BRPI0214137B1 - Anticorpo monoclonal humano ou porção de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente ao cd40 humano e o ativa, linhagem celular de hibridoma isolado, composição farmacêutica compreendendo os mesmos, uso dos mesmos na fabricação de um medicamento e método de fabricação dos referidos anticorpos ou porção de ligação a antígeno do mesmo - Google Patents

Anticorpo monoclonal humano ou porção de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente ao cd40 humano e o ativa, linhagem celular de hibridoma isolado, composição farmacêutica compreendendo os mesmos, uso dos mesmos na fabricação de um medicamento e método de fabricação dos referidos anticorpos ou porção de ligação a antígeno do mesmo Download PDF

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Abstract

"anticorpos para o cd40, composição farmacêutica compreendendo os mesmos, uso dos mesmos na fabricação de um medicamento, linhagem de célula isolada, molécula de ácido nucléico isolada, vetor compreendendo a mesma, célula hospedeira e método de fabricação dos referidos anticorpos". a presente invenção refere-se a anticorpos e porções de ligação a antígeno dos mesmos que se ligam especificamente ao cd40, de preferência cd40 humano e que funcionam como agonistas do cd40. a invenção também refere-se a anticorpos anti-cd40 humanos e porções de ligação a antígeno dos mesmos. a invenção também refere-se a anticorpos que são quiméricos, biespecíficos, derivatizados, anticorpos com cadeia simples ou porções de proteínas de fusão. a invenção também refere-se a imunoglobulinas de cadeia pesada e leve isoladas derivadas de anticorpos anti-cd40 humanos e moléculas de ácido nucléico que codificam tais imunoglobulinas. a presente invenção também refere-se a métodos de fabricação de anticorpos anti-cd40 humanos, composições compreendendo esses anticorpos e métodos de uso dos anticorpos e composições para diagnóstico e tratamento. a invenção também proporciona métodos de terapia genética usando moléculas de ácido nucléico que codificam as moléculas de imunoglobulina de cadeia pesada e/ou leve que compreendem os anticorpos anti-cd40 humanos. a invenção também refere-se a animais transgênicos compreendendo as moléculas de ácido nucléico da presente invenção.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para ANTICORPO MONOCLONAL HUMANO OU PORÇÃO DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO DO MESMO QUE SE LIGA ESPECIFICAMENTE AO CD40 HUMANO Ε O ATIVA, LINHAGEM CELULAR DE HIBRIDOMA ISOLADO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA COMPREENDENDO OS MESMOS, USO DOS MESMOS NA FABRICAÇÃO DE UM MEDICAMENTO E MÉTODO DE FABRICAÇÃO DOS REFERIDOS ANTICORPOS OU PORÇÃO DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO DO MESMO.
[001] O presente pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório dos Estados Unidos 60/348.980, depositado em 9 de Novembro de 2001.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [002] O antígeno CD40 é uma glicoproteína da superfície celular de 50 kDa a qual pertence a família do Receptor de Fator de Necrose de Tumor (TNF-R). (Stamenkovic e outros, EMBO J. 8: 1403-10 (1989). O CD40 é expresso em muitos tipos de células normais e tumorígenas, incluindo linfócitos B, células dendríticas, monócitos, macrófagos, epitélio tímico, células endoteliais, fibroblastos e células do músculo liso. (Paulie S. e outros, Câncer Immunol. Immunother. 20: 23-8 (1985); Banchereau J. e outros, Adv. Exp. Med. & Biol. 378: 7983 (1995); Alderson, M.R. e outros, J. of Exp. Med. 178: 669-74 (1993); Ruggiero G. e outros, J. of Immunol. 156: 3737-46 (1996); Hollenbaugh, D. e outros, J. of Exp. Med. 182: 33-40 (1995); Yellin M.J. e outros, J. of Leukocyte Biol. 58: 209-16 (1995); e Lazaar A.L. e outros,
J. of Immunol. 161: 3120-7 (1998)). O CD40 é expressão em linfomas B e em 70% de todos os tumores sólidos. Embora constitutivamente expresso, o CD40 é super-regulado em células que apresentam antígeno por sinais de maturação, tais como LPS, IL-1 β, IFN-γ e GM-CSF.
[003] A ativação do CD40 exerce um papel crítico na regulação
Petição 870190007041, de 23/01/2019, pág. 9/192
2/176 das respostas imunes celulares e humorais. A apresentação de antígeno sem ativação do CD40 pode levar à tolerância, ao passo que a sinalização ao CD40 reverte tal tolerância, intensifica a apresentação por todas as células que apresentam antígenos (APCs), leva à secreção de citocinas e quimiocinas auxiliares, aumenta a expressão e sinalização de moléculas co-estimulatórias e estimula a atividade citolítica de células imunes.
[004] O CD40 exerce um papel crítico na proliferação, maturação e comutação de classe das células B. (Foy, T.M. e outros, Ann. Rev. of Immunol. 14: 591-617 (1996)). A ruptura da via de sinalização ao CD40 leva à distribuição anormal do isótipo de imunoglobulina no soro, à carência de iniciação de células T CD4+ e a defeitos nas respostas humorais secundárias. Por exemplo, a síndrome de hiper-lgM X-ligada é uma doença associada a uma mutação no gene do CD40L humano e é caracterizada pela incapacidade dos indivíduos afetados de produzir outros anticorpos que não aqueles do isótipo IgM, indicando que a interação produtiva entre o CD40 e o CD40L é requerida para uma resposta imune eficaz.
[005] O acoplamento do CD40 pelo CD40L leva à associação do domínio citoplásmico do CD40 com os TRAFs (fatores TNF-R associados). (Lee, H.H. e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96: 1421-6 (1999); Pullen, S.S. e outros, Biochemistry 37: 11836-45 (1998); Grammar, A.C. e outros, J. of Immunol. 161: 1183-93 (1998); Ishida, T.K. e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93: 9437-42 (1996); Pullen, S.S. e outros, J. of Biol. Chem. 274: 14246-54 (1999)). A interação com os TRAFs pode culminar na ativação das vias NFkB e Jun/AP1. (Tsukamoto, N. e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96: 1234-9 (1999); Sutherland, C.L. e outros, J. of Immunol. 162: 4720-30 (1999)). Dependendo do tipo de células, essa sinalização leva à secreção intensificada de citocinas, tais como IL-6 (Jeppson, J.D. e outros, J. of ImmuPetíção 870190007041, de 23/01/2019, pág. 10/192
3/176 nol. 161: 1738-42 (1998); Uejima, Υ. e outros, Int. Arch. Of Allergy & Immunol. 110: 225-32 (1996), IL-8 (Gruss, H.J. e outros, Blood 84: 2305-14 (1994); von Leoprechting, A. e outros, Câncer Res. 59: 128794 (1999); Denfeld, R.W. e outros, Europ. J. of Immunol. 26: 2329-34 (1996)), IL-12 (Cella, M. e outros, J. of Exp. Med. 184: 747-52 (1996); Ferlin, W.G. e outros, Europ. J. of Immunol. 28: 525-31 (1998); Armant, M. e outros, Europ. J. of Immunol. 26: 1430-4 (1996); Koch, F. e outros, J. of Exp. Med. 184: 741-6 (1996); Seguin, R. e L.H. Kasper, J. of Infect. Diseases 179: 467-74 (1999); Chaussabel, D. e outros, Infection & Immunity 67: 1929-34 (1999)), IL-15 (Kuniyoshi, J.S. e outros, Cellular Immunol. 193: 48-58 (1999)) e quimiocinas (MIP1 α, MIP1 β, RANTES e outras) (McDyer, J.F. e outros, J. of Immunol. 162: 3711-7 (1999); Schaniel, C. e outros, J. of Exp. Med. 188: 451-63 (1998); Altenburg, A. e outros, J. of. Immunol. 162: 4140-7 (1999); Deckers, J.G. e outros, J. ofthe Am. Society of Nephrology 9: 1187-93 (1998)), expressão aumentada de moléculas da classe I e II do MHC (SantosArgumedo, L. e outros, Cellular Immunol. 156: 272-85 (1994)) e expressão aumentada de moléculas de adesão (por exemplo, ICAM) (Lee, H.H. e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96: 1421-6 (1999); Grousson, J. e outros, Archives of Dermatol. Res. 290: 325-30 (1998); Katada, Y. e outros, Europ. J. of Immunol. 26: 192-200 (1996); Mayumi. M. e outros, J. of Allergy & Clin. Immunol. 96: 1136-44 (1995); Flores-Romo, L. e outros, Immunol. 79: 445-51 (1993)) e moléculas coestimulatórias (por exemplo, B7) (Roy, M. e outros, Europ. J. of Immunol. 25: 596-603 (1995); Jones, K.W. e C.J. Hackett, Cellular Imunol. 174: 42-53 (1996); Caux, C. e outros, Journal of Exp. Med. 180: 126372 (1994); Kiener, P.A. e outros, J. of Immunol. 155: 4917-25 (1995)). As citocinas induzidas pelo acoplamento ao CD40 intensificam a sobrevivência e ativação de células T.
[006] Além da intensificação da função celular e imune, os efeitos
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4/176 da ativação do CD40 incluem: recrutamento celular e diferenciação pelas quimiocinas e citocinas; ativação de monócitos; atividade citolítica aumentada do linfócito T citolítico (CTL) e células assassinas naturais (NK); indução de apoptose em tumores CD40 positivos; intensificação da imunogenicidade de tumores CD40 positivos; e produção de anticorpos tumores-específicos. O papel da ativação do CD40 em respostas imunes células-mediadas também é bem-estabelecido e é revisto em: Grewal e outros, Ann. Rev. of Immunol. 16: 111-35 (1998); Mackey e outros, J. of Leukocyte Biol. 63: 418-28 (1998); e Noelle, R.J., Agents&Actions- Supl. 49: 17-22 (1998).
[007] Estudos usando um sistema de modelo com iniciaçãoconcorrente mostrou que a ativação das APCs pelo CD40 pode substituir a exigência de células T auxiliares para a geração de linfócito T citolítico (CTL). (Bennett e outros, Nature 393: 478-480 (1998)). Evidência a partir de camundongos deficientes em CD40L indica uma exigência clara para sinalização ao CD40 em iniciação de células T auxiliares. (Grewal, I.S. e outros, Science 273: 1864-7 (1996); Grewal,
I. S. e outros, Nature 378: 617-20 (1995)). A ativação do CD40 converte células B trazendo antígeno de outro modo tolerogênicas em APCs competentes. (Buhlmann, J.E. e outros, Immunity2\ 645-53 (1995)). A ativação do CD40 induz à maturação e diferenciação de progenitores no sangue umbilical em células dendríticas. (Flores-Romo, L. e outros,
J. of Exp. Med. 185: 341-9 (1997); Mackey, M.F. e outros, J. of Immunol. 161: 2094-8 (1998)). A ativação do CD40 também induz à diferenciação de monócitos em células dendríticas funcionais. (Brossart, P. e outros, Blood 92: 4238-47 (1998)). Ainda, a ativação do CD40 intensifica a atividade citolítica de células NK através de citocinas APC-CD40 induzidas. (Carbone, E. e outros, J. of Exp. Med. 185: 2053-60 (1997); Martin-Fontecha, A. e outros, J. of Immunol. 162: 5910-6 (1999)). Essas observações indicam que o CD40 exerce um papel essencial no
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5/176 início e intensificação das respostas imunes através de indução da maturação de APCs, secreção de citocinas auxiliares, super-regulação de moléculas co-estimulatórias e intensificação de funções efetuadoras.
[008] O papel crítico da sinalização ao CD40 no início e maturação de respostas imunes humorais e citotóxicas torna esse sistema um alvo ideal para intensificação imune. Tal intensificação pode ser particularmente importante para estruturação de respostas imunes eficazes aos antígenos tumorígenos, os quais são geralmente apresentados ao sistema imune através de iniciação-concorrente de APCs ativadas. (Huang, A.Y. e outros, Ciba Foundation Symp. 187: 229-44 (1994); Toes, R.E.M. e outros, Seminars in Immunol. 10: 443-8 (1998); Albert, M.L. e outros, Nature 392: 86-9 (1998); Bennett, S.R. e outros, J. ofExp. Med. 186: 65-70 (1997)).
[009] Muitos grupos têm demonstrado a eficácia da ativação do CD40 para as respostas antitumor in vitro e in vivo. (Toes, R.E.M. e outros, Seminars in Immunol. 10: 443-8 (1998)). Dois grupos, usando um modelo metastático em pulmão de carcinoma de células renais e tumores subcutâneos através de células viralmente transformadas, demonstraram independentemente que a ativação do CD40 pode reverter a tolerância a antígenos tumores-específicos, resultante em iniciação antitumor eficaz de células T. (Sotomayor, E.M. e outros, Nature Medicine 5: 780-787 (1999); Diehl, L. e outros, Nature Medicine 5: 774-9 (1999)). A atividade antitumor na ausência de células imunes também foi reportada através de tratamento com anticorpo anti-CD40 e CD40L em um modelo com uma linhagem de câncer de mama humano em camundongos SCID. (Hirano, A. e outros, Blood 93: 29993007 (1999)). Foi mostrado recentemente que a ativação do CD40 pelo anticorpo anti-CD40 erradica o linfoma CD40- e CD40+ em modelos com camundongo. (French, R.R. e outros, Nature Medicine 5: 548-53
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6/176 (1999)). Além disso, estudos anteriores por Glennie e outros concluem que a atividade de sinalização pelos anticorpos anti-CD40 é mais eficaz para indução de eliminação de tumor in vivo do que outros anticorpos marcadores anti-superfície capazes de recrutamento de efetuadores. (Tutt, A.L. e outros, J. oflmmunol. 161: 3176-85 (1998)).
[0010] Consistente com essas observações, quando anticorpos anti-CD40 foram testados com relação à atividade contra células tumorígenas CD40+ in vivo, a maioria, mas nem toda, a atividade tumoricida estava associada à sinalização ao CD40, ao invés de ao ADCC. (Funakoshi, S. e outros, J. of Immunotherapy with Emphasis on Tumor Immunol. 19: 93-101 (1996)). Em outro estudo, células dendríticas da medula óssea foram tratadas ex vivo com uma variedade de agentes e testadas com relação à atividade antitumor in vivo. Esses estudos demonstraram que as DCs estimuladas pelo CD40L foram as células mais maduras e mais eficazes que estruturavam uma resposta antitumor.
[0011] O papel essencial do CD40 na imunidade antitumor também foi demonstrado através de comparação de respostas de camundongos do tipo nativa e CD40-/- a vacinas contra tumor. Esses estudos mostram que os camundongos CD40-/- foram incapazes de obter a imunidade ao tumor observada em camundongos normais. (Mackey, M.F. e outros, Câncer Research 57: 2569-74 (1997)). Em outro estudo, esplenócitos de camundongos trazendo tumor foram estimulados com células tumorígenas e tratados com anticorpos anti-CD40 de ativação ex vivo e foi mostrado que tinham atividade de CTL tumor específica intensificada. (Donepudi, M. e outros, Câncer Immunol. Immunother. 48: 153-164 (1999)). Esses estudos demonstram que o CD40 ocupa uma posição crítica na imunidade antitumor, em tumores CD40 negativos e positivos. Uma vez que o CD40 é expresso em linfomas, leucemias, mieloma múltiplo, uma maioria dos carcinomas na nasofaringe,
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7/176 bexiga, ovário e fígado e alguns cânceres de mama e cólonrretal, a ativação do CD40 pode ter uma ampla faixa de aplicações clínicas.
[0012] Anticorpos monoclonais de ativação anti-CD40 podem contribuir para a erradicação de tumor via muitos mecanismos importantes. O mais importante entre esses é a ativação de células dendríticas hospedeiras para processamento e apresentação intensificados de antígeno tumorígeno, bem como apresentação ou imunogenicidade intensificada de células tumorígenas CD40 positivas em si, levando à ativação de linfócitos CD4+ e CD8+ tumor específicos. Atividade antitumor específica pode ser mediada por outros efeitos de intensificação imune da sinalização ao CD40 (produção de quimiocinas e citocinas, recrutamento e ativação de monócitos e atividade citolítica intensificada de NK e CTL), bem como morte direta de tumores CD40+ através de indução de apoptose ou através de estimulação de uma resposta humoral levando a ADCC. Células tumorígenas apoptóticas e que estão morrendo também podem se tornar uma fonte importante de antígenos tumor-específicos que são processados e apresentados pelas APCs CD40 ativadas.
[0013] Conseqüentemente, existe uma necessidade crítica por anticorpos agonistas anti-CD40 terapêuticos, clinicamente relevantes.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0014] As Figuras 1A-1H são alinhagemmentos de seqüência de seqüências previstas de aminoácidos dos domínios variáveis das cadeias leve e pesada de um anticorpo monoclonal anti-CD40 com as seqüências de aminoácidos da linhagem germinativa dos genes das cadeias leve e pesada correspondentes. As diferenças entre as seqüências dos clones e da linhagem germinativa são indicadas por sombreados. As seqüências das linhagens germinativas da CDR1, CDR2 e CDR3 estão sublinhagemdas. Em alinhagemmentos das seqüências da cadeia pesada, inserções evidentes na região CDR3 es
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8/176 tão indicadas por um traçado (-) na seqüência da linhagem germinativa e deleções evidentes na região CDR3 são indicadas por um traçado (-) na seqüência do clone.
[0015] Figura 1 A: seqüências previstas de aminoácidos da região variável de cadeia leve kappa dos mAbs 3.1.1 e 7.1.2 com as seqüências de aminoácidos da linhagem germinativa do gene Vk=A3/A19 e J=Jk1.
[0016] Figura 1B: seqüência prevista de aminoácidos da região variável de cadeia leve kappa do clone 15.1.1 e a seqüência de aminoácidos da linhagem germinativa (Vk=A3/A19 e J=Jk2).
[0017] Figura 1C: seqüências previstas de aminoácidos da região variável de cadeia leve kappa dos mAbs 10.8.3. e 21.4.1 e a seqüência de aminoácidos da linhagem germinativa (Vk=L5 (DP5) e J=Jk4);
[0018] Figura 1D: seqüência prevista de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do mAb 3.1.1 e a seqüência de aminoácidos da linhagem germinativa (Vh=3-30+(DP-49), D=D4+DIR3 e J=Jh6); [0019] Figura 1E: seqüência prevista de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do mAb 7.1.2 e a seqüência de aminoácidos da linhagem germinativa (Vh=3-30+(DP-49), D=DIR5+D1-26 e J=Jh6);
[0020] Figura 1F: seqüências previstas de aminoácidos da cadeia pesada do mAb 10.8.3 e a seqüência de aminoácidos da linhagem germinativa (VH=4.35 (VIV-4), D=DIR3 e J=Jh6);
[0021] Figura 1G: seqüências previstas de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do mAb 15.1.1 e a seqüência de aminoácidos da linhagem germinativa (Vh=4-59(DP-71), D=D4-23 e J=Jh4); e [0022] Figura 1H: seqüências previstas de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do mAb 21.4.1 e a seqüência de aminoácidos da linhagem germinativa (Vh=1-02(DP-75), D=DLR1 e J=Jh4).
[0023] As Figuras 2A-2H são alinhagemmentos de seqüência das
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9/176 seqüências de aminoácidos previstas dos domínios variáveis de cadeias leve e pesada do anticorpo monoclonal anti-CD40 isolado com as seqüências de aminoácidos da linhagem germinativa dos genes das cadeias leve e pesada correspondentes. As diferenças entre as seqüências dos clones e da linhagem germinativa são indicadas em negrito. As seqüências das linhagens germinativas da CDR1, CDR2 e CDR3 estão sublinhagemdas. Em alinhagemmentos das seqüências da cadeia pesada, inserções evidentes na região CDR3 estão indicadas por um traçado (-) na seqüência da linhagem germinativa e deleções evidentes na região CDR3 são indicadas por um traçado (-) na seqüência do clone.
[0024] Figura 2A: seqüências previstas de aminoácidos da cadeia leve kappa dos mAbs 22.1.1, 23.5.1 e 23.29.1 e a seqüência de aminoácidos da linhagem germinativa (Vk=A3/A19 e J=Jk1);
[0025] Figura 2B: seqüência prevista de aminoácidos da cadeia leve kappa do mAb 21.2.1 e a seqüência de aminoácidos da linhagem germinativa (Vk=A3/A19 e J=Jk3);
[0026] Figura 2C: seqüências previstas de aminoácidos da cadeia leve kappa dos mAbs 23.28.1, 23.28.1 L-C92A e 24.2.1 e a seqüência de aminoácidos da linhagem germinativa (Vk=A27 e J=Jk3);
[0027] Figura 2D: seqüência prevista de aminoácidos da cadeia pesada do mAb 21.2.1 e a seqüência de aminoácidos da linhagem germinativa (Vh=3-30+, D=DIR3+D6-19 e J=Jh4);
[0028] Figura 2E: seqüência prevista de aminoácidos da cadeia pesada dos mAbs 22.1.1, 22.1.1H-C109A e a seqüência de aminoácidos da linhagem germinativa (Vh=3-30+, D=D1-1 e J=Jh6);
[0029] Figura 2F: seqüência prevista de aminoácidos da cadeia pesada do mAb 23.5.1 e a seqüência de aminoácidos da linhagem germinativa (Vh=3-30+, D=D4-17 e J=Jh6);
[0030] Figura 2G: seqüência prevista de aminoácidos da cadeia
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10/176 pesada dos mAb 23.29.1 e a seqüência de aminoácidos da linhagem germinativa (Vh=3-30.3, D=D4-17 e J=Jh6); e [0031] Figura 2H: seqüências previstas de aminoácidos da cadeia pesada do mab 23.28.1, 23.28. 1H-D16E e 24.2.1 e seqüência de aminoácido de linhagem germinativa (Vh=4-59, D=DIR1+D4-17 e J=Jh5).
[0032] A Figura 3 é uma curva de resposta-dose que ilustra a capacidade de um anticorpo anti-CD40 da invenção (21.4.1) de intensificar a produção de IL-12p40 por células dendríticas humanas.
[0033] A Figura 4 é uma curva de resposta-dose que ilustra a capacidade de um anticorpo anti-CD40 da invenção (21.4.1) de intensificar a produção de IL-12p70 por células dendríticas humanas.
[0034] A Figura 5 é um gráfico que ilustra a capacidade de um anticorpo anti-CD40 da invenção (21.4.1) de aumentar a imunogenicidade de células estimulatórias Jy e intensificar a atividade do CTL contra células Jy alvo.
[0035] A Figura 6 é uma curva de inibição do desenvolvimento de tumor que ilustra o desenvolvimento reduzido de tumores de Daudi CD40 positivos em camundongos beges SCID tratados com um anticorpo anti-CD40 da invenção (21.4.1).
[0036] A Figura 7 é uma curva de inibição do desenvolvimento de tumor que ilustra o desenvolvimento reduzido de tumores K562 CD40 negativos em camundongos beges SCID tratados com um anticorpo anti-CD40 da invenção (21.4.1) e células dendríticas e células T humanas.
[0037] A Figura 8 mostra a inibição do desenvolvimento de tumores K562 CD40 negativos em camundongos SCID por diferentes concentrações de mAb agonista anti-CD40 23.29.1.
[0038] A Figura 9 mostra a inibição do desenvolvimento de tumores K562 CD40 negativos em camundongos SCID por diferentes conPetíção 870190007041, de 23/01/2019, pág. 18/192
11/176 centrações de mAb agonista anti-CD40 3.1.1.
[0039] A Figura 10 mostra a inibição do desenvolvimento de tumores de Raji CD40 positivos na presença e ausência de células T e células dendríticas em camundongos SCID pelo mAb agonista antiCD40.
[0040] A Figura 11 mostra a inibição do desenvolvimento de tumores de Raji CD40 positivos em camundongos SCID por anticorpos agonistas anti-CD40.
[0041] A Figura 12 mostra a inibição do desenvolvimento de células do câncer de mama BT 474 em camundongos beges SCID por anticorpos agonistas anti-CD40.
[0042] A Figura 13 mostra a inibição do desenvolvimento de tumores de próstata PC-3 em camundongos beges SCID por anticorpos agonistas anti-CD40.
[0043] A Figura 14 é uma curva de sobrevivência para camundongos beges SCID injetados (iv) com células de tumor de Daudi e tratados com anticorpos agonistas anti-CD40.
[0044] A Figura 15 é uma análise por Western blot de anticorpos agonistas anti-CD40 ao CD40 humano reduzido (R) e não-reduzido (NR).
[0045] A Figura 16 é um alinhagemmento dos domínios D1-D4 do CD40 de camundongo e humano.
[0046] A Figura 17 é um alinhagemmento das seqüências de aminoácidos do CD40 de camundongo e humano, mostrando a localização dos locais de fusão das quimeras.
[0047] A Figura 18 é um grupo de diagramas esquemáticos dos constructos quiméricas de CD40.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0048] A presente invenção proporciona um anticorpo isolado ou porção de ligação a antígeno do mesmo que se liga ao CD40 e atua
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12/176 como um agonista do CD40.
[0049] A invenção proporciona uma composição compreendendo o anticorpo anti-CD40 ou porção de ligação a antígeno do mesmo, e um veículo farmaceuticamente aceitável. A composição pode ainda compreender outro componente, tal como um agente antitumor ou agente de formação de imagem. Métodos diagnósticos e terapêuticos também são proporcionados pela invenção.
[0050] A invenção proporciona uma linhagem de células isolada, tal como um hibridoma, que produz um anticorpo anti-CD40 ou porção de ligação a antígeno do mesmo.
[0051] A invenção também proporciona moléculas de ácido nucléico que codificam a cadeia leve e/ou pesada ou porções de ligação a antígeno das mesmas de um anticorpo anti-CD40.
[0052] A invenção proporciona vetores e células hospedeiras compreendendo as moléculas de ácido nucléico, bem como métodos de produção recombinante dos polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucléico.
[0053] Animais transgênicos não-humanos que expressam a cadeia leve e/ou pesada ou porções de ligação a antígeno das mesmas, de um anticorpo anti-CD40 também são proporcionados.
[0054] A presente invenção proporciona um método para o tratamento de um indivíduo que precise do mesmo com uma quantidade eficaz de uma molécula de ácido nucléico que codifica a cadeia leve e/ou pesada ou porções de ligação a antígeno das mesmas, de um anticorpo anti-CD40.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Definição e Técnicas Gerais [0055] A menos que de outro modo definido aqui, os termos científicos e técnicos usados junto com a presente invenção terão os significados que são comumente compreendidos por aqueles versados na
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13/176 técnica. Ainda, a menos que de outro modo requerido pelo contexto, termos no singular incluirão pluralidades e termos no plural incluirão o singular. Geralmente, as nomenclaturas usadas junto com e as técnicas de, célula de cultura e tecidual, biologia molecular, imunologia, microbiologia, genética e química e hibridização de proteínas e ácidos nucléicos descritas aqui são aquelas bem-conhecidas e comumente usadas na técnica.
[0056] Os métodos e técnicas da presente invenção são, geralmente, realizados de acordo com métodos convencionais bemconhecidos na técnica e conforme descrito em várias referências gerais e específicas que são citadas e discutidas no decorrer da presente relatório descritivo, a menos que de outro modo indicado. Veja, por exemplo, Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratorv Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) e Ausubel e outros, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992) e Hariow e Lane, Antibodies: A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990), os quais são incorporados aqui por referência. As reações enzimáticas e técnicas de purificação são realizadas de acordo com os relatórios descritivos do fabricante, conforme comumente aplicado na técnica ou conforme descrito aqui. As nomenclaturas usadas junto com e os procedimentos de laboratório e técnicas de química analítica, química orgânica sintética e química medicinal e farmacêutica descritos aqui são aquelas bem-conhecidas e comumente usadas na técnica. Técnicas padrão são usadas para síntese química, análises químicas, preparação de produtos farmacêuticos, formulação e distribuição e tratamento de pacientes.
[0057] Os termos a seguir, a menos que de outro modo indicado, devem ser compreendidos como tendo os seguintes significados: [0058] O termo polipeptídeo abrange proteínas nativas ou artifi
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14/176 ciais, fragmentos de proteínas e análogos de polipeptídeo de uma seqüência de proteína. Um polipeptídeo pode ser monomérico ou polimérico.
[0059] O termo proteína isolada, polipeptídeo isolado ou anticorpo isolado é uma proteína, polipeptídeo ou anticorpo que, em virtude de sua origem ou fonte de derivação (1) não está associado aos componentes naturalmente associados que acompanham o mesmo em seu estado nativo, (2) é isento de outras proteínas das mesmas espécies, (3) é expresso por uma célula de uma espécie diferente ou (4) não ocorre na natureza. Assim, um polipeptídeo que é quimicamente sintetizado ou sintetizado em um sistema celular diferente da célula a partir da qual ele se origina naturalmente será isolado de seus componentes naturalmente associados. Uma proteína também pode ser tornada substancialmente isenta de componentes naturalmente associados por meio de isolamento, usando-se técnicas de purificação de proteína bem-conhecidas na técnica.
[0060] Exemplos de anticorpos isolados incluem um anticorpo antiCD40 que tenha sido purificado por afinidade usando-se CD40, um anticorpo anti-CD40 que tenha sido sintetizado por meio de um hibridoma ou outra linhagem de célula in vitro e um anticorpo anti-CD40 humano derivado de um camundongo transgênico.
[0061] Uma proteína ou polipeptídeo é substancialmente puro, substancialmente homogêneo ou substancialmente purificado quando pelo menos cerca de 60 a 75% de uma amostra exibe uma única espécie de polipeptídeo. O polipeptídeo ou proteína pode ser monomérica ou multimérica. Um polipeptídeo ou proteína substancialmente pura compreenderá, tipicamente, cerca de 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% PESO/PESO de uma amostra de proteína, mais usualmente cerca de 95% e de preferência mais de 99% pura. A pureza ou homogeneidade da proteína pode ser indicada por uma série de meios
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15/176 bem-conhecidos na técnica, tais como eletroforese em gel de poliacrilamida de uma amostra de proteína, seguido por visualização de uma única banda de polipeptídeo quando de coloração do gel com um corante bem-conhecido na técnica. Para determinadas finalidades, uma resolução maior pode ser proporcionada através de uso de HPLC ou outros meios bem-conhecidos na técnica para purificação.
[0062] O termo fragmento de polipeptídeo, conforme usado aqui, refere-se a um polipeptídeo que tem uma deleção amino-terminal e/ou carbóxi-terminal, mas onde a seqüência de aminoácidos restante é idêntica às posições correspondentes na seqüência que ocorre naturalmente. Em algumas concretizações, os fragmentos são de pelo menos 5, 6, 8 ou 10 aminoácidos de comprimento. Em outras concretizações, os fragmentos são de pelo menos 14, pelo menos 20, pelo menos 50 ou pelo menos 70, 80, 90, 100, 150 ou 200 aminoácidos de comprimento.
[0063] O termo análogo de polipeptídeo, conforme usado aqui, refere-se a um polipeptídeo que compreende um segmento que tem identidade substancial a uma porção de uma seqüência de aminoácido e que tem pelo menos uma das seguintes propriedades: (1) ligação específica ao CD40 sob condições de ligação adequadas, (2) capacidade de ativar o CD40, (3) capacidade de sobre-regular a expressão de moléculas da superfície celular, tais como ICAM, MHC-II, B7-1, B72, CD71, CD23 e CD83 ou (4) a capacidade de intensificar a secreção de citocinas tais como IFN-βΙ, IL-2, IL-8, IL-12, IL-15, IL-18 e IL-23. Tipicamente, análogos de polipeptídeo compreendem uma substituição conservativa de aminoácido (ou inserção ou deleção) com relação à seqüência que ocorre naturalmente. Análogos são, tipicamente, de 20 ou 25 aminoácidos de comprimento, de preferência de pelo menos 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 ou 200 aminoácidos de comprimento ou mais e podem, muitas vezes, ser tão longos quanto um polipeptídeo
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16/176 que ocorre naturalmente de comprimento total.
[0064] Substituições de aminoácidos preferidas são aquelas as quais: (1) reduzem a suscetibilidade à proteólise, (2) reduzem a suscetibilidade à oxidação, (3) alteram a afinidade de ligação para formação de complexos de proteína e (4) conferem ou modificam outras propriedades físico-químicas ou funcionais de tais análogos. Análogos podem incluir várias muteínas de uma outra seqüência que não a seqüência de peptídeo que ocorre naturalmente. Por exemplo, substituições únicas ou múltiplas de aminoácidos (de preferência substituições conservativas de aminoácidos) podem ser feitas na seqüência que ocorre naturalmente (de preferência na porção do polipeptídeo externamente ao(s) domínio(s) que forma(m) contatos intermoleculares). Uma substituição conservativa de aminoácido não deverá alterar substancialmente as características estruturais da seqüência original (por exemplo, uma substituição de aminoácido não deverá tender a romper uma hélice que ocorre na seqüência original ou romper outros tipos de estruturas secundárias que caracterizam a seqüência original). Exemplos de estruturas secundárias e terciárias de polipeptídeo reconhecidas na técnica são descritas em Proteins, Structures and Molecular Principies (Creighton, Ed., W.H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden e J. Tooze editores, Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); e Thornton e outros, Nature 354: 105 (1991), os quais são, cada um, incorporados aqui por referência.
[0065] Análogos de não-peptídeo são comumente usados na indústria farmacêutica como drogas com propriedades análogas àquelas do peptídeo modelo. Esses tipos de composto não-peptídico são denominados miméticos de peptídeo ou peptidomiméticos. Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15: 29 (1986); Veber e Freidinger, TINS, página 392 (1985); e Evans e outros, J. Med. Chem. 30: 1229 (1987), os quais são
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17/176 incorporados aqui por referência. Tais compostos são, muitas vezes, desenvolvidos com o auxílio de modelagem molecular computadorizada. Miméticos de peptídeo que são estruturalmente similares a peptídeos terapeuticamente úteis podem ser usados para produzir um efeito profilático ou terapêutico equivalente. Geralmente, peptidomiméticos são estruturalmente similares a um polipeptídeo paradigma (isto é, um polipeptídeo que tem uma propriedade bioquímica ou atividade farmacológica desejada), tal como um anticorpo humano, mas tem uma ou mais ligações de peptídeo opcionalmente substituídas por uma ligação selecionada do grupo consistindo de: --CH2NH--, --CH2S--, --CH2-CH2-, —CH=CH—(cis e trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2— e -CH2SO-, por meio de métodos bem-conhecidos na técnica. Substituição sistemática de um ou mais aminoácidos de uma seqüência de consenso por um Daminoácido do mesmo tipo (por exemplo, D-lisina em lugar de L-lisina) também pode ser usada para gerar peptídeos mais estáveis. Além disso, peptídeo limitados compreendendo uma seqüência de consenso ou uma variação de seqüência de consenso substancialmente idêntica podem ser gerados por meio de métodos conhecidos na técnica (Rizo e Gierasch, Ann. Rev. Biochem. 61: 387 (1992), incorporado aqui por referência); por exemplo, através da adição de resíduos internos de cisteína capazes de formar pontes intramoleculares de dissulfeto as quais ciclizam o peptídeo.
[0066] Um anticorpo refere-se a um anticorpo completo ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo, que compete com o anticorpo intacto pela ligação específica. Veja, de modo geral, Fundamental Immunoloqy, Cap. 7 (Paul, W. ed., 2a ed., Raven Press, N.Y. (1989)) (incorporado aqui por referência em sua totalidade para todas as finalidades). As porções de ligação a antígeno podem ser produzidas através de técnicas de DNA recombinante ou por meio de divagem enzimática ou química de anticorpos intactos. As porções de ligação a an
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18/176 tígeno incluem, inter alia, Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb e fragmentos da região de determinação de complementaridade (CDR), anticorpos com cadeia simples (scFv), anticorpos quiméricos, diacorpos e polipeptídeos que contêm pelo menos uma porção de um anticorpo que é suficiente para conferir ligação a antígeno específica ao polipeptídeo.
[0067] Do N-término para o C-término, os domínios variáveis de cadeia leve e pesada compreendem as regiões FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. A atribuição de aminoácidos a cada domínio é de acordo com as definições de Kabat, Sequences of Proteins of Immunoloqical Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 e 1991)) ou Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987); Chothia e outros, Nature 342: 878-883 (1989).
[0068] Conforme usado aqui, um anticorpo que é referido pelo número é um anticorpo monoclonal que é obtido a partir do hibridoma do mesmo número. Por exemplo, o anticorpo monoclonal 3.1.1 é obtido do hibridoma 3.1.1.
[0069] Conforme usado aqui, um fragmento Fd significa um fragmento de anticorpo que consiste nos domínios Vh e Ch 1; um fragmento Fv consiste nos domínios Vl e Vh de uma única ramificação de um anticorpo; e um fragmento dAb (Ward e outros, Nature, 341: 544-546 (1989)) consiste em um domínio Vh.
[0070] Em algumas concretizações, o anticorpo é um anticorpo com cadeia simples (scFv) no qual os domínios Vl e Vh são emparelhados a fim de formar moléculas monovalentes via um ligante sintético que possibilita que as mesmas sejam feitas como uma cadeia simples de proteína. (Bird e outros, Science 242: 423-426 (1988) e Huston e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 5879-5883 (1988)). Em algumas concretizações, os anticorpos são diacorpos, isto é, são anticorpos bivalentes nos quais os domínios Vh e Vl são expressos em uma única cadeia de polipeptídeo, mas usando-se um ligante que é muito
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19/176 curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, desse modo, forçando os domínios a se emparelharem a domínios complementares de outra cadeia e criando dois locais de ligação a antígeno. (Veja, por exemplo, Holliger, P. e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 6444-6448 (1993) e Poljak, R.J. e outros, Structure 2: 1121-1123 (1994). Em algumas concretizações, uma ou mais CDRs de um anticorpo da invenção pode ser incorporado em uma molécula covalente ou não-covalentemente para torna-la uma imunoadesina que se liga especificamente ao CD40. Em tais concretizações, a(s) CDR(s) pode(m) ser incorporada(s) como parte de uma cadeia de polipeptídeo maior, pode(m) ser covalentemente ligada(s) a outra cadeia de polipeptídeo ou pode(m) ser incorporada(s) não-covalentemente.
[0071] Em concretizações tendo um ou mais locais de ligação, os locais de ligação podem ser idênticos uns aos outros ou podem ser diferentes.
[0072] Conforme usado aqui, o termo anticorpo humano significa qualquer anticorpo no qual todas as seqüências de domínio constante e variável são seqüências humanas. Esses anticorpos podem ser preparados através de uma variedade de formas, conforme descrito abaixo.
[0073] O termo anticorpo quimérico, conforme usado aqui, significa um anticorpo que compreende regiões de dois ou mais anticorpos diferentes. Em uma concretização, uma ou mais das CDRs são derivadas de um anticorpo anti-CD40 humano. Em outra concretização, todas as CDRs são derivadas de um anticorpo anti-CD40 humano. Em outra concretização, as CDRs de mais de um anticorpo anti-CD40 humano são combinadas em um anticorpo quimérico. Por exemplo, um anticorpo quimérico pode compreender uma CDR1 da cadeia leve de um primeiro anticorpo anti-CD40 humano, uma CDR2 da cadeia leve do segundo anticorpo anti-CD40 humano e uma CDR3 e CDR3 da ca
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20/176 deia leve de um terceiro anticorpo anti-CD40 humano e as CDRs da cadeia pesada podem ser derivadas de um ou mais de outros anticorpos anti-CD40. Ainda, as regiões da rede de trabalho podem ser derivadas de um dos mesmos anticorpos anti-CD40 ou de um ou mais humanos diferentes.
[0074] Um anticorpo de ativação (também referido aqui como um anticorpo agonista), conforme usado aqui, significa um anticorpo que aumenta uma ou mais atividades do CD40 em pelo menos cerca de 20% quando adicionado a uma célula, tecido ou organismo expressando o CD40. Em algumas concretizações, o anticorpo ativa a atividade do CD40 em pelo menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%. Em algumas concretizações, o anticorpo de ativação é adicionado na presença de CD40L. Em algumas concretizações, a atividade do anticorpo de ativação é medida usando-se um ensaio de super-regulação de moléculas da superfície de sangue íntegro. Veja Exemplo VII. Em outra concretização, a atividade do anticorpo de ativação é medida usando-se um ensaio de células dendríticas para medir a liberação de IL-
12. Veja Exemplo VIII. Em outra concretização, a atividade do anticorpo de ativação é medida usando-se um modelo de tumor in vivo. Veja Exemplo X.
[0075] Fragmentos ou análogos de anticorpos ou moléculas de imunoglobulina podem ser prontamente preparados por aqueles versados na técnica seguindo-se os ensinamentos da presente relatório descritivo. Fragmentos ou análogos amino- e carbóxi-terminais preferidos ocorrem próximos aos domínios funcionais. Os domínios estruturais e funcionais podem ser identificados por meio de comparação dos dados das seqüências de nucleotídeo e/ou aminoácidos a bancos de dados de seqüências particulares ou públicos. De preferência, métodos de comparação computadorizados são usados para identificar motivos de seqüência ou domínios de conformação de proteína previstos
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21/176 que ocorrem em outras proteínas de estrutura e/ou função conhecida. Métodos para identificar seqüências de proteína que se duplicam em uma estrutura tridimensional conhecida são conhecidos. Veja Bowie e outros, Science 253: 164 (1991).
[0076] O termo ressonância por plasmônio em superfície, conforme usado aqui, refere-se a um fenômeno óptico que permite a análise de interações bioespecíficas em tempo real através de detecção de alterações nas concentrações de proteína dentro de uma matriz biossensora, por exemplo, usando-se o sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suécia e Piscataway, N.J.). Para outras descrições veja Jonsson, U. e outros, Ann. Biol. Clin. 51: 19-26 (1993); Johnsson, U. e outros, Biotechniques 11: 620-627 (1991); Johnsson, B. e outros, J. Mol. Recognit. 8: 125-131 (1995); e Johnsson, B. e outros, Anal. Biochem. 198: 268-277 (1991).
[0077] O termo Kd refere-se à constante de dissociação em equilíbrio de uma interação anticorpo-antígeno em particular.
[0078] O termo epitopo inclui qualquer determinante de proteína capaz de ligação específica a uma imunoglobulina ou receptor de células T. Determinantes epitópicas usualmente consistem em grupamentos na superfície quimicamente ativos de moléculas tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e usualmente têm características estruturais tridimensionais, bem como características de carga específicas. Um anticorpo é dito como se ligando especificamente a um antígeno quando a constante de dissociação em equilíbrio é < 1 μΜ, de preferência < 100 nM e mais preferivelmente <10 nM.
[0079] Conforme usado aqui, os vinte aminoácidos convencionais e suas abreviações seguem o uso convencional. Veja Immunoloqv-A Synthesis (2a Edição, E.S. Golub e D.R. Gren Editores, Sinauer Associates, Sunderiand, Mass. (1991)), o qual é incorporado aqui por referência.
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22/176 [0080] O termo polinucleotídeo, conforme referido aqui, significa uma forma polimérica de nucleotídeos de pelo menos 10 bases de comprimento, quer ribonucleotídeos ou desoxinucleotídeos ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo. O termo inclui as formas simples e duplamente trançadas.
[0081] O termo polinucleotídeo isolado, conforme usado aqui, significa um polinucleotídeo de origem genômica, cDNA ou sintética ou alguma combinação dos mesmos o qual, em virtude de sua origem, o polinucleotídeo isolado (1) não está associado a toda ou uma porção de um polinucleotídeo com o qual o polinucleotídeo isolado é encontrado na natureza, (2) é operavelmente ligado a um polinucleotídeo ao qual ele não está ligado na natureza ou (3) não ocorre na natureza como parte de uma seqüência maior.
[0082] O termo oligonucleotídeo, conforme usado aqui, inclui nucleotídeos modificados e que ocorrem naturalmente ligados juntos através de ligações de oligonucleotídeo que ocorrem naturalmente e que não ocorrem naturalmente. Oligonucleotídeos são um subconjunto de polinucleotídeo compreendendo geralmente 200 bases de comprimento ou menos. Oligonucleotídeos preferidos são de 10 a 60 bases de comprimento e mais preferivelmente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 a 40 bases de comprimento. Oligonucleotídeos usualmente são simplesmente filamentosos, por exemplo, para iniciadores e sondas; embora oligonucleotídeos possam ser duplamente filamentosos, por exemplo, para uso na construção de um mutante genético. Os oligonucleotídeos da invenção podem ser oligonucleotídeos de senso ou anti-sentido.
[0083] O termo nucleotídeos que ocorrem naturalmente, conforme usado aqui, inclui desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos. O termo nucleotídeos modificados, conforme usado aqui, inclui nucleotídeos com grupos açúcar modificados ou substituídos e semelhantes.
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O termo ligações de oligonucleotídeo referido aqui inclui ligações de oligonucleotídeos tais como fosforotioato, fosforoditioato, fósforosselenoato, fosforodisselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforoamidato e semelhantes. Veja, por exemplo, LaPlanche e outros, Nucl. Acids Res. 14: 9081 (1986); Stec e outros, J. Am. Chem. Soc. 106: 6077 (1984); Stein e outros, Nucl. Acids Res. 16: 3209 (1988); Zon e outros, Anti-Câncer Drug Design 6: 539 (1991); Zon e outros, Qligonucleotides and Analoques: A Practical ADproach, páginas 87-108 (F. Eckstein Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Pat. U.S. N° 5.151.510; Uhlmann e Peyman, Chemical Reviews 90: 543 (1990), as descrições dos quais são aqui incorporadas por referência. Um oligonucleotídeo pode incluir um rótulo para detecção, se desejado.
[0084] Seqüências operavelmente ligadas incluem seqüências de controle de expressão que são contíguas ao gene de interesse e seqüências de controle de expressão que atuam in trans ou a distância para controlar o gene de interesse. O termo seqüência de controle de expressão, conforme usado aqui, significa seqüências de polinucleotídeo que são necessárias para efetuar a expressão e processamento de seqüências de codificação às quais elas estão ligadas. Seqüências de controle de expressão incluem seqüências de início de transcrição, iniciação, término, promotoras e intensificadoras apropriadas; sinais de processamento de RNA eficientes, tais como sinais de divisão e de poliadenilação; seqüências que estabilizam o mRNA citoplásmico; seqüências que intensificam a eficiência de tradução (isto é, seqüência de consenso de Kozak); seqüências que intensificam a estabilidade de proteína; e, quando desejado, seqüências que intensificam a secreção de proteína. A natureza de tais seqüências de controle difere, dependendo do organismo hospedeiro; em procariotas, tais seqüências de controle geralmente incluem seqüência promotora, de local de ligação
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24/176 ribossômica e de término de transcrição; em eucariotas, geralmente, tais seqüências de controle incluem seqüências promotoras e de término de transcrição. O termo seqüências de controle se destina a incluir, no mínimo, todos os componentes cuja presença é essencial para expressão e processamento e também pode incluir componentes adicionais cuja presença é vantajosa, por exemplo, seqüências líderes e seqüências parceiras de fusão.
[0085] O termo vetor, conforme usado aqui, significa uma molécula de ácido nucléico capaz de transportar outro ácido nucléico ao qual ela tenha sido ligada. Em algumas concretizações, o vetor é um plasmídeo, isto é, uma alçade DNA duplamente filamentoso circular ao qual segmentos adicionais de DNA podem ser ligados. Em algumas concretizações, o vetor é um vetor viral, em que segmentos adicionais de DNA podem ser ligados no genoma viral. Em algumas concretizações, os vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira à qual eles tenham sido introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos tendo uma origem bacteriana de replicação e vetores epissomais de mamíferos). Em outras concretizações, os vetores (por exemplo, vetores não-epissomais de mamíferos) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira quando de introdução na célula hospedeira e, desse modo, são reproduzidos junto com o genoma do hospedeiro. Além disso, determinados vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais eles estão operavelmente ligados. Tais vetores são referidos aqui como vetores de expressão recombinantes (ou simplesmente vetores de expressão).
[0086] O termo célula hospedeira recombinante (ou simplesmente célula hospedeira), conforme usado aqui, significa uma célula na qual um vetor de expressão recombinante tenha sido introduzida. Deve ser compreendido que célula hospedeira recombinante e célula hospedeira significam não apenas a célula individual em questão,
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25/176 mas também a prole de tal célula. Devido a determinadas modificações que podem ocorrem nas gerações seguintes em virtude de mutação ou influências ambientais, tal prole pode ou não, na verdade, ser idêntica à célula original, mas está ainda incluída dentro do escopo do termo célula hospedeira, conforme usado aqui.
[0087] O termo hibridizar seletivamente referido aqui significa ligar-se detectável e especificamente, polinucleotídeos, oligonucleotídeos e fragmentos dos mesmos de acordo com a invenção se hibridizam seletivamente a filamentos de ácido nucléico sob condições de hibridização e lavagem que minimizam quantidades apreciáveis de ligação detectável a ácidos nucléicos não-específicos. Condições de alta estringência ou altamente estringentes podem ser usadas para obter condições de hibridização seletiva, conforme conhecido na técnica e discutido aqui. Um exemplo de condições de alta estringência ou altamente estringentes é a incubação de um polinucleotídeo com outro polinucleotídeo, em que um polinucleotídeo pode ser afixado a uma superfície sólida, tal como uma membrana, em um tampão de hibridização de 6X SSPE ou SSC, 50% de formamida, 5X reagente de Denhardt, 0,5% de SDS, 100 pg/ml de DNA de esperma de salmão fragmentado desnaturado em uma temperatura de hibridização de 42 °C durante 12-16 horas, seguido por lavagem dupla a 55 °C usando-se um tampão de lavagem de 1X SSC, 0,5% de SDS. Veja também Sambrook e outros, supra, páginas 9.50-9.55.
[0088] O termo identidade percentual de seqüência, no contexto de seqüências de ácido nucléico, significa os resíduos em duas seqüências que são as mesmas quando alinhagemdas para correspondência máxima. A extensão da comparação de identidade de seqüência pode ser sobre um trecho de pelo menos cerca de nove nucleotídeos, usualmente pelo menos cerca de 18 nucleotídeos, mais usualmente pelo menos cerca de 24 nucleotídeos, tipicamente pelo menos
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26/176 cerca de 28 nucleotídeos, mais tipicamente pelo menos cerca de 32 nucleotídeos e de preferência pelo menos cerca de 36, 48 ou mais nucleotídeos. Existe uma série de diferentes algoritmos conhecidos na técnica os quais podem ser usados para medir a identidade de uma seqüência de nucleotídeo. Por exemplo, as seqüências de polinucleotídeo podem ser comparadas usando-se o FASTA, Gap ou Bestfit, os quais são programas no Wisconsin Package Versão 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin. O FASTA, o qual inclui, por exemplo, os programas FASTA2 e FASTA3, proporciona alinhagemmentos e identidade percentual de seqüência das regiões de melhor sobreposição entre as seqüências de busca e a seqüência em questionamento (Pearson, Methods Enzymol. 183: 63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132: 185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol. 266: 227-258 (1996); Pearson, J. Mol. Biol. 276: 71-84 (1998); aqui incorporado por referência). A menos que de outro modo especificado, os parâmetros padrão para um programa ou algoritmo em particular são usados. Por exemplo, a identidade percentual de seqüência entre seqüências de ácido nucléico pode ser determinada usando-se o FASTA com seus parâmetros padrão (um tamanho de palavra de 6 e o fator NOPAM para a matriz de escore) ou usando-se o Gap com seus parâmetros padrão, conforme proporcionado no GCG Versão 6.1, aqui incorporado por referência.
[0089] Uma referência a uma seqüência de nucleotídeo abrange seu complemento, a menos que de outro modo especificado. Assim, uma referência a um ácido nucléico tendo uma seqüência em particular deverá ser compreendida como abrangendo seu filamento complementar, com sua seqüência complementar.
[0090] Na técnica de biologia molecular, os pesquisadores usam os termos identidade percentual de seqüência, similaridade percentual de seqüência e homologia percentual de seqüência, permuta
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27/176 velmente. No presente pedido, esses termos têm o mesmo significado com relação a seqüências de ácido nucléico apenas.
[0091] O termo similaridade substancial ou similaridade substancial de seqüência, quando referindo a um ácido nucléico ou fragmento do mesmo, significa que quando otimamente alinhagemdo com inserções ou deleções de nucleotídeo apropriadas a outro ácido nucléico (ou seu filamento complementar), há uma identidade da seqüência de nucleotídeo de pelo menos cerca de 85%, de preferência pelo menos cerca de 90% e mais preferivelmente pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% das bases de nucleotídeo, conforme medido por qualquer algoritmo de identidade de seqüência bemconhecido, tal como FASTA, BLAST ou Gap, conforme discutido acima.
[0092] Quando aplicado a polipeptídeos, o termo identidade substancial significa que duas seqüências de peptídeo, quando otimamente alinhagemdas, tal como por meio dos programas GAP ou BESTFIT usando-se os pesos de fenda padrão, têm pelo menos 70, 75 ou 80 por cento de identidade de seqüência, de preferência pelo menos 90 ou 95 por cento de identidade de seqüência e mais preferivelmente pelo menos 97, 98 ou 99 por cento de identidade de seqüência. De preferência, as posições de resíduos que não são idênticas diferem por substituições conservativas de aminoácidos. Uma substituição conservativa de aminoácido é uma na qual um resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo de aminoácido tendo um grupo R na cadeia lateral) com propriedades químicas similares (por exemplo, carga ou hidrofobicidade). Em geral, uma substituição conservativa de aminoácido não mudará substancialmente as propriedades funcionais de uma proteína. Em casos onde duas ou mais seqüências de aminoácido diferem umas das outras por substituições conservativas de aminoácidos, a identidade percentual de seqüência ou grau de simila
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28/176 ridade pode ser ajustado para corrigir a natureza conservativa da substituição. Meios para fazer esse ajuste são bem-conhecidos por aqueles versados na técnica. Veja, por exemplo, Pearson, Methods Mol. Biol. 243: 307-31 (1994). Exemplos de grupos de aminoácidos que tenham cadeias laterais com propriedades químicas similares incluem 1) cadeias laterais alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadeias laterais alifáticas-hidroxila: serina e treonina; 3) cadeias laterais contendo amida: asparagina e glutamina; 4) cadeias laterais aromáticas: fenilalanina, tirosina e triptofano; 5) cadeias laterais básicas: lisina, arginina e histidina; 6) cadeias laterais ácidas: ácido aspártico e ácido glutâmico; e 7) cadeias laterais contendo enxofre: cisteína e metionina. Grupos de substituição conservativa de aminoácidos preferidos são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato e asparaginaglutamina.
[0093] Alternativamente, uma substituição conservativa é qualquer troca tendo um valor positivo na matriz de log-probabilidade PAM250 descrita em Gonnet e outros, Science 256: 1443-45 (1992), aqui incorporado por referência. Uma substituição moderadamente conservativa é qualquer troca tendo um valor não-negativo na matriz de logprobabilidade PAM250.
[0094] A similaridade de seqüência para polipeptídeos, a qual também é referida como identidade de seqüência, é tipicamente medida usando-se um software para análise de seqüência. O software para análise de proteína emparelha seqüências similares usando medidas de similaridade atribuídas a várias substituições, deleções e outras modificações, incluindo substituições conservativas de aminoácidos. Por exemplo, o GCG contém programas tais como Gap e Bestfit os quais são usados com os parâmetros padrão para determinar a homologia de seqüência ou identidade de seqüência entre polipeptídeos in
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29/176 timamente relacionados, tais como polipeptídeo homólogos de diferentes espécies de organismos ou entre uma proteína do tipo silvestre e uma muteína da mesma. Veja, por exemplo, GCG Versão 6.1. As seqüências de polipeptídeo também podem ser comparadas usando-se o FASTA utilizando os parâmetros padrão ou recomendados, um programa no GCG Versão 6.1. O FASTA (por exemplo, FASTA2 e FASTA3) proporciona alinhagemmentos e a identidade percentual de seqüência das regiões de melhor sobreposição entre a seqüência em questão e as de busca (Pearson, Methods Enzymol. 183: 63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132: 185-219 (2000)). Outro algoritmo preferido quando de comparação de uma seqüência da invenção a um banco de dados contendo um número maior de seqüências de diferentes organismos é o programa de computador BLAST, especialmente blastp ou tblastn, usando-se os parâmetros padrão. Veja, por exemplo, Altschul e outros, J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990); Altschul e outros, Nucleic Acids Res. 25: 3389-402 (1997); aqui incorporado por referência.
[0095] O comprimento das seqüências de polipeptídeo comparadas para homologia geralmente será de pelo menos cerca de 16 resíduos de aminoácidos, usualmente pelo menos cerca de 20 resíduos, mais usualmente pelo menos cerca de 24 resíduos, tipicamente pelo menos cerca de 28 resíduos e de preferência mais do que cerca de 35 resíduos. Quando de busca em um banco de dados contendo seqüências de um número maior de diferentes organismos, é preferível comparar seqüências de aminoácidos.
[0096] Conforme usado aqui, os termos rótulo ou rotulado refere-se à incorporação de outra molécula no anticorpo. Em uma concretização, o rótulo é um marcador detectável, por exemplo, incorporação de um aminoácido rádiorotulado ou fixação a um proporcionar de porções biotinila que podem ser detectadas por avidina marcada (por
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30/176 exemplo, estreptavidina contendo um marcador fluorescente ou atividade enzimática que pode ser detectada por métodos ópticos ou colorimétricos). Em outra concretização, o rótulo ou marcador pode ser terapêutico, por exemplo, um conjugado de droga ou toxina. Vários métodos de rotulação de polipeptídeos e glicoproteínas são conhecidos na técnica e podem ser usados. Exemplos de rótulos para polipeptídeo incluem, mas não estão limitados, aos seguintes: radioisótopos ou radionuclídeos (por exemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, Tc, 111ln, 125l, 131l), rótulos fluorescentes (por exemplo, FITC, rodamina, fósforo de lantanídeo), rótulos enzimáticos (por exemplo, peroxidase de rábano silvestre, β-galactosidase, luciferase, alcalina fosfatase, marcadores quimioluminescentes, grupos biotinila, epitopos predeterminados de polipeptídeo reconhecidos por um repórter secundário (por exemplo, seqüências pares com zíper de leucina, locais de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação a metal, etiquetas de epitopo), agentes magnéticos, tais como quelatos de gadolínio, toxinas, tais como toxina pertussis, taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposídeo, tenoposídeo, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidróxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-dehidrotestosterona, glicorticóides, procaína, tetracaína, lidocaína, propanolol e puromicina e análogos ou homólogos dos mesmos. Em algumas concretizações, os rótulos são presos por braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir o impedimento estérico potencial.
[0097] O termo paciente inclui seres humanos e indivíduos veterinários.
[0098] No decorrer do relatório descritivo e nas reivindicações, a palavra compreende ou variações tais como compreendem ou compreendendo deve ser compreendida como implicando na inclusão do grupo de número inteiro ou número inteiro estabelecido, mas
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31/176 não a exclusão de qualquer outro inteiro ou grupo de inteiro.
Anticorpos Anti-CD40 Humanos e Caracterização dos Mesmos [0099] Anticorpos humanos evitam determinados problemas associados a anticorpos que possuem regiões constantes e/ou variáveis não-humanas (por exemplo, roedores). Tais problemas incluem a eliminação rápida dos anticorpos ou resposta imune contra o anticorpo. Portanto, em uma concretização, a invenção proporciona anticorpos anti-CD40 humanizados. Em outra concretização, a invenção proporciona anticorpos anti-CD40 humanos. Em algumas concretizações, os anticorpos anti-CD40 humanos são produzidos através de imunização de um roedor cujo genoma compreende genes da imunoglobulina humana, de modo que o roedor produz anticorpos humanos. Espera-se que os anticorpos anti-CD40 humanos minimizem as respostas imunogênicas e alérgicas intrínsecas a anticorpos monoclonais nãohumanos ou derivados de não-humanos (Mabs) e, assim, aumente a eficácia e segurança dos anticorpos administrados. Pode-se esperar que o uso de anticorpos totalmente humanos proporcione uma vantagem substancial no tratamento de doença humanas crônicas e recorrentes, tais como inflamação e câncer, as quais requerem administrações repetidas de anticorpos.
[00100] A invenção proporciona onze anticorpos monoclonais antiCD40 humanos de ativação (mAbs) e as linhagens de células de hibridoma que produzem os mesmos. A Tabela A lista os identificadores de seqüência (SEQ ID NOS:) dos ácidos nucléicos que codificam as cadeias pesada e leve de comprimento total (incluindo seqüência líder), as seqüências deduzidas de aminoácidos de comprimento total e as seqüências deduzidas de aminoácidos e nucleotídeo das regiões variáveis de cadeia pesada e leve.
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Tabela A
ANTICORPOS ANTI-CD40 HUMANOS
MAb IDENTIFICADOR DE SEQÜÊNCIA (SEQ ID NO:)
Região variável Comprimento total
Pesada Leve Pesada Leve
DN A proteína DNA proteína DNA proteína DNA proteína
3.1.1 1 2 3 4 5 6 7 8
7.1.2 9 10 11 12 13 14 15 16
10.8.3 17 18 19 20 21 22 23 24
15.1.1 25 26 27 28 29 30 31 32
21.2.1 33 34 35 36 37 38 39 40
21.4.1 41 42 43 44 45 46 47 48
22.1.1 49 50 51 52 53 54 55 56
23.5.1 57 58 59 60 61 62 63 64
23.28.1 65 66 67 68 69 70 71 72
23.29.1 73 74 75 76 77 78 79 80
24.2.1 81 82 83 84 85 86 87 88
[00101] A invenção ainda proporciona o mAb anti-CD40 humano
23.25.1 e a linhagem de célula de hibridoma que produz o mesmo.
[00102] A invenção ainda proporciona variantes de cadeia pesada e/ou leve de alguns dos mAbs anti-CD40 humanos acima listados, compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos. A invenção proporciona duas cadeias pesadas variantes do mAb 3.1.1. Em uma, a alanina no resíduo 78 é trocada por treonina. Na segunda, a alanina no resíduo 78 é trocada por treonina e as valinas nos resíduos 88 e 97 são trocadas por alaninas. A invenção também proporciona uma cadeia leve variante do mAb 3.1.1 na qual a leucina no resíduo 4 e a leucina no resíduo 83 são trocadas por metionina e valina, respectivamente. A combinação de uma cadeia pesada ou leve variante com uma cadeia leve ou pesada do tipo silvestre, respectivamente, é designada pela cadeia mutante. Assim, um anticorpo contendo uma cadeia leve do tipo silvestre e uma cadeia pesada compreendendo a mu
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33/176 tação de alanina para treonina no resíduo 78 é designada como 3.1.1H-A78T. Contudo, em outras concretizações da invenção, anticorpos contendo qualquer combinação de uma cadeia pesada variante e a cadeia leve variante do 3.1.1 estão incluídos.
[00103] Ainda, a invenção proporciona uma variante da cadeia pesada do mAb 22.1.1 na qual a cisteína no resíduo 109 é trocada por uma alanina. Um anticorpo monoclonal compreendendo a cadeia pesada variante e a cadeia leve do 22.1.1 é designado mAb 22.1.1 HC109A. A invenção ainda proporciona duas cadeias pesadas variantes e uma cadeia leve variante do mAb 23.28.1. Em uma variante de cadeia pesada, o ácido aspártico no resíduo 16 é trocado por ácido glutâmico. Um mAb compreendendo a variante de cadeia pesada e a cadeia leve do 23.28.1 é designado 23.28.1 H-D16E. A invenção também inclui uma variante de cadeia leve do 23.28.1 na qual a cisteína no resíduo 92 é trocada por uma alanina. Um mAb compreendendo a cadeia pesada do 23.28.1 e a cadeia leve variante é designado 23.28.1 L C92A. A invenção também proporciona mAbs compreendendo qualquer uma das variantes de cadeia pesada do 23.28.1 com a variante da cadeia leve do 23.28.1.
[00104] A cadeia leve produzida pelo hibridoma 23.29.1 contém uma mutação na região constante no resíduo 174. A cadeia leve produzida pelo hibridoma tem arginina nessa posição ao invés da lisina canônica. Conseqüentemente, a invenção também proporciona uma cadeia leve do 23.29.1 com a lisina canônica no resíduo 174 e um mAb designado 23.29.1L-R174K, compreendendo a cadeia pesada do
23.29.1 e a cadeia leve variante.
[00105] Em uma concretização preferida, o anticorpo anti-CD40 é
3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 3.1.1 L-L4M-L83V, 7.1.2,
10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1 H-C109A, 23.5.1, 23.25.1,
23.28.1, 23.28.1 H-D16E, 23.28.1 L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K e
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24.2.1. Em algumas concretizações preferidas, o anticorpo anti-CD40 compreende uma cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64, 72, 80, 88, 94, 100 ou 1 02 ou a região variável das mesmas ou codificada por uma seqüência de ácido nucléico selecionada de SEQ ID NO: 7, 15, 23, 31, 39, 47, 55, 63, 71, 79, 87, 93, 99 ou 101. Em algumas concretizações, o anticorpo anti-CD40 compreende uma cadeia leve compreendendo pelo menos a CDR2 da um dos anticorpos listados, uma das seqüências de aminoácidos acima identificadas (conforme mostrado nas Figuras 1A-1C e 2A-2C) ou codificada por uma das seqüências de ácido nucléico acima identificadas. Em outra concretização, a cadeia leve ainda compreende uma CDR1 e uma CDR3 independentemente selecionadas de uma região variável de cadeia leve que compreende não mais do que dez aminoácidos da seqüência de aminoácidos codificada por uma linhagem germinativa do gene Vk A3/A19, L5 ou A27 ou compreende uma CDR1 e uma CDR3 independentemente selecionadas de uma CDR1 e uma CDR3 de (1) um anticorpo selecionado de 3.1.1, 3.1.1 L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1,
22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1LR174K ou 24.2.1; (2) a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94, 100 ou 102 ou (3) codificada pela seqüência de ácido nucléico de SEQ ID NO: 3, 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 93, 99 ou 101.
[00106] Em outra concretização preferida, o anticorpo anti-CD40 compreende uma cadeia pesada compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOS: 6, 14, 22, 30, 38, 46, 54, 62, 70, 78 ou 86 ou região variável da mesma ou codificada por seqüência de ácido nucléico selecionada de SEQ ID NOS: 5, 13, 21, 29, 37, 45, 53, 61, 69, 77 ou 85. Em algumas concretizações, o anticorpo anti-CD40 compreende uma cadeia pesada compreendendo pelo me
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35/176 nos a CDR3 de um dos anticorpos listados, uma das seqüências de aminoácidos acima identificadas (conforme mostrado nas Figuras 1A1C e 2A-2C) ou codificada por uma das seqüências de ácido nucléico acima identificadas. Em outra concretização, a cadeia pesada ainda compreende uma CDR1 e CDR2 independentemente selecionadas de uma região variável de cadeia pesada que compreende não mais do que dezoito aminoácidos da seqüência de aminoácidos codificada por uma linhagem germinativa do gene Vh3-30+, 4-59, 1-02, 4.35 ou 330.3 ou compreende uma CDR1 e CDR2 independentemente selecionadas de uma CDR1 e CDR2 de (1) um anticorpo selecionado de
3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1,
21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1,
23.28.1 H-D16E, 23.29.1, e 24.2.1; (2) a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 ou 98 ou (3) codifica pela seqüência de ácido nucléico de SEQ ID NO: 1,9,17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 91, 95 ou 97. Em outra concretização, o anticorpo anti-CD40 compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve conforme definido acima.
[00107] Conforme usado aqui, o anticorpo 3.1.1 H-A78T é idêntico àquele do 3.1.1, exceto que o resíduo 78 da cadeia pesada é treonina ao invés de alanina. Similarmente, no anticorpo 3.1.1H-A78T-V88AC97A, o resíduo 78 é trocado para A e os resíduos 88 e 97 são trocados de valina para alanina na cadeia pesada. O anticorpo 3.1.1L-L4ML83V é idêntico àquele do 3.1.1, exceto que o resíduo 4 é metionina ao invés de leucina e o resíduo 83 é valina ao invés de leucina na cadeia leve. O anticorpo 22.1.1H-C109A é idêntico àquele do 22.1.1, exceto que o resíduo 109 da cadeia pesada é trocado de uma cisteína para uma alanina. Os anticorpos 23.28.1 H-D16E e 23.28.1L-C92A são idênticos àqueles do 23.28.1, exceto que o resíduo 16 da cadeia pesada é trocado de aspartato para glutamato e o resíduo 92 da cadeia
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36/176 leve é trocado de cisteína para alanina, respectivamente. O anticorpo
23.29.1 L-R174K é idêntico àquele do 23.29.1, exceto que o resíduo 174 da cadeia leve é trocado de arginina para lisina.
Classe e Subclasse de Anticorpos Anti-CD40 [00108] A classe e subclasse de anticorpos anti-CD40 podem ser determinadas por meio de qualquer método conhecido na técnica. Em geral, a classe e subclasse de um anticorpo podem ser determinadas usando-se anticorpos que são específicos para uma classe e subclasse de anticorpo em particular. Tais anticorpos estão comercialmente disponíveis. A classe e subclasse podem ser determinadas por ELISA ou Western blot, bem como outras técnicas. Alternativamente, a classe e subclasse podem ser determinadas através de seqüenciamento de todos ou uma porção dos domínios constantes das cadeias pesada e/ou leve dos anticorpos, comparando suas seqüências de aminoácidos a seqüências de aminoácidos conhecidas de várias classes e subclasses de imunoglobulinas e determinação da classe e subclasse dos anticorpos.
[00109] Em algumas concretizações, o anticorpo anti-CD40 é um anticorpo monoclonal. O anticorpo anti-CD40 pode ser uma molécula de IgG, uma de IgM, uma de IgE, uma de IgA ou uma de IgD. Em uma concretização preferida, o anticorpo anti-CD40 é uma IgG e é de uma subclasse lgG1, lgG2, lgG3 ou lgG4. Em outra concretização preferida, os anticorpos anti-CD40 são da subclasse lgG2.
Seletividade por Espécies e Moléculas [00110] Em outro aspecto da invenção, os anticorpos anti-CD40 demonstram seletividade por espécies e moléculas. Em algumas concretizações, o anticorpo anti-CD40 se liga ao CD40 de primata e humano. Em algumas concretizações, o anticorpo anti-CD40 se liga ao CD40 humano, de cynomolgus ou rhesus. Em outras concretizações, o anticorpo anti-CD40 não se liga ao CD40 de camundongo, rato, cão ou
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37/176 coelho. Seguindo os ensinamentos do relatório descritivo, pode-se determinar a seletividade por espécies com relação ao anticorpo antiCD40 usando-se métodos bem-conhecidos na técnica. Por exemplo, pode-se determinar a seletividade por espécies usando-se Western blot, FACS, ELISA ou RIA. (Veja, por exemplo, Exemplo IV).
[00111] Em algumas concretizações, o anticorpo anti-CD40 tem seletividade pelo CD40 que é mais de 100 vezes maior do que sua seletividade pelo RANK (ativador receptor do fator kappa-B nuclear), 41BB (CD137), TNFR-1 (Receptor-1 do Fator de Necrose de Tumor) e TNFR-2 (Receptor-2 de Fator de Necrose de Tumor). Em algumas concretizações, o anticorpo anti-CD40 não exibe qualquer ligação específica apreciável a qualquer outra proteína que não o CD40. Podese determinar a seletividade do anticorpo anti-CD40 pelo CD40 usando-se métodos bem-conhecidos na técnica, usando os ensinamentos do relatório descritivo. Por exemplo, pode-se determinar a seletividade usando-se Western blot, FACS, ELISA ou RIA. (Veja, por exemplo, Exemplo V).
Identificação de Epitopos de CD40 Reconhecidos pelo Anticorpo Anti-CD4Q [00112] Ainda, a invenção proporciona um anticorpo monoclonal anti-CD40 humano que se liga ao CD40 e compete concorrentemente com e/ou se liga ao mesmo epitopo e/ou se liga ao CD40 com a mesma Kd que o anticorpo anti-CD40 humano selecionado de um anticorpo
3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 3.1.1 L-L4M-L83V, 7.1.2,
10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1 H-C109A, 23.5.1, 23.25.1,
23.28.1, 23.28.1 H-D16E, 23.28.1 L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K ou 24.2.1; ou um anticorpo anti-CD40 humano que compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 ou 98 ou um anticorpo anti-CD40 humano que compreende uma região
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38/176 variável de cadeia leve tendo uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94, 100 ou 102.
[00113] Pode-se determinar se um anticorpo se liga ao mesmo epitopo ou compete concorrentemente pela ligação com um anticorpo anti-CD40 usando-se qualquer método conhecido na técnica. Em uma concretização, pode-se deixar o anticorpo anti-CD40 da invenção se ligar ao CD40 sob condições de saturação e, então, medir a capacidade do anticorpo de teste de se ligar ao CD40. Se o anticorpo de teste é capaz de se ligar ao CD40 ao mesmo tempo que o anticorpo antiCD40, então, o anticorpo de teste se liga a um epitopo diferente do anticorpo anti-CD40. Contudo, se o anticorpo de teste não é capaz de se ligar ao CD40 ao mesmo tempo, então, o anticorpo de teste se liga ao mesmo epitopo, um epitopo em sobreposição ou um epitopo que está em íntima proximidade ao epitopo ligado pelo anticorpo anti-CD40 humano. Esse experimento pode ser realizado usando-se ELISA, RIA, FACS ou ressonância de plasmônio em superfície. (Veja, por exemplo, Exemplo VI). Em uma concretização preferida, o experimento é realizado usando-se ressonância de plasmônio em superfície. Em uma concretização mais preferida, BIAcore é usado.
Ligação por Afinidade de Anticorpos Anti-CD40 ao CD40 [00114] Em algumas concretizações da invenção, o anticorpo antiCD40 se liga ao CD40 com alta afinidade. Em algumas concretizações, o anticorpo anti-CD40 se liga ao CD40 com uma Kd de 2 x 10'8 M ou menos. Em outras concretizações preferida, o anticorpo se liga ao CD40 com uma Kd de 2 x 10 9, 2 x 10_1°, 4,0 x 10'11 M ou menos. Em uma concretização ainda mais preferida, o anticorpo se liga ao CD40 com uma Kd de 2,5 x 10'12 M ou menos. Em algumas concretizações, o anticorpo se liga ao CD40 com substancialmente a mesma Kd que um anticorpo selecionado de 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78TV88A-V97A, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1,
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22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1 H-D16E,
23.28.1 L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K e 24.2.1. Em outra concretização preferida, o anticorpo se liga ao CD40 com substancialmente a mesma Kd que um anticorpo que compreende uma CDR2 de uma cadeia leve e/ou uma CDR3 de uma cadeia pesada de um anticorpo selecionado de 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 3.1.1 LL4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1HC109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1 H-D16E, 23.28.1L-C92A,
23.29.1, 23.29.1L-R174K e 24.2.1. Em ainda outra concretização preferida, o anticorpo se liga ao CD40 com substancialmente a mesma Kd que um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 ou 98 ou que compreende uma cadeia leve tendo uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94, 100 ou 102. Em outra concretização preferida, o anticorpo se liga ao CD40 com substancialmente a mesma Kd que um anticorpo que compreende uma CDR2 de uma região variável de cadeia leve tendo uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94, 100 ou 102 ou uma CDR3 de uma região variável de cadeia pesada tendo uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 ou 98.
[00115] Em algumas concretizações, o anticorpo anti-CD40 tem uma baixa taxa de dissociação. Em algumas concretizações, o anticorpo anti-CD40 tem uma Koff de 2,0 x 10'4 ou menos. Em algumas concretizações, a KOff é de 2,0 x 10-7 ou menos. Em algumas concretizações, a Koff é substancialmente a mesma que um anticorpo descrito aqui, incluindo um anticorpo selecionado de 3.1.1, 3.1.1 H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1,
21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1,
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23.28.1 H-D16E, 23.28.1 L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K e 24.2.1. Em algumas concretizações, o anticorpo se liga ao CD40 com substancialmente a mesma KOff que um anticorpo que compreende uma CDR3 de uma cadeia pesada ou uma CDR2 de uma cadeia leve de um anticorpo selecionado de 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1 H-A78T-V88AV97A, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.28.1 LC92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K e 24.2.1. Em algumas concretizações, o anticorpo se liga ao CD40 com substancialmente a mesma KOff que um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 ou 98 ou que compreende uma cadeia leve tendo uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 4, 12, 30, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94, 100 ou 102. Em outra concretização preferida, o anticorpo se liga ao CD40 com substancialmente a mesma KOff que um anticorpo que compreende uma CDR2 de uma região variável de cadeia leve tendo uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94, 100 ou 102 ou uma CDR3 de uma região variável de cadeia pesada tendo uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 6,14, 22, 30, 38, 46, 54, 62, 70, 78, 86, 90, 92, 96 ou 98.
[00116] A afinidade de ligação e taxa de dissociação de um anticorpo anti-CD40 ao CD40 podem ser determinadas por meio de qualquer método conhecido na técnica. A afinidade de ligação pode ser medida através de ELISAs competitivos, RIAs ou ressonância de plasmônio em superfície, tal como BIAcore. A taxa de dissociação também pode ser medida através de ressonância de plasmônio em superfície. De preferência, a afinidade de ligação e a taxa de dissociação são medidas através de ressonância de plasmônio em superfície. Mais preferivelmente, a afinidade de ligação e taxa de dissociação são medidas
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41/176 usando-se BIAcore®. Veja, por exemplo, Exemplo XIV.
Uso dos Genes das Cadeias Leve e Pesada [00117] Um anticorpo anti-CD40 da invenção pode compreender uma cadeia leve kappa humana ou lambda humana ou um seqüência de aminoácidos derivada das mesmas. Em algumas concretizações compreendendo uma cadeia leve kappa, o domínio variável da cadeia leve (Vl) é codificado, em parte, por um gene da Vk A3/A19 (DPK-15), L5 (DP5) ou A27 (DPK-22) humana.
[00118] Em algumas concretizações, a Vl do anticorpo anti-CD40 contém uma ou mais substituições de aminoácidos com relação à seqüência de aminoácidos da linhagem germinativa. Em algumas concretizações, a Vl do anticorpo anti-CD40 compreende 1,2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 substituições de aminoácidos com relação à seqüência de aminoácidos da linhagem germinativa. Em algumas concretizações, uma ou mais dessas substituições da linhagem germinativa estão nas regiões CDR da cadeia leve. Em algumas concretizações, as substituições de aminoácidos com relação à linhagem germinativa estão em uma ou mais das mesmas posições que as substituições com relação à linhagem germinativa em qualquer uma das Vl dos anticorpos 3.1.1, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1,
23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K e 24.2.1. Por exemplo, a Vl do anticorpo anti-CD40 pode conter uma ou mais substituições de aminoácidos comparado à linhagem germinativa encontrada no anticorpo 21.4.1 e outras substituições de aminoácidos comparado à linhagem germinativa encontrada no anticorpo 10.8.3, o qual utiliza o mesmo gene Vk que o anticorpo 21.4.1. Em algumas concretizações, as alterações de aminoácidos estão em uma ou mais das mesmas posições, mas envolvem uma mutação diferente daquela no anticorpo de referência.
[00119] Em algumas concretizações, alterações de aminoácidos
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42/176 com relação à linhagem germinativa ocorrem em uma ou mais das mesmas posições que em qualquer uma das Vl dos anticorpos 3.1.1, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1,
23.25.1, 23.28.1, 23.28.1 H-D16E, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1 LR174K e 24.2.1, mas as alterações podem representar substituições conservativas de aminoácidos em tal(is) posição(ões) com relação ao aminoácido no anticorpo de referência. Por exemplo, se uma posição em particular em um desses anticorpos é trocada com relação à linhagem germinativa e é glutamato, pode-se substituir conservativamente o aspartato nessa posição. Similarmente, se uma substituição de aminoácido comparado à linhagem germinativa é serina, pode-se substituir conservativamente treonina por serina nessa posição. Substituições conservativas de aminoácidos são discutidas supra.
[00120] Em algumas concretizações, a cadeia leve do anticorpo anti-CD40 humano compreende a seqüência de aminoácidos que é a mesma que a seqüência de aminoácidos da Vl do anticorpo 3.1.1 (SEQ ID NO: 4), 3.1.1L-L4M-L83V (SEQ ID NO: 94), 7.1.2 (SEQ ID NO: 12), 10.8.3 (SEQ ID NO: 20), 15.1.1 (SEQ ID NO: 28), 21.4.1 (SEQ ID NO: 44), 21.2.1 (SEQ ID NO: 36), 21.4.1 (SEQ ID NO: 44)
22.1.1 (SEQ ID NO: 52), 23.5.1 (SEQ ID NO: 60), 23.28.1 (SEQ ID NO: 68), 23.28.1L-C92A (SEQ ID NO: 100), 23.29.1 (SEQ ID NO: 76),
23.29.1 L-R174K (SEQ ID NO: 102) ou 24.2.1 (SEQ ID NO: 84) ou a referida seqüência de aminoácidos tendo até 1, 2, 3, 4, 6, 8 ou 10 substituições conservativas de aminoácidos e/ou um total de até 3 substituições não-conservativas.
[00121] Em algumas concretizações, a cadeia leve do anticorpo anti-CD40 compreende pelo menos a CDR2 da cadeia leve e também pode compreender as regiões CDR1 e CDR3 de uma seqüência de linhagem germinativa, conforme descrito aqui. Em outra concretização, a cadeia leve pode compreender uma CDR1 e uma CDR2 de um anti
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43/176 corpo independentemente selecionado de 3.1.1, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1,
23.28.1 L-C92A, 23.29.1 e 24.2.1 ou regiões CDR, cada uma tendo menos de 8, menos de 6, menos de 4 ou menos de 3 substituições conservativas de aminoácidos e/ou um total de três ou menos substituições não-conservativas de aminoácidos. Em outras concretizações, a cadeia leve do anticorpo anti-CD40 compreende pelo menos a CDR2 da cadeia leve e também pode compreender as regiões CDR1 e CDR3, cada uma das quais é independentemente selecionada das regiões CDR1 e CDR3 de um anticorpo tendo uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOS: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94 ou 100 ou codificada por uma molécula de ácido nucléico selecionada de SEQ ID NOS: 3, 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 93 ou 99.
[00122] Com relação à cadeia pesada, em algumas concretizações, a região variável da seqüência de aminoácidos da cadeia pesada é codificada, em parte, pelo gene Vh3-30+, Vh4-59, Vh1-02, Vh4.35 ou Vh3-30.3. Em algumas concretizações, a Vh do anticorpo anti-CD40 contém uma ou mais substituições, deleções ou inserções (adições) de aminoácidos com relação à seqüência de aminoácidos da linhagem germinativa. Em algumas concretizações, o domínio variável da cadeia pesada compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18 mutações da seqüência de aminoácido da linhagem germinativa. Em algumas concretizações, a(s) mutação(ões) é(são) nãoconservativa(s), comparado à seqüência de aminoácidos da linhagem germinativa. Em algumas concretizações, as mutações estão nas regiões CDR da cadeia pesada. Em algumas concretizações, as trocas de aminoácidos são feitas em uma ou mais das mesmas posições que as mutações da linhagem germinativa em qualquer uma ou mais das Vh dos anticorpos 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 7.1.2,
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10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1 H-C109A, 23.5.1, 23.25.1,
23.28.1, 23.28.1 H-D16E, 23.29.1 e 24.2.1. Em outras concretizações, as alterações de aminoácidos são em uma ou mais das mesmas posições, mas envolvem uma mutação diferente daquela no anticorpo de referência.
[00123] Em algumas concretizações, a cadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácidos do domínio variável (Vh) do anticorpo
3.1.1 (SEQ ID NO: 2), 3.1.1H-A78T (SEQ ID NO: 90), 3.1.1 H-A78TV88A-V97A (SEQ ID NO: 92), 7.1.2 (SEQ ID NO: 10), 10.8.3 (SEQ ID NO: 18), 15.1.1 (SEQ ID NO: 26), 21.2.1 (SEQ ID NO: 34), 21.2.1 (SEQ ID NO: 42), 22.1.1 (SEQ ID NO: 50), 22.1.1H-C109A (SEQ ID NO: 96), 23.5.1 (SEQ ID NO: 58), 23.28.1 (SEQ ID NO: 66), 23.28.1 HD16E (SEQ ID NO: 98), 23.29.1 (SEQ ID NO: 74) e 24.2.1 (SEQ ID NO: 82) ou a referida seqüência de aminoácidos tendo até 1,2,3, 4, 6, 8 ou 10 substituições conservativas de aminoácidos e/ou um total de até 3 substituições não-conservativas de aminoácidos.
[00124] Em algumas concretizações, a cadeia pesada compreende as regiões CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada do anticorpo 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1 H-A78T-V88A-V97A, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1,
21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1 HD16E, 23.29.1 e 24.2.1 (como mostradp nas figuras 1D-1H ou 2D-2H) ou as referidas regiões CDR têm, cada uma, menos de 8, menos de 6, menos de 4 ou menos de 3 substituições conservativas de aminoácidos e/ou um total de três ou menos substituições não-conservativas de aminoácidos.
[00125] Em algumas concretizações, a cadeia pesada compreende uma CDR3 e também pode compreender as regiões CDR1 e CDR2 de uma seqüência de linhagem germinativa, como descrito acima, ou pode compreender uma CDR1 ou CDR2 de um anticorpo, cada uma das quais é independentemente selecionada de um anticorpo tendo uma
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45/176 cadeia pesada de um anticorpo selecionado de 3.1.1, 3.1.1 H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1 H-D16E, 23.29.1 e
24.2.1. Em outra concretização, a cadeia pesada compreende uma CDR3 e também pode compreender as regiões CDR1 e CDR2, cada uma das quais é independentemente selecionada de uma região CDR1 e CDR2 de uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOS: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 ou 98 (conforme mostrado nas Figuras 1D-1H ou Figuras 2D-2H) ou codificada por uma seqüência de ácido nucléico selecionada de SEQ ID NOS: 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 91, 95 ou 97. Em outra concretização, o anticorpo compreende uma cadeia pesada conforme divulgado acima e uma cadeia leve conforme divulgado acima.
[00126] Um tipo de substituição de aminoácido que pode ser feita é trocar uma ou mais cisteínas no anticorpo, as quais podem ser quimicamente reativas, por outro resíduo, tal como, sem limitação, alanina ou serina. Em outra concretização, a substituição de cisteína é feita em uma região de rede de um domínio variável ou no domínio constante de um anticorpo. Em outra concretização, a cisteína está em uma região não-canônica do anticorpo. Outro tipo de substituição de aminoácido que pode ser feita é trocar quaisquer locais proteolíticos potenciais no anticorpo, particularmente aqueles que estão em uma região de rede de um domínio variável, no domínio constante de um anticorpo ou em uma região não-canônica do anticorpo. A substituição de resíduos de cisteína e a remoção de locais proteolíticos podem diminuir o risco de qualquer heterogeneidade no produto de anticorpo e, assim, aumentar sua homogeneidade. Outro tipo de substituição de aminoácido é eliminar pares de asparagina-glicina, os quais formam locais de desamidação potenciais, através de alteração de um ou am
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46/176 bos os resíduos. Isso é feito, de preferência, em regiões de rede, no domínio constante ou nas regiões não-canônicas do anticorpo.
Ativação de CD40 pelo Anticorpo Anti-CD40 [00127] Outro aspecto da presente invenção envolve um anticorpo anti-CD40 que é um anticorpo de ativação, isto é, um agonista de CD40. Um anticorpo de ativação amplifica ou substitui os efeitos do CD40L sobre o CD40. Em algumas concretizações, o anticorpo de ativação é essencial mente um mímico de CD40L e compete com o CD40L pela ligação ao CD40. Em algumas concretizações, o anticorpo não compete com o CD40L pela ligação ao CD40, mas amplifica o efeito de ligação do CD40L ao CD40. Em algumas concretizações, o anticorpo anti-CD40 ativa o CD40 na presença ou ausência de CD40L. Inibição do Desenvolvimento de Tumor in vivo pelos Anticorpos Anti-CD40 [00128] De acordo com algumas concretizações, a invenção proporciona um anticorpo anti-CD40 que inibe a proliferação de células tumorígenas in vitro ou o desenvolvimento do tumor in vivo.
[00129] Em algumas concretizações, o anticorpo inibe o desenvolvimento de tumor em pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%. Em algumas concretizações, o anticorpo inibe o desenvolvimento do tumor em 75%. Em uma concretização, a inibição do desenvolvimento do tumor é detectável 14 dias após o tratamento inicial com o anticorpo. Em outras concretizações, a inibição do desenvolvimento de tumor é detectável 7 dias após o tratamento inicial com o anticorpo. Em algumas concretizações, outro agente antineoplásico é administrado ao animal com o anticorpo anti-CD40. Em algumas concretizações, o agente antineoplásico ainda inibe o desenvolvimento de tumor. Em algumas concretizações, o agente antineoplásico é adriamicina ou taxol. Em algumas concretizações, a co-administração de um agente antineoplásico e do anticorpo anti-CD40 inibe o desenvolvimento do
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47/176 tumor em pelo menos 50%, após um período de 22-24 dias a partir de início de tratamento, comparado ao desenvolvimento de tumor em um animal não tratado.
Indução de Apoptose pelos Anticorpos Anti-CD40 [00130] Outro aspecto da invenção proporciona um anticorpo antiCD40 que induz a morte celular de células CD40 positivas. Em algumas concretizações. O anticorpo causa apoptose de células CD40 positivas in vivo ou in vitro.
Intensificação da Expressão de Moléculas na Superfície Celular [00131] Em algumas concretizações, o anticorpo anti-CD40 intensifica a expressão de moléculas na superfície de células B incluindo, mas não limitado a, ICAM, MHC-II, B7-2, CD71, CD23 e CD83. Em algumas concretizações, 1 μς/ΓηΙ do anticorpo intensifica a expressão da ICAM em um ensaio de super-regulação de moléculas na superfície de células B com sangue íntegro em pelo menos 2 vezes ou mais preferivelmente em pelo menos 4 vezes. Em algumas concretizações, 1 pg/ml do anticorpo intensifica a expressão de MHC-II em um ensaio de super-regulação de moléculas na superfície de células B com sangue íntegro em pelo menos 2 vezes ou mais preferivelmente em pelo menos 3 vezes. Em algumas concretizações, 1 μg/ml do anticorpo intensifica a expressão do CD23 em um ensaio de super-regulação de moléculas na superfície de células B com sangue íntegro em pelo menos 2 vezes ou mais preferivelmente em pelo menos 5 vezes. Veja, por exemplo, Exemplo VII, Tabela 25.
[00132] Em algumas concretizações, o anticorpo anti-CD40 intensifica a expressão de moléculas da superfície de células dendríticas incluindo, mas não limitado a, MHC-II, ICAM, B7-2, CD83 e B7-1. Em algumas concretizações, a faixa de super-regulação é similar à faixa de super-regulação observada em células B. Veja, por exemplo, Tabelas 25 e 26 infra. Em algumas concretizações, o anticorpo super
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48/176 regula, de preferência, a expressão de moléculas da superfície de células dendríticas, tais como B7-2 e MHC-II, comparado à expressão dessas moléculas em células B. Veja, por exemplo, Tabela 27.
Intensificação da Secreção de Citocinas Celulares [00133] Em algumas concretizações, o anticorpo intensifica a secreção celular de citocinas incluindo, mas não limitado a, IL-8, IL-12, IL-15, IL-18e IL-23.
[00134] Em algumas concretizações, o anticorpo intensifica a secreção de citocina em células dendríticas e monócitos aderentes. Em algumas concretizações, a produção de citocina é ainda intensificada pela co-estimulação com um ou mais LPS, IFN-γ ou IL-1 β. Em ainda outro aspecto da invenção, o anticorpo com co-estimulação por LPS intensifica a produção de IL-12p70 em um ensaio com células dendríticas com uma EC50 de cerca de 0,48 pg/ml. Em algumas concretizações, o anticorpo intensifica a produção de IL-12p40 em células dendríticas com uma EC50 de cerca de 0,21 gg/ml. (Veja, por exemplo, Exemplo VIII).
[00135] Em algumas concretizações, o anticorpo intensifica a secreção de IFN-gama em células T em um ensaio com células dendríticas/células T alogênicas, conforme descrito no Exemplo VIII. Em algumas concretizações, o anticorpo intensifica a secreção de IFN-gama em um ensaio com células dendríticas/células T alogênicas com uma EC50 de cerca de 0,3 pg/ml. Em algumas concretizações, o anticorpo intensifica a secreção de IFN-gama em um ensaio com células dendríticas/células T alogênicas com uma EC50 de cerca de 0,2 gg/ml. Em uma concretização, o anticorpo intensifica a secreção de IFN-gama em um ensaio com células dendríticas/células T alogênicas com uma EC50 de cerca de 0,03 pg/ml.
Métodos de Produção de Anticorpos e Linhagens de Células que Produzem Anticorpo
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Imunização [00136] Em algumas concretizações, anticorpos humanos são produzidos através de imunização de um animal não-humano compreendendo em seu genoma algum ou todos os locais de cadeia leve e cadeia pesada de uma imunoglobulina humana com um antígeno ao CD40. Em uma concretização preferida, o animal não-humano é um animal XenoMouse®.
[00137] Camundongos XenoMouse® são cepas de camundongos manipulados que compreendem grandes fragmentos de locais de cadeia leve e cadeia pesada de imunoglobulinas humanas e são deficientes na produção de anticorpos de camundongo. Veja, por exemplo, Green e outros, Nature Genetics 7: 13-21 (1994) e Patentes U.S. 5.916.771, 5.939.598, 5.985.615, 5.998.209, 6.075.181, 6.091.001, 6.114.598, 6.130.364, 6.162.963 e 6.150.584. Veja também WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096, WO 96/33735, WO 98/16654, WO 98/24893, WO 98/50433, WO 99/45031, WO 99/53049, WO 00/09560 e WO 00/037504.
[00138] Em outro aspecto, a invenção proporciona um método para fazer anticorpos anti-CD40 a partir de animais não-humanos nãocamundongos através de imunização de animais transgênicos nãohumanos que compreendem um local de imunoglobulina humana com um antígeno ao CD40. Pode-se produzir tais animais usando-se os métodos descritos nos documentos citados acima. Os métodos divulgados nesses documentos podem ser modificados, conforme descrito na Patente U.S. 5.994.619. Em concretizações preferida, os animais não-humanos são ratos, ovelha, porcos, bezerros, gado ou cavalos.
[00139] Os camundongos XenoMouse® produzem um repertório humano semelhante a adulto de anticorpos totalmente humanos e geram anticorpos humanos antígeno-específicos. Em algumas concretizações, os camundongos XenoMouse® contêm aproximadamente
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80% do repertório do gene V do anticorpo humano através de introdução de fragmentos do cromossoma artificial de levedo (YAC) com configuração de linhagem germinativa, dimensionado para megabase ao local da cadeia pesada e ao local da cadeia leve kappa humanas. Veja Mendez e outros, Nature Genetics 15: 146-156 (1997), Green e Jakobovits, J. Exp. Med. 188: 483-495 (1998) e WO 98/24893, as descrições dos quais são aqui incorporadas por referência.
[00140] Em algumas concretizações, o animal não-humano compreendendo genes da imunoglobulina humana são animais que têm um minilocal de imunoglobulina humana. Na abordagem com minilocal, um local de Ig exógena é imitado através de infusão de genes individuais do local da Ig. Assim, um ou mais genes Vh, um ou mais genes Dh, um ou mais genes Jh, um domínio constante mu e um segundo domínio constante (de preferência um domínio constante gama), são formados em um constructo para inserção em um animal. Essa abordagem é descrita, inter alia, nas Patentes U.S. N°. 5.545.807, 5.545.806, 5.569.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.016, 5.770.429, 5.789.650, 5.814.318, 5.591.669, 5.612.205, 5.721.367, 5.789.215 e 5.643.763, aqui incorporadas por referência.
[00141] Uma vantagem da abordagem com minilocal e a rapidez com a qual estruturas incluindo porções do local da Ig podem ser geradas e introduzidas nos animais. Contudo, uma desvantagem potencial da abordagem com minilocal é que não há diversidade de imunoglobulina suficiente para suportar o desenvolvimento de células B totais, de modo que pode existir menor produção de anticorpo.
[00142] Em outro aspecto, a invenção proporciona um método para fazer anticorpos anti-CD40 humanizados. Em algumas concretizações, animais não-humanos são imunizados com um antígeno ao CD40, conforme descrito abaixo, sob condições que permitem a produção de anticorpo. Células que produzem anticorpo são isoladas dos animais,
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51/176 fundidas com mielomas para produzir hibridomas e os ácidos nucléicos que codificam as cadeias pesada e leve de um anticorpo antiCD40 de interesse são isoladas. Esses ácidos nucléicos são, subseqüentemente, manipulados usando-se métodos conhecidos por aqueles versados na técnica e conforme ainda descrito abaixo, para reduzir a quantidade de seqüências não humanas, isto é, para humanizar o anticorpo a fim de reduzir a resposta imune em seres humanos.
[00143] Em algumas concretizações preferidas, o antígeno ao CD40 é CD40 isolado e/ou purificado. Em uma concretização preferida, o antígeno ao CD40 é CD40 humano. Em algumas concretizações, o antígeno ao CD40 é um fragmento de CD40. Em algumas concretizações, o fragmento de CD40 é o domínio extracelular do CD40. Em algumas concretizações, o fragmento de CD40 compreende pelo menos um epitopo de CD40. Em outras concretizações, o antígeno ao CD40 é uma célula que expressa ou superexpressa o CD40 ou um fragmento imunogênico do mesmo sobre sua superfície. Em algumas concretizações, o antígeno ao CD40 é uma proteína de fusão CD40.
[00144] A imunização de animais pode ser feita através de qualquer método conhecido na técnica. Veja, por exemplo, Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990. Métodos para a imunização de animais não-humanos, tais como camundongos, ratos, ovelha, bezerros, porcos, gado e cavalos são bem-conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Harlow e Lane, supra e Patente U.S. 5.994.619. Em uma concretização preferida, o antígeno ao CD40 é administrado com um adjuvante a fim de estimular a resposta imune. Adjuvantes exemplificativos incluem adjuvante completo ou incompleto de Freund, RIBI (dipeptídeos de muramila) ou ISCOM (complexos de imunoestimulação). Tais adjuvantes podem proteger o polipeptídeo contra dispersão rápida através de captura do mesmo em um depósito local ou eles podem conter substâncias que estimulam o
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52/176 hospedeiro a secretar fatores que são quimiotáticos para macrófagos e outros componentes do sistema imune. De preferência, se um polipeptídeo estiver sendo administrado, o esquema de imunização envolverá duas ou mais administrações do polipeptídeo, dispersas ao longo de várias semanas.
[00145] O Exemplo I descreve a produção de anticorpos anti-CD40 monoclonais.
Produção de Anticorpos e Linhagens de Células que Produzem Anticorpo [00146] Após imunização de um animal com um antígeno ao CD40, anticorpos e/ou células que produzem anticorpos podem ser obtidas do animal. Em algumas concretizações, soro contendo anticorpo antiCD40 é obtido do animal através de coleta do sangue ou sacrifício do animal. O soro pode ser usado à medida que ele é obtido do animal, uma fração de imunoglobulina pode ser obtida do soro ou os anticorpos anti-CD40 podem ser purificados do soro. É bem-conhecido por aqueles versados na técnica que o soro ou imunoglobulinas obtidos dessa maneira serão policlonais. A desvantagem do uso de anticorpos policlonais preparados a partir do soro é que a quantidade de anticorpos que pode ser obtida é limitada e o anticorpo policlonal tem uma série de propriedades heterogêneas.
[00147] Em algumas concretizações, linhagens de células imortalizadas que produzem anticorpo são preparadas a partir de células isoladas do animal imunizado. Após imunização, o animal é sacrificado e células B esplênicas e/ou do nódulo linfático são imortalizadas. Métodos de imortalização de células incluem, mas não estão limitados a, transferência das mesmas com oncogenes, inflexão das mesmas com o vírus oncogênico, cultura das mesmas sob condições que selecionam células imortalizadas, sujeição das mesmas a compostos carcinogênicos ou mutacionais, fusão das mesmas com uma célula imorta
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53/176 lizada, por exemplo, uma célula de mieloma e inativação de um gene supressor de tumor. Veja, por exemplo, Harlow e Lane, supra. Se a fusão com células de mieloma for usada, as células de mieloma, de preferência, não secretam polipeptídeos de imunoglobulina (uma linhagem de células não-secretórias). Células imortalizadas são selecionadas usando-se CD40, uma porção do mesmo ou uma célula expressando o CD40. Em uma concretização preferida, a seleção inicial é realizada usando-se um imunoensaio enzima-ligado (ELISA) ou um radioimunoensaio. Em exemplo de seleção por ELISA é proporcionado no WO 00/37504, incorporado aqui por referência.
[00148] Células que produzem um anticorpo anti-CD40, por exemplo, hibridomas, são selecionadas, clonadas e ainda selecionadas com relação a características desejáveis, incluindo desenvolvimento robusto, elevada produção de anticorpo e características desejáveis do anticorpo, conforme discutido ainda abaixo. Hibridomas podem ser expandidos in vivo em animais singenéicos, em animais que carecem de um sistema imune, por exemplo, camundongos nus, ou em cultura de células in vitro. Métodos de seleção, clonagem e expansão de hibridomas são bem-conhecidos por aqueles versados na técnica.
[00149] Em uma concretização preferida, o animal imunizado é um animal não-humano que expressa genes de imunoglobulina humana e as células B esplênicas são fundidas a uma linhagem de células de mieloma da mesma espécie que o animal não-humano. Em uma concretização mais preferida, o animal imunizado é um animal XENOMOUSE® e a linhagem de células de mieloma é um mieloma de camundongo não-secretório. Em uma concretização ainda mais preferida, a linhagem de células de mieloma é P3-X63-AG8.653. Veja, por exemplo, Exemplo I.
[00150] Em outro aspecto, a invenção proporciona hibridomas que produzem um anticorpo anti-CD40 humano. Em uma concretização
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54/176 preferida, os hibridomas são hibridomas de camundongo, conforme descrito cima. Em outras concretizações, os hibridomas são produzidos em uma espécie não humana não-camundongo, tal como ratos, ovelha, porcos, bezerros, gado ou cavalos. Em outra concretização, os hibridomas são hibridomas humanos.
Ácidos Nucléicos, Vetores, Células Hospedeiras e Métodos Recombinantes de Fabricação dos Anticorpos [00151] Ácidos Nucléicos [00152] A presente invenção também abrange moléculas de ácido nucléico que codificam os anticorpo anti-CD40. Em algumas concretizações, diferentes moléculas de ácido nucléico codificam uma cadeia pesada e uma cadeia leve de uma imunoglobulina anti-CD40. Em outras concretizações, a mesma molécula de ácido nucléico codifica uma cadeia pesada e uma cadeia leve de uma imunoglobulina anti-CD40.
[00153] Em algumas concretizações, a molécula de ácido nucléico que codifica o domínio variável da cadeia leve compreende uma seqüência do gene Vk humano A3/A19 (DPK-15), L5 (DP5) ou A27 (DPK-22) ou uma seqüência derivada das mesmas. Em algumas concretizações, a molécula de ácido nucléico compreende uma seqüência de nucleotídeo de um gene Vk A3/A19 e um gene Jk1, Jk2 ou Jk3 ou seqüências derivadas dos mesmos. Em algumas concretizações, a molécula de ácido nucléico compreende uma seqüência de nucleotídeos de um gene Vk L5 e um gene Jk4. Em algumas concretizações, a molécula de ácido nucléico compreende uma seqüência de nucleotídeos de um gene Vk A27 e um gene Jk3.
[00154] Em algumas concretizações, a molécula de ácido nucléico que codifica a cadeia leve codifica uma seqüência de aminoácidos compreendendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 mutações da seqüência de aminoácido da linhagem germinativa. Em algumas concretizações, a molécula de ácido nucléico compreende uma seqüência de nucleotíPetíção 870190007041, de 23/01/2019, pág. 62/192
55/176 deo que codifica uma seqüência de aminoácido Vl compreendendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 substituições não-conservativas de aminoácidos e/ou 1, 2 ou 3 substituições não-conservativas, comparado à seqüência da linhagem germinativa. Substituições podem estar nas regiões CDR, nas regiões de rede ou no domínio constante.
[00155] Em algumas concretizações, a molécula de ácido nucléico que codifica o domínio variável da cadeia leve (Vl) codifica uma seqüência de aminoácido Vl compreendendo uma ou mais mutações, comparado à seqüência da linhagem germinativa que são idênticas às mutações encontradas na Vl de um dos anticorpos 3.1.1, 3.1.1L-L4ML83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1,
23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.29.1 e 24.2.1. Em algumas concretizações, a molécula de ácido nucléico codifica pelo menos três mutações de aminoácidos, comparado à seqüência da linhagem germinativa encontrada na Vl de um dos anticorpos 3.1.1, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2,
10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1,
23.28.1 L-C92A, 23.29.1 e 24.2.1.
[00156] Em algumas concretizações, a molécula de ácido nucléico compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica a seqüência de aminoácidos da Vl do anticorpo monoclonal 3.1.1 (SEQ ID NO: 4), 3.1.1L-L4M-L83V (SEQ ID NO: 94), 7.1.2 (SEQ ID NO: 12), 10.8.3 (SEQ ID NO: 20), 15.1.1 (SEQ ID NO: 28), 21.2.1 (SEQ ID NO: 36),
21.4.1 (SEQ ID NO: 44), 22.1.1 (SEQ ID NO: 52), 23.5.1 (SEQ ID NO: 60), 23.28.1 (SEQ ID NO: 68), 23.28.1 L-C92A (SEQ ID NO: 100),
23.29.1 (SEQ ID NO: 76) ou 24.2.1 (SEQ ID NO: 84) ou uma porção dos mesmos. Em algumas concretizações, a referida porção compreende pelo menos a região CDR3. Em algumas concretizações, o ácido nucléico codifica a seqüência de aminoácidos das CDRs de cadeia leve do referido anticorpo. Em algumas concretizações, a referida porção é uma porção contígua compreendendo CDR1-CDR3.
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56/176 [00157] Em algumas concretizações, a molécula de ácido nucléico compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica a seqüência de aminoácidos de uma das SEQ ID NOS: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94 ou 100 ou a referida seqüência carecendo da seqüência sinalizadora. Em algumas concretizações preferidas, a molécula de ácido nucléico compreende a seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NOS: 3, 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 93 ou 99 ou uma porção das mesmas, as referidas seqüências opcionalmente carecendo da seqüência sinalizadora.
[00158] Em algumas concretizações, a referida porção codifica uma região Vl. Em algumas concretizações, a referida porção codifica pelo menos a região CDR2. Em algumas concretizações, o ácido nucléico codifica a seqüência de aminoácidos das CDRs de cadeia leve do referido anticorpo. Em algumas concretizações, a referida porção codifica uma região contígua de CDR1-CDR3.
[00159] Em algumas concretizações, a molécula de ácido nucléico codifica uma seqüência de aminoácidos de Vl que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma seqüência de aminoácidos de Vl de qualquer um dos anticorpos 3.1.1, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1,
23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, um gene D1-1 humano e um gene Jh6 humano; um gene VH 3-30 + humano, 23.29.1L-R174K ou 24.2.1 ou uma cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64, 72, 80, 88, 94, 100 ou 102 ou uma cadeia leve compreendendo uma mutação, tal como uma divulgado aqui. Ainda, o ácido nucléico pode compreender a seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NOS: 7, 15, 23, 31, 39, 47, 55, 63, 71, 79 ou 87 ou uma molécula de ácido nucléico que codifica uma cadeia leve que compreende uma mutação, tal como uma divulgado aqui.
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57/176 [00160] Em outra concretização preferida, a molécula de ácido nucléico codifica o domínio variável da cadeia pesada (Vh) que compreende uma seqüência do gene Vh 3-30+, 4-59, 1-02, 4.35 ou 3-30.3 humano ou uma seqüência derivada dos mesmos. Em várias concretizações, a molécula de ácido nucléico compreende um gene Vh 3-30+ humano, um gene D4 (DIR3) e um gene Jh6 humano; um gene Vh 330+ humano, um gene D1-26 (DIR5) humano e um gene Jh6 humano; um gene Vh 4.35 humano, um gene DIR3 humano e um gene Jh6 humano; um gene Vh 4-59 humano, um gene D4-23 humano e um gene Jh4 humano; um gene Vh 1-20 humano, um gene DLR1 humano e um gene Jh4 humano; um gene Vh 3-30+ humano, um gene D6-19 (DIR3) humano e um gene Jh4 humano; um gene Vh 3-30+ humano, um gene D1-1 humano e um gene Jh6 humano; um gene VH 3-3- + humano um gene D4-17 humano e um gene Jh6 humano; um gene Vh 3-30.3 humano, um gene D4-17 humano e um gene Jh6 humano; um gene Vh 459 humano, um gene D4-17 (DIR1) humano e um gene Jh5 humano ou uma seqüência derivadas dos genes humanos.
[00161] Em algumas concretizações, a molécula de ácido nucléico codifica uma seqüência de aminoácidos compreendendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18 mutações de aminoácido comparado à seqüência de aminoácidos da linhagem germinativa dos genes V, D ou J humanos. Em algumas concretizações, as referidas mutações estão na região Vh. Em algumas concretizações, as referidas mutações estão nas regiões CDR.
[00162] Em algumas concretizações, a molécula de ácido nucléico codifica uma ou mais mutações de aminoácido comparado à seqüência da linhagem germinativa que são idênticas às mutações de aminoácidos encontradas na Vh do anticorpo monoclonal 3.1.1, 3.1.1HA78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1,
22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1 H-D16E,
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23.29.1 e 24.2.1. Em algumas concretizações, o ácido nucléico codifica pelo menos três mutações de aminoácidos comparado às seqüências da linhagem germinativa que são idênticas a pelo menos três mutações de aminoácidos encontradas em um dos anticorpos monoclonais acima listados.
[00163] Em algumas concretizações, a molécula de ácido nucléico compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica pelo menos uma porção da seqüência de aminoácidos Vh do anticorpo 3.1.1 (SEQ ID NO: 2), 3.1.1H-A78T (SEQ ID NO: 90), 3.1.1 H-A78T-V88A-V97A (SEQ ID NO: 92), 7.1.2 (SEQ ID NO: 10), 10.8.3 (SEQ ID NO: 18),
15.1.1 (SEQ ID NO: 26), 21.2.1 (SEQ ID NO: 34), 21.4.1 (SEQ ID NO: 42), 22.1.1 (SEQ ID NO: 50), 22.1.1H-C109A (SEQ ID NO: 96), 23.5.1 (SEQ ID NO: 58), 23.28.1 (SEQ ID NO: 66), 23.28.1 H-D16E (SEQ ID NO: 98), 23.29.1 (SEQ ID NO: 74) ou 24.2.1 (SEQ ID NO: 82) ou a referida seqüência tendo mutações conservativas de aminoácidos e/ou um total de três ou menos substituições não-conservativas de aminoácidos. Em várias concretizações, a seqüência codifica uma ou mais regiões CDR, de preferência uma região ODR3, todas as três regiões CDR, uma porção contígua incluindo CDR1-CDR3 ou a região Vh inteira, com ou sem uma seqüência sinalizadora.
[00164] Em algumas concretizações, a molécula de ácido nucléico compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica a seqüência de aminoácidos de uma das SEQ ID NOS: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 ou 98 ou a referida seqüência carecendo da seqüência sinalizadora. Em algumas concretizações preferidas, a molécula de ácido nucléico compreende pelo menos uma porção da seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1,9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 91, 95 ou 97 ou a referida seqüência carecendo da seqüência sinalizadora. Em algumas concretizações, a referida porção codifica a região Vh (com ou sem uma seqüência sinalizadora), uma
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59/176 região CDR3, todas as três regiões CDR ou uma região contígua incluindo CDR1-CDR3.
[00165] Em algumas concretizações, a molécula de ácido nucléico codifica uma seqüência de aminoácidos Vh que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% idêntica às seqüências de aminoácidos Vh mostradas nas FIGURAS 1A-1C ou 2A-2C ou a uma seqüência de aminoácidos Vh de qualquer uma das SEQ ID NOS: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 ou 98. As moléculas de ácido nucléico da invenção incluem ácidos nucléicos que se hibridizam sob condições altamente estringentes, tais como aquelas descritas acima, a uma seqüência de ácido nucléico que codifica a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 ou 98 ou que tem a seqüência de ácido nucléico de SEQ ID NOS: 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 91, 95 ou 97. A molécula de ácido nucléico da invenção inclui uma molécula de ácido nucléico que se hibridiza sob condições altamente estringentes, tais como aquelas descritas acima, a uma seqüência de ácido nucléico que codifica uma Vh, conforme descrito imediatamente acima.
[00166] Em outra concretização, o ácido nucléico codifica uma cadeia pesada de comprimento total de um anticorpo selecionado de
3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1,
21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1,
23.28.1 H-D16E, 23.29.1 e 24.2.1 ou uma cadeia pesada tendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 6, 14, 22, 30, 38, 46, 54, 62, 70, 78 ou 86 ou uma cadeia pesada compreendendo uma mutação, tal como uma das mutações discutidas aqui. Ainda, o ácido nucléico pode compreender a seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NOS: 5, 13, 21, 29, 37, 45, 53, 61, 69, 77, 85 ou 89 ou uma molécula de ácido nucléico que codifica uma cadeia pesada compreendendo uma mutação, tal como uma das mutações discutidas aqui.
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60/176 [00167] Uma molécula de ácido nucléico que codifica a cadeia leve ou pesada inteira de um anticorpo anti-CD40 ou porções do mesmo pode ser isolada de qualquer fonte que produz tal anticorpo. Em várias concretizações, as moléculas de ácido nucléico são isoladas de uma célula B isolada de um animal imunizado com CD40 ou de uma célula imortalizada derivada de tal célula B que expressa um anticorpo antiCD40. Métodos de isolamento de mRNA que codifica um anticorpo são bem-conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Sambrook e outros. O mRNA pode ser usado para produzir cDNA para uso na reação em cadeia de polimerase (PCR) ou clonagem de cDNA de genes de anticorpo. Em uma concretização preferida, a molécula de ácido nucléico é isolada de um hibridoma que tem como um de seus parceiros de fusão uma célula que produz imunoglobulina humana de um animal transgênico não-humano. Em uma concretização ainda mais preferida, a célula que produz imunoglobulina humana é isolada de um animal XenoMouse®. Em outra concretização, a célula que produz imunoglobulina humana é de um animal transgênico não-humano não camundongo, conforme descrito acima. Em outra concretização, o ácido nucléico é isolado de um animal não-humano não transgênico. As moléculas de ácido nucléico isoladas de um animal não-humano, nãotransgênico podem ser usadas, por exemplo, para anticorpos humanizados.
[00168] Em algumas concretizações, um ácido nucléico que codifica uma cadeia pesada de um anticorpo anti-CD40 da invenção pode compreender uma seqüência de nucleotídeo que codifica um domínio Vh da invenção unido em-rede a uma seqüência de nucleotídeo que codifica um domínio constante de cadeia pesada de qualquer fonte. Similarmente, uma molécula de ácido nucléico que codifica uma cadeia leve de um anticorpo anti-CD40 da invenção pode compreender uma seqüência de nucleotídeo que codifica um domínio Vl da inven
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61/176 ção unido em-rede a uma seqüência de nucleotídeo que codifica um domínio constante de cadeia leve de qualquer fonte.
[00169] Em um outro aspecto da invenção, moléculas de ácido nucléico que codificam o domínio variável das cadeias pesada (Vh) e leve (Vl) são convertidas aos genes de anticorpo de comprimento total. Em uma concretização, moléculas de ácido nucléico que codificam os domínios Vh ou Vl são convertidas aos genes de anticorpo de comprimento total através de inserção em um vetor de expressão que já codifica os domínios constantes de cadeia pesada ou de cadeia leve, respectivamente, de modo que o segmento Vh está operativamente ligado ao(s) segmento(s) Ch dentro do vetor e o segmento Vl está operativamente ligado ao(s) segmento(s) Cl dentro do vetor. Em outra concretização, moléculas de ácido nucléico que codificam os domínios Vh e/ou Vl são convertidas em genes de anticorpo de comprimento total através de ligação, por exemplo, de uma molécula de ácido nucléico que codifica os domínios Vh e/ou Vl a uma molécula de ácido nucléico que codifica um domínio Ch e/ou Cl usando-se técnicas padrão de biologia molecular. Seqüências de ácido nucléico de genes dos domínios constantes de imunoglobulina de cadeias pesada e leve humanas são conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, Kabat e outros, Sequences of Proteins of Immunoloqical Interest, 5a ed., NIH Publ. No. 91-3242, 1991. Moléculas de ácido nucléico que codificam as cadeias pesada e/ou leve de comprimento total podem, então, ser expressas a partir de uma célula na qual elas tenham sido introduzidas e o anticorpo anti-CD40 isolado.
[00170] As moléculas de ácido nucléico podem ser usadas para expressar recombinantemente grandes quantidades de anticorpos antiCD40. As moléculas de ácido nucléico também podem ser usadas para produzir anticorpos quiméricos, anticorpos biespecíficos, anticorpos com cadeia simples, imunoadesinas, diacorpos, anticorpos com mutaPetíção 870190007041, de 23/01/2019, pág. 69/192
62/176 ção e derivados de anticorpos, conforme ainda descrito abaixo. Se as moléculas de ácido nucléico são derivadas de um animal não-humano não-transgênico, as moléculas de ácido nucléico podem ser usadas para humanização de anticorpos, conforme também descrito abaixo. [00171] Em outra concretização, uma molécula de ácido nucléico da invenção é usada como uma sonda ou iniciador de PCR para uma seqüência de anticorpo específica. Por exemplo, o ácido nucléico pode ser usado como uma sonda em métodos diagnósticos ou como um prímero de PCR para amplificar regiões de DNA que poderíam ser usadas, inter alia, para isolar moléculas de ácido nucléico adicionais que codificam os domínios variáveis de anticorpos anti-CD40. Em algumas concretizações, as moléculas de ácido nucléico são oligonucleotídeos. Em algumas concretizações, os oligonucleotídeos são de regiões altamente variáveis das cadeias pesada e leve do anticorpo de interesse. Em algumas concretizações, os oligonucleotídeos codificam todas ou parte de uma ou mais das CD Rs do anticorpo 3.1.1, 3.1.1 HA78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3,
15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1,
23.28.1, 23.28.1 H-D16E, 23.28.1 L-C92A, 23.29.1 ou 24.2.1.
Vetores [00172] A invenção proporciona vetores compreendendo moléculas de ácido nucléico que codificam a cadeia pesada de um anticorpo antiCD40 da invenção ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo. A invenção também proporciona vetores compreendendo moléculas de ácido nucléico que codificam a cadeia leve de tais anticorpos ou porção de ligação a antígeno dos mesmos. A invenção ainda proporciona vetores compreendendo moléculas de ácido nucléico que codificam proteínas de fusão, anticorpos modificados, fragmentos de anticorpos e sondas dos mesmos.
[00173] Em algumas concretizações, os anticorpos anti-CD40 ou
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63/176 porções de ligação a antígeno dos mesmos da invenção são expressos através de inserção de DNAs que codificam cadeias leves e pesadas parciais ou de comprimento total, obtidas conforme descrito acima, em vetores de expressão de modo que os genes são operativamente ligados a seqüências de controle de expressão necessárias, tais como seqüências de controle de transcrição e tradução. Vetores de expressão incluem plasmídeos, retrovírus, adenovírus, vírus adenoassociados (AAV), vírus de plantas, tais como vírus mosaico da couveflor, vírus mosaico do tabaco, cosmídeos, YACs, epissomas derivados de EBV e semelhantes. O gene de anticorpo é ligado em um vetor de modo que seqüências de controle de transcrição e tradução dentro do vetor servem à sua função pretendida de regulação da transcrição e tradução do gene do anticorpo. O vetor de expressão e as seqüências de controle de expressão são escolhidos para serem compatíveis com a célula hospedeira usada. O gene da cadeia leve do anticorpo e o gene da cadeia pesada do anticorpo podem ser inseridos em vetores distintos. Em uma concretização preferida, ambos os genes são inseridos no mesmo vetor de expressão. Os genes de anticorpo são inseridos no vetor de expressão por meio de métodos padrão (por exemplo, ligação de locais de restrição complementares sobre o fragmento do gene de anticorpo e vetor ou ligação à extremidade cega se nenhum local de restrição estiver presente).
[00174] Um vetor conveniente é um que codifica uma seqüência de imunoglobulina Ch ou Cl humana funcionalmente completa, com locais de restrição apropriados manipulados de modo que qualquer seqüência Vl ou Vh possa ser facilmente inserida e expressa, conforme descrito acima. Em tais vetores, a divisão usualmente ocorre entre o local doador dividido na região J inserida e o local aceitador dividido precedendo o domínio C humano e também nas regiões divididas que ocorrem dentro dos éxons Ch humanos. A poliadenilação e término de
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64/176 transcrição ocorrem em locais cromossômicos nativos a jusante das regiões de codificação. O vetor de expressão recombinante também pode codificar um peptídeo sinalizador que facilita a secreção da cadeia do anticorpo a partir de uma célula hospedeira. O gene da cadeia do anticorpo pode ser clonado no vetor de modo que o peptídeo sinalizador está ligado em-rede ao amino-término da cadeia de imunoglobulina. O peptídeo sinalizador pode ser um peptídeo sinalizador de imunoglobulina ou um peptídeo sinalizador heterólogo (isto é, um peptídeo sinalizador de uma proteína não-imunoglobulina).
[00175] Além dos genes da cadeia de anticorpo, os vetores de expressão recombinantes da invenção trazem seqüências regulatórias que controlam a expressão dos genes da cadeia do anticorpo em uma célula hospedeira. Será apreciado por aqueles versados na técnica que o modelo do vetor de expressão, incluindo a seleção de seqüências regulatórias, pode depender de fatores, tais como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão de proteína desejado, etc. Seqüências regulatórias preferidas para expressão de células de mamífero incluem elementos virais que direcionam altos níveis de expressão de proteína em células de mamíferos, tais como promotores e/ou intensificadores derivados de LTRs retrovirais, citomegalovírus (CMV) (tais como o promotor/intensificador de CMV), Vírus Simian 40 (SV40) (tal como o promotor/intensificador de SV40), adenovírus (por exemplo, o promotor tardio principal de adenovírus (AdMLP)), polioma e promotores fortes de mamífero, tais como imunoglobulinas nativas e promotores de actina. Para outra descrição de elementos regulatórios virais e seqüências dos mesmos veja, por exemplo, Patente U.S. No. 5.168.062, Patente U.S. No. 4.510.245 e Patente U.S. No. 4.968.615. Métodos para expressão de anticorpos em vegetais, incluindo uma descrição de promotores e vetores, bem como transformação de plantas são conhecidos na técnica. Veja, por
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65/176 exemplo, Patente dos Estados Unidos 6.517.529, aqui incorporada por referência. Métodos de expressão de polipeptídeos em células bacterianas ou células fúngicas, por exemplo, células de levedo, também são bem-conhecidos na técnica.
[00176] Além dos genes de cadeias de anticorpo e seqüências regulatórias, os vetores de expressão recombinante da invenção podem trazer seqüências adicionais, tais como seqüências que regulam a replicação do vetor em células hospedeiras (por exemplo, origens de replicação) e genes marcadores selecionáveis. O gene marcador selecionável facilita a seleção de células hospedeiras nas quais o vetor tenha sido introduzido (veja, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 4.399.216, 4.634.665 e 5.179.017). Por exemplo, tipicamente, o gene marcador selecionável confere resistência a drogas, tais como G418, higromicina ou metotrexato, sobre uma célula hospedeira na qual o vetor tenha sido introduzido. Genes marcadores selecionáveis preferidos incluem o gene da reductase de dihidrofolato (DHFR) (para uso em células dhfr-hospedeiras com seleção/amplificação por metotrexato), o gene neo (para seleção por G418) e o gene de glutamato sintetase.
Células Hospedeiras de Não Hibridoma e Métodos de Produção Recombinante de Proteína [00177] As moléculas de ácido nucléico que codificam os anticorpos anti-CD40 e vetores compreendendo essas moléculas de ácido nucléico podem ser usadas para a transfecção de células hospedeiras de mamífero, vegetais, bacterianas ou de levedo adequadas. A transformação pode ser através de qualquer método conhecido para introdução de polinucleotídeos em uma célula. Métodos para a introdução de polinucleotídeos heterólogos em células de mamífero são bemconhecidos na técnica e incluem transfecção mediada por dextrano, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção mediada por polibreno, fusão de protoplasto, eletroporação, encapsulação do(s) polinucleotí
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66/176 deo(s) em lipossomas e microinjeção direta de DNA no núcleo. Além disso, moléculas de ácido nucléico podem ser introduzidas em células de mamíferos através de vetores virais. Métodos de transformação de células são bem-conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 4.399.216, 4.912.040, 4.740.461 e 4.959.455 (patentes as quais são incorporadas aqui por referência). Métodos de transformação de células vegetais são bem-conhecidos na técnica incluindo, por exemplo, transformação mediada por Agrobacterium, transformação biolística, injeção direta, eletroporação e transformação viral. Métodos de transformação de células bacterianas e de levedo também são bem-conhecidos na técnica.
[00178] Linhagens de células de mamífero disponíveis como hospedeiros para expressão são bem-conhecidas na técnica e incluem muitas linhagens de células imortalizadas disponíveis da American Type Culture Collection (ATCC). Essas incluem, inter alia, células de ovário de hâmster Chinês (CHO), NSO, células SP2, células HeLa, células de rim de hâmster bebê (BHK), células renais de macaco (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por exemplo, Hep G2), células A549 e uma série de outras linhagens de células. Linhagens de células de preferência particular são selecionadas através de determinação de quais linhagens de células têm altos níveis de expressão. Outras linhagens de células que podem ser usadas são linhagens de células de inseto, tais como células Sf9. Quando vetores de expressão recombinante que codificam genes de anticorpo são introduzidos em células hospedeiras de mamífero, os anticorpos são produzidos através de cultura das células hospedeiras durante um período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou, mais preferivelmente, secreção do anticorpo no meio de cultura no qual as células hospedeiras são desenvolvidas. Os anticorpos podem ser recuperados do meio de cultura usando-se
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67/176 métodos padrão de purificação de proteína. Células hospedeiras vegetais incluem, por exemplo, Nicotiana, Arabidopsis, lentilha d'água, milho, trigo, batata, etc. Células hospedeiras bacterianas incluem E. Coli e as espécies Streptomyces. Células hospedeiras de levedo incluem Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris.
[00179] Ainda, a expressão dos anticorpos da invenção (ou outras metades dos mesmos) a partir de linhagens de células de produção pode ser intensificada usando-se uma série de técnicas conhecidas. Por exemplo, o sistema de expressão do gene da sintetase de glutamina (o sistema GS) é uma abordagem comum para intensificação da expressão sob determinadas condições. O sistema GS é discutido, no todo ou em parte, com relação às Patentes Européias Nos. 0 216 846, 0 256 055 e 0 323 997 e no Pedido de Patente Européia No. 89303964.4.
[00180] É provável que os anticorpos expressos por diferentes linhagens de células ou em animais transgênicos tenham diferente glicosilação uns dos outros. Contudo, todos os anticorpos codificados pelas moléculas de ácido nucléico proporcionadas aqui ou compreendendo as seqüências de aminoácidos proporcionadas aqui são parte da presente invenção, a despeito da glicosilação dos anticorpos.
Animais e plantas transgênicos [00181] Os anticorpos anti-CD40 da invenção também podem ser produzidos transgenicamente através da geração de um mamífero ou planta que é transgênico para as seqüências das cadeias pesada e leve de imunoglobulina de interesse e a produção do anticorpo em uma forma recuperável a partir dos mesmos. Com relação à produção transgênica em mamíferos, os anticorpos anti-CD40 podem ser produzidos e recuperados do leite de cabras, vacas ou outros mamíferos. Veja, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 5.827.690, 5.756.687,
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5.750.172 e 5.741.957. Em algumas concretizações, animais transgênicos não-humanos que compreendem um local de imunoglobulina humana são imunizados com CD40 ou uma porção imunogênica do mesmo, conforme descrito acima. Métodos para a fabricação de anticorpos em plantas são descritos, por exemplo, nas Patentes US 6.046.037 e 5.959.177.
[00182] Em algumas concretizações, animais transgênicos nãohumanos ou plantas são produzidos através de introdução de uma ou mais moléculas de ácido nucléico que codificam um anticorpo antiCD40 da invenção no animal ou planta por meio de técnicas transgênicas padrão. Veja Hogan e Patente dos Estados Unidos 6.417.429, supra. As células transgênicas usadas para se fazer o animal transgênico podem ser células do tronco embriônico ou células somáticas. Os organismos não-humanos transgênicos podem ser quiméricos, nãoquiméricos, heterozigotos e homozigotos não quiméricos. Veja Hogan e outros, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson e outros, Mouse Genetics and Transqenics: A Practical Approach, Oxford University Press (2000); e Pinkert, Transqenic Animal Technoloqy: A Laboratory Handbook, Academic Press (1999). Em algumas concretizações, os animais não-humanos transgênicos têm uma ruptura e substituição objetivadas através de objetivação de uma estrutura que codifica uma cadeia pesada e/ou uma cadeia leve de interesse. Em uma concretização preferida, os animais transgênicos compreendem e expressam moléculas de ácido nucléico que codificam as cadeias pesada e leve que se ligam especificamente ao CD40, de preferência CD40 humano. Em algumas concretizações, os animais transgênicos compreendem moléculas de ácido nucléico que codificam um anticorpo modificado, tal como um anticorpo com cadeia simples, um anticorpo quimérico ou um anticorpo humanizado. Os anticorpos anti-CD40 podem ser feitos em
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69/176 qualquer animal transgênico. Em uma concretização preferida, os animais não-humanos são camundongos, ratos, ovelhas, porcos, bezerros, gado ou cavalos. O animais não-humano transgênico expressa os referidos polipeptídeo codificados no sangue, leite, urina, saliva, lágrimas, mucos e outros fluidos corporais.
Bibliotecas de Visualização de Fago [00183] A invenção proporciona um método para a produção de um anticorpo anti-CD40 ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo compreendendo as etapas de síntese de uma biblioteca de anticorpos humanos sobre um fago, seleção da biblioteca com um CD40 ou uma porção do mesmo, isolamento do fago que se liga ao CD40 e obtenção do anticorpo do fago. À guisa de exemplo, um método para a preparação da biblioteca de anticorpos para uso nas técnicas de visualização de fago compreende as etapas de imunização de um animal nãohumano compreendendo um local de imunoglobulina humana com CD40 ou uma porção antigênica do mesmo para criar uma resposta imune, extração de células que produzem anticorpo do animal imunizado; isolamento do RNA das células extraídas, transcrição reversa do RNA para produzir cDNA, amplificação do cDNA usando-se um prímero e inserção do cDNA em um vetor de visualização de fago, de modo que os anticorpos são expressos sobre o fago. Os anticorpos antiCD40 recombinantes da invenção podem ser obtidos dessa forma.
[00184] Os anticorpos anti-CD40 humanos recombinantes da invenção podem ser isolados através de seleção de uma biblioteca de anticorpo combinatorial recombinante. De preferência, a biblioteca é uma biblioteca de visualização de fago scFv, gerada usando-se cDNAs de Vl e Vh humana preparados a partir de mRNA isolado de células B. Metodologias para a preparação e seleção de tais bibliotecas são conhecidas na técnica. Existem kits comercialmente disponíveis para geração de bibliotecas de visualização de fago (por exemplo, o Pharma
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70/176 cia Recombinant Phage Antibody System, catálogo no. 27-9400-01; e o kit de visualização de fago SurfZAP® da Stratagene, catálogo no. 240612). Também existem outros métodos e reagentes que podem ser usados na geração e seleção de bibliotecas de visualização de anticorpo (veja, por exemplo, Patente U.S. No. 5.223.409; Publicações PCT Nos. WO 92/18619, WO 91/17271, WO 92/20791, WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047, WO 92/09690; Fuchs e outros, Bio/Technology 9: 1370-1372 (1991); Hay e outros, Hum. Antibod. Hybridomas 3: 81-85 (1992); Huse e outros, Science 246: 1275-1281 (1989); McCafferty e outros, Nature 348: 552-554 (1990); Griffiths e outros, EMBO J. 12: 725-734 (1993); Hawkins e outros, J. Mol. Biol. 226: 889-896 (1992); Clackson e outros, Nature 352: 624-628 (1991); Gram e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 3576-3580 (1992); Garrad e outros, Bio/Technology 9: 1373-1377 (1991); Hoogenboom e outros, Nuc. Acid Res. 19: 4133-4137 (1991); e Barbas e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 7978-7982 (1991).
[00185] Em uma concretização, para isolar um anticorpo anti-CD40 humano com as características desejadas, um anticorpo anti-CD40 humano conforme descrito aqui é primeiro usado para selecionar seqüências das cadeias pesada e leve humanas tendo atividade de ligação similar com relação ao CD40, usando-se os métodos de impressão em epitopo descritos na Publicação PCT No. WO 93/06213. As bibliotecas de anticorpo usadas nesse método são, de preferência, bibliotecas scFv preparadas e selecionadas conforme descrito na Publicação PCT No. 92/01047, McCafferty e outros, Nature 348: 552-554 (1990); e Griffiths e outros, EMBO J. 12: 725-734 (1993). As bibliotecas de anticorpo scFv são, de preferência, selecionadas usando-se CD40 humano como o antígeno.
[00186] Uma vez que os domínios Vl e Vh humanos iniciais são selecionados, experimentos de mistura e empareihamento são realiza
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71/176 dos, nos quais diferentes pares dos segmentos Vl e Vh inicialmente selecionados são separados para ligação ao CD40 a fim de selecionar as combinações de pares Vl/Vh preferidas. Adicionalmente, para melhorar a qualidade do anticorpo, os segmentos Vl e Vh do(s) par(es) Vl/Vh preferido(s) podem sofrer mutação aleatória, de preferência, dentro da região CDR3 da Vh e/ou Vl, em um processo análogo ao processo de mutação somática in vivo responsável pela maturação por afinidade de anticorpos durante uma resposta imune natural. Essa maturação por afinidade in vitro pode ser realizada através de amplificação dos domínios Vh e Vl usando-se iniciadores de PCR complementares a CDR3 da Vh ou CDR3 da Vl, respectivamente, iniciadores os quais tenham sido trespassados com uma mistura aleatória das quatro bases de nucleotídeo em determinadas posições, de modo que os produtos de PCR resultante codificam segmentos Vh e Vl nos quais mutações aleatórias tenham sido introduzidas nas regiões CDR3 da Vh e/ou Vl. Esses segmentos Vh e/ou Vl com mutação aleatória podem ser selecionados novamente para ligação ao CD40.
[00187] Após seleção e isolamento de um anticorpo anti-CD40 da invenção a partir de uma biblioteca de visualização de imunoglobulina recombinante, ácidos nucléicos que codificam o anticorpo selecionado podem ser recuperados do pacote de visualização (por exemplo, do genoma do fago) e subclonados em outros vetores de expressão por meio de técnicas padrão de DNA recombinante. Se desejado, o ácido nucléico pode ainda ser manipulado para criar outras formas de anticorpo da invenção, conforme descrito abaixo. Para expressar um anticorpo humano recombinante isolado através de seleção ou uma biblioteca combinatorial, o DNA que codifica o anticorpo é clonado em um vetor de expressão recombinante e introduzido em células hospedeiras de mamífero, conforme descrito acima.
Troca de Classe
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72/176 [00188] Outro aspecto da invenção proporciona um método para conversão da classe ou subclasse de um anticorpo anti-CD40 para outra classe ou subclasse. Em algumas concretizações, uma molécula de ácido nucléico que codifica uma Vl ou Vh que não inclui quaisquer seqüências de ácido nucléico que codificam a Cl ou Ch é isolada usando-se métodos bem-conhecidos na técnica. A molécula de ácido nucléico é, então, operativamente ligada a uma seqüência de ácido nucléico que codifica a Cl ou Ch de uma classe ou subclasse de imunoglobulina desejada. Isso pode ser obtido usando-se um vetor ou molécula de ácido nucléico que compreende uma cadeia Cl ou Ch, conforme descrito acima. Por exemplo, um anticorpo anti-CD40 que era originalmente IgM pode ter a classe trocada para uma IgG. Ainda, a troca de classe pode ser usada para converter uma subclasse de IgG em outra, por exemplo, de lgG1 para lgG2. Outro método de produção de um anticorpo da invenção compreendendo um isótipo desejado compreende as etapas de isolamento de um ácido nucléico que codifica uma cadeia pesada de um anticorpo anti-CD40 e um ácido nucléico que codifica uma cadeia leve de um anticorpo anti-CD40, isolamento da seqüência que codifica a região Vh, ligação da seqüência Vh a uma seqüência que codifica um domínio constante de uma cadeia pesada do isótipo desejado, expressão do gene da cadeia leve e da estrutura da cadeia pesada em uma célula e coleta do anticorpo anti-CD40 com o isótipo desejado.
Anticorpos Desimunizados [00189] Outra forma de produção de anticorpos com imunogenicidade reduzida é a desimunização de anticorpos. Em outro aspecto da invenção, o anticorpo pode ser desimunizado usando-se técnicas descritas, por exemplo, nas Publicações PCT Nos. WO 98/52976 e WO 00/34317 (as quais são incorporadas aqui por referência em sua totalidade).
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Anticorpos com Mutação [00190] Em outra concretização, as moléculas de ácido nucléico, vetores e células hospedeiras podem ser usados para fazer anticorpos anti-CD40 com mutação. Os anticorpos podem sofrer mutação nos domínios variáveis das cadeias pesada e/ou leve, por exemplo, para alterar uma propriedade de ligação do anticorpo. Por exemplo, uma mutação pode ser feita em uma ou mais regiões CDR para aumentar ou diminuir a Kd do anticorpo pelo CD40, para aumentar ou diminuir a KOff ou para alterar a especificidade de ligação do anticorpo. Métodos em mutagênese local-dirigida são bem-conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Sambrook e outros e Ausubel e outros, supra. Em uma concretização preferida, mutações são feitas em um resíduo de aminoácido que se sabe ter sido trocado, comparado à linhagem germinativa em um domínio variável de um anticorpo anti-CD40. Em outra concretização, uma ou mais mutações são feitas em um resíduo de aminoácido que se sabe ter sido trocado, comparado à linhagem germinativa em uma região CDR ou região de rede de um domínio variável ou em um domínio constante de um anticorpo monoclonal 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1 H-A78T-V88A-V97A, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2,
10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1 H-C109A, 23.5.1, 23.25.1,
23.28.1, 23.28.1 H-D16E, 23.28.1 L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K e
24.2.1. Em outra concretização, uma ou mais mutações são feitas em um resíduo de aminoácido que se sabe ter sido trocado, comparado à linhagem germinativa em uma região CDR ou região de rede de um domínio variável de uma seqüência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOS: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94, 100, 102, 2,
10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96, 98, 100 ou 102 ou cuja seqüência de ácido nucléico é apresentada em SEQ ID NOS: 3,
11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 93, 99, 101, 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 91, 95, 97, 99 ou 101.
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74/176 [00191] Em uma concretização, a região de rede sofre mutação, de modo que a(s) região(ões) de rede resultante(s) tem(têm) a seqüência de aminoácido do gene da linhagem germinativa correspondente. Uma mutação pode ser feita em uma região de rede ou no domínio constante a fim de aumentar a meia-vida do anticorpo anti-CD40. Veja, por exemplo, Publicação PCT No. WO 00/09560, aqui incorporada por referência. Uma mutação em uma região de rede ou domínio constante também pode ser feita para alterar a imunogenicidade do anticorpo, para proporcionar um local para ligação covalente ou não-covalente à outra molécula ou para alterar propriedades, tais como fixação de complemento, ligação a FcR e ADCC. De acordo com a invenção, um único anticorpo pode ter mutações em qualquer uma ou mais das regiões de rede, no domínio constante ou nas regiões variáveis.
[00192] Em algumas concretizações, existem de 1 a 18, incluindo qualquer número entre eles, de mutações de aminoácidos nos domínios Vh ou Vl do anticorpo anti-CD40 com mutação, comparado ao anticorpo anti-CD40 antes de mutação. Em quaisquer dos acima, as mutações podem ocorrer em uma ou mais regiões CDR. Ainda, qualquer uma das mutações podem ser substituições conservativas de aminoácidos. Em algumas concretizações, não existe mais de 5, 4, 3, 2 ou 1 alteração de aminoácido nos domínios constantes.
Anticorpos Modificados [00193] Em outra concretização, um anticorpo de fusão ou imunoadesina pode ser feito, que compreende todo ou uma porção de um anticorpo anti-CD40 da invenção ligado a outro polipeptídeo. Em uma concretização preferida, apenas os domínios variáveis do anticorpo anti-CD40 são ligados ao polipeptídeo. Em outra concretização preferida, o domínio Vh de um anticorpo anti-CD40 é ligado a um primeiro polipeptídeo, ao passo que o domínio Vl de um anticorpo anti-CD40 é ligado a um segundo polipeptídeo que se associa ao primeiro polipep
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75/176 tídeo de uma maneira tal que os domínios Vh e Vl podem interagir um com o outro a fim de formar um local de ligação de anticorpo. Em outra concretização preferida, o domínio Vh é separado do domínio Vl por um ligante, de modo que os domínios Vh e Vl podem interagir um com o outro (veja abaixo sob Anticorpos com Cadeia Simples). O anticorpo VH-ligante-VL é, então, ligado ao polipeptídeo de interesse. O anticorpo de fusão é útil para direcionar um polipeptídeo a uma célula ou tecido expressando o CD40. O polipeptídeo pode ser um agente terapêutico, tal como uma toxina, fator do desenvolvimento ou outra proteína regulatória, ou pode ser um agente diagnóstico, tal como uma enzima que pode ser facilmente visualizada, tal como peroxidase de rábanosilvestre. Além disso, podem ser criados anticorpos de fusão nos quais dois (ou mais) anticorpos com cadeia simples são ligados uns aos outros. Isso é útil quando se deseja criar um anticorpo divalente ou polivalente sobre uma cadeia simples de polipeptídeo ou se deseja criar um anticorpo biespecífico.
[00194] Para criar um anticorpo com cadeia simples, (scFv), os fragmentos de DNA que codificam a Vh e Vl são operativamente ligados a outro fragmento que codifica um ligante flexível, por exemplo, que codifica a seqüência de aminoácido (Gly4-Ser)3, de modo que as seqüências da Vh e Vl podem ser expressas como uma proteína com cadeia simples contígua, com os domínios da Vh e Vl unidos pelo ligante flexível. Veja, por exemplo, Bird e outros, Science 242: 423-426 (1988); Huston e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 5879-5883 (1988); McCafferty e outros, Nature 348: 552-554 (1990). O anticorpo com cadeia simples pode ser monovalente, se apenas uma única Vh e Vl for usada, bivalente, se duas Vh e Vl foram usadas ou polivalente, se mais de duas Vh e Vl forem usadas. Anticorpos biespecíficos ou polivalentes podem ser gerados, os quais se ligam especificamente ao CD40 e à outra molécula.
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76/176 [00195] Em outras concretizações, outros anticorpos modificados podem ser preparados usando-se moléculas de ácido nucléico que codificam um anticorpo anti-CD40. Por exemplo, Kappa Bodies (III e outros, Protein Eng. 10: 949-57 (1997)), Minibodies (Martin e outros, EMBO J. 13: 5303-9 (1994)), Diabodies (Holliger e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 6444-6448 (1993)) ou Janusins (Traunecker e outros, EMBO J. 10: 3655-3659 (1991) e Traunecker e outros, Int. J. Câncer (Sup.) 7: 51-52 (1992)) podem ser preparados usando-se técnicas padrão de biologia molecular seguindo os ensinamentos do relatório descritivo.
[00196] Anticorpos biespecíficos ou fragmentos de ligação a antígeno podem ser produzidos por uma variedade de métodos, incluindo fusão de hibridomas ou ligação de fragmentos Fab'. Veja, por exemplo, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990), Kostelny e outros, J. Immunol. 148: 1547-1553 (1992). Além disso, anticorpos biespecíficos podem ser formados como diacorpos ou Janusins. Em algumas concretizações, o anticorpo biespecífico se liga a dois epitopos diferentes de CD40. Em algumas concretizações, o anticorpo biespecífico tem uma primeira cadeia pesada e uma primeira cadeia leve do anticorpo monoclonal 3.1.1, 3.1.1 H-A78T, 3.1.1H-A78TV88A-V97A, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1,
22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1 H-D16E,
23.28.1 L-C92A, 23.29.1, 23.29.1 L-R174K e 24.2.1 e uma cadeia pesada e uma cadeia leve de um anticorpo adicional. Em algumas concretizações, a cadeia leve e a cadeia pesada adicionais também são de um dos anticorpos monoclonais acima identificados, mas são diferentes das primeiras cadeias leve e pesada.
[00197] Em algumas concretizações, os anticorpos modificados descritos acima são preparados usando-se um ou mais dos domínios variáveis ou regiões CDR de um anticorpo monoclonal anti-CD40 hu
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77/176 mano proporcionado aqui, de uma seqüência de aminoácidos do referido anticorpo monoclonal ou de uma cadeia pesada ou cadeia leve codificada pela seqüência de ácido nucléico que codifica o referido anticorpo monoclonal.
Anticorpos Derivatizados e Rotulados [00198] Um anticorpo anti-CD40 ou porção de ligação a antígeno da invenção pode ser derivatizada ou ligada à outra molécula (por exemplo, outro peptídeo ou proteína). Em geral, os anticorpos ou porção dos mesmos é derivatizada de modo que a ligação ao CD40 não seja adversamente afetada pela derivatização ou rotulação. Conseqüentemente, os anticorpos e porções de anticorpos da invenção se destinam a incluir formas intactas e modificadas dos anticorpos anti-CD40 humanos descritos aqui.Por exemplo, um anticorpo ou porção de anticorpo da invenção pode ser funcionalmente ligado (através de acoplamento químico, fusão genética, associação não-covalente ou outro) a uma ou mais entidades moleculares, tais como outro anticorpo (por exemplo, um anticorpo biespecífico ou um diacorpo), um agente de detecção, um agente citotóxico, um agente farmacêutico e/ou uma proteína ou peptídeo que pode associar imediatamente o anticorpo ou porção de anticorpo à outra molécula (tal como uma região com núcleo de estreptavidina ou um rótulo de polihistidina).
[00199] Um tipo de anticorpo derivatizado é produzido através de reticulação de dois ou mais anticorpos (do mesmo tipo ou de tipos diferentes, por exemplo, para criar anticorpos biespecíficos). Reticuladores adequados incluem aqueles que são heterobifuncionais, tendo dois grupos distintamente reativos separados por um espaçador apropriado (por exemplo, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida) ou homobifuncionais (por exemplo, suberato de dissuccinimidila). Tais ligantes estão disponíveis da Pierce Chemical Company, Rockford, III.
[00200] Outro tipo de anticorpo derivatizado é um anticorpo rotula
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78/176 do. Agentes de detecção úteis com os quais um anticorpo ou porção de ligação a antígeno da invenção pode ser derivatizada incluem compostos fluorescentes, incluindo fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, cloreto de 5-dimetilamina-1-naftalenossulfonila, ficoeritrina, fósforo de lantanídeo e semelhantes. Um anticorpo também pode ser rotulado com enzimas que são úteis para detecção, tais como peroxidase de rábano-silvestre, β-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina, glicose oxidase de e semelhantes. Quando um anticorpo é rotulado com uma enzima detectável, ele é detectado através de adição de reagentes adicionais que as enzimas usam para produzir um produto da reação que pode ser discernido. Por exemplo, quando o agente peroxidase de armorácia está presente, a adição de peróxido de hidrogênio e diaminobenzidina leva a um produto da reação colorido, o qual é detectável. Um anticorpo também pode ser rotulado com biotina e detectado através de medição indireta de ligação à avidina ou estreptavidina. Um anticorpo também pode ser rotulado com um epitopo de polipeptídeo predeterminado reconhecido por um repórter secundário (por exemplo, seqüências pares com zíper de leucina, sítios de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação a metal, etiquetas de epitopo). Em algumas concretizações, os rótulos são presos por braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir o impedimento estérico potencial.
[00201] Um anticorpo anti-CD40 também pode ser rotulado com um aminoácido radiorrotulado. O rádiorrótulo pode ser usado para fins diagnósticos e terapêuticos. Por exemplo, o rádiorrotulo pode ser usado para detectar tumores que expressam o CD40 através de raios X e outras técnicas diagnosticas. Ainda, o rádiorrotulo pode ser usado terapeuticamente como uma toxina para células cancerígenas ou tumores. Exemplos de rótulos para polipeptídeos incluem, mas não estão limitados a, os seguintes radioisótopos ou radionuclídeos — 3H, 14C,
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15^| 35g 90γ 99ψθ 111 |η 125| 1311 [00202] Um anticorpo anti-CD40 também pode ser derivatizado com um grupo químico, tal como polietileno glicol (PEG), um grupo metila ou etila ou um grupo carboidrato. Esses grupos são úteis para melhorar as características biológicas do anticorpo, por exemplo, para aumentar a meia-vida no soro ou para aumentar a ligação tecidual.
Composições farmacêuticas e Kits [00203] A invenção também refere-se a composições compreendendo um anticorpo agonista anti-CD40 humano para o tratamento de indivíduos que precisem de imunoestimulação. Tais composições são úteis para tratar, prevenir, reduzir a freqüência de ou gravidade de infecção, incluindo infecção viral e bacteriana, para o tratamento de um distúrbio hiperproliferativo, incluindo condições cancerígenas e précancerígenas, para o tratamento de condições de imunodeficiência genética, tais como síndrome de hiper-lgM e para o tratamento de condições de imunodeficiência primária ou combinadas, incluindo condições caracterizadas por neutropenia, em um mamífero, incluindo seres humanos. Indivíduos para tratamento por terapia com um anticorpo anti-CD40 agonista incluem qualquer indivíduo que precise de intensificação imune incluindo, mas não limitado a, idosos e indivíduos que estão imunossuprimidos, por exemplo, devido à quimioterapia.
[00204] Distúrbios hiperproliferativos que podem ser tratados por um anticorpo anti-CD40 agonista da invenção podem envolver qualquer tecido ou órgão e incluem, mas não estão limitados a, câncer de cérebro, pulmão, de células escamosas, bexiga, gástrico, pancreático, de mama, cabeça, pescoço, fígado, renal, ovariano, próstata, colorretal, esofageal, ginecológico, nasofaringe ou da tiróide, melanomas, linfomas, leucemias ou mielomas múltiplos. Em particular, os anticorpos anti-CD40 agonistas humanos do oxigênio são úteis para tratar carcinomas da mama, de próstata, cólon e pulmão.
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80/176 [00205] O tratamento pode envolver a administração de um ou mais anticorpos monoclonais anti-CD40 agonistas da invenção ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, sozinhos ou com um veículo farmaceuticamente aceitável. Conforme usado aqui, veículo farmaceuticamente aceitável significa qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes para retardo de absorção e isotônicos e semelhantes que são fisiologicamente compatíveis. Alguns exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis são água, solução salina, solução salina tamponada com fosfato, dextrose, glicerol, etanol e semelhantes, bem como combinações dos mesmos. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio na composição. Exemplos adicionais de substâncias farmaceuticamente aceitáveis são agentes de umedecimento ou quantidades mínimas de substâncias auxiliares tais como agentes de umedecimento ou emulsificação, conservantes ou tampões, os quais intensificam a vida útil ou eficácia do anticorpo.
[00206] Os anticorpos anti-CD40 agonistas da invenção e composições compreendendo os mesmos podem ser administrados em combinação com um ou mais de outros agentes terapêuticos, diagnósticos ou profiláticos. Agentes terapêuticos adicionais incluem outros agentes antineoplásicos, antitumor, antiangiogênicos ou quimioterapêuticos. Tais agentes adicionais podem ser incluídos na mesma composição ou administrados separadamente. Em algumas concretizações, um ou mais anticorpos anti-CD40 agonistas da invenção podem ser usados como uma vacina ou como adjuvantes para uma vacina.
[00207] As composições da presente invenção podem estar em uma variedade de formas, por exemplo, formas de dosagem líquidas, semi-sólidas e sólidas, tais como soluções líquidas (por exemplo, soluções injetáveis e infusíveis), dispersões ou suspensões, tabletes, pílu
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Ias, pós, lipossomas e supositórios. A forma preferida depende do modo pretendido de administração e da aplicação terapêutica. Composições preferidas típicas estão na forma de soluções injetáveis ou infusíveis, tais como composições similares àquelas usadas para imunização passiva de seres humanos. O modo preferido de administração é parenteral (por exemplo, intravenosa, subcutânea, intraperitoneal, intramuscular). Em uma concretização preferida, o anticorpo é administrado através de infusão ou injeção intravenosa. Em outra concretização preferida, o anticorpo é administrado através de injeção subcutânea ou intramuscular.
[00208] Composições terapêuticas devem ser, tipicamente, estéreis e estáveis sob as condições de fabricação e armazenamento. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, dispersão, lipossoma ou outra estrutura adequada para alta concentração de droga. Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas através de incorporação do anticorpo anti-CD40 na quantidade requerida em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, conforme requerido, seguido por esterilização filtrada. Geralmente, as dispersões são preparadas por meio de incorporação do composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são secagem a vácuo e congelamento-secagem que proporciona um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução previamente filtrada-estéril do mesmo. A fluidez apropriada de uma solução pode ser mantida, por exemplo, através do uso de um revestimento, tal como lecitina, através da manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e através do uso de tensoativos. Absorção prolongada das composições injetáveis pode
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82/176 ser mantida através de inclusão na composição de um agente que retarda a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.
[00209] Os anticorpos da presente invenção podem ser administrados por uma variedade de métodos conhecidos na técnica embora, para muitas aplicações terapêuticas, a via/modo preferido de administração é subcutâneo, intramuscular ou infusão intravenosa. Conforme será apreciado por aqueles versados na técnica, a via e/ou modo de administração variará, dependendo dos resultados desejados.
[00210] Em determinadas concretizações, o composto ativo das composições de anticorpo pode ser preparado com um veículo que protegerá o anticorpo contra liberação rápida, tal como formulação com liberação controlada, incluindo implantes, emplastros transdérmicos e sistemas de distribuição microencapsulados. Polímeros biodegradáveis biocompatíveis podem ser usados, tais como acetato de etileno vinila, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido poliláctico. Muitos métodos para a preparação de tais formulações são patenteados ou geralmente conhecidos por aqueles versados na técnica. Veja, por exemplo, Sustained and Controlled Release Druq Delivery Systems (J.R. Robinson ed., Marcei Dekker, Inc., New York, 1978).
[00211] Em determinadas concretizações, um anticorpo anti-CD40 da invenção pode ser oralmente administrado, por exemplo, com um diluente inerte ou um veículo ingerível assimilável. O composto (e outros ingredientes, se desejado) também pode ser encerrado em uma cápsula de gelatina com envoltório duro ou mole, prensado em comprimidos ou incorporado diretamente na dieta do indivíduo. Para administração terapêutica oral, os anticorpos anti-CD40 podem ser incorporados com excipientes e usados na forma de comprimidos ingeríveis, comprimidos bucais, trociscos, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, wafers e semelhantes. Para administrar um composto da inven
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83/176 ção por outra administração que não parenteral, pode ser necessário revestir o composto com ou co-administrar o composto com um material para prevenir sua inativação.
[00212] Compostos ativos adicionais também podem ser incorporados nas composições. Em determinadas concretizações, um anticorpo anti-CD40 da invenção é co-formulado com e/ou co-administrado com um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Esses agentes incluem, sem limitação, anticorpos que se ligam a outros alvos (por exemplo, anticorpos que se ligam a um ou mais fatores do desenvolvimento ou citocinas ou seus receptores na superfície celular, tais como o anticorpo anti-CTL4), agentes antineoplásicos, agentes antitumor, agentes quimioterapêuticos, análogos de peptídeo que ativam o CD40, CD40L solúvel, um ou mais agentes químicos que ativam o CD40 e/ou outros agentes conhecidos na técnica que podem intensificar uma resposta imune contra células tumorígenas, por exemplo, IFN-βΙ, IL-2, IL-8, IL12, IL-15, IL-18, IL-23, IFN-γ e GM-CSF. Tais terapias combinadas podem requerer dosagens menores do anticorpo anti-CD40, bem como os agentes co-administrados, assim, evitando possíveis toxicidades ou complicações associadas às várias monoterapias.
[00213] Os anticorpos anti-CD40 agonistas da invenção e composições compreendendo os mesmos também podem ser administrados em combinação com outros regimes terapêuticos, em particular em combinação com tratamento por radiação.
[00214] As composições da invenção podem incluir uma quantidade terapeuticamente eficaz ou uma quantidade profilaticamente eficaz de um anticorpo ou porção de ligação a antígeno da invenção. Uma quantidade terapeuticamente eficaz refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e durante períodos de tempo necessários para se obter o resultado terapêutico desejado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou porção de anticorpo pode variar de acor
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84/176 do com fatores tais como o estado da doença, idade, sexo e peso do indivíduo e a capacidade do anticorpo ou porção do anticorpo de estimular uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz também é uma na qual quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais do anticorpo ou porção do anticorpo são superados pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Uma quantidade profilaticamente eficaz refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e durante períodos de tempo necessários para se obter o resultado profilático desejado. Tipicamente, uma vez que uma dose profilática é usada em indivíduos antes de ou em um estágio precoce da doença, a quantidade profilaticamente eficaz será menor do que a quantidade terapeuticamente eficaz.
[00215] Os regimes de dosagem podem ser ajustados para proporcionar a resposta desejada ótima (por exemplo, uma resposta terapêutica ou profilática). Por exemplo, um único bolo pode ser administrado, muitas doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parenterais na forma de unidade de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. Forma de unidade de dosagem, conforme usado aqui, refere-se a unidades fisicamente distintas adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos mamíferos a serem tratados; cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo farmacêutico requerido. A especificação para as formas de unidade de dosagem da invenção é orientada por e diretamente dependente (a) das características únicas do anticorpo anti-CD40 ou porção e do efeito terapêutico ou profilático em particular a ser obtido e (b) das limitações inerentes na técnica de composição, tais como anticorpo para o
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85/176 tratamento de sensitividade em indivíduos.
[00216] Uma faixa exemplificativa não-limitativa para uma quantidade profilática ou terapeuticamente eficaz de um anticorpo ou porção de anticorpo da invenção é 0,025 a 50 mg/kg, mais preferivelmente, 0,1 a 50 mg/kg, mais preferivelmente 0,1-25, 0,1 a 10 ou 0,1 a 3 mg/kg. Deve ser observado que os valores de dosagem podem variar com o tipo e gravidade da condição a ser aliviada. Deve ser ainda compreendido que para qualquer indivíduo em particular, regimes de dosagem específicos deverão ser ajustados ao longo do tempo de acordo com a necessidade individual e o julgamento profissional da pessoa que está administrando ou supervisionando a administração das composições e essas faixas de dosagem apresentadas aqui são exemplificativas apenas e não se destinam a limitar o escopo ou a prática da composição reivindicada.
[00217] Outro aspecto da presente invenção proporciona kits compreendendo um anticorpo anti-CD40 ou porção de anticorpo da invenção ou uma composição compreendendo tal anticorpo. Um kit pode incluir, além do anticorpo ou composição, agentes diagnósticos ou terapêuticos. Um kit também pode incluir instruções para uso em um método diagnóstico ou terapêutico. Em uma concretização preferida, o kit inclui o anticorpo ou uma composição compreendendo o mesmo e um agente diagnóstico que pode ser usado em um método descrito abaixo. Em outra concretização preferida, o kit inclui o anticorpo ou uma composição compreendendo o mesmo e um ou mais agentes terapêuticos que podem ser usados em um método descrito abaixo.
[00218] A presente invenção também refere-se a composições para inibição do desenvolvimento de células anormais em um mamífero compreendendo uma quantidade de um anticorpo da invenção em combinação com uma quantidade de um quimioterapêutico, em que as quantidades do composto, sal, solvato ou pró-droga e do quimiotera
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86/176 pêutico são, juntas, eficazes na inibição do desenvolvimento de células anormais. Muitos quimioterapêuticos são atualmente conhecidos na técnica. Em algumas concretizações, o quimioterapêutico é selecionado do grupo consistindo de inibidores mitóticos, agentes de alquilação, anti-metabólitos, antibióticos de intercalação, inibidores do fator do desenvolvimento, inibidores do ciclo celular, enzimas, inibidores de topoisomerase, modificadores da resposta biológica, anti-hormônios, por exemplo, anti-androgênios e agentes antiangiogênicos.
[00219] Agentes antiangiogênicos, tais como inibidores da MMP-2 (metaloproteinase matricial 2), inibidores da MMP-9 (metaloproteinase matricial 9) e inibidores da COX-II (ciclooxigenase II), podem ser usados junto com um anticorpo anti-CD40 da invenção. Exemplos de inibidores da COX-II úteis incluem CELEBREX® (alecoxib), valdecoxib e rofecoxib. Exemplos de inibidores da metaloproteinase matricial úteis são descritos no WO 96/33172 (publicado em 24 de Outubro de 1996), WO 96/27583 (publicado em 7 de Março de 1996), Pedido de Patente Européia No. 97304971.1 (depositado em 8 de Julho de 1997), Pedido de Patente Européia No. 99308617.2 (depositado em 29 de Outubro de 1999), WO 98/07697 (publicado em 26 de Fevereiro de 1998), WO 98/03516 (publicado em 29 de Janeiro de 1998), WO 98/34918 (publicado em 13 de Agosto de 1998), WO 98/34915 (publicado em 13 de Agosto de 1998), WO 98/33768 (publicado em 6 de Agosto de 1998), WO 98/30566 (publicado em 16 de Julho de 1998), Publicação de Patente Européia 606.046 (publicado em 13 de Julho de 1994), Publicação de Patente Européia 931.788 (publicada em 28 de Julho de 1999), WO 90/05719 (publicado em 31 de Maio de 1990), WO 99/52910 (publicado em 21 de Outubro de 1999), WO 99/52889 (publicado em 21 de Outubro de 1999), WO 99/29667 (publicado em 17 de Junho de 1999), Pedido Internacional PCT No. PCT/IB98/01113 (depositado em 21 de Julho de 1998), Pedido de Patente Européia No. 9902232.1 (dePetíção 870190007041, de 23/01/2019, pág. 94/192
87/176 positado em 25 de Março de 1999), pedido de patente da Grã Bretanha número 9912961.1 (depositado em 3 de Junho de 1999), Pedido Provisório U.S. No. 60/148.464 (depositado em 12 de Agosto de 1999), Patente U.S. 5.863.949 (depositada em 26 de Janeiro de 1999), Patente U.S. 5.861.510 (depositada em 19 de Janeiro de 1999) e Publicação de Patente Européia 780.386 (publicada em 25 de Junho de 1997), todos os quais são incorporados aqui em suas totalidades por referência. Inibidores de MMP preferidos são aqueles que não demonstram artralgia. Mais preferidos são aqueles que inibem seletivamente a MMP-2 e/ou MMP-9 com relação a outras metaloproteinases matriciais (isto é, MMP-1, MMP-3, MMP-4, MMP-5, MMP-6, MMP-7, MMP-8, MMP-10, MMP-11, MMP-12 e MMP-13). Alguns exemplos específicos de inibidores de MMP úteis na presente invenção são AG3340, RO 32-3555, RS 13-0830 e os compostos mencionados na seguinte lista: ácido 3-[[4-(4-flúor-fenóxi)-benzenossulfonil]-(1hidroxicarbamoil-ciclopentil)-amino]-propiônico; hidroxiamida de ácido
3-exo-3-[4-(4-flúor-fenóxi)-benzenossulfonilamino]-8-oxabiciclo[3.2.1]octano-3-carboxílico; hidroxiamida de ácido (2R,3R) 1-[4(2-cloro-4-flúor-benzilóxi)-benzenossulfonil]-3-hidróxi-3-metilpiperidina-2-carboxílico; hidroxiamida de ácido 4-[4-(4-flúor-fenóxi)benzenossulfonilamino]-tetrahidro-piran-4-carboxí-lico; ácido 3-[[4-(4flúor-fenóxi)-benzenossulfonil]-(1-hidroxicarbamoil-ciclo-butil)-amino]propiônico; hidroxiamida de ácido 4-[4-(4-cloro-fenóxi)benzenossulfonilamino]-tetrahidro-piran-4-carboxílico; hidroxiamida de ácido (R) 3-[4-(4-cloro-fenóxi)-benzenossulfonilamino]-tetrahidro-piran-
3-carboxíli-co; hidroxiamida de ácido (2R,3R) 1-[4-(4-flúor-2-metilbenzilóxi)-benzenossulfonil]-3-hidróxi-3-metil-piperidina-2-carboxílico; ácido 3-[[4-(4-flúor-fenóxi)-benzenossulfonil]-(1-hidroxicarbamoil-1metil-etil)-amino]-propiônico; ácido 3-[[4-(4-flúor-fenóxi)- benzenossulfonil]-(4-hidroxicarbamoil-tetrahidro-piran-4-il)-amino]
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88/176 propiônico; hidroxiamida de ácido 3-exo-3-[4-(4-cloro-fenóxi)benzenossulfonilamino]-8-oxa-biciclo[3.2.1]octano-3-carboxíli-co; hidroxiamida de ácido 3-endo-3-[4-(4-flúor-fenóxi)-benzenossulfonilamino]-8-oxa-biciclo[3.2.1]octano-3-carboxílico; e hidroxiamida de ácido (R) 3-[4-(4-flúor-fenóxi)-benzenossulfonilamino]-tetrahidro-furan-3carboxílico; e sais e solvatos farmaceuticamente aceitáveis dos referidos compostos.
[00220] Um composto da invenção também pode ser usado com inibidores da transdução de sinal, tais como agentes que podem inibir as respostas do EGF-R (receptor do fator do desenvolvimento epidérmico), tais como anticorpos EGF-R, anticorpos EGF e moléculas que são inibidores de EGF-R; inibidores de VEGF (fator do desenvolvimento endotelial vascular), tais como receptores de VEGF e moléculas que podem inibir o VEGF; e inibidores do receptor erbB2, tais como moléculas orgânicas ou anticorpos que se ligam ao receptor erbB2, por exemplo, HERCEPTIN™ (Genentech, Inc.). Inibidores de EGF-R são descritos, por exemplo, no WO 95/19970 (publicado em 27 de Julho de 1995), WO 98/14451 (publicado em 9 de Abril de 1998), WO 98/02434 (publicado em 22 de Janeiro de 1998) e Patente dos Estados Unidos 5.747.498 (emitida em 5 de Maio de 1998) e tais substâncias podem ser usadas na presente invenção conforme descrito aqui. Agentes para inibição de EGFR incluem, mas não estão limitados, aos anticorpos monoclonais C225 e 22Mab anti-EGFR (ImClone Systems Incorporated), ABX-EGF (Abgenix/Cell Genesys), EMD-7200 (Merck KgaA), EMD-5590 (Merck KgaA), MDX-447/H-477 (Medarex Inc. and Merck KgaA) e os compostos ZD-1834, ZD-1838 e ZD-1839 (AstraZeneca), PKI-166 (Novartis), PKI-166/CGP-75166 (Novartis), PTK 787 (Novartis), CP 701 (Cephalon), leflunomida (Pharmacia/Sugen), CI-1033 (Warner Lambert Parke Davis), CI-1033/PD 183.805 (Warner Lambert Parke Davis), CL-387.785 (Wyeth-Ayerst), BBR-1611 (Boehringer
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Mannheim GmbH/Roche), Naamidina A (Bristol Myers Squibb), RC3940-II (Pharmacia), BIBX-1382 (Boehringer llgelheim), OLX-103 (Merck & Co.), VRCTC-310 (Ventech Research), toxina de fusão EGF (Seragen Inc.), DAB-389 (Seragen/Lilgand), ZM-252808 (Imperial Câncer Research Fund), RG-50864 (INSERM), LFM-A12 (Parker Hughes Câncer Center), WHI-P97 (Parker Hughes Câncer Center), GW-282974 (Glaxo), KT-8391 (Kyowa Hakko) e Vacina de EGF-R (York Medical/Centro de Imunologia Molecular (CIM)). Esses e outros agentes de inibição de EGF-R podem ser usados na presente invenção.
[00221] Inibidores de VEGF, por exemplo, SU-6668 (Sugen Inc.), SH-268 (Schering) e NX-1838 (NeXstar) também podem ser combinados com o composto da presente invenção. Inibidores de VEGF são descritos, por exemplo, no WO 99/24440 (publicado em 20 de Maio de 1999), Pedido Internacional PCT/IB99/00797 (depositado em 3 de Maio de 1999), no WO 95/21613 (publicado em 17 de Agosto de 1995), WO 99/61422 (publicado em 2 de Dezembro de 1999), Patente dos Estados Unidos 5.834.504 (emitido em 10 de Novembro de 1998), WO 98/50356 (publicado em 12 de Novembro de 1998), Patente dos Estados Unidos 5.883.113 (emitida em 16 de Março de 1999), Patente dos Estados Unidos 5.886.020 (emitida em 23 de Março de 1999), Patente dos Estados Unidos 5.792.783 (emitida em 11 de Agosto de 1998), WO 99/10349 (publicado em 4 de Março de 1999), WO 97/32856 (publicado em 12 de Setembro de 1997), WO 97/22596 (publicado em 26 de Junho de 1997), WO 98/54093 (publicado em 3 de Dezembro de 1998), WO 98/02438 (publicado em 22 de Janeiro de 1998), WO 99/16755 (publicado em 8 de Abril de 1999) e WO 98/02437 (publicado em 22 de Janeiro de 1998), todos os quais são incorporados aqui em suas totalidades por referência. Outros exemplos de alguns inibidores de VEGF específicos úteis na presente in
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90/176 venção são IM862 (Cytran Inc.); anticorpo monoclonal anti-VEGF da Genentech, Inc.; e angiozima, uma ribozima sintética da Ribozyme and Chiron. Esses e outros inibidores de VEGF podem ser usados na presente invenção conforme descrito aqui. Inibidores do receptor ErbB2, tais como GW-282974 (Glaxo Wellcome pic) e os anticorpos monoclonais AR-209 (Aronex Pharmaceuticals Inc.) e 2B-1 (Chiron) podem, além disso, ser combinados com o composto da invenção, por exemplo, aqueles indicados no WO 98/02434 (publicado em 22 de Janeiro de 1998), WO 99/35146 (publicado em 15 de Julho de 1999), WO 99/35132 (publicado em 15 de Julho de 1999), WO 98/02437 (publicado em 22 de Janeiro de 1998), WO 97/13760 (publicado em 17 de Abril de 1997), WO 95/19970 (publicado em 27 de Julho de 1995), Patente dos Estados Unidos 5.587.458 (emitida em 24 de Dezembro de 1996) e Patente dos Estados Unidos 5.877.305 (emitida em 2 de Março de 1999), os quais são incorporados aqui por referência em suas totalidades. Inibidores do receptor erbB2 úteis na presente invenção também são descritos no Pedido Provisório dos Estados Unidos No. 60/117.341, depositado em 27 de Janeiro de 1999 e no Pedido Provisório dos Estados Unidos No. 60/117.346, depositado em 27 de Janeiro de 1999, ambos os quais são incorporados em suas totalidades aqui por referência. Os compostos e substâncias inibidoras do receptor erbB2 descrito no pedidos PCT, patentes U.S. e pedidos provisórios U.S. antes mencionados, bem como outros compostos e substâncias que inibem o receptor erbB2, podem ser usados com o composto da presente invenção de acordo com a presente invenção.
[00222] Agentes anti-sobrevivência incluem anticorpos anti-IGF-IR e agentes antiintegrina, tais como anticorpos antiintegrina.
Métodos Diagnósticos de Uso [00223] Em outro aspecto, a invenção proporciona métodos diagnósticos. Os anticorpos anti-CD40 podem ser usados para detectar
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CD40 em uma amostra biológica in vitro ou in vivo. Em uma concretização, a invenção proporciona um método para diagnóstico da presença ou localização de um tumor que expressa o CD40 em um indivíduo que precise do mesmo, compreendendo as etapas de injeção do anticorpo no indivíduo, determinação da expressão do CD40 no indivíduo através de localização de onde o anticorpo foi ligado, comparação da expressão no indivíduo com aquela de um indivíduo de referência normal ou padrão e diagnóstico da presença ou localização do tumor.
[00224] Os anticorpos anti-CD40 podem ser usados em um imunoensaio convencional incluindo, sem limitação, um ELISA, um RIA, FACS, imunohistoquímica tecidual, Western blot ou imunoprecipitação. Os anticorpos anti-CD40 da invenção podem ser usados para detectar CD40 de seres humanos. Em outra concretização, os anticorpos antiCD40 podem ser usados para detectar CD40 de primatas do Velho Mundo, tais como macacos cynomolgus e rhesus, chimpanzés e gorilas. A invenção proporciona um método para detecção de CD40 em uma amostra biológica compreendendo contato de uma amostra biológica com um anticorpo anti-CD40 da invenção e detecção do anticorpo ligado. Em uma concretização, o anticorpo anti-CD40 é diretamente rotulado com um rótulo detectável. Em outra concretização, o anticorpo anti-CD40 (o primeiro anticorpo) é não rotulado e um segundo anticorpo ou outra molécula que pode se ligar ao anticorpo anti-CD40 é rotulada. Conforme é bem-conhecido por aqueles versados na técnica, um segundo anticorpo é escolhido de modo que ele é capaz de se ligar especificamente a espécies e classes do primeiro anticorpo em particular. Por exemplo, se o anticorpo anti-CD40 é uma IgG humana, então, o segundo anticorpo seria uma IgG anti-humana. Outras moléculas que podem se ligar a anticorpos incluem, sem limitação, Proteína A e Proteína G, ambas as quais estão comercialmente disponíveis, por exemplo, da Pierce Chemical Co.
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92/176 [00225] Rótulos adequados para o anticorpo ou anticorpo secundário foram divulgadas supra e incluem várias enzimas, grupos prostéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes e materiais radioativos. Exemplos de enzimas adequadas incluem peroxidase de armorácia, fosfatase alcalina, β-galactosidase ou acetilcolinesterase; exemplos de complexos de grupo prostético adequados incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina; exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, fluoresceína de diclorotriazinilamina, cloreto de dansila ou ficoeritrina; um exemplo de material luminescente inclui luminol; e exemplos de materiais radioativos adequados incluem 125l, 1311, 35S ou 3H.
[00226] Em outras concretizações, o CD40 pode ser analisado em uma amostra biológica através de um imunoensaio por competição utilizando padrões de CD40 rotulados com uma substância detectável e um anticorpo anti-CD40 não-rotulado. Nesse ensaio, a amostra biológica, os padrões de CD40 rotulados e o anticorpo anti-CD40 são combinados e a quantidade de padrão de CD40 rotulado ligado ao anticorpo não rotulado é determinada. A quantidade de CD40 na amostra biológica é inversamente proporcional à quantidade de padrão de CD40 rotulado ligado ao anticorpo anti-CD40.
[00227] Pode-se usar os imunoensaios divulgados acima para uma série de finalidades. Por exemplo, os anticorpos anti-CD40 podem ser usados para detectar CD40 em células na cultura de células. Em uma concretização preferida, os anticorpos anti-CD40 são usados para determinar a quantidade de CD40 sobre a superfície de células que tenham sido tratadas com vários compostos. Esse método pode ser usado para identificar compostos que são úteis para ativar ou inibir o CD40. De acordo com esse método, uma amostra de células é tratada com um composto de teste durante um período de tempo, ao passo
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93/176 que outra amostra é deixada não tratada. Se o nível total de CD40 tem de ser medido, as células são submetidas à lise e o nível total de CD40 é medido usando-se um dos imunoensaios descritos acima. O nível total de CD40 nas células tratadas versus as não tratadas é comparado a fim de determinar o efeito do composto de teste.
[00228] Um imunoensaio preferido para medição dos níveis totais de CD40 é um ELISA ou Western blot. Se o nível de CD40 na superfície celular tem de ser medido, as células não são submetidas à lise e os níveis de CD40 na superfície celular são medidos usando-se um dos imunoensaios descritos acima. Um imunoensaio preferido para determinação dos níveis de CD40 na superfície celular inclui as etapas de rotulação das proteínas da superfície celular com um rótulo detectável, tal como biotina ou 125l, imunoprecipitação do CD40 com um anticorpo anti-CD40 e, então, detecção do CD40 rotulado. Outro imunoensaio preferido para determinação da localização de CD40, por exemplo, níveis na superfície celular, é através do uso de imunohistoquímica. Métodos tais como ELISA, RIA, Western blot, imunohistoquímica, rotulação da superfície celular de proteína integrais da membrana e imunoprecipitação são bem-conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Hariow e Lane, supra. Além disso, os imunoensaios podem ser aplicados a seleção em elevado rendimento de formar a testar um grande número de composto com relação à ativação ou inibição do CD40.
[00229] Os anticorpos anti-CD40 da invenção também podem ser usados para determinar os níveis de CD40 em um tecido ou em células derivadas do tecido. Em algumas concretizações, o tecido é um tecido doente. Em algumas concretizações, o tecido é um tumor ou uma biópsia do mesmo. Em algumas concretizações do método, um tecido ou uma biópsia do mesmo é excisada de um paciente. O tecido ou biópsia é, então, usada em um imunoensaio para determinar, por
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94/176 exemplo, os níveis totais de CD40, os níveis de CD40 na superfície celular ou a localização do CD40 por meio dos métodos discutidos acima.
[00230] O método de diagnóstico acima descrito pode ser usado para determinar se um tumor expressa níveis elevados de CD40, o que poderia ser indicativo de que o tumor é um alvo para o tratamento com um anticorpo anti-CD40. Ainda, o mesmo método pode ser usado para monitorar o efeito do tratamento com um anticorpo anti-CD40 através de detecção de morte celular no tumor. O método de diagnóstico também pode ser usado para determinar se um tecido ou célula expressa níveis insuficientes de CD40 ou CD40 ativado e, assim, é um candidato para tratamento com anticorpos anti-CD40 de ativação, CD40L e/ou outros agentes terapêuticos para aumento dos níveis ou atividade do CD40.
[00231] Os anticorpos da presente invenção também podem ser usados in vivo para identificar tecidos e órgãos que expressam CD40. Em algumas concretizações, os anticorpos anti-CD40 são usados para identificar tumores que expressam CD40. Uma vantagem de usar os anticorpos anti-CD40 humanos da presente invenção é que eles podem ser seguramente usados in vivo sem estimular uma resposta imune ao anticorpo quando de administração, diferente de anticorpos de origem não humana ou anticorpos humanizados.
[00232] O método compreende as etapas de administração de um anticorpo anti-CD40 detectavelmente rotulado ou uma composição compreendendo o mesmo a um paciente que precise de tal teste diagnóstico e sujeição do paciente a análise de imagem a fim de determinar a localização dos tecidos que expressam o CD40. Análise de imagem é bem-conhecida na técnica médica e inclui, sem limitação, análise por raios X, formação de imagem por ressonância magnética (MRI) ou tomografia computadorizada (CE). O anticorpo pode ser rotulado
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95/176 com qualquer agente adequado para formação de imagem in vivo, por exemplo, um agente de contraste, tal como bário, o qual pode ser usado para análise por raios X, ou um agente de contraste magnético, tal como quelato de gadolínio, o qual pode ser usado para MRI ou CE. Outros agentes de rotulação incluem, sem limitação, radioisótopos, tal como Tc. Em outra concretização, o anticorpo anti-CD40 será não rotulado e terá sua imagem formada através de administração de um segundo anticorpo ou outra molécula que é detectável e que pode se ligar ao anticorpo anti-CD40. Em uma concretização, uma biópsia é obtida do paciente a fim de determinar se o tecido de interesse expressa o CD40.
Métodos Terapêuticos de Uso [00233] Em outro aspecto, a invenção proporciona métodos terapêuticos de uso de um anticorpo anti-CD40 da invenção.
[00234] Um anticorpo anti-CD40 agonista humano da invenção pode ser administrado a um ser humano ou um mamífero não-humano que expressa uma reação colateral ao CD40. O anticorpo pode ser administrado a tal mamífero não-humano (isto é, um primata, macaco cynomolgus ou rhesus) para fins veterinários ou como um modelo de doença humana em um animal. Tais modelos com animais são úteis para avaliação da eficácia terapêutica dos anticorpos da presente invenção.
[00235] Em algumas concretizações, o anticorpo anti-CD40 é administrado a um indivíduo que sofre de imunodeficiências primárias e/ou combinadas, incluindo imunodeficiência CD40-dependente com síndrome de Hiper-lgM, Imunodeficiência Variável Comum, Agamaglobulinemia de Bruton, deficiências da subclasse de IgG e SCID X-ligada (mutações comuns da cadeia gama). Em algumas concretizações, o anticorpo anti-CD40 é administrado para tratar um indivíduo que está com imunossupressão, por exemplo, devido à quimioterapia ou tem
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96/176 uma doença de debilitação imune, incluindo qualquer doença com deficiência imune adquirida, tal como HIV. Em algumas concretizações, o anticorpo anti-CD40 é administrado para intensificar a imunidade de um indivíduo mais idoso. Em algumas concretizações, o anticorpo antiCD40 é administrado para tratar um indivíduo que tem uma infecção bacteriana, viral, fúngica ou parasítica. Em algumas concretizações, um anticorpo anti-CD40 agonista humano da invenção pode ser administrado profilaticamente a um indivíduo que, em virtude da idade, enfermidade ou baixa saúde em geral, é suscetível a uma infecção para prevenir ou reduzir o número ou gravidade de infecções.
[00236] Em algumas concretizações, o anticorpo anti-CD40 é administrado a um indivíduo que tem um distúrbios hiperproliferativo.
[00237] Em algumas concretizações, o anticorpo anti-CD40 é administrado para tratar um indivíduo que tem um tumor. Em algumas concretizações, o tumor é CD40 positivo. Em algumas concretizações, o tumor é CD40 negativo. O tumor pode ser um tumor sólido ou um tumor não sólido, tal como um linfoma. Em algumas concretizações, um anticorpo anti-CD40 é administrado a um paciente que tem um tumor que é cancerígeno. Em algumas concretizações, o anticorpo inibe a proliferação de células cancerígenas, inibe ou previne um aumento no peso ou volume do tumor e/ou causa uma diminuição do peso ou volume do tumor.
[00238] Pacientes que podem ser tratados com anticorpos antiCD40 ou porções de anticorpo da invenção incluem, mas não estão limitados, a pacientes que tenham sido diagnosticados como tendo câncer de cérebro, câncer de pulmão, câncer dos ossos, câncer pancreático, câncer de pele, câncer da cabeça e pescoço, melanoma cutâneo ou intraocular, câncer uterino, câncer ovariano, câncer retal, câncer da região anal, câncer de estômago, câncer gástrico, câncer cólon-retal, câncer de cólon, câncer de mama, tumores ginecológicos
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97/176 (por exemplo, sarcomas uterinos, carcinoma das trompas falopianas, carcinoma do endométrio, carcinoma do cérvix, carcinoma da vagina ou carcinoma da vulva), câncer do esôfago, câncer do intestino delgado, câncer do sistema endócrino (por exemplo, câncer das glândulas tiróide, paratireóide ou adrenal), sarcomas de tecidos moles, leucemia, mieloma, mieloma múltiplo, câncer da uretra, câncer do pênis, câncer de próstata, leucemia crônica ou aguda, tumores sólidos da infância, doença de Hodgkin, linfomas linfocíticos, linfoma não-Hodgkin, câncer da bexiga, câncer de fígado, câncer renal, câncer dos rins ou ureter (por exemplo, carcinoma de células renais, carcinoma da pélvis renal) ou neoplasmas do sistema nervoso central (por exemplo, linfoma primário do CNS, tumores do eixo espinhal, gliomas do feixe cerebral ou adenomas da pituitária), glioma ou fibrosarcoma.
[00239] O anticorpo pode ser administrado de três vezes ao dia a uma vez a cada seis meses e de preferência pode ser administrado através da via oral, mucosal, bucal, intranasal, inalável, intravenosa, subcutânea, intramuscular, parenteral, intratumor, transdérmica ou tópica. O anticorpo pode também ser administrado continuamente via uma minibomba. O anticorpo geralmente será administrado durante tanto tempo quanto o tumor esteja presente, contanto que o anticorpo faça com que o tumor ou câncer pare de se desenvolver ou diminua seu peso ou volume. A dosagem de anticorpo geralmente estará na faixa de 0,025 a 50 mg/kg, mais preferivelmente 0,1 a 50 mg/kg, mais preferivelmente 0,1-20 mg/kg, 0,1-10 mg/kg, 0,1-5 mg/kg ou ainda mais preferivelmente 0,1-2 mg/kg. O anticorpo também pode ser administrado profilaticamente.
[00240] Em algumas concretizações, o anticorpo anti-CD40 é administrado como parte de um regime terapêutico que inclui uma ou mais drogas ou moléculas antineoplásicas a um paciente que tem um distúrbio hiperproliferativo, tal como câncer ou um tumor. Agentes antitu
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98/176 mor exemplificativos incluem, mas não estão limitados, a inibidores mitóticos, agentes de alquilação, antimetabólitos, agentes de intercalação, inibidores do fator de desenvolvimento, inibidores do ciclo celular, enzimas, inibidores de topoisomerase, modificadores da resposta biológica, anti-hormônios, inibidores de cínase, inibidores da metaloprotease matricial, terapêuticos genéticos e antiandrogênios. Em concretizações mais preferidas, o anticorpo anti-CD40 é administrado com um agente antineoplásico, tal como acriamicina ou taxol. Em algumas concretizações preferidas, a terapia anti-CD40 é realizada junto com radioterapia, quimioterapia, terapia fotodinâmica, cirurgia ou outra imunoterapia. Em algumas concretizações, o anticorpo anti-CD40 é administrado com um ou mais anticorpos adicionais. Por exemplo, o anticorpo anti-CD40 pode ser administrado com anticorpos que são conhecidos por inibir a proliferação de células cancerígenas ou tumorígenas. Tais anticorpos incluem, mas não estão limitados, a um anticorpo que inibe CTLA4, o receptor erbB2, EGF-R, IGF-1R, CD20 ou VEGF.
[00241] Em algumas concretizações, o anticorpo anti-CD40 é rotulado com um rádiorrotulo, uma imunotoxina ou uma toxina ou uma proteína de fusão compreendendo um peptídeo tóxico. O anticorpo antiCD40 ou proteína de fusão de anticorpo anti-CD40 direciona o rádiorrotulo, imunotoxina, toxina ou peptídeo tóxico à célula cancerígena ou tumorígena. Em uma concretização preferida, o rádiorrotulo, imunotoxina, toxina ou peptídeo tóxico é internalizado pela célula tumorígena ou cancerígena após o anticorpo anti-CD40 se ligar ao CD40 sobre a superfície da célula.
[00242] Em outro aspecto, o anticorpo anti-CD40 pode ser usado terapeuticamente para induzir à apoptose de células específicas em um paciente. Em muitos casos, as células objetivadas para apoptose são células cancerígenas ou tumorígenas. Assim, a invenção propor
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99/176 ciona um método de indução da apoptose através de administração de um anticorpo anti-CD40 a um paciente que precise do mesmo.
[00243] Em outro aspecto, a invenção proporciona um método de administração de um anticorpo anti-CD40 de ativação a um paciente para aumentar a atividade do CD40. Um anticorpo anti-CD40 é administrado com um ou mais fatores que aumentam a atividade do CD40. Tais fatores incluem CD40L e/ou análogos de CD40L que ativam o CD40.
[00244] Em algumas concretizações, o anticorpo anti-CD40 é administrado com um ou mais agentes de intensificação imune adicionais incluindo, sem limitação, IFN-βΙ, IL-2, IL-8, IL-12, IL-15, IL-18, IL-23, IFN-ye GM-CSF.
[00245] Em algumas concretizações, um anticorpo anti-CD40 agonista humano da invenção é usado como um adjuvante para intensificar a eficácia de uma vacina. Quando usado dessa forma, o anticorpo anti-CD40 ativa o CD40 sobre células apresentando antígeno, incluindo células B, células dendríticas e monócitos, bem como intensificação da produção de moléculas imunomodulatórias, tais como citocinas e quimiocinas. O efeito imunoestimulatório do anticorpo intensifica a resposta imune do indivíduo vacinado ao antígeno da vacina.
[00246] Em outro aspecto, a invenção proporciona um método para a geração de uma vacina de células dendríticas para câncer ou imunoterapia por células dendríticas. De acordo com o método, células dendríticas de um paciente com câncer são cultivadas durante 1-5 dias com lisato ou homogenato de tumor, células tumorígenas mortas através de irradiação ou outros meios ou antígenos tumor-específicos (por exemplo, peptídeos, idiotipos) e 1-10 pg/ml de um anticorpo antiCD40. As células dendríticas pulsadas com antígeno de tumor são reinjetadas no paciente para estimular respostas imunes antitumor, particularmente respostas do CTL antitumor. Células dendríticas deriva
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100/176 das de monócito para uso no método podem ser obtidas de uma amostra de sangue periférico através de cultura em IL-4 e GM-CSF. Células dendríticas também podem ser derivadas da medula óssea de um paciente através de purificação magnética ou escolha de células CD34 positivas, seguido por cultura em IL-4 e GM-CSF.
Terapia Genética [00247] As moléculas de ácido nucléico da presente invenção podem ser administradas a um paciente que precise das mesmas via terapia genética. A terapia pode ser in vivo ou ex vivo. Em uma concretização preferida, moléculas de ácido nucléico que codificam uma cadeia pesada e uma cadeia leve são administradas a um paciente. Em uma concretização mais preferida, as moléculas de ácido nucléico são administradas de modo que elas são estavelmente integradas em cromossomas de células B devido ao fato de que essas células são especializadas para a produção de anticorpos. Em uma concretização preferida, células B precursoras são transfectadas ou infectadas ex vivo e re-transplantadas em um paciente que precise das mesmas. Em outra concretização, células B precursoras ou outras células são infectadas in vivo usando-se um vírus conhecido por infectar o tipo de célula de interesse. Vetores típicos usados para terapia genética incluem lipossomas, plasmídeos e vetores virais. Vetores virais exemplificativos são retrovírus, adenovírus e vírus adeno-associados. Após infecção in vivo ou ex vivo, os níveis de expressão do anticorpo podem ser monitorados tomando-se uma amostra do paciente tratado e usandose um imunoensaio conhecido na técnica ou discutido aqui.
[00248] Em uma concretização preferida, o método de terapia genética compreende as etapas de administração de uma molécula isolada de ácido nucléico que codifica a cadeia pesada ou uma porção de ligação a antígeno da mesma de um anticorpo anti-CD40 que expressa a molécula de ácido nucléico. Em outra concretização, o método de
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101/176 terapia genética compreende as etapas de administração de uma molécula isolada de ácido nucléico que codifica a cadeia leve ou uma porção de ligação a antígeno da mesma de um anticorpo anti-CD40 e expressando a molécula de ácido nucléico. Em um método mais preferido, o método de terapia genética compreende as etapas de administração de uma molécula isolada de ácido nucléico que codifica a cadeia pesada ou uma porção de ligação a antígeno da mesma e uma molécula isolada de ácido nucléico que codifica a cadeia leve ou a porção de ligação a antígeno da mesma de um anticorpo anti-CD40 da invenção e expressando as moléculas de ácido nucléico. O método de terapia genética também pode compreender a etapa de administração de outro agente anti-câncer, tal como taxol ou adriamicina.
[00249] De forma que a presente invenção possa ser melhor compreendida, os exemplos a seguir são apresentados. Esses exemplos são para fins de ilustração apenas e não devem ser construídos como limitando o escopo da invenção de qualquer maneira.
EXEMPLO I
Geração de Hibridomas que Produzem Anticorpo Anti-CD40 [00250] Os anticorpos da invenção foram preparados, selecionados e analisados como segue.
Imunização e geração de hibridoma [00251] Imunizou-se camundongos XeroMaise® de oito a dez semanas de idade intraperitonealmente ou nas almofadas de suas patas traseiras com uma proteína de fusão CD40-lgG (10 pg/dose/camundongo) ou com células 300.19CD40 as quais são uma linhagem de célula que expressa o CD40 humano sobre sua membrana (10 x 106 células/dose/camundongo). Repetiu-se essa dose cinco a sete vezes durante um período de oito semanas. Quatro dias antes da fusão, foi dado aos camundongos uma injeção final do domínio extracelular do CD40 humano em PBS. Fundiu-se os linfócitos do nódulo
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102/176 linfático e do baço de camundongos imunizados com a linhagem de células do mieloma não-secretório P3-X63-Ag8.653 e submetemos as células de fusão à seleção por HAT conforme previamente descrito (Galfre e Milstein, Methods Enzymol. 73: 3-46, 1981). Recuperou-se um painel de hibridomas, todos secretando anticorpos lgG2K CD40 humano-específicos. Selecionou-se onze hibridomas para outro estudo e designou-se os mesmos 3.1.1, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1,
22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.29.1 e 24.2.1.
[00252] Depositou-se os hibridomas 3.1.1, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1 e
21.4.1 na American Type Culture Collection (ATCC) de acordo com o Tratado de Budapeste, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, em 6 de Agosto de 2001. Depositamos os hibridomas
21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.29.1 e 24.2.1 na ATCC em 16 de Julho de 2002. Aos hibridomas foram atribuídos os seguintes números de depósito:
Hibridoma No, Depósito
3.1.1 (LN 15848) PTA-3600
7.1.2 (LN 15849) PTA-3601
10.8.3 (LN 15850) PTA-3602
15.1.1 (LN 15851) PTA-3603
21.4.1 (LN 15853) PTA-3605
21.2.1 (LN 15874) PTA-4549
22.1.1 (LN 15875) PTA-4550
23.5.1 (LN 15855) PTA-4548
23.25.1 (LN 15876) PTA-4551
23.28.1 (LN 15877) PTA-4552
23.29.1 (LN 15878) PTA-4553
24.2.1 (LN 15879) PTA-4554
EXEMPLO II
Seqüências de Anticorpo Anti-CD40 Preparadas de Acordo com a
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Invenção [00253] Para analisar a estrutura dos anticorpos produzidos de acordo com a invenção, clonou-se ácidos nucléicos que codificam fragmentos de cadeia pesada e leve de hibridomas produzindo anticorpos monoclonais anti-CD40. A clonagem e seqüenciamento foram realizados como segue.
[00254] Isolou-se mRNA poli(A)+ de aproximadamente 2 X 105 células de hibridoma derivado de camundongos XeroMouse® imunizados com CD40 humano, conforme descrito no Exemplo I, usando um kit Fast-Track (Invitrogen). Acompanhou-se por PCR a geração de um iniciador cDNA aleatório. Usamos iniciadores para região variável específicos à família Vh humana ou Vk humana (Marks e outros, Oligonucleotide primers for polymerase chain reaction amplification of human immunoglobulin variable genes and design of family-specific oligonucleotide probes, Eur. J. Immunol. 21: 985-991 (1991)) ou um prímero Vh humano universal, MG-30, CAGGTGCAGCTGGAGCAGTCIGG (SEQ ID NO: 18), junto com iniciadores específicos para a região constante Cj2 humana, MG-40d, 5'GCTGAGGGAGTAGAGTCCTGAGGA-3' (SEQ ID NO: 19) ou a região constante Ck (ΙίκΡ2; conforme previamente descrito por Green e outros, 1994). Obteve-se moléculas de ácido nucléico que codificam transcritos das cadeias leve kappa e pesada humanas dos hibridomas que produzem anti-CD40 através de seqüenciamento direto de produtos de PCR gerados a partir de RNA poli(A)+ usando os iniciadores descritos acima. Clonou-se produtos de PCR em pCRIl usando um kit de clonagem TA (Invitrogen) e seqüenciamos ambos os filamentos usando kits de seqüenciamento Prism Dye-Terminator e uma máquina de seqüenciamento ABI 377. Analisou-se todas as seqüências através de alinhagemmentos ao diretório de seqüência V BASE (Tomlinson e outros, MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, Reino Unido)
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104/176 usando os programas de software MacVector e Geneworks.
[00255] Ainda submeteu-se os anticorpos monoclonais 3.1.1, 7.1.2,
10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.28.1, 23.29.1 e 24.2.1 a clonagem e seqüenciamento de DNA de comprimento total. Para tal seqüenciamento, isolou-se RNA de aproximadamente 4 X 106 células de hibridoma usando o kit de isolamento de RNA QIAGEN RNeasy (QIAGEN). Transcreveu-se reversamente o mRNA usando oligodT(18) e o kit Advantage RT/PCR (Clonetech). Usou-se ο V Base para projetar iniciadores dianteiros de amplificação que incluíam locais de restrição, a seqüência ótima de Kozak, o local inicial ATG e parte da seqüência sinalizadora da cadeia pesada. A Tabela 1 lista os iniciadores dianteiros de amplificação usados para seqüenciar os clones de anticorpos.
TABELA 1
Clone Cadeia Pesada do Prímero Dianteiro
3.1.1 5'-TATCTAAGCTTCTAGACTCGACCGCCACCATGGAGTTT GGGCTGAGCTG-3'(SEQ ID NO: 120)
7.1.2 5'-TATCTAAGCTTCTAGACTCGACCGCCACCATGGAGTTT GGGCTGAGCTG-3'(SEQ ID NO: 121)
10.8.3 5'-TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGAAACAC CTGTGGTTCTTCC-3'(SEQ ID NO: 122)
15.1.1 5'-TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGAAACAT CTGTGGTTCTTCC 3'(SEQ ID NO: 123)
21.4.1 5'-TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGGACTGG ACCTGGAGGATCC-3'(SEQ ID NO: 124)
21.2.1 5'-TATCTAAGCTTCTAGACTCGACCGCCACCATGGA GTTTGGGCTGAGCTG-3' (SEQ ID NO: 128)
22.1.1 5'-TATCTAAGCTTCTAGACTCGACCGCCACCATGGAG TTTGGGCTGAGCTG-3' (SEQ ID NO: 129)
23.5.1 5'-TATCTAAGCTTCTAGACTCGACCGCCACCATGGAG
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TTTGGGCTGAGCTG-3'(SEQ ID NO: 130)
23.28.1 5'-TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGAAA CATCTGTGGTTCTTCC-3'(SEQ ID NO: 131)
23.29.1 5'-TATCTAAGCTTCTAGACTCGACCGCCACCATGGAG TTTGGGCTGAGCTG-3'(SEQ ID NO: 132)
24.2.1 5'-TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGAA ACATCTGTGGTTCTTCC-3'(SEQ ID NO: 133)
[00256] Usou-se o mesmo método para projetar um prímero para incluir as seqüências de codificação 3', o códon final da região constante da lgG2 (5TTCTCTGATCAGAATTCCTATCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG3') (SEQ ID NO: 125) e locais de restrição.
[00257] Usou-se o mesmo método para projetar um prímero em torno do local inicial ATG da cadeia kappa:
[00258] (51CTTCAAGCTTACCCGGGCCACCATGAGGCTCCCTGCTCAGC-3' (SEQ ID NO: 126). Uma seqüência de Kozak ótima (CCGCCACC) foi adicionada 5' ao local inicial ATG. Esse prímero foi usado para clonar por PCR as cadeias leves dos seguintes clones de anticorpo: 3.1.1, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1 e 23.29.1. Usou-se um segundo prímero dianteiro, 5'TCTTCAAGCTTGCCCGGGCCCGCCACCATGGAAACCCCAGCGCAG-3' (SEQ ID NO: 134) para clonar as cadeias leves dos clones
23.28.1 e 24.2.1. Usou-se o mesmo método para projetar um prímero em torno do códon final da região constante kappa [00259] (51TTCTTTGATCAGAATTCTCACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGC-3') (SEQ ID NO: 127). Usou-se os pares de iniciadores para amplificar os cDNAs usando o kit Advantage High Fidelity PCR (Clonetech). Obtivemos a seqüência do produto de PCR através de seqüenciamento
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106/176 direto usando técnicas padrão (por exemplo, medição passo-a-passo com iniciadores) usando kits de seqüenciamento Dye-Terminator e uma máquina de seqüenciamento ABI. Clonou-se o produto de PCR em um vetor de expressão de mamífero e seqüenciamos os clones para confirmar mutações somáticas. Para cada clone, verificou-se a seqüência de ambos os filamentos em pelo menos três reações.
Análise da Utilização de Gene [00260] A Tabela 2 apresenta a utilização de gene evidenciada pelos clones de hibridoma seletivos de anticorpos de acordo com a invenção.
TABELA 2
Utilização de Gene das Cadeias Pesada e Leve
Clone Cadeia Pesada Cadeia Leve Kappa
VH D JH VK JK
3.1.1 (3-30+) DP-49 D4+ DIR3 JH6 A3/A19 (DPK-15) JK1
7.1.2 (3-30+) DP-49 DIR5+D1- 26 JH6 A3/A19 (DPK-15) JK1
10.8.3 (4.35) VIV-4 DIR3 JH6 L5 (DP5) JK4
15.1.1 (4-59) DP-71 D4-23 JH4 A3/A19 (DPK-15) JK2
21.4.1 (1-02) DP-75 DLR1 JH4 L5 (DP5) JK4
21.2.1 (3-30+) DP-49 DIR3+ D6-19 JH4 A3/A19 (DPK-15) JK3
22.1.1 (3-30+) DP-49 D1-1 JH6 A3/A19 (DPK-15) JK1
23.5.1 (3-30+) DP-49 D4-17 JH6 A3/A19 (DPK-15) JK1
23.28.1 (4-59) DP-71 DIR1 + D4-17 JH5 A27 (DPK-22) JK3
23.29.1 (3-30.3) DP-46 D4-17 JH6 A3/A19 (DPK-15) JK1
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24.2.1 (4-59) DP-71 DIR1 + D4-17 JH5 A27 (DPK-22) JK3
Análise de seqüência e Mutaç ão
[00261] Conforme será apreciado, a análise de utilização de gene proporciona apenas uma visão limitada da estrutura do anticorpo. Uma vez que as células B nos animais XeroMouse® geram estequiometricamente transcritos de cadeia leve kappa V-J ou pesada V-D-J, existe uma série de processos secundários que ocorrem incluindo, sem limitação, hipermutação somática, deleções, N-adições e extensões de CDR3. Veja, por exemplo, Mendez e outros, Nature Genetics 15: 146156 (1997) e Publicação de Patente Internacional WO 98/24893. Conseqüentemente, para examinar adicionalmente a estrutura do anticorpo, gerou-se seqüências previstas de aminoácidos dos anticorpos a partir dos cDNAs obtidos dos clones. A Tabela A proporciona os identificadores de seqüência para cada uma das seqüências previstas de aminoácidos e nucleotídeo dos anticorpos seqüenciados.
[00262] As Tabelas 3-7 proporcionam as seqüências previstas de aminoácidos e nucleotídeo das cadeias pesada e leve kappa dos anticorpos 3.1.1 (Tabela 3), 7.1.2 (Tabela 4), 10.8.3 (Tabela 5), 15.1.1 (Tabela 6) e 21.4.1 (Tabela 7).
[00263] As Tabelas 8-13 proporcionam as seqüências previstas de aminoácidos e nucleotídeo do domínio variável das cadeias pesada e leve kappa dos anticorpos 21.2.1 (Tabela 8), 22.1.1 (Tabela 9), 23.5.1 (Tabela 10), 23.28.1 (Tabela 11), 23.29.1 (Tabela 12) e 24.2.1 (Tabela 13).
[00264] A seqüência de DNA do seqüenciamento de comprimento total do anticorpo monoclonal 23.28.1 difere das seqüências de DNA obtidas a partir de seqüenciamento da região Vh do produto de PCR inicial por um par de base (C a G), resultando em uma alteração do resíduo 16 da cadeia pesada natural de D para E.
[00265] As Tabelas 14-19 proporcionam as seqüências previstas de
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108/176 aminoácidos e nucleotídeo das cadeias pesada e leve kappa dos anticorpos 21.2.1 (Tabela 14), 22.1.1 (Tabela 15), 23.5.1 (Tabela 16),
23.28.1 (Tabela 17), 23.29.1 (Tabela 18) e 24.2.1 (Tabela 19). Nas Tabelas, a seqüência peptídica sinalizadora (ou as bases que codificam a mesma) está sublinhagemda.
[00266] Gerou-se dois anticorpos com mutações, 22.1.1 e 23.28.1. A cadeia pesada do anticorpo 22.1.1 sofreu mutação para trocar um resíduo de cisteína na posição 109 por um resíduo de alanina. Designou-se o clone com mutação 22.1.1H-C109A. A cadeia leve do anticorpo 23.28.1 na posição 92 sofreu mutação também para trocar um resíduo de cisteína por um resíduo de alanina. Designou-se o clone com mutação 23.28.1L-C92A.
[00267] Mutagênese de resíduos específicos foi realizada pelos iniciadores projetados e usando o Kit de Mutagênese Local Dirigida QuickChance da Stratagene, de acordo com as instruções do fabricante. As mutações foram confirmadas através de seqüenciamento automático e os insertos com mutação foram subclonados em vetores de expressão.
[00268] A Tabela 20 proporciona as seqüências de aminoácido e nucleotídeo da cadeia pesada com mutação do anticorpo 22.1.1 HC109A. A Tabela 21 proporciona as seqüências de aminoácidos e nucleotídeo da cadeia leve com mutação do anticorpo 23.28.1. Os códons de DNA com mutação são mostrados em itálico. O resíduo de aminoácido com mutação está em negrito.
Tabela 3: Seqüências de DNA e de proteína do anticorpo 3.1.1
DESCRIÇÃO SEQÜÊNCIA (seqüência sinalizadora sublinhagemda)
Seqüência de DNA da Cadeia Pesada ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTT- GCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGTCAGGTG- CAGCTGGTGGAGTCTGGGG- GAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGA- GACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAG-
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TTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCAAAGGATGGAGGTAATAAATACCATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAATGCGCTGTATCTGCAAATGAATAGCCTGAGAGTTGAAGACACGGCTGTGTATTACTGTGTGAGAAGAGGGCATCAGCTGGTTCTGGGATACTACTACTACAACGGTCTGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCA GGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGA TCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACAC-
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CTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
Seqüência de Pro- MEFGLSWVFLVALLRGVQCQVQLVESGGGWQPGRSLR-
teína da Cadeia LSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISKD-
Pesada GGNKYHADSVKGRFTISRDNSKNALYLQMNSLRVEDTAVYYCVRRGHQLVLGYYYYNGLDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Seqüência de DNA ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAATG-
da Cadeia Leve CTCTGGGTCTCTGGATCCAGTGGGGATATTGTGCTGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCTTGTATAGTAATGGATACAACTTTTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGATTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGCTCTACAAACTCCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACG-
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CCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
Seqüência de Proteína da Cadeia Leve MRLPAQLLGLLMLWVSGSSGDIVLTQSPLSLPVTPGEPA-
SISCRSSQSLLYSNGYNFLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDVGVYYCMQALQTPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Domínio Variável Maduro da Seqüência de DNA da Cadeia Pesada CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCAAAGGATGGAGGTAATAAATACCATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAATGCGCTGTATCTGCAAATGAATAGCCTGAGAGTTGAAGACACGGCTGTGTATTACTGTGTGAGAAGAGGGCATCAGCTGGTTCTGGGATACTACTACTACAACGGTCTGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
Domínio Variável Maduro da Seqüência de Proteína da Cadeia Pesada QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISKDGGNKYHADSVKGRFTISRDNSKNALYLQMNSLRVEDTAVYYCVRRGHQLVLGYYYYNGLDVWGQGTTVTVSS
Domínio Variável Maduro da Seqüência de DNA da Cadeia Leve GATATTGTGCTGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCTTGTATAGTAATGGATACAACTTTTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGAT-
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CAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGATTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGCTCTACAAACTCCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
Domínio Variável Maduro da Seqüência de Proteína da Cadeia Leve DIVLTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLYSNGYN- FLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSG- TDFTLKISRLEAEDVGVYYCMQALQTPRTFGQGTKVEIK
DNA da Cadeia Pesada (domínio variável) (3.1.1H-A78T) SEQ ID NO: 89 CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCAAAGGATGGAGGTAATAAATACCATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAATaCGCTGTATCTGCAAATGAATAGCCTGAGAGTTGAAGACACGGCTGTGTATTACTGTGTGAGAAGAGGGCATCAGCTGGTTCTGGGATACTACTACTACAACGGTCTGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
Proteína da Cadeia Pesada (domínio variável) (3.1.1H-A78T) SEQ ID NO: 70 QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISKDGGNKYHADSVKGRFTISRDNSKN7LYLQMNSLRVEDTAVYYCVRRGHQLVLGYYYYNGLDVWGQGTTVTVSS
DNA da Cadeia Pesada (domínio variável) (3.1.1H-A78TV88A-V97A) SEQ ID NO: 91 CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCAAAGGATGGAGGTAATAAATACCATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAATaCGCTGTATCTGCAAATGAATAGCCTGAGAGcTGAAGACACGGCTGTGTATTACTGTGcGAGAAGAGGGCATCAGCTGGTTCTGGGATACTACTAC-
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TACAACGGTCTGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
Proteína da Cadeia Pesada (domínio variável) (3.1.1H-A78TV88A-V97A) SEQ ID NO: 92 QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISKDGGNKYHADSVKGRFTISRDNSKN7LYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGHQLVLGYYYYNGLDVWGQGTTVTVSS
DNA da Cadeia Leve (domínio variável) (3.1.1L-L4M-L83V) SEQ ID NO: 93 GATATTGTGaTGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCTTGTATAGTAATGGATACAACTTTTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAgTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGCTCTACAAACTCCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
Proteína da Cadeia Leve (domínio variável) (3.1.1L-L4M-L83V) SEQ ID NO: 94 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLYSNGYN- FLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSG- TDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPRTFGQGTKVEIK
Tabela 4: Seqüências de DNA e de proteína do anticorpo 7.1.2
DESCRIÇÃO SEQÜÊNCIA (seqüência sinalizadora sublinhagemda)
Seqüência de DNA da Cadeia Pesada ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGI I I ICCICGTTG-
CTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGTCAGGTGCAGCTGG-
TGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCAAATGATGGAGATAATAAATACCATGCAGACTCCG-
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TGTGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAGGAGCACGCTTTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTATATTACTGTGCGAGAAGAGGCATGGGGTCTAGTGGGAGCCGTGGGGATTACTACTACTACTACGGTTTGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
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Seqüência de Proteí- MEFGLSWVFLVALLRGVQCQVQLVESGGGWQPGRSL-
na da Cadeia Pesada RLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISNDGDNKYHADSVWGRFTISRDNSRSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGMGSSGSRGDYYYYYGLDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Seqüência de DNA ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAATG-
da Cadeia Leve CTCTGGGTCTCTGGATCCAGTGGGGATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCTTGTATAGTAATGGATACAACTTTTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGCTCTACAAACTCCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
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Seqüência de Proteína da Cadeia Leve MRLPAQLLGLLMLWVSGSSGDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLYSNGYNFLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Domínio Variável Maduro da Seqüência de DNA da Cadeia Pesada CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCAAATGATGGAGATAATAAATACCATGCAGACTCCGTGTGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAGGAGCACGCTTTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTATATTACTGTGCGAGAAGAGGCATGGGGTCTAGTGGGAGCCGTGGGGATTACTACTACTACTACGGTTTGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
Domínio Variável Maduro da Seqüência de Proteína da Cadeia Pesada QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYG- MHWVRQAPGKGLEWVAVISND- GDNKYHADSVWGRFTISRDNSRSTLYLQMNSLRAEDTA- VYYCARRGMGSSGSRGDYYYYYGLDVWGQGTTVTVSS
Domínio Variável Maduro da Seqüência de DNA da Cadeia Leve GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCTTGTATAGTAATGGATACAACTTTTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGCTCTACAAACTCCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
Domínio Variável DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLYSNGYN-
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Maduro da Seqüência de Proteína da Cadeia Leve FLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPRTFGQGTKVEIK
Tabela 5: Seqüências de DNA e de proteína do anticorpo 10.8.3
DESCRIÇÃO SEQÜÊNCIA (seqüência sinalizadora sublinhagemda)
Seqüência de DNA ATGAAACACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCAG-
da Cadeia Pesada CTCCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTAGTTACTACTGGATCTGGATCCGGCAGCCCGCCGGGAAGGGACTGGAATGGATTGGGCGTGTCTATACCAGTGGGAGCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATGTCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATGGTCTTTACAGGGGGTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGG-
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TCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
Seqüência de Prote- ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTG-
ína da Cadeia Pe- CTCTGGTTCCCAGGTTCCAGATGCGACATCCAGATGAC-
sada CCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGCCTATTAGCAGCTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAACTCCTGATTTATTCTGCCTCCGGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAGACTGACAGTTTCCCGCTCACTTTCGGCGGCGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
Seqüência de DNA MRLPAQLLGLLLLWFPGSRCDIQMTQSPSSVSAS-
da Cadeia Leve VGDRVTITCRASQPISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYSAS- GLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISS- LQPEDFATYYCQQTDSFPLTFGGGTKVEIKRTVAAP-
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SVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVD- NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS- LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Seqüência de Proteína da Cadeia Leve CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTAGTTACTACTGGATCTGGATCCGGCAGCCCGCCGGGAAGGGACTGGAATGGATTGGGCGTGTCTATACCAGTGGGAGCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATGTCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATGGTCTTTACAGGGGGTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
Domínio Variável Maduro da Seqüência de DNA da Cadeia Pesada QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWIWIRQPAGKGLEWIGRVYTSGSTNYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDGLYRGYGMDVWGQGTTVTVSS
Domínio Variável Maduro da Seqüência de Proteína da Cadeia Pesada GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGCCTATTAGCAGCTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAACTCCTGATTTATTCTGCCTCCGGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAGACTGACAGTTTCCCGCTCACTTTCGGCGGCGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
Domínio Variável Maduro da Seqüência de DNA da Cadeia Leve DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQPISSWLAWYQQK- PGKAPKLLIYSASGLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISS- LQPEDFATYYCQQTDSFPLTFGGGTKVEIK
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Tabela 6: Seqüências de DNA e de proteína do anticorpo 15.1.1
DESCRIÇÃO SEQÜÊNCIA (seqüência sinalizadora sublinhagemda)
Seqüência de DNA da ATGAAACATCTGTGGTTCTTCCTTCTCCTGGTGGCA-
Cadeia Pesada GCTCCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGAAGTTACTACTGGACCTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGATATATCTATTACAGTGGGAGCACCAACTACAATCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACATGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGTTCTGTGACCGCTGCGGACACGGCCGTTTATTACTGTGCGAGAAAGGGTGACTACGGTGGTAATTTTAACTACTTTCACCAGTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGTCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGG-
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CAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAG- CCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
Seqüência de Proteína da Cadeia Pesada MKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIRSYYWTWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDMSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARKGDYGGNFNYFHQWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Seqüência de DNA da Cadeia Leve ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAA-
TGCTCTGGGTCTCTGGATCCAGTGGGGATATTG-
TGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCCTACATACTAATGGATACAACTATTTCGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAACTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGCTCTACAAACTCCGTACAGTTTTGG-
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CCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
Seqüência de Proteína da Cadeia Leve MRLPAQLLGLLMLWVSGSSGDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHTNGYNYFDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPYSFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Domínio Variável Maduro da Seqüência de DNA da Cadeia Pesada CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGAAGTTACTACTGGACCTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGATATATCTATTACAGTGGGAGCACCAACTACAATCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACATGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGTTCTGTGACCGCTGCGGACACGGCCGTTTATTACTGTGCGAGAAAGGGTGACTACGGTGGTAATTTTAACTACTTTCACCAGTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
Domínio Variável Maduro da Seqüência de Proteína da Cadeia Pesada QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIRSYYWTWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDMSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARKGDYGGNFNYFHQWGQGTLVTVSS
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Domínio Variável Ma- GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTG-
duro da Seqüência de CCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTG-
DNA da Cadeia Leve CAGGTCTAGTCAGAGCCTCCTACATACTAATGGATACAACTATTTCGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAACTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGCTCTACAAACTCCGTACAGTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA
Domínio Variável Ma- DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQS-
duro da Seqüência de LLHTNGYNYFDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVP-
Proteína da Cadeia DRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQAL-
Leve QTPYSFGQGTKLEIK
Tabela 7: Seqüências de DNA e de proteína do anticorpo 21.4.1
DESCRIÇÃO SEQÜÊNCIA (seqüência sinalizadora sublinhagemda)
Seqüência de DNA da ATGGACTGGACCTGGAGGATCCTCTTCTTGGTGGCA-
Cadeia Pesada GCAGCCACAGGAGCCCACTCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCGGCTACTATATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACCCTGACAGTGGTGGCACAAACTATGCACAGAAGTTTCAGGGCAGGGTCACCATGACCAGGGACACGTCCATCAGCACAGCCTACATGGAGCTGAACAGGCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATCAGCCCCTAGGATATTGTACTAATGGTGTATGCTCCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTC-
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TACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
Seqüência de Proteína da Cadeia Pesada MDWTWRILFLVAAATGAHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELNRLRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEM-
Petição 870190007041, de 23/01/2019, pág. 132/192
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TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN- GQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR- WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Seqüência de DNA da Cadeia Leve ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTG-
CTGCTCTGGTTCCCAGGTTCCAGATGCGACATCCA-
GATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTATTTACAGCTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAACCTCCTGATCTATACTGCATCCACTTTACAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAGGCTAACATTTTCCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
Seqüência de Proteína da Cadeia Leve MRLPAQLLGLLLLWFPGSRCDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIYSWLAWYQQKPGKAPNLLIYTASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANIFPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Domínio Variável Maduro da Seqüência de DNA da Cadeia Pesa- CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGG- TGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTG- CAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCGGCTACTATA-
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da TGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACCCTGACAGTGGTGGCACAAACTATGCACAGAAGTTTCAGGGCAGGGTCACCATGACCAGGGACACGTCCATCAGCACAGCCTACATGGAGCTGAACAGGCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATCAGCCCCTAGGATATTGTACTAATGGTGTATGCTCCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
Domínio Variável Maduro da Seqüência de Proteína da Cadeia Pesada QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYT- FTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPDSGGTNYAQK- FQGRVTMTRDTSISTAYMELNRLRSDDTAVYYCARD- QPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSS
Domínio Variável Maduro da Seqüência de DNA da Cadeia Leve GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTATTTACAGCTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAACCTCCTGATCTATACTGCATCCACTTTACAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAGGCTAACATTTTCCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
Domínio Variável Maduro da Seqüência de Proteína da Cadeia Leve DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRAS- QGIYSWLAWYQQKPGKAPNLLIYTASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANIFPLTFGGGTKVEIK
Tabela 8: Seqüências de DNA e de proteína dos domínios variá veis maduros do anticorpo 21.2.1
DESCRIÇÃO: SEQÜÊNCIA:
DNA da Cadeia Pesada CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGG- TCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCA-
Petição 870190007041, de 23/01/2019, pág. 134/192
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GCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGTCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATGTCATATGATGGAAGTAGTAAATACTATGCAAACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATAAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATGGGGGTAAAGCAGTGCCTGGTCCTGACTACTGGGGCCAGGGAATCCTGGTCACCGTCTCCTCAG
Proteína da Cadeia Pesada QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYVMHWVRQAPGKGLEWVAVMSYDGSSKYYANSVKGRFTISRDNSKNTLYLQINSLRAEDTAVYYCARDGGKAVPGPDYWGQGILVTVSS
DNA da Cadeia Leve GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGTGTTCTGTATAGTAATGGATACAACTATTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGTTTTACAAACTCCATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAAC
Proteína da Cadeia Leve DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSVLYSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQVLQTPFTFGPGTKVDIK
Tabela 9: Seqüências de DNA e de proteína dos domínios variá' veis maduros do anticorpo 21.1.1
DESCRIÇÃO: SEQÜÊNCIA:
DNA da Cadeia Pesada CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTCGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATCTGATGGAGGTAATAAA-
Petição 870190007041, de 23/01/2019, pág. 135/192
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TACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTACGAGAAGAGGGACTGGAAAGACTTACTACCACTACTGTGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAG
Proteína da Cadeia Pesada QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSRYG- MHWVRQAPGKGLEWVAVISSD- GGNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAE- DTAVYYCTRRGTGKTYYHYCGMDVWGQGTTVTVSS
DNA da Cadeia Leve GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTG- CCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGTATAGTAATGGATATAACTATTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACACCTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGTTCAGGCACTGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGCTCTACAAACTCCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAC
Proteína da Cadeia Leve DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLYSNGYNYLDWYLQKPGQSPHLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPRTFGQGTKVEIK
Tabela 10: Seqüências de DNA e de proteína dos domínios variá veis maduros do anticorpo 23.5.1
DESCRIÇÃO: SEQÜÊNCIA:
DNA da Cadeia Pesada CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGTAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAACTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAATTATATCATATGATGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATGTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTG-
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TATTACTGTGCGAGACGCGGTCACTACGGGAGGGAT- TACTACTCCTACTACGGTTTGGACGTCTGGGG- CCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAG
Proteína da Cadeia Pesada QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCVASGFTFSNYG- MHWVRQAPGKGLEWVAIISYDGSNKYYADSVKGRFTIS- RDNSKNTLYVQMNSLRAEDTAVYYCAR- RGHYGRDYYSYYGLDVWGQGTTVTVSS
DNA da Cadeia Leve GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGCCTGGTAATGGATACAACTATTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGCTCTACAAACTCCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAC
Proteína da Cadeia Leve DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLL- PGNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPRTFGQGTKVEIK
Tabela 11: Seqüências de DNA e de proteína dos domínios variáveis maduros do anticorpo 23.28.1
DESCRIÇÃO: SEQÜÊNCIA:
DNA da Cadeia Pesada CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGACACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGAGGTTACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCCCCTGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGTATATCTATTACAGTGGGAGCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAACTCTGTGACCGCTGCGGACACGGCCGTGTATTATTGTGCGAGAAAGGGGGGCCTCTACGGTGACTACGGCTGGTTCGCCCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAG
Petição 870190007041, de 23/01/2019, pág. 137/192
130/176
Proteína da Cadeia Pesada QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCTVSGGSIRGYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLNSVTAADTAVYYCARKGGLYGDYGWFAPWGQGTLVTVSS
DNA da Cadeia Leve GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCGACTTAGCCTGGCACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGACTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCACTGTCGTAGCTTATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAAC
Proteína da Cadeia Leve EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSS- DLAWHQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSG- TDFTLTISRLEPEDFAVYYCQHCRSLFTFGPGTKVDIK
DNA de Cadeia Pesada (domínio variável) (23.28.1 H-D16E) (SEQ ID NO: 97) CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGAGGTTACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCCCCTGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGTATATCTATTACAGTGGGAGCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAACTCTGTGACCGCTGCGGACACGGCCGTGTATTATTGTGCGAGAAAGGGGGGCCTCTACGGTGACTACGGCTGGTTCGCCCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAG
Proteína de Cadeia Pesada (domínio variável) (23.28.1 HD16E) (SEQ ID NO: 98) QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIRGYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLNSVTAADTAVYYCARKGGLYGDYGWFAPWGQGTLVTVSS
Tabela 12: Seqüências de DNA e de proteína dos domínios variá
Petição 870190007041, de 23/01/2019, pág. 138/192
131/176 veis maduros do anticorpo 23.29.1
DESCRIÇÃO: SEQÜÊNCIA:
DNA da Cadeia Pesada CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTACAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACGCGGTCACTACGGGAATAATTACTACTCCTATTACGGTTTGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAG
Proteína da Cadeia Pesada QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFT- FSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYD- GSNKYYADSVKGRFTIYRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA- VYYCARRGHYGNNYYSYYGLDVWGQGTTVTVSS
DNA da Cadeia Leve GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGCCTGGTAATGGATACAACTATTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGCTCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGATTTATTACTGCATGCAAGCTCTACAAACTCCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAC
Proteína da Cadeia Leve DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLL- PGNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCMQALQTPRTFGQGTKVEIK
Petição 870190007041, de 23/01/2019, pág. 139/192
132/176
Tabela 13: Seqüências de DNA e de proteína dos domínios variá veis maduros do anticorpo 24.2.1
DESCRIÇÃO: SEQÜÊNCIA:
DNA da Cadeia Pesada CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGAGGTTACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGTATATCTATTACAGTGGGAGCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGTTCTGTGACCGCTGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAAGGGGGGGCCTCTACGGTGACTACGGCTGGTTCGCCCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAG
Proteína da Cadeia Pesada QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIRGYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARRGGLYGDYGWFAPWGQGTLVTVSS
DNA da Cadeia Leve GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCACCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATAGTAGCTTATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAAC
Proteína da Cadeia Leve EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRAS- QSVSSTYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYSSLFTFGPGTKVDIK
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133/176
Tabela 14: Seqüências de DNA e de proteína do anticorpo 21.2.1
DESCRIÇÃO: SEQÜÊNCIA (seqüência sinalizadora sublinhagemda)
DNA da Cadeia Pe- ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGG1 1 1 1CC1CGTTG-
sada CTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGTCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGTCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATGTCATATGATGGAAGTAGTAAATACTATGCAAACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATAAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATGGGGGTAAAGCAGTGCCTGGTCCTGACTACTGGGGCCAGGGAATCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGT-
Petição 870190007041, de 23/01/2019, pág. 141/192
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CAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
Proteína da Cadeia MEFGLSWVFLVALLRGVQCQVQLVESGGGWQPGRSL-
Pesada RLSCAASGFTFSSYVMHWVRQAPGKGLEWVAVMSYDGSSKYYANSVKGRFTISRDNSKNTLYLQINSLRAEDTAVYYCARDGGKAVPGPDYWGQGILVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
DNA da Cadeia Leve ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAATGCTCTGGGTCTCTGGATCCAGTGGGGATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGTGTTCTGTATAGTAATGGATACAACTATTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGTTTTACAAACTCCATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCA-
Petição 870190007041, de 23/01/2019, pág. 142/192
135/176
GAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACG- CCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
Proteína da Cadeia Leve MRLPAQLLGLLMLWVSGSSGDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSVLYSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQVLQTPFTFGPGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Tabela 15: Seqüências de DNA e de proteína do anticorpo 22.1.1
DESCRIÇÃO: SEQÜÊNCIA (seqüência sinalizadora sublinhagemda)
DNA da Cadeia Pesada ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGG1 1 1 1CC1CGTTG-
CTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGTCAGGTGCAACTGG-
TGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTCGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATCTGATGGAGGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTACGAGAAGAGGGACTGGAAAGACTTACTACCACTACTGTGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCT-
Petição 870190007041, de 23/01/2019, pág. 143/192
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CAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
Proteína da Cadeia Pesada MEFGLSWVFLVALLRGVQCQVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSRYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISSDGGNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRRGTGKTYYHYCGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Petição 870190007041, de 23/01/2019, pág. 144/192
137/176
DNA da Cadeia Leve ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAATGCTCTGGGTCTCTGGATCCAGTGGGGATATTGTGATGA-
CTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGTATAGTAATGGATATAACTATTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACACCTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGTTCAGGCACTGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGCTCTACAAACTCCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCYTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
Proteína da Cadeia Leve MRLPAQLLGLLMLWVSGSSGDIVMTQSPLSLPVTPGE-
PASISCRSSQSLLYSNGYNYLDWYLQKPGQSPHLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Tabela 16: Seqüências de DNA e de proteína do anticorpo 23.5.1
DESCRIÇÃO: SEQÜÊNCIA (seqüência sinalizadora sublinhagemda)
DNA da Cadeia Pesada ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTG- CTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGTCAGGTGCAGCTGGTG-
GAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGG- TCCCTGAGACTCTCCTGTGTAGCCTCTGGATTCACCTT- CAGTAACTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCA-
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GGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAATTATATCATATGATGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATGTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACGCGGTCACTACGGGAGGGATTACTACTCCTACTACGGTTTGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
Petição 870190007041, de 23/01/2019, pág. 146/192
139/176
Proteína da Ca- MEFGLSWVFLVALLRGVQCQVQLVESGGGWQPGRSLR-
deia Pesada LSCVASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAIISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYVQMNSLRAEDTAVYYCARRGHYGRDYYSYYGLDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
DNA da Cadeia ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAATG-
Leve CTCTGGGTCTCTGGATCCAGTGGGGATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGCCTGGTAATGGATACAACTATTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGCTCTACAAACTCCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTSTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCYTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA
Proteína da Ca- MRLPAQLLGLLMLWVSGSSGDIVMTQSPLSLPVTPGEPA-
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140/176
deia Leve SISCRSSQSLLPGNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTAXWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Tabela 17: Seqüências de DNA e de proteína do anticorpo 23.28.1
DESCRIÇÃO: SEQÜÊNCIA (seqüência sinalizadora sublinhagemda)
DNA da Cadeia ATGAAACATCTGTGGTTCTTCCTTCTCCTGGTGG-
Pesada CAGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGAGGTTACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCCCCTGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGTATATCTATTACAGTGGGAGCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAACTCTGTGACCGCTGCGGACACGGCCGTGTATTATTGTGCGAGAAAGGGGGGCCTCTACGGTGACTACGGCTGGTTCGCCCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTT-
Petição 870190007041, de 23/01/2019, pág. 148/192
141/176
CCCCCCAAAACCCAAGGACACCCT- CATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
Proteína da Cadeia Pesada MKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQLQESGPGLVK-
PSETLSLTCTVSGGSIRGYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLNSVTAADTAVYYCARKGGLYGDYGWFAPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR-
Petição 870190007041, de 23/01/2019, pág. 149/192
142/176
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
DNA da Cadeia Leve ATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGC-
TACTCTGGCTCCCAGAATCCACCGGAGAAATTGTG-
TTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCGACTTAGCCTGGCACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGACTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCACTGTCGTAGCTTATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
Proteína da Cadeia Leve METPAQLLFLLLLWLPESTGEIVLTQSPGTLSLSPGE-
RATLSCRASQSVSSSDLAWHQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQHCRSLFTFGPGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Petição 870190007041, de 23/01/2019, pág. 150/192
143/176
Tabela 18: Seqüências de DNA e de proteína do anticorpo 23.29.1
DESCRIÇÃO: SEQÜÊNCIA (seqüência sinalizadora sublinhagemda)
DNA da Cadeia ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGG1 1 1 1CC1CGTTG-
Pesada CTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGTCAGGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTACAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACGCGGTCACTACGGGAATAATTACTACTCCTATTACGGTTTGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCA-
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GCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
Proteína da Cadeia Pesada MEFGLSWVFLVALLRGVQCQVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTIYRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGHYGNNYYSYYGLDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
DNA da Cadeia Leve ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAATG-
CTCTGGGTCTCTGGATCCAGTGGGGATATTGTGATGAC-
TCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGCCTGGTAATGGATACAACTATTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGCTCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGATTTATTACTGCATGCAAGCTCTACAAACTCCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTTCAGTGGAGGGTGGATAACG-
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CCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
Proteína da Cadeia MRLPAQLLGLLMLWVSGSSGDIVMTQSPLSLPVTPGEPA-
Leve SISCRSSQSLLPGNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCMQALQTPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWRVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
DNA de Cadeia ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAATG-
Leve CTCTGGGTCTCTGGATCCAGTGGGGATATTGTGATGAC-
(23.29.1LR174K) TCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAG-
(SEQIDNO: 101) CCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGCCTGGTAATGGATACAACTATTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGCTCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGATTTATTACTGCATGCAAGCTCTACAAACTCCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTTCAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
Proteína de Cadeia MRLPAQLLGLLMLWVSGSSGDIVMTQSPLSLPVTPGEPA-
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Leve SISCRSSQSLLPGNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSN-
(23.29.1LR174K) RASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCMQAL-
(SEQIDNO: 101) QTPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Tabela 19: Seqüências de DNA e de proteína do anticorpo 24.2.1
DESCRIÇÃO: SEQÜÊNCIA (seqüência sinalizadora sublinhagemda)
DNA da Cadeia ATGAAACATCTGTGGTTCTTCCTTCTCCTGGTGGCAG-
Pesada CTCCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGAGGTTACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGTATATCTATTACAGTGGGAGCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGTTCTGTGACCGCTGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAAGGGGGGGCCTCTACGGTGACTACGGCTGGTTCGCCCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCAC-
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CGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
Proteína da Ca- MKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQLQESGPGLVKPSETLS-
deia Pesada LTCTVSGGSIRGYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARRGGLYGDYGWFAPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
DNA da Cadeia ATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTAC-
Leve TCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCACCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATAGTAGCTTATTCACTTTCGGCCCTGG-
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GACCAAAGTGGATATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
Proteína da Cadeia Leve METPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPGTLSLSPGE-
RATLSCRASQSVSSTYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYSSLFTFGPGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Tabela 20: Seqüências de DNA e de proteína dos domínios variá veis maduros do anticorpo 22.1.1 H-C109A
DESCRIÇÃO: SEQÜÊNCIA (seqüência sinalizadora sublinhagemda)
DNA da Cadeia Pesada (SEQ ID NO: 95) CAGGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTCGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATCTGATGGAGGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTACGAGAAGAGGGACTGGAAAGACTTACTACCACTACGCCGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAG
Proteína da Cadeia Pesada (SEQ ID NO: 96) QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSRYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISSDGGNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRRGTGKTYYHYAGMDVWGQGTTVTVSS
Tabela 21: Seqüências de DNA e de proteína dos domínios variá
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149/176 veis maduros do anticorpo 23.28.1 L-C92A
DESCRIÇÃO: SEQÜÊNCIA (seqüência sinalizadora sublinhagemda)
DNA da Cadeia Leve (SEQ ID NO: 99) GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCGACTTAGCCTGGCACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGACTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCACGCCCGTAGCTTATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAAC
Proteína da Cadeia Leve (SEQIDNO: 100) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSS- DLAWHQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSG- TDFTLTISRLEPEDFAVYYCQHARSLFTFGPGTKVDIK
EXEMPLO III
Análise das Substituições de Aminoácidos das Cadeias Pesada e Leve [00269] As Figuras 1D-1H e 2D-2H proporcionam alinhagemmentos de seqüência entre as seqüências previstas de aminoácidos do domínio variável da cadeia pesada dos anticorpos monoclonais 3.1.1, 7.1.2,
10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1 H-C109A, 23.5.1, 23.28.1,
23.28.1 H-D16E, 23.29.1 e 24.2.1 e as seqüências de aminoácidos da linhagem germinativa de seus respectivos genes. A maioria das regiões da cadeia pesada CDR3 contém inserções de aminoácidos.
[00270] O gene DLR1 usado no domínio VH do anticorpo 21.4.1 codifica dois resíduos de cisteína (Cys). Análise por espectrometria de massa e modelagem por homologia demonstraram que os dois resíduos Cys são ligados por dissulfeto e que essa ligação de dissulfeto não rompe a estrutura do anticorpo.
[00271] As Figuras 1A-1C e 2A-2C proporcionam alinhagemmentos de seqüência entre as seqüências previstas de aminoácidos do domínio variável da cadeia leve dos clones de anticorpos monoclonais
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3.1.1, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.28.1,
23.28.1 L-C92A, 23.29.1 e 24.2.1 e as seqüências de aminoácidos da linhagem germinativa de seus respectivos genes. As cadeias leves desses anticorpos são derivadas da três genes Vk diferentes. Sete dos onze anticorpos usam o gene Vk A3/A19, seis dos quais têm duas mutações na região CDR1. Ainda, cinco dos sete anticorpos que usam o gene Vk A3/A19 também usam o gene Jk1 ; em todos esses anticorpos, o primeiro aminoácido derivado do gene Jk1 é consistentemente trocado de um W para um R.
[00272] Será apreciado que muitas das substituições ou inserções de aminoácidos acima identificadas existem em proximidade íntima a ou dentro de uma CDR. Parece que tais substituições levam a algum efeito sobre a ligação do anticorpo à molécula do CD40. Ainda, tais substituições tiveram efeito significativo sobre a afinidade dos anticorpos.
EXEMPLO IV
Reatividade-Concorrente entre Espécies dos Anticorpos da Invenção [00273] Realizou-se análises por FACS a fim de determinar a ligação e afinidade dos anticorpos da invenção pelo CD40 de várias espécies, particularmente determinados macacos mais velhos. Incubou-se alíquotas de sangue íntegro humano e de maçado durante 1 hora sobre gelo com concentrações crescentes dos anticorpos anti-CD40 da invenção exemplificados aqui ou com um anticorpo de hemocianina de antilapa keyhole (KLH) como um controle negativo. Então, incubouse as amostras durante 30 minutos sobre gelo com RPE lgG2conjugada anti-humana (ficoeritrina). Mediu-se a ligação por meio de citometria de fluxo das células B CD19/CD20 positivas e analisou-se os histogramas de intensidade de fluorescência (F12-H) versus o número de células (Contagens) usando o software CelIQuest. Estimou-se a ligação (Kd) para cada anticorpo a partir de gráficos da intensidade
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151/176 de fluorescência média versus concentração de anticorpo. Controlouse a eliminação do anticorpo através de medição da ligação sobre uma faixa de concentrações de células.
[00274] Testou-se os anticorpos 3.1.1, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1 e 21.4.1 com relação à ligação a células B humanas, de rhesus e cynomolgus. Foi também testado os anticorpos 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1,
23.28.1, 23.29.1 e 24.2.1 com relação à ligação a células B humanas e de cynomolgus.
[00275] Observou-se que o sinal e a concentração máxima para ligação máxima média às células de macaco estava dentro de um fator de dois com relação aos parâmetros correspondentes para células B humanas. Nenhuma ligação foi observada em experimentos similares com sangue de camundongo, rato, coelho e cão.
EXEMPLO V
Seletividade de Anticorpos pelo CD40 [00276] Conduziu-se outro ensaio in vitro para determinar a seletividade dos anticorpos da invenção com relação ao CD40.
ELISA para Seletividade pelo CD40: Materiais e Métodos [00277] Revestiu-se uma lâmina FluroNUNC com 96 cavidades (Cat. Nunc N- 475515) com quatro antígenos: CD40/lg, CD44/lg, RANK/lg, 4-1BB/lg, TNFR-1/lg e TNFR-2/lg (antígenos gerados nolocal), durante a noite a +4°C a 1 gg/ml de 100 μΙ/cavidade em tampão de bicarbonato de sódio a 0,1 M, pH de 9,6. Então, lavou-se a lâmina com PBST (PBS + 0,1% de Tween-20) três vezes e bloqueou-se a lâmina com PBST + 0,5% de BSA a 150 μΙ/cavidade. Incubou-se a lâmina em temperatura ambiente durante 1 hora e, então, lavou-se com PBST três vezes. Em seguida, diluiu-se os anticorpos anti-CD40 gerados no Exemplo I em bloco a 1 μg/ml e adicionamos os anticorpos diluídos à lâmina. Incubou-se a lâmina em temperatura ambiente durante 1 hora, então, lavamos com PBST três vezes. Então, foi tratada as ca
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152/176 vidades que continham os anticorpos gerados no Exemplo I com 100 ml/cavidade de lgG2-HRP anti-humana (Cat. Southern Biotech No. 9070-05) em uma diluição a 1:4000 em bloco. Também, tratamos uma fileira com IgG anti-humana (Cat. Jackson N- 209-035-088) diluída a 1:5000 em bloco e adicionamos a 100 μΙ/cavidade a fim de normalizar o revestimento da lâmina. Também foi tratada uma fileira com CD40HRP anti-humano (Cat. Pharmingen N2. 345815/Custom HRP conjugated) a 0,05 μο/ιυΙ diluído em bloco como um controle positivo. Incubouse a lâmina em temperatura ambiente durante 1 hora e, então, foi lavado com PBST três vezes. Adicionou-se substrato TMB (K % P Labs) a 100 μΙ/cavidade e incubou-se a lâmina durante 5 a 10 minutos. Então, leu-se a lâmina usando uma leitora para lâminas Spectra-Max™. Os resultados mostraram que os anticorpos têm uma seletividade pelo CD40 que é pelo menos 100 vezes maior do que sua seletividade pelo RANK, 4-1 BB, TNFR-1 e TNFR-2 pelo fato de que o sinal CD4específico (sinal ao CD40 menos base) é pelo menos 100X maior do que o sinal correspondente para as outras moléculas.
EXEMPLO VI
Estudos de Classificação de Epitopo [00278] Tendo demonstrado que os anticorpos da invenção são seletivos para o CD40, realizou-se análise de ligação por competição usando BI Açore e FACS
Estudos de Competição por BIAcore [00279] Conduziu-se estudos de competição por BIAcore para determinar se os anticorpos anti-CD40 humanos da invenção se ligam aos mesmos ou a locais distintos sobre a molécula do CD40.
[00280] Nesses experimentos, foi usado um instrumento BIAcore 2000, seguindo os protocolos do fabricante. Proteína A foi imobilizada sobre as superfícies do chip sensor do BIAcore. Uma concentração de saturação de CD40-lg, a qual compreende o domínio extracelular do
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CD40, foi ligada ao chip sensor. Então, foi ligado um primeiro anticorpo anti-CD40 agonista humano da invenção, um anticorpo anti-CD40 comercial ou CD40L ao CD40 ligado ao chip sensor sob condições de saturação. Então, mediu-se a capacidade de um segundo anticorpo anti-CD40 agonista humano da invenção de competir com o primeiro anticorpo, o anticorpo comercial ou CD40L pela ligação ao CD40. Essa técnica permitiu atribuir os anticorpos a diferentes grupos de ligação. A ligação ao CD40 indicou reconhecimento de um epitopo independente. A carência de ligação pode indicar reconhecimento do mesmo epitopo ou de epitopos sobrepostos.
Estudos por FACS [00281] Conduziu-se estudos de FACS para determinar se os anticorpos anti-CD40 da invenção se ligam aos mesmos ou a locais distintos sobre a molécula do CD40 e determinar se eles se ligam aos mesmos ou a locais distintos sobre a molécula do CD40 que os anticorpos anti-CD40 comercialmente disponíveis EA5 (Cat. Alexis N2 ANC-300-050), LOB7/6 (Serotec MCA/590PE) e 5C3 (Pharmingen n2 555458 (não-rotulado) e 555460 (PE-rotulado por FACS).
[00282] Corou-se por contador células dendríticas tratadas com os anticorpos anti-CD40 da invenção com anticorpo EA5 PE-rotulado ou LOB7/6 PE-rotulado sobre gelo durante 30 minutos. Após uma lavagem, a coloração das células foi analisado sobre um citômetro com calibrador B-D. Ligação reduzida dos anticorpos comerciais foi interpretada como uma indicação de que o anticorpo de teste se ligou ao mesmo ou a epitopos sobrepostos.
[00283] Análise de ligação por competição por meio de BIAcore e FACS mostrou que os epitopos reconhecidos pelo anticorpos mAb
21.4.1 se sobrepõem ao epitopo reconhecido pelo anticorpo EA5, não se sobrepõem ao epitopo reconhecido pelo anticorpo comercialmente disponível LOB7/6 e não se sobrepõem ao local de ligação pelo
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CD40L. Os epitopos reconhecidos pelos anticorpos restantes se sobrepõem ao local de ligação pelo CD40L.
[00284] A Tabela 22 resume os resultados desses estudos de classificação de epitopos.
TABELA 22
Classificação de Epitopos através de Competição por BIAcore de Determinados Anticorpos Anti-CD40 da Invenção
EA5 5C3 LOB7/6 3.1.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.29.1 21.4.1 23.25.1, 23.28.1, 24.2.1 CD40L
EA5 X X X X
5C3 X X X X X
LOB7/6 X X X X
3.1.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.29.1 X X X
21.4.1 X X X
23.25.1, 23.28.1, 24.2.1 X X X X
CD40L X X X X X X
EXEMPLO VII
Super-requlação de Moléculas da Superfície pelos anticorpos AntiCD40 [00285] Conduziu-se um ensaio com sangue íntegro a fim de determinar se os anticorpos anti-CD40 humanos da invenção superregulam a expressão de moléculas da superfície sobre células B.
[00286] Sangue íntegro humano ou de primata foi diluído a 1:1 com
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155/176 meio RPMI e incubado 24 horas com várias concentrações de anticorpos agonistas CD40 ou controles. As células foram coradas durante 30 minutos (sobre gelo, no escuro) com HLA-DR, ICAM, B7-1, B7-2, CD19/CD20, CD40, CD23 e CD71 usando-se reagentes para anticorpo com rótulo de fluorocroma comercial mente disponíveis. As células foram, então, analisadas sobre um FACS-Caliber (Becton-Dickinson). Células B foram identificadas através de formação de um portão sobre células CD19 ou CD20 positivas e ativação de marcadores determinados para esse portão.
[00287] O aumento duplo máximo da fluorescência média (a 1 < pg/ml de anticorpo) e a ECso média obtidos usando-se um dos anticorpos anti-CD40 da invenção reivindicada (21.4.1) são mostrados na Tabela 23.
TABELA 23
Super-requlação de Moléculas da Superfície de Células B por um Anticorpo Anti-CD40 da Invenção
Aumento Duplo Máximo ECso (ng/ml)
Média +/- Desvio Padrão Média +/- Desvio Padrão
MHC II 4,50 +/- 0,52 3,85 +/- 0,35
CD71 2,30 +/- 0,77 0,73 +/- 0,28
ICAM 4,52 +/- 2,42 15,3 +/-7,3
CD23 69,9 +/- 25,8 19,0 +/-4,4
B7-2 2,74 +/- 0,14 16,0 +/-21,9
[00288] Também foram conduzidos experimentos para determinar se os anticorpos anti-CD40 humanos da invenção super-regulam a expressão de moléculas da superfície de células dendríticas monócitoderivadas.
Preparação das células dendríticas monócito-derivadas
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156/176 [00289] Sangue periférico foi coletado de voluntários humanos normais. Células mononucleares foram isoladas usando-se tubos Sigma Accuspin (St. Louis, MO), lavadas com meio RPMI (Gibco BRL, Rockville, MD) e colocadas em frascos para cultura tecidual a 5 x 106/ml em meio RPMI completo (contendo 100 U/ml de penicilina/estreptomicina, tampão de HEPES a 10 mM, glutamina a 2 mM, aminoácidos nãoessenciais a 0,1 mM; todos da Gibco BRL); e 10% de soro fetal de bezerro (Hyclone, Logan, Utah). Após uma incubação de 3 horas a 37°C (5% de CO2), as células não-aderentes foram removidas e as células T foram isoladas usando-se colunas de seleção (R&D Systems, Minneapolis, MN). As células aderentes foram lavadas com meio RPMI e incubadas durante 7 dias em meio RPMI completo suplementado com 10 ng/ml de IL-4 (R&D Systems) e 100 ng/ml de GM-CSF (R&D Systems). As células não-aderentes foram, então, isoladas, lavadas e utilizadas como células dendríticas derivadas de monócitos (mDCs) para todos os experimentos. As células aderentes restantes foram removidas usando-se tripsina/EDTA e utilizadas em experimentos empregando monócitos aderentes.
[00290] Para determinar se os anticorpos anti-CD40 da invenção super-regulam a expressão de marcadores na superfície celular, as células dendríticas derivadas de monócitos foram cultivadas com várias concentrações de anticorpos agonistas durante 48-72 horas, seguido por coloração (30 minutos, sobre gelo, no escuro) para HLA-DR, ICAM, B7-1, B7-2, CD40 e CD83, usando-se reagentes para anticorpo com rótulo de fluorocromo comercialmente disponíveis. As células foram, então, analisadas sobre um FACS-Caliber (Becton-Dickinson).
[00291] O aumento duplo máximo da fluorescência média (a < 1 pg/ml de anticorpo) e a EC50 média obtidos usando-se um dos anticorpos anti-CD40 da invenção reivindicada (21.4.1) são mostrados na Tabela 24.
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TABELA 24
Super-requlação de Moléculas da Superfície de Células Dendríticas por um Anticorpo Anti-CD40 da Invenção
Aumento Duplo Máximo EC50 (ng/ml)
Média +/- Desvio Padrão Média +/- Desvio Padrão
MHC II 7,7 +/- 5,6 252 +/- 353
CD83 36,3 +/- 42,2 233 +/- 262
ICAM 10,4 +/-4,8 241 +/- 140
B7-2 21,9 +/-9,4 71,4 +/-44,4
[00292] Também foram conduzidos experimentos similares com células B e mDCs usando vários anticorpos anti-CD40 da invenção e marcadores adicionais. Mediu-se a expressão de moléculas da superfície de células B (MHC-II, ICAM, B7-1, B7-2 e CD23) conforme descrito acima, mas usando 1 gg/ml do anticorpo anti-CD40. Os resultados desse experimento são apresentados na Tabela 25. Mediu-se a expressão de moléculas da superfície de células dendríticas (MHC-II, ICAM, B7-1, B7-2 e CD83) após 72 horas conforme indicado acima, mas usando 1 pg/ml do anticorpo anti-CD40. Os resultados desse experimento são apresentados na Tabela 26. As Tabelas 25-26 mostram o aumento duplo na intensidade média +/- o desvio padrão.
TABELA 25
Super-requlação de Moléculas da Superfície de Células B pelos Anticorpos Anti-CD40 da Invenção
Classe II do MHC ICAM (CD54) B7-1 (CD80) B7-2 (CD86) CD23
Células B Células B Células B Células B Células B
3.1.1 3,2 +/- 2,6 1,3 +/-0,2 1,7+/-0,2 1,2+/-0,4 5,6 +/- 4,8
21.2.1 1,2 +/-0,2 1,3 +/-0,9 0,9 +/- 0,5 1,0+/-0,04 1,0 +/-0,1
21.4.1 3,6 +/- 3,0 5,0 +/- 3,0 1,9+/-0,8 1,8+/-0,7 21,5+/-34,8
22.1.1 1,4 +/-0,5 1,1 +/-0,2 1,2+/-0,3 1,0+/-0,1 1,3 +/-0,2
23.5.1 1,4 +/-0,5 1,1 +/-0,2 1,4+/-0,6 1,0+/-0,1 1,1 +/-0,2
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23.25.1 2,5 +/-1,1 2,5 +/- 0,9 1,6+/-0,4 1,3+/-0,2 4,3 +/- 2,3
23.28.1 1,1 +/-0,2 1,1 +/-0,2 1,8+/-0,6 1,0+/-0,1 1,1 +/-0,4
23.29.1 1,2 +/-0,2 1,0 +/-0,2 1,3+/-0,6 0,9 +/- 0,2 1,1 +/-0,1
24.2.1 1,8 +/- 1,0 1,6 +/-0,8 1,1 +/-0,4 1,1 +/-0,2 0,9 +/- 0,6
TABELA 26
Super-regulacão de Moléculas da Superfície de Células Dendríticas pelos Anticorpos Anti-CD40 da Invenção
Classe II do MHC ICAM (CD54) B7-1 (CD80) B7-2 (CD86) CD23
CD CD CD CD CD
3.1.1 4,4 +/- 2,4 1,5 +/-0,7 1,8+/-0,9 23,7 +/- 33,5 15,2+/- 18,2
21.2.1 1,8 +/-1,3 1,5 +/-0,9 0,9 +/- 0,4 7,4+/- 10,5 10,8+/- 16,5
21.4.1 5,0 +/- 3,8 3,7 +/-1,4 1,5+/-1,1 12,9 +/- 13,3 48,6 +/- 49,5
22.1.1 2,3 +/- 1,2 1,6 +/-0,7 1,4+/- 1,0 16,3 +/-25,5 12,0+/- 17,0
23.5.1 2,3 +/- 1,8 1,2 +/-0,5 1,1 +/-0,6 10,7 +/-17,5 9,2 +/-11,1
23.25.1 2,1 +/- 1,8 2,4 +/-1,0 1,1 +/-0,5 3,3 +/- 4,2 13,6+/-28,9
23.28.1 2,4 +/- 1,7 2,7 +/-2,1 1,3+/-0,6 10,6 +/-17,5 18,3+/-22,6
23.29.1 2,0 +/- 1,5 1,2 +/-0,4 0,9 +/- 0,5 8,4+/- 10,6 10,6+/- 13,1
24.2.1 4,7 +/- 3,0 2,1 +/- 1,2 3,8 +/- 3,8 56,6 +/- 95,8 31,2+/-28,4
[00293] A Tabela 27 compara a super-regulação de moléculas da superfície celular em células dendríticas com relação a células B em termos da proporção de aumento duplo médio em células dendríticas com relação ao aumento duplo médio em células B.
TABELA 27
Super-regulação de Moléculas da Superfície Celular em Células Dendríticas com relação a Células B
B7-1 (CD80) B7-2 (CD86) Classe II do MHC ICAM (CD54)
3.1.1 1,08 19,40 1,38 1,15
21.2.1 1,01 7,37 1,49 1,12
21.4.1 0,77 7,04 1,37 0,74
22.1.1 1,18 16,36 1,61 1,44
23.5.1 0,83 10,54 1,59 1,06
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23.25.1 0,66 2,57 0,85 0,98
23.28.1 0,71 10,81 2,16 2,57
23.29.1 0,73 9,07 1,66 1,23
24.2.1 3,48 52,30 2,64 1,35
EXEMPLO VIII
Intensificação da Secreção de Citocina [00294] Conduziu-se um ensaio com células dendríticas derivadas de monócitos para determinar se os anticorpos anti-CD40 humanos da invenção intensificam a secreção de IL-12p40, IL-12p70 e IL-8.
[00295] As células dendríticas derivadas de monócitos e os monócitos aderentes foram preparados conforme descrito acima. As células foram cultivadas na presença de um anticorpo anti-CD40 da invenção (21.4.1) ou com um anticorpo de hemocianina anti-lapa keyhole) (KLH) como um controle negativo. As citocinas foram medidas nos sobrenadantes a 24 horas por meio de ELISA (R&D Systems). Em alguns estudos (veja Tabela 28), as células dendríticas derivadas de monócitos tratadas com o anticorpo também foram co-estimuladas com 100 ng/ml de LPS (Sigma), 1000 U/ml de IFNy (R&D Systems) ou 25 ng/ml de IL-1 β (R&D Systems).
[00296] O anticorpo anti-CD40 intensificou a produção de IL-12p40, IL-12p70 e IL-8 em células dendríticas derivadas de monócitos e em monócitos aderentes. A presença de LPS intensificou adicionalmente a produção de IL-12p40 e IL-12p70. Apenas níveis mínimos de citocinas foram detectados nos sobrenadantes de células dendríticas incubadas com o anticorpo de controle de isótipo, anti-KLH. Resultados representativos são apresentados na Tabela 28 e Figuras 3 e 4. A Tabela 28 resume as principais citocinas produzidas pelas células dendríticas ou monócitos aderentes por 1 gg/ml de um anticorpo anti-CD40 da invenção (21.4.1) +/- 100 ng/ml de LPS. Conforme mostrado na Figura 3, o anticorpo anti-CD40 intensificou a produção de IL-12p40 pelas células dendríticas humanas. A Figura 4 ilustra a produção intensificada de IL
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12p70 por células dendríticas humanas na presença de anticorpo e 100 ng/ml de LPS.
TABELA 28
Intensificação da Secreção de IL-12p40, IL-12p70 e IL-8 por um Anticorpo Anti-CD40 da Invenção
T ratamento Citocina induzida
Tipo de célula Anticorpo 1 pg/ml LPS 100 ng/ml IL-12p40 pg/ml IL-12p70 pg/ml IL-8 pg/ml
Célula dendríticas 21.4.1 + 32252 1000 ND
21.4.1 - 1200 76 1200
anti-KLH + 14280 352 ND
anti-KLH - 200 4 150
Monócito aderente 21.4.1 - ND ND 7000
21.4.1 + ND 425 ND
anti-KLH - ND ND 400
anti-KLH + ND 30 ND
ND = não determinado.
[00297] Experimentos similares foram realizados usando-se anticorpos anti-CD40 múltiplos da invenção. As células dendríticas derivadas de monócitos foram preparadas conforme descrito acima e cultivadas na presença de várias concentrações dos anticorpos anti-CD40 e foram co-estimuladas com 100 ng/ml de LPS (Sigma). A IL-12p70 no sobrenadante foi medida a 24 horas por meio de ELISA (R&D Systems) e, para cada anticorpo, a EC50 foi determinada. Os resultados dos experimentos são apresentados na Tabela 29.
TABELA 29
Intensificação da Secreção de IL-12p70 em Células Dendríticas
Anticorpo Clone IL-12p70 em DC EC50 Max pg/ml pg/ml
21.4.1 0,3 1796-7004
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22.1.1 0,1 720-1040
23.25.1 0,2 540-960
23.5.1 0,1 676-1112
24.2.1 0,2 754-3680
3.1.1 0,2 668-960
23.28.1 0,2 1332-1404
23.29.1 0,1 852-900
21.2.1 0,03 656-872
[00298] Também foram testados a capacidade dos anticorpos antiCD40 da invenção de intensificar a secreção de IFN-gama a partir de células T em um ensaio com células dendríticas/células T alogênicas. Para realizar esse ensaio, células T e monócitos foram isolados do sangue periférico de voluntários saudáveis. Os monócitos foram diferenciados em células dendríticas usando-se os métodos acima descritos. 1 x 105 células obtidas de um indivíduo foram cultivadas com 1 x 105 células dendríticas obtidas de um indivíduo diferente na presença de um anticorpo anti-CD40 da invenção ou um anticorpo de controle. Após 4 dias de cultura, os sobrenadantes foram analisados com relação à secreção de IFN-gama por meio de ELISA. Os resultados desse ensaio são mostrados na Tabela 30.
TABELA 30
Intensificação da Secreção de IFN-gama pelos Anticorpos Anti-CD40 da Invenção
Anticorpo Clone IFNyem DC/TAIIo EC50 Max gg/ml pg/ml
21.4.1 0,3 212
22.1.1 0,3 110-180
23.25.1 0,3 180-232
23.5.1 0,2 150-240
24.2.1 0,2 111-194
3.1.1 0,1 100-195
23.28.1 0,2 120-190
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23.29.1 21.2.1 0,3 134-150 0,03 230-256
EXEMPLO IX
Indução de Citocinas Inflamatórias pelos Anticorpos Anti-CD40 da Invenção [00299] Os anticorpos 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1 e 3.1.1 foram testados em um ensaio de liberação de citocina com sangue íntegro descrito por Wing e outros, Therapeutic Immunol. 2: 183-90 (1995) a fim de determinar se citocinas inflamatórias são induzidas pelos anticorpos em concentrações de 1, 10 e 100 pg/ml. Nenhuma liberação significativa de TNF -a, IL-1 β, IFN-γ ou IL-6 foi observada com esses anticorpos nas concentrações indicadas no sangue de 10 doadores normais. EXEMPLO X
Intensificação da Imunogenicidade da Linhagem de Células Jv pelos Anticorpos Anti-CD40 [00300] Células JIYOYE CD40 positivas (ATCC CCL 87) (células Jy) foram cultivadas e mantidas em meio RPMI. As células JIYOYE foram incubadas durante 24 horas com um anticorpo anti-CD40 da invenção (21.4.1) ou com um anticorpo com um isótipo semelhante (antiKLH) em meio RPMI completo. As células foram, então, lavadas e tratadas com meios de 25 mg de mitomicina C (Sigma)/7 ml durante 60 minutos. Essas células foram, então, incubadas com células T humanas isoladas em uma proporção a 1:100 durante 6 dias a 37°C (5% de CO2). As células T foram, então, coletadas, lavadas e o nível de atividade do CTL determinado contra células JIYOYE com rótulo de cromo 51 fresco (New England Nuclear, Boston, MA). A atividade de CTL específica foi calculada como citólise % específica = (citólise Jy (cpm) - citólise espontânea (cpm)/(citólise total (cpm) - citólise espontânea (cpm)).
[00301] A Figura 5 ilustra que um anticorpo anti-CD40 da invenção (21.4.1) intensificou significativamente a imunogenicidade contra célu
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Ias Jy tratadas com o anticorpo.
EXEMPLO XI
Modelo de Tumor em Animal [00302] Para investigar a atividade antitumor dos anticorpos antiCD40 feitos de acordo com a invenção, projetou-se um modelo com camundongo SCID bege para testar o efeito in vivo do anticorpo sobre o desenvolvimento de tumor.
[00303] Foram obtidos camundongos beges SCID de Charles River e deixamos os camundongos se aclimatarem uma semana antes de uso. Foram injetada células tumorígenas (células Daudi (ATCC CCL 213), células K562 CD40(-) (ATCC CCL 243) e células de Raji (CD40+) (ATCC CCL 86), células de câncer de mama BT474 (ATCC HTB 20) ou células de próstata PC-3 (ATCC CRL 1435)) subcutaneamente em uma concentração de 1 x 107 células/animal. Em alguns casos, foram injetadas células T (5 x 105) e células dendríticas (1 x 105) do mesmo doador humano junto com as células tumorígenas. Também injetou-se um anticorpo anti-CD40 da invenção ou um controle de isótipo semelhante (anti-KLH), intraperitonealmente, imediatamente antes da injeção de tumor (uma injeção apenas). Então, mediu-se o desenvolvimento do tumor. Experimentos específicos são descritos abaixo.
[00304] Em um experimento, Injetou-se um anticorpo anti-CD40 da invenção (21.4.1) ou um controle com isótipo semelhante (anti-KLH), intraperitonealmente, em uma dose de 10 mg/kg imediatamente antes de injeção de tumor (uma injeção apenas). As células tumorígenas (células Daudi) foram injetadas subcutaneamente em uma concentração de 1 x 107 células/animal. Mediu-se o desenvolvimento do tumor com calibradores nos dias 17, 19, 20, 21, 25, 26, 27 e 28 após implante na presença de células T humanas e células dendríticas. Conforme mostrado na Figura 6, o anticorpo anti-CD40 inibiu o desenvolvimento do
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164/176 tumor em cerca de [60]%.
[00305] Em outro experimento, Injetou-se um anticorpo anti-CD40 da invenção (21.4.1) ou um controle com isótipo semelhante (antiKLH), intraperitonealmente, em uma dose de 0,1 mg/kg, 1 mg/kg ou 10 mg/kg imediatamente antes da injeção de tumor (uma injeção apenas). As células tumorígenas (células K562) foram injetadas subcutaneamente em uma concentração de 1 x 107 células/animal. Nesse experimento, foram injetadas células T (5 x 105) e células dendríticas (1 x 105) do mesmo doador humano junto com as células tumorígenas. Mediu-se o desenvolvimento do tumor com calibradores nos dias 17, 19, 20, 21, 25, 26, 27 e 28 após implante. Conforme mostrado na Figura 7, o anticorpo anti-40 inibiu o desenvolvimento do tumor em 6085%.
[00306] Em outro experimento, injetou-se um anticorpo anti-CD40 da invenção (21.4.1, 23.29.1 ou 3.1.1) ou um controle com isótipo semelhante (anti-KLH), intraperitonealmente, imediatamente antes da injeção de tumor (apenas uma injeção). O anticorpo de controle com isótipo semelhante e o anticorpo 21.4.1 foram injetados em uma dose de 1 mg/ml. Os anticorpos 23.29.1 e 3.1.1 foram injetados em uma dose de 1, 0,1, 0,01, 0,001 ou 0,0001 mg/kg. As células tumorígenas (células K562) foram injetadas subcutaneamente em uma concentração de 1 x 107 células/animal. Nesse experimento, foram injetadas células T (5 x 105) e células dendríticas (1 x 105) do mesmo doador humano junto com as células tumorígenas. Então, foram medimos o desenvolvimento do tumor com calibradores no dia 28 após implante. Os resultados desse experimento são mostrados nas Figuras 8 e 9. Cada ponto na figura representa uma medição de um animal individual.
[00307] Em outro experimento, injetou-se um anticorpo anti-CD40 da invenção (21.4.1) ou um controle com um isótipo semelhante (antiKLH), intraperitonealmente, imediatamente antes de injeção de tumor
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165/176 (uma injeção apenas). Os anticorpos foram injetados em uma dose de 1, 0,1, 0,01, 0,001 ou 0,0001 mg/kg. As células tumorígenas (células Raji) foram injetadas subcutaneamente em uma concentração de 1 x 107 células/animal. Em alguns animais, foram injetadas células T (5 x 105) e células dendríticas (1 x 105) do mesmo doador humano junto com as células tumorígenas. Então, mediu-se o desenvolvimento do tumor com calibradores no dia 28 após implante. Os resultados desse experimento são mostrados na Figura 10. Cada ponto na figura representa uma medição de um animal individual.
[00308] Em ainda outro experimento, injetou-se um anticorpo antiCD40 da invenção (21.4.1, 23.28.1, 3.1.1 ou 23.5.1) ou um controle com isótipo semelhante (anti-KLH), intraperitonealmente, imediatamente antes de injeção de tumor (uma injeção apenas). Os anticorpos foram injetados em uma dose de 1 ou 0,1 mg/kg. As células tumorígenas (células Raji) foram injetadas subcutaneamente em uma concentração de 1 x 107 células/animal. Então, mediu-se o desenvolvimento do tumor com calibradores no dia 28 após implante. Os resultados desse experimento são mostrados na Figura 11. Cada ponto na figura representa uma medição de um animal individual.
[00309] Em ainda outro experimento, injetou-se um anticorpo antiCD40 da invenção (21.4.1, 23.29.1 ou 3.1.1) ou um controle com isótipo semelhante (anti-KLH), intraperitonealmente, imediatamente antes de injeção de tumor (uma injeção apenas). Os anticorpos foram injetados em uma dose de 1 mg/kg. As células tumorígenas (células de câncer de mama BT474) foram injetadas subcutaneamente em uma concentração de 1 x 107 células/animal. Foram injetadas células T (5 x 105) e células dendríticas (1 x 105) do mesmo doador humano junto com as células tumorígenas. Então, mediu-se o desenvolvimento do tumor com calibradores no dia 39 após implante. Conforme mostrado na Figura 12, todos os anticorpos inibiram o desenvolvimento do tumor
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166/176 de câncer de mama. Cada ponto na figura representa uma medição de um animal individual.
[00310] Em ainda outro experimento, injetou-se um anticorpo antiCD40 da invenção (3.1.1) ou um controle com isótipo semelhante (anti-KLH), intraperitonealmente, imediatamente antes de injeção de tumor (uma injeção apenas). Os anticorpos foram injetados em uma dose de 1 mg/kg. As células tumorígenas (células de tumor de próstata PC-3) foram injetadas subcutaneamente em uma concentração de 1 x 107 células/animal. Então, mediu-se o desenvolvimento do tumor com calibradores no dia 41 após implante. Conforme mostrado na Figura 13, o anticorpo anti-CD40 inibiu o desenvolvimento do tumor de próstata em cerca de 60%. Cada ponto na figura representa uma medição de um animal individual.
EXEMPLO XII
Sobrevivência de Camundongos Beqes SCID Injetados com Células Tumorígenas Daudi e Tratados com os Anticorpos Anti-CD40 da Invenção [00311] Em outro experimento, injetou-se um anticorpo anti-CD40 da invenção ou um controle com isótipo semelhante (uma injeção), intraperitonealmente, imediatamente antes da injeção de tumor. Os anticorpos foram injetados em uma dose de 1 ou 0,1 mg/kg. As células tumorígenas (células Daudi) foram injetadas intravenosamente em uma dose de 5 x 106 células/animal. Então, monitorou-se a sobrevivência do animal. Conforme mostrado na Figura 14, todos os anticorpos anti-CD40 testados prolongaram a sobrevivência dos camundongos injetados com tumores em pelo menos seis dias.
[00312] A Tabela 31 lista a EDso dos anticorpos anti-CD40 nos diferentes modelos de tumores sólidos descritos no Exemplo XI. A Tabela 31 resume a atividade antitumor in vivo de alguns dos anticorpos antiCD40 da invenção em camundongos SCID. Além disso, a tabela lista a
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EDõo dos anticorpos anti-CD40 no modelo de tumor sistêmico de Daudi descrito acima no Exemplo XII.
TABELA 31
ED50 de Anticorpos Anti-CD40 da Invenção Usando Diferentes Modelos de Tumor in vivo em Camundongos SCID
Anticorpo K562 CD40(-) Raji CD40(+) & T/DC & T/DC subcutânea subcutânea (mg/kg) (mg/kg) Raji CD40(+) Daudi CD40(+) subcutânea subcutânea (mg/kg) (mg/kg)
21.4.1 0,005 0,0008 0,016 0,1
22.1.1 0,01 ND 1,0 0,1
23.25.1 1,0 ND 1,0 ND
23.5.1 1,0 ND 1,0 ND
24.2.1 1,0 ND 1,0 ND
3.1.1 0,02 ND 0,1 <0,1
23.28.1 1,0 ND 1,0 0,1
23.29.1 0,009 ND 1,0 <0,1
21.2.1 < 1,0 ND NDND
ND = não dei terminado.
EXEMPLO XIII
Determinação das Constantes de Afinidade (KD) de Anticorpos AntiCD40 Totalmente Humanos Através de BIAcore [00313] Foram realizadas medidas de afinidade de anticorpos purificados através de ressonância por plasmônio em superfície usando o instrumento BIAcore 3000, seguindo os protocolos do fabricante.
[00314] O instrumento de análise por interação bioespecífica com biosensor (BIAcore) usa ressonância por plasmônio em superfície para medir interações moleculares em um chip sensor CM5. As alterações nos índices refrativos entre dois meios, vidro e dextrana carboximetilada, causadas pela interação das moléculas no lado com dextrana do chip sensor, são medidas e reportadas como alterações em unidades
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168/176 de reflectância (RU) arbitrárias, conforme detalhado nas observações de aplicação do fabricante.
[00315] A superfície com dextrana carboximetilada de uma célula de fluxo sobre um chip sensor foi ativada através de derivatização com N-hidroxisuccinimida a 0,05M mediada por N-etil-N'(dimetilaminopropil)carbodiimida a 0,2M durante 7 minutos. Proteína de fusão CD40-lg (descrita no Exemplo I) em uma concentração de 5 pg/ml, em acetato de Na a 10 mM, pH 3,5, foi manualmente injetada na célula de fluxo em uma taxa de 5 /min e covalentemente imolizada em uma superfície de célula de fluxo com a quantidade desejada de RU's. Desativação dos ésteres de N-hidroxisuccinimida não-reagidos foi realizada usando-se cloridrato de etanolamina a 1M, pH 8,5. Após imobilização, as células de fluxo são limpas de qualquer material deficientemente ligado ou não-reagido com 5 injeções de regeneração de 5 μΙ de NaOH a 50 mM, até que uma linhagem de base estável seja obtida. A célula de fluxo 2, uma superfície em alta densidade, media aproximadamente 300 RU's após preparação da superfície e a célula de fluxo 3, uma superfície de baixa densidade, media aproximadamente 150 RU's. Para a célula de fluxo 1, a superfície placebo ativada, 35 μΙ de tampão de acetato de Na a 10 mM foram injetados durante imobilização em lugar de antígeno. A célula de fluxo 4 continha aproximadamente 450 RU's de CTLA4-lg imobilizada, um controle antigênico irrelevante.
[00316] Uma diluição em série de cada anticorpo foi preparada na faixa de concentração de 100 μg/ml a 0,1 μg/ml por logs médios. A taxa de fluxo foi ajustada a 5 μΙ/minuto e 25 μΙ de cada amostra em um ponto de concentração foi injetada sobre o chip sensor com uma injeção de regeneração de 5 μΙ de NaOH a 50 mM entre cada concentração de anticorpo injetada. Os dados foram analisados usando o software BIAevaluation 3.0.
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169/176 [00317] Nos experimentos de cinética em orientação inversa, o anticorpo 21.4.1 foi imobilizado na superfície do chip sensor usando-se o protocolo descrito acima. Anti-KLH foi usado como uma superfície de controle para anticorpo. O antígeno, proteína de fusão CD40-lg, foi injetado na faixa de concentração de 100 gg/ml a 0,1 gg/ml.
[00318] A Tabela 32 lista as medições de afinidade para anticorpos anti-CD40 representativos da presente invenção.
TABELA 32
Medições de Afinidade para os Anticorpos Anti-CD40 da Invenção
Anticorpo Kon(1/Ms) Kofr (1/s) KD (M)
3.1.1 1,12x106 3,31 x10'5 3,95x10'11
10.8.3 2,22x105 4,48x10'7 2,23x10'12
15.1.1 8,30x104 2,83x10'7 4,05x10'12
21.4.1 8,26x104 2,23x10'5 3,48x10'10
22.1.1 9,55x105 1,55x10'4 2,79x10'10
23.25.1 3,83x105 1,65x10'7 7,78x10'12
23.28.1 7,30x105 8,11 x10'5 1,61 x10'10
23.29.1 3,54x105 3,90x105 7,04x10'11
EXEMPLO XIV
Mapeamento de Epitopo de anticorpos Anti-CD40 [00319] Os ensaios de ligação foram feitos usando-se antígeno de fusão de Fc lgG1/CD40-humano purificado por proteína A. A proteína de fusão de Fc CD40-humano/lgG1 foi clonada em Pfizer. A proteína de fusão CD40 humano/lgG1 foi expressa em uma linhagem de células de mamífero e purificada sobre uma coluna de Proteína A. A pureza do antígeno de fusão foi avaliada através de SDS/PAGE.
[00320] O CD40 tem uma estrutura de uma proteína transmembrana do tipo I típica. A molécula madura é composta de 277 aminoácidos. O domínio extracelular do CD40 consiste em quatro domínios ricos em cisteína semelhantes ao TNFR. Veja, por exemplo, Neismith e Sprang, TIBS 23: 74-79 (1998); van Kooten e Banchereau, J. Leu
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170/176 kocyte Biol. 67: 2-17 (2000); Stamenkovic e outros, EMBO J 8: 14031410 (1989).
Ligação de Anticorpos Anti-CD40 a CD40 Humano Reduzido e NãoReduzido:
[00321] Devido ao fato de o domínio extracelular do CD40 consistir em quatro domínios ricos em cisteína, a ruptura das ligações intramoleculares, através de um agente de redução, pode alterar a reatividade do anticorpo. Para determinar se a ruptura das ligações intramoleculares, pelo agente de redução, altera a reatividade dos anticorpos antiCD40 selecionados da invenção, CD40-hlgG purificado foi carregado sobre SDS/PAGE (gel a 4-20%) sob condições de não-redução (NR) ou redução (R). SDS/PAGE foi realizado por meio do método de Laemmli, usando um sistema com mini-gel. As proteínas separadas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose. As membranas foram bloqueadas usando PBS contendo 5% (peso/volume) de leite seco desnatado durante pelo menos 1 hora antes de desenvolvimento e submetidas à sonda durante 1 hora com cada anticorpo. Os anticorpos anti-CD40 foram detectados usando imunoglobulinas anti-humanas de ovelha HRP-conjugada (diluição a 1:8.000; Catálogo Ne A-8667 da Sigma). As membranas foram desenvolvidas através de uso de Quimioluminescência intensificada (ECL®; Amersham Bioscience) de acordo com as instruções do fabricante.
[00322] A Western Blot foi, então, submetida a sonda com quatro anticorpos anti-CD40 da invenção: 21.4.1, 23.25.1, 23.29.1 e 24.2.1 (1 μΙ/ml), seguido por IgG anti-humana de ovelha HRP-conjugada (diluição a 1:8000). Os resultados desse experimento são mostrados na Figura 15. Os resultados indicam que os anticorpos 21.4.1, 23.25.1,
23.29.1 e 24.2.1 se ligam ao CD40 não-reduzido, mas não se ligam ao CD40 reduzido, os anticorpos, assim, reconhecem um epitopo conformacional.
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171/176
Ligação de Anticorpos Anti-CD40 de Proteínas Deletadas do Domínio do CD40 humano:
[00323] A região extracelular do CD40 inclui quatro domínios repetidos semelhantes ao TNFR (referidos como D1-D4). Veja, por exemplo, Neismith e Sprang, TIBS 23: 74-79 (1998); van Kooten e Banchereau, J. Leukocyte Biol. 67: 2-17 (2000); Stamenkovic e outros, EMBO J 8: 1403-1410 (1989). A Figura 16 mostra as seqüências de aminoácidos dos domínios D1-D4 do CD40 de camundongo e humano. Para investigar a contribuição de diferentes regiões da molécula do CD40 na apresentação ao epitopo, uma série de mutantes com domínio deletado foi construída.
[00324] Para fazer os constructos com deleção do CD40 humano, o domínio extracelular todo do CD40 humano (aminoácidos 1-193) foi amplificado a partir de cDNA de células B humanas (cD19+) (painéis de cDNA Multiple Tissue, Catálogo N- K1428-1 da Clontech) através de PCR usando-se iniciadores seqüência-específicos e 6XHis-Tag foi adicionada ao Ctérmino. Um prímero 5' ao CD40 humano 5'GCAAGCTTCACCAATGGTTCGTCTGCCTCTGCAGTG-3' (SEQ ID NO: 135) foi usado com diferentes combinações de iniciadores 3' para clonagem das moléculas de CD40 truncadas e de comprimento total. O prímero 3' para clonagem do domínio extracelular de comprimento total do CD40 humano era: 5'TCAGTGATGGTGATGGTGATGTCTCAGCCGATCCTGGGGACCA-3' (SEQ ID NO: 136). O prímero 3' usado para clonar os domínios D1-D3 do CD40 humano foi: 5TCAGTGATGGTGATGGTGATGTGGGCAGGGCTCGCGATGGTAT-3' (SEQ ID NO: 137). O prímero 3' usado para clonar os domínios D1-D2 do CD40 foi: 5'TCAGTGATGGTGATGGTGATGACAGGTGCAGATGGTGTCTGTT-3' (SEQ ID NO: 138). Após esses constructos do cDNA do CD40 trunca
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172/176 do serem geradas, eles foram expressos na linhagem de células 293F usando o vetor pCR3.1 (Invitrogen). As proteínas de fusão CD406XHis foram purificadas através de eluição a partir de uma coluna de níquel.
[00325] As seqüências de aminoácidos desses quatro mutantes com deleção são mostradas na Tabela 33.
TABELA 33
Proteínas de Fusão CD40 His-Tag
Mutante com deleção: Seqüência de aminoácidos (seqüência líder sublinhagemda)
CD40-6XHis humano (domínio extracelular de comprimento total) [Copiar seqüência da página 137]
CD40(D1-D3) humano-6xHis [Copiar seqüência da página 137]
CD40(D1-D2) humano-6XHis [Copiar seqüência da página 138]
[00326] Para expressar esses constructos com deleção do CD40 humano, os constructos foram clonados no vetor pCR3.1 (Invitrogen) e a expressão foi avaliada em várias linhagens de células 293F estáveis e transitoriamente transfectadas. Os sobrenadantes das células 293F transitoriamente transfectadas foram analisados com relação à ligação aos anticorpos 21.4.1, 23.25.1, 23.29.1 e 24.2.1 através de ELISA e Western Blot.
[00327] Os ensaios ELISA foram realizados usando sobrenadante de células 293F transfectadas com diferentes constructos de CD40. Lâminas para ELISA foram revestidas com anticorpos policlonais CD40 anti-humano de ovelha (Catálogo R&D N2 AF 632) ou anticorpos policlonais CD40 anticamundongo de olvelha (catálogo R & D N2 AF 440) diluídos a 1 pg/ml em tampão de revestimento para lâmina para ELISA. A expressão dos constructos de CD40 em células 293F foi confirmada através de detecção com CD40 anti-humano de ovelha biotinilado (catálogo R&D N2 BAF 632), CD40 anticamundongo de ovelha (catálogo R&D N2 BAF 440) ou anticorpo anti-His HRP-conjugado
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173/176 (C terminal) (Invitrogen, Catálogo No. 46-0707). A ligação de anticorpos humanos anti-CD40 foi detectada com IgG anti-humana de ovelha HRP-conjugada (Cat. FC Especific H10507), diluída a 1:2.000. Os resultados, conforme mostrado na Tabela 34, indicam que a maioria, senão todo, o epitopo reconhecido pelos mAbs 21.4.1, 23.28.1 e 23.29.1 está localizado na região D1-D2 do CD40, ao passo que o epitopo para o mAb 24.2.1 está localizado, pelo menos parcialmente, no domínio D3-D4. Uma proteína de fusão de Fc de coelho-CD40 humano foi usada como um controle para confirmar a especificidade de ligação do anticorpo.
TABELA 34
ELISA: Ligação do Anticorpo aos Mutantes CD40 com Deleção
CD40(D1-D2) humano-6Xhis CD40(D1-D3) humano-6XHis CD40 humano-6XHis
21.4.1 + + +
23.25.1 + + +
23.29.1 + + +
24.2.1 - + +
Anti-His + + +
Anti-Rblg ND ND ND
[00328] Os constructos de CD40 com deleção também foram analisados através de análise por Western Blot. Os resultados são mostrados na Tabela 35. Os resultados do ELISA mostram que o local de ligação dos anticorpos 21.4.1, 23.25.1, 23.29.1 e 24.2.1 envolve os domínios D1-D3. Os resultados também mostram que o local de ligação para os anticorpos 21.4.1, 23.25.1 e 23.29.1 envolve os domínios D1D2 e que o local de ligação do anticorpo 24.2.1 envolve o domínio D3.
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TABELA 35
Western Blot: Ligação do Anticorpo ao Mutante CD40 com Deleção
CD40(D1-D3) humano-6Xhis CD40 humano-6Xhis
21.4.1 + +
23.25.1 + +
23.29.1 + +
24.2.1 + +
Anti-His + +
Anti-Rblg ND ND
Ligação de Anticorpos Anti-CD40 a CD40 de Camundongo:
[00329] Ainda determinou-se a capacidade dos anticorpos 21.4.1,
23.25.1, 23.29.1 e 24.2.1 de se ligara CD40 de camundongo.
[00330] Para esse experimento, CD40 de camundongo foi amplificado a partir de cDNA de células B de camundongo. Proteína de fusão CD40(D1-D3) de camundongo-6xHis foi clonado no pCR3.1, o qual utiliza o promotor CMV, para acionar a transcrição. O prímero 5' usado para clonar o domínio extracelular do CD40 de camundongo foi:
[00331] 5-TGCAAGCTTCACCATGGTGTCTTTGCCTCGGCTGTG3'. O prímero 3' usado para clonar os domínios D1-D3 de CD40 de camundongo foi:
[00332] 5'GTCCTCGAGTCAGTGATGGTGATGGTGATGTGGGCAGGGATGACAGAC-3'. Constructos de cDNA de camundongo e humano foram transfectados transitoriamente em células 293F. A expressão do CD40 recombinante foi detectada por meio de ELISA usando anticorpos policlonais contra o CD40 de camundongo e humano, anticorpos anti-His e anticorpos anti-CD40 21.4.1, 23.25.1, 23.29.1 e 24.2.1. Os resultados desses experimentos são mostrados na Tabela 36. Esse experimento mostra que todos os anticorpos são específicos ao CD40 humano e não reagem concorrentemente com CD40 de camundongo.
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TABELA 36
Reatividade-Concorrente de CD40 de Camundongo e Humano
CD40(D1-D3) de camundongo-6Xhis CD40(D1-D3) humano-6XHis
21.4.1 Não Sim
23.25.1 Não Sim
23.29.1 Não Sim
24.2.1 Não Sim
CD40 anti-humano de ovelha Não Sim
CD40 anti-camundongo de ovelha Sim Não
Anti-His Sim Sim
Ligação de Anticorpos Anti-CD40 a CD40 Quimérico Humano/de Camundongo:
[00333] Devido ao fato de os anticorpos 21.4.1, 23.25.1, 23.29.1 e
24.2.1 não se ligarem ao CD40 de camundongo, Foram construídas proteínas quiméricas de CD40 humano/de camundongo para mapear mais definitivamente os epítopos desses anticorpos.
[00334] Para a construção de fusões em rede das proteínas quiméricas de CD40 humano e de murino, foram usados locais de restrição únicos nas bordas dos domínios do CD40 em posições idênticas no cDNA do CD40 humano e de camundongo. Vários constructos de cDNA do CD40 foram geradas usando o local de restrição EcoRI no final do domínio 1 (nucleotídeo 244, aminoácido 64) e o local de restrição Bani no final do domínio 2 (nucleotídeo 330, aminoácido 94) (Figura 17).
[00335] Vários domínios do CD40 foram amplificados por meio de PCR e ligados. Essa abordagem permitiu a substituição de vários domínios do CD40 de camundongo pelos domínios homólogos do CD40 humano. Os constructos obtidos são mostrados na Figura 18.
[00336] Então, determinou-se se os anticorpos 21.4.1, 23.25.1,
23.29.1 e 24.2.1 eram capazes de se ligar às proteínas quiméricas de CD40 de camundongo/humano através de ELISA. Os resultados des
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176/176 se experimento são mostrados na Tabela 37. Conforme mostrado na Tabela 37, os mAbs 21.4.1 e 23.25.1 reconhecem o epitopo que está localizado parcialmente em D1 e parcialmente em D2; o mAb 23.29.1 reconhece um epitopo localizado principal mente, se não completamente, em D2; e o mAb 24.2.1 reconhece um epitopo localizado em D2 e D3.
TABELA 37
Ligação de Anticorpo a Proteínas Quiméricas de CD40
Anticorpo HuD1 HuD2 HuD3 HuD1,D2 HuD2,D3 HuD1,D3
21.4.1 não Não Não Sim Não Não
23.25.1 não Não Não Sim Não Não
23.29.1 Não Sim Não Sim Sim Não
24.2.1 não não não Não sim não
[00337] Todas as publicações e pedidos de patente citados no presente relatório descritivo são aqui incorporados por referência como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse específica e individualmente indicado como sendo incorporado por referência. Embora a invenção precedente tenha sido descrita em maiores detalhes por meio de ilustração e exemplo para fins de clareza de compreensão, será evidente para aqueles versados na técnica à luz dos ensinamentos da presente invenção que determinadas alterações e modificações podem ser feitas na mesma sem se desviar do espírito ou escopo da invenção.

Claims (9)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Anticorpo monoclonal humano ou porção de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente ao CD40 humano e o ativa, caracterizado pelo fato de que compreende:
    a) uma cadeia pesada compreendendo um CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 148, um CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 149 e um CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 150; e
    b) uma cadeia leve compreendendo um CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 151, um CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 152 e um CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 153.
  2. 2. Anticorpo ou porção de ligação a antígeno de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que:
    (a) o domínio variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:42; e (b) o domínio variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:44.
  3. 3. Anticorpo ou porção de ligação a antígeno de acordo com a reivindicação 1, sendo caracterizado pelo fato de que compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 46 sem uma sequência sinal e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 48 sem uma sequência sinal.
  4. 4. Linhagem celular de hibridoma isolado, caracterizado pelo fato de que é depositado na Coleção de Tipos de Culturas Americana sob número de acesso PTA-3605.
  5. 5. Anticorpo, caracterizado pelo fato de que é produzido
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    2/2 através da linhagem celular de hibridoma isolada como definida na reivindicação 4.
  6. 6. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo ou porção de ligação a antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou o anticorpo como definido na reivindicação 5 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
  7. 7. Uso do anticorpo ou porção de ligação a antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou do anticorpo como definido na reivindicação 5, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento.
  8. 8. Uso do anticorpo ou porção de ligação a antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou do anticorpo como definido na reivindicação 5, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer em um ser humano necessitado do mesmo ou para intensificar uma resposta imune em um ser humano necessitado do mesmo.
  9. 9. Método de fabricação de um anticorpo anti-CD40 ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende cultura da linhagem de células de hibridoma isolada como definida na reivindicação 4, e recuperação do referido anticorpo ou porção de ligação a antígeno.
BRPI0214137A 2001-11-09 2002-11-08 anticorpo monoclonal humano ou porção de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente ao cd40 humano e o ativa, linhagem celular de hibridoma isolado, composição farmacêutica compreendendo os mesmos, uso dos mesmos na fabricação de um medicamento e método de fabricação dos referidos anticorpos ou porção de ligação a antígeno do mesmo BRPI0214137B8 (pt)

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Date Code Title Description
B15G Petition not considered as such [chapter 15.7 patent gazette]

Free format text: DESCONHECIDA A TRANSFERENCIA SOLICITADA NA PETICAO NO 020090061887/RJ DE 24/06/2009, UMA VEZ QUE O DEPOSITO DE PATENTE JA SE ENCONTRA NO NOME DO CESSIONARIO.

B25D Requested change of name of applicant approved

Owner name: PFIZER PRODUCTS INC. (US) , AMGEN FREMONT INC. (US

Free format text: ALTERADO DE: ABGENIX, INC.

B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette]
B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]
B25B Requested transfer of rights rejected

Owner name: PFIZER PRODUCTS INC. (US) , AMGEN FREMONT INC. (US

B07E Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette]
B07A Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette]
B06A Patent application procedure suspended [chapter 6.1 patent gazette]
B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 10 (DEZ) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 19/03/2019, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS.

B16C Correction of notification of the grant [chapter 16.3 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 08/11/2002 OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF

B21A Patent or certificate of addition expired [chapter 21.1 patent gazette]

Free format text: PATENTE EXTINTA EM 08/11/2022