TW202003576A - 活化cd40之單株抗體及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供經分離單株抗體或其抗原結合部分，其以高親和力特異性結合CD40，較佳人類CD40，且充當CD40促效劑。本發明亦係關於為嵌合的、人類化的、雙特異性的、衍生的單鏈抗體或融合蛋白之部分的抗體。亦提供編碼本發明之該等抗體的核酸分子、融合瘤及用於表現本發明之該等抗體的方法。亦提供包含本發明之該等抗體的醫藥組合物。本發明亦提供用於調節體液及細胞免疫反應的方法，以及用於使用本發明之抗CD40促效劑抗體治療癌症的方法。

Description

活化CD40之單株抗體及其用途
CD40抗原係屬於腫瘤壞死因子受體(Tumor Necrosis Factor Receptor；TNF-R)家族之50 kDa細胞表面糖蛋白。(Stamenkovic等人，EMBO J .8: 1403-10 (1989))。CD40在B淋巴球、樹突狀細胞、巨噬細胞和其他細胞類型上表現且對調節細胞向促進對抗原之免疫反應的效應細胞之分化係重要的。CD40在所有B淋巴瘤中及70%之所有實體腫瘤中表現。儘管CD40係組成性表現，其亦在抗原呈現細胞中藉由諸如LPS、IL-1βp、IFN-γ及GM-CSF之成熟信號上調。
CD40活化在調節體液及細胞免疫反應方面起重要作用。無CD40活化之抗原呈現可引起耐受，而CD40信號傳導可逆轉此類耐受，藉由所有抗原呈現細胞(antigen presenting cells；APC)增強抗原呈現，引起輔助細胞介素及趨化介素之分泌，增加共刺激分子表現及信號傳導，且刺激免疫細胞之溶胞活性。CD40在B細胞增殖、成熟及類別轉換方面起決定性作用。(Foy T.M.等人,Ann.Rev. of Immunol.14:591-617(1996))。藉由CD40L之CD40參與引起CD40細胞質結構域與TNF-R相關因子(TNF-R associated factors；TRAF)之關聯。(Lee H. H. 等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:1421-6 (1999)。除了增強細胞及免疫功能，CD40活化之功效亦包括：趨化介素及細胞介素之細胞募集及分化；單核球之活化；溶細胞性T淋巴球(cytolytic T lymphocyte；CTL)及自然殺傷(natural killer；NK)細胞之增加的細胞溶解活性；CD40陽性腫瘤之細胞凋亡之誘導；CD40陽性腫瘤之免疫原性之增強；及腫瘤特異性抗體產生。
CD40活化依賴於CD40配體(CD40L或CD154)。然而，大部分CD40L在CD4+ T細胞或血小板上表現，該表現在活體內生理條件下不容易操控。靶向CD40之所揭示抗體可繞過CD40L活化之需要。抗體之高穩定性具有用於潛在療法的許多優點。
此項技術中存在對抗體或其抗原結合部分之需要，包括嵌合抗體及人類化抗體，其結合CD40且引起CD40下游信號傳導之活化，且其可應用於治療癌症及靶向疫苗佐劑。
本發明提供一種經分離單株抗體或其抗原結合部分，其特異性結合且活化人類CD40。與所公開之抗體相比較，最新研發的抗體具有高親和力且可靶向人類CD40上之不同抗原決定基。
在一個態樣中，本發明係關於一種單株抗體或其抗原結合部分，其特異性結合且活化人類CD40，其中該抗體或其部分包含重鏈：分別具有SEQ ID NO:1之胺基酸殘基26-33、51-58及97-111之CDR1胺基酸序列、CDR2胺基酸序列及CDR3胺基酸序列；及輕鏈：分別具有SEQ ID NO:2之胺基酸殘基27-38、56-58及95-103之CDR1胺基酸序列、CDR2胺基酸序列及CDR3胺基酸序列。在另一態樣中，本發明係關於一種單株抗體或其抗原結合部分，其特異性結合且活化人類CD40，其中該抗體或其部分包含重鏈：分別具有SEQ ID NO:10之胺基酸殘基26-33、51-58及97-104之CDR1胺基酸序列、CDR2胺基酸序列及CDR3胺基酸序列；及輕鏈：分別具有SEQ ID NO:11之胺基酸殘基27-32、50-52及89-97之CDR1胺基酸序列、CDR2胺基酸序列及CDR3胺基酸序列。在一些實施例中，單株抗體或該其抗原結合部分刺激抗腫瘤免疫反應。在一些實施例中，單株抗體可為嵌合抗體或人類化抗體。在另一態樣中，抗CD40促效劑抗體在血清中具有比CD40L明顯更高的半衰期。
在另一態樣中，本發明係關於一種經分離單株抗體或其抗原結合部分，其特異性結合且活化人類CD40，其中該抗體包含：重鏈可變結構域，其包含SEQ ID NO:1；及輕鏈可變結構域，其包含SEQ ID NO:2。在另一態樣中，本發明係關於一種經分離單株抗體或其抗原結合部分，其特異性結合且活化人類CD40，其中該抗體包含：重鏈可變結構域，其包含SEQ ID NO:10；及輕鏈可變結構域，其包含SEQ ID NO:11。在一些實施例中，單株抗體或其抗原結合部分刺激抗腫瘤免疫反應。在一些實施例中，單株抗體可為嵌合抗體或人類化抗體。
藉由將免疫原性降至最低的修飾，可將本發明之抗體進一步工程化為適合於人類治療之形式。合適的抗體包括但不限於嵌合抗體及人類化抗體。所揭示之抗體之親和力、穩定性及特異性亦可藉由熟習此項技術者已知之技術(諸如輕鏈改組)來進一步優化。其他形式可涉及寡聚化、藥物共軛以及所揭示之抗體與其他功能性蛋白的融合。
在另一態樣中，本發明之抗體可例如為例如全長抗體，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同種型。替代地，所揭示抗體可為抗體片段，諸如Fab、Fab'及F(ab')2 片段、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、單鏈可變區片段(scFv)、二硫穩定的可變區片段(dsFv)及半抗體。替代地，所揭示抗體可為雙特異性抗體。
在另一態樣中，本發明提供一種經分離單株抗體或其抗原結合部分，其包含：(a)重鏈可變區CDR1，其包含SEQ ID NO:3；(b)重鏈可變區CDR2，其包含SEQ ID NO:4；(c)重鏈可變區CDR3，其包含SEQ ID NO:5；(d)輕鏈可變區CDR1，其包含SEQ ID NO:6；(e)輕鏈可變區CDR2，其包含Trp-Ala-Ser；及(f)輕鏈可變區CDR3，其包含SEQ ID NO:7；其中該抗體特異性結合且活化人類CD40。
在另一態樣中，本發明提供一種經分離單株抗體或其抗原結合部分，其包含：(a)重鏈可變區CDR1，其包含SEQ ID NO:12；(b)重鏈可變區CDR2，其包含SEQ ID NO:13；(c)重鏈可變區CDR3，其包含SEQ ID NO:14；(d)輕鏈可變區CDR1，其包含SEQ ID NO:15；(e)輕鏈可變區CDR2，其包含Trp-Thr-Ser；及(f)輕鏈可變區CDR3，其包含SEQ ID NO:16；其中該抗體特異性結合且活化人類CD40。
在另一態樣中，亦提供包含一種醫藥組合物，其包含經分離單株抗體或其抗原結合部分，及藥學上可接受之載劑。
在另一態樣中，本發明係關於使用本發明之抗CD40促效劑抗體刺激免疫反應的方法。舉例而言，在一個實施例中，本發明提供一種用於治療有需要之個體的方法，其中該反應由抗原呈現細胞之活化指示，該方法包含向個體投與有效量的本發明之抗體或抗原結合部分的步驟。
在另一態樣中，本發明提供一種用於治療人類之癌症的方法，其包含向人類投與呈可有效治療該癌症之量的本發明之抗體或抗原結合部分的步驟。
在又另一態樣中，本發明係關於一種單株抗體或其抗原結合部分，其特異性結合且活化人類CD40，其中該抗體包含：重鏈可變結構域胺基酸序列，其由包含SEQ ID NO:8 or SEQ ID NO:17之核酸序列編碼；及輕鏈可變結構域胺基酸序列，其由包含SEQ ID NO:9或18之核酸序列編碼。在又另一態樣中，本發明亦提供編碼抗CD40抗體之重鏈及/或輕鏈或其抗原結合部分的核酸分子。
本發明之其他特徵及優點將自以下詳細描述及實例顯而易見，該等實例不應視為限制性的。本申請案通篇所引用之所有參考文獻、GenBank條目、專利及公開專利申請案之內容均明確地以引用之方式併入本文中。
本發明係關於一種經分離單株抗體，其結合CD40且充當CD40促效劑。在某些實施例中，本發明之抗體衍生自所鑑別重鏈及輕鏈生殖系序列及/或包含所鑑別結構特徵，諸如包含所鑑別胺基酸序列之CDR區。本發明提供經分離抗體、製備本發明之此類抗體及其抗原結合部分的方法。本發明亦係關於使用抗體之方法，諸如單獨或與其他免疫刺激抗體組合使用本發明之抗CD40促效劑抗體來刺激免疫反應。因此，亦提供使用本發明之抗CD40促效劑抗體的方法，例如包括但不限於治療人類之癌症的方法。
為了使本發明可更易於理解，首先定義某些術語。在通篇詳細描述中，闡述另外的定義。
如本文所使用之「活化抗體」(在本文中亦稱作「促效劑抗體」)可係指當添加至表現CD40之細胞、組織或生物體時將一或多個CD40活性增加至少約20%的抗體。在一些實施例中，抗體將CD40活性活化至少約40%、約50%、約60%、約70%、約80%及約85%。在一些實施例中，活化抗體在CD40L之存在下添加。在一些實施例中，使用全血表面分子上調分析來量測活化抗體之活性。在另一實施例中，使用樹突狀細胞分析來量測活化抗體之活性，以量測IL-12釋放。在另一實施例中，使用活體內腫瘤模型來量測活化抗體之活性。
如本文所使用之術語「抗原決定基」可包括能夠特異性結合免疫球蛋白或T細胞受體的任何蛋白決定子。抗原決定基決定子通常由分子之化學活性表面分組組成，諸如胺基酸或糖側鏈，且通常具有特定三維結構特性以及特定電荷特性。當平衡解離常數≤1 μM、較佳≤100 nM且最佳≤10 nM時，將抗體稱為特異性結合抗原。
如本文所使用之術語「免疫反應」可係指例如淋巴球、抗原呈現細胞、吞噬細胞、顆粒球及由以上細胞或肝臟產生之可溶性大分子(包括抗體、細胞介素及補體)，其產生對侵入病原體、感染有病原體之細胞或組織、癌細胞或(在自體免疫或病理性炎症之情況下)正常生物體細胞或組織之生物體之選擇性損壞、破壞或自該生物體消除。
本文所使用之「抗原特異性T細胞反應」可係指藉T細胞之反應，該反應係用T細胞對其有特異性的抗原刺激T細胞而產生的。抗原特異性刺激後T細胞之反應之非限制性實例包括(但不限於)增殖及細胞介素產生(例如，IL-2產生)。
本文所使用之術語「抗體」可包括完全抗體、F(ab')2片段、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、雙特異性抗體、單體抗體及其任何抗原結合片段(亦即「抗原結合部分」)或單鏈可變區片段(scFv)或二硫穩定的可變區片段(dsFv)。完全抗體為糖蛋白，其包含藉由二硫鍵相互連接的至少兩個重鏈(H)及兩個輕鏈(L)。各重鏈包含重鏈可變區(本文縮寫為VH)及重鏈恆定區。重鏈恆定區由三個結構域CH1、CH2和CH3構成。各輕鏈由輕鏈可變區(本文縮寫為VL)及輕鏈恆定區(CL)構成。輕鏈恆定區由一個結構域CL構成。VH及VL區可進一步細分成被稱為互補決定區(CDR)之高變區，穿插被稱為構架區(FR)之更保守區。各VH及VL由三個CDR和四個FR構成，自胺基末端至羧基末端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原相互作用的結合結構域。抗體之恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子之結合，包括免疫系統之各種細胞(例如，效應細胞)和典型補體系統之第一組分(Clq)。
如本文所使用，術語抗體之「抗原結合部分」(或簡稱「抗體部分」)可係指保持特異性結合抗原(例如，CD40蛋白)之能力的抗體之一或多個片段。已展示，抗體之抗原結合功能可藉由全長抗體之片段執行。涵蓋於術語抗體之「抗原結合部分」內的結合片段之實例包括(i) Fab片段，由VL、VH、CL及CH1結構域組成的單價片段；(ii) F(ab')2片段，包含由鉸鏈區處之二硫橋鍵連接的兩個Fab片段的二價片段；(iii) Fab'片段，其本質上為具有部分鉸鏈區之Fab (參見FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY(Paul編, 3.sup.rd ed。1993))；(iv) Fd片段，其由VH及CH1結構域組成；(v) Fv片段，其由抗體之單臂之VL及VH結構域組成；(vi) dAb片段(Ward等人, (1989) Nature 341 :544-546))，其由VH結構域組成；(vii)經分離互補決定區(CDR)；及(viii)奈米抗體，含有單個可變結構域及兩個恆定結構域之重鏈可變區。此外，儘管Fv片段之兩個結構域VL及VH由不同基因編碼，但其可使用重組方法藉由使得其能夠製備為單個蛋白鏈的合成連接子接合，其中VL區及VH區配對以形成單價分子(稱為單鏈Fv (scFv))；參見例如，Bird 等人(1988) Science 242:423-426；及Huston 等人(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)。此類單鏈抗體亦意欲涵蓋於術語抗體之「抗原結合部分」內。此等抗體片段係使用熟習此項技術者已知之習知技術獲得，且以與完整抗體相同之方式來篩選供使用的片段。
如本文所使用之「經分離抗體」可係指實質上不含具有不同抗原特異性之其他抗體的抗體(例如，特異性結合CD40蛋白之經分離抗體可實質上不含特異性結合除CD40蛋白以外之抗原的抗體)。然而，特異性結合人類CD40蛋白之經分離抗體可與諸如來自其他物種之CD40蛋白的其他抗原具有交叉反應性。此外，經分離抗體可實質上不含其他細胞材料及/或化學品。
產生抗CD40促效劑抗體之細胞(例如融合瘤)可針對所需特性經選擇、選殖及進一步篩選，該等所需特性包括強健生長、高抗體產量及所需抗體特性，如下文進一步論述。融合瘤可在同系動物中、在缺乏免疫系統之動物(例如，裸鼠)中活體內擴增，或在活體外細胞培養物中擴增。選擇、選殖及擴增融合瘤之方法已為一般技術者所熟知。
如本文中所用之術語「單株抗體」或「單株抗體組合物」可係指單一分子組合物之抗體分子之製備物。單株抗體組合物顯示針對特定抗原決定基之單一結合特異性及親和力。
如本文所使用之術語「重組人類抗體」可係指藉由重組手段製備、表現、產生或分離的所有人類抗體，諸如(a)自動物(例如，小鼠)或由其製備之融合瘤分離之抗體，該動物為人類免疫球蛋白基因的轉基因或轉殖染色體(如下文所描述)，(b)自經轉形以表現人類抗體的宿主細胞(例如，自轉染瘤)分離之抗體，(c)自重組組合性人類抗體庫分離之抗體，及(d)藉由涉及將人類免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他手段製備、表現、產生或分離的抗體。此類重組人類抗體具有構架區及CDR區源於人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區。然而，在某些實施例中，此類重組人類抗體可進行活體外突變誘發(或，當使用人類Ig序列之動物轉殖基因時，為活體內體細胞突變誘發)，且由此重組抗體之VH及VL區之胺基酸序列儘管源於人類生殖系VH及VL序列且與其有關，然而該等胺基酸序列為可不活體內天然存在於人類抗體生殖系抗體庫內之序列。
術語「同種型」可係指由重鏈恆定區基因編碼的抗體類別(例如，IgM或IgG1)。
短語「識別抗原之抗體」及「對抗原具有特異性之抗體」在本文中可與術語「特異性結合於抗原之抗體」互換使用。
術語「人類化抗體」可指源於另一哺乳物種(諸如小鼠)之生殖系的CDR序列已移植至人類構架序列上的抗體。可在人類構架序列內進行額外的構架區修飾。
術語「嵌合抗體」可指可變區序列可源於一個物種且恆定區序列可源於另一物種的抗體，諸如可變區序列可源於小鼠抗體且恆定區序列可源於人類抗體的抗體。
如本文中所用之術語「表面電漿子共振」可係指允許藉由例如使用BIAcore™系統(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden及Piscataway, N.J.)偵測生物感測器基質內之蛋白濃度之變化來分析即時生物特異性相互作用的光學現象。對於進一步的描述，參見Jonsson U. 等人，Ann. Biol. Clin. 51:19-26 (1993)；Jonsson U.等人，Biotechniques 11:620-627 (1991)；Jonsson B.等人，J. Mal. Recognit. 8:125-131 (1995)；及Johnsson B. 等人，Anal. Biochem. 198:268-277 (1991)。
術語「KD 」可指特定抗體-抗原相互作用之平衡解離常數。
如本文所使用，「特異性結合人類CD40」之抗體可係指結合於人類CD40蛋白(及可能來自一或多個非人類物種之CD40蛋白)但實質上不結合於非CD40蛋白之抗體。較佳地，抗體以「高親和力」結合於人類CD40蛋白，即EC50 為1×10-7 M或更小、更佳5×10-8 M或更小、更佳3×10-8 M或更小、更佳1×10-8 M或更小、更佳5×10-9 M或更小，或甚至更佳1×10-9 M或更小。
如本文所使用，術語「實質上不結合」於蛋白或細胞可意謂其不能結合或不以高親和力結合於蛋白或細胞，亦即以2×10-6 M或更大、更佳1×10-5 M或更大、更佳1×10-4 M或更大、更佳1×10-3 M或更大，甚至更佳1×10-2 M或更大之EC50 結合於蛋白或細胞。
術語對IgG抗體之「高親和力」可係指對靶抗原具有1×10-6 M或更少、更佳1×10-7 M或更少、甚至更佳1×10-8 M或更小、甚至更佳1×10-9 M或更小、甚至更佳1×10-10 M或更小之EC50 的抗體。然而，「高親和力」結合可針對其他抗體同種型變化。
術語「個體」可係指任何人類或非人類動物。術語「非人類動物」包括所有脊椎動物，例如哺乳動物及非哺乳動物，諸如非人類靈長類、綿羊、犬、貓、牛、馬、雞、兔、小鼠、大鼠、兩棲動物及爬行動物，但哺乳動物為較佳的，諸如非人類靈長類動物、綿羊、犬、貓、牛及馬。
本發明之抗體與CD40之結合可使用此項技術中已良好確立的一或多種技術來評定。舉例而言，在一較佳實施例中，抗體可藉由ELISA分析，例如使用重組CD40蛋白來測試。其他適合結合分析包括(但不限於)流式細胞量測分析，其中抗體與表現人類CD40之細胞株反應，細胞株諸如已經轉染以在其細胞表面上表現CD40 (例如，人類CD40)的CHO細胞。另外地或可替代地，抗體之結合，包括結合動力學(例如，KD 值)可在BIAcore結合分析及其類似分析中測試。
較佳地，本發明之抗體以5×10-8 M或更小之EC50 結合於CD40蛋白，以2×10-8 M或更小之EC50 結合於CD40蛋白，以5×10-9 M或更小之EC50 結合於CD40蛋白，以4×10-9 M或更小之EC50 結合於CD40蛋白，以3×10-9 M或更小之EC50 結合於CD40蛋白，以2×10-9 M或更小之EC50 結合於CD40蛋白，以1×10-9 M或更小之EC50 結合於CD40蛋白。
抗體可如實例1中所描述經分離及結構上表徵。純系# 1E10-H2之VH胺基酸序列展示於SEQ ID NO:1中。純系# 1E10-H2之VL胺基酸序列展示於SEQ ID NO:2中。純系# 2G9-B11之VH胺基酸序列展示於SEQ ID NO:10中。純系# 2G9-B11之VL胺基酸序列展示於SEQ ID NO:11中。
因此，在一個態樣中，本發明提供一種經分離單株抗體或其抗原結合部分，其包含：(a)重鏈可變區，該重鏈可變區包含含有SEQ ID NO:1之胺基酸序列；及(b)輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含含有SEQ ID NO:2之胺基酸序列；其中抗體特異性結合且活化人類CD40。
在另一態樣中，本發明提供一種經分離單株抗體或其抗原結合部分，其包含：(a)重鏈可變區，該重鏈可變區包含含有SEQ ID NO:10之胺基酸序列；及(b)輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含含有SEQ ID NO:11之胺基酸序列；其中抗體特異性結合且活化人類CD40。在一些實施例中，單株抗體或其抗原結合部分刺激抗腫瘤免疫反應。在一些實施例中，單株抗體可為嵌合抗體。
在另一態樣中，本發明提供包含純系# 1E10-H2之重鏈及輕鏈CDR1、CDR2及CDR3之抗體。純系# 1E10-H2之VH CDR1的胺基酸序列展示於SEQ ID NO:3中。純系# 1E10-H2之VH CDR2之胺基酸序列展示於SEQ ID NO:4中。純系# 1E10-H2之VH CDR3之胺基酸序列展示於SEQ ID NO:5中。純系# 1E10-H2之VL CDR1之胺基酸序列展示於SEQ ID NO:6中。純系# 1E10-H2之VL CDR2之胺基酸序列為Trp-Ala-Ser。純系# 1E10-H2之VL CDR3之胺基酸序列展示於SEQ ID NO:7中。
在另一態樣中，本發明提供包含純系# 2G9-B11之重鏈及輕鏈CDR1、CDR2及CDR3之抗體。純系# 2G9-B11之VH CDR1之胺基酸序列展示於SEQ ID NO:12中，純系# 2G9-B11之VH CDR2之胺基酸序列展示於SEQ ID NO:13中。純系# 2G9-B11之VH CDR3之胺基酸序列展示於SEQ ID NO:14中。純系# 2G9-B11之VL CDR1之胺基酸序列展示於SEQ ID NO:15中。純系# 2G9-B11之VL CDR2之胺基酸序列為Trp-Thr-Ser。純系# 2G9-B11之VL CDR3之胺基酸序列展示於SEQ ID NO:16中。CDR區可使用Kabat系統來詳述(Kabat等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，美國衛生及人類服務部(U.S. Department of Health and Human Services)，NIH Publication No. 91-3242)。
在另一態樣中，本發明提供編碼單株抗體純系# 1E10-H2之重鏈及輕鏈可變結構域的聚核苷酸序列。在另一態樣中，本發明提供編碼單株抗體純系# 2G9-B11之重鏈及輕鏈可變結構域的聚核苷酸序列。
抗體可藉由組合或不組合其重鏈可變結構域之隨機突變誘發之輕鏈改組且淘選CD40來親和成熟。本發明中提及的抗體之VL CDR1、CDR2及CDR3可用輕鏈改組來最佳化，以產生本發明之其他抗CD40促效劑結合分子。
本發明之抗體進一步可使用具有本文揭示之VH及/或VL序列中之一或多者之抗體作為起始材料來製備，以工程改造經修飾抗體，該經修飾抗體可具有與起始抗體不同的性質。抗體可藉由修飾一個或兩個可變區(亦即，VH及/或VL)內，例如一或多個CDR區內及/或一或多個構架區內之一或多個殘基進行工程改造。另外或替代地，抗體可藉由在恆定區內修飾殘基進行工程改造，以例如更改抗體之效應功能。
在某些態樣中，CDR移植可用於工程改造抗體之可變區。抗體主要經由位於六個重鏈及輕鏈互補決定區(CDR)中的胺基酸殘基與標靶抗原相互作用。出於此原因，與CDR外部之序列相比，CDR內之胺基酸序列在個別抗體之間可更多樣化。
因為CDR序列可引起大多數抗體-抗原相互作用，所以可通過構築表現載體來表現模擬特定天然存在之抗體之性質的重組抗體，該表現載體包括來自自具有不同性質之不同抗體移植至構架序列上的特定天然存在之抗體的CDR序列(參見例如, Riechmann 等人 (1998)Nature 332:323-327；Jones 等人 (1986)Nature 321: 522-525；Queen 等人 (1989)Proc.Natl.Acad.See. U.S.A. 86: 10029-10033；美國專利第5,225,539號、第5,530,101號、第5,585, 089號、第5,693,762號及第6,180,370號)。
因此，本發明之另一實施例係關於一種經分離單株抗體或其抗原結合部分，其包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含CDR1、CDR2及CDR3序列，該等序列分別包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:5之胺基酸序列；及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含CDR1、CDR2及CDR3序列，該等序列分別包含SEQ ID NO:6、Trp-Ala-Ser及SEQ ID NO:7之胺基酸序列。本發明之另一實施例係關於一種經分離單株抗體或其抗原結合部分，其包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含CDR1、CDR2及CDR3序列，該等序列分別包含SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:14之胺基酸序列；及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含CDR1、CDR2及CDR3序列，該等序列分別包含SEQ ID NO:15、Trp-Thr-Ser及SEQ ID NO:16之胺基酸序列。因此，此類抗體含有單株抗體1E10-H2或2G9-B11之VH及VL CDR序列，且可含有與此等抗體不同的構架序列。
此類構架序列可自公共DNA資料庫或包括生殖系抗體基因序列之公開文獻獲取。舉例而言，人類重鏈及輕鏈可變區基因之生殖系DNA序列可在以下中發現：「VBase」人類生殖系序列資料庫(可在網路www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase上獲得)，以及Kabat等人(1991)，見上文所引用；Tomlinson等人(1992)「The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops」J.Mol .Biol. 227:776-798；以及Cox等人(1994)「A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage」Eur.J.Immunol. 24:827-836；；其中之每一者之內容以引用之方式明確地併入本文中。作為另一實例，人類重鏈及輕鏈可變區基因之生殖系DNA序列可在Genbank資料庫中發現。舉例而言，在HCo7 HuMAb小鼠中發現的以下重鏈生殖系序列可在隨附Genbank寄存編號1-69 (NG_0010109、NT_024637及BC070333)、3-33 (NG_0010109及NT_024637)及3-7 (NG_0010109及NT_024637)中獲得。作為另一實例，在HCo12 HuMAb小鼠中發現的以下重鏈生殖系序列可在隨附GenBank寄存編號1-69 (NG_0010109、NT_024637及BC070333)、5-51 (NG_0010109及NT_024637)、4-34 (NG_0010109及NT_024637)、3-30.3 (CAJ556644)及3-23 (AJ406678)中獲得。
使用熟習此項技術者熟知的稱作Gapped BLAST (Altschul等人.(1997), 見上文)的序列相似性搜索方法中之一者將抗體蛋白序列對照經編譯蛋白序列資料庫進行比較。本發明之組合物及方法不限於本文揭示之例示性序列之變型，但包括與本文所揭示之例示性序列具有至少90%、至少95%及至少99%序列一致性的彼等變型。
編碼抗CD40促效劑抗體或其部分之重鏈或整個輕鏈的核酸分子可自產生此類抗體之任何來源分離。在各種實施例中，核酸分子自B細胞分離，該B細胞自用CD40免疫的動物分離或自源於表現抗CD40促效劑抗體之此類B細胞的永生化細胞分離。分離編碼抗體之mRNA的方法係此項技術中熟知的。參見例如Sambrook等人。mRNA可用於產生用於抗體基因之聚合酶鏈式反應(PCR)或cDNA選殖的cDNA。在一較佳實施例中，核酸分子自融合瘤分離，該融合瘤具有來自非人類基因轉殖動物的產生人類免疫球蛋白之細胞作為其融合配偶體中之一者。在另一實施例中，核酸可自非人類、非基因轉殖動物分離。自非人類、非基因轉殖動物分離的核酸分子可用於例如人類化抗體。
在另一態樣中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含與醫藥學上可接受之載劑一起調配的一或多種本發明之抗體。組合物可視情況含有一或多個額外醫藥活性成分，諸如另一種抗體或藥物。本發明之醫藥組合物亦可在組合療法中與例如另一種免疫刺激劑、抗癌劑、抗病毒劑或痘苗一起投藥，使得抗CD40促效劑抗體增強藉由痘苗刺激之免疫反應。
醫藥組合物可包含任何數目的賦形劑。可使用的賦形劑包括載劑、界面活性劑、增稠劑或乳化劑、固態黏合劑、分散或懸浮助劑、增溶劑、著色劑、調味劑、包衣、崩解劑、潤滑劑、甜味劑、防腐劑、等張劑，及其組合。適合賦形劑之選擇及使用教示於Gennaro編，Remington:The Science and Practice of Pharmacy , 第20版. (Lippincott Williams & Wilkins 2003)中，其揭示內容係通過引用併入。
治療組合物在製造及儲存條件下通常必須為無菌的及穩定的。組合物可調配為溶液、微乳液、分散液、脂質體或適合於較高藥物濃度之其他有序結構。無菌可注射溶液可藉由將呈所需量的抗CD40促效劑抗體與上文所列舉之一或多種成分一起併入合適溶劑中來製備，視需要，隨後過濾滅菌。一般而言，分散液藉由將活性化合物併入含有基本分散介質及來自上文所列舉之彼等的成分的所需其他成分的無菌媒劑中來製備。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉末的情況下，較佳的製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥，其自其先前無菌過濾的溶液產生活性成分加上任何額外所需成分的粉末。溶液之適當流動性可例如藉由使用諸如卵磷脂之包衣、在分散液之情況下藉由維持所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持。可注射組合物之延長吸收可藉由在組合物中包括延遲吸收的試劑，例如單硬脂酸鹽及明膠來實現。
本發明之抗體可藉由此項技術中已知之多種方法投藥，但對於許多療法應用來說，較佳的投藥途徑/模式為皮下、肌內或靜脈內灌注。如熟習此項技術者所瞭解，投藥途徑及/或模式將視所要結果而變化。
在某些實施例中，抗體組合物活性化合物可使用將保護抗體免遭快速釋放之載劑來製備，諸如控制釋放調配物，包括植入劑、經皮貼片及微膠囊化遞送系統。可使用可生物降解、生物相容性聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。用於製備此類調配物之許多方法已獲得專利或為熟習此項技術者普遍所知。參見例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery System (J.R.Robinson編, Marcel Dekker, Inc., New York, 1978)。
在某些實施例中，本發明之抗CD40促效劑抗體可例如與惰性稀釋劑或可吸收的可食用載劑一起口服投藥。該化合物(若需要，及其他成分)亦可包覆於硬殼或軟殼明膠膠囊中，壓製成錠劑，或直接併入個體之膳食中。對於口服投藥，抗CD40促效劑抗體可與賦形劑一起併入，且以可攝取之錠劑、頰內錠劑、糖衣錠、口含錠、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿、粉片及其類似者之形式使用。為藉由除非經腸投藥以外之形式投藥本發明之化合物，可能有必要用防止其失活之材料包覆化合物或將化合物與該材料一起共投藥。
額外的活性化合物亦可併入至所揭示組合物中。在某些實施例中，本發明之抗CD40促效劑抗體與一或多種額外治療劑一起共調配及/或共投藥。此等試劑包括(但不限於)結合其他靶標的抗體(例如，結合一或多種生長因子或細胞介素或其細胞表面受體之抗體，諸如抗CTL4抗體)、抗贅生性劑、抗腫瘤劑、化學治療劑、活化CD40之肽類似物、可溶性CD40L、活化CD40之一或多種化學試劑，及/或此項技術中已知的可增強對腫瘤細胞之免疫反應的其他試劑，例如IFN-1、IL-2、IL-8、IL-12、IL-15、IL-18、IL-23、IFN-y及GM-CSF。此類組合療法可能需要較低劑量的抗CD40促效劑抗體以及共投藥試劑，因此避免與各種單一療法相關聯的可能毒性或併發症。
本發明之促效劑抗CD40抗體及包含其之組合物亦可與其他治療方案組合投藥，特定而言，與放射治療組合投藥。
本發明之醫藥組合物可包括醫藥學上可接受之鹽。「醫藥學上可接受之鹽」可係指保留母體化合物之所需生物活性且不賦予任何非所需毒理學作用的鹽。此等鹽之實例包括酸加成鹽及鹼加成鹽。酸加成鹽包括源於無毒無機酸之彼等物，諸如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸亞磷酸及其類似物；以及源於無毒有機酸之彼等物，諸如脂族單甲酸及脂族二甲酸、經苯基取代之烷酸、羥基烷酸、芳族酸、脂族及芳族磺酸及其類似物。鹼加成鹽包括衍生自鹼土金屬(諸如鈉、鉀、鎂、鈣及其類似物)以及衍生自無毒有機胺(諸如N,N生自二苯甲基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普魯卡因(chloroprocaine)、膽鹼、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因(procaine)及其類似物)之鹽。
調節劑量方案以得到最佳所需反應(例如，治療反應)。舉例而言，可投藥單一藥團，隨著時間推移可投藥分次劑量或劑量可如藉由療法情況之緊急程度所指示按比例減少或增加。就投藥之簡便性及劑量之均一性而言，將非經腸組合物調配成單位劑型尤其有利。如本文所用之單位劑型係指適合作為單一劑量用於待治療之個體的實體上離散單位；各單位含有與所需醫藥載劑結合之經計算以產生所需治療性效應之預定量活性化合物。替代地，抗體可作為持續釋放調配物投藥，在此情況下，可能需要較低的投藥頻率。
本發明之抗體或抗體部分之治療或預防有效量的例示性非限制性範圍為0.025至50 mg/kg，更佳0.1至50 mg/kg，更佳0.1至25 mg/kg、0.1至10 mg/kg及0.1至3 mg/kg。應注意，劑量值可隨待緩解之病況的類型及嚴重程度變化。此外應瞭解，對任何特定個體而言，特定劑量方案應根據個體需要及投與組合物或監督組合物投與的人員的專業判斷而隨時間調整，且本文所闡述之劑量範圍僅為例示性的，且不意欲限制所主張之組合物的範疇或實務。
雙特異性抗體或抗原結合片段可藉由多種方法來產生，包括融合融合瘤或連接Fab'片段。參見例如，Songsivilai 及 Lachmarm,Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990)，Kos- telny 等人，J. Immunol. 148:1547-1553 (1992)。另外，雙特異性抗體可形成為「雙功能抗體」或「Janusins」。在一些實施例中，雙特異性抗體結合於CD40之兩個不同抗原決定基。在一些實施例中，雙特異性抗體具有來自單株抗體1E10-H2之第一輕鏈，及額外的抗體重鏈及輕鏈。在一些實施例中，雙特異性抗體具有來自單株抗體2G9-B11之第一重鏈及第一輕鏈，及額外的抗體重鏈及輕鏈。在一些實施例中，額外的輕鏈及重鏈亦來自上述單株抗體中之一者，但是可與第一重鏈及輕鏈不同。
實例1.免疫及融合瘤產生
藉由電融合經人類CD40免疫之小鼠脾細胞(Balb/c株)與SP2/0-A14細胞(ATCC)產生抗體(免疫程序；劑量、佐劑、時程)。將經融合細胞接種至96孔培養盤中，且進行ELISA篩選以鑑別含有與人類CD40蛋白相互作用之抗體的孔。陽性孔進一步擴增且在有限稀釋後分離單株融合瘤。經純化抗體用於藉由內部創建的報導子系統來測試其觸發CD40信號傳導的能力。基本上，經工程改造之293T細胞株經轉導以穩定表現人類CD40蛋白。當測試CD40抗體之促效功能時，將NF-kB驅動螢光素酶報導子及Fc-γ受體之DNA質粒瞬時經轉染中已建立的CD40-293T細胞中。將待測試抗體添加至培養物中且培育24小時。經處理細胞經收穫，裂解且在培養盤讀取器上分析螢光素酶之活性。抗人類CD40 mAb 純系# 1E10-H2及純系# 2G9-B11經測試結合且活化人類CD40。圖1中展示抗人類CD40促效性mAb 純系# 1E10-H2之IgG重鏈及輕鏈可變結構域之序列。
實例2.抗人類CD40抗體活體外分析
藉由用rIL-4及rGM-CSF培養5天將經冷凍人類原代單核球(CD14+；陰性選擇)分化成樹突狀細胞(DC)。接著將5×105 個DC與用FcgR瞬時轉染之1×105 個293FT細胞在24孔培養盤中與系列稀釋劑量之抗CD40 2G9-B11抗體或固定劑量之同型對照抗體共培養額外2天。用TruStain FcX抗體(BioLegend)阻斷細胞，隨後用PE/Cy5抗CD11c抗體(BioLegend，純系3.9，小鼠IgG1)及PE/Dazzle 594抗CD83抗體(BioLegend，純系HB15e，小鼠IgG1)染色。使用BD LSRII流式細胞儀執行流式細胞量測術。結果展示於圖2中，其顯示在共培養反應分析中，抗CD40抗體自人類原代單核球衍生之樹突狀細胞誘導活化標記物CD83表現。
實例3.抗人CD40抗體活體外分析
用CFSE (BioLegend)標記自人類PBMC (Miltenyi Biotec，陰性選擇)分離之人類原代B細胞，且與用FcgR瞬時轉染之1×105 個293FT細胞在24孔培養盤中與固定劑量之抗體共培養7天。用TruStain FcX抗體(BioLegend)阻斷細胞，隨後用APC山羊抗人類IgG (H+L)抗體(Jackson ImmunoResearch)染色。使用BD LSRII流式細胞儀執行流式細胞量測術。結果展示於圖3中，其顯示在共培養反應分析中，抗CD40抗體誘導人類原代B細胞增殖。
雖然前述本發明出於清楚理解之目的已藉助於說明及實例較詳細地描述，但是熟習此項技術者顯而易知可實施某些改變及修改。因此，本說明書及實例不應理解為限制本發明之範疇。
本文藉由鑑別引用提及的所有公開案、專利、專利申請案及公開專利申請案之揭示內容在此以全文引用之方式併入本文中。在統一資源定位符(Uniform Resource Locator，URL)的開頭使用「萬維網(World-Wide-Web)」的網站參考物可藉由用www替換「萬維網」來訪問。
圖1說明在一個實施例中，編碼抗人類CD40促效性mAb (純系# 1E10-H2)之重鏈及輕鏈可變結構域的本發明之抗體重鏈及輕鏈可變結構域蛋白序列及相應DNA序列。1E10-H2之重鏈V結構域為SEQ ID NO:1且核酸序列為SEQ ID NO:8，1E10-H2之輕鏈V結構域為SEQ ID NO:2且核酸序列為SEQ ID NO:9。
圖2說明在共培養反應分析中，本發明之抗人類CD40抗體自人類原代單核球衍生之樹突狀細胞誘導活化標記物CD83表現。同種型抗體對照：小鼠抗BrdU (同種型:IgG1)；小鼠抗CD40抗體(同種型:IgG1)：純系#2G9-B11。
圖3說明在共培養反應分析中，本發明之抗人類CD40抗體誘導人類原代B細胞增殖。同種型抗體對照：小鼠抗BrdU (同種型：IgG1)；小鼠抗CD40抗體(同種型：IgG1)：純系#2G9-B11。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008

Claims (24)

  1. 一種單株抗體或其抗原結合部分，其包含： (a)分別具有SEQ ID NO:1之胺基酸殘基26-33、51-58及97-111的重鏈CDR1胺基酸序列、CDR2胺基酸序列及CDR3胺基酸序列；及 (b)分別具有SEQ ID NO: 2之胺基酸殘基27-38、56-58及95-103之輕鏈CDR1胺基酸序列、CDR2胺基酸序列及CDR3胺基酸序列，其中該抗體或部分特異性結合且活化人類CD40。
  2. 一種單株抗體或其抗原結合部分，其包含： (a)分別具有SEQ ID NO:10之胺基酸殘基26-33、51-58及97-104之重鏈CDR1胺基酸序列、CDR2胺基酸序列及CDR3胺基酸序列；及 (b)分別具有SEQ ID NO: 11之胺基酸殘基27-32、50-52及89-97的輕鏈CDR1胺基酸序列、CDR2胺基酸序列及CDR3胺基酸序列，其中該抗體或部分特異性結合且活化人類CD40。
  3. 如請求項1及2中任一項之抗體或抗原結合部分，其為Fab片段、F(ab')2 片段、Fv片段、單鏈抗體或雙特異性抗體。
  4. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1及2中任一項之抗體或抗原結合部分及醫藥學上可接受之載劑。
  5. 一種如請求項1及2中任一項之抗體或抗原結合部分之用途，其製造用於治療人類之癌症的藥物。
  6. 一種如請求項1及2中任一項之抗體或抗原結合部分之用途，其製造用於增強對其有需要之個體之免疫反應的藥物，其中該反應藉由抗原呈現細胞之活化指示。
  7. 如請求項1及2中任一項之單株抗體或其抗原結合部分，其中該抗體刺激抗腫瘤免疫反應。
  8. 一種單株抗體或其抗原結合部分，其包含：重鏈可變結構域，該重鏈可變結構域包含SEQ ID NO:1；及輕鏈可變結構域，該輕鏈可變結構域包含SEQ ID NO:2，其中該抗體特異性結合且活化人類CD40。
  9. 一種單株抗體或其抗原結合部分，其包含：重鏈可變結構域，該重鏈可變結構域包含SEQ ID NO:10；及輕鏈可變結構域，該輕鏈可變結構域包含SEQ ID NO:11，其中該抗體特異性結合且活化人類CD40。
  10. 如請求項8及9中任一項之抗體或抗原結合部分，其為Fab片段、F(ab')2 片段、Fv片段、單鏈抗體或雙特異性抗體。
  11. 一種醫藥組合物，其包含如請求項8及9中任一項之抗體或抗原結合部分及醫藥學上可接受之載劑。
  12. 一種如請求項8及9中任一項之抗體或抗原結合部分之用途，其製造用於治療人類之癌症的藥物。
  13. 一種如請求項8及9中任一項之抗體或抗原結合部分之用途，其製造用於增強對其有需要之個體之免疫反應的藥物，其中該反應藉由對其有需要之該個體中之抗原呈現細胞之活化指示。
  14. 如請求項8及9中任一項之抗體，其中該抗體刺激抗腫瘤免疫反應。
  15. 一種經分離單株抗體或其抗原結合部分，其包含 (a)重鏈可變區CDR1，其包含SEQ ID NO:3； (b)重鏈可變區CDR2，其包含SEQ ID NO:4； (c)重鏈可變區CDR3，其包含SEQ ID NO:5； (d)輕鏈可變區CDR1，其包含SEQ ID NO:6； (e)輕鏈可變區CDR2，其包含Trp-Ala-Ser；及 (f)輕鏈可變區CDR3，其包含SEQ ID NO:7； 其中，該抗體或部分特異性結合且活化人類CD40。
  16. 一種經分離單株抗體或其抗原結合部分，其包含 (a)重鏈可變區CDR1，其包含SEQ ID NO:12； (b)重鏈可變區CDR2，其包含SEQ ID NO:13； (c)重鏈可變區CDR3，其包含SEQ ID NO:14； (d)輕鏈可變區CDR1，其包含SEQ ID NO:15； (e)輕鏈可變區CDR2，其包含Trp-Thr-Ser；及 (f)輕鏈可變區CDR3，其包含SEQ ID NO:16； 其中，該抗體或部分特異性結合且活化人類CD40。
  17. 2、15及16中任一項之抗體，其為免疫球蛋白G(IgG)、IgM、IgE、IgA或IgD分子，或自其衍生。
  18. 如請求項17之單株抗體，其中該抗體為嵌合抗體或人類化抗體。
  19. 如請求項17之單株抗體，其中該抗體為IgGl、IgG2、IgG3或IgG4，或自其衍生。
  20. 如請求項8及9中任一項之抗體，其為免疫球蛋白G(IgG)、IgM、IgE、IgA或IgD分子，或自其衍生。
  21. 如請求項20之單株抗體，其中該抗體為IgGl、IgG2、IgG3或IgG4，或自其衍生。
  22. 如請求項20之單株抗體，其中該抗體為嵌合抗體或人類化抗體。
  23. 一種單株抗體或其抗原結合部分，其特異性結合且活化人類CD40，其中，該抗體包含：重鏈可變結構域胺基酸序列，其由包含SEQ ID NO:8之核酸序列編碼；及輕鏈可變結構域胺基酸序列，其由包含SEQ ID NO:9之核酸序列編碼。
  24. 一種單株抗體或其抗原結合部分，其特異性結合且活化人類CD40，其中該抗體包含：重鏈可變結構域胺基酸序列，其由包含SEQ ID NO:17之核酸序列編碼；及輕鏈可變結構域胺基酸序列，其由包含SEQ ID NO:18的核酸序列編碼。
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