO: 135) je korišćen sa različitim kombinacijama 3' prajmera za kloniranje celih i skraćenih molekula CD40. 3' prajmer za kloniranje celih vanćelijskih domena humanog CD40 je bio:
5'-TCAGTGATGGTGATGGTGATGTCTCAGCCGATCCTGGGGACCA'3’ (SEQ ID NO: 136). 3' prajmer korišćen za kloniranje DI-D3 domena humanih CD40 je bio: 5'-TCAGTG-ATGGT GAT GGTGAT GT GGGC AGGGCTCGCGAT GGT AT-3' (SEQ ID NO: 137)
3’ prajmer korišćen za kloniranje D1-D2 domena CD40 je bio: S’-TCAGTGATG GTGATGGTGATGACAGGTGCAGATGGTGTCTGTT-31 (SEQ ID NO: 138). Pošto su ovi konstrukti skraćenih CD40 cDNK generisani, eksprimirani su u ćelijskoj liniji 293F pomoću pCR3.1 vektora (Invitrogen). CD40-6XHis fuzionisani proteini su prečišćeni eluiranjem sa kolone od nikla.
Aniinokiselinske sekvence ova četiri deleciona mutanta su prikazane u Tabeli 33,
TABELA 33
Fuzioni proteini CD40 i His-markera
Da bi se eksprimirali ovi humani CD40 delecioni konstrukti, konstrukti su klonirani u pCR3.1 vektor (Invitrogen) i ekspresija je određena u različitim stabilnim i prolazno transfektovanim 293F ćelijskim Unijama. Supematanti iz prolazno transfektovanih 293F ćelija su analizirani na vezivanje za antitela 21.4.1, 23.25.1, 23.29.1 i 24.2.1 pomoću ELISA i Westem Blot.
ELISA testovi su rađeni pomoću supematanta iz 293F ćelija transfektovanih različitim CD40 konstruktima. ELISA ploče su prevučene kozjim anti-humanim CD40 poliklonskim antitelima (R&D catalog No. AF 632) ili kozjim anti-mišjim CD40 poliklonskim antitelima (R&D catalog No. AF 440), razblaženim do 1 µg/ml u puferu za prevlačenje ELISA ploča. Ekspresija CD40 konstrukata u 293F ćelijama je potvrđena detekcijom hiotinilovanim kozjim anti-humanim CD40 (R&D catalog No. BAF 632), kozjim anti-mišjim CD40 (R&D catalog No. BAF 440) ili anti-His konjugovanim sa ILRP (C kraj) antitelima (Invitrogen, Catalog No. 46-0707). Vezivanje humanih antitela na CD40 je detektovano HRP-konjugovanim kozjim anti-humanim IgG (FC specific Caltag HI0507), razblaženim 1:2000. Rezultati, kao što je pokazano u Tabeli 34, ukazuju daje većina epitopa, ako ne svi, koje prepoznaju mAb 21.4.1, 23.28.1 i 23.29.1 locirana u D1-D2 regionu CD40, dok je epitop za mAb 24.2.1 lociran bar delimično u domenu D3-D4. Fuzioni protein humani CD40-zečji Fc je korišćen kao kontrola, da bi se potvrdila specifičnost vezivanja antitela.
TABELA 34
ELISA: Vezivanje antitela za CD40 delecione mutante
CD40 delecioni konstrukti su analizirani i Westem Blot analizom. Rezultati su pokazani u Tabeli 35. Rezultati ELISA-e pokazuju da vezivno mesto antitela 21.4.1, 23.25.1,
23.29.1 i 24.2.1 uključuje domene D1-D3. Rezultati takođe pokazuju da vezivno mesto za antitela 21.4.1, 23.25.1 i 23.29.1 uključuje domene D1-D2, a da vezivno mesto antitela 24.2.1 uključuje domen D3.
TABELA 35
Westem Blot: Vezivanje antitela za CD40 delecione mutante
Vezivanje antitela na CD40 za mišji CD40
Određivali smo sposobnost antitela 21.4.1, 23.25.1, 23.29.1 i 24.2.1 da se vežu za mišji CD40.
Za ovaj eksperiment, mišji CD40 je umnožen iz cDNK mišjih B ćelija. Mišji CD40(Dl-D3)-6xHis fuzioni protein je kloniran u pCR3.1, koji za transkripciju koristi CMV promotor, 5' prajmer korišćen za kloniranje vanćelijskog domena mišjeg CD40 je bio: 5-TGCAAGCTTCACCATGGTGTCTTTGCCTCGGCTGTG-3'. 3' prajmer korišćen za kloniranje D1-D3 domena mišjeg CD40 je bio: 5'-GTCCTCGAGTCAGTGATGGT GATGGTGATGTGGGCAGGGATGACAGAC-3*. Mišji i humani cDNK konstrukti su prolazno transfektovani u 293F ćelije. Ekspresija rekombinantnog CD40 je detektovana pomoću ELISA, korišćenjem poliklonskih antitela na mišji i humani CD40, anti-His antitela i antitela na CD40 21.4.1, 23.25.1, 23.29.1 i 24.2.1. Rezultati ovih eksperimenata su pokazani u Tabeli 36. Ovaj eksperiment pokazuje da su sva antitela specifična za humani CD40 i ne interaguju sa mišjim CD40.
TABELA 36
Unakrsna reaktivnost mišjeg i humanog CD40
Pošto se antitela 21.4.1, 23.25.1,23.29.1 i 24.2.1 ne vezuju za mišji CD40, konstmisali smo humane/mišje himeme proteine đa bismo preciznije mapirali epitope ovih antitela.
Za konstruisanje fuzija humanih i mišjih CD40 himemih proteina sa odgovarajućim okvirom čitanja, koristili smo jedinstvena restrikciona mesta na granicama CD40 domena na identičnim pozicijama u cDNK i humanog i mišjeg CD40. Različiti cDNK konstrukti CD40 su generisani pomoću EcoRI restrikcionog mesta na kraju domena 1 (nukleotid 244, aminokiselina 64) i Bani restrikcionog mesta na kraju domena 2 (nukleotid 330, aminokiselina 94) (Slika 17).
Različiti CD40 domeni su umnoženi PCR-om i ligirani. Ovaj pristup je omogućio zamenu različitih CD40 domena mišjeg CD40 homolognim domenima iz humanog CD40. Dobijeni konstrukti su prikazani na Slici 18.
Zatim smo odredili pomoću ELISA da li su antitela 21.4.1, 23.25.1, 23.29.1 i 24.2.1 sposobna da vežu humane/mišje himeme CD40 proteine. Rezultati ovog eksperimenta su prikazani u Tabeli 37. Kao što je pokazano u Tabeli 37, mAb 21.4,1 i 23.25.1 prepoznaju epitop koji je lokalizovan delimično u Dl, a delimično u D2; mAb 23.29.1 prepoznaje epitop koji je najviše, ako ne sasvim, lokalizovan u D2; a mAb 24.2.1 prepoznaje epitop koji je lokalizovan u D2 i D3.
TABELA 37
Vezivanje antitela za himeme CD40 proteine
[0330] Sve publikacije i patentne prijave citirane u ovoj specifikaciji su ovde obuhvaćene referencama kao da jc svaka pojedinačna publikacija ili patentna prijava specifično i pojedinačno navedena referencom. Iako je izloženi pronalazak opisan donekle detaljno ilustracijama i primerima u cilju jasnoće, svakom na uobičajenom nivou struke će biti očigledno, u kontekstu ovog pronalaska, da određene promene i modifikacije mogu da se prave, a da se ne odstupi od duha ili opsega pronalaska.
APSTRAKT ANTITELA NA CD40
Pronalazak se odnosi na antitela i njihove delove za vezivanje antigena, koji se specifično vezuju za CD40, poželjno humani CD40, i koji funkcionišu kao agonisti CD40. Pronalazak se takođe odnosi na humana antitela na CD40 i njihove delove koji vezuju antigen. Pronalazak se takođe odnosi na antitela koja su himema, bispecifična, derivirana, jednolančana antitela ili delove fuzionih proteina. Pronalazak se takođe odnosi na izolovane teške i lake lance imunoglobulina derivirane iz humanih antitela na CD40 i molekule nukleinskih kiselina koji kodiraju takve imunoglobuline. Pronalazak se takođe odnosi na postupke pravljenja humanih antitela na CD40, kompozicije koje sadrže ova antitela i postupke upotrebe antitela i kompozicija za dijagnozu i lečenje. Pronalazak takođe obezbeđuje postupke genske terapije koji koriste molekule nukleinskih kiselina koji kodiraju teške i/ili lake molekule imunoglobulina koji sadrže humana antitela na CD40. Pronalazak se takođe odnosi na transgene životinje koje sadrže molekule nukleinskih kiselina iz ovog pronalaska.
cn
co
(
≤

Claims (18)

1. Monoklonsko antitelo ili njegov deo koji vezuje antigen koji se specifično vezuje za humani CD40 i aktivira ga, naznačeno time, što navedeno antitelo ili njegov deo koji vezuje antigen sadrži: (a)    težak lanac koji sadrži aminokiselinske sekvence CDR1 teškog lanca, CDR2 teškog lanca i CDR3 teškog lanca iz varijabilnog domena teškog lanca; gde su navedene aminokiselinske sekvence CDR1 teškog lanca i CDR2 teškog lanca nezavisno odabrane iz CDR1 i CDR2 varijabilnog domena teškog lanca, respektivno, gde sekvenca navedenog varijabilnog domena teškog lanca sadrži ne više od 18 aminokiselinskih izmena u aminokiselinskoj sekvenci koju kodira embrionski gen za VH 3-30+, 4-59,1-02, 4.35 ili 3-30.3; gde je navedena aminokiselinska sekvenca CDR3 teškog lanca iz CDR3 varijabilnog domena teškog lanca, gde je navedeni varijabilni domen teškog lanca odabran iz grupe koju čine i)    varijabilni domen teškog lanca antitela odabranog iz grupe koju čine 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 7.1.2,10.8.3, 15.1.1, 21,4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.IH-D16E, 23.29.1 i 24.2.1; ii)    varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine SEQ ID NOS: 2,10,18, 26, 34,42, 50,58, 66, 74,82, 90, 92, 96 i 98; i iii)    varijabilni domen teškog lanca koji kodira sekvenca nukleinske kiseline odabrana iz grupe koju Čine SEQ 1D NOS: 1, 9, 17, 25, 33, 41,49, 57,65, 73, 81, 89, 91, 95 i 97; gde aminokiselinska sekvenca navedenog CDR3 teškog lanca može imati do dve konzervativne aminokiselinske supstitucije i/ili do dve nekonzervativne aminokiselinske insercije, delecije ili supstitucije u tom đelu; ili (b)    lak lanac koji sadrži aminokiselinske sekvence CDR1 lakog lanca, CĐR2 lakog lanca i CDR3 lakog lanca iz varijabilnog domena lakog lanca, gde su navedene aminokiselinske sekvence CDR1 lakog lanca i CDR3 lakog lanca nezavisno odabrane iz CDR1 i CDR3 varijabilnog domena lakog lanca, respektivno, gde varijabilni domen lakog lanca sadrži ne više od deset aminokiselinskih izmena u aminokiselinskoj sekvenci koju kodira embrionski gen za Vk A3/A19, L5 ili A27; i gde je navedena aminokiselinska sekvenca CDR2 lakog lanca iz varijabilnog domena lakog lanca, gde je navedeni varijabilni domen lakog lanca odabran iz grupe koju čine i)    varijabilni domen lakog lanca antitela odabranog iz grupe koju čine 3.1.1, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.29.1 i 24.2.1; ii)    varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine SEQ ID NOS: 4,12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94 i 100; i iii)    varijabilni domen lakog lanca koji kodira sekvenca nukleinske kiseline odabrana iz grupe koju čine SEQ ID NOS: 3, 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83,93 i 99; gde aminokiselinska sekvenca navedenog CDR2 lakog lanca može imati do dve konzervativne aminokiselinske supstitucije i/ili do dve nekonzervativne aminokiselinske insercije, delecije ili supstitucije u tom delu.
2. Antitelo ili njegov deo koji vezuje antigen prema zahtevu 1, naznačeno time, što (a)    su aminokiselinske sekvence svakog od navedenih CDR1 teškog lanca, CDR2 teškog lanca i CDR3 teškog lanca nezavisno odabrane iz varijabilnog domena teškog lanca, gde je navedeni varijabilni domen teškog lanca odabran iz grupe koju čine: i)    varijabilni region teškog lanca antitela odabranog iz grupe koju čine 3.1.1, 3.1.IH-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.29.1 i 24.2.1; ii)    varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine SEQ ID NOS: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 i 98; i iii)    varijabilni domen teškog lanca koji kodira sekvenca nukleinske kiseline odabrana iz grupe koju čine SEQ ID NOS: 1, 9,17, 25, 33, 41,49, 57, 65, 73, 81, 89, 91, 95 i 97; ili (b)    su aminokiselinske sekvence svakog od navedenih CDR1 lakog lanca i CDR3 lakog lanca nezavisno odabrane iz CDR1 i CDR3 varijabilnog domena lakog lanca gde je navedeni varijabilni domen lakog lanca odabran iz grupe koju čine: i)    varijabilni domen lakog lanca antitela odabranog iz grupe koju čine 3.1.1, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3,15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1,23.5.1, 23.25.1,23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.29.1 i 24.2.1; ii)    varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine SEQ ED NOS: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84,94 i 100; i iii)    varijabilni domen lakog lanca koji kodira sekvenca nukleinske kiseline odabrana iz grupe koju čine SEQ ED NOS: 3, 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 93 i 99.
3. Antitelo ili njegov đeo koji vezuje antigen prema zahtevu t, naznačeno time, što sadrži težak lanac i lak lanac i gde su aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 navedenog teškog lanca i CDR1, CDR2 i CDR3 navedenog lakog lanca odabrane iz grupe koju čine (a)    aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 iz SEQ UD NO: 2 i aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 iz SEQ ID NO: 4; (b)    aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 iz SEQ ID NO: 2 i aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 iz SEQ ID NO: 94; (c)    aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 iz SEQ ID NO: 90 i aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 iz SEQ ID NO: 4; (d)    aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 iz SEQ ID NO: 90 i aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 iz SEQ ID NO: 94; (e)    aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 iz SEQ ED NO: 92 i aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 iz SEQ ID NO: 4; (f)    aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 iz SEQ ID NO: 92 i aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 iz SEQ ID NO: 94; (g)    aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 iz SEQ ID NO: 10 i aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 iz SEQ ID NO: 12; (h)    aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 iz SEQ ID NO: 18 i aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 iz SEQ ID NO: 20; (i)    aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 iz SEQ ID NO: 26 i aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 iz SEQ ID NO: 28; (j)    aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 iz SEQ ED NO: 34 i aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 iz SEQ ID NO: 36; (k)    aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 iz SEQ ID NO: 42 i aminokiselinske sekvence CDR1, CĐR2 i CDR3 iz SEQ IDNO: 44; (l)    aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 iz SEQ ID NO: 50 i aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 iz SEQ ID NO: 52; (m)    aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 iz SEQ ID NO; 96 i aminokiselinske sekvence CDR1, CĐR2 i CDR3 iz SEQ ID NO: 52; (n)    aminokiselinske sekvence CDR1, CĐR2 i CDR3 iz SEQ ID NO: 58 i aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 iz SEQ ID NO: 60; (0)    aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 iz SEQID NO: 66 i aminokiselinske sekvence CĐR1, CDR2 i CDR3 iz SEQ ID NO: 68; (p)    aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 iz SEQ ID NO: 66 i aminokiselinske sekvence CĐR1, CDR2 i CDR3 iz SEQ ID NO: 100; (q)    aminokiselinske sekvence CDRI, CDR2 i CDR3 iz SEQ ID NO: 98 t aminokiselinske sekvence CDRI, CDR2 i CDR3 iz SEQ ID NO: 68; (r)    aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 iz SEQ ID NO: 98 i aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 iz SEQ ID NO: 100; (s)    aminokiselinske sekvence CDRI, CDR2 i CDR3 iz SEQ ID NO: 74 i aminokiselinske sekvence CDRI, CDR2 i CDR3 iz SEQ ID NO: 78; (t)    aminokiselinske sekvence CDRI, CDR2 i CDR3 iz SEQ ID NO: 82 i aminokiselinske sekvence CDRI, CDR2 i CDR3 iz SEQ ID NO: 84.
4. Antitelo prema zahtevn 1, naznačeno time, što sadrži težak lanac i lak lanac gde su aminokiselinske sekvence teškog lanca i lakog lanca odabrane iz grupe koju čine: (a)    aminokiselinska sekvenca teškog lanca i aminokiselinska sekvenca lakog lanca 3.1.1,    obe aminokiselinske sekvence bez signalne sekvence; (b)    aminokiselinska sekvenca teškog lanca i aminokiselinska sekvenca lakog lanca 7.1.2,    obe aminokiselinske sekvence bez signalne sekvence; (c)    aminokiselinska sekvenca teškog lanca i aminokiselinska sekvenca lakog lanca 10.8.3, obe aminokiselinske sekvence bez signalne sekvence; (d)    aminokiselinska sekvenca teškog lanca i aminokiselinska sekvenca lakog lanca 15.1.1,    obe aminokiselinske sekvence bez signalne sekvence; (e)    aminokiselinska sekvenca teškog lanca i aminokiselinska sekvenca lakog lanca 21.4.1,    obe aminokiselinske sekvence bez signalne sekvence; (f)    aminokiselinska sekvenca teškog lanca i aminokiselinska sekvenca lakog lanca 21.2.1,    obe aminokiselinske sekvence bez signalne sekvence; (g)    aminokiselinska sekvenca teškog lanca i aminokiselinska sekvenca lakog lanca 22.2.1,    obe aminokiselinske sekvence bez signalne sekvence; (h)    aminokiselinska sekvenca teškog lanca i aminokiselinska sekvenca lakog lanca 22.1.1H-C109A, obe aminokiselinske sekvence bez signalne sekvence; (1)    aminokiselinska sekvenca teškog lanca i aminokiselinska sekvenca lakog lanca 23.5.1,    obe aminokiselinske sekvence bez signalne sekvence; (j)    aminokiselinska sekvenca teškog lanca i aminokiselinska sekvenca lakog lanca 23.25.1,    obe aminokiselinske sekvence bez signalne sekvence; (k)    aminokiselinska sekvenca teškog lanca i aminokiselinska sekvenca lakog lanca 23.28.1,    obc aminokiselinske sekvence bez signalne sekvence; (l)    aminokiselinska sekvenca teškog lanca i aminokiselinska sekvenca lakog lanca 23.28.1L-C92A, obe aminokiselinske sekvence bez signalne sekvence; (m)    aminokiselinska sekvenca teškog lanca i aminokiselinska sekvenca lakog lanca 23.28.1H-D16E, obe aminokiselinske sekvence bez signalne sekvence; (n)    aminokiselinska sekvenca teškog lanca i aminokiselinska sekvenca lakog lanca 23.29.1,    obe aminokiselinske sekvence bez signalne sekvence; (o)    aminokiselinska sekvenca teškog lanca i aminokiselinska sekvenca lakog lanca 24.2.1,    obe aminokiselinske sekvence bez signalne sekvence; (p)    aminokiselinska sekvenca teškog lanca i aminokiselinska sekvenca lakog lanca 3.1.1H-A78T, obe aminokiselinske sekvence bez signalne sekvence; (q)    aminokiselinska sekvenca teškog lanca i aminokiselinska sekvenca lakog lanca 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, obe aminokiselinske sekvence bez signalne sekvence; (r)    aminokiselinska sekvenca teškog lanca i aminokiselinska sekvenca lakog lanca 3.1.1L-L4M-L83V, obe aminokiselinske sekvence bez signalne sekvence; (s)    aminokiselinska sekvenca teškog lanca i aminokiselinska sekvenca lakog lanca 3.1.1H-A78T-V88A-V97A/3.1.1L-L4M-L83V, obe aminokiselinske sekvence bez signalne sekvence;i (t)    aminokiselinska sekvenca teškog lanca i aminokiselinska sekvenca lakog lanca 23.29.1 L-R174K., obe aminokiselinske sekvence bez signalne sekvence.
5. Antitelo ili njegov deo koji vezuje antigen prema zahtevu 1, naznačeno time, što sadrži težak lanac i lak lanac i gde su aminokiselinske sekvence varijabilnog domena navedenog teškog lanca i varijabilnog domena navedenog lakog lanca odabrane iz grupe koju čine: (a)    aminokiselinska sekvenca SEQID NO: 2 i aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 4; (b)    aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 2 i aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 94; (c)    aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 90 i aminokiselinska sekvenca SEQ ED NO: 4; (d)    aminokiselinska sekvenca SEQ 1D NO: 90 i aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 94; (e)    aminokiselinska sekvenca SEQ ED NO: 92 i aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 4; (f)    aminokiselinska sekvenca SEQ ED NO: 92 i aminokiselinska sekvenca SEQ ED NO: 94; (g)    aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 10 i aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 12; (h)    aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 18 i aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 20; (i)    aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 26 i aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 28; (j)    aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 34 i aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 36; (k)    aminokiselinska sekvenca SEQ ED NO: 42 i aminokiselinska sekvenca SEQ ED NO: 44; (l)    aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 50 i aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 52; (m)    aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 96 i aminokiselinska sekvenca SEQ ED NO: 52; (n)    aminokiselinska sekvenca SEQ TD NO: 58 i aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 60; (o)    aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 66 i aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 68; (p)    aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 66 i aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 100; (q)    aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 98 i aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 68; (r)    aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 98 i aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 100; (s)    aminokiselinska sekvenca SEQID NO: 74 i aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 78; (t)    aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 82 i aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 84.
6.    Farmaceutski sastav, naznačen lime, što sadrži antitelo ili njegov deo koji vezuje antigen, prema bilo kojem od zahteva 1-3 i 5 ili antitelo prema zahtevu 4, za proizvodnju leka.
7.    Upotreba antitela ili njegovog dela koji vezuje antigen, prema bilo kojem od zahteva 1-3 i 5 ili antitela prema zahtevu 4, za proizvodnju leka,
8.    Upotreba antitela ili njegovog dela koji vezuje antigen, prema bilo kojem od zahteva 1-3 i 5 ili antitela prema zahtevu 4, za proizvodnju leka za tečenje kancera u čoveku kome je to potrebno ili za pojačanje imunog odgovora u čoveku kome je to potrebno.
9.    Izolovana ćelijska linija koja proizvodi antitelo ili njegov deo koji vezuje antigen, prema bilo kojem od zahteva 1-3 i 5 ili antitelo prema zahtevu 4 ili težak lanac ili lak lanac navedenog antitela ili njegovog dela koji vezuje antigen.
10.    Izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira težak lanac, ili njegov deo koji vezuje antigen, ili lak lanac, ili njegov deo koji vezuje antigen antitela ili njegovog dela koji vezuje antigen, prema bilo kojem od zahteva 1-3 i 5 ili antitela prema zahtevu 4.
11.    Izolovani molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 10, naznačen time, što molekul nukleinske kiseline sadrži nukleotidnu sekvencu odabranu iz grupe koju čine: (a) nukleotidna sekvenca koja kodira aminokisehnsku sekvencu teškog lanca, ili njegovog dela koji vezuje antigen, antitela odabranog iz grupe koju čine 3.1.1, 3.1. 1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 3.1 1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1,21.2.1, 22.1.1, 22.MH-C109A, 23.5.1, 23.25.1,23.28.1,23.28.1L-C92A, 23.28.1H-D16E, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K i 24.2.1, ili navedena aminokiselinska sekvenca bez signalne sekvence; (b)    nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu lakog lanca, ili njegovog đela koji vezuje antigen, antitela odabranog iz grupe koju čine 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.UH-A78T-V88A-V97A, 3.1.1L-L4M, L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1,21.4.1,21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23,28.1H-D16E, 23. 28.1L-C92A, 23.29. 1, 23.29.1L-R174K i 24.2.1, ili navedena aniinokiselinska sekvenca bez signalne sekvence; (c)    nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16,18, 20, 22, 24,26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96,98,100 i 102 ili navedena aminokiselinska sekvenca bez signalne sekvence, ako je prisutna; i (d)    nukleotidna sekvenca odabrana iz grupe koju čine SBQ ID NOS: 1, 3, 5,1,9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95,97, 99 i 101 ili navedena sekvenca bez signalne sekvence, ako je prisutna.
12.    Vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline prema bilo kojem od zahteva 1( ili 11, naznačen time, što on po izboru sadrži ekspresionu kontrolnu sekvencu operativno vezanu za molekul nukleinske kiseline.
13.    Ćelija domaćin naznačena time, što sadrži vektor prema zahtevu 12 ili moleku; nukleinske kiseline prema bilo kojem od zahteva 10 ili 11.
14.    Postupak pravljenja antitela na CD40, ili njegovog dela koji vezuje antigen, naznačen time, što obuhvata gajenje ćelija domaćina prema zahtevu 13, ili ćelijske linije prema zahtevu 9, u odgovarajućim uslovima i đobijanje iz njih navedenog antitela ili njegovog dela koji vezuje antigen.
15.    Monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za humani CD40 i aktivira ga, naznačeno time, što sadrži težak lanac i lak lanac, i što su aminokiselinske sekvence teškog lanca i lakog lanca i odabrane iz grupe koju čine: (a) aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 6 i aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO 8, obe aminokiselinske sekvence bez signalne sekvence; (b)    aminokiselinska sekvenca SEQ DD NO: 14 i aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 16, obe aminokiselinske sekvence bez signalne sekvence; (c)    aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 22 i aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 24, obe aminokiselinske sekvence bez signalne sekvence; (d)    aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO; 30 i aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 32, obe aminokiselinske sekvence bez signalne sekvence; (e)    aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 38 i aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 40, obe aminokiselinske sekvence bez signalne sekvence; (f)    aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 46 i aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 48, obe aminokiselinske sekvence bez signalne sekvence; (g)    aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 54 i aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 56, obe aminokiselinske sekvence bez signalne sekvence; (h)    aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 62 i aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 64, obe aminokiselinske sekvence bez signalne sekvence; (i)    aminokiselinska sekvenca SEQ ED NO: 70 i aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 72, obe aminokiselinske sekvence bez signalne sekvence; (j)    aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 78 i aminokiselinska sekvenca SEQ ED NO: 80, obe aminokiselinske sekvence bez signalne sekvence i (k)    aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 86 i aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 88, obe aminokiselinske sekvence bez signalne sekvence.
16.    Upotreba antitela koje se specifično vezuje za humani CD40 i aktivira ga, za proizvodnju leka za lečenje CD40 negativnog tumora u čoveku.
17.    Monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za humani CD40 i aktivira ga, naznačeno time, Što navedeno antitelo sadrži: (a)    aminokiselinsku sekvencu đatu u SEQ ID NO: 6 bez signalne sekvence, gde je alanin na 78. mestu zrele sekvence zamenjen treoninom, valin na 88. mestu zrele sekvence zamenjen alaninom i valin na 97. mestu zrele sekvence zamenjen alauinoin i (b)    aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ED NO: 8 bez signalne sekvence, gde je leucin na 4. mestu zrele sekvence zamenjen metioninom, a leucm na 83. mestu zrele sekvence zamenjen valinom.
18. Monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za humani CD40 i aktivira ga, naznačeno time, što navedeno antitelo sadrži: (a)    aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO: 46 bez signalne sekvence i (b)    aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO: 48 bez signalne sekvence.
MEP-2008-814A 2001-11-09 2002-11-08 Antitjela za cd40 ME00503B (me)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US34898001P 2001-11-09 2001-11-09
PCT/US2002/036107 WO2003040170A2 (en) 2001-11-09 2002-11-08 Antibodies to cd40

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ME00503B true ME00503B (me) 2011-10-10

Family

ID=23370387

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MEP-2008-814A ME00503B (me) 2001-11-09 2002-11-08 Antitjela za cd40

Country Status (46)

Country Link
US (9) US7288251B2 (me)
EP (2) EP2343086A3 (me)
JP (3) JP4616555B2 (me)
KR (1) KR100830086B1 (me)
CN (2) CN103450360B (me)
AP (1) AP1918A (me)
AR (1) AR039067A1 (me)
AU (1) AU2002356926B2 (me)
BR (1) BRPI0214137B8 (me)
CA (1) CA2466128C (me)
CL (1) CL2009001779A1 (me)
CR (2) CR7343A (me)
CU (1) CU23745A3 (me)
CY (1) CY1115675T1 (me)
DK (1) DK1476185T3 (me)
DO (1) DOP2002000507A (me)
EA (1) EA011449B1 (me)
EC (1) ECSP045093A (me)
EG (1) EG25801A (me)
ES (1) ES2432968T3 (me)
GE (1) GEP20074222B (me)
GT (1) GT200200228A (me)
HN (1) HN2002000318A (me)
HR (1) HRP20040525B1 (me)
HU (1) HU229829B1 (me)
IL (2) IL161823A0 (me)
IS (1) IS2940B (me)
MA (1) MA27139A1 (me)
ME (1) ME00503B (me)
MX (1) MXPA04004467A (me)
MY (1) MY137641A (me)
NI (1) NI200200128A (me)
NO (1) NO334339B1 (me)
NZ (1) NZ533180A (me)
OA (1) OA12725A (me)
PA (1) PA8557701A1 (me)
PE (1) PE20030846A1 (me)
PL (2) PL214634B1 (me)
PT (1) PT1476185E (me)
RS (1) RS52484B (me)
SI (1) SI1476185T1 (me)
TN (1) TNSN04078A1 (me)
TW (2) TWI331040B (me)
UY (1) UY27537A1 (me)
WO (1) WO2003040170A2 (me)
ZA (1) ZA200404207B (me)

Families Citing this family (266)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7244827B2 (en) * 2000-04-12 2007-07-17 Agensys, Inc. Nucleic acid and corresponding protein entitled 24P4C12 useful in treatment and detection of cancer
US6943235B1 (en) * 1999-04-12 2005-09-13 Agensys, Inc. Transmembrane protein expressed in prostate cancer
US20050255106A1 (en) * 1999-05-22 2005-11-17 Linda Diehl Induction of anti-tumor ctl immunity through in vivo triggering of 4-1bb and/or cd40
US20030059427A1 (en) * 2000-04-28 2003-03-27 Force Walker R. Isolation and characterization of highly active anti-CD40 antibody
US7972845B2 (en) 2000-09-07 2011-07-05 Case Western Reserve University Human antibodies against Pseudomonas aeruginosa LPS derived from transgenic xenomouse
PT1391464E (pt) 2001-04-27 2007-11-15 Kirin Pharma Kk Anticorpo monoclonal anti-cd40
US7658924B2 (en) 2001-10-11 2010-02-09 Amgen Inc. Angiopoietin-2 specific binding agents
AR039067A1 (es) * 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
US20040185040A1 (en) 2001-11-21 2004-09-23 Celltech R & D Limited Modulating immune responses
WO2003045318A2 (en) * 2001-11-21 2003-06-05 Celltech R & D, Inc. Manipulation of cytokine levels using cd83 gene products
EP2377547A1 (en) * 2002-06-07 2011-10-19 ZymoGenetics, Inc. Use of IL-21 as an antimicrobial agent
US7052694B2 (en) * 2002-07-16 2006-05-30 Mayo Foundation For Medical Education And Research Dendritic cell potentiation
HN2004000285A (es) 2003-08-04 2006-04-27 Pfizer Prod Inc ANTICUERPOS DIRIGIDOS A c-MET
PL1680140T3 (pl) * 2003-10-16 2011-11-30 Imclone Llc Inhibitory receptora-1 czynnika wzrostu fibroblastów i związane z nim sposoby leczenia
US8277810B2 (en) 2003-11-04 2012-10-02 Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc. Antagonist anti-CD40 antibodies
KR101403910B1 (ko) * 2003-11-04 2014-06-09 노바티스 백신즈 앤드 다이아그노스틱스 인코포레이티드 길항제 항-ｃｄ４０ 단클론성 항체 및 그것의 사용 방법
EP1706425A2 (en) 2003-12-05 2006-10-04 John R. Schreiber Human anti-pseudomonas-aeruginosa antibodies derived from transgenic xenomouse®
US20050136055A1 (en) * 2003-12-22 2005-06-23 Pfizer Inc CD40 antibody formulation and methods
DK1707627T3 (da) * 2003-12-25 2012-12-17 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Antagonistisk anti-CD40-antistofmutant.
EP1709080B1 (en) 2004-01-09 2011-03-09 Pfizer Inc. ANTIBODIES TO MAdCAM
WO2005092927A1 (en) 2004-03-23 2005-10-06 Biogen Idec Ma Inc. Receptor coupling agents and therapeutic uses thereof
ES2427147T3 (es) * 2004-06-30 2013-10-29 Mayo Foundation For Medical Education And Research Anticuerpo sHlgM12 útil para tratar esclerosis múltiple
US20060099203A1 (en) 2004-11-05 2006-05-11 Pease Larry R B7-DC binding antibody
CN1997670B (zh) 2004-07-01 2014-04-30 诺和诺德公司 人类抗-kir抗体
WO2006017574A1 (en) * 2004-08-03 2006-02-16 Mayo Foundation For Medical Education And Research Improving treatments
US7563443B2 (en) * 2004-09-17 2009-07-21 Domantis Limited Monovalent anti-CD40L antibody polypeptides and compositions thereof
PL1836225T3 (pl) 2005-01-06 2012-05-31 Novo Nordisk As Czynniki wiążące kir i sposoby ich stosowania
JP4986633B2 (ja) 2005-01-12 2012-07-25 協和発酵キリン株式会社 安定化されたヒトＩｇＧ２およびＩｇＧ３抗体
SG10201912554TA (en) * 2005-03-23 2020-02-27 Genmab As Antibodies against cd38 for treatment of multiple myeloma
CA2763671A1 (en) 2005-04-26 2006-11-02 Pfizer Inc. P-cadherin antibodies
WO2006125117A2 (en) * 2005-05-18 2006-11-23 Novartis Ag Methods for diagnosis and treatment of diseases having an autoimmune and/or inflammatory component
EP1894012A2 (en) * 2005-05-18 2008-03-05 Novartis AG Methods for diagnosis and treatment of proliferative disorders mediated by cd40 signaling
GB0512225D0 (en) * 2005-06-16 2005-07-27 Univ Sheffield Immunoglobulin molecules
SI3248613T1 (sl) 2005-07-18 2022-04-29 Seagen Inc. Konjugati beta-glukuronidni linker-zdravilo
CN101517068B (zh) 2005-09-07 2017-02-08 安进弗里蒙特公司 活化素受体样激酶‑1的人单克隆抗体
WO2007103048A2 (en) * 2006-03-01 2007-09-13 Regents Of The University Of Colorado Tlr agonist (flagellin)/cd40 agonist/antigen protein and dna conjugates and use thereof for inducing synergistic enhancement in immunity
US7993648B2 (en) 2006-05-03 2011-08-09 The Regents of the Universitry of Colorado Immunostimulatory regimen comprising administering type 1 interferon and agonistic anti-CD40 antibody
BRPI0711358A2 (pt) 2006-05-09 2011-09-27 Pfizer Prod Inc derivados do ácido cicloalquilamino e suas composições farmacêuticas
EP1854810A1 (en) * 2006-05-09 2007-11-14 PanGenetics B.V. Deimmunized antagonistic anti-human CD40 monoclonal antibody from the ch5D12 antibody
US9234174B2 (en) * 2006-05-12 2016-01-12 Ospedale San Raffaele S.R.L. Tolerogenic dendritic cells, method for their production and uses therof
US20090074711A1 (en) * 2006-09-07 2009-03-19 University Of Southhampton Human therapies using chimeric agonistic anti-human cd40 antibody
AU2007332473B2 (en) * 2006-12-14 2012-09-27 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Anti-Claudin-3 monoclonal antibody, and treatment and diagnosis of cancer using the same
EP2064242A1 (en) 2007-02-23 2009-06-03 Schering Corporation Engineered anti-il-23p19 antibodies
ATE554791T1 (de) 2007-02-23 2012-05-15 Schering Corp Gentechnisch hergestellte anti-il-23p19- antikörper
LT2176298T (lt) 2007-05-30 2018-04-10 Xencor, Inc. Būdai ir kompozicijos, skirti cd32b ekspresuojančių ląstelių slopinimui
EP1997830A1 (en) 2007-06-01 2008-12-03 AIMM Therapeutics B.V. RSV specific binding molecules and means for producing them
US8039597B2 (en) * 2007-09-07 2011-10-18 Agensys, Inc. Antibodies and related molecules that bind to 24P4C12 proteins
BRPI0820707A2 (pt) 2007-11-07 2015-06-16 Genentech Inc Métodos e composição para avaliar a responsividade do linfoma de células b para o tratamento com anticorpos anti-cd40
SG186656A1 (en) 2007-12-14 2013-01-30 Bristol Myers Squibb Co Binding molecules to the human ox40 receptor
JO2913B1 (en) * 2008-02-20 2015-09-15 امجين إنك, Antibodies directed towards angiopoietin-1 and angiopoietin-2 proteins and their uses
ATE542813T1 (de) 2008-08-06 2012-02-15 Pfizer 6-substituierte 2- heterocyclylaminopyrazinverbindungen als chk-1- inhibitoren
US20110311525A1 (en) * 2008-08-29 2011-12-22 Academisch Ziekenhuis Leiden H.O.D.N. Lumc Delivery of a cd40 agonist to a tumor draining lymph node of a subject
EP2198878A1 (en) 2008-12-18 2010-06-23 University Of Miami Polypeptide bombesin antagonists
JO3382B1 (ar) 2008-12-23 2019-03-13 Amgen Inc أجسام مضادة ترتبط مع مستقبل cgrp بشري
AU2016244220B2 (en) * 2008-12-23 2018-05-17 Amgen Inc. Human CGRP receptor binding proteins
CA2754531A1 (en) * 2009-03-06 2010-09-30 Seattle Genetics, Inc. Antibody drug conjugates (adc) that bind to 24p4c12 proteins
ES2584956T3 (es) * 2009-03-10 2016-09-30 Baylor Research Institute Anticuerpos anti-CD40 y usos de los mismos
CN105837691B (zh) * 2009-03-10 2021-06-29 贝勒研究院 靶向抗原呈递细胞的癌症疫苗
DK2406288T3 (en) 2009-03-10 2017-03-27 Baylor Res Inst ANTIGEN PRESENTING CELL-TARGETED VACCINES
KR101787768B1 (ko) 2009-04-18 2017-10-18 제넨테크, 인크. 항-ｃｄ４０ 항체를 사용한 치료에 대한 ｂ-세포 림프종의 반응성 평가를 위한 방법
EP2993188B1 (en) 2009-04-20 2020-08-19 Kyowa Kirin Co., Ltd. Anti cd40 antibody containing igg2 having three amino acid mutations introduced therein
TW201138843A (en) 2009-12-18 2011-11-16 Colgate Palmolive Co Biguanide preservation of precipitated calcium carbonate
WO2011083391A2 (en) 2010-01-05 2011-07-14 Pfizer Inc. Biomarkers for anti-igf-ir cancer therapy
AU2011235214B2 (en) 2010-03-31 2015-04-23 Boehringer Ingelheim International Gmbh Anti-CD40 antibodies
GB201006096D0 (en) * 2010-04-13 2010-05-26 Alligator Bioscience Ab Novel compositions and uses thereof
FR2959994B1 (fr) 2010-05-12 2012-08-24 Lfb Biotechnologies Nouveaux anticorps humanises 12g4 mutes et leurs fragments diriges contre le recepteur humain de l'hormone anti-mullerienne de type ii
SG10201912092VA (en) 2010-09-09 2020-02-27 Pfizer 4-1bb binding molecules
CA2805361A1 (en) * 2010-09-29 2012-04-05 Universite De Liege Combination of an agonistic anti-cd40 monoclonal antibody or a cd40 ligand and inactivated or attenuated bacteria for use in the treatment and/or prevention of mastitis
AR083847A1 (es) 2010-11-15 2013-03-27 Novartis Ag Variantes de fc (fragmento constante) silenciosas de los anticuerpos anti-cd40
US20130273055A1 (en) * 2010-11-16 2013-10-17 Eric Borges Agents and methods for treating diseases that correlate with bcma expression
DK2663580T3 (en) * 2011-01-10 2017-03-13 Ct Atlantic Ltd COMBINATION THERAPY INCLUDING TUMOR ASSOCIATED ANTI-BINDING ANTIBODIES
GB201103578D0 (en) 2011-03-02 2011-04-13 Sabrepharm Ltd Dipyridinium derivatives
PL2683406T3 (pl) 2011-03-11 2019-11-29 Beth Israel Deaconess Medical Ct Inc Przeciwciała anty-cd40 i ich zastosowania
US20140178368A1 (en) 2011-04-19 2014-06-26 Leslie Lynne SHARP Combinations of anti-4-1bb antibodies and adcc-inducing antibodies for the treatment of cancer
KR20140059168A (ko) 2011-04-21 2014-05-15 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 콜로라도, 어 바디 코포레이트 시신경 척수염 치료용 조성물 및 치료 방법
PL2699601T3 (pl) 2011-04-21 2018-05-30 Bristol-Myers Squibb Company Polipeptydy przeciwciała, które antagonizują CD40
CN106928362B (zh) 2011-04-29 2021-10-26 埃派斯进有限公司 抗-cd40抗体及其使用方法
CN107936121B (zh) 2011-05-16 2022-01-14 埃泰美德(香港)有限公司 多特异性fab融合蛋白及其使用方法
GB201115280D0 (en) * 2011-09-05 2011-10-19 Alligator Bioscience Ab Antibodies, uses and methods
GB201116092D0 (en) 2011-09-16 2011-11-02 Bioceros B V Antibodies and uses thereof
BR112014006822B1 (pt) * 2011-09-22 2021-05-18 Amgen Inc. Proteína de ligação ao antígeno cd27l, composição compreendendo uma proteína de ligação ao antígeno cd27l, ácido nucleico isolado, vetor de expressão, célula hospedeira recombinante procariótica, método de preparação de um conjugado de droga e anticorpo cd27l e uso de uma proteína de ligação ao antígeno cd27l
KR102096224B1 (ko) 2011-10-28 2020-04-03 테바 파마슈티컬즈 오스트레일리아 피티와이 엘티디 폴리펩티드 구축물 및 이의 용도
TWI679212B (zh) 2011-11-15 2019-12-11 美商安進股份有限公司 針對ｂｃｍａ之e3以及ｃｄ３的結合分子
WO2013091661A2 (en) * 2011-12-23 2013-06-27 Aarhus Universitet Proteolytic resistant protein affinity tag
IN2014CN04645A (me) * 2012-01-31 2015-09-18 Regeneron Pharma
AR090263A1 (es) * 2012-03-08 2014-10-29 Hoffmann La Roche Terapia combinada de anticuerpos contra el csf-1r humano y las utilizaciones de la misma
JP5798199B2 (ja) * 2012-03-08 2015-10-21 国立研究開発法人科学技術振興機構 抗がん剤
SG11201406592QA (en) 2012-05-04 2014-11-27 Pfizer Prostate-associated antigens and vaccine-based immunotherapy regimens
US20140004131A1 (en) 2012-05-04 2014-01-02 Novartis Ag Antibody formulation
WO2013192215A1 (en) 2012-06-18 2013-12-27 Yale University Compositions and methods for diminishing an immune response
KR102270618B1 (ko) 2012-10-30 2021-06-30 아펙시젠, 인코포레이티드 항-cd40 항체 및 사용 방법
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
PT2951208T (pt) * 2013-02-01 2019-12-30 Univ California Anticorpos anti-cd83 e sua utilização
WO2014144817A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Amgen Inc. Inhibitory polypeptides specific to wnt inhibitors
MD20180107A2 (ro) 2013-03-18 2019-06-30 Biocerox Products B.V. Anticorpi anti-CD134 (OX40) umanizaţi şi utilizarea acestora
US11117975B2 (en) 2013-04-29 2021-09-14 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-CD38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2B
EP2992013B1 (en) 2013-04-29 2019-12-04 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-cd38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2b
BR112015030881A2 (pt) 2013-06-14 2017-10-24 Psioxus Theraupeutics Ltd “regime de dosagem e formulações para adenovírus de tipo b”
JP6450750B2 (ja) 2013-06-17 2019-01-09 コーニンクレッカ フィリップス エヌ ヴェＫｏｎｉｎｋｌｉｊｋｅ Ｐｈｉｌｉｐｓ Ｎ．Ｖ． 磁気共鳴画像化被験者支持器
GB201311487D0 (en) * 2013-06-27 2013-08-14 Alligator Bioscience Ab Bispecific molecules
EP3995507B1 (en) 2013-08-08 2023-10-04 Cytune Pharma Il-15 and il-15ralpha sushi domain based on modulokines
WO2015035215A1 (en) 2013-09-05 2015-03-12 Amgen Inc. Fc-containing molecules exhibiting predictable, consistent, and reproducible glycoform profiles
AR097584A1 (es) 2013-09-12 2016-03-23 Hoffmann La Roche Terapia de combinación de anticuerpos contra el csf-1r humano y anticuerpos contra el pd-l1 humano
EP3831398A1 (en) 2013-10-25 2021-06-09 PsiOxus Therapeutics Limited Oncolytic adenoviruses armed with heterologous genes
GB201322583D0 (en) * 2013-12-19 2014-02-05 Alligator Bioscience Ab Antibodies
HK1221409A1 (zh) * 2013-12-20 2017-06-02 豪夫迈．罗氏有限公司 抗ang2抗体和cd40激动剂的组合疗法
CN120939216A (zh) 2014-01-13 2025-11-14 贝勒研究院 抗hpv和hpv相关的疾病的新疫苗
EP3113796A1 (en) 2014-03-07 2017-01-11 Bristol-Myers Squibb Company Method of using antibody polypeptides that antagonize cd40 to treat ibd
MX2016012779A (es) 2014-03-31 2017-04-27 Genentech Inc Terapia de combinacion con agentes antiangiogénesis y agonistas de unión a ox40.
IL303667A (en) * 2014-04-30 2023-08-01 Max Delbruck Centrum Fur Molekulare Medizin In Der Helmholtz Gemeinschaft Humanized antibodies against cd269 (bcma)
UA119352C2 (uk) 2014-05-01 2019-06-10 Тева Фармасьютикалз Острейліа Пті Лтд Комбінація леналідоміду або помалідоміду і конструкції анти-cd38 антитіло-атенуйований інтерферон альфа-2b та спосіб лікування суб'єкта, який має cd38-експресуючу пухлину
AU2015259053B2 (en) 2014-05-16 2020-12-24 Amgen Inc. Assay for detecting Th1 and Th2 cell populations
GB201413665D0 (en) 2014-07-03 2014-09-17 Transimmune Ag And Yale University Method for obtaining globally activated monocytes
CN114099671A (zh) 2014-08-12 2022-03-01 鳄鱼生物科学公司 利用抗cd40抗体的组合疗法
JP6586454B2 (ja) 2014-08-14 2019-10-02 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト ヒトｃｄ４０を活性化する抗体とヒトｐｄ−ｌ１に対する抗体との併用療法
EP3070102A1 (en) 2015-03-18 2016-09-21 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of antibodies human cd40 activating antibodies and anti human pld-1 antibodies
AU2015318008B2 (en) 2014-09-15 2021-05-20 Amgen Inc. Bi-specific anti-CGRP receptor/PAC1 receptor antigen binding proteins and uses thereof
CA2965170A1 (en) 2014-10-23 2016-04-28 Dendrocyte Biotech Pty Ltd Cd83 binding proteins and uses thereof
US9107906B1 (en) 2014-10-28 2015-08-18 Adma Biologics, Inc. Compositions and methods for the treatment of immunodeficiency
UA125637C2 (uk) 2014-10-29 2022-05-11 Тева Фармасьютікалз Острейліа Пті Лтд ЗЛИТИЙ ПОЛІПЕПТИД ІНТЕРФЕРОНУ <font face="Symbol">a2</font>b
KR20240073140A (ko) 2014-10-29 2024-05-24 씨젠 인크. 비-푸코실화된 항-cd40 항체의 용량 및 투여
TWI595006B (zh) 2014-12-09 2017-08-11 禮納特神經系統科學公司 抗ｐｄ－１抗體類和使用彼等之方法
BR112017020952A2 (pt) 2015-04-13 2018-07-10 Five Prime Therapeutics Inc método de tratamento de câncer, composição e uso da composição
JOP20200116A1 (ar) 2015-04-24 2017-06-16 Amgen Inc طرق لعلاج أو الوقاية من الصداع النصفي
KR20180118249A (ko) 2015-04-30 2018-10-30 싸이오서스 테라퓨틱스 엘티디. B7 단백질을 암호화하는 종양세포붕괴 아데노바이러스
IL302486A (en) 2015-06-24 2023-06-01 Hoffmann La Roche Antibodies against the transnephrine receptor with adapted affinity
MX2017016502A (es) 2015-06-29 2018-03-12 Univ Rockefeller Anticuerpos contra cd40 con actividad agonista mejorada.
ES3039629T3 (en) * 2015-06-29 2025-10-23 Bristol Myers Squibb Co Antibodies to cd40
WO2017009842A2 (en) 2015-07-16 2017-01-19 Biokine Therapeutics Ltd. Compositions and methods for treating cancer
BR112018004296B1 (pt) 2015-09-04 2020-05-05 Primatope Therapeutics Inc anticorpos anti-cd40 humanizados e usos dos mesmos
CN108368510B (zh) 2015-09-30 2023-09-01 詹森生物科技公司 特异性结合人cd40的激动性抗体和使用方法
CN114057885A (zh) 2015-10-02 2022-02-18 豪夫迈·罗氏有限公司 双特异性抗人cd20/人转铁蛋白受体抗体及使用方法
AR106189A1 (es) 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO
GB2543550A (en) 2015-10-21 2017-04-26 Hox Therapeutics Ltd Peptides
MY198562A (en) 2015-11-03 2023-09-05 Janssen Biotech Inc Antibodies specifically binding pd-1 and their uses
EP3757119A1 (en) * 2015-11-16 2020-12-30 Ubiprotein, Corp. A method for extending half-life of a protein
CA3007311A1 (en) * 2015-12-07 2017-06-15 Opi Vi - Ip Holdco Llc Compositions of antibody construct-agonist conjugates and methods of use thereof
AU2016369485B2 (en) 2015-12-17 2024-02-01 Akamis Bio Limited Group B adenovirus encoding an anti-TCR-complex antibody or fragment
EP4406550A3 (en) * 2016-03-04 2024-10-16 The Rockefeller University Antibodies to cd40 with enhanced agonist activity
PL3426271T3 (pl) 2016-03-10 2025-11-24 Cg Oncology, Inc. Sposoby leczenia guzów litych terapią skojarzoną
US10870701B2 (en) 2016-03-15 2020-12-22 Generon (Shanghai) Corporation Ltd. Multispecific fab fusion proteins and use thereof
WO2017165681A1 (en) 2016-03-24 2017-09-28 Gensun Biopharma Inc. Trispecific inhibitors for cancer treatment
JP7073266B2 (ja) 2016-03-25 2022-05-23 シージェン インコーポレイテッド Ｐｅｇ化薬物リンカー及びその中間体を調製するためのプロセス
CA3025345A1 (en) 2016-05-27 2017-11-30 Abbvie Biotherapeutics Inc. Bispecific binding proteins binding an immunomodulatory protein and a tumor antigen
KR102366355B1 (ko) 2016-05-27 2022-02-24 애브비 바이오테라퓨틱스 인크. 항-cd40 항체 및 이의 용도
PT3468997T (pt) 2016-06-08 2023-12-07 Debra Zack Tratamento de doenças relacionadas com igg4 com anticorpos anti-cd19 com ligação cruzada a cd32b
EP3470424B1 (en) * 2016-06-08 2025-04-23 Shanghai Jiao Tong University School of Medicine Sequence of antibody heavy chain constant region for enhancing agonist antibody activity
JP7461741B2 (ja) 2016-06-20 2024-04-04 カイマブ・リミテッド 抗ｐｄ－ｌ１およびｉｌ－２サイトカイン
BR112019000512A2 (pt) 2016-07-14 2019-04-24 Genmab A/S anticorpo, ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira, composição, métodos de tratamento de uma doença, para produzir um anticorpo biespecífico e para detectar se a reticulação entre as células que expressam cd40 e cd137 ocorre em uma amostra, uso de um anticorpo multiespecífico, e, kit
US11618784B2 (en) 2016-07-19 2023-04-04 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd. Anti-CD47 combination therapy
SG11201900746RA (en) 2016-08-12 2019-02-27 Janssen Biotech Inc Engineered antibodies and other fc-domain containing molecules with enhanced agonism and effector functions
CA3033665A1 (en) 2016-08-12 2018-02-15 Janssen Biotech, Inc. Fc engineered anti-tnfr superfamily member antibodies having enhanced agonistic activity and methods of using them
EP3504239B1 (en) 2016-08-25 2024-05-29 F. Hoffmann-La Roche AG Intermittent dosing of an anti-csf-1r antibody in combination with macrophage activating agent
GB201713765D0 (en) 2017-08-28 2017-10-11 Psioxus Therapeutics Ltd Modified adenovirus
CA3033267A1 (en) 2016-08-29 2018-03-08 Psioxus Therapeutics Limited Adenovirus armed with bispecific t cell engager (bite)
KR102019033B1 (ko) 2016-11-11 2019-09-06 다이노나(주) Cd40에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도
EA201991207A1 (ru) 2016-12-19 2019-12-30 Гленмарк Фармасьютикалс С.А. Новые агонисты tnfr и их применение
EP3558360A1 (en) 2016-12-22 2019-10-30 F. Hoffmann-La Roche AG Treatment of tumors with an anti-csf-1r antibody in combination with an anti-pd-l1 antibody after failure of anti-pd-l1/pd1 treatment
WO2018128939A1 (en) 2017-01-05 2018-07-12 Gensun Biopharma Inc. Checkpoint regulator antagonists
WO2018144955A1 (en) * 2017-02-02 2018-08-09 Silverback Therapeutics, Inc. Construct-peptide compositions and methods of use thereof
JP7577446B2 (ja) 2017-02-10 2024-11-05 ジェンマブ ビー．ブイ． ポリペプチドバリアントおよびそれらの使用
JP7672196B2 (ja) 2017-03-14 2025-05-07 アムジエン・インコーポレーテツド 細胞培養において産生される抗体の総非フコシル化グリコフォームの調節
US10259865B2 (en) 2017-03-15 2019-04-16 Adma Biologics, Inc. Anti-pneumococcal hyperimmune globulin for the treatment and prevention of pneumococcal infection
KR102648564B1 (ko) 2017-03-24 2024-03-19 씨젠 인크. 글루쿠로니드 약물-링커의 제조 공정 및 그 중간물
CA3055433A1 (en) * 2017-03-29 2018-10-04 Glycotope Gmbh Humanized anti-cd40 antibodies
KR102464270B1 (ko) 2017-03-30 2022-11-07 니치유 가부시키가이샤 헤테로이관능성 단분산 폴리에틸렌 글리콜 및 그것을 이용한 복합체
EP3604384B1 (en) 2017-03-30 2021-09-08 NOF Corporation Hydrophilic polymer derivative having self-immolative acetal linker and composite using same
PE20200006A1 (es) 2017-04-04 2020-01-06 Hoffmann La Roche Nuevas moleculas de union antigeno biespecificas capaces de unirse especificamente cd40 y a fap
JP2020516638A (ja) 2017-04-13 2020-06-11 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト がんを処置する方法における使用のための、インターロイキン２イムノコンジュゲート、ｃｄ４０アゴニスト、および任意選択のｐｄ−１軸結合アンタゴニスト
CN110267989B (zh) * 2017-06-01 2023-04-04 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗cd40抗体、其抗原结合片段及其医药用途
CN118308311A (zh) * 2017-06-01 2024-07-09 阿卡米斯生物公司 溶瘤病毒和方法
JP2020521788A (ja) * 2017-06-02 2020-07-27 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 免疫アゴニストの投与経路
EP3418302A1 (en) 2017-06-19 2018-12-26 F. Hoffmann-La Roche AG Administration routes for immune agonists
CR20200076A (es) 2017-07-14 2020-06-10 Pfizer ANTICUERPOS CONTRA MAdCAM
WO2019036855A1 (en) 2017-08-21 2019-02-28 Adagene Inc. Anti-cd137 molecules and use thereof
CN111225924B (zh) 2017-09-19 2023-10-10 Mab发现股份有限公司 激动性cd40抗体
US10610585B2 (en) 2017-09-26 2020-04-07 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Methods and compositions for treating and preventing HIV
EP3708589A4 (en) 2017-11-08 2021-08-11 Kyowa Kirin Co., Ltd. BISPECIFIC ANTIBODIES THAT BIND TO CD40 AND EpCAM
JP7284759B2 (ja) 2017-12-27 2023-05-31 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー 抗ｃｄ４０抗体およびその使用
CN109971717B (zh) * 2017-12-28 2023-06-20 上海细胞治疗研究院 共表达cd40抗体与间皮素特异性嵌合抗原受体的t细胞及其用途
CN109971723B (zh) * 2017-12-28 2023-07-07 上海细胞治疗研究院 包含CD40抗体与muc1特异性嵌合抗原受体基因的T细胞及其用途
US12398209B2 (en) 2018-01-22 2025-08-26 Janssen Biotech, Inc. Methods of treating cancers with antagonistic anti-PD-1 antibodies
GB201801614D0 (en) 2018-01-31 2018-03-14 Psioxus Therapeutics Ltd Formulation
WO2019148445A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Precision/context-dependent activatable antibodies, and methods of making and using the same
WO2019148444A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Anti-ctla4 antibodies and methods of making and using the same
CA3093645A1 (en) 2018-03-13 2019-09-19 Nof Corporation Heterobifunctional compound having monodispersed polyethylene glycol in main chain and side chain
EP3775251A1 (en) 2018-03-26 2021-02-17 Amgen Inc. Total afucosylated glycoforms of antibodies produced in cell culture
MA52202A (fr) 2018-04-02 2021-02-17 Amgen Inc Compositions d'érénumab et utilisations de celles-ci
AU2019255781A1 (en) * 2018-04-20 2020-10-29 Lyvgen Biopharma Holdings Limited Anti-CD40 antibodies and uses thereof
US20200017596A1 (en) * 2018-05-10 2020-01-16 Abvision, Inc. Monoclonal antibodies activating cd40 and uses thereof
WO2019232533A1 (en) * 2018-06-01 2019-12-05 Massachusetts Institute Of Technology Combination treatments of hsp90 inhibitors for enhancing tumor immunogenicity and methods of use thereof
CN112638375A (zh) 2018-06-15 2021-04-09 旗舰创业创新五公司 通过后细胞信号传导因子的调节来增加免疫活性
US11001635B2 (en) 2018-06-29 2021-05-11 Gensun Biopharma Inc. Antitumor antagonists
PE20211412A1 (es) 2018-08-20 2021-08-02 Pfizer Anticuerpos anti-gdf15, composiciones y metodos de uso
EP3847196A4 (en) 2018-09-07 2023-01-04 ITabMed (HK) Limited BISPECIFIC ANTIGEN BINDING PROTEINS AND USES THEREOF
WO2020070288A1 (en) 2018-10-05 2020-04-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and systems for controlling the agonistic properties of antibody variable domains by light
CN112969714B (zh) 2018-11-30 2022-11-22 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗cd40抗体、其抗原结合片段及其医药用途
BR112021010414A2 (pt) 2018-11-30 2021-09-08 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Composição farmacêutica compreendendo um anticorpo cd40, método para preparar uma preparação liofilizada, preparação liofilizada, uso das mesmas e produto que compreende um recipiente contendo as mesmas
WO2020154335A1 (en) * 2019-01-22 2020-07-30 Revmab Biosciences Usa, Inc. Novel anti-cd40 antibodies
US10570210B1 (en) 2019-03-04 2020-02-25 Beijing Mabworks Biotech Co.Ltd Antibodies binding CD40 and uses thereof
US20220175920A1 (en) 2019-03-27 2022-06-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Recombinant proteins with cd40 activating properties
AU2020256828A1 (en) 2019-04-10 2021-11-18 Nankai University Anti-CD40 antibody and use thereof
EP3962493A2 (en) 2019-05-03 2022-03-09 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Methods of modulating immune activity/level of irf or sting or of treating cancer, comprising the administration of a sting modulator and/or purinergic receptor modulator or postcellular signaling factor
EP3971293A4 (en) 2019-05-15 2023-02-08 Kyowa Kirin Co., Ltd. BISPECIFIC ANTIBODY THAT CAN BIND TO CD40 AND GPC3
AU2020276931A1 (en) 2019-05-15 2021-12-16 Kyowa Kirin Co., Ltd. Bispecific antibody binding to CD40 and FAP
EP3990116A1 (en) 2019-06-28 2022-05-04 Gensun Biopharma Inc. ANTITUMOR ANTAGONIST CONSISTING OF A MUTATED TGFß1 - RII EXTRACELLULAR DOMAIN AND AN IMMUNOGLOBULIN SCAFFOLD
US20220370418A1 (en) 2019-09-09 2022-11-24 Basilea Pharmaceutica International AG Pharmaceutical combinations comprising a furazanobenzimidazoles and a cd40 agonist for use in the treatment of neoplastic diseases
US20220362397A1 (en) 2019-09-26 2022-11-17 Nof Corporation Heterobifunctional monodispersed polyethylene glycol having peptide linker
CA3152547A1 (en) 2019-09-26 2021-04-01 Amgen Inc. Methods of producing antibody compositions
BR112022010680A2 (pt) * 2019-12-03 2022-08-16 Evotec Int Gmbh Proteínas de ligação ao antígeno associado ao interferon e uso das mesmas
WO2021127217A1 (en) 2019-12-17 2021-06-24 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Combination anti-cancer therapies with inducers of iron-dependent cellular disassembly
MX2022007688A (es) 2019-12-20 2022-07-19 Amgen Inc Constructos de anticuerpo multiespecificos agonistas de cd40 dirigidos a mesotelina para el tratamiento de tumores solidos.
US20210214454A1 (en) * 2020-01-10 2021-07-15 Symphogen A/S Anti-cd40 antibodies and compositions
IL272194A (en) 2020-01-22 2021-07-29 Yeda Res & Dev Multi-target antibodies for use in the treatment of diseases
JPWO2021215462A1 (me) 2020-04-23 2021-10-28
EP4559477A3 (en) 2020-05-13 2025-08-13 Adagene AG Compositions and methods for treating cancer
EP4149960A1 (en) 2020-05-14 2023-03-22 Molecular Partners AG Recombinant cd40 binding proteins and their use
BR112022023049A2 (pt) 2020-05-14 2022-12-20 Molecular Partners Ag Proteínas multiespecíficas
WO2021239838A2 (en) 2020-05-26 2021-12-02 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (sars-cov-2) polypeptides and uses thereof for vaccine purposes
GB202008003D0 (en) * 2020-05-28 2020-07-15 Quine Medical Ab Anti-CD40 antibody
US20230273126A1 (en) 2020-06-04 2023-08-31 Amgen Inc. Assessment of cleaning procedures of a biotherapeutic manufacturing process
EP4172323A1 (en) 2020-06-29 2023-05-03 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Viruses engineered to promote thanotransmission and their use in treating cancer
WO2022037662A1 (en) * 2020-08-21 2022-02-24 Wuxi Biologics (Shanghai) Co. Ltd. Cd40 agonistic antibody and method of use
JP2023548767A (ja) 2020-10-15 2023-11-21 アムジエン・インコーポレーテツド 抗体製造方法における相対不対グリカン
MX2023005570A (es) 2020-11-12 2023-05-29 Inst Nat Sante Rech Med Anticuerpos conjugados o fusionados al dominio de union del receptor de la proteina de la espicula de sars-cov-2 y usos de los mismos con fines de vacunacion.
EP4267176A1 (en) 2020-12-23 2023-11-01 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Chlamydia vaccine based on targeting momp vs4 antigen to antigen presenting cells
TW202241479A (zh) 2020-12-30 2022-11-01 美商安迅生物製藥公司 遞送外來抗原之溶瘤病毒及表現靶向外來抗原之嵌合受體之經工程化免疫細胞之組合療法
KR20230142724A (ko) * 2021-01-08 2023-10-11 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 인자 XIa 억제제에 대한 항체 및 항원 결합 펩티드및 그의 용도
EP4277668A1 (en) 2021-01-13 2023-11-22 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy
CA3209251A1 (en) 2021-01-29 2022-08-04 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Chlamydia trachomatis antigenic polypeptides and uses thereof for vaccine purposes
CA3206549A1 (en) 2021-01-29 2022-08-04 Frederick G. Vogt Methods of making modified tumor infiltrating lymphocytes and their use in adoptive cell therapy
CN116917009A (zh) 2021-02-19 2023-10-20 美国迈胜医疗系统有限公司 用于粒子治疗系统的机架
IL305681A (en) 2021-03-09 2023-11-01 Genmab As Multispecific binding agents against cd40 and cd137 in therapy
KR20230165276A (ko) 2021-03-31 2023-12-05 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이, 인크. 타노트랜스미션 폴리펩티드 및 암의 치료에서의 이의 용도
WO2022261021A1 (en) 2021-06-07 2022-12-15 Amgen Inc. Using fucosidase to control afucosylation level of glycosylated proteins
MX2023015070A (es) * 2021-06-28 2024-01-17 Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co Ltd Anticuerpo anti-cd40, fragmento de union a antigeno y uso medico del mismo.
AU2022303363A1 (en) 2021-06-29 2024-01-18 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Immune cells engineered to promote thanotransmission and uses thereof
AU2022312698A1 (en) 2021-07-13 2024-01-25 BioNTech SE Multispecific binding agents against cd40 and cd137 in combination therapy for cancer
US20230203176A1 (en) * 2021-09-17 2023-06-29 Novartis Ag Methods For Prevention Of Graft Rejection In Xenotransplantation
CA3232917A1 (en) * 2021-10-01 2023-04-06 Mab Discovery Gmbh Agonistic cd40 antibodies as immune stimulatory agents
EP4413377A1 (en) 2021-10-05 2024-08-14 Amgen Inc. Fc-gamma receptor ii binding and glycan content
US12234294B2 (en) 2021-11-05 2025-02-25 Kiniksa Pharmaceuticals, Gmbh Pharmaceutical composition of a humanized anti-CD40 antibody
KR20240103030A (ko) 2021-11-17 2024-07-03 인스티튜트 내셔날 드 라 싼테 에 드 라 리셰르셰 메디칼르 범용 사르베코바이러스 백신
JP2025504908A (ja) 2022-01-28 2025-02-19 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド サイトカイン関連腫瘍浸潤リンパ球組成物及び方法
WO2023172890A2 (en) * 2022-03-07 2023-09-14 Agenus Inc. Anti-ilt2 antibodies and uses thereof
WO2023193239A1 (en) 2022-04-08 2023-10-12 Peter Peizhi Luo Anti-cd28 antibodies and methods of use thereof
WO2023198851A1 (en) 2022-04-14 2023-10-19 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for controlling the tumor cell killing by light
WO2023215725A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
EP4534559A4 (en) 2022-05-31 2025-11-05 Futuregen Biopharmaceutical Beijing Co Ltd Anti-CD40 antibodies, bispecific anti-PD-L1×CD40 antibodies, and their use
EP4583999A1 (en) 2022-09-09 2025-07-16 Bristol-Myers Squibb Company Methods of separating chelator
JP2025530110A (ja) * 2022-09-20 2025-09-11 カーラス・バイオロジクス・ピーティーワイ・リミテッド 二重特異性ポリペプチド及びその使用
EP4598576A1 (en) * 2022-10-04 2025-08-13 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Anti-cd40 antibodies and uses thereof
US20240174732A1 (en) 2022-10-05 2024-05-30 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Nucleic acid molecules encoding trif and additional polypeptides and their use in treating cancer
CN119948059A (zh) 2022-10-05 2025-05-06 法国国家健康医学研究院 靶向dc的抗尼帕病毒感染疫苗
WO2024118836A1 (en) 2022-11-30 2024-06-06 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes with shortened rep step
AU2023401158A1 (en) 2022-12-01 2025-05-29 BioNTech SE Multispecific antibody against cd40 and cd137 in combination therapy with anti-pd1 ab and chemotherapy
CN115969997B (zh) * 2022-12-19 2024-02-13 华润生物医药有限公司 一种靶向cldn18.2的抗体药物偶联物及其应用
CN116375870B (zh) * 2022-12-30 2023-09-15 优睿赛思(武汉)生物科技有限公司 抗人cd40蛋白的人源化抗体、制备方法及其应用
US20240269251A1 (en) 2023-01-09 2024-08-15 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Genetic switches and their use in treating cancer
WO2024213635A1 (en) * 2023-04-12 2024-10-17 Evotec International Gmbh Interferon-associated antigen binding proteins for use for the treatment or prevention of hepatitis delta virus infection
AU2024256160A1 (en) 2023-04-20 2025-10-02 Amgen Inc. Methods of determining relative unpaired glycan content
WO2025038600A1 (en) 2023-08-14 2025-02-20 Amgen Inc. Methods for reducing yellow color
WO2025250159A2 (en) * 2023-08-24 2025-12-04 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York N-linked glycan removal mutant antibodies and their use against influenza viruses
WO2025101820A1 (en) 2023-11-08 2025-05-15 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
CN120424223A (zh) * 2024-02-04 2025-08-05 苏州泽璟生物制药股份有限公司 包含lrrc15抗原结合结构域的多特异性抗体
WO2025245964A1 (zh) * 2024-05-28 2025-12-04 中生康元生物科技(北京)有限公司 一种树突状细胞制剂及其制备方法

Family Cites Families (140)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US142358A (en) * 1873-09-02 Improvement in the purification of illuminating-gas
US59427A (en) * 1866-11-06 Improvement in fences
US439216A (en) * 1890-10-28 Maker
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
CA1319120C (en) 1985-04-01 1993-06-15 John Henry Kenten Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
US4735210A (en) 1985-07-05 1988-04-05 Immunomedics, Inc. Lymphographic and organ imaging method and kit
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
US5750172A (en) 1987-06-23 1998-05-12 Pharming B.V. Transgenic non human mammal milk
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
GB8827305D0 (en) 1988-11-23 1988-12-29 British Bio Technology Compounds
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
US6713610B1 (en) * 1990-01-12 2004-03-30 Raju Kucherlapati Human antibodies derived from immunized xenomice
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
ATE139258T1 (de) 1990-01-12 1996-06-15 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
US5151510A (en) 1990-04-20 1992-09-29 Applied Biosystems, Inc. Method of synethesizing sulfurized oligonucleotide analogs
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
DK0585287T3 (da) 1990-07-10 2000-04-17 Cambridge Antibody Tech Fremgangsmåde til fremstilling af specifikke bindingsparelementer
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
AU664976B2 (en) 1990-08-29 1995-12-14 Gene Pharming Europe Bv Homologous recombination in mammalian cells
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
AU8507191A (en) 1990-08-29 1992-03-30 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
CA2095633C (en) 1990-12-03 2003-02-04 Lisa J. Garrard Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
ES2287206T3 (es) 1991-03-01 2007-12-16 Dyax Corporation Proceso para el desarrollo de mini-proteinas de union.
US5416367A (en) * 1991-03-06 1995-05-16 Quicklogic Corporation Programmable application specific integrated circuit and logic cell therefor
WO1992018619A1 (en) 1991-04-10 1992-10-29 The Scripps Research Institute Heterodimeric receptor libraries using phagemids
EP0940468A1 (en) 1991-06-14 1999-09-08 Genentech, Inc. Humanized antibody variable domain
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
AU2515992A (en) 1991-08-20 1993-03-16 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
EP0605522B1 (en) 1991-09-23 1999-06-23 Medical Research Council Methods for the production of humanized antibodies
FI941572A7 (fi) 1991-10-07 1994-05-27 Oncologix Inc Anti-erbB-2-monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmä ja käyttömenete lmä
JPH05242071A (ja) * 1991-11-20 1993-09-21 Mitsubishi Electric Corp 対象システムを制御または決定・推定する方法、およびその装置
DE69334255D1 (de) 1992-02-06 2009-02-12 Novartis Vaccines & Diagnostic Marker für Krebs und biosynthetisches Bindeprotein dafür
US5397703A (en) 1992-07-09 1995-03-14 Cetus Oncology Corporation Method for generation of antibodies to cell surface molecules
US5874082A (en) 1992-07-09 1999-02-23 Chiron Corporation Humanized anti-CD40 monoclonal antibodies and fragments capable of blocking B cell proliferation
NZ255101A (en) 1992-07-24 1997-08-22 Cell Genesys Inc A yeast artificial chromosome (yac) vector containing an hprt minigene expressible in murine stem cells and genetically modified rodent therefor
US6177401B1 (en) 1992-11-13 2001-01-23 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften Use of organic compounds for the inhibition of Flk-1 mediated vasculogenesis and angiogenesis
US5455258A (en) 1993-01-06 1995-10-03 Ciba-Geigy Corporation Arylsulfonamido-substituted hydroxamic acids
DK0804070T3 (da) 1993-03-09 2000-08-07 Genzyme Corp Fremgangsmåde til isolering af proteiner fra mælk
EP0724456B1 (en) 1993-10-01 2003-12-10 Immunex Corporation Antibodies to cd40
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
AU680102B2 (en) * 1993-12-23 1997-07-17 Immunex Corporation Method of preventing or treating disease characterized by neoplastic cells expressing CD40
US5612126A (en) * 1994-01-19 1997-03-18 Burlington Industries, Inc. Stiff fabric and method of forming the stiff fabric
IL112248A0 (en) 1994-01-25 1995-03-30 Warner Lambert Co Tricyclic heteroaromatic compounds and pharmaceutical compositions containing them
JPH0812700A (ja) 1994-07-01 1996-01-16 Sumitomo Electric Ind Ltd マウスｃｄ４０に対するモノクローナル抗体
US5643763A (en) 1994-11-04 1997-07-01 Genpharm International, Inc. Method for making recombinant yeast artificial chromosomes by minimizing diploid doubling during mating
GB9425060D0 (en) * 1994-12-13 1995-02-08 Univ Birmingham Carcinoma treatment
US6046037A (en) 1994-12-30 2000-04-04 Hiatt; Andrew C. Method for producing immunoglobulins containing protection proteins in plants and their use
US5863949A (en) 1995-03-08 1999-01-26 Pfizer Inc Arylsulfonylamino hydroxamic acid derivatives
US6130364A (en) 1995-03-29 2000-10-10 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US6091001A (en) 1995-03-29 2000-07-18 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
RU2164166C2 (ru) * 1995-04-11 2001-03-20 Роберт Бош Гмбх Способ и устройство для снижения содержания вредных веществ, в частности окислов азота, в газообразных продуктах сгорания
PT821671E (pt) 1995-04-20 2001-04-30 Pfizer Derivados do acido arilsulfonil hidroxamico como inibidores de mmp e tnf
AU705616B2 (en) 1995-04-21 1999-05-27 Cell Genesys, Inc. Generation of large genomic DNA deletions
EP0822830B1 (en) 1995-04-27 2008-04-02 Amgen Fremont Inc. Human anti-IL-8 antibodies, derived from immunized xenomice
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
US5747498A (en) 1996-05-28 1998-05-05 Pfizer Inc. Alkynyl and azido-substituted 4-anilinoquinazolines
US5880141A (en) 1995-06-07 1999-03-09 Sugen, Inc. Benzylidene-Z-indoline compounds for the treatment of disease
US5780215A (en) * 1995-07-26 1998-07-14 Konica Corporation Silver halide color photographic light-sensitive material
GB9520822D0 (en) 1995-10-11 1995-12-13 Wellcome Found Therapeutically active compounds
US6440418B1 (en) 1995-11-07 2002-08-27 Idec Pharmaceuticals Corporation Methods of treating autoimmune diseases with gp39-specific antibodies
GB9624482D0 (en) 1995-12-18 1997-01-15 Zeneca Phaema S A Chemical compounds
ATE225343T1 (de) 1995-12-20 2002-10-15 Hoffmann La Roche Matrix-metalloprotease inhibitoren
DE69709319T2 (de) 1996-03-05 2002-08-14 Astrazeneca Ab, Soedertaelje 4-anilinochinazolin derivate
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
US5994619A (en) 1996-04-01 1999-11-30 University Of Massachusetts, A Public Institution Of Higher Education Of The Commonwealth Of Massachusetts, As Represented By Its Amherst Campus Production of chimeric bovine or porcine animals using cultured inner cell mass cells
EP0818442A3 (en) 1996-07-12 1998-12-30 Pfizer Inc. Cyclic sulphone derivatives as inhibitors of metalloproteinases and of the production of tumour necrosis factor
EP0912559B1 (en) 1996-07-13 2002-11-06 Glaxo Group Limited Fused heterocyclic compounds as protein tyrosine kinase inhibitors
HRP970371A2 (en) 1996-07-13 1998-08-31 Kathryn Jane Smith Heterocyclic compounds
WO1998002437A1 (en) 1996-07-13 1998-01-22 Glaxo Group Limited Bicyclic heteroaromatic compounds as protein tyrosine kinase inhibitors
EP0923585B1 (en) 1996-07-18 2002-05-08 Pfizer Inc. Phosphinate based inhibitors of matrix metalloproteases
IL128189A0 (en) 1996-08-23 1999-11-30 Pfizer Arylsulfonylamino hydroxamic acid derivatives
US5817690A (en) * 1996-08-27 1998-10-06 American Home Products Corporation 4-aminoethoxy indolone derivatives
ID18494A (id) 1996-10-02 1998-04-16 Novartis Ag Turunan pirazola leburan dan proses pembuatannya
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
EP1500329B1 (en) 1996-12-03 2012-03-21 Amgen Fremont Inc. Human antibodies that specifically bind human TNF alpha
EP0950059B1 (en) 1997-01-06 2004-08-04 Pfizer Inc. Cyclic sulfone derivatives
ATE248812T1 (de) 1997-02-03 2003-09-15 Pfizer Prod Inc Arylsulfonylhydroxamsäurederivate
CA2279863A1 (en) 1997-02-07 1998-08-13 Pfizer Inc. N-hydroxy-beta-sulfonyl-propionamide derivatives and their use as inhibitors of matrix metalloproteinases
TR199901926T2 (xx) 1997-02-11 1999-12-21 Pfizer Inc. Arils�lfonil hidroksamik asit t�revleri
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
ATE292623T1 (de) 1997-05-07 2005-04-15 Sugen Inc 2-indolinonderivate als modulatoren der proteinkinase-ativität
ATE319745T1 (de) 1997-05-21 2006-03-15 Biovation Ltd Verfahren zur herstellung von nicht-immunogenen proteinen
CA2291709A1 (en) 1997-05-30 1998-12-03 Merck & Co., Inc. Novel angiogenesis inhibitors
PT1003720E (pt) 1997-08-08 2004-07-30 Pfizer Prod Inc Derivados de acido ariloxiarilsulfonilamino hidroxamico
WO1999010349A1 (en) 1997-08-22 1999-03-04 Zeneca Limited Oxindolylquinazoline derivatives as angiogenesis inhibitors
AU744939B2 (en) 1997-09-26 2002-03-07 Merck & Co., Inc. Novel angiogenesis inhibitors
ID23978A (id) 1997-11-11 2000-06-14 Pfizer Prod Inc Turunan-turunan tienopirimidin dan tienopiridin yang berguna sebagai zat-zat anti kangker
GB9725782D0 (en) 1997-12-05 1998-02-04 Pfizer Ltd Therapeutic agents
GB9800569D0 (en) 1998-01-12 1998-03-11 Glaxo Group Ltd Heterocyclic compounds
GB9800575D0 (en) 1998-01-12 1998-03-11 Glaxo Group Ltd Heterocyclic compounds
GB9801690D0 (en) 1998-01-27 1998-03-25 Pfizer Ltd Therapeutic agents
US6051228A (en) 1998-02-19 2000-04-18 Bristol-Myers Squibb Co. Antibodies against human CD40
WO1999045031A2 (en) 1998-03-03 1999-09-10 Abgenix, Inc. Cd147 binding molecules as therapeutics
JP4462654B2 (ja) 1998-03-26 2010-05-12 ソニー株式会社 映像素材選択装置及び映像素材選択方法
PA8469401A1 (es) 1998-04-10 2000-05-24 Pfizer Prod Inc Derivados biciclicos del acido hidroxamico
PA8469501A1 (es) 1998-04-10 2000-09-29 Pfizer Prod Inc Hidroxamidas del acido (4-arilsulfonilamino)-tetrahidropiran-4-carboxilico
US20020029391A1 (en) 1998-04-15 2002-03-07 Claude Geoffrey Davis Epitope-driven human antibody production and gene expression profiling
WO1999061057A2 (en) * 1998-05-23 1999-12-02 Tanox, Inc. Molecules targeting cd40 and tumor cells
CO5031249A1 (es) 1998-05-29 2001-04-27 Sugen Inc Pirrol substituido-2-indolinonas inhibidoras de proteinci-nasas
UA60365C2 (uk) 1998-06-04 2003-10-15 Пфайзер Продактс Інк. Похідні ізотіазолу, спосіб їх одержання, фармацевтична композиція та спосіб лікування гіперпроліферативного захворювання у ссавця
US20020142374A1 (en) 1998-08-17 2002-10-03 Michael Gallo Generation of modified molecules with increased serum half-lives
PT1004578E (pt) 1998-11-05 2004-06-30 Pfizer Prod Inc Derivados hidroxamida do acido 5-oxo-pirrolidino-2-carboxilico
AU776910B2 (en) 1998-12-08 2004-09-23 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschrankter Haftung Modifying protein immunogenicity
SI2112166T1 (sl) 1998-12-23 2019-05-31 Pfizer Inc. Človeška monoklonska protitelesa proti CTLA-4
WO2000066155A1 (en) * 1999-04-30 2000-11-09 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Methods for preventing reactivation of latent virus and controlling virus replication
US20030118588A1 (en) * 1999-05-22 2003-06-26 Linda Diehl Induction of anti-tumor CTL immunity through in vivo triggering of 4-1BB and/or CD40
US6946129B1 (en) * 1999-06-08 2005-09-20 Seattle Genetics, Inc. Recombinant anti-CD40 antibody and uses thereof
US6482411B1 (en) * 1999-08-27 2002-11-19 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods of reducing bone loss with CD40 ligand
US6517529B1 (en) 1999-11-24 2003-02-11 Radius International Limited Partnership Hemodialysis catheter
GB9927757D0 (en) * 1999-11-25 2000-01-26 Kennedy Rheumatology Inst Treatment of autoimmune diseases
WO2001056603A1 (en) 2000-02-01 2001-08-09 Tanox, Inc. Cd40-binding apc-activating molecules
AU2001259215A1 (en) * 2000-04-28 2001-11-12 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Human anti-cd40 antibodies and methods of making and using same
US7063845B2 (en) 2000-04-28 2006-06-20 Gemini Science, Inc. Human anti-CD40 antibodies
US20030059427A1 (en) * 2000-04-28 2003-03-27 Force Walker R. Isolation and characterization of highly active anti-CD40 antibody
UY27087A1 (es) 2001-01-05 2002-06-20 Pfizer Anticuerpos contra el receptor del factor de crecimiento similar a insulina
AR039067A1 (es) * 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
EP1709080B1 (en) 2004-01-09 2011-03-09 Pfizer Inc. ANTIBODIES TO MAdCAM
US9881309B2 (en) 2012-03-13 2018-01-30 American Express Travel Related Services Company, Inc. Systems and methods for tailoring marketing
US10884952B2 (en) 2016-09-30 2021-01-05 Intel Corporation Enforcing memory operand types using protection keys

Also Published As

Publication number Publication date
HRP20040525B1 (hr) 2017-06-02
EP1476185A4 (en) 2007-04-04
PT1476185E (pt) 2013-11-05
NZ533180A (en) 2008-03-28
IS2940B (is) 2016-03-15
ECSP045093A (es) 2004-07-23
GT200200228A (es) 2008-09-26
US20070190051A1 (en) 2007-08-16
MA27139A1 (fr) 2005-01-03
HRP20040525A2 (en) 2005-04-30
CU23745A3 (es) 2012-01-31
NI200200128A (es) 2010-01-11
MXPA04004467A (es) 2005-05-16
US7626012B2 (en) 2009-12-01
AU2002356926C1 (en) 2003-05-19
AP2004003034A0 (en) 2004-06-30
IS7253A (is) 2004-05-06
EP1476185B1 (en) 2013-07-31
HU229829B1 (en) 2014-09-29
PL392809A1 (pl) 2011-03-14
US20090169563A1 (en) 2009-07-02
BR0214137A (pt) 2004-09-14
TNSN04078A1 (fr) 2006-06-01
EP2343086A2 (en) 2011-07-13
JP2005508176A (ja) 2005-03-31
EA200400654A1 (ru) 2004-12-30
CA2466128A1 (en) 2003-05-15
TW201034686A (en) 2010-10-01
BRPI0214137B1 (pt) 2019-03-19
US7288251B2 (en) 2007-10-30
KR100830086B1 (ko) 2008-05-20
AR039067A1 (es) 2005-02-09
WO2003040170A3 (en) 2003-10-09
US20120225014A1 (en) 2012-09-06
US20060093600A1 (en) 2006-05-04
BRPI0214137B8 (pt) 2021-05-25
PL214289B1 (pl) 2013-07-31
OA12725A (en) 2006-06-28
WO2003040170A2 (en) 2003-05-15
CR10878A (es) 2011-01-12
DOP2002000507A (es) 2003-05-15
PE20030846A1 (es) 2003-10-11
DK1476185T3 (da) 2013-10-14
ZA200404207B (en) 2005-08-31
PL370514A1 (en) 2005-05-30
MY137641A (en) 2009-02-27
ES2432968T3 (es) 2013-12-05
HUP0402247A3 (en) 2012-09-28
GEP20074222B (en) 2007-10-25
US20030211100A1 (en) 2003-11-13
US20130024956A1 (en) 2013-01-24
AP1918A (en) 2008-11-13
JP5547532B2 (ja) 2014-07-16
TW200306204A (en) 2003-11-16
US8388971B2 (en) 2013-03-05
CN1582165B (zh) 2013-05-29
US20100098694A1 (en) 2010-04-22
CN1582165A (zh) 2005-02-16
KR20050063749A (ko) 2005-06-28
US7563442B2 (en) 2009-07-21
US7618633B2 (en) 2009-11-17
HUP0402247A2 (hu) 2005-01-28
RS52484B (sr) 2013-02-28
CN103450360B (zh) 2016-11-02
US7338660B2 (en) 2008-03-04
AU2002356926A2 (en) 2003-05-19
EP2343086A3 (en) 2012-02-22
HN2002000318A (es) 2003-03-10
RS39204A (sr) 2006-12-15
JP2010213704A (ja) 2010-09-30
JP2013099333A (ja) 2013-05-23
TWI331040B (en) 2010-10-01
US20160152713A1 (en) 2016-06-02
PA8557701A1 (es) 2003-12-19
JP5848232B2 (ja) 2016-01-27
HK1069122A1 (en) 2005-05-13
US20090130715A1 (en) 2009-05-21
CY1115675T1 (el) 2017-01-25
CL2009001779A1 (es) 2010-02-05
TWI338579B (en) 2011-03-11
PL214634B1 (pl) 2013-08-30
CN103450360A (zh) 2013-12-18
UY27537A1 (es) 2003-02-28
EA011449B1 (ru) 2009-02-27
IL161823A0 (en) 2005-11-20
CA2466128C (en) 2013-10-29
WO2003040170A9 (en) 2004-06-10
IL161823A (en) 2014-02-27
SI1476185T1 (sl) 2013-12-31
AU2002356926B2 (en) 2007-01-04
NO334339B1 (no) 2014-02-10
JP4616555B2 (ja) 2011-01-19
EG25801A (en) 2012-08-08
CR7343A (es) 2004-10-28
EP1476185A2 (en) 2004-11-17
NO20042388L (no) 2004-08-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2002356926B2 (en) Antibodies to CD40
AU2002356926A1 (en) Antibodies to CD40
HK1069122B (en) Antibodies to cd40
HK1192569A (en) Antibodies to cd40
HK1192569B (en) Antibodies to cd40