ES2659764T3

ES2659764T3 - Moléculas biespecíficas de unión a antígeno activadoras de linfocitos T

Info

Publication number: ES2659764T3
Application number: ES12750364.7T
Authority: ES
Inventors: Oliver Ast; Peter Bruenker; Tanja FAUTI; Anne Freimoser-Grundschober; Christiane Neumann; Christian Klein; Ekkehard Moessner; Pablo Umana
Original assignee: Roche Glycart AG
Current assignee: Roche Glycart AG
Priority date: 2011-08-23
Filing date: 2012-08-21
Publication date: 2018-03-19
Anticipated expiration: 2032-08-21
Also published as: KR101963923B1; IL268886A; RS56879B1; CN103748114B; MY169358A; CL2014000126A1; US20230340160A1; PL2748201T3; KR20140034310A; PE20141521A1; EA030147B1; CO6811817A2; SI2748201T1; CA2837975C; TWI633121B; IL229765A0; AU2012298537A8; AR087608A1; JP6339015B2; HUE038225T2

Abstract

Una molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T que comprende un primer y un segundo resto de unión a antígeno, siendo uno de ellos una molécula Fab capaz de unirse específicamente a un antígeno activador de linfocitos T y siendo el otro de ellos una molécula Fab capaz de unirse específicamente a un antígeno de célula diana, y un dominio Fc compuesto por una primera y una segunda subunidad capaces de crear una asociación estable; en la que el primer resto de unión a antígeno es una molécula Fab entrecruzada en la que las regiones variables o constantes de la cadena ligera Fab y la cadena pesada Fab están intercambiadas; en la que el primer y el segundo resto de unión a antígeno están fusionados entre sí, opcionalmente a través de conector peptídico; y en la que la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T comprende no más de un resto de unión a antígeno capaz de unirse específicamente a un antígeno activador de linfocitos T.

Description

Moléculas biespecíficas de unión a antígeno activadoras de linfocitos T

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a moléculas biespec[ficas de unión a antrgeno para la activación de linfocitos T. Además, la presente invención se refiere a polinucleólidos que codifican dichas moléculas biespecíficas de unión a antígeno, a procedimientos para producir las moléculas biespecificas de unión a antígeno de la invención, ya dichas moléculas biespecíficas de unión a antígeno para su uso en el tratamiento de enfermedades.

Antecedentes

La destrucción selectiva de una célula individual o de un tipo de célula espec[fico es a menudo deseable en una variedad de entornos clinicos. Por ejemplo, el objetivo principal del tratamiento contra el cáncer es destruir especifica mente tas células tumorales, dejando tas cétulas y tejidos sanos intactos y sin daños.

Una forma atractiva de lograr esto es inducir una respuesta inmunitaria contra et tumor, para hacer que tas cétulas efectoras inmunitarias tales como los linfocitos citolíticos naturales (NK) o los linfocitos T citotóxicos (CTL) ataquen y destruyan las células tumorales. Los CTl constituyen las células efectoras más potentes del sistema inmunitario; sin embargo, no se pueden activar por el mecanismo efector mediado por el dominio Fe de los anticuerpos terapéuticos convencionales.

A este respecto, los anticuerpos biespecificos diseñados para unirse con un «brazo» a un anUgeno de superficie en las células diana, y con el segundo «brazo» a un componente activador invariable del complejo receptor de linfocitos T (TCR), han adquirido interés en los últimos años. la unión simultánea de dicho anticuerpo a ambas de sus dianas forzará una interacción temporal entre la célula diana y el linfocito T, provocando la activación de cualquier linfocito T citotóxioo y la posteriOf lisis de la célula diana. Por lo tanto, la respuesta inmunitaria se redirige a las células diana y es independiente de la presentación de anUgenos peptidicos pOf parte de la célula diana o de la especificidad del linfocito T, ya que sería relevante para la activación de CTL restringida por MHC normal. En este contexto, es crucial que los CTL solo se activen cuando una célula diana les presenta el anticuerpo biespecífico, es decir, cuando se imite la sinapsis inmunológica. Son particularmente deseables los anticuerpos biespecificos que no reqUieren precondicionamiento o coestimulación de linfocitos para provocar una lisis eficaz de las células diana.

Se han desarrollado varios formatos de anticuerpos biespecificos y se ha investigado su idoneidad para la inmunoterapia mediada por linfocitos T. Entre ellas, las moléculas llamadas BiTE (atrapadoras de linfocitos T biespecificas) se han caracterizado muy bien y ya se han mostrado prometedoras en el entorno clinioo (revisado en Nagorsen y Bauerte, Exp Cell Res 317,1255-1260 (201 1». Las BiTE son moléculas scFv en tándem en las que dos moléculas scFv están fusionadas por un conector flexible. Otros formatos biespecíficos en los que se está evaluando la implicación de linfocitos T incluyen diacuerpos (Holliger et al., Prot Eng 9, 299-305 (1996» y derivados de los mismos, tales comodiacuerpos en tándem (Kipriyanov et al., J Mol 8i0l293, 41-66 (1999» . Un desarrollo más reciente son las llamadas moléculas DART (redireccionamiento de doble afinidad). que se basan en el formato de diacuerpo pero presentan un puente disulfuro C-terminal para una estabilización adicional (Moore et al., Blood 117, 4542-51 (2011 ». Los llamados triomabs, que son moléculas de IgG de ratón/rata hibridas completas y que también se están evaluando actualmente en ensayos clinicos, representan un formato de mayor tamaño (revisado en Seimetz et al., Cancer Treat Rev 36, 458-467 (2010)).

La variedad de formatos que se están desarrollando muestra el gran potencial atribuido a la reorientación y activación de los linfocitos T en inmunoterapia. Sin embargo, la tarea de generar anticuerpos biespecificos adecuados para ello no resulta nada trivial, ya que implica una serie de desafíos que se deben cumplir en relación con la eficacia, la toxicidad, la aplicabilidad y la capacidad de producción de los anticuerpos.

Estructuras pequeñas tales como, por ejemplo, las moléculas BiTE, que son capaces a la vez de entrelazarse eficazmente a células efectoras y diana, tienen una semivida en suero muy corta que requiere que se administren a los pacientes mediante infusión continua. Por otro lado, formatos similares a IgG, que tienen el gran beneficio de tener una larga semivida, sufren toxicidad asociada con las funciones efectoras naturales inherentes a las moléculas de IgG. Su potencial inmunogénico constituye otra caracteristica desfavOfable de los anticuerpos biespecíficos similares a IgG, especialmente en los formatos no humanos, para un desarrollo terapéutico exitoso. Finalmente, un desafio importante en el desarrollo general de anticuerpos biespecificos ha sido la producción de construcciones de anticuerpos biespecificos en una cantidad y con una pureza clinicamente suficientes, debido al emparejamiento erróneo de cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos de diferentes especificidades en la coexpresión, lo que disminuye el rendimiento de la construcción correctamente ensamblada y da como resultado una serie de productos secundarios no funcionales que pueden resultar dificiles de sepa rar del anticuerpo biespecifico deseado.

Dadas las dificultades y desventajas asociadas a los anticuerpos biespecíficos actualmente dispooibles para inmunoterapia mediada por linfocitos T, sigue existiendo la necesidad de formatos novedosos y mejorados de didlas

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moléculas. La presente invención proporcioo8 moléculas biespecíficas de unión a antígeno diseñadas para la activación y reorientaci6n de linfocitos T que combinan una buena eficacia y capacidad de producción con una baja toxicidad y propiedades farmacocinéticas favorables.

Sumario de la invención

En un primer aspecto, la presente invención proporciona una molécula biespec[fica de unión a antrgeno activadora de linfocitos T que comprende un primer y un segundo resto de unión a antígeno, siendo uno de ellos una molécula Fab capaz de unirse específicamente a un antígeno activador de linfocitos T y siendo el otro de ellos una molécula Fab capaz de unirse especifica mente a un anUgeno de la célula diana, y un dominio Fe compuesto por una primera y una segunda subunidad capaces de crear una asociación estable; en el que el primer resto de unión a antrgeno es una molécula Fab entrecruzada en la que las regiones variables o constantes de la cadena ligera Fab y la cadena pesada Fab están intercambiadas; en el que el primer y el segundo resto de unión a antígeno están fusionados entre sí, opcionalmente a través de un conector peptrdico; yen el que la molécula biespecífica de u níón a anUgeno activadora de linfocitos T comprende no más de un resto de unión a anUgeno capaz de unirse específicamente a un antígeno activador de linfocitos T (es decir, la molécula biespecifica de unión a antígeno activadora de linfocitos T proporciona una unión monovalente al antígeno activador de linfocitos T).

De acuerdo con la invención, el primer y el segundo resto de unión a antígeno de la molécula biespecífica de unión a antigeno activadora de linfocitos T están fusionados entre sí , opcionalmente a través de un conector peptídico. En un modo de realización, el segundo resto de unión a antígeno está fusionado en el extremo e de la cadena pesada Fab al extremo N de la cadena pesada Fab del primer resto de unión a antígeno. En otro modo de realización, el primer resto de unión a ant1geno está fusionado en el extremo e de la cadena pesada Fab al extremo N de la cadena pesada Fab del segundo resto de unión a antígeno. En otro modo de realización más, el segundo resto de unión a antrgeno está fusionado en el extremo e de la cadena ligera Fab al extremo N de la cadena ligera Fab del primer resto de unión a antígeno. En modos de realización en los que (i) el segundo resto de unión a anUgeno está fusionado en el extremo e de la cadena pesada Fab al extremo N de la cadena pesada Fab del primer resto de unión a antígeno o (ii) el primer resto de unión a antígeno está fusionado en el extremo e de la cadena pesada Fab al extremo N de la cadena pesada Fab del segundo resto de unión a antrgeno, adicionalmente la cadena ligera Fab del primer resto de unión a antígeno y la cadena ligera Fab del segundo resto de unión a antígeno pueden estar fusionadas entre sí, opcionalmente a través de un conector peptídico.

En un modo de realización, en el que (i) el primer resto de unión a antígeno está fusionado en el extremo e de la cadena pesada Fab al extremo N de la cadena pesada Fab del segundo resto de unión a antígeno o (ii) el segundo resto de unión a antígeno está fusionado en el extremo e de la cadena ligera Fab al extremo N de la cadena ligera Fab del primer resto de unión a antígeno, el segundo resto de unión a antígeno de la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T está fusionado en el extremo e de la cadena pesada Fab al extremo N de la primera o la segunda subunidad del dominio Fc. En otro modo de realización, en el que el segundo resto de unión a antígeno está fusionado en el extremo e de la cadena pesada Fab al extremo N de la cadena pesada Fab del primer resto de unión a antígeno, el primer resto de unión a antígeno está fusionado en el extremo e de la cadena pesada Fab al extremo N de la primera o la segunda subunidad del dominio Fc.

En ciertos modos de realización, la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T comprende un tercer resto de unión a anUgeno que es una molécula Fab capaz de unirse específicamente a un antrgeno de célula diana. En uno de dichos modos de realización, el tercer resto de unión a anUgeno está fusionado en el extremo e de la cadena pesada Fab al extremo N de la primera o la segunda subunidad del dominio Fc. En un modo de realización particular, el segundo y el tercer resto de unión a antrgeno de la molécula de unión a antígeno activadora de linfocitos T están fusionados cada uno en el extremo e de la cadena pesada Fab al extremo N de una de las subunidades del dominio Fc, y el primer resto de unión a antígeno está fusionado en el extremo e de la cadena pesada Fab al extremo N de la cadena pesada Fab del segundo resto de unión a antígeno. En otro modo de realización particular, el primer y el tercer resto de unión a anUgeno de la molécula de unión a antrgeno activadora de linfocitos T están fusionados cada uno en el extremo e de la cadena pesada Fab al extremo N de una de las subunidades del dominio Fc, yel segundo resto de unión a antígeno está fusionado en el extremo e de la cadena pesada Fab al extremo N de la cadena pesada Fab del primer resto de unión a antígeno. Los componentes de la molécula biespecifica de unión a antrgeno activadora de linfocitos T pueden estar fusionados directamente o a través de conectOl"es peptídicos adecuados. En un modo de realización, en el que el segundo y el tercer resto de unión a anUgeno de la molécula de unión a anUgeno activadora de linfocitos T están fusionados cada uno en el extremo e de la cadena pesada Fab al extremo N de una de las subunidades del dominio Fc, el segundo y el tercer resto de unión a antígeno y el dominio Fc son parte de una molécula de inmunoglobulina. En un modo de realización particular, la molécula de inmunoglobulina es una inmunoglobulina de clase 19G.

En un modo de realización particular, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG. En un modo de realización especifico, el dominio Fc es un dominio Fc de 19G1. En otro modo de realización específico, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG4. En modos de realización particulares, el dominio Fe es un dominio Fc humano.

En modos de realización particulares, el dominio Fc comprende una modificación que promueve la asociación de la

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primera y la segunda subunidad del dominio Fe. En uno de dichos modos de realización específicos, un residuo de aminoácido del dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fe se reemplaza por un residuo de aminoácido que tiene un volumen de cadena lateral mayor, generando así una protuberancia en el dominio CH3 de la primera subunidad que se puede colocar en una cavidad dentro del dominio CH3 de la segunda subunidad, y un residuo de aminoácido en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fe se reemplaza por un residuo de aminoácido que tiene un volumen de cadena laleral más pequeño, generando así una cavidad en el dominio CH3 de la segunda subun idad en la que se puede colocar la protuberancia del dominio CH3 de la primera subunidad.

En un modo de realización particular, el dominio Fe exhibe una afinidad de unión reducida por un receptor Fc y{o una función efectora reducida, en comparación con un dominio Fc de IgGl natural. En un modo de realización, el dominio Fc comprende una o mas sustituciones de aminoácidos que reducen la unión a un receptor Fc y{o la función efectora. En un modo de realización, la una o más sustituciones de aminoácidos en el dominio Fc que reducen la unión a un receptor Fc y/o la función efectora están en una o más posiciones seleccionadas entre el grupo de L234, L235 Y P329 (numeración UE). En modos de realización particulares, cada subunidad del dominio Fc comprende tres sustituciones de aminoácidos que reducen la unión a un receptor Fc y/o la función efectora en las que dichas sustituciones de aminoacidos son L234A, L235A YP329G.

En un modo de realización, el receptor Fc es un receptor Fcy. En un modo de realización, la función efectora es citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (AOCC).

En un modo de realización particular, el antrgeno activador de linfocitos T es C03. En un modo de realización, el antígeno de la célula diana se selecciona entre el grupo que consiste en: proteoglucano de sulfato de condroitina asociado a melanoma (MCSP), receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), antígeno carcinoembrionario (CEA), proteina de activación de fibroblastos (FAP), C019, C020 y C033.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un polinucleótido aislado que codifica una molécula biespecífica de unión a antigeno activadora de linfocitos T de la invención.

En otro aspecto, se proporciona un procedimiento para producir la molécula biespecifica de unión a antígeno activadora de linfocitos T de la invención, que comprende las etapas de a) cultivo de una célula hospedadora que comprende el polinucieótido aíslado de la invención, o un vector que comprende el polinudeólido aislado de la invención; en condiciones adecuadas para la expresión de la molécula biespecifica de unión a antlgeno activadora de linfocitos T y b) recuperación de la molécula biespecifica de unión a antígeno activadora de linfocitos T.

La invención proporciona además una composiciÓfl farmacéutica que comprende la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

También están abarcados por la invención los procedimientos para usar la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T y la composición farmacéutica de la invención. En un aspecto, la invención proporciona una molécula biespecífica de uniÓfl a antígeno activadora de linfocitos T o una composición farmacéutica de la invención para su uso como un medicamento. En un aspecto se proporciona una molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T o una composiciÓfl farmacéutica de acuerdo con la invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad en un individuo que lo necesite. En un modo de realización específico, la enfermedad es cáncer.

La invención también proporciona una molécula biespecifica de unión a antígeno activadora de linfocitos T o una composición farmacéutica de la invención para su uso en un procedimiento para inducir la lisis de una célula diana en un individuo, que comprende poner en contacto una célula diana con una molécula biespecifica de unión a antígeno activadora de linfocitos T de la invención en presencia de un linfocito T, en la que la célula diana es una célula tumoral.

Breve descripción de los dibujos

FIGURA 1. Configuraciones a modo de ejemplo de las moléculas biespecíficas de unión a antigeno activadoras de linfocitos T divulgadas en el presente documento. Ilustración de (A) la molécula «1+1 IgG scFab, con un brazo», y (B) la molécula «1+1IgG scFab, con un brazo invertido». En la molécula «1+1 IgG scFab, con un brazo», la cadena ligera del Fab dirigido al linfocito T está fusionada a la cadena pesada mediante un conector, mientras que la molécula «1+1 IgG scFab, con un brazo invertido» tiene el conector en el Fab dirigido al tumor. (C) lIustraciórl de la molécula «2+1 IgG scFab». (O) Ilustración de la molécula «1+1 IgG scFab». (E) Ilustración de la molécula «1+1 IgG Crossfab». (F) Ilustración de la molécula «2+1 1gG Crossfab». (G) Ilustración de la molécula «2+1 IgG Crossfab» con orden alternativo de los componentes Crossfab y Fab (<<invertidos»). (H) Ilustración de la molécula de «1+1 IgG Crossfab, fusión de cadena ligera (LC)>>. (F) Ilustración de la molécula «1+1 CrossMab». (J) Ilustración de la molécula «2+1 IgG Crossfab, cadena ligera conectada». (K) Ilustración de la molécula «1 +1 IgG Crossfab, cadena ligera conectada». (L) lIustraciórl de la molécula «2+1 IgG Crossfab, cadena ligera conectada, invertida». (M) Ilustración de la molécula «1+1 IgG Crossfab, cadena ligera conectada, invertida». Punto negro: modificación opcional en el dominio Fc que promueve la heterodimerización.

FIGURA 2. SOS PAGE (BislTris al 4-12 %, NuPage Invitrogen, teñido con Coomassie) de «1+1 IgG scFab, con un

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brazo» (anli-MCSPlanli-huCD3) (véase SEa ID NO: 1, 3, 5), no reducido (Al y reducido (B), y de «1 +1 1gG scf ab, con un brazo invertidQ») (anti-MCSP/anti-huCD3) (véase SEa ID NO: 7, 9, 11 l. no reducido (C) y reducido (D).

FIGURA 3. Cromatografía analitica de exclusión por tamaño (Superdex 200 101300 GL GE Healthcare; MQPS 2 mM, pH 7,3, NaCI 150 mM, NaCI al 0,02 % (plv), 50 1-19 de muestra inyectada) de «1 +1 IgG scfab, oon un brazo» (anliMCSP/anti-huCD3) (véase SEa ID NO: 1,3,5) (Al Y «1 +1 IgG scf ab, con un brazo invertido» (anli-MCSP/anti-huCD3) (véase SEa ID NO: 7, 9, 11) (8).

FIGURA 4. SOS PAGE (BisITris al 4-12 %, NuPage Invitrogen, teñido oon Coomassie) de «1+1 IgG scf ab, con un brazo» (anti-EGFR/anti-huCD3) (véase SEa ID NO: 43, 45, 57), no reducido (A) y reducido (B), y de «1+1 IgG scFab, con un brazo invertido» (anti-EGFRJanti-huCD3) (véase SEO ID NO: 11, 49, 51), no reducido (C) y reducido (D).

FIGURA S. Cromatografía analítica de exclusión por tamaño (Superdex 200 10/300 GL GE Healthcare; MOPS 2 mM, pH 7,3, NaCI 150 mM, NaCI al 0,02 % (pfv), 50 I-.Ig de muestra inyectada) de «1+1 IgG scFab, con un brazo» (antiEGFR/anti-huCD3) (véase SEO ID NO: 43, 45, 47) (A) Y «1+1 IgG scFab, con un brazo invertido» (anti-EGFRlantihuC03)(véase SEO ID NO: 11, 49, 51) (B).

FIGURA 6. (A, B) SDS PAGE (Bis/Tris al 4---12 %, NuPage Invitrogen, teñido con Coomassie) de «1+1 IgG scFab, con un brazo invertido» (anti-FAPlanti-huC03) (véase SEO ID NO: 11, 51, 55), no reducido (A) y reducido (B). (C) Cromatografía analítica de exclusión por tamaño (Superdex 200 10/300 GL GE Healthcare; MOPS 2 mM pH 7,3, NaCI 150 mM, NaCI al 0,02 % (pfv); inyección de 50 I-.Ig de muestra) de «1+1 IgG scFab, con un brazo invertído» (antiFAPlanti-huC0 3).

FIGURA 7. SDS PAGE (Bis/Tris a14-12 %, NuPage Invitrogen, teñido con Coomassie) de (A) «2+1 IgG scFab, P329G LALA» (anti-MCSPlanti-huC03) (véase SEO ID NO: 5, 21, 23), no reducido (columna 2) y reducido (columna 3); de

(B) «2+1IgG scFab, LALA» (anti-MCSP/anti-huC03) (véase SEO ID NO: 5, 17, 19), no reducido (columna 2) y reducido (columna 3); de (C) «2+1 IgG scFab, wh (anti-MCSPlanti-huCD3) (véase SEO ID NO: 5, 13, 15), no reducido (columna 2) y reducido (columna 3); y de (O) «2+1 IgG scfab, P329G LALA N2970» (anti-MCSP/anti-huC03) (véase SEO ID NO: 5, 25, 27), no reducido (columna 2) y reducido (columna 3).

FIGURA 8. Cromatografía analítica de exclusión por tamaño (Superdex 200 10/300 GL GE Heallhcare: MOPS 2 mM pH 7,3, NaCI 150 mM, NaCI al 0,02 % (pfv); inyección de 50 I-.Ig de muestra) de (A) «2+1 19G scFab, P329G LALA» (anti-MCSP/anti-huCD3) (véase SEO ID NO: 5, 21, 23); de (B) «2+1 IgG scFab, LALA» (anti-MCSP/anti-huC03) (véase SEO ID NO: 5, 17, 19); de (C) «2+1 IgG scFab, wt» (anti-MCSPlanti-huC03) (véase SEO ID NO: 5, 13, 15); Y de (O) «2+1 IgG scFab, P329G LALA N2970 )) (anti-MCSP/anti-huC0 3) (véase SEO ID NO: 5, 25, 27).

FIGURA 9. (A, B) SOS PAGE (BisfTris al 4-12 %, NuPage Invitrogen, teñido con Coomassie) de «2+1 IgG scFab, P329G LALA» (anti-EGFRJanti-huCD3) (véase SEO ID NO: 45, 47, 53), no reducido (A) y reducido (B). (C) Cromatografía analítica de exclusión por tamaño (Superdex 200 10/300 GL GE Healthcare; MOPS 2 mM pH 7,3, NaCI 150 mM, NaCI al 0,02 % (plv); inyección de 50 IJg de muestra) de «2+1 IgG scFab, P329G LALA» (anti-EGFRJantihuC0 3).

FIGURA 10. (A, B) SOS PAGE (BisfTris al 4-12 %, NuPage Invitrogen, teñido con Coomassie) de «2+1 IgG scFab, P329G lAlA» (anti-FAP/anti-huC0 3) (véase SEO ID NO: 57, 59, 61), no reducido (A) y reducido (B). (C) Cromatografía analitica de exclusión por tamaño (Superdex 200 10/300 GL GE Healthcare; MOPS 2 mM pH 7,3, NaCI 150 mM, NaCI al 0,02 % (pfv); inyección de 50 IJg de muestra) de «2+1 IgG scFab, P329G LALA» (anti-FAPlanti-huCD3).

FIGURA 11. (A, B) SOS PAGE (Tris-Acetato al 4-12 % (A) o BisITris al 4-12 % (B), NuPage Invitrogen, teñido con Coomassie) de «1 +1 IgG Crossfab, Fc (ojal) P329G LAlAIFc (botón) wt)) (anti-MCSPlanti-huCD3) (véase SEO ID NO: 5, 29, 31, 33), no reducido (A) y reducido (B). (C) Cromatografía analítica de exclusión por tamaño (Superdex 200 10f300 Gl GE Healthcare; MOPS 2 mM pH 7,3, NaCI150 mM, NaCI al 0,02 % (pfv); inyección de 50 IJg de muestra) de «1 +1 IgG Crossfab, Fc (ojal) P329G LAlAIFc (botón) wt» (anti-MCSP/anti-huC03).

FIGURA 12. (A, B) SOS PAGE (BislTris a14-12 %, NuPage Invitrogen, teñido con Coomassie) de «2+1 IgG Crossfab» (anti-MCSP/anti-huC03) (véase SEO ID NO: 3, 5, 29, 33), no reducido (A) y reducido (B). (C) Cromatografía analítica de exclusiórl por tamaño (Superdex 200 10/300 GL GE HeaUhcare; MOPS 2 mM, pH 7,3, NaCI 150 mM, NaCI al 0,02 % (pfv); inyecciórl de 50 IJg de muestra) de «2+1 IgG Crossfab» (anti-MCSPlanti-huCD3).

FIGURA 13. (A, B) SOS PAGE (BislTris a14-12 %, NuPage Invitrogen, teñido con Coomassie) de «2+1 IgG Crossfab» (anti-MCSP/anti-cyCD3) (véase SEO ID NO: 3, 5, 35, 37), no reducido (A) y reducido (B). (C) Cromatografia analítica de exclusiórl por tamaño (Superdex 200 10/300 GL GE Healthcare; MOPS 2 mM, pH 7,3, NaCI 150 mM, NaCI al 0,02 % (pfv); inyecciórl de 50 IJg de muestra) de «2+1 IgG Crossfab» (anti-MCSP/anti-cyC03).

FIGURA 14. (A, B) SOS PAGE (BisfTris a14-12 %, NuPage Invitrogen, teñido con Coomassie) de «2+1 IgG Crossfab, invertido» (anti-CEAlanti-huCD3) (véase SEO ID NO: 33, 63, 65, 67), no reducido (A) y reducido (B). (C) Cromatografía analitica de exclusión portamaño (Superdex 200 10/300 GL GE Healthcare; MOPS 2 mM, pH 7,3, NaCI150 mM, NaCI

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al 0,02 % (plv); inyección de 50 1-19 de muestra) de «2+1 IgG Crossfab, invertido» (anti-CEAlanti-huCD3).

FIGURA 15. (A) Estabilidad térmica de «(SCFV)2-Fc)) y «(dsscFv)z-Fc» (anti-MCSP (LC007)1anti-huCD3 (V9». Dispersión de luz dinámica, medida en una rampa de temperatura de 25-75 oC a 0,05 °Cfmin. Curva negra: «(SCFV)2Fe»; curva gris: «(dsscFv)2-Fc». (B) Estabilidad térmica de «2+1 IgG scFab» (véase SEa ID NO: 5, 21 , 23) Y «2+1 IgG Crossfab» (anti-MCSPfanti-huCD3) (véase SEa ID NO: 3, 5, 29, 33). Dispersión de luz dinámica, medida en una rampa de temperatura de 25-75 oC a 0,05 oC/mino Curva negra: «2+1 IgG scfab»; curva gris: «2+1 IgG Crossfab».

FIGURA 16. Configuración del ensayo Biacore para (A) la determinación de la interacción de diversos Fc mutantes con FcyRllla humano, y para (8) la unión simultánea de construcciones biespec[ficas de linfocitos T con diana tumoral y C03y(G4S)sC03t-AcTev-Fc(botón)-Avi/Fc(ojal) humano.

FIGURA 17. Unión simultánea de constIucciooes biespecificas de linfocitos T al dominio 03 de MCSP humano y C03y(G4S)sC03t-AcTev-Fc(botón)-Avi/Fc(ojal) humano. (A) «2+1 IgG erossfab» (véase SEO ID NO: 3, 5, 29, 33),

(S) «2+1 1gG scFab» (véase SEO ID NO: 5, 21, 23).

FIGURA 18. Unión simultánea de construcciones biespecíficas de linfocitos T a EGFR humano y e03y(G4S)Se03EAcTev-Fc(botórl)-AvVFc(ojal) humano. (A) «2+1 IgG scFab» (véase SEO ID NO: 45, 47, 53), (8) «1+1IgG scFab, con un brazo» (véase SEO ID NO: 43, 45, 47), (e) «1+1 IgG scFab, con un brazo invertido» (véase SEO ID NO: 11,49, 51) Y (O) «1+1 19G scFab» (véase SEO ID NO: 47, 53, 213).

FIGURA 19. Uniórl de la molécula «(SCFV)2» (50 nM) a C03 expresada en células Jur1o;at (A), o a MeSp en células eolo-38 (B), medida por FACS. Se representa la intensidad media de fluorescencia en comparación con células no tratadas y células teñidas con el anticuerpo secundario solamente.

FIGURA 20. Unión de la construcciórl «2+1 IgG scFab, lALA» (véase SEO ID NO: 5, 17, 19)(50 nM) a C03 expresada en células Jurkat (A), o a MeSp en células eolo-38 (B), medida por FAeS. Se representa la intensidad media de fluorescencia en comparación con células tratadas con la IgG anti-eD3 de referencia (como se indica), células no tratadas y células teñidas con el anticuerpo secundario solamente.

FIGURA 21. Unión de las construcciones «1+1 scFab IgG, con un brazo» (véase SEO ID NO: 1, 3, 5) Y «1 +1 IgG scFab, con un brazo invertido» (véase SEO ID NO: 7, 9, 11) (50 nM) a C03 expresado en células Jur1o;at (A), o a MCSP en células eolo-3S (8), medida pOf FAeS. Se representa la intensidad media de fluorescencia en comparación con células tratadas con la IgG anti-e03 o anti-MeSP de referencia (como se indica), células no tratadas y células teñidas con el anticuerpo secundario solamente.

FIGURA 22. Unión dependiente de la dosis de la construcciórl biespecifica «2+1 19G scFab, LALA» (véase SEO ID NO: 5, 17, 19) Y la correspoodiente IgG anti-MCSP a MCSP en células Colo-3S, medida por FACS.

FIGURA 23. Nivel de expresión en superficie de diferentes marcadores de activación en linfocitos T humanos después de la incubación con construcciones biespecíficas para C03-MCSP «2+1 scFab LALA» 1 nM (véase SEO ID NO: 5, 17,19) o «(SCFV)2)) en presencia o ausencia de células diana tumorales CoIo-3S. como se indica (proporción E:T de PBMC a células tumorales = 10:1). Se representa el nivel de expresión del marcador de activaciórl temprana C069 (A), o el marcador de activación tardia C025 (a) en linfocitos T COS· después de 15 o 24 horas de incubaciórl, respectivamente.

FIGURA 24. Nivel de expresión superficial del marcador de activación tardía C025 en linfocitos T humanos después de la incubación con construcciones biespecificas para C03-MCSP «2+1 scFab LALA» 1 nM (véase SEO ID NO: 5, 17, 19) o «(scFv)2» en presencia o ausencia de células diana tumorales Colo-3S, como se indica (proporción E:T = 5: 1). Se representa el nivel de expresión del marcador de activación tardla C025 en linfocitos T COS' (A) o en linfocitos T C04· (S) después de 5 días de incubación.

FIGURA 25. Nivel de expresión superficial del marcador de activación tardía C025 en linfocitos T COS+de macaco de dos animales diferentes (macaco Nestor, macaco Nobu) después de 43 horas de incubación con las concentraciones indicadas de la construcción biespecífica «2+1 IgG Crossfab» (dirigida a CD3 de macaco y MCSP humano, véase SEO ID NO: 3, 5, 35, 37), en presencia o ausencia de células diana tumorales humanas MV-3 que expresan MCSP (proporción E:T = 3:1 ). Como controles se usaron las IgG de referencia (IgG anti-C03 de macaco, IgG anti-MCSP humano) o el estímulo no fisiológico PHA-M.

FIGURA 26. Niveles de IFN-y secretados por linfocitos pan T humanos que se activaron durante 1S,5 horas por la construcción biespecífica para C03-MCSP «2+1 IgG scFab, LALA» (véase SEO ID NO: 5, 17, 19) en presencia de células tumorales US7MG (proporción E:T = 5:1). Como controles se administraron las IgG anti-C03 y anti-MCSP correspondientes.

FIGURA 27. Muerte celular (medida por la liberación de LOH) de células tumorales MOA-MB-435 tras el cocullivo con linfocitos pan T humanos (proporciórl E:T = 5:1) y activación durante 20 hOfas por diferentes concentraciones de

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moléculas biespecíficas «2+1 IgG scFab» (véase SEa ID NO: 5, 21, 23), «2+11gG Crossfab» (véase SEO ID NO: 3, 5,29, 33) Y «(SCFV)2» y las IgG correspondientes.

FIGURA 28. Muerte celular (medida PO( la liberación de LDH) de células tumorales MDA·MB-435 tras el cocultivo con linfocitos pan T humanos (proporción E:T = 5:1) y activación durante 20 horas por diferentes concentraciones de las construcciones biespecificas y las 19G correspondientes. Se compararon las construcciones «2+1 19G scFab» que difieren en su dominio Fe (que tienen un dominio Fe de tipo natural (véase SEO ID NO: 5, 13, 15) o un dominio Fe mutado para suprimir la función celular efectora (NK): P329G LALA (véase SEO ID NO: 5, 21, 23), P329G LALA N297D (véase SEa ID NO: 5, 25, 27» y la construcción «2+1 IgG Crossfab» (véase SEO ID NO: 3, 5, 29, 33).

FIGURA 29. Muerte celular (medida por la liberación de LOH) de células tumorales Colo-38 tras el cocultivo con linfocitos pan T humanos (proporción E:T = 5:1), tratadas con la construcción biespecifica para C03-MCSP «2+1 IgG scFab, LALA» (véase SEO ID NO: 5,17,19), la molécula «(SCFV)2» o las IgG correspondientes durante 18,5 horas.

FIGURA 30. Muerte celular (medida por la liberación de LOH) de células tumorales Colo-38 tras el cocultivo con linfocitos pan T humanos (proporción E:T = 5:1), tratadas con la construcción biespecifica para C03-MCSP «2+1 IgG scFab, LALA» (véase SEO ID NO: 5,17,19), la molécula «(SCFV)2» o las IgG correspondientes durante 18 horas.

FIGURA 31. Muerte celular (medida por la liberación de LOH) de células tumorales MDA-MB-435 tras el cocultivo con linfocitos pan T humanos (proporción E:T = 5:1) y activación durante 23,5 horas por diferentes concentraciones de la construcción biespeclfica para C03·MCSP «2+1 IgG scFab, LALA» (véase SEO ID NO: 5, 17, 19), la molécula «(SCFV)2» o las IgG correspond ientes.

FIGURA 32. Muerte celular (medida por la liberación de LOH) de células tumorales Colo·38 tras el cocultivo con linfocitos pan T humanos (proporción E:T = 5:1) y activación durante 19 horas por diferentes concentraciones de las construcciones biespecificas para C03·MCSP «1+1 IgG scFab, con un brazo» (véase SEO 10 NO: 1, 3, 5), «1+1 IgG scFab, con un brazo invertido» (véase SEO ID NO: 7, 9, 11) o «(scFv)2» o las IgG correspondientes.

FIGURA 33. Muerte celular (medida por la liberación de LOH) de células tumorales Colo·38 tras el cocultivo con linfocitos pan T humanos (proporción E:T = 5:1 ), tratadas con la construcción biespecífica para C03-MCSP «1+1 IgG scFab» (véase SEO ID NO: 5, 21, 213) o la molécula «(SCFV)2» durante 20 horas.

FIGURA 34. Muerte celular (medida pOf la liberación de LOH) de células tumorales MOA-MB-435 tras el cocultivo con linfocitos pan T humanos (proporción E:T = 5:1) y activación durante 21 horas por diferentes concentraciones de las construcciones biespecíficas y las IgG correspondientes. Se compararon las construcciones biespecíficas para CD3MCSP «2+1 IgG Crossfab» (véase SEO ID NO: 3, 5, 29, 33) Y «1+1 IgG Crossfab» (véase SEO ID NO: 5, 29, 31, 33), la molécula «(scFv)2» y las IgG correspondientes.

FIGURA 35. Muerte celular (medida por liberación de LOH) de diferentes células diana (células diana tumorales Colo38 positivas para MCSP, células madre mesenquimales derivadas de médula ósea o tejido adiposo, o pericitos de la placenta, como se indica) inducida por la activación de linfocitos T humanos por concentraciones de 135 ng/ml o 1,35 ng/ml de la construcción biespecífica para de CD3-MCSP «2+1 IgG Crossfab» (véase SEO ID NO: 3. 5,29.33) (proporción E:T = 25:1).

FIGURA 36. Muerte celular (medida por la liberación de LOH) de células diana tumorales Colo-38, medida después de una incubaciÓfl durante la noche de 21 h, tras el cocultivo con PBMC humanas y diferentes construcciones biespecificas para C03·MCSP «2+1 IgG scFab, LALA» (véase SEO ID NO: 5, 17, 19) Y «(SCFV)2» o una IgG anti· MCSP modificada pOf glucoingenieria (GlycoMab). l a propOfGÍón entre células efectoras y células diana (EfT) se fijó en 25:1 (A), o varió como se representa (B). las PBMC se aislaron a partir de sangre fresca (A) o de una capa leucocitica (B).

FIGURA 37. Efecto citotóxico dependiente del tiempo de la construcción «2+1 IgG Crossfab», dirigido a C03 de macaco y a MCSP humano (véase SEO ID NO: 3, 5, 35, 37). Se representa la liberación de lDH a partir de células MV-3 humanas que expresan MCSP tras el cocultivo con PBMC de macaco primarias (proporción E:T = 3: 1) durante 24 h o 43 h. Como controles se usaron las IgG de referencia (lgG anti·CD3 de macaco e IgG anti-MCSP humano) a la misma molaridad. PHA-M sirvió como control para la activaciÓfl de linfocitos T (no fisiológica).

FIGURA 38. Muerte celular (medida por la liberación de LOH) de células de mela noma MV-3 positivas para huMCSP tras el cocultivo con PBMC humanas (proporción E:T = 10:1), tratadas con diferentes construcciones biespecrficas C03·MCSP (<<2+1 IgG Crossfab» (véase SEO ID NO: 3, 5, 29, 33) Y «(SCFV)2») durante -26 horas.

FIGURA 39. Muerte celular (medida por la liberación de LOH) de células tumorales LS·174T positivas para EGFR tras el cocultivo con linfocitos pan T humanos (proporción E:T = 5:1), tratadas con diferentes construcciones biespeclficas para CD3-EGFR (<<2+1 IgG scFab» (véase SEO ID NO: 45, 47, 53), «1+1IgG scFab» (véase SEO ID NO: 47, 53, 213) Y «(scFv)2») o las IgG de referencia durante 18 horas.

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FIGURA 40. Muerte celular (medida por la liberación de LDH) de células tumorales LS-174T positivas para EGFR tras el cocultivo con linfocitos pan T humanos (proporción E:T = 5:1). tratadas con diferentes cooslrucciones biespecíficas para CD3-EGFR (<<1+1 IgG scFab, con un brazo» (véase SEO ID NO: 43, 45, 47), «1+1 IgG scFab, con un brazo invertido» (véase SEO ID NO: 11, 49, 51), «1+1 IgG scfab» (véase SEO ID NO: 47, 53, 213) Y «(SCFV)2») o las IgG de referencia durante 21 horas.

FIGURA 41. Muerte celular (medida por la liberación de lDH) de células tumorales LS-174T positivas para EGFR tras el cocultivo con linfocitos pan T humanos (Al o linfocitos T humanos ¡ndiferenciados (9), tratadas con diferentes construcciones biespecíficas para CD3-EGFR (<<1+1 IgG scFab, oon un brazo» (véase SEO ID NO: 43, 45, 47), «1+1 IgG scFab, con un brazo invertido» (véase SEa ID NO: 11, 49, 51) Y a(scFv)2») o las IgG de referencia durante 16 horas. l a proporción entre células efectoras y células diana fue de 5:1.

FIGURA 42. Muerte celular (medida por la liberación de l DH) de fibroblastos GM05389 positivos para FAP tras el cocultivo oon linfocitos pan T humanos (proporción E:T = 5:1), tratados con diferentes construcciones biespec[ficas para CD3-FAP (<<1+1 IgG scFab, con un brazo invertido» (véase SEa ID NO: 11, 51, 55), «1+1 IgG scFab» (véase SEa ID NO: 57, 61, 213), «2+1 IgG scFab» (véase SEa ID NO: 57, 59, 61) y«(scFv)2») durante -18 horas.

FIGURA 43. Análisis por citometria de flujo de los niveles de expresión de CD107alb, asi como de los niveles de perforina en linfocitos T CD8+ que se han tratado oon diferentes coostrucciones biespecíficas para CD3-MCSP (<<2+1 IgG scFab, LALA» (véase SEa ID NO: 5, 17, 19) Y «(SCFV)2») o las IgG de control correspondientes en presencia (A)

o ausencia (B) de células diana durante 6 h. Se incubaron linfocitos pan T humanos con 9,43 nM de las diferentes moléculas en presencia o ausencia de células diana tumorales Colo-38 con una proporción entre células efectoras y diana de 5:1. Se añadió monensina después de la primera hora de incubación para aumentar los niveles de proteina intracelular al evitar el transporte de proteinas. las puertas se establecieron en todas las células positivas para CD107a1b, positivas para perforina o doble positivas, oomo se muestra.

FIGURA 44. Proliferación relativa de linfocitos T humanos CD8+ (A) o CD4+ (B) tras la incubación con 1 nM de diferentes construcciones biespec[ficas para CD3-MCSP (<<2+1 IgG scFab, LAlA» (véase SEa ID NO: 5, 17, 19) o «(scFv)2») o las IgG de control correspondientes en presencia o ausencia de células diana tumorales CoIo-38 en una proporción entre células efectoras y tumorales de 5:1. los linfocitos pan T humanos marcados con CFSE se caracterizaron por FACS. El nivel de proliferación relativa se determinó estableciendo una puerta alrededor de las células no proliferantes y usando el número de célula de esta puerta en relación con el número total de células medidas como la referencia.

FIGURA 45. Niveles de diferentes citocinas medidos en el sobrenadante de PBMC humanas después del tratamiento con 1 nM de construcciones biespecíficas para CD3-MCSP (<<2+1IgG scFab, LALA» (véase SEa ID NO: 5,17, 19) o «(scFv)2») o las IgG de cootrol correspondientes en presencia (A) o ausencia (6) de células tumorales Co10-38 durante 24 horas. l a proporción entre células efectoras y células diana fue de 10:1.

FIGURA 46. Niveles de diferentes citocinas medidos en el sobrenadante de sangre completa después del tratamiento con 1 nM de diferentes construcciones biespecificas para CD3-MCSP (<<2+1 IgG scFab», «2+1 IgG Crossfab» (véase SEa ID NO: 3. 5, 29. 33) o «(SCFV)2))) o las IgG de control correspondientes en presencia (A, B) o ausencia (C, D) de células tumorales Colo-38 durante 24 horas. Entre las construcciones biespecíficas se encontraban diferentes construcciones «2+1 IgG scFab» que tenian un dominio Fc de tipo natural (véase SEa ID NO: 5, 13, 15), o un dominio Fc mutado para suprimir la función celular efectora (NK) (LALA (véase SEa ID NO: 5, 17, 19), P329G LALA (véase SEa ID NO: 5, 2, 23) Y P329G LALA N297D (véase SEa ID NO: 5, 25, 27».

FIGURA 47. Análisis CE-SDS. Electroferograma mostrado oomo SDS PAGE de «2+1 IgG Crossfab, cadena ligera conectada» (véase SEa ID NO: 3, 5, 29, 179) (columna 1: reducido, columna 2: no reducido).

FIGURA 48. Cromatografía analítica de exclusión por tamaño de «2+1IgG Crossfab, cadena ligera conectada» (véase SEO ID NO: 3, 5, 29,179) (producto final). Se inyectaron 20 I-Ig de muestra.

FIGURA 49. Muerte celular (medida por la liberación de lDH) de células tumOfales MV-3 positivas para MCSP tras el cocultivo con PBMC humanas (proporción E:T :: 10: 1), tratadas coo diferentes construcciooes biespecíficas para CD3MCSP durante -44 horas (<<2+1 IgG Crossfab» (véase SEa ID NO: 3, 5, 29, 33) Y 2+1 «lgG Crossfab, lC conectada» (véase SEO ID NO: 3, 5, 29, 179)). Se aislaron PBMC humanas a partir de sangre fresca de voluntarios sanos.

FIGURA 50. Muerte celular (medida por la liberación de LDH) de células tumorales Colo-36 positivas para MC$P tras el cocultivo con PBMC humanas (proporción E:T = 10:1), tratadas con diferentes construcciones biespecíficas para CD3-MCSP durante -22 horas (<<2+1 IgG Crossfab» (véase SEO ID NO: 3, 5, 29, 33) Y 2+1 «lgG Crossfab, lC conectada» (véase SEa ID NO: 3, 5, 29, 179». Se aislaron PBMC humanas a partir de sangre fresca de voluntarios sanos.

FIGURA 51. Muerte celular (medida por la liberaciÓfl de l DH) de células tumorales Co10-38 posilivas para MCSP tras el oocullivo con PBMC humanas (proporción E:T = 10:1), traladas con diferentes conslrucciones biespecíficas para

5

15

25

35

45

55

65

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CD3-MCSP durante -22 horas (<<2+1 IgG Crossfab» (véase SEa ID NO: 3, 5, 29, 33) Y 2+1 «lgG Crossfab, Le conectada» (véase SEO ID NO: 3, 5, 29, 179)). Se aislaron PBMC humanas a partir de sangre fresca de voluntarios sanos.

FIGURA 52. Muerte celular (medida por la liberación de LDH) de células tumorales WM266-4 positivas para MCSP tras el cocultivo COfl PBMC humanas (proporción E:T = 10:1), tratadas con diferentes oonslrucciones biespecíficas para CD3-MCSP durante -22 horas (<<2+1 IgG Crossfab» (véase SEO ID NO: 3, 5, 29, 33) Y 2+1 «lgG Crossfab, le conectada» (véase SEO ID NO: 3, 5, 29, 179». Se aislaron PBMC humanas a partir de sangre fresca de voluntarios sanos.

FIGURA 53. Nivel de ex:presión superficial del marcador de activación temprana CD69 (Al y el marcador de activación lardia CD25 (8) en linfocitos T CD8+ humanos después de 22 horas de incubación con 10 nM , 80 pM 03 pM de diferentes construcciones biespecificas para C03-MCSP (<<2+1 IgG Crossfab» (véase SEO ID NO: 3, 5, 29, 33) Y «2+1 IgG Crossfab, LC conectada» (véase SEO ID NO: 3, 5, 29, 179)) en presencia o ausencia de células diana tumorales Colo-38 que expresan MCSP humano (proporción E:T = 10:1),

FIGURA 54. Análisis CE-SOS. (A) Electroferograma mostrado como SOS-PAGE de «1+1 IgG Crossfab»; intercambio VLNH (LC007N9) (véase SEO ID NO: 5, 29, 33, 181): a) no reducido, b) reducido. (B) Electroferograma mostrado como SDS-PAGE de «1+1 IgG CrossMab»; intercambio CUCH1 (LC007N 9) (véase SEO ID NO: 5, 23,183, 185): a) reducido, b) no reducido. (C) Electroferograma mostrado como SOS-PAGE de «2+1 19G Crossfab, invertido»; intercambio CUCH1 (LC007N9) (véase SEO ID NO: 5, 23, 183, 187): a) reducido, b) no reducido. (D) Electroferograma mostrado como SOS-PAGE de «2+1 IgG Crossfab»; intercambio VLNH (M4-3 ML2IV9) (véase SEO ID NO: 33, 189, 191, 193): a) reducido, b) no reducido. (E) Electroferograma mostrado como SOS-PAGE de «2+1 19G Crossfab»: intercambio CUCH1 (M4-3 ML2IV9) (véase SEO ID NO: 183, 189, 193, 195): a) reducido, b) no reducido. (F) Electroferograma mostrado como SDS-PAGE de «2+1 IgG Crossfab, invertido»; intercambio CUCH1 (CH1A1AN9) (véase SEO ID NO: 65, 67, 183, 197): a) reducido, b) no reducido. (G) Electroferograma mostrado como SOS-PAGE de «2+1IgG Crossfab»; intercambio CUCH1 (M4-3 ML2/H2C) (véase SEO ID NO: 189, 193, 199, 201): al reducido, b) no reducido. (H) Electroferograma mostrado como SDS-PAGE de «2+1 IgG Crossfab, invertido»; intercambio CUCH1 (431126N9) (véase SEO ID NO: 183, 203, 205, 207): a) reducido, b) no reducido. (1) Electroferograma mostrado como SDS-PAGE de ««2+1 IgG Crossfab, fusión de cadena ligera» (CH1A1AN9) (véase SEO ID NO: 183, 209, 211, 213): a) reducido, b) no reducido. (J) SDS PAGE (BisfTris al 4-12 %, NuPage Invilrogen, teñido con Coomassie) de «2+1 IgG Crossfab» (anti-MCSP/anti-huCD3) (véase SEO ID NO: 5, 23, 215, 217), no reducido (izquierda) y reducido (derecha). (K) Electroferograma mostrado como SDS-PAGE de «2+1 IgG Crossfab, invertido» (anli-MCSP/anti-huCD3) (véase SEO ID NO: 5, 23, 215, 219): a) reducido, b) no reducido. (L) SDS PAGE (BislTris al 4-12 %, NuPage Invitrogen, teñido con Coomassie) de «1+1 IgG Crossfab» (anti-C033fanti-huCD3) (véase SEO ID NO: 33, 213, 221, 223), reducido (izquierda) y no reducido (derecha). (M) SDS PAGE (BisfTris al 4-12 %, NuPage Invitrogen, teñido con Coomassie) de «2+1 IgG Crossfab» (anti-CD33/anti-huC03) (véase SEO ID NO: 33, 221 , 223, 225), reducido (izquierda) y no reducido (derecha). (N) SDS PAGE (BisITris a14-12 %, NuPage Invitrogen, teñido con Coomassie) de «2+1 IgG Crossfab» (anti-CD20/anti-huCD3) (véase SEO ID NO: 33, 227, 229, 231), no reducido.

FIGURA 55. Unión de construcciones biespecificas (CENC03) «2+1 IgG Crossfab, invertido (VLNH)>> (véase SEO ID NO: 33, 63. 65, 67) Y «2+1 IgG Crossfab, invertido (CUCH1)>> (véase SEO ID NO: 65, 67. 183,197» a C03 humano, expresada por células Jurkat (A), o a CEA humano, expresada por células LS-174T (B), según lo determinado por FACS. Como control también se evaluarOfl la concentración máxima equivalente de las 19G de referencia y la tinción de fOfldo debida al anticuerpo secundario marcado (fragmento F(ab')2 AffiniPure de cabra conjugado con anti-FITC humano, específico para fragmento Fcy, Jackson Immuno Research Lab n.o 109-096-098).

FIGURA 56. Unión de construcciones biespecíficas (MCSP/C03) «2+1 IgG Crossfab» (véase SEO ID NO: 3, 5, 29, 33) Y «2+1 IgG Crossfab, invertidOl) (véase SEO ID NO: 5, 23, 183, 187» a C03 humano, expresada por células Jurkat (A), o a MCSP humano, expresada por células tumorales WM266-4 (B), según lo determinado por FACS.

FIGURA 57. Unión de la construcción biespecífica «1+1 IgG Crossfab, fusión de cadena ligera» (véase SEO ID NO: 183, 209,211, 213) a CD3 humano, expresada por células Jurkat (A), o a CEA humano, expresada por células LS174T (8), según lo determinado por FACS.

FIGURA 58. Unión de las construcciones biespecificas «2+1 IgG Crossfab» (véase SEO ID NO: 5, 23, 215, 217) Y «2+1IgG Crossfab, invertido» (véase SEO ID NO: 5, 23, 215, 219) a C03 humano, expresada por células Jurkat (A),

o a MCSP humano, expresada por células tumorales WM2664 (8), según lo determinado por FACS.

FIGURA 59. Nivel de expresión superficial del marcador de activación temprana CD69 (A) o el marcador de activación tardía C025 (8) en linfocitos T CD4+ o C08-humanos después de 24 horas de incubación con las concentraciones indicadas de las construcciones biespecificas para C03/MCSP «1+1 CrossMab» (véase SEO ID NO: 5, 23,183,185), «1+1 IgG Crossfab» (véase SEO ID NO: 5, 29, 33, 181) Y «2+1 IgG Crossfab» (véase SEO ID NO: 3, 5, 29, 33). El ensayo se realizó en presencia o ausencia de células diana MV-3, según se indica.

FIGURA 60. Nivel de expresión superficial del marcador de activación temprana CD25 en células CD4+ o C08-de dos

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macacos diferentes (A y Bl en presencia o ausencia de células tumorales MV-3 positivas para huMCSP Iras el cocultivo con PBMC de macaco (proporción E:T = 3:1, normalizado a números CD3+), tratadas con la construcción «2+1 IgG Cossfab)) (véase SEO ID NO: 5, 23, 215, 217) Y la construcción «2+1 IgG Cossfab, invertida)) (véase SEO ID NO: 5, 23, 215, 219) durante -41 horas.

FIGURA 61. Muerte celular (medida por la liberación de LDH) de células tumorales MKN-45 (Al o LS-174T (B) tras el cocultivo con PBMC humanas (proporción E:T = 10:1) y activación durante 28 horas por diferentes concentraciones de la construcción «2+1 IgG Crossfab, invertido (VLNH)>> (véase SEO ID NO: 33, 63, 65, 67) frente a la construcción «2+1 IgG Crossfab, invertido (CUCH1)>> (véase SEa ID NO: 65, 67, 183, 197).

FIGURA 62. Muerte celular (medida por la liberación de LOH) de células tumorales WM266·4 tras el cocultivo con PBMC humanas (proporción E:T = 10:1) y la activación durante 26 horas por diferentes concentraciones de la construcción «2+1 19G Crossfab (VLNH)>> (véase SEa ID NO: 33, 189, 191 , 193) frente a la construcción «2+1 IgG Crossfab (CUCH1)>> (véase SEa ID NO: 183, 189, 193, 195).

FIGURA 63. Muerte celular (medida por la liberación de LOH) de células tumorales MV·3 tras el cocultivo con PBMC humanas (proporción E:T = 10:1) y la aclivación durante 27 horas por diferentes concenlraciones de la conslrucción «2+1 IgG Crossfab (VHNL)>> (véase SEa ID NO: 33, 189, 191, 193) frente a la construcción «2+1 IgG Crossfab (CUCH1)>> (véase SEa ID NO: 183, 189, 193, 195).

FIGURA 64. Muerte celular (medida por la liberación de lDH) de células tumorales humanas WM266-4 (A) o MV·3 (B)

(B) positivas para MCSP tras el cocullivo con PBMC humanas (proporción E:T = 10:1) y activación durante 21 horas por diferentes concentraciones de las construcciones «2+1 IgG Crossfab» (véase SEa ID NO: 3, 5, 29, 33), «1+1 CrossMab» (véase SEO ID NO: 5, 23, 183, 185) Y «1+1 IgG Crossfab» (véase SEO ID NO: 5, 29, 33, 181), según se ind ica.

FIGURA 65. Muerte celular (medida por la liberación de lOH) de células tumorales MKN-45 (A) o LS-174T (B) tras el cocultivo con PBMC humanas (proporciÓfl E:T = 10:1) y activación durante 28 horas por diferentes concentraciones de la construcción «1+1 IgG Crossfab, fusión lC» (véase SEO ID NO: 183, 209, 211 , 213).

FIGURA 66. Muerte celular (medida por la liberación de LDH) de células tumorales MC38-huCEA tras el cocultivo con PBMC humanas (proporción E:T = 10:1) y aclivación durante 24 horas por diferentes concentraciones de la de la construcción «1+11gG Crossfab, fusión LC» (véase SEa ID NO: 183, 209, 211 , 213) frente a una referencia no diana de «2+1 IgG Crossfab».

FIGURA 67. Muerte celular (medida por la liberación de lOH) de células tumorales MV-3 (A) o WM266-4 (B) positivas para MCSP tras el cocultivo con PBMC humanas (proporción E:T = 10:1), tratadas coolas construcciones «2+1 IgG Crossfab (V9)>> (véase SEa ID NO: 3, 5, 29, 33), «2+1 IgG Crossfab, invertido (V9)>> (véase SEa ID NO: 5, 23, 183, 187), «2+1 IgG Crossfab (anti-CD3)>> (véase SEa ID NO: 5, 23, 215, 217) Y «2+1 IgG Crossfab, invertido (anti-C03)>> (véase SEa ID NO: 5, 23, 215, 219).

Descripción detallada

Definiciones

Los términos se usan en el presente documento como se usan en general en la técnica, a menos que se defina lo contrario a continuación.

Como se usa en el presente documento, el término «molécula de unión a antigeno» se refiere, en su sentido más amplio, a una molécula que se une especrficamente a un determinante antigénico. Los ejemplos de moléculas de unión a anllgeno son inmunoglobulinas y derivados, por ejemplo, fragmentos de los mismos.

El término «biespecífico» significa que la molécula de unión a antígeno se puede unir de forma específica a al menos dos determinantes antigénicos distintos. Típicamente, una molécula biespecífica de unión a anUgeno comprende dos sitios de unión a antígeno, siendo cada uno de ellos específico para un determinante antigénico diferente. En ciertos modos de realización, la molécula biespecífica de unión a antígeno es capaz de unirse simultáneamente a dos determinantes antigénicos, particularmente dos determinantes antigénicos expresadosen dos células distintas.

El término «valente», como se usa en el presente documento, denota la presencia de un número espeCificado de sitios de unión a antigeno en una molécula de unión a antigeno. Como tal, el término «unión monovalente a un antigeno» indica la presencia de un (y no más de un) sitio de unión a antígeno específico para el antígeno en la molécula de unión a anllgeno.

Un «sitio de unión a antígeno» se refiere al sitio, es decir, uno o más residuos de aminoácido, de una molécula de unión a antígeno que proporciona interacción con el antígeno. Por ejemplo, el sitio de unión a antígeno de un anticuerpo contiene residuos de aminoácido de las regiones determinantes de complementariedad (CDR). Una

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molécula de inmunoglobulina natural tiene típicamente dos sitios de unión a antígeno, una molécula Fab tiene típicamente un único sitio de unión a antígeno.

Como se usa en el presente documento, el término «resto de uniórl a antígeno» se refiere a una molécula de polipéptido que se une específicamente a un determinante anligénico. En un modo de realización, un resto de unión a antígeno es capaz de dirigir la entidad a la que está unido (por ejemplo, un segundo resto de unión a antígeno) hasta un sitio diana, por ejemplo, a un tipo especifico de célula tumoral o estroma tumoral que lleva el determinante antigénico. En otro modo de realización, un resto de unión a antígeno es capaz de activar la señalización a través de su antígeno diana, por ejemplo, un antígeno complejo receptor de linfocitos T. Los restos de unión a antígeno incluyen anticuerpos y fragmentos de los mismos, tal como se define adicionalmente en el presente documento. Los restos de unión a anUgeno particulares incluyen un dominio de uniórl a antrgeno de un anticuerpo, que comprende una región variable de cadena pesada de anticuerpo y una región variable de cadena ligera de anticuerpo. En ciertos modos de realización, los restos de unión a antígeno pueden comprender regiones constantes de anticuerpo, como se define adicionalmente en el presente documento y es conocido en la técnica. Las regiones constantes de cadena pesada útiles incluyen cualquiera de los cinco isotipos: a, 6, t, Y o~. Las regiones constantes de cadena ligera útiles incluyen cualquiera de los dos isotipos: K y A.

Como se usa en el presente documento, el ténnino «determinante antigénico» es sinónimo de «antígeno» y «epítopo» y se refiere a un sitio (pOf ejemplo, un tramo contiguo de aminoácidos o una configuración confonnacional compuesta por diferentes regiones de aminoácidos no contiguos) en una macromolécula polipeptídica al que se une un resto de unión a anUgeno, formando un complejo antígeno-resto de unión a antígeno. Se pueden encontrar determinantes antigénicos útiles, por ejemplo, en las superficies de las células tumorales, en las superficies de las células infectadas por virus, en las superficies de otras células enfermas, en la superficie de células inmunitarias, libres en suero sanguíneo y/o en la matriz extracelular (ECM). Las protelnas a las que se hace referencia en el presente documento como antrgenos (por ejemplo, MCSP, FAP, CEA, EGFR, C033, C03) pueden ser cualquier forma natural de las proteínas de cualquier fuente vertebrada, incluidos mamíferos tales como primates (por ejemplo, seres humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique lo contrario. En un modo de realización particular, el antígeno es una proteína humana. Cuando en el presente documento se hace referencia a una proteína específica, el ténnino abarca la protelna no procesada de «longitud completa», así como cualquier forma de proteína que resulte del procesamiento en la célula. El término también engloba variantes naturales de la proteína, por ejemplo. variantes de empalme o variantes alélicas. Las proteínas humanas ejemplares útiles como antígenos incluyen, pero no se limitan

a: proteoglucano de sulfato de condroitina asociado a melanoma (MCSP), también conocido como proteoglucano de sulfato de condroitina 4 (UniProt n.o 06UVK1 (versiórl70), n.o RefSeq NCBI NP _001888.2); proteína de activación de fibroblastos (FAP), también conocida como seprasa (Uní Prot n.o 012884, 086Z29, 099998, n.o de acceso NCBI NP _004451); antígeno carcinoembrionario (CEA), también conocido como molécula de adhesión celular 5 relacionada con el antígeno carcinoembrionario (UniProt n.o P06731 (versión 119), n.o RefSeq NCBI NP _ 004354.2); C033, también conocido como gp67 o Siglec·3 (UniProt n.o P20138, n.o de acceso NCBI NP _001076087, NP _001171079); receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), también conocido como ErbB·1 o Her1 (UniProt n.o P0053, n.o de acceso NCBI NP_958439, NP _958440) Y CD3, particulannente la subunidad épsilon de C03 (véase UniProt n.o P07766 (versión 130), n.o RefSeq NCBI NP_000724.1, SEO ID NO: 265 para la secuencia humana, o UniProt n.o 095L15 (versión 49), n.o GenBank NCBI BAB71849.1, SEO ID NO: 266 para la secuencia de macaco [Macaca tascicularis]. En ciertos modos de realización, la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento se une a un epítopo de un antígeno activador de linfocitos T o un antígeno de célula diana que se conserva entre el antígeno activador de linfocitos T o el antígeno diana de diferentes especies.

Por «unión específica» se entiende que la unión es selectiva para el antígeno y se puede discriminar de interacciones no deseadas o no específicas. La capacidad de un resto de unión a antrgeno para unirse a un detenninante antigénico específico se puede medir mediante un ensayo de inmunoadsorción enz.imática (ELlSA) u otras técnicas familiares para un experto en la técnica, por ejemplo, técnica de resonancia de plasmón superficial (SPR) (en un instrumento BIAcore) (Liljeblad et al., Glyco J 17, 323·329 (2000)) Y ensayos de unión tradicionales (Heeley, Endocr Res 28, 217· 229 (2002». En un modo de realiz.aciÓn, el grado de unión de un resto de unión a anUgeno a una proteína no relacionada es inferior a aproximadamente un 10 % de la unión del resto de unión a antígeno al antígeno medida, por ejemplo, mediante SPR. En ciertos modos de realización, un resto de unión a antígeno que se une al antígeno, o una molécula de unión a antígeno que comprende ese resto de unión a antrgeno, liene una constante de disociación (Kd) de:s 1 IJM, :s 100 nM, :s 10 nM, :s 1 nM, :s 0,1 nM, :s 0,01 nM o :s 0,001 nM (pO( ejemplo, 10-8 M o menos, por ejemplo, de 10-8 M a 10.13 M, por ejemplo, de 10.9 M a 10.13 M).

«Afinidad» se refiere a la fortaleza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un receptor) y SU socio de unión (por ejemplo, un ligando). A menos que se indique lo contrario, como se usa en el presente documento, «afinidad de unión» se refiere a la afinidad de unión intrinseca que refleja una interacción 1:1 entre los miembros de una pareja de unión (por ejemplo, un resto de unción a antígeno y un anUgeno, O un receptor y su ligando). La afinidad de una molécula X por su socio Y se puede representar, en general, mediante la constante de disociación (Ko), que es la proporción entre las constantes de velocidad de disociación y asociación (kdis y ka., respectivamente). Por lo tanto, las afinidades equivalentes pueden comprender diferentes constantes de velocidad, siempre que la proporción de las constantes de velocidad permanezca igual. La afinidad se puede medir por procedimientos comunes conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en el presente

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documento. Un procedimiento particular para medir la afinidad es la Resonancia de PlasmÓfl Superficial (SPR).

«Unión reducida)), por ejemplo, unión reducida a un receptor Fe, se refiere a una disminución de la afinidad por la interacción respectiva, medida por ejemplo PO( SPR. Para mayor claridad, el término incluye también la reducción de la afinidad hasta cero (o por debajo del límite de detección del procedimiento analítico), es decir, la supresión completa de la interacción. Por el contrario, «unión aumentada» se refiere a un aumento en la afinidad de unión para la interacción respectiva.

Un «antígeno activador de linfocitos T»), como se usa en el presente documento, se refiere a un determinante antigénico expresado en la superficie de un linfocito T, particularmente un linfocito T citotóxico, que es capaz de inducir la activación de linfocitos T al interaccionar con una molécula de unión a antigeno. De manera especifica, la interacción de una molécula de unión a antigeno con un antigeno activador de linfocitos T puede inducir la activación de linfocitos T al activar la cascada de señalización del complejo receptor de linfocitos T. En un modo de realización particular, el anUgeno activador de linfocitos T es eD3.

«Activación de linfocitos T», como se usa en el presente documento, se refiere a una o más respuestas celulares de un linfocito T, particularmente un linfocito T citotóxico, seleccionadas entre: proliferación, diferenciación, secreción de citocinas, liberación de moléculas efectoras citotóxicas, actividad citotóxica y expresión de marcadores de activación. las moléculas biespecíficas de unión a antígeno activadoras de linfocitos T divulgadas en el presente documento son capaces de inducir la activaciórl de los linfocitos T. los ensayos adecuados para medir la activación de linfocitos T son conocidos en la técnica y se describen en el presente documento.

Un «antigeno de célula diana», como se usa en el presente documento, se refiere a un determinante antigénico presentado en la superficie de una célula diana, por ejemplo, una célula en un tumor tal como una célula cancerosa o una célula del estroma tumoral.

Como se usa en el presente documento, los términos «primero» y «segundo» con respecto a restos de unión a antigeno, etc., se usan por conveniencia para distinguir cuando hay más de uno de cada tipo de resto. El uso de estos términos no pretende conferir un orden u orientaciórl especificos de la molécula biespecifica de unión a antigeno activadora de linfocitos T , a menos que así se indique explícitamente.

Una «molécula Fab» se refiere a una proteina que consiste en el dominio VH y CH1 de la cadena pesada (la «cadena pesada Fab») yel dominio Vl y el de la cadena ligera (la «cadena ligera Fab») de una inmunoglobulina.

Por «fusionado» se entiende que los componentes (por ejemplo, una molécula Fab y una subunidad del dominio Fe) están unidos por enlaces peptidicos, directamente o mediante uno o más conectores peptídicos.

Como se usa en el presente documento, el término «de cadena única» se refiere a una molécula que comprende monómeros de aminoácidos unidos linealmente por enlaces peptídicos. En ciertos modos de realización, uno de los restos de unión a antígeno es una molécula Fab de cadena única, es decir, una molécula Fab en la que la cadena ligera Fab y la cadena pesada Fab están conectadas por un conector peptidico para formar una única cadena peptídica. En uno de dichos modos de realización particulares. el extremo C de la cadena ligera Fab está conectado al extremo N de la cadena pesada Fab en la molécula Fab de cadena única.

Por una molécula Fab '«entrecruzada» (también llamada «erossfab») se entiende una molécula Fab en la que las regiones variables o las regiones constantes de la cadena pesada y ligera Fab están intercambiadas, es decir, la molécula Fab entrecruzada comprende una cadena peptldica compuesta por la región variable de la cadena ligera y la región constante de la cadena pesada, y una cadena peptídica compuesta por la región variable de la cadena pesada y la región constante de la cadena ligera. Para mayor claridad, en una molécula Fab entrecruzada en la que las regiones variables de la cadena ligera Fab y la cadena pesada Fab están intercambiadas, la cadena peptidica que comprende la región constante de la cadena pesada se denomina la «cadena pesada» de la molécula Fab entrecruzada en el presente documento. Por el contrario, en una molécula Fab entrecruzada en la que las regiones constantes de la cadena ligera Fab y la cadena pesada Fab están intercambiadas, la cadena peptídica que comprende la región variable de la cadena pesada se denomina la «cadena pesada» de la molécula Fab entrecruzada en el presente documento.

El término «molécula de inmunoglobulina» se refiere a una proteína que tiene la estructura de un anticuerpo natural. Por ejemplo, las inmunoglobulinas de la clase 19G son glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150000 dalton, compuestas por dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que están unidas con enlaces disulfuro. Desde el extremo N al extremo C, cada cadena pesada tiene una región variable (VH), también llamada dominio pesado variable o dominio variable de la cadena pesada, seguida de tres dominios constantes (CH1 , CH2 y CH3), también llamada región constante de la cadena pesada. De forma similar, desde el extremo N al extremo e, cada cadena ligera tiene una región variable (Vl), también llamada dominio ligero va riable o dominio variable de la cadena ligera, seguida de un dominio ligero constante (Cl), también llamado región constante de la cadena ligera. l a cadena pesada de una inmunoglobulina se puede asignar a uno de los cinco tipos, llamados a (lgA), (lgO), (lgE), V (lgG) o IJ (lgM), Y algunos de ellos se pueden dividir adicionalmente en subtipos, por ejemplo, y, (lgG,), y2 (lgG2), yl (lgGl), y4

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(IgG4), al (lgAl) y a2 <IQA2). La cadena ligera de una inmunoglobulina se puede asignar a uno de dos lipos. llamados kappa (K) y lambda (A), basados en la secuencia de aminoácidos de su dominio constante. Una inmunoglobulina consiste esencialmente en dos moléculas Fab y un dominio Fe, unidos a través de la región bisagra de inmunoglobulina.

El término «anticuerpo» se usa en el presente documento en el sentido más amplio y abarca diversas estructuras de anticuerpos, incluyendo, pero no limitadas a, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales y fragmentos de anticuerpo siempre que presenten la actividad de unión a antígeno deseada.

Un «fragmentade anticuerpo» se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende un segmento de un anticuerpo intacto que se une al anUgeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no están limitados a, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena única (por ejemplo, scFv) y anticuerpos de un único dominio. Para una revisión de ciertos fragmentos de anticuerpos, véase Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003). Para una revisión de los fragmentos scFv, véase, por ejemplo, PluckthOn, en !he Pharmacofogy ofMonocfonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., (Springer-Verlag, Nueva York), págs. 269-315 (1994); véase también el documento WO 93/16185; y las patentes de EE. UU. n.'" 5.571.894 y 5.587.458. Para un análisis de los fragmentos Fab y F(ab')2 que comprenden los residuos del epitopo de unión al receptor de rescate y que tienen una semivida in vivo aumentada, véase la patente de EE. UU. n.o 5.869.046. Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno que pueden ser bivalentes o biespecificos. Véase, por ejemplo, el documento EP 404.097; el documento WO 1993/01161; Hudson et al., Nat Med 9,129· 134 (2003); y Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993). Los triacuerpos y tetracuerpos también se describen en Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003). Los anticuerpos de un único dominio son fragmentos de anticuerpo que comprenden todo o una parte del dominio va riable de la cadena pesada o todo o una parte del dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo. En ciertos modos de realización, un anticuerpo de un único dominio es un anticuerpo de un único dominio humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.o 6.248.516 61). Los fragmentos de anticuerpo se pueden preparar por diversas técnicas incluyendo, pero no limitadas a la digestión proteolitica de un anticuerpo intacto, así como la producción por células hospedadoras recombinantes (por ejemplo, E. coli o fagos), como se describe en el presente documento.

El término «dominio de unión a antígeno» se refiere a la parte de un anticuerpo que comprende el área que se une específicamente y es complementaria a parte o la totalidad de un antígeno. Un dominio de unión a antígeno se puede proporcionar, por ejemplo, por uno o más dominios variables de anticuerpo (también denominados regiones variables de anticuerpo). Particularmente, un dominio de unión a antígeno comprende una región variable de la cadena ligera de anticuerpo (VL) y una región variable de la cadena pesada de anticuerpo (VH).

El término «región variable» o «dominio variable» se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que participa en la unión del anticuerpo al anUgeno. Los dominios variables de la cadena pesada y de la cadena ligera (VH yVL, respectivamente) de un anticuerpo natural, en general, tienen estructuras similares, en las que cada dominio está compuesto por cuatro regiones estructurales (FR) conservadas y tres regiones hipervariables (HVR). Véase, por ejemplo, Kindt et al., Kuby Immunology, 6.' ed., W.H. Freeman and Co., página 91 (2007). Un único dominio VH o VL puede ser suficiente para conferir especificidad de unión a antigeno.

El término «(egión hipervariable» o «HVR», como se usa en el presente documento, se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en cuanto a su secuencia y/o forman budes definidos estructuralmente (<<bucles hipervariables»). Generalmente, los anticuerpos tetracatenarios naturales comprenden seis HVR; tres en el VH (H1, H2, H3) Y tres en el VL (L 1, L2, L3). Las HVR comprenden, en general, residuos de aminoácido de los budes hipervariables y/o de las regiones determinantes de complementariedad (CDR), siendo las últimas las de variabilidad de secuencia más alta y/o estando implicadas en el reconocimiento antigénico. Con la excepción de la CDR1 de la VH, las CDR comprenden, en general, los residuos de aminoácido que forman los bucles hipervariables. Las regiones hipervariables (HVR) también se denominan «regiones determinantes de complementariedad» (CDR), y estos términos se usan en el presente documento de manera indistinta en referencia a segmentos de la región variable que forman las regiones de unión a antígeno. Esta región particular ha sido descrita por Kabat et al., U.S. Dep!. of Health and Human Services, Sequences of Proteins of lmmunological lnterest (1983) y por Chothia et al., J Mol Bio1196: 901 -917 (1987), donde las definiciones incluyen superposición o subconjuntos de residuos de aminoácidos cuando se comparan entre sí. Sin embargo, la aplicación de cualquiera de las definiciones para referirse a una CDR de un anticuerpo o a variantes de la misma está destinada a estar incluida dentro del alcance del término, como se define y se usa en el presente documento. Los residuos de aminoácido apropiados que abarcan las CDR, tal como se definen en cada una de las referencias citadas, se exponen a continuación en la Tabla 1 a modo de comparación. El número exacto de residuos que abarca una CDR particular variará dependiendo de la secuencia y del tamaño de la CDR. los expertos en la técnica pueden determinar de manera rutinaria qué residuos comprenden una CDR particular dada la secuencia de aminoácidos de la región variable del anticuerpo.

TABLA 1. Definiciones de CDRl

CDR Kabat Chothia bM' CDR1 VH 1-35 6-32 6-35

ES 2 659 764 T3

CDR2 VH CDR3 VH CDR1 VL CDR2 Vl CDR3 Vl: 0-65 5-102 4-34 O-56 9-97 52·58 5-102 6-32 50-52 1-96 0-58 5-102 4-34 0-56 9-97

lla numeración de todas las definiciones de CDR en la Tabla 1 está de acuerdo cOfllas convenciones de numeración establecidas por Kabal el al. (véase abajo).

5 2 «AbM» con una «b» minúscula, como se utiliza en la Tabla 1, se refiere a las CDR definidas por el programa informático de modelado de anticuerpos «AbM» de Oxford Molecular.

Kabat el al. también definieron un sistema de numeración para las secuencias de la región variable que es aplicable a cualquier anticuerpo. Un experto en la técnica puede asignar inequívocamente este sistema de «numeración de 10 Kabat» a cualquier secuencia de región variable, sin depender de ningún dato experimental más allá de la propia secuencia. Como se usa en el presente documento, «numeración de Kabat» se refiere al sistema de numeración establecido por Kabat et al., U.S. Oepl. of Heallh and Human Services, «Sequence of Proteins of Immunological Interest» (1983). A menos que se especifique lo contrario, las referencias a la numeración de las posiciones especificas de los residuos de aminoácido en una región variable de anticuerpo están de acuerdo con el sistema de numeración

15 de Kabat.

Las secuencias polipeptidicas del listado de secuencias (es decir, SEO ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, etc.) no están numeradas de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat. Sin embargo, está dentro de la experiencia ordinaria del experto en la técnica convertir la numeración de las secuencias del listado de secuencias a la numeración de

20 Kabat.

«Región estructural» o «FR» se refiere a residuos del dominio variable distintos de los residuos de la región hipervariable (HVR). La FR de un dominio variable consiste, en general, en cuatro dominios FR: FR1, FR2, FR3 Y FR4. En consecuencia, las secuencias de HVR y FR aparecen en general en la siguiente secuencia en VH (o VL): FR1

25 H1 (L 1 )-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

La «clase» de un anticuerpo o inmunoglobulina se refiere al tipo de dominio constante o región constante que posee su cadena pesada. Hay cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgO, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Los dominios constantes

30 de la cadena pesada que se corresponden con las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman a, 5, (, Y Y 1.1, respectivamente.

El término «dominio Fc» o «región Fc» se usa en el presente documento para definir una región de extremo C de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos un segmento de la región constante. El término incluye las 35 regiones Fc de secuencia natural y regiones Fc variantes. Aunque los limites de la región Fc de una cadena pesada de IgG pueden variar ligeramente, la región Fc de la cadena pesada de IgG humana se define habitualmente para que se extienda desde el residuo Cys226, o desde Pro230, hasta el extremo carboxilico de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina carboxiterminal (Lys447) de la región Fc puede estar o no presente. A menos que se especifique lo contrario en el presente documento, la numeración de los residuos de aminoácido en la región Fc o la región constante se 40 realiza de acuerdo con el sistema de numeración UE, también llamado indica UE, como se describe en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interes!, 5.-ed. Public Health Service, Nationallnstitutes of Health, Bethesda, MO, 1991. Una «subunidad» de un dominio Fc, como se usa en el presente documento, se refiere a uno de los dos polipéptidos que forman el dominio Fc dimérico, es decir, un polipéptido que comprende regiones constantes del extremo e de una cadena pesada de inmunoglobulina, capaz de autoasociarse de manera estable. Por ejemplo, una

45 subunidad de un dominio Fc de 19G comprende un dominio constante CH2 de IgG y uno CH3 de IgG.

Una «modificación promotora de la asociación de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc» es una manipulación del esqueleto peptidico o las modificaciones postraduccionales de una subunidad del dominio Fc que reduce o evita la asociación de un polipéptido que comprende la subunidad de dominio Fc. con un polipéptido idéntico 50 para formar un homodimero. Una modificación promotora de la asociación, como se usa en el presente documento, incluye particularmente modificaciones separadas hechas en cada una de las dos subunidades del dominio Fc que se desean asociar (es decir, la primera y la segunda subunidad del dominio Fc), en la que las modificaciones son complementarias entre sí para promover la asociación de las dos subunidades de dominio Fc. Por ejemplo, una modificación promotora de la asociación puede alterar la estructura o carga de una o ambas subunidades del dominio 55 Fc a fin de hacer que su asociación sea estéricamente o electrostáticamente favorable, respectivamente. PO( lo tanto, la (hetero)dimerización se produce entre un polipéptido que comprende la primera subunidad de dominio Fc y un polipéptido que comprende la segunda subunidad de dominio Fc, que podría no ser idéntica en el sentido de que los componentes adiciooales fusionados a cada una de las subunidades (por ejemplo, restos de unión a antígeno) no son iguales. En algunos modos de realización, la modificación promotora de la asociación comprende una mutación de 60 aminoácido en el dominio Fc, especifica mente una sustitución de aminoácido. En un modo de realización particular, la modificación promotora de la asociación comprende una mutación de aminoácido separada, específicamente una

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sustituciÓfl de aminoácido, en cada una de las dos subunidades del dominio Fe.

El término «funciones efectoras)) se refiere a las actividades biológicas atribuibles a la región Fe de un anticuerpo, que varian con el isotipo del anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de los anticuerpos incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), unión al receptor Fe, citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP), secreción de citocinas, absorción de anUgeno mediada por complejos inmunitarios por células presentadoras de antígenos, regulación por disminución de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos Bl y activación de linfocitos B.

Como se usa en el presente documento, se considera que los términos «ingeniería, manípulado por íngeníería, genomanípulacíón, genomodificación» incluyen cualquier manipulación del esqueleto peptídico o las modificaciones postraduccionales de un polipéptido recombinante o natural o fragmento del mismo. l a genomanipulación incluye modificaciones de la secuencia de aminoácidos, del patrón de glucosilación, o del grupo de cadena lateral de aminoácidos individuales, así como combinaciones de estas aproximaciones.

El término «mutación de aminoácido», como se usa en el presente documento, pretende abarcar las sustituciones, eliminaciones, inserciones y modificaciones de aminoácidos. Se puede realizar cualquier combinación de sustitución, eliminación, inserción y modificación para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas, por ejemplo, reducida unión a un receptor Fc o aumentada asociación a otro péptido. las eliminaciones e inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen eliminaciones e inserciones de aminoácidos amino-ylo carboxiterminales. las mutaciones de aminoácidos particulares son sustituciones de aminoácidos. Con el fin de alterar, por ejemplo, las características de unión de una región Fc, son particularmente preferentes las sustituciones de aminoácidos no conservadoras, es decir, la sustitución de un aminoácido por otro aminoácido que tiene diferentes propiedades estructurales ylo quimicas. l as sustituciones de aminoácidos incluyen la sustitución por aminoácidos no naturales o por derivados de aminoácidos naturales de los veinte aminoácidos estándar (por ejemplo, 4-hidroxiprolina, 3-metilhistidina, ornitina, homoserina, 5-hidroxilisina). las mutaciones de aminoácidos se pueden generar usando procedimientos genéticos o químicos bien conocidos en la técnica. los procedimientos genéticos pueden incluir mutagénesis dirigida, PCR, síntesis de genes y similares. Se contempla que los procedimientos para alterar el grupo de cadena lateral de un aminoácido por procedimientos distintos de la ingeniería genética, tales como la modificación química, también pueden ser útiles. En el presente documento se pueden usar diferentes designaciones para indicar la misma mutación de aminoácido. Por ejemplo, una sustitución de prolina en la posición 329 del dominio Fc por glicina se puede indicar como 329G, G329, G329, P329G o Pro329Gly.

Como se usa en el presente documento, el término «polipéptido» se refiere a una molécula compuesta por monómeros (aminoácidos) unidos linealmente por enlaces amída (también conocidos como enlaces peptídicos). El término «polipéptido» se refiere a cualquier cadena de dos o más aminoácidos, y no se refiere a una longitud específica del producto. Por lo tanto, los péptidos, dipéptidos, tripéptidos, oligopéptidos, «proteina», «cadena de aminoácidos» o cualquier otro término utilizado para referirse a una cadena de dos o más aminoácidos se incluyen dentro de la definición de «polipéptido», y el término «polipéptido» se puede usar en lugar de, o de manera intercambiable con, cualquiera de estos términos. El término (polipéptido» también pretende referirse a los productos de las modificaciones posteriores a la expresión del polipéptido, que incluyen, entre otros, glucosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos protectoreslbloqueantes conocidos. escisión proteolitica o modificación por aminoácidos no naturales. Un polipéptido se puede derivar de una fuente biológica natural o producir mediante tecnología recombinante, pero no se traduce necesariamente a partir de una secuencia de ácido nucleico designada. Se puede generar de cualquier manera, incluso por síntesis química. Un polipéptido divulgado en el presente documento puede tener un tamaño de aproximadamente 3 o más, 5 o más, 10 o más, 20 o más, 25 o más, 50 o más, 75 o más, 100 o más, 200 o más, 500 o más, 1000 o más, o 2000 o más aminoácidos. los polipéptidos pueden tener una estructura tridimensional definida, aunque no necesariamente tienen dicha estructura. los polipéptidos con una estructura tridimensional definida se denominan plegados, y polipéptidos que no poseen una estructura tridimensional definida, pero que pueden adoptar un gran número de conformaciones diferentes, y se denominan desplegados.

Por un polipéptido «aislado» o una variante, o un derivado del mismo se entiende un polipéptido que no se encuentra en su medio natural. No se requiere un nivel particular de purificación. Por ejemplo, un polipéptido aislado se puede eliminar de su entorno nativo o natural. Los polipéptidos y proteínas producidos de manera recombinante expresados en células hospedadoras se consideran aislados para el propósito de la presente divulgación, ya que son polipéptidos naturales o recombinantes que se han separado, fraccionado o se han purificado parcial o sustancialmente mediante cualquier técnica adecuada.

«Porcentaje (%) de identidad de una secuencia de aminoácidos» con respecto a una secuencia de polipéptido de referencia se define como el porcentaje de residuos de aminoácido de una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácido de la secuencia de polipéptido de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si fuera necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. la alineación con el propÓSito de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos se puede lograr de diversas formas que están dentro de la habilidad en la técnica, por ejemplo, usando un programa informático disponible al público, tal como el programa informático BLAST, BLAST-2, AlIGN o Megalign (DNASTAR). los expertos en la técnica pueden determinar los

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parámetros apropiados para la alineación de secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir la alineación máxima sobre la longitud completa de las secuencias que se están comparando. Para los fines del presente documento, sin embargo, los valores de porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos se generan utilizando el programa infonnático de comparación de secuencias AUGN·2. El programa informático de comparación de secuencias AlIGN-2 lo creó Genentech, Inc., y el código fuente se ha presentado con la documentación de usuario en la oficina de propiedad intelectual de EE. UU., Washington OC, 20559, en la que se ha registrado oon el n.o de registro de propiedad intelectual de EE. UU. TXU510087. El programa AlIGN-2 está disponible al público de Genentech, Inc., South San Francisco, California, o se puede recopilar a partir del código fuente. El programa AlIGN2 se debe recopilar para su uso en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias los establece el prog rama AlIGN-2 y no varran. En situaciones en las que se usa AlIGN-2 para comparaciones de secuencias de aminoácidos, el porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada A respecto a, con o frente a, una secuencia de aminoácidos dada S (que, de forma alternativa, se puede expresar como una secuencia de aminoácidos dada A que tiene o que comprende un cierto porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos respecto a, con o frente a, una secuencia de aminoácidos dada B) se calcula de la siguiente manera:

100 veces la fracción XJY

en la que X es el número de residuos de aminoácido valorados como emparejamientos idénticos por el programa de alineación de secuencias Al1GN-2 en esa alineación del programa de A y B, yen la que Y es el número total de residuos de aminoácido en B. Se apreciará que cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos S, el porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos de A respecto a B no será igual al porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos de B respecto a A. A menos que se indique especrficamente lo contrario, todos los valores de porcentaje de identidad de una secuencia de aminoácidos usados en el presente documento se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente anterior usando el programa informático ALlGN-2.

El término «polinucle6tidQ») se refiere a una molécula o construcción de ácido nucleico aislada, por ejemplo, ARN mensajero (ARNm), ARN derivado de virus o ADN de plásmido (ADNp). Un polinucleótido puede comprender un enlace fosfodiéster convencional o un enlace no convencional (por ejemplo, un enlace amida, tal como el encontrado en los écidos nucleicos peptídicos (PNA). El término ((molécula de ácido nucleico» se refiere a uno o más segmentos de ácido nucleico, por ejemplo, fragmentos de ADN o ARN, presentes en un polinucleótido.

Por molécula de ácido nucleico o polinucle6tido «aislado» se entiende una molécula de ácido nucleico, ADN o ARN, que se ha eliminado de su entorno natural. Por ejemplo, un polinucleótido recombinante que codifica un polipéptido contenido en un vector se considera aislado para los fines de la presente divulgación. Otros ejemplos de un polinucleótido aislado incluyen polinucleótidos recombinantes mantenidos en células hospedadoras heterólogas o polinucleótidos purificados (parcial o sustancialmente) en solución. Un polinucleótido aislado incluye una molécula de polinucleótido contenida en células que contienen normalmente la molécula de polinucleótido, pero la molécula de polinucleótido está presente de forma extracromosómica o se encuentra en una ubicación cromosómica que es diferente de su ubicación cromosómica natural. Las moléculas de ARN aisladas incluyen transcritos de ARN in vivo o in vitro divulgados en el presente documento, así como formas de cadena positiva y negativa. y formas de cadena doble. l os polinucle6tidos o ácidos nucleicos aislados divulgados en el presente documento incluyen además didlas moléculas producidas sintéticamente. Además, un polinucleótido o un ácido nucleico puede ser o puede incluir un elemento regulador tal como un promotor, sitio de unión a ribosoma o un terminador de la transcripción.

Por un ácido nucleico o polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos, por ejemplo, un 95 % «idéntica» a una secuencia de nucleótidos de referencia divulgada en el presente documento, se pretende que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido sea idéntica a la secuencia de referencia excepto porque la secuencia de polinucleótidos puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia. En otras palabras, para obtener un polinucle6tido que tiene una secuencia de nucleótidos idéntica al menos en un 95 % a una secuencia de nucleótidos de referencia, hasta un 5 % de los nucleótidos de la secuencia de referencia se puede eliminar o sustituir por otro nucleótido o un número de nucleótidos de hasta un 5 % de los nucleótidos totales de la secuencia de referencia se puede insertar en la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden ocurrir en las posiciones terminales 5' o 3' de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre residuos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. Como una cuestión práctica, si cualquier secuencia de polinucleótido particular es al menos un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 'Yo, un 96 %, un 97 %, un 98 % un o 99 % idéntica a una secuencia de nucleótidos divulgada en el presente documento se puede determinar convencionalmente usando programas informáticos conocidos, tales como los discutidos anteriormente para polipéptidos (por ejemplo, AUGN-2).

El término «casete de expresión» se refiere a un polinucleótido generado de manera recombinante o sintética, con una serie de elementos de ácido nucleico especificados que permiten la transcripción de un ácido nucleico particular en una célula diana. El casete de expresión recombinante se puede incorporar a un plásmido, cromosoma, ADN mitocondrial, ADN de plástido, virus o fragmento de ácido nucleico. Típicamente, el segmento de casete de expresión

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recombinante de un vector de expresión incluye, entre otras secuencias, una secuencia de écida nucleico que hay que transcribir y un promotor. En ciertos modos de realización, el casete de expresión divulgado en el presente documento comprende secuencias de polinucleótidos que codifican moléculas biespecíficas de unión a antígeno divulgadas en el presente documento o fragmentos de las mismas.

El término «vector» o «vector de expresión» es sinónimo de «cOflslrucci6n de expresión» y se refiere a una molécula de AON que se usa para introducir y dirigir la expresión de un gen específico al que está asociado de forma funcional en una célula diana. El término incluye el vector como una construcción de ácido nucleico autorreplicanle, así como el vector incorporado en el genoma de una célula hospedadora en la que se ha inlroducido. El veclor de expresión divulgado en el presenle documento comprende un casete de expresión. los vectores de expresión permiten la transcripción de grandes cantidades de ARNm estable. Una vez que el vector de expresión está dentro de la célula diana, la molécula de ácido ribonucleico o proteina que está codificada por el gen se produce pOf la maquinaria de transcripción y/o traducción celular. En un modo de realización, el vector de expresión divulgado en el presente documento comprende un casete de expresión que comprende secuencias de polinucleótidos que codifican moléculas biespecificas de unión a antigeno divulgadas en el presente documento o fragmentos de las mismas.

los términos «célula hospedadora», «línea celular hospedadora» y «cultivo de células hospedadoras» se usan de manera intercambiable y se refieren a células en las que se ha introducido un ácido nucleico exógeno, incluyendo la descendencia de didlas células. las células hospedadoras incluyen «Iransformanles» y «células transformadas», que incluyen la célula primaria transfOfmada y la descendencia derivada de la misma independientemente del número de pases. la descendencia puede no ser completamente idéntica a una célula precurSOfa en cuanto al contenido de ácido nucleico, sino que puede contener mutaciones. l a descendencia mutante que liene la misma función o actividad biológica que la cribada o seleccionada en la célula originalmente transformada también se incluye en el presente documento. Una célula hospedadora es cualquier tipo de sistema celular que se puede usar para generar las moléculas biespecificas de unión a antígeno divulgadas en el presente documento. las células hospedadoras incluyen células cultivadas, por ejemplo, células cultivadas de mamíferos, tales como células CHO, células BHK, células NSO, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de ratÓfl P3X63, células PER, células PER.C6 o células de hibridoma, células de levadura, células de insecto y células de planta, por nombrar solo algunas, pero también células comprendidas dentro de un animal transgénico, una planta transgénica o un tejido vegetal o animal cultivado.

Un ((receptor Fc activador» es un receptor Fc que, después del acoplamiento por un dominio Fc de un anticuerpo, provoca eventos de señalizaciÓfl que estimulan a la célula que lleva el receptor para que realice funciones efectoras. los receptores Fc activadores humanos incluyen FcyRllla (CD16a), FcyRI (CD64), FcyRlla (CD32) y FcoRI (CD89).

la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) es un mecanismo inmunitario que conduce a la lisis de células diana recubiertas de anticuerpo por parte de células efectoras inmunilarias. las células diana son células a las que se unen especificamente anticuerpos o derivados de los mismos que comprenden una región Fc, en general a través de la parte de proteina que está en el extremo N a la región Fc. Como se usa en el presente documenlo, el término «ADCC reducida» se define como una reducción en el número de células diana que se lisan en un tiempo dado, a una concenlración dada de anticuerpo en el medio que rodea las células diana, mediante el mecanismo de ADCC definido anteriormente, y/o un aumento en la concentración de anticuerpo en el medio que rodea las células diana, requerido para lograr la lisis de un número dado de células diana en un liempo dado, por el mecanismo de ADCC. la reducción en ADCC se refiere a la ADCC mediada por el mismo anticuerpo, producida por el mismo tipo de células hospedadOfas, aplicando los mismos procedimientos estándar de producción, purificación, formulación y conservación, que son conocidos por los expertos en la técnica, pero que no se ha modificado por ingeniería genélica. Por ejemplo, la reducción en ADCC mediada por un anticuerpo que comprende en su dominio Fc una sustitución de aminoácidos que reduce la ADCC es relativa a la ADCC mediada por el mismo anticuerpo sin esa sustitución de aminoácidos en el dominio Fc. l os ensayos adecuados para medir la ADCC son bien conocidos en la lécnica (véase, pOf ejemplo, la publicación PCT n.o WO 20061082515 o la publicación PCT n.o WO 20121130831 ).

Una «cantidad eficaz» de un agente se refiere a la cantidad que es necesaria para producir un cambio fisiológico en la célula o tejido al que se administra.

Una «cantidad terapéuticamente eficaz» de un agente, por ejemplo, una composición farmacéutica, se refiere a una cantidad eficaz, en las dosis y durante los periodOS de tiempo necesarios, para conseguir el resultado terapéutico o profiláctico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente, por ejemplo, elimina, disminuye, retrasa, minimiza o previene los efectos adversos de una enfermedad.

Un «individuo» O «sujeto» es un mamifero. los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales domesticados (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, seres humanos y primates no humanos tales como monos), conejos y roedOfes (por ejemplo, ralones y ratas). Particularmente, el individuo o sujeto es un ser humano.

El térm ino «composición farmacéutica» se refiere a una preparación que está en tal forma que permite la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en la misma para ser eficaz, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se administraría la formulación.

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Un «vehículo farmacéuticamenle aceptable» se refiere a un ingrediente de una composición farmacéutica, distinto de un ingrediente activo, que no es tóxico para un sujeto. Un vehículo farmacéuticamenle aceptable incluye, pero no se limita a, un tampón, un excipiente, un estabilizante o un conservante.

Como se usa en el presente documento, «tratamiento» (y variaciones gramaticales del mismo lales como «tratar» o «tratando») se refiere a la intervención clínica en un inlenlo PO( alterar el curso natural de una enfermedad en un individuo que está recibiendo tratamiento, y que se puede realizar como profilaxis o durante la evolución de una patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, pero no se limitan a, prevención de la aparición o recidiva de la enfennedad, alivio de los síntomas, disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfennedad, prevención de la metástasis, disminución de la tasa de progresión de la enfennedad, mejora o paliación del estado de la enfermedad y remisión o mejora del pronóstico. En algunos modos de realización, las moléculas biespecíficas de unión a antígeno activadoras de linfocitos T divulgadas en el presente documento se usan para retrasar el desarrollo de una enfermedad o para ralentizar la progresión de una enfermedad.

El ténnino «prospecto» se usa para hacer referencia a las instrucciones incluidas habitualmente en envases comerciales de productos terapéuticos, que contienen información sobre las indicacíones, uso, dosis, administración, tratamiento de combinación, contraindicaciones y/o advertencias sobre el uso de dichos productos terapéuticos.

Descripción detallada de los modos de realización

En el presente documento se proporciona una molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T que comprende un primer y un segundo resto de unión a an1lgeno, siendo uno de ellos una molécula Fab capaz de unirse específicamente a un anUgeno activador de linfocitos T y siendo el otro de ellos una molécula Fab capaz de unirse específicamente a un anUgeno de célula diana, y un dominio Fe compuesto por una primera y una segunda subunidad capaces de crear una asociación estable;

en la que el primer resto de unión a antígeno es

(a): una molécula Fab de cadena única en la que la cadena lígera Fab y la cadena pesada Fab están conectadas por un conector peptídico, o

(b): una molécula Fab entrecruzada en la que las regiones variables o constantes de la cadena ligera Fab y la cadena pesada Fab están intercambiadas.

Formatos de moléculas biespecíficas de unión a antígeno activadoras de linfocitos T

Los componentes de la molécula biespecífica de unión a anUgeno activadora de linfocitos T se pueden fusionar entre sí en una variedad de configuraciones. Las configuraciones a modo de ejemplo se representan en la Figura 1.

En algunos modos de realización, el segundo resto de unión a anUgellO está fusionado en el extremo e de la cadena pesada Fab al extremo N de la primera o la segunda subunidad del dominio Fc.

En uno de dichos modos de realización particulares, el primer resto de unión a antígeno está fusionado en el extremo e de la cadena pesada Fab al extremo N de la cadena pesada Fab del segundo resto de uníón a antlgeno. En uno de dichos modos de realización específicos, la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T consiste esencialmente en un primer y un segundo resto de unión a antrgeno, un dominio Fc compuesto por una primera y una segunda subunidad y, opcionalmente, uno o más conectores peptídicos, en el que el primer resto de unión a antígeno está fusionado en el extremo e de la cadena pesada Fab al extremo N da la cadena pesada Fab del segundo resto de unión a an1lgeno, y el segundo resto de unión a antígellO está fusionado en el extremo e de la cadena pesada Fab al extremo N de la primera o la segunda subunidad del dominio Fc. En un modo de realización incluso más específico, el primer resto de unión a antígeno es una molécula Fab de cadena única. Altemativamente, en un modo de realización particular, el primer resto de unión a antígeno es una molécula Fab entrecruzada. Opcionalmente, si el primer resto de unión a antígeno es una molécula Fab entrecruzada, la cadena ligera Fab del primer resto de unión a antígeno y la cadena ligera Fab del segunda resto de unión a antígeno se pueden fusionar adicionalmente entre sI.

En uno de dichos modos de realización alternativos, el primer resto de uniÓfl a antígeno está fusionado en el extremo e de la cadena pesada Fab con el extremo N de la primera o segunda subunidad del dominio Fc. En UIlO de dichos modos de realización especificos, la molécula biespecifica de unión a antigeno activadora de linfocitos T consiste esencialmente en un primer y un segundo resto de unión a antígeno, un dominio Fc compuesto por una primera y una segunda subunidad y, opcionalmente, uno O más conectores pepUdicos, en el que el primer y el segundo resto de unión a antígeno están fusionados cada uno en el extremo e de la cadena pesada Fab al extremo N de una de las subunidades del dominio Fc. En un modo de realización incluso más específico, el primer resto de unión a antígeno es una molécula Fab de cadena única. Alternativamente, en un modo de realización particular, el primer resto de unión a antígeno es una molécula Fab entrecruzada.

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En otro más de dichos modos de realización, el segundo resto de unión a antígeno esta fusionado en el extremo e de la cadena ligera Fab al extremo N de la cadena ligera Fab del primer resto de unión a antígeno. En uno de dichos modos de realización especificos, la molécula biespec1fica de unión a anUgeno activadora de linfocitos T consiste esencialmente en un primer y un segundo resto de unión a antígeno, un dominio Fe compuesto por una primera y una segunda subunidad y. opcionalmente, uno o más conectores peplídioos, en el que el primer resto de unión a antígeno está fusionado en el extremo N de la cadena ligera Fab al extremo e de la cadena ligera Fab del segundo resto de unión a antígeno, yel segundo resto de unión a antígeno está fusionado en el extremo e de la cadena pesada Fab al extremo N de la primera o la segunda subunidad del dominio Fc. En un modo de realización incluso más específico, el primer resto de unión a antígeno es una molécula Fab entrecruzada.

En otros modos de realización, el primer resto de unión a antrgeno está fusionado en el extremo e de la cadena pesada Fab al extremo N de la primera o la segunda subunidad del dominio Fc.

En uno de dichos modos de realización particulares, el segundo resto de unión a antlgenoestá fusionado en el extremo e de la cadena pesada Fab al extremo N de la cadena pesada Fab del primer resto de unión a anUgeno. En uno de dichos modos de realización específicos, la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T consiste esencialmente en un primer y un segundo resto de unión a anUgeno, un dominio Fc compuesto por una primera y una segunda subunidad y, opcionalmente, uno o más conectores peptídicos, en el que el segundo resto de unión a antígeno está fusionado en el extremo e de la cadena pesada Fab al extremo N de la cadena pesada Fab del primer resto de unión a antígeno, y el primer resto de unión a antígeno está fusionado en el extremo e de la cadena pesada Fab al extremo N de la primera o la segunda subunidad del dominio Fc. En un modo de realización incluso más especifico, el primer resto de un ión a antrgeno es una molécula Fab entrecruzada. Opcionalmente, la cadena ligera Fab del primer resto de uniórl a antlgenoy la cadena ligera Fab del segundo resto de unión a antígeno se pueden fusionar adicionalmente entre si.

En particular en estos modos de realización, el primer resto de unión a antígeno es capaz de unirse específicamente a un antigeno activador de linfocitos T. En otros modos de realización, el primer resto de unión a antígeno es capaz de unirse específicamente a un antígeno de célula diana.

Los restos de unión a antígeno se pueden fusionar al dominio Fc o entre sí directamente o a través de un conector peptídico, que comprende uno o más aminoácidos, Upicamente aproximadamente 2-20 aminoácidos. l os conectores peptídicos se conocen en la técnica y se describen en el presente documento. los conectores peptídicos no inmunogénicos adecuados incluyen, por ejemplo, conectores peptídicos (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n o G4(SG4)n, en el que «ni) es, en general, un número entre 1 y 10, típicamente entre 2 y 4. Un conector peptídico particularmente adecuado para fusionar las cadenas ligeras Fab del primer yel segundo resto de unión a antígeno entre sí es (G4S p. Un conector peptídico ejemplar adecuado para conectar las cadenas pesadas Fab del primer yel segundo resto de uniórl a antrgeno es EPKSC(0)-(G4Sp (SEO ID NO: 150 y 151). Adicionalmente, los conectores pueden comprender (un segmento de) una región de bisagra de inmunoglobulina. Particularmente cuando un resto de unión a antígeno está fusionado con el extremo N de una subunidad de dominio Fc, se puede fusionar a través de una región bisagra de inmunoglobulina

o un segmento de la misma, con o sin un conector peptídico adicional.

Una molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T con un único resto de un ión a antígeno capaz de unirse específicamente a un anUgeno de célula diana (por ejemplo, como se muestra en la Figura 1A, 16, 10, 1E, 1 H, 11, 1 K o 1 M) es útil, particularmente en los casos en los que se espera la intemalización del antígeno de la célula diana después de la unión de un resto de unión a antígeno de alta afinidad. En dichos casos, la presencia de más de un resto de unión a antígeno especifico para el antígeno de la célula diana puede potenciar la intemalizaciórl del antigeno de la célula diana, reduciendo así su disponibilidad.

En muchos otros casos, sin embargo, será ventajoso tener una molécula biespecifica de unión a antígeno activadora de linfocitos T que comprenda dos o más restos de unión a antígeno especificos para un anUgeno de célula diana (véase los ejemplos en las Figuras 1C, 1 F, 1G, 1J o 1l), por ejemplo, para optimizar la orientaciórl al sitio diana o para permitir el entrelazamiento de los antígenos de la célula diana.

Porconsiguienle, en ciertos modos de realizaciórl, la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento comprende adicionalmente un tercer resto de unión a anUgeno que es una molécula Fab capaz de unirse específicamente a un antígeno de célula diana. En un modo de realización, el tercer resto de unión a antígeno es capaz unirse específicamente al mismo antígeno de célula diana que el primer o segundo resto de unión a antígeno. En un modo de realizaciórl particular, el primer resto de unión a antígeno es capaz de unirse específicamente a un antígeno activador de linfocítos T, y el segundo yel tercer resto de unión a antígeno son capaces de unirse específicamente a un antígeno de célula diana.

En un modo de realización, el tercer resto de unión a antrgeno está fusionado en el extremo e de la cadena pesada Fab al extremo N de la primera o la segunda subunidad del dominio Fe. En un modo de realización particular, el segundo y el tercer resto de uniórl a antígeno están fusionados cada uno en el extremo e de la cadena pesada Fab al extremo N de una de las subunidades del dominio Fc, yel primer resto de unión a antígeno está fusionado en el

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extremo e de la cadena pesada Fab al extremo N de la cadena pesada Fab del segundo resto de unión a antígeno. En uno de dichos modos de realización, el primer resto de unión a antígeno es una molécula Fab de cadena única. En uno de dichos modos de realización particulares, el primer resto de unión a antígeno es una molécula Fab entrecruzada. Opcionalmente, si el primer resto de unión a anUgeno es una molécula Fab entrecruzada, la cadena 5 ligera Fab del primer resto de uniÓfl a anligenoy la cadena ligera Fab del segundo resto de unión a antígeno se pueden fusionar adicionalmente entre sí. El segundo y el tercer resto de unión a antígeno se pueden fusionar al dominio Fe directamente o a través de un conector peptidico. En un modo de realización particular, el segundo y el tercer resto de unión a antígeno están fusionados cada uno al dominio Fc a través de una región bisagra de inmunoglobulina. En un modo de realización específico, la región bisagra de inmunoglobulina es una región bisagra de IgGl humana. En un modo de realización, el segundo y el tercer resto de unión a antígeno y el dominio Fc son parte de una molécula de inmunoglobulina. En un modo de realizaciórl particular, la molécula de inmunoglobulina es una inmunoglobulina de clase IgG. En un modo de realización incluso más particular, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina de subclase IgGl. En otro modo de realización, la inmunoglobulina es una inmunog!obulina de subclase IgG4. En un modo de realizaciórl particular adicional, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina humana. En otros modos de realización,

15 la inmunoglobulina es una inmunoglobulina quimérica o una inmunoglobulina humanizada. En un modo de realización, la molécula biespecifica de unión a antígeno activadora de linfocitos T consiste esencialmente en una molécula de inmunoglobulina capaz de unirse específicamente a un antígeno de célula diana, y un resto de unión a antígeno capaz de unirse especificamente a un antigeno activador de linfocitos T en el que el resto de unión a antrgeno es una molécula Fab de cadena única o una molécula Fab entrecruzada, particularmente una molécula Fab entrecruzada, fusionada al extremo N de una de las cadenas pesadas de inmunoglobulina, opcionalmente a través de un conector peptidico.

En un modo de realización alternativo, el primer y el tercer resto de unión a antrgeno están fusionados cada uno en el extremo C de la cadena pesada Fab al extremo N de una de las subunidades del dominio Fc, y el segundo resto de 25 unión a antigeno está fusionado en el extremo C de la cadena pesada Fab al extremo N de la cadena pesada Fab del primer resto de uniórl a anUgeno. En uno de dichos modos de realización especificas, la molécula biespecifica de unión a antígeno activadora de linfocitos T consiste esencialmente en un primer, un segundo y un tercer resto de unión a antigeno, un dominio Fc compuesto por una primera y una segunda subunidad y, opcionalmente, uno o más conectores pepUdicos, en el que el segundo resto de unión a anUgeno está fusionado en el extremo C de la cadena pesada Fab al extremo N de la cadena pesada Fab del primer resto de unión a antígeno, yel primer resto de unión a antígeno está fusionado en el extremo C de la cadena pesada Fab al extremo N de la primera subunidad del dominio Fc, yen el que el tercer resto de unión a antigeno está fusionado en el extremo C de la cadena pesada Fab al extremo N de la segunda subunidad del dominio Fc. En uno de dichos modos de realización particulares, el primer resto de unión a antígeno es una molécula Fab entrecruzada. Opcionalmente, la cadena ligera Fab del primer resto de unión a

35 antígeno y la cadena ligera Fab del segundo resto de unión a antígeno se pueden fusionar adicionalmente entre sí.

En algunas de las moléculas biespecificas de unión a anUgeno activadoras de linfocitos T divulgadas en el presente documento, la cadena ligera Fab del primer resto de uniórl a antrgeno y la cadena ligera Fab del segundo resto de unión a antígeno están fusionadas entre sí, opcionalmente a través de un conector peptídico. Dependiendo de la configuración del primer y el segundo resto de unión a antigellO, la cadena ligera Fab del primer resto de unión a anUgeno se puede fusionar en su extremo C con el extremo N de la cadena ligera Fab del segundo resto de unión a antígeno. o la cadena ligera Fab del segundo resto de unión a antígeno se puede fusionar en su extremo C con el extremo N de la cadena ligera Fab del primer resto de unión a antígeno. La fusión de las cadenas ligeras Fab del primer y el segundo resto de unión a antrgeno reduce además el emparejamiento errórleo de cadenas pesadas y

45 ligeras Fab no comparables, y también reduce el número de plásmidos necesarios para la expresión de algunas de las moléculas biespecíficas de unión a antígeno activadoras de linfocitos T divulgadas en el presente documento.

En ciertos modos de realizaciórl, la molécula biespecífica de unión a antfgeno activadora de linfocitos T comprende un polipéptido en el que una primera cadena ligera Fab oomparte un enlace peptídico carboxiterminal oon un conector peptidico, que a su vez comparte un enlace peptrdico carboxiterminal con una primera cadena pesada Fab, que a su vez comparte un enlace peptidico carboxiterminal con una subunidad de dominio Fc (VL·CL-conector.VH·CH1·CH2· CH2(·CH4», y un polipéptidoen el que una segunda cadena pesada Fab comparte un enlace peptídicocarboxiterminal con una subunidad de dominio Fc (VH·CH1·CH2·CH3(·CH4». En algunos modos de realización, la molécula biespecifica de unión a antigeno activadora de linfocitos T comprende además un segundo polipéptido de cadena

55 ligera Fab (Vl·Cl). En ciertos modos de realización, los polipéptidos están unidos covalentemente, por ejemplo, mediante un enlace disulfuro.

En algunos modos de realización, la molécula biespecífica de unión a antígeno activad ora de linfocitos T comprende un polipéptido en el que una primera cadena ligera Fab comparte un enlace pepUdico carboxiterminal con un conector peptidico, que a su vez comparte un enlace peptidico carboxiterminal con una primera cadena pesada Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una segunda cadena pesada Fab, que a su vez comparte un enlace peptidico carboxiterminal con una subunidad de dominio Fc (VL·CL-conector.VH·CH1.VH·CH1·CH2·CH3(· CH4». En uno de estos modos de realización, dicha molécula biespecifica de unión a antrgeno activadora de linfocitos T comprende además un segundo polipéptido de cadena ligera Fab (VL·CL). La molécula biespecífica de unión a 65 antígeno activadora de linfocitos T de acuerdo con estos modos de realización puede comprender además (i) un polipéptido de subunidad del dominio Fc (CH2·CH3(·CH4», o (ii) un polipéptido en el que una tercera cadena pesada

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Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad de dominio Fe (VH-CH1-CH2-CH3(-CH4)) y un tercer polipéplido de cadena ligera Fab (VL-CL). En ciertos modos de realización, los polipéplidos están unidos oovalentemente, por ejemplo, mediante un enlace disulfuro.

En ciertos modos de realizaciÓfl, la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T comprende un polipéptido en el que una primera región variable de cadena ligera Fab comparte un enlace peplídioo carboxiterminal con una primera región constante de cadena pesada Fab (es decir, una cadena pesada Fab entrecruzada, en la que la región variable de cadena pesada está reemplazada por una región variable de cadena ligera), que a su vez oomparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad de dominio Fc (VL-CH1-CH2CH2(-CH4», y un polipéptidoen el que una segunda cadena pesada Fab comparte un enlace peptrdicocarboxiterminal con una subunidad del dominio Fc (VH-CH1-CH2-CH3(-CH4». En algunos modos de realización, la molécula biespecifica de unión a anUgeno activadora de linfocitos T comprende además un polipéptido en el que una región variable de cadena pesada Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una región constante de cadena ligera Fab (VH-CL) y un polipéptido de cadena ligera Fab (VL-CL). En ciertos modos de realización, los polipéptidos están unidos covalentemente, por ejemplo, mediante un enlace disulfuro.

En modos de realización alternativos, la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T comprende un polipéptido en el que una primera región variable de cadena pesada Fab comparte un enlace peptrdico carboxiterminal con una primera región constante de cadena ligera Fab (es decir, una cadena pesada Fab entrecruzada, en la que la región constante de cadena pesada está reemplazada por una región constante de cadena ligera), que a su vez comparte un enlace pepUdico carboxiterminal con una subunidad de dominio Fc (VH-CL-CH2CH2(-CH4», y un polipéptido en el que una segunda cadena Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc (VH-CH1-CH2-CH3(-CH4» . En algunos modos de realización, la molécula biespecífica de unión a antrgeno activadora de linfocitos T comprende además un polipéptido en el que una región va riable de cadena ligera Fab comparte un enlace peptídicocarboxiterminal con una región constante de cadena pesada Fab (VLCH1) y un polipéptido de cadena ligera Fab (Vl -CL). En ciertos modos de realización, los polipéptidos están unidos covalentemente, por ejemplo, mediante un enlace disulfuro.

En algunos modos de realización, la molécula biespeclfica de unión a anHgeno activadora de linfocitos T comprende un polipéptido en el que una primera región variable de cadena ligera Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una primera reg ión constante de cadena pesada Fab (es decir, una cadena pesada Fab entrecruzada, en la que la región variable de cadena pesada está reemplazada por una región variable de cadena ligera), que a su vez comparte un enlace peptrdico carboxiterminal con una segunda cadena pesada Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad de dominio Fc (VL-CH1-VH-CH1-CH2-CH3(CH4». En otros modos de realización, la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T comprende un polipéptido en el que una primera reg ión variable de cadena pesada Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una primera región constante de cadena ligera Fab (es decir, una cadena pesada Fab entrecruzada, en la que la región constante de cadena pesada está reemplazada por una región constante de cadena ligera), que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una segunda cadena pesada Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad de dominio Fc (VH-CL-VH-CH1-CH2-CH3(CH4». En otros modos de realización más, la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T comprende un polipéptido en el que una segunda cadena pesada Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una primera región variable de cadena ligera Fab. que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal COfl una primera región constante de cadena pesada Fab (es decir, una cadena pesada Fab entrecruzada, en la que la región variable de cadena pesada está reemplazada por una región variable de cadena ligera), que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad de dominio Fc (VH-CH1-VL-CH1-CH2-CH3(-CH4». En otros modos de realización, la molécula biespeclfica de unión a anUgeno activadora de linfocitos T comprende un polipéptido en el que una segunda cadena pesada Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una primera región variable de cadena pesada Fab, que a su vez oomparte un enlace peptídico carboxiterminal con una primera región constante de cadena ligera Fab (es decir, una cadena pesada Fab entrecruzada, en la que la región constante de cadena pesada está reemplazada por una región constante de cadena ligera), que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad de dominio Fc (VH-CH1-VH-CL-CH2-CH3(-CH4)).

En algunos de estos modos de realización, la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T comprende además un polipéptido de cadena ligera Fab entrecruzada, en el que una región variable de cadena pesada Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una región constante de cadena ligera Fab (VH-CL) y un polipéptido de cadena ligera Fab (VL-CL). En otros de estos modos de realización, la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T comprende además un polipéptido de cadena ligera Fab entrecruzada, en el que una región variable de cadena ligera Fab comparte un enlace pepUdico carboxiterminal con una región constante de cadena pesada Fab (VL-CH1) y un polipéptido de cadena ligera Fab (VL-CL). En aun otros de estos modos de realización, la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T comprende además un polipéptido en el que una región variable de cadena ligera Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una región constante de cadena pesada Fab, que a su vez comparte un enlace peptldioo carboxiterminal con un polipéptido de cadena ligera Fab (VL-CH1-VL-CL), un polipéptido en el que una región variable de cadena pesada Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una región constante de cadena ligera Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con un polipéptido de cadena ligera Fab (VH-CL-VL-CL), un polipéptido en el que un

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polipéptido de cadena ligera Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal COfl una regiÓfl variable de cadena ligera Fab, que a su vez comparte un enlace peplídioo carboxiterminal oon una región constante de cadena pesada Fab (VL-Cl-Vl-CH1 l, o un polipéptido en el que un polipéptido de cadena ligera Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una región variable de cadena pesada Fab, que a su vez comparte un enlace pepUdico carboxiterminal oon una región constante de cadena ligera Fab (VL-CL-VH-CL).

La molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T de acuerdo con estos modos de realización puede comprender además (i) un polipéptido de subunidad del dominio Fe (CH2-CH3(-CH4» , o (ii) un polipéplido en el que una tercera cadena pesada Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal oon una subunidad de dominio Fc (VH-CH1-CH2-CH3(-CH4» y un tercer polipéptido de cadena ligera Fab (VL-CL). En ciertos modos de realización, los polipéptidos están unidos covalentemente, por ejemplo, mediante un enlace disulfuro.

En un modo de realización, la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T comprende un polipéptido en el que una segunda cadena ligera Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una primera región va riable de cadena ligera Fab, que a su vez comparte un enlace pepUdico carboxiterminal con una primera región constante de cadena pesada Fab (es decir, una cadena ligera Fab entrecruzada, en la que la región constante de cadena ligera está reemplazada por una región constante de cadena pesada) (VL-CL-VL-CH1), un polipéptido en el que una segunda cadena pesada Fab comparte un enlace peptidico carboxiterminal con una subunidad de dominio Fc (VH-CH1-CH2-CH3(-CH4», y un polipéptido en el que una primera región variable de cadena pesada Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una primera regiórl constante de cadena ligera Fab (VH-CL). En otro modo de realización, la molécula biespec¡fica de unión a anUgeno activadora de linfocitos T comprende un polipéptido en el que una segunda cadena ligera Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una primera región variable de cadena pesada Fab, que a su vez comparte un enlace peptidico carboxiterminal con una primera región constante de cadena ligera Fab (es decir, una cadena ligera Fab entrecruzada, en la que la región variable de cadena ligera está reemplazada por una regiórl variable de cadena pesada) (VL-CL-VH-CL), un polipéptido en el que una segunda cadena pesada Fab comparte un enlace peptidico carboxiterminal con una subunidad de dominio Fc (VH-CH1-CH2-CH3(CH4», y un polipéptido en el que una primera región variable de cadena ligera Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una primera región constante de cadena pesada Fab (VL-CH1). La molécula biespecrfica de unión a anUgeno activadora de linfocitos T de acuerdo con estos modos de realización puede comprender además (i) un polipéptido de subunidad del dominio Fc (CH2-CH3(-CH4» , o (ii) un polipéptido en el que una tercera cadena pesada Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad de dominio Fe (VH-CH1-CH2-CH3(-CH4)) y un tercer polipéptido de cadena ligera Fab (VL-CL). En ciertos modos de realización, los polipéptidos están unidos covalentemente, por ejemplo, mediante un enlace disulfuro.

De acuerdo con uno cualquiera de los modos de realizaciórl anteriores, los componentes de la molécula biespecífica de unión al antígeno aclivadora de linfocitos T (por ejemplo, resto de unión a antígeno, dominio Fc) se pueden fusionar directamente o a través de diversos conectores, particularmente conectores peptídicos que comprenden uno o más aminoácidos, Upicamente aproximadamente 2-20 aminoácidos, que se describen en el presente documento o son conocidos en la técnica. Los conectores peptídioos no inmunogénicos adecuados incluyen, por ejemplo, conectores peptidicos (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n o G4(SG4)n, en el que «n» es, en general, un número entre 1 y 10, tipicamente entre

2 y4.

Domínio Fc

El dominio Fc de la molécula biespecifica de unión a antígeno activadora de linfocitos T consiste en un par de cadenas polipeptídicas que oomprenden dominios de cadena pesada de una molécula de inmunoglobulina. Por ejemplo, el dominio Fe de una molécula de inmunoglobulina G (lgG) es un dimero, en el que cada subunidad comprende los domínios constantes de cadena pesada CH2 y CH3 de IgG. l as dos subunidades del dominio Fe son capaces de crear una asociación estable entre sí. En un modo de realización, la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento comprende no más de un dominio Fc.

En un modo de realización, el dominio Fe de la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T es un dominio Fc de IgG. En un modo de realización particular, el dominio Fc es un dominio Fc de IgGl. En otro modo de realizaciórl, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG4. En un modo de realización más especIfico, el dominio Fc es un dominio Fc de 19G4 que comprende una sustitución de aminoácido en la posición S228 (numeración UE), en particular la sustitución de aminoácido S228P. Esta sustitución de aminoácido reduce el intercambio in vivo del brazo Fab de anticuerpos IgG4 (véase Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010». En un modo de realizaciórl particular adicional, el dominio Fc es humano. Una secuencia ejemplar de una región Fc de 19G1 humana se proporciOfla en la SEO ID NO: 149.

Modificaciones del dominio Fc que promueven la heterodimerización

Las moléculas biespec¡ficas de unión a anUgeno activadoras de linfocitos T divulgadas en la presente comprenden diferentes restos de unión a antígeno, fusionados a una u otra de las dos subunidades del dominio Fc, de modo que las dos subunidades del dominio Fc están típicamente comprendidas en dos cadenas polipeptídicas no idénticas. la coexpresión recombinante de estos polipéptidos y la posterior dimerización conduce a varias combinaciones posibles

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de los dos polipéptidos. Para mejorar el rendimiento y la pureza de las moléculas biespecíficas de unión a antígeno aclivadoras de linfocitos T en la producción recombinanle, será ventajoso introducir una modificación en el dominio Fe de la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T que promueva la asociación de los polipéptidos deseados.

5

Por consiguiente, en modos de realización particulares, el dominio Fe de la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento comprende una modificación que promueve la asociación de la primera y la segunda subunidad del dominio Fe. El sitio de la interacción proteína·proteína más extensa entre las dos subunidades de un dominio Fc de IgG humana está en el dominio CH3 del dominio Fc. Por lo tanto, en un modo de realización, dicha modificación está en el dominio CH3 del dominio Fc.

En un modo de realización especifico, dicha modificación es una modificación llamada «botón en ojal» (del inglés

«knob·into-hole»), que comprende una modificación de «botón» en una de las dos subunidades del dominio Fc y una

modificación de «ojal» en la otra de las dos subunidades del dominio Fc.

15 La tecnologia de botón en ojal se describe, por ejemplo, en los documentos US 5.731.168; US 7.695.936; en Ridgway et al., Prot Eng 9, 617..s21 (1996) yen Carter, J Immunol Meth 248, 7·15 (2001). En general, el procedimiento implica introducir una protuberancia (<<botón») en la interfaz de un primer polipéptido y una cavidad correspondiente (<<ojal») en la interfaz de un segundo polipéptido, de manera que la protuberancia se puede colocar en la cavidad para promover la formación de heterodimeros y dificultar la formación de homodimeros. Las protuberancias se construyen reemplazando cadenas laterales pequeñas de aminoácidos de la interiaz del primer polipéptido por cadenas laterales mayores (p.ej. tirosina o triptófano). Las cavidades compensatorias de tamaño idéntico o similar a las protuberancias se crean en la interfaz del segundo polipéptido reemplazando cadenas laterales de aminoácidos grandes por otras más pequeñas (p.ej. alanina o treonina).

25 Por consiguiente, en un modo de realización particula r, en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc de la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T se reemplaza un residuo de aminoácido por un residuo de aminoácido que tiene un volumen de cadena lateral mayor, generando de ese modo una protuberancia dentro del dominio CH3 de la primera subunidad que se puede colocar en una cavidad creada dentro del dominio CH3 de la segunda SUbunidad, y en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc se reemplaza un residuo de aminoácido por un residuo de aminoácido que tiene un menor volumen de la cadena lateral, generando de ese modo una cavidad dentro del dominio CH3 de la segunda subunidad en la que se puede colocar la protuberancia creada dentro del dominio CH3 de la primera subunidad.

35 La protuberancia y la cavidad se pueden obtener alterando el ácido nucleico que codifica los polipéptidos, por ejemplo, mediante mutagénesis específica de sitio o mediante síntesis de péptidos.

En un modo de realizaciórl espeCifico, en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc, el residuo de treonina en la posición 366 se reemplaza por un residuo de triptófano (T366W), yen el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc, el residuo de tirosina en la posición 407 se reemplaza por un residuo de valina (Y407V). En un modo de realización, en la segunda subunidad del dominio Fc adicionalmente el residuo de treonina en la posiciórl 366 se reemplaza por un residuo de serina (T366S) y el residuo de leucina en la posición 368 se reemplaza por un residuo de alanina (L368A).

45 En aún otro modo de realización adicional, en la primera subunidad del dominio Fc adicionalmente el residuo de serina en la posiciÓfl 354 se reemplaza por un residuo de cisteína (S354C), y en la segunda subunidad del dominio Fc adicionalmente el residuo de tirosina en la posición 349 se reemplaza por un residuo de cisteina (Y349C). La introducción de estos dos residuos de cisterna da como resultado la formación de un puente disulfuro entre las dos subunidades del dominio Fc, estabilizando adicionalmente el drmero (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001».

En un modo de realizaciórl particula r, el resto de unión a antigenocapaz de unirse a un antrgeno activadorde linfocitos T se fusiona (opcionalmente a través del resto de unión a antígeno capaz de unirse a un antrgeno de célula diana) a la primera subunidad del dominio Fc (que comprende la modificación «botón»). Sin pretender imponer ninguna teoría, la fusión del resto de unión a antrgeno capaz de unirse a un antigeno activador de linfocitos T a la subunidad del

55 dominio Fc que contiene el botón minimizará (adicionalmente) la generación de moléculas de unión a antigeno que comprenden dos restos de uniórl a antigeno capaces de unirse a un anUgeno activador de los linfocitos T (choque estérico de dos polipéptidos que contienen un botón).

En un modo de realización alternativo, una modificación que promueve la asociación de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc comprende una modificación en la que median efectos de o rientación por interacción electrostática, por ejemplo, como se describe en la publicación PCT WO 2009/089004. En general, este procedimiento implica la sustitución de uno o más residuos de aminoácidos en la interfaz de las dos subunidades del domi nio Fc por residuos de aminoácido cargados, de modo que la formación del homodimero se vuelve electrostáticamente desfavorable, mientras que la heterodimerización es electrostáticamente favorable.

65

Modificaciones del dominio Fe que reducen la función efectora vio la unión al receptor Fe

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El dominio Fe confiere propiedades farmacocinéticas favorables a la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T , que induyen una prolongada semivida en suero que contribuye a una buena acumulación en el tejido diana y a una proporción favorable de distribución tejido-sangre. Al mismo tiempo, sin embargo, puede provocar que la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T se dirija de manera indeseable a células que expresan receptores de Fe en lugar de a células portadoras de antígenos preferentes. Además, la coactivación de las vías de señalización del receptor Fe puede conducir a la liberación de citocinas que, en combinación con las propiedades de activación de linfocitos T y la larga semivida de la molécula de unión al antígeno, provoca una activación excesiva de los receptores de citocinas y efectos secundarios graves tras la administración sistémica. La activación de células inmunitarias (que portan el receptor Fc) distintas de los linfocitos T puede incluso reducir la eficacia de la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T debido a la posible destrucción de los linfocitos T, por ejemplo, mediante células NK.

Por consigUiente, en modos de realización particulares, el dominio Fc de las moléculas biespecíficas de uníón a antígeno activadoras de linfocitos T divulgadas en el presente documento muestra una afinidad de unión reducida por un receptor Fcy/o una función efectora reducida, en comparación con un dominio Fc de IgG1 natural. En uno de dichos modos de realización, el dominio Fc (o la molécula biespecífica de unión al antígeno activadora de linfocitos T que comprende dicho dominio Fc) exhibe menos de un 50 %, preferentemente menos de un 20 %, más preferentemente menos de un 10 % Y lo más preferentemente menos de un 5 % de la afinidad de unión por un receptor Fc, en comparación con un dominio Fc de 19G1 natural (o una molécula biespecífica de unión al antígeno activadora de linfocitos T que comprende un dominio Fc de IgG1 natural), y/o menos de un 50 %, preferentemente menos de un 20 %, más preferentemente menos de un 10 % Y lo más preferentemente menos de un 5 % de la función efectora, en comparación con un dominio dominio Fc de IgG1 natural (o una molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T que comprende un dominio Fc de 19G1 natural). En un modo de realización, el dominio dominio Fc (o la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T que comprende dicho dominio Fc) no se une sustancialmente a un receptor Fc y/o no induce sustancialmente una función efectora. En un modo de realización particular, el receptor Fc es un receptor Fcy. En un modo de realización, el receptor Fc es un receptor Fc humano. En un modo de realización, el receptor Fc es un receptor Fc activador. En un modo de realizaciÓfl especifico, el receptor Fc es un receptor Fcy humano activador, más específicamente FcyRllla, FcyRI o FcyRlla humano, más específicamente FcyRllla humano. En un modo de realización, la función efectora es una o más seleccionadas entre el grupo de COC, AOCC, ADCP y secreción de citocinas. En un modo de realización particular, la función efectora es ADCC. En un modo de realización, el dominio dominio Fc exhibe una afinidad de unión sustancialmente similar por el receptor Fc neonatal (FcRn), en comparación con un dominio Fc de IgG1 natural. Se logra una unión sustancialmente similar a FcRn cuando el dominio Fc (o la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T que comprende dicho dominio Fc) exhibe más de aproximadamente un 70 %. particularmente más de aproximadamente un 80 %, más particularmente más de aproximadamente un 90 % de la unión afinidad de un dominio Fc de IgG1 natural (o de la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T que comprende un dominio Fc de IgG1 natural) por FcRn.

En ciertos modos de realización, el dominio Fc se genomanipula para que tenga afinidad de unión reducida por un receptor Fc y/o función efectora reducida, en comparación con un dominio Fc no genomanipulado. En modos de realizaciÓfl particulares. el dominio Fc de la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T comprende una o más mutaciones de aminoácidos que reducen la afinidad de unión del dominio Fc por un receptor Fc y/o la función efectora. Típicamente, la misma de una o más mutaciones de aminoácidos está presente en cada una de las dos subunidades del dominio Fc. En un modo de realización, la mutación de am inoácido reduce la afinidad de unión del dominio Fc por un receptor Fc. En un modo de realización, la mutación de aminoácido reduce la afinidad de unión del dominio Fc por un receptor Fc en al menos 2 veces, al menos 5 veces o al menos 10 veces. En modos de realización en los que hay más de una mutación de aminoácido que reduce la afinidad de unión del dominio Fc por el receptor Fc, la combinación de estas mutaciones de aminoácidos puede reducir la afinidad de unión del dominio Fc por un receptor Fc en al menos 10 veces, al menos 20 veces o incluso al menos 50 veces. En un modo de realizaciÓfl, la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T que comprende un dominio Fc genomanipulado exhibe menos de un 20 %, particularmente menos de un 10 %, más particularmente menos de un 5 % de la afinidad de un ión por un receptor Fcen comparac ión con una molécula biespecífica de un ión a antígeno activadora de linfocitos T que comprende un dominio Fc no genomanipulado. En un modo de realización particular, el receptor Fc es un receptor Fcy. En algunos modos de realización, el receptor Fc es un receptor Fc humano. En algunos modos de realización, el receptor Fc es un receptor Fc activador. En un modo de realización espeCífico, el receptor Fc es un receptor Fcy humano activador, más específicamente FcyRllla, FcyRI o FcyRlla humano, más específicamente FcyRllla humano. Preferentemente, se reduce la un ión a cada uno de estos receptores. En algunos modos de realización también se reduce la afinidad de unión por un componente del complemento, específicamente la afinidad de unión por C1q. En un modo de realización, la afinidad de unión por el receptor Fc neonatal (FcRn) no se reduce. Se consigue una unión sustancialmente similar a FcRn, es decir, preservación de la afinidad de unión del dominio Fc por dicho receptor, cuando el dominio Fc (o la molécula biespecifica de unión a antígeno activadora de linfocitos T que comprende dicho dominio Fc) exhibe más de aproximadamente un 70 % de la unión afinidad de una forma no genomanipulada del dominio Fc (o de la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T que comprende dicha forma no genomanipulada del dominio Fc) por FcRn. El dominio Fc, o las moléculas biespecíficas de unión a antígeno activadoras de linfocitos T divulgadas en el presente documento que comprenden dicho dominio

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Fe, pueden exhibir más de aproximadamente un 80 % e ¡nduso más de aproximadamente un 90 % de dicha afinidad. En ciertos modos de realización, el dominio Fe de la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T se genomanipula para que tenga una función efedora reducida, en comparación con un dominio Fe no genomanipulado. La función efectora reducida puede incluir, pero no se limita a, uno o más de los siguientes: citotoxicidad dependiente del complemento (eDC) reducida, citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADGel reducida, fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) reducida, secreción de cilocinas reducida, absorción de antígeno mediada por complejos inmunitarios por células presentadoras de anUgenos reducida, unión a células NK reducida, unión a macrófagos reducida, unión a monocitos reducida, unión a células polimorfonucleares reducida, señalización directa inductora de apoptosis reducida, entrelazamiento de anticuerpos unidos a diana reducido, maduración de células dendriticas reducida o sensibilización de linfocitos T reducida. En un modo de realizaciÓf'l, la función efectora reducida es una o más seleccionadas entre el grupo de CDC reducida, ADCC reducida, ADCP reducida y secreción de citocinas reducida. En un modo de realización particular, la función efectora reducida es ADCC reducida. En un modo de realización, la ADCC reducida es inferior a un 20 % de la ADCC inducida por un dominio Fc no genomanipulado (o una molécula biespecifica de unión a anUgeno activadora de linfodtos T que comprende un dominio Fc no genomanipulado).

En un modo de realización, la mutación de aminoácido que reduce la afinidad de unión del dominio Fc por un receptor Fc yfo función efectora es una sustitución de aminoácido. En un modo de realización, el dominio Fc comprende una sustituciÓf'l de aminoácido en una posición selecciooada entre el grupo de E233, L234, L235, N297, P331 Y P329. En un modo de realización más espeCifico, el dominio Fc comprende una sustitución de aminoácido en una posición seleccionada entre el grupo de L234, L235 Y P329. En algunos modos de realización, el dominio Fc comprende las sustituciooes de aminoácidos L234A y L235A. En uno de dichos modos de realización, el dominio Fc es un dominio Fc de IgGl, particularmente un dominio Fc de IgGl humana. En un modo de realización, el dominio Fc comprende una sustituciÓf'l de aminoácido en la posición P329. En un modo de realización más espeCifico, la sustitución de aminoácido es P329A o P329G, particulannente P329G. En un modo de realización, el dominio Fc comprende una sustitución de aminoácido en la posición P329 y una sustitución de aminoácido adicional en una posición seleccionada entre E233, L234, L235, N297 Y P331. En un modo de realización más específico, la sustitución de aminoácido adicional es E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D o P3318. En modos de realización particulares, el dominio Fc comprende sustituciooes de aminoácidos en las posiciones P329, L234 Y L235. En modos de realización más particulares, el dominio Fc comprende las mutaciones de aminoácidos L234A, L235A Y P329G (<<P329G LALA»). En uno de dichos modos de realización, el dominio Fc es un dominio Fc de IgGl, particularmente un dominio Fc de IgGl humana. La combinación «P329G LALA» de sustituciones de aminoácidos suprime casi completamente la unión al receptor Fcy de un dominio Fc de IgGl humana, como se describe en la publicación PCT n.o WO 2012/130831 . El documento WO 2012/130831 también describe procedimientos de preparación de dichos dominios Fc mutantes y procedimientos para determinar sus propiedades tales como la unión al receptor Fc o funciones efectoras.

Los anticuerpos IgG4 exhiben una afinidad de unión reducida por los receptores Fc y reducidas funciones efectoras, en comparación con los anticuerpos IgGl. Por lo tanto, en algunos modos de realización, el dominio Fc de las moléculas biespecíficas de unión a antígeno activadoras de linfocitos T divulgadas en el presente documento es un dominio Fc de IgG4, particulannente un dominio Fc de IgG.t humana. En un modo de realización, el dominio Fc de IgG4 comprende las sustituciones de aminoácidos en la posición 8228, especifica mente la sustitución de aminoácido 8228P. Para reducir aún más su afinidad de unión por un receptor Fc y/o su función efectora, en un modo de realización. el dominio Fc de IgG4 comprende una sustitución de aminoácido en la posición L235, específicamente la sustitución de aminoácido L235E. En otro modo de realización, el dominio Fc de IgG4 comprende una sustitución de aminoácido en la posiCiÓf'l P329, especificamente la sustitución de aminoácido P329G. En un modo de realización particular, el dominio Fc de IgG4 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 8228, L235 Y P329, específicamente las sustituciones de aminoácidos 8228P, L235E Y P329G. Dichos mutantes de dominio Fc de IgG4 y sus propiedades de unión al receptor Fcy se describen en la publicación PCT n.O WO 2012/130831.

En un modo de realización particular, el dominio Fc que exhibe una afinidad de unión reducida por un receptor Fc yfo una función efectora reducida, en comparaciÓf'l con un dominio Fc de IgGl natural, es un dominio Fc de IgGl humana que comprende las sustituciooes de aminoácidos L234A, L235A y, opcionalmente, P329G, o un dominio Fc de IgG4 humana que comprende las sustituciones de aminoácidos 8228P, L235E y, opcionalmente, P329G.

En ciertos modos de realización, se ha eliminado la N-glucosilación del dominio Fc. En uno de dichos modos de realizaciÓf'l, el dominio Fc comprende una mutación de aminoácido en la posición N297, particularmente una sustituciÓf'l de aminoácido que reemplaza asparagina por alanina (N297A) o ácido aspártico (N297D).

Además de los dominios Fc descritos anterionnente en el presente documento y en la publicación PCT n.o W02012/130831 , dominios Fc con reducida unión al receptor Fc yfo función efectora reducida también incluyen aquellos con sustitución de uno o más de los residuos 238, 265, 269, 270, 297, 327 Y 329 del dominio Fc (patente de EE. UU. n.o 6.737.056). Dichos mutantes de Fc incluyen mutantes de Fc con sustituciones en dos o más de las posiciones de aminoácido 265, 269, 270, 297 Y 327, incluyendo el llamado mutante de Fc «DANA» con la sustitución de los residuos 265 y 297 por alanina (patente de EE. UU. n.o 7.332.581).

Los dominios de Fc mutantes se pueden preparar por eliminación, sustitución, inserción o modificación de aminoácidos

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usando procedimientos genéticos o químicos bien cOflocidos en la técnica. Los procedimientos genéticos pueden incluir mutagénesis específica de sitio de la secuencia de ADN codificante, peR, síntesis de genes y similares. Los cambios de nucle6tidos correctos se pueden verificar, por ejemplo, mediante secuenciaciÓn.

La unión a los receptores Fe se puede determinar fácilmente, por ejemplo, mediante EUSA, o Resooancia de Plasmón Superficial (SPR) usando instrumentación estándar tal como un instrumento BIAcore (GE Heallhcare), y receptores Fe tales como los que se pueden obtener por expresión recombinante. Uno de dichos ensayos de unión adecuados se describe en el presente documento. De forma alternativa, la afinidad de unión de los dominios Fe o de las moléculas biespecíficas de unión a antígeno activadoras de linfocitos T que comprenden un dominio Fc por los receptores Fc se puede evaluar usando lineas celulares conocidas por expresar receptores Fc particulares, tales como células NK humanas que expresan el receptor Fcyllla.

La función efectora de un dominio Fc, o de una molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T que comprende un dominio Fc, se puede medir por procedimientos conocidos en la técnica. Un ensayo adecuado para medir AOCC se describe en el presente documento, Otros ejemplos de ensayos in vitro para evaluar la actividad de AOCC de una molécula de interés se describen en la patente de EE. UU. n.o 5.500.362, en Hellstrom, 1. et al. Proc NaU Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986) Y en Hellstrom et al., Proc NaU Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985); la patente de EE. UU. n.o 5.821.337; 6ruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987). De forma alternativa se pueden emplear procedimientos de ensayos no radioactivos (véase, por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad no radioactivo ACTITM para citometría de flujo (CeIITechnology, Inc. Mountain View, CA; y el ensayo de citotoxicidad no radiactivo CytoTox 96® (Promega, Madison, WI). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (P6MC) y linfocitos citolíticos naturales (NK). De forma alternativa, o adicional, la actividad de AOCC de la molécula de interés se puede evaluar in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el divulgado en Clynes et al., PNAS (USA) 95:652-656 (1998).

En algunos modos de realización se reduce la unión del dominio Fc a un componente del complemento, específicamente a C1q. Por consiguiente , en algunos modos de realización en los que el dominio Fc está genomanipulado para tener una función efectora reducida, dicha función efectora reducida incluye COC reducida. Los ensayos de uniórl a C1q se pueden llevar a cabo para determinar si la molécula biespecífica de unión a antrgeno activadora de linfocitos T es capaz de unirse a C1q y, J)Or lo tanto, tiene actividad de COCo Véase, por ejemplo, el ELlSA de un ión a C1q y C3c en los documentos WO 20061029879 y WO 2005/100402. Para evaluar la activación del complemento se puede realizar un ensayo de COC (véase, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202,163 (1996); Cragg et al., 6100d 101, 1045-1052 (2003); Cragg y Glennie, 6100d 103, 2738-2743 (2004).

Restos de unión a antígeno

La molécula de unión a anUgeno divulgada en el presente documento es biespecífica, es decir, comprende al menos dos restos de unión a antrgeno capaces de unirse específicamente a dos determinantes antigénicos distintos. De acuerdo con la presente divulgación, los restos de unión a antígeno son moléculas de Fab (es decir, dominios de unión a antígeno compuestos por una cadena pesada y una cadena ligera, comprendiendo cada uno de ellos una región variable y una región constante). En un modo de realización, dichas moléculas Fab son humanas. En otro modo de realizaciórl, dichas moléculas Fab están humanizadas. En aún otro modo de realización, dichas moléculas Fab comprenden regiones constantes de cadena pesada y ligera humanas.

Al menos uno de los restos de unión a antígeno es una molécula Fab de cadena única o una molécula Fab entrecruzada. Dichas modificaciones evitan el emparejamiento incorrecto de cadenas pesadas y ligeras de diferentes moléculas de Fab, mejorando de ese modo el rendimiento y la pureza de la molécula biespecífica de unión a antrgeno activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento en la producción recombinante. En una molécula Fab de cadena única particular útil para la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento, el extremo C de la cadena ligera Fab está conectado al extremo N de la cadena pesada Fab mediante un conector peptídico. El conector peptídico permite la dispOSición de la cadena pesada y ligera Fab para formar un resto de unión a antígeno funcional. Los conectores peptídicos adecuados para conectar la cadena pesada y ligera de Fab incluyen, por ejemplo, (G4S)6-GG (SEO ID NO: 152) o (SG3)2-(SEG3).t-(SG3}-SG (SEO ID NO: 153). En una molécula Fab entrecruzada particular útil para la molécula biespecífica de unión a anUgeno activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento, las regiones constantes de la cadena ligera Fab y la cadena pesada Fab están intercambiadas. En otra molécula Fab entrecruzada particular útil para la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento, las regiones variables de la cadena ligera Fab y la cadena pesada Fab están intercambiadas.

En un modo de realización particular, la molécula biespecifica de unión a antigeno activadora de linfocitos T es capaz de unirse simultáneamente a un antígeno de célula diana, particularmente un antígeno de célula tumoral, y a un anUgeno activador de linfocitos T. En un modo de realización, la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T es capaz de entrelazar un linfocito T y una célula diana mediante la uniórl simultánea a un antígeno de célula diana y a un antígeno activador de linfocitos T. En un modo de realización incluso más particular, didla unión simultánea da como resultado la lisis de la célula diana, particularmente una célula tumoral. En un modo de realización, dicha uniórl simultánea da como resultado la activación del linfocito T. En otros modos de realización, dicha unión

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simultánea da como resultado una respuesta celular de un linfocito T, particularmente un linfocito T citotóxico, seleccionado entre el grupo de: proliferación, diferenciación, secreción de cilocinas, liberación de moléculas efectoras citotóxicas, actividad citot6xica y expresión de marcadores de activación. En un modo de realización, la unión de la molécula biespecifica de unión a anUgeno activadora de linfocitos T al anUgeno activador de linfocitos T sin la unión simultánea al antígeno de la célula diana no da como resultado la activación del linfocito T.

En un modo de realización, la molécula biespeclfica de unión a antlgeno activadora de linfocitos T es capaz de redirigir la actividad citolóxica de un linfocito T a una célula diana. En un modo de realización particular, dicho redireccionamiento es independiente de la presentación de antígenos peptídicos mediada por MHC por parte de la célula diana y/o de la especificidad del linfocito T.

Particularmente, un linfocito T de acuerdo con cualquiera de los modos de realización de la presente divulgación es un linfocito T citotÓxico. En algunos modos de realización, el linfocito T es un linfocito T C04+ o CD8+, particularmente un linfocito T CD8+.

Resto de unión a antígeno activador de linfocitos T

La molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento comprende al menos un resto de unión a antígeno capaz de unirse a un antígeno activador de linfocitos T (también denominado en el presente documento «resto de unión a antígeno activador de linfocitos T»). En un modo de realizaciórl particular, la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T comprende no más de un reslo de unión a anlígeno capaz de unirse específicamente a un antígeno aclivador de linfocitos T. En un modo de realizaciórl, la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T proporciona una unión monovalente al antígeno activador de linfocitos T. El resto de unión a antrgeno activador de linfocitos T puede ser una molécula Fab convencional o una molécula Fab modificada, es decir, una molécula Fab de cadena única o entrecruzada. En modos de realización en los que hay más de un resto de unión a antígeno capaz de unirse específicamente a un anUgeno de célula diana comprendido en la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T, el resto de unión a antrgeno capaz de unirse especificamente a un antígeno activador de linfocitos T es preferentemente una molécula Fab modificada.

En un modo de realización particular, el antígeno activador de linfocitos T es C03, particularmente C03 humano (SEO ID NO: 265) o CD3 de macaco (SEa ID NO: 266), los más particularmente CD3 humano. En un modo de realización particular, el resto de unión a antígeno activador de linfocitos T tiene reactividad entrecruzada por (es decir, se une específicamente a) CD3 humano y de macaco. En algunos modos de realización, el antígeno activador de linfocitos T es la subunidad épsilon de CD3.

En un modo de realización, el resto de unión a antígeno activador de linfocitos T puede competir con el anticuerpo monoclonal H2C (descrito en la publicaciórl PCT n.o W02008f119567) por la unión a un epltopo de CD3. En otro modo de realización, el resto de unión a antígeno activador de linfocitos T puede competir con el anticuerpo monoclonal V9 (descrito en Rodrigues et al., IntJ Cancer Suppl7, 45-50 (1992) Y la patente de EE. UU. n.o 6.054.297) por la unión a un epítopo de CD3. En otro modo de realización más, el resto de unión a antrgeno activador de linfocitos T puede competir con el anticuerpo monodonal FN18 (descrito en Nooij et al., Eur J Immunol19. 981-984 (1986» por la unión a un epítopo de CD3. En un modo de realización particular, el resto de unión a antígeno activador de linfocitos T puede competir con el anticuerpo monoclonal SP34 (descrito en Pessano et al., EMBO J 4, 337-340 (1985» por la unión a un epltopo de CD3. En un modo de realización, el resto de unión a anUgeno activador de linfocitos T se une al mismo epítopo de CD3 que el anticuerpo monoclonal SP34. En un modo de realización, el resto de unión a antígeno activador de linfocitos T comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEa ID NO: 163, la CDR2 de la cadena pesada de SEa ID NO: 165, la COR3 de la cadena pesada de SEa ID NO: 167, la CDR1 de la cadena ligera de SEa ID NO: 171 , la CDR2 de la cadena ligera de SEa ID NO: 173 y la CDR3 de la cadena ligera de SEa ID NO: 175. En un modo de realizaciórl adicional, el resto de unión a antigeno activador de linfocitos T comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % idéntica a SEa ID NO: 169 y una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 %

o un 100 % idéntica a SEa ID NO: 177, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad.

En un modo de realizaciórl particular, el resto de unión a anUgeno activador de linfocitos T comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEa ID NO: 249, la CDR2 de la cadena pesada de SEa ID NO: 251, la COR3 de la cadena pesada de SEa ID NO: 253, la CDR1 de la cadena ligera de SEa ID NO: 257, la CDR2 de la cadena ligera de SEa ID NO: 259 y la CDR3 de la cadena ligera de SEa ID NO: 261 . En un modo de realización, el resto de unión a anUgeno activador de linfocitos T puede competir por la unión a un epitopo de C03 con un resto de unión a antígeno que comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEa ID NO: 249, la CDR2 de la cadena pesada de SEa ID NO: 251, la COR3 de la cadena pesada de SEa ID NO: 253, la COR1 de la cadena ligera de SEa ID NO: 257, la COR2 de la cadena ligera de SEa ID NO: 259 y la COR3 de la cadena ligera de SEa ID NO: 261. En un modo de realización, el resto de unión a antígeno activador de linfocitos T se une al mismo epítopo de C03 que un resto de unión a antígeno que comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEa ID NO: 249, la CDR2 de la cadena pesada de SEa ID NO: 251, la COR3 de la cadena pesada de SEa ID NO: 253, la CDR1 de la cadena ligera de SEa ID NO: 257, la CDR2

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de la cadena ligera de SEa ID NO: 259 y la CDR3 de la cadena ligera de SEa ID NO: 261. En un modo de realización adicional, el resto de unión a antígeno activador de linfocitos T comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 ('"/0 o un 100 % idéntica a SEO ID NO: 255 y una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % idéntica a SEa ID NO: 263, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En un modo de realización, el resto de unión a anUgeno activador de linfocitos T puede competir por la unión a un epltopo de CD3 con un resto de unión a antígeno que comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEO ID NO: 255 y la secuencia de la regiÓfl variable de la cadena ligera de SEO ID NO: 263. En un modo de realización, el resto de unión a anUgeno activador de linfocitos T se une al mismo epitopo de C03 que un resto de unión a antigeno que comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEa ID NO: 255 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEa ID NO: 263. En otro modo de realización, el resto de unión a antígeno activador de linfocitos T comprende una versiÓfl humanizada de la secuencia de la regiÓfl variable de la cadena pesada de SEa ID NO: 255 y una versiÓfl humanizada de la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEa ID NO: 263. En un modo de realización, el resto de unión a antigeno activador de linfocitos T comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEa ID NO: 249, la COR2 de la cadena pesada de SEa ID NO: 251 , la COR3 de la cadena pesada de SEa ID NO: 253, la CoR1 de la cadena ligera de SEa ID NO: 257, la CoR2 de la cadena ligera de SEO ID NO: 259, la CDR3 de la cadena ligera de SEa ID NO: 261 y las secuencias estructurales de la región variable de la cadena pesada y ligera humanas.

Resto de unión a antígeno de célula diana

La molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento comprende al menos un resto de unión a antigeno capaz de unirse a un antigenode célula diana (también denominado en el presente documento «resto de unión a antígeno de célula diana»). En ciertos modos de realización, la molécula biespecifica de unión a antigeno activadora de linfocitos T comprende dos restos de unión a anUgeno capaces de unirse a un antígeno de célula diana. En uno de dichos modos de realización particulares, cada uno de estos restos de unión a antigeno se une específicamente al mismo determinante antigénico. En un modo de realización, la molécula biespecifica de uniÓfl a antígeno activadora de linfocitos T comprende una molécula de inmunoglobulina capaz de unirse especificamente a un antigeno de célula diana. En un modo de realización, la molécula biespecifica de unión a antígeno activadora de linfocitos T comprende no más de dos restos de unión a antigeno capaces de unirse a un antígeno de célula diana. El resto de unión a antígeno de célula diana es, en general, una molécula Fab que se une a un detenninante antigénico especifico y que es capaz de dirigir a la molécula biespecifica de unión a antigeno activadora de linfocitos T a un sitio diana, por ejemplo, a un tipo específico de célula tumoral que posee el detenninante antigénico.

En ciertos modos de realización, el resto de unión a antígeno de célula diana se dirige a un antígeno asociado con un estado patológico, tal como un antígeno presentado en una célula tumoral o en una céluta infectada por virus. Los anUgenos adecuados soo antigenos de superficie celular, por ejemplo, pero sin limitación, receptores de superficie celular. En algunos modos de realización, el anticuerpo es un anticuerpo humano. En un modo de realización específico, el antígeno de la célula diana se selecciona entre el grupo de proteina de activación de fibroblastos (FAP), proteoglucano de sulfato de condroitina asociado a melanoma (MCSP), receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR), antígeno carcinoembrionario (CEA), C019. CD20 y CD33.

En modos de realización particulares, la molécula biespecifica de unión a antigeno activadora de linfocitos T comprende al menos un resto de uniÓfl a antigeno que es espeCifico para el proteoglucano de sulfato de condroitina asociado a melanoma (MCSP). En un modo de realización, la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T comprende al menos uno, tipicamente dos o más restos de uniÓfl a antigeno que pueden competir con el anticuerpo monoclonal LC0ü7 (véase SEa ID NO: 75 y 83, Y publicación de solicitud de patente europea n.o EP 2748195) por la unión a un epítopo de MCSP. En un modo de realización, el resto de unión a antígeno que es específico para MCSP comprende la COR1 de la cadena pesada de SEa ID NO: 69, la CDR2 de la cadena pesada de SEa ID NO: 71 , Ia COR3 de la cadena pesada de SEa ID NO: 73, la COR1 de la cadena ligera de SEa ID NO: 17, la CoR2 de la cadena ligera de SEa ID NO: 79 y la CDR3 de la cadena ligera de SEa ID NO: 81. En un modo de realizaciÓfl adicional, el resto de unión a antígeno que es específico para MCSP comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % idéntica a SEO ID NO: 75 y una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 %

o un 100 % idéntica a SEO ID NO: 83, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En modos de realizaciÓfl particulares, la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocilos T comprende al menos uno, típicamente dos o más restos de unión a antígeno que pueden competir con el anticuerpo monoclonal M4·3 ML2 (véase SEO ID NO: 239 y 247, Y publicación de solicitud de patente europea n.O EP 2748195) por la unión a un epitopo de MCSP. En un modo de realización, el resto de unión a antígeno que es específico para MCSP se une al mismo epitopo de MCSP que el anticuerpo monoclonal M4·3 ML2. En un modo de realización, el resto de unión a antigeno que es espeCifico para MCSP comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEa ID NO: 233, la CDR2 de la cadena pesada de SEO ID NO: 235, la CDR3 de la cadena pesada de SEa ID NO: 237, la CoR1 de la cadena ligera de SEO ID NO: 241 , la CoR2 de la cadena ligera de SEa ID NO: 243 y la CDR3 de la cadena ligera de SEa ID NO: 245. En un modo de realización adicional, el resto de unión a antígeno que es específico para MCSP comprende una secuencia

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de la región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 %, particularmente un 98 %, un 99 % o un 100 %, idéntica a SEa ID NO: 239 y una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 %, particularmente un 98 %, un 99 % o un 100 %, idéntica a SEa ID NO: 247, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En un modo de realizaciÓfl, el resta de unión a antígeno que es específico para MCSP comprende las secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera de una versión de afinidad madurada del anticuerpo monoclonal M4-3 ML2. En un modo de realización, el reslade unión a antígeno que es específico para MCSP comprende la secuencia de la regi6n variable de la cadena pesada de SEa ID NO: 239 con uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete, particularmente dos, tres, cuatro o cinco, sustituciones de aminoácidos; y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEa ID NO: 247 con una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete, particulannente dos, tres, cuatro o cinco, sustituciones de aminoácidos. Cuatquier residuo de aminoácido de las secuencias de la región variable se puede sustituir por un aminoácido diferente, incluyendo residuos de aminoácido de las regiones CDR, siempre que se conserve la unión a MCSP, particulannente a MCSP humano. Las variantes preferentes son aquellas que tienen una afinidad de unión por MCSP al menos igual (o más fuerte) a la afinidad de unión del resto de unión a antígeno que comprende las secuencias de región variable no sustituidas.

En un modo de realización, la molécula biespecífica de unión a anUgeno activadora de linfocitos T comprende la secuencia polipepUdica de SEa ID NO: 1, la secuencia polipepUdica de SEa ID NO: 3 y la secuencia polipepUdica de SEa ID NO: 5, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En un modo de realización adicional, la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T comprende la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 7, la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 9 y la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 11, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En otro modo de realización más, la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T comprende la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 13, la secuencia polipepUdica de SEa ID NO: 15 y la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 5, o va riantes de las mismas que conservan la funciooalidad. En otro modo de realización más, la molécula biespecifica de unión a anUgeno activadOfa de linfocitos T comprende la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 17, la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 19 y la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 5, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En otro modo de realización, la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T comprende la secuencia polipepUdica de SEa ID NO: 21, la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 23 y la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 5, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En otro modo de realización más, la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T comprende la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 25, la secuencia polipepUdica de SEa ID NO: 27 y la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 5, o variantes de las mismas que cooservan la funcionalidad. En otro modo de realización, la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T comprende la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 29, la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 31, la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 33 y la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 5, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En otro modo de realización, la molécula biespecífica de unión a antígeno activadOfa de linfocitos T comprende la secuencia polipepUdica de SEa ID NO: 29, la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 3, la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 33 y la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 5, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En otro modo de realización, la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T comprende la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 35, la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 3, la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 37 y la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 5. o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En otro modo de realización, la molécula biespecífica de u nión a antígeno activadora de linfocitos T comprende la secuencia polipepUdica de SEa ID NO: 39, la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 3, la secuencia polipepUdica de SEa ID NO: 41 y la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: S, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En otro modo de realización más, la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T comprende la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 29, la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 3, la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: S y la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 179, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En un modo de realización, la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T comprende la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 5, la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 29, la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 33 y la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 181, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En un modo de realización, la molécula biespecíficade unión a antígeno activadora de linfocitos T comprende la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 5, la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 23, la secuencia polipepUdica de SEa ID NO: 183 y la secuencia polipepUdica de SEa ID NO: 185, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En un modo de realización, la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T comprende la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 5, la secuencia polipepUdica de SEa ID NO: 23, la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 183 y la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 187, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En un modo de realización, la molécula biespecifica de unión a antígeno activadora de linfocitos T comprende la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 33, la secuencia pQlipepUdica de SEa ID NO: 189, la secuencia polipeptidica de SEa ID NO: 191 y la secuencia polipeptidica de SEa ID NO: 193, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En un modo de realización, la molécula biespecificade unión a antígeno activadora de linfocitos T comprende la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 183, la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 189, la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 193 y la secuencia polipepUdica de SEa ID NO: 195, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En un modo de realización, la molécula biespecifica de unión a antígeno activadora de linfocitos T comprende la secuencia polipeplídica de SEa ID NO: 189, la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 193, la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 199 y la secuencia polipeptídica de SEa

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ID NO: 201 , o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En un modo de realización, la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T comprende la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 5, la secuencia polipeptídica de SEO ID NO: 23, la secuencia polipeptídica de SEO ID NO: 215 y la secuencia polipeptídica de SEO ID NO: 217, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En un modo de realización, la molécula

5 biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T comprende la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 5, la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 23, la secuencia polipeptídica de SEO ID NO: 215 y la secuencia polipeplídica de SEO ID NO: 219, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad.

En un modo de realización específioo, la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia de polinudeótidos que es al menos aproximadamente un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % idéntica a una secuencia seleccionada entre el grupo de SEa ID NO: 70, SEa ID NO: 72, SEa ID NO: 74, SEa ID NO: 76, SEa ID NO: 78, SEa ID NO: 80, SEa ID NO: 82, SEa ID NO: 84, SEa ID NO: 234, SEa ID NO: 236, SEa ID NO: 238, SEa ID NO: 240, SEa ID NO: 242, SEa ID NO: 244, SEa ID NO: 246, SEa ID NO: 248, SEa ID NO: 2, SEa ID NO: 15 4, SEa ID NO: 6, SEa ID NO: 8, SEa ID NO: 10, SEa ID NO: 12, SEa ID NO: 14, SEa ID NO: 16, SEa ID NO: 18,

~OOO.~IDooa~IDOO~~IDooa~oooa~OOO~~IDOOR

SEa ID NO: 34, SEa ID NO: 36, SEa ID NO: 38, SEa ID NO: 40, SEa ID NO: 42, SEa ID NO: 180, SEa ID NO: 182,

SEa ID NO: 184, SEa ID NO: 186, SEa ID NO: 188, SEa ID NO: 190, SEa ID NO: 192, SEa ID NO: 194, SEa ID

NO: 196, SEa ID NO: 200, SEa ID NO: 202, SEa ID NO: 216, SEa ID NO: 218 y SEa ID NO: 220.

En un modo de realización, la molécula biespecífica de unión a antígenoactivadora de linfocitos T comprende al menos un reslo de unión a antígeno que es específioo para el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). En airo modo de realización, la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T comprende al menos uno, típicamente dos o más restos de unión a antígeno que pueden competir con el anticuerpo mOfloclonal GA201 por la

25 unión a un epítopo de EGFR. Véase la publicación PCT WO 2006/082515. En un modo de realización, el resto de unión a antígeno que es específico para EGFR comprende la COR1 de la cadena pesada de SEa ID NO: 85, la COR2 de la cadena pesada de SEa ID NO: 87, la CDR3 de la cadena pesada de SEa ID NO: 89, la CDR1 de la cadena ligera de SEa ID NO: 93, la CDR2 de la cadena ligera de SEa ID NO: 95 y la CoR3 de la cadena ligera de SEa ID NO: 97. En un modo de realización adicional, el resto de uniórl a antígeno que es especifico para EGFR comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % idénlica a SEa ID NO: 91 y una secuencia de la región va riable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 ('"/0 idéntica a SEa ID NO: 99, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad.

35 En airo modo de realización más, la molécula biespecífica de unión a antígeno activadOfa de linfocilos T comprende la secuencia polipeptldica de SEa ID NO: 43, la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 45 y la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 47, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En un modo de realizaciórl adicional, la molécula biespecífica de uniórl a antígeno activadora de linfocitos T comprende la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 49, la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 51 y la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 11, o va riantes de las mismas que conservan la funciOflalidad. En otro modo de realización más, la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocilos T comprende la secuencia polipeplídica de SEa ID NO: 53, la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 45 y la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 47, o varianles de las mismas que conservan la funcionalidad.

45 En un modo de realización específioo, la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia de polinucleótidos que es al menos aproximadamente un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % idéntica a una secuencia seleccionada entre el grupo de SEa ID NO: 86, SEa ID NO: 88, SEa ID NO: 90, SEa 10 NO: 92, SEa ID NO: 94, SEa ID NO: 96, SEa ID NO: 98, SEa ID NO: 100, SEa ID NO: 44, SEa ID NO: 46, SEa ID NO: 48, SEa ID NO: 50, SEa ID NO: 52, SEa ID NO: 54 y SEa ID NO: 12.

En un modo de realización, la molécula biespecífica de unión a antígeno ac1ivadora de linfocitos T comprende al menos un resto de unión a antígeno que es específico para la proteína de activación de fibroblastos (FAP). En otro modo de

55 realizaciórl, la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T comprende al menos uno, típicamente dos o más restos de unión a antígeno que pueden competir con el anticuerpo mOfloclonal 3F2 por la unión a un epítopo de FAP. Véase la publicación PCT WO 20121020006. En un modo de realización, el reslo de unión a antígeno que es específioo para FAP comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEa ID NO: 101 , la CDR2 de la cadena pesada de SEa ID NO: 103, la CDR3 de la cadena pesada de SEa ID NO: 105, la CDR1 de la cadena ligera de SEa ID NO: 109, la COR2 de la cadena ligera de SEa ID NO: 111 y la COR3 de la cadena ligera de SEa ID NO:

113. En un modo de realización adicional, el reslo de unión a antígeno que es específico para FAP comprende una secuencia de la regiórl variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 ('"/0, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % idéntica a SEa ID NO: 107 y una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 96 %, un

65 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % idéntica a SEa ID NO: 115, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad.

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En otro modo de realización más, la molécula biespecífica de unión a antígeno activadOf8 de linfocitos T comprende la secuencia polipeptídica de SEO ID NO: 55, la secuencia polipeptidica de SEO ID NO: 51 y la secuencia polipeptidica de SEO ID NO: 11, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En un modo de realización adicional, la molécula biespecífica de uniÓfl a antígeno aclivadora de linfocitos T comprende la secuencia polipeptídica de SEO ID NO: 57, la secuencia polipeplídica de SEO ID NO: 59 y la secuencia polipeptídica de SEO ID NO: 61, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad.

En un modo de realización específico, la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T comprende una secuencia polipepUdica codificada por una secuencia de polinudeótidos que es al menos aproximadamente un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % idéntica a una secuencia seleccionada entre el grupo de SEa ID NO: 102, SEa ID NO: 104, SEa ID NO: 106, SEa ID NO: 108, SEa ID NO: 110, SEa ID NO: 112, SEa ID NO: 114, SEa ID NO: 116, SEa ID NO: 56, SEa ID NO: 58, SEa ID NO: 60, SEa ID NO: 62, SEa ID NO: 52 y SEa ID NO: 12.

En modos de realización particulares, la molécula biespeclfica de unión a antígeno activadora de linfocitos T comprende al menos un resto de unión a antígeno que es específico para el antígeno carcinoembrionario (CEA). En un modo de realización, la molécula biespecífica de unión a antigeno activadora de linfocitos T comprende al menos uno, típicamente dos o más restos de unión a antígeno que pueden competir con el anticuerpo monoclonal BW431/26 (descrito en la patente europea n.o EP 160897 yen Bosslet et al. Int J Cancer 36, 75-84 (1985)) por la unión a un epítopo de CEA. En un modo de realización, la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T comprende al menos uno, típicamente dos o más restos de uniÓfl a antígeno que pueden competir con el anticuerpo monoclonal CH1A1A (véase SEa ID NO: 123 y 131) por la unión a un epítopo de CEA. Ver la publicación PCT n.o WO 2011/023787. En un modo de realización, el resto de unión a anUgeno que es espeCifico para CEA se une al mismo epitopo de CEA que el anticuerpo monoclonal CH1 A1A. En un modo de realización, el resto de unión a antígeno que es especifico para CEA comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEa ID NO: 117, la CDR2 de la cadena pesada de SEa ID NO: 119, la CDR3 de la cadena pesada de SEa ID NO: 121, la CDR1 de la cadena ligera de SEa ID NO: 125, la COR2 de la cadena ligera de SEa ID NO: 127 y la COR3 de la cadena ligera de SEa ID NO: 129. En un modo de realización adicional, el resto de unión a antígeno que es espeCífico para CEA comprende una secuencia de la reg ión variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 %, particularmente un 98 %, un 99 % o un 100 %, idéntica a SEa ID NO: 123 y una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es at menos aproximadamente un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 %, particularmente un 98 %, un 99 % o un 100 %, idéntica a SEa ID NO: 131, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En un modo de realizaciÓfl, el resto de unión a antígeno que es especifico para CEA comprende las secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera de una versión de afinidad madurada del anticuerpo monoclonal CH1A1A. En un modo de realización, el resto de unión a antígeno que es espectfico para CEA comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEa ID NO: 123 con uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete, particulannente dos, tres, cuatro o cinco, sustituciones de aminoácidos; y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEa ID NO: 131 con una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete, particulannente dos, tres, cuatro o cinco, sustituciones de aminoácidos. Cualquier residuo de aminoácido de las secuencias de la región variable se puede sustituir por un aminoácido diferente, incluyendo residuos de aminoácido de las regiones CDR, siempre que se oonserve la unión a CEA, particulannente CEA humano. Las variantes preferentes son aquellas que tienen una afinidad de unión por CEA al menos igual (o más fuerte) a la afinidad de unión del resto de unión a antígeno que comprende las secuencias de región variable no sustituidas.

En un modo de realización, la molécula biespecífica de unión a anUgeno activadora de linfocitos T comprende la secuencia polipeptidica de SEa ID NO: 63, la secuencia polipeptidica de SEa ID NO: 65, la secuencia polipeptldica de SEa ID NO: 67 y la secuencia polipeptidica de SEa ID NO: 33, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En un modo de realizaciÓfl, la molécula biespecífica de unión a antígeno aclivadora de linfocitos T comprende la secuencia polipepUdica de SEa ID NO: 65, la secuencia potipeptídica de SEa ID NO: 67, la secuencia polipeptidica de SEa ID NO: 183 y la secuencia polipeptidica de SEa ID NO: 197, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En un modo de realizaciÓfl, la molécula biespecifica de unión a antígeno activadora de linfocitos T comprende la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 183, la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 203, la secuencia polipeptidica de SEa ID NO: 205 y la secuencia polipepUdica de SEa ID NO: 207, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En un modo de realización, la molécula biespecifica de unión a antígeno aclivadora de linfocilos T comprende la secuencia polipeptidica de SEa ID NO: 183, la secuencia polipeplidica de SEa ID NO: 209, la secuencia polipeptidica de SEa ID NO: 211 y la secuencia polipeptídica de SEa ID NO: 213, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad.

En un modo de realización especifico, la molécula biespecífica de unión a antigeno aclivadora de linfocitos T comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuenda de polinucleótidos que es al menos aproximadamente un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % idéntica a una secuencia seleccionada entre el grupo de SEa ID NO: 118, SEa ID NO: 120, SEa ID NO: 122, SEa ID NO: 124, SEa ID NO: 126, SEa ID NO: 128, SEa ID NO: 130, SEa ID NO: 132, SEa ID NO: 64, SEa ID NO: 66, SEa ID NO: 68, SEa ID NO: 34, SEa ID NO: 184, SEa ID NO: 198, SEa ID NO: 204, SEa ID NO: 206, SEa ID NO: 208, SEa ID

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NO: 210, SEa ID NO: 212 y SEa ID NO: 214.

En un modo de realización, la molécula biespecífica de unión a anligenoactivadora de linfocitos T comprende al menos un resto de unión a antigeno que es específico para CD33. En un modo de realización, el resto de unión a antrgeno

5 que es específico para CD33 comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEO ID NO: 133, la CDR2 de la cadena pesada de SEa ID NO: 135, la CDR3 de la cadena pesada de SEO ID NO: 137, la CDR1 de la cadena ligera de SEO ID NO: 141 , la CDR2 de la cadena ligera de SEO ID NO: 143 y la CDR3 de la cadena ligera de SEO ID NO: 145. En un modo de realización adicional, el resto de unión a antígeno que es específico para CD33 comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % idéntica a SEO ID NO: 139 y una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % idéntica a SEO ID NO: 147, o variantes de las mismas que cooservan la funcionalidad.

En un modo de realización, la molécula biespecifica de unión a anUgeno activadora de linfocitos T comprende la

15 secuencia polipeptídica de SEO ID NO: 33, la secuencia polipeptídica de SEO ID NO: 213, la secuencia polipepUdica de SEO ID NO: 221 y la secuencia polipeptídica de SEO ID NO: 223, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad. En un modo de realizaciÓfl, la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T comprende la secuencia polipeptídica de SEO ID NO: 33, la secuencia polipeptrdica de SEO ID NO: 221, la secuencia polipeptídica de SEO ID NO: 223 y la secuencia polipeptídica de SEO ID NO: 225, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad.

En un modo de realización específico, la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T comprende una secuencia polipepUdica codificada por una secuencia de polinucleótidos que es al menos aproximadamente un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % idéntica a

25 una secuencia seleccionada entre el grupo de SEO ID NO: 134, SEO ID NO: 136, SEO ID NO: 138, SEO ID NO: 140, SEO ID NO: 142, SEO ID NO: 144, SEO ID NO: 146, SEO ID NO: 148, SEO ID NO: 34, SEO ID NO: 214, SEO ID NO: 222, SEO ID NO: 224 y SEO ID NO: 226.

Polinucleótidos

En el presente documento también se proporcionan polinucleótidos aislados que codifican una molécula biespecifica de unión a antlgeno activadora de linfocitos T como se describe en el presente documento o un fragmento de la misma.

Los polinucteótidos divulgados en el presente documento incluyen aquellos que son al menos aproximadamente un

35 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % idénticos a las secuencías establecidas en las SEO ID NO: 2, 4,6, 8, 10, 12, 14,16, 18, 20, 22,24,26,28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50,52, 54,56,58,60,62,64,66,68,70, 72,74, 76, 78,80,82,84,86,88, 90,92,94,96,98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200,202, 204, 206,208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262 Y 264, incluyendo fragmentos funcionales o variantes de los mismos.

Los polinucte6tidos que codifican las moléculas biespecíficas de unión a antígeno activadoras de linfocitos T divulgadas en el presente documento se pueden expresar como un único polinucleótido que codifica la molécula 45 biespecífica de unión a anUgeno activadora de linfocitos T completa o como múltiples (por ejemplo, dos o más) polinucieótidos que se coexpresan. Los polipéptidos codificados por polinucle6tidos que se coexpresan se pueden asociar a través de, por ejemplo, enlaces disulfuro u otros medios para formar una molécula biespecífica de unión a ant1geno aclivadora de linfocitos T funciooal. Por ejemplo, el segmento de cadena ligera de un resto de unión a antígeno puede estar codificado por un polinucteótido separado del segmento de la molécula biespecifica de unión a antígeno activadora de linfocitos T que comprende el segmento de cadena pesada del resto de unión a antígeno, una subunidad de dominio Fc y, opcionalmente, (parte de) otro resto de unión a antígeno. Cuando se coexpresan, los polipéptidos de cadena pesada se asociarán coo los polipéptidos de cadena ligera para formar el resto de unión a antígeno. En otro ejemplo, el segmento de la molécula biespecifica de unión a antígeno activadora de linfocitos T que comprende una de las dos subunidades del dominio Fc y, opciooalmente, (parte de) uno o más restos de unión a

55 antígeno podría estar codificado por un polinucleótido separado del segmento de la molécula biespecifica de unión a anUgeno aclivadora de linfocitos T que comprende la la otra de las dos subunidades del dominio Fc y, opcionalmente, (parte de) un resto de unión a antígeno. Cuando se coexpresan, las subunidades del dominio Fc se asociarán para formar el dominio Fc.

En ciertos modos de realización, un polinucleótido aislado divulgado en el presente documento codifica un fragmento de una molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T que comprende un primer y un segundo resto de unión a anUgeno, y un dominio Fc que consiste en dos subunidades, en la que el primer resto de unión a anUgeno es una molécula Fab de cadena única. En un modo de realización, un polinucle6tido aislado divulgado en el presente documento codifica el primer resto de unión a antígeno y una subunidad del dominio Fc. En un modo de 65 realizaciÓfl más específico, el polinucleótido aislado codifica un polipéptido en el que una molécula Fab de cadena única comparte un enlace peptidico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc. En otro modo de realización,

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un polinucleólido aislado divulgado en el presente documento cod ifica la cadena pesada del segundo reslo de unión a antígeno y una subunidad del dominio Fe. En un modo de realización más específico, el polinucle6lido aislado codifica un polipéptido en el que una cadena pesada Fab comparte un enlace peptídioo carboxiterminal con una subunidad del dominio Fe. En otro modo de realización más, un polinucleótido aislado divulgado en el presente documento codifica el primer resto de unión a antígeno, la cadena pesada del segundo resto de unión a antígeno y una subunidad del dominio de Fe. En un modo de realizaciÓfl más específico, el polinucleótido aislado codifica un polipéptido en el que una molécula Fab de cadena única comparte un enlace peptldico carboxiterminal con una cadena pesada Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc.

En ciertos modos de realización, un polinucleótido aislado divulgado en el presente documento codifica un fragmento de una molécula biespecifica de unión a antrgeno activadora de linfocitos T que comprende un primer y un segundo resto de unión a anUgeno, y un dominio Fc que consiste en dos subunidades, en la que el primer resto de unión a antígeno es una molécula Fab entrecruzada. En un modo de realización, un polinucleótido aislado divulgado en el presente documento codifica la cadena pesada del primer resto de unión a antrgeno y una subunidad del dominio Fc. En un modo de realización más especrfico, el polinucleótido aislado codifica un polipéptido en el que la región variable de la cadena ligera Fab comparte un enlace pepUd ico carboxiterminal con una reg ión constante de la cadena pesada Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc. En otro modo de realizaciórl especifico, el polinucle6tido aislado codifica un polipéptido en el que la región variable de la cadena pesada Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal coo una región constante de cadena ligera Fab, que a su vez comparte un enlace peptrdico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc. En otro modo de realizaciórl, un polinucleótido aislado divulgado en el presente documento codifica la cadena pesada del segundo resto de unión a antígeno y una subunidad del dominio Fe. En un modo de realización más específico, el polinucleótido aislado codifica un polipéptido en el que una cadena pesada Fab comparte un enlace peptidico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc. En otro modo de realizaciórl más, un polinucle6tido aislado divulgado en el presente documento codifica la cadena pesada del primer resto de unión a antrgeno, la cadena pesada del segundo resto de unión a antígeno y una subunidad del dominio de Fc. En un modo de realización más especifico, el polinucleótido aislado codifica un polipéptido en el que una región variable de la cadena ligera Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una región constante de la cadena pesada Fab, que a su vez comparte un enlace peptidico carboxiterminal oon una cadena pesada Fab, que a su vez comparte un enlace peptrdico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc. En otro modo de realización específico, el polinucleótido aislado oodifica un polipéptido en el que una regi6n variable de la cadena pesada Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una región constante de la cadena ligera Fab, que a su vez comparte un enlace pepUdico carboxiterminal oon una cadena pesada Fab, que a su vez comparte un enlace pepUdico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc. En otro modo de realización específico más, el polinucleótido aislado oodifica un polipéptido en el que una cadena pesada Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una región variable de la cadena ligera Fab, que a su vez comparte un enlace peptrdico carboxiterminal con una región coostante de la cadena pesada Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc. En otro modo de realización espeCífico más, el polinucle6tido aislado codifica un polipéptido en el que una cadena pesada Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una región variable de la cadena pesada Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una región constante de la cadena ligera Fab, que a su vez comparte un enlace peptidico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc.

En modos de realización adiciooales, un polinucleótido aislado divulgado en el presente documento codifica la cadena pesada de un tercer resto de uniórl a anUgeno y una subunidad del dominio Fc. En un modo de realización más especifico, el polinucleótido aislado codifica un polipéptido en el que una cadena pesada Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc.

En modos de realización adiciooales, un polinucleótido aislado divulgado en el presente documento codifica la cadena ligera de un resto de unión a antígeno. En algunos modos de realización, el polinucleótido aislado codifica un polipéptido en el que una región variable de la cadena ligera Fab comparte un enlace peptidico carboxilerminal con una región constante de la cadena pesada Fab. En otros modos de realización, el polinucleótido aislado codifica un polipéptido en el que una región variable de la cadena pesada Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una región constante de la cadena ligera Fab. En otros modos de realización más, un polinucleótido aislado divulgado en el presente documento codifica la cadena ligera del primer resto de unión a antígeno y la cadena ligera del segundo resto de unión a antígeno. En un modo de realización más especifico, el polinucleótido aislado codifica un polipéptido en el que una región variable de la cadena pesada Fab comparte un enlace peptídico carboxilerminal con una región constante de la cadena ligera Fab, que a su vez comparte un enlace peptidico carboxiterminal con una cadena ligera Fab. En otro modo de realización específico, el polinucle6tido aislado codifica un polipéptido en el que una cadena ligera Fab comparte un enlace pepUdico carboxiterminal con una regiórl variable de la cadena pesada Fab, que a su vez comparte un enlace peptidico carboxiterminal con una regiórl constante de la cadena ligera Fab. En otro modo de realización específico más, el polinucie6tido aislado codifica un polipéptido en el que una región variable de la cadena ligera Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una región constante de la cadena pesada Fab, que a su vez comparte un enlace peptrdico carboxiterminal con una cadena ligera Fab. En otro modo de realización espeCifico más, el polinucle6tido aislado codifica un polipéptido en el que una cadena ligera Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una región variable de la cadena ligera Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal oon una región constante de la cadena pesada Fab.

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En otro modo de realización, la presente divulgación está dirigida a un polinucleólido aislado que oodifica una molécula biespecifica de unión a antígeno activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento o un fragmento de la misma, en la que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica una secuencia de región variable como se muestra en las SEO ID NO: 75, 83, 91,99, 107, 115, 123, 131, 139, 147, 169, 177,239,247,255 '1263. En otro modo de realización, la presente divulgación está dirigida a un polinucleólido aislado que codifica una molécula biespecífica de unión a anUgeno aclivadora de linfocitos T o fragmento de la misma, en la que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica una secuencia polipeptídica como se muestra en las SEO ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19,21,23, 25,27,29,31,33,35,37,39, 41,43,45,47,49, 51,53,55,57, 59,61,63,65,67, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211,213,215,217, 219, 221, 223, 225, 227, 229 Y 231. En otro modo de realización, la presente divulgación está dirigida a un polinucleótido aislado que codifica una molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento o un fragmento de la misma, en el que el polinucleótido comprende una secuencia que es al menos aproximadamente un 80 %, un 85 %, un 90 ('"/0, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % idéntica a una secuencia de nucleótidos mostrada en las SEO ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26,28, 30,32,34, 36,38, 40,42, 44, 46, 48,50, 52,54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118,120, 122,124, 126,128,130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 164, 166, 168, 170,172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224,226,228, 230,232,234,236,238,240,242,244,246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262 0264. En otro modo de realización, la presente divulgación está dirigida a un polinucleótido aislado que codifica una molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento o un fragmento de la misma, en el que el polinucleótido comprende una secuencia de ácido nucleico mostrada en las SEO ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14,16, 18,20,22,24,26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74,76, 78,80,82, 84,86, 88,90,92, 94,96, 9B, 100, 102, 104, 106, 10B, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122,

1~,126,1~,130,1~,134,136,1~,140,1~,1~, 146,1~,1~1~,168,1ro,1n,1~1ro,178,100,1B2,

184, 186, 18B, 190, 192, 194, 196, 19B, 200, 202, 204, 206, 20B, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230,232,234,236,238,240,242,244,246,248,250,252,254, 256, 258, 260, 262 o 264. En otro modo de realización, la presente divulgación está dirigida a un polinucleótido aislado que codifica una molécula biespecífica de unión a anUgeno activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento o un fragmento de la misma, en el que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica una secuencia de regiÓfl variable que es al menos aproximadamente un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos en las SEO ID NO: 75, 83, 91, 99, 107, 115, 123, 131, 139, 147, 169, 177, 239, 247, 255 o 263. En otro modo de realización, la presente divulgación está dirigida a un polinucleótido aislado que codifica una molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T o fragmento de la misma, en el que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica una secuencia polipepUdica que es al menos un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos en las SEO ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11,13, 15,17, 19,21,23, 25,27, 29, 31,33, 35,37, 39, 41, 43,45,47, 49, 51, 53, 55,57, 59, 61, 63, 65, 67, 179, 181, 183, 185,187,189, 191, 193,195, 197, 199, 201,203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229 o 231. La presente divulgación abarca un polinucleótido aislado que codifica una molécula biespecifica de unión a antígeno activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento o un fragmento de la misma, en el que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica la secuencia de región variable de SEO ID NO: 75, 83, 91,

99. 107, 115. 123, 131. 139, 147. 169, 177, 239. 247, 255 o 263 con sustituciones conservadoras de aminoácidos. La divulgación también abarca un polinucle6tido aislado que codifica una molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento o un fragmento de la misma, en el que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica la secuencia polipeptídica de SEO ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23,25,27,29,31,33,35,37,39,41,43,45,47,49,51,53, 55, 57, 59, 61,63, 65,67, 179, 181, 183, 185, 187,189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229 o 231 con sustituciones conservadoras de aminoácidos.

En ciertos modos de realización, el polinucleótido o ácido nucleico es ADN. En otros modos de realización, un polinucleótido divulgado en el presente documento es ARN, por ejemplo, en forma de ARN mensajero (ARNm). El ARN divulgado en el presente documento puede ser monocatenario o bicatenario.

Procedimientos recombinantes

Las moléculas biespecíficas de unión a antígeno activadoras de linfocitos T divulgadas en el presente documento se pueden obtener, por ejemplo, mediante síntesis de péptidos en estado sólido (por ejemplo, síntesis en fase sólida de Merrifield) o producción recombinante. Para la producción recombinante, se aísla uno o más polinucle6tídos que codifican la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T (fra9mento, por ejemplo, como se describe anteriormente, y se inserta en uno o más vectores para la posterior clonación y/o expresión en una célula hospedadora. Didlo polinucleótido se puede aislar y secuenciar fácilmente usando procedimientos convencionales. En un modo de realización se proporciona un vector, preferentemente un vector de expresión, que comprende uno o más de los polinucleótidos divulgados en el presente documento. Los procedimientos que son bien conocidos por los expertos en la técnica se pueden usar para construir vectores de expresión que contienen la secuencia codificante de una molécula biespecifica de unión a antígeno activadora de linfocitos T (fragmento) junto con señales de control de transcripción/traducción apropiadas. Estos procedimientos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas

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sintéticas y recombinación genélicalrecombinación in vivo. Véase, por ejemplo, las técnicas descritas en Maniatis el al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbar Laboratory, N.Y. (1989); Y Ausubel el al., Curren! Proiocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989). El veclor de expresión puede ser parte de un plásmido, virus o puede ser un fragmento de ácido nudeico. El vector de expresión incluye un casete de expresión en el que el polinucleótido que codifica la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T (fragmento) (es decir, la región codificante) se clona en asociación funciooal con un promotor y/u otros elementos de control de la transcripción o la traducción. Como se usa en el presente documento, una «región codificante» es un segmento de ácido nucleico que consiste en codones traducidos en aminoácidos. Aunque un «codón de parada» (TAG, TGA o TAA) no se traduce en un aminoácido, se puede considerar como parte de una región COdificante, si está presente, mientras que cualquier secuencia flanqueante, por ejemplo, promotores, sitios de unión a ribosomas, terminadores de la transcripción, intrones, regiones 5' y 3' no traducidas y similares, no son parte de una región codificante. Dos o más regiones codificantes pueden estar presentes en una única construcción de polinucieótido, por ejemplo, en un único vector, o en construcciones de polinucle6tidos separadas, por ejemplo, en vectores separados (diferentes). Además, cualquier vector puede contener una única región COdificante, o puede comprender dos o más regiones codificantes, por ejemplo, un vector divulgado en el presente documento puede codificar uno o más polipéptidos, que se separan después de o durante la traducción en las proteinas finales por escisión proteolitica. Además, un vector, un polinucieótido o un ácido nucleico divulgado en el presente documento puede codificar regiones codificantes heterólogas, fusionadas o no fusionadas a un polinucleótido que codifica la molécula biespecífica de unión al antígeno activadora de linfocitos T (fragmento) divulgada en el presente documento, o una variante o derivado de la misma. l as regiones codificantes heterólogas incluyen, sin limitación, elementos o motivos especializados, tales como un péptido señal secretor o un dominio funcional heterÓlogo. Una asociación funcional se produce cuando una región codificante para un producto génico, por ejemplo, un polipéptido, se asocia con una o más secuencias reguladoras de tal manera que la expresión del producto génico queda bajo la influencia o el control de la o las secuencias reguladoras. Dos fragmentos de ADN (tal como una región codificante de polipéptido y un promotor asociado) están «asociados de fonna funciooal» si la inducción de la función promotora da como resultado la transcripción de ARNm que codifica el producto génico deseado y si la naturaleza de la unión entre los dos fragmentos de ADN no interfiere en la capacidad de las secuencias reguladoras de la expresión de dirigir la expresión del producto génico o en la capacidad de la plantilla de ADN que se va a transcribir. Por lo tanto, una región promotora estaria asociada de fonna funcional a un ácido nucleico que codifica un polipéptido si el promotor fuera capaz de efectuar la transcripción de ese ácido nucleico. El promotor puede ser un promotor específico de la célula que dirige la transcripción sustancial del ADN solo en células predeterminadas. Otros elementos de control de la transcripción, además de un promotor, por ejemplo, potenciadores, operadores, represores y señales de terminación de la transcripción, se pueden asociar de fonna funcional al polinucleótido para dirigir la transcripción específica de la célula. En el presente documento se divulgan promotores adecuados y otras regiones de control de la transcripción. Los expertos en la técnica COflocen una variedad de regiones de control de la transcripción. Estas incluyen, sin limitación, regiones de control de la transcripción que funcionan en células de vertebrados, tales como, pero sin limitación, segmentos promotores y potenciadores de citomegalovirus (por ejemplo, el promotor temprano inmediato, junto con el intrón A), virus 40 de simio (por ejemplo, el promotor temprano) y retrovirus (tal como, por ejemplo, el virus del sarcoma de Rous). Otras reg iones de control de la transcripción incluyen los derivados de genes de vertebrados tales como actina, proteina de choque ténnico, hormona de crecimiento bovina y alfa-globina de conejo, asi como otras secuencias capaces de controlar la expresión génica en células eucariotas. Las regiones de control de la transcripción adecuadas adiciooales incluyen promotores y potenciadores específicos de tejido, así como promotores inducibles (por ejemplo, promotores inducibles portetraciciinas). De manera similar, los expertos en la técnica conocen una variedad de elementos de control de la traducción. Estos incluyen, pero fIO se limitan a, sitios de unión a ribosomas, codones de iniciación y de terminación de la traducción y elementos derivados de sistemas víricos (particularmente un sitio interno de entrada al ribosoma, o IRES, también denominado secuencia CITE). El casete de expresión también puede incluir otras características tales como un OI'"igen de replicación y/o elementos de integración cromosómica tales como repeticiones terminales largas (lTR) retroviricas o repeticiones terminales invertidas (ITR) de virus adenoasociados (AAV).

Las regiones codificantes de polinucle6tidos y ácidos nucleicos divulgadas en el presente documento se pueden asociar a regiones codificantes adicionales que codifican péptidos secretores o de señal, que dirigen la secreción de un polipéptido codificado por un polinucie6tido divulgado en el presente documento. Por ejemplo, si se desea la secreción de la molécula biespecífica de unión a anUgeno activadora de linfocitos T, el ADN que codifica una secuencia señal se puede colocar en dirección' del ácido nucleico que codifica una molécula biespecifica de unión a antigeno activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento o un fragmento de la misma. De acuerdo con la hipótesis de señal, las proteínas secretadas por células de mamifero tienen un péptido señalo secuencia lider secretora que se escinde de la proteína madura una vez que se ha iniciado la exportación de la cadena de proteína en crecimiento a través del retículo endoplásmico rugoso. Los expertos en la técnica saben que los polipéptidos secretados pOI'" células de vertebrados tienen, en general, un péptido señal fusionado al extremo N del polipéptido, que se escinde del polipéptido traducido para producir una forma secretada °«madura» del polipéptido. En ciertos modos de realización se usa el péptido señal natural, por ejemplo, un péptido señal de cadena pesada o cadena ligera de inmunoglobulina,

: o un derivado funcional de esa secuencia que retiene la capacidad de dirigir la secreción del polipéptido que está asociado de fonna funciooal al mismo. De fonna altemativa, se puede usar un péptido señal heterólogo de mamifero,

: o un derivado funcional del mismo. Por ejemplo, la secuencia lider natural puede estar sustituida con la secuencia líder de activador de plasminógeno tisular humano (TPA) o de ¡3-glucurooidasa de ratón. Las secuencias ejemplares

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de aminoácidos y polinucleótidos de los péptidos señal secretores se proporcionan en las SEO ID NO: 154-162.

El ADN que codifica una secuencia de proteína corta que se podría usar para facilitar la purificación posterior (por ejemplo, un marcadO( de histidina) o para ayudar a marcar la molécula biespecifica de unión a anUgeno activadora de linfocitos T se puede induir dentro o en los extremos de la molécula biespecífica de unión a antígeno activad ora de linfocitos T (fragmento) que codifica el polinucleótido.

En un modo de realización adicional se proporciona una célula hospedadora que comprende uno arnás polinucleólidos divulgados en el presente documento. En ciertos modos de realización se proporciona una célula hospedadora que comprende uno o más vectores divulgados en el presente documento. Los polinucleótidos y vectores pueden incorporar cualquiera de las caracteristicas, individuatmente o en combinación, divulgadas en el presente documento en relación con los polinucleótidos y vectores, respectivamente. En uno de dichos modos de realización, una célula hospedadora comprende (por ejemplo. se ha transformado o transfectado con) un vector que comprende un polinucleótido que codifica (parte de) una molécula biespecifica de unión a anUgeno activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento. Como se usa en el presente documento, el término «célula hospedadora» se refiere a cualquier tipo de sistema celular que se puede manipular genéticamente para generar las moléculas biespecíficas de unión a antígeno activadoras de linfocitos T divulgadas en el presente documento o fragmentos de las mismas. Las células hospedadoras adecuadas para la replicación y para soportar la expresión de las moléculas biespecíficas de unión a antígeno activadoras de linfocitos T son bien conocidas en la técnica. Dichas células se pueden transfeclaro transducir según sea apropiado con el vector de expresión particular y se pueden cuttivar grandes cantidades de células que contienen vectores para sembrar fermentadores a gran escala con el fin de obtener cantidades suficientes de la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T para aplicaciones clinicas. Las células hospedadoras adecuadas incluyen microorganismos procariotas, tales como E. eoli, o diversas células eucariotas, tales como células de ovario de hámster chino (CHO), células de insecto o similares. Por ejemplo, los polipéptidos se pueden producir en bacterias, en particular cuando la glucosilación no es necesaria. Después de la expresión, el polipéptido se puede aislar de la pasta de células bacterianas en una fracción soluble y se puede purificar adicionalmente. Además de los procariotas, los microbios eucariotas, por ejemplo, los hongos filamentosos o las levaduras, son hospedadores adecuados de donación o expresión para vectores que codifican polipéptidos, incluyendo cepas de hongos y levaduras cuyas rutas de glucosilación se han «humanizado», loque da como resultado la producciÓfl de un polipéptido con un patrón de glucosilación parciat o totalmente humano. Véase Gerngross, Nat Biolech 22, 1409-1414 (2004) Y Li el al., Nat Biolech 24,210-215 (2006). Las células hospedadoras adecuadas para la expresión de polipéptidos (glucosilados) también se derivan de organismos multicelulares (invertebrados y vertebrados). los ejemplos de células de invertebrados incluyen células de plantas y de insectos. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus que se pueden usar en combinación con células de insectos, particularmente para la transfección de células de Spodoptera frugiperda. Los cultivos de células de plantas también se pueden usar como hospedadores. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.o 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978 Y

6.417.429 (que describen la tecnologia PLANTIBODIES™ para la producción de anticuerpos en plantas transgénicas). Las células de vertebrados también se pueden usar como hospedadores. Pueden ser útiles, por ejemplo, lineas celulares de mamífero que están adaptadas para crecer en suspensión. Otros ejemplos de líneas de células hospedadoras de mamfferos útiles son la linea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7): la linea de riñón embrionario humano (células 293 o 293T como se describe, por ejemplo, en Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977», células de riñón de hámster recién nacido (BHK). células de Sertoli de ratón (células TM4 como se describe, por ejemplo, en Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)), células de riñón de mono (CV1 ), células de riñón de mono verde africano (VERO-76), células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA), células de riñón canino (MDCK), células de higado de ratas búfalo (BRL 3A), células de pulmón humano (W138), células de higado humano (Hep G2), células de tumor de mama de ratÓfl (MMT 060562), células TRI (como se describe, por ejemplo, en Mather et al., Annals NY Acad Sci 383, 44-68 (1982», células MRC 5 y células FS4. Otras lineas de células hospedadoras de mamifero induyen células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo células DHFR-CHO (Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980» y lineas celulares de mieloma tales como YO, NSO, P3X63 Y Sp2l0. Para una revisión de algunas lineas de células hospedadoras de mamifero adecuadas para la producción de proteinas, véase, por ejemplo, Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), págs. 255268 (2003). Las células hospedadoras incluyen células cultivadas, por ejemplo, células cultivadas de mamífero, células de levadura, células de insecto, células bacterianas y células vegetales, por nombrar solo algunas, pero también células comprendidas dentro de un animal transgénico, planta transgénica o tejido vegetal o animal cultivado. En un modo de realización, la célula hospedadora es una célula eucariota, preferentemente una célula de mamifero, tal como una célula de ovario de hámster chino (CHO), una célula de riñón embrionario humano (HEK) o una célula linfoide (por ejemplo, célula YO, NSO, Sp20).

Las tecnologias estándar para expresar genes extraños en estos sistemas son conocidas en la técnica. Las células que expresan un polipéptido que comprende la cadena pesada o la cadena ligera de un dominio de unión a antigeno tal como un anticuerpo, se pueden genomanipular para expresar también la otra de las cadenas de anticuerpo de modo que el producto expresado sea un anticuerpo que tiene tanto una cadena pesada como una cadena ligera.

En un modo de realización se proporciona un procedimiento para producir una molécula biespecifica de unión a antígeno activadora de linfocitos T como se divulga en el presente documento, en el que el procedimiento comprende cultivar una célula hospedadora que comprende un polinucle6tido que codifica la molécula biespecifica de unión a

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antígeno activadora de linfocitos T, como se proporciona en el presente documento, en condiciones adecuadas para la expresión de la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T, y la recuperación de la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T de la célula hospedadora (o del medio de cultivo de la célula hospedadora).

5

Los componentes de la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T están genéticamente fusionados entre sI. La molécula biespecifica de unión a antígeno activadora de linfocitos T se puede diseñar de manera que sus compooentes se fusionen directamente entre sí o indirectamente a través de una secuencia conectora. La composición y la longitud del conector se pueden determinar de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica y se puede someter a ensayo su eficacia. En las secuencias proporcionadas en el presente documento se encuentran ejemplos de secuencias conectoras entre los diferentes componentes de las moléculas biespecificas de unión a antigeno activadoras de linfocitos T. Si se desea, también se pueden incluir secuencias adicionales para incorporar un sitio de escisión para separar los componentes individuales de la fusión, por ejemplo, una secuencia de reconocimiento de endopeptidasa.

15 En ciertos modos de realización, el uno o más restos de unión a antrgeno de las moléculas biespeclficas de unión a antrgeno activadoras de linfocitos T comprenden al menos una región variable de anticuerpo capaz de unirse a un determinante antigénico. Las regiones variables pueden formar parte de y derivarse de anticuerpos naturales y no naturales y fragmentos de los mismos. Los procedimientos para producir anticuerpos policlonales y anticuerpos monoclonales son bien cOllOcidos en la técnica (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, «Antibodies, a laboratorymanual», Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Los anticuerpos no naturales se pueden construir usando slntesis de péptidos en fase sólida, se pueden producir de manera recombinante (por ejemplo, como se describe en la patente de EE. UU.

n.o 4.186.567) o se pueden obtener, por ejemplo, seleccionando bibliotecas combinatorias que comprendan cadenas pesadas variables y cadenas ligeras variables (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.o 5.969.1 08 de McCafferty).

25 En las moléculas biespeclficas de unión a antlgeno activadoras de linfocitos T divulgadas en el presente documento se puede usar cualquier especie animal de anticuerpo, fragmento de anticuerpo, dominio de unión a antígeno o regiÓfl variable. Los anticuerpos llO limitantes, fragmentos de anticuerpos, dominios de unión a antlgeno o regiones variables útiles en el presente documento pueden ser de origen mu rino, primate o humano. Si la molécula biespeclfica de unión a antígeno activadora de linfocitos T está destinada al uso en seres humanos, se puede usar una forma quimérica de anticuerpo en la que las regiones constantes del anticuerpo proceden de un ser humano. También se puede preparar una forma humanizada o totalmente humana del anticuerpo de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.o 5.565.332 de Winter). la humanización se puede lograr mediante diversos procedimientos que incluyen, pero no se limitan a (a) injertar las COR no humanas (por ejemplo,

35 anticuerpo donante) en las regiones estructurales y constantes humanas (por ejemplo, anticuerpo receptor) con o sin retención de residuos estructurales críticos (por ejemplo, los que son importantes para conservar una buena afinidad de unión al antigenoo funciones de anticuerpos), (b) injertar únicamente las regiones determinantes de la especificidad (SOR o a·COR, los residuos criticos para la interacción anticuerpo·antigeno) no humanas en las regiones estructurales y constantes humanas, o (c) trasplantar los dominios variables llO humanos completos, pero «enmascarartos» con una sección de tipo humano mediante el reemplazo de los residuos superficiales. Los anticuerpos humanizados y los procedimientos para prepararlos se revisan, por ejemplo, en Almagro y Fransson, Front Biosci 13, 1619·1633 (2008), Y se describen adicionalmente, por ejemplo. en Riechmann et al., Nature 332, 323·329 (1988); Oueen et al.. Proc Natl Acad Sci USA 86,10029·10033 (1989); las patentes de EE. UU. n.o 5.821.337, 7.527.791, 6.982.321 Y 7.087.409; Jones et al., Nature 321,522-525 (1986); Morrison etal., Proc Natl Acad Sci 81,6851 -6855 (1984); Morrison y Oi, Adv

45 Immunol 44, 65-92 (1988); Vertloeyen et al., Scienee 239, 1534·1536 (1988); Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994); Kashmiri et al., Methods 36, 25·34 (2005) (que describe el injerto de SOR (a·COR)); Padlan, Mollmmunol28, 489--498 (1991) (que describe el «rebamizado»); Oall'Acqua et al., Methods 36, 43·60 (2005) (que describe la «mezclado de FR»); y Osboum et al., Methods 36, 61·68 (2005) Y Klimka etal., Br J Caneer 83, 252·260 (2000) (que describen la estrategia de «selecciÓfl guiada» para el mezclado de FR). Los anticuerpos humanos y las regiones variables humanas se pueden producir usando diversas técnicas conocidas en la técnica. Los anticuerpos humanos se describen, en general, en van Oijk y van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368·74 (2001) Y Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008). Las regiones variables humanas pueden formar parte de y derivarse de anticuerpos monoclonales humanos preparados mediante el procedimiento del hibridoma (véase, por ejemplo, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 51-63 (Mareel Oekker, Inc., Nueva Yori<, 1987». Los

55 anticuerpos humanos y las regiones variables humanas se pueden preparar también administrando un inmunógeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir anticuerpos humanos intactos O anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta a la exposición antigénica (véase, por ejemplo, Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)). Los anticuerpos humanos y las regiones variables humanas también se pueden generar aislando secuencias de la región variable del clon Fv seleccionadas en bibliotecas de presentación de fagos derivadas de seres humanos (véase, por ejemplo, Hoogenboom et al. en Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001 ) Y McCafferty et al., Nature 348, 552·554; Clackson et al., Nature 352, 624..s28 (1991 ». Los fagos tlpicamente presentan fragmentos de anticuerpo, como fragmentos Fv de cadena única (scFv) o como fragmentos Fab.

65 En ciertos modos de realizaciÓfl, los restos de unión a antígeno útiles en el presente documento se genomanipulan para que tengan una afinidad de unión mejorada de acuerdo con, por ejemplo, los procedimientos divulgados en la

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publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.o 2004f0132066 . La capacidad de la molécula biespecífica de uniÓfl a antígeno activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento para unirse a un determinante antigénico específico se puede medir mediante un ensayo de inmunoadsorción enzimática (EUSA) u otras técnicas familiares para un experto en la técnica, por ejemplo, técnica de resonancia de plasmón superficial (analizada en un sistema 5 BIACORE T10Q) (Liljeblad, el al., Glyco J 17, 323-329 (2000)) Y ensayos de unión tradicionales (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002». Los ensayos de competencia se pueden usar para identificar un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, dominio de unión a anUgellO o dominio variable que compite con un anticuerpo de referencia PO( la unión a un antígeno particular, por ejemplo, un anticuerpo que compite con el anticuerpo V9 por la unión a CD3. En ciertos modos de realización, dicho anticuerpo competidor se une al mismo epítopo (por ejemplo, un epítopo lineal o conformacional) al que está unido el anticuerpo de referencia. Ejemplos de procedimientos detallados para la cartografía de un epítopo al que se une un anticuerpo se proporcionan en Morris (1996) «Epitope Mapping Protocols», en Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ). En un ejemplo de ensayo de competencia, el antígeno inmovilizado (por ejemplo, CD3) se incuba en una solución que comprende un primer anticuerpo marcado que se une al antigellO (por ejemplo, anticuerpo V9) y un segundo anticuerpo no marcado cuya capacidad de competir

15 con el primer anticuerpo por la unión al antigeno se esta sometiendo a prueba. El segundo anticuerpo puede estar presente en un sobrenadante de hibridoma. Como control, el antigeno inmovilizado se incuba en una solución que comprende el primer anticuerpo marcado, pero no el segundo anticuerpo no marcado. Después de la incubación en condiciones permisivas para la unión del primer anticuerpo al antigeno, se retira el exceso de anticuerpo no unido y se mide la cantidad de marcador asociado al antígeno inmovilizado. Si la cantidad de marcador asociado al antigeno inmovilizado se reduce sustancialmente en la muestra de prueba con respecto a la muestra de control, indica que el segundo anticuerpo está compitiendo con el primer anticuerpo pOf la unión al anllgeno. Véase Harlow y lane (1988) Antibodies: A l aboratory Manual, cap.14 (Cold Spring Harbar l aboratory, Cold Spring Harbor, NY).

las moléculas biespeclficas de unión a anllgeno activadoras de linfocitos T preparadas como se describe en el

25 presente documento se pueden purificar mediante técnicas conocidas en la técnica, tales como cromatografía de I1quidos de alto rendimiento, cromatografía de intercambio iónico, eleclroforesis en gel, cromatografia de afinidad, cromatografía de exclusión por tamaño y similares. Las condiciones reales usadas para purificar una proteina particular dependerán, en parte, de factores tales como la carga neta, la hidrofobicidad, la hidrofilicidad, etc., y serán evidentes para los expertos en la técnica. Para la purificaCión por cromatografía de afinidad se puede usar un anticuerpo, ligando, receptor o antígeno al que se una la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T. Por ejemplo, para la purificación por cromatografía de afinidad de moléculas biespecíficas de unión a antígeno aclivadoras de linfocitos T divulgadas en el presente documento se puede usar una matriz oon proteina A o proteina G. l a cromatografía de afinidad de proteina A o G secuencial y la cromatografía de exclusión por tamaño se pueden usar para aislar una molécula biespecífica de unión a antígeno aclivadora de linfocitos T esencialmente como se describe

35 en los Ejemplos. l a pureza de la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T se puede determinar por cualquiera de una variedad de procedimientos analíticos bien conocidos que incluyen electroforesis en gel, cromatografia de liquidos de alta presión y similares. Por ejemplo, las proteinas de fusión de la cadena pesada expresadas como se describe en los Ejemplos se muestran intactas y se ensamblan apropiadamente, como se demuestra reduciendo la SDS-PAGE (véase, por ejemplo, la Figura 2). Las tres bandas se resolvieron a aproximadamente Mr 25000, Mr 50000 Y Mr 75 000, que correspooden a las masas moleculares predichas de la proteina de cadena ligera, la cadena pesada y de fusión de cadena pesada/ligera de la molécula biespecifica de unión a antígeno activadora de linfocitos T.

Ensayo s

45 Las moléculas biespecíficas de unión a antígeno aclivadoras de linfocitos T proporcionados en el presente documento se pueden identificar, cribar o caracterizar por sus propiedades fisicas/qulmicas yfo sus actividades biotógicas pOf diversos ensayos conocidos en la técnica.

Ensayos de afinidad

La afinidad de la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T por un receptor Fc o un antigeno diana se puede determinar de acuerdo con los procedimientos expuestos en los Ejemplos mediante resonancia de plasmón superficial (SPR), usando instrumentación estándar tal como un instrumento BIAcore (GE Healthcare) y

55 receptores o proteínas diana tales como los que se pueden obtener por expresión reoombinante. De forma alternativa, la unión de las moléculas biespecificas de unión a anllgeno aclivadoras de linfocitos T para diferentes receptores o antígenos diana se puede evaluar usando líneas celulares que expresan el receptor o antígellO diana particular, por ejemplo, mediante citometría de flujo (FACS). Un modo de realización ilustrativo y ejemplar específico para medir la afinidad de unión se describe a continuación y en los Ejemplos siguientes.

De acuerdo con un modo de realización, Ko se mide mediante resonancia de plasmón superficial usando un equipo BIACORE® T100 (GE Healthcare) a 25 oC.

Para analizar la interacción entre el segmento Fc y los receptores Fc, el receptor Fc reoombinante marcado con His lo

65 capturaun anticuerpo anti-Penta His (Qiagen) inmovilizado sobre dlips CM5 y las construcciones biespecíficas se usan como analitos. En resumen, los dlips biodeteclores de dextrano carbaximetilado (CM5, BIACORE, Inc.) se activan

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con dorhidralo de N-elil-N'-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El anticuerpo anti-Penta-His se diluye con acetato de sodio 10 mM, pH 5,0, a 40 fJg{ml antes de la inyecciÓfl a una caudal de 5 !JI/min para conseguir aproximadamente 6500 unidades de respuesta (UR) de proteina acoplada. Después de la inyección del antígeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos que no han reaccionado. Posteriormente, el receptor Fe se captura durante 60 s a 4 o 10 nM. Para realizar mediciones cinéticas, diluciones cuádruples en serie de la construcción biespecífica (intervalo entre 500 nM y 4000 nM) se inyectan en HBS-EP (GE Healthcare, HEPES 10 mM, NaCI 150 mM, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,05 %, pH 7,4) a 25 oC a un caudal de 30 IJVmin durante 120 s.

Para determinar la afinidad por el anUgeno diana, las construcciones biespeclficas se capturan por un anticuerpo especifico anti·Fab humano (GE Healthcare) que está inmovilizado sobre una superficie activada de chips detectores CM5, como se describe para el anticuerpo anti-Penta-His. la cantidad final de protelna acoplada es es de aproximadamente 12000 UR. Las construcciones biespecíficas se capturan durante 90 s a 300 nM. Los antígenos diana se pasan a través de las cubetas de lectura durante 180 s en un intervalo de concentración de 250 a 1000 nM con un caudal de 30 IJVmin. La disociación se monitoriza durante 180 s.

Las diferencias en el índice de refracción masivo se corrigen restando la respuesta obtenida en la cubeta de lectura de referencia. La respuesta en estado estacionario se usó para derivar la constante de disociación Ko mediante ajuste de curva no lineal de la isoterma de unión de Langmuir. Las tasas de asociación (kas) y tasas de disociación (kdis) se calculan usando un modelo simple individualizado de unión de Langmuir (programa informático de evaluación BIACORE® T100, versión 1.1.1) mediante el ajuste simultáneo de los sensogramas de asociación y de disociación. La constante de disociación en equilibrio (Ka) se calcula como la proporción kdi,Jkas. Véase, por ejemplo, Chen et al., J Mol 6i0l293, 865-881 (1999).

Ensayos de actividad

La actividad biológica de las moléculas biespecíficas de unión a antígeno activadoras de linfocitos T divulgadas en el presente documento se puede medir mediante diversos ensayos, como se describe en los Ejemplos. Las actividades biológicas pueden incluir, por ejemplo, la inducción de proliferación de linfocitos T, la inducción de señalización en linfocitos T, la inducción de expresión de marcadores de activación en linfocitos T, la inducción de secreción de citocinas por linfocitos T, la inducción de lisis de células diana tales como células tumorales, y la inducción de regresión del tumor y/o de mejora de la supervivencia.

Composiciones, formulaciones y vias de administración

En un aspecto adicional, en el presente documento se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de las moléculas biespeclficas de unión a antlgeno activadoras de linfocitos T proporcionadas en el presente documento, por ejemplo, para su uso en cualquiera de los procedimientos terapéuticos siguientes. En un modo de realización, una composición farmacéutica comprende cualquiera de las moléculas biespecíficas de unión a antígeno activadoras de linfocitos T proporcionadas el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En un modo de realización, una composición farmacéutica comprende cualquiera de las moléculas biespecíficas de unión a antígeno activadoras de linfocitos T proporcionadas el presente documento y al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación.

Se proporciona además un procedimiento para producir una molécula biespecifica de unión a antlgeno activadora de linfocitos T como se divulga en el presente documento en una forma adecuada para la administración in vivo, comprendiendo el procedimiento (a) obtener una molécula biespecifica de unión a anUgeno activadora de linfocitos T como se divulga en el presente documento, y (b) formular la molécula biespecifica de unión a antígeno activadora de linfocitos T con al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable, por lo que se formula una preparación de una molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T para administración in vivo.

Las composiciones farmacéuticas divulgadas en el presente documento comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de una o más moléculas biespecíficas de unión a antígeno activadoras de linfocitos T disueltas o dispersadas en un vehiculo farmacéuticamente aceptable. Las frases «farmacéutica o farmacológicamente aceptable» se refieren a entidades moleculares y composiciones que, en general, no son tóxicas para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas, es decir, no producen reacciooes adversas, alérgicas u otras reacciooes perjudiciales cuando se administran a un animal, tal como, por ejemplo, un ser humano, según corresponda. La preparación de una composición farmacéutica que contiene al menos una molécula biespecífica de uniÓfl a antígeno activadora de linfocitos T y, opcionalmente, un ingrediente activo adicional será conocida por los expertos en la técnica a la luz de la presente divulgación, como lo ejemplifica Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.-ed. Mack Printing Company, 1990. Además, para la administración en animales (por ejemplo, seres humanos), se entenderá que las preparaciones deben cumplir los estándares de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza según lo requerido por la Oficina de Normas Biológicas de la FDA o las autoridades correspondientes de otros paises. las composiciones preferentes son formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Como se usa en el presente documento, «vehículo farmacéuticamente aceptable» incluye cualquiera y todos los disolventes, tampones, medios de dispersión, recubrimientos, tensioactivos, antioxidantes, conservantes (por ejemplo, agentes antibacterianos, agentes

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anlifúngioos), agentes isotónicos, agentes retardadores de la absorciÓfl, sales, cOflservantes, antioxidantes, proteínas, fármacos, estabilizadores de fármacos, polímeros, geles, aglutinantes. excipientes, agentes de desintegración, lubricantes, edulcorantes, aromatizanles, colorantes, tales como materiales y combinaciones de los mismos, como conocerá un experto en la técnica (véase, para ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.8 ed. Mack Printing Company, 1990, págs. 1289-1329). Excepto en la medida en que cualquier vehículo convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas o farmacéuticas.

La composición puede comprender diferentes tipos de vehículos dependiendo de si se va a administrar en forma sólida, líquida o en aerosol, y si debe ser estéril para dichas vías de administración tales como la inyección. Las moléculas biespecíficas de unión a antígeno activadoras de linfocitos T divulgadas en el presente documento (y cualquier agente terapéutico adiciooal) se pueden administrar de forma intravenosa, intradérmica, intraarterial, intraperitoneal, intralesional, intracraneal, intraarticular, intraprostática, intraesplénica, intramuscular, intrapleural, intratraqueal, intranasal, intravitreal, intravaginal, intrarrectal, intratumoral, intramuscular, intraperitooeal, subcutánea, subconjuntival, intravesicular, mucosal, intrapericárdica, intraumbilical, intraocular, oral, tópica, local, por inhalación (por ejemplo, inhalación de aerosol), inyección, infusión, infusión cootinua, perfusión localizada bañando directamente las células diana, a través de un catéter, a través de un lavado, en cremas, en composiciones lipídicas (por ejemplo, liposomas), o mediante otro procedimiento o cualquier combinación de los anteriores, como sabrá un experto en la técnica (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. 8 ed. Mack Printing Company). La administración parenteral, en particular la inyección intravenosa, se usa lo más comúnmente posible para administrar moléculas polipeptídicas tales como las moléculas biespecíficas de unión a antígeno activadoras de linfocitos T divulgadas en el presente documento.

Las composiciones parenterales induyen las diseñadas para la administración por inyección, por ejemplo, inyección subcutanea, intradérmica, intralesional, intravenosa, inlIaarterial, intramuscular, intratecal o intraperitoneal. Para inyección, las moléculas biespecíficas de unión a antígeno activadoras de linfocitos T divulgadas en el presente documento se pueden formular en soluciones acuosas, preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como solución de Hanks, solución de Ringer o tampón salino fisiológico. La solución puede contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabiliz.antes yfo dispersantes. De forma alternativa, las moléculas biespecíficas de unión a antígeno activadoras de linfocitos T pueden estar en forma de polvo para su reconstitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril apirógena, antes de su uso. Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando las moléculas biespecíficas de unión a antígeno activadoras de linfocitos T divulgadas en el presente documento en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con varios de los otros ingredientes enumerados a continuación, según se requiera. l a esterilidad se puede conseguir fácilmente, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles. En general, las dispersiones se preparan incorporando los diversos principios activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y/o los otros ingredientes. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones, suspensiones o emulsiooes inyectables estériles, los procedimientos preferidos de preparación son técnicas de secado a vacío o liofilización que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado de un medio liquido filtrado previamente de forma estéril del mismo. El medio líquido se debe tamponar adecuadamente en caso necesario, y el diluyente líquido se vuelve primero isotónico antes de la inyección con suficiente solución salina o glucosa. l a composición debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento, y se debe conservar frente a la acción contaminante de microorganismos. tales como bacterias y hongos. Se apreciará que la contaminación con endotoxinas se debe minimiz.ar a un nivel seguro, por ejemplo, menos de 0,5 ng/mg de proteína. los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a: tampooes tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como doruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, doruro de bencetonio; fenol, alcohol butilico o bencilico; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol; resOl'"cinol; ciclohexanol; 3·pentanol y m.cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina: monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa

: o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contra iones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn·proteina) yfo tensioactivos no iónicos tales como polietilenglicol (PEG). Las suspensiones acuosas para inyección pueden contener compuestos que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales comocarboximetilcelulosa de sodio, sorbitol, dextrano

: o similares. Opcionalmente, la suspenSión también puede contenerestabilizantes o agentes adecuados que aumenten la solubilidad de los compuestos para permitir la preparaCión de soluciooes altamente concentradas. Adicionalmente, las suspensiones de los compuestos activos se pueden preparar como suspensiones oleosas para inyección apropiadas. los disolventes o vehículos lipófilos adecuados induyen aceites grasos, tales como aceite de sésamo, o ésteres de acidos grasos sintéticos, tales como oleatos de etilo o triglicéridos, o liposomas.

Los ingredientes activos se pueden atrapar en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación

o pOI'" polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanoparticulas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences (18.-ed. Mack Printing Company, 1990). Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación

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sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el polipéptido, en las que dichas matrices se encuentran en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. En modos de realización particulares, la absorción prolongada de una composición inyectable se puede conseguir mediante el uso en las composiciones de agentes que retrasan la absorción, tales como, por ejemplo, monoestearato de aluminio,

S gelatina o combinaciones de los mismos.

Además de las composiciones descritas anteriormente, las moléculas biespeclficas de unión a anUgeno activadoras de linfocitos T también se pueden formular como una preparación de medicamentos de liberación retardada. Dichas formulaciones de acción prolongada se pueden administrar mediante implantación (por ejemplo, por vía subcutánea o intramuscular) o mediante inyección intramuscular. As1, por ejemplo, tas moléculas biespecificas de unión a antigeno activadoras de tinfocitos T se pueden formular con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados poco solubles, por ejemplo, como una sal poco soluble.

15 Las composiciones farmacéuticas que comprenden las moléculas biespecificas de unión a antígeno activado ras de linfocitos T divulgadas en el presente documento se pueden fabricar mediante procedimientos convencionales de mezclado, disolución, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización. Las composiciones farmacéuticas se pueden formular de manera convencional usando uno o más vehiculos, diluyentes, excipientes o auxiliares fisiológicamente aceptables que faciliten el procesamiento de las proteínas en preparaciones que se pueden usar farmacéuticamente. La formulación adecuada depende de la vía de administración elegida.

Las moléculas biespecíficas de uniÓfl a antígeno activadoras de linfocitos T se pueden formular en una composición en forma de ácido o base libre, neutra o sal. Las sales farmacéuticamente aceptables son sales que conselVan sustancialmente la actividad biológica del ácido o base libre. Estas incluyen las sales de adición de ácido, por ejemplo,

25 las formadas con los grupos amino libres de una composición proteinácea, o que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácido dortlidrico o fosfórico, o con ácidos orgánicos tales como ácido acético, oxálico, tartárico o mandélico. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también se pueden derivar de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o hierro; o bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina o procaína. Las sales farmacéuticas tienden a ser más solubles en disolventes acuosos y otros disolventes próticos que las formas de base libre correspondientes.

Procedimientos y composiciones terapéuticas

Cualquiera de las moléculas biespecíficas de unión a antígeno activadoras de linfocitos T proporcionadas en el

35 presente documento se puede usar en proced imientos terapéuticos. Las moléculas biespecíficas de unión a antigeno activadoras de linfocitos T como se divulgan en el presente documento se pueden usar como agentes inmunoterápicos, por ejemplo, en el tratamiento de cánceres.

Para su uso en procedimientos terapéuticos, las moléculas biespecíficas de uniÓfl a antígeno activadoras de linfocitos T divulgadas en el presente documento se formularlan, dosificarían y administrarían de una manera coherente con una buena práctica médica. Los faclores que se deben considerar en este contexto incluyen el trastorno particular que se vaya a tratar. el mamífero particular que se vaya a tratar. la afección clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el procedimiento de administración, la programación de la administración y otros faclores conocidos por los médicos.

45 En un aspecto se proporcionan moléculas biespecíficas de unión a antígeno activadoras de linfocitos T como se divulgan en el presente documento para su uso como medicamento. En aspectos adicionales se proporcionan moléculas biespecíficas de unión a antigeno aclivadoras de linfocitos T como se divulgan en el presente documento para su uso en el tratamiento de una enfermedad. En ciertos modos de realización se proporcionan moléculas biespecificas de unión a antigeno aclivadoras de linfocitos T como se divulgan en el presente documento para su uso en un procedimiento de tratamiento. En un modo de realización se proporciona una molécula biespecifica de unión a antígeno activadora de linfocitos T como se divulga en el presente documento para su uso en el tratamiento de una enfermedad en un individuo que lo necesite. En ciertos modos de realización se proporciona una molécula biespecífica de unión a antígeno aclivadora de linfocitos T para su uso en un procedimiento para tratar a un individuo que tiene

55 una enfermedad que comprende la administración al individuode una cantidad terapéuticamente eficaz de la molécula biespecifica de uniórl a antígeno aclivadora de linfocitos T. En ciertos modos de realización, la enfermedad a tratar es un trastorno proliferativo. En un modo de realización particular, la enfermedad es cáncer. En ciertos modos de realizaciÓfl, el procedimiento comprende además la administración al individuo de una cantidad terapéuticamente eficaz de al mellOS un agente terapéutico adicional, por ejemplo, un agente antineoplásico si la enfermedad que se va a tratar es cáncer. En modos de realización adicionales se proporciona una molécula biespecifica de unión a antigeno activadora de linfocitos T tal como se divulga en el presente documento para su uso en la inducción de la lisis de una célula diana, particularmente una célula tumoral. En ciertos modos de realización se proporciona una molécula biespecifica de unión a antígeno aclivadora de linfocitos T para su uso en un procedimiento para inducir la lisis de una célula diana, particularmente una célula tumoral, en un individuo que comprende la administración al individuo de una

65 cantidad eficaz de la molécula biespecífica de un ión a antígeno activadora de linfocitos T para inducir la lisis de una célula diana. Un «individuo» de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores es, preferentemente,

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un ser humano.

En un aspecto adicional, en el presente documento se proporciona el uso de una molécula biespecifica de unión a anUgeno activadora de linfocitos T como se divulga en el presente documento en la fabricación o preparación de un medicamento. En un modo de realización, el medicamento está destinado al tratamiento de una enfermedad en un individuo que lo necesite. En un modo de realización adicional, el medicamento está destinado al uso en un procedimiento para tratar una enfermedad, que comprende la administración a un individuo que tiene la enfermedad de una cantidad eficaz del medicamento. En ciertos modos de realización, la enfermedad a tratar es un trastorno proliferativo. En un modo de realizaciÓfl particular, la enfermedad es cáncer. En un modo de realización, el procedimiento comprende además la administración al individuo de una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, un agente antineoplásico si la enfermedad que se va a tratar es cáncer. En un modo de realizaciórl adiciooal, el medicamento está destinado a la inducción de la lisis de una célula diana, particularmente una célula tumoral. En otro modo de realización más, el medicamento está destinado al uso en un procedimiento para inducir la lisis de una célula diana, particularmente una célula tumoral, en un individuo que comprende la administración al individuo de una cantidad eficaz del medicamento para inducir la lisis de una célula diana. Un «individuo» de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores puede ser, preferentemente, un ser humano.

En un aspecto adicional, en el presente documento se proporciona un procedimiento para tratar una enfermedad. En un modo de realización, el procedimiento comprende la administración a un individuo que tiene dicha enfermedad de una cantidad terapéuticamente eficaz de una molécula biespec[fica de uniórl a antlgeno activadora de linfocitos T como se divulga en el presente documento. En un modo de realización se administra una composición a dicho individuo, que comprende la molécula biespec¡fica de unión a antlgeno activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento en una forma farmacéutica mente aceptable. En ciertos modos de realización, la enfermedad a tratar es un trastorno proliferativo. En un modo de realización particular, la enfermedad es cáncer. En ciertos modos de realización, el procedimiento comprende además la administración al individuo de una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, un agente antineoplásico si la enfermedad que se va a tratar es cáncer. Un «individuQ») de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores puede ser, preferentemente, un ser humano.

En un aspecto adicional, en el presente documento se proporciona un procedimiento para inducir la lisis de una célula diana, particularmente una célula tumoral. En un modo de realización, el procedimiento comprende pooer en contacto una célula diana con una molécula biespecifica de unión a antlgeno activadora de linfocitos T como se divulga en el presente documento en presencia de un linfocito T, particularmente un linfocito T citotóxico. En un aspecto adicional se proporciona un procedimiento para inducir la lisis de una célula diana, particularmente una célula tumoral, en un individuo. En uno de dichos modos de realización, el procedimiento comprende la administración al individuo de una cantidad eficaz de una molécula biespecifica de unión a anUgeno activadora de linfocitos T para inducir la lisis de una célula diana. En un modo de realización, un «individuo» es un ser humano.

En ciertos modos de realización, la enfermedad a tratar es un trastOfno proliferativo, particularmente cáncer. Ejemplos no limitantes de cánceres incluyen cáncer de vejiga, cáncer cerebral, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de páncreas, cáncer broncopulmonar, cáncer de mama, cáncer de ovario. cáncer uterino. cáncercervicouterino. cáncer endometrial, cáncer esofágico, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer de recto, cáncer gástrico, cáncer de próstata, neoplasia hemática, cáncer de piel, carcinoma escamocelular, cáncer de huesos y cáncer de riñón. Otros trastornos de proliferación celular que se pueden tratar usando una molécula biespecifica de unión a antigeno activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento incluyen, pero no están limitados a, neoplasias localizadas en abdomen, hueso, mama, sistema digestivo, higado, páncreas, peritoneo, glándulas endocrinas (suprarrenales, paratiroides, pituitaria, testiculos, ovario, timo, tiroides), ojo, cabeza y cuello, sistema nervioso (central y periférico), sistema linfático, pelvis, piel, tejido blando, bazo, región torácica y sistema urogenital. También se incluyen afecciones

o lesiones precancerosas y metástasis de cáncer. En ciertos modos de realización, el cáncer se elige entre el grupo que consiste en cáncer de células renales, cáncer de piel, cáncer broncopulmooar, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer cerebral, cáncer de cabeza y cuello. Un experto en la técnica reconoce fácilmente que, en mudlos casos, la molécula biespecifica de unión a antigeno activadora de linfocitos T puede no proporcionar una cura, sino que solo puede propOfcionar un beneficio parcial. En algunos modos de realización, un cambio fisiológico que tiene algún beneficio también se considera terapéuticamente beneficioso. Por lo tanto, en algunos modos de realización, una cantidad de molécula biespecifica de unión a antigeno activadora de linfocitos T que proporciona un cambio fisiológico se considera una «cantidad eficaz» o una «cantidad terapéuticamente eficaz». El sujeto, paciente o individuo que necesita tratamiento es tipicamente un mamifero, más especificamente un ser humano.

En algunos modos de realización se administra una cantidad eficaz de una molécula biespecífica de unión a antigeno activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento a una célula. En otros modos de realización se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de una molécula biespecifica de unión a antrgeno activadOfa de linfocitos T divulgada en el presente documento a un individuo para el tratamiento de la enfermedad.

Para la prevención o el tratamiento de enfermedades, la dosificación apropiada de una molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento (cuando se usa sola o en combinación con

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uno o más agentes terapéuticos adicionales) dependerá del lipo de enfermedad que se vaya a tratar, de la vía de administración, del peso corporal del paciente, del tipo de molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos l, de la gravedad y el curso de la enfermedad, de si la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T se administra con fines preventivos o terapéuticos, de intervenciones terapéuticas previas o simultáneas, de la anamnesis del paciente y de la respuesta a la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T, y del criterio del médico especialista. El médico responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la concentración de ingrediente o ingredientes activos en una composición y la dosis apropiada para el sujeto individual. En el presente documento se contemplan varios programas de dosificación incluyendo, pero no limitados a, administraciones individuales o múltiples en varios puntos temporales, administración en bolo e infusión pulsada.

La molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T se administra adecuadamente al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y de la gravedad de la enfermedad, una dosis inicial candidata para la administración al paciente puede ser de aproximadamente 1 IJg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, de 0,1 mg/kg a 10 mgfkg) de molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T, ya sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas, o mediante infusión continua. Una dosis diaria Upica podria variar de aproximadamente 1 IJgfkg a 100 mgJkg o más, dependiendo de los factores mencionados anterionnente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento se mantendría, en general, hasta que se produjera una supresión deseada de los síntomas de la enfennedad. Una dosis de ejemplo de la molécula biespecífica de uniÓfl a antígeno activadora de linfocitos T estaría en el intervalo de aproximadamente 0,005 mgfkg a aproximadamente 10 mg/kg. En otros ejemplos no limitantes, una dosis también puede comprender desde aproximadamente 1 microgramof1<g de peso corporal, aproximadamente 5 microgramoslkg de peso corporal, aproximadamente 10 microgramos/kg de peso corpora l, aproximadamente 50 microgramoslkg de peso corporal , aproximadamente 100 microgramos/kg peso corporal, aproximadamente 200 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 350 microgramoslkg de peso corporal, aproximadamente 500 microgramoslkg de peso corporal, aproximadamente 1 miligramof1<g de peso corporal, aproximadamente 5 miligramoslkg de peso corporal, aproximadamente 10 miligramoslkg de peso corporal, aproximadamente 50 miligramoslkg de peso corporal, aproximadamente 100 miligramos/kg de peso corporal, aproximadamente 200 miligramos/kg de peso corporal, aproximadamente 350 miligramos/kg de peso corporal, aproximadamente 500 miligramos/kg de peso corporal, hasta aproximadamente 1000 mg/kg de peso corporal o más por administración, y cualquier intervalo derivable de los mismos. En ejemplos no limitantes de un intervalo derivable de las cifras enumeradas en el presente documento, se puede administrar un intervalo de aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 100 mgll<g de peso corporal, de aproximadamente 5 microgramoslkg de peso corporal a aproximadamente 500 miligramos!kg de peso corporal, etc., basándose en las cifras descritas anteriormente. Por lo tanto, se pueden administrar al paciente una o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 5,0 mg/kg o 10 mgfkg (o cualquier combinación de las mismas). Dichas dosis se pueden administrar intermitentemente, por ejemplo, cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de tal manera que el paciente reciba de aproximadamente dos a aproximadamente veinte o, por ejemplo, aproximadamente seis dosis de la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T). Se puede administrar una dosis inicial de carga más alta, seguida de una o más dosis más bajas. Sin embargo, pueden ser útiles otras pautas posológicas. La evolución de este tratamiento se monitoriza fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales.

Las moléculas biespecíficas de unión a antígeno activadoras de linfocitos T divulgadas en el presente documento se usarán, en general, en una cantidad eficaz para lograr el propósito pretendido. Para su uso para tratar o prevenir una enfermedad, las moléculas biespecíficas de unión a antlgeno activadoras de linfocitos T divulgadas en el presente documento, o sus composiciones farmacéuticas, se administran o aplican en una cantidad terapéutica mente eficaz. La determinaciÓfl de una cantidad terapéuticamente eficaz está dentro de las capacidades de los expertos en la técnica , especialmente a la luz de la divulgación detallada proporcionada en el presente documento.

Para la administración sistémica, una dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente a partir de ensayos in vitro, tales como ensayos de cultivo celular. Una dosis se puede formular entonces en modelos animales para conseguir un intervalo de concentración circulante que incluye la Clso como se determina en un cultivo celular. Dicha información se puede usar para determinar con mayor precisión las dosis útiles en seres humanos.

Las dosificaciones iniciales también se pueden estimar a partir de datos in vivo, por ejemplo, modelos animales, usando técnicas que son bien conocidas en la técnica. Un experto en la técnica podría optimizar fácilmente la administración a seres humanos basándose en datos de animales.

La cantidad de dosificaciÓfl y el intervalo se pueden ajustar individualmente para proporcionar niveles en plasma de las moléculas biespecíficas de unión a antígeno aclivadoras de linfocitos T que sean suficientes para mantener el efecto terapéutico. Las dosificaciones habituales de pacientes para administración por inyección varian de aproximadamente 0,1 a 50 mg/kgfdía, típicamente de aproximadamente 0,5 a 1 mglkgfdía. Se pueden lograr niveles plasmáticos terapéuticamente eficaces administrando múltiples dosis cada día. Los niveles en plasma se pueden medir, por ejemplo, mediante HPLC.

En casos de administración local o captación selectiva, la concentraciÓfllocal eficaz de las moléculas biespecíficas de unión a antígeno activadoras de linfocitos T puede no estar relacionada con la cOflcentración en plasma. Alguien con

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experiencia en la técnica podrá optimizar las dosificaciones locales terapéuticamente eficaces sin excesiva experimentación.

Una dosis terapéutica mente eficaz de las moléculas biespecificas de unión a antígeno activadoras de linfocitos T

5 descritas en el presente documento proporcionará, en general, un beneficio terapéutico sin causar una toxicidad sustancial. La toxicidad y la eficacia terapéutica de una molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T se puede determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándares en cultivo celular o animales experimentales. Los ensayos de cultivo celular y los estudios en animales se pueden utilizar para determinar la DL50 (la dosis letal para el 50 % de una población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50 % de una población). La proporción de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el indice terapéutico, que se puede expresar como la proporCión DLsoIDEso Son preferentes las moléculas biespecificas de unión a antigeno activadoras de linfocitos T que exhiben indices terapéuticos grandes. En un modo de realización, la molécula biespecifica de unión a antigeno activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento exhibe un alto índice terapéutico. Los datos obtenidos a partir de ensayos de cultivo celular y estudios en animales se pueden usar para formular un intervalo de dosis

15 adecuado para su uso en seres humanos. La dosificación se encuentra preferentemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DEso coo escasa o nula toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de una variedad de factores, por ejemplo, la forma de dosificación empleada, la vía de administración utilizada, la afección del sujeto y similares. La fonnulación exacta, la via de administración y la dosificación las puede elegir el médico individual a la vista de la afección del paciente (véase, por ejemplo, Fingl et al., 1975, en: The Pharmacological Basis of Therapeutics, cap. 1, pág. 1).

El méd ico especialista de los pacientes tratados con moléculas biespecíficas de uniÓfl a antígeno activadoras de linfocitos T divulgadas en el presente documento saMa cómo y cuándo terminar, interrumpir o ajustar la administración debido a toxicidad, disfunción orgánica y similares. Por el contra rio, el médico especialista también saMa ajustar el

25 tratamiento a niveles más altos si la respuesta cHnica no fuera adecuada (excluyendo la toxicidad). La magnitud de una dosis administrada en el tratamiento del trastorno de interés variará en función de la gravedad de la afección que se va a tratar, de la vía de administración, y similares. La gravedad de la afección, por ejemplo, se puede evaluar, en parte, mediante proced imientos de evaluación de pronóstico estándar. Además, la dosis y quizás la frecuencia de la dosis también variarán en función de la edad, el peso corporal y la respuesta del paciente individual.

Otros agentes y tratamientos

Las moléculas biespec1ficas de unión a antígeno activadoras de linfocitos T divulgadas en el presente documento se pueden administrar en combinación con uno o más agentes diferentes en el tratamiento. Por ejemplo, una molécula 35 biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento se puede coadministrar con al menos un agente terapéutico adicional. El término «agente terapéutico» abarca cualquier agente administrado para tratar un sintoma o enfermedad en un individuo que necesita dicho tratamiento. Dicho agente terapéutico adicional puede comprender cualquier ingrediente activo adecuado para la indicación particular que se esté tratando, preferentemente los que tienen actividades complementarias que no se ven afectadas de manera adversa entre sí. En ciertos modos de realización, un agente terapéutico adicional es un agente inmunomodulador, un agente citostático, un inhibidor de la adhesión celular, un agente citotóxico, un activador de la apoptosis celular o un agente que aumenta la sensibilidad de las células a los inductores apoptóticos. En un modo de realización particular. el agente terapéutico adicional es un agente antineoplásico, por ejemplo, un perturbador de microtúbulos, un antimetabolito, un inhibidor de topoisomerasa, un intercalador de ADN. un agente alquilante, un tratamiento hormonal, un inhibidor de cinasas, un

45 antagonista de receptores, un activador de la apoptosis de células tumorales, o un agente antiangiogénico.

Dichos otros agentes están presentes adecuadamente en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito pretendido. la cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad de molécula biespecifica de un ión a antígeno activadora de linfocitos T utilizada, del tipo de trastorno o tratamiento y de otros factores analizados anteriormente. Las moléculas biespecificas de unión a antigeno aclivadoras de linfocitos T se usan, en general, en las mismas dosis y por las vias de administración que se describen en el presente documento, o de aproximadamente un 1 a un 99 % de las dosis descritas en el presente documento, o en cualquier dosis y por cualquier vía que se determine empíricamentefclínicamente como apropiada.

55 Dichos tratamientos combinados indicados anteriormente abarcan la administración combinada (en la que dos o más agentes terapéuticos se incluyen en la misma composición o en composiciooes separadas) y la administración separada, en cuyo caso, la administración de la molécula biespecifica de unión a antígeno activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento se puede producir antes de, simultáneamente y/o después de la administración del agente y/o adyuvante terapéutico adicional. l as moléculas biespeclficas de unión a antrgeno activadoras de linfocitos T divulgadas en el presente documento también se pueden usar en combinación con radioterapia.

Artículos de fabricación

En otro aspecto de la invención se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el

65 tratamiento, la prevención y/o el diagnóstico de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricaciÓfl comprende un recipiente y una etiqueta o prospecto en o asociado al recipiente. Los recipientes adecuados incluyen,

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por ejemplo, frascos, viales, jeringas, bolsas de solución j.v., elc. Los recipientes se pueden formar a partir de diversos materiales lales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composiciÓfl que es, por sí misma o en combinación oon otra composición, eficaz para tratar, prevenir y/o diagnosticar la afección y que puede tener una vía de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo de la composición es una molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T romo se divulga en el presente documento. La etiqueta o prospecto indica que la composición se usa para tratar la afección de elecciórl. Por otra parte, el articulo de fabricación puede comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende una molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T como se divulga en el presente documento; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un agente citotóxico o de otro modo terapéutico adicional. El articulo de fabricación en este modo de realización puede comprender además un prospecto que indique que las composiciones se pueden usar para tratar una afección particular. De forma alternativa, o adicional, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir adicionalmente otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones. diluyentes, filtros, agujas y jeringas.

Ejemplos

Los siguientes son ejemplos de procedimientos y composiciones divutgados en el presente documento. Se entiende que se pueden poner en práctica otros modos de realización diversos, dada la descripción general proporcionada anteriormente.

Procedimientos generales

Técnicas de ADN recombinante

Se usaron procedimientos estándar para manipular ADN como se describe en Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989. Los reactivos biológicos moleculares se usaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La información general sobre las secuencias de nucleótidos de las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulinas humanas se proporciona en: Kabat, EA et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological lnterest, 5.' ed., publicación NIH n.o 91-3242.

Secuenciación de ANO

Las secuencias de ADN se determinaron por secuenciación de doble cadena.

Síntesis de genes

Los segmentos génicos deseados, cuando se requirieron, se generaron por PCR utilizando plantillas apropiadas o se sintetizaron por Geneart AG (Regensburg. Alemania) a partir de oligonucleótidos sintéticos y productos de PCR mediante sintesis genética automatizada. En los casos en que no estaba disponible una secuencia génica exacta, se diseñaron cebadores de oligonucleótidos basados en las secuencias de los homólogos mas cercanos y los genes se aislaron mediante RT-PCR a partir del ARN que se originaba en el tejido apropiado. Los segmentos génicos flanqueados por sitios de escisión de endonucleasa de restricción singular se clonaron en vectores de clonaciónlsecuenciación estándar. El AON plasmidico se purificó a partir de bacterias transformadas yla concentración se determinó mediante espectroscopia UV. La secuencia de ADN de los fragmentos de genes subclonados se confirmó por secuenciación de ADN. Los segmentos génicos se diseñaron con sitios de restricción adecuados para permitir la subclonación en los respectivos vectores de expresión. Todas las construcciones se diseñaron con una secuencia de AON en el extremo 5' que codifica un péptido !ider dirige las proteinas para la secreciórl en células eucariotas. Las SEO ID NO: 154-162 proporcionan ejemplos de péptidos Ilder y de secuencias de polinucleótidos que los codifican, respectivamente.

Aislamiento de linfocitos pan T humanos primarios a partir de PBMC

Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se prepararon mediante centrifugación por densidad Histopaque a partir de preparaciones de linfocitos enriquecidas (capas leucociticas) obtenidas de bancos de sangre locales o de sangre fresca de donantes humanos sanos. En resumen, la sangre se diluyó con PBS estéril y se superpuso cuidadosamente sobre un gradiente Histopaque (Sigma, H8B89). Después de la centrifugación durante 30 minutos a 450 x 9 a temperatura ambiente (freno desconectado), se descartó la parte del plasma situada por encima de la interfase que contenia PBMC. Las PBMC se transfirieron a nuevos tubos Falcon de 50 mi y los tubos se rellenaron con PBS hasta un volumen total de 50 mI. La mezcla se centrifugó a temperatura ambiente durante 10 minutos a 400 x 9 (freno activado). El sobrenadante se descartó y el sedimento de PBMC se lavó dos veces con PBS estéril (etapas de centrifugaciórl a 4 oC durante 10 minutos a 350 x g). La población de PBMC resultante se contó automáticamente (ViCell) y se almacenó en un medio RPMI1640 que contenía FCS al10 % y L-alanil-L-glutamina al

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1 % (Biodlrom, K0302) a 37 QC, 5 % de C02 en la incubadora hasta el inicio del ensayo.

El enriquecimiento de linfocitos T a partir de PBMC se realizó usando el kit de aislamiento de linfocitos pan T 11 (Miltenyi Biotee n.o 130.Q91.156), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, los sedimentos celulares se

5 diluyeron en 40 1-11de lampón frío por cada 10 millones de células (PBS con BSA al 0,5 %, EDTA 2 mM, filtrado de forma estéril) y se incubaron con 10 1-11de cóctel de bialina-anticuerpo por cada 10 millones de células durante 10 min a 4 oC. Se añadieron 30 !JI de lampón frio y 20 !JI de perlas magnéticas anti-biolina por cada 10 millones de células, y la mezcla se incubó durante otros 15 minutos a 4 oC. las células se lavaron añadiendo 10-20 veces el volumen de ese momento y una etapa de centrifugación posterior a 300 x g durante 10 min. Se resuspendieron hasta 100 millones de células en 500 ¡JI de tampón. La separación magnética de los linfocitos pan T humanos no marcados se realizó usando columnas lS (Miltenyi Biotec n.o 130-042-401) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La población de linfocitos T resultante se contó automáticamente (ViCell) y se almacenó en medio AIM-V a 37 oC, 5 % de C02 en la incubadora hasta el inicio del ensayo (no más de 24 h).

15 Aislamiento de linfocitos T ¡ndiferenciados humanos primarios a partir de PBMC

Las células mononucieares de sangre periférica (PBMC) se prepararon mediante centrifugación por densidad Histopaque a partir de preparaciones de linfocitos enriquecidas (capas leucocíticas) obtenidas de bancos de sangre locales o de sangre fresca de donantes humanos sanos. El enriquecimiento de linfocitos T a partir de PBMC se realizó utilizando el kit de aislamiento de linfocitos T C08+ indiferenciados de Miltenyi Biotec (n.o 130-093-244) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, pero omitiendo la última etapa de aislamiento de linfocitos T C08+ (véase también la descripciÓfl para el aislamiento de linfocitos pan T humanos primarios).

Aislamiento de linfocitos pan T murinos a partir de esplenocitos

25 Se aislaron los bazos de ratones C57BU6, se transfirieron a un tubo C GentleMACS (Miltenyi Biotech n.o 130-093237) que contenía tampón MACS (PBS + BSA al 0,5 % + EOTA 2 mM) y se disociaron con el Disociador GentleMACS para obtener suspensiones de células individuales de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La suspensión celular se pasó a través de un filtro de separación previa para eliminar las partículas de tejido no disociadas restantes. Después de la centrifugación a 400 x g durante 4 min a 4 oC, se añadió tampón de lisis ACK para lisar los glóbulos rojos (incubación durante 5 min a temperatura ambiente). Las células restantes se lavaron con tampÓfl MACS dos veces, se contaron y se usaron para el aislamiento de linfocitos pan T murinos. l a selección negativa (magnética) se realizó usando el kit de aislamiento de linfocitos pan T de Miltenyi Biotec (n.o 130-090-861), siguiendo las instrucciones del fabricante. La población de linfocitos T resultante se contó automáticamente (ViCell) y se usó inmediatamente para

35 ensayos adicionales.

Aislamiento de PBMC primarias de macaco a partir de sangre heparinizada

Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se prepararon por centrifugación por densidad a partir de sangre fresca de macacos donantes sanos, de la siguiente manera: La sangre heparinizada se diluyó 1:3 con PBS estéril, y el medio Lymphoprep (Axon lab n.o 1114545) se diluyó al 90 % con PBS estéril. Dos volúmenes de la sangre diluida se colocaron en capas sobre un volumen del gradiente de densidad diluido y la fracción de PBMC se separó por centrifugación durante 30 min a 520 x g, sin freno, a temperatura ambiente. La banda de PBMC se transfirió a un tubo Falcon de 50 mi nuevo y se lavó con PBS estéril mediante centrifugación durante 10 min a 400 x g a 4 oC. Se

45 realizó una centrifugación a baja velocidad para eliminar las plaquetas (15 min a 150 x g, 4 oC), y la población de PBMC resultante se contó automáticamente (ViCell) y se usó inmediatamente para ensayos adicionales.

Células diana

Para la evaluación de moléculas biespecrficas de unión a antlgeno dirigidas a MCSP se usaron las siguientes lineas celulares tumorales: la linea celular de melanoma humano WM266-4 (ATCC n.o CRL-1676), derivada de un sitio metastásico de un melanoma maligno y que expresaba altos niveles de MCSP humano; y la linea celular de melanoma humano MV-3 (un amable obsequio de The Radboud University Nijmegen Medical Center), que expresaba niveles medios de MCSP humano.

55 Para la evaluación de moléculas biespecíficas de unión a antígeno dirigidas a CEA se usaron las siguientes lineas celulares tumorales: la línea celular de cáncer gástrico humano MKN45 (DSMZ n.oACC 409), que expresaba niveles muy altos de CEA humano; la línea celular de adenocarcinoma de colon en mujer humana caucásica LS-174T (ECACC

n.o 87060401), que expresaba niveles medios a bajos de CEA humano; la I1nea celular de carcinoma pancreático epitelioide humano Panc-1 (ATCC n.o CRL-1469), que expresaba niveles (muy) bajos de CEA humano; y una linea celular de carcinoma de colon murino MC38-huCEA, que se diseñó internamente para expresar de manera estable el CEA humano.

Además, se usó una línea celular de leucemia de linfocitos T humanos, Jur1o;at (ATCC n.o TIB-152), para evaluar la 65 unión de diferentes construcciones biespecificas a C03 humano sobre las células.

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Ejemplo 1

Preparación, purificación y caracterización de moléculas biespecificas de unión a antigeno

Las secuencias de la región variable de cadena pesada y ligera se subclonaron en la estructura con la cadena pesada constante o la cadena ligera constante preinsertada en el vector de expresión de mamífero receptor respectivo. La expresión del anticuerpo estaba dirigida por un promotor MPSV y una secuencia señal poliA sintética localizada en el extremo 3' de COSo Además, cada vector contenía una secuencia de OriP EBV.

Las moléculas se produjeron cotransfectando células HEK293 EBNA con los vectores de expresiórl de mamiferos. Se transfectaron células HEK293 EBNA de crecimiento exponencial usando el procedimiento del fosfato de calcio. Alternativamente, las células HEK293 EBNA que crecian en suspensión se transfectaron usando polietilenimina (PEI). Para la preparación de las construcciones «1 +1 scFab IgG, con un brazo/un brazo invertido», las células se transfectaron con los vectores de expresión correspondientes en una proporción 1:1:1 (<<cadena pesada de vector»: «cadena ligera de vector»: «cadena pesada de vector-scFab»). Para la preparación de las construcciones «2+1 IgG scFab», las células se transfectaron con los vectores de expresión correspondientes en una proporción 1 :2:1 (<<cadena pesada de vector»: «cadena ligera de vector»: «cadena pesada de vector-scFa b»). Para la preparación de las construcciones «1+1 IgG Crossfab», las células se transfectaroo con los vectores de expresión correspondientes en una proporción 1:1:1:1 (<<primera cadena pesada de vector»: «primera cadena ligera de vector»: «cadena ligera de vector Crossfab»: «primera cadena pesada de vector-cadena pesada Crossfab»). Para la preparación de las construcciones «2+1 IgG Crossfab», las células se transfectaron con los vectores de expresión correspondientes en una proporción 1:2:1:1 (<<primera cadena pesada de vector»: «cadena ligera de veclor»: «primera cadena pesada de vector-cadena pesada de Crossfab)): «cadena ligera de vector Crossfab»). Para la preparación de la construcción «2+1 IgG Crossfab, cadena ligera conectada», las células se transfectaron con los vectores de expresión correspondientes en una proporción 1 :1:1:1 (<<cadena pesada de vector»: «cadena ligera de vector»: «cadena pesada de vector (CrossFab-Fab-Fc)>> : «cadena ligera unida de vector»). Para la preparación de la construcción «1+1 CrossMab», las células se transfeclaron con los vectores de expresión correspondienles en una proporción 1:1:1:1 (<<primera cadena pesada de vector»: «segunda cadena pesada de vector»: «primera cadena ligera de vector»: «segunda cadena ligera de vector»). Para la preparación de la construcción «1 +1 IgG Crossfab, fusión de cadena ligera», las células se transfectaron con los vectores de expresión correspondientes en una proporción 1:1:1:1 «((primera cadena pesada de vector»: «segunda cadena pesada de vector»: «cadena ligera de vector Crossfab»: «segunda cadena ligera de vector»).

Para la Iransfección usando fosfato de calcio, las células se cultivaron como cultivos monocapa adherentes en matraces en T usando medio de cultivo DMEM enriquecido con FCS al10 % (v/v), y se transfectaron cuando tenian confluencia enlre un 50 y un 80 %. Para la transfección de un malraz T150 se sembraron 15 millones de células 24 horas antes de la transfección en 25 mi de medio de cultivo DMEM enriquecido con FCS (al 10 % v/v final), y las células se colocaron a 37 oC en una incubadora con una de atmósfera de un 5 % de COz durante la noche. Para cada malraz T150 que se iba a transfectar se preparó una solución de ADN, CaCI2 yagua mezclando 94 g de ADN de vector plasmidico total divididos en la proporción correspondiente, agua a un volumen final de 469 !JI Y 469 !JI de una solución 1 M de CaCb. A esta solución se añadieron 938 ¡JI de una solución HEPES 50 mM, NaCI 280 mM, NazHP04 1,5 mM a pH 7.05. se mezcló inmediatamente durante 10 s y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 20 s. La suspensión se diluyó con 10 mi de DMEM enriquecido con FCS al2 % (vlv) y se añadió al T150 en lugar del medio existente. Posteriormente, se añadieron 13 mi adicionales de medio de transfecciÓn. Las células se incubaron a 37 oC, 5 % de COz durante aproximadamente 17 a 20 horas y, a continuación, se sustituyó el medio por 25 mi de DMEM, FCS al 10 %. El medio de cultivo acondicionado se extrajo aproximadamente 7 días después del intercambio de medios por centrifugación durante 15 min a 210 x g, se filtró de forma estéril (filtro de 0,22¡Jm), se enriqueció con azida de sodio a una concentración final de 0,01 % (p/v) y se mantuvo a 4 oC.

Para la transfección usando polielilenimina (PEI), las células HEK293 EBNA se cultivaron en suspensión en medio de cultivo CD CHO libre de suero. Para la producción en matraces de agitación de 500 mi, se sembraron 400 millones de células HEK293 EBNA 24 horas antes de la transfección. Para la transfecciÓfl, las células se centrifugaron durante 5 min a 210 x g y el sobrenadante se reemplazó por 20 mi de medio CD CHO precalentado. Los vectores de expresión se mezdaron en 20 mi de medio CD CHO hasta una cantidad final de 200 ¡Jg de ADN. Después de la adición de 540 1.11 de PEI , la mezcla se sometió a agitación vorticral durante 15 s y posteriormente se incubó durante 10 min a temperatura ambiente. Posteriormente, las células se mezclaron con la solución de AON/PEI, se transfirieron a un matraz de agitación de 500 mi y se incubaron durante 3 horas a 37 oC en una incubadora con una atmósfera de un 5 % de C02. Después del tiempo de incubación, se añadieron 160 mi de medio F17 y las células se cultivaron durante 24 horas. Un dia después de la transfección, se añadió ácido valproico 1 mM y Feed 1 al 7 %(Lonza). Después de un cultivo de 7 dias, se recogió el sobrenadante para la purificación por centrifugación durante 15 min a 210 x g, la solución se filtró de forma estéril (filtro de 0,22 IJm), se enriqueció coo azjda de sodio a una ooncentraci6n final de 0,01 % plv Y se mantuvo a 4 oC. Las proteinas secretadas se purificaron a partir de los sobrenadantes de cultivo celular mediante cromatografia de afinidad con proteina A, segu ido de una etapa de cromatografia de exclusión por tamaño.

Para la cromatografía de afinidad, el sobrenadante se cargó en una columna HiTrap ProteinA HP (CV = 5 mi, GE Healthcare) equilibrada con 25 mi de fosfato de sodio 20 mM, citrato de sodio 20 mM, pH 7,5 o oon 40 mi de fosfato

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de sodio 20 mM, citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M, pH 7,5. La proteína no unida se eliminó mediante lavado con al menos diez volúmenes de columna de fosfato de sodio 20 mM, citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M a pH 7,5, seguido de una etapa de lavado adicional usando seis volúmenes de columna de fosfato de sodio 10 mM, citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M a pH 5,45. Posteriormente, la columna se lavó con 20 mi de 5 MES 10 mM, cloruro de sodio 100 mM, pH 5,0, Y la proteína diana se eluyó en seis volúmenes de columna de citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 100 mM, glicina 100 mM, pH 3,0. De forma alternativa, la proteína diana se eluy6 usando un gradiente sobre 20 volúmenes de columna desde citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M, pH 7,5 hasta citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M, pH 2,5. La solución de proteína se neutralizó añadiendo 1/10 de fosfato de sodio 0,5 M, pH 8. La proteína diana se concentró y se filtró antes de carga rta en una columna HiLoad

10 Superdex 200 (GE Healthcare) equilibrada con una solución de fosfato de potasio 25 mM, cloruro de sodio 125 mM, glicina 100 mM a pH 6,7. Para la purificación de 1+11gG Crossfab, la columna se equilibró con una solución de histidina 20 mM, cloruro de sodio 140 mM a pH 6,0.

La concentración de proteína de las muestras de proteína purificada se detenninó midiendo la densidad óptica (00) a

15 280 nm, utilizando el coeficiente de extinción molar calculado basándose en la secuencia de aminoácidos. La pureza y la masa molecular de las construcciones biespecificas se analizaron mediante SOS·PAGE en presencia y ausencia de un agente reductor (1 ,4·ditiotreitol 5 mM) y tinciÓfl con Coomassie (SimpleBlue'"" SafeStain de Invitrogen) usando el sistema de gel Pre·Cast NuPAGE® (Invitrogen, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (geles de Tris·acetato al 4·12 % o Bis· Tris al 4·12 %). De fonna alternativa, la pureza y la masa molecular de las moléculas se

20 analizaron mediante análisis CE-SOS en presencia y ausencia de un agente reductor, utilizando el sistema Caliper LabChip GXII (Caliper Lifescience) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El contenido de agregado de las muestras de proteínas se analizó usando una columna de cromatografia analítica de exclusión por tamaño Superdex 200 101300GL (GE Healthcare) en tampón de desarrollo MOPS 2 mM, NaCI 150 mM, NaN3 al 0,02 % (pfv), pH 7,3 a 25 oC. Oe fonna alternativa, contenido de agregado de las muestras de anticuerpo se analizó usando una columna

25 analitica de exclusión por tamaño TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) en tampón de desarrollo K2HP04 25 mM, NaCI 125 mM, monoclorflidrato de l -arginina 200 mM, NaN3 al 0,02 % (pfv), pH 6,7 a 25 oC.

l as Figuras 2·14 muestran los resultados de la SOS PAGE Y de la cromatografía analítica de exclusión por tamano y la Tabla 2A muestra los rendimientos, el contenido de agregado después de la proteína A y el contenido de monómero

30 final de las preparaciones de las diferentes construcciones biespecíficas.

la Figura 47 muestra el resultado de los análisis CE-SOS de la construcción anti·C03lanti-MCSP biespecífica «2+1

IgG Crossfab, cadena ligera conectada» (véase SEO ID NO: 3, 5, 29 Y 179). Se usaron 2 IJg de muestra para los

análisis. la Figura 48 muestra el resultado de la cromatografía analítica de exclusión por tamaño del producto fi nal

35 (inyección de 20 IJg de muestra).

la Figura 54 muestra los resultados de los análisis de CE-SOS y SOS PAGE de diversas construcciones, y la Tabla

2A muestra los rendimientos, el contenido de agregado después de la proteína A y el contenido de mOllÓmero final de

las preparaciones de las diferentes construcciones biespecíficas.

40 TABLA 2A Rendimientos, contenido de agregado después de la proteína A y contenido final de monÓmero.

Construcción: Rendimie nto [mgll] Contenido de agregado después de la IDroteína A-r%l- Alto PM [%] Bajo PM [%] Monómero [%]

MCSP

2+1 IgG Crossfab; intercambio VHNL (LC007N9) SEa ID NO: 3 5 29 33): 12,8 2,2 O O 100

2+1 IgG Crossfab; intercambio VHN L (LC007/FN 18) SEa ID NO: 3, S, 35, 37): 3,2 5,7 0,4 O 99,6

2+1 IgG scFab, P329G LAtA SEa ID NO: 5 21 23l: 11,9 23 0,3 O 99,7

2+1 IgG scFab, LALA SEa ID NO: 5 17 19l: 9 23 O O 100

2+11gG scFab, P329G LAtA N2970 SEO ID NO: 5, 25, 27): 12,9 32,7 O O 100

2+1 IgG scFab, wt SEO ID NO: 5, 13, 15): 15,5 31 ,8 O O 100

1 +11gG scFab SEa ID NO: 5 21 213): 7 24,S O O 100

1 +11gG scFab «un5~razo» SEa ID NO: 1, 3, 5: 7,6 43,7 2,3 O 97,7

1+11gG scFab «un brazo invertido» SEa ID NO: 7, 9,11): 1 27 7, 1 9,1 83,8

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1+11gG Crossfab; inter~~bio VHNL (LCOO7N9) 9,8 SEO ID NO: 5 29 31 33 2+1 IgG Crossfab , cadena ligera conectada; intercambio 0,54 VUVH (LCOO7N9) SEO ID NO: 3 5 29 179l 1 +11gG Crossfab; intercambio VLNH (LCOO7N9) 6,61 SEO ID NO: 5, 29, 33, 181) 1+1 CrossMab; intercambio CUCH1 (LCOON9) SEO ID NO: S, 23, 183, 185) 6,91 2+1 19G Crossfab, invertido; intercambio CUCH1 9,45 (LCOO7N9) SEO ID NO: 5, 23, 183, 187) 2+1 IgG Crossfab; intercambio VUVH (M4-3 ML2N9) 36,6 SEO ID NO: 33,189,191,193) 2+11gG Crossfab: intercambio CUCH1 (M4-3 ML2N9) 2,62 SEO ID NO: 183, 189, 193, 195} 2+1 1gG Crossfab; intercambio CUCH1 (M4-3 ML2/H2C) SEO ID NO: 189 193 199 201l29,75 2+1 19G Crossfab; intercambio CUCH1 (l COQ7/anti1,2 CD3) SEO ID NO: 5, 23, 215, 217) 2+1 '9G Crossfab, invertido; intercambio CUCH1 7,82 (LC007/anti-CD3) SEO ID NO: 5, 23, 215, 219) EGFR 2+1 IgG scFab 5,2 SEO ID NO: 45 47 53) 1+1 IgG scFab 3,4 SEO ID NO: 47, 53, 213) 1+1 IgG scFab «un brazo» (SEO ID NO: 43, 45, 47) 9,05 1+1 IgG scFab «un brazo invertido» (SEO ID NO: 11,49, 3,87 51) FAP 2+11gG scFab 12,57 SEO ID NO: 57 59 61) 1+1 1gG scFab 17,95 SEO ID NO: 57, 61, 213) 1+11gG scFab «un brazo invertido» (SEO ID NO: 11,51 , 2,44 55) CEA 2+1 IgG Crossfab, invertido; intercambio VLNH 0,34 (CH1A1A1V9) SEO ID NO: 33 63 65 67) 2+1 IgG Crossfab, invertido; intercambio CUCH1 12,7 CH1A1 AlV9) (SEO ID NO: 65 67 183 197) 2+1 IgG Crossfab, invertido: intercambio CUCH1 7,1 431126N9l (SEO ID NO: 183, 203, 205, 207) 1 +11gG-Crossfab, fusión de cadena ligera (CH1A1A1V9) 7,85 SEO ID NO: 183, 209, 211, 213): O 40 8,5 10,5 6,1 O 12 O O 0,5 53 66 ,6 60,8 58,8 53 41 69 13 43 20 27 O 1,4 O 1,3 0,8 9,5 2,8 O 1,25 O O O O O O 0,4 0,6 4,4 O O 4,3 O O O 1,7 O 35,3 O O 1,65 O 30 1,6 O O O O O O O O 3,2 100 98,6 100 97 99,2 55,2 97,2 100 97,1 100 70 98,4 100 100 100 99,6 99,4 95,6 100 100 92,5

Como controles se generaron moléculas biespecíficas de unión a antígeno en el formato scFv en tándem de la técnica anterior (<«scFv)z») y fusionando un scFv en tándem a un dominio Fc (<«scFv)z-Fc»). Las moléculas se produjeron en células HEK293-EBNA y se purificaron mediante cromatografía de afinidad con proteína A, seguida de una etapa de 5 cromatografía de exclusión por tamaño de una manera análoga a la descrita anteriormente. Debido a la alta formación de agregados, algunas de las muestras tuvieron que purificarse adicionalmente aplicando muestras eluidas y concentradas desde la columna HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) a una columna Superdex 101300 GL (GE Healthcare) equilibrada con histidina 20 mM, cloruro de sod io 140 mM , pH 6 ,7 para obtener proteína con alto conten ido de manó mero. Posteriormente, la concentración de proteína, la pureza y la masa molecular, y el contenido de agregado

10 se determinaron como se describe anteriormente.

Los rendimientos, el contenido de agregado después de la primera etapa de purificación y el contenido de monómero final para las moléculas de control se muestran en la Tabla 2B. La comparación del contenido de agregado después de la primera etapa de purificación (Proteína A) indica la mayor estabilidad de las oonstrucciones IgG Crossfab e IgG 15 scFab en oomparación con moléculas «(scFv)z-Fc» y con las moléculas «(dsscFv)z-Fc» estabilizadas por puente

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disulfuro. TABLA 26 Rendimientos, contenido de agregado después de la proteína A y contenido final de monÓmero.

Construcción: ~~~di~ient o mall AgregadO~r~/~sPUéS deIDroteína A % Final

Alto PM %]: Bajo PM[%] Mon6mero 'lo]

(scFv)2-Fc (anti-MCSPfanti-huCD3): 76 ,5 40 0,5 O 99,5

(dsscFv)2-Fc (anli-MCSP/anti-huCD3): 2,65 48 7,3 8,0 84,7

5

La estabilidad térmica de las proteínas se monitorizó mediante dispersión de luz dinámica (DLS). Se aplicaron 30 1-19 de muestra de proteína filtrada con una concentración de proteína de 1 mg/ml por duplicado en un lector de placa Dynapro (Wyatt Technology Corporalion, EE. UU.). La temperatura se aumentó de 25 a 75 QC a 0,05 QC/min, recogiéndose el radio y la intensidad de dispersión total. Los resultados se muestran en la Figura 15 y en la Tabla 2C.

10 Para la molécula «(SCFV)2-Fc» (anti-MCSP/anti-huCD3) se observaron dos puntos de agregación, a 49 oC ya 68 oC. La construcción «(dsscFv)2-Fc» tiene una temperatura de agregación mayor (57 OC) como resultado del puente disulfuro introducido (Figura 15A, Tabla 2C). Ambas construcciones, la «2+1 IgG scFab» y la «2+1 IgG Crossfab» se agregan a temperaturas superiores a 60 oC, lo que demuestra su superior estabilidad térmica en comparación con los formatos «(scFV)2-Fc» y «(dsscFv)2-Fc» (Figura 15B, Tabla 2C).

15

TABLA 2C. Estabilidad térmica determinada por dispersión de luz dinámica.

Construcción: Tag [oC]

2+1 IgG scFab (LC007N9): 68

2+1 IgG Crossfab (LC007N9): 65

Fc-(scFv)2 (LC007N9): 49168

Fc-(dsscFv)2 (LC007N9): 57

Ejemplo 2

20

Análisis por resonancia de plasmón supelficial de la unión al receptor Fc y al antigeno diana

Procedimiento

25 Todos los experimentos de resonancia de plasmón superficial (SPR) se realizaron en un Biacore T100 a 25 oC con HBS-EP como tampón de desarrollo (HEPES 0,01 M, pH 7,4, NaCI 0,15 M, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,005 %, Biacore, FreiburgIAlemania).

Análisis de la unión a FeR de diferentes variantes de Fe 30

La configuración del ensayo se muestra en la Figura 16A. Para analizar la interacción de diferentes variantes de Fc con FcyRllla-V158 humano y FcyRIV murino, se realiza un acoplamiento directo de alrededor de 6500 unidades de resonancia (UR) del anticuerpo anti-Penta His (Qiagen) en un chip CM5 a pH 5,0 usando el kit de acoplamiento de amina estándar (Biacore, Freiburg/Alemania). HuFcyRllla-V15B-K6H6 y muFcyRIV-aviHis-biotina se capturan durante

35 60 s a 4 y 10 nM, respectivamente.

Las construcciones con diferentes mutaciones Fc se pasan a través de las cubetas de lectura durante 120 s a una

concentración de 1000 nM oon un caudal de 30 IJVmin. La disociación se monitoriza durante 220 s. Las diferencias en

ellndice de refracción masivo se corrigen restando la respuesta obtenida en una cubeta de lectura de referencia. En

40 el presente documento, las variantes de Fc se hacen volar sobre una superficie con anticuerpo anti-Penta His inmovilizado, pero en la que se ha inyectado HBS-EP en lugar de HuFcyRllla-V15B-K6H6 o muFcyRIV-aviHis-biotina. La afinidad por FcyRllla-V158 humano y FcyRIV murino se determinó para Fc natural usando un intervalo de concentración de 500-4000 nM.

45 La respuesta en estado estacionario se usó para derivar la constante de disociación Ko mediante ajuste de curva no lineal de la isoterma de unión de Langmuir. Las constantes cinéticas se obtuvieron utilizando el programa informático de evaluación Biacore nao (vAA, Biacore AB, Uppsala/Suecia) para ajustar las ecuaciones de velocidad para la unión de Langmuir 1:1 por integración numérica.

50 Resultados

La interacción de las variantes de Fc con FcyRllla humano y FcyRIV murino se monitorizó mediante resonancia de plasmón superficial. La unión a huFcyRllla-V158-K6H6 y muFcyRIV-aviHis-biotina capturadas se reduce

Ko en nM T=25°C: FcyRllla-V1 58 humano FcyRIV murino

estado cinético: estado estacionario estado cinético estado estacionario

Fc-wt SEO ID NO: 5 13 15l: 600· (1200) 3470 576 1500

Fc-lAlA SEa ID NO, 5 17 19): 2130* n.d. n.d.

Fc-P329G LALA SEa ID NO, 5, 21, 23): n.d. n.d.

Fc-P329G LALA N29;~ SEO ID NO: 5 25 27: n.d. n.d.

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significativamente para todos los mutantes Fe analizados en comparación con la construcción con un dominio Fe natural (wt).

Los mutantes Fe con la unión más baja al receptor Fcy humano fueron P329G l234A l 235A (LALA) Y P329G LALA

5 N297D. La mutación LALA sola no fue suficiente para anular la unión a huFcyRllla-V158-K6H6. La variante Fe que portaba solo la mutación LALA tenía una afinidad de unión residual por FcyRllla humana de 2,100 nM, mientras que el dominio Fe natural se unja al receptor FcyRllla humano con una afinidad de 600 nM (Tabla 3). Ambos valores de Ko se obtuvieron a partir del modelo de unión 1:1, usando una única concentración.

10 La afinidad por FcyRlllaN158 humano y FcyRIV murino solo se pudo analizar para el dominio Fe natural. Los valores de Ko se enumeran en la Tabla 3. la unión al FcyRIV murino se eliminó casi por completo para todos los mutantes Fc analizados.

TABLA 3. Afinidad de variantes de Fc por FcyRlllaN158 humano y FcyRIV murino.

15

imagen1 deterrlllnado usando una concentración (1000 nM)

Análisis de unión simultánea al antígeno tumoral V al CD3

20 Análisis de la unión simultánea de las construcciones biespecíficas aclivadoras de linfocitos T al antígeno tumoral yal CD3 humano se realizó por acoplamiento directo de 1650 unidades de resonancia (UR) del dominio 03 biotinilado de MCSP en un chip detector SA usando el procedimiento de acoplamiento estándar. El EGFR humano se inmovilizó usando un procedimiento de acoplamiento amino estándar. Se inmovilizaron SOOO UR en un chip delector CM5 a pH 5,5. la configuración del ensayo se muestra en la Figura 168.

25

Se capturaron diferentes construcciones biespecificas activadoras de linfocitos T durante 60 s a 200 nM. El CD3y(G4S)sCD3¡;-AcTev-Fc(botón}-AvilFc(ojal) humano se pasó posteriormente a una concentración de 2000 nM y un caudal de 40 ¡JVmin durante 60 s. Las diferencias en el indice de refracción masivo se corrigieron restando la respuesta obten ida en una cubeta de lectura de referencia en la que el CD3 recombinante se hizo volar sobre una

30 superficie con dominio 03 inmovilizado de MCSP o EGFR sin las construcciones biespecíficas activadoras de linfocitos T capturadas.

Resultados

35 La unión simultánea al antígeno tumoral y al CD3 humano se analizó mediante resonancia de plasmón superficial (Figura 17, Figura 18). Todas las construcciones fueron capaces de unirse al antigeno tumoral y al C03 simultáneamente. Para la mayoria de las construcciones, el nivel de unión (UR) después de la inyección de CD3 humano fue mayor que el nivel de unión logrado después de la inyección de la construcción sola, lo que refleja que tanto el antígeno tumoral como el C03 humano estaban unidos a la construcción.

40

Ejemplo 3

Unión de construcciones biespecíficas al antígeno diana respectivo en las células

45 La unión de las diferentes construcciones biespecificas al CD3 en células Jurkat (ATCC n.o TIB-152) y al respectivo anUgeno tumoral en células diana se determinó mediante FACS. En resumen, las células se extrajeron, se contaron y se verificó su viabilidad. Se sembraron en placa 0,15-0.2 millones de células por pocillo (en PBS que contenía BSA al 0,1 %, 901-11) en una placa de 96 pocillos de fondo redondo y se incubaron con la concentración indicada de las construcciones biespeclficas y los correspondientes controles de IgG (10 ¡JI) durante 30 min a 4 oC. Para una mejor

50 comparación, todas las construcciones y controles de IgG se normalizaron a la misma molaridad. Después de la incubación, las células se centrifugaron (5 min, 350 x g), se lavaron con 150 ¡JI de PBS que contenia BSA al 0,1 %, se resuspendieron y se incubaron durante 30 min adicionales a 4 oC con 12 I-llIpocillo de un anticuerpo secundario conjugado con FITC o PE. Las construcciones unidas se detectaron usando un FACSCantoll (Software FACS Diva).

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La molécula «(SCFV)2» se detectó utilizando un anticuerpo anti-His conjugado con FITC (Lucerna, n.o RHIS-45F-Z). Para todas las demás moléculas se usó un fragmento F(ab')2 AffiniPure de cabra conjugado con anti-FITC o PE humano, específico para fragmento Fcy (Jackson Immuno Research lab n.o 109-096-098 / solución de trabajo 1:20,

o n.O 109-116-170 I solución de trabajo 1:80, respectivamente). las células se lavaron mediante la adición de 120 ¡JI/pocillo de PBS que contenía BSA al 0,1 % y centrifugación a 350 x 9 durante 5 mino Se realizó una segunda etapa de lavado coo150 ¡JI/pocillo de PBS que contenía BSA al 0,1 %. A menos que se indique lo contrario, las células se fijaron con 100 ¡Jlfpocillode tampón de fijación (BD n.o 554655) durante 15 min a 4 oC en oscuridad, se centrifugaron durante 6 min a 400 x 9 y se guardaron en 200 !JI/pocillo de PBS que contenía BSA al 0,1 % hasta que las muestras se midieron coo FACS Cantal!. Los valores de CE50 se calcularoo usando el programa informático GraphPad Prism. En un primer experimento, se analizaron diferentes coostrucciones biespec[ficas dirigidas a MCSP humano y C03 humano mediante citometría de flujo para determinar la uniórl a C03 humano expresada en linfocitos T de leucemia humana Jurkat, o a MCSP humano en células de melanoma humano Colo-38.

Los resultados se presentan en las Figuras 19·21 y muestran la intensidad media de fluorescencia de las células que se incubaron con la molécula biespecifica, la IgG de control, el anticuerpo secundario solamente o las que no se trataron.

Como se muestra en la Figura 19, para ambos restos de unión a antígeno de la molécula «(SCFV)2», es decir, C03 (Figura 19A) y MCSP (Figura 19B), se observa una señal de unión clara en comparación con las muestras de control.

La molécula «2+1 IgG scFab» (SEO ID NO: 5, 17, 19) muestra una buena unión a huMCSP en células Colo-38 (Figura 20A). El resto C03 se une a C03 ligeramente mejor que la IgG anti·C03 humano de referencia (Figura 20B).

Como se representa en la Figura 21A, las dos construcciones «1+1 » muestran señales de unión comparables a C03 humano en las células. La IgG anti·C03 humano de referencia proporciona una señal ligeramente más débil. Además, ambas construcciones evaluadas (<<1+1 IgG scFab, con un brazo» (SEO ID NO: 1, 3, 5) Y «1+1 IgG scFab, con un brazo invertido» (SEO ID NO: 7, 9, 11» muestran una unión comparable a MCSP humano en las células (Figura 21 B). La señal de unión obtenida con la referencia IgG anti·MCSP humano es ligeramente más débil.

En otro experimento, la construcción biespecífica «2+1 19G scFab» purificada (SEO ID NO: 5, 17, 19) Y la 19G anti· MCSP humano correspondiente se analizaron por citometría de flujo para la unión dependiente de la dosis a MCSP humano en células de melanoma humano CoIo·38, para determinar si la construcción biespecifica se une a MCSP a través de uno o ambos de sus «brazos». Como se representa en la Figura 22, la construcción «2+1 IgG scFab» muestra el mismo patrón de unión que el IgG MCSP.

En otro experimento más se evaluó la unión a C03 humano de las construcciones biespecíficas para C03/CEA «2+1 IgG Crossfab, invertida» con intercambio VLNH (véase SEO ID NO: 33, 63, 65, 67) o CUCH1 (véase SEO ID NO: 66, 67, 183, 197) en el fragmento Crossfab, expresado por células Jurkat, o a CEA humano, expresado por células LS174T. Como control también se evaluaron la concentración máxima equivalente de las IgG correspondientes y la tinción de fondo debida al anticuerpo secundario marcado (fragmento F(ab')2 AffiniPure de cabra conjugado con antiFITC humano, espeCifico para fragmento Fcy, Jackson Immuno Research Lab n.o 109-096-098). Como se ilustra en la Figura 55. ambas construcciones muestran una buena unión al CEA humano, así como al C03 humano en las células. Los valores de CE50 calculados fueroo de 4,6 y 3,9 nM (C03) y de 9,3 y 6,7 nM (CEA) para las construcciones «2+1 IgG Crossfab, invertido (VLNH)>> y «2+1IgG Crossfab, invertido (CUCH1)>>, respectivamente.

En otro experimento se evaluó la unión de las construcciones para C03/MCSP «2+1 IgG Crossfab» (véase SEO ID NO: 3, 5, 29, 33) y «2+1 IgG Crossfab, invertido» (véase SEO ID NO: 5, 23, 183, 187) a C03 humano, expresadas por células Jurkat, o a MCSP humano, expresadas por células WM266-4. La Figura 56 muestra que, aunque la unión de ambas construcciones a MCSP en células era comparablemente buena, la unión de la construcción «invertida») a C03 se redujo en comparación con la otra construcción. Los valores de CE50 calculados fueron de 6,1 Y 1,66 nM (C03) y de 0,57 y 0,95 nM (MCSP) para las construcciooes «2+1 IgG Crossfab, invertido» y «2+1 IgG Crossfab», respectivamente.

En un experimento adicional se determinó la unión de la construcción «1+1 IgG Crossfab, fusión de cadena ligera (LC)>> (SEO ID NO: 183, 209, 211 , 213) a C03 humano, expresada por células Jurkat, ya CEA humano, expresada por células LS· 174T. Como control también se evaluaron la concentración máxima equivalente de las IgG anti-C03 y antj·CEA correspoodientes y la tinción de fondo debida al anticuerpo secundario marcado (fragmento F(ab')2 AffiniPure de cabra conjugado con antj·FITC humano, específico para fragmento Fcy, Jackson Immuno Research Lab n.o 109· 09&098). Como se representa en la Figura 57, la unión de la construcción «1+1 IgG Crossfab, fusión Le» a CEA parece reducirse en gran medida, mientras que la unión a C03 fue al menos comparable a la de la IgG de referencia.

En un experimento final se determinó la unión de las construcciones «2+1 IgG Crossfab» (SEO ID NO: 5, 23, 215, 217) Y la «2+1 IgG Crossfab, invertida» (SEO ID NO: 5, 23, 215, 219) a C03 humano, expresadas por células Jurkat, ya MCSP humano, expresadas por células tumorales WM2664. Como se representa en la Figura 58, la unión a C03 humano se redujo para la construcción «2+1 19G Crossfab, invertida» en comparación con la otra construcción, pero la unión a MCSP humano fue comparablemente buena. Los valores de CE50 calculados fueron de 10,3 y 32,0 nM

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(CD3) y de 3,1 Y 3,4 nM (MCSP) para las construcciones «2+1 IgG Crossfab» y «2+1 IgG Crossfab, invertida», respectivamente.

Ejemplo 4

Análisis FACS de marcadores de activación de superficie en linfocitos T humanos primarios tras el acoplamiento de construcciones biespecíficas

Las moléculas «(SCFV)2» y «2+1 IgG scFab» (SEO ID NO: 5, 17, 19) biespecífica dirigida a huMCSP-huCD3 se analizaron mediante citometria de flujo para determinar su potencial para regular por incremento el marcador de activación de superficie temprana CD69, o el marcador de activación tardía CD25 en linfocitos T CD8~ en presencia de células tumorales que expresan MCSP humano.

En resumen, las células Colo-38 positivas para MCSP se recogieron con tampón de disociación celular, se contaron y se comprobó su viabilidad. Las células se ajustaron a 0,3 x 10G células (viables) por mi en medio AIM-V y se pipetearon 100 1.11 de esta suspensión celular por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo (como se indica). Se añadieron 50 1.11 de la construcción biespecífica (diluida) a los pocillos que contenían células para obtener una concentración final de 1 nM. Se aislaron células efectoras PBMC humanas a partir de sangre fresca de un donante sano y se ajuslaron a 6 x 1Q6 células (viables) por mi en medio AIM-V. Se añadieron 50 1.11 de esta suspensión celular por pocillo de la placa de ensayo (véase más arriba) para obtener una proporción E:T final de 10:1. Para analizar si las construcciones biespecíficas son capaces de activar linfocitos T exclusivamente en presencia de células diana que expresan el antígeno tumoral huMCSP, se incluyeron pocillos que contenían 1 nM de las moléculas biespecíficas respectivas, así como PBMC, pero no células diana. Después de la incubación durante 15 h (CD69) o 24 h (CD25) a 37 oC, 5 % de C02, las células se centrifugaron (5 min, 350 x g) y se lavaron dos veces con 150 IJI/pocillo de PBS que contiene BSA al 0,1 %. La tinción superficial para CDS (lgGl,K de ratón, cloo HITSa, BD n.o 555635), CD69 (lgGl de ratón, clon L7S, BD n.o 340560) y CD25 (lgG1,K de ratón; clan M-A251 ; BD n.o 555434) se realizó a 4 oC durante 30 min de acuerdo con las sugerencias del proveedor. Las células se lavaron dos veces con 150 IJVpocillo de PBS

que contenía BSA al 0, 1 % Y se fijaron durante 15 min a 4 ~C, usando 100 IJI/pocillo de tampÓfl de fijación (BD n.o 554655). Después de la centrifugación, las muestras se resuspendieron en 200 IJI/pocillo de PBS con BSA al 0,1 % Y se analizaron usando un equipo FACS Cantoll (Software FACS Diva).

La Figura 23 representa el nivel de expresión del marcador de activación temprana CD69 (A), o el marcador de activación tardía CD25 (B) en linfocitos T CD8~ después de 15 horas o 24 horas de incubación, respectivamente. Ambas construcciones inducen la regulación por incremento de ambos marcadores de activación exclusivamenle en presencia de células diana. La molécula «(scFv)2» parece ser ligeramente más activa en este ensayo que la construcción «2+1 IgG scFab».

La molécula «(scFv)2» y «2+1 scG scFab» biespecífica dirigida a huMCSP-huCD3 purificada se analizaron adicionalmente mediante citometría de flujo para determinar su potencial para regular por incremento el marcador de activación tardía CD25 en linfocitos T COSo o linfocitos T CD4° en presencia de células tumorales que expresan MCSP humano. Los procedimientos experimentales fueron como se describe anteriormente, usando células efectoras pan T humanas en una proporción E:T de 5:1 y un tiempo de incubación de cinco días.

La Figura 24 muestra que ambas construcciones inducen la regulación por incremento de CD25 exclusivamente en presencia de células diana tanto en linfocitos T CDS~ (A) como CD4° (B). La construcción «2+1 IgG scFab» parece inducir una menor regulación por incremento de CD25 en este ensayo, en comparación con la molécula «(scFv)2». En general, la regulación por incremento de CD25 es más pronunciada en linfocitos T CDS~ que en linfocitos T CD4 o.

En otro experimento se analizó «2+1 IgG Crossfab» purificada dirigida a CD3 de macaco y MCSP humano (SEO ID NO: 3, 5, 35, 37) para determinar su potencial para regular por incremento el marcador de activaciÓfl superficial CD25 en linfocitos T CDS· en presencia de células diana tumorales. En resumen, las células diana tumorales MV-3 que expresan MCSP humano se recogieron cootampón de disociación celular, se lavaroo y resuspendieron en DMEM que contenía FCS al 2 % y GlutaMax al 1 %. Se sembraron 30 000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo y se añadió la correspondiente dilución de anticuerpo a las concentraciones indicadas (Figura 25). La construcción biespecífica y los diferentes controles de 19G se ajustaroo a la misma molaridad. Se añadieron células efectoras PBMC de macaco, aisladas de sangre de dos animales sanos, para obtener una proporción E:T final de 3:1. Después de una incubación durante 43 h a 37 oC, 5 % de C02, las células se centrifugaron a 350 x g durante 5 min y se lavaron dos veces con PBS que contenía BSA al 0,1 %. La tinción superficial para CDS (Miltenyi Biotech n.o 130OS0.601) Y CD25 (BD n.o 557138) se realizó de acuerdo con las sugerencias del proveedor. Las células se lavaron dos veces con 150 IJI/pocillo de PSS que contenia SSA al 0,1 % Y se fijaron durante 15 min a 4 oC, usando 100 IJI/pocillo de tampón de fijación (SO n.o 554655). Después de la centrifugación, las muestras se resuspendieron en 200 IJI/pocillo de PSS con SSA al 0,1 % Yse analizaron usando un equipo FACS Cantoll (Software FACS Diva).

Como se representa en la Figura 25, la construcción biespecífica induce una regulación por incremento dependiente de la ooncentración de CD25 en linfocitos T CDS· solo en presencia de células diana. EllgG anti-CD3 de macaco (clan FN-1S) también puede inducir la regulación por incremento de CD25 en linfocitos T CDS-, sin estar entrelazado (véase

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datos obtenidos con macaco Neslor). No hay hiperaclivaciÓfl de los linfocitos T de macaco con la concentración máxima de la construcción biespecífica (en ausencia de células diana).

En otro experimento se comparó el «2+1 IgG Crossfab, cadena ligera conectada» para CD3·MCSP (véase SEO ID NO: 3, 5, 29, 179) oon el «2+1 IgG Crossfab» para CD3-MCSP (véase SEa ID NO: 3, 5, 29, 33) para determinar su potencial para regular por incremento el marcador de activación temprana CD69 o el marcador de activación tardía CD25 en linfocitos T CD8+ en presencia de células diana tumorales. las PBMC humanas primarias (aisladas como se describe anteriormente) se incubaron con las concentraciones indicadas de construcciones biespecíficas durante al menos 22 h en presencia o ausencia de células diana Co10-38 positivas para MCSP. En resumen, se sembraron 0,3 millones de PBMC humanas primarias por pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo plano, que cOf'ltenia las células diana positivas para MCSP (o medio). l a proporción final entre células efectoras y diana (E:T) fue de 10:1. las células se incubaron con la concentración indicada de las construcciones biespecificas y durante los tiempos de incubación indicados a 37 oC, S % de COz. las células efectoras se tiñeron para CD8 y CD69 o CD25 y se analizaron mediante un equipo FACS Cantal!.

La Figura 53 muestra el resultado de este experimento. No se detectaron diferencias significativas para la regulación por incremento de CD69 (A) o C025 (8) entre las dos moléculas 2+1 IgG Crossfab (con o sin la cadena ligera conectada).

En otro experimento más, las construcciones «2+1 IgG Crossfab» (véase SEO ID NO: 3, 5, 29, 33) Y «1+1 IgG Crossfab» (véase SEO ID NO: 5, 29, 33, 181) para C03IMCSP se compararon con la construcción «1+1 CrossMab» (véase SEO ID NO: 5, 23, 183, 185) para determinar su potencial para regular por incremento C069 o C025 en linfocitos T CD4+ o CD8+ en presencia de células diana tumorales. El ensayo se realizó como se describe anteriormente, en presencia o ausencia de células tumorales MV-3 que expresan MCSP humano, con un tiempo de incubaciórl de 24 h.

Como se muestra en la Figura 59, las construcciones «1+1 IgG Crossfab» y «2+1 19G Cross Fab» indujeron una regulación por incremento más pronunciada de los marcadores de activación que la molécula «1 +1 CrossMab».

En un experimento final, las construcciones «2+1 IgG Crossfab» (véase SEO ID NO: 5, 23, 215, 217) Y «2+1 IgG Crossfab, invertido» (véase SEO ID NO: 5, 23, 215, 219) para CD3/MCSP se evaluaron para determinar su potencial para regular por incremento C025 en linfocitos T C04+ o CD8+ de macacos diferentes en presencia de células diana tumorales. El ensayo se realizó como se describe anteriormente, en presencia de células tumorales MV-3 que expresan MCSP humano, con una proporción E:T de 3:1 y un tiempo de incubación de aproximadamente 41 h.

Como se muestra en la Figura 60, ambas construcciones fueron capaces de regular por incremento C025 en linfocitos T CD4+ y C08+ de una manera dependiente de la concentración, sin diferencia significativa entre los dos formatos. Las muestras de control sin anticuerpo y sin células diana dieron una señal comparable a las muestras con anticuerpo, pero sin dianas (no se muestra).

Ejemplo 5

Secreción de interferón-y tras la activación de linfocitos pan T humanos con construcciones biespecíficas para CD3

Se analizó la construcciórl «2+1 IgG scFab» dirigida a MCSP humano y a C03 humano (SEO ID NO: 5, 17, 19) para determinar su potencial para inducir la activación de tinfocitos T en presencia de células U-87MG positivas para MCSP humano, medida por la liberación de interierón humano (IFN)-y en el sobrenadante. Como controles se usaron IgG anti-MCSP humano y anti-CD3 humano, ajustadas a la misma molaridad. En resumen, las células diana de astrocitoma de glioblastoma U-87MG que expresan huMCSP (ECACC n.o 89081402) se recogieron con tampón de disociación celular, se lavaron y se resuspendieron en medio AIM-V (Invitrogen n.o 12055-091). Se sembraron 20 000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo y se añadió la dilución de anticuerpo respectiva para obtener una concentración final de 1 nM. Se añadieron células efectoras pan T humanas, aisladas de capas leucociticas, para obtener una proporción E:T final de 5:1. Después de una incubación durante la noche de 18,5 h a 37 oC, 5 % de COz, la placa de ensayo se centrifugó durante 5 min a 350 x g y el sobrenadante se transfirió a un placa de 96 pocillos fresca. Los niveles de IFN-y humano en el sobrenadante se midieron mediante ElISA, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (BD OptEIA human IFN-y ELlSA Kit 11 de 8ecton o ickinson, n.o 550612).

Como se representa en la Figura 26, las IgG de referencia muestran una inducciórl nula a débil de la secreción de IFN-y, mientras que la construcción «2+1 IgG scFab» es capaz de activar linfocitos T humanos para secretar IFN-y.

Ejemplo 6

Citotoxicidad de linfocitos T redirigida mediada por construcciones biespecificas entrelazadas dirigidas a C03 en linfocitos T y dirigidas a MCSP o EGFR en células tumorales (ensayo de liberación de LOH)

5

15

25

35

45

55

65

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En una primera serie de experimentos, las construcciones biespecíficas dirigidas a CD3 y MCSP se analizaron para determinar su potencial para inducir apoptosis mediada por linfocitos T en células diana tumorales tras el entrelazamiento de la construcción a través de la unión de los restos de unión a antígeno a sus respectivos antígenos diana en células (Figuras 27-38).

En un experimento se compararon las construcciones «2+1 IgG scFab» (SEO ID NO: 5, 21, 23) Y «2+1 IgG Crossfab» (SEO ID NO: 3, 5, 29, 33) purificadas dirigidas a CD3 humano y a MCSP humano, y la molécula «(scFv)z» correspondiente. En resumen, las células diana de melanoma humano MOA-MB-435 que expresan huMCSP se recogieron con tampón de disociación celular, se lavaron y se resuspendieron en medio AIM-V (Invitrogen n.o 12055091 ). Se sembraron 30 000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo y se añadió la dilución respectiva de la construcción a la concentración indicada. Todas las construcciones y las IgG de control correspondientes se ajustaron a la misma molaridad. Se añadieron células efectoras pan T humanas para obtener una proporción E:T final de 5:1. Como control positivo para la activación de los linfocitos pan T humanos se usó 1 IJglml de PHA-M (Sigma n.o L8902, mezcla de isolectinas aisladas de Phaseolus vulgaris). Para la normalización, la lisis máxima de las células diana (= 100 %) se determinó mediante incubación de las células diana con una concentración final de un 1 % de Triton X-100. la lisis minima (= O%) se refiere a las células diana coincubadas con células efectoras, pero sin ninguna construcción o anticuerpo. Después de una incubación durante la nodle de 20 h a 37 QC, 5 % de C02, la liberación de LDH de células diana apoptóticaslnecróticas en el sobrenadante se midió con el kit de detección de LDH (Rache Applied Science, n.o 11 644793001), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Como se representa en la Figura 27, ambas construcciones «2+1» inducen apoptosis en células diana de manera comparable a la molécula «(scFv):2».

Además, se compararon las construcciones «2+1 IgG Crossfab» (SEO ID NO: 3, 5, 29, 33) e «2+1 IgG scFab» purificadas que difieren en su dominio Fc, asi como la molécula «(SCFV)2». Las diferentes mutaciones en el dominio Fc (l 234A+L235A (LALA), P329G y/o N297D, como se indica) reducen o anulan la función de las células efectoras (NK) inducida por construcciones que contienen un dominio Fc natural (wt). Los procedimientos experimentales fueron como se describe anteriormente.

La Figura 28 muestra que todas las construcciones inducen apoptosis en células diana de manera comparable a la molécula «(SCFV)2».

La Figura 29 muestra el resultado de comparar la construcción «2+1 IgG scFab» purificada (SEO ID NO: 5, 17, 19) Y la molécula «(SCFV)2» para determinar su potencial para inducir apoptosis mediada por linfocitos T en células diana tumorales. Los procedimientos experimentales fueron como se describe anteriormente, utilizando células diana de melanoma humano Co10-38 que expresan huMCSP en una proporción E:T de 5:1, y una incubación durante la noche de 18,5 h. Como se representa en la figura, la construcción «2+1 IgG scFab» muestra actividad citotóxica comparable a la molécula «(scFv):2».

De manera similar, la Figura 30 muestra el resultado de comparar la construcción «2+1 IgG scFab» purificada (SEO ID NO: 5, 17, 19) Y la molécula «(scFv):2» utilizando células diana de melanoma humano Colo-38 que expresan huMCSP en una proporción E:T de 5:1 y un tiempo de incubación de 18 h. Como se representa en la figura. la construcción «2+1 IgG scFab» muestra actividad citotóxica comparable a la molécula «(SCFV)2».

La Figura 31 muestra el resultado de comparar la construcción «2+1 IgG scFab» purificada (SEO ID NO: 5, 17, 19) Y la molécula «(SCFV)2» utilizando células diana de melanoma humano MDA-MB-435 que expresan huMCSP en una proporción E:T de 5:1 y una incubación durante la noche de 23,5 h. Como se representa en la figura, la construcción induce apoptosis en células diana de forma comparable a la molécula «(SCFV)2». la construcción «2+1 IgG scFab» muestra una eficacia reducida a las concentraciones más altas.

Además, se analizaron diferentes construcciones biespecificas que son monovalentes para ambas dianas, CD3 humano y MCSP humano, así como la correspondiente molécula «(SCFV)2» para determinar su potencial para inducir apoptosis mediada por linfocitos T. la Figura 32 muestra los resultados para las construcciones «1+1 IgG scFab, con un brazo» (SEO ID NO: 1, 3, 5) Y «1+1 IgG scFab, con un brazo invertido» (SEO ID NO: 7, 9, 11) usando células diana de metanoma humano Coto-38 que expresan huMCSP en una proporción E:T de 5:1, y un tiempo de incubación de 19 h. Como se muestra en la figura, ambas construcciones «1+1» son menos activas que la molécula «(SCFV)2», con la molécula «1+11gG scFab, un solo brazo» siendo superior a la molécula «1+1IgG scFab, con un brazo invertido» en este ensayo.

La Figura 33 muestra los resultados para la construcción «1+1IgG scFab» (SEO ID NO: 5, 21 , 213) usando células diana de melanoma humano Colo-38 que expresan huMCSP en una proporción E:T de 5:1 y un tiempo de incubación de 20 h. Como se representa en la figura, la construcción «1+1 IgG scFab» es menos citotóxica que la molécula «(scFv}2».

En otro experimento, la construcción «2+1 IgG Crossfab» purificada (SEO ID NO: 3, 5, 29, 33), la construcciÓfl «1 +1 IgG Crossfab» (SEO ID NO: 5, 29, 31 , 33) Y la molécula «(scFv):2» se analizaron para determinar su potencial para

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inducir apoplosis mediada por linfocitos T en células diana tumorales Iras el entrelazamiento de la cOflslrucción a través de la uniÓfl de ambos antígenos diana, CD3 y MCSP en las células. Las células da melanoma humano MOAMB-435 que expresan huMCSP se usaron como células diana, la proporción E:T fue 5:1 y el tiempo de incubación fue de 20 h. Los resultados se muestran en la Figura 34. la construcción «2+1 IgG Crossfab» induce apoptosis en células

5 diana de forma comparable a la molécula «(scFv):2». La oomparación de los formalos mono y bivalente «lgG Crossfab» muestra claramente que el bivalente es mucho más potente.

En otro experimento más se analizó la construcción purificada «2+1 IgG Crossfab» (SEO ID NO: 3, 5, 29, 33) para determinar su potencial para inducir apoptosis mediada por linfocitos T en diferentes células diana (tumorales). En resumen, células diana tumorales Co10-38 positivas para MCSP, células madre mesenquimales (derivadas de médula ósea, Lanza n.o PT-2501 o tejido adiposo, Invitrogen n.o R778&115) o pericitos (de placenta; PromoCell n.o C-12980), como se indica, se recogieron con tampón de disociación celular, se lavaroo y se resuspendieron en medio AIM -V (Invitrogen n.o 12055--091). Se sembraron 30 000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo y se añadió la correspondiente dilución de anticuerpo a las concentraciones indicadas. Se añadieron células efectoras

15 PBMC humanas aisladas de sangre fresca de un donante sano para obtener una proporción E:T final de 25:1. Después de una incubación durante 4 h a 37°C, 5 % de C02, la liberación de LOH de células diana apoptóticas/necróticas en el sobrenadante se midió con el kit de detección de LOH (Roche Applied Science, n.o 11 644 793 001), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Como se representa en la Figura 35, se pudo observar una significativa citotoxicidad mediada por linfocitos T solo con células CoI0-38. Este resultado está en linea con los significativos niveles de expresión de MCSP de las células Colo38, mientras que las células madre mesenquimales y los pericitos expresan MCSP solo muy débilmente.

La construcción pu rificada «2+1 IgG scFab» (SEO ID NO: 5,17,19) Y la molécula «(scFv)2» también se compararon

25 con un anticuerpo 19G anti-MCSP humano modificado por 9lucoingenierla, que tiene una proporción reducida de polisacáridos N fucosilados en su dominio Fc (MCSP GlycoMab). Para este experimento se usaron células diana de melanoma humano CoIo-38 que expresan huMCSP y células efectoras PBMC humanas, ya sea a una proporción E:T fija de 25:1 (Figura 36A), o a diferentes relaciones E:T de 20:1 a 1:10 (Figura 36B). Las diferentes moléculas se usaron a las concentraciones indicadas en la Figura 36A, o a una concentración fija de 1667 pM (Figura 36B). la lectura se realizó después de 21 h de incubación. Como se representa en la Figura 36 A Y B, ambas construcciones biespecíficas muestran una potencia mayor que MSCP GlycoMab.

En otro experimento se analizó la construcción «2+1 IgG Crossfab» dirigidas a C03 de macaco y MCSP humano (SEO ID NO: 3, 5, 35, 37). En resumen, las células diana tumorales MV-3 que expresan MCSP humano se recogieroo con

35 tampón de disociación celular, se lavaron y resuspendieron en OMEM que contenía FCS al 2 % y GlutaMax al 1 %. Se sembraron 30 000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo y se añadió la dilución respectiva de la construcción o de la IgG de referencia a las concentraciones indicadas. La construcción biespecífica y los diferentes controles de IgG se ajustaron a la misma molaridad. Se añadieron células efectoras PBMC de macaco, aisladas de sangre de macacos sanos, para obtener una proporción E:T final de 3:1. Después de la incubación durante 24 horas o 43 horas a 37 oC, 5 % de cen,se midió la liberación de LOH de las células diana apoptóticasfnecróticas en el sobrenadante con el kit de detección de LOH (Roche Applied Science, n.o 11 644793001), de acuerdo con las instrucciooes del fabricante.

Como se representa en la Figura 37, la construcción biespeclfica induce la liberación de LOH dependiente de la

45 concentración de las células diana. El efecto es más fuerte después de 43 h que después de 24 h. La IgG anti-C03 de macaco (clan FN-18) también es capaz de inducir la liberación de LOH de las células diana sin estar entrelazada.

La Figura 38 muestra el resultado de comparar la construcción purificada «2+1 IgG Crossfab» (SEO ID NO: 3, 5, 29, 33) Y la molécula «(SCFV)2» usando una línea celular de melanoma humano que expresa MCSP (MV-3) como células diana y PBMC humanas como células efectoras con una proporción E:T de 10:1 y un tiempo de incubación de 26 h. Como se representa en la figura, la construcción «2+1 IgG Crossfab» es más potente en términos de CEso que la molécula «(SCFV)2».

En una segunda serie de experimentos, las construcciones biespecíficas dirigidas a C03 y EGFR se analizaron para

55 determinar su potencial para inducir alX>ptosis mediada por linfocitos T en células diana tumorales tras el entrelazamiento de la construcción a través de la unión de los restos de unión a antígeno a sus respectivos antígenos diana en células (Figuras 39-41 ).

En un experimento se compararon las construcciones «2+1 IgG scFab» (SEO ID NO: 45, 47, 53) y «1+1 IgG scFab» (SEO ID NO: 47, 53, 213) purificadas dirigidas a C03 y EGFR, Y la molécula «(SCFV)2» correspondiente. En resumen, las células diana tumorales LS-174T que expresan EGFR humano se recogieron con tripsina, se lavaron y se resuspendieron en medio AIM-V (Invitrogen n.o 12055--091). Se sembraron 30 000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo y se añadió la correspondiente dilución de anticuerpo a las concentraciones indicadas. Todas las construcciooes y los controles se ajustaron a la misma molaridad. Se añadieroo células efectoras pan T 65 humanas para obtener una proporción E:T final de 5:1. Como control positivo para la activación de los linfocitos pan T humanos se usó 1 jJg/ml de PHA-M (Sigma n.o L8902). Para la normalización, la lisis máxima de las células diana

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(= 100 %) se determinó mediante incubaciÓfl de las células diana con una concentración final de un 1 % de Trilon X

100. La lisis mínima (= O%) se refiere a las células diana coincubadas con células efectoras, pero sin ninguna construcción o anticuerpo. Después de una incubación durante la noche de 18 ha 37 QC, 5 % de C02, la liberación de LDH de células diana apoptóticaslnecróticas en el sobrenadante se midió con el kit de detección de LDH (Roche Applied Science, n.o 11 644793001), de acuerdo oon las instrucciones del fabricante.

Como se representa en la Figura 39, la construcción «2+1 IgG scfab» muestra actividad cltotóxica comparable a la molécula «(SCFV)2», mientras que la construcción «1 +1 IgG scFab» es menos activa.

En otro experimento se comparan las construcciones purificadas «1+1IgG scFab, con un brazo» (SEO ID NO: 43, 45, 47), «1+1 IgG scFab, con un brazo invertido» (SEO ID NO: 11 , 49, 51) Y «1+1 IgG scFab» (SEO ID NO: 47, 53, 213) Yla molécula «(scFv)z». Las condiciones experimentales fueron como se describe anteriormente, excepto por el tiempo de incubación, que fue de 21 h.

Como se representa en la Figura 40, la construcción «1+1 IgG scFab» muestra una actividad citotóxica ligeramente menor que la molécula «(scFv)2» en este ensayo. Ambas construcciones «1+1 IgG scFab, con un brazo (invertido)>> son claramente menos activas que la molécula «(scFv)2».

En otro experimento adicional se compararon las construcciones «1+1IgG scFab, con un brazo» (SEO ID NO: 43, 45, 47) Y «1+1 IgG scFab, con un brazo invertido» (SEO ID NO: 11, 49, 51) Y la molécula «(scFv)2». El tiempo de incubación en este experimento fue de 16 h Y el resultado se representa en la Figura 41. Incubados con linfocitos pan T humanos, ambas construcciones ((1+1 IgG scFab, con un brazo (invertido)>> son menos activas que la molécula «(SCFV)2», pero muestran liberación de LOH dependiente de la concentración de las células diana (Figura 41A). Tras el cocultivo de las células tumorales LS-174T con linfocitos T indiferenciados aislados de PBMC, las construcciones tenian solo una actividad basal, siendo la más activa la molécula «(scFv)z» (Figura 41 B).

En un experimento adicional se analizaron las construcciones purificadas «1+1 IgG scFab, con un brazo invertido» (SEO 10 NO: 11, 51, 55), «1+1 IgG scFab» (SEO ID NO: 57, 61, 213) Y «2+1 IgG scFab» (SEO ID NO: 57, 59, 61) dirigidas a C03 y a la proteina de activación de fibroblastos (FAP), y la molécula «(scFv)2» correspondiente para determinar su potencial para inducir apoptosis mediada por linfocitos T en fibroblastos humanos que expresan FAP GM05389 tras el entrelazamiento de la construcción a través de la unión de ambos restos diana a sus respectivos anUgenos diana en las células. En resumen, las células diana GM05389 humanas se recogieron con tripsina el dia anterior, se lavaron y se resuspendieron en medio AIM-V (Invitrogen n.o 12055-091 ). Se sembraron 30 000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo y se incubaron durante la nodle a 37 QC, 5 % de C02 para permitir la recuperación y adhesión de las células. Al dia siguiente, las células se centrifugaron, el sobrenadante se descartó y se ai"iadió medio nuevo, asi como la dilución respectiva de las construcciones o de las IgG de referencia a las concentraciones indicadas. Todas las construcciones y los controles se ajustaron a la misma molaridad. Se añadieron células efectoras pan T humanas para obtener una proporción E:T final de 5: 1. Como control positivo para la activación de los linfocitos pan T humanos se usó 5 IJg{ml de PHA-M (Sigma n.o L8902). Para la normalización se determinó la lisis máxima de las células diana (= 100 %) mediante la incubación de las células diana a una concentración final de Triton X-100 al1 %. La lisis minima (= O %) se refiere a las células diana coincubadas con células efectoras, pero sin ninguna construcción o anticuerpo. Después de una incubación adicional durante la noche de 18 h a 37 QC. 5 % de COz, se midió la liberación de LOH de células diana apoptóticas{necróticas en el sobrenadante con el kit de detección de LOH (Rache Applied Science, n.o 11 644793001), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Como se representa en la Figura 42, la construcción «2+1 IgG scFab» muestra una actividad citotóxica comparable a la molécula «(scFv)z» en términos de valores de CEso. La construcción «1+1 IgG scFab, con un brazo invertido» es menos activa que las otras construcciones probadas en este ensayo.

En otro conjunto de experimentos se comparó la construcción «2+1 19G Crossfab, cadena ligera conectada» para C03{MCSP (véase SEa ID NO: 3, 5, 29, 179) con la construcción «2+1 IgG Crossfab» para C03{MCSP (véase SEO ID NO: 3, 5, 29, 33). En resumen, las células diana (células de mela noma Co10-38 humanas, MV-3 humanas o WM2664) se recogieron con tampón de disociación celular el dia del ensayo (o con tripsina un dia antes de que comenzara el ensayo), se lavaron y se volvieron a suspender en el medio de cultivo celular apropiado (RPMI1640, que incluye FCS al 2 % Y Glutamax al1 %). Se sembraron 20 000-30 000 células pOI" pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo plano y se añadió la dilución de anticuerpo respectiva como se indicó (triplicados). Se añadieron PBMC como células efectoras para obtener una proporción final entre células efectoras y diana (E:T) de 10:1. Todas las construcciones y controles se ajustaron a la misma molaridad, el tiempo de incubación fue de 22 h. La detección de la liberación de LOH y la normalización se realizaron como se describe anteriormente.

Las Figuras 49 a 52 muestran el resultado de cuatro ensayos realizados con células de mela noma MV-3 (Figura 49), células CoIo-38 (Figuras 50 y 51 ) o células WM266-4 (Figura 52). Como se muestra en la Figura 49, la construcción con la cadena ligera conectada fue menos potente en comparación con la que no tenia la cadena ligera conectada en el ensayo con células MV-3 como células diana. Como se muestra en las Figuras 50 y 51, la construcción con la cadena ligera conectada fue más potente en comparación con la que no tiene la cadena ligera conectada en los ensayos con células Co10-38 que expresan niveles altos de MCSP como células diana. Finalmente, como se muestra

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en la Figura 52, no hubo diferencias significativas entre las dos construcciones cuando se usaron células WM266-4 que expresan niveles altos de MCSP como células diana.

En otro experimento se compararon dos construcciones «2+1 IgG Crossfab, invertida» dirigidas a CEA en las que en el fragmento Crossfab se habían inlercambiadolas regiones V (VUVH, véase SEa ID NO: 33, 63, 65, 67) olas regiones e (CUCH1, véase SEO ID NO: 65, 67, 183, 197). El ensayo se realizó como se describe anteriormente, usando PBMC humanas como células efectoras y células diana que expresan CEA humano. Las células diana (células tumorales MKN-45 o lS-174T) se recogieron con tripsina-EOTA (luBiosciences n.o 25300-096), se lavaron y se resuspendieron en RPMI1640 (Invitrogen n.O 42404042), que incluye Glutamax al1 % (LuBiosciences n.o 35050087) y FCS al 2 %. Se sembrarOf'l 30 000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo y se añadieron las construcciones biespecificas a las concentraciones ind icadas. Todas las construcciones y los controles se ajustaron a la misma molaridad. Se añadieron células efectoras PBMC humanas para obtener una proporción E:T final de 10:1, el tiempo de incubación fue de 28 h. Los valores de CEso se calcularon usando el programa informático GraphPad Prism 5.

Como se muestra en la Figura 61 , la construcción con el intercambio CUCH1 muestra una actividad ligeramente mejor en ambas lineas celulares diana que la construcción con el intercambio VLNH. Los valores de CEso calculados fueron de 115 y 243 pM en células MKN-45 y de 673 y 955 pM en células LS-174T, para la construcción con intercambio CUCH1 y la construcción con intercambio VLNH, respectivamente.

De forma similar, se compararon dos construcciones «2+1 IgG Crossfab» dirigidas a MCSP, en las que en el fragmento Crossfab se hablan intercambiado las regiones V (VLNH, véase SEO ID NO: 33, 189, 191 , 193) o las regiones C (CUCH1, véase SEO ID NO: 183, 189, 193, 195). El ensayo se realizó como se describe anteriormente, usando PBMC humanas como células efectoras y células diana que expresan MCSP humano. Las células diana (WM266-4) se recogieron con tampón de disociación celular (LuBiosciences n.o 13151014), se lavaron y se resuspendieron en RPMI1640 (Invitrogen n.O 42404042), que incluye Glutamax all % (LuBiosciences n.o 35050087) y FCS al 2 %. Se sembrarOf'l 30 000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo y se añadieron las construcciones a las concentraciones indicadas. Todas las construcciones y los controles se ajustaron a la misma molaridad. Se añadieron células efectoras PBMC humanas para obtener una proporción E:T final de 10:1, el tiempo de incubaciÓfl fue de 26 h. Los valores de CEso se calcularon usando el programa informático GraphPad Prism 5.

Como se muestra en la Figura 62, las dos construcciones muestran actividad comparable, la construcción con el intercambio CUCHl tiene un valor de CEso ligeramente menor (12,9 pM para la construcciÓfl con el intercambio CUCH1, en comparación con 16,8 pM para la construcción con el intercambio VLNH).

La Figura 63 muestra el resultado de un ensayo similar, realizado con células diana MV-3 que expresan MCSP humano. De nuevo, ambas construcciones muestran actividad comparable, la construcción COf'l el intercambio CUCHl tiene un valor de CEso ligeramente inferior (aproximadamente 11,7 pM para la construcción con el intercambio CUCH1, comparado con aproximadamente 82,2 pM para la construcción con el intercambio VLNH). No se pudieron calcular los valores exactos de CEso, ya que las curvas de muerte celular no alcanzaron una meseta a altas concentraciones de los compuestos.

En otro experimento. las construcciones «2+1 IgG Crossfab» (véase SEa ID NO: 3. 5. 29, 33) Y«1+1 IgG Crossfab» (véase SEa ID NO: 5, 29, 33, 181) para C03/MCSP se compararon con la construcción «1+1 CrossMab» para C03/MCSP (véase SEO ID NO: 5, 23, 183, 185). El ensayo se realizó como se describe anteriormente, usando PBMC humanas como células efectoras y células diana WM266-4 o MV-3 (proporción E:T = 10:1) y un tiempo de incubación de 21 h.

Como se muestra en la Figura 64, la construcción «2+1 IgG Crossfab» es la molécula más potente en este ensayo, seguida por la «1 +1 IgG Crossfab» y la «1+1 CrossMabll>. Esta clasificación es aún más prOf'lunciada con las células MV-3, que expresan niveles medios de MCSP, en comparación cOf'llas células WM266-4que expresan niveles altos de MCSP. Los valores de CEso calculados fueron de 9,2, 40,9 Y 88,4 pM en células MV-3 y de 33,1, 28,4 Y 53,9 pM en células WM266-4, para las construcciones «2+1 IgG Crossfab», «1+1 IgG Crossfabll> y «1+1 CrossMabll>, respectivamente.

En un experimento adicional se analizaron diferentes concentraciones de la construcción .;<1+1 IgG Crossfab, fusión LC» (SEO ID NO: 183, 209, 211 , 213), usando células diana tumorales MKN-45 o LS-174T y células efectoras PBMC humanas a una proporción E:T de 10:1 y un tiempo de incubación de 28 horas. Como se muestra en la Figura 65, la construcción «1+1 IgG Crossfab, fusión LC» indujo la apoptosis en células diana MKN-45 con una CEso calculada de 213 pM, mientras que la CEso calculada es de 1,56 nM con células LS-174T, mOstrando la influencia de los diferentes niveles de expresión del antigeno tumoral sobre la potencia de las construcciones biespecificas dentro de un cierto período de tiempo.

En otro experimento más, la construcción «1+1IgG Crossfab, fusión LC» (SEO ID NO: 183, 209, 211, 213) se comparó con una molécula «2+1 IgG Crossfab» no dirigida. Se usaron células tumorales MC38-huCEA y PBMC humanas (proporción E:T = 10:1) y un tiempo de incubación de 24 horas. Como se muestra en la Figura 66, la construcción «1+1 IgG Crossfab, fusión LC» indujo la apoptosis de las células diana de una manera dependiente de la

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concentración, con un valor de CEro calculado de aproximadamente 3,2 nM. Por el cootrario, la construcción «2+11gG Crossfab» no dirigida mostró la muerte de las células diana mediada por linfocitos T independiente de antígeno solo a la concentración más alta.

En un experimento final, las construcciones «2+1 IgG Crossfab (V9)>> (SEO ID NO: 3, 5, 29, 33), «2+1 IgG Crossfab, invertido (V9)>> (SEO ID NO: 5, 23, 183, 187), «2+1 IgG Crossfab (anti-CD3)>> (SEO ID NO: 5, 23, 215, 217) Y «2+1 IgG Crossfab, invertido (anti-CD3)>> (SEO ID NO: 5, 23, 215, 219) se compararon utilizando células tumorales MV$3

o WM26&.4 positivas para MCSP humano y PBMC humanas (proporción E:T = 10:1), y un tiempo de incubación de aproximadamente 24 horas. Como se representa en la Figura 67, la muerte mediada por linfocitos T de las construcciones «2+1 IgG Crossfab, invertida» parece ser ligeramente más fuerte o al menos igual a la inducida por las construcciones «2+1 IgG Crossfab» para ambos conectores CD3. Los valores de CEso calculados fueron los siguientes:

CEso [pM]: 2+1 IgG Crossfab N9) 2+1 IgG Crossfab, invertidó N9) 2+1 IgG Crossfab (antiCD3) 2+1 IgG Crossfab, invertido (anti-CD3l

MV-3: 10,0 4,1 11 ,0 3,0

WM266-4: 12,4 3,7 11 ,3 7 ,1

15 Ejemplo 7

Ensayo de CD107aJb

La construcción purificada «2+1 IgG scFab» (SEO ID NO: 5, 17, 19) Y la molécula «(SCFV)2», ambas dirigidas a MCSP humano y CD3 humano, se analizaron mediante citometría de flujo para determinar su potencial para regular por incremento los niveles de CD107a y perforina intracelular en presencia o ausencia de células tumorales que expresan MCSP humano.

En resumen, en el día 1, se sembraron 30 000 células tumorales diana Co10-38 por pocillo en una placa de 96 pocillos

25 de fondo redondo y se incubaron durante la noche a 37 oC, 5 % de C02 para permitir la adhesión. Se aislaron linfocitos pan T humanos primarios el día 1 o el día 2 de capas leucociticas, como se describe.

El día 2 se añadieron 0,15 millones de células efectoras por pocillo para obtener una proporción E:T final de 5:1. Se añadieron anticuerpos CD107alb conjugados con FITC, asl como las diferentes construcciones biespecificas y controles. Las diferentes moléculas biespecificas y los anticuerpos se ajustaron a la misma molaridad para obtener una concentración final de 9,43 nM. Después de una etapa de incubación de 1 h a 37 "C, 5% de C02, se añadió monensina para inhibir la secreción, pero también para neutralizar el pH dentro de los endosomas y los lisosomas. Después de un tiempo de incubación adicional de 5 h, las células se tiñeron a 4 oC durante 30 min para la expresión de CD8 en la superficie. Las células se lavaron con tampón de tinción (PBS/BSA al 0,1 %), se fijaron y se

35 permeabilizaron durante 20 min usando el kit BO CytofixlCytoperm Plus con BO Golgi Stop (BD Biosciences n." 554715). Las células se lavaron dos veces usando 1 x tampón BO Perm1Wash, y la tinción intracelular para la perforina se realizó a 4 oC durante 30 min. DespuéS de una etapa de lavado final con 1 x tampón SD Perm/Wash, las células se resuspendieron en PBS/BSA al 0,1 % Y se analizaron en un equipo FACS Canloll (todos los anticuerpos se adquirieron a BD Biosciences o BioLegend).

Las puertas se establecieron en todas las células positivas para CD107a1b, positivas para la perfOfina o positivas dobles, tal como se indica (Figura 43). La construcción «2+1 IgG scFab» fue capaz de activar linfocitos T y de regular por incremento los niveles de C0107a1b y de perforina intracelular solo en presencia de células diana (Figura 43A), mientras que la molécula «(scFv)2» muestra (débil) inducción de la activación de linfocitos T también en ausencia de

45 células diana (Figura 43B). La referencia bivalente de IgG anti-C03 da como resultado un nivel de activación más bajo en comparación con la molécula «(SCFV)2» o la otra construcción biespecífica.

Ejemplo 8

Ensayo de proliferación

Las moléculas «2+1 IgG scFab» (SEO ID NO: 5, 17, 19) Y «(scFv)2» purificadas, ambas dirigidas a CD3 humano y a

MCSP humano, se analizaron mediante citometría de flujo para determinar su potencial para inducir la proliferación

de linfocitos T C08-o C04-en presencia y ausencia de células tumorales que expresan MCSP humano.

55 En resumen, los linfocitos pan T humanos recién aislados se ajustaron a 1 millón de células por mi en PBS templado y se tiñeron con CFSE 1 IJM a temperatura ambiente durante 10 minutos. El volumen de tinción se duplicó mediante la adición de medio RPMI1640, que contiene FCS al10 % y GlutaMax al1 %. Despues de la incubación a temperatura ambiente durante 20 minutos adicionales, las células se lavaron tres veces con medio precalentado para eliminar el CFSE restante. Las células Co10-38 positivas para MCSP se recogieron con tampón de disociación celular, se contaron y se comprobó su viabilidad. Las células se ajustaron a 0,2 x 10G células (viables) pOf mi en medio AIM-V y se

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pipetearon 100 1-11de esta suspensión celular por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo (como se indica). Se añadieron 50 1-11 de las conslrucciooes biespecíficas (diluidas) a los pocillos que contenían células para obtener una concentración final de 1 nM. Las células efectoras pan T humanas teñidas con CFSE se ajustaron a 2 x 106 células (viables) por mi en medio AIM·V. Se añadieron 50 1.11 de esta suspensión celular por pocillo de la placa de ensayo (véase más arriba) para obtener una proporción E:T final de 5:1. Para analizar si las cOflslrucciones biespecíficas son capaces de activar linfocitos T exclusivamente en presencia de células diana que expresan el antígeno tumoral huMCSP, se incluyeron pocillos que contenían 1 nM de las moléculas biespecificas respectivas, así como PBMC, pero no células diana. Después de la incubación durante cinco días a 37 QC, 5 % de COz, las células se centrifugaron (5 min, 350 x g) y se lavaron dos veces con 150 IJI/pocillo de PBS que induía BSA al 0,1 %. La tinción superficial para C08 (lgG1,K de ratón, clan HIT8a, BO n.O 555635), C04 (IgG1,K de ratón, don RPA·T4, BD n.o 560649) o CD25 (IgG1,K de ratón; clan M·A251; BD n.O 555434) se realizó a 4 oC durante 30 min de acuerdo con las sugerencias del proveedor. Las células se lavaron dos veces con 150 IJI/pocillo de PBS que contenia BSA al 0,1 %, se resuspendieron en 200 ¡JI/pocillo de PBS con BSA al 0,1 % Y se analizaron usando un equipo FACS Cantoll (Software FACS Diva). El nivel de proliferación relativa se determinó estableciendo una puerta alrededor de las células no proliferantes y usando el número de célula de esta puerta en relación con el número total de células medidas como la referencia.

La Figura 44 muestra que todas las construcciones inducen la proliferación de linfocitos T CD8+(A) o linfocitos T CD4+

(B) solo en presencia de células diana, de forma comparable a la molécula «(scFv)2». En general, los linfocitos T CD8+ activados proliferan más que los linfocitos T CD4+ activados en este ensayo.

Ej emplo 9

Ensayo de liberación de citocinas

La construcción «2+1 IgG scFab» purificada (SEO ID NO: 5, 17, 19) Y la molécula «(scFv)z», ambas dirigidas a MCSP humano y CD3 humano, se analizaron para determinar su capacidad de inducir la secreción de novo de citocinas mediada por linfocitos T en presencia o ausencia de células diana tumorales.

En resumen, se aislaron PBMC humanas de capas leucoclticas y se sembraron 0,3 millones de células por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo. Se añadieron células diana tumorales Colo·38, que expresan MCSP humano, para obtener una proporción E:T final de 10:1. Se añadieron las construcciones biespecificas y los controles de 19G a una concentración final de 1 nM y las células se incubaron durante 24 h a 37 oC, 5 % de CÜ2. Al día siguiente, las células se centrifugaron durante 5 min a 350 x g y el sobrenadante se transfirió a una nueva placa de 96 pocillos de pocillos profundos para su posterior análisis. El análisis de CBA se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante para el equipo FACS Cantoll, usando el kit de citocinas Th1fTh2 humana 11 (SD n.o 551809).

La Figura 45 muestra los niveles de las diferentes citocinas medidos en el sobrenadante. En presencia de células diana, la citocina principal secretada tras la activación de los linfocitos T es lFN-y. la molécula «(scFv)2» induce un nivel ligeramente más allo de IFN·y que la construcción «2+1 IgG scFab». La misma tendencia se puede encontrar para el TNF humano, pero los niveles globales de esta citocina fueron mucho más bajos en comparación con eI IFN

y. No hubo secreción significativa de citocinas Th2 (IL-10 e IL-4) tras la activación de los linfocitos T en presencia (o ausencia) de células diana. En ausencia de células diana Colo·38, solo se observó una inducción muy débil de la secreción de TNF, que fue más alta en las muestras tratadas coo la molécula «(scFv)z».

En un segundo experimento se analizaroo las siguientes construcciones biespecificas purificadas dirigidas a MCSP humano y C03 humano: la construcción «2+1 IgG Crossfab» (SEO ID NO: 3, 5, 29, 33), la molécula «(SCFV)2», así como diferentes moléculas «2+1 19G scFab» que comprenden un dominio Fe natural o mutado (LALA, P329G y/o N297D, como se indica). En resumen, se sembraron 280 ¡JI de sangre completa de un donante sano por pocillO de una placa de 96 pocillos de pocillos profundos. Se añadieron 30 000 células diana tumorales Colo-38, que expresan MCSP humano, así como las diferentes construcciones biespecificas y controles de IgG a una concentración final de 1 nM. Las células se incubaron durante 24 ha 37 oC, 5 % de COzy después se centrifugaroo durante 5 min a 350 x g. El sobrenadante se transfirió a una nueva placa de 96 pocillos de pocillos profundos para su análisis posteriOf. El análisis de CBA se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante para un equipo FACS Cantoll, usando la combinación de los siguientes CBA Flex Sets: granzima B humana (BD n.o 560304), Flex Set para lFN-y humano (BO

n.O 558269), Flex Set para TNF humano (SD n.o 558273), Flex Set para lL-10 humano (BO n.o 558274), Flex Set para lL-6 humano (BO n.o 558276), Flex Set para lL-4 humano (BO n.o 558272), Flex Set para lL-2 humano (BD n.o 558270).

La Figura 46 muestra los niveles de las diferentes citocinas medidos en el sobrenadante. La principal citocina secretada en presencia de células tumorales Colo-38 fue lL·6, seguida de lFN-y. Además, también los niveles de granzima B aumentaron fuertemente con la activación de linfocitos T en presencia de células diana. En general, la molécula «(SCFV)2» indujo niveles más altos de secreción de citocinas en presencia de células diana (Figura 46, A Y B). No hubo secreción significativa de citocinas Th2 (IL-1 0 e IL-4) tras la activación de los linfocitos T en presencia (o ausencia) de células diana.

En este ensayo hubo una secreción débil de IFN·y, inducida por diferentes construcciones «2+1 IgG scFab», incluso en ausencia de células diana (Figura 46, C y D). En estas condiciones, no se pudieron observar diferencias

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significativas entre las construcciones «2+1 IgG scFab» con un dominio Fe natural o mutado.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una molécula biespecífica de unión a antígeno activadOf8 de linfocitos T que comprende un primer y un segundo resto de un ión a antígeno, siendo uno de ellos una molécula Fab capaz de un irse específicamente a un antígeno aclivador de linfocitos T y siendo el otro de ellos una molécula Fab capaz de un irse específicamente a un antígeno de célula diana, y un dominio Fe compuesto por una primera y una segunda subunidad capaces de crear una asociación estable;

en la que el primer resto de unión a antígeno es una molécula Fab entrecruzada en la que las regiones variables o constantes de la cadena ligera Fab y la cadena pesada Fab están intercambiadas;

en la que el primer y el segundo resto de unión a antrgeno están fusionados entre si, opcionalmente a través de conector peptídico; y

en la que la molécula biespecífica de uniórl a antígeno activadora de linfocitos T comprende no más de un resto de unión a antígeno capaz de unirse específicamente a un antígeno activador de tinfocitos T.
2. La motécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T de la reivindicación 1, en la que el segundo resto de unión a antígeno está fusionado en el extremo e de la cadena pesada Fab al extremo N de la cadena pesada Fab del primer resto de unión a antígeno, en la que, opcionalmente

i) la cadena ligera Fab del primer resto de unión a antígeno y la cadena ligera Fab del segundo resto de unión a antígeno están fusionadas entre sí, opcionalmente a través de un conector peptídico; y/o

ii) el primer resto de unión a antígeno está fusionado en el extremo e de la cadena pesada Fab al extremo N de la primera o la segunda subunidad del dominio Fc.
3. La molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T de la reivindicación 1, en la que el primer resto de un ión a antígeno está fusiooado en el extremo e de la cadena pesada Fab al extremo N de la cadena pesada Fab del segundo resto de uniórl a antígeno, en la que, opcionalmente

i) la cadena ligera Fab del primer resto de unión a antígeno y la cadena ligera Fab del segundo resto de unión a antígeno están fusionadas entre sí, opcionalmente a través de un conector peptídico; y/o

ii) en la que el segundo resto de uniórl a antígeno está fusionado en el extremo e de la cadena pesada Fab al extremo N de la primera o la segunda subunidad del dominio Fc.
4. La molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T de la reivindicaciórl1, en la que el segundo resto de uniórl a antígeno está fusionado en el extremo e de la cadena ligera Fab al extremo N de la cadena ligera Fab del primer resto de unión a antígeno, yen la que, opcionalmente, el segundo resto de unión a antígeno está fusionado en el extremo e de la cadena pesada Fab al extremo N de la primera o la segunda subunidad del dominio

Fe.
5. La molécula biespecífica de unión a antlgeno activadora de linfocitos T de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende un tercer resto de unión a antlgeno que es una molécula Fab capaz de unirse espec1ficamente a un antígeno de célula diana, en la que, opcionalmente, el tercer resto de unión a antígeno está fusionado en el extremo e de la cadena pesada Fab al extremo N de la primera o la segunda subunidad del dominio Fc, y en la que, opcionalmente

i) el segundo y el tercer resto de unión a antígeno están fusionados cada uno en el extremo e de la cadena pesada Fab al extremo N de una de las subunidades del dominio Fc, yel primer resto de unión a antígeno está fusionado en el extremo e de la cadena pesada Fab al extremo N de la cadena pesada Fab del segundo resto de unión a antígeno:

o

ii) el primer y el tercer resto de unión a antígeno están fusionados cada uno en el extremo e de la cadena pesada Fab al extremo N de una de las subunidades del dominio Fc, y el segundo resto de unión a antígeno está fusionado en el extremo e de la cadena pesada Fab al extremo N de la cadena pesada Fab del primer resto de unión a antígeno.
6. La molécula biespecifica de unión a antígeno activad ora de linfocitos T de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que

i) la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T es como se define en la reivindicación 5(i) y en la que el segundo y el tercer resto de unión a antígeno y el dominio Fc son parte de una molécula de inmunoglobulina, particularmente una inmunoglobulina de clase IgG:

ii) el dominio Fc es un dominio Fc de IgG, específicamente de IgGl o IgG4:

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iii) el dominio Fe es un dominio Fe humano; y/o

Iv) el dominio Fe comprende una modificación que promueve la asociación de la primera y la segunda subunidad del dominio Fe, en el que, opcionalmente, en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fe, un residuo de aminoácido se reemplaza por un residuo de aminoácido que tiene una volumen de la cadena laleral mayor, generando as! una protuberancia en el dominio CH3 de la primera subunidad que se puede colocar en una cavidad dentro del dominio CH3 de la segunda subunidad, yen el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fe, un residuo de aminoácido se reemplaza por un residuo de aminoácido que tiene un volumen de cadena laleral más pequeño, generando as! una cavidad en el dominio CH3 de la segunda subunidad en la que se puede colocar la protuberancia del dominio CH3 de la primera subunidad.
7. La molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que

i) el dominio Fc exhibe una afinidad de unión reducida por un receptor Fc y/o una función efectora reducida, en comparación con un dominio Fc de IgGl natural;

ii) el dominio Fc oomprende una o más sustituciones de aminoácidos que reducen la unión a un receptor Fc y/o la función efectora;

iii) el dominio Fc comprende una o más sustituciones de aminoácidos que reducen la unión a un receptor Fc y/o la función efectora, en el que dicha una o más sustituciones de aminoácidos está en una o más posiciones seleccionadas entre el grupo de L234, L235 Y P329 (numeración UE); y/o

iv) cada subunidad del dominio Fe comprende tres sustituciones de aminoácidos que reducen la unión a un receptor Fc activador y/o la función efectora, en las que dichas sustituciooes de aminoácidos son L234A, L235A Y P329G (numeración UE).
8.

La molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T de la reivindicación 7, en la que i) el receptor Fc es un receptor Fcy; o ii) la función efectora es citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC).
9.

La molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que

i) el antígeno activador de linfocitos T es CD3; y{o

li) el antígeno de la célula diana se selecciona entre el grupo que consiste en: proteoglucano de sulfato de condroitina asociado a melanoma (MCSP), receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), CD19, CD20. CD33. antígeno carcinoembrionario (CEA) y proteína de activaciÓfl de fibroblastos (FAP).
10.

Un polinucleótido aislado que codifica la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
11.

Un procedimiento de producción de la molécula biespecifica de uniÓfl a antígeno activadora de linfocitos T de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende las etapas de al cultivo de una célula hospedadora que comprende el polinucleótido aislado de la reivindicación 10, o un vector que comprende el polinucleótido aislado de la reivindicación 10, en coodiciones adecuadas para la expresión de la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T y bl recuperación de la molécula biespecífica de un ión a antígeno activadora de linfocitos T.
12.

Una composición farmacéutica que comprende la molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y un vehículo fannacéuticamenle aceptable.
13.

La molécula biespecífica de unión a antígeno activadora de linfocitos T de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o la composición fannacéutica de la reivindicación 12 i) para su uso como medicamento;

ii) para su uso en el tratamiento de una enfermedad en un individuo que lo necesite; iii) para su uso en el tratamiento de una enfermedad en un individuo que lo necesite, en el que la enfermedad es cáncer; o

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iv) para su uso en un procedimiento de inducción de la lisis de una célula diana en un individuo, que oomprende poner en contacto una célula diana con la molécula biespecifica de unión a antígeno activadora de linfocitos T en presencia de un linfocito T, en el que la célula diana es una célula tumoral.

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