CN115175936A

CN115175936A - 用于治疗实体瘤的靶向间皮素的cd40激动性多特异性抗体构建体

Info

Publication number: CN115175936A
Application number: CN202080095225.3A
Authority: CN
Inventors: X·于; J·艾根; F·加塞斯; S·竹中; A·金; D·萨旺特
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 2019-12-20
Filing date: 2020-12-18
Publication date: 2022-10-11
Also published as: IL293640A; UY38995A; ZA202206541B; CA3164129A1; US20210347905A1; KR20220117300A; BR112022012191A2; CL2022001697A1; TW202136306A; JP2023507323A; EP4077392A1; AU2020405230A1; US20240150481A1; US11926672B2; AR120832A1; WO2021127528A1; MX2022007688A

Abstract

本发明涉及用于治疗实体瘤的人激动性CD40多特异性抗体构建体，其通过对特异性地靶向肿瘤相关的APC上的CD40通路的分子进行工程化，而无需全身的CD40激活。

Description

用于治疗实体瘤的靶向间皮素的CD40激动性多特异性抗体构建体

技术领域

本发明涉及肿瘤学，特别地癌症免疫疗法的领域。本发明涉及人激动性CD40抗体，其通过对特异性地靶向肿瘤相关的APC上的CD40通路的分子进行工程化，而无需全身性CD40激活。

背景技术

在快速变化的免疫疗法领域，治疗对免疫检查点抑制剂(如抗PD1)无反应的癌症患者代表着主要挑战和令人兴奋的机遇。实体瘤中PD1阻断的应答的主要决定因素是治疗前肿瘤相关的T细胞浸润的程度，浸润较弱的、“冷”肿瘤患者显示最小的临床益处。虽然临床数据仍在出现，但PD1阻断以外的其他靶向T细胞的免疫疗法(如实体瘤

抗体构建体或CAR-T方法)的临床活性也可仅限于“冷”肿瘤。靶向T细胞的方法与能增强T细胞向实体瘤浸润的新疗法的结合对于最大化受益于免疫疗法的患者数量可能是关键的。

CD40是TNF受体(TNFR)超家族的成员，其优先地通过抗原呈递细胞(APC)(如树突状细胞、B细胞和巨噬细胞)表达。与其在激活的T辅助细胞上的三聚体配体相互作用导致APC激活，该激活包括细胞因子/趋化因子(如白介素12[IL-12]和CxCL10)、参与抗原呈递的蛋白质(如MHC I类和II类配体)、T细胞共刺激配体(如CD80和CD86)和一系列其他免疫调节因子(即，黏附分子和其他TNFR)的上调。然后，这些“得到许可”的APC可以触发一系列事件，从而导致稳健的适应性免疫应答。

能激活CD40信号传导的治疗剂具有通过其增强抗肿瘤T细胞的生成和增强T细胞直接募集到肿瘤病变中的能力来使实体瘤发炎的潜力。用抗CD40激动剂进行的临床前研究表明，用APC上的交联抗体触发的CD40可以替代CD4 T细胞，以帮助许可APC，并促进CD8效应T细胞的激活及扩增。此外，激活CD40的巨噬细胞也可发挥直接的杀肿瘤功能。已经证明单独这些抗CD40激动剂抗体或与其他疗法组合在多种同基因肿瘤模型中是有效的。基于这些临床前研究，在实体瘤患者的I/II期临床试验中，正在研究几种CD40激动抗体。迄今为止，这些单克隆抗CD40抗体已显示一些临床活性的迹象，但通常与免疫相关的不良反应有关，如细胞因子释放综合征和肝损伤的证据。这些毒性限制了可以被递送的CD40激动剂的剂量，并且因此可导致与肿瘤相关的APC群体中CD40途径的激活不足，从而对此治疗方法的功效产生负面影响。能在肿瘤组织中局部激活CD40信号传导的治疗剂可改善抗肿瘤作用，同时限制全身毒性。

为了实现肿瘤定位，设计了结合CD40和肿瘤相关抗原(TAA)、间皮素(MSLN)的激动性多特异性抗体构建体。在表达CD40的APC上，此多特异性抗体构建体的稳健的激动剂活性完全取决于相邻的表达MSLN的细胞的存在。将多特异性抗体构建体特异性工程化，以在不存在表达MSLN的细胞中与CD40结合后缺乏CD40激动剂活性。另外，将突变引入IgG Fc结构域限制了与Fc受体的结合，因此防止Fc受体介导的CD40激动剂活性。因此，本文所述的MSLN依赖性CD40激动剂多特异性抗体构建体具有以主要限于肿瘤组织的方式驱动稳健的CD40介导的APC的激活的潜力，因此最小化全身毒性的诱导。

发明内容

本发明涉及多特异性抗体构建体，该多特异性抗体构建体包含：

(i)含有两个轻链和两个重链的第一抗体，其中

轻链包含第一可变区(VL1)和轻链恒定区(CL)；

重链包含第一重可变区(VH1)和CH1、铰链、CH2、和CH3区；

重链包含至少一个氨基酸取代，该取代导致该重链对人FcγRI受体的结合亲和力降低(与未取代的重链相比)；和

(ii)含有第二抗体的第二轻链可变区(VL2)和第二重链可变区(VH2)的scFv，其中该VL2和该VH2经由第一肽接头连接，

其中scFv在其氨基末端通过第二肽接头与每个重链的羧基末端融合，以形成重链融合蛋白；并且

其中该第一抗体特异性地结合至并激动人CD40(SEQ ID NO：1)，并且该scFv特异性地结合至人间皮素(MSLN)(SEQ ID NO：2)。

在一个实施例中，多特异性抗体构建体以MSLN依赖性方式特异性激动CD40。

在一个实施例中，多特异性抗体构建体包含限制Fc受体结合的突变并且因此减少Fc受体依赖型CD40激动作用。

在一个实施例中，两个轻链相同并且两个重链融合蛋白相同。

在一个实施例中，重链包含选自由以下组成的组的氨基酸取代：

(i)N297G或N297A；

(ii)L234A和L235A；以及

(iii)R292C和V302C；

其中氨基酸编号是根据Kabat的EU编号。

在一个实施例中，重链包含N297G、R292C、和V302C突变，其中氨基酸编号是根据Kabat的EU编号。

在一个实施例中，VL1包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3：

分别是SEQ ID NO：58、59、和60；

分别是SEQ ID NO：64、65、和66；

分别是SEQ ID NO：70、71、和72；

分别是SEQ ID NO：76、77、和78；

分别是SEQ ID NO：82、83、和84；

分别是SEQ ID NO：88、89、和90；

分别是SEQ ID NO：94、95、和96；

分别是SEQ ID NO：100、101、和102；

分别是SEQ ID NO：106、107、和108；

分别是SEQ ID NO：112、113、和114；

分别是SEQ ID NO：118、119、和120；

分别是SEQ ID NO：124、125、和126；以及

分别是SEQ ID NO：130、131、和132；

VH1包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3：

分别是SEQ ID NO：136、137、和138；

分别是SEQ ID NO：142、143、和144；

分别是SEQ ID NO：148、149、和150；

分别是SEQ ID NO：154、155、和156；

分别是SEQ ID NO：160、161、和162；

分别是SEQ ID NO：166、167、和168；

分别是SEQ ID NO：172、173、和174；

分别是SEQ ID NO：178、179、和180；

分别是SEQ ID NO：184、185、和186；

分别是SEQ ID NO：190、191、和192；

分别是SEQ ID NO：196、197、和198；

分别是SEQ ID NO：202、203、和204；以及

分别是SEQ ID NO：208、209、和210；

VL2包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3：

分别是SEQ ID NO：230、231、和232；

分别是SEQ ID NO：236、237、和238；

分别是SEQ ID NO：242、243、和244；以及

分别是SEQ ID NO：248、249、和250；

并且VH2包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3：

分别是SEQ ID NO：254、255、和256；

分别是SEQ ID NO：260、261、和262；

分别是SEQ ID NO：266、267、和268；以及

分别是SEQ ID NO：272、273、和274。

在一个实施例中，1)VL1和VH1选自由以下组成的组：

a)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL1：分别是SEQ ID NO：58、59、和60；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH1：分别是SEQ IDNO：136、137、和138；

b)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL1：分别是SEQ ID NO：64、65、和66；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH1：分别是SEQ IDNO：142、143、和144；

c)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL1：分别是SEQ ID NO：70、71、和72；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH1：分别是SEQ IDNO：148、149、和150；

d)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL1：分别是SEQ ID NO：76、77、和6780；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH1：分别是SEQ IDNO：154、155、和156；

e)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL1：分别是SEQ ID NO：82、83、和84；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH1：分别是SEQ IDNO：160、161、和162；

f)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL1：分别是SEQ ID NO：88、89、和90；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH1：分别是SEQ IDNO：166、167、和168；

g)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL1：分别是SEQ ID NO：94、95、和96；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH1：分别是SEQ IDNO：172、173、和174；

h)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL1：分别是SEQ ID NO：100、101、和102；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH1：分别是SEQ IDNO：178、179、和180；

i)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL1：分别是SEQ ID NO：106、107、和108；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH1：分别是SEQ IDNO：184、185、和186；

j)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL1：分别是SEQ ID NO：112、113、和114；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH1：分别是SEQ IDNO：190、191、和192；

k)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL1：分别是SEQ ID NO：118、119、和120；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH1：分别是SEQ IDNO：196、197、和198；

1)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL1：分别是SEQ ID NO：124、125、和126；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH1：分别是SEQ IDNO：202、203、和204；以及

m)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL1：分别是SEQ ID NO：130、131、和132；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH1：分别是SEQ IDNO：208、209、和210；

并且

2)VL2和VH2选自由以下组成的组：

a)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL2：分别是SEQ ID NO：230、231、和232；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH2：分别是SEQ IDNO：254、255、和256；

b)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL2：分别是SEQ ID NO：236、237、和238；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH2：分别是SEQ IDNO：260、261、和262；

c)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL2：分别是SEQ ID NO：242、243、和244；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH2：分别是SEQ IDNO：266、267、和268；以及

d)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL2：分别是SEQ ID NO：248、249、和250；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH2：分别是SEQ IDNO：272、273、和274。

在一个实施例中，VL1包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、49、和53；

VH1包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、和54；

VL2包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：213、217、221、和225；

VH2包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：214、218、222、和226。

在一个实施例中，

1)VL1和VH1选自由以下组成的组：

a)包含SEQ ID NO：5的VL1和包含SEQ ID NO：6的VH1；

b)包含SEQ ID NO：9的VL1和包含SEQ ID NO：10的VH1；

c)包含SEQ ID NO：13的VL1和包含SEQ ID NO：14的VH1；

d)包含SEQ ID NO：17的VL1和包含SEQ ID NO：18的VH1；

e)包含SEQ ID NO：21的VL1和包含SEQ ID NO：22的VH1；

f)包含SEQ ID NO：25的VL1和包含SEQ ID NO：26的VH1；

g)包含SEQ ID NO：29的VL1和包含SEQ ID NO：30的VH1；

h)包含SEQ ID NO：33的VL1和包含SEQ ID NO：34的VH1；

i)包含SEQ ID NO：37的VL1和包含SEQ ID NO：38的VH1；

j)包含SEQ ID NO：41的VL1和包含SEQ ID NO：42的VH1；

k)包含SEQ ID NO：45的VL1和包含SEQ ID NO：46的VH1；

l)包含SEQ ID NO：49的VL1和包含SEQ ID NO：50的VH1；以及

m)包含SEQ ID NO：53的VL1和包含SEQ ID NO：54的VH1；

并且

2)VL2和VH2选自由以下组成的组：

a)包含SEQ ID NO：213的VL2和包含SEQ ID NO：214的VH2；

b)包含SEQ ID NO：217的VL2和包含SEQ ID NO：218的VH2；

c)包含SEQ ID NO：221的VL2和包含SEQ ID NO：222的VH2；以及

d)包含SEQ ID NO：225的VL2和包含SEQ ID NO：226的VH2。

在一个实施例中，轻链的CL选自由SEQ ID NO：883和SEQ ID NO：884组成的组。

在一个实施例中，重链的CH1-铰链-CH2-CH3选自由SEQ ID NO：885和SEQ ID NO：886组成的组。

在一个实施例中，第一肽接头选自由SEQ ID NO：888-893组成的组。

在一个实施例中，第二肽接头选自由SEQ ID NO：887-893组成的组。

在一个实施例中，第一肽接头包含SEQ ID NO：889并且第二肽接头包含SEQ IDNO：887。

在一个实施例中，

轻链包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO：286、290、294、298、302、306、310、314、318、322、326、330、336、342、346、350、354、358、362、366、370、374、和378；并且

重链融合蛋白包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO：285、289、293、297、301、305、309、313、317、321、325、329、333、337、341、345、349、353、357、361、365、369、373、和377。

在一个实施例中，轻链和重链融合蛋白包含多肽，这些多肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：

分别是SEQ ID NO：286和SEQ ID NO：285；

分别是SEQ ID NO：290和SEQ ID NO：289；

分别是SEQ ID NO：294和SEQ ID NO：293；

分别是SEQ ID NO：298和SEQ ID NO：297；

分别是SEQ ID NO：302和SEQ ID NO：301；

分别是SEQ ID NO：306和SEQ ID NO：305；

分别是SEQ ID NO：310和SEQ ID NO：309；

分别是SEQ ID NO：314和SEQ ID NO：313；

分别是SEQ ID NO：318和SEQ ID NO：317；

分别是SEQ ID NO：322和SEQ ID NO：321；

分别是SEQ ID NO：326和SEQ ID NO：325；

分别是SEQ ID NO：330和SEQ ID NO：329；

分别是SEQ ID NO：334和SEQ ID NO：333；

分别是SEQ ID NO：338和SEQ ID NO：337；

分别是SEQ ID NO：342和SEQ ID NO：341；

分别是SEQ ID NO：346和SEQ ID NO：345；

分别是SEQ ID NO：350和SEQ ID NO：349；

分别是SEQ ID NO：354和SEQ ID NO：353；

分别是SEQ ID NO：358和SEQ ID NO：357；

分别是SEQ ID NO：362和SEQ ID NO：361；

分别是SEQ ID NO：366和SEQ ID NO：365；

分别是SEQ ID NO：370和SEQ ID NO：369；

分别是SEQ ID NO：374和SEQ ID NO：373；以及

分别是SEQ ID NO：378和SEQ ID NO：377。

在一方面，本发明涉及编码本发明的抗体构建体的轻链的多核苷酸。

在一方面，本发明涉及编码本发明的抗体构建体的重链融合蛋白的多核苷酸。

在一方面，本发明涉及包含编码抗体构建体的轻链的多核苷酸、编码抗体构建体的重链的多核苷酸、或两者的载体。

在一方面，本发明涉及用载体或编码抗体构建体的轻链的多核苷酸和编码抗体构建体的重链的多核苷酸转化或转染的宿主细胞。

在一方面，本发明涉及用于产生本发明的抗体构建体的方法，该方法包括在允许表达该抗体构建体的条件下，培养包含编码轻链的多核苷酸以及还包含编码重链融合蛋白的多核苷酸的宿主细胞，并且从培养物回收产生的抗体构建体。

在一方面，本发明涉及药物组合物，该药物组合物包含根据本发明的抗体构建体和载剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂、防腐剂或辅助剂。

在一方面，本发明涉及用于治疗或改善实体瘤疾病或转移性癌症疾病的方法，该方法包括向有需要的受试者施用有效量的根据本发明的抗体构建体。

在一个实施例中，实体瘤疾病选自由以下组成的组：卵巢癌、胰腺癌、间皮瘤、肺癌、胃部癌和三阴性乳腺癌疾病或源自任何前述疾病的转移性癌症疾病。

在一方面，本发明涉及试剂盒，该试剂盒包含根据本发明的抗体构建体和任选地，使用说明书。

在一方面，本发明涉及多特异性抗体构建体，该多特异性抗体构建体包含：

(i)含有两个轻链和两个重链的第一抗体，其中

轻链包含第一可变区(VL1)和轻链恒定区(CL)；

重链包含第一重可变区(VH1)和CH1、铰链、CH2、和CH3区；

重链包含至少一个氨基酸取代，该取代导致该重链对人FcγRI受体的结合亲和力降低(与未取代的重链相比)；以及

其中第一抗体特异性地结合至人间皮素(MSLN)(SEQ ID NO：2)，并且scFv特异性地结合至并激动人CD40(SEQ ID NO：1)。

(i)N297G或N297A；

(ii)L234A和L235A；以及

(iii)R292C和V302C；

其中氨基酸编号是根据Kabat的EU编号。

在一个实施例中：

VL1包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3：

分别是SEQ ID NO：230、231、和232；

分别是SEQ ID NO：236、237、和238；

分别是SEQ ID NO：242、243、和244；以及

分别是SEQ ID NO：248、249、和250；

VH1包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3：

分别是SEQ ID NO：254、255、和256；

分别是SEQ ID NO：260、261、和262；

分别是SEQ ID NO：266、267、和268；以及

分别是SEQ ID NO：272、273、和274；

VL2包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3：

分别是SEQ ID NO：58、59、和60；

分别是SEQ ID NO：64、65、和66；

分别是SEQ ID NO：70、71、和72；

分别是SEQ ID NO：76、77、和78；

分别是SEQ ID NO：82、83、和84；

分别是SEQ ID NO：88、89、和90；

分别是SEQ ID NO：94、95、和96；

分别是SEQ ID NO：100、101、和102；

分别是SEQ ID NO：106、107、和108；

分别是SEQ ID NO：112、113、和114；

分别是SEQ ID NO：118、119、和120；

分别是SEQ ID NO：124、125、和126；以及

分别是SEQ ID NO：130、131、和132；

并且

VH2包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3：

分别是SEQ ID NO：136、137、和138；

分别是SEQ ID NO：142、143、和144；

分别是SEQ ID NO：148、149、和150；

分别是SEQ ID NO：154、155、和156；

分别是SEQ ID NO：160、161、和162；

分别是SEQ ID NO：166、167、和168；

分别是SEQ ID NO：172、173、和174；

分别是SEQ ID NO：178、179、和180；

分别是SEQ ID NO：184、185、和186；

分别是SEQ ID NO：190、191、和192；

分别是SEQ ID NO：196、197、和198；

分别是SEQ ID NO：202、203、和204；以及

分别是SEQ ID NO：208、209、和210。

在一个实施例中，

1)VL1和VH1选自由以下组成的组：

a)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL1：分别是SEQ ID NO：230、231、和232；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH1：分别是SEQ IDNO：254、255、和256；

b)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL1：分别是SEQ ID NO：236、237、和238；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH1：分别是SEQ IDNO：260、261、和262；

c)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL1：分别是SEQ ID NO：242、243、和244；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH1：分别是SEQ IDNO：266、267、和268；以及

d)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL1：分别是SEQ ID NO：248、249、和250；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH1：分别是SEQ IDNO：272、273、和274；

并且

2)VL2和VH2选自由以下组成的组：

a)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL2：分别是SEQ ID NO：58、59、和60；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH2：分别是SEQ IDNO：136、137、和138；

b)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL2：分别是SEQ ID NO：64、65、和66；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH2：分别是SEQ IDNO：142、143、和144；

c)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL2：分别是SEQ ID NO：70、71、和72；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH2：分别是SEQ IDNO：148、149、和150；

d)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL2：分别是SEQ ID NO：76、77、和6780；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH2：分别是SEQ IDNO：154、155、和156；

e)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL2：分别是SEQ ID NO：82、83、和84；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH2：分别是SEQ IDNO：160、161、和162；

f)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL2：分别是SEQ ID NO：88、89、和90；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH2：分别是SEQ IDNO：166、167、和168；

g)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL2：分别是SEQ ID NO：94、95、和96；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH2：分别是SEQ IDNO：172、173、和174；

h)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL2：分别是SEQ ID NO：100、101、和102；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH2：分别是SEQ IDNO：178、179、和180；

i)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL2：分别是SEQ ID NO：106、107、和108；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH2：分别是SEQ IDNO：184、185、和186；

j)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL2：分别是SEQ ID NO：112、113、和114；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH2：分别是SEQ IDNO：190、191、和192；

k)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL2：分别是SEQ ID NO：118、119、和120；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH2：分别是SEQ IDNO：196、197、和198；

l)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL2：分别是SEQ ID NO：124、125、和126；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH2：分别是SEQ IDNO：202、203、和204；以及

m)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL2：分别是SEQ ID NO：130、131、和132；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH2：分别是SEQ IDNO：208、209、和210。

在一个实施例中：

VL1包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：213、217、221、和225；

VH1包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：214、218、222、和226；

VL2包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、49、和53；并且

VH2包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、和54。

在一个实施例中：

1)VL1和VH1选自由以下组成的组：

a)包含SEQ ID NO：213的VL1和包含SEQ ID NO：214的VH1；

b)包含SEQ ID NO：217的VL1和包含SEQ ID NO：218的VH1；

c)包含SEQ ID NO：221的VL1和包含SEQ ID NO：222的VH1；以及

d)包含SEQ ID NO：225的VL1和包含SEQ ID NO：226的VH1；

并且

2)VL2和VH2选自由以下组成的组：

a)包含SEQ ID NO：5的VL2和包含SEQ ID NO：6的VH2；

b)包含SEQ ID NO：9的VL2和包含SEQ ID NO：10的VH2；

c)包含SEQ ID NO：13的VL2和包含SEQ ID NO：14的VH2；

d)包含SEQ ID NO：17的VL2和包含SEQ ID NO：18的VH2；

e)包含SEQ ID NO：21的VL2和包含SEQ ID NO：22的VH2；

f)包含SEQ ID NO：25的VL2和包含SEQ ID NO：26的VH2；

g)包含SEQ ID NO：29的VL2和包含SEQ ID NO：30的VH2；

h)包含SEQ ID NO：33的VL2和包含SEQ ID NO：34的VH2；

i)包含SEQ ID NO：37的VL2和包含SEQ ID NO：38的VH2；

j)包含SEQ ID NO：41的VL2和包含SEQ ID NO：42的VH2；

k)包含SEQ ID NO：45的VL2和包含SEQ ID NO：46的VH2；

l)包含SEQ ID NO：49的VL2和包含SEQ ID NO：50的VH2；以及

m)包含SEQ ID NO：53的VL2和包含SEQ ID NO：54的VH2。

在一个实施例中，

轻链包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO：382、386、390、394、398、402、406、410、414、418、422、426、430、434、438、442、446、和450；并且

重链融合蛋白包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO：381、385、389、393、397、401、405、409、413、417、421、425、429、433、437、441、445、和449。

分别是SEQ ID NO：382和SEQ ID NO：381；

分别是SEQ ID NO：386和SEQ ID NO：385；

分别是SEQ ID NO：390和SEQ ID NO：389；

分别是SEQ ID NO：394和SEQ ID NO：393；

分别是SEQ ID NO：398和SEQ ID NO：397；

分别是SEQ ID NO：402和SEQ ID NO：401；

分别是SEQ ID NO：406和SEQ ID NO：405；

分别是SEQ ID NO：410和SEQ ID NO：409；

分别是SEQ ID NO：414和SEQ ID NO：413；

分别是SEQ ID NO：418和SEQ ID NO：417；

分别是SEQ ID NO：422和SEQ ID NO：421；

分别是SEQ ID NO：426和SEQ ID NO：425；

分别是SEQ ID NO：430和SEQ ID NO：429；

分别是SEQ ID NO：434和SEQ ID NO：433；

分别是SEQ ID NO：438和SEQ ID NO：437；

分别是SEQ ID NO：442和SEQ ID NO：441；

分别是SEQ ID NO：446和SEQ ID NO：445；以及

分别是SEQ ID NO：450和SEQ ID NO：449。

a)每个都包含第一重链可变区(VH1)和第一CH1结构域的两个相同重链融合蛋白，其中该第一CH1结构域连接至铰链-CH2-CH3多肽，并且其中该铰链-CH2-CH3多肽连接至第二重链可变区(VH2)，其中该VH2连接至第二CH1结构域；其中

i)VH1或第一CH1结构域包含至少一个氨基酸取代以在选自由以下位置组成的组的残基处引入带正电的氨基酸：39、44、和183，使用EU编号；并且

ii)VH2或第二CH1结构域包含至少一个氨基酸取代以在选自由对应于以下位置的残基组成的组的残基处引入带负电的氨基酸：39、44、和183，使用EU编号；以及

b)包含第一轻链的第二多肽，其中该第一轻链包含第一轻链可变区(VL1)和第一CL区；并且其中VL1或第一CL结构域包含至少一个氨基酸取代以在选自由以下位置组成的组的残基处引入带负电的氨基酸：38、100、和176，使用EU编号；以及

c)包含第二轻链的第三多肽，其中该第二轻链包含第二轻链可变区(VL2)和第二CL区；并且其中VL2或第二CL结构域包含至少一个氨基酸取代以在选自由以下位置组成的组的残基处引入带正电的氨基酸：38、100、和176，使用EU编号；

其中VH1和VL1相互作用以结合第一抗原并且其中VH2和VL2相互作用以结合第二抗原；

其中：

第一抗原是人CD40(SEQ ID NO：1)并且第二抗原是人间皮素(“MSLN”；SEQ ID NO：2)；或者

第一抗原是人MSLN(SEQ ID NO：2)并且第二抗原是人CD40(SEQ ID NO：1)。

i)VH1或第一CH1结构域包含至少一个氨基酸取代以在选自由以下位置组成的组的残基处引入带负电的氨基酸：39、44、和183，使用EU编号；并且

ii)VH2或第二CH1结构域包含至少一个氨基酸取代以在选自由对应于以下位置的残基组成的组的残基处引入带正电的氨基酸：39、44、和183，使用EU编号；以及

b)包含第一轻链的第二多肽，其中该第一轻链包含第一轻链可变区(VL1)和第一CL区；并且其中VL1或第一CL结构域包含至少一个氨基酸取代以在选自由以下位置组成的组的残基处引入带正电的氨基酸：38、100、和176，使用EU编号；以及

c)包含第二轻链的第三多肽，其中该第二轻链包含第二轻链可变区(VL2)和第二CL区；并且其中VL2或第二CL结构域包含至少一个氨基酸取代以在选自由以下位置组成的组的残基处引入带负电的氨基酸：38、100、和176，使用EU编号；

其中：

在一个实施例中，将铰链-CH2-CH3多肽经由肽接头连接至VH2。

在一个实施例中，肽接头包含选自由以下组成的组的序列：(Gly₃Ser)₂(SEQ IDNO：916)、(Gly₄Ser)₂(SEQ ID NO：888)、(Gly₃Ser)₃(SEQ ID NO：917)、(Gly₄Ser)₃(SEQ IDNO：889)、(Gly₃Ser)₄(SEQ ID NO：918)、(Gly₄Ser)₄(SEQ ID NO：890)、(Gly₃Ser)₅(SEQ IDNO：919)、(Gly₄Ser)₅(SEQ ID NO：920)、(Gly₃Ser)₆(SEQ ID NO：921)、和(Gly₄Ser)₆(SEQ IDNO：922)。

在一个实施例中，

a)VH1或第一CH1结构域包含选自由以下组成的组的突变：Q39K、G44K、和S183K，使用EU编号；

b)VH2或第二CH1结构域包含选自由以下组成的组的突变：Q39E、G44E、和S183E，使用EU编号；

c)VL1或第一CL结构域包含选自由以下组成的组的突变：Q38E、G100E、和S176E，使用EU编号；并且

d)VL2或第二CL结构域包含选自由以下组成的组的突变：Q38K、G100K、和S176K，使用EU编号。

在一个实施例中，

a)第一CH1结构域包含S183K突变，使用EU编号；

b)第二CH1结构域包含S183E突变，使用EU编号；

c)第一CL结构域包含S176E突变，使用EU编号；并且

d)第二CL结构域包含S176K突变，使用EU编号。

在一个实施例中，

a)VH1包含Q39K突变并且第一CH1结构域包含S183K突变，使用EU编号；

b)VH2包含Q39E突变并且第二CH1结构域包含S183E突变，使用EU编号；

c)VL1包含Q38E突变并且第一CL结构域包含S176E突变，使用EU编号；并且

d)VL2包含Q38K突变并且第二CL结构域包含S176K突变，使用EU编号。

在一个实施例中，

a)第一CH1结构域包含G44K和S183K突变，使用EU编号；

b)第二CH1结构域包含G44E和S183E突变，使用EU编号；

c)第一CL结构域包含G100E和S176E突变，使用EU编号；并且

d)第二CL结构域包含G100K和S176K突变，使用EU编号。

在一个实施例中，

a)VH1或第一CH1结构域包含选自由以下组成的组的突变：Q39E、G44E、和S183E，使用EU编号；

b)VH2或第二CH1结构域包含选自由以下组成的组的突变：Q39K、G44K、和S183K，使用EU编号；

c)VL1或第一CL结构域包含选自由以下组成的组的突变：Q38K、G100K、和S176K，使用EU编号；并且

d)VL2或第二CL结构域包含选自由以下组成的组的突变：Q38E、G100E、和S176E，使用EU编号。

在一个实施例中，

a)第一CH1结构域包含S183E突变，使用EU编号；

b)第二CH1结构域包含S183K突变，使用EU编号；

c)第一CL结构域包含S176K突变，使用EU编号；并且

d)第二CL结构域包含S176E突变，使用EU编号。

在一个实施例中，

a)VH1包含Q39E突变并且第一CH1结构域包含S183E突变，使用EU编号；

b)VH2包含Q39K突变并且第二CH1结构域包含S183K突变，使用EU编号；

c)VL1包含Q38K突变并且第一CL结构域包含S176K突变，使用EU编号；并且

d)VL2包含Q38E突变并且第二CL结构域包含S176E突变，使用EU编号。

在一个实施例中，

a)第一CH1结构域包含G44E和S183E突变，使用EU编号；

b)第二CH1结构域包含G44K和S183K突变，使用EU编号；

c)第一CL结构域包含G100K和S176K突变，使用EU编号；并且

d)第二CL结构域包含G100E和S176E突变，使用EU编号。

在一个实施例中，铰链-CH2-CH3多肽包含选自由以下组成的组的氨基酸取代：

(i)N297G或N297A；

(ii)L234A和L235A；并且

(iii)R292C和V302C；

其中氨基酸编号是根据Kabat的EU编号。

在一个实施例中，铰链-CH2-CH3多肽包含N297G、R292C、和V302C突变，其中氨基酸编号是根据Kabat的EU编号。

在一个实施例中，第一抗原是人CD40(SEQ ID NO：1)并且第二抗原是人MSLN(SEQID NO：2)；并且

VL1包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3：

分别是SEQ ID NO：58、59、和60；

分别是SEQ ID NO：64、65、和66；

分别是SEQ ID NO：70、71、和72；

分别是SEQ ID NO：76、77、和78；

分别是SEQ ID NO：82、83、和84；

分别是SEQ ID NO：88、89、和90；

分别是SEQ ID NO：94、95、和96；

分别是SEQ ID NO：100、101、和102；

分别是SEQ ID NO：106、107、和108；

分别是SEQ ID NO：112、113、和114；

分别是SEQ ID NO：118、119、和120；

分别是SEQ ID NO：124、125、和126；以及

分别是SEQ ID NO：130、131、和132；

VH1包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3：

分别是SEQ ID NO：136、137、和138；

分别是SEQ ID NO：142、143、和144；

分别是SEQ ID NO：148、149、和150；

分别是SEQ ID NO：154、155、和156；

分别是SEQ ID NO：160、161、和162；

分别是SEQ ID NO：166、167、和168；

分别是SEQ ID NO：172、173、和174；

分别是SEQ ID NO：178、179、和180；

分别是SEQ ID NO：184、185、和186；

分别是SEQ ID NO：190、191、和192；

分别是SEQ ID NO：196、197、和198；

分别是SEQ ID NO：202、203、和204；以及

分别是SEQ ID NO：208、209、和210；

VL2包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3：

分别是SEQ ID NO：230、231、和232；

分别是SEQ ID NO：236、237、和238；

分别是SEQ ID NO：242、243、和244；以及

分别是SEQ ID NO：248、249、和250；

并且VH2包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3：

分别是SEQ ID NO：254、255、和256；

分别是SEQ ID NO：260、261、和262；

分别是SEQ ID NO：266、267、和268；以及

分别是SEQ ID NO：272、273、和274。

64.如权利要求63所述的抗体构建体，其中

1)VL1和VH1选自由以下组成的组：

l)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL1：分别是SEQ ID NO：124、125、和126；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH1：分别是SEQ IDNO：202、203、和204；以及

以及

2)VL2和VH2选自由以下组成的组：

在一个实施例中：

VL1包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：5、9、13、17、2１、25、29、33、37、41、45、49、和53；

在一个实施例中：

1)VL1和VH1选自由以下组成的组：

a)包含SEQ ID NO：5的VL1和包含SEQ ID NO：6的VH1；

b)包含SEQ ID NO：9的VL1和包含SEQ ID NO：10的VH1；

c)包含SEQ ID NO：13的VL1和包含SEQ ID NO：14的VH1；

d)包含SEQ ID NO：17的VL1和包含SEQ ID NO：18的VH1；

e)包含SEQ ID NO：21的VL1和包含SEQ ID NO：22的VH1；

f)包含SEQ ID NO：25的VL1和包含SEQ ID NO：26的VH1；

g)包含SEQ ID NO：29的VL1和包含SEQ ID NO：30的VH1；

h)包含SEQ ID NO：33的VL1和包含SEQ ID NO：34的VH1；

i)包含SEQ ID NO：37的VL1和包含SEQ ID NO：38的VH1；

j)包含SEQ ID NO：41的VL1和包含SEQ ID NO：42的VH1；

k)包含SEQ ID NO：45的VL1和包含SEQ ID NO：46的VH1；

l)包含SEQ ID NO：49的VL1和包含SEQ ID NO：50的VH1；以及

m)包含SEQ ID NO：53的VL1和包含SEQ ID NO：54的VH1；

并且

2)VL2和VH2选自由以下组成的组：

a)包含SEQ ID NO：213的VL2和包含SEQ ID NO：214的VH2；

b)包含SEQ ID NO：217的VL2和包含SEQ ID NO：218的VH2；

c)包含SEQ ID NO：221的VL2和包含SEQ ID NO：222的VH2；以及

d)包含SEQ ID NO：225的VL2和包含SEQ ID NO：226的VH2。

在一方面，本发明涉及编码抗体构建体的第一轻链的多核苷酸。

在一方面，本发明涉及编码抗体构建体的第二轻链的多核苷酸。

在一方面，本发明涉及编码抗体构建体的重链融合蛋白的多核苷酸。

在一方面，本发明涉及载体，该载体包含：

a)编码抗体构建体的第一轻链的多核苷酸，

b)编码抗体构建体的第二轻链的多核苷酸，

c)编码抗体构建体的重链融合蛋白的多核苷酸，或

d)a)、b)、和c)的任何组合。

在一方面，本发明涉及用根据本发明的载体或多核苷酸转化或转染宿主细胞。

在一方面，本发明涉及用于产生根据本发明的抗体构建体的方法，该方法包括在允许表达该抗体构建体的条件下，培养包含编码第一轻链的多核苷酸、编码第二轻链的多核苷酸、和编码重链融合蛋白的多核苷酸的宿主细胞，并且从培养物回收产生的抗体构建体。

在一个实施例中，该第一抗原是人MSLN(SEQ ID NO：2)并且该第二抗原是人CD40(SEQ ID NO：1)；其中：

VL1包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3：

分别是SEQ ID NO：230、231、和232；

分别是SEQ ID NO：236、237、和238；

分别是SEQ ID NO：242、243、和244；以及

分别是SEQ ID NO：248、249、和250；

VH1包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3：

分别是SEQ ID NO：254、255、和256；

分别是SEQ ID NO：260、261、和262；

分别是SEQ ID NO：266、267、和268；以及

分别是SEQ ID NO：272、273、和274；

VL2包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3：

分别是SEQ ID NO：58、59、和60；

分别是SEQ ID NO：64、65、和66；

分别是SEQ ID NO：70、71、和72；

分别是SEQ ID NO：76、77、和78；

分别是SEQ ID NO：82、83、和84；

分别是SEQ ID NO：88、89、和90；

分别是SEQ ID NO：94、95、和96；

分别是SEQ ID NO：100、101、和102；

分别是SEQ ID NO：106、107、和108；

分别是SEQ ID NO：112、113、和114；

分别是SEQ ID NO：118、119、和120；

分别是SEQ ID NO：124、125、和126；以及

分别是SEQ ID NO：130、131、和132；

并且

VH2包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3：

分别是SEQ ID NO：136、137、和138；

分别是SEQ ID NO：142、143、和144；

分别是SEQ ID NO：148、149、和150；

分别是SEQ ID NO：154、155、和156；

分别是SEQ ID NO：160、161、和162；

分别是SEQ ID NO：166、167、和168；

分别是SEQ ID NO：172、173、和174；

分别是SEQ ID NO：178、179、和180；

分别是SEQ ID NO：184、185、和186；

分别是SEQ ID NO：190、191、和192；

分别是SEQ ID NO：196、197、和198；

分别是SEQ ID NO：202、203、和204；以及

分别是SEQ ID NO：208、209、和210。

在一个实施例中，

1)VL1和VH1选自由以下组成的组：

并且

2)VL2和VH2选自由以下组成的组：

在一个实施例中，

1)VL1和VH1选自由以下组成的组：

a)包含SEQ ID NO：213的VL1和包含SEQ ID NO：214的VH1；

b)包含SEQ ID NO：217的VL1和包含SEQ ID NO：218的VH1；

c)包含SEQ ID NO：221的VL1和包含SEQ ID NO：222的VH1；以及

d)包含SEQ ID NO：225的VL1和包含SEQ ID NO：226的VH1；

并且

2)VL2和VH2选自由以下组成的组：

a)包含SEQ ID NO：5的VL2和包含SEQ ID NO：6的VH2；

b)包含SEQ ID NO：9的VL2和包含SEQ ID NO：10的VH2；

c)包含SEQ ID NO：13的VL2和包含SEQ ID NO：14的VH2；

d)包含SEQ ID NO：17的VL2和包含SEQ ID NO：18的VH2；

e)包含SEQ ID NO：21的VL2和包含SEQ ID NO：22的VH2；

f)包含SEQ ID NO：25的VL2和包含SEQ ID NO：26的VH2；

g)包含SEQ ID NO：29的VL2和包含SEQ ID NO：30的VH2；

h)包含SEQ ID NO：33的VL2和包含SEQ ID NO：34的VH2；

i)包含SEQ ID NO：37的VL2和包含SEQ ID NO：38的VH2；

j)包含SEQ ID NO：41的VL2和包含SEQ ID NO：42的VH2；

k)包含SEQ ID NO：45的VL2和包含SEQ ID NO：46的VH2；

l)包含SEQ ID NO：49的VL2和包含SEQ ID NO：50的VH2；以及

m)包含SEQ ID NO：53的VL2和包含SEQ ID NO：54的VH2。

在一方面，本发明涉及抗原结合蛋白，该抗原结合蛋白特异性地结合并且激动人CD40(SEQ ID NO：1)，该抗原结合蛋白包含轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)，其中：

VL包含选自由以下组成的组：CDRL1、CDRL2、和CDRL3：

分别是SEQ ID NO：58、59、和60；

分别是SEQ ID NO：64、65、和66；

分别是SEQ ID NO：70、71、和72；

分别是SEQ ID NO：76、77、和78；

分别是SEQ ID NO：82、83、和84；

分别是SEQ ID NO：88、89、和90；

分别是SEQ ID NO：94、95、和96；

分别是SEQ ID NO：100、101、和102；

分别是SEQ ID NO：106、107、和108；

分别是SEQ ID NO：112、113、和114；

分别是SEQ ID NO：118、119、和120；

分别是SEQ ID NO：124、125、和126；以及

分别是SEQ ID NO：130、131、和132；

并且

VH包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3：

分别是SEQ ID NO：136、137、和138；

分别是SEQ ID NO：142、143、和144；

分别是SEQ ID NO：148、149、和150；

分别是SEQ ID NO：154、155、和156；

分别是SEQ ID NO：160、161、和162；

分别是SEQ ID NO：166、167、和168；

分别是SEQ ID NO：172、173、和174；

分别是SEQ ID NO：178、179、和180；

分别是SEQ ID NO：184、185、和186；

分别是SEQ ID NO：190、191、和192；

分别是SEQ ID NO：196、197、和198；

分别是SEQ ID NO：202、203、和204；以及

分别是SEQ ID NO：208、209、和210。

在一个实施例中，

VL和VH选自由以下组成的组：

a)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL：分别是SEQ ID NO：58、59、和60；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH：分别是SEQ ID NO：136、137、和138；

b)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL：分别是SEQ ID NO：64、65、和66；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH：分别是SEQ ID NO：142、143、和144；

c)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL：分别是SEQ ID NO：70、71、和72；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH：分别是SEQ ID NO：148、149、和150；

d)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL：分别是SEQ ID NO：76、77、和6780；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH：分别是SEQ ID NO：154、155、和156；

e)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL：分别是SEQ ID NO：82、83、和84；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH：分别是SEQ ID NO：160、161、和162；

f)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL：分别是SEQ ID NO：88、89、和90；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH：分别是SEQ ID NO：166、167、和168；

g)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL：分别是SEQ ID NO：94、95、和96；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH：分别是SEQ ID NO：172、173、和174；

h)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL：分别是SEQ ID NO：100、101、和102；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH：分别是SEQ IDNO：178、179、和180；

i)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL：分别是SEQ ID NO：106、107、和108；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH：分别是SEQ IDNO：184、185、和186；

j)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL：分别是SEQ ID NO：112、113、和114；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH：分别是SEQ IDNO：190、191、和192；

k)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL：分别是SEQ ID NO：118、119、和120；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH：分别是SEQ IDNO：196、197、和198；

l)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL：分别是SEQ ID NO：124、125、和126；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH：分别是SEQ IDNO：202、203、和204；以及

m)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL：分别是SEQ ID NO：130、131、和132；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH：分别是SEQ IDNO：208、209、和210。

在一个实施例中，

VL包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、49、和53；并且

VH包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、和54。

在一个实施例中，

VL和VH选自由以下组成的组：

a)包含SEQ ID NO：5的VL和包含SEQ ID NO：6的VH；

b)包含SEQ ID NO：9的VL和包含SEQ ID NO：10的VH；

c)包含SEQ ID NO：13的VL和包含SEQ ID NO：14的VH；

d)包含SEQ ID NO：17的VL和包含SEQ ID NO：18的VH；

e)包含SEQ ID NO：21的VL和包含SEQ ID NO：22的VH；

f)包含SEQ ID NO：25的VL和包含SEQ ID NO：26的VH；

g)包含SEQ ID NO：29的VL和包含SEQ ID NO：30的VH；

h)包含SEQ ID NO：33的VL和包含SEQ ID NO：34的VH；

i)包含SEQ ID NO：37的VL和包含SEQ ID NO：38的VH；

j)包含SEQ ID NO：41的VL和包含SEQ ID NO：42的VH；

k)包含SEQ ID NO：45的VL和包含SEQ ID NO：46的VH；

l)包含SEQ ID NO：49的VL和包含SEQ ID NO：50的VH；以及

m)包含SEQ ID NO：53的VL和包含SEQ ID NO：54的VH。

(i)N297G或N297A；

(ii)L234A和L235A；以及

(iii)R292C和V302C；

其中氨基酸编号是根据Kabat的EU编号。

在一个实施例中，抗原结合蛋白进一步包含连接至VL的轻链CL多肽，其中该CL多肽选自由SEQ ID NO：883和SEQ ID NO：884组成的组。

在一个实施例中，抗原结合蛋白进一步包含重链CH1-铰链-CH2-CH3多肽，其中该CH1-铰链-CH2-CH3多肽选自由SEQ ID NO：885和SEQ ID NO：886组成的组。

在一个实施例中，抗原结合蛋白进一步包含第二抗原结合部分，该第二抗原结合部分特异性地结合第二抗原。

在一个实施例中，第二抗原是肿瘤相关抗原(TAA)。

附图说明

图1描绘了抗MSLN抗体与表达人MSLN的CHO细胞的细胞结合。

图2描绘了在人B细胞测定中具有或不具有交联的抗CD40抗体的活性。

图3描绘了二价双特异性抗体形式。

图4描绘了表达不同水平的MSLN的细胞系的产生。

图5描绘了小鼠中抗CD40xMSLN双特异性分子的药代动力学特性和稳定性。

图6描绘了表达MC38-人EPCAM和B16F10-人EPCAM的细胞系的产生。

图7描绘了小鼠替代的抗CD40x人EPCAM双特异性分子的活性。

图8描绘了小鼠替代的抗CD40x人EPCAM双特异性分子在体内具有肿瘤-定位的、TAA-介导的X-连接的-依赖性活性。

图9描绘了小鼠替代的抗CD40x人EPCAM双特异性分子增强CD8+ T细胞抗肿瘤应答。

图10描绘了小鼠替代的抗CD40x人EPCAM双特异性分子在体内具有肿瘤-定位的、TAA-介导的X-连接的-依赖性活性。

图11描绘了小鼠替代的抗CD40x人EPCAM双特异性分子不增加全身细胞因子的水平或增加肝脏炎症。

图12描绘了小鼠替代的抗CD40x人EPCAM双特异性分子单独和与PD1/PDL1阻断组合诱导已建立的MC38-人EPCAM肿瘤的消退。

图13描绘了小鼠替代的抗CD40x人EPCAM双特异性分子诱导长效的免疫记忆，该免疫记忆防止肿瘤再激发。

具体实施方式

除非另外指明，否则在一系列元素前面的术语“至少”应被理解为指该系列中的每一个元素。本领域技术人员将认识到，或能够仅使用常规试验确定本文所述的本发明的具体实施例的许多等效内容。此类等效物旨在由本发明所涵盖。

术语“和/或”在本文使用时包括“和”、“或”和“由所述术语连接的要素的全部或任何其他组合”的含义。

如本文所用的，术语“约”或“大约”意指在给定值或范围的±20％内，优选地在±15％内，更优选地在±10％内，最优选地在±5％内。

贯穿本说明书及以下权利要求书，除非上下文另有要求，否则单词“包含(comprise)”及变化形式如“包含(comprises和comprising)”应理解为隐含包括所陈述的整数或步骤或者整数或步骤的组，而不是排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤的组。当在本文中使用时，术语“包含”可以用术语“含有”或“包括”取代，或者有时在本文中取代为术语“具有”。

当在本文中使用时，“由......组成”排除在权利要求书中未指定的任何元件、步骤或成分。如本文使用的，“基本上由......组成”并不排除不实质性地影响权利要求的基本和新颖特征的材料或步骤。

在本文的每种情况下，术语“包含”、“基本上由......组成”和“由......组成”中的任一者都可以用另外两个术语中的任一者来替换。

如本文所用的，术语“抗原结合蛋白”是指特异性地结合至一个或多个靶抗原的蛋白质。抗原结合蛋白可包括抗体及其功能片段。“功能性抗体片段”是抗体中不含全长重链和/或轻链中存在的氨基酸的至少一部分，但仍能够特异性地结合至抗原的部分。功能性抗体片段包括但不限于Fab片段、Fab′片段、F(ab′)₂片段、Fv片段、Fd片段和互补决定区(CDR)片段，且可以衍生自任何哺乳动物来源，例如人、小鼠、大鼠、兔或骆驼。功能性抗体片段可以与完整抗体竞争结合靶抗原且这些片段可以通过修饰完整抗体(例如酶或化学裂解)或使用重组DNA技术或肽合成从头合成获得。

术语“抗体构建体”是指其中结构和/或功能是基于抗体(例如，全长或完整免疫球蛋白分子)的结构和/或功能的分子。因此，抗体构建体能够与其特异性靶标或抗原结合。此外，根据本发明的抗体构建体包含允许靶结合的抗体的最小结构要求。这种最小要求可以例如通过至少三个轻链CDR(即VL区的CDR1、CDR2和CDR3)和/或三个重链CDR(即VH区的CDR1、CDR2和CDR3)、优选全部六个CDR的存在来定义。根据本发明的构建体所基于的抗体包括例如单克隆、重组、嵌合、去免疫、人源化和人抗体。

在某些实施例中，本发明的抗原结合蛋白包含抗体。如本文所用的，术语“抗体”是指包含两个轻链多肽(各自约25kDa)和两个重链多肽(各自约50-70kDa)的四聚免疫球蛋白。术语“轻链”或“免疫球蛋白轻链”是指自氨基末端至羧基末端包含单一免疫球蛋白轻链可变区(VL)和单一免疫球蛋白轻链恒定结构域(CL)的多肽。免疫球蛋白轻链恒定结构域(CL)可以是kappa(κ)或lambda(λ)。术语“重链”或“免疫球蛋白重链”是指自氨基末端至羧基末端包含单一免疫球蛋白重链可变区(VH)、免疫球蛋白重链恒定结构域1(CH1)、免疫球蛋白铰链区、免疫球蛋白重链恒定结构域2(CH2)、免疫球蛋白重链恒定结构域3(CH3)和任选地免疫球蛋白重链恒定结构域4(CH4)的多肽。重链分类为mu(μ)、delta(Δ)、gamma(γ)、alpha(α)、和epsilon(ε)链，且其分别将抗体同型(isotype)定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG类别和IgA类别的抗体进一步细分为数个亚类，即分别为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，以及IgA1和IgA2。IgG、IgA和IgD抗体中的重链具有三个结构域(CH1、CH2和CH3)，而IgM和IgE抗体中的重链具有四个结构域(CH1、CH2、CH3和CH4)。免疫球蛋白重链恒定结构域可以来自任何免疫球蛋白同型，包括亚型。抗体链是经由在CL结构域与CH1结构域之间(即，在轻链与重链之间)和在抗体重链的铰链区之间的多肽间二硫键连接在一起。

在人抗体中，CH1是指在EU索引的位置118-215处具有氨基酸序列的区域。称为“铰链区”的高度柔性氨基酸区在CH1与CH2之间存在。CH2表示在EU索引的位置231至340处具有氨基酸序列的区域，并且CH3表示在EU索引的位置341至446处具有氨基酸序列的区域。

“CL”表示轻链的恒定区。在人抗体的中κ链的情况下，CL表示在EU索引的位置108-214处具有氨基酸序列的区域。在λ链中，CL表示在位置108至215处具有氨基酸序列的区域。

EU索引(如Kabat等人.，Sequences of Proteins of Immunological Interest[免疫学目的蛋白的序列]，5th Ed.Public Health Service[公共卫生服务第5版]，National Institutes of Health[美国国立卫生研究院]，贝塞斯达，马里兰州(Bethesda，MD.)(1991)中的)和AHo编号方案(HoneggerA.和Plückthun A.J Mol Biol.[分子生物学杂志]2001年6月8日；309(3)：657-70)可用于本发明。给定抗体的氨基酸位置和互补决定区(CDR)和框架区(FR)可以使用任一系统标识。例如，39、44、183、356、357、360、370、392、399、和409的EU重链位置分别等效于AHo重链位置46、51、230、484、485、491、501、528、535、和551。

VL包含选自由以下组成的组：CDRL1、CDRL2、和CDRL3：

分别是SEQ ID NO：58、59、和60；

分别是SEQ ID NO：64、65、和66；

分别是SEQ ID NO：70、71、和72；

分别是SEQ ID NO：76、77、和78；

分别是SEQ ID NO：82、83、和84；

分别是SEQ ID NO：88、89、和90；

分别是SEQ ID NO：94、95、和96；

分别是SEQ ID NO：100、101、和102；

分别是SEQ ID NO：106、107、和108；

分别是SEQ ID NO：112、113、和114；

分别是SEQ ID NO：118、119、和120；

分别是SEQ ID NO：124、125、和126；以及

分别是SEQ ID NO：130、131、和132；

并且

VH包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3：

分别是SEQ ID NO：136、137、和138；

分别是SEQ ID NO：142、143、和144；

分别是SEQ ID NO：148、149、和150；

分别是SEQ ID NO：154、155、和156；

分别是SEQ ID NO：160、161、和162；

分别是SEQ ID NO：166、167、和168；

分别是SEQ ID NO：172、173、和174；

分别是SEQ ID NO：178、179、和180；

分别是SEQ ID NO：184、185、和186；

分别是SEQ ID NO：190、191、和192；

分别是SEQ ID NO：196、197、和198；

分别是SEQ ID NO：202、203、和204；以及

分别是SEQ ID NO：208、209、和210。

在一个实施例中，

VL和VH选自由以下组成的组：

在一个实施例中，

VL和VH选自由以下组成的组：

a)包含SEQ ID NO：5的VL和包含SEQ ID NO：6的VH；

b)包含SEQ ID NO：9的VL和包含SEQ ID NO：10的VH；

c)包含SEQ ID NO：13的VL和包含SEQ ID NO：14的VH；

d)包含SEQ ID NO：17的VL和包含SEQ ID NO：18的VH；

e)包含SEQ ID NO：21的VL和包含SEQ ID NO：22的VH；

f)包含SEQ ID NO：25的VL和包含SEQ ID NO：26的VH；

g)包含SEQ ID NO：29的VL和包含SEQ ID NO：30的VH；

h)包含SEQ ID NO：33的VL和包含SEQ ID NO：34的VH；

i)包含SEQ ID NO：37的VL和包含SEQ ID NO：38的VH；

j)包含SEQ ID NO：41的VL和包含SEQ ID NO：42的VH；

k)包含SEQ ID NO：45的VL和包含SEQ ID NO：46的VH；

l)包含SEQ ID NO：49的VL和包含SEQ ID NO：50的VH；以及

m)包含SEQ ID NO：53的VL和包含SEQ ID NO：54的VH。

在一个实施例中，第二抗原是肿瘤相关抗原(TAA)。

根据本发明的抗体构建体是全长抗体的片段，如VH、VHH、VL、(s)dAb、Fv、Fd、Fab、Fab’、F(ab′)2或“r IgG”(“半抗体”)。根据本发明的抗体构建体还可以包括抗体的经修饰的片段(也称为抗体变体，如scFv、二scFv或双(s)-scFv、scFv-Fc、scFv-拉链、scFab、Fab2、Fab3、双抗体、单链双抗体、串联双抗体(Tandab)、串联二scFv、串联三scFv)、“微型抗体”(其由如下结构示例：(VH-VL-CH3)2、(scFv-CH3)2、((scFv)2-CH3+CH3)、((scFv)2-CH3)或(scFv-CH3-scFv)2)、多体抗体如三抗体(triabody)或四抗体(tetrabody)、和单结构域抗体(如纳米抗体或仅包含一个可变结构域的单可变结构域抗体，该结构域可以是VHH、VH或VL，它独立于其他V区或结构域而特异性地结合抗原或表位)。另外，包括在“抗体构建体”的定义内的是多特异性分子，该多特异性分子包含多种类型的抗体和抗体构建体，例如包含与IgG或IgG-Fab连接的scFv、包含与IgG连接的Fab片段的IgG-scFv。在一个实施例中，将连接至免疫球蛋白重链的scFv称为“重链融合蛋白”。在其他实施例中，连接至免疫球蛋白重链的VH-CH1多肽称为“重链融合蛋白”。

“结合结构域”或“抗原结合结构域”典型地可以包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)；然而，它不一定包含两者。例如，Fd片段具有两个VH区并且通常保留完整抗原结合结构域的一些抗原结合功能。抗体片段、抗体变体或结合结构域的形式的另外实例包括(1)Fab片段，一种具有VL、VH、CL和CH1结构域的单价片段；(2)F(ab′)₂片段，一种具有由二硫桥在铰链区连接的两个Fab片段的双价片段；(3)具有两个VH和CH1结构域的Fd片段；(4)具有抗体的单一臂的VL和VH结构域的Fv片段；(5)具有VH结构域的dAb片段(Ward等人，(1989)Nature[自然]341：544-546)；(6)分离的互补决定区(CDR)，和(7)单链Fv(scFv)，后者是优选的(例如，衍生自scFV文库)。根据本发明的抗体构建体的实施例的实例例如描述于以下中：WO 00/006605、WO 2005/040220、WO 2008/119567、WO 2010/037838、WO 2013/026837、WO 2013/026833、US 2014/0308285、US 2014/0302037、W 02014/144722、WO 2014/151910、和WO 2015/048272。

此外，术语“抗体构建体”的定义包括单价、二价和多价(polyvalent/multivalent)构建体，并且由此包括特异性地结合至仅一个抗原性结构的单特异性构建体，以及通过独特的结合结构域特异性地结合多于一个(例如，两个、三个或更多个)抗原性结构的双特异性和多特异性构建体。此外，术语“抗体构建体”的定义包括由仅一条多肽链组成的分子以及由多于一条多肽链组成的分子，这些链可以相同(同二聚体、同三聚体或同寡聚体)或不同(异二聚体、异三聚体或异寡聚体)。上文鉴定的抗体及其变体或衍生物的实例尤其描述于以下中：Harlow和Lane，Antibodies a laboratory manual[抗体：实验室手册]，CSHL Press[冷泉港实验室出版社](1988)和Using Antibodies：a laboratorymanual[使用抗体：实验室手册]，CSHL Press[冷泉港实验室出版社](1999)；Kontermann和Dubel，Antibody Engineering[抗体工程]，Springer[施普林格]，第2版2010和Little，Recombinant Antibodies for Immunotherapy[用于免疫疗法的重组抗体]，CambridgeUniversity Press[剑桥大学出版社]2009。

本发明的抗体构建体优选地是“体外产生的抗体构建体”。此术语是指根据上述定义的抗体构建体，其中在非免疫细胞选择中生成全部或部分可变区(例如，至少一个CDR)，例如体外噬菌体展示、蛋白质芯片或可以测试候选序列结合抗原的能力的任何其他方法。因此，该术语优选排除仅通过动物的免疫细胞中的基因组重排生成的序列。“重组抗体”是通过使用重组DNA技术或基因工程制得的抗体。

(i)含有两个轻链和两个重链的第一抗体，其中

轻链包含第一可变区(VL1)和轻链恒定区(CL)；

重链包含第一重可变区(VH1)和CH1、铰链、CH2、和CH3区；

分别是SEQ ID NO：58、59、和60；

分别是SEQ ID NO：64、65、和66；

分别是SEQ ID NO：70、71、和72；

分别是SEQ ID NO：76、77、和78；

分别是SEQ ID NO：82、83、和84；

分别是SEQ ID NO：88、89、和90；

分别是SEQ ID NO：94、95、和96；

分别是SEQ ID NO：100、101、和102；

分别是SEQ ID NO：106、107、和108；

分别是SEQ ID NO：112、113、和114；

分别是SEQ ID NO：118、119、和120；

分别是SEQ ID NO：124、125、和126；并且

分别是SEQ ID NO：130、131、和132；

VH1包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3：

分别是SEQ ID NO：136、137、和138；

分别是SEQ ID NO：142、143、和144；

分别是SEQ ID NO：148、149、和150；

分别是SEQ ID NO：154、155、和156；

分别是SEQ ID NO：160、161、和162；

分别是SEQ ID NO：166、167、和168；

分别是SEQ ID NO：172、173、和174；

分别是SEQ ID NO：178、179、和180；

分别是SEQ ID NO：184、185、和186；

分别是SEQ ID NO：190、191、和192；

分别是SEQ ID NO：196、197、和198；

分别是SEQ ID NO：202、203、和204；并且

分别是SEQ ID NO：208、209、和210；

VL2包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3：

分别是SEQ ID NO：230、231、和232；

分别是SEQ ID NO：236、237、和238；

分别是SEQ ID NO：242、243、和244；并且

分别是SEQ ID NO：248、249、和250；

并且VH2包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3：

分别是SEQ ID NO：254、255、和256；

分别是SEQ ID NO：260、261、和262；

分别是SEQ ID NO：266、267、和268；并且

分别是SEQ ID NO：272、273、和274。

在一个实施例中，1)VL1和VH1选自由以下组成的组：

并且

2)VL2和VH2选自由以下组成的组：

VH1包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、和54：

在一个实施例中，

1)VL1和VH1选自由以下组成的组：

a)包含SEQ ID NO：5的VL1和包含SEQ ID NO：6的VH1；

b)包含SEQ ID NO：9的VL1和包含SEQ ID NO：10的VH1；

c)包含SEQ ID NO：13的VL1和包含SEQ ID NO：14的VH1；

d)包含SEQ ID NO：17的VL1和包含SEQ ID NO：18的VH1；

e)包含SEQ ID NO：21的VL1和包含SEQ ID NO：22的VH1；

f)包含SEQ ID NO：25的VL1和包含SEQ ID NO：26的VH1；

g)包含SEQ ID NO：29的VL1和包含SEQ ID NO：30的VH1；

h)包含SEQ ID NO：33的VL1和包含SEQ ID NO：34的VH1；

i)包含SEQ ID NO：37的VL1和包含SEQ ID NO：38的VH1；

j)包含SEQ ID NO：41的VL1和包含SEQ ID NO：42的VH1；

k)包含SEQ ID NO：45的VL1和包含SEQ ID NO：46的VH1；

l)包含SEQ ID NO：49的VL1和包含SEQ ID NO：50的VH1；以及

m)包含SEQ ID NO：53的VL1和包含SEQ ID NO：54的VH1；

并且

2)VL2和VH2选自由以下组成的组：

a)包含SEQ ID NO：213的VL2和包含SEQ ID NO：214的VH2；

b)包含SEQ ID NO：217的VL2和包含SEQ ID NO：218的VH2；

c)包含SEQ ID NO：221的VL2和包含SEQ ID NO：222的VH2；以及

d)包含SEQ ID NO：225的VL2和包含SEQ ID NO：226的VH2。

在一个实施例中，

分别是SEQ ID NO：286和SEQ ID NO：285；

分别是SEQ ID NO：290和SEQ ID NO：289；

分别是SEQ ID NO：294和SEQ ID NO：293；

分别是SEQ ID NO：298和SEQ ID NO：297；

分别是SEQ ID NO：302和SEQ ID NO：301；

分别是SEQ ID NO：306和SEQ ID NO：305；

分别是SEQ ID NO：310和SEQ ID NO：309；

分别是SEQ ID NO：314和SEQ ID NO：313；

分别是SEQ ID NO：318和SEQ ID NO：317；

分别是SEQ ID NO：322和SEQ ID NO：321；

分别是SEQ ID NO：326和SEQ ID NO：325；

分别是SEQ ID NO：330和SEQ ID NO：329；

分别是SEQ ID NO：334和SEQ ID NO：333；

分别是SEQ ID NO：338和SEQ ID NO：337；

分别是SEQ ID NO：342和SEQ ID NO：341；

分别是SEQ ID NO：346和SEQ ID NO：345；

分别是SEQ ID NO：350和SEQ ID NO：349；

分别是SEQ ID NO：354和SEQ ID NO：353；

分别是SEQ ID NO：358和SEQ ID NO：357；

分别是SEQ ID NO：362和SEQ ID NO：361；

分别是SEQ ID NO：366和SEQ ID NO：365；

分别是SEQ ID NO：370和SEQ ID NO：369；

分别是SEQ ID NO：374和SEQ ID NO：373；以及

分别是SEQ ID NO：378和SEQ ID NO：377。

在另一方面，本发明涉及多特异性抗体构建体，该多特异性抗体构建体包含：

(i)含有两个轻链和两个重链的第一抗体，其中

轻链包含第一可变区(VL1)和轻链恒定区(CL)；

重链包含第一重可变区(VH1)和CH1、铰链、CH2、和CH3区；

在一个实施例中：

VL1包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3：

分别是SEQ ID NO：230、231、和232；

分别是SEQ ID NO：236、237、和238；

分别是SEQ ID NO：242、243、和244；并且

分别是SEQ ID NO：248、249、和250；

VH1包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3：

分别是SEQ ID NO：254、255、和256；

分别是SEQ ID NO：260、261、和262；

分别是SEQ ID NO：266、267、和268；以及

分别是SEQ ID NO：272、273、和274；

VL2包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3：

分别是SEQ ID NO：58、59、和60；

分别是SEQ ID NO：64、65、和66；

分别是SEQ ID NO：70、71、和72；

分别是SEQ ID NO：76、77、和78；

分别是SEQ ID NO：82、83、和84；

分别是SEQ ID NO：88、89、和90；

分别是SEQ ID NO：94、95、和96；

分别是SEQ ID NO：100、101、和102；

分别是SEQ ID NO：106、107、和108；

分别是SEQ ID NO：112、113、和114；

分别是SEQ ID NO：118、119、和120；

分别是SEQ ID NO：124、125、和126；以及

分别是SEQ ID NO：130、131、和132；

并且

VH2包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3：

分别是SEQ ID NO：136、137、和138；

分别是SEQ ID NO：142、143、和144；

分别是SEQ ID NO：148、149、和150；

分别是SEQ ID NO：154、155、和156；

分别是SEQ ID NO：160、161、和162；

分别是SEQ ID NO：166、167、和168；

分别是SEQ ID NO：172、173、和174；

分别是SEQ ID NO：178、179、和180；

分别是SEQ ID NO：184、185、和186；

分别是SEQ ID NO：190、191、和192；

分别是SEQ ID NO：196、197、和198；

分别是SEQ ID NO：202、203、和204；以及

分别是SEQ ID NO：208、209、和210。

在一个实施例中，

1)VL1和VH1选自由以下组成的组：

并且

2)VL2和VH2选自由以下组成的组：

在一个实施例中：

1)VL1和VH1选自由以下组成的组：

a)包含SEQ ID NO：213的VL1和包含SEQ ID NO：214的VH1；

b)包含SEQ ID NO：217的VL1和包含SEQ ID NO：218的VH1；

c)包含SEQ ID NO：221的VL1和包含SEQ ID NO：222的VH1；以及

d)包含SEQ ID NO：225的VL1和包含SEQ ID NO：226的VH1；

并且

2)VL2和VH2选自由以下组成的组：

a)包含SEQ ID NO：5的VL2和包含SEQ ID NO：6的VH2；

b)包含SEQ ID NO：9的VL2和包含SEQ ID NO：10的VH2；

c)包含SEQ ID NO：13的VL2和包含SEQ ID NO：14的VH2；

d)包含SEQ ID NO：17的VL2和包含SEQ ID NO：18的VH2；

e)包含SEQ ID NO：21的VL2和包含SEQ ID NO：22的VH2；

f)包含SEQ ID NO：25的VL2和包含SEQ ID NO：26的VH2；

g)包含SEQ ID NO：29的VL2和包含SEQ ID NO：30的VH2；

h)包含SEQ ID NO：33的VL2和包含SEQ ID NO：34的VH2；

i)包含SEQ ID NO：37的VL2和包含SEQ ID NO：38的VH2；

j)包含SEQ ID NO：41的VL2和包含SEQ ID NO：42的VH2；

k)包含SEQ ID NO：45的VL2和包含SEQ ID NO：46的VH2；

l)包含SEQ ID NO：49的VL2和包含SEQ ID NO：50的VH2；以及

m)包含SEQ ID NO：53的VL2和包含SEQ ID NO：54的VH2。

在一个实施例中，

分别是SEQ ID NO：382和SEQ ID NO：381；

分别是SEQ ID NO：386和SEQ ID NO：385；

分别是SEQ ID NO：390和SEQ ID NO：389；

分别是SEQ ID NO：394和SEQ ID NO：393；

分别是SEQ ID NO：398和SEQ ID NO：397；

分别是SEQ ID NO：402和SEQ ID NO：401；

分别是SEQ ID NO：406和SEQ ID NO：405；

分别是SEQ ID NO：410和SEQ ID NO：409；

分别是SEQ ID NO：414和SEQ ID NO：413；

分别是SEQ ID NO：418和SEQ ID NO：417；

分别是SEQ ID NO：422和SEQ ID NO：421；

分别是SEQ ID NO：426和SEQ ID NO：425；

分别是SEQ ID NO：430和SEQ ID NO：429；

分别是SEQ ID NO：434和SEQ ID NO：433；

分别是SEQ ID NO：438和SEQ ID NO：437；

分别是SEQ ID NO：442和SEQ ID NO：441；

分别是SEQ ID NO：446和SEQ ID NO：445；以及

分别是SEQ ID NO：450和SEQ ID NO：449。

如本文所用的，术语“单克隆抗体”(mAb)或单克隆抗体构建体是指从基本上均质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能少量存在的可能的天然存在的突变和/或翻译后修饰(例如，异构化、酰胺化)以外，构成该群体的单独抗体是相同的。单克隆抗体具有高度特异性，针对抗原上的单一抗原性位点或决定簇，与常规(多克隆)抗体制剂相反，这些常规(多克隆)抗体制剂典型地包括针对不同决定簇(或表位)的不同抗体。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优点还在于它们通过杂交瘤培养合成，因此不被其他免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”指示抗体的特征为，是从基本上均质的抗体群获得，并且不应视为需要通过任何特定方法产生抗体。

为了制备单克隆抗体，可以使用提供通过连续细胞系培养产生的抗体的任何技术。例如，有待使用的单克隆抗体可以通过Koehler等人，Nature[自然]，256：495(1975)首次描述的杂交瘤方法，或可以通过重组DNA方法(参见，例如美国专利号4,816,567)制备。用于产生人单克隆抗体的其他技术的实例包括三瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor，Immunology Today[今日免疫学]4(1983)，72)和EBV-杂交瘤技术(Cole等人，MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy[单克隆抗体和癌症疗法]，Alan R.Liss公司(1985)，77-96)。

然后可以使用标准方法如酶联免疫吸附测定(ELISA)和表面等离子体共振(BIACORE^TM)分析来筛选杂交瘤，以鉴定产生与特定抗原特异性地结合的抗体的一种或多种杂交瘤。任何形式的相关抗原可用作免疫原，例如重组抗原、天然存在的形式、其任何变体或片段及其抗原肽。如在BIAcore系统中采用的表面等离子体共振可以用于增加与靶抗原(MSLN或CD40)的表位结合的噬菌体抗体的效率(Schier，Human Antibodies Hybridomas[人抗体杂交瘤]7(1996)，97-105；Malmborg，J.Immunol.Methods[免疫学方法杂志]183(1995)，7-13)。

制备单克隆抗体的另一种示例性方法包括筛选蛋白质表达文库，例如噬菌体展示或核糖体展示文库。噬菌体展示例如描述于以下中：Ladner等人，美国专利号5,223,409；Smith(1985)Science[科学]228：1315-1317、Clackson等人，Nature[自然]，352：624-628(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]，222：581-597(1991)。

除了使用展示文库外，相关抗原可用于免疫非人动物，例如啮齿动物(诸如小鼠、仓鼠、兔或大鼠)。在一个实施例中，非人动物至少包括人免疫球蛋白基因的一部分。例如，可以采用人Ig(免疫球蛋白)基因座的大片段来工程化在小鼠抗体产生方面有缺陷的小鼠品系。通过使用杂交瘤技术，可以产生和选择源自具有所需特异性的基因的抗原特异性单克隆抗体。参见，例如，XENOMOUSE^TM、Green等人(1994)Nature Genetics[自然遗传学]7：13-21、US 2003-0070185、WO 96/34096和WO 96/33735。

单克隆抗体也可以从非人动物获得，然后使用本领域已知的重组DNA技术进行修饰，例如人源化、去免疫、呈现嵌合等。修饰的抗体构建体的实例包括非人抗体的人源化变体、“亲和力成熟”抗体(参见，例如Hawkins等人J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]254，889-896(1992)和Lowman等人，Biochemistry[生物化学]30，10832-10837(1991))和具有改变的一种或多种效应子功能的抗体突变体(参见，例如美国专利5,648,260、Kontermann和Dubel(2010)，上述引文和Little(2009)，上述引文)。

在免疫学中，亲和力成熟是这样的过程：通过该过程，在免疫应答的过程中B细胞产生与抗原的亲和力增加的抗体。通过反复暴露于相同抗原，宿主将产生相继更大亲和力的抗体。与天然原型类似，体外亲和力成熟是基于突变和选择的原理。体外亲和力成熟已经成功地用于优化抗体、抗体构建体和抗体片段。使用辐射、化学诱变剂或易错PCR引入CDR内的随机突变。此外，通过链改组可以增加遗传多样性。使用噬菌体展示等展示方法进行两轮或三轮突变和选择通常会产生具有低纳摩尔范围亲和力的抗体片段。

抗体构建体的优选类型的氨基酸取代变异包括取代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步开发的一种或多种所得变体相对于生成它们的亲本抗体将具有改善的生物学特性。用于生成此类取代变体的便利方式包括使用噬菌体展示的亲和力成熟。简单来说，使几个超变区位点(例如，6-7个位点)突变以在每个位点产生所有可能的氨基酸取代。由此产生的抗体变体以单价方式从丝状噬菌体颗粒展示为与每个颗粒内包装的M13的基因III产物的融合物。然后针对如本文所披露的噬菌体展示的变体的生物活性(例如结合亲和力)对其进行筛选。为了鉴定用于修饰的候选超变区位点，可以进行丙氨酸扫描诱变以鉴定对抗原结合有重要贡献的超变区残基。可替代地或另外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定结合结构域与例如人MSLN之间的接触点可能是有利的。根据本文详述的技术，此类接触残基和相邻残基是取代的候选物。一旦生成这样的变体，对变体组进行如本文所述的筛选，并且可以选择在一种或多种相关测定中具有优异特性的抗体以用于进一步开发。

本发明的单克隆抗体和抗体构建体特别包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列一致或同源，而一个或多个链的其余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列一致或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出所希望的生物活性即可(美国专利号4,816,567；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]，81：6851-6855(1984))。本文感兴趣的嵌合抗体包括“灵长类化(primitized)”抗体，其包含源自非人灵长类动物(例如，旧大陆猴(Old World Monkey)、猿等)的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列。已经描述了多种制备嵌合抗体的方法。参见，例如Morrison等人，Proc.Natl.Acad.ScL U.S.A.[美国国家科学院院刊]81：6851，1985；Takeda等人，Nature[自然]314：452，1985；Cabilly等人，美国专利号4,816,567；Boss等人，美国专利号4,816,397；Tanaguchi等人，EP 0171496；EP 0173494；和GB 2177096。

抗体、抗体构建体、抗体片段或抗体变体还可以通过例如WO 98/52976或WO 00/34317中披露的方法特定地缺失人T细胞表位(称为“去免疫”的方法)来进行修饰。简而言之，可以针对与II类MHC结合的肽分析抗体的重链和轻链可变结构域；这些肽代表潜在的T细胞表位(如WO 98/52976和WO 00/34317中所定义)。为了检测潜在T细胞表位，可以应用称为“肽穿线”的计算机建模方法，并且此外针对VH和VL序列中存在的基序，可以搜索人MHCII类结合肽的数据库，如WO 98/52976和WO 00/34317中所述。这些基序与18种主要的MHCII类DR同种异型中的任一种结合，并且因此构成潜在T细胞表位。检测到的潜在T细胞表位可以通过取代可变结构域中的少量氨基酸残基，或者优选通过单个氨基酸取代来消除。典型地，进行保守取代。通常但非唯一地，可以使用人种系抗体序列中的位置所共有的氨基酸。人种系序列例如披露于以下中：Tomlinson等人(1992)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]227：776-798；Cook，G.P.等人(1995)Immunol.Today[今日免疫学]第16卷(5)：237-242；和Tomlinson等人(1995)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]14：14：4628-4638。V BASE目录提供了人免疫球蛋白可变区序列的综合目录(由Tomlinson，LA.等人编辑MRC Centre forProtein Engineering[医学研究理事会蛋白质工程中心]，Cambridge，UK[英国剑桥])。这些序列可用作例如框架区和CDR的人序列的来源。也可以使用共有的人框架区，例如如美国专利号6,300,064中所述。

“人源化”抗体、抗体构建体、其变体或片段(如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗体的其他抗原结合子序列)是大多数人序列的抗体或免疫球蛋白，其含有一个或多个源自非人免疫球蛋白的最小序列。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的高变区(也称CDR)的残基被来自非人(例如啮齿动物)物种(如小鼠、大鼠、仓鼠或兔)的具有所需特异性、亲和力和容量的高变区(供体抗体)的残基替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基替代。此外，如本文所用的“人源化抗体”也可以包含在受体抗体或供体抗体中都未发现的残基。进行这些修饰以进一步改进和优化抗体性能。人源化抗体还可以包含典型地是人免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分。对于更多的细节，参见Jones等人，Nature[自然]，321：522-525(1986)；Reichmann等人，Nature[自然]，332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.[结构生物学新见]，2：593-596(1992)。

可以通过用来自人Fv可变结构域的等价序列替代不直接参与抗原结合的Fv可变结构域的序列来生成人源化抗体或其片段。用于产生人源化抗体或其片段的示例性方法由以下提供：Morrison(1985)Science[科学]229：1202-1207；Oi等人(1986)BioTechniques[生物技术]4：214；以及US 5,585,089；US 5,693,761；US 5,693,762；US 5,859,205；和US6,407,213。那些方法包括分离、操作和表达编码来自重链或轻链中的至少一种的全部或部分免疫球蛋白Fv可变结构域的核酸序列。这种核酸可以如上所述通过产生针对预定靶标的抗体从杂交瘤获得以及从其他来源获得。然后可以将编码人源化抗体分子的重组DNA克隆至合适的表达载体中。

人源化抗体也可以使用转基因动物如表达人重链和轻链基因但不能表达内源小鼠免疫球蛋白重链和轻链基因的小鼠产生。Winter描述了可用于制备本文所述的人源化抗体的示例性CDR移植方法(美国专利号5,225,539)。特定人抗体的全部CDR可以用至少一部分非人CDR替换，或者仅一些CDR可以用非人CDR替换。仅需要替代人源化抗体与预定抗原结合所需的CDR数量。

可以通过引入保守取代、共有序列取代、种系取代和/或回复突变来优化人源化抗体。此类经改变的免疫球蛋白分子可以通过几种本领域已知的技术中的任一种来制备(例如，Teng等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]，80：7308-7312，1983；Kozbor等人，Immunology Today[今日免疫学]，4：7279，1983；Olsson等人，Meth.Enzymol.[酶学方法]，92：3-16，1982；和EP 239400)。

术语“人抗体”、“人抗体构建体”和“人结合结构域”包括具有抗体区的抗体、抗体构建体和结合结构域，这些抗体区诸如基本上对应于本领域中已知的人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区或结构域，包括例如由Kabat等人(1991)(上述引文)描述的那些。本发明的人抗体、抗体构建体或结合结构域可以包含例如CDR中且特别是CDR3中不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。人抗体、抗体构建体或结合结构域可以具有至少一个、两个、三个、四个、五个或更多个被氨基酸残基替换的位置，该氨基酸残基不由人种系免疫球蛋白序列编码。然而，如本文所用的人抗体、抗体构建体和结合结构域的定义还涵盖“完全人抗体”，这些完全人抗体仅包含非人工和/或遗传改变的人抗体序列，如可通过使用诸如Xenomouse技术或系统衍生的那些。

在一些实施例中，本发明的抗体构建体是“分离的”或“基本上纯的”抗体构建体。在用于描述本文所披露的抗体构建体时，“分离的”或“基本上纯的”意味着抗体构建体已经从其产生环境的组分鉴定、分离和/或回收。优选地，抗体构建体不含来自其生产环境的所有其他组分或基本上不与来自其生产环境的所有其他组分相关。其生产环境的污染组分(如由重组转染细胞产生的污染组分)是通常会干扰多肽的诊断或治疗用途的物质，并且该物质可包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。按重量计，抗体构建体可以例如占给定样品中总蛋白质的至少约5％或至少约50％。应当理解，按重量计，分离的蛋白质可根据情况占总蛋白质含量的5％至99.9％。可以通过使用诱导型启动子或高表达启动子以制备显著更高浓度的多肽，使得制备增加的浓度水平的多肽。该定义包括在本领域已知的多种生物和/或宿主细胞中产生抗体构建体。在优选的实施例中，将抗体构建体(1)纯化至足以通过使用旋转杯测序仪获得至少15个N-末端或内部氨基酸序列残基的程度，或(2)通过SDS-PAGE在非还原或还原条件下使用考马斯蓝或优选银染色来纯化至均匀。然而，通常，分离的抗体构建体通过至少一个纯化步骤来制备。

术语“结合结构域”关于本发明表征了(特异性地)与靶分子(抗原)(此处：分别为MSLN和CD40)上的给定靶表位或给定靶侧结合/相互作用/识别该给定靶表位或给定靶侧的结构域。一个结合结构域(识别MSLN)的结构和功能以及优选地还有另一个结合结构域(识别CD40)的结构和/或功能是基于抗体(例如，全长或完整免疫球蛋白分子)的结构和/或功能。根据本发明，结合结构域的特征在于，三个轻链CDR(即，VL区的CDRL1、CDRL2和CDRL3)和三个重链CDR(即，VH区的CDRH1、CDRH2和CDRH3)的存在。设想结合结构域由噬菌体展示或文库筛选方法产生或可通过噬菌体展示或文库筛选方法获得，而不是通过将CDR序列从预先存在的(单克隆)抗体移植到支架中产生或获得。根据本发明，结合结构域呈一种或多种多肽的形式。此类多肽可包括蛋白质部分和非蛋白质部分(例如化学接头或化学交联剂，如戊二醛)。蛋白质(包括其片段、优选生物活性片段，以及通常具有少于30个氨基酸的肽)包含经由共价肽键彼此偶联的两个或更多个氨基酸(产生氨基酸链)。如本文所用的，术语“多肽”描述了一组分子，其通常由多于30个氨基酸组成。多肽可以进一步形成多聚体，如二聚体、三聚体和更高级的寡聚体，即由多于一种多肽分子组成。形成这种二聚体、三聚体等的多肽分子可以相同或不同。因此，将此类多聚体的相应较高阶结构称为同二聚体或异二聚体、同三聚体或异三聚体等。异多聚体的实例是抗体分子，其在其天然存在的形式中由两条相同的轻多肽链和两条相同的重多肽链组成。术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”还是指天然修饰的肽/多肽/蛋白质，其中该修饰是通过例如翻译后修饰(如糖基化、乙酰化、磷酸化等)来实现。当在本文中提及时，“肽”、“多肽”或“蛋白质”也可以是化学修饰的，如聚乙二醇化的。此类修饰在本领域中是熟知的并且在下文中描述。

优选地，与MSLN结合的结合结构域和/或与CD40结合的结合结构域是人结合结构域。包含至少一种人结合结构域的抗体和抗体构建体避免了与具有非人如啮齿动物(例如鼠、大鼠、仓鼠或兔)可变区和/或恒定区的抗体或抗体构建体相关的一些问题。这种啮齿动物来源的蛋白质的存在可以导致抗体或抗体构建体的快速清除，或者可以导致患者生成针对抗体或抗体构建体的免疫应答。为了避免使用啮齿动物衍生的抗体或抗体构建体，可以通过将人抗体功能引入到啮齿动物中以使啮齿动物产生完全人抗体来产生人或完全人抗体/抗体构建体。

在YAC中克隆和重建兆碱基大小的人基因座并将它们引入小鼠种系的能力提供了一种强有力的方法，用于阐明非常大或粗略作图的基因座的功能组分以及生成有用的人疾病模型。此外，使用这种技术将小鼠基因座取代为其人类等同物可以提供关于对人类基因产物在发育期间的表达和调节、它们与其他系统的交流以及它们参与疾病诱导和进展的独特见解。

这种策略的重要实际应用是小鼠体液免疫系统的“人源化”。将人免疫球蛋白(Ig)基因座引入其中内源Ig基因已经失活的小鼠中提供了研究抗体的程序化表达和组装的机制以及它们在B细胞发育中的作用的机会。此外，这种策略可以为完全人单克隆抗体(mAb)的产生提供理想来源-这是有助于实现抗体疗法在人疾病中的前景的重要里程碑。预期完全人抗体或抗体构建体将小鼠或小鼠衍生的mAb所固有的免疫原性和变应性应答最小化，并且由此增加施用的抗体/抗体构建体的功效和安全性。可以预期使用完全人抗体或抗体构建体在治疗需要重复化合物施用的慢性和复发性人类疾病如炎症、自身免疫和癌症方面提供了显著优势。

实现该目标的一种方法是用人Ig基因座的大片段工程化在小鼠抗体产生方面有缺陷的小鼠品系，预期这样的小鼠在没有小鼠抗体的情况下会产生大量的人抗体。大的人Ig片段将保留大的可变基因多样性以及对抗体产生和表达的适当调节。通过利用小鼠的抗体多样化和选择机制以及缺乏对人蛋白质的免疫耐受性，这些小鼠品系中的再生人抗体库应产生针对任何感兴趣的抗原(包括人抗原)的高亲和力抗体。通过使用杂交瘤技术，可以容易地产生和选择具有所需特异性的抗原特异性人mAb。这种一般策略与第一代XenoMouse小鼠品系有关(参见Green等人Nature Genetics[自然遗传学]7：13-21(1994))。用酵母人工染色体(YAC)工程化XenoMouse品系，这些酵母人工染色体分别含有人重链基因座和κ轻链基因座的245kb和190kb大小的种系构型片段，这些片段含有核心可变区和恒定区序列。证明含有人Ig的YAC与小鼠系统关于抗体的重排和表达是相容的，并且能够取代失活的小鼠Ig基因。这通过其诱导B细胞发育、产生完全人抗体的成人样人组库和产生抗原特异性人mAb的能力来证明。这些结果还表明，引入含有更多V基因、附加调节元件和人Ig恒定区的更大部分的人Ig基因座可能基本上概括具有感染和免疫的人体液应答特征的完整库。Green等人的工作最近扩展到通过分别引入人重链基因座和κ轻链基因座的兆碱基大小的种系构型YAC片段来引入大于约80％的人抗体库。参见Mendez等人Nature Genetics[自然遗传学]15：146-156(1997)和美国专利申请序列号08/759,620。

XenoMouse小鼠的产生进一步论述和描绘于以下中：美国专利申请序列号07/466,008、序列号07/610,515、序列号07/919,297、序列号07/922,649、序列号08/031,801、序列号08/112,848、序列号08/234,145、序列号08/376,279、序列号08/430,938、序列号08/464,584、序列号08/464,582、序列号08/463,191、序列号08/462,837、序列号08/486,853、序列号08/486,857、序列号08/486,859、序列号08/462,513、序列号08/724,752、和序列号08/759,620；和美国专利号6,162,963；6,150,584；6,114,598；6,075,181和5,939,598以及日本专利号3 068 180 B2、3 068 506 B2、和3 068 507 B2。还参见Mendez等人NatureGenetics[自然遗传学]15：146-156(1997)和Green和Jakobovits J.Exp.Med.[实验医学杂志]188：483-495(1998)、EP 0 463 151 B1、WO 94/02602、WO 96/34096、WO 98/24893、WO00/76310和WO 03/47336。

在一种替代方法中，其他公司(包括GenPharm国际公司)利用了“微基因座”方法。在迷你基因座方法中，通过包含来自Ig基因座的碎片(单独基因)来模拟外源Ig基因座。因此，一个或多个VH基因、一个或多个DH基因、一个或多个JH基因、mu恒定区和第二恒定区(优选γ恒定区)形成用于插入动物中的构建体。此方法描述于以下中：Surani等人的美国专利号5,545,807和美国专利号5,545,806；5,625,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016；5,770,429；5,789,650；5,814,318；5,877,397；5,874,299；和6,255,458(各自为Lonberg和Kay)、Krimpenfort和Berns的美国专利号5,591,669和6,023.010、Berns等人的美国专利号5,612,205；5,721,367；和5,789,215、以及Choi和Dunn的美国专利号5,643,763、以及GenPharm国际美国专利申请序列号07/574,748、序列号07/575,962、序列号07/810,279、序列号07/853,408、序列号07/904,068、序列号07/990,860、序列号08/053,131、序列号08/096,762、序列号08/155,301、序列号08/161,739、序列号08/165,699、序列号08/209,741中。还参见EP 0 546 073 B1、WO 92/03918、WO 92/22645、WO 92/22647、WO 92/22670、WO93/12227、WO 94/00569、WO 94/25585、WO 96/14436、WO 97/13852、和WO 98/24884以及美国专利号5,981,175。进一步参见Taylor等人(1992)，Chen等人(1993)，Tuaillon等人(1993)，Choi等人(1993)，Lonberg等人(1994)，Taylor等人(1994)，以及Tuaillon等人(1995)，Fishwild等人(1996)。

Kirin还证明了从小鼠中生成人抗体，在该小鼠中通过微细胞融合已经引入了大的染色体碎片或整个染色体。参见欧洲专利申请号773 288和843 961。Xenerex生物科学正在开发一种可能生成人抗体的技术。在这种技术中，用人淋巴细胞(例如B和/或T细胞)重构SCID小鼠。然后用抗原免疫小鼠并可以生成针对抗原的免疫应答。参见美国专利号5,476,996；5,698,767；和5,958,765。

人抗小鼠抗体(HAMA)应答已引导该行业制备嵌合抗体或其他人源化抗体。然而，预期将观察到特别是在抗体的长期或多剂量利用中某些人抗嵌合抗体(HACA)应答。因此，期望提供抗体构建体，这些抗体构建体包含针对MSLN的人结合结构域和针对CD40的人结合结构域以便消除HAMA或HACA应答的问题和/或效应。

术语“与......(特异性)结合”、“(特异性)识别”、“(特异性)针对”和“与......(特异性)反应”意指根据本发明，结合结构域与靶分子(抗原)(此处：分别为MSLN和CD40)上的给定表位或给定位点相互作用或特异性相互作用。

术语“表位”是指抗原上的位点，该抗原是结合结构域如抗体或免疫球蛋白或者抗体或免疫球蛋白的衍生物、片段或变体所特异性地结合的。“表位”是抗原性的，因此术语表位有时在本文中也称为“抗原结构”或“抗原决定簇”。因此，结合结构域是“抗原相互作用位点”。所述结合/相互作用也被理解为定义为“特异性识别”。

“表位”可以由连续氨基酸或通过蛋白质的三级折叠并置的非连续氨基酸形成。“线性表位”是氨基酸一级序列包含识别的表位。线性表位通常包括独特序列中的至少3个或至少4个、以及更通常至少5个或至少6个或至少7个例如约8个至约10个氨基酸。

与线性表位相反，“构象表位”是如下表位，其中构成表位的一级氨基酸序列并非所识别表位的唯一定义性组分(例如，其中一级氨基酸序列不一定被结合结构域识别的表位)。典型地，构象表位相对于线性表位包含增加数量的氨基酸。关于构象表位的识别，结合结构域识别抗原的三维结构，优选肽或蛋白质或其片段(在本发明的上下文中，一种结合结构域的抗原结构包含在MSLN蛋白内)。例如，当蛋白质分子折叠形成三维结构时，形成构象表位的某些氨基酸和/或多肽骨架被并置，使得抗体能够识别表位。确定表位构象的方法包括但不限于X射线晶体学、二维核磁共振(2D-NMR)光谱和定点自旋标记和电子顺磁共振(EPR)光谱。

以下描述了用于表位定位的方法：当人MSLN蛋白中的区(连续氨基酸拉伸物)与其非人和非灵长类动物MSLN抗原(例如小鼠MSLN，但其他如鸡、大鼠、仓鼠、兔等也是可能的)的相应区交换或替换时，预期发生结合结构域结合的降低，除非结合结构域对于所使用的非人、非灵长类动物MSLN具有交叉反应性。相比于与人MSLN蛋白中的对应区的结合，所述降低优选为至少10％、20％、30％、40％或50％；更优选至少60％、70％或80％，并且最优选90％、95％或甚至100％，由此将与人MSLN蛋白中对应区的结合设定为100％。设想前述人MSLN/非人MSLN嵌合体在CHO细胞中表达。人MSLN/非人MSLN嵌合体也可以与不同膜结合蛋白(如EpCAM)的跨膜结构域和/或细胞质结构域融合，尽管此技术对于实例1和2中所述的方法不是必需的。

在用于表位定位的替代或额外的方法中，可以产生几种截短形式的人MSLN细胞外结构域以便确定由结合结构域识别的特异性区。在这些截短形式中，不同的细胞外MSLN结构域/亚结构域或区从N末端开始逐步缺失。截短的MSLN形式可在CHO细胞中表达。还设想截短的MSLN形式可以与不同膜结合蛋白(诸如EpCAM)的跨膜结构域和/或细胞质结构域融合。还设想截短的MSLN形式可以在其N末端涵盖信号肽结构域，例如衍生自小鼠IgG重链信号肽的信号肽。此外设想，截短的MSLN形式可以在其N末端(在信号肽后)涵盖v5结构域，这允许验证其在细胞表面上的正确表达。预期对不再涵盖由结合结构域识别的MSLN区的那些截短的MSLN形式发生结合的减少或丧失。结合降低优选地为至少10％、20％、30％、40％、50％；更优选地至少60％、70％、80％，并且最优选地90％、95％或甚至100％，由此将与整个人MSLN蛋白(或其细胞外区域或结构域)的结合设定为100％。

确定靶抗原的特定残基对抗体构建体或结合结构域的识别的贡献的另一种方法是丙氨酸扫描(参见，例如Morrison KL和Weiss GA.Cur Opin Chem Biol.[化学生物学新见]2001年6月；5(3)：302-7)，其中有待分析的每个残基例如经由定点诱变被丙氨酸替换。丙氨酸的使用是因为其具有非巨大的、化学惰性的甲基官能团，但仍然模仿许多其他氨基酸所具有的二级结构参考。在需要保守突变残基的大小的情形下，有时可以使用巨大的氨基酸(如缬氨酸或亮氨酸)。丙氨酸扫描是一项已经使用了很长一段时间的成熟技术。

结合结构域与表位或包含表位的区之间的相互作用意味着结合结构域对特定蛋白或抗原(此处：分别为MSLN和CD40)上的表位/包含表位的区表现出可观的亲和力，并且通常与MSLN或CD40以外的蛋白质或抗原不表现出显著反应性。“可观的亲和力”包括以约10^-6M(KD)或更强的亲和力结合。优选地，当结合亲和力为约10^-12至1^0-8M、10^-12至10^-9M、10^-12至10^-10M、10^-11至10^-8M，优选约10^-11至10^-9M时，结合被认为是特异性的。结合结构域是否与靶标特异性地反应或结合可以尤其通过以下方式容易地测试：比较所述结合结构域与靶蛋白或抗原的反应与所述结合结构域与除MSLN或CD40之外的蛋白质或抗原的反应。优选地，本发明的结合结构域基本上或基本上不与MSLN或CD40以外的蛋白质或抗原结合(例如，一个结合结构域不能与MSLN以外的蛋白质结合，并且其他结合结构域不能与CD40以外的蛋白质结合)。

术语“基本上/基本上不结合”或“不能结合”意指本发明的结合结构域不结合MSLN或CD40以外的蛋白质或抗原，即与MSLN或CD40以外的蛋白质或抗原不显示超过30％、优选不超过20％、更优选不超过10％、特别优选不超过9％、8％、7％、6％或5％的反应性，由此将与MSLN或CD40的结合分别设定为100％。

认为特异性结合受结合结构域和抗原的氨基酸序列中的特定基序的影响。因此，由于它们的一级、二级和/或三级结构以及所述结构的二次修饰的结果，实现了结合。抗原相互作用位点与其特异性抗原的特异性相互作用可以导致所述位点与抗原的简单结合。此外，抗原相互作用位点与其特异性抗原的特异性相互作用可以可替代地或另外地导致信号的引发，例如由于诱导抗原构象变化、抗原寡聚化等所致。

抗体的Fc区与多个Fc受体和配体相互作用，赋予一系列重要的功能性性能(称为效应子功能)。对于IgG，Fc区包含Ig结构域CH2和CH3。IgG同型的Fc受体的重要家族是Fcγ受体(FcγR)。这些受体介导抗体与免疫系统细胞臂之间的通信。在人中，此蛋白质家族包括FcγRI(CD64)，包括同种型(isoforms)FcγRIa、FcγRIb、和FcγRIc；FcγRII(CD32)，包括同种型FcγRlla(包括同种异型H131和R131)、FcγRllb(包括FcγRllb-1和FcγRllb-2)、和FcγRllc；和FcγRIII(CD16)，包括同种型FcγRllla(包括同种异型V158和F158)和FcγRlllb(包括同种异型FcγRlilb-NA1和FcγRlllb-NA2)(Jefferis等人.，2002，Immunol Lett[免疫学通讯]82：57-65)。这些受体通常具有细胞外结构域(介导与Fc的结合)、跨膜区域、和细胞内结构域(可介导细胞内一些信号传导事件)。这些受体在多种免疫细胞中表达，这些免疫细胞包括单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、血小板、B细胞、大颗粒淋巴细胞、蓝格汉氏细胞(Langerhans′cell)、自然杀伤(NK)细胞和γδT细胞。Fc/FcγR复合物的形成将这些效应细胞募集到结合抗原的位点，通常导致细胞内的信号传导事件和重要的后续免疫应答，如炎症介质的释放、B细胞激活、内吞作用、吞噬作用和细胞毒性攻击。介导细胞毒性和吞噬效应子功能的能力是抗体破坏靶细胞的潜在机制。其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上结合的抗体并且随后导致靶细胞裂解的细胞介导的反应称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上结合的抗体并且随后导致靶细胞的吞噬作用的细胞介导的反应称为抗体依赖性细胞介导的吞噬(ADCP)。

不同的IgG亚类对FcTR具有不同的亲和力，IgG1和IgG3与受体的结合通常比IgG2和IgG4更好。所有的FcγRs都结合IgG Fc上的相同区域，但亲和力不同：高亲和力的结合剂FcγRI对于lgG1具有10-8 M-1的Kd，而低亲和力受体FcγRII和FcγRIII通常分别在10-6和10-5结合。

通过如本文所用的“Fcγ受体”或“FcγR”来表示结合IgG抗体Fc区并基本上由FcγR基因编码的蛋白质家族的任何成员。在人中，该家族包括但不限于FcγRI(CD64)，包括同种型FcγRIa、FcγRIb、和FcγRIc；FcγRII(CD32)，包括同种型FcγRlla(包括同种异型H131和R131)、FcγRllb(包括FcγRllb-1和FcγRllb-2)、和FcγRllc；和FcγRIII(CD16)，包括同种型FcγRllla(包括同种异型V158和F158)和FcγRlllb(包括同种异型FcγRlllb-NA1和FcγRlllb-NA2)(Jefferis等人.，2002，Immunol Lett[免疫学通讯]82：57-65)，以及任何未发现的人FcγRs或FcγR同种型或同种异型。FcγR可以来自任何生物，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔和猴。小鼠FcγRs包括但不限于FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)、和FcγRIII-2(CD16-2)，以及任何未发现的小鼠FcγRs或FcγR同种型或同种异型。

可通过确定抗体对FcγR的亲和力来直接进行与FcγR的结合。或者可以通过在基于细胞的测定中测量细胞因子的释放来间接确定结合。

为了促进特定重链与其同源轻链的缔合，重链和轻链都可以包含互补性氨基酸取代。如本文所用的，“互补性氨基酸取代”是指一个链中带正电的氨基酸的取代与另一个链中带负电的氨基酸的取代配对。例如，在一些实施例中，重链包含至少一个氨基酸取代以引入带电氨基酸，并且相应的轻链包含至少一个氨基酸取代以引入带电氨基酸，其中引入重链的带电氨基酸具有与引入轻链的氨基酸相反的电荷。在某些实施例中，可以将一个或多个带正电的残基(例如赖氨酸、组氨酸或精氨酸)引入第一轻链(LC1)并且可以将一个或多个带负电的残基(例如天冬氨酸或谷氨酸)引入LC1/HC1结合界面处的相伴重链(HC1)，而可以将一个或多个带负电的残基(例如，天冬氨酸或谷氨酸)引入第二轻链(LC2)中，并且可以将一个或多个带正电的残基(例如，赖氨酸、组氨酸或精氨酸)引入LC2/HC2结合界面处的相伴重链(HC2)中。当界面处相反的带电残基(极性)吸引时，静电相互作用将引导LC1与HC1成对，LC2与HC2成对。在界面处具有相同带电残基(极性)的重/轻链对(例如LC1/HC2和LC2/HC1)将排斥，导致抑制不需要的HC/LC配对。

在这些和其他实施例中，重链的CH1结构域或轻链的CL结构域包含与野生型IgG氨基酸序列不同的氨基酸序列，使得野生型IgG氨基酸序列中的一个或多个带正电的氨基酸被一个或多个带负电的氨基酸替换。可替代地，重链的CH1结构域或轻链的CL结构域包含与野生型IgG氨基酸序列不同的氨基酸序列，使得野生型IgG氨基酸序列中的一个或多个带负电的氨基酸被一个或多个带正电的氨基酸替换。在一些实施例中，多特异性抗体构建体中的第一和/或第二重链的CH1结构域中在选自F126、P127、L128、A141、L145、K147、D148、H168、F170、P171、V173、Q175、S176、S183、V185和K213的EU位置处的一个或多个氨基酸被带电氨基酸替换。在某些实施例中，用带负电或正电的氨基酸取代的重链残基是S183(EU编号系统)。在一些实施例中，S183被带正电的氨基酸取代。在可替代的实施例中，S183被带负电的氨基酸取代。例如，在一个实施例中，S183在第一重链中被带负电的氨基酸(例如S183E)取代，并且S183在第二重链中被带正电的氨基酸(例如S183K)取代。

在轻链为κ轻链的实施例中，多特异性抗体构建体中的第一和/或第二轻链的CL结构域中在选自F116、F118、S121、D122、E123、Q124、S131、V133、L135、N137、N138、Q160、S162、T164、S174和S176的位置(在κ轻链中以EU编号)处的一个或多个氨基酸被带电氨基酸替换。在轻链为λ轻链的实施例中，多特异性抗体构建体中的第一和/或第二轻链的CL结构域中在选自T116、F118、S121、E123、E124、K129、T131、V133、L135、S137、E160、T162、S165、Q167、A174、S176和Y178的位置(在λ链中以EU编号)处的一个或多个氨基酸被带电氨基酸替换。在一些实施例中，用带负电或正电的氨基酸取代的残基是κ或λ轻链的CL结构域的S176(EU编号系统)。在某些实施例中，CL结构域的S176被带正电的氨基酸替换。在可替代的实施例中，CL结构域的S176被带负电的氨基酸替换。在一个实施例中，S176在第一轻链中被带正电的氨基酸(例如S176K)取代，并且S176在第二轻链中被带负电的氨基酸(例如S176E)取代。

除了CH1和CL结构域中的互补性氨基酸取代或作为替代，多特异性抗体构建体中轻链和重链的可变区可包含一个或多个互补性氨基酸取代以引入带电氨基酸。例如，在一些实施例中，多特异性抗体构建体的重链的VH区或轻链的VL区包含与野生型IgG氨基酸序列不同的氨基酸序列，使得野生型IgG氨基酸序列中的一个或多个带正电的氨基酸被一个或多个带负电的氨基酸替换。可替代地，重链的VH区或轻链的VL区包含与野生型IgG氨基酸序列不同的氨基酸序列，使得野生型IgG氨基酸序列中的一个或多个带负电的氨基酸被一个或多个带正电的氨基酸替换。

VH区内的V区界面残基(即，介导VH和VL区组装的氨基酸残基)包括EU位置1、3、35、37、39、43、44、45、46、47、50、59、89、91和93。VH区中的这些界面残基中的一个或多个可以被带电(带正电或负电)氨基酸取代。在某些实施例中，第一和/或第二重链的VH区中EU位置39处的氨基酸被带正电的氨基酸(例如赖氨酸)取代。在可替代的实施例中，第一和/或第二重链的VH区中EU位置39处的氨基酸被带负电的氨基酸(例如谷氨酸)取代。在一些实施例中，第一重链的VH区中的EU位置39处的氨基酸被带负电的氨基酸(例如G39E)取代，并且第二重链的VH区中的EU位置39处的氨基酸被带正电的氨基酸(例如G39K)取代。在一些实施例中，第一和/或第二重链的VH区中EU位置44处的氨基酸被带正电的氨基酸(例如赖氨酸)取代。在可替代的实施例中，第一和/或第二重链的VH区中EU位置44处的氨基酸被带负电的氨基酸(例如谷氨酸)取代。在某些实施例中，第一重链的VH区中的EU位置44处的氨基酸被带负电的氨基酸(例如G44E)取代，并且第二重链的VH区中的EU位置44处的氨基酸被带正电的氨基酸(例如G44K)取代。

VL区内的V区界面残基(即，介导VH和VL区组装的氨基酸残基)包括EU位置32、34、35、36、38、41、42、43、44、45、46、48、49、50、51、53、54、55、56、57、58、85、87、89、90、91和100。VL区中的一个或多个界面残基可以用带电氨基酸(优选与引入同源重链的VH区中的那些具有相反电荷的氨基酸)取代。在一些实施例中，第一和/或第二轻链的VL区中EU位置100处的氨基酸被带正电的氨基酸(例如赖氨酸)取代。在可替代的实施例中，第一和/或第二轻链的VL区中EU位置100处的氨基酸被带负电的氨基酸(例如谷氨酸)取代。在某些实施例中，第一轻链的VL区中的EU位置100处的氨基酸被带正电的氨基酸(例如G100K)取代，并且第二轻链的VL区中的EU位置100处的氨基酸被带负电的氨基酸(例如G100E)取代。

可以修饰任何恒定结构域以含有以上所述的电荷对突变的一种或多种，以促进多特异性抗体构建体的正确组装。

如本文所用的，术语“Fc区”是指免疫球蛋白重链的C末端区域，其可通过木瓜蛋白酶消化完整抗体产生。免疫球蛋白的Fc区一般包含两个恒定结构域，即CH2结构域和CH3结构域，且任选地包含CH4结构域。在某些实施例中，Fc区是来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4免疫球蛋白的Fc区。在一些实施例中，Fc区包含来自人IgG1或人IgG2免疫球蛋白的CH2和CH3结构域。Fc区可以保持效应子功能，例如C1q结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和吞噬作用。在其他实施例中，Fc区可以修饰成降低或消除效应子功能，如本文更详细地描述。

本文所述的多特异性抗体构建体的重链恒定区或Fc区可包含影响抗原结合蛋白的糖基化和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代。免疫球蛋白Fc区的功能之一是当免疫球蛋白结合其靶时与免疫系统通信。此通常称为“效应子功能”。通信导致抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。ADCC和ADCP是经由Fc区结合至免疫系统细胞表面上的Fc受体介导。CDC是经由Fc与补体系统，例如C1q的蛋白质结合所介导。在一些实施例中，本发明的多特异性抗体构建体在恒定区中包含一个或多个增强所述抗原结合蛋白的效应子功能(包括ADCC活性、CDC活性、ADCP活性和/或清除率或半衰期)的氨基酸取代。可以增强效应子功能的示例性氨基酸取代(EU编号)包括但不限于，E233L、L234I、L234Y、L235S、G236A、S239D、F243L、F243V、P247I、D280H、K290S、K290E、K290N、K290Y、R292P、E294L、Y296W、S298A、S298D、S298V、S298G、S298T、T299A、Y300L、V305I、Q311M、K326A、K326E、K326W、A330S、A330L、A330M、A330F、I332E、D333A、E333S、E333A、K334A、K334V、A339D、A339Q、P396L或前述中任何的组合。

在其他实施例中，本发明的多特异性抗体构建体在恒定区中包含一个或多个降低效应子功能的氨基酸取代。可以降低效应子功能的示例性氨基酸取代(EU编号)包括但不限于，C220S、C226S、C229S、E233P、L234A、L234V、V234A、L234F、L235A、L235E、G237A、P238S、S267E、H268Q、N297A、N297G、V309L、E318A、L328F、A330S、A331S、P331S或前述中任何的组合。

糖基化可以促进抗体，特别是IgG1抗体的效应子功能。因此，在一些实施例中，本发明的多特异性抗体构建体包含影响结合蛋白糖基化的水平或类型的一个或多个氨基酸取代。多肽的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。N-连接是指碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链连接。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸)是碳水化合物部分与天冬酰胺侧链酶促连接的识别序列。因此，多肽中这些三肽序列中任一个的存在产生潜在的糖基化位点。O-连接糖基化是指将糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一连接到羟基氨基酸上，最通常为丝氨酸或苏氨酸，尽管也可以使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。

在某些实施例中，通过向例如结合蛋白的Fc区中添加一个或多个糖基化位点来增加本文所述的多特异性抗体构建体的糖基化。在抗原结合蛋白中添加糖基化位点通常可以通过改变氨基酸序列，以使其含有上述三肽序列(对于N-连接的糖基化位点)中的一个或多个来实现。也可以通过将一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基添加至起始序列或被一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基取代(对于O-连接的糖基化位点)来进行改变。为便利起见，可以通过在DNA层面上的变化，特别是通过使编码靶多肽的DNA在预先选择的碱基处突变，由此产生会翻译成所需氨基酸的密码子，来改变抗原结合蛋白的氨基酸序列。

本发明还涵盖产生具有改变的碳水化合物结构而引起效应子活性改变的多特异性抗体构建体分子，包括岩藻糖基化不存在或减少的展现改善的ADCC活性的抗原结合蛋白。本领域中已知各种减少或消除岩藻糖基化的方法。例如，通过使抗体分子与FcγRIII受体结合来介导ADCC效应子活性，经显示此取决于在CH2结构域N297残基处N-连接的糖基化的碳水化合物结构。相较于天然、岩藻糖基化抗体，非岩藻糖基化抗体以增加的亲和力结合此受体且更有效地触发FcγRIII介导的效应子功能。例如，在α-1，6-岩藻糖基转移酶已敲除的CHO细胞中重组产生非岩藻糖基化抗体使抗体具有100倍增加的ADCC活性(参见Yamane-Ohnuki等人，Biotechnol Bioeng.[生物技术及生物工程]87(5)：614-22，2004)。通过降低α-1，6-岩藻糖基转移酶或岩藻糖基化路径中的其他酶的活性，例如通过siRNA或反义RNA处理，将细胞系工程改造以敲除一种或多种酶，或与选择性糖基化抑制剂一起培养可以实现类似作用(参见Rothman等人，Mol Immunol.[分子免疫学]26(12)：1113-23，1989)。一些宿主细胞系，例如Lec13或大鼠杂交瘤YB2/0细胞系天然地产生岩藻糖基化程度较低的抗体(参见Shields等人，J Biol Chem.[生物化学杂志]277(30)：26733-40，2002；以及Shinkawa等人，J Biol Chem.[生物化学杂志]278(5)：3466-73，2003)。还已确定例如经由在过度表达GnTIII酶的细胞中重组产生抗体以增加等分碳水化合物的含量，可增加ADCC活性(参见Umana等人，Nat Biotechnol.[自然生物技术]17(2)：176-80，1999)。

在其他实施例中，通过例如自结合蛋白的Fc区移除一个或多个糖基化位点来减少或消除本文所述的多特异性抗体构建体的糖基化。消除或改变N-连接的糖基化位点的氨基酸取代可以减少或消除抗原结合蛋白的N-连接的糖基化。在某些实施例中，本文所述的多特异性抗体构建体包含在位置N297(EU编号)处的突变，例如N297Q、N297A或N297G。在某些实施例中，本文所述的多特异性抗体构建体包含在位置L234和L235(EU编号)，如L234A和L235A处的突变。在一个特定实施例中，本发明的多特异性抗体构建体包含来自人IgG1抗体的具有N297G突变的Fc区。为了改善含N297突变的分子的稳定性，可以对分子的Fc区进行进一步工程改造。例如，在一些实施例中，Fc区中的一个或多个氨基酸经半胱氨酸取代以促进二聚体状态下二硫键的形成。对应于IgG1 Fc区的V259、A287、R292、V302、L306、V323或I332(EU编号)的残基因此可以经半胱氨酸取代。在一个实施例中，特定残基对经半胱氨酸取代以使其优先彼此形成二硫键，由此限制或防止二硫键混乱。在某些实施例中，对包括但不限于，A287C与L306C、V259C与L306C、R292C与V302C、以及V323C与I332C。在特定实施例中，本文所述的多特异性抗体构建体包含来自人IgG1抗体的具有R292C和V302C突变的Fc区。在此类实施例中，Fc区还可包含N297G突变。

(i)N297G或N297A；

(ii)L234A和L235A；和

(iii)R292C和V302C；

其中氨基酸编号是根据Kabat的EU编号。

还可能希望对本发明的多特异性抗体构建体进行修饰以增加血清半衰期，例如通过并入或添加补救受体结合表位(例如通过使适当区域突变或通过将该表位并入肽标签中，接着使其与抗原结合蛋白在任一端或在中间融合，例如通过DNA或肽合成；参见，例如WO96/32478)或添加例如PEG或其他水溶性聚合物的分子，包括多糖聚合物。补救受体结合表位优选构成这样一种区域，其中来自Fc区中一个或两个环的任一个或多个氨基酸残基转移至抗原结合蛋白中的类似位置。在一个实施例中，来自Fc区中一个或两个环的三个或更多个氨基酸残基经转移。在一个实施例中，自Fc区(例如IgG Fc区)的CH2结构域取得表位并将其转移至抗原结合蛋白的CH1、CH3或VH区，或超过一个此类区域。可替代地，自Fc区的CH2结构域取得表位并将其转移至抗原结合蛋白的CL区或VL区，或这两个区域。有关Fc变体及其与补救受体相互作用的说明，参见国际公开WO 97/34631和WO 96/32478。

在本发明的多特异性抗体构建体的某些实施例中，位于Fc区的氨基末端的结合结构域(即，氨基末端结合结构域)是通过本文所述的肽接头或通过免疫球蛋白铰链区与Fc区的氨基末端融合的Fab片段。“免疫球蛋白铰链区”指连接免疫球蛋白重链的CH1结构域和CH2结构域的氨基酸序列。通常将人IgG1的铰链区定义为从约Glu216或约Cys226，至约Pro230的氨基酸序列。其他IgG同型的铰链区可通过将形成重链间二硫键的第一个和最后一个半胱氨酸残基置于相同位置来与IgG1序列比对，并且对本领域技术人员而言是确定的。在一些实施例中，将氨基末端结合结构域通过人IgG1铰链区连接到Fc区的氨基末端。在其他实施例中，将氨基末端结合结构域通过人IgG2铰链区连接到Fc区的氨基末端。在一个实施例中，将氨基末端结合结构域(例如Fab片段)通过Fab的CH1区的羧基末端融合至Fc区。

在本发明的重链融合蛋白的一些实施例中，位于Fc区羧基末端的结合结构域(即羧基末端结合结构域)是Fab片段。在这样的实施例中，Fab通过肽接头通过Fab片段的VH区的氨基末端融合或以其它方式连接到Fc区的羧基末端(例如CH3结构域的羧基末端)。因此，在一个实施例中，Fab通过Fab的VH区的氨基末端与Fc区融合，使得所得融合蛋白从N末端到C末端包含CH2结构域、CH3结构域、肽接头、VH区和CH1区。

将Fc区连接至羧基末端Fab的肽接头可以是本文所述的任何肽接头。在特定实施例中，将Fc区连接至羧基末端Fab片段的肽接头长度为至少5个氨基酸。在其他实施例中，将Fc区连接至羧基末端Fab片段的肽接头长度为至少8个氨基酸。用于将Fc区连接至羧基末端Fab片段的特别合适的肽接头是甘氨酸-丝氨酸接头，如(Gly_xSer)_n，其中x＝3或4并且n＝2、3、4、5或6(SEQ ID NO：923)。在一个实施例中，将Fc区连接至羧基末端Fab片段的肽接头是L10(G₄S)₂接头(SEQ ID NO：888)。在另一个实施例中，将Fc区连接至羧基末端Fab片段的肽接头是L9或G₃SG₄S接头(SEQ ID NO：924)。

在本发明的抗原结合蛋白的一些实施例中，其中羧基末端结合结构域是Fab片段，位于Fc区氨基末端的结合结构域(即，氨基末端结合结构域)也是Fab片段。氨基末端Fab片段可通过本文所述的肽接头或免疫球蛋白铰链区融合至Fc区的氨基末端。在一些实施例中，将氨基末端Fab片段通过人IgG1铰链区连接到Fc区的氨基末端。在其他实施例中，将氨基末端Fab片段通过人IgG2铰链区连接到Fc区的氨基末端。在一个实施例中，将氨基末端Fab片段通过Fab的CH1区的羧基末端融合至Fc区。

在一些实施例中，本发明的多特异性抗体构建体包含与第一靶标特异性地结合的第一抗体，其中来自第二抗体(与第二靶标特异性地结合)的Fab片段的一个多肽链(例如重链(VH2-CH1))融合到第一抗体的重链的羧基末端。在此实施例中的多特异性抗体构建体还包含含有来自第二抗体的Fab片段的另一半的多肽链(例如，轻链(VL2-CL))。此形式在本文中称为“IgG-Fab”形式，并且此类型的分子的一个实施例示意性地显示在图1中。因此，在某些实施例中，本发明包括包含以下的双特异性、多价抗原结合蛋白：(i)来自第一抗体的轻链，(ii)来自第一抗体的重链，其中该重链在其羧基末端通过肽接头与包含第二抗体的VH-CH1结构域的第一多肽融合以形成修饰的重链，和(iii)包含第二抗体的VL-CL结构域的第二多肽。当二聚化时，多特异性抗体构建物是包含两个修饰的重链、两个轻链(来自第一抗体)和含有来自第二抗体的Fab片段(Fd片段)的另一半的两个多肽链组成的同源六聚体(homohexamer)。在一个实施例中，第一多肽(与重链的羧基末端融合)包含来自第二抗体的VH和CH1结构域，并且第二多肽包含来自第二抗体的VL和CL结构域。

可以将本文所述的电荷对突变或互补性氨基酸取代引入第一抗体(Fab 1)或第二抗体(Fab 2)的Fab区，以促进正确的重链-轻链配对。例如，在一些实施例中，Fab1中的VL结构域的EU位置38处的氨基酸被带负电的氨基酸(例如，谷氨酸)替换并且Fab1中的VH结构域的EU位置39处的氨基酸被带正电的氨基酸(例如，赖氨酸)替换。在其他实施例中，Fab1中的VL结构域的EU位置38处的氨基酸被带正电的氨基酸(例如，赖氨酸)替换并且Fab1中的VH结构域的EU位置39处的氨基酸被带负电的氨基酸(例如，谷氨酸)替换。在某些实施例中，Fab2中的VL结构域的EU位置38处的氨基酸被带负电的氨基酸(例如，谷氨酸)替换并且Fab2中的VH结构域的EU位置39处的氨基酸被带正电的氨基酸(例如，赖氨酸)替换。在其他实施例中，Fab2中的VL结构域的EU位置38处的氨基酸被带正电的氨基酸(例如，赖氨酸)替换并且Fab2中的VH结构域的EU位置39处的氨基酸被带负电的氨基酸(例如，谷氨酸)替换。

在来自第二抗体的VH-CH1区(即Fd片段)与第一抗体的重链融合的实施例中，来自第一抗体的重链包含S183E突变(EU编号)，来自第一抗体的轻链包含S176K突变(EU编号)，来自第二抗体的轻链包含S176E突变(EU编号)，并且来自第二抗体的Fd区(与来自第一抗体的重链的C末端融合)包含S183K突变(EU编号)。在其他实施例中，来自第一抗体的重链包含G44E突变(EU)和S183E突变(EU编号)，来自第一抗体的轻链包含G100K突变(EU)和S176K突变(EU编号)，来自第二抗体的轻链包含G100E突变(EU)和S176E突变(EU编号)，和来自第二抗体的Fd区(与来自第一抗体的重链的C末端融合)包含G44K突变(EU)和S183K突变(EU编号)。前述实例中的电荷可以颠倒，只要相应的轻链或重链上的电荷也颠倒，以使正确的重/轻链对具有相反的电荷。

如与VH2和第二CH1结构域有关的“对应”意指如果没有接头，则从第一重链的C末端计数VH2和第二CH1结构域的氨基酸残基。如果有肽接头，从肽接头的C末端计数VH2和第二CH1结构域的氨基酸残基。在两种情况下均不从第一重链的N末端计数氨基酸残基。具体而言，对于VH2和第二CH1结构域，计数在VH2结构域的第一氨基酸残基处开始。使用EU或AHo惯例进行氨基酸残基的计数。

在某些实施例中：a)VH1包含Q39E突变并且第一CH1结构域包含S183K突变，使用EU编号；b)VH2包含Q39K突变并且第二CH1结构域包含S183E突变，使用EU编号；c)VL1包含Q38K突变并且第一CL结构域包含S176E突变，使用EU编号；并且d)VL2包含Q38E突变并且该第二CL结构域包含S176K突变，使用EU编号。

在某些实施例中：a)第一CH1结构域包含G44E和S183K突变，使用EU编号；b)第二CH1结构域包含G44K和S183E突变，使用EU编号；c)第一CL结构域包含G100K和S176E突变，使用EU编号；并且d)第二CL结构域包含G100E和S176K突变，使用EU编号。

在某些实施例中：a)VH1包含Q39K突变并且第一CH1结构域包含S183E突变，使用EU编号；b)VH2包含Q39E突变并且第二CH1结构域包含S183K突变，使用EU编号；c)VL1包含Q38E突变并且第一CL结构域包含S176K突变，使用EU编号；并且d)VL2包含Q38K突变并且该第二CL结构域包含S176E突变，使用EU编号。

在某些实施例中：a)第一CH1结构域包含G44K和S183E突变，使用EU编号；b)第二CH1结构域包含G44E和S183K突变，使用EU编号；c)第一CL结构域包含G100E和S176K突变，使用EU编号；并且d)第二CL结构域包含G100K和S176E突变，使用EU编号。

在某些实施例中，将第一重链经由肽接头融合至VH2。在某些实施例中，肽接头包含选自由以下组成的组的序列：(Gly₃Ser)₂(SEQ ID NO：916)、(Gly₄Ser)₂(SEQ ID NO：888)、(Gly₃Ser)₃(SEQ ID NO：917)、(Gly₄Ser)₃(SEQ ID NO：889)、(Gly₃Ser)₄(SEQ ID NO：918)、(Gly₄Ser)₄(SEQ ID NO：890)、(Gly₃Ser)₅(SEQ ID NO：919)、(Gly₄Ser)₅(SEQ ID NO：920)、(Gly₃Ser)₆(SEQ ID NO：921)、和(Gly₄Ser)₆(SEQ ID NO：922)。这些序列也可以写成：GGGSGGGS(SEQ ID NO：916)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：888)、GGGSGGGSGGGS(SEQ ID NO：917)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：889)、GGGSGGGSGGGSGGGS(SEQ ID NO：918)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：890)、GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS(SEQ ID NO：919)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：920)、GGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGS(SEQ ID NO：921)、和GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：922)。

另外或替代性地，可以通过交换羧基末端Fab结合结构域中的CH1和CL结构域来促进正确的重-轻链配对。举例来说，第一多肽(融合至重链的羧基末端)可包含来自第二抗体的VL结构域和CH1结构域，并且第二多肽可包含来自第二抗体的VH结构域和CL结构域。在其他实施例中，第一多肽(融合至重链的羧基末端)可包含来自第二抗体的VH结构域和CL结构域，并且第二多肽可包含来自第二抗体的VL结构域和CH1结构域。

ii)VH2或第二CH1结构域包含至少一个氨基酸取代以在选自由对应于以下位置的残基组成的组的残基处引入带负电的氨基酸：39、44、和183，使用EU编号；和

其中：

ii)VH2或第二CH1结构域包含至少一个氨基酸取代以在选自由对应于以下位置的残基组成的组的残基处引入带正电的氨基酸：39、44、和183，使用EU编号；和

其中：

在一个实施例中，将铰链-CH2-CH3多肽经由肽接头连接至VH2。

在一个实施例中，肽接头包含选自由以下组成的组的序列：(Gly₃Ser)₂(SEQ IDNO：916)、(Gly₄Ser)₂(SEQ ID NO：888)、(Gly₃Ser)₃(SEQ ID NO：917)、(Gly₄Ser)₃(SEQ IDNO：889)、(Gly₃Ser)₄(SEQ ID NO：918)、(Gly₄Ser)₄(SEQ ID NO：890)、(Gly₃Ser)₅(SEQ IDNO：919)、(Gly₄Ser)₅(SEQ ID NO：920)、(G1y₃Ser)₆(SEQ ID NO：921)、和(Gly₄Ser)₆(SEQ IDNO：922)。

在一个实施例中，

a)第一CH1结构域包含S183K突变，使用EU编号；

b)第二CH1结构域包含S183E突变，使用EU编号；

c)第一CL结构域包含S176E突变，使用EU编号；并且

d)第二CL结构域包含S176K突变，使用EU编号。

在一个实施例中，

a)第一CH1结构域包含G44K和S183K突变，使用EU编号；

b)第二CH1结构域包含G44E和S183E突变，使用EU编号；

c)第一CL结构域包含G100E和S176E突变，使用EU编号；并且

d)第二CL结构域包含G100K和S176K突变，使用EU编号。

在一个实施例中，

a)第一CH1结构域包含S183E突变，使用EU编号；

b)第二CH1结构域包含S183K突变，使用EU编号；

c)第一CL结构域包含S176K突变，使用EU编号；并且

d)第二CL结构域包含S176E突变，使用EU编号。

在一个实施例中，

a)第一CH1结构域包含G44E和S183E突变，使用EU编号；

b)第二CH1结构域包含G44K和S183K突变，使用EU编号；

c)第一CL结构域包含G100K和S176K突变，使用EU编号；并且

d)第二CL结构域包含G100E和S176E突变，使用EU编号。

(i)N297G或N297A；

(ii)L234A和L235A；和

(iii)R292C和V302C；

其中氨基酸编号是根据Kabat的EU编号。

VL1包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3：

分别是SEQ ID NO：58、59、和60；

分别是SEQ ID NO：64、65、和66；

分别是SEQ ID NO：70、71、和72；

分别是SEQ ID NO：76、77、和78；

分别是SEQ ID NO：82、83、和84；

分别是SEQ ID NO：88、89、和90；

分别是SEQ ID NO：94、95、和96；

分别是SEQ ID NO：100、101、和102；

分别是SEQ ID NO：106、107、和108；

分别是SEQ ID NO：112、113、和114；

分别是SEQ ID NO：118、119、和120；

分别是SEQ ID NO：124、125、和126；和

分别是SEQ ID NO：130、131、和132；

VH1包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3：

分别是SEQ ID NO：136、137、和138；

分别是SEQ ID NO：142、143、和144；

分别是SEQ ID NO：148、149、和150；

分别是SEQ ID NO：154、155、和156；

分别是SEQ ID NO：160、161、和162；

分别是SEQ ID NO：166、167、和168；

分别是SEQ ID NO：172、173、和174；

分别是SEQ ID NO：178、179、和180；

分别是SEQ ID NO：184、185、和186；

分别是SEQ ID NO：190、191、和192；

分别是SEQ ID NO：196、197、和198；

分别是SEQ ID NO：202、203、和204；以及

分别是SEQ ID NO：208、209、和210；

VL2包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3：

分别是SEQ ID NO：230、231、和232；

分别是SEQ ID NO：236、237、和238；

分别是SEQ ID NO：242、243、和244；以及

分别是SEQ ID NO：248、249、和250；

并且VH2包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3：

分别是SEQ ID NO：254、255、和256；

分别是SEQ ID NO：260、261、和262；

分别是SEQ ID NO：266、267、和268；以及

分别是SEQ ID NO：272、273、和274。

64.如权利要求63所述的抗体构建体，其中

1)VL1和VH1选自由以下组成的组：

并且

2)VL2和VH2选自由以下组成的组：

在一个实施例中：

VL1包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、49、和53；

在一个实施例中：

1)VL1和VH1选自由以下组成的组：

a)包含SEQ ID NO：5的VL1和包含SEQ ID NO：6的VH1；

b)包含SEQ ID NO：9的VL1和包含SEQ ID NO：10的VH1；

c)包含SEQ ID NO：13的VL1和包含SEQ ID NO：14的VH1；

d)包含SEQ ID NO：17的VL1和包含SEQ ID NO：18的VH1；

e)包含SEQ ID NO：21的VL1和包含SEQ ID NO：22的VH1；

f)包含SEQ ID NO：25的VL1和包含SEQ ID NO：26的VH1；

g)包含SEQ ID NO：29的VL1和包含SEQ ID NO：30的VH1；

h)包含SEQ ID NO：33的VL1和包含SEQ ID NO：34的VH1；

i)包含SEQ ID NO：37的VL1和包含SEQ ID NO：38的VH1；

j)包含SEQ ID NO：41的VL1和包含SEQ ID NO：42的VH1；

k)包含SEQ ID NO：45的VL1和包含SEQ ID NO：46的VH1；

l)包含SEQ ID NO：49的VL1和包含SEQ ID NO：50的VH1；以及

m)包含SEQ ID NO：53的VL1和包含SEQ ID NO：54的VH1；

并且

2)VL2和VH2选自由以下组成的组：

a)包含SEQ ID NO：213的VL2和包含SEQ ID NO：214的VH2；

b)包含SEQ ID NO：217的VL2和包含SEQ ID NO：218的VH2；

c)包含SEQ ID NO：221的VL2和包含SEQ ID NO：222的VH2；以及

d)包含SEQ ID NO：225的VL2和包含SEQ ID NO：226的VH2。

VL1包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3：

分别是SEQ ID NO：230、231、和232；

分别是SEQ ID NO：236、237、和238；

分别是SEQ ID NO：242、243、和244；以及

分别是SEQ ID NO：248、249、和250；

VH1包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3：

分别是SEQ ID NO：254、255、和256；

分别是SEQ ID NO：260、261、和262；

分别是SEQ ID NO：266、267、和268；以及

分别是SEQ ID NO：272、273、和274；

VL2包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3：

分别是SEQ ID NO：58、59、和60；

分别是SEQ ID NO：64、65、和66；

分别是SEQ ID NO：70、71、和72；

分别是SEQ ID NO：76、77、和78；

分别是SEQ ID NO：82、83、和84；

分别是SEQ ID NO：88、89、和90；

分别是SEQ ID NO：94、95、和96；

分别是SEQ ID NO：100、101、和102；

分别是SEQ ID NO：106、107、和108；

分别是SEQ ID NO：112、113、和114；

分别是SEQ ID NO：118、119、和120；

分别是SEQ ID NO：124、125、和126；以及

分别是SEQ ID NO：130、131、和132；

并且

VH2包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3：

分别是SEQ ID NO：136、137、和138；

分别是SEQ ID NO：142、143、和144；

分别是SEQ ID NO：148、149、和150；

分别是SEQ ID NO：154、155、和156；

分别是SEQ ID NO：160、161、和162；

分别是SEQ ID NO：166、167、和168；

分别是SEQ ID NO：172、173、和174；

分别是SEQ ID NO：178、179、和180；

分别是SEQ ID NO：184、185、和186；

分别是SEQ ID NO：190、191、和192；

分别是SEQ ID NO：196、197、和198；

分别是SEQ ID NO：202、203、和204；以及

分别是SEQ ID NO：208、209、和210。

在一个实施例中，

1)VL1和VH1选自由以下组成的组：

并且

2)VL2和VH2选自由以下组成的组：

在一个实施例中，

1)VL1和VH1选自由以下组成的组：

a)包含SEQ ID NO：213的VL1和包含SEQ ID NO：214的VH1；

b)包含SEQ ID NO：217的VL1和包含SEQ ID NO：218的VH1；

c)包含SEQ ID NO：221的VL1和包含SEQ ID NO：222的VH1；和

d)包含SEQ ID NO：225的VL1和包含SEQ ID NO：226的VH1；

并且

2)VL2和VH2选自由以下组成的组：

a)包含SEQ ID NO：5的VL2和包含SEQ ID NO：6的VH2；

b)包含SEQ ID NO：9的VL2和包含SEQ ID NO：10的VH2；

c)包含SEQ ID NO：13的VL2和包含SEQ ID NO：14的VH2；

d)包含SEQ ID NO：17的VL2和包含SEQ ID NO：18的VH2；

e)包含SEQ ID NO：21的VL2和包含SEQ ID NO：22的VH2；

f)包含SEQ ID NO：25的VL2和包含SEQ ID NO：26的VH2；

g)包含SEQ ID NO：29的VL2和包含SEQ ID NO：30的VH2；

h)包含SEQ ID NO：33的VL2和包含SEQ ID NO：34的VH2；

i)包含SEQ ID NO：37的VL2和包含SEQ ID NO：38的VH2；

j)包含SEQ ID NO：41的VL2和包含SEQ ID NO：42的VH2；

k)包含SEQ ID NO：45的VL2和包含SEQ ID NO：46的VH2；

l)包含SEQ ID NO：49的VL2和包含SEQ ID NO：50的VH2；以及

m)包含SEQ ID NO：53的VL2和包含SEQ ID NO：54的VH2。

本发明包括编码本文所述的多特异性抗体构建体及其组分的一种或多种分离的核酸。本发明的核酸分子包括呈单链和双链形式的DNA和RNA，以及相应互补序列。DNA包括例如cDNA、基因组DNA、化学合成的DNA、通过PCR扩增的DNA及其组合。本发明的核酸分子包括全长基因或cDNA分子，以及其片段组合。在一个实施例中，本发明的核酸衍生自人源，但本发明也包括衍生自非人物种的核酸。

“分离的核酸”在本文中与“分离的多核苷酸”可互换使用，在自天然存在的来源分离核酸的情况下，是指已与分离出核酸的生物体基因组中存在的相邻基因序列分离的核酸。在由模板酶法合成或化学合成核酸，例如PCR产物、cDNA分子或寡核苷酸的情况下，应理解，由此类方法获得的核酸是分离的核酸。分离的核酸分子是指呈独立片段形式或作为较大核酸构建体的一种组分的核酸分子。在一个实施例中，核酸基本上不含污染性内源物质。该核酸分子衍生自基本上纯的形式和能够利用标准生物化学方法(例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册]，第2版，Cold SpringHarbor Laboratory[冷泉港实验室]，Cold Spring Harbor[冷泉港]，NY[纽约州](1989)中概述的方法)鉴别、操作和回收其组分核苷酸序列的量或浓度分离至少一次的DNA或RNA。此类序列以不含典型地存在于真核基因中的内部非翻译序列或内含子的可读框形式提供和/或构建。非翻译DNA序列可以存在于可读框的5′或3′处，其中这些序列不干扰编码区的操作或表达。除非另外说明，否则本文所论述的任何单链多核苷酸序列的左手端是5’端；双链多核苷酸序列的左手方向称为5’。新生RNA转录物的5′至3′添加方向称为转录方向；在具有与RNA转录物的序列相同序列的DNA链上作为RNA转录物5′端至5′端的序列区称为“上游序列”；在具有与RNA转录物的序列相同序列的DNA链上作为RNA转录物3′端至3′端的序列区称为“下游序列”。

如本文所概述，可以通过使用盒式或PCR诱变，或本领域中熟知的其他技术对编码多肽的DNA中的核苷酸进行位点特异性诱变，以产生编码变体的DNA，且随后在细胞培养中表达重组DNA来制备本文所述的抗原结合蛋白的变体。不过，还可使用确定的技术，通过体外合成制备包含具有多达约100-150个残基的变体CDR的抗原结合蛋白。这些变体典型地展现与天然存在的类似物相同的定性生物活性，例如结合至抗原。此类变体包括例如在抗原结合蛋白的氨基酸序列内残基的缺失和/或插入和/或取代。进行缺失、插入和取代的任何组合以得到最终构建体，条件是最终构建体具有所需的特征。氨基酸变化还可能改变抗原结合蛋白的翻译后加工，例如改变糖基化位点的数目或位置。在某些实施例中，抗原结合蛋白变体的制备意图修饰直接参与表位结合的氨基酸残基。在其他实施例中，出于本文所论述的目的，需要对不直接参与表位结合的残基或不以任何方式参与表位结合的残基进行修饰。预期在任何CDR区和/或框架区内的诱变。本领域普通技术人员可以采用协方差分析设计抗原结合蛋白的氨基酸序列中的有用修饰。参见例如，Choulier等人，Proteins[蛋白质]41：475-484，2000；Demarest等人，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]335：41-48，2004；Hugo等人，Protein Engineering[蛋白质工程改造]16(5)：381-86，2003；Aurora等人，美国专利公开号2008/0318207 A1；Glaser等人，美国专利公开号2009/0048122 A1；Urech等人，WO2008/110348 A1；Borras等人，WO 2009/000099 A2。由协方差分析确定的此类修饰可以改善抗原结合蛋白的效力、药物代谢动力学、药效学和/或可制造特征。

本发明的核酸序列。本领域技术人员应理解，由于遗传密码的简并性，所以可能获得极大数量的核酸，其全部编码本文的CDR(和本文所述的抗原结合蛋白的重链和轻链或其他组分)。因此，通过以不改变编码蛋白的氨基酸序列的方式简单地修饰一个或多个密码子序列来标识特定氨基酸序列，本领域技术人员可以制得多种不同的核酸。

本发明还包括载体，其包含编码本发明的多特异性抗体构建体的一种或多种组分(例如可变区、轻链、重链、修饰的重链、和Fd片段)的一个或多个核酸。术语“载体”是指用于将蛋白质编码信息转移至宿主细胞中的任何分子或实体(例如核酸、质粒、噬菌体或病毒)。载体的实例包括但不限于，质粒、病毒载体、非游离型哺乳动物载体和表达载体，例如重组表达载体。如本文所用的，术语“表达载体”或“表达构建体”是指含有所需编码序列和用于在特定宿主细胞中表达可操作地连接的编码序列所必需的适合的核酸控制序列的重组DNA分子。表达载体可包括但不限于，影响或控制转录、翻译且在存在内含子时，影响与其可操作地连接的编码区的RNA剪接的序列。用于在原核生物中表达所必需的核酸序列包括启动子，任选地操纵序列、核糖体结合位点和可能的其他序列。已知真核细胞利用启动子、增强子、和终止子以及多腺苷酸化信号。分泌信号肽序列还可以任选地由表达载体编码，与目的编码序列可操作地连接，使得表达的多肽可以由重组宿主细胞分泌，如果需要，以便更容易地从细胞中分离目的多肽。例如，在一些实施例中，信号肽序列可以被附接/融合到本发明的任何多肽序列的氨基末端。在某些实施例中，具有MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC(SEQ ID NO：894)氨基酸序列的信号肽与本发明的任何多肽序列的氨基末端融合。在其他实施例中，具有MAWALLLLTLLTQGTGSWA(SEQ ID NO：895)氨基酸序列的信号肽与本发明的任何多肽序列的氨基末端融合。在又其他实施例中，具有MTCSPLLLTLLIHCTGSWA(SEQ ID NO：896)氨基酸序列的信号肽与本发明的任何多肽序列的氨基末端融合。可以与本文所述的多肽序列的氨基末端融合的其他适合信号肽序列包括：MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG(SEQ ID NO：897)、MEWTWRVLFLVAAATGAHS(SEQ ID NO：898)、METPAQLLFLLLLWLPDTTG(SEQ ID NO：899)、METPAQLLFLLLLWLPDTTG(SEQ ID NO：900)、MKHLWFFLLLVAAPRWVLS(SEQ ID NO：901)、和MEWSWVFLFFLSVTTGVHS(SEQ ID NO：902)。其他信号肽是本领域技术人员已知的，并且可以与本发明的任何多肽链融合，例如以促进或优化在特定宿主细胞中的表达。

典型地，用于宿主细胞中以产生本发明的双特异性抗原蛋白的表达载体将含有用于质粒维持以及用于克隆和表达编码多特异性抗体构建体各组分的外源核苷酸序列的序列。在某些实施例中，此序列，统称为“侧接序列”，典型地将包括以下核苷酸序列中的一个或多个：启动子、一个或多个增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供体和受体剪接位点的完整内含子序列、编码用于多肽分泌的前导序列的序列、核糖体结合位点、聚腺苷酸化序列、用于插入编码待表达的多肽的核酸的多接头区和可选择标记物组件。这些序列分别于下文论述。

任选地，载体可以含有“标签”编码序列，即，位于多肽编码序列的5′或3′端的寡核苷酸分子；该寡核苷酸标签序列编码聚组氨酸(例如六组氨酸(SEQ ID NO：925))、FLAG、HA(血凝素流感病毒)、myc或现有可商购抗体所针对的另一“标签”分子。该标签典型地在多肽表达时与该抗体融合，且可以用作一种自宿主细胞亲和纯化或检测多肽的方式。亲和纯化可以通过例如柱层析法，使用针对标签的抗体作为亲和基质来实现。任选地，随后可以通过各种方式，例如使用某些肽酶裂解，自纯化的多肽移除标签。

侧接序列可以为同源的(即，来自与宿主细胞相同的物种和/或品系)、异源的(即，来自与宿主细胞物种或品系不同的物种)、混合的(即，来自超过一种来源的侧接序列的组合)、合成的或天然的。因此，侧接序列的来源可以为任何原核或真核生物体、任何脊椎动物或非脊椎动物生物体，或任何植物，只要该侧接序列在宿主细胞机器中起作用且可以经宿主细胞机器激活。

可用于本发明载体中的侧接序列可以通过本领域中熟知的几种方法中的任一种获得。典型地，可用于本文中的侧接序列将预先通过定位和/或通过限制性核酸内切酶消化鉴别且因此可以使用适当限制性核酸内切酶自适当组织来源分离。在一些情况下，侧接序列的全核苷酸序列可以是已知的。此处，侧接序列可以使用常规核酸合成或克隆方法合成。

无论已知侧接序列的全部抑或仅一部分，其均可使用聚合酶链反应(PCR)和/或通过用适合探针，例如来自相同或另一物种的寡核苷酸和/或侧接序列片段筛选基因组文库来获得。若侧接序列未知，则可以自可能含有例如编码序列或甚至另外一个或多个基因的较大DNA片段分离含有侧接序列的DNA片段。可以通过限制性核酸内切酶消化产生适当DNA片段，随后使用琼脂糖凝胶纯化、

柱层析法(加利福尼亚州查茨沃斯(Chatsworth，CA))或技术人员已知的其他方法分离来实现分离。本领域普通技术人员将易于了解实现此目的的适合酶的选择。

复制起点典型地是可商购的原核表达载体的一部分，且该起点有助于在宿主细胞中扩增载体。若所选载体不含复制起点，则可以基于已知序列以化学方式合成，并将其连接到载体中。例如，来自质粒pBR322(马萨诸塞州贝弗利的新英格兰生物实验室(New EnglandBiolabs，Beverly，MA))的复制起点适合大多数革兰氏阴性细菌，且各种病毒起点(例如SV40、多瘤病毒、腺病毒、水疱性口炎病毒(VSV)，或乳头瘤病毒，例如HPV或BPV)可用于在哺乳动物细胞中克隆载体。一般而言，哺乳动物表达载体不需要复制起点组分(例如，通常仅使用SV40起点，因为其还含有病毒早期启动子)。

转录终止序列典型地位于多肽编码区3′端且用于终止转录。通常，原核细胞中的转录终止序列是富含G-C的片段，后接聚T序列。尽管该序列易于自文库克隆或甚至作为载体的一部分商购获得，但其还可使用核酸合成方法容易地合成。

可选择标记物基因编码选择性培养基中生长的宿主细胞存活和生长所需的蛋白质。典型的选择标记基因编码如下蛋白质：(a)赋予针对抗生素或其他毒素(例如，对于原核宿主细胞，胺苄青霉素、四环素或卡那霉素)的抗性；(b)补充细胞的营养缺陷；或(c)提供不可得自复杂培养基或限定培养基的重要营养物。特定的可选择标记物为卡那霉素抗性基因、胺苄青霉素抗性基因及四环素抗性基因。有利地，新霉素抗性基因还可用于在原核及真核宿主细胞二者中进行选择。

可以使用其他可选择基因扩增有待表达的基因。扩增是使生长或细胞存活必要的蛋白质产生所需的基因在连续数代重组细胞的染色体内串联性复制的过程。适用于哺乳动物细胞的可选择标记物的实例包括二氢叶酸还原酶(DHFR)和无启动子胸苷激酶基因。使哺乳动物细胞转化株处于选择压力下，其中由于载体中存在可选择基因，所以仅转化株唯一适于存活。选择压力是通过在连续地增加培养基中选择剂的浓度的条件下培养经转化细胞，由此使可选择基因和编码另一基因，例如本文所述的多特异性抗体构建体的一种或多种组分的DNA扩增来施加。因此，由扩增的DNA合成较多量的多肽。

核糖体结合位点通常是mRNA翻译起始所必需的，且以夏因-达尔加诺(Shine-Dalgarno)序列(原核生物)或科扎克(Kozak)序列(真核生物)表征。该元件典型地位于启动子的3′端且在待表达的多肽的编码序列的5′端。在某些实施例中，一个或多个编码区可以可操作地连接到内部核糖体结合位点(IRES)，由此允许自单一RNA转录物翻译两个可读框。

在一些情况下，例如在真核宿主细胞表达系统中需要糖基化的情况下，可以操作各种前序列或原序列以改善糖基化或产率。例如，可以改变特定信号肽的肽酶裂解位点，或添加原序列，这些序列还可影响糖基化。最终蛋白质产物可以在位置-1(相对于成熟蛋白质的第一个氨基酸)具有一个或多个易于表达的另外的氨基酸，这些氨基酸可能未完全移除。例如，最终蛋白质产物可能具有一个或两个在肽酶裂解位点中发现的附接至氨基末端的氨基酸残基。可替代地，当酶在成熟多肽内的此类区域切割时，使用一些酶裂解位点可能产生所需多肽的略微截短的形式。

本发明的表达和克隆载体典型地将含有由宿主生物体识别且可操作地连接至编码多肽的分子的启动子。如本文所用的，术语“可操作地连接”是指两个或多个核酸序列以使得产生能够引导给定基因的转录和/或所需蛋白质分子的合成的核酸分子的方式连接。例如，载体中“可操作地连接”至蛋白质编码序列的控制序列是与该编码序列连接以使得在与控制序列的转录活性相适应的条件下实现该蛋白质编码序列的表达。更具体地，若启动子和/或增强子序列(包括顺式作用转录控制组件的任何组合)在适合宿主细胞或其他表达系统中刺激或调节编码序列的转录，则其可操作地连接至该编码序列。

启动子为位于控制结构基因转录的结构基因起始密码子(一般在约100至1000bp内)上游(即，5’)的非转录序列。启动子通常分组为两种类别中的一个：诱导型启动子及组成型启动子。诱导型启动子起始处于其控制下的DNA应答于培养条件的某种变化(如营养素的存在或不存在，或者温度变化)以提高的水平转录。另一方面，组成型启动子一致地转录其可操作地连接的基因，即，对基因表达具有极小控制或无控制。许多由多种潜在宿主细胞识别的启动子是熟知的。通过限制性酶消化移除源DNA启动子，并将所需启动子序列插入载体中，将适合的启动子可操作地连接至编码例如本发明多特异性抗体构建体的重链、轻链、修饰的重链或其他组分的DNA。

适用于酵母宿主的适合启动子还是本领域中熟知的。酵母增强子宜与酵母启动子一起使用。用于哺乳动物宿主细胞的适合启动子是熟知的，且包括但不限于获自病毒基因组的那些启动子，这些病毒为诸如多形瘤病毒、传染性上皮瘤病毒、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛乳头状瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、B型肝炎病毒及猿猴病毒40(SV40)。其他适合哺乳动物启动子包括异源哺乳动物启动子，例如热休克启动子及肌动蛋白启动子。

其他感兴趣的启动子包括但不限于：SV40早期启动子(Benoist和Chambon，1981，Nature[自然]290：304-310)；CMV启动子(Thornsen等人，1984，Proc.Natl.Acad.U.S.A.[美国科学院院报]81：659-663)；劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)的3′长末端重复序列中所含的启动子(Yamamoto等人，1980，Cell[细胞]22：787-797)；疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等人，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国科学院院报]78：1444-1445)；来自金属硫蛋白基因的启动子和调控序列(Prinster等人，1982，Nature[自然]296：39-42)；和原核启动子，例如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等人，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国科学院院报]75：3727-3731)；或tac启动子(DeBoer等人，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国科学院院报]80：21-25)。有意义的还有以下动物转录控制区，它们表现出组织特异性并已用于转基因动物中：在胰脏腺泡细胞中具有活性的弹性蛋白酶I基因控制区(Swift等人，1984，Cell[细胞]38：639-646；Ornitz等人，1986，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.[冷泉港数量生物学研讨会]50：399-409；MacDonald，1987，Hepatology[肝脏病学]7：425-515)；在胰脏β细胞中具有活性的胰岛素基因控制区(Hanahan，1985，Nature[自然]315：115-122)；在淋巴样细胞中有活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl等人，1984，Cell[细胞]38：647-658；Adames等人，1985，Nature[自然]318：533-538；Alexander等人，1987，Mol.Cell.Biol.[分子细胞生物学]7：1436-1444)；在睾丸、乳房、淋巴和肥大细胞中具有活性的小鼠乳房肿瘤病毒控制区(Leder等人，1986，Cell[细胞]45：485-495)；在肝中具有活性的白蛋白基因控制区(Pinkert等人，1987，Genes and Devel.[基因与发育]1：268-276)；在肝中具有活性的α-胎蛋白基因控制区(Krumlauf等人，1985，Mol.Cell.Biol.[分子细胞生物学]5：1639-1648；Hammer等人，1987，Science[科学]253：53-58)；在肝中具有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey等人，1987，Genes and Devel.[基因与发育]1：161-171)；在骨髓细胞中具有活性的β-球蛋白基因控制区(Mogram等人，1985，Nature[自然]315：338-340；Kollias等人，1986，Cell[细胞]46：89-94)；在脑中的寡树突细胞中具有活性的髓磷脂碱性蛋白基因控制区(Readhead等人，1987，Cell[细胞]48：703-712)；在骨骼肌中具有活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区(Sani，1985，Nature[自然]314：283-286)；和在下丘脑中具有活性的促性腺激素释放激素基因控制区(Mason等人，1986，Science[科学]234：1372-1378)。

可以将增强子序列插入载体中以增加高等真核细胞中编码多特异性抗体构建体的组分(例如，轻链、重链、修饰的重链、Fd片段)的DNA的转录。增强子为DNA的顺式作用元件，长度通常为约10-300bp，作用于启动子以增加转录。增强子在方向及位置方面为相对独立的，已见于转录单元的5′及3′位置。已知可得自哺乳动物基因的几种增强子序列(例如，球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白及胰岛素)。然而，典型地使用来自于病毒的增强子。本领域中已知的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒增强子和腺病毒增强子是用于激活真核启动子的示例性强化元件。尽管增强子可以定位于载体中编码序列的5′或3′，但其典型地位于启动子5′的位点处。可将编码适当天然或异源信号序列(前导序列或信号肽)的序列并入表达载体中，以促进抗体的细胞外分泌。信号肽或前导序列的选择取决于待产生抗体的宿主细胞的类型，且异源信号序列可替换天然信号序列。信号肽的实例在上文有描述。在哺乳动物宿主细胞中起作用的其他信号肽包括美国专利号4,965,195中所述的白介素-7(IL-7)的信号序列；Cosman等人，1984，Nature[自然]312：768中所述的白介素-2受体的信号序列；欧洲专利号0367 566中所述的白介素-4受体信号肽；美国专利号4,968,607中所述的I型白介素-1受体信号肽；EP专利号0 460 846中所述的II型白介素-1受体信号肽。

可由起始载体(例如市售载体)构建所提供的表达载体。这些载体可含有或可不含所有所需侧接序列。在载体中不存在一个或多个本文所述的侧接序列的情况下，其可以独立地获得且连接到载体中。用于获得各侧接序列的方法是本领域普通技术人员熟知的。可以将表达载体引入宿主细胞中，由此产生由如本文所述的核酸所编码的蛋白质，包括融合蛋白。

在某些实施例中，可以将编码本发明的多特异性抗体构建体的不同组分的核酸插入相同表达载体中。例如，编码抗第一靶抗原轻链的核酸可被克隆到与编码抗第一靶抗原重链的核酸相同的载体中。在此类实施例中，该两个核酸可以由内部核糖体进入位点(IRES)隔开且处于单一启动子控制下，由此使轻链和重链由相同mRNA转录物表达。可替代地，该两个核酸可以处于两个独立启动子控制下，由此使轻链和重链由两个独立的mRNA转录物表达。在一些实施例中，编码抗第一靶抗原轻链和抗第一靶抗原重链的核酸可被克隆到一个表达载体中，并且编码抗第二靶抗原轻链和抗第二靶抗原重链的核酸可被克隆到第二表达载体中。

类似地，对于IgG-Fab多特异性抗体构建体，编码三个组分中的每一个的核酸可被克隆到相同的表达载体中。在一些实施例中，编码IgG-Fab分子的轻链的核酸和编码第二多肽(包含C末端Fab结构域的另一半)的核酸被克隆到一个表达载体中，而编码修饰的重链(包含重链和Fab结构域的一半的融合蛋白)的核酸被克隆到第二表达载体中。在某些实施例中，本文所述的多特异性抗体构建体的所有组分都从相同的宿主细胞群表达。例如，即使将一种或多种组分克隆到单独的表达载体中，宿主细胞也用两种表达载体共转染，使得一个细胞产生多特异性抗体构建体的所有组分。

在构建出载体并将编码本文所述的多特异性抗体构建体各组分的一个或多个核酸分子插入一个或多个载体的一个或多个适当位点中之后，可以将一个或多个完整载体插入适当宿主细胞中以进行扩增和/或多肽表达。因此，本发明包括分离的宿主细胞，其包含编码多特异性抗体构建体组分的一个或多个表达载体。如本文所用的，术语“宿主细胞”是指经核酸转化或能够经核酸转化且由此表达目的基因的细胞。该术语包括亲本细胞的后代，无论后代是否与原始亲本细胞在形态上或遗传构成方面相同，只要存在目的基因即可。包含本发明的分离核酸的宿主细胞(在一个实施例中可操作地连接到至少一个表达控制序列(例如启动子或增强子))是“重组宿主细胞”。

可以通过熟知方法，包括转染、感染、磷酸钙共沉淀、电穿孔、显微注射、脂质体转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或其他已知技术将抗原结合蛋白的表达载体转化至所选宿主细胞中。该方法将部分随所用宿主细胞的类型而变化。这些方法及其他适合的方法对于技术人员是熟知的，并且阐述于例如Sambrook等人，2001，同上中。

宿主细胞当在适当条件下培养时合成抗原结合蛋白，该抗原结合蛋白随后可以自培养基收集(若宿主细胞将其分泌至培养基中)或直接由产生该抗原结合蛋白的宿主细胞收集(若其并非分泌的)。合适的宿主细胞的选择将取决于各种因素，例如所需的表达水平、活性所需或必需的多肽修饰(例如糖基化或磷酸化)以及易于折叠成生物活性分子。

示例性宿主细胞包括原核生物细胞、酵母或高等真核细胞。原核宿主细胞包括真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)如埃希氏杆菌属(Escherichia)，例如大肠杆菌(E.coli)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)，例如如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、和志贺氏杆菌(Shigella)、还有芽孢杆菌属(Bacillus)，例如枯草杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、假单胞菌属(Pseudomonas)、和链霉菌属(Streptomyces)。真核微生物(如丝状真菌或酵母)是用于重组多肽的合适的克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通面包酵母是低等真核宿主微生物中最常用的。不过，多种其他属、种和菌株是常用的且可用于本文中，例如毕赤酵母属(Pichia)，例如巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，耶氏酵母属(Yarrowia)；假丝酵母属(Candida)；瑞氏木霉(Trichoderma reesia)；粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，例如西方许旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)；和丝状真菌，如，例如脉孢菌属(Neurospora)、青霉菌属(Penicillium)、木霉菌属(Tolypocladium)和曲霉属(Aspergillus)宿主，例如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。

用于表达糖基化抗原结合蛋白的宿主细胞可以来源于多细胞生物体。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株和变体以及来自以下宿主的相应的许可性昆虫宿主细胞，例如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)，埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)，白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)，黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)。用于转染此类细胞的多种病毒株是公开可获得的，例如，苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5株。

脊椎动物宿主细胞还为适合宿主，且由此类细胞重组产生抗原结合蛋白已成为常规程序。可用作表达的宿主的哺乳动物细胞系是本领域熟知的，并且包括但不限于可从美国种质保存中心(ATCC)获得的永生化细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括CHOK1细胞(ATCC CCL61)、DXB-11、DG-44和中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]77：4216，1980)；由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚胎肾系(293细胞或亚克隆用于在悬浮培养中生长的293细胞(Graham等人，J.Gen Virol.[普通病毒学杂志]36：59，1977)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL10)；小鼠塞托利细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.[生殖生物学]23：243-251，1980)；猴肾细胞(CV1、ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝癌细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人，Annals N.YAcad.Sci.[纽约科学院年报]383：44-68，1982)；MRC 5细胞或FS4细胞；哺乳动物骨髓瘤细胞，以及许多其他的细胞系。在某些实施例中，可通过确定何种细胞系具有高表达水平且组成型地产生本发明的多特异性抗体构建体来选择细胞系。在另一实施例中，可以自B细胞谱系选择不产生自身抗体但能够制备并分泌异源抗体的细胞系。CHO细胞是用于表达本发明的多特异性抗体构建体的宿主细胞。

用上述核酸或载体转化或转染宿主细胞以产生多特异性抗体构建体，并在适当改进用于诱导启动子、选择转化子、或扩增编码所需序列的基因的常规营养培养基中培养。此外，具有由选择性标记物隔开的多个转录单元拷贝的新颖载体和经转染细胞系特别适用于表达抗原结合蛋白。因此，本发明还提供了制备本文所述的多特异性抗体构建体的方法，该方法包括在允许由本文所述的一种或多种表达载体编码的多特异性抗体构建体表达的条件下，在培养基中培养包含该一种或多种表达载体的宿主细胞；并且从该培养基中回收该多特异性抗体构建体。

用于产生本发明的抗原结合蛋白的宿主细胞可以在多种培养基中培养。诸如Ham′s F10(西格玛公司(Sigma))、最小必需培养基((MEM)，(西格玛公司))、RPMI-1640(西格玛公司)和杜尔贝科改良型伊戈尔培养基(Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium)((DMEM)，西格玛公司))等市售培养基适用于培养宿主细胞。另外，在Ham等人，Meth.Enz.[酶学方法]58：44，1979；Barnes等人，Anal.Biochem.[分析生物化学]102：255，1980；美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90103430；WO 87/00195；或美国专利注册号30,985中描述的任何培养基可以用作宿主细胞的培养基。必要时，这些培养基中的任一种可以补充有激素和/或其他生长因子(例如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(例如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(例如HEPES)、核苷酸(例如腺苷和胸苷)、抗生素(例如健他霉素(Gentamycin^TM)药物)、微量元素(定义为通常以在微摩尔浓度范围内的最终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等效能量来源。还可以按本领域技术人员已知的适当浓度包含任何其他必需的补充剂。培养条件，例如温度、pH等，是先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的条件，并且对于普通技术人员来说是显而易见的。

在培养宿主细胞后，多特异性抗体构建体可以在细胞内、周质间隙中产生，或直接分泌到培养基中。若在细胞内产生抗原结合蛋白，则作为第一个步骤，例如通过离心或超滤来移除宿主细胞或溶解片段的颗粒状碎片。双特异性抗原结合蛋白可以使用例如羟基磷灰石色谱、阳离子或阴离子交换色谱、或亲和色谱、使用一种或多种目的抗原或蛋白A或蛋白G作为亲和配体来纯化。蛋白A可用于纯化包括基于人γ1、γ2或γ4重链的多肽的蛋白质(Lindmark等人，J.Immunol.Meth.[免疫学方法杂志]62：1-13，1983)。对于所有小鼠同型和对于人γ3推荐蛋白G(Guss等人，EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]5：15671575，1986)。亲和配体所附接的基质通常是琼脂糖，但也可以使用其他基质。相较于用琼脂糖，机械稳定的基质，例如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯可以提高流动速率并缩短加工时间。在蛋白质包含CH3结构域的情况下，Bakerbond ABX^TM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，N.J.[新泽西州菲利普斯堡])可用于纯化。依据待回收的特定多特异性抗体构建体，还可采用其他蛋白质纯化技术，例如乙醇沉淀法、逆相HPLC、层析聚焦法、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀法。

将本发明的多特异性抗体构建体用于检测一种或多种靶抗原(生物样品中)并且鉴定表达一种或多种靶抗原的细胞或组织。本文所述的多特异性抗体构建体可用于诊断目的以检测、诊断或监测与一种或多种靶抗原相关的疾病和/或病症。还提供了使用本领域技术人员已知的经典免疫组织学方法在样品中检测一种或多种靶抗原的存在的方法(例如Tijssen，1993，Practice and Theory of Enzyme Immunoassays[酶免疫分析的实践与理论]，第15卷(R.H.Burdon和P.H.van Knippenberg编辑，爱思唯尔出版公司(Elsevier)，阿姆斯特丹)；Zola，1987，Monoclonal Antibodies：A Manual of Techniques[单克隆抗体：技术手册]，第147-158页(CRC出版公司(CRC Press，Inc.))；Jalkanen等人，1985，J.Cell.Biol.[细胞生物学杂志]101：976-985；Jalkanen等人，1987，J.Cell Biol.[分子生物学杂志]105：3087-3096)。任一靶标的检测可以在体内或体外进行。

一个实施例提供了本发明的多特异性抗体构建体或根据本发明的方法产生的多特异性抗体构建体，用于在预防、治疗或缓解肿瘤或癌症疾病或转移性癌症疾病中使用。

根据本发明的优选实施例，所述肿瘤或癌症疾病是实体瘤疾病。

本文所述的制剂可用作在有需要的患者中治疗、改善和/或预防本文所述的病理医学病况的药物组合物。术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性(prophylactic或preventative)措施两者。治疗包括将制剂应用或施用至来自具有疾病/病症、疾病/病症的症状或对疾病/病症的倾向的患者的身体、分离的组织或细胞，目的是治疗、治愈、缓解、减轻、改变、补救、减轻、改善或影响疾病、疾病的症状或向疾病的倾向。

如本文所用的，术语“减轻”是指通过向有需要的受试者施用根据本发明的多特异性抗体构建体，对患有如本文所述的肿瘤或癌症或转移性癌症的患者的疾病状态的任何改善。这种改善还可以被视为减缓或停止患者的肿瘤或癌症或转移性癌症的p进展。如本文所用的，术语“预防”意指通过向有需要的受试者施用根据本发明的多特异性抗体构建体，避免患有如下文所述的肿瘤或癌症或转移性癌症的患者的发病或复发。

术语“疾病”是指将受益于用本文所述的多特异性抗体构建体或药物组合物治疗的任何病况。这包括慢性和急性病症或疾病，包括使哺乳动物易患所讨论的疾病的那些病理状况。“赘生物”是组织的异常生长，通常但不总是形成肿块。当还形成肿块时，通常将其称为“肿瘤”。赘生物或肿瘤或可以是良性的、潜在恶性(癌前)或恶性的。恶性肿瘤通常被称为癌症。它们通常侵入并破坏周围组织并可形成转移瘤，即它们扩散到身体的其他部位、组织或器官。因此，术语“转移癌”包括原始肿瘤之外的其他组织或器官的转移瘤。淋巴瘤和白血病是淋巴样肿瘤。出于本发明的目的，它们也涵盖在术语“肿瘤”或“癌症”中。

在本发明优选的实施例中，肿瘤或癌症疾病是实体瘤疾病并且转移性癌症疾病可源自前述任一种。

与本发明有关的优选的肿瘤或癌症疾病选自由以下组成的组：乳腺癌、类癌、宫颈癌、结直肠癌、子宫内膜癌、胃部癌、头颈癌、间皮瘤、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、肾癌和胃癌。更优选地，肿瘤或癌症疾病(优选实体瘤疾病)可选自由以下组成的组：卵巢癌、胰腺癌、间皮瘤、肺癌、胃部癌和三阴性乳腺癌。转移性癌症疾病可源自前述的任一种。

本发明还提供治疗或缓解肿瘤或癌症疾病或转移性癌症疾病的方法，该方法包括向有需要的受试者施用本发明的多特异性抗体构建体或根据本发明的方法产生的多特异性抗体构建体的步骤。

术语“有需要的受试者”或“需要治疗”的那些术语包括已经患有该病症的那些受试者，以及要预防该病症的那些受试者。有需要的受试者或“患者”包括接受预防性或治疗性治疗的人和其他哺乳动物受试者。

本发明的多特异性抗体构建体通常以生物利用度和持久性的范围等被设计用于特定的施用途径和方法、特定的施用剂量和频率、特定疾病的特定治疗。组合物的材料优选以施用部位可接受的浓度配制。

因此，可以根据本发明设计制剂和组合物用于通过任何合适的施用途径递送。在本发明的上下文中，施用途径包括但不限于

·局部途径(如表皮、吸入、鼻、眼、耳(auricular/aural)、阴道、黏膜)；

·肠内途径(如口服、胃肠道、舌下、唇下部、经颊、直肠)；以及

·肠胃外途径(如静脉内、动脉内、骨内、肌内、脑内、脑室内、硬膜外、鞘内、皮下、腹膜内、羊膜外、关节内、心内、真皮内、病灶内、子宫内、膀胱内、玻璃体内、经皮、鼻内、经粘膜、滑膜内、管腔内)。

本发明的药物组合物和多特异性抗体构建体特别适用于肠胃外施用，例如皮下或静脉内递送，例如通过注射如弹丸注射或通过输注如连续输注。可以使用医疗设备施用药物组合物。用于施用药物组合物的医疗装置的实例描述于美国专利号4,475,196；4,439,196；4,447,224；4,447,233；4,486,194；4,487,603；4,596,556；4,790,824；4,941,880；5,064,413；5,312,335；5,312,335；5,383,851；和5,399,163中。

特别地，本发明提供了合适组合物的不间断施用。作为非限制性实例，不间断或基本上不间断的，即连续的施用可以通过患者佩戴的用于计量流入患者体内的治疗剂的小泵系统实现。包含本发明的多特异性抗体构建体的药物组合物可以通过使用所述泵系统施用。这种泵系统在本领域中通常是已知的，并且通常依赖于含有待输注的治疗剂的药筒的定期更换。当在这种泵系统中更换药筒时，治疗剂不间断流入患者体内可能会发生暂时中断。在这种情况下，在更换药筒之前的施用阶段和更换药筒之后的施用阶段仍将被认为是在本发明的药学手段和方法的含义内，其共同构成这种治疗剂的一种“不间断的施用”。

本发明的多特异性抗体构建体的可以通过流体递送设备或小泵系统来静脉内或皮下连续或不间断施用，该流体递送设备或小泵系统包括用于驱动流体离开储器的流体驱动机构和用于驱使驱动机构的驱使机构。用于皮下施用的泵系统可包括用于穿透患者皮肤并将合适的组合物递送到患者体内的针或套管。所述泵系统可以独立于静脉、动脉或血管直接固定或附接至患者的皮肤，从而允许泵系统与患者皮肤之间的直接接触。泵系统可以附接至患者的皮肤上24小时至数天。泵系统可以是小尺寸的，其中储器适用于小体积。作为非限制性实例，待施用的适合的药物组合物的储器容积可以为0.1与50ml之间。

连续施用也可以通过佩戴在皮肤上的贴剂进行透皮施用，并且每隔一段时间更换一次。本领域技术人员了解适用于该目的的用于药物递送的贴剂系统。值得注意的是，透皮施用尤其适用于不间断的施用，因为第一次耗尽的贴剂的更换可以有利地与例如在紧邻第一次耗尽的贴剂的皮肤表面上放置新的第二贴剂同时地且在去除第一次耗尽的贴剂之前立即完成。不会出现流量中断或电池故障的问题。

如果药物组合物已经冻干，则冻干材料首先在施用之前在合适的液体中重构。可以将冻干物质在例如抑菌注射用水(BWFI)、生理盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)或与冷冻干燥前蛋白质所处于的相同配制品中重构。

本发明的组合物可以以合适的剂量施用受试者，合适的剂量可以例如通过施用渐增剂量的本发明的多特异性抗体构建体(其显示出对于非黑猩猩灵长类动物例如猕猴的本文所述的跨物种特异性)的剂量递增研究来确定。如上所述，显示出本文所述的跨物种特异性的本发明的多特异性抗体构建体可有利地以相同形式用于非黑猩猩灵长类动物的临床前试验中以及作为药物用于人。剂量方案将由主治医师和临床因素确定。如在医学领域中熟知的，任何一个患者的剂量取决于许多因素，包括患者体型、体表面积、年龄、有待施用的具体化合物、性别、施用时间和途径、一般健康状况和同时施用的其他药物。

术语“有效剂量(effective dose或effective dosage)”定义为足以实现或至少部分实现所希望效应的量。术语“治疗有效剂量”定义为足以治愈或至少部分阻止已罹患疾病的患者的疾病及其并发症的量。对此用途有效的量或剂量将取决于有待治疗的病状(适应症)、递送的多特异性抗体构建体、治疗背景和目标、疾病的严重程度、先前疗法、患者的临床病史和对治疗剂的应答、施用途径、患者的体型(体重、体表或器官大小)和/或病状(年龄和一般健康状况)以及患者自体免疫系统的一般状态。可以根据主治医师的判断调整适当的剂量，使得其可以向患者一次施用或经一系列给药进行施用，并且目的是获得最佳治疗效果。

治疗有效量的本发明的多特异性抗体构建体优选导致疾病症状的严重程度降低、疾病无症状期的频率或持续时间增加或预防由于疾病痛苦引起的损伤或残疾。对于治疗表达MSLN的肿瘤，治疗有效量的本发明的多特异性抗体构建体例如抗MSLN/抗CD40多特异性抗体构建体优选将相对于未治疗的患者抑制细胞生长或肿瘤生长至少约20％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％。可以在预测在人肿瘤中的功效的动物模型中评价化合物抑制肿瘤生长的能力。

药物组合物可以作为唯一的治疗剂施用，或者根据需要与其他疗法如抗癌疗法(例如其他蛋白质和非蛋白质药物)结合施用。这些药物可以与包含本文所定义的本发明的多特异性抗体构建体的组合物同时施用，或者在给予所述多特异性抗体构建体之前或之后分别以时间限定的间隔和剂量施用。

如本文所用的，术语“有效和无毒剂量”是指耐受剂量的本发明多特异性抗体构建体，其足够高以引起病理细胞耗竭、肿瘤消除、肿瘤缩小或疾病稳定而不具有或本质上不具有主要毒性作用。这样的有效和无毒剂量可以例如通过本领域描述的剂量递增研究来确定，并且该有效和无毒剂量应低于诱导严重不良事件的剂量(剂量限制性毒性，DLT)。

如本文所用的，术语“毒性”是指在不良事件或严重不良事件中表现的药物的毒性作用。这些副作用可能是指施用后药物通常缺乏耐受性和/或缺乏局部耐受性。毒性可能还包括由药物引起的致畸或致癌作用。

如本文所用的，术语“安全性”、“体内安全性”或“耐受性”定义了在施用后没有立即引起严重不良事件(局部耐受)和在较长的用药期间不引起严重不良事件的情况下药物的施用。可以例如在治疗期间和随访期间定期评估“安全性”、“体内安全性”或“耐受性”。测量包括临床评估(例如器官表现)和实验室异常筛查。可以进行临床评估，并根据NCI-CTC和/或MedDRA标准记录/编码与正常发现的偏差。器官表现可包括诸如过敏/免疫学、血液/骨髓、心律失常、凝血等标准，如例如在不良事件的通用术语标准v3.0(CTCAE)中所述。可以测试的实验室参数包括例如血液学、临床化学、凝血谱和尿液分析以及其他体液(如血清、血浆、淋巴或脊髓液、液体等)的检查。因此可以评估安全性，例如通过体检、成像技术，即超声、X射线、CT扫描、核磁共振成像(MRI)、采用技术设备的其他措施(即心电图)、生命体征、通过测量实验室参数和记录不良事件。例如，可以通过组织病理学和/或组织化学方法检查非黑猩猩灵长类动物在根据本发明的用途和方法中的不良事件。以上术语也在以下中提及：例如Preclinical safety evaluation of biotechnology-derived pharmaceuticalsS6[生物技术衍生药物的临床前安全性评价S6]；ICH Harmonised Tripartite Guideline[ICH三方协调指南]；ICH Steering Committee meeting on July 16，1997[1997年7月16日的ICH指导委员会会议]。

在另外的实施例中，本发明提供了试剂盒，该试剂盒包含本发明的多特异性抗体构建体、根据本发明的方法产生的多特异性抗体构建体、本发明的多核苷酸、本发明的载体和/或本发明的宿主细胞。

在本发明的背景下，术语“试剂盒”意指两种或更多种组分(其中一种对应于本发明的多特异性抗体构建体、药物组合物、载体或宿主细胞)一起包装在容器、接受器或其他中。因此，试剂盒可以被描述为足以实现特定目标的一组产品和/或器具，其可以作为单个单元销售。

该试剂盒可以包含具有任何适当的形状、大小和材料(优选防水，例如塑料或玻璃)的一个或多个器皿(例如小瓶、安瓿、容器、注射器、瓶子、袋子)，该一个或多个器皿含有合适的施用剂量(见上文)的本发明的多特异性抗体构建体或药物组合物。试剂盒可另外包含使用说明书(例如以单页或安装手册的形式)、用于施用本发明的多特异性抗体构建体的装置(如注射器、泵、输注器等)、用于重构本发明的多特异性抗体构建体的装置和/或用于稀释本发明的多特异性抗体构建体的装置。

本发明还提供了用于单剂量施用单元的试剂盒。本发明的试剂盒还可以含有包含干燥/冻干的多特异性抗体构建体的第一器皿和包含水性制剂的第二器皿。在本发明的某些实施例中，提供了含有单室和多室预填充注射器(例如液体注射器和冻干注射器)的药剂盒。

实例

抗间皮素抗体的产生和表征

抗间皮素抗体产生。

如前所述(US20170029502A1)或通过对

转基因小鼠进行免疫接种来产生针对人类间皮素的完全人抗体(美国专利第6,114,598号；第6,162,963号；第6,833,268号；第7,049,426号；第7,064,244号，将其通过引用以其全文并入本文中；Green等人，1994，Nature Genetics[自然遗传学]7：13-21；Mendez等人，1997，Nature Genetics[自然遗传学]15：146-156；Green和Jakobovits，1998，J.Ex.Med[实验医学杂志]，188：483-495；Kellerman和Green，Current Opinion in Biotechnology[生物技术新观点]13，593-597，2002)。来自XMG4-K和XMG4-KL

品系的动物用于这些免疫接种。将动物用交替的可溶人间皮素-His和食蟹猴间皮素-His进行免疫接种。针对人间皮素和食蟹猕猴间皮素具有最高抗原特异性血清天然效价的动物用于产生杂交瘤(Kohler和Milstein，1975)。通过在合适的培养基(例如达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco′s ModifiedEagle Medium，DMEM)；加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen，Carlsbad，CA))中研磨，自淋巴组织解离来自脾脏和/或引流淋巴结的汇集的淋巴细胞(来自各次收获)。使用标准方法选择和/或扩增B细胞，且使用本领域中已知的技术与合适融合配偶体融合。然后选择与人间皮素和食蟹猴间皮素结合的杂交瘤上清液用于进一步表征。

抗间皮素抗体的测序。

对于

衍生抗体，使用Qiagen RNeasy mini或Invitrogen mRNAcatcher plus试剂盒，自含有产生抗间皮素抗体的杂交瘤细胞的孔纯化RNA(总RNA或mRNA)。经纯化的RNA用于使用经由逆转录的cDNA合成、接着聚合酶链反应(RT-PCR)来扩增抗体重链和轻链可变区(V)基因。使用Qiagen单步逆转录酶PCR试剂盒(凯杰公司(Qiagen))获得完全人抗体γ重链。使用Qiagen单步逆转录酶PCR试剂盒(凯杰公司(Qiagen))获得完全人κ轻链。通过生物信息学方法，自对应核酸序列推导出氨基酸序列。接着分析衍生的氨基酸序列，以确定抗体的种系序列起源，且鉴别与种系序列的偏差。将对应于测序抗体的互补决定区(CDR)的氨基酸序列比对，且这些比对用于通过类似性将纯系分组。

抗体产生。

将选择的和测序的抗间皮素抗体重链和轻链亚克隆到哺乳动物表达载体中，并且产生并纯化个别抗体。将所有抗体用人IgG1 SEFL2(REF)重链序列重新转换。

抗体与人和食蟹猴间皮素的结合。

抗间皮素抗体与人间皮素的结合通过流式细胞术在工程化以表达人间皮素的CHO细胞(huMSLN-CHO)上证实。将人MSLN转染的CHO细胞用各种浓度的纯化的抗间皮素抗体孵育，洗涤，并且用对人IgG特异性的荧光共轭的第二抗体标记。然后通过流式细胞术分析细胞。将荧光阳性细胞的百分比相对于抗体浓度作图(图1)并且使用Prism GraphPad软件确定EC50(表1)。还通过Octet测定(表1)、量化结合率(Kon)、解离率(Kdis)和平衡结合常数(KD)测量了抗人间皮素抗体与重组人和食蟹猴(cyno)间皮素的可溶形式的结合亲和力。这些数据表明所有抗MSLN抗体与人和食蟹猴间皮素两者结合。

表1.抗MSLN抗体与人和食蟹猴间皮素(MSLN)的结合

抗CD40激动剂抗体的产生和表征

抗CD40抗体产生。

通过对

转基因小鼠进行免疫接种来产生针对人CD40的完全人抗体(美国专利第6,114,598号；第6,162,963号；第6,833,268号；第7,049,426号；第7,064,244号，将其通过引用以其全文并入本文中；Green等人，1994，Nature Genetics[自然遗传学]7：13-21；Mendez等人，1997，Nature Genetics[自然遗传学]15：146-156；Green和Jakobovits，1998，J.Ex.Med[实验医学杂志]，188：483-495；Kellerman和Green，CurrentOpinion in Biotechnology[生物技术新观点]13，593-597，2002)。来自XMG4-K和XMG4-KL

品系的动物用于这些免疫接种。多种免疫原和免疫途径用于产生抗人CD40免疫应答。对于可溶性重组蛋白免疫，将小鼠用交替的可溶性人CD40-Fc和食蟹猕猴CD40-Fc进行免疫接种。对于基于细胞的免疫，将CHO-S细胞用野生型人CD40或食蟹猴CD40作为免疫原的来源短暂转染。将动物用这些短暂转染的CHO细胞免疫接种。针对人CD40和食蟹猕猴CD40具有最高抗原特异性血清天然效价的动物用于产生杂交瘤(Kohler和Milstein，1975)。通过在合适的培养基(例如达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco′sModified Eagle Medium，DMEM)；加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen，Carlsbad，CA))中研磨，自淋巴组织解离来自脾脏和/或引流淋巴结的汇集的淋巴细胞(来自各次收获)。使用标准方法选择和/或扩增B细胞，且使用本领域中已知的技术与合适融合配偶体融合。鉴定与人和食蟹猴CD40结合的杂交瘤上清液。

抗体产生。

选择显示与人和食蟹猴CD40结合的杂交瘤上清液用于产生纯化的抗CD40抗体(使用本领域已知的技术)(表2)。

表2.抗CD40抗体

与人和食蟹猴CD40结合的抗CD40抗体。

通过Octet测定(表3)、量化结合率(Kon)、解离率(Kdis)和平衡结合常数(KD)测量了抗人CD40抗体与人和食蟹猴(cyno)CD40的结合亲和力。通过在HEK293细胞上表达人TNFR1、TNFR2、TNFR10或TNFR14(通过瞬时转染编码这些基因的表达载体)来评估抗CD40抗体与相关TNF受体超家族(TNFRSF)成员的交叉反应性。通过流式细胞术确定显示的抗人CD40抗体与这些转染细胞的结合。计算的相对于对照细胞的荧光强度的几何平均值表明抗CD40与其他TNFRSF成员的最小化结合(表4)。通过在HEK293细胞上表达食蟹猴或小鼠CD40(通过瞬时转染编码这些基因的表达载体)来计算抗CD40抗体与食蟹猴和小鼠CD40的交叉反应性。通过流式细胞术确定显示的抗人CD40抗体与过表达食蟹猴和小鼠CD40的细胞的结合。计算的相对于对照细胞的荧光强度的几何平均值表明抗CD40与食蟹猴(cyno)CD40稳健的结合，但不与小鼠CD40结合(表5)。总体而言，这些数据表明抗CD40抗体与人和食蟹猴CD40的强的和等效的结合，但是与相关的TNFRSF成员或小鼠CD40的最小化结合。

表3.抗CD40抗体与人和食蟹猴CD40的结合亲和力

表4.与相关的TNF受体超家族成员结合的抗CD40抗体的存在(相对于对照值的倍数)

抗体ID	TNFR1	TNFR2	TNFR10	TNFR14
					29H10	0.98	0.88	0.89	0.84
4G7	0.97	0.90	0.87	0.89
					33H6	1.00	0.81	0.77	0.80
35F11	1.00	0.85	0.73	0.74
					30A12	1.07	0.89	0.91	0.96
36F3	0.99	0.92	0.86	0.88
					39C2	1.00	0.90	0.86	0.89
33H9	1.03	0.93	0.89	0.88
					37A6	0.99	0.87	0.88	0.87

表5.抗CD40抗体与食蟹猴和小鼠CD40的物种交叉反应性(相对于对照值的倍数)

抗体ID	食蟹猴	小鼠
			29H10	71	0.8
4G7	57	0.9
			33H6	74	0.9
35F11	76	0.8
			30A12	71	1.3
36F3	82	0.9
			39C2	87	0.9
33H9	73	0.9
			37A6	92	0.9

通过抗CD40抗体的CD40的交联依赖性激活。

CD40受体对人B细胞的刺激导致激活和增殖。将纯化的原代人B细胞接种到384孔测定板中并且用IL-4/IL-21(作为共分裂原)、不同浓度的抗CD40抗体、和蛋白质G存在(图2A)或不存在(图2B)下处理。蛋白质G的单个分子能结合多个IgG分子并且因此可以在溶液中交联抗体。将细胞孵育5天并且使用CellTiter-Glo检查细胞增殖。由于检查的所有抗CD40抗体均是IgG4，因此将无关的IgG4同型抗体作为阴性对照包括。计算EC50和最大活性百分比(表6)。所有抗CD40抗体在蛋白质G存在下均诱导B细胞的稳健增殖但是在蛋白质G不存在下具有最小的活性，这表明仅与CD40结合的抗CD40抗体不足以刺激CD40，并且需要另外的交联的抗体。

表6.在人B细胞功能测定中具有或不具有交联的抗CD40抗体的活性

抗CD40抗体对人CD40配体与人CD40结合的影响。

为了评估抗CD40抗体阻断CD40配体与CD40相互作用的能力，进行了基于流式细胞术的配体结合测定，以测量荧光标记的可溶性人CD40L与在293T细胞(通过用编码此基因的表达载体转染)上过表达的人CD40的结合。将百分比配体结合抑制计算为[(在抗CD40不存在下的结合gMFI的CD40L)-(在抗CD40存在下的结合gMFI的CD40L)]/(在抗CD40不存在下的结合gMFI的CD40L)。gMFI：几何平均荧光强度。所有抗CD40抗体均显示对CD40L结合至CD40受体的能力的最小影响(表7)。

表7.抗CD40抗体不阻断CD40-CD40L相互作用

抗入CD40抗体对CD40L-诱导的B细胞激活的影响。

一些对TNFRSF成员具有特异性的抗体已显示可通过其正常配体，可能通过聚集受体并且降低配体诱导的激活的阈值来增强受体的激活。为了评估抗CD40抗体增强CD40配体活性的能力，将纯化的原代人B细胞在1ug/ml的显示的CD40抗体存在或不存在下用各种浓度的重组人CD40L处理。将细胞孵育5天并且使用CellTiter-Glo检查细胞增殖。无抗CD40抗体诱导CD40配体的EC50的显著改变，以刺激人B细胞的增殖(表8)。

表8.抗CD40抗体不加强CD40L的活性

抗CD40抗体的测序。

使用Qiagen RNeasy mini或Invitrogen mRNA catcher plus试剂盒，自含有产生抗间皮素抗体的杂交瘤细胞的孔纯化RNA(总RNA或mRNA)。经纯化的RNA用于使用经由逆转录的cDNA合成、接着聚合酶链反应(RT-PCR)来扩增抗体重链和轻链可变区(V)基因。使用Qiagen单步逆转录酶PCR试剂盒(凯杰公司(Qiagen))获得完全人抗体γ重链。使用Qiagen单步逆转录酶PCR试剂盒(凯杰公司(Qiagen))获得完全人κ轻链。通过生物信息学方法，自对应核酸序列推导出氨基酸序列。接着分析衍生的氨基酸序列，以确定抗体的种系序列起源，且鉴别与种系序列的偏差。将对应于测序抗体的互补决定区(CDR)的氨基酸序列比对，且这些比对用于通过类似性将纯系分组。

抗CD40抗体序列的优化。

通过标准重组DNA技术进行选择抗CD40抗体的工程化以去除抗体重和轻链可变区中的潜在的序列责任(sequence liabilities)。这些抗体通过在细胞系中过表达来产生，并且使用本领域已知的技术纯化。如上所述，然后在具有和不具有蛋白质G交联的人B细胞增殖测定中评估纯化的抗体。计算EC50和最大活性百分数(表9)，其显示工程化的抗体变体维持与其亲本抗体序列相似的交联依赖性激动剂活性。

表9.抗CD40抗体的工程化变体的功能活性

靶向间皮素的CD40激动剂二价双特异性抗体的产生和表征

双特异性抗体产生。

为了产生间皮素依赖性CD40激动剂，使用以上所述的抗间皮素和抗CD40抗体的可变区结合结构域，生成了IgG-Fab形式(图3A)或IgG-scFv形式(图3B)的能与人间皮素和人CD40结合的二价双特异性抗体。

IgG-Fab形式的间皮素x CD40双特异性激动剂抗体的产生和评估。

将间皮素x CD40双特异性抗体的小图以IgG-Fab形式(表10)产生并且使用Octet测定评估与人和食蟹猴CD40以及人和食蟹猴间皮素的可溶性形式的结合(表11)。计算结合速率(K_on)、解离速率(K_dis)、和平衡结合常数(K_D)。大多数双特异性抗体显示与人和食蟹猴CD40和间皮素两者的高亲和力结合。接下来，针对其诱导人B细胞的间皮素依赖性激活的能力评估这些双特异性抗体。将表达人间皮素CHO细胞接种在96孔板中。第二天，将不同浓度的间皮素x CD40 IgG-Fab抗体添加至具有纯化的人B细胞的孔中，并且将板孵育另外的48小时。通过流式细胞术在B细胞上量化CD86(CD40介导的B细胞激活的标记物)的上调。计算对于CD86上调的EC50值，并且该值表明大多数间皮素x CD40IgG-Fab双特异性抗体在表达人间皮素的CHO细胞存在下能够B细胞激活(表12)。

表10.抗CD40xMSLN IgG-Fab分子

表12.在表达人间皮素的CHO细胞存在下，人B细胞中的抗CD40xMSLN IgG-Fab分子功能活性

IgG-scFv形式的间皮素x CD40双特异性激动剂抗体的产生和评估。

将间皮素x CD40双特异性抗体的小图以IgG-scFv形式(表13)产生并且使用Octet测定评估与人和食蟹猴CD40以及人和食蟹猴间皮素的可溶性形式的结合(表14)。计算结合速率(Kon)、解离速率(Kdis)、和平衡结合常数(KD)。大多数双特异性抗体显示与人和食蟹猴CD40和间皮素两者的高亲和力结合。接下来，针对其诱导人B细胞的间皮素依赖性激活的能力评估这些双特异性抗体。将表达人间皮素CHO细胞接种在96孔板中。第二天，将不同浓度的间皮素x CD40 IgG-scFv抗体添加至具有纯化的人B细胞的孔中，并且将板孵育另外的48小时。通过流式细胞术在B细胞上量化CD86(CD40介导的B细胞激活的标记物)的上调。计算对于CD86上调的EC50值，并且该值表明大多数间皮素x CD40 IgG-scFv双特异性抗体在表达人间皮素的CHO细胞存在下能够B细胞激活(表15)。

表13.抗CD40xMSLN IgG-scFv分子

表15.在表达人间皮素的CHO细胞存在下，人B细胞中的抗CD40xMSLN IgG-scFv分子功能活性

抗体ID	EC50(nM)
		6028-2	0.012240302
6030-2	0.010141789
		6032-2	0.009349861
6043-2	0.007758607
		6044-2	0.005001671
6033-2	0.006030707
		6034-2	0.007262489
6035-2	0.016708182
		6056-2	0.004577206
6039-2	0.003317003
		6040-2	0.002665906
6041-2	0.004479453
		6042-2	0.003988474
6045-2	0.004663271
		6046-2	0.004723116
6047-2	0.005131571
		6048-2	0.004342491
6049-2	0.005853663
		6050-2	0.003388309
6051-2	0.003753076
		6052-2	0.003155443
6055-2	0.004340411
		6054-2	0.003331971
6053-2	0.004033184
		6023-2	0.002805537

IgG-scFv形式的间皮素x CD40双特异性激动剂抗体的序列优化

通过标准重组DNA技术进行选择间皮素x CD40双特异性IgG-scFv抗体的工程化以去除抗体重和轻链可变区中的潜在的序列责任。这些抗体通过在细胞系中过表达来产生，并且使用本领域已知的技术纯化。接下来，针对其诱导人B细胞的间皮素依赖性激活的能力评估这些双特异性抗体。将表达人间皮素CHO细胞接种在96孔板中。第二天，将不同浓度的间皮素x CD40 IgG-scFv序列变体抗体添加至具有纯化的人B细胞的孔中，并且将板孵育另外的48小时。通过流式细胞术在B细胞上量化CD86(CD40介导的B细胞激活的标记物)的上调。计算对于CD86上调的EC50值，并且该值表明大多数间皮素x CD40 IgG-scFv序列变体双特异性抗体在表达人间皮素的CHO细胞存在下维持诱导B细胞激活的能力(表16)。

表16.在表达人间皮素的CHO细胞存在下，人B细胞中的序列优化的抗CD40xMSLNIgG-scFv分子功能活性

在人B细胞功能测定中，不同水平的间皮素对选择间皮素x CD40双特异性抗体活性的影响

将MC38细胞工程化以表达范围从低(MC38.MSLN1)至高(MC38.MSLN5)的不同水平的人间皮素。鉴于MC38细胞源自小鼠，其不表达人间皮素(图4)。将表达不同水平人间皮素的亲本MC38细胞和MC38细胞接种至96孔板并培养过夜。第二天，将间皮素x CD40双特异性抗体以不同浓度添加至细胞。然后将分离的人B细胞添加至孔中并且将板孵育另外的48小时。B细胞中CD86的上调通过流式细胞术评估并且用作B细胞激活的量度。计算EC50和最大活性(Emax)值，并且表明间皮素x CD40双特异性抗体能在所有水平的MSLN表达中诱导B细胞激活(表17)。如通过B细胞中的CD86上调的几何平均荧光强度测量的，表达低水平的间皮素的细胞系诱导较低的间皮素x CD40双特异性抗体的最大活性。在亲本MC38细胞存在下，间皮素x CD40双特异性抗体无活性，这与针对CD40激动剂活性的这些分子的间皮素依赖性活性一致。

在单核细胞衍生的树突状细胞功能测定中，不同水平的间皮素对选择间皮素xCD40双特异性抗体活性的影响。

将工程化以表达不同水平的人间皮素的MC38细胞(图4)或亲本MC38细胞接种在96孔板中并过夜培养。第二天，将间皮素x CD40双特异性抗体以不同浓度添加至细胞。将使用GMCSF和IL4的从人单核细胞分化的单核细胞衍生的树突状细胞添加到孔中并将板孵育另外的48小时。收集来自每个孔的上清液并且使用ELISA试剂盒定量从树突状细胞分泌的IL12p40的浓度。计算EC50和最大活性(Emax)值，并且表明间皮素x CD40双特异性抗体能在高和低水平的MSLN表达中诱导树突状细胞激活(表17)。表达低水平的间皮素的细胞系诱导较低的间皮素x CD40双特异性抗体的最大活性。在亲本MC38细胞存在下，间皮素x CD40双特异性抗体无活性，这与针对CD40激动剂活性的这些分子的间皮素依赖性活性一致。

选择间皮素x CD40双特异性抗体在用表达间皮素的食蟹猴CHO细胞的食蟹猴B细胞功能测定中的活性。

将工程化以表达食蟹猴间皮素的CHO细胞接种在96孔板中并培养过夜。第二天，将选择间皮素x CD40双特异性抗体以不同浓度添加至细胞。然后将分离的食蟹猴B细胞添加至孔中并且将板孵育另外的48小时。食蟹猴B细胞中CD23的上调通过流式细胞术评估并且用作CD40诱导的B细胞激活的量度。计算EC50，并且该值表明间皮素x CD40双特异性抗体能诱导在食蟹猴间皮素存在下的食蟹猴B细胞的激活(表18)。

表18.在用表达食蟹猴间皮素的CHO细胞刺激的食蟹猴B细胞中的抗CD40xMSLN双特异性分子的活性

抗体ID	EC50(nM)
		6041	0.0012
8765	0.0013
		8766	0.0016
8767	0.0014
		8945	0.0018
8947	0.0014

间皮素x CD40双特异性抗体在小鼠中的药代动力学和稳定性。

为了表征间皮素x CD40双特异性抗体体内的稳定性，将选择的间皮素x CD40双特异性分子注射入小鼠(1mg/kg剂量)。注射后在不同的时间点将动物放血并且分离血清。免疫测定被用于量化血清中间皮素x CD40双特异性抗体的浓度，用人CD40捕获并且用抗人IgG检测、或用人间皮素捕获并且用抗人IgG检测。这两种测定法的组合提供了检测分子降解或不稳定性的能力。CD40或间皮素捕获测定产生相当的结果，表明分子在体内14天的过程中保持完整(图5)。除一个分子外，所有分子均具有相似的药代动力学特性。

在小鼠模型中，靶向肿瘤的CD40激动剂双特异性抗体的免疫刺激和抗肿瘤活性

小鼠替代的人EPCAM依赖性CD40激动剂双特异性抗体和表达人EPCAM的小鼠肿瘤细胞系的产生。

抗小鼠CD40激动剂抗体(克隆FGK45)和抗人EPCAM抗体(克隆4-7)被用于产生替代的具有小鼠IgG1 N297G Fc结构域的IgG-scFv形式的CD40双特异性抗体(抗muCD40 xhuEPCAM双特异性抗体)。双特异性抗体含有在分子的N-末端的抗CD40和在分子的C-末端的抗EPCAM(如scFv)。通过用编码人EPCAM和人截短的神经生长因子受体(NGFR)报告基因的逆转录病毒转导，人EPCAM在小鼠MC38结肠癌细胞系和小鼠B16F10黑色素瘤细胞系中过表达(图6)。将人EpCAM-MC38或人EpCAM-B16肿瘤细胞以每个植入物3e5个细胞接种在右侧，并分别允许生长24天或11天。用数字卡尺每周两次测量肿瘤，表明表达人EPCAM的肿瘤细胞系维持了在小鼠中生长和形成肿瘤的能力。从小鼠收获并且进行酶解离的肿瘤的流式细胞术表明，在体内肿瘤形成期间，人EPCAM表达在肿瘤细胞表面上维持(图6)。

小鼠B细胞上EPCAM x CD40激动剂抗体的人EPCAM-依赖性激动剂活性。

将人EpCAM过表达MC38细胞(huEpCAM-MC38)或亲本MC38细胞接种在96孔中并培养过夜。第二天，将抗muCD40 x huEPCAM双特异性抗体、亲本抗CD40抗体(FGK54)、或同型对照抗体以各种浓度添加至细胞中。然后将分离的小鼠B细胞添加至孔中并且将板孵育另外的48小时。B细胞中CD86的上调通过流式细胞术评估并且用作B细胞激活的量度。计算EC50值并且该值表明抗muCD40 x huEPCAM双特异性抗体能诱导小鼠B细胞激活(图7)。与FGK45抗CD40单克隆抗体相比，抗muCD40 x huEPCAM双特异性抗体显示稳健的激动剂活性，该活性取决于人EPCAM的存在并且在激活B细胞中显示显著更高的效力。

在MC38肿瘤模型中，抗muCD40 x huEPCAM双特异性抗体的体内免疫刺激活性

为了评估靶向肿瘤的CD40激动剂双特异性抗体对体内的免疫细胞激活的影响，将表达人EpCAM的MC38肿瘤细胞以每个植入物3e5个细胞接种到小鼠的右侧并且允许其生长8-10天。然后通过肿瘤体积(60-100mm3)将小鼠随机化并且以5mg/kg腹膜内施用的指定抗体进行处理。在处理24-48小时后收获肿瘤、肿瘤引流淋巴结(dLN)和非引流淋巴结(ndLN)，并且通过酶消化组织制备单细胞悬浮液。进行流式细胞术分析以确定细胞比例和表型，表面免疫细胞谱系标记物和激活标记物的染色，以及细胞内细胞因子(图8)。如预期，CD40激动剂抗体(抗CD40)处理激活位于肿瘤和包括dLN和ndLN的周围组织中的树突状细胞(DC)。相反，抗muCD40 x huEPCAM双特异性抗体仅激活表达人EPCAM的MC38肿瘤中肿瘤浸润DC，但不激活外周组织(dLN和ndLN)中的DC(图8A)。此外，抗muCD40 x huEPCAM双特异性抗体增加肿瘤中CD8T细胞与调节性T细胞的比率、和产生干扰素γ(IFNg)的CD4+ T细胞(图8B)。还从用指定抗体治疗的表达huEpCAM的MC38荷瘤小鼠的脾脏中分离出总T细胞。通过与重组的GM-CSF和IL4孵育7天，从初始的C57BL/6骨髓细胞产生骨髓衍生的树突状细胞(BMDC)。将BMDC用指定肿瘤细胞脉冲过夜，并且然后与分离的T细胞共培养18小时。将ELISPOT测定用于测量通过抗原特异性T细胞产生的IFNg，表明抗muCD40 x huEPCAM双特异性抗体显著增加对表达人EPCAM的MC38和亲本MC38抗原具有特异性的T细胞(图9)。总体而言，这些数据表明靶向肿瘤的CD40激动剂双特异性抗体可以以肿瘤相关的抗原依赖性方式激活肿瘤中的骨髓群体(如DC)，导致增强的抗肿瘤T细胞应答。

在B16F10肿瘤模型中，抗muCD40 x huEPCAM双特异性抗体的体内免疫刺激活性

为了评估靶向肿瘤的CD40激动剂双特异性抗体对另外的肿瘤模型中的免疫细胞激活的影响，将载体对照或表达人EpCAM的B16F10肿瘤细胞以每个植入物3e5个细胞接种到小鼠的右侧并且允许其生长8-10天。然后通过肿瘤体积(60-100mm3)将小鼠随机化并且以5mg/kg腹膜内施用的指定抗体进行处理。在处理24-48小时后收获肿瘤、dLN和ndLN，并且通过酶消化组织制备单细胞悬浮液。进行流式细胞术分析以确定细胞比例和表型，表面免疫细胞谱系标记物和激活标记物的染色，以及细胞内细胞因子(图10)。如预期，CD40激动剂抗体(抗CD40)治疗的DC位于肿瘤和周围组织(包括在亲本huEpCAM阴性B16F10肿瘤和在表达huEpCAM的B16F10肿瘤中的dLN和ndLN)。相反，抗muCD40 x huEPCAM双特异性抗体仅激活在表达huEpCAM的B16F10肿瘤中肿瘤浸润DC，但不激活亲本huEpCAM-B16F10肿瘤中的DC。抗muCD40 x huEPCAM双特异性抗体不激活dLN或ndLN中的DC，无论这些小鼠是否具有表达人EPCAM或不表达人EPCAM的B16F10肿瘤(图10A)。另外，抗muCD40 x huEPCAM双特异性抗体在表达人EPCAM的B16F10肿瘤中增加了产生IFNg的效应子CD4+和CD8+ T细胞，但在亲本B16F10肿瘤中不增加(图10B)。这些数据提供了另外的证据，该证据表明靶向肿瘤的CD40激动剂双特异性抗体可以以肿瘤相关抗原依赖性方式激活肿瘤浸润免疫细胞以增强抗肿瘤T细胞应答。

抗muCD40 x huEPCAM双特异性抗体不在小鼠中诱导全身血清细胞因子的上调或肝损伤

CD40激动剂抗体在临床试验中显示剂量限制性毒性，包括肝损伤和升高的血清细胞因子水平，这可能是由于全身免疫细胞激活。为了比较非靶向CD40激动剂抗体和靶向肿瘤的CD40激动剂双特异性抗体之间的全身免疫细胞激活和肝损伤，将携带已建立的表达人EPCAM的MC38肿瘤(上述)的小鼠用非特异性同型对照抗体、鼠CD40激动剂抗体(抗CD40)、在Fc结构域中携带突变(降低Fc受体结合使抗体为弱激动剂)的CD40抗体(抗CD40 N297G)、或抗muCD40 x huEPCAM双特异性抗体(抗CD40xhuEPCAM)处理，并且在24-48小时后收集血清。使用小鼠细胞因子/趋化因子多重测定试剂盒测量选择细胞因子的浓度。抗CD40抗体增加小鼠血清中几种促炎性细胞因子的浓度，与全身免疫细胞激活一致。相反，抗CD40 N297G和抗muCD40 x huEPCAM双特异性抗体不诱导增加的血清细胞因子浓度(图11A)。在B16F10肿瘤模型中观察到相似的结果，其中，与非靶向的抗CD40抗体相比，抗muCD40 x huEPCAM双特异性抗体在携带载体对照B16F10肿瘤的小鼠或携带表达人EPCAM的B16F10肿瘤的小鼠中均未引起血清细胞因子浓度增加(图11B)。还将携带表达人EPCAM的MC38肿瘤并且用抗CD40激动剂抗体或抗muCD40 x huEPCAM双特异性抗体处理的小鼠的肝脏固定在10％中性缓冲福尔马林中，在石蜡中包埋，切片，并用苏木精与伊红染色以用于组织学分析。尽管抗CD40激动剂抗体在肝脏中诱导了多灶性单核细胞浸润并且这些肝脏含有单细胞坏死图像，但来自抗muCD40 x huEPCAM双特异性抗体处理的小鼠的肝脏不显示任何可区分的组织病理学变化(图11C)。综上所述，这些数据表明靶向肿瘤的CD40激动剂抗体能诱导肿瘤中的局部免疫细胞激活，而不导致全身细胞因子产生或与抗CD40介导的毒性相关的肝损伤。

小鼠肿瘤模型中人EPCAMx鼠CD40双特异性抗体的抗肿瘤作用

为了评估靶向肿瘤的CD40激动剂抗体对肿瘤生长的免疫介导的抑制的作用和此治疗方法与免疫检查点抑制剂PD1的阻断结合的潜力，将携带表达人EPCAM的MC38肿瘤的小鼠用同型对照抗体、抗CD40激动剂抗体、抗PDL1(阻断PD1与PDL1之间的相互作用)、抗muCD40 x huEPCAM双特异性抗体、抗CD40与抗PDL1的组合、和抗muCD40 x huEPCAM双特异性抗体与抗PDL1的组合处理(图12)。相对于同型对照抗体处理，用抗CD40激动剂抗体或抗PDL1阻断抗体的单剂处理对肿瘤生长(图12A)或改进存活(图12B)具有最小的影响，而抗CD40激动剂和抗PDL1的组合显著抑制肿瘤生长。与其他单一疗法处理相比，用抗muCD40 xhuEPCAM双特异性激动剂抗体的处理显著抑制肿瘤生长并且增加动物存活。此外，抗muCD40x huEPCAM双特异性抗体与抗PDL1的组合导致肿瘤的完全消退，所有动物都存活到研究结束。将这些完全响应的动物圈养3个月(无处理并且无肿瘤复发的迹象)，之后，将它们用表达人EPCAM的MC38肿瘤细胞或B16F10肿瘤细胞进行肿瘤再激发(图13)。这些动物完全拒绝表达人EpCAM的MC38肿瘤细胞，而对照B16F10肿瘤如预期的生长。在年龄匹配的对照动物中，两种肿瘤细胞系均按预期的生长，这些对照动物先前未暴露于表达人EPCAM的MC38肿瘤或抗muCD40 x huEPCAM双特异性抗体。总体而言，这些数据表明靶向肿瘤的CD40激动剂抗体疗法可以增强抗肿瘤免疫应答，导致已建立的肿瘤消退(通过与PD1/PDL1阻断组合而进一步增强)。此外，靶向肿瘤的CD40激动剂处理与PD1/PDL1阻断的组合可诱导持久的免疫记忆，该免疫记忆防止随后的肿瘤再激发。

本文讨论和引用的所有出版物、专利和专利申请均通过引用以其整体结合在此。应理解，披露的发明不限于所描述的特定方法、方案和材料，因为这些可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，并且不意图限制所附权利要求的范围。

本领域技术人员将认识到，或能够仅使用常规试验确定本文所述的本发明的具体实施例的许多等效内容。此类等效物旨在由以下权利要求所涵盖。

Claims

1.一种多特异性抗体构建体，该多特异性抗体构建体包含：

(i)含有两个轻链和两个重链的第一抗体，其中

这些轻链包含第一可变区(VL1)和轻链恒定区(CL)；

这些重链包含第一重可变区(VH1)和CH1、铰链、CH2、和CH3区；

这些重链包含至少一个氨基酸取代，与未取代的重链相比，该取代导致该重链对人FcγRI受体的结合亲和力降低；和

其中该scFv在其氨基末端通过第二肽接头与每个重链的羧基末端融合，以形成重链融合蛋白；并且

其中该第一抗体特异性地结合至并激动人CD40(SEQ ID NO:1)，并且该scFv特异性地结合至人间皮素(MSLN)(SEQ ID NO:2)。

2.如权利要求1所述的抗体构建体，其中该两个轻链相同并且该两个重链融合蛋白相同。

3.如任一前述权利要求所述的抗体构建体，其中该重链包含选自由以下组成的组的氨基酸取代：

(i)N297G或N297A；

(ii)L234A和L235A；和

(iii)R292C和V302C；

其中该氨基酸编号是根据Kabat的EU编号。

4.如权利要求3所述的抗体构建体，其中该重链包含N297G、R292C、和V302C突变，其中该氨基酸编号是根据Kabat的EU编号。

5.如任一前述权利要求所述的抗体构建体，其中

该VL1包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3：

分别是SEQ ID NO:58、59、和60；

分别是SEQ ID NO:64、65、和66；

分别是SEQ ID NO:70、71、和72；

分别是SEQ ID NO:76、77、和78；

分别是SEQ ID NO:82、83、和84；

分别是SEQ ID NO:88、89、和90；

分别是SEQ ID NO:94、95、和96；

分别是SEQ ID NO:100、101、和102；

分别是SEQ ID NO:106、107、和108；

分别是SEQ ID NO:112、113、和114；

分别是SEQ ID NO:118、119、和120；

分别是SEQ ID NO:124、125、和126；和

分别是SEQ ID NO:130、131、和132；

该VH1包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3：

分别是SEQ ID NO:136、137、和138；

分别是SEQ ID NO:142、143、和144；

分别是SEQ ID NO:148、149、和150；

分别是SEQ ID NO:154、155、和156；

分别是SEQ ID NO:160、161、和162；

分别是SEQ ID NO:166、167、和168；

分别是SEQ ID NO:172、173、和174；

分别是SEQ ID NO:178、179、和180；

分别是SEQ ID NO:184、185、和186；

分别是SEQ ID NO:190、191、和192；

分别是SEQ ID NO:196、197、和198；

分别是SEQ ID NO:202、203、和204；和

分别是SEQ ID NO:208、209、和210；

该VL2包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3：

分别是SEQ ID NO:230、231、和232；

分别是SEQ ID NO:236、237、和238；

分别是SEQ ID NO:242、243、和244；和

分别是SEQ ID NO:248、249、和250；

并且VH2包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3：

分别是SEQ ID NO:254、255、和256；

分别是SEQ ID NO:260、261、和262；

分别是SEQ ID NO:266、267、和268；和

分别是SEQ ID NO:272、273、和274。

6.如任一前述权利要求所述的抗体构建体，其中

1)该VL1和VH1选自由以下组成的组：

a)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL1：分别是SEQ ID NO:58、59、和60；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH1：分别是SEQ ID NO:136、137、和138；

b)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL1：分别是SEQ ID NO:64、65、和66；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH1：分别是SEQ ID NO:142、143、和144；

c)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL1：分别是SEQ ID NO:70、71、和72；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH1：分别是SEQ ID NO:148、149、和150；

d)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL1：分别是SEQ ID NO:76、77、和6780；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH1：分别是SEQ ID NO:154、155、和156；

e)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL1：分别是SEQ ID NO:82、83、和84；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH1：分别是SEQ ID NO:160、161、和162；

f)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL1：分别是SEQ ID NO:88、89、和90；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH1：分别是SEQ ID NO:166、167、和168；

g)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL1：分别是SEQ ID NO:94、95、和96；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH1：分别是SEQ ID NO:172、173、和174；

h)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL1：分别是SEQ ID NO:100、101、和102；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH1：分别是SEQ ID NO:178、179、和180；

i)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL1：分别是SEQ ID NO:106、107、和108；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH1：分别是SEQ ID NO:184、185、和186；

j)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL1：分别是SEQ ID NO:112、113、和114；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH1：分别是SEQ ID NO:190、191、和192；

k)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL1：分别是SEQ ID NO:118、119、和120；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH1：分别是SEQ ID NO:196、197、和198；

l)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL1：分别是SEQ ID NO:124、125、和126；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH1：分别是SEQ ID NO:202、203、和204；和

m)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL1：分别是SEQ ID NO:130、131、和132；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH1：分别是SEQ ID NO:208、209、和210；

并且

2)该VL2和VH2选自由以下组成的组：

a)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL2：分别是SEQ ID NO:230、231、和232；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH2：分别是SEQ ID NO:254、255、和256；

b)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL2：分别是SEQ ID NO:236、237、和238；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH2：分别是SEQ ID NO:260、261、和262；

c)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL2：分别是SEQ ID NO:242、243、和244；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH2：分别是SEQ ID NO:266、267、和268；和

d)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL2：分别是SEQ ID NO:248、249、和250；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH2：分别是SEQ ID NO:272、273、和274。

7.如任一前述权利要求所述的抗体构建体，其中

该VL1包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、49、和53；

该VH1包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、和54；

该VL2包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:213、217、221、和225；

该VH2包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:214、218、222、和226。

8.如任一前述权利要求所述的抗体构建体，其中

1)该VL1和VH1选自由以下组成的组：

a)包含SEQ ID NO:5的VL1和包含SEQ ID NO:6的VH1；

b)包含SEQ ID NO:9的VL1和包含SEQ ID NO:10的VH1；

c)包含SEQ ID NO:13的VL1和包含SEQ ID NO:14的VH1；

d)包含SEQ ID NO:17的VL1和包含SEQ ID NO:18的VH1；

e)包含SEQ ID NO:21的VL1和包含SEQ ID NO:22的VH1；

f)包含SEQ ID NO:25的VL1和包含SEQ ID NO:26的VH1；

g)包含SEQ ID NO:29的VL1和包含SEQ ID NO:30的VH1；

h)包含SEQ ID NO:33的VL1和包含SEQ ID NO:34的VH1；

i)包含SEQ ID NO:37的VL1和包含SEQ ID NO:38的VH1；

j)包含SEQ ID NO:41的VL1和包含SEQ ID NO:42的VH1；

k)包含SEQ ID NO:45的VL1和包含SEQ ID NO:46的VH1；

l)包含SEQ ID NO:49的VL1和包含SEQ ID NO:50的VH1；和

m)包含SEQ ID NO:53的VL1和包含SEQ ID NO:54的VH1；

并且

2)该VL2和VH2选自由以下组成的组：

a)包含SEQ ID NO:213的VL2和包含SEQ ID NO:214的VH2；

b)包含SEQ ID NO:217的VL2和包含SEQ ID NO:218的VH2；

c)包含SEQ ID NO:221的VL2和包含SEQ ID NO:222的VH2；和

d)包含SEQ ID NO:225的VL2和包含SEQ ID NO:226的VH2。

9.如任一前述权利要求所述的抗体构建体，其中该轻链的CL选自由SEQ ID NO:883和SEQ ID NO:884组成的组。

10.如任一前述权利要求所述的抗体构建体，其中该重链的CH1-铰链-CH2-CH3选自由SEQ ID NO:885和SEQ ID NO:886组成的组。

11.如任一前述权利要求所述的抗体构建体，其中该第一肽接头选自由SEQ ID NO:888-893组成的组。

12.如任一前述权利要求所述的抗体构建体，其中该第二肽接头选自由SEQ ID NO:887-893组成的组。

13.如任一前述权利要求所述的抗体构建体，其中该第一肽接头包含SEQ ID NO:889并且该第二肽接头包含SEQ ID NO:887。

14.如任一前述权利要求所述的抗体构建体，其中

该轻链包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:286、290、294、298、302、306、310、314、318、322、326、330、336、342、346、350、354、358、362、366、370、374、和378；并且

该重链融合蛋白包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:285、289、293、297、301、305、309、313、317、321、325、329、333、337、341、345、349、353、357、361、365、369、373、和377。

15.如任一前述权利要求所述的抗体构建体，其中该轻链和该重链融合蛋白包含多肽，这些多肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：

分别是SEQ ID NO:286和SEQ ID NO:285；

分别是SEQ ID NO:290和SEQ ID NO:289；

分别是SEQ ID NO:294和SEQ ID NO:293；

分别是SEQ ID NO:298和SEQ ID NO:297；

分别是SEQ ID NO:302和SEQ ID NO:301；

分别是SEQ ID NO:306和SEQ ID NO:305；

分别是SEQ ID NO:310和SEQ ID NO:309；

分别是SEQ ID NO:314和SEQ ID NO:313；

分别是SEQ ID NO:318和SEQ ID NO:317；

分别是SEQ ID NO:322和SEQ ID NO:321；

分别是SEQ ID NO:326和SEQ ID NO:325；

分别是SEQ ID NO:330和SEQ ID NO:329；

分别是SEQ ID NO:334和SEQ ID NO:333；

分别是SEQ ID NO:338和SEQ ID NO:337；

分别是SEQ ID NO:342和SEQ ID NO:341；

分别是SEQ ID NO:346和SEQ ID NO:345；

分别是SEQ ID NO:350和SEQ ID NO:349；

分别是SEQ ID NO:354和SEQ ID NO:353；

分别是SEQ ID NO:358和SEQ ID NO:357；

分别是SEQ ID NO:362和SEQ ID NO:361；

分别是SEQ ID NO:366和SEQ ID NO:365；

分别是SEQ ID NO:370和SEQ ID NO:369；

分别是SEQ ID NO:374和SEQ ID NO:373；和

分别是SEQ ID NO:378和SEQ ID NO:377。

16.一种多核苷酸，该多核苷酸编码如任一前述权利要求所述的抗体构建体的轻链。

17.一种多核苷酸，该多核苷酸编码如任一前述权利要求所述的抗体构建体的重链融合蛋白。

18.一种载体，该载体包含如权利要求16所述的多核苷酸、如权利要求17所述的多核苷酸或两者。

19.一种宿主细胞，该宿主细胞用如权利要求16所述的多核苷酸和如权利要求17所述的多核苷酸转化或转染。

20.一种用于产生如权利要求1-15中任一项所述的抗体构建体的方法，所述方法包括在允许表达该抗体构建体的条件下，培养包含编码轻链的多核苷酸以及还包含编码重链融合蛋白的多核苷酸的宿主细胞，并且从培养物回收产生的抗体构建体。

21.一种药物组合物，该药物组合物包含如权利要求1-15中任一项所述的抗体构建体和载剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂、防腐剂或辅助剂。

22.一种用于治疗或改善实体瘤疾病或转移性癌症疾病的方法，该方法包括向有需要的受试者施用有效量的如权利要求1-15中任一项所述的抗体构建体。

23.如权利要求22所述的方法，其中该实体瘤疾病选自由以下组成的组：卵巢癌、胰腺癌、间皮瘤、肺癌、胃部癌和三阴性乳腺癌疾病或源自任何前述疾病的转移性癌症疾病。

24.一种试剂盒，该试剂盒包含如权利要求1-15中任一项所述的抗体构建体和任选地，使用说明书。

25.一种多特异性抗体构建体，该多特异性抗体构建体包含：

(i)含有两个轻链和两个重链的第一抗体，其中

这些轻链包含第一可变区(VL1)和轻链恒定区(CL)；

这些重链包含第一重可变区(VH1)和CH1、铰链、CH2、和CH3区；

其中第一抗体特异性地结合至人间皮素(MSLN)(SEQ ID NO:2)，并且scFv特异性地结合至并激动人CD40(SEQ ID NO:1)。

26.如权利要求25所述的抗体构建体，其中该两个轻链相同并且该两个重链融合蛋白相同。

27.如权利要求25-26中任一项所述的抗体构建体，其中该重链包含选自由以下组成的组的氨基酸取代：

(i)N297G或N297A；

(ii)L234A和L235A；和

(iii)R292C和V302C；

其中该氨基酸编号是根据Kabat的EU编号。

28.如权利要求27所述的抗体构建体，其中该重链包含N297G、R292C、和V302C突变，其中该氨基酸编号是根据Kabat的EU编号。

29.如权利要求25-28中任一项所述的抗体构建体，其中

该VL1包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3：

分别是SEQ ID NO:230、231、和232；

分别是SEQ ID NO:236、237、和238；

分别是SEQ ID NO:242、243、和244；和

分别是SEQ ID NO:248、249、和250；

该VH1包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3：

分别是SEQ ID NO:254、255、和256；

分别是SEQ ID NO:260、261、和262；

分别是SEQ ID NO:266、267、和268；和

分别是SEQ ID NO:272、273、和274；

该VL2包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3：

分别是SEQ ID NO:58、59、和60；

分别是SEQ ID NO:64、65、和66；

分别是SEQ ID NO:70、71、和72；

分别是SEQ ID NO:76、77、和78；

分别是SEQ ID NO:82、83、和84；

分别是SEQ ID NO:88、89、和90；

分别是SEQ ID NO:94、95、和96；

分别是SEQ ID NO:100、101、和102；

分别是SEQ ID NO:106、107、和108；

分别是SEQ ID NO:112、113、和114；

分别是SEQ ID NO:118、119、和120；

分别是SEQ ID NO:124、125、和126；和

分别是SEQ ID NO:130、131、和132；

和

该VH2包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3：

分别是SEQ ID NO:136、137、和138；

分别是SEQ ID NO:142、143、和144；

分别是SEQ ID NO:148、149、和150；

分别是SEQ ID NO:154、155、和156；

分别是SEQ ID NO:160、161、和162；

分别是SEQ ID NO:166、167、和168；

分别是SEQ ID NO:172、173、和174；

分别是SEQ ID NO:178、179、和180；

分别是SEQ ID NO:184、185、和186；

分别是SEQ ID NO:190、191、和192；

分别是SEQ ID NO:196、197、和198；

分别是SEQ ID NO:202、203、和204；和

分别是SEQ ID NO:208、209、和210。

30.如权利要求25-29中任一项所述的抗体构建体，其中

1)该VL1和VH1选自由以下组成的组：

a)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL1：分别是SEQ ID NO:230、231、和232；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH1：分别是SEQ ID NO:254、255、和256；

b)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL1：分别是SEQ ID NO:236、237、和238；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH1：分别是SEQ ID NO:260、261、和262；

c)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL1：分别是SEQ ID NO:242、243、和244；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH1：分别是SEQ ID NO:266、267、和268；和

d)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL1：分别是SEQ ID NO:248、249、和250；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH1：分别是SEQ ID NO:272、273、和274；

并且

2)该VL2和VH2选自由以下组成的组：

a)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL2：分别是SEQ ID NO:58、59、和60；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH2：分别是SEQ ID NO:136、137、和138；

b)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL2：分别是SEQ ID NO:64、65、和66；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH2：分别是SEQ ID NO:142、143、和144；

c)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL2：分别是SEQ ID NO:70、71、和72；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH2：分别是SEQ ID NO:148、149、和150；

d)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL2：分别是SEQ ID NO:76、77、和6780；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH2：分别是SEQ ID NO:154、155、和156；

e)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL2：分别是SEQ ID NO:82、83、和84；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH2：分别是SEQ ID NO:160、161、和162；

f)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL2：分别是SEQ ID NO:88、89、和90；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH2：分别是SEQ ID NO:166、167、和168；

g)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL2：分别是SEQ ID NO:94、95、和96；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH2：分别是SEQ ID NO:172、173、和174；

h)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL2：分别是SEQ ID NO:100、101、和102；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH2：分别是SEQ ID NO:178、179、和180；

i)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL2：分别是SEQ ID NO:106、107、和108；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH2：分别是SEQ ID NO:184、185、和186；

j)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL2：分别是SEQ ID NO:112、113、和114；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH2：分别是SEQ ID NO:190、191、和192；

k)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL2：分别是SEQ ID NO:118、119、和120；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH2：分别是SEQ ID NO:196、197、和198；

l)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL2：分别是SEQ ID NO:124、125、和126；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH2：分别是SEQ ID NO:202、203、和204；和

m)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL2：分别是SEQ ID NO:130、131、和132；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH2：分别是SEQ ID NO:208、209、和210。

31.如权利要求25-30中任一项所述的抗体构建体，其中

该VL1包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:213、217、221、和225；

该VH1包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:214、218、222、和226；

该VL2包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、49、和53；并且

该VH2包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、和54。

32.如权利要求25-31中任一项所述的抗体构建体，其中

1)该VL1和VH1选自由以下组成的组：

a)包含SEQ ID NO:213的VL1和包含SEQ ID NO:214的VH1；

b)包含SEQ ID NO:217的VL1和包含SEQ ID NO:218的VH1；

c)包含SEQ ID NO:221的VL1和包含SEQ ID NO:222的VH1；和

d)包含SEQ ID NO:225的VL1和包含SEQ ID NO:226的VH1；

并且

2)该VL2和VH2选自由以下组成的组：

a)包含SEQ ID NO:5的VL2和包含SEQ ID NO:6的VH2；

b)包含SEQ ID NO:9的VL2和包含SEQ ID NO:10的VH2；

c)包含SEQ ID NO:13的VL2和包含SEQ ID NO:14的VH2；

d)包含SEQ ID NO:17的VL2和包含SEQ ID NO:18的VH2；

e)包含SEQ ID NO:21的VL2和包含SEQ ID NO:22的VH2；

f)包含SEQ ID NO:25的VL2和包含SEQ ID NO:26的VH2；

g)包含SEQ ID NO:29的VL2和包含SEQ ID NO:30的VH2；

h)包含SEQ ID NO:33的VL2和包含SEQ ID NO:34的VH2；

i)包含SEQ ID NO:37的VL2和包含SEQ ID NO:38的VH2；

j)包含SEQ ID NO:41的VL2和包含SEQ ID NO:42的VH2；

k)包含SEQ ID NO:45的VL2和包含SEQ ID NO:46的VH2；

l)包含SEQ ID NO:49的VL2和包含SEQ ID NO:50的VH2；和

m)包含SEQ ID NO:53的VL2和包含SEQ ID NO:54的VH2。

33.如权利要求25-32中任一项所述的抗体构建体，其中该轻链的CL选自由SEQ ID NO:883和SEQ ID NO:884组成的组。

34.如权利要求25-33中任一项所述的抗体构建体，其中该重链的CH1-铰链-CH2-CH3选自由SEQ ID NO:885和SEQ ID NO:886组成的组。

35.如权利要求25-34中任一项所述的抗体构建体，其中该第一肽接头选自由SEQ IDNO:888-893组成的组。

36.如权利要求25-35中任一项所述的抗体构建体，其中该第二肽接头选自由SEQ IDNO:887-893组成的组。

37.如权利要求25-36中任一项所述的抗体构建体，其中该第一肽接头包含SEQ ID NO:889并且该第二肽接头包含SEQ ID NO:887。

38.如权利要求25-37中任一项所述的抗体构建体，其中

该轻链包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:382、386、390、394、398、402、406、410、414、418、422、426、430、434、438、442、446、和450；并且

该重链融合蛋白包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:381、385、389、393、397、401、405、409、413、417、421、425、429、433、437、441、445、和449。

39.如权利要求25-38中任一项所述的抗体构建体，其中该轻链和该重链融合蛋白包含多肽，这些多肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：

分别是SEQ ID NO:382和SEQ ID NO:381；

分别是SEQ ID NO:386和SEQ ID NO:385；

分别是SEQ ID NO:390和SEQ ID NO:389；

分别是SEQ ID NO:394和SEQ ID NO:393；

分别是SEQ ID NO:398和SEQ ID NO:397；

分别是SEQ ID NO:402和SEQ ID NO:401；

分别是SEQ ID NO:406和SEQ ID NO:405；

分别是SEQ ID NO:410和SEQ ID NO:409；

分别是SEQ ID NO:414和SEQ ID NO:413；

分别是SEQ ID NO:418和SEQ ID NO:417；

分别是SEQ ID NO:422和SEQ ID NO:421；

分别是SEQ ID NO:426和SEQ ID NO:425；

分别是SEQ ID NO:430和SEQ ID NO:429；

分别是SEQ ID NO:434和SEQ ID NO:433；

分别是SEQ ID NO:438和SEQ ID NO:437；

分别是SEQ ID NO:442和SEQ ID NO:441；

分别是SEQ ID NO:446和SEQ ID NO:445；和

分别是SEQ ID NO:450和SEQ ID NO:449。

40.一种多核苷酸，该多核苷酸编码如权利要求25-39中任一项所述的抗体构建体的轻链。

41.一种多核苷酸，该多核苷酸编码如权利要求25-39中任一项所述的抗体构建体的重链融合蛋白。

42.一种载体，该载体包含如权利要求40所述的多核苷酸、如权利要求41所述的多核苷酸或两者。

43.一种宿主细胞，该宿主细胞用如权利要求40所述的多核苷酸和如权利要求42所述的多核苷酸转化或转染。

44.一种用于产生如权利要求25-39中任一项所述的抗体构建体的方法，所述方法包括在允许表达该抗体构建体的条件下，培养包含编码轻链的多核苷酸以及还包含编码重链融合蛋白的多核苷酸的宿主细胞，并且从培养物回收产生的抗体构建体。

45.一种药物组合物，该药物组合物包含如权利要求25-39中任一项所述的抗体构建体和载剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂、防腐剂或辅助剂。

46.一种用于治疗或改善实体瘤疾病或转移性癌症疾病的方法，该方法包括向有需要的受试者施用有效量的如权利要求25-39中任一项所述的抗体构建体。

47.如权利要求46所述的方法，其中该实体瘤疾病选自由以下组成的组：卵巢癌、胰腺癌、间皮瘤、肺癌、胃部癌和三阴性乳腺癌疾病或源自任何前述疾病的转移性癌症疾病。

48.一种试剂盒，该试剂盒包含如权利要求25-39中任一项所述的抗体构建体和任选地，使用说明书。

49.一种多特异性抗体构建体，该多特异性抗体构建体包含：

i)该VH1或第一CH1结构域包含至少一个氨基酸取代以在选自由以下位置组成的组的残基处引入带正电的氨基酸：39、44、和183，使用EU编号；并且

b)包含第一轻链的第二多肽，其中该第一轻链包含第一轻链可变区(VL1)和第一CL区；并且其中该VL1或第一CL结构域包含至少一个氨基酸取代以在选自由以下位置组成的组的残基处引入带负电的氨基酸：38、100、和176，使用EU编号；和

c)包含第二轻链的第三多肽，其中该第二轻链包含第二轻链可变区(VL2)和第二CL区；并且其中该VL2或第二CL结构域包含至少一个氨基酸取代以在选自由以下位置组成的组的残基处引入带正电的氨基酸：38、100、和176，使用EU编号；

其中该VH1和VL1相互作用以结合第一抗原并且其中该VH2和VL2相互作用以结合第二抗原；

其中：

该第一抗原是人CD40(SEQ ID NO:1)并且该第二抗原是人间皮素(“MSLN”；SEQ ID NO:2)；或者

该第一抗原是人MSLN(SEQ ID NO:2)并且该第二抗原是人CD40(SEQ ID NO:1)。

50.一种多特异性抗体构建体，该多特异性抗体构建体包含：

b)包含第一轻链的第二多肽，其中该第一轻链包含第一轻链可变区(VL1)和第一CL区；并且其中该VL1或第一CL结构域包含至少一个氨基酸取代以在选自由以下位置组成的组的残基处引入带正电的氨基酸：38、100、和176，使用EU编号；和

其中：

51.如权利要求49或50中任一项所述的抗体构建体，其中将该铰链-CH2-CH3多肽经由肽接头连接至该VH2。

52.如51所述的抗体构建体，其中该肽接头包含选自由以下组成的组的序列：(Gly₃Ser)₂(SEQ ID NO:916)、(Gly₄Ser)₂(SEQ ID NO:888)、(Gly₃Ser)₃(SEQ ID NO:917)、(Gly₄Ser)₃(SEQ ID NO:889)、(Gly₃Ser)₄(SEQ ID NO:918)、(Gly₄Ser)₄(SEQ ID NO:890)、(Gly₃Ser)₅(SEQ ID NO:919)、(Gly₄Ser)₅(SEQ ID NO:920)、(Gly₃Ser)₆(SEQ ID NO:921)、和(Gly₄Ser)₆(SEQ ID NO:922)。

53.如权利要求49所述的抗原结合蛋白，其中

a)该VH1或第一CH1结构域包含选自由以下组成的组的突变：Q39K、G44K、和S183K，使用EU编号；

b)该VH2或第二CH1结构域包含选自由以下组成的组的突变：Q39E、G44E、和S183E，使用EU编号；

c)该VL1或第一CL结构域包含选自由以下组成的组的突变：Q38E、G100E、和S176E，使用EU编号；并且

d)该VL2或第二CL结构域包含选自由以下组成的组的突变：Q38K、G100K、和S176K，使用EU编号。

54.如权利要求53所述的抗原结合蛋白，其中

a)该第一CH1结构域包含S183K突变，使用EU编号；

b)该第二CH1结构域包含S183E突变，使用EU编号；

c)该第一CL结构域包含S176E突变，使用EU编号；并且

d)该第二CL结构域包含S176K突变，使用EU编号。

55.如权利要求53所述的抗原结合蛋白，其中

a)该VH1包含Q39K突变并且该第一CH1结构域包含S183K突变，使用EU编号；

b)该VH2包含Q39E突变并且该第二CH1结构域包含S183E突变，使用EU编号；

c)该VL1包含Q38E突变并且该第一CL结构域包含S176E突变，使用EU编号；并且

d)该VL2包含Q38K突变并且该第二CL结构域包含S176K突变，使用EU编号。

56.如权利要求53所述的抗原结合蛋白，其中

a)该第一CH1结构域包含G44K和S183K突变，使用EU编号；

b)该第二CH1结构域包含G44E和S183E突变，使用EU编号；

c)该第一CL结构域包含G100E和S176E突变，使用EU编号；并且

d)该第二CL结构域包含G100K和S176K突变，使用EU编号。

57.如权利要求50所述的抗原结合蛋白，其中

a)该VH1或第一CH1结构域包含选自由以下组成的组的突变：Q39E、G44E、和S183E，使用EU编号；

b)该VH2或第二CH1结构域包含选自由以下组成的组的突变：Q39K、G44K、和S183K，使用EU编号；

c)该VL1或第一CL结构域包含选自由以下组成的组的突变：Q38K、G100K、和S176K，使用EU编号；并且

d)该VL2或第二CL结构域包含选自由以下组成的组的突变：Q38E、G100E、和S176E，使用EU编号。

58.如权利要求57所述的抗原结合蛋白，其中

a)该第一CH1结构域包含S183E突变，使用EU编号；

b)该第二CH1结构域包含S183K突变，使用EU编号；

c)该第一CL结构域包含S176K突变，使用EU编号；并且

d)该第二CL结构域包含S176E突变，使用EU编号。

59.如权利要求57所述的抗原结合蛋白，其中

a)该VH1包含Q39E突变并且该第一CH1结构域包含S183E突变，使用EU编号；

b)该VH2包含Q39K突变并且该第二CH1结构域包含S183K突变，使用EU编号；

c)该VL1包含Q38K突变并且该第一CL结构域包含S176K突变，使用EU编号；并且

d)该VL2包含Q38E突变并且该第二CL结构域包含S176E突变，使用EU编号。

60.如权利要求57所述的抗原结合蛋白，其中

a)该第一CH1结构域包含G44E和S183E突变，使用EU编号；

b)该第二CH1结构域包含G44K和S183K突变，使用EU编号；

c)该第一CL结构域包含G100K和S176K突变，使用EU编号；并且

d)该第二CL结构域包含G100E和S176E突变，使用EU编号。

61.如权利要求49-50中任一项所述的抗体构建体，其中该铰链-CH2-CH3多肽包含选自由以下组成的组的氨基酸取代：

(i)N297G或N297A；

(ii)L234A和L235A；和

(iii)R292C和V302C；

其中该氨基酸编号是根据Kabat的EU编号。

62.如权利要求61所述的抗体构建体，其中该铰链-CH2-CH3多肽包含N297G、R292C、和V302C突变，其中该氨基酸编号是根据Kabat的EU编号。

63.如权利要求49-62中任一项所述的抗体构建体，其中该第一抗原是人CD40(SEQ IDNO:1)并且该第二抗原是人MSLN(SEQ ID NO:2)；并且

该VL1包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3：

分别是SEQ ID NO:58、59、和60；

分别是SEQ ID NO:64、65、和66；

分别是SEQ ID NO:70、71、和72；

分别是SEQ ID NO:76、77、和78；

分别是SEQ ID NO:82、83、和84；

分别是SEQ ID NO:88、89、和90；

分别是SEQ ID NO:94、95、和96；

分别是SEQ ID NO:100、101、和102；

分别是SEQ ID NO:106、107、和108；

分别是SEQ ID NO:112、113、和114；

分别是SEQ ID NO:118、119、和120；

分别是SEQ ID NO:124、125、和126；并且

分别是SEQ ID NO:130、131、和132；

该VH1包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3：

分别是SEQ ID NO:136、137、和138；

分别是SEQ ID NO:142、143、和144；

分别是SEQ ID NO:148、149、和150；

分别是SEQ ID NO:154、155、和156；

分别是SEQ ID NO:160、161、和162；

分别是SEQ ID NO:166、167、和168；

分别是SEQ ID NO:172、173、和174；

分别是SEQ ID NO:178、179、和180；

分别是SEQ ID NO:184、185、和186；

分别是SEQ ID NO:190、191、和192；

分别是SEQ ID NO:196、197、和198；

分别是SEQ ID NO:202、203、和204；和

分别是SEQ ID NO:208、209、和210；

该VL2包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3：

分别是SEQ ID NO:230、231、和232；

分别是SEQ ID NO:236、237、和238；

分别是SEQ ID NO:242、243、和244；和

分别是SEQ ID NO:248、249、和250；

并且VH2包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3：

分别是SEQ ID NO:254、255、和256；

分别是SEQ ID NO:260、261、和262；

分别是SEQ ID NO:266、267、和268；和

分别是SEQ ID NO:272、273、和274。

64.如权利要求63所述的抗体构建体，其中

1)该VL1和VH1选自由以下组成的组：

并且

2)该VL2和VH2选自由以下组成的组：

65.如权利要求63所述的抗体构建体，其中

66.如权利要求65所述的抗体构建体，其中

1)该VL1和VH1选自由以下组成的组：

a)包含SEQ ID NO:5的VL1和包含SEQ ID NO:6的VH1；

b)包含SEQ ID NO:9的VL1和包含SEQ ID NO:10的VH1；

c)包含SEQ ID NO:13的VL1和包含SEQ ID NO:14的VH1；

d)包含SEQ ID NO:17的VL1和包含SEQ ID NO:18的VH1；

e)包含SEQ ID NO:21的VL1和包含SEQ ID NO:22的VH1；

f)包含SEQ ID NO:25的VL1和包含SEQ ID NO:26的VH1；

g)包含SEQ ID NO:29的VL1和包含SEQ ID NO:30的VH1；

h)包含SEQ ID NO:33的VL1和包含SEQ ID NO:34的VH1；

i)包含SEQ ID NO:37的VL1和包含SEQ ID NO:38的VH1；

j)包含SEQ ID NO:41的VL1和包含SEQ ID NO:42的VH1；

k)包含SEQ ID NO:45的VL1和包含SEQ ID NO:46的VH1；

l)包含SEQ ID NO:49的VL1和包含SEQ ID NO:50的VH1；和

m)包含SEQ ID NO:53的VL1和包含SEQ ID NO:54的VH1；

并且

2)该VL2和VH2选自由以下组成的组：

a)包含SEQ ID NO:213的VL2和包含SEQ ID NO:214的VH2；

b)包含SEQ ID NO:217的VL2和包含SEQ ID NO:218的VH2；

c)包含SEQ ID NO:221的VL2和包含SEQ ID NO:222的VH2；和

d)包含SEQ ID NO:225的VL2和包含SEQ ID NO:226的VH2。

67.一种多核苷酸，该多核苷酸编码如权利要求49-66和76-80中任一项所述的抗体构建体的第一轻链。

68.一种多核苷酸，该多核苷酸编码如权利要求49-66和76-80中任一项所述的抗体构建体的第二轻链。

69.一种多核苷酸，该多核苷酸编码如权利要求49-66和76-80中任一项所述的抗体构建体的重链融合蛋白。

70.一种载体，该载体包含：

a)如权利要求67所述的多核苷酸，

b)如权利要求68所述的多核苷酸，

c)如权利要求69所述的多核苷酸，或

d)a)、b)、和c)的任何组合。

71.一种宿主细胞，该宿主细胞用如权利要求67所述的多核苷酸、如权利要求68所述的多核苷酸和如权利要求69所述的多核苷酸转化或转染。

72.一种用于产生如权利要求49-66和76-80中任一项所述的抗体构建体的方法，所述方法包括在允许表达该抗体构建体的条件下，培养包含编码第一轻链的多核苷酸、编码第二轻链的多核苷酸和编码重链融合蛋白的多核苷酸的宿主细胞，并且从培养物回收产生的抗体构建体。

73.一种药物组合物，该药物组合物包含如权利要求49-66和76-80中任一项所述的抗体构建体和载剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂、防腐剂或辅助剂。

74.一种用于治疗或改善实体瘤疾病或转移性癌症疾病的方法，该方法包括向有需要的受试者施用有效量的如权利要求49-66和76-80中任一项所述的抗体构建体。

75.如权利要求74所述的方法，其中该实体瘤疾病选自由以下组成的组：卵巢癌、胰腺癌、间皮瘤、肺癌、胃部癌和三阴性乳腺癌疾病或源自任何前述疾病的转移性癌症疾病。

76.一种试剂盒，该试剂盒包含如权利要求49-66和76-80中任一项所述的抗体构建体和任选地，使用说明书。

77.如权利要求49-62中任一项所述的抗体构建体，其中该第一抗原是人MSLN(SEQ IDNO:2)并且该第二抗原是人CD40(SEQ ID NO:1)；其中：

该VL1包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3：

分别是SEQ ID NO:230、231、和232；

分别是SEQ ID NO:236、237、和238；

分别是SEQ ID NO:242、243、和244；并且

分别是SEQ ID NO:248、249、和250；

该VH1包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3：

分别是SEQ ID NO:254、255、和256；

分别是SEQ ID NO:260、261、和262；

分别是SEQ ID NO:266、267、和268；并且

分别是SEQ ID NO:272、273、和274；

该VL2包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3：

分别是SEQ ID NO:58、59、和60；

分别是SEQ ID NO:64、65、和66；

分别是SEQ ID NO:70、71、和72；

分别是SEQ ID NO:76、77、和78；

分别是SEQ ID NO:82、83、和84；

分别是SEQ ID NO:88、89、和90；

分别是SEQ ID NO:94、95、和96；

分别是SEQ ID NO:100、101、和102；

分别是SEQ ID NO:106、107、和108；

分别是SEQ ID NO:112、113、和114；

分别是SEQ ID NO:118、119、和120；

分别是SEQ ID NO:124、125、和126；并且

分别是SEQ ID NO:130、131、和132；

并且

该VH2包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3：

分别是SEQ ID NO:136、137、和138；

分别是SEQ ID NO:142、143、和144；

分别是SEQ ID NO:148、149、和150；

分别是SEQ ID NO:154、155、和156；

分别是SEQ ID NO:160、161、和162；

分别是SEQ ID NO:166、167、和168；

分别是SEQ ID NO:172、173、和174；

分别是SEQ ID NO:178、179、和180；

分别是SEQ ID NO:184、185、和186；

分别是SEQ ID NO:190、191、和192；

分别是SEQ ID NO:196、197、和198；

分别是SEQ ID NO:202、203、和204；并且

分别是SEQ ID NO:208、209、和210。

78.如权利要求77所述的抗体构建体，其中

1)该VL1和VH1选自由以下组成的组：

并且

2)该VL2和VH2选自由以下组成的组：

79.如权利要求77所述的抗体构建体，其中

80.如权利要求79所述的抗体构建体，其中

1)该VL1和VH1选自由以下组成的组：

a)包含SEQ ID NO:213的VL1和包含SEQ ID NO:214的VH1；

b)包含SEQ ID NO:217的VL1和包含SEQ ID NO:218的VH1；

c)包含SEQ ID NO:221的VL1和包含SEQ ID NO:222的VH1；和

d)包含SEQ ID NO:225的VL1和包含SEQ ID NO:226的VH1；

并且

2)该VL2和VH2选自由以下组成的组：

a)包含SEQ ID NO:5的VL2和包含SEQ ID NO:6的VH2；

b)包含SEQ ID NO:9的VL2和包含SEQ ID NO:10的VH2；

c)包含SEQ ID NO:13的VL2和包含SEQ ID NO:14的VH2；

d)包含SEQ ID NO:17的VL2和包含SEQ ID NO:18的VH2；

e)包含SEQ ID NO:21的VL2和包含SEQ ID NO:22的VH2；

f)包含SEQ ID NO:25的VL2和包含SEQ ID NO:26的VH2；

g)包含SEQ ID NO:29的VL2和包含SEQ ID NO:30的VH2；

h)包含SEQ ID NO:33的VL2和包含SEQ ID NO:34的VH2；

i)包含SEQ ID NO:37的VL2和包含SEQ ID NO:38的VH2；

j)包含SEQ ID NO:41的VL2和包含SEQ ID NO:42的VH2；

k)包含SEQ ID NO:45的VL2和包含SEQ ID NO:46的VH2；

l)包含SEQ ID NO:49的VL2和包含SEQ ID NO:50的VH2；和

m)包含SEQ ID NO:53的VL2和包含SEQ ID NO:54的VH2。

81.一种抗原结合蛋白，该抗原结合蛋白特异性地结合并且激动人CD40(SEQ ID NO:1)，该抗原结合蛋白包含轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)，其中：

该VL包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3：

分别是SEQ ID NO:58、59、和60；

分别是SEQ ID NO:64、65、和66；

分别是SEQ ID NO:70、71、和72；

分别是SEQ ID NO:76、77、和78；

分别是SEQ ID NO:82、83、和84；

分别是SEQ ID NO:88、89、和90；

分别是SEQ ID NO:94、95、和96；

分别是SEQ ID NO:100、101、和102；

分别是SEQ ID NO:106、107、和108；

分别是SEQ ID NO:112、113、和114；

分别是SEQ ID NO:118、119、和120；

分别是SEQ ID NO:124、125、和126；和

分别是SEQ ID NO:130、131、和132；

并且

该VH包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3：

分别是SEQ ID NO:136、137、和138；

分别是SEQ ID NO:142、143、和144；

分别是SEQ ID NO:148、149、和150；

分别是SEQ ID NO:154、155、和156；

分别是SEQ ID NO:160、161、和162；

分别是SEQ ID NO:166、167、和168；

分别是SEQ ID NO:172、173、和174；

分别是SEQ ID NO:178、179、和180；

分别是SEQ ID NO:184、185、和186；

分别是SEQ ID NO:190、191、和192；

分别是SEQ ID NO:196、197、和198；

分别是SEQ ID NO:202、203、和204；并且

分别是SEQ ID NO:208、209、和210。

82.如权利要求81所述的抗体构建体，其中

该VL和VH选自由以下组成的组：

a)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL：分别是SEQ ID NO:58、59、和60；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH：分别是SEQ ID NO:136、137、和138；

b)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL：分别是SEQ ID NO:64、65、和66；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH：分别是SEQ ID NO:142、143、和144；

c)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL：分别是SEQ ID NO:70、71、和72；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH：分别是SEQ ID NO:148、149、和150；

d)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL：分别是SEQ ID NO:76、77、和6780；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH：分别是SEQ ID NO:154、155、和156；

e)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL：分别是SEQ ID NO:82、83、和84；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH：分别是SEQ ID NO:160、161、和162；

f)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL：分别是SEQ ID NO:88、89、和90；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH：分别是SEQ ID NO:166、167、和168；

g)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL：分别是SEQ ID NO:94、95、和96；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH：分别是SEQ ID NO:172、173、和174；

h)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL：分别是SEQ ID NO:100、101、和102；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH：分别是SEQ ID NO:178、179、和180；

i)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL：分别是SEQ ID NO:106、107、和108；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH：分别是SEQ ID NO:184、185、和186；

j)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL：分别是SEQ ID NO:112、113、和114；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH：分别是SEQ ID NO:190、191、和192；

k)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL：分别是SEQ ID NO:118、119、和120；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH：分别是SEQ ID NO:196、197、和198；

l)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL：分别是SEQ ID NO:124、125、和126；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH：分别是SEQ ID NO:202、203、和204；和

m)包含选自由以下组成的组的CDRL1、CDRL2、和CDRL3的VL：分别是SEQ ID NO:130、131、和132；和包含选自由以下组成的组的CDRH1、CDRH2、和CDRH3的VH：分别是SEQ ID NO:208、209、和210。

83.如权利要求81所述的抗体构建体，其中

该VL包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、49、和53；并且

该VH包含选自由以下组成的组的氨基酸序列SEQ ID NO:6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、和54。

84.如权利要求83所述的抗体构建体，其中

该VL2和VH2选自由以下组成的组：

a)包含SEQ ID NO:5的VL和包含SEQ ID NO:6的VH；

b)包含SEQ ID NO:9的VL和包含SEQ ID NO:10的VH；

c)包含SEQ ID NO:13的VL和包含SEQ ID NO:14的VH；

d)包含SEQ ID NO:17的VL和包含SEQ ID NO:18的VH；

e)包含SEQ ID NO:21的VL和包含SEQ ID NO:22的VH；

f)包含SEQ ID NO:25的VL和包含SEQ ID NO:26的VH；

g)包含SEQ ID NO:29的VL和包含SEQ ID NO:30的VH；

h)包含SEQ ID NO:33的VL和包含SEQ ID NO:34的VH；

i)包含SEQ ID NO:37的VL和包含SEQ ID NO:38的VH；

j)包含SEQ ID NO:41的VL和包含SEQ ID NO:42的VH；

k)包含SEQ ID NO:45的VL和包含SEQ ID NO:46的VH；

l)包含SEQ ID NO:49的VL和包含SEQ ID NO:50的VH；和

m)包含SEQ ID NO:53的VL和包含SEQ ID NO:54的VH。

85.如权利要求81-84中任一项所述的抗体构建体，其中该重链包含选自由以下组成的组的氨基酸取代：

(i)N297G或N297A；

(ii)L234A和L235A；和

(iii)R292C和V302C；

其中该氨基酸编号是根据Kabat的EU编号。

86.如权利要求85所述的抗体构建体，其中该重链包含N297G、R292C、和V302C突变，其中该氨基酸编号是根据Kabat的EU编号。

87.如权利要求81-86中任一项所述的抗体构建体，其中该抗原结合蛋白进一步包含连接至该VL的轻链CL多肽，其中该CL多肽选自由SEQ ID NO:883和SEQ ID NO:884组成的组。

88.如权利要求81-87中任一项所述的抗体构建体，其中该抗原结合蛋白进一步包含重链CH1-铰链-CH2-CH3多肽，其中该CH1-铰链-CH2-CH3多肽选自由SEQ ID NO:885和SEQ IDNO:886组成的组。

89.如权利要求81-88中任一项所述的抗体构建体，其中该抗原结合蛋白进一步包含第二抗原结合部分，该第二抗原结合部分特异性地结合第二抗原。

90.如权利要求89所述的抗体构建体，其中该第二抗原是肿瘤相关抗原(TAA)。