KR20180069839A - 카파 및 람다 경사슬을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드 구조체 및 이의 용도 - Google Patents

카파 및 람다 경사슬을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드 구조체 및 이의 용도 Download PDF

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던자 유로세브
마리오 산체스
스테이시 에이.엘. 톰-유
레너드 쥐. 프레스타
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자임워크스 인코포레이티드
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Abstract

본 명세서에 제공된 것은 각각 중사슬 및 경사슬을 포함하는 적어도 두 가지 상이한 이종이합체를 포함하는 다중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체이다. 적어도 하나의 이종이합체는 람다 경사슬을 포함하는 Fab 영역을 포함하고 적어도 하나의 이종이합체는 카파 경사슬을 포함하는 Fab 영역을 포함한다. 항원-결합 폴리펩티드 구조체를 형성하는 하나 이상의 면역글로불린 중사슬 및 경사슬은 중사슬 및 경사슬 사이에 올바른 쌍 형성을 촉진하여 요망되는 다중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체를 형성하는 아미노산 변형을 포함한다. 아미노산 변형은 CH1 및/또는 CL 도메인, VH 및/또는 VL 도메인, 또는 이들의 조합 내에 있을 수 있다.

Description

카파 및 람다 경사슬을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드 구조체 및 이의 용도
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자 제출된 서열 목록을 포함하며 이는 그 전체가 본 명세서에 참고로서 포함된다. 2015년 12월 1일에 생성된 상기 ASCII 파일의 명칭은 0966216이고 크기는 20.0바이트이다.
이중특이적 항체는 두 개의 상이한 에피토프를 결합시킬 수 있고, 대개 두 개의 상이한 단일-특이적 모 항체의 면역글로불린 중사슬 및 경사슬을 기초로 하여 제작된다. 두 개의 상이한 에피토프 또는 항원에 결합하는 능력은 이중특이적 항체를 질환의 치료에 있어서 하나 초과의 항원 또는 에피토프를 표적화하는 이익이 존재하는 경우의 치료적 적용을 위한 매력적인 도구가 되게 만든다. 그러나, 이중특이적 항체를 자연발생적 항체와 유사한 형태로 효율적으로 제조하는 것은 어려울 수 있고, 이는 항체 중사슬이 항체 경사슬에 비교적 무차별적인 방식으로 결합하도록 진화되었기 때문이다. 이러한 무차별성 쌍 형성의 결과로 수반되는 이중특이적 항체의 두 개의 상이한 중사슬 및 두 개의 상이한 경사슬의 발현은 자연적으로 중사슬 - 경사슬 쌍 형성의 뒤섞임을 야기한다. 이러한 뒤섞임은 균일한 쌍 형성이 양호한 제조성 및 생물학적 효능을 위한 핵심 요건인 이중특이적 치료제의 생산에서 가장 큰 장벽으로 남아있다.
일부 접근법은 이중특이적 항체를 자연발생적 항체와 유사한 형태로 제조하도록 기술되어 있다. 그러나, 이들 접근법은 이중특이적 항체를 제조하기 위해 사용되는 모 항체가 모두 카파 유전자 패밀리의 경사슬을 가지는 경우에 대해 개발되었고 예시되었다.
비록 대부분의 공지된 치료적 항체(및 따라서 잠재적 모 항체)가 카파 경사슬을 가지지만,람다 경사슬을 가지는 일부가 존재한다. 카파 및 람다 경사슬은 서로 구조 및 서열 모두에서 상이하다.
두 개의 모 항체로부터 이중특이적 항체를 자연발생적 항체와 유사한 형태로 제조하기 위한 다양한 접근법의 리뷰를 Klein 등, (2012) mAbs 4:6, 1-11에서 찾을 수 있다. 국제 특허 출원 번호 PCT/EP2011/056388(WO 2011/131746)호는 환원 조건 하에서 배양시 두 개의 단일특이적 IgG4- 또는 IgG4-유사 항체 사이에서 지향성 "Fab-팔" 또는 "반쪽-분자" 교환을 유도하기 위해 두 개의 단일특이적 출발 단백질의 CH3 영역에 비대칭 돌연변이가 도입된 이종이합체 단백질을 생성하기 위한 시험관 내 방법을 기술한다.
미국 특허 공개 번호 2009/0182127호(Novo Nordisk, Inc.)는 경사슬-중사슬 쌍의 Fc 접촉면 및 CH1:CL 접촉면에서 아미노산 잔기를 변형함에 의해 다른 쌍의 중사슬과 상호작용하는 한 쌍의 경사슬의 능력을 감소시키는 이중-특이적 항체의 생성을 기술한다. 국제 특허 공개 번호 WO2014/081955호(Amgen), 및 WO2014/150973호(Eli Lilly)는 잠재적으로 변형되어 요망되는 쌍 형성 특이성을 야기할 수 있는 람다 경사슬 내 아미노산 잔기를 기술한다. 이들 공개 중 어느 것도 카파 경사슬을 가지는 하나의 모 항체 및 람다 경사슬을 가지는 또다른 모 항체로부터 이중특이적 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있는 상보적 아미노산 변형을 기술하지 않는다. 국제 특허 공개 번호 WO2012/131555호(Glenmark)는 한 항체의 중사슬 및 람다 경사슬 사이의 접촉면을 TCR (T-세포 수용체) 도메인 접촉면의 그것으로 교체하는 것을 기술한다.
요약
본 개시는 면역글로불린 람다 경사슬 및 면역글로불린 카파 경사슬을 포함하는 다중특이적 항원-결합 폴리펩티드를 제공한다. 한 양태에서, 항원-결합 폴리펩티드는 제1 이종이합체 및 제2 이종이합체를 포함하는 구조체이다. 한 구체예에서, 제1 이종이합체(H1L1)는 제1 면역글로불린 중사슬 폴리펩티드 서열(H1), 및 제1 항원에 특이적으로 결합하여 제1 Fab 영역을 형성하는 면역글로불린 람다 경사슬 폴리펩티드 서열(L1)을 포함하고; 제2 이종이합체(H2L2)는 제2 면역글로불린 중사슬 폴리펩티드 서열(H2), 및 제2 항원에 특이적으로 결합하여 제2 Fab 영역을 형성하는 면역글로불린 카파 경사슬 폴리펩티드 서열(L2)을 포함한다. 일부 구체예에서, H1은 H2와 구별된다. 일부 구체예에서, H1 및 H2는 중사슬 가변 도메인(VH 도메인) 및 중사슬 불변 도메인 1(CH1 도메인)을 포함한다. 한 구체예에서, L1은 람다 경사슬 가변(VL-람다) 도메인 및 람다 경사슬 불변(CL-람다) 도메인을 포함한다. 한 구체예에서, L2는 카파 경사슬 가변(VL-카파) 도메인 및 카파 경사슬 불변(CL-카파) 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 H1, H2, L1, 및 L2는 상응하는 야생형 H1, H2, L1, 및 L2 폴리펩티드 서열과 비교할 때 아미노산 변형을 포함하며, 여기서 아미노산 변형은 H1의 L2보다 L1과의 우선적 쌍 형성을 촉진하고, 및/또는 H2의 L1보다 L2와의 우선적 쌍 형성을 촉진한다. 일부 구체예에서, 아미노산 변형은 신규한 시스테인 잔기를 도입하지 않는다. 한 구체예에서, 아미노산 변형은 자연발생적 시스테인 잔기를 제거하지 않는다.
일부 구체예에서, H1, H2, L1 및 L2가 세포 또는 포유류 세포에서 동시-발현되는 경우, 또는 H1, H2, L1 및 L2가 무-세포 발현 시스템에서 동시-발현되는 경우, 또는 H1 및 L1가 (제1) 세포에서 생산되고 H2 및 L2가 제2(예컨대, 상이한) 세포에서 생산되며 두 세포의 산물이 산화환원 생산 방법을 통해 혼합되는 경우, 또는 H1 및 L1가 제1 무-세포 발현 시스템에서 생산되고 H2 및 L2가 제2(예컨대, 상이한) 무-세포 발현 시스템에서 생산되며 두 무-세포 발현 시스템의 산물이 혼합되는 경우, 구조체는 H1의 L2보다 L1과의 우선적 쌍 형성을 촉진하고, 및/또는 H2의 L1보다 L2와의 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 변형을 포함한다.
구조체의 일부 구체예에서, 각각의 이종이합체는 단일 Fab을 포함한다.
본 명세서에 기술된 항원-결합 폴리펩티드 구조체의 일부 구체예에서:
a. H2는 위치 143에 아미노산 치환을 포함하고; L2는 위치 124에 아미노산 치환을 포함하고; 및
i. H1은 위치 186 또는 179에 아미노산 치환을 포함하고, 및 L1은 위치 180에 아미노산 치환을 포함하고;
ii. H1은 위치 186에 아미노산 치환을 포함하고; 및 L1은 위치 133에 아미노산 치환을 포함하고;
iii. H1은 위치 143에 아미노산 치환을 포함하고; 및 L1은 위치 133에 아미노산 치환을 포함하고; 또는
iv. H1은 위치 188에 아미노산 치환을 포함하고; 및 L1은 위치 178에 아미노산 치환을 포함하고;
b. H1은 위치 143에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 131에 아미노산 치환을 포함하고; 및
i. H2는 위치 186, 또는 124 및 186에 아미노산 치환을 포함하고, 및 L2는 위치 133, 또는 133 및 160, 또는 124 및 133, 또는 176 및 180에 아미노산 치환을 포함하고; 또는
ii. H2는 위치 188에 아미노산 치환을 포함하고; 및 L2는 위치 131에 아미노산 치환을 포함하고;
iii. H2는 위치 143에 아미노산 치환을 포함하고; 및 L2는 위치 124 및 133, 또는 124 및 133 및 180에 아미노산 치환을 포함하고;
c. H1은 위치 143에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 131에 아미노산 치환을 포함하고; 및
i. H2는 위치 124 및 186, 또는 124 및 179, 또는 188에 아미노산 치환을 포함하고, 및 L2는 위치 176 및 178, 또는 176 및 180, 또는 131에 아미노산 치환을 포함하고; 또는
ii. H2는 위치 143 및 188, 또는 143, 또는 124 및 143에 아미노산 치환을 포함하고; 및 L2는 위치 124 및 176 및 178, 또는 124 및 178, 또는 124 및 180, 또는 124 및 176 및 180, 또는 124, 또는 124 및 176에 아미노산 치환을 포함하고;
d. H1은 위치 179, 186, 143 및/또는 188에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 180, 133 및/또는 176 및 178에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 143에 아미노산 치환을 포함하고, 및 L2는 위치 131 및/또는 124에 아미노산 치환을 포함하고;
e. H1은 위치 39에 아미노산 치환을 포함하거나 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 치환을 포함하지 않고; L1은 위치 38에 아미노산 치환을 포함하거나 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 치환을 포함하지 않고; H2는 위치 39에 아미노산 치환을 포함하고, 및 L2는 위치 38에 아미노산 치환을 포함하고;
f. H1은 위치 143에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 131에 아미노산 치환을 포함하고; 및
i. H2는 위치 188 또는 124 및 186에 아미노산 치환을 포함하고, 및 L2는 위치 176 및 178, 또는 176 및 180, 또는 131에 아미노산 치환을 포함하고; 또는
ii. H2는 위치 143 또는 186에 아미노산 치환을 포함하고; 및 L2는 위치 124 및 133, 또는 124 및 133 및 180에 아미노산 치환을 포함하고;
g. H1은 위치 188에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 176 및 178, 또는 178에 아미노산 치환을 포함하고; 및
i. H2는 위치 177 및 188에 아미노산 치환을 포함하고, 및 L2는 위치 176 및 178에 아미노산 치환을 포함하고; 또는
ii. H2는 위치 186 또는 124 또는 124 및 179에 아미노산 치환을 포함하고; 및 L2는 위치 176, 또는 131 및 176에 아미노산 치환을 포함하고;
h. H1은 위치 186에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 133에 아미노산 치환을 포함하고; 및
i. H2는 위치 188에 아미노산 치환을 포함하고, 및 L2는 위치 131에 아미노산 치환을 포함하고; 또는
ii. H2는 위치 177 및 188에 아미노산 치환을 포함하고; 및 L2는 위치 176 및 178에 아미노산 치환을 포함하고; 또는
H1은 위치 124 및 190에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 135에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 124 또는 188에 아미노산 치환을 포함하고, 및 L2는 위치 176, 또는 176 및 178에 아미노산 치환을 포함하고;
i. H1은 위치 177 및 188에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 176 및 178에 아미노산 치환을 포함하고; 및
a. H2는 위치 188에 아미노산 치환을 포함하고, 및 L2는 위치 176 및 178, 또는 131에 아미노산 치환을 포함하고;
b. H2는 위치 186에 아미노산 치환을 포함하고; 및 L2는 위치 133, 또는 124 및 160 및 180에 아미노산 치환을 포함하고;
c. H2는 위치 124, 또는 124 및 179, 또는 124 및 186에 아미노산 치환을 포함하고; 및 L2는 위치 176, 또는 176 및 178, 또는 176 및 180에 아미노산 치환을 포함하고; 또는
d. H2는 위치 143에 아미노산 치환을 포함하고; 및 L2는 위치 133, 또는 124 및 133에 아미노산 치환을 포함하고;
j. H1은 위치 188에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 178에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 124 또는 188에 아미노산 치환을 포함하고, 및 L2는 위치 176 및 178, 또는 176 및 180, 또는 176에 아미노산 치환을 포함하고;
k. 또는 H1은 위치 145 및 188에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 178에 아미노산 치환을 포함하고; 및 H2는 위치 124 및/또는 188에 아미노산 치환을 포함하고, 및 L2는 하나 이상의 위치 124, 133, 및 178에 아미노산 치환을 포함하고;
l. H1은 위치 174, 179 또는 186에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 176 또는 180에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 143 또는 190에 아미노산 치환을 포함하고, 및 L2는 위치 131, 135 또는 124에 아미노산 치환을 포함하고; 또는
m. H1은 위치 174에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 176에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 190에 아미노산 치환을 포함하고; 및 L2는 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 치환을 포함하지 않거나 위치 135에 아미노산 치환을 포함하고;
n. H1은 위치 143 및 190에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 133에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 124에 아미노산 치환을 포함하고, 및 L2는 위치 131 및 135에 아미노산 치환을 포함하고;
o. H1은 위치 143 및/또는 186에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 133에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 124에 아미노산 치환을 포함하고, 및 L2는 위치 131에 아미노산 치환을 포함하고;
p. H1은 위치 143 및 179에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 124 및 178에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 186에 아미노산 치환을 포함하고, 및 L2는 위치 178 및 180, 또는 160 및 180에 아미노산 치환을 포함하고;
q. H1은 위치 143에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 124에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 179 또는 186에 아미노산 치환을 포함하고, 및 L2는 위치 124 및 160 및 180에 아미노산 치환을 포함하고;
r. H1은 위치 186에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 180 또는 178 및 180에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 143 및/또는 179에 아미노산 치환을 포함하고, 및 L2는 위치 124 및 178, 또는 131에 아미노산 치환을 포함하고;
s. H1은 위치 179에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 180에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 143에 아미노산 치환을 포함하고, 및 L2는 위치 124에 아미노산 치환을 포함하고;
t. H1은 위치 143 또는 186에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 180에 아미노산 치환을 포함하거나 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 치환을 포함하지 않고; H2는 위치 143 및 145에 아미노산 치환을 포함하고, 및 L2는 위치 124에 아미노산 치환을 포함하고;
u. H1은 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 치환을 포함하지 않고; L1은 위치 135에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 139에 아미노산 치환을 포함하고, 및 L2는 위치 116에 아미노산 치환을 포함하고;
v. H1은 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 치환을 포함하지 않거나 위치 45에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 치환을 포함하지 않고; H2는 위치 45에 아미노산 치환을 포함하고, 및 L2는 위치 44에 아미노산 치환을 포함하고;
w. H1은 위치 139에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 116에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 치환을 포함하지 않고, 및 L2는 위치 135에 아미노산 치환을 포함하고; 또는
x. H1은 위치 124에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 176에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 124에 아미노산 치환을 포함하고, 및 L2는 위치 176에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 제1 항원에 대한 제1 Fab 영역의 친화성은 제1 항원에 대한 상응하는 야생형 H1 및 L1 폴리펩티드 서열에 의해 형성된 Fab 영역의 친화성의 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 또는 100-배 이내이고, 및/또는 제2 항원에 대한 제2 Fab 영역의 친화성은 제2 항원에 대한 상응하는 야생형 H2 및 L2 폴리펩티드 서열에 의해 형성된 Fab 영역의 친화성의 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 또는 100-배 이내이다.
일부 구체예에서, 제1 Fab 영역의 용해 온도(Tm)는 제1 항원에 대한 상응하는 야생형 H1 및 L1 폴리펩티드 서열에 의해 형성된 Fab 영역의 Tm의 약 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 20°C 이내이고, 및/또는 제2 Fab 영역의 용해 온도(Tm)는 제2 항원에 대한 상응하는 야생형 H2 및 L2 폴리펩티드 서열에 의해 형성된 Fab 영역의 Tm의 약 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 20°C 이내이다.
항원-결합 폴리펩티드 구조체의 일부 구체예에서:
a. H1 및 L1은 야생형 폴리펩티드 서열이고 H2 및 L2는 각각 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하고;
b. 하나 이상의 H1, L1, 및 H2는 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하고, L2는 야생형 폴리펩티드 서열이고;
c. 하나 이상의 H1, L1, 및 L2는 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하고, H2는 야생형 폴리펩티드 서열이고;
d. 하나 이상의 H1, H2, 및 L2는 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하고, L1은 야생형 폴리펩티드 서열이고;
e. 하나 이상의 H1, H2, 및 L2는 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하고 H1은 야생형 폴리펩티드 서열이고;
f. H1, L1, H2, 및 L2는 각각 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함한다.
일부 구체예에서, 아미노산 변형은 여기에 있다:
a. H1 및 H2의 CH1 도메인, L1의 CL-람다 도메인 및 L2의 CL-카파 도메인; 또는
b. H1 및 H2의 CH1 및 VH 도메인, L1의 CL-람다 도메인 및 VL-람다 도메인, 및 L2의 CL-카파 도메인 및 VL-카파 도메인.
일부 구체예에서, 아미노산 변형은 여기에 있다:
a. H1의 적어도 두 CH1 도메인, H2의 CH1 도메인, L1의 CL-람다 도메인 및 L2의 CL-카파 도메인;
b. H1 및 H2의 적어도 두 CH1 및 VH 도메인, L1의 CL-람다 도메인 및 VL-람다 도메인, 및 L2의 CL-카파 도메인 및 VL-카파 도메인, 또는
c. H1의 적어도 두 VH 도메인, H2의 VH 도메인, L1의 VL-람다 도메인, 및 L2의 VL-카파 도메인.
일부 구체예에서, H1, L1, H2, 및/또는 L2는 Fab 영역 내에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의, 아미노산 돌연변이를 포함한다. 일부 구체예에서, H1, H2, L1 및 L2 중 적어도 하나는 적어도 하나의 불변 도메인 및/또는 적어도 하나의 가변 도메인의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 변형을 포함한다.
한 구체예에서, 하나 이상의 H1, H2, L1 및 L2는 H1의 L2보다 L1과의 우선적 쌍 형성을 촉진하여 H1L1을 형성하거나, 또는 H2의 L1보다 L2와의 우선적 쌍 형성을 촉진하여 H2L2를 형성하는 아미노산 변형을 포함하며, 그래서 H1L1 또는 H2L2 중 적어도 하나의 상대적인 쌍 형성이 야생형에 비해 적어도 약 10% 더 많고, 및 그 외의 것의 상대적인 쌍 형성은 야생형의 약 10% 이내 또는 야생형에 비해 적어도 약 10% 더 많게 된다.
일부 구체예에서, 아미노산 변형은 H1의 L2보다 L1과의 우선적 쌍 형성을 촉진하여 H1L1을 형성하거나, 또는 H2의 L1보다 L2와의 우선적 쌍 형성을 촉진하여 H2L2를 형성하고, 여기서 H1L1:H1L2의 비율은 적어도 40:60이고 H2L2:H2L1의 비율은 적어도 60:40이고; 또는 아미노산 변형은 H1의 L2보다 L1과의 우선적 쌍 형성을 촉진하여 H1L1을 형성하거나, 또는 H2의 L1보다 L2와의 우선적 쌍 형성을 촉진하여 H2L2를 형성하고, 여기서 H2L2:H2L1의 비율은 적어도 40:60이고 H1L1:H1L2의 비율은 적어도 60:40이다.
일부 구체예에서, 제1 Fab 영역의 열 안정성은 상응하는 야생형 H1 및 L1 폴리펩티드 서열에 의해 형성된 Fab 영역의 Tm의 약 0, 1, 2, 또는 3°C 이내이다. 瞿 구체예에서, 제2 Fab 영역의 열 안정성은 상응하는 야생형 H2 및 L2 폴리펩티드 서열에 의해 형성된 Fab 영역의 Tm의 약 0, 1, 2, 또는 3°C 이내이다.
일부 구체예에서, 아미노산 변형은 표 4A 또는 4B에 나타난 고유한 식별자 Mab 설계 집합으로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 아미노산 변형은 하나 이상의 표 10-A1 내지 10-A12에 나타난 고유한 식별자 Mab 설계 집합으로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 아미노산 변형은 하나 이상의 표 10-B1 내지 10-B10에 나타난 고유한 식별자 Mab 설계 집합으로 이루어진 군에서 선택된다.
일부 구체예에서, 구조체는 추가로 CH3 도메인 서열을 각각 포함하고 링커로 또는 링커 없이 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역 중 하나에 커플링된 두 개의 Fc 폴리펩티드를 가지는 이합체 Fc를 포함한다. 일부 구체예에서, Fc는 인간 Fc, 인간 IgG1 Fc, 인간 IgA Fc, 인간 IgG Fc, 인간 IgD Fc, 인간 IgE Fc, 인간 IgM Fc, 인간 IgG2 Fc, 인간 IgG3 Fc, 또는 인간 IgG4 Fc이다. 한 구체예에서, Fc는 야생형에 비해 하나 이상의 변형을, 이종이합체 Fc의 형성을 촉진하는 CH3 도메인 서열 중 적어도 하나에 포함한다.
일부 구체예에서, Fc는 다음을 포함한다:
i) 제1 Fc 폴리펩티드 내에 변형 L351Y_F405A_Y407V, 및 제2 Fc 폴리펩티드 내에 변형 T366L_K392M_T394W을 가지는 이종이합체 IgG1 Fc;
ii) 제1 Fc 폴리펩티드 내에 변형 L351Y_F405A_Y407V, 및 제2 Fc 폴리펩티드 내에 변형 T366L_K392L_T394W을 가지는 이종이합체 IgG1 Fc;
iii) 제1 Fc 폴리펩티드 내에 변형 T350V_L351Y_F405A_Y407V, 및 제2 Fc 폴리펩티드 내에 변형 T350V_T366L_K392L_T394W을 가지는 이종이합체 IgG1 Fc;
iv) 제1 Fc 폴리펩티드 내에 변형 T350V_L351Y_F405A_Y407V, 및 제2 Fc 폴리펩티드 내에 변형 T350V_T366L_K392M_T394W을 가지는 이종이합체 IgG1 Fc; 또는
v) 제1 Fc 폴리펩티드 내에 변형 T350V_L351Y_S400E_F405A_Y407V, 및 제2 Fc 폴리펩티드 내에 변형 T350V_T366L_N390R_K392M_T394W을 가지는 이종이합체 IgG1 Fc.
일부 구체예에서, Fc는 추가로 적어도 하나의 CH2 도메인 서열을 포함한다. 한 구체예에서, Fc는 Fc-감마 수용체의 선택적 결합을 촉진하거나, Fc-감마 수용체에 대한 결합을 감소 또는 제거하거나, 또는 FcRn에 대한 결합을 촉진하는 하나 이상의 변형을 포함한다.
일부 구체예에서, H1, L1, H2 및 L2가 동시-발현될 경우, H1L1 및 H2L2 쌍 형성의 합으로 측정되는 올바른 쌍 형성의 총량의 변화는 우선적 쌍 형성을 촉진하는 Fab 영역 내 아미노산 치환이 없는 상응하는 H1, L1, H2 및 L2 폴리펩티드 사슬의 쌍 형성에 비해 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 또는 45%를 초과하고; 또는 생산된 반쪽-항체가 아닌 종류의 백분율로서 생성된 이중특이적 항체의 양으로 측정되는 올바른 쌍 형성의 총량의 변화는 우선적 쌍 형성을 촉진하는 Fab 영역 내 아미노산 치환이 없는 상응하는 H1, L1, H2 및 L2 폴리펩티드 사슬의 쌍 형성에 비해 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 또는 80%을 초과하고, 또는 생산된 모든 종류의 백분율로서 생성된 이중특이적 항체의 양으로 측정되는 올바른 쌍 형성의 총량의 변화는 우선적 쌍 형성을 촉진하는 Fab 영역 내 아미노산 치환이 없는 상응하는 H1, L1, H2 및 L2 폴리펩티드 사슬의 쌍 형성에 비해 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 또는 80%을 초과한다.
일부 구체예에서, 링커는 하나 이상의 폴리펩티드 링커, 하나 이상의 항체 경첩 부위, 또는 하나 이상의 IgG1 경첩 부위를 포함한다. 한 구체예에서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 야생형 폴리펩티드 링커에 비해 하나 이상의 변형을 포함한다.
일부 구체예에서, 아미노산 변형은 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 하나 이상의 H1, H2, L1, 및 L2의 서열은 인간 서열 또는 인간화된 서열로부터 유래된다.
일부 구체예에서, 본 명세서에 기술된 구조체는 치료제 또는 약물에 공액결합된다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 본 명세서에 기술된 구조체(들)를 인코딩하는 단리된 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 단리된 재조합 폴리뉴클레오티드의 집합을 제공한다. 일부 구체예에서, 본 명세서에 기술된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 집합을 포함하는 벡터 또는 벡터의 집합이 제공된다. 일부 구체예에서, 벡터 또는 벡터의 집합 중 적어도 하나의 벡터는 다중-시스트론성(multi-cistronic)이다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 집합, 또는 본 명세서에 기술된 벡터 또는 벡터의 집합을 포함하는 단리된 세포를 제공한다. 일부 구체예에서, 세포는 효모 세포, 박테리아 세포, 곤충 세포, 또는 포유류 세포이다. 일부 구체예에서, 단리된 세포는 본 명세서에 기술된 벡터 또는 벡터의 집합으로 안정하게 형질주입되거나 일시적으로 형질주입된다.
또 다른 양태에서, 본 명세서에 기술된 항원-결합 폴리펩티드 구조체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 일부 구체예에서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 일부 구체예에서, 약제학적 조성물은 추가로 완충액, 항산화제, 저분자량 분자, 약물, 단백질, 아미노산, 탄수화물, 지질, 킬레이트제, 안정화제, 및 부형제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 명세서에 기술된 구조체를 제조하는 방법이 기술된다. 일부 구체예에서, 본 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 항원-결합 폴리펩티드 구조체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 집합을 포함하는 숙주 세포를 수득하는 단계;
(b) 항원-결합 폴리펩티드 구조체의 발현을 허용하는 조건 하에서 숙주 세포 배양물에서 숙주 세포를 배양하는 단계, 및
(c) 숙주 세포 배양물로부터 항원-결합 폴리펩티드 구조체를 수집하는 단계.
일부 구체예에서, 숙주 세포는 본 명세서에 기술된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 집합으로 일시적으로 형질주입되거나 안정하게 형질주입된다.
또 다른 양태에서, 컴퓨터-판독가능한 저장 매체가 제공된다. 일부 구체예에서, 컴퓨터-판독가능한 저장 매체는 제1 면역글로불린 중사슬 폴리펩티드 서열(H1) 및 제1 면역글로불린 람다 경사슬 폴리펩티드 서열(L1)을 포함하는 제1 이종이합체; 및/또는 제2 면역글로불린 중사슬 폴리펩티드 서열(H2) 및 제2 면역글로불린 카파 경사슬 폴리펩티드 서열(L2)을 포함하는 제2 이종이합체 내 상보적 아미노산 변형을 나타내는 데이터를 포함하는 데이터 집합을 저장한다. 일부 구체예에서, 데이터 집합 내에 저장된 H1 및 H2 폴리펩티드 서열은 적어도 하나의 중사슬 가변 도메인(VH 도메인) 및 하나의 중사슬 불변 도메인(CH1 도메인)을 포함하고 각각 서로 구분된다. 일부 구체예에서, 데이터 집합 내에 저장된 L1 및 L2 폴리펩티드 서열은 적어도 하나의 경사슬 가변 도메인(VL 도메인) 및 하나의 경사슬 불변 도메인(CL 도메인)을 포함한다. 일부 구체예에서, 데이터 집합 내에 저장된 상보적 아미노산 변형은 H1의 L2보다 L1과의, 및 H2의 L1보다 L2와의 우선적 쌍 형성을 촉진한다. 일부 구체예에서, 데이터 집합은 표 4A 또는 표 4B에 나열된 변형들 또는 이들 변형의 하위 집합을 나타내는 데이터를 포함한다. 일부 구체예에서, 데이터 집합은 하나 이상의 표 10-A1 내지 10-A12 또는 표 10-B1 내지 10-B10에 나열된 변형들 또는 이들 변형의 하위 집합을 나타내는 데이터를 포함한다.
또 다른 양태에서, 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체를 제조하는 방법이 기술된다. 일부 구체예에서, 본 방법에 의해 제조되는 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 다음을 포함한다:
a. 제1 면역글로불린 중사슬 폴리펩티드 서열(H1) 및 제1 면역글로불린 람다 경사슬 폴리펩티드 서열(L1)을 포함하는 제1 이종이합체; 및
b. 제2 면역글로불린 중사슬 폴리펩티드 서열(H2) 및 제2 면역글로불린 카파 경사슬 폴리펩티드 서열(L2)을 포함하는 제2 이종이합체.
일부 구체예에서, 본 방법에 의해 제조된 H1 및 H2 폴리펩티드 서열은 적어도 하나의 중사슬 가변 도메인(VH 도메인) 및 하나의 중사슬 불변 도메인(CH1 도메인)을 포함하고 각각 서로 구분된다. 일부 구체예에서, 본 방법에 의해 제조된 L1 및 L2 폴리펩티드 서열은 경사슬 가변 도메인(VL 도메인) 및 경사슬 불변 도메인(CL 도메인)을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 방법에 의해 제조된 하나 이상의 H1, L1, H2, 및 L2 폴리펩티드 서열은 H1의 L2보다 L1과의 및 H2의 L1보다 L2와의 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 변형을 포함한다.
일부 구체예에서, 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체를 제조하는 방법은 다음을 포함한다:
a. 본 명세서에 기술된 데이터 집합으로부터의 하나 이상의 상보적 아미노산 변형을 H1, L1, H2 및/또는 L2 내로 도입하는 단계; 및
b. 숙주 세포에서 H1, L1, H2 및 L2를 동시-발현시켜 이중-특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체를 포함하는 발현 산물을 제조하는 단계.
일부 구체예에서, 본 방법은 추가로 발현 산물 내에서 다른 폴리펩티드 산물에 비한 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체의 양을 확인하여 야생형 H1, L1, H2 및 L2의 동시-발현으로 생성된 발현 산물 내 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체의 양에 비해 증가된 양의 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체를 제공하는 상보적 아미노산 변형의 바람직한 하위 집합을 선별하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 다른 폴리펩티드 산물에 비해 70%를 초과하는 순도로 제조된다. 일부 구체예에서, 본 방법에 의해 제조된 구조체는 적어도 두 개의 CH3 도메인 서열을 포함하는 Fc를 포함하며, Fc는 하나 이상의 링커와 함께 또는 없이 제1 이종이합체 및 제2 이종이합체에 커플링된다. 일부 구체예에서, Fc는 동종이합체 Fc 보다 이종이합체 Fc의 형성을 촉진하는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 이종이합체 Fc이다.
이중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체를 제조하는 방법의 일부 구체예에서, H1, L1, H2 및 L2가 동시-발현되는 경우, 생산된 % H1L1 및 %H2L2의 합으로 측정되는 올바른 쌍 형성의 총량의 변화는 우선적 쌍 형성을 촉진하는 Fab 영역 내 아미노산 치환이 없는 상응하는 H1, L1, H2 및 L2 폴리펩티드 사슬의 쌍 형성에 비해 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 또는 45%을 초과하고; 또는 생산된 반쪽-항체가 아닌 종류의 백분율로서 생성된 이중특이적 항체의 양으로 측정되는 올바른 쌍 형성의 총량의 변화는 우선적 쌍 형성을 촉진하는 Fab 영역 내 아미노산 치환이 없는 상응하는 H1, L1, H2 및 L2 폴리펩티드 사슬의 쌍 형성에 비해 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 또는 80%을 초과하고; 또는 생산된 모든 종류의 백분율로서 생성된 이중특이적 항체의 양으로 측정되는 올바른 쌍 형성의 총량의 변화는 우선적 쌍 형성을 촉진하는 Fab 영역 내 아미노산 치환이 없는 상응하는 H1, L1, H2 및 L2 폴리펩티드 사슬의 쌍 형성에 비해 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 또는 80%을 초과한다.
도 1은 인간 생식계열 서열에 대해 가변 및 불변 도메인에 맞춰 정렬된 D3H44, 페르투주맙(Pertuzumab), 및 CAT-2200 중사슬 및 경사슬 아미노산 서열을 도시한다. 각각의 도메인, 생식계열, 및 알릴에 대해 번역된 단백질 서열은 IMGT/GENE-DB(http://www.imgt.org/genedb/query)을 직접 검색하여 수득하였다. IMGT/DomainGapAlign(http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi)을 사용하여 가장 가까운 유전자/알릴을 결정하였다. 공통 서열의 식별은 BoxShade(http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html)에 의해 0.8 컷오프로 수행하였다. 검게 칠해진 아미노산 잔기는 아미노산 서열 동일성을 나타내는 반면, 회색으로 칠해진 부분은 아미노산 서열 유사성을 나타낸다. 도 1의 각각의 도메인에 대한 아미노산의 지정은 Lefranc M.-P. 등. "IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor constant domains and Ig superfamily C-like domains" Dev. Comp. Immunol., 2005, 29, 185-203, 및 Lefranc, M.-P., Pommie, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. 및 Lefranc, G. "IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains" Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)에 기술된 바와 같은 IMGT 정의에 따라 이루어졌다. 도 1a는 인간 IGHV 및 IGHJ 생식계열 하위군에 대해 정렬된 페르투주맙 및 D3H44 가변 중사슬(VH) 도메인을 도시한다(각각의 유전자 및 알릴에 대해 하나의 대표적인 서열이 표시된다). 페르투주맙 IGHV 및 IGHJ에 가장 가까운 유전자 및 알릴 서열은 각각 X92218|IGHV3-66*01 및 J00256|IGHJ4*01이다. D3H44 IGHV 및 IGHJ에 가장 가까운 유전자 및 알릴 서열은 각각 X92218|IGHV3-66*01 및 J00256|IGHJ4*01이다. 도 1b는 인간 카파 IGKV 및 IGKJ 생식계열 하위군에 대해 정렬된 페르투주맙 및 D3H44 가변 경사슬(VL) 도메인을 도시한다(각각의 유전자 및 알릴로부터 하나의 대표적인 서열이 표시된다). 페르투주맙 IGKV 및 IGKJ에 가장 가까운 유전자 및 알릴 서열은 각각 Y14865|IGKV1-NL1*01 및 J00242|IGKJ2*01이다. D3H44 IGKV 및 IGKJ에 가장 가까운 유전자 및 알릴 서열은 각각 X59315|IGKV1-39*01 및 J00242|IGKJ1*01이다. 도 1c는 인간 CH1 IGHG 생식계열 하위군에 대해 정렬된 페르투주맙 및 D3H44 불변 중사슬 1(CH1) 도메인을 도시한다. 페르투주맙 및 D3H44 IGHG에 가장 가까운 유전자 및 알릴 서열은 J00228|IGHG1*01이다. 도 1d는 인간 카파 IGKC 생식계열 하위군에 대해 정렬된 페르투주맙 및 D3H44 불변 경사슬(CL) 도메인을 도시한다. 페르투주맙 및 D3H44 IGKC에 가장 가까운 유전자 및 알릴 서열은 J00241|IGKC*01이다. 도 1e는 인간 IGHV 및 IGHJ 생식계열 하위군에 대해 정렬된 CAT-2200 VH 도메인을 도시한다(각각의 유전자 및 알릴에 대해 하나의 대표적인 서열이 표시된다). CAT-2200 IGHV 및 IGHJ에 가장 가까운 유전자 및 알릴 서열은 각각 M99660|IGHV3-23*01 및 J00256|IGHJ4*01이다. 도 1f는 인간 람다 IGLV 및 IGLJ 생식계열 하위군에 대해 정렬된 CAT-2200 VL 도메인을 도시한다(각각의 유전자 및 알릴로부터 하나의 대표적인 서열이 표시된다). CAT-2200 IGLV 및 IGLJ에 가장 가까운 유전자 및 알릴 서열은 각각 Z73673|IGLV6-57*01 및 M15641|IGLJ2*01이다. 도 1g는 인간 CH1 IGHG 생식계열 하위군에 대해 정렬된 CAT-2200 CH1 도메인을 도시한다. CAT-2200 IGHG에 가장 가까운 유전자 및 알릴 서열은 J00228|IGHG1*01이다. 도 1h는 인간 람다 IGLC 생식계열 하위군에 대해 정렬된 CAT-2200 CL 도메인을 도시한다. CAT-2200 IGLC에 가장 가까운 유전자 및 알릴 서열은 J00253|IGLC2*01이다.
도 2는 접점 잔기 식별 및 우선적 중사슬-경사슬 쌍 형성을 갖는 설계의 컴퓨터 모델링을 위한 흐름도를 도시한다.
도 3은 D3H44(PDB ID 1JPT) 및 CAT-2200(PDB-ID 2VXS)의 불변 도메인 사이의 3D 구조적 정렬을 도시한다. 도 3a는 카파 및 람다 경사슬이 이들의 각각의 중사슬에 정렬되었을 때 둘 사이에 보이는 전형적인 형태적 차이점을 예시한다. 도 3b는 도 3a에 나타난 모델의 경사슬 접점(중사슬은 제거됨)의 모습을 나타내며, 형태적 차이점을 추가로 예시한다. 점선 화살표는 중사슬 및 경사슬 사이의 접점에서 이차 구조 요소의 형태적 재배열을 가리킨다.
도 4는 이중특이적 항체를 형성하기 위한 공정 요건의 높은 수준의 도식적 개요, 및 중사슬 경사슬(H-L) 쌍을 정량하기 위해 필요한 어세이 요건을 예시한다. 높은 순도를 갖는 이중특이적 항체(즉, 오류쌍을 형성한 H-L 연합이 적거나 없음)를 제작하는 설계 목표는 두 가지 고유한 중사슬의 이들의 고유한 동족 경사슬에 대한 우선적 쌍 형성을 합리적으로 조작하여(특이적 아미노산 돌연변이의 도입을 통해) 달성될 수 있다. 이러한 과정이 도식적으로 나타나며; 여기서 H1은 L2("X"로 표시된 것)가 아니라 L1(체크로 표시된 것)와 우선적 쌍을 이루도록 조작되었다. 유사하게, H2는 L1이 아니라 L2와 우선적 쌍을 이루도록 조작되었다. H1L1 및 H2L2 이종이합체 상의 화살표는 이들 H-L 쌍 사이의 촉진된 쌍 형성을 나타내는 반면, H1L2 및 H2L1 이종이합체 상의 화살표는 후자 H-L 쌍 사이의 쌍 형성의 파괴를 나타낸다. 우선적 쌍 형성을 촉진하는 설계의 실험적 선별은 H1L1:H1L2 및 H2L2:H2L1를 동시에 정량할 수 있는 어세이를 필요로 한다. 이들 어세이 요건은 각각의 이중특이적 Fab 팔이 독립적으로 조작될 수 있다는 가정에 의해 단순화될 수 있다. 이러한 경우, 어세이는 오로지 H1L1:H1L2 또는 H2L2:H2L1만 정량해야 할 뿐, 동시에 정량할 필요는 없다.
도 5는 중사슬 및 경사슬이 어떻게 태깅될 수 있는지 및 우선적 쌍 형성이 어떻게 결정되는지 보여주는 도식을 제공한다. 이러한 도식에서, 환형 경계는 3개의 구조체(하나의 중사슬 및 두 개의 고유한 경사슬)가 형질주입된 세포를 나타낸다. 발현 산물은 세포로부터 분비되며 상청액(SPNT)은 검출 장치, 이 경우에는 SPR 칩을 거쳐 통과한다. 중사슬 쌍 형성에 있어서 경쟁하는 두 개의 경사슬에 융합된 두 개의 상이한 태그의 검출을 기반으로, 두 개의 경사슬에 대한 중사슬의 우선적 쌍 형성의 정량적 추정치를 얻을 수 있다.
도 6은 각각의 설계에 대하여 두 가지 LCCA 결과를 기초로 하는 성능 필터링 기준을 도시한다. 이들 성능 필터링 기준은 K-L 설계 라이브러리 및 K-K-유래 K-L 설계 라이브러리를 확인하기 위해 사용되었다. 포함을 위해, 설계는 중성 구역을 넘는 양성 LCCA 결과(중성 구역은 40:60 및 60:40 쌍형성:오류쌍형성 비율 사이의 영역으로 정의됨)를 보유해야 하는 반면 다른 LCCA는 중성 구역의 하한(40:60 쌍형성:오류쌍형성 비율)을 넘어야 한다. 시나리오 A 및 B는 필터링 기준을 통과하는 설계를 나타낸다. 시나리오 B가 포함된 이유는 H2L2:H2L1 LCCA가 중성 구역을 넘으며 H1L1:H1L2 LCCA가 중성 구역 내부(아래에 있지 않음)에 있기 때문임을 눈여겨보라. 시나리오 C는 필터링 후 배제된 설계를 나타내며, 여기서 LCCA 결과 모두는 양성이지만, 어느 것도 중성 구역 위에 있지 않다. 시나리오 D 및 E는 필터링 후 배제된 설계를 나타내며 그 이유는 다른 LCCA가 중성 구역 위에 있더라도 적어도 하나의 LCCA 결과가 중성 구역 아래에 있기 때문이다(시나리오 D 참조).H1L1 및 H2L2의 명칭이 역전된 설계가 또한 포함된다. 이러한 도면의 설명은 야생형 쌍 형성 비율이 50:50임을 가정한다.
도 7은 설계 강도 = ΔH1:L1:L2_스칼라 + ΔH2:L2:L1_스칼라로 정의된 바와 같은 선택된 K-L 설계 뿐만 아니라 K-K-유래 K-L 설계(표 4A 및 4B의 Mab 설계 집합에 대한 LCCA 데이터를 기초로 함)의 성능을 도시한다. 이러한 계량은 설계 단계에서 전반적인 쌍 형성의 성공을 나타내준다.
도 8은 세포에서 두 개의 상이한 경사슬이 두 개의 상이한 중사슬과 함께 동시-발현되는 경우 예상될 수 있는 가능한 중사슬 연관 산물을 도시한다.
도 9는 본 명세서에 제공된 Mab 설계 집합 라이브러리를 이용하여 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체를 제조하는 일반적 방법을 도시한다.
도 10은 설계 클러스터에 의한, 세 가지 이중특이적 시스템 내 SMCA에서 모든 K-L 설계 시험의 성능을 요약하는 최소-최대 박스 도표를 도시한다. 도 10a는 총 이중특이성 산출(Δ이중특이성%)로 측정된 성능을 나타낸다. 도 10b는 총 쌍 형성 산출(Δ쌍 형성%)로 측정된 성능을 나타낸다.
도 11은 이동가능한 군에 의한, 이중특이적 시스템당 K-L 설계 및 K-K-유래 K-L 설계의 성능을 요약하는 최소-최대 박스 도표 그래프를 도시하며; "kl 3/3"은 3/3 이중특이적 시스템에서 이동가능한 K-L 설계를 나타내고, "kl 3/3 + 2/3"은 적어도 2개의 이중특이적 시스템에서 이동가능한 K-L 설계를 나타내고, 및 "kl 모두"는 시험된 모든 K-L 설계를 나타낸다. 유사하게, "kk 3/3"은 3/3 이중특이적 시스템에서 이동가능한 K-K-유래 K-L 설계를 나타내고, "kk 3/3 + 2/3"은 적어도 2개의 이중특이적 시스템에서 이동가능한 K-K-유래 K-L 설계를 나타내고, 및 "kk 모두"는 시험된 모든 K-K-유래 K-L 설계를 나타내며; 결과는 총 이중특이성 계산(Δ이중특이성%)을 기초로 제시된다.
도 12는 Mab 설계 집합 3972 (SMCA 설계 ID) (각각의 세 가지 이중특이적 시스템으로 된 것)을 이용하여 제조된 이중특이적 항체, 및 각각의 시스템에 대한 야생형 모 항체의 DSC 센서그램(sensorgram)을 도시한다. 도 12a는 야생형 CAT-2200 mAb(어두운 회색), 야생형 페르투주맙 mAb(중간 회색), 및 설계 3972 CAT-2200/페르투주맙 SMCA(밝은 회색)을 도시하며; 도 12b는 야생형 CAT-2200 mAb(어두운 회색), 야생형 SGN-CD19a mAb(중간 회색), 및 설계 3972 CAT-2200/SGN-CD19a SMCA(밝은 회색)을 도시하며; 도 12c는 야생형 SGN-CD19a mAb(어두운 회색), 야생형 CR8071 mAb(중간 회색), 및 설계 3972 CR8071/SGN-CD19a SMCA(밝은 회색)을 도시한다.
도 13은 시험된 Fab의 Tm에 대한 Mab 설계의 아미노산 치환의 효과를 요약하는 최소-최대 박스 도표를 도시한다. 결과는 WT에 비교한 Fab Tm의 변화로서 기록되며 Tm을 측정한 모든 설계("모두")에 대해 나타나고, 파라토프(paratope)로 분리된다.
도 14는 시험된 Fab의 이의 항원에 대한 친화성에 대한 Mab 설계의 아미노산 치환의 효과를 요약하는 최소-최대 박스 도표를 도시한다. 결과는 WT로부터 이중특이적의 적절한 Fab의 로그(KD)의 차이로서 기록된다(-(로그(KD_변이체)-로그(KD_wt)). 결과는 친화성을 측정한 모든 설계("모두")에 대해 나타나고, 파라토프로 분리된다.
도 15는 단백질-A 및 분취용-SEC 정제된 이중특이적 항체 및 모 항체의 UPLC-SEC 프로파일을 도시한다. 도 15a는 야생형 모 CAT-2200 mAb를 나타내고; 도 15b는 야생형 모 CR8071 mAb를 나타내고; 도 15c는 야생형 모 SGN-CD19a mAb를 나타내고; 도 15d는 야생형 모 페르투주맙 mAb를 나타내고; 도 15e는 설계 3972 CAT-2200/페르투주맙 SMCA를 이용하여 생성된 이중특이적 항체를 나타내고; 도 15f는 설계 3972 CAT-2200/SGN-CD19a SMCA를 이용하여 생성된 이중특이적 항체를 나타내고; 및 도 15g는 설계 3972 CR8071/SGN-CD19a SMCA를 이용하여 생성된 이중특이적 항체를 나타낸다.
도 16은 상응하는 WT 이중특이적 구조체가 SMCA에 의해 평가되지 않은 경우, SMCA에서 시험된 설계에 있어서, 'WT에 비한 총 쌍 형성의 변화' 및 'WT에 비한 총 이중특이성의 변화'의 계산을 위해, 야생형 기준 수치를 선별하기 위한 과정을 도시한다. 도 16a는 각각의 세 가지 이중특이적 시스템에 대하여 '총 쌍 형성' ("% H1L1 및 % H2L2 쌍 형성")에 대한 야생형 기준 수치를 선별하기 위한 과정을 나타내고; 도 16b는 각각의 세 가지 이중특이적 시스템에 대하여 '총 이중특이성' ("H1L1_H2L2 및 H1L2_H2L1**")에 대한 야생형 기준 수치를 선별하기 위한 과정을 나타낸다.
본 명세서에 제공된 것은 쌍을 이뤄 제1 Fab 영역을 형성하는 제1 면역글로불린 중사슬(H1) 및 면역글로불린 람다 경사슬(L1)을 가지는 제1 이종이합체(H1L1), 및 면역글로불린 중사슬(H2) 및 쌍을 이뤄 제2 Fab 영역을 형성하는 면역글로불린 카파 경사슬(L2)을 가지는 제2 이종이합체(H2L2)를 포함할 수 있는 조작된 항체(또한 본 명세서에서 다중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체로도 지칭됨)이다. 제1 Fab 영역은 전형적으로 제1 항원에 결합하고 제2 Fab 영역은 전형적으로 제2 항원에 결합한다. 일부 구체예에서, 제1 및 제2 항원은 각각 서로 상이하다. H1은 H2와 구별된다. 하나 이상의 면역글로불린 중사슬 및 경사슬은 동시-발현 또는 동시-생산된 경우 올바르게 쌍을 형성한 중사슬 및 경사슬(H1L1 또는 H2L2)의 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 변형을 포함하도록 조작된다. 더 상세하게는, 아미노산 변형은 각각의 중사슬 및 올바른 경사슬 사이에 우선적 쌍 형성을 촉진하여 제1 이종이합체(H1)의 중사슬이 L2보다 L1과 우선적으로 쌍을 이룰 수 있게 하고, 및 제2 이종이합체(H2)의 중사슬이 L1보다 L2와 우선적으로 쌍을 이룰 수 있게 한다. 그 결과, H1, L1, H2 및 L2 폴리펩티드의 동시-발현은 감소되거나 제한된 오류쌍형성을 가지며 올바르게 쌍을 형성한 이중특이적 항체의 생산을 가능하게 할 수 있고, 따라서 생산된 오류쌍형성 종류의 수와 양을 감소시키고 가능하게는 제조가능성(manufacturability)을 향상시킨다. 한 구체예에서, Fab 영역 내 아미노산 변형은 이종이합체 Fc 영역의 형성을 촉진하는 Fc 영역 내 아미노산 변형과 쌍을 형성하여 추가로 오류쌍형성 중사슬의 양을 감소시킨다. 아미노산 변형은 야생형 H1 및 L1, 또는 H2 및 L2 폴리펩티드로부터 형성된 이종이합체와 비교할 때 올바르게 쌍을 형성한 이종이합체의 열 안정성, 또는 각각의 올바르게 쌍을 형성한 이종이합체의 항원에 대한 결합 친화성에 현저한 영향을 끼치지 않는다.
또한 본 명세서에 제공된 것은 상기 기술된 다중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체를 제조하는 방법이다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 청구된 주제가 속하는 당해 분야의 숙련가에게 공통적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서의 용어에 대해 다수의 정의가 존재하는 경우에는, 본 단락의 정의가 우선한다. 참조 출처가 URL이거나 기타 그러한 식별자 또는 주소를 가지는 경우, 그러한 식별자가 변할 수 있으며 인터넷 상의 특정 정보가 나타났다가 사라질 수 있지만, 등가의 정보가 인터넷 검색을 통해 검색될 수 있음이 이해되어야 한다. 그러한 정보의 입수가능성 및 공공 보급이 이러한 참조를 뒷받침한다.
전술된 일반 설명 및 이어지는 상세한 설명이 예시 및 설명을 위한 것일 뿐 청구된 내용의 어느 것도 제한하지 않음이 이해되어야 한다. 본 명세서에서, 단수의 사용은 달리 구체적으로 언급되지 않은 한 복수를 포함한다.
본 명세서에서, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위, 또는 정수 범위는 달리 지정되지 않는 한 언급된 범위 내의 임의의 정수값 및, 적절한 경우에는, 이의 분률(가령 정수의 십분의 일 및 백분의 일)을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에서 사용된, "약"은 달리 지정되지 않는 한 언급된 범위, 수치, 서열, 또는 구조의 ±1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10%를 의미한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "a" 및 "an"은 달리 지정되거나 본문이 분명히 지시하지 않는 한 열거된 성분의 "하나 이상"을 가리키는 것으로 이해되어야 한다. 대안의 사용(예컨대, "또는")은 대안들 중 하나, 전부, 또는 이들의 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에서 사용된, 용어 "포함하다" 및 "포함하는"은 동의어로 사용된다. 또한, 본 명세서에 기술된 다양한 조합의 구조 및 치환기로부터 유래한 개별적인 단일 사슬 폴리펩티드 또는 면역글로불린 구조체는 본 출원에 의해 각각의 단일 사슬 폴리펩티드 또는 이종이합체가 개별적으로 제시된 것과 동일한 정도로 개시되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 개별적인 단일 사슬 폴리펩티드 또는 이종이합체를 형성하기 위한 특정 성분의 선별이 본 개시의 범위 내에 있다.
본 명세서에 사용된 단락의 제목은 구조적 목적을 위한 것일뿐 기술된 내용을 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 이에 제한되지 않지만, 특허, 특허 출원, 기사, 서적, 매뉴얼, 및 조약을 비롯한 본 명세서에 언급된 모든 문서, 또는 문서의 일부는 어느 목적으로든 그 전체가 본 명세서에 분명하게 참고로서 포함된다.
본 명세서에 기술된 방법 및 조성물이 본 명세서에 기술된 구체적인 방법, 프로토콜, 세포주, 구조체, 및 시약에 제한되지 않으며 따라서 달라질 수 있음이 이해되어야 한다. 또한 본 명세서에 사용된 명칭은 특정 구체예를 설명하기 위한 목적으로 사용되었을 뿐, 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 본 명세서에 기술된 방법 및 조성물의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않음이 이해되어야 한다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물 및 특허는 예를 들면, 본 명세서에 기술된 방법, 조성물 및 화합물과 관련하여 사용될 수 있는 공개에 기술된 구조체 및 방법론을 설명 및 개시할 목적을 위해 그 전체가 본 명세서에 참고로서 포함된다. 본 명세서에서 논의된 간행물은 오로지 본 명세서의 출원날짜 전의 개시에 대해서만 제공된다. 본 명세서의 어떤 것도 본 명세서에 기술된 발명자가 선행 발명 또는 어떠한 다른 이유를 근거로 그러한 개시보다 우선할 자격이 없다는 허가로 간주되어서는 안된다.
본 명세서에서, 아미노산 명칭 및 원자 명칭(예컨대, N, O, C, 등)은 IUPAC 명명법(IUPAC 산 및 펩티드의 명명 및 표시(Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides) (잔기 명칭, 원자 명칭 등), Eur. J. Biochem., 138, 9-37 (1984)를 기초로 하고 Eur. J. Biochem., 152, 1 (1985)의 보정을 더한 단백질 데이터뱅크(Protein DataBank, PDB) (www.pdb.org)의 정의에 의해 사용된다. 용어 "아미노산 잔기"는 주로 20가지 자연발생적 아미노산, 즉 알라닌 (Ala 또는 A), 시스테인 (Cys 또는 C), 아스파르트산 (Asp 또는 D), 글루탐산 (Glu 또는 E), 페닐알라닌 (Phe 또는 F), 글리신 (Gly 또는 G), 히스티딘 (His 또는 H), 이소류신 (Ile 또는 I), 라이신 (Lys 또는 K), 류신 (Leu 또는 L), 메티오닌 (Met 또는 M), 아스파라긴 (Asn 또는 N), 프롤린 (Pro 또는 P), 글루타민 (Gln 또는 Q), 아르기닌 (Arg 또는 R), 세린 (Ser 또는 S), 트레오닌 (Thr 또는 T), 발린 (Val 또는 V), 트립토판 (Trp 또는 W), 및 티로신 (Tyr 또는 Y) 잔기로 이루어진 군에 포함된 아미노산 잔기를 가리키는 것으로 의도된다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 가리키기 위해 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 즉, 폴리펩티드에 관한 설명이 동일하게 펩티드의 설명 및 단백질의 설명에 적용되며, 반대로도 적용된다. 이 용어는 자연발생적 아미노산 중합체 뿐만 아니라 하나 이상의 아미노산 잔기가 비-자연적으로 인코딩된 아미노산인 아미노산 중합체에 적용된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 이 용어는 전장 단백질을 비롯하여 아미노산 잔기가 공유 펩티드 결합으로 연결된 임의의 길이의 아미노산 사슬을 포괄한다.
용어 "뉴클레오티드 서열" 또는 "핵산 서열"은 둘 이상의 뉴클레오티드 분자의 연속적 구간을 지칭하는 것으로 의도된다. 뉴클레오티드 서열은 유전체, cDNA, RNA, 반합성 또는 합성 유래, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
"세포", "숙주 세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며 모든 그러한 용어는 세포의 성장 또는 배양으로 생성된 자손을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. "형질전환" 및 "형질주입"은 핵산 서열을 세포 내로 도입하는 과정을 가리키기 위해 상호교환적으로 사용된다.
용어 "아미노산"은 자연발생적 및 비-자연발생적 아미노산, 뿐만 아니라 자연발생적 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 가리킨다. 자연적으로 인코딩된 아미노산은 20가지 공통 아미노산(알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 및 발린) 및 피롤리신 및 셀레노시스테인이다. 아미노산 유사체는 자연발생적 아미노산과 동일한 염기성 화학 구조를 가지는 화합물, 즉, 탄소가 수소, 카르복실 기, 아미노 기, 및 R 기, 가령, 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌 메틸 설포늄에 결합된 것을 가리킨다. 그러한 유사체는 변형된 R 기(가령, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 백본을 가지지만, 자연발생적 아미노산과 동일한 염기성 화학 구조를 보유한다. 아미노산에 대한 언급은, 예를 들면, 자연발생적 단백질생성 L-아미노산; D-아미노산, 화학적으로 변형된 아미노산 가령 아미노산 변이체 및 유도체; 자연발생적 비-단백질생성 아미노산 가령 알라닌, 오르니틴, 등; 및 아미노산의 특징이라고 당해 분야에 공지된 특성을 지니는 화학적으로 합성된 화합물을 포함한다. 비-자연발생적 아미노산의 예시는 N-메틸 아미노산(예컨대 메틸 알라닌), D-아미노산, 히스티딘-유사 아미노산(예컨대, 2-아미노-히스티딘, 하이드록시-히스티딘, 호모히스티딘), 곁사슬에 추가적인 메틸렌을 가지는 아미노산("호모" 아미노산), 및 곁사슬 내 카르복실산 관능기가 설폰산 기(예컨대, 시스테산)로 대체된 아미노산을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 합성 비-자연적인 아미노산, 치환된 아미노산, 또는 하나 이상의 D-아미노산을 비롯한 비-자연적인 아미노산을 본 명세서에 기술된 항원-결합 폴리펩티드 구조체의 단백질 내에 도입하는 것은 수많은 상이한 방식에서 유익할 수 있다. D-아미노산-함유 펩티드, 등은 L-아미노산-함유 상대에 비해 시험관 내 또는 생체 내에서 증가된 안정성을 나타낸다. 따라서, D-아미노산을 포함하는 펩티드의 구조체, 등은 더 높은 세포내 안정성이 요망되거나 필요한 경우에 특히 유용할 수 있다. 더 상세하게는, D-펩티드, 등은 내인성 단백질분해효소 및 프로테아제에 대해 저항성이며, 이를 통해 그러한 특성이 요망되는 경우 분자의 향상된 생체이용률, 및 연장된 생체 내 수명을 제공한다. 추가적으로, D-펩티드, 등은 T 헬퍼 세포에게의 주요 조직적합성 복합체 클래스 II-제한된 제시에 있어서 효율적으로 처리될 수 없고, 그러므로, 전체 유기체에서 체액성 면역 반응을 덜 유도할 것이다.
본 명세서에서 아미노산은 일반적으로 알려진 세 문자 표시 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회(Biochemical Nomenclature Commission)에서 권장하는 한 문자 표시로 언급된다. 뉴클레오티드 역시 일반적으로 받아들여지는 단일-문자 암호로 언급될 수 있다.
"보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열 둘다에 적용된다. 특정 핵산 서열에 있어서, "보존적으로 변형된 변이체"는 동일하거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열, 또는 핵산이 아미노산 서열을 인코딩하지 않을 경우 본질적으로 동일한 서열을 인코딩하는 핵산을 가리킨다. 유전 암호의 소멸성으로 인해, 다수의 기능적으로 동일한 핵산이 어느 한 소정의 단백질을 인코딩한다. 예를 들면, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 인코딩한다. 따라서, 알라닌이 코돈으로 명시된 매 위체에서, 코돈은 인코딩된 폴리펩티드를 바꾸지 않고 기술된 상응하는 코돈 중 어느 하나로 바뀔 수 있다. 그러한 핵산 변이는 보존적으로 변형된 변이의 한 종류인 "조용한 변이"이다. 폴리펩티드를 인코딩하는 본 명세서의 모든 핵산 서열은 또한 핵산의 모든 가능한 조용한 변이를 기술한다. 당해 분야의 숙련가는 핵산 내 각각의 코돈(본래 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG, 및 본래 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG는 제외)이 기능적으로 동일한 분자를 얻도록 변형될 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산의 각각의 조용한 변이는 각각의 기술된 서열 내에 암시된다.
아미노산 서열에 있어서, 당해 분야의 숙련가는 인코딩된 서열에서 단일 아미노산 또는 아미노산의 소량 비율을 개조, 부가 또는 결실하는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질 서열에 대한 개별적인 치환, 결실 또는 부가가 "보존적으로 변형된 변이체"임을 인식할 것이며, 여기서 개조는 아미노산의 결실, 아미노산의 부가, 또는 아미노산의 화학적으로 유사한 아미노산으로의 치환을 생성한다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당해 분야의 숙련가에게 공지이다. 그러한 보존적으로 변형된 변이체는 본 발명의 다형체 변이체, 종간 동족체, 및 알릴에 더해지며 이들을 배제하지 않는다.
기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당해 분야의 숙련가에게 공지이다. 이하의 여덟 군은 각각 서로 보존적 치환으로 고려될 수 있는 아미노산을 내포한다:
알라닌 (A), 글리신 (G);
아스파르트산 (D), 글루탐산 (E);
아스파라긴 (N), 글루타민 (Q);
아르기닌 (R), 라이신 (K);
이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V);
페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W); 및
세린 (S), 트레오닌 (T);
(예컨대, Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2판(1993년 12월)을 참조하라).
둘 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 맥락에서, 용어 "동일한" 또는 백분율 "동일성"은 둘 이상의 서열 또는 하위서열이 동일함을 가리킨다. 이어지는 서열 비교 알고리즘(또는 당해 분야의 숙련가가 이용가능한 다른 알고리즘) 또는 수동 정렬 및 육안 검사 중 하나를 이용하여 측정된 비교 창, 또는 지정 영역에 대해 최대의 연관성으로 비교 및 정렬되었을 때 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 백분율이 동일한 경우(즉, 특정된 영역에 대해 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성) 서열은 "실질적으로 동일한" 또는 "실질적으로 유사하다". 이러한 정의는 또한 시험 서열의 보체를 가리킨다. 동일성은 적어도 약 50개 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이의 영역 위에서, 또는 75-100개 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이의 영역 위에서, 또는 특정되지 않는 경우에, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 전체 서열에 걸쳐 존재할 수 있다. 인간이 아닌 종으로부터의 동족체를 비롯하여, 본 명세서에 기술된 항원-결합 폴리펩티드 구조체의 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 엄격한 혼성화 조건 하에, 본 명세서에 기술된 항원-결합 폴리펩티드 구조체 또는 이의 단편을 갖는 표지된 탐침으로 라이브러리를 스크리닝하고, 그리고 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 내포하는 전장 cDNA와 유전체 클론을 단리하는 단계를 포함하는 공정에 의해 수득될 수 있다. 그러한 혼성화 기술은 당해 분야의 숙련가에게 널리 공지되어 있다.
백분율 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하기 위해 적절한 알고리즘의 예시는 BLAST™ 및 BLAST™ 2.0 알고리즘이고, 이들은 각각 Altschul 등 (Nuc. Acids Res. 25:3389-402, 1977), 및 Altschul 등 (J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990)에 기술되어 있다. BLAST™ 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생명공학 정보센터(National Center for Biotechnology Information, 인터넷에서 www.ncbi.nlm.nih.gov를 참조하라)를 통해 누구나 입수가능하다. 누적 점수는 뉴클레오티드 서열에 있어서, 척도 M(매칭되는 잔기의 쌍에 대한 리워드 점수; 항상 >0) 및 N (미스매치 잔기에 대한 페널티 점수; 항상 <0)를 이용하여 산출된다. 아미노산 서열에 있어서, 누적 점수를 산출하기 위해 채점표가 사용된다. 각 방향에서 단어 히트의 확장은 누적 정렬 점수가 이의 최대 달성된 수치로부터 양 X만큼 떨어지는 경우; 하나 이상의 음성-점수 잔기 정렬의 누적으로 인해 누적 점수가 제로 또는 그 아래로 떨어지는 경우; 또는 서열 중 어느 하나의 마지막에 도달한 경우에 중지된다. BLAST 알고리즘 척도 W, T, 및 X는 정렬의 감수성 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열의 경우)을 위한 알고리즘 척도의 예시는 11의 단어 길이(W), 10의 예상치(E), M=5, N=-4 및 두 가닥의 비교이다. 아미노산 서열에 있어서, BLASTP 프로그램을 위한 알고리즘 척도의 예시는 3의 단어 길이, 10의 예상치(E), 및 BLOSUM62 채점표(Henikoff 및 Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989을 참조)이다.
폴리펩티드의 유도체, 또는 변이체는 유도체 또는 변이체의 아미노산 서열이 본래의 펩티드로부터의 100개 아미노산 길이의 서열에 대해 적어도 50% 동일성을 가지는 경우 이 펩티드와 "상동성"을 공유하거나 "상동하다"고 부른다. 특정한 구체예에서, 유도체 또는 변이체는 유도체와 동일한 수의 아미노산 잔기를 가지는 펩티드 또는 펩티드의 단편과 적어도 75% 동일하다. 특정한 구체예에서, 유도체 또는 변이체는 유도체와 동일한 수의 아미노산 잔기를 가지는 펩티드 또는 펩티드의 단편과 적어도 85% 동일하다. 특정한 구체예에서, 유도체의 아미노산 서열은 유도체와 동일한 수의 아미노산 잔기를 가지는 펩티드 또는 펩티드의 단편과 적어도 90% 동일하다. 일부 구체예에서, 유도체의 아미노산 서열은 유도체와 동일한 수의 아미노산 잔기를 가지는 펩티드 또는 펩티드의 단편과 적어도 95% 동일하다. 특정한 구체예에서, 유도체 또는 변이체는 유도체와 동일한 수의 아미노산 잔기를 가지는 펩티드 또는 펩티드의 단편과 적어도 99% 동일하다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "단리된" 폴리펩티드 또는 구조체는 이의 자연적인 세포 배양 환경의 성분으로부터 확인되고 분리 및/또는 회수된 구조체 또는 폴리펩티드를 의미한다. 자연적인 환경의 오염 성분은 이종다합체의 진단적 또는 치료적 용도를 전형적으로 방해할 수 있는 물질이며, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다.
특정한 구체예에서, 본 명세서에서 사용된, "단리된" 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 자연적인 세포 배양 환경의 성분으로부터 확인되고 분리 및/또는 회수된 항원-결합 폴리펩티드 구조체를 설명한다. 예를 들면, 본 명세서에 기술된 단리된 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 자연적인 세포 배양 환경의 성분으로부터 확인되고 분리 및/또는 회수된 이종이합체 또는 이종이합체 쌍을 포함하는 이종이합체 쌍 또는 "단리된" 이종이합체 쌍을 포함한다. 자연적인 환경의 오염 성분은 이종이합체 또는 항원-결합 폴리펩티드 구조체의 진단적 또는 치료적 용도를 방해할 수 있는 물질이며, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다.
이종이합체 및 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 실질적인 동종성이 되도록 정제될 수 있다. 문구 "실질적으로 동종의", "실질적으로 동종인 형태" 및 "실질적인 동종성"은 올바르게 쌍을 형성한 산물에 원치않는 폴리펩티드 조합에서 유래한 부산물(예컨대 동종이합체 또는 오류쌍형성 이종이합체)이 실질적으로 없음을 나타내기 위해 사용된다. LCCA 설계 집합(H1L1L2)의 맥락에서, 올바르게 쌍을 형성한 산물은 H1 및 L1을 포함하는 이종이합체(H1L1)이다. LCCA 설계 집합(H2L1L2)의 맥락에서, 올바르게 쌍을 형성한 산물은 H2 및 L2을 포함하는 이종이합체(H2L2)이다. 구체예에서, H1, L1, H2, 및 L2이 발현되는 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체의 맥락에서, 올바르게 쌍을 형성한 산물은 올바르게 쌍을 형성한 H1L1 및 H2L2를 포함하는 이종이합체 쌍(H1L1H2L2)이다. 일부 구체예에서, H1, L1, H2, 및 L2이 발현되는 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체의 맥락에서, 올바르게 쌍을 형성한 산물은 적어도 하나의 Fab 영역에서 올바른 쌍 형성을 나타내는 추가적인 산물 가령, 예를 들면, H1L1H2L1 또는 H1L2H2L2을, 또는 "반쪽 항체"가 생산되는 경우에는, H1L1 또는 H2L2을 포함할 수 있다. 순도 측면에서 표현되는 경우, 한 구체예에서, 실질적인 동종성은 완전히 오류쌍형성된 부산물의 양이 혼합물에 존재하는 모든 종으로부터의 총 LC-MS 강도의 20%를 넘지 않음, 예를 들면 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 또는 0.5% 미만인 것을 의미하며, 여기서 백분율은 질량 분광 분석으로부터의 결과를 반영한다.
항체 기술 분야의 숙련가에게 이해되는 용어는 본 명세서에 달리 명시적으로 정의되지 않은 경우, 각각 당해 분야에 받아들여진 의미로 제공된다. 항체는 가변 영역, 경첩 부위, 및 불변 도메인을 가지는 것으로 공지이다. 면역글로불린 구조 및 기능은, 예를 들면, Harlow 등, Eds., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1988)에서 검토되어 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체" 및 "면역글로불린" 또는 "항원-결합 폴리펩티드 구조체"는 상호교환적으로 사용된다. "항원-결합 폴리펩티드 구조체"는 피분석물(항원)에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자, 또는 이들의 하나 이상의 단편에 의해 실질적으로 인코딩되는 폴리펩티드를 가리킨다. 확인된 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤 불변 영역 유전자, 뿐만 아니라 무수히 많은 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 경사슬은 카파 또는 람다 중 어느 하나로 분류된다. 중사슬은 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론로 분류되며, 이는 다시 각각 면역글로불린 이소형, IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE을 정의한다. 또한, 항체는 다수의 하위유형에 속할 수 있으며, 예를 들면, IgG는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 하위 클래스에 속할 수 있다.
예시적인 면역글로불린 (항체) 구조적 단위는 2쌍의 폴리펩티드 사슬로 구성되며, 각각의 쌍은 하나의 면역글로불린 "경"사슬(약 25 kD) 및 하나의 면역글로불린 "중"사슬(약 50-70 kD)을 가진다. 이러한 유형의 면역글로불린 또는 항체 구조적 단위는 "자연발생적"인 것으로 간주된다. 용어 "경사슬"은 결합 특이성을 부여하기에 충분한 가변 도메인 서열을 가지는 전장 경사슬 및 이의 단편을 포함한다. 전장 경사슬은 가변 도메인, VL, 및 불변 도메인, CL을 포함한다. 경사슬의 가변 도메인은 폴리펩티드의 아미노-말단에 있다. 경사슬은 카파 사슬 및 람다 사슬을 포함한다. 용어 "중사슬"은 결합 특이성을 부여하기에 충분한 가변 영역 서열을 가지는 전장 중사슬 및 이의 단편을 포함한다. 전장 중사슬은 가변 도메인, VH, 및 세 개의 불변 도메인, CH1, CH2, 및 CH3을 포함한다. VH 도메인은 폴리펩티드의 아미노-말단에 있고, CH 도메인은 카르복실-말단에 있으며, CH3가 폴리펩티드의 카르복시-말단에 가장 가까이 위치한다. 중사슬은 임의의 이소형, 가령 IgG(가령 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 하위클래스), IgA(가령 IgA1 및 IgA2 하위클래스), IgM, IgD 및 IgE일 수 있다. 용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 일반적으로 항원 인식을 담당하는 항체의 경사슬 및/또는 중사슬의 부분을 가리키며, 전형적으로 중사슬(VH) 내 대략 아미노-말단 120 내지 130개 아미노산 및 경사슬(VL) 내 약 100 내지 110개 아미노 말단 아미노산을 포함한다.
"상보성 결정부위" 또는 "CDR"은 항원-결합 특이성 및 친화성에 기여하는 아미노산 서열이다. "프레임워크" 영역(FR)은 항원-결합 영역 및 항원 사이의 결합을 촉진하는 CDR의 적절한 형태를 유지하는 것을 도울 수 있다. 구조적으로, 프레임워크 영역은 항체에서 CDR 사이에 위치할 수 있다. 가변 영역은 전형적으로 세 개의 초가변 영역, CDR과 이어진 비교적 보존된 프레임워크 영역(FR)의 동일한 일반 구조를 나타낸다. 각각의 쌍의의 두 사슬로부터의 CDR은 전형적으로 프레임워크 영역에 의해 정렬되어 특이적 에피토프에 결합할 수 있게 할 수 있다. N-말단에서 C-말단으로, 경사슬 및 중사슬 가변 영역은 둘다 전형적으로 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4를 포함한다. 각각의 도메인에의 아미노산의 배치는 달리 언급되지 않은 한 전형적으로 면역학적 관심의 단백질의 Kabat 서열의 정의에 따른다 (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 및 1991)).
＂다중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체＂ 또는 ＂다중특이적 항체＂는 하나 초과의 분명한 항원 또는 에피토프에 표적화 또는 결합한다. ＂이중특이적＂, ＂이중-특이적＂ 또는 ＂이관능성＂ 항원-결합 폴리펩티드 구조체 또는 항체는 두 가지 상이한 항원 또는 에피토프를 표적화 또는 결합하는 다중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체의 한 종류이다. 일반적으로, 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 두 개의 상이한 항원-결합 도메인을 가질 수 있다. 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체 또는 항체의 두 개의 항원-결합 도메인은 동일하거나 상이한 분자 표적 상에 존재할 수 있는 두 개의 상이한 에피토프에 결합할 것이다. 한 구체예에서, 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 자연발생적 형태로 되어 있다. 달리 말하면, 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 자연발생적 IgG, IgA, IgM, IgD, 또는 IgE 항체와 동일한 형태를 가진다.
항체 중사슬은 항체 경사슬과 쌍을 형성하고 하나 이상의 ＂접점＂에서 또다른 또다른 사슬과 만나거나 접촉한다. ＂접점＂은 제2 폴리펩티드의 하나 이상의 ＂접촉＂ 아미노산 잔기와 상호작용하는 제1 폴리펩티드의 하나 이상의 ＂접촉＂ 아미노산 잔기를 포함한다. 예를 들면, 접점은 이합체 Fc 영역의 두 개의 CH3 도메인 사이에, 중사슬의 CH1 도메인 및 경사슬의 CL 도메인 사이에, 및 중사슬의 VH 도메인 및 경사슬의 VL 도메인 사이에 존재한다. ＂접점＂은 IgG 항체로부터, 예를 들면, 인간 IgG1 항체로부터 유래할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 ＂아미노산 변형＂은 아미노산 삽입, 결실, 치환, 화학적 변형, 물리적 변형, 및 재배열을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
면역글로불린 중사슬 및 경사슬을 위한 아미노산 잔기는 Kabat (Kabat 및 Wu, 1991; Kabat 등, Sequences of proteins of immunological interest. 5판 - US Department of Health and Human Services, NIH 발행번호. 91-3242, p 647 (1991)에 기술된 것), IMGT (Lefranc, M.-P., 등. IMGT®, the international ImMunoGeneTics information system® Nucl. Acids Res, 37, D1006-D1012 (2009), 및 Lefranc, M.-P.,IMGT, the International ImMunoGeneTics Information System, Cold Spring Harb Protoc. 2011 Jun 1; 2011(6)에 제시된 것), 1JPT (Katja Faelber, Daniel Kirchhofer, Leonard Presta, Robert F Kelley, Yves A Muller, The 1.85 Å resolution crystal structures of tissue factor in complex with humanized fab d3h44 and of free humanized fab d3h44: revisiting the solvation of antigen combining sites1, Journal of Molecular Biology, Volume 313, Issue 1, Pages 83-97에 기술된 것), 및 EU (EU 항체의 번호를 언급하는 Kabat에서와 같은 EU 인덱스에 따른 것(Edelman 등, 1969, Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85))을 비롯한 몇몇 방법에 따라 번호가 매겨질 수 있다. Kabat 번호는 달리 지정되지 않는 한 본 명세서에서 VH, CH1, CL, 및 VL 도메인에 대해 사용된다. EU 번호는 달리 지정되지 않는 한 본 명세서에서 CH3 및 CH2 도메인, 및 경첩 부위에 대해 사용된다. 표 22A는 IMGT, Kabat, 1JPT, 및 EU 번호 시스템을 이용하여 IgG1 중사슬 폴리펩티드에서의 선택된 위치에 대한 아미노산 번호를 나타내는 대응표를 제공한다. 표 22B는 IMGT 및 Kabat 번호 시스템을 이용하여 람다 경사슬 폴리펩티드에서의 선택된 위치에 대한 아미노산 번호를 나타내는 대응표를 제공한다. 표 22C는 IMGT, 1JPT 및 Kabat 번호 시스템을 이용하여 카파 경사슬 폴리펩티드에서의 선택된 위치에 대한 아미노산 번호를 나타내는 대응표를 제공한다.
항원-결합 폴리펩티드 구조체
본 명세서에 기술된 항원-결합 폴리펩티드 구조체(즉 항체)는 다중특이적 또는 이중특이적일 수 있다. 다중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 제1 면역글로불린 중사슬 폴리펩티드 서열(H1) 및 제1 Fab 영역을 형성하는 면역글로불린 람다 경사슬 폴리펩티드 서열(L1)을 가지는 적어도 하나의 제1 이종이합체(H1L1) 및 면역글로불린 중사슬 폴리펩티드 서열(H2) 및 제2 Fab 영역을 형성하는 면역글로불린 카파 경사슬 폴리펩티드 서열(L2)을 가지는 적어도 하나의 제2 이종이합체(H2L2)를 포함할 수 있고, 여기서 H1 및 H2는 각각 서로 분명히 다르다. 한 구체예에서, 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 제1 면역글로불린 중사슬 폴리펩티드 서열(H1) 및 제1 Fab 영역을 형성하는 면역글로불린 람다 경사슬 폴리펩티드 서열(L1)을 가지는 제1 이종이합체(H1L1) 및 면역글로불린 중사슬 폴리펩티드 서열(H2) 및 제2 Fab 영역을 형성하는 면역글로불린 카파 경사슬 폴리펩티드 서열(L2)을 가지는 제2 이종이합체(H2L2)를 포함할 수 있고, 여기서 H1 및 H2는 각각 서로 분명히 다르다. 한 구체예에서, 각각의 이종이합체는 단일 Fab 영역을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 용어 ＂Fab 영역＂은 하나의 면역글로불린 경사슬 폴리펩티드 서열과 하나의 면역글로불린 중사슬 폴리펩티드 서열의 쌍 형성으로부터 생성된 영역을 가리키고, 면역글로불린 중사슬 폴리펩티드 서열의 VH 및 CH1 도메인, 및 면역글로불린 경사슬 폴리펩티드 서열의 VL 및 CL 도메인으로 이루어진다. 일부 구체예에서, 제1 Fab 영역은 제1 항원에 결합하고, 및 제2 Fab 영역은 제2 항원에 결합한다. 제1 및 제2 항원은 동일하거나 상이할 수 있다. 하나 이상의 면역글로불린 중사슬 및 경사슬은 동시-발현 또는 동시-생산된 경우 올바르게 쌍을 형성한 중사슬 및 경사슬의 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 변형을 포함할 수 있다.
항원-결합 폴리펩티드 구조체가 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체(즉 이중특이적 항체)인 경우, 이는 또한 ＂이종이합체 쌍＂으로 지칭될 수 있다.
예시의 목적을 위해, 항원-결합 폴리펩티드 구조체의 제1 이종이합체는 H1L1로 지칭되며, 면역글로불린 람다 경사슬 폴리펩티드 서열(L1)과 쌍을 형성한 제1 면역글로불린 중사슬 폴리펩티드 서열(H1)을 포함하고, 제2 이종이합체는 H2L2로 지칭되며 면역글로불린 카파 경사슬 폴리펩티드 서열(L2)과 쌍을 형성한 제2 면역글로불린 중사슬 폴리펩티드 서열(H2)을 포함한다. 그러나, 이러한 설계가 임의적이며 단지 한 이종이합체가 면역글로불린 카파 경사슬을 포함하고 다른 이종이합체가 면역글로불린 람다 경사슬을 포함한다는 것을 구체적으로 설명할 의도임이 이해되어야 한다. 제1 이종이합체의 Fab 영역인 H1L1은 또한 본 명세서에서 ＂람다 Fab＂으로 지칭될 수 있는 반면, 제2 이종이합체의 Fab 영역 H2L2은 또한 본 명세서에서 ＂카파 Fab＂으로 지칭될 수 있다.
모 항체
각각의 이종이합체의 ＂중사슬＂로도 비칭되는 면역글로불린 중사슬 폴리펩티드 서열, 및 ＂경사슬＂로도 지칭되는 면역글로불린 경사슬 폴리펩티드 서열은 하나 이상의 모 항체로부터 수득될 수 있고, 여기서 적어도 하나의 모 항체는 카파 경사슬을 포함하고, 적어도 하나의 다른 모 항체는 람다 경사슬을 포함하며, 및 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 변형은 이들 중사슬 및 경사슬 내로 조작된다. 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 변형이 결여된 모 면역글로불린 중사슬 및 면역글로불린 경사슬 서열은 야생형 면역글로불린 중사슬 폴리펩티드 서열, 야생형 면역글로불린 카파 경사슬 폴리펩티드 서열, 및 야생형 면역글로불린 람다 경사슬 폴리펩티드 서열로 지칭된다. 한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체의 이종이합체의 중사슬 및 경사슬은 두 가지 모 항체로부터 수득된다. 일반적으로, 두 가지 모 항체는 각각 서로 다르며; 그러나, 이것이 항상 필수적인 경우는 아니다. 한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 각각의 이종이합체는 상이한 모 항체로부터 수득되는 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체이다. 또다른 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 두 모 항체가 모두 동일한 항원에 결합하지만, 동일한 항원 상의 상이한 에피토프를 표적화하는 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체이다. 한 구체예에서, 적어도 하나의 모 항체는 단일특이적, 즉 단 하나의 에피토프에만 결합할 수 있다. 또다른 구체예에서, 적어도 하나의 모 항체는 하나 초과의 에피토프에 결합할 수 있다.
항원-결합 폴리펩티드 구조체의 각각의 이종이합체의 중사슬 및 경사슬은 쌍을 형성하여 이들이 유래한 모 항체와 동일한 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 영역을 형성한다. 예를 들면, 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체가 모 항체 CAT-2200(람다 경사슬을 내포하고, IL-17A에 결합함) 및 D3H44(카파 경사슬을 내포하고, 조직 인자에 결합함)를 바탕으로 제작된 경우, 하나의 이종이합체의 중사슬 및 경사슬은 쌍을 이뤄 IL-17A에 결합하는 Fab 영역을 형성할 것이고, 제2 이종이합체의 중사슬 및 경사슬은 쌍을 이뤄 조직 인자에 결합하는 Fab 영역을 형성할 것이다.
모 항체는 인간, 마우스, 래트, 토끼, 양, 소, 염소 또는 낙타를 비롯하지만, 이에 제한되지 않는 종으로부터 수득될 수 있다. 한 구체예에서, 모 항체는 인간 또는 마우스로부터 수득될 수 있다.
모 항체는 또한 표준 단클론 항체 생산 프로토콜, 가령 Kohler 및 Milstein (Nature, 256:495-497, 1975)에 기술된 바와 같은 내용을 이용하여 하이브리도마로부터 제조된 것들을 포함할 수 있다.
특정 표적에 결합하는 항체는 또한 수많은 상이한 전략, 가령 파지 전시, 시험관 내 전시, 및 다른 방법에 의해 확인될 수 있다. 이들 전략은 scFv 형태, Fab 형태 또는 전장 IgG 형태로 된 항체를 생성한다. 이들 전략의 검토는 William R. Strohl 및 Lila M. Strohl의 Therapeutic Antibody Engineering의 Chapter 4, Woodhead Publishing series in Biomedicine No 11, ISBN 1 907568 37 9, Oct 2012에 나와있다. 한 구체예에서, 모 항체는 파지 전시 또는 시험관 내 전시에 의해 확인된 항체를 포함한다. Fab 또는 전장 IgG 형태가 아닌 형태로 확인된 항체는 당해 분야에 공지된 바와 같이 전환될 수 있다. scFv를 Fab으로 전환하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다(예를 들면, Steinwand 등 Mabs 6: 204-218, 또는 Zuberbuhler 등 Protein Engineering, Design & Selection 22:169-174을 참조하라). 한 구체예에서, 본래 scFv로 확인되는 항체라도, scFv가 Fab 형태로 전환되고 통상적인 또는 자연발생적 항체의 형태로 조작된 경우에는 또한 모 항체로서 사용될 수 있다.
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체의 각각의 이종이합체의 중사슬 및 경사슬은 인간화된 항체인 모 항체로부터 수득될 수 있다. 인간화된 항체는 인간이 아닌 포유동물, 예를 들면, 마우스에서 유래한 항체의 상보성 결정부위(CDR)를 인간 항체의 CDR로 치환함으로써 수득될 수 있다. CDR을 확인하기 위한 방법은 당해 분야에 공지되어 있다(Kabat 등, Sequence of Proteins of Immunological Interest (1987), National Institute of Health, Bethesda, Md.; Chothia 등, Nature (1989) 342:877). 이러한 목적을 위해 적절한 일반 유전자 재조합 기술은 또한 공지되어 있다(유럽 특허 출원 공개 번호 EP 125023호; 및 WO 96/02576호를 참조하라). 예를 들면, 마우스 항체의 CDR은 공지된 방법으로 확인될 수 있고, CDR이 인간 항체의 프레임워크 영역(FR)과 결찰된 항체를 인코딩하도록 DNA가 제조될 수 있다. 인간화된 항체는 이후 통상적인 발현 벡터를 사용하는 시스템을 이용하여 생산될 수 있다. 그러한 DNA는 프라이머로서 CDR 및 FR 영역 둘다의 말단이 겹치는 부분을 포함하도록 설계된 몇몇 올리고뉴클레오티드를 이용하는 PCR에 의해 합성될 수 있다(WO 98/13388호에 기술된 방법 참조). CDR을 통해 연결된 인간 항체 FR은 CDR이 적절한 항원-결합 부위를 형성하도록 선택된다. 필요시, 항체 가변 영역의 FR 내 아미노산은 재형성된 인간 항체의 CDR이 적절한 항원-결합 도메인을 형성할 수 있도록 변형될 수 있다(Sato, K. 등, Cancer Res. (1993) 53:851-856). FR 내 변형가능한 아미노산 잔기는 비-공유 결합을 통해 항원에 직접 결합하는 부분(Amit 등, Science (1986) 233: 747-53), CDR 구조에 일부 영향을 주거나 끼치는 부분(Chothia 등, J. Mol. Biol. (1987) 196: 901-17), 및 VH 및 VL 사이의 상호작용에 관여하는 부분(EP 239400)을 포함한다.
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체의 각각의 이종이합체의 중사슬 및 경사슬은 키메라 항체인 모 항체로부터 수득될 수 있다. 키메라 항체는 상이한 동물로부터 유래한 서열을 조합하여 제조된 항체이다. 예를 들면, 키메라 항체는 마우스 항체로부터의 중사슬 및 경사슬 가변 도메인을 인간 항체로부터의 중사슬 및 경사슬 불변 도메인과 조합하여 제조될 수 있다. 키메라 항체는 공지의 방법에 의해 제조될 수 있다. 그러한 키메라 항체를 얻기 위해, 예를 들면, 항체 가변 도메인을 인코딩하는 DNA가 인간 항체 불변 도메인을 인코딩하는 핵산에 결찰될 수 있고; 생성된 결찰 산물은 발현 벡터에 삽입될 수 있고; 구조체가 숙주 세포에 도입되어 키메라 항체를 생산할 수 있다.
이종이합체의 중사슬 및 경사슬은 당해 분야에 공지된 수많은 모 항체로부터 수득될 수 있다. 대부분의 항체는 모 항체로서 기능할 수 있지만, 단서로서 이들이 면역글로불린 경사슬 폴리펩티드 서열과 쌍을 형성하여 항원에 결합하는 Fab 영역을 형성하는 면역글로불린 중사슬 폴리펩티드 서열을 포함해야 한다. 한 구체예에서, 적어도 하나의 모 항체는 치료적 항체 즉 질환을 치료하기 위해 사용되는 항체이다. 카파 경사슬 및 이들이 결합하는 항원을 포함하는 적절한 치료적 항체의 비-제한적인 예시가 하기 표 A에서 확인된다:
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
람다 경사슬 및 이들이 결합하는 항원을 포함하는 적절한 치료적 항체의 비-제한적인 예시가 하기 표 B에서 확인된다:
Figure pct00010
면역글로불린 하위클래스
모 항체의 면역글로불린 중사슬은 다음 클래스에 속한다: IgA1, IgA2, IgM, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4. 한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체의 제1 및 제2 이종이합체는 IgG 중사슬을 포함한다. 한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체의 제1 및 제2 이종이합체는 IgG1 중사슬을 포함한다. 모 항체의 면역글로불린 경사슬은 카파 경사슬 또는 람다 경사슬이다.
본 명세서에 기술된 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 면역글로불린 중사슬 폴리펩티드 서열 및 면역글로불린 카파 경사슬 폴리펩티드 서열을 가지는 적어도 하나의 이종이합체, 및 면역글로불린 중사슬 폴리펩티드 서열 및 면역글로불린 람다 경사슬 폴리펩티드 서열을 가지는 적어도 또다른 이종이합체를 포함한다. 한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 IgG 중사슬 폴리펩티드 서열 및 면역글로불린 카파 경사슬 폴리펩티드 서열을 가지는 하나의 이종이합체, 및 IgG 중사슬 폴리펩티드 서열 및 면역글로불린 람다 경사슬 폴리펩티드 서열을 가지는 또다른 이종이합체를 포함한다.
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 VH 도메인 생식계열 군 IGHV1, IGHV2, IGHV3, IGHV4, IGHV5, IGHV6 또는 IGHV7로부터 선택된 VH 도메인을 갖는 중사슬을 가지는 이종이합체를 포함한다. 한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 생식계열 하위군 IGHV3으로부터의 VH 도메인을 갖는 중사슬을 가지는 이종이합체를 포함한다. 또다른 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 J 분절 생식계열 유전자 IGHJ1, IGHJ2, IGHJ3, IGHJ4, IGHJ5, 또는 IGHJ6로부터 선택된 J 분절을 갖는 중사슬을 가지는 이종이합체를 포함한다. 또다른 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 생식계열 하위군 IGHJ4으로부터의 J 분절을 갖는 중사슬을 가지는 이종이합체를 포함한다. 한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 CH1 도메인 생식계열 하위군 IGHG1, IGHG2, IGHG3, 또는 IGHG4로부터 선택된 CH1 도메인을 갖는 중사슬을 가지는 이종이합체를 포함한다. 한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 생식계열 하위군 IGHG1으로부터의 CH1 도메인을 갖는 중사슬을 가지는 이종이합체를 포함한다.
람다 경사슬 폴리펩티드 서열을 포함하는 이종이합체에 있어서, 람다 경사슬은 생식계열 유전자 IGLC1, IGLC2, IGLC3, IGLC6, 또는 IGLC7로부터 선택된 CL-람다 도메인을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 생식계열 하위군 IGLC2로부터 CL-람다 도메인을 포함하는 람다 경사슬을 가지는 이종이합체를 포함한다. 람다 경사슬은 생식계열 하위군 IGLV1, IGLV2, IGLV3, IGLV4, IGLV5, IGLV6, IGLV7, IGLV8, IGLV9, IGLV10 또는 IGLV11로부터 선택된 VL-람다 도메인을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 생식계열 하위군 IGLV6로부터 VL-람다 도메인을 갖는 람다 경사슬을 가지는 이종이합체를 포함한다. 또다른 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 J 분절 생식계열 유전자 IGLJ1, IGLJ2, IGLJ3, IGLJ6 또는 IGLJ7로부터 선택된 람다 J 분절을 갖는 람다 경사슬을 가지는 이종이합체를 포함한다. 또다른 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 생식계열 하위군 IGLJ2로부터의 람다 J 분절을 갖는 중사슬을 가지는 이종이합체를 포함한다.
카파 경사슬 폴리펩티드 서열을 포함하는 이종이합체에 있어서, 카파 경사슬은 CL 생식계열 알릴 IGKC*01, IGKC*02, IGKC*03, IGKC*04, 또는 IGKC*05로부터 선택된 CL-카파 도메인을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 생식계열 하위군 IGKC*01로부터 CL-카파 도메인을 포함하는 카파 경사슬을 가지는 이종이합체를 포함한다. 카파 경사슬은 생식계열 하위군 IGKV1, IGKV1D, IGKV2, IGKV3, IGKV4, IGKV5, 또는 IGKV6로부터 선택된 VL-카파 도메인을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 생식계열 하위군 IGKV1로부터 VL-카파 도메인을 갖는 카파 경사슬을 가지는 이종이합체를 포함한다. 또다른 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 J 분절 생식계열 유전자 IGKJ1, IGKJ2, IGKJ3, IGKJ4 또는 IGKJ5로부터 선택된 J 분절을 갖는 카파 경사슬을 가지는 이종이합체를 포함한다. 또다른 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 생식계열 하위군 IGKJ1 또는 IGKJ2로부터의 J 분절을 갖는 카파 경사슬을 가지는 이종이합체를 포함한다.
면역글로불린 중사슬은 전형적으로 적어도 하나의 가변(VH) 도메인, 및 세 개의 불변 도메인, CH1, CH2, 및 CH3을 포함한다. 한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체의 제1 이종이합체 및 제2 이종이합체의 각각의 중사슬은 VH 도메인, CH1 도메인, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함한다. 또다른 구체예에서, 제1 이종이합체 및 제2 이종이합체의 각각의 중사슬은 VH 도메인, CH1 도메인, 및 CH3 도메인을 포함한다. 또다른 구체예에서, 제1 이종이합체 및 제2 이종이합체의 각각의 중사슬은 VH 도메인 및 CH1 도메인을 포함한다. 면역글로불린 경사슬은 전형적으로 하나의 가변(VL) 도메인 및 하나의 불변(CL) 도메인을 포함한다. 한 구체예에서, 각각의 이종이합체의 경사슬은 VL 도메인 및 CL 도메인을 포함한다.
상기 나타난 바와 같이, 일부 구체예에서, 각각의 이종이합체의 면역글로불린 중사슬 폴리펩티드 서열 및 면역글로불린 경사슬 폴리펩티드 서열은 공지의 치료적 항체, 또는 다양한 표적 분자 또는 암 항원에 결합하는 항체로부터 수득될 수 있다. 수많은 그러한 분자의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 쉽게 입수가능하다(예를 들면, 유전자은행 등록번호: AJ308087.1 (인간화된 항-인간 조직 인자 항체 D3H44 경사슬 가변 영역 및 CL 도메인); 유전자은행 등록번호: AJ308086.1 (인간화된 항-인간 조직 인자 항체 D3H44 중사슬 가변 영역 및 CH1 도메인); 유전자은행 등록번호: HC359025.1 (페르투주맙 Fab 경사슬 유전자 모듈); 유전자은행 등록번호: HC359024.1 (페르투주맙 Fab 중사슬 유전자 모듈); 유전자은행 등록번호: GM685465.1 (항체 트라스투주맙 (= 헤르셉틴) - 야생형; 경사슬); 유전자은행 등록번호: GM685463.1 (항체 트라스투주맙 (= 헤르셉틴) - 야생형; 중사슬); 유전자은행 등록번호: GM685466.1 (항체 트라스투주맙 (= 헤르셉틴) - GC-최적화 경사슬); 및 유전자은행 등록번호: GM685464.1 (항체 트라스투주맙 (= 헤르셉틴) - GC-최적화 중사슬을 참조하라. 상기 기술된 각각의 폴리펩티드의 서열은 2012년 11월 28일자로 NCBI 웹사이트에서 입수가능하며 각각 모든 목적에 있어서 그 전체가 참고로서 포함된다. 세툭시맙에 대한 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 또한 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들면 캐나다 보건 연구소(Canadian Institutes of Health Research), 알버타 이노베이츠 - 보건 솔루션(Alberta Innovates - Health Solutions), 및 메타볼로믹스 이노베이션 센터(The Metabolomics Innovation Centre, TMIC)로부터 지원받는 약물 뱅크 웹사이트, 등록번호 DB00002를 참조하라.
우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 변형
하나 이상의 중사슬 및 경사슬 H1, L1, H2, 및 L2는 모 항체의 중사슬 및 경사슬 내로 조작된 중사슬 및 경사슬 사이에 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 변형을 포함한다. 한 구체예에서, 중사슬 및 경사슬 H1, L1, H2, 및 L2 중 두 개는 중사슬 및 경사슬 사이에 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 변형을 포함한다. 구체예에서, 중사슬 및 경사슬 H1, L1, H2, 및 L2 중 세 개는 중사슬 및 경사슬 사이에 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 변형을 포함한다.
일부 구체예에서, 아미노산 변형은 변형된 아미노산 위치가 H1 및 H2 사이, 및 L1 및 L2 사이에 상이한 점에서 비대칭일 수 있다.
한 구체예에서, H2 및 L2는 중사슬 및 경사슬 사이에 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 변형을 포함하는 반면, H1 및 L1은 포함하지 않는다. 한 구체예에서, H1, L1, 및 H2는 중사슬 및 경사슬 사이에 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 변형을 포함하는 반면, L2는 포함하지 않는다. 한 구체예에서, H1, H2, 및 L2는 중사슬 및 경사슬 사이에 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 변형을 포함하는 반면, L1은 포함하지 않는다. 한 구체예에서, L1, H2, 및 L2는 중사슬 및 경사슬 사이에 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 변형을 포함하는 반면, H1은 포함하지 않는다.
한 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 변형은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 아미노산 변형은 H1 또는 H2가 L1 및 L2와 동시-발현되거나, H1, L1, H2, 및 L2가 동시-발현되는 경우에 H1과 L1 및 H2와 L2의 우선적 쌍 형성을 촉진한다. 상기 나타난 바와 같이, 예시의 목적을 위해, 항원-결합 폴리펩티드 구조체의 이종이합체는 하기와 같이 확인될 것이다: H1L1 이종이합체는 람다 경사슬 L1을 포함하고, H2L2 이종이합체는 카파 경사슬 L2를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 ＂Mab 설계＂ 또는 ＂Mab 설계 집합＂은 H1, L1, H2 및 L2의 하나의 집합으로 존재하며, 또한 H1L1H2L2로서 확인된 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 변형의 특정한 집합을 가리킨다. 우선적 쌍 형성을 촉진하는 하나 이상의 H1, L1, H2, 및 L2 내 아미노산 변형은 Mab 설계 또는 Mab 설계 집합(즉 H1L1H2L2)으로 언급되고 표시된다. Mab 설계 집합은 쌍 형성 특이성의 강도를 결정하기 위해 우선 LCCA 설계 집합(즉. H1L1L2 또는 H2L1L2)으로서 시험되며, 여기서 H1 및 H2는 개별적으로 L1 및 L2와 동시-발현된다.
한 구체예에서, 아미노산 변형은 경사슬 및 중사슬 사이의 접점의 일부인 하나 이상의 아미노산에 만들어질 수 있다. 한 구체예에서, 면역글로불린 중사슬 폴리펩티드 서열 및 면역글로불린 경사슬 폴리펩티드 서열 내에 도입된 아미노산 변형은 각각 서로 상보적이다. 중사슬 및 경사슬 접점에서의 상보성은 입체 및 소수성 접촉, 정전/전하 상호작용 또는 이들의 조합 및 다양한 다른 상호작용을 기초로 하여 성취될 수 있다. 단백질 표면 사이의 상보성은 문헌에서 자물쇠와 열쇠 정합, 단추와 구멍(knob into hole), 돌출부 및 공동, 공여자 및 수용자 등, 모두 두 개의 상호작용 표면 사이의 구조적 및 화학적 매칭을 암시하는 내용으로 보편적으로 기술되어 있다. 한 구체예에서, 적어도 하나의 이종이합체는 면역글로불린 중사슬 및 면역글로불린 경사슬 내에 도입되어 접점에서 경사슬 및 중사슬을 가로질러 신규한 수소 결합을 도입하는 아미노산 변형을 포함한다. 한 구체예에서, 적어도 하나의 이종이합체는 면역글로불린 중사슬 및 면역글로불린 경사슬 내에 도입되어 접점에서 경사슬 및 중사슬을 가로질러 신규한 염 가교를 도입하는 아미노산 변형을 포함한다.
한 구체예에서, Mab 설계 집합의 아미노산 변형은 주로 정전적 인력 및 척력을 통한 우선적 쌍 형성을 촉진한다. 한 구체예에서, Mab 설계 집합의 아미노산 변형은 주로 입체 메커니즘을 통한 우선적 쌍 형성을 촉진한다. 그러한 Mab 설계가 표 4A, 4B, 7A 및 7B에 포함되며, 선택된 예시는 고유한 식별인자 10771-11335, 10771-11360, 10780-11417를 가지는 것들을 포함한다. 한 구체예에서 Mab 설계 집합의 아미노산 변형은 입체 및 정전 메커니즘 모두를 이용하는 우선적 쌍 형성을 촉진한다.
한 구체예에서, 하나 이상의 H1, L1, H2, 및 L2는 H1 및 L1이 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 변형을 포함하지 않고 H2 및 L2가 각각 우선적 쌍 형성을 촉진하는 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하는 아미노산 변형을 포함한다. 한 구체예에서, 하나 이상의 H1, L1, H2, 및 L2는 하나 이상의 H1, L1, 및 H2가 우선적 쌍 형성을 촉진하는 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하고, L2가 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 변형을 포함하지 않는 아미노산 변형을 포함한다. 한 구체예에서, 하나 이상의 H1, L1, H2, 및 L2는 하나 이상의 H1, L1, 및 L2가 우선적 쌍 형성을 촉진하는 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하고, H2가 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 변형을 포함하지 않는 아미노산 변형을 포함한다. 한 구체예에서, 하나 이상의 H1, L1, H2, 및 L2는 하나 이상의 H1, H2, 및 L2가 우선적 쌍 형성을 촉진하는 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하고, L1이 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 변형을 포함하지 않는 아미노산 변형을 포함한다. 한 구체예에서, 하나 이상의 H1, L1, H2, 및 L2는 하나 이상의 L1, H2, 및 L2가 우선적 쌍 형성을 촉진하는 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하고, H1이 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 변형을 포함하지 않는 아미노산 변형을 포함한다. 한 구체예에서, 하나 이상의 H1, L1, H2, 및 L2는 각각의 L1, H2, 및 L2가 우선적 쌍 형성을 촉진하는 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하는 아미노산 변형을 포함한다.
아미노산 변형은 하나 이상의 H1, L1, H2, 및 L2의 불변 도메인 및/또는 가변 도메인 내에 있을 수 있다. 한 구체예에서, 아미노산 변형은 H1 및 H2의 CH1 도메인, L1의 CL-람다 도메인 및 L2의 CL-카파 도메인 내에 있을 수 있다. 또다른 구체예에서, 아미노산 변형은 H1 및 H2의 CH1 및 VH 도메인, L1의 CL-람다 및 VL-람다 도메인 및 L2의 CL-카파 및 VL-카파 도메인 내에 있을 수 있다. 또다른 구체예에서, 아미노산 변형은 H1 및 H2의 VH 도메인, L1의 VL-람다 도메인 및 L2의 VL-카파 도메인 내에 있을 수 있다.
한 구체예에서, 아미노산 변형은 하나 이상의 H1, L1, H2 및 L2의 프레임워크 영역 내에 있을 수 있다. 한 구체예에서 아미노산 변형은 잔기의 Kabat 번호로 표시된 바와 같이 가변(VH, VL) 및 불변(CH1, CL) 도메인의 보존된 프레임워크 잔기에 제한된다. 예를 들면, Almagro [Frontiers In Bioscience (2008) 13: 1619-1633]는 Kabat, Chotia, 및 IMGT 번호 방식을 기초로 프레임워크 잔기의 정의를 제공한다.
각각의 Mab 설계 또는 Mab 설계 집합 내 아미노산 변형의 수는 달라질 수 있다. 한 구체예에서, H1은 0 내지 8개의 아미노산 변형, 0 내지 7개의 아미노산 변형, 0 내지 6개의 아미노산 변형, 0 내지 5개의 아미노산 변형, 0 내지 4개의 아미노산 변형, 0 내지 3개의 아미노산 변형, 0 내지 2개의 아미노산 변형, 하나의 아미노산 변형, 또는 무 아미노산 변형을 포함한다. 한 구체예에서, L1은 0 내지 8개의 아미노산 변형, 0 내지 7개의 아미노산 변형, 0 내지 6개의 아미노산 변형, 0 내지 5개의 아미노산 변형, 0 내지 4개의 아미노산 변형, 0 내지 3개의 아미노산 변형, 0 내지 2개의 아미노산 변형, 하나의 아미노산 변형, 또는 무 아미노산 변형을 포함한다. 한 구체예에서, H2는 0 내지 8개의 아미노산 변형, 0 내지 7개의 아미노산 변형, 0 내지 6개의 아미노산 변형, 0 내지 5개의 아미노산 변형, 0 내지 4개의 아미노산 변형, 0 내지 3개의 아미노산 변형, 0 내지 2개의 아미노산 변형, 하나의 아미노산 변형, 또는 무 아미노산 변형을 포함한다. 한 구체예에서, L2는 0 내지 8개의 아미노산 변형, 0 내지 7개의 아미노산 변형, 0 내지 6개의 아미노산 변형, 0 내지 5개의 아미노산 변형, 0 내지 4개의 아미노산 변형, 0 내지 3개의 아미노산 변형, 0 내지 2개의 아미노산 변형, 하나의 아미노산 변형, 또는 무 아미노산 변형을 포함한다.
한 구체예에서, H1, L1, H2, 및 L2 내 아미노산 변형의 총 수는 20개 미만, 15개 미만, 12개 미만, 11개 미만, 10개 미만, 9개 미만, 8개 미만, 7개 미만, 6개 미만, 5개 미만, 4개 미만, 또는 3개 미만이다. 한 구체예에서, H1, L1, H2, 및 L2 내 아미노산 변형의 총 수는 2이다.
한 구체예에서, 아미노산 변형은 카파-람다 시스템에 대해 특정하게 설계될 수 있고, 여기서 하나의 모 항체는 카파 경사슬 폴리펩티드 서열을 포함하고, 하나의 모 항체는 람다 경사슬 폴리펩티드 서열을 포함한다. 그러한 아미노산 변형 또는 설계는 본 명세서에서 K-L 설계로 지칭된다. 그러한 아미노산 변형 또는 K-L 설계의 예시는 표 4A, 표 7A, 및 표 10-A1 내지 10-A12에 나타난다.
또다른 구체예에서, 아미노산 변형은 카파-카파 시스템(K-K 설계)과 관련하여 초기에 확인될 수 있고, 여기서 모 항체는 둘다 카파 경사슬 폴리펩티드 서열을 포함하고, 나중에 카파-람다 시스템으로 변화된다. 당해 분야의 숙련가는 이들 설계가 어떻게 카파-람다 시스템으로 변할 수 있는지 이해할 것이다. 예를 들면, 카파 및 람다 모 항체의 중사슬 및 경사슬은 정렬되어 K-K 설계에 상응하는 균등한 람다 경사슬 위치를 결정할 수 있다. 균등한 람다 경사슬 위치는 이후 K-K 설계에 순응하도록 변형될 수 있다. 그러한 아미노산 변형 또는 설계는 본 명세서에서 K-K-유래 K-L 설계로 지칭되며, 다음 군에 속할 수 있다: a) 설계에 변화가 필요없는 경우, 및 카파-카파 시스템에서 변형된 아미노산 잔기는 카파-람다 시스템에서 변형된 것과 동일하다; b) 조용한 변형을 내포하는 경우, 여기서 카파-카파 시스템에 만들어진 적어도 하나의 변형은 람다 경사슬 폴리펩티드 서열 내에 그러한 변형이 자연적으로 존재하기 때문에 카파-람다 시스템에서 불필요하다; c) 카파 경사슬 폴리펩티드 서열 및 람다 경사슬 폴리펩티드 서열 내 동일한 상대 위치에서 적어도 하나의 아미노산 잔기에 대한 아미노산 변형을 내포하는 경우, 그러나 여기서 해당 위치의 초기 아미노산 잔기는 카파 및 람다 경사슬 폴리펩티드 서열 사이에서 상이하여, 그 위치에 동일한 아미노산 변형을 생성한다, 및 d) 카파-카파 시스템과 비교할 때 카파-람다 시스템 내에 적어도 하나의 추가적인 아미노산 변형을 내포하는 경우. 그러한 K-K-유래 K-L 설계의 예시는 표 4B, 표 7B, 및 표 10-B1 내지 10-B10에 제공된다. 군 a)의 구체적인 예시는 표 4B에서 별표로 표시된다. 군 b)의 구체적인 예시는 고유한 식별인자 10689-10707을 가지는 Mab 설계 집합으로 입증된다. 조용한 변형은 L1 내에 있다(Q160E는 위치 160의 잔기로서 람다 내 WT에서 부재하고 E이고 Q가 아니다). 군 c)의 구체적인 예시는 고유한 식별인자 10652-10734을 가지는 Mab 설계 집합으로 입증되며, 여기서 L1 아미노산 124가 WT 람다에서 E이고 WT 카파에서 Q이다. 군 d)의 구체적인 예시는 고유한 식별인자 10684-10706을 가지는 Mab 설계 집합으로 입증되고, 이는 아미노산 변형 K129T를 포함한다.
한 구체예에서, 하나 이상의 H1, L1, H2, 및 L2는 H1의 L2보다 L1와의 및 H2의 L1보다 L2와의 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 변형을 포함하고, 여기서 아미노산 변형은 표 4A, 표 4B, 표 7A, 표 7B, 표 10-A1 내지 10-A12, 및 표 10-B1 내지 10-B10에 제공된 Mab 설계 집합의 보존적 아미노산 치환을 포함한다.
한 구체예에서, 아미노산 변형은 신규한 시스테인 잔기를 도입하지 않고 동일한 설계를 갖는 면역글로불린 중사슬 또는 면역글로불린 경사슬 내에서 자연발생적 시스테인 잔기를 제거하지 않는다.
우선적 쌍 형성을 촉진하는 H1, L1, H2 및 L2 내 아미노산 변형의 조합은 일반적으로 설계로 지칭된다. 설계는 더 상세하게는 "LCCA 설계"(H1, L1, L2 또는 H2, L1, L2의 맥락에서) 또는 "Mab 설계"(H1, L1, H2, L2의 맥락에서)로 지칭될 수 있다. 전형적으로, LCCA 설계는 요망되는 이중특이적 항체의 각각의 중사슬에 기반한 하나 이상의 특이적 상보적 LCCA 설계로 조작되고 따라서 전형적으로 이중특이적 항체의 모든 네 가지 폴리펩티드 사슬 내 아미노산 변형이 확인된 형태로 제시된다(예를 들면, 표 4A 및 4B를 참조). 특이적 아미노산 치환이 전체적으로 확인될 수 있음에도 불구하고, 각각의 아미노산 위치의 보존적 치환이 또한 고려될 수 있음이 이해되어야 한다.
게다가, 예시의 목적을 위해, 달리 지정되지 않는 한 H1L1 이종이합체는 람다 경사슬을 포함하는 이종이합체를 나타내고, H2L2 이종이합체는 카파 경사슬을 포함하는 이종이합체를 나타낸다. 마지막으로, 모든 아미노산 잔기 또는 위치는 달리 지정되지 않는 한 Kabat 번호 시스템에 따라 번호가 매겨진다.
설계는 우선적 쌍 형성을 촉진하는 상보적 아미노산 치환의 추진 집합을 포함하고, 및 또한 이차 치환을 포함할 수 있다. 이차 치환은 추진 집합의 성능을 최적화하도록 작용할 수 있다.
하나 이상의 추진 집합이 우선적 쌍 형성을 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 이들 추진 집합은 우선적 쌍 형성을 촉진하기 위해 개별적으로, 또는 조합으로 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 추진 집합은 정전 인력 및 척력이 우선적 쌍 형성을 촉진하는 주된 인자로 예상되는 정전적 추진 집합이다. 예를 들면, H1이 아미노산 치환 186 K를 포함하고, L1이 아미노산 치환 133D를 포함하고, H2는 아미노산 치환 188D를 포함하고, 및 L2는 아미노산 치환 131 K를 포함하는 설계는 정전 메커니즘에 의해 우선적 쌍 형성을 촉진할 수 있다. 정전 추진의 수많은 다른 예시가 실시예 전반에 나타난다. 한 구체예에서, 하나 이상의 정전 추진 집합이 표 C에서 확인되는 것들 중에서 선택될 수 있다:
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
한 구체예에서, 추진 집합은 오류쌍형성된 이종이합체에서 이황화 결합을 형성하지 못하도록 작용할 수 있는 이황화물 조종 추진 집합이다. 이러한 유형의 추진 집합의 예시는 H1 내125R, L1 내 122D, H2 내 228D, 및 L2 내 121K를 포함할 수 있다.
한 구체예에서 추진 집합은 올바르게 쌍을 형성한 이종이합체 사이의 상보적 상호작용 및 오류쌍형성된 이종이합체 사이의 입체적 부적합성을 입체적으로 촉진하도록 작용할 수 있는 입체 추진 집합일 수 있다. 입체 추진 집합의 비-제한적인 예시가 표 D에 나타나며, 여기서 "-"는 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 치환이 존재하지 않음을 나타낸다.
Figure pct00016
한 구체예에서, 추진 집합은 가변 설계 추진 집합이다. 그러한 가변 설계 추진 집합은 우선적 쌍 형성을 촉진하는 카파 및/또는 람다 Fab의 가변 도메인 내에 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 한 구체예에서, 가변 설계 추진 집합은 입체 메커니즘을 기초하여 우선적 쌍 형성을 촉진한다. 한 구체예에서, 가변 설계 추진 집합은 정전 메커니즘을 기초하여 우선적 쌍 형성을 촉진한다. 가변 설계 추진 집합의 비-제한적인 예시가 표 E에 나타나며, 여기서 "-"는 해당 폴리펩티드 내에 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 변형이 존재하지 않음을 나타낸다.
Figure pct00017
한 구체예에서, 하나 이상의 비-자연발생적 이황화물 결합이 항원-결합 폴리펩티드 구조체의 이종이합체의 하나 또는 둘다 내에 조작될 수 있다. 이러한 유형의 아미노산 변형의 한 예시는 중사슬이 카파 경사슬 내 124C 치환과 쌍을 형성한 122C 치환을 포함한 것이다.
설계의 쌍 형성 성능을 최적화하기 위해 이차 치환이 설계 내에 포함될 수 있다. 예를 들면, 이차 치환은 A) 중사슬 및 올바르게 쌍을 형성한 경사슬 사이의 접촉 수를 최적화, B) 추진에 기여하는 환경을 제공, C) 추진 집합을 위한 수소 결합 네트워크를 최적화, 또는 D) 추진을 위한 입체 여건을 제공하도록 작용할 수 있다. 이러한 유형의 이차 치환의 비-제한적인 예시가 표 F에 나타나며, 여기서 "Lk"는 카파 경사슬 특이적 치환을 나타내고, "Ll"은 람다 경사슬 특이적 치환을 나타낸다. "L"은 카파 또는 람다 경사슬 중 하나의 경사슬 특이적 치환을 나타내고, "H"는 중사슬 특이적 치환을 나타낸다.
Figure pct00018
항원-결합 폴리펩티드 구조체는 상기 기술된 추진 집합 및 이차 치환에 상응하는 아미노산 변형의 서로다른 조합으로 조작될 수 있다. 공통된 특징을 기초로 집단으로 군을 나눈 그러한 조합의 비-제한적인 특이적 예시가 이하에 기술된다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 단일 사슬 내의 복수의 위치의 아미노산 변형의 조합이 변형된 각각의 위치 사이에 "_"를 이용하여 확인된다. 예를 들면, "124_186"은 위치 124 및 186 둘다가 언급된 폴리펩티드 사슬 내에서 변형된 것을 가리킨다. 유사하게, "124_133_180"은 위치 124, 133, 및 180 모두가 언급된 폴리펩티드 사슬 내에서 변형된 것을 가리킨다.
K-L 집단 1:
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 1에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서:
H1은 위치 143에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 131에 아미노산 치환을 포함하고; 및
a) H2는 위치 188 또는 124_186에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 176_178 또는 176_180 또는 131에 아미노산 치환을 포함하고; 또는
b) H2는 위치 143 또는 186에 아미노산 치환을 포함하고; L2는 위치 124_133 또는 124_133_180에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, H1은 추가로 하나 이상의 위치 125, 145 및 179에 아미노산 치환을 포함하고, L1은 추가로 하나 이상의 위치 122, 124, 및 133에 아미노산 치환을 포함하고, H2는 추가로 위치 228에 아미노산 치환을 포함하고, 및/또는 L2는 추가로 위치 121에 아미노산 치환을 포함한다.
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 1에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서: H1은 위치 125_143_145에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 122_124_131에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 228에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 121_133에 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, H1은 추가로 위치 179에 아미노산 치환을 포함하고, L1은 추가로 위치 133에 아미노산 치환을 포함하고, H2는 추가로 하나 이상의 위치 124, 143, 186, 및 188에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 추가로 하나 이상의 위치 124, 131, 176, 178, 및 180에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 1에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서 H1은 위치 125_143_145, 또는 125_143_145_179에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치에 아미노산 치환을 포함하고 122_124_131, 또는 122_124_131_133; H2는 위치 124_186_228, 143_228, 143_186_228, 186_228, 또는 188_228에 아미노산 치환을 포함하고, 및 L2는 위치 121_124_133, 121_124_133_180, 121_131_133_178, 121_133_176_178, 또는 121_133_176_180에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 1에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서 H1 내 아미노산 치환은 125R, 145T, 143D, 143E, 179E, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택되고; L1 내 아미노산 치환은 124Q, 122D, 131K, 131R, 133S, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택되고; H2 내 아미노산 치환은 228D, 124R, 1431, 143R, 186K, 186R, 188K, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택되고; L2 내 아미노산 치환은 124E, 121K, 131D, 176D, 178E, 178F, 180D, 180E, 133D, 133G, 133I, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 1에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하는 H1L1 이종이합체를 가지며, 여기서 H1L1 이종이합체는 다음의 아미노산 치환의 집합 중 하나를 포함한다:
Figure pct00019
한 구체예에서, H1은 125R_143E_145T_179E를 포함하고 L1은 122D_124Q_131R을 포함한다. 또다른 구체예에서, H1은 125R_143E_145T를 포함하고 L1은 122D_124Q_131R을 포함한다. 추가의 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 1에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하는 H2L2 이종이합체를 가지며, 여기서 H2L2 이종이합체는 다음의 아미노산 치환의 집합 중 하나를 포함한다:
Figure pct00020
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 하나의 H1L1 이종이합체와 하나의 H2L2 이종이합체의 조합을 포함한다. 한 구체예에서, H1은 125R_143E_145T_179E를 포함하고, L1은 122D_124Q_131R을 포함하고, H2는 188K_228D를 포함하고, L2는 121K_133I_176D_178E를 포함한다. 또다른 구체예에서, H1은 125R_143D_145T를 포함하고, L1은 122D_124Q_131R를 포함하고, H2는 143R_228D를 포함하고, L2는 121K_124E_133D를 포함한다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 이황화물 조종 추진 집합을 포함하는, K-L 집단 1에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함한다.
한 구체예에서, K-L 집단 1의 아미노산 조합은 표 F로부터 선택된 하나 이상의 이차 치환을 포함한다.
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 표 10-A1 내 하나 이상의 설계로 제시된 바와 같은 K-L 집단 1에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함한다.
K-L 집단 2:
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 2에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서:
H1은 위치 143에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 131에 아미노산 치환을 포함하고; 및
c) H2는 위치 186 또는 124_186에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 133 또는 133_160 또는 124_133 또는 176_180에 아미노산 치환을 포함하고; 또는
d) H2는 위치 188에 아미노산 치환을 포함하고; L2는 위치 131에 아미노산 치환을 포함하고;
e) H2는 위치 143에 아미노산 치환을 포함하고; L2는 위치 124_133 또는 124_133_180에 아미노산 치환을 포함하고;
일부 구체예에서, H1은 추가로 하나 이상의 위치 139, 145, 174, 및 179에 아미노산 치환을 포함하고, L1은 추가로 하나 이상의 위치 116, 124, 133 및 176에 아미노산 치환을 포함하고, H2는 추가로 하나 이상의 위치 190, 39, 및 45에 아미노산 치환을 포함하고, 및/또는 L2는 추가로 하나 이상의 위치 135, 178, 38, 및 44에 아미노산 치환을 포함한다.
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 2에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서 H1은 위치 143_145에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 131에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 143 또는 186 또는 188에 아미노산 치환을 포함하고; L2는 위치 133에 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, H1은 추가로 하나 이상의 위치 139, 174, 및 179에 아미노산 치환을 포함하고, L1은 추가로 하나 이상의 위치 116, 124, 133, 및 176에 아미노산 치환을 포함하고, H2는 추가로 하나 이상의 위치, 124, 190, 39, 및 45에 아미노산 치환을 포함하고 L2는 추가로 하나 이상의 위치 124, 131, 135, 160, 176, 178, 180, 38, 44에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 2에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서 H1은 위치 139_143_145, 143_145, 143_145_174, 또는 143_145_179에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 116_124_131_176, 124_131, 124_131_133, 124_131_133_176, 131, 또는 131_133에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 124_186_190, 143, 143_186, 143_186_190, 143_190, 186, 186_190, 188, 39_143, 또는 45_143에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 124_133, 124_133_135, 124_133_135_180, 124_133_180, 131_133_135_178, 131_133_178, 133, 133_135 176_180, 133_160, 38_124_133, 또는 44_124_133에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 2에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서 H1 내 아미노산 치환은 139W, 143D, 145T, 174G, 179E, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택되고; L1 내 아미노산 치환은 124Q, 176F, 116F, 131K, 131R, 133S, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택되고; H2 내 아미노산 치환은 124R, 143I, 143K, 143R, 186K, 188K, 190F, 39E, 45P, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택되고; L2 내 아미노산 치환은 124E, 131D, 131E, 133D, 133G, 135A, 135W, 160E, 176D, 178F, 180D, 180E, 38R, 44F, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 2에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하는 H1L1 이종이합체를 가지며, 여기서 H1L1 이종이합체는 다음의 아미노산 치환의 집합 중 하나를 포함한다:
Figure pct00021
추가의 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 2에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하는 H2L2 이종이합체를 가지며, 여기서 H2L2 이종이합체는 다음의 아미노산 치환의 집합 중 하나를 포함한다:
Figure pct00022
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 하나의 H1L1 이종이합체와 하나의 H2L2 이종이합체의 조합을 포함한다. 한 구체예에서, H1L1 이종이합체 및 H2L2 이종이합체의 조합은 다음 중 하나이다:
Figure pct00023
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 하나 이상의 입체 1, 입체 2, 가변 도메인 입체, 또는 가변 도메인 정전 추진 집합을 가지는, K-L 집단 2에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함한다.
한 구체예에서, K-L 집단 2의 아미노산 조합은 표 F로부터 선택된 하나 이상의 이차 치환을 포함한다.
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 표 10-A2 내 하나 이상의 설계로 제시된 바와 같은 K-L 집단 2에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함한다.
K-L 집단 3:
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 3에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서:
H1은 위치 143에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 131에 아미노산 치환을 포함하고; 및
a) H2는 위치 124_186 또는 124_179 또는 188에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 176_178 또는 176_180 또는 131에 아미노산 치환을 포함하고; 또는
b) H2는 143_188 또는 143 또는 124_143에 아미노산 치환을 포함하고; L2는 위치 124_176_178 또는 124_178 또는 124_180 또는 124_176_180, 또는 124, 또는 124_176에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, H1은 추가로 하나 이상의 위치 139, 145, 174, 및 179에 아미노산 치환을 포함하고, L1은 추가로 하나 이상의 위치 116, 124, 및 176에 아미노산 치환을 포함하고, H2는 추가로 하나 이상의 위치 190, 39, 및 45에 아미노산 치환을 포함하고, 및/또는 L2는 추가로 하나 이상의 위치 133, 135, 178, 38, 및 44에 아미노산 치환을 포함한다.
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 3에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서: H1은 위치 143_145에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 124_131에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 하나 이상의 위치 143, 124, 및 188에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 133 또는 176_178에 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, H1은 추가로 하나 이상의 위치 139, 174, 및 179에 아미노산 치환을 포함하고, L1은 추가로 위치 116 또는 176에 아미노산 치환을 포함하고, H2는 추가로 하나 이상의 위치 177, 179, 186, 190, 39, 및 45에 아미노산 치환을 포함하고, 및/또는 L2는 추가로 하나 이상의 위치 124, 131, 135, 180, 38, 및 44에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 3에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서 H1은 위치 139_143_145, 139_143_145_179, 143_145, 143_145_174_179, 또는 143_145_179에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 116_124_131_176에, 또는 124_131에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 124_143, 124_179, 124_186, 143, 143_188, 177_188, 188, 188_190, 39_124_179, 또는 45_124_179에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 124_133, 124_133_176, 124_133_176_178, 124_133_176_180, 124_133_178, 124_133_180, 131_133_178, 133_135_176_178, 133_135_176_180, 133_176_178, 133_176_180, 176_178, 38_133_176_180, 또는 44_133_176_180에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 3에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서 H1 내 아미노산 치환은 139W, 174G, 145T, 143D, 143E, 179E, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택되고; L1 내 아미노산 치환은 116F, 124Q, 131K, 131R, 176F, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택되고; H2 내 아미노산 치환은 124R, 143K, 143R, 177I, 179K, 186K, 186R, 188K, 190F, 39E, 45P, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택되고; L2 내 아미노산 치환은 135A, 135W, 44F, 124E, 38R, 131D, 131E, 176D, 176E, 178D, 178E, 178F, 180D, 180E, 133D, 133G, 133I, 133L, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 3에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하는 H1L1 이종이합체를 가지며, 여기서 H1L1 이종이합체는 다음의 아미노산 치환의 집합 중 하나를 포함한다:
Figure pct00024
추가의 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 3에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하는 H2L2 이종이합체를 가지며, 여기서 H2L2 이종이합체는 다음의 아미노산 치환의 집합 중 하나를 포함한다:
Figure pct00025
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 하나의 H1L1 이종이합체와 하나의 H2L2 이종이합체의 조합을 포함한다. 한 구체예에서, H1L1 이종이합체 및 H2L2 이종이합체의 조합은 다음 중 하나이다:
Figure pct00026
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 하나 이상의 입체 1, 입체 2, 가변 도메인 입체, 또는 가변 도메인 정전 추진 집합을 가지는, K-L 집단 3에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함한다.
한 구체예에서, K-L 집단 3의 아미노산 조합은 표 F로부터 선택된 하나 이상의 이차 치환을 포함한다.
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 표 10-A3 내 하나 이상의 설계로 제시된 바와 같은 K-L 집단 3에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함한다.
K-L 집단 4:
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 4에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서: H1은 위치 188에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 176_178, 또는 178에 아미노산 치환을 포함하고; 및
a) H2는 위치 177_188에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 176_178에 아미노산 치환을 포함하고; 또는
b) H2는 위치 186 또는 124 또는 124_179에 아미노산 치환을 포함하고; L2는 위치 176 또는 131_176에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, H1은 추가로 하나 이상의 위치 125, 139, 및 177에 아미노산 치환을 포함하고, L1은 추가로 하나 이상의 위치 122, 129, 및 133에 아미노산 치환을 포함하고, H2는 추가로 하나 이상의 위치 145, 228, 45, 및 39에 아미노산 치환을 포함하고, 및/또는 L2는 추가로 하나 이상의 위치 135, 44, 38, 121, 및 133에 아미노산 치환을 포함한다.
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 4에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서: H1은 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 치환을 포함하지 않거나 위치 188에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 치환을 포함하지 않거나 위치 176_178에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 188 또는 186_188에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 176_178에 아미노산 치환을 포함한다.
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 4에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서: H1은 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 치환을 포함하지 않거나 위치 188에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 치환을 포함하지 않거나 위치 178에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 하나 이상의 위치 124, 186, 및 188에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 176에 에 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, H1은 추가로 하나 이상의 위치 125, 139, 및 177에 아미노산 치환을 포함하고, L1은 추가로 하나 이상의 위치 122, 129, 133, 및 176에 아미노산 치환을 포함하고, H2는 추가로 하나 이상의 위치 145, 228, 45, 177, 179, 및 39에 아미노산 치환을 포함하고, 및/또는 L2는 추가로 하나 이상의 위치 135, 44, 38, 121, 131, 178, 및 133에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 4에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서 H1은 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 치환을 포함하지 않거나 위치 125_188, 139_188, 188, 또는 177_188에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 치환을 포함하지 않거나 위치 129_176_178, 129_178 , 122_129_176_178, 176_178 , 또는 133_176_178에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 145_186, 145_186_228, 145_177_188, 124, 124_145_179, 124_145_179_186_188, 124_145_179_188, 124_186_188, 124_188,45_124_145_179,39_124_145_179, 또는 186_188에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 44_131_133_176, 38_131_133_176, 121_131_176, 131_135_176, 131_176, 131_133_176, 131_133_176_178, 176, 176_178, 133_176, 또는 133_176_178에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 4에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서 H1 내 아미노산 치환은 125R, 139W, 188A, 188K, 및 177I, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택되고; L1 내 아미노산 치환은 129T, 122D, 176A, 176D, 176E, 133I, 133L, 178D, 178E, 178T, 및 178W, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택되고; H2 내 아미노산 치환은 124E, 145T, 177D, 179E, 186E, 186I, 186L, 188D, 188W, 228D, 39E, 및 45P, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택되고; L2 내 아미노산 치환은 121K, 131K, 131R, 133A, 133G, 135W, 176A, 176K, 176R, 176V, 178A, 178K, 178L, 178R, 38R, 및 44F, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 4에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하는 H1L1 이종이합체를 가지며, 여기서 H1L1 이종이합체는 다음의 아미노산 치환의 집합 중 하나를 포함한다:
Figure pct00027
추가의 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 4에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하는 H2L2 이종이합체를 가지며, 여기서 H2L2 이종이합체는 다음의 아미노산 치환의 집합 중 하나를 포함한다:
Figure pct00028
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 하나의 H1L1 이종이합체와 하나의 H2L2 이종이합체의 조합을 포함한다. 한 구체예에서, H1L1 이종이합체 및 H2L2 이종이합체의 조합은 다음 중 하나이다:
Figure pct00029
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 하나 이상의 정전, 이황화물 조종, 입체 3, 가변 도메인 입체 및 가변 도메인 정전 추진 집합을 가지는, K-L 집단 4에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함한다.
한 구체예에서, K-L 집단 4의 아미노산 조합은 표 F로부터 선택된 하나 이상의 이차 치환을 포함한다.
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 표 10-A4 내 하나 이상의 설계로 제시된 바와 같은 K-L 집단 4에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함한다.
K-L 집단 5:
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 5에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서:
H1은 위치 186에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 133에 아미노산 치환을 포함하고; 및
a) H2는 위치 188에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 131에 아미노산 치환을 포함하고; 또는
b) H2는 위치 177_188에 아미노산 치환을 포함하고; L2는 위치 176_178에 아미노산 치환을 포함하고; 또는
여기서 H1은 위치 124_190에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 135에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 124 또는 188에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 176, 또는 176_178에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, H1은 추가로 위치, 143 및/또는 188에 아미노산 치환을 포함하고, L1은 추가로 위치 131 및/또는 178에 아미노산 치환을 포함하고, H2는 추가로 위치 143 및/또는 145에 아미노산 치환을 포함하고, 및/또는 L2는 추가로 위치 133 및/또는 178에 아미노산 치환을 포함한다.
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 5에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서: H1은 위치 186 또는 124에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 133 및/또는 135에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 하나 이상의 위치 188, 177 및 124에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 176 및/또는 131에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, H1은 추가로 하나 이상의 위치 143, 188, 및 190에 아미노산 치환을 포함하고, L1은 추가로 위치 131 및/또는 178에 아미노산 치환을 포함하고, H2는 추가로 위치 143 및/또는 145에 아미노산 치환을 포함하고, 및/또는 L2는 추가로 위치 133 및/또는 178에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 5에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서 H1은 위치 124_190, 143_186_188, 또는 186_188에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 131_133_178, 133_135, 133_135_178, 133_178, 또는 135_178에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 124, 143_188, 145_177_188, 또는 177_188에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 131_176_178, 131_178, 133_176, 133_176_178, 또는 176_178에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 5에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서 H1 내 아미노산 치환은 124E, 143S, 186K, 188T, 190D, 190E, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택되고; L1 내 아미노산 치환은 131S, 133D, 133I, 135K, 135R, 178F, 178T, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택되고; H2 내 아미노산 치환은 124R, 143T, 145T, 177D, 177I, 188D, 188K, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택되고; L2 내 아미노산 치환은 131K, 133G, 133L, 176A, 176D, 176K, 178E, 178K, 178R, 178S, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 5에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하는 H1L1 이종이합체를 가지며, 여기서 H1L1 이종이합체는 다음의 아미노산 치환의 집합 중 하나를 포함한다:
Figure pct00030
추가의 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 5에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하는 H2L2 이종이합체를 가지며, 여기서 H2L2 이종이합체는 다음의 아미노산 치환의 집합 중 하나를 포함한다:
Figure pct00031
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 하나의 H1L1 이종이합체와 하나의 H2L2 이종이합체의 조합을 포함한다. 한 구체예에서, H1L1 이종이합체 및 H2L2 이종이합체의 조합은 H1이 186K_188T를 포함하고, L1이 133D_178T를 포함하고, H2이 145T_177D_188D를 포함하고, L2가 176K_178K를 포함하는 것이다.
한 구체예에서, K-L 집단 5의 아미노산 조합은 표 F로부터 선택된 하나 이상의 이차 치환을 포함한다.
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 표 10-A5 내 하나 이상의 설계로 제시된 바와 같은 K-L 집단 5에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함한다.
K-L 집단 6:
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 6에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서:
H1은 위치 177_188에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 176_178에 아미노산 치환을 포함하고; 및
a) H2는 위치 188에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 176_178 또는 131에 아미노산 치환을 포함하고;
b) H2는 위치 186에 아미노산 치환을 포함하고; L2는 위치 133 또는 124_160_180에 아미노산 치환을 포함하고;
c) H2는 위치 124 또는 124_179 또는 124_186에 아미노산 치환을 포함하고; L2는 위치 176 또는 176_178 또는 176_180에 아미노산 치환을 포함하고; 또는
d) H2는 위치 143에 아미노산 치환을 포함하고; L2는 위치 133 또는 124_133에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, H1은 추가로 145 및/또는 146에 아미노산 치환을 포함하고, 및/또는 H2는 추가로 하나 이상의 위치 143 및/또는 177에 아미노산 치환을 포함한다.
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 6에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서:
H1은 위치 177_188에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 176_178에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 하나 이상의 위치 124, 143, 179, 186, 및 188에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 하나 이상의 위치 133, 176, 및 178에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, H1은 추가로 145 및/또는 146 위치에 아미노산 치환을 포함하고, H2는 추가로 위치 177에 아미노산 치환을 포함하고, 및/또는 L2는 추가로 하나 이상의 위치 124, 131, 160, 및 180에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 6에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서 H1은 위치 145_177_188, 또는 146_177_188에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 176_178에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 124, 124_179, 124_186, 143, 143_186_188, 177_188, 179, 186, 186_188, 또는 188에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 124_133, 124_160_176_178_180, 124_160_180, 131_133_178, 133, 133_176, 133_176_178, 133_176_180, 또는 176_178에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 6에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서 H1 내 아미노산 치환은 145T, 146T, 177D, 188D, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택되고; L1 내 아미노산 치환은 176K, 178K, 178L, 178R, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택되고; H2 내 아미노산 치환은 124R, 143K, 143R, 143S, 177I, 179K, 186K, 186R, 188K, 188T, 188W, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택되고; L2 내 아미노산 치환은 124E, 131D, 131E, 133D, 133G, 133I, 133L, 160E, 176A, 176D, 176E, 178A, 178D, 178E, 178F, 180E, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 6에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하는 H1L1 이종이합체를 가지며, 여기서 H1L1 이종이합체는 다음의 아미노산 치환의 집합 중 하나를 포함한다:
Figure pct00032
추가의 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 6에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하는 H2L2 이종이합체를 가지며, 여기서 H2L2 이종이합체는 다음의 아미노산 치환의 집합 중 하나를 포함한다:
Figure pct00033
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 하나의 H1L1 이종이합체와 하나의 H2L2 이종이합체의 조합을 포함한다. 한 구체예에서, H1L1 이종이합체 및 H2L2 이종이합체의 조합은 다음 중 하나이다:
Figure pct00034
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 입체 추진 집합을 가지는, K-L 집단 6에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함한다.
한 구체예에서, K-L 집단 6의 아미노산 조합은 표 F로부터 선택된 하나 이상의 이차 치환을 포함한다.
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 표 10-A6 내 하나 이상의 설계로 제시된 바와 같은 K-L 집단 6에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함한다.
K-L 집단 7:
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 7에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서:
H1은 위치 188에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 178에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 124 또는 188에 아미노산 치환을 포함하고, 및 L2는 위치 176_178, 또는 176_180, 또는 176에 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, H1은 추가로 하나 이상의 위치 125, 139, 145, 및 177에 아미노산 치환을 포함하고, L1은 추가로 위치 122에 아미노산 치환을 포함하고, H2는 추가로 하나 이상의 위치 143, 177, 179, 186,228, 39, 및 45에 아미노산 치환을 포함하고, 및/또는 L2는 추가로 하나 이상의 위치 121, 124, 133, 135, 160, 38, 및 44에 아미노산 치환을 포함한다.
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 7에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서: H1은 위치 145_188에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 178에 아미노산 치환을 포함하고; 및 H2는 위치 124 및/또는 188에 아미노산 치환을 포함하고, 및 L2는 하나 이상의 위치 124, 133, 및 178에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, H1은 추가로 하나 이상의 위치 125, 139, 및 177에 아미노산 치환을 포함하고, L1은 추가로 위치 122에 아미노산 치환을 포함하고, H2는 추가로 하나 이상의 위치 143, 177, 179, 186, 228, 39, 및 45에 아미노산 치환을 포함하고, 및/또는 L2는 추가로 하나 이상의 위치 121, 135, 160, 176, 180, 38, 및 44에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 7에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서 H1은 위치 125_145_188, 139_145_188, 145_177_188, 또는 145_188에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 122_178, 또는 178에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 124, 124_143, 124_179, 124_186, 124_186_228, 124_188, 124_228, 143_188, 177_188, 179_188, 186_188, 188, 188_228, 39_124_179, 또는 45_124_179에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 121_133_176, 121_133_176_180, 121_176_178, 124_133_176, 124_133_176_178, 124_133_176_178_180, 124_133_176_180, 124_133 178, 124_160_176_178, 124_160_176_178_180, 124_176_178_180, 124_176_180, 133_135_176, 133_135_176_180, 133_176, 133_176_178, 133_176_180, 135_176_178, 176_178, 38_133_176_180, 또는 44_133_176_180에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 7에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서 H1 내 아미노산 치환은 125R, 139W, 145T, 177T, 188E, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택되고; L1 내 아미노산 치환은 122D, 178K, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택되고; H2 내 아미노산 치환은 124K, 124R, 143K, 143R, 177I, 179K, 186R, 188K, 228D, 39E, 45P, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택되고; L2 내 아미노산 치환은 121K, 124E, 133D, 133G, 133L, 135W, 160E, 176D, 176E, 178D, 178E, 180E, 38R, 44F, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 7에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하는 H1L1 이종이합체를 가지며, 여기서 H1L1 이종이합체는 다음의 아미노산 치환의 집합 중 하나를 포함한다:
Figure pct00035
추가의 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 7에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하는 H2L2 이종이합체를 가지며, 여기서 H2L2 이종이합체는 다음의 아미노산 치환의 집합 중 하나를 포함한다:
Figure pct00036
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 하나의 H1L1 이종이합체와 하나의 H2L2 이종이합체의 조합을 포함한다. 한 구체예에서, H1L1 이종이합체 및 H2L2 이종이합체의 조합은 다음 중 하나이다:
Figure pct00037
일부 구체예에서, K-L 집단 7의 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 이황화물 조종 추진 집합, 입체 2 추진 집합, 및 가변 도메인 추진 집합으로부터 선택된 하나 이상의 추진 집합을 가지는 아미노산 치환의 조합을 포함한다.
한 구체예에서, K-L 집단 7의 아미노산 조합은 표 F로부터 선택된 하나 이상의 이차 치환을 포함한다.
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 표 10-A7 내 제시된 하나 이상의 설계로 제시된 바와 같은 K-L 집단 7에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함한다.
K-L 집단 8:
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 8에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서:
H2는 위치 143에 아미노산 치환을 포함하고; L2는 위치 124에 아미노산 치환을 포함하고; 및
a) H1은 위치 186 또는 179에 아미노산 치환을 포함하고, L1은 위치 180에 아미노산 치환을 포함하고;
b) H1은 위치 186에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 133에 아미노산 치환을 포함하고;
c) H1은 위치 143에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 133에 아미노산 치환을 포함하고; 또는
d) H1은 위치 188에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 178에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, H1은 추가로 하나 이상의 위치 124, 139, 177, 및 190에 아미노산 치환을 포함하고, L1은 추가로 하나 이상의 위치 129, 131, 135, 및 176에 아미노산 치환을 포함하고, H2는 추가로 하나 이상의 위치 122, 124, 145, 179, 186, 188, 39, 및 45에 아미노산 치환을 포함하고, 및/또는 L2는 추가로 하나 이상의 위치 129, 133, 135, 160, 176, 178, 38, 및 44에 아미노산 치환을 포함한다.
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 8에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서: H1은 위치 143, 186, 179 및/또는 188에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 129 및/또는 178에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 143에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 124에 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, H1은 추가로 하나 이상의 위치 124, 139, 177, 및 190에 아미노산 치환을 포함하고, L1은 추가로 하나 이상의 위치 131, 133, 135, 176, 및 180에 아미노산 치환을 포함하고, H2는 추가로 하나 이상의 위치 122, 124, 145, 179, 186, 188, 39, 및 45에 아미노산 치환을 포함하고, 및/또는 L2는 추가로 하나 이상의 위치 129, 133, 135, 160, 176, 178, 38, 및 44에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 8에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서 H1은 위치 124_143, 139_143, 139_143_186, 139_186, 139_188, 143, 143_179, 143_186, 143_186_188, 143_190, 177_188, 179, 179_190, 186, 또는 186_188, 188에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 129_131_133, 129_133, 129_133_135, 129_133_135_180, 129_133_178, 129_133_180, 129_176_178, 129_176_178_180, 129_178, 129_178_180, 129_180, 133_176_178, 133_178, 또는 176_178에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 122_143_145, 122_143_145_179, 124_143_145, 124_143_145_179, 143_145, 143_145_179, 143_145_179_186_188, 143_145_179_188, 143_145_188,39_143_145_179, 또는 45_143_145_179에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 124_129_160_178, 124_129_178, 124_133_178, 124_135_160_178, 124_135_178, 124_160_176_178, 124_160_178, 124_176_178, 124_178, 38_124_178, 또는 44_124_178에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 8에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서 H1 내 아미노산 치환은 124K, 139W, 143A, 143I, 143K, 143S, 177I, 179K, 186K, 186R, 188K, 188T, 190K, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택되고; L1 내 아미노산 치환은 129T, 131D, 131E, 133D, 133L, 133W, 135S, 176A, 176D, 176E, 178D, 178E, 178T, 178W, 180E, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택되고; H2 내 아미노산 치환은 122C, 124W, 143E, 145T, 179E, 186I, 188L, 188W, 39E, 45P, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택되고; L2 내 아미노산 치환은 124C, 124K, 124R, 129K, 133A, 135W, 160K, 160R, 176A, 178R, 38R, 44F, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 8에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하는 H1L1 이종이합체를 가지며, 여기서 H1L1 이종이합체는 다음의 아미노산 치환의 집합 중 하나를 포함한다:
Figure pct00038
추가의 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 8에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하는 H2L2 이종이합체를 가지며, 여기서 H2L2 이종이합체는 다음의 아미노산 치환의 집합 중 하나를 포함한다:
Figure pct00039
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 하나의 H1L1 이종이합체와 하나의 H2L2 이종이합체의 조합을 포함한다. 한 구체예에서, H1L1 이종이합체 및 H2L2 이종이합체의 조합은 다음 중 하나이다:
Figure pct00040
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 하나 이상의 입체 2, 입체 3, 입체 4, 및 가변 도메인 추진 집합을 가지는, K-L 집단 8에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함한다. 한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 비-자연발생적 이황화 결합을 도입하는 K-L 집단 8에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함한다.
한 구체예에서, K-L 집단 8의 아미노산 조합은 표 F로부터 선택된 하나 이상의 이차 치환을 포함한다.
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 표 10-A8 내 하나 이상의 설계로 제시된 바와 같은 K-L 집단 8에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함한다.
K-L 집단 9:
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 9에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서:
H1은 위치 179, 186, 143 및/또는 188에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 180, 133 및/또는 176_178에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 143에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 131 및/또는 124에 에 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, H1은 추가로 위치 125에 아미노산 치환을 포함하고, L1은 추가로 위치 122 또는 129에 아미노산 치환을 포함하고, H2는 추가로 하나 이상의 위치 145, 179 및 228에 아미노산 치환을 포함하고, 및/또는 L2는 추가로 하나 이상의 위치 121, 129, 135, 160, 및 178에 아미노산 치환을 포함한다.
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 9에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서: H1은 위치 125에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 122_129에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 145에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 121 및/또는 124에 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, H1은 추가로 하나 이상의 위치 143, 179, 186, 및 188에 아미노산 치환을 포함하고, L1은 추가로 하나 이상의 위치 133, 176, 178, 및 180에 아미노산 치환을 포함하고, H2는 추가로 하나 이상의 위치 143, 179, 및 228에 아미노산 치환을 포함하고, 및/또는 L2는 추가로 하나 이상의 위치 129, 131, 135, 160, 및 178에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 9에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서 H1은 위치 125_143, 125_179, 125_186, 또는 125_188에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 122_129_133, 122_129_176_178, 또는 122_129_180에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 143_145, 143_145_179, 143_145_179_228, 143_145_228, 또는 145_179_228에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 121_124_160_178, 121_124_178, 121_129_131, 121_131, 124_135_160_178, 또는 124_135_178에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 9에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서 H1 내 아미노산 치환은 125R, 143K, 179K, 186R, 188K, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택되고; L1 내 아미노산 치환은 122D, 129T, 133D, 176D, 176E, 178E, 178T, 180E, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택되고; H2 내 아미노산 치환은 143E, 145T, 179E, 228D, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택되고; L2 내 아미노산 치환은 135W, 124R, 160K, 121K, 131K, 129K, 178R, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 9에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하는 H1L1 이종이합체를 가지며, 여기서 H1L1 이종이합체는 다음의 아미노산 치환의 집합 중 하나를 포함한다:
Figure pct00041
추가의 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 9에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하는 H2L2 이종이합체를 가지며, 여기서 H2L2 이종이합체는 다음의 아미노산 치환의 집합 중 하나를 포함한다:
Figure pct00042
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 하나의 H1L1 이종이합체와 하나의 H2L2 이종이합체의 조합을 포함한다. 한 구체예에서, H1L1 이종이합체 및 H2L2 이종이합체의 조합은 다음 중 하나이다:
Figure pct00043
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 이황화물 조종 추진 집합을 가지는, K-L 집단 9에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함한다.
한 구체예에서, K-L 집단 9의 아미노산 조합은 표 F로부터 선택된 하나 이상의 이차 치환을 포함한다.
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 표 10-A9 내 하나 이상의 설계로 제시된 바와 같은 K-L 집단 9에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함한다.
K-L 집단 10:
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 10에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서: H1은 위치 174, 179 또는 186에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 176 또는 180에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 143 또는 190에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 131, 135 또는 124에 아미노산 치환을 포함하고; 또는 H1은 위치 174에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 176에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 190에 아미노산 치환을 포함하고; L2는 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 치환을 포함하지 않거나 위치 135에 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, H1은 추가로 위치 143에 아미노산 치환을 포함하고, L1은 추가로 하나 이상의 위치 116, 129 및 133에 아미노산 치환을 포함하고, H2는 추가로 하나 이상의 위치 145, 179, 및 188에 아미노산 치환을 포함하고, 및/또는 L2는 추가로 하나 이상의 위치 133, 160 및 178에 아미노산 치환을 포함한다.
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 10에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서: H1은 위치 174 및/또는 186에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 176 및/또는 180에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 145, 190 및/또는 188에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 135, 131, 178, 또는 133에 아미노산 치환을 포함하거나 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 치환을 포함하지 않는다. 일부 구체예에서, H1은 추가로 하나 이상의 위치 143 및/또는 179에 아미노산 치환을 포함하고, L1은 추가로 하나 이상의 위치 116, 129, 및 133에 아미노산 치환을 포함하고, H2는 추가로 위치 143 및/또는 179에 아미노산 치환을 포함하고, 및/또는 L2는 추가로 위치 124 및/또는 160에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 10에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서 H1은 위치 143_174, 174, 174_179, 174_186, 또는 186에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 116_129_133_176, 116_129_176_180, 116_176, 129_180, 또는 176에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 143_145_179_ 188_190, 143_145_179_190, 143_145_190, 143_190, 145_179, 145_179_188_190, 188, 또는 190에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 124_135_160_178, 124_135_178, 131, 131_135, 133,135, 135_178, 178에 아미노산 치환을 포함하거나 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 치환을 포함하지 않는다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 10에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서 H1 내 아미노산 치환은 143K, 174G, 179K, 186R, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택되고; L1 내 아미노산 치환은 116F, 129T, 133D, 176F, 180E, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택되고; H2 내 아미노산 치환은 143E, 1431, 145T, 179E, 188F, 190F, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택되고; L2 내 아미노산 치환은 124K, 124R, 131K, 133A, 135A, 160K, 178F, 178R, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 10에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하는 H1L1 이종이합체를 가지며, 여기서 H1L1 이종이합체는 다음의 아미노산 치환의 집합 중 하나를 포함한다:
Figure pct00044
추가의 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 10에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하는 H2L2 이종이합체를 가지며, 여기서 H2L2 이종이합체는 다음의 아미노산 치환의 집합 중 하나를 포함한다:
Figure pct00045
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 하나의 H1L1 이종이합체와 하나의 H2L2 이종이합체의 조합을 포함한다. 한 구체예에서, H1L1 이종이합체 및 H2L2 이종이합체의 조합은 다음 중 하나이다:
Figure pct00046
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 입체 1 추진 집합을 가지는, K-L 집단 10에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함한다.
한 구체예에서, K-L 집단 10의 아미노산 조합은 표 F로부터 선택된 하나 이상의 이차 치환을 포함한다.
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 표 10-A10 내 하나 이상의 설계로 제시된 바와 같은 K-L 집단 10에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함한다.
K-L 집단 11:
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 11에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서: H1은 위치 143_190에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 133에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 124에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 131_135에 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, H1은 추가로 위치 125에 아미노산 치환을 포함하고, L1은 추가로 하나 이상의 위치 122, 129 및 135에 아미노산 치환을 포함하고, H2는 추가로 하나 이상의 위치 139, 145, 190, 및 228에 아미노산 치환을 포함하고, 및/또는 L2는 추가로 위치 121에 아미노산 치환을 포함한다.
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 11에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서:
H1은 위치 143_190에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 129_133_135에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 124_145에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 131_135에 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, H1은 추가로 위치 125에 아미노산 치환을 포함하고, L1은 추가로 위치 122에 아미노산 치환을 포함하고, H2는 추가로 하나 이상의 위치 139, 190 및 228에 아미노산 치환을 포함하고, 및/또는 L2는 추가로 위치 121에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 11에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서 H1은 위치 125_143_190, 또는 143_190에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 122_129_133_135, 또는 129_133_135에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 124_139_145_190, 124_139_145_190_228, 또는 124_145에 아미노산 치환을 포함하고, 및 L2는 위치 121_131_135, 또는 131_135에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 11에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서 H1 내 아미노산 치환은 125R, 143K, 190K, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택되고; L1 내 아미노산 치환은 122D, 129T, 133D, 135S, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택되고; H2 내 아미노산 치환은 124E, 139I, 145T, 190I, 228D, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택되고; L2 내 아미노산 치환은 121K, 131K, 135K, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 11에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하는 H1L1 이종이합체를 가지며, 여기서 H1L1 이종이합체는 다음의 아미노산 치환의 집합 중 하나를 포함한다:
Figure pct00047
추가의 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 11에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하는 H2L2 이종이합체를 가지며, 여기서 H2L2 이종이합체는 다음의 아미노산 치환의 집합 중 하나를 포함한다:
Figure pct00048
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 하나의 H1L1 이종이합체와 하나의 H2L2 이종이합체의 조합을 포함한다. 한 구체예에서, H1L1 이종이합체 및 H2L2 이종이합체의 조합은 H1이 143K_190K를 포함하고, L1이 129T_133D_135S를 포함하고, H2이 124E_145T를 포함하고, L2가 131K_135K를 포함하는 것이다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 이황화물 조종 추진 집합을 가지는, K-L 집단 11에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함한다.
한 구체예에서, K-L 집단 11의 아미노산 조합은 표 F로부터 선택된 하나 이상의 이차 치환을 포함한다.
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 표 10-A11 내 하나 이상의 설계로 제시된 바와 같은 K-L 집단 11에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함한다.
K-L 집단 12:
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 12에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서: H1은 위치 143 및/또는 186에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 133에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 124에 아미노산 치환을 포함하고, 및 L2는 위치 131에 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, H1은 추가로 하나 이상의 위치 124, 125, 139, 및 188에 아미노산 치환을 포함하고, L1은 추가로 하나 이상의 위치 122, 129, 131, 및 178에 아미노산 치환을 포함하고, H2는 추가로 하나 이상의 위치 143, 145, 179, 186, 188, 228, 39, 및 45에 아미노산 치환을 포함하고, 및/또는 L2는 추가로 하나 이상의 위치 121, 133, 135, 176, 178, 38, 및 44에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 12에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서 H1은 위치 124_143, 125_143, 125_143_186, 125_186, 125_186_188, 139_143, 139_143_186, 139_186, 139_186_188, 143, 또는 186_188에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 122_129_133, 122_129_133_178, 122_133_178, 129_131_133, 129_133, 129_133_178, 또는 133_178에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 124_143_145, 124_145_179, 124_145_179_186_188, 124_145_179_188, 124_145_179_228, 124_145_186, 39_124_145_179, 또는 45_124_145_179에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 121_131_133_176, 131_133_135, 131_133_135_176, 131_133_135_178, 131_133_176, 131_133_176_178, 38_131_133_176, 또는 44_131_133_176에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 12에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서 H1 내 아미노산 치환은 124K, 125R, 139W, 143I, 143K, 186K, 188T, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택되고; L1 내 아미노산 치환은 122D, 129T, 131D, 131E, 133D, 178T, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택되고; H2 내 아미노산 치환은 124E, 143E, 145T, 179E, 186E, 186I, 188W, 228D, 39E, 45P, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택되고; L2 내 아미노산 치환은 121K, 131K, 131R, 133G, 133S, 133T, 135K, 135W, 176R, 178A, 178S, 38R, 44F, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 12에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하는 H1L1 이종이합체를 가지며, 여기서 H1L1 이종이합체는 다음의 아미노산 치환의 집합 중 하나를 포함한다:
Figure pct00049
추가의 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 집단 12에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하는 H2L2 이종이합체를 가지며, 여기서 H2L2 이종이합체는 다음의 아미노산 치환의 집합 중 하나를 포함한다:
Figure pct00050
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 하나의 H1L1 이종이합체와 하나의 H2L2 이종이합체의 조합을 포함한다. 한 구체예에서, H1L1 이종이합체 및 H2L2 이종이합체의 조합은 다음 중 하나이다:
Figure pct00051
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 하나 이상의 이황화물 조종, 입체 2, 입체 3, 가변 도메인 정전 및 가변 도메인 입체 추진 집합을 가지는, K-L 집단 12에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함한다.
한 구체예에서, K-L 집단 12의 아미노산 조합은 표 F로부터 선택된 하나 이상의 이차 치환을 포함한다.
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 표 10-A12 내 하나 이상의 설계로 제시된 바와 같은 K-L 집단 12에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함한다.
K-K 집단 1:
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-K 집단 1에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서: H1은 위치 143_179에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 124_178에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 186에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 178_180 또는 160_180에 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, H1은 추가로 위치 145에 아미노산 치환을 포함한다.
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-K 집단 1에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서: H1은 위치 143_145_179에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 124_178에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 186에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 180에 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, L2는 추가로 위치 160 및/또는 178에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-K 집단 1에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서 H1은 위치 143_145_179에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 124_178에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 186에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 178_180 또는 160_180에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-K 집단 1에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서 H1 내 아미노산 치환은 143E, 145T, 179E, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택되고; L1 내 아미노산 치환은 124K, 178R, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택되고; H2 내 아미노산 치환은 186R, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택되고; L2 내 아미노산 치환은 160E, 178E, 180E, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-K 집단 1에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하는 H1L1 이종이합체를 가지며, 여기서 H1L1 이종이합체는 다음의 아미노산 치환의 집합을 포함한다: H1은 143E_145T_179E를 포함하고 L1은 124K_178R를 포함한다. 추가의 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-K 집단 1에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하는 H2L2 이종이합체를 가지며, 여기서 H2L2 이종이합체는 다음의 아미노산 치환의 집합을 포함한다: H2는 124K_178R를 포함하고 L2는 178E_180E 또는 160E_180E를 포함한다. 일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 이들 H1L1 및 H2L2 이종이합체의 조합을 포함한다.
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 표 10-B1에 제시된 바와 같은 K-K 집단 1에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함한다.
K-K 집단 2:
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-K 집단 2에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서: H1은 위치 143에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 124에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 179 또는 186에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 124_160_180에 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, H1은 추가로 위치 145에 아미노산 치환을 포함하고, 및/또는 H2는 추가로 위치 146에 아미노산 치환을 포함한다.
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-K 집단 2에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서: H1은 위치 143_145에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 124에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 179 또는 186에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 124_160_180에 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, H2는 추가로 위치 146에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-K 집단 2에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서 H1은 위치 143_145에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 124에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 186, 179, 또는 146_179에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 124_160_180에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-K 집단 2에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서 H1 내 아미노산 치환은 143E, 145T, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택되고; L1 내 아미노산 치환은 124R, 또는 이들의 보존적 치환이고; H2 내 아미노산 치환은 186R, 179K, 146G, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택되고; L2 내 아미노산 치환은 124E, 160E, 180E, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-K 집단 2에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하는 H1L1 이종이합체를 가지며, 여기서 H1L1 이종이합체는 다음의 아미노산 치환의 집합을 포함한다: H1은 143E_145T를 포함하고 L1은 124R를 포함한다. 추가의 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-K 집단 2에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하는 H2L2 이종이합체를 가지며, 여기서 H2L2 이종이합체는 다음의 아미노산 치환의 집합을 포함한다: H2는 186R, 179K 또는 146G_179K를 포함하고 L2는 124E_160E_180E를 포함한다. 일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 하나의 H1L1 이종이합체와 하나의 H2L2 이종이합체의 조합을 포함한다. 한 구체예에서, H1L1 이종이합체 및 H2L2 이종이합체의 조합은 H1이 143E_145T를 포함하고, L1이 124R를 포함하고, H2이 179K를 포함하고, L2가 124E_160E_180E를 포함하는 것이다.
한 구체예에서, K-L 집단 2의 아미노산 조합은 표 F로부터 선택된 하나 이상의 이차 치환을 포함한다.
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 표 10-B2 내 하나 이상의 설계로 제시된 바와 같은 K-K 집단 2에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함한다.
K-K 집단 3:
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-K 집단 3에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서:
H1은 위치 186에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 180 또는 178_180에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 143 및/또는 179에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 124_178, 또는 131에 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, H2는 추가로 위치 145에 아미노산 치환을 포함한다.
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-K 집단 3에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서: H1은 위치 186에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 180에 아미노산 치환을 포함하고; 및 H2는 위치 145에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 124 또는 131에 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, L1은 추가로 위치 178에 아미노산 치환을 포함하고, H2는 추가로 위치 143 및/또는 179에 아미노산 치환을 포함하고, 및/또는 L2는 추가로 위치 178에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-K 집단 3에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서 H1은 위치 186에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 180 또는 178_180에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 143_145, 143_145_179, 또는 145_179에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 131 또는 124_178에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-K 집단 3에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서 H1 내 아미노산 치환은 186R, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택되고; L1 내 아미노산 치환은 178E, 180E, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택되고; H2 내 아미노산 치환은 143E, 145T, 179E, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택되고; L2 내 아미노산 치환은 124K, 131K, 178R, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-K 집단 3에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하는 H1L1 이종이합체를 가지며, 여기서 H1L1 이종이합체는 다음의 아미노산 치환의 집합을 포함한다: H1은 186R를 포함하고 L1은 178E_180E 또는 180E를 포함한다. 추가의 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-K 집단 3에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하는 H2L2 이종이합체를 가지며, 여기서 H2L2 이종이합체는 다음의 아미노산 치환의 집합 중 하나를 포함한다:
Figure pct00052
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 하나의 H1L1 이종이합체와 하나의 H2L2 이종이합체의 조합을 포함한다. 한 구체예에서, H1L1 이종이합체 및 H2L2 이종이합체의 조합은 H1이 186R를 포함하고, L1이 180E를 포함하고, H2가 143E_145T_179E를 포함하고 L2가 124K_178R를 포함하는 것이다.
한 구체예에서, K-L 집단 3의 아미노산 조합은 표 F로부터 선택된 하나 이상의 이차 치환을 포함한다.
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 표 10-B3 내 하나 이상의 설계로 제시된 바와 같은 K-K 집단 3에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함한다.
K-K 집단 4:
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-K 집단 4에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서: H1은 위치 179에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 180에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 143에 아미노산 치환을 포함하고, 및 L2는 위치 124에 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, H1은 추가로 위치 146에 아미노산 치환을 포함하고, H2는 추가로 위치 145에 아미노산 치환을 포함하고, 및/또는 L2는 추가로 위치 160 및/또는 178에 아미노산 치환을 포함한다.
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-K 집단 4에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서: H1은 위치 179에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 180에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 143_145에 아미노산 치환을 포함하고, 및 L2는 위치 124에 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, H1은 추가로 위치 146에 아미노산 치환을 포함하고, 및/또는 L2는 추가로 위치 160 및/또는 178에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-K 집단 4에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서 H1은 위치 146_179 또는 179에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 180에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 143_145에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 124 또는 124_160_178에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-K 집단 4에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서 H1 내 아미노산 치환은 146G, 179K, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택되고; L1 내 아미노산 치환은 180E, 또는 이들의 보존적 치환이고; H2 내 아미노산 치환은 143E, 145T, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택되고; L2 내 아미노산 치환은 124R, 160K, 178R, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-K 집단 4에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하는 H1L1 이종이합체를 가지며, 여기서 H1L1 이종이합체는 다음의 아미노산 치환의 집합을 포함한다: H1은 179K 또는 146G_179K를 포함하고, L1은 180E를 포함한다. 추가의 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-K 집단 4에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하는 H2L2 이종이합체를 가지며, 여기서 H2L2 이종이합체는 다음의 아미노산 치환의 집합을 포함한다: H2는 143E_145T를 포함하고 L2는 Q124R_Q160K_T178R 또는 Q124R를 포함한다. 일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 하나의 H1L1 이종이합체와 하나의 H2L2 이종이합체의 조합을 포함한다. 한 구체예에서, H1L1 이종이합체 및 H2L2 이종이합체의 조합은 H1이 179K를 포함하고, L1이 180E를 포함하고, H2이 143E_145T를 포함하고, L2가 124R_160K_178R를 포함하는 것이다.
한 구체예에서, K-K 집단 4의 아미노산 조합은 표 F로부터 선택된 하나 이상의 이차 치환을 포함한다.
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 표 10-B4 내 하나 이상의 설계로 제시된 바와 같은 K-K 집단 4에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함한다.
K-K 집단 5:
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-K 집단 5에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서: H1은 위치 143 또는 186에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 180에 아미노산 치환을 포함하거나 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 치환을 포함하지 않고; H2는 위치 143_145에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 124에 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, L2는 추가로 하나 이상의 위치 160 및/또는 178에 아미노산 치환을 포함한다. 부가적인 구체예에서, L2는 위치 124, 124_178 또는 124_160_178에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-K 집단 5에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서 H1 내 아미노산 치환은 186R, 143R, 143K, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택되고; L1 내 아미노산 치환은 180E, 및 이들의 보존적 치환이고; H2 내 아미노산 치환은 143E, 145T, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택되고; L2 내 아미노산 치환은 124R, 160K, 178R, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-K 집단 5에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하는 H1L1 이종이합체를 가지며, 여기서 H1L1 이종이합체는 다음의 아미노산 치환의 집합 중 하나를 포함한다:
Figure pct00053
추가의 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-K 집단 5에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하는 H2L2 이종이합체를 가지며, 여기서 H2L2 이종이합체는 다음의 아미노산 치환의 집합 중 하나를 포함한다:
Figure pct00054
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 하나의 H1L1 이종이합체와 하나의 H2L2 이종이합체의 조합을 포함한다.
한 구체예에서, K-K 집단 5의 아미노산 조합은 표 F로부터 선택된 하나 이상의 이차 치환을 포함한다.
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 표 10-B5 내 하나 이상의 설계로 제시된 바와 같은 K-K 집단 5에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함한다.
K-K 집단 6:
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-K 집단 6에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서: H1은 위치 39에 아미노산 치환을 포함하거나 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 치환을 포함하지 않고; L1은 위치 38에 아미노산 치환을 포함하거나 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 치환을 포함하지 않고; H2는 위치 39에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 38에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-K 집단 6에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서 H1 내 아미노산 치환은 39D, 39E, 39K, 39R, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택되고; L1 내 아미노산 치환은 38D, 38E, 38K, 38R, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택되고; H2 내 아미노산 치환은 39D, 39E, 39K, 39R, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택되고; L2 내 아미노산 치환은 38D, 38E, 38K, 38R, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-K 집단 6에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하는 H1L1 이종이합체를 가지며, 여기서 H1L1 이종이합체는 다음의 아미노산 치환의 집합 중 하나를 포함한다:
Figure pct00055
추가의 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-K 집단 6에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하는 H2L2 이종이합체를 가지며, 여기서 H2L2 이종이합체는 다음의 아미노산 치환의 집합 중 하나를 포함한다:
Figure pct00056
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 하나의 H1L1 이종이합체와 하나의 H2L2 이종이합체의 조합을 포함한다. 한 구체예에서, H1L1 이종이합체 및 H2L2 이종이합체의 조합은 H1이 39R를 포함하고, L1이 38E를 포함하고, H2가 39D를 포함하고, L2가 38R를 포함하는 것이다.
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 표 10-B6 내 하나 이상의 설계로 제시된 바와 같은 K-K 집단 6에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함한다. 한 구체예에서, K-K 집단 6 설계는 LCCA 고유 식별자 10674-10749 또는 10679-10744에 상응하는 설계가 아니다.
K-K 집단 7:
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-K 집단 7에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서: H1은 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 치환을 포함하지 않고; L1은 위치 135에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 139에 아미노산 치환을 포함하고, 및 L2는 위치 116에 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, L2는 추가로 위치 135에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-K 집단 7에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서 L1 내 아미노산 치환은 135W, 또는 이들의 보존적 치환이고; H2 내 아미노산 치환은 139W, 또는 이들의 보존적 치환이고; L2 내 아미노산 치환은 116A, 135V, 및 이들의 보존적 치환으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-K 집단 7에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하는 H1L1 이종이합체를 가지며, 여기서 H1L1 이종이합체는 다음의 아미노산 치환의 집합을 포함한다: H1은 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 치환을 포함하지 않고, L1은 135W를 포함한다. 추가의 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-K 집단 7에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하는 H2L2 이종이합체를 가지며, 여기서 H2L2 이종이합체는 다음의 아미노산 치환의 집합을 포함한다: H2는 139W를 포함하고, L2는 116A 또는 116A_1335V를 포함한다. 일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 하나의 H1L1 이종이합체와 하나의 H2L2 이종이합체의 조합을 포함한다.
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 표 10-B7 내 하나 또는 다른 하나의 설계로 제시된 바와 같은 K-K 집단 7에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함한다.
K-K 집단 8:
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-K 집단 8에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서: H1은 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 치환을 포함하지 않거나 위치 45에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 치환을 포함하지 않고; H2는 위치 45에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 44에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-K 집단 8에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서 H1 내 아미노산 치환은 45F, 또는 이들의 보존적 치환이고; H2 내 아미노산 치환은 45P, 45A, 또는 이들의 보존적 치환이고; L2 내 아미노산 치환은 44F 또는 이들의 보존적 치환이다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-K 집단 8에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하는 H1L1 이종이합체를 가지며, 여기서 H1L1 이종이합체는 다음의 아미노산 치환의 집합 중 하나를 포함한다: H1은 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 치환을 포함하지 않거나 45F를 포함하고, L1은 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 치환을 포함하지 않는다. 추가의 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-K 집단 8에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하는 H2L2 이종이합체를 가지며, 여기서 H2L2 이종이합체는 다음의 아미노산 치환의 집합을 포함한다: H2는 45A 또는 45P를 포함하고, L2는 44F를 포함한다. 일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 H1 및 L1이 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 치환을 포함하지 않고, H2는 45A를 포함하고 L2는 44F를 포함하는 H1L1 및 H2L2 이종이합체의 조합을 포함한다.
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 표 10-B8 내 하나 이상의 설계로 제시된 바와 같은 K-K 집단 8에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함한다.
K-K 집단 9:
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-K 집단 9에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서: H1은 위치 139에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 116에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 치환을 포함하지 않고, 및 L2는 위치 135에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-K 집단 9에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서 H1 내 아미노산 치환은 139W, 또는 이들의 보존적 치환이고; L1 내 아미노산 치환은 116A, 또는 이들의 보존적 치환이고; L2 내 아미노산 치환은 135W 또는 이들의 보존적 치환이다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-K 집단 9에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하는 H1L1 이종이합체를 가지며, 여기서 H1L1 이종이합체는 다음의 아미노산 치환의 집합을 포함한다: H1은 139W를 포함하고 L1은 116A를 포함한다. 추가의 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-K 집단 9에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하는 H2L2 이종이합체를 가지며, 여기서 H2L2 이종이합체는 다음의 아미노산 치환의 집합을 포함한다: H2는 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 치환을 포함하지 않고, L2는 135W를 포함한다.
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 표 10-B9에 제시된 바와 같은 K-K 집단 9에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함한다.
K-K 집단 10:
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-K 집단 10에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서: H1은 위치 124에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 176에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 124에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 176에 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, L1 및/또는 L2는 추가로 위치 133에 아미노산 치환을 포함한다.
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-K 집단 10에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서: H1은 위치 124에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 133_176에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 124에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 133_176에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-K 집단 10에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하고 여기서 H1 내 아미노산 치환은 124E 또는 이들의 보존적 치환이고; L1 내 아미노산 치환은 133G, 176R 또는 이들의 보존적 치환으로부터 선택되고; H2 내 아미노산 치환은 124R, 또는 이들의 보존적 치환이고; L2 내 아미노산 치환은 133G, 176D 또는 이들의 보존적 치환으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-K 집단 10에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하는 H1L1 이종이합체를 가지며, 여기서 H1L1 이종이합체는 다음의 아미노산 치환의 집합을 포함한다: H1은 124E를 포함하고, L1은 133G_176R를 포함한다. 추가의 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-K 집단 10에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함하는 H2L2 이종이합체를 가지며, 여기서 H2L2 이종이합체는 다음의 아미노산 치환의 집합을 포함한다: H2는 124R를 포함하고, L2는 133G_176D를 포함한다. 일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 이들 H1L1 및 H2L2 이종이합체의 조합을 포함한다.
한 구체예에서, K-L 집단 9의 아미노산 조합은 표 F로부터 선택된 하나 이상의 이차 치환을 포함한다.
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 표 10-B10에 제시된 바와 같은 K-K 집단 10에 따른 아미노산 치환의 조합을 포함한다.
LCCA 설계 집합에서 우선적 쌍 형성
하나 이상의 H1, L1, H2, 및 L2는 H1의 L2보다 L1과의 및 H2의 L1보다 L2와의 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 변형을 포함한다. 일반적으로, 아미노산 변형 및 임의의 자연발생적 편향성의 부재에서, 야생형 면역글로불린 중사슬 서열(H1)은, 두 가지 상이한 야생형 면역글로불린 경사슬 서열(L1 및 L2)과 동시-발현되는 경우, 통계학적으로 두 경사슬 모두와 동일하게 쌍을 형성하여, L1과 쌍을 형성한 H1(H1L1, 올바른 쌍형성) 및 L2와 쌍을 형성한 H1(H1L2, 오류쌍형성)의 대략 50:50 혼합물을 생성할 것이다. 유사하게, 야생형 H2가 야생형 L1 및 L2와 동시-발현되는 경우, 중사슬은 통계학적으로 두 경사슬 모두와 동일하게 쌍을 형성하여, L1과 쌍을 형성한 H2(H2L1, 오류쌍형성) 및 L2과 쌍을 형성한 H2(H2L2, 올바른 쌍형성)의 대략 50:50 혼합물을 생성할 것이다. 용어 "우선적 쌍 형성"은 본 명세서에서 면역글로불린 중사슬 폴리펩티드 서열이 또다른 면역글로불린 경사슬 폴리펩티드 서열보다 하나의 면역글로불린 경사슬 폴리펩티드 서열과 쌍을 형성하는 특이성 또는 쌍을 형성하는 선호성을 기술하기 위해 사용된다. 이러한 맥락에서, 우선적 쌍 형성은 예를 들면, H1이 L1 및 L2 둘다와 동시-발현될 때 H1L1 이종이합체의 양이 H1L2 이종이합체의 양보다 더 많을 경우, H1 및 L1 사이에 일어날 수 있다. 유사하게, 우선적 쌍 형성은 예를 들면, H2가 L1 및 L2 둘다와 동시-발현될 때 H2L2 이종이합체의 양이 H2L1 이종이합체의 양보다 더 많을 경우, H2 및 L2 사이에 일어날 수 있다.
그러나, 일부 경우에, 모 항체로부터 수득된 야생형 중사슬 및 경사슬 폴리펩티드 서열에서 관찰되는 고유한 쌍 형성 편향이 존재한다. 이러한 고유한 쌍 형성 편향은 야생형 모 H1 또는 H2가 야생형 모 L1 및 L2와 동시-발현되고, 경사슬 중 하나가 두 모 항체 모두의 중사슬과 우선적 쌍을 이루는 LCCA 설계 집합의 맥락에서 관찰될 수 있다. 한 구체예에서, 우선적 쌍 형성은 하나 이상의 H1, L1, H2 및 L2 내 아미노산 변형이 상응하는 야생형 시스템에서 발생하는 우선적 쌍 형성을 초월하는 우선적 쌍 형성을 촉진하는 경우 발생한다.
우선적 쌍 형성 정도, 또는 설계 강도는 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 변형의 능력을 측정한 것이다. 우선적 쌍 형성의 정도는 본 명세서의 다른 곳, 및 실시예에 기술된 바와 같이 평가될 수 있고, 오류쌍형성된 이종이합체(즉 H1L2 및 H2L1)에 비해 올바르게 쌍을 형성한 이종이합체(즉 H1L1 및 H2L2)의 측정치를 기초로 한다. 우선적 쌍 형성의 정도는 하나의 중사슬이 두 가지 고유한 경사슬과 동시-발현되는 LCCA 설계 집합(H1L1L2, 또는 H2L1L2), 또는 모 항체의 중사슬 및 경사슬이 동시-발현되는 Mab 설계 집합(H1L1H2L2)의 맥락에서 평가될 수 있다.
다음의 구체예는 LCCA 설계 집합의 맥락과 연관된다. 본 단락의 모든 구체예에서, 용어 "약"은 특정된 비율의 ± 5%를 의미하며 우선적 쌍 형성은 달리 지정되지 않은 한, 야생형에 대하여 비교된다.한 구체예에서, 하나 이상의 H1, H2, L1 및 L2는 H1의 L2보다 L1과의 우선적 쌍 형성을 촉진하여 H1L1을 형성하거나, 또는 H2의 L1보다 L2와의 우선적 쌍 형성을 촉진하여 H2L2를 형성하는 아미노산 변형을 포함하고, 여기서 H1L1:H1L2의 비율은 적어도 약 40:60이고 H2L2:H2L1의 비율은 적어도 약 60:40이다. 한 구체예에서, 하나 이상의 H1, H2, L1 및 L2는 H1의 L2보다 L1과의 우선적 쌍 형성을 촉진하여 H1L1을 형성하거나, 또는 H2의 L1보다 L2와의 우선적 쌍 형성을 촉진하여 H2L2를 형성하는 아미노산 변형을 포함하고, 여기서 H2L2:H2L1의 비율은 적어도 약 40:60이고 H1L1:H1L2의 비율은 적어도 약 60:40이다.
한 구체예에서, 하나 이상의 H1, H2, L1 및 L2는 H1의 L2보다 L1과의 우선적 쌍 형성을 촉진하여 H1L1을 형성하거나, 또는 H2의 L1보다 L2와의 우선적 쌍 형성을 촉진하여 H2L2를 형성하는 아미노산 변형을 포함하고, 여기서 H1L1:H1L2의 비율은 적어도 약 40:60이고 H2L2:H2L1의 비율은 적어도 약 65:35이다. 한 구체예에서, 하나 이상의 H1, H2, L1 및 L2는 H1의 L2보다 L1과의 우선적 쌍 형성을 촉진하여 H1L1을 형성하거나, 또는 H2의 L1보다 L2와의 우선적 쌍 형성을 촉진하여 H2L2를 형성하는 아미노산 변형을 포함하고, 여기서 H2L2:H2L1의 비율은 적어도 약 40:60이고 H1L1:H1L2의 비율은 적어도 약 65:35이다.
한 구체예에서, 하나 이상의 H1, H2, L1 및 L2는 H1의 L2보다 L1과의 우선적 쌍 형성을 촉진하여 H1L1을 형성하거나, 또는 H2의 L1보다 L2와의 우선적 쌍 형성을 촉진하여 H2L2를 형성하는 아미노산 변형을 포함하고, 여기서 H1L1:H1L2의 비율은 적어도 약 40:60이고 H2L2:H2L1의 비율은 적어도 약 70:30이다. 한 구체예에서, 하나 이상의 H1, H2, L1 및 L2는 H1의 L2보다 L1과의 우선적 쌍 형성을 촉진하여 H1L1을 형성하거나, 또는 H2의 L1보다 L2와의 우선적 쌍 형성을 촉진하여 H2L2를 형성하는 아미노산 변형을 포함하고, 여기서 H2L2:H2L1의 비율은 적어도 약 40:60이고 H1L1:H1L2의 비율은 적어도 약 70:30이다.
한 구체예에서, 하나 이상의 H1, H2, L1 및 L2는 H1의 L2보다 L1과의 우선적 쌍 형성을 촉진하여 H1L1을 형성하거나, 또는 H2의 L1보다 L2와의 우선적 쌍 형성을 촉진하여 H2L2를 형성하는 아미노산 변형을 포함하고, 여기서 H1L1:H1L2의 비율은 적어도 약 40:60이고 H2L2:H2L1의 비율은 적어도 약 75:25이다. 한 구체예에서, 하나 이상의 H1, H2, L1 및 L2는 H1의 L2보다 L1과의 우선적 쌍 형성을 촉진하여 H1L1을 형성하거나, 또는 H2의 L1보다 L2와의 우선적 쌍 형성을 촉진하여 H2L2를 형성하는 아미노산 변형을 포함하고, 여기서 H2L2:H2L1의 비율은 적어도 약 40:60이고 H1L1:H1L2의 비율은 적어도 약 75:25이다.
한 구체예에서, 하나 이상의 H1, H2, L1 및 L2는 H1의 L2보다 L1과의 우선적 쌍 형성을 촉진하여 H1L1을 형성하거나, 또는 H2의 L1보다 L2와의 우선적 쌍 형성을 촉진하여 H2L2를 형성하는 아미노산 변형을 포함하고, 여기서 H1L1:H1L2의 비율은 적어도 약 40:60이고 H2L2:H2L1의 비율은 적어도 약 80:20이다. 한 구체예에서, 하나 이상의 H1, H2, L1 및 L2는 H1의 L2보다 L1과의 우선적 쌍 형성을 촉진하여 H1L1을 형성하거나, 또는 H2의 L1보다 L2와의 우선적 쌍 형성을 촉진하여 H2L2를 형성하는 아미노산 변형을 포함하고, 여기서 H2L2:H2L1의 비율은 적어도 약 40:60이고 H1L1:H1L2의 비율은 적어도 약 80:20이다.
한 구체예에서, 하나 이상의 H1, H2, L1 및 L2는 H1의 L2보다 L1과의 우선적 쌍 형성을 촉진하여 H1L1을 형성하거나, 또는 H2의 L1보다 L2와의 우선적 쌍 형성을 촉진하여 H2L2를 형성하는 아미노산 변형을 포함하고, 여기서 H1L1:H1L2의 비율은 적어도 약 40:60이고 H2L2:H2L1의 비율은 적어도 약 85:15이다. 한 구체예에서, 하나 이상의 H1, H2, L1 및 L2는 H1의 L2보다 L1과의 우선적 쌍 형성을 촉진하여 H1L1을 형성하거나, 또는 H2의 L1보다 L2와의 우선적 쌍 형성을 촉진하여 H2L2를 형성하는 아미노산 변형을 포함하고, 여기서 H2L2:H2L1의 비율은 적어도 약 40:60이고 H1L1:H1L2의 비율은 적어도 약 85:15이다.
한 구체예에서, 하나 이상의 H1, H2, L1 및 L2는 H1의 L2보다 L1과의 우선적 쌍 형성을 촉진하여 H1L1을 형성하거나, 또는 H2의 L1보다 L2와의 우선적 쌍 형성을 촉진하여 H2L2를 형성하는 아미노산 변형을 포함하고, 여기서 H1L1:H1L2의 비율은 적어도 약 40:60이고 H2L2:H2L1의 비율은 적어도 약 90:10이다. 한 구체예에서, 하나 이상의 H1, H2, L1 및 L2는 H1의 L2보다 L1과의 우선적 쌍 형성을 촉진하여 H1L1을 형성하거나, 또는 H2의 L1보다 L2와의 우선적 쌍 형성을 촉진하여 H2L2를 형성하는 아미노산 변형을 포함하고, 여기서 H2L2:H2L1의 비율은 적어도 약 40:60이고 H1L1:H1L2의 비율은 적어도 약 90:10이다.
한 구체예에서, 하나 이상의 H1, H2, L1 및 L2는 H1의 L2보다 L1과의 우선적 쌍 형성을 촉진하여 H1L1을 형성하거나, 또는 H2의 L1보다 L2와의 우선적 쌍 형성을 촉진하여 H2L2를 형성하는 아미노산 변형을 포함하고, 여기서 H1L1:H1L2의 비율은 적어도 약 40:60이고 H2L2:H2L1의 비율은 적어도 약 95:5이다. 한 구체예에서, 하나 이상의 H1, H2, L1 및 L2는 H1의 L2보다 L1과의 우선적 쌍 형성을 촉진하여 H1L1을 형성하거나, 또는 H2의 L1보다 L2와의 우선적 쌍 형성을 촉진하여 H2L2를 형성하는 아미노산 변형을 포함하고, 여기서 H2L2:H2L1의 비율은 적어도 약 40:60이고 H1L1:H1L2의 비율은 적어도 약 95:5이다.
한 구체예에서, 하나 이상의 H1, H2, L1 및 L2는 H1의 L2보다 L1과의 우선적 쌍 형성을 촉진하여 H1L1을 형성하거나, 또는 H2의 L1보다 L2와의 우선적 쌍 형성을 촉진하여 H2L2를 형성하는 아미노산 변형을 포함하고, 여기서 H1L1:H1L2의 비율은 적어도 약 40:60이고 H2L2:H2L1의 비율은 적어도 약 99:1이다. 한 구체예에서, 하나 이상의 H1, H2, L1 및 L2는 H1의 L2보다 L1과의 우선적 쌍 형성을 촉진하여 H1L1을 형성하거나, 또는 H2의 L1보다 L2와의 우선적 쌍 형성을 촉진하여 H2L2를 형성하는 아미노산 변형을 포함하고, 여기서 H2L2:H2L1의 비율은 적어도 약 40:60이고 H1L1:H1L2의 비율은 적어도 약 99:1이다.
다른 구체예에서, 하나 이상의 H1, H2, L1 및 L2는 H1의 L2보다 L1과의 우선적 쌍 형성을 촉진하여 H1L1을 형성하거나, 또는 H2의 L1보다 L2와의 우선적 쌍 형성을 촉진하여 H2L2를 형성하는 아미노산 변형을 포함하고, 그래서 H1L1 또는 H2L2의 양이 약 40, 45, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 더 많게 된다.
한 구체예에서, 우선적 쌍 형성은 실시예에 기술된 바와 같이 LCCA에 의해 측정된다. LCCA 결과는 일반적으로 H1, L1, H2, 및 L2가 동시-발현되는 Mab 설계 집합(하기 기술됨)에서 우선적 쌍 형성의 맥락에서의 결과를 예견한다.
한 구체예에서, 하나 이상의 H1, H2, L1 및 L2는 H1의 L2보다 L1과의 우선적 쌍 형성을 촉진하여 H1L1을 형성하거나, 또는 H2의 L1보다 L2와의 우선적 쌍 형성을 촉진하여 H2L2를 형성하는 아미노산 변형을 포함하며, 그래서 H1L1 또는 H2L2 중 적어도 하나의 상대적인 쌍 형성이 야생형에 비해 적어도 약 10% 더 많고, 및 그 외의 것의 상대적인 쌍 형성은 야생형의 약 10% 이내 또는 야생형에 비해 적어도 약 10% 더 많게 된다.
한 구체예에서, 하나 이상의 H1, H2, L1 및 L2는 H1의 L2보다 L1과의 우선적 쌍 형성을 촉진하여 H1L1을 형성하거나, 또는 H2의 L1보다 L2와의 우선적 쌍 형성을 촉진하여 H2L2를 형성하는 아미노산 변형을 포함하며, 그래서 H1L1 또는 H2L2 중 적어도 하나의 상대적인 쌍 형성이 야생형에 비해 적어도 약 20% 더 많고, 및 그 외의 것의 상대적인 쌍 형성은 야생형의 약 10% 이내 또는 야생형에 비해 적어도 약 10% 더 많게 된다.
한 구체예에서, 하나 이상의 H1, H2, L1 및 L2는 H1의 L2보다 L1과의 우선적 쌍 형성을 촉진하여 H1L1을 형성하거나, 또는 H2의 L1보다 L2와의 우선적 쌍 형성을 촉진하여 H2L2를 형성하는 아미노산 변형을 포함하며, 그래서 H1L1 또는 H2L2 중 적어도 하나의 상대적인 쌍 형성이 야생형에 비해 적어도 약 30% 더 많고, 및 그 외의 것의 상대적인 쌍 형성은 야생형의 약 10% 이내 또는 야생형에 비해 적어도 약 10% 더 많게 된다.
Mab 설계 집합에서 우선적 쌍 형성
우선적 쌍 형성은 또한 H1, L1, H2 및 L2이 동시-발현되고 하나 이상의 H1, L1, H2 및 L2가 H1와 L1 및 H2와 L2의 우선적 쌍 형성을 촉진하여 올바르게 쌍을 형성한 제1 이종이합체(H1L1) 및 올바르게 쌍을 형성한 제2 이종이합체(H2L2)를 포함하는 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체를 형성하는 아미노산 변형을 포함하는 Mab 설계 집합의 맥락에서 평가될 수 있다. 이러한 유형의 구체예에서, 도 8에 나타난 바와 같이, 두 가지 구별되는 면역글로불린 중사슬 폴리펩티드 서열이 두 가지 구별되는 면역글로불린 경사슬 폴리펩티드 서열과 동시-발현되는 경우, 수많은 가능한 산물이 생성될 수 있고, 이중 열네 가지가 도 8에 나타나며, 이중 단 하나만이 요망되는, 또는 올바르게 쌍을 형성한, 이중특이적 항체 H1L1H2L2이다(도 8의 항체 종 A). 그러나, Mab 설계 집합을 기초로 중사슬 및 경사슬 사이의 올바른 쌍 형성을 평가하는 맥락에서, 일부의 추가적인 산물이 또한 Fab 수준에서 올바르게 쌍을 형성한 이종이합체(예를 들면 도 8의 항체 종 E, H, K, 및 M를 참조)를 포함하기 때문에 Fab 영역의 맥락에서 올바른 쌍 형성을 나타내는 것으로 고려될 수 있다. 일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체의 Fc 부분은 이종이합체 Fc의 형성을 촉진하는 비대칭 아미노산 변형을 포함한다. 이들 구체예에서, 종 E 내지 J의 수와 양은 감소할 것으로 예상된다.
LCCA 설계 집합에 있어서, 모든 네 가지 면역글로불린 폴리펩티드 서열 H1, L1, H2, 및 L2가 동시-발현되는 Mab 설계 집합의 맥락에서, 일부 경우에 하나의 경사슬(L1 또는 L2 중 하나)이 우선적으로 H1 및 H2 모두와 쌍을 형성하는 고유한 쌍 형성 편향성이 존재할 수 있다. 따라서, 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체의 맥락에서 Mab 설계의 강도를 측정하는 경우, Mab 설계의 아미노산 변형이 있는 쌍 형성의 정도를 상응하는 야생형 모 시스템(Mab 설계의 아미노산 변형이 없는 H1, L1, H2, L2 폴리펩티드 서열)에서 관찰되는 올바른 쌍 형성의 양에 비교하여 평가하는 것이 필요할 수 있다. 따라서, 한 구체예에서, 올바르게 쌍을 형성한 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체의 양이 상응하는 야생형 모 시스템에서 수득된 올바르게 쌍을 형성한 이중특이적 항체의 양을 초과하는 경우 Mab 설계는 우선적 쌍 형성을 보이는 것으로 간주된다. 대안적으로, 총 발현 산물 내 올바르게 쌍을 형성한 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체의 백분율이 상응하는 야생형 모 시스템의 총 발현 산물에서 수득된 올바르게 쌍을 형성한 이중특이적 항체의 백분율을 초과하는 경우 Mab 설계는 우선적 쌍 형성을 보이는 것으로 간주된다. 한 구체예에서, 총 발현 산물은 도 8의 항체 종 A 내지 N를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 총 발현 산물은 오로지 두 개의 중사슬 및 두 개의 경사슬을 가지는 항체 종(도 8의 항체 종 A 내지 J)만일 수 있다. 후자의 구체예에서, 우선적 쌍 형성은 도 8의 반쪽-항체 가령 종 K내지 N을 제외한, 총 이중특이적 항체의 백분율로서 측정된다).
또다른 구체예에서, 올바른 쌍 형성의 양이 상응하는 야생형 모 시스템에서 높은 정도의 오류쌍형성을 나타내는 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체의 이종이합체에서 증가한 경우 Mab 설계는 우선적 쌍 형성을 보이는 것으로 간주된다. 또다른 구체예에서, H1 및 L1 사이, 및 H2 및 L2 사이의 올바른 쌍 형성의 총량이 상응하는 야생형 모 시스템에서 관찰되는 총량을 초과하는 경우 Mab 설계는 우선적 쌍 형성을 보이는 것으로 간주된다. 예를 들면, 도 8에 있어서, 종 A, B, H, I, 및 M은 H1L1에 대해 올바르게 쌍을 형성한 것으로 간주되고, 종 A, C, E, F, 및 K는 H2L2에 대해 올바르게 쌍을 형성한 것으로 간주될 것이다. 이러한 구체예에서, 우선적 쌍 형성은 총 쌍 형성의 백분율로서 측정된다.
한 구체예에서, 우선적 쌍 형성은 본 명세서에 기술된 바와 같이 SMCA에 의해 측정된다.
일부 구체예에서, H1L1 및 H2L2 쌍 형성의 합으로 측정되는 올바른 쌍 형성의 총량의 변화가 우선적 쌍 형성을 촉진하는 Fab 영역 내 아미노산 치환이 없는 상응하는 H1, L1, H2 및 L2 폴리펩티드 사슬의 쌍 형성에 비해 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 또는 45%를 초과하는 경우 Mab 설계는 우선적 쌍 형성을 촉진하는 것으로 간주된다.
일부 구체예에서, 생산된 반쪽-항체가 아닌 종류의 백분율로서 생성된 이중특이적 항체의 양으로 측정되는 올바른 쌍 형성의 총량의 변화가 우선적 쌍 형성을 촉진하는 Fab 영역 내 아미노산 치환이 없는 상응하는 H1, L1, H2 및 L2 폴리펩티드 사슬의 쌍 형성에 비해 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 또는 80%를 초과하는 경우 Mab 설계는 우선적 쌍 형성을 촉진하는 것으로 간주된다.
한 구체예에서, 생산된 모든 종류의 백분율로서 생성된 이중특이적 항체의 양으로 측정되는 올바른 쌍 형성의 총량의 변화가 우선적 쌍 형성을 촉진하는 Fab 영역 내 아미노산 치환이 없는 상응하는 H1, L1, H2 및 L2 폴리펩티드 사슬의 쌍 형성에 비해 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 또는 80%를 초과하는 경우 Mab 설계는 우선적 쌍 형성을 촉진하는 것으로 간주된다.
Fab 영역의 열 안정성
하나 이상의 H1, L1, H2 및 L2 폴리펩티드 서열 내 아미노산 변형은 H1의 L2보다 L1 및 H2의 L1보다 L2와의 우선적 쌍 형성을 촉진하며, 항원-결합 폴리펩티드 구조체의 각각의 이종이합체의 열 안정성에 최소의 영향을 준다. 각각의 이종이합체에 대한 아미노산 변형의 효과는 H1 및 L1, 또는 H2 및 L2에 의해 형성된 Fab 영역의 열 안정성을 측정하고, 이를 상응하는 야생형 H1 및 L1 폴리펩티드 서열(wt 제1 Fab 영역) 또는 상응하는 야생형 H2 및 L2 폴리펩티드 서열(wt 제2 Fab 영역)에 의해 형성된 Fab 영역의 열 안정성과 비교함으로써 확인된다. 용어 "상응하는 야생형 H1 및 L1 폴리펩티드 서열" 및 "상응하는 야생형 H2 및 L2 폴리펩티드 서열"은 본 명세서에 기술된 바와 같은 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 변형을 가지지 않는 상응하는 H1, L1, H2, 및 L2 폴리펩티드 서열을 기술하는 것으로 의도된다.
열 안정성은 시차 주사 열량측정(DSC), 또는 시차 주사 형광측정(DSF)을 비롯한 당해 분야에 공지되고 본 명세서에 기술된 다양한 방법에 의해 측정될 수 있다. 후자의 방법은 "용해 온도" 또는 Tm의 측면에서 열 안정성 측정을 제공한다.
이하의 구체예의 맥락에서, 용어 "약"은 언급된 온도의 ±10%을 의미한다. 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 상응하는 wt 제1 Fab 영역의 Tm의 약 20°C 이내의 Tm을 가지는 제1 Fab 영역을 포함한다. 한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 상응하는 wt 제1 Fab 영역의 Tm의 약 15°C 이내의 Tm을 가지는 제1 Fab 영역을 포함한다. 한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 상응하는 wt 제1 Fab 영역의 Tm의 약 10°C 이내의 Tm을 가지는 제1 Fab 영역을 포함한다. 한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 상응하는 wt 제1 Fab 영역의 Tm의 약 9°C 이내의 Tm을 가지는 제1 Fab 영역을 포함한다. 한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 상응하는 wt 제1 Fab 영역의 Tm의 약 8°C 이내의 Tm을 가지는 제1 Fab 영역을 포함한다. 한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 상응하는 wt 제1 Fab 영역의 Tm의 약 7°C 이내의 Tm을 가지는 제1 Fab 영역을 포함한다. 한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 상응하는 wt 제1 Fab 영역의 Tm의 약 6°C 이내의 Tm을 가지는 제1 Fab 영역을 포함한다. 한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 상응하는 wt 제1 Fab 영역의 Tm의 약 5°C 이내의 Tm을 가지는 제1 Fab 영역을 포함한다. 한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 상응하는 wt 제1 Fab 영역의 Tm의 약 4°C 이내의 Tm을 가지는 제1 Fab 영역을 포함한다. 한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 상응하는 wt 제1 Fab 영역의 Tm의 약 3°C 이내의 Tm을 가지는 제1 Fab 영역을 포함한다. 한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 상응하는 wt 제1 Fab 영역의 Tm의 약 2°C 이내의 Tm을 가지는 제1 Fab 영역을 포함한다. 한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 상응하는 wt 제1 Fab 영역의 Tm의 약 1°C 이내의 Tm을 가지는 제1 Fab 영역을 포함한다. 한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 상응하는 wt 제1 Fab 영역과 거의 동일한 Tm을 가지는 제1 Fab 영역을 포함한다.
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 상응하는 wt 제2 Fab 영역의 Tm의 약 20°C 이내의 Tm을 가지는 제2 Fab 영역을 포함한다. 한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 상응하는 wt 제2 Fab 영역의 Tm의 약 15°C 이내의 Tm을 가지는 제2 Fab 영역을 포함한다. 한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 상응하는 wt 제2 Fab 영역의 Tm의 약 10°C 이내의 Tm을 가지는 제2 Fab 영역을 포함한다. 한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 상응하는 wt 제2 Fab 영역의 Tm의 약 9°C 이내의 Tm을 가지는 제2 Fab 영역을 포함한다. 한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 상응하는 wt 제2 Fab 영역의 Tm의 약 8°C 이내의 Tm을 가지는 제2 Fab 영역을 포함한다. 한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 상응하는 wt 제2 Fab 영역의 Tm의 약 7°C 이내의 Tm을 가지는 제2 Fab 영역을 포함한다. 한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 상응하는 wt 제2 Fab 영역의 Tm의 약 6°C 이내의 Tm을 가지는 제2 Fab 영역을 포함한다. 한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 상응하는 wt 제2 Fab 영역의 Tm의 약 5°C 이내의 Tm을 가지는 제2 Fab 영역을 포함한다. 한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 상응하는 wt 제2 Fab 영역의 Tm의 약 4°C 이내의 Tm을 가지는 제2 Fab 영역을 포함한다. 한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 상응하는 wt 제2 Fab 영역의 Tm의 약 3°C 이내의 Tm을 가지는 제2 Fab 영역을 포함한다. 한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 상응하는 wt 제2 Fab 영역의 Tm의 약 2°C 이내의 Tm을 가지는 제2 Fab 영역을 포함한다. 한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 상응하는 wt 제2 Fab 영역의 Tm의 약 1°C 이내의 Tm을 가지는 제2 Fab 영역을 포함한다. 한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 상응하는 wt 제2 Fab 영역과 거의 동일한 Tm을 가지는 제2 Fab 영역을 포함한다.
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 제1 이종이합체 및 제2 이종이합체를 포함하며 여기서 제1 Fab 영역의 용해 온도(Tm)는 제1 항원에 대한 상응하는 야생형 H1 및 L1 폴리펩티드 서열에 의해 형성된 Fab 영역(wt 제1 Fab 영역)의 Tm의 약 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 20°C 이내이고, 및/또는 제2 Fab 영역의 용해 온도(Tm)는 제2 항원에 대한 상응하는 야생형 H2 및 L2 폴리펩티드 서열에 의해 형성된 Fab 영역(wt 제2 Fab 영역)의 Tm의 약 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 20°C 이내이다.
게다가, 일부 구체예에서, 제1 또는 제2 Fab 영역의 Tm은 상응하는 wt 제1 Fab 또는 상응하는 제2 wt 제2 Fab의 그것을 초과한다. 따라서, 한 구체예에서, 제1 또는 제2 Fab 영역의 Tm은 상응하는 wt 제1 Fab 영역 또는 상응하는 wt 제2 Fab 영역에 비해 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8. 0.9, 1.0, 1.1, 1.2,.1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.5, 5.0 °C 또는 그 이상 증가한다.
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 설계 번호 2979, 3018, 3041, 3102, 3898, 및/또는 3947에 상응하는 아미노산 치환을 포함한다. 한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 K-L 설계 번호 3025, 3109, 3113, 3878, 3890, 3910, 3931, 3954, 3967, 4010, 및/또는 4040에 상응하는 아미노산 치환을 포함한다.
항원에 결합하는 Fab 영역의 능력
하나 이상의 H1, L1, H2 및 L2 폴리펩티드 서열 내 아미노산 변형은 H1의 L2보다 L1 및 H2의 L1보다 L2와의 우선적 쌍 형성을 촉진하며, 항원-결합 폴리펩티드 구조체의 각각의 이종이합체가 이의 항원에 결합하는 능력에 최소의 영향을 준다. 각각의 이종이합체에 대한 아미노산 변형의 효과는 H1 및 L1, 또는 H2 및 L2에 의해 형성된 Fab 영역이 이들의 각각의 항원에 결합하는 능력을 측정하고, 이를 상응하는 wt 제1 Fab 영역, 또는 상응하는 wt 제2 Fab 영역이 이들의 각각의 항원에 결합하는 능력과 비교하여 확인된다.
Fab 영역이 이들의 각각의 항원에 결합하는 능력은 당해 분야에 공지된 수많은 방법에 의해 측정될 수 있고, 이중 일부가 본 명세서의 다른 곳에 기술되어 있다. 예를 들면 표면 플라스몬 공명(SPR), 또는 전세포 결합 어세이가 제1 항원에 결합하는 제1 Fab 영역의 능력 및 제2 항원에 결합하는 제2 Fab 영역의 능력을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 후자의 두 방법은 Fab 영역이 이들의 각각의 항원에 결합하는 능력을 이의 항원에 대한 Fab 영역의 친화성을 결정함으로써 측정한다.
한 구체예에서, 제1 항원에 대한 제1 Fab 영역의 친화성은 제1 항원에 대한 wt 제1 Fab 영역의 친화성의 약 100-배 이내이다. 한 구체예에서, 제1 항원에 대한 제1 Fab 영역의 친화성은 제1 항원에 대한 wt 제1 Fab 영역의 친화성의 약 50-배 이내이다. 한 구체예에서, 제1 항원에 대한 제1 Fab 영역의 친화성은 제1 항원에 대한 wt 제1 Fab 영역의 친화성의 약 40-배 이내이다. 한 구체예에서, 제1 항원에 대한 제1 Fab 영역의 친화성은 제1 항원에 대한 wt 제1 Fab 영역의 친화성의 약 30-배 이내이다. 한 구체예에서, 제1 항원에 대한 제1 Fab 영역의 친화성은 제1 항원에 대한 wt 제1 Fab 영역의 친화성의 약 20-배 이내이다. 한 구체예에서, 제1 항원에 대한 제1 Fab 영역의 친화성은 제1 항원에 대한 wt 제1 Fab 영역의 친화성의 약 10-배 이내이다. 한 구체예에서, 제1 항원에 대한 제1 Fab 영역의 친화성은 제1 항원에 대한 wt 제1 Fab 영역의 친화성의 약 9-배 이내이다. 한 구체예에서, 제1 항원에 대한 제1 Fab 영역의 친화성은 제1 항원에 대한 wt 제1 Fab 영역의 친화성의 약 8-배 이내이다. 한 구체예에서, 제1 항원에 대한 제1 Fab 영역의 친화성은 제1 항원에 대한 wt 제1 Fab 영역의 친화성의 약 7-배 이내이다. 한 구체예에서, 제1 항원에 대한 제1 Fab 영역의 친화성은 제1 항원에 대한 wt 제1 Fab 영역의 친화성의 약 6-배 이내이다. 한 구체예에서, 제1 항원에 대한 제1 Fab 영역의 친화성은 제1 항원에 대한 wt 제1 Fab 영역의 친화성의 약 5-배 이내이다. 한 구체예에서, 제1 항원에 대한 제1 Fab 영역의 친화성은 제1 항원에 대한 wt 제1 Fab 영역의 친화성의 4-배 이내이다. 한 구체예에서, 제1 항원에 대한 제1 Fab 영역의 친화성은 제1 항원에 대한 wt 제1 Fab 영역의 친화성의 약 3-배 이내이다. 한 구체예에서, 제1 항원에 대한 제1 Fab 영역의 친화성은 제1 항원에 대한 wt 제1 Fab 영역의 친화성의 약 2-배 이내이다. 한 구체예에서, 제1 항원에 대한 제1 Fab 영역의 친화성은 제1 항원에 대한 wt 제1 Fab 영역의 친화성과 거의 동일하다.
한 구체예에서, 제2 항원에 대한 제2 Fab 영역의 친화성은 제2 항원에 대한 wt 제2 Fab 영역의 친화성의 약 100-배 이내이다. 한 구체예에서, 제2 항원에 대한 제2 Fab 영역의 친화성은 제2 항원에 대한 wt 제2 Fab 영역의 친화성의 약 50-배 이내이다. 한 구체예에서, 제2 항원에 대한 제2 Fab 영역의 친화성은 제2 항원에 대한 wt 제2 Fab 영역의 친화성의 약 40-배 이내이다. 한 구체예에서, 제2 항원에 대한 제2 Fab 영역의 친화성은 제2 항원에 대한 wt 제2 Fab 영역의 친화성의 약 30-배 이내이다. 한 구체예에서, 제2 항원에 대한 제2 Fab 영역의 친화성은 제2 항원에 대한 wt 제2 Fab 영역의 친화성의 약 20-배 이내이다. 한 구체예에서, 제2 항원에 대한 제2 Fab 영역의 친화성은 제2 항원에 대한 wt 제2 Fab 영역의 친화성의 약 10-배 이내이다. 한 구체예에서, 제2 항원에 대한 제2 Fab 영역의 친화성은 제2 항원에 대한 wt 제2 Fab 영역의 친화성의 약 9-배 이내이다. 한 구체예에서, 제2 항원에 대한 제2 Fab 영역의 친화성은 제2 항원에 대한 wt 제2 Fab 영역의 친화성의 약 8-배 이내이다. 한 구체예에서, 제2 항원에 대한 제2 Fab 영역의 친화성은 제2 항원에 대한 wt 제2 Fab 영역의 친화성의 약 7-배 이내이다. 한 구체예에서, 제2 항원에 대한 제2 Fab 영역의 친화성은 제2 항원에 대한 wt 제2 Fab 영역의 친화성의 약 6-배 이내이다. 한 구체예에서, 제2 항원에 대한 제2 Fab 영역의 친화성은 제2 항원에 대한 wt 제2 Fab 영역의 친화성의 약 5-배 이내이다. 한 구체예에서, 제2 항원에 대한 제2 Fab 영역의 친화성은 제2 항원에 대한 wt 제2 Fab 영역의 친화성의 4-배 이내이다. 한 구체예에서, 제2 항원에 대한 제2 Fab 영역의 친화성은 제2 항원에 대한 wt 제2 Fab 영역의 친화성의 약 3-배 이내이다. 한 구체예에서, 제2 항원에 대한 제2 Fab 영역의 친화성은 제2 항원에 대한 wt 제2 Fab 영역의 친화성의 약 2-배 이내이다. 한 구체예에서, 제2 항원에 대한 제2 Fab 영역의 친화성은 제2 항원에 대한 wt 제2 Fab 영역의 친화성과 거의 동일하다.
아미노산 변형 또는 설계 집합의 이동가능성
본 명세서에 기술된 아미노산 변형 또는 설계 집합은 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체를 제조하기 위해 사용될 수 있고 여기서 각각의 이종이합체의 면역글로불린 중사슬 폴리펩티드 서열 및 면역글로불린 경사슬 폴리펩티드는 하나 이상의 모 항체로부터 수득될 수 있고, 이때 적어도 하나의 모 항체는 카파 경사슬을 포함하고, 적어도 하나의 다른 모 항체는 람다 경사슬을 포함한다. 이하의 논의를 근거로, Mab 설계 집합은 대부분의 그러한 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체에 적용될 수 있다.
면역글로불린 중사슬 및 경사슬 사이의 접점 내 VH:VL 및 CH1:CL 접점 잔기는 비교적 잘 보존되어 있다(Padlan 등, 1986, Mol. Immunol. 23(9): 951-960). 이러한 서열 보존은, 진화 제약의 결과로서, 경사슬 및 중사슬의 조합적 쌍 형성 도중 기능적으로 활성인 항체 결합 도메인이 형성될 가능성을 증가시킨다. 이러한 서열 보존의 결과로, 본 명세서에 기술되고 우선적 쌍 형성을 추진하는 D3H44 카파 Fab 및 CAT-2200 람다 Fab의 구조의 모델링을 기초로 하는 Mab 설계 집합은, 이러한 영역이 항체에 걸쳐 높은 서열 보존을 나타내기 때문에, 다른 모 항체의 카파 Fab 및 람다 Fab로 이동되어 우선적 쌍 형성을 추진할 수 있다고 추론된다. 추가로, 서열 차이가 발생하는 경우, 이들은 보통 CH1:CL 접점에서 원위에 위치한다. 이는 특히 CH1 및 CL 도메인의 경우에 해당한다. 한 구체예에서, 본 명세서에 기술된 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 카파 Fab가 CL 및/또는 CH1 도메인 내에 우선적 쌍 형성을 촉진하는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 이종이합체를 포함한다. 한 구체예에서, 본 명세서에 기술된 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 람다 Fab가 CL 및/또는 CH1 도메인 내에 우선적 쌍 형성을 촉진하는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 이종이합체를 포함한다.
그러나, CDR(상보성-결정 영역) 루프 잔기 (및 길이)와 관련하여, 특히 CDR-H3에 있어서 항원-결합 부위의 일부 서열 가변성이 존재한다. 따라서, 한 구체예에서, 본 명세서에 기술된 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 항원-결합 부위의 아미노산 서열이 D3H44 항체의 그것과 상당히 상이할 경우 카파 Fab가 CDR 루프에서 원위에 위치하는 VH 및/또는 VL 도메인 내에 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 이종이합체를 포함한다. 또다른 구체예에서, 본 명세서에 기술된 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 항원-결합 부위의 아미노산 서열이 CAT-2200 항체의 그것과 상당히 상이할 경우 람다 Fab가 CDR 루프에서 원위에 위치하는 VH 및/또는 VL 도메인 내에 우선적 쌍 형성을 촉진하는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 이종이합체를 포함한다. 또다른 구체예에서, 본 명세서에 기술된 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 항원-결합 부위의 아미노산 서열이 D3H44 항체의 그것과 실질적으로 유사할 경우 카파 Fab가 CDR 루프에서 근위 또는 원위에 위치하는 VH 및/또는 VL 도메인 내에 우선적 쌍 형성을 촉진하는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 이종이합체를 포함한다. 또다른 구체예에서, 본 명세서에 기술된 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 항원-결합 부위의 아미노산 서열이 CAT-2200 항체의 그것과 실질적으로 유사할 경우 람다 Fab가 CDR 루프에서 근위 또는 원위에 위치하는 VH 및/또는 VL 도메인 내에 우선적 쌍 형성을 촉진하는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 이종이합체를 포함한다. 한 구체예에서, 본 명세서에 기술된 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 카파 Fab가 CL 및/또는 CH1 도메인 내에 우선적 쌍 형성을 촉진하는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함할 뿐만 아니라 VH 및/또는 VL 도메인 내에 변형을 포함하는 이종이합체를 포함한다. 한 구체예에서, 본 명세서에 기술된 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 람다 Fab가 CL 및/또는 CH1 도메인 내에 우선적 쌍 형성을 촉진하는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함할 뿐만 아니라 VH 및/또는 VL 도메인 내에 변형을 포함하는 이종이합체를 포함한다.
한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체의 하나 이상의 H1, L1, H2, 및 L2 내 아미노산 변형은 하나의 모 항체의 카파 Fab가 인간 또는 인간화된 IgG1/κ인 항원-결합 폴리펩티드 구조체에서 우선적 쌍 형성을 촉진할 수 있다. 그러한 모 항체의 비-제한적인 예시는 오파투무맙(인간) 또는 트라스투주맙, 또는 베바시주맙(인간화)을 포함한다. 한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체의 하나 이상의 H1, L1, H2, 및 L2 내 아미노산 변형은 하나의 모 항체의 람다 Fab가 인간 또는 인간화된 IgG1/람다인 항원-결합 폴리펩티드 구조체에서 우선적 쌍 형성을 촉진할 수 있다. 그러한 인간 항체의 비-제한적인 예시는 브리아키누맙 또는 시팔리무맙을 포함하는 반면, 인간화된 항체의 예시는 브론틱투주맙이다.
또다른 구체예에서, 본 명세서에 기술된 아미노산 변형은 일반적으로 사용되는 VH 및 VL 하위군을 이용하는 항체의 면역글로불린 중사슬 및 경사슬로 이동가능하다.
한 구체예에서, 본 명세서에 기술된 아미노산 변형은 생식계열에 가까운 프레임워크를 가지는 항체의 면역글로불린 중사슬 및 경사슬로 이동가능하다. 그러한 항체의 예시는 오비누투주맙을 포함한다.
한 구체예에서, 본 명세서에 기술된 아미노산 변형은 중사슬 및 경사슬 쌍에 대해 관찰되는 평균에 가까운 VH:VL 도메인간 각을 가지는 항체의 면역글로불린 중사슬 및 경사슬로 이동가능하다. 이러한 유형의 항체의 예시는 페르투주맙을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 또다른 구체예에서, 본 명세서에 기술된 아미노산 변형은 표준적인 CL 및 CH1 도메인을 가지는 항체의 면역글로불린 중사슬 및 경사슬로 이동가능하다. 그러한 항체의 적절한 예시는 트라스투주맙을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
실시예, 도면, 및 표는 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 변형(예컨대, 가변 영역 및 불변 영역을 포함하는 하나 이상의 Fab 단편 내부의)이 다른 면역글로불린 중사슬 및 경사슬로 이동가능하여, 하나의 면역글로불린 중사슬이 두 면역글로불린 경사슬 중 하나와 우선적으로 쌍을 형성하는 유사한 패턴을 야기함을 증명한다.
스캐폴드(Scaffold)
항원-결합 폴리펩티드 구조체의 이종이합체는 스캐폴드에 연결될 수 있다. 봬냔骸若 펩티드, 폴리펩티드, 중합체, 나노입자 또는 다른 화학적 요소일 수 있다. 항원-결합 폴리펩티드 구조체의 이종이합체는 스캐폴드의 N- 또는 C-말단 중 어느 하나에 연결될 수 있고, 여기서 스캐폴드는 폴리펩티드이다. 한 구체예에서, 스캐폴드는 알부민 폴리펩티드이다.
또다른 구체예에서, 스캐폴드는 면역글로불린 Fc(Fc), 또는 이의 부분이다. 일부 구체예에서, Fc는 적어도 하나 또는 두 개의 CH3 도메인 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, Fc는 추가로 적어도 하나 또는 두 개의 CH2 도메인 서열을 포함한다. 일부 구체예에서 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 하나 이상의 링커로 또는 없이, 제1 이종이합체 및/또는 제2 이종이합체에 커플링되는 Fc를 포함한다. 일부 구체예에서, Fc는 인간 Fc이다. 일부 구체예에서, Fc는 인간 IgG 또는 IgG1 Fc이다. 일부 구체예에서, Fc는 이종이합체 Fc이다. 일부 구체예에서, Fc는 단일 폴리펩티드이다. 일부 구체예에서, Fc는 복수의 펩티드, 예컨대, 두 개의 폴리펩티드이다.
일부 구체예에서, Fc는 적어도 하나의 CH3 도메인 서열 내에 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 아미노산 변형은 동종이합체 CH3 도메인 서열에 비해 이종이합체 CH3 도메인 서열 사이에 우선적 쌍 형성을 추진하기 위해 면역글로불린 Fc에 만들어질 수 있다. 그러한 아미노산 변형은 당해 분야에 공지이며, 예를 들면, US 특허 공개 번호 2012/0149876호에 기술된 것들을 포함한다. 동종이합체 CH3 도메인 서열에 비해 이종이합체 CH3 도메인 서열 사이에 우선적 쌍 형성을 추진하기 위한 대안적 전략은, 예를 들면, "단추와 구멍"을 포함하며, 이온성 상호작용을 이용한 하전된 잔기, 및 가닥-교환 조작된 도메인(SEED) 기술이 또한 사용될 수 있다. 후자의 전략은 당해 분야에 기술되어 있고 Klein 등, 상기와 동일에서 검토된 바 있다. Fc 도메인의 추가적인 논의가 하기에 계속된다.
일부 양태에서, Fc는 2011년 11월 4일에 출원된 특허 출원 PCT/CA2011/001238호 또는 2012년 11월 2일에 출원된 PCT/CA2012/050780호에 기술된 Fc이며, 이들 각각의 전체 개시는 모든 목적에 있어서 그 전체가 본 명세서에 참고로서 포함된다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기술된 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 비대칭적으로 변형된 변형된 CH3 도메인을 포함하는 이종이합체 Fc를 포함한다. 이종이합체 Fc는 두 가지 중사슬 불변 도메인 폴리펩티드: 제1 중사슬 폴리펩티드 및 제2 중사슬 폴리펩티드를 포함할 수 있고, 이들은 Fc가 하나의 제1 중사슬 폴리펩티드 및 하나의 제2 중사슬 폴리펩티드를 포함하는 조건으로 상호교환적으로 사용될 수 있다. 일반적으로, 제1 중사슬 폴리펩티드는 제1 CH3 서열을 포함하고 제2 중사슬 폴리펩티드는 제2 CH3 서열을 포함한다.
비대칭 방식으로 도입된 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 두 가지 CH3 서열은 두 CH3 서열이 이합체를 형성할 경우 일반적으로 동종이합체보다 이종이합체 Fc를 생성한다. 본 명세서에서 사용된, "비대칭 아미노산 변형"은 제1 CH3 서열 상의 특정한 위치의 아미노산이 동일한 위치의 제2 CH3 서열 상의 아미노산과 상이하고, 제1 및 제2 CH3 서열이 우선적으로 쌍을 이뤄 동종이합체보다는 이종이합체를 형성하는 임의의 변형을 가리킨다. 이러한 이종이합체는 각각의 서열 상의 동일한 각각의 아미노산 위치에서 두 아미노산 중 단 하나의 변형; 또는 각각의 제1 및 제2 CH3 서열 상의 동일한 각각의 위치에서 각각의 서열 상의 두 아미노산 모두의 변형으로 생성될 수 있다. 이종이합체 Fc의 제1 및 제2 CH3 서열은 하나 또는 하나 이상의 비대칭 아미노산 변형을 포함할 수 있다.
표 X는 전장 인간 IgG1 중사슬의 아미노산 231 내지 447에 상응하는, 인간 IgG1 Fc 서열의 아미노산 서열을 제공한다. CH3 서열은 전장 인간 IgG1 중사슬의 아미노산 341-447을 포함한다.
전형적으로 Fc는 이합체를 형성할 수 있는 두 가지의 연접한 중사슬 서열(A 및 B)을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, Fc 중 하나 또는 두 서열 모두는 하나 이상의 돌연변이 또는 변형을 다음의 위치에 포함한다: EU 번호를 이용하여, L351, F405, Y407, T366, K392, T394, T350, S400, 및/또는 N390. 일부 양태에서, Fc는 표 X에 나타난 돌연변이 서열을 포함한다. 일부 양태에서, Fc는 변이체 1 A-B의 돌연변이를 포함한다. 일부 양태에서, Fc는 변이체 2 A-B의 돌연변이를 포함한다. 일부 양태에서, Fc는 변이체 3 A-B의 돌연변이를 포함한다. 일부 양태에서, Fc는 변이체 4 A-B의 돌연변이를 포함한다. 일부 양태에서, Fc는 변이체 5 A-B의 돌연변이를 포함한다.
Figure pct00057
일부 구체예에서, Fc는 적어도 하나의 CH2 도메인 서열 내에 하나 이상의 아미노산 변형을 포함할 수 있다. Fc의 중사슬 서열 내 수많은 돌연변이는 상이한 Fc 감마 수용체에 있어서 항체 Fc의 친화성을 선택적으로 변화시키기 위해 당해 분야에 공지되어 있다. 일부 구체예에서, Fc는 항원-결합 폴리펩티드 구조체에 대한 Fc-감마 수용체의 결합을 개조하기 위한 하나 이상의 변형을 포함한다
CH2 도메인은 표 X에 나타난 서열의 아미노산 231-340에 상응한다. Fc-감마 수용체에 결합하기 위한 항원-결합 폴리펩티드 구조체의 Fc의 능력을 변화시키는 예시적인, 비-제한적인 아미노산 변형이 하기에 나열된다:
S298A/E333A/K334A, S298A/E333A/K334A/K326A (Lu Y, Vernes JM, Chiang N, 등 J Immunol Methods. 2011년 2월 28일;365(1-2):132-41); F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L, F243L/R292P/Y300L/L235V/P396L (Stavenhagen JB, Gorlatov S, Tuaillon N, 등 Cancer Res. 2007년 9월 15일;67(18):8882-90; Nordstrom JL, Gorlatov S, Zhang W, 등. Breast Cancer Res. 2011년 11월 30일;13(6):R123); F243L (Stewart R, Thom G, Levens M, 등 Protein Eng Des Sel. 2011년 9월;24(9):671-8.), S298A/E333A/K334A (Shields RL, Namenuk AK, Hong K, 등 J Biol Chem. 2001년 3월 2일;276(9):6591-604); S239D/I332E/A330L, S239D/I332E (Lazar GA, Dang W, Karki S, 등 Proc Natl Acad Sci U S A. 2006년 3월 14일;103(11):4005-10); S239D/S267E, S267E/L328F (Chu SY, Vostiar I, Karki S, 등 Mol Immunol. 2008년 9월;45(15):3926-33); S239D/D265S/S298A/I332E, S239E/S298A/K326A/A327H, G237F/S298A/A330L/I332E, S239D/I332E/S298A, S239D/K326E/A330L/I332E/S298A, G236A/S239D/D270L/I332E, S239E/S267E/H268D, L234F/S267E/N325L, G237F/V266L/S267D 및 본 명세서에 참고로서 포함된 WO2011/120134호 및 WO2011/120135호에 나열된 다른 돌연변이. 　Therapeutic Antibody Engineering(William R. Strohl 및 Lila M. Strohl 저, Woodhead Publishing series in Biomedicine No 11, ISBN 1 907568 37 9, 2012년 10월)은 283쪽에 Fc-감마 수용체에 대한 Fc의 결합에 영향을 주는 Fc에 대한 추가적인 변형을 기술한다.
이펙터 기능을 향상하기 위한 추가적인 변형.
일부 구체예에서 본 명세서에 기술된 항원-결합 폴리펩티드 구조체의 Fc는 이의 이펙터 기능을 향상하기 위해 변형될 수 있다. 그러한 변형은 당해 분야에 공지되며 탈푸코실화, 또는 활성화 수용체, 주로 ADCC에 있어서는 FCGR3a, 및 CDC에 있어서는 C1q를 표적하는 항체의 Fc 부분의 친화성 조작을 포함한다. 이어지는 표 Y는 이펙터 기능 조작에 대한 문헌에 보고된 다양한 설계를 요약한다.
Figure pct00058
따라서, 한 구체예에서, 본 명세서에 기술된 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 상기 표에서 보이는 바와 같이 향상된 이펙터 기능을 부여하는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 이량체 Fc를 포함할 수 있다. 또다른 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 이펙터 기능을 향상하기 위해 탈푸코실화될 수 있다.
FcRn 결합 및 PK 척도
당해 분야에 공지된 바와 같이, FcRn에 대한 결합은 세포내 이입된 항체를 엔도좀으로부터 다시 혈류로 순환시킨다(Raghavan 등, 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ghetie 등, 2000, Annu Rev Immunol 18:739-766). 이러한 과정은, 전장 분자의 커다란 크기로 인한 신장 여과의 배제와 더해져, 한 주 내지 삼 주에 이르는 유리한 항체 혈청 반-감기를 생성한다. FcRn에 대한 Fc의 결합은 또한 항체 수송에서 핵심 역할을 수행한다. 따라서, 한 구체예에서, Fc는 FcRn에 결합하는 Fc의 능력을 변형 또는 촉진하는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다.
링커
본 명세서에 기술된 구조체는 본 명세서에 기술된 Fc에 작동가능하게 커플링된 본 명세서에 기술된 하나 이상의 이종이합체를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, Fc는 하나 이상의 링커로 또는 없이 하나 이상의 이종이합체에 커플링된다. 일부 양태에서, Fc는 하나 이상의 이종이합체에 직접 커플링된다. 일부 양태에서, Fc는 하나 이상의 링커에 의해 하나 이상의 이종이합체에 커플링된다. 일부 양태에서, Fc는 링커에 의해 각각의 이종이합체의 중사슬에 커플링된다.
일부 양태에서, 하나 이상의 링커는 하나 이상의 폴리펩티드 링커이다. 일부 양태에서, 하나 이상의 링커는 하나 이상의 항체 경첩 부위를 포함한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 링커는 하나 이상의 IgG1 경첩 부위를 포함한다.
추가적인 임의의 변형
한 구체예에서, 본 명세서에 기술된 항원-결합 폴리펩티드 구조체의 면역글로불린 중사슬 및 경사슬은 공유적 부착이 중사슬 및 경사슬 사이의 우선적 쌍 형성을 방해하지 않도록 또는 이종이합체가 이의 항원에 결합하는 능력에 영향을 주도록, 또는 이의 안정성에 영향을 주도록 추가로 변형(즉, 다양한 유형의 분자의 공유적 부착에 의해)될 수 있다. 그러한 변형은, 예를 들면, 제한하는 것이 아니면서도, 당화, 아세틸화, 페길화, 인산화, 아미드화, 공지의 보호/차단 기에 의한 유도체화, 단백질가수분해 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질에의 연결, 등을 포함한다. 임의의 수많은 화학적 변형이 이에 제한되지 않지만, 특이적 화학 절단, 아세틸화, 포르밀화, 튜니카마이신의 대사 합성, 등을 비롯한 공지의 기술에 의해 수행될 수 있다.
또다른 구체예에서, 본 명세서에 기술된 항원-결합 폴리펩티드 구조체의 면역글로불린 중사슬 및 경사슬은 치료제 또는 약물 모이어티에 공액결합(직접 또는 간접적으로)되어 소정의 생물학적 반응을 변형할 수 있다. 특정한 구체예에서 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 약물, 예컨대, 독소, 화학요법제, 면역 조절제, 또는 방사성 동위원소에 공액결합된다. ADC(항체-약물 접합체 또는 항원-결합 폴리펩티드 구조체 약물 접합체)를 제조하는 몇몇 방법이 당해 분야에 공지되어 있고 예를 들면 US 특허 8,624,003호(팟(pot) 방법), 8,163,888호(한-단계), 및 5,208,020호(두-단계 방법)에 기술되어 있다. 일부 구체예에서, 약물은 마이탄신, 아우리스타틴, 칼리케아미신, 또는 이들의 유도체로부터 선택된다. 다른 구체예에서, 약물은 DM1 및 DM4로부터 선택된 마이탄신이다.
일부 구체예에서 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 세포독성제에 공액결합된다. 본 명세서에서 사용된 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 저해 또는 방해 및/또는 세포의 파괴를 야기하는 물질을 가리킨다. 상기 용어는 방사성 동위원소(예컨대 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, 및 Lu177), 화학요법제, 및 독소 가령 단편 및/또는 이들의 변이체를 비롯한 소형 분자 독소 또는 효소적으로 활성인 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 유래 독소를 포함하는 것으로 의도된다.
치료제 또는 약물 모이어티는 전통적인 화학적 치료제에 제한되는 것으로 여겨지지 않는다. 예를 들면, 약물 모이어티는 요망되는 생물학적 활성을 보유하는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 그러한 단백질은, 예를 들면, 독소 가령 아브린, 리신 A, 온코나제(Onconase)(또는 또다른 세포독성 리보뉴클레아제), 슈도모나스 외독소, 콜레라 독소, 또는 디프테리아 독소; 단백질 가령 종양 괴사 인자, 알파-인터페론, 베타-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 조직 플라스미노겐 활성화제, 아폽토시스 물질, 예컨대, TNF-알파, TNF-베타, AIM I (국제 공보 번호 WO 97/33899호를 참조), AIM II (국제 공보 번호 WO 97/34911를 참조), Fas 리간드(Takahashi 등, 1994, J. Immunol., 6:1567), 및 VEGI (국제 공보 번호 WO 99/23105호를 참조), 혈전유발 물질 또는 항-혈관형성 물질, 예컨대, 앤지오스타틴 또는 엔도스타틴; 또는, 생물학적 반응 조절제 가령, 예를 들면, 림포카인(예컨대, 인터류킨-1("IL-1"), 인터류킨-2("IL-2"), 인터류킨-6("IL-6"), 과립구 대식 세포 콜로니 자극 인자("GM-CSF"), 및 과립구 콜로니 자극 인자("G-CSF")), 또는 성장 인자(예컨대, 성장 호르몬("GH"))를 포함할 수 있다.
게다가, 대안적인 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 치료적 모이어티 가령 방사성 물질 또는 방사성금속 이온을 공액결합하기에 유용한 거대고리 킬레이트제(상기 방사성 물질에 대한 예시를 참조)에 공액결합될 수 있다. 특정한 구체예에서, 거대고리 킬레이트제는 링커 분자를 통해 항체에 부착될 수 있는 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-N,N',N",N"-테트라아세트산(DOTA)이다. 그러한 링커 분자는 당해 분야에 널리 공지되어 있고 Denardo 등, 1998, Clin Cancer Res. 4:2483; Peterson 등, 1999, Bioconjug. Chem. 10:553; 및 Zimmerman 등, 1999, Nucl. Med. Biol. 26:943에 기술되어 있다.
일부 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체의 면역글로불린 중사슬 및 경사슬은 정제 및/또는 시험 등을 용이하게 하는 태그를 포함하는 융합 단백질로서 발현된다 본 명세서에 언급된 바와 같이, "태그"는 단백질의 식별 또는 정제에 기여하는 단백질 내 C-말단, N-말단, 또는 내부에 제공되는 임의의 부가된 일련의 아미노산이다. 적절한 태그는 정제 및/또는 시험에서 유용하다고 당해 분야의 숙련가에게 공지된 태그 가령 알부민 결합 도메인(ABD), His 태그, FLAG 태그, 글루타티온-s-전이효소, 혈구응집소(HA) 및 말토오스 결합 단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 그러한 태그가 달린 단백질은 또한 정제 전, 도중 또는 후에 태그의 제거를 쉽게 하기 위한 절단 부위, 가령 트롬빈, 엔테로키나제 또는 인자 X 절단 부위를 포함하도록 조작될 수 있다.
항원-결합 폴리펩티드 구조체를 제조하는 방법
상기 기술된 바와 같이, 본 명세서에 기술된 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 제1 이종이합체 및 제2 이종이합체를 포함할 수 있고, 제1 이종이합체는 적어도 하나의 VH 및 CH1 도메인을 가지는 면역글로불린 중사슬 또는 이들의 단편, 및 VL 도메인 및 CL 도메인을 가지는 면역글로불린 람다 경사슬을 포함하고, 제2 이종이합체는 적어도 하나의 VH 및 CH1 도메인을 가지는 면역글로불린 중사슬 또는 이들의 단편, 및 VL 도메인 및 CL 도메인을 가지는 면역글로불린 카파 경사슬을 포함한다. 면역글로불린 폴리펩티드 서열은 본 명세서에 기술된 바와 같은 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 변형을 포함하도록 조작된다. 따라서, 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체의 경우에, 전형적으로 네 가지의 구별된 폴리펩티드 서열, 두 가지 면역글로불린 중사슬 폴리펩티드 서열 또는 이들의 단편 및 두 가지 면역글로불린 경사슬 폴리펩티드 서열이 존재하여, 항원-결합 폴리펩티드 구조체를 구성한다. 항원-결합 폴리펩티드 구조체의 면역글로불린 중사슬 폴리펩티드 서열 및 면역글로불린 경사슬 폴리펩티드 서열은 당해 분야에 공지된 재조합 DNA 기술을 이용하여 쉽게 제조될 수 있다. 표준 기술 가령, 예를 들면, Sambrook 및 Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 3판, 2001); Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2판, 1989); Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel 등, John Wiley and Sons, New York, 4판, 1999); 및 Glick 및 Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA (ASM Press, Washington, D.C., 2판, 1998)에 기술된 내용이 재조합 핵산 방법, 핵산 합성, 세포 배양, 전이유전자 도입, 및 재조합 단백질 발현을 위해 사용될 수 있다.
항원-결합 폴리펩티드 구조체를 구성하는 모 항체의 면역글로불린 중사슬 및 경사슬의 폴리뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 당해 분야에 공지되어 있거나 핵산 및/또는 단백질 서열분석 방법을 이용하여 쉽게 결정될 수 있다.
따라서, 또한 항원-결합 폴리펩티드 구조체의 면역글로불린 중사슬 및 경사슬을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 집합이 제공된다. 그러한 폴리뉴클레오티드는 DNA 및 RNA의 단일-가닥 및 이중-가닥 형태 둘다, 뿐만 아니라 상응하는 상보적 서열을 포함한다. DNA는, 예를 들면, cDNA, 유전체 DNA, 화학적으로 합성된 DNA, PCR로 증폭된 DNA, 및 이들의 조합을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 전장 유전자 또는 cDNA 분자 뿐만 아니라 이들의 단편의 조합을 포함한다.
본 명세서에 기술된 조작된 면역글로불린 중사슬 및 경사슬 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 카세트 또는 PCR 돌연변이유발 또는 당해 분야에 널리 공지된 다른 기술을 이용하여 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 내 뉴클레오티드의 부위 특이적 돌연변이유발을 일으킴으로써, 조작된 면역글로불린 중사슬 및 경사슬 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA를 생성하고, 이어서 본 명세서에 개괄된 바와 같이 세포 배양물에서 재조합 DNA를 발현시켜 제조될 수 있다. 그러나, 조작된 면역글로불린 중사슬 및 경사슬 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 또한 확립된 기술을 이용한 시험관 내 유전자 합성에 의해 제조될 수 있다.
당해 분야의 숙련가에게 이해되는 바와 같이, 유전 암호의 소멸성으로 인해, 극도로 많은 수의 폴리뉴클레오티드가 만들어질 수 있고, 이들 모두가 본 명세서에 기술된 조작된 면역글로불린 중사슬 및 경사슬 폴리펩티드를 인코딩한다. 따라서, 특정 아미노산 서열을 확인한 경우, 당해 분야의 숙련가는 인코딩된 단백질의 아미노산 서열에 변화를 주지 않는 방식으로 하나 이상의 코돈의 서열을 단순히 변형시킴으로써 임의의 수의 상이한 폴리뉴클레오티드를 만들 수 있다.
또한 상기와 같은 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드, 발현 벡터, 전사 또는 발현 카세트의 형태로 된 발현 시스템 및 구조체가 제공된다. 또한 그러한 발현 시스템 또는 구조체를 포함하는 숙주 세포가 제공된다.
전형적으로, 숙주 세포에서 사용되는 발현 벡터는 플라스미드 유지 및 외인성 뉴클레오티드 서열의 클로닝 및 발현을 위한 서열을 내포할 것이다. 통합적으로 "측면부착 서열"이라 지칭되는 그러한 서열은, 특정 구체예에서 전형적으로 다음 중 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함할 것이다: 프로모터, 하나 이상의 인핸서 서열, 복제 원점, 전사 종결 서열, 완전한 인트론 서열 함유 공여자 및 수용자 스플라이싱 부위, 폴리펩티드 분비를 위한 선도 서열을 인코딩하는 서열, 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 서열, 발현되어야 하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하기 위한 다중링커 영역, 및 선별가능한 표지 요소. 벡터는 다시스트론성 즉 항원-결합 폴리펩티드 구조체의 면역글로불린 중사슬 및 경사슬을 인코딩하는 둘 이상의 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있거나, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 벡터의 집합에 의해 발현될 수 있고, 각각의 벡터는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 발현한다. 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 또한 다시스트론성 벡터 및 하나의 면역글로불린 중사슬 및 경사슬을 인코딩하는 단일 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터의 조합을 포함하는 벡터의 집합을 이용하여 발현될 수 있다.
일부 구체예에서, 벡터는 "태그"-인코딩 서열, 즉, 폴리펩티드 암호화 서열의 5' 또는 3' 말단에 위치하는 올리고뉴클레오티드 분자를 내포할 수 있고; 이 올리고뉴클레오티드 서열은 폴리His(가령 헥사His), 또는 시판되는 항체가 존재하는 또다른 "태그" 가령 FLAG, HA(혈구응집소 인플루엔자 바이러스), 또는 myc를 인코딩한다. 이러한 태그는 전형적으로 폴리펩티드의 발현시 폴리펩티드와 융합되며, 숙주 세포로부터의 폴리펩티드의 친화성 정제 또는 검출을 위한 수단으로 기능할 수 있다. 친화성 정제는, 예를 들면, 친화성 기질로서 태그에 대항하는 항체를 이용하는 컬럼 크로마토그래피에 의해 달성될 수 있다. 임의로, 태그는 추후에 단백질분해효소 절단과 같은 다양한 수단에 의해 정제된 폴리펩티드로부터 제거될 수 있다.
벡터는 전형적으로 숙주 유기체에 의해 인식되고 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하도록 연결된 프로모터를 내포한다. 프로모터는 구조적 유전자(일반적으로 약 100 내지 1000 bp 이내)의 출발 코돈에서 상류(즉, 5')에 위치하여 구조적 유전자의 전사를 제어하는 미전사 서열이다. 프로모터는 통상적으로 두 클래스: 유도성 프로모터 및 구성적 프로모터 중 하나로 구분된다. 유도성 프로모터는 배양 조건의 일부 변화, 가령 영양분의 존재 또는 부재 또는 온도 변화에 반응하여 이들의 제어 하에 DNA로부터 증가된 수준의 전사를 개시한다. 구성적 프로모터는, 그와 달리, 이들이 작동가능하도록 연결된 유전자를 일정하게 전사하며, 유전자 발현을 거의 제어하지 않거나 제어하지 않는다. 다양한 가능한 숙주 세포에 의해 인식되는 수많은 프로모터는 잘 알려져 있다.
효모 숙주, 박테리아 숙주, 및 곤충 숙주와 사용하기 위한 적절한 프로모터가 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 효모 인핸서는 효모 프로모터와 사용되기에 유리하다. 포유류 숙주 세포와 사용하기 위해 적절한 프로모터는 잘 알려져 있고 바이러스 가령 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스(가령 아데노바이러스 2), 소의 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 거대세포바이러스, 레트로바이러스, 간염-B 바이러스 및 가장 바람직하게는 원숭이 바이러스 40(SV40)의 유전체로부터 수득된 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 다른 적절한 포유류 프로모터는 이종 포유류 프로모터, 예를 들면, 열-충격 프로모터 및 액틴 프로모터를 포함한다.
벡터는 벡터가 숙주 세포 유전체에 통합될 경우 발현을 용이하게 하는 하나 이상의 요소를 내포할 수 있다. 예시는 EASE 요소(Aldrich 등 2003 Biotechnol Prog. 19:1433-38) 및 기질 부착 영역(MAR)을 포함한다. MAR는 염색질의 구조적 조직화를 매개하며 통합된 벡터를 "위치" 효과로부터 보호할 수 있다. 따라서, MAR는 벡터가 안정한 형질감염체를 생성하기 위해 사용되는 경우에 특히 유용하다. 수많은 자연 및 합성 MAR-내포 핵산이 당해 분야에, 예컨대, U.S. 특허 번호 6,239,328호; 7,326,567호; 6,177,612호; 6,388,066호; 6,245,974호; 7,259,010호; 6,037,525호; 7,422,874호; 7,129,062호에 공지되어 있다.
벡터가 구성되고 폴리뉴클레오티드가 벡터의 적절한 부위에 삽입된 후에, 완성된 벡터는 증폭 및/또는 폴리펩티드 발현을 위해 적절한 숙주 세포 내로 삽입될 수 있다. 선택된 숙주 세포 내로의 발현 벡터의 형질전환은 형질주입, 감염, 인산칼슘 공-침전, 전기천공, 미세주입, 리포솜주입(lipofection), DEAE-덱스트란 매개 형질주입, 또는 다른 공지의 기술을 비롯한 널리-공지된 방법에 의해 달성될 수 있다. 선택되는 방법은 부분적으로 사용될 숙주 세포의 유형에 따라 달라질 것이다. 숙주 세포는 일시적으로 형질주입될 수 있거나 숙주 세포는 안정하게 형질주입될 수 있다. 이들 방법 및 다른 적절한 방법이 당해 분야의 숙련가에게 널리 공지되어 있고, 예를 들면, Sambrook 등, 2001, 상기와 동일에 제시되어 있다.
재조합 단백질 장기간, 고-수율 생산을 위해서는, 안정한 발현이 대개 바람직하다. 예를 들면, 항원-결합 폴리펩티드 구조체의 조작된 중사슬 및 경사슬을 안정하게 발현하는 세포주가 제조될 수 있다. 바이러스 복제 원점을 내포하는 발현 벡터를 이용하는 대신, 숙주 세포는 적절한 발현 제어 요소(예컨대, 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종결인자, 폴리아데닐화 부위, 등)에 의해 제어되는 DNA, 및 선별가능한 마커로 형질전환될 수 있다. 외부 DNA 또는 폴리뉴클레오티드의 도입 후, 조작된 세포는 완전 배지에서 1-2일간 성장하게 허용되고, 이후 선택적 배지로 옮겨진다. 재조합 플라스미드 내의 선별가능한 마커는 선별에 대한 저항성을 부여하며 세포로 하여금 플라스미드를 이들의 염색체 내로 안정하게 통합하고 성장하여 foci를 형성할 수 있게 하고 이는 다시 복제되어 세포주 내로 확장될 수 있다.
수많은 선별 시스템이 사용될 수 있으며, 각각 tk-, hgprt- 또는 aprt-세포에서 유전자가 사용될 수 있는 단순포진 바이러스 티미딘 키나아제(Wigler 등, 1977, Cell 11 :223), 히포잔틴-구아닌 포스포리보실전이효소(Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026), 및 아데닌 포스포리보실전이효소(Lowy 등, 1980, Cell 22:817)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 또한, 대사길항물질 저항성이 메토트렉세이트에 대한 저항성을 부여하는 dhfr(Wigler 등, 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:3567; O'Hare 등, 1981 , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527); 미코페놀산에 대한 저항성을 부여하는 gpt(Mulligan & Berg, 1981 , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072); 아미노글리코시드 G-418에 대한 저항성을 부여하는 neo(Colberre-Garapin 등, 1981 , J. Mol. Biol. 150:1); 및 히그로마이신에 대한 저항성을 부여하는 hygro(Santerre 등, 1984, Gene 30:147) 유전자에 대한 선별의 기초로서 사용될 수 있다.
숙주 세포는, 적절한 조건 하에 배양되는 경우, 항원-결합 폴리펩티드 구조체를 생산하며 이는 나중에 배양 배지로부터(숙주 세포가 이를 배지로 분비할 경우) 또는 이를 생산하는 숙주 세포로부터 직접(분비되지 않는 경우) 수집될 수 있다. 적절한 숙주 세포의 선택은 다양한 요인, 가령 요망되는 발현 수준, 활성을 위해 요망되거나 필수적인 폴리펩티드 변형(가령 당화 또는 인산화) 및 생물학적으로 활성인 분자로의 접힘 용이성에 의존적일 것이다. 숙주 세포는 진핵세포 또는 원핵세포일 수 있다. 예를 들면, 박테리아 시스템 내 발현은 미당화 산물을 생산할 것이고 효모 내 발현은 당화 산물을 생산할 것이다. 유전자 산물의 일차 전사물의 적절한 처리(예컨대, 당화, 및 인산화)를 위한 세포 기작을 보유하는 진핵세포 숙주 세포가 사용될 수 있다.
발현 숙주로서 이용가능한 포유류 세포주는 당해 분야에 널리 공지되어 있고 미국 기준배양주 은행(ATCC)으로부터 입수가능한 불멸화 세포주를 포함하지만 이에 제한되지 않고 당해 분야에 공지된 발현 시스템에서 사용되는 임의의 세포주가 본 명세서에 기술된 재조합 폴리펩티드를 제작하기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 숙주 세포는 항원-결합 폴리펩티드 구조체를 인코딩하는 DNA를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된다. 사용될 수 있는 숙주 세포 중에는 원핵세포, 효모 또는 고차원의 진핵 세포가 있다. 원핵세포는 그램 음성 또는 그램 양성 유기체, 예를 들면 E. coli 또는 바실러스를 포함한다. 고차원의 진핵 세포는 곤충 세포 및 포유류 유래의 확립된 세포주를 포함한다. 적절한 포유류 숙주 세포주의 예시는 COS-7 계열 원숭이 신세포(ATCC CRL 1651) (Gluzman 등, 1981, Cell 23:175), L 세포, C127 세포, 3T3 세포(ATCC CCL 163), 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 이들의 유도체 가령 Veggie CHO 및 무-혈청 배지에서 성장하는 관련 세포주(Rasmussen 등, 1998, Cytotechnology 28:31), HeLa 세포, BHK(ATCC CRL 10) 세포주, 및 아프리카 녹색 원숭이 신세포주 CV1에서 유도한 CV1/EBNA 세포주(ATCC CCL 70) 이는 McMahan 등, 1991, EMBO J. 10: 2821에 기술됨, 인간 배아 신세포 가령 293, 293 EBNA 또는 MSR 293, 인간 상피 A431 세포, 인간 Colo205 세포, 다른 형질전환된 영장류 세포주, 정상 이배체 세포, 일차 조직, 일차 외식편, HL-60, U937, HaK 또는 Jurkat 세포의 시험관 내 배양물에서 유도한 세포 균주를 포함한다. 대안적으로, 저차원 진핵세포 가령 효모 또는 원핵세포 가령 박테리아에서 폴리펩티드를 생산하는 것이 가능하다. 적절한 효모는 사카로미세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클뤼베로미세스(Kluyveromyces) 균주, 칸디다(Candida), 또는 이종 폴리펩티드를 발현할 수 있는 임의의 효모 균주를 포함한다. 적절한 박테리아 균주는 에셔리키아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 또는 이종 폴리펩티드를 발현할 수 있는 임의의 박테리아 균주를 포함한다.
항원-결합 폴리펩티드 구조체가 효모 또는 박테리아에서 생산되는 경우, 기능적 산물을 얻기 위해서는 그렇게 생산된 산물을, 예를 들면 적절한 부위의 인산화 또는 당화에 의해, 변형시키는 것이 요망될 수 있다. 그러한 공유적 부착은 공지의 화학적 또는 효소적 방법을 이용하여 달성될 수 있다. 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 또한 하나 이상의 곤충 발현 벡터 내 적절한 제어 서열에 폴리뉴클레오티드의 집합을 작동가능하도록 연결하고, 곤충 발현 시스템을 사용함으로써 생산될 수 있다. 배큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템을 위한 재료 및 방법은, 예컨대, Invitrogen, San Diego, Calif., U.S.A. (MaxBac™ 키트)로부터 시판되는 키트 형태로 입수가능하며, 그러한 방법은 Summers 및 Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987), 및 Luckow 및 Summers, Bio/Technology 6:47 (1988)에 기술된 바와 같이 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 박테리아, 진균, 효모, 및 포유류 세포 숙주와 사용하기 위해 적절한 클로닝 및 발현 벡터는 Pouwels 등(Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985)에 기술되어 있다.
특정한 구체예에서, 무-세포 단백질 발현 시스템이 살아있는 세포를 이용하지 않고도 폴리뉴클레오티드의 집합으로부터 폴리펩티드 (예컨대, 중사슬 및 경사슬 폴리펩티드)를 동시-발현하기 위해 사용될 수 있다. 대신, DNA를 RNA로 전사하고 RNA를 단백질로 번역하기 위해 필요한 모든 성분(예컨대 리보솜, tRNA, 효소, 보조인자, 아미노산)이 시험관 내 사용을 위한 용액 내에 제공된다. 특정한 구체예에서, 시험관 내 발현은 (1) 중사슬 및 경사슬 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자 주형(mRNA 또는 DNA) 및 (2) 필요한 전사 및 번역 분자적 기작을 함유하는 반응 용액을 필요로 한다. 특정한 구체예에서, 세포 추출물은 반응 용액의 성분들, 예를 들면: mRNA 전사를 위한 RNA 중합효소, 폴리펩티드 번역을 위한 리보솜, tRNA, 아미노산, 효소의 보조인자, 에너지 공급원, 및 적절한 단백질 접힘을 위해 필수적인 세포 성분을 실질적으로 공급한다. 무-세포 단백질 발현 시스템은 박테리아 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 포유류 세포, 인간 세포 또는 이들의 조합으로부터 유래한 용해물을 이용하여 제조될 수 있다. 그러한 세포 용해물은 번역을 위해 필요한 효소 및 구성 성분의 정확한 조성 및 비율을 제공할 수 있다. 일부 구체예에서, 세포막이 제거되어 세포의 세포질 및 구조 성분만 남는다.
몇몇 무-세포 단백질 발현 시스템이 Carlson 등 (2012) Biotechnol. Adv. 30:1185-1194에서 검토된 바와 같이 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 무-세포 단백질 발현 시스템은 원핵 또는 진핵 세포를 기초로 입수가능하다. 원핵세포 무-세포 발현 시스템의 예시는 E. coli로부터의 시스템을 포함한다. 진핵세포 무-세포 단백질 발현 시스템은 예를 들면, 토끼 망상적혈구, 밀 배아, 및 곤충 세포로부터의 추출물을 기초로 입수가능하다. 그러한 원핵세포 및 진핵세포 무-세포 단백질 발현 시스템은 Roche, Invitrogen, Qiagen, 및 Novagen과 같은 기업으로부터 시판 제품으로 입수가능하다. 당해 분야의 숙련가는 서로 쌍을 형성할 수 있는 폴리펩티드(예컨대, 중사슬 및 경사슬 폴리펩티드)를 생산할 수 있는 적절한 무-세포 단백질 발현 시스템을 쉽게 선택할 수 있을 것이다. 추가로, 무-세포 단백질 발현 시스템은 또한 IgG 접힙 효율을 향상하기 위해 샤페론(예컨대 BiP) 및 이성질화 효소(예컨대 이황화물 이성질화 효소)으로 보충될 수 있다.
중사슬 및 경사슬의 동시-발현
위에서 언급한 바와 같이, 본 명세서에 기술된 항원-결합 폴리펩티드 구조체의 조작된 면역글로불린 중사슬 및 경사슬은 포유류 세포에서 동시-발현될 수 있다. 한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체의 면역글로불린 중사슬 및 면역글로불린 경사슬은 숙주 세포에서 동시-발현된다. 따라서, 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체의 경우에, 두 가지 면역글로불린 중사슬 및 두 가지 면역글로불린 경사슬이 숙주 세포에서 동시-발현된다. 그러나, 모든 네 가지 사슬을 발현하는 단일 클론 또는 일시적인 세포주의 사용에 의존하지 않고 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체를 생산하는 대안적인 방법이 또한 당해 분야에 공지되어 있다(Gramer, 등 (2013) mAbs 5, 962; Strop 등 (2012) J Mol Biol 420, 204.). 이들 방법은 이중특이적 항체의 형성에 관여하는 경사슬 및 중사슬의 두 쌍을 생산 후 산화환원 조건 하에 팔을 교환하는 것에 의존한다(산화환원 생산). 이러한 접근법에서 H1L1 및 H2L2 이종이합체는 두 가지 상이한 세포주에서 발현되어 독립적으로 두 가지 이종이합체를 생산할 수 있다. 나중에, 두 가지 이종이합체는 선택적 산화환원 조건 하에 혼합되어 두 가지 고유한 중사슬 H1 및 H2의 재-연합을 달성하여 H1L1H2L2를 포함하는 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체를 형성한다.
비록 우선적 쌍 형성이 주로 Mab 설계 집합 아미노산 변형을 면역글로불린 중사슬 및 경사슬 폴리펩티드 내에 도입함으로써 추진되지만, 올바른-쌍형성 이종이합체의 양은 실시예에 나타난 바와 같이, 각각 서로의 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 비율을 변화시킴으로써 추가로 최적화될 수 있다.
항원-결합 폴리펩티드 구조체의 시험
상기 기술된 바와 같이, 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 H1 및 L1를 포함하는 제1 이종이합체, 그리고 H2 및 L2를 포함하는 제2 이종이합체를 포함하며, 여기서 L1는 람다 경사슬이고, L2는 카파 경사슬이고, H1 및 H2는 서로 구별된다. 하나 이상의 H1, L1, H2, 및 L2는 H1의 L2보다 L1과의 및 H2의 L1보다 L2와의 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 변형을 포함한다. H1L1 이종이합체의 제1 Fab 영역 및 H2L2 이종이합체의 제2 Fab 영역은 상응하는 wt 제1 Fab 영역 또는 wt 제2 Fab 영역과 유사한 친화성으로 항원에 결합할 수 있다. H1L1 이종이합체의 제1 Fab 영역 및 H2L2 이종이합체의 제2 Fab 영역은 또한 상응하는 wt 제1 Fab 영역 또는 wt 제2 Fab 영역의 그것에 필적하는 열 안정성을 나타낸다.
각각의 항원에 대한 이종이합체 쌍의 각각의 이종이합체의 친화성은 하기 기술된 바와 같이 시험될 수 있다. 이종이합체 쌍의 각각의 이종이합체의 열 안정성 또한 하기 기술된 바와 같이 시험될 수 있다.
한 구체예에서, 하나의 중사슬은 상기 기술된 바와 같이 LCCA 설계 집합 내 두 가지 상이한 경사슬과 동시-발현되며, 여기서 중사슬은 두 개의 경사슬 중 하나와 우선적으로 쌍을 이룬다. 또다른 구체예에서, 두 가지 고유한 중사슬은 두 가지 고유한 경사슬과 동시-발현되며, 여기서 각각의 중사슬은 경사슬 중 하나와 우선적으로 쌍을 이룬다.
우선적 쌍 형성을 측정하는 방법
우선적 쌍 형성의 정도는, 예를 들면, 하기 및 실시예에서 기술된 방법을 이용하여 평가될 수 있다. 우선적 쌍 형성은 LCCA 설계 집합(H1L1L2, 또는 H2L1L2) 또는 Mab 설계 집합(H1L1H2L2)의 맥락에서 평가될 수 있다.
한 구체예에서, 경사슬 경쟁 어세이(LCCA)가 LCCA 설계 집합의 맥락에서 우선적 쌍 형성을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 2013년 10월 3일에 출원된 공동-권리 특허 출원 PCT/US2013/063306호는 LCCA의 다양한 구체예를 기술하며 이는 모든 목적에서 그 전체가 본 명세서에서 참고로서 포함된다. 상기 방법은, 동시-발현된 단백질의 혼합물 내에서 중사슬의 특정 경사슬과의 쌍형성의 정량적 분석을 가능하게 하고 중사슬 및 경사슬이 동시-발현되는 경우, 하나의 특정한 면역글로불린 중사슬이 두 가지 면역글로불린 경사슬 중 하나와 선택적으로 결합하는지 확인하기 위하여 사용될 수 있다. 상기 방법은 다음처럼 간단히 기술된다: 적어도 하나의 중사슬 및 두 가지 상이한 경사슬은 중사슬이 쌍 형성 반응을 제한하는 요소이게 하는 비율로 세포에서 동시-발현된다. 중사슬 및 경사슬은 검출을 용이하게 하기 위해 태깅될 수 있다. 분비된 단백질은 세포로부터 분리될 수 있고, 중사슬에 결합된 면역글로불린 경사슬 폴리펩티드는 다른 분비 단백질로부터 단리되어 단리된 중사슬 쌍 분획을 생성한다. 단리된 중사슬 분획 내 각각의 상이한 경사슬의 양은 이후 검출되고, 단리된 중사슬 분획 내 각각의 상이한 경사슬의 상대적인 양은 경사슬 중 하나와 선택적으로 쌍을 형성하는 중사슬의 능력을 확인하기 위해 분석된다. 이러한 방법과 관련된 추가적인 상세한 내용이 실시예에 제공된다.
또다른 구체예에서, 우선적 쌍 형성은 H1, L1, H2 및 L2이 동시-발현되는 Mab 설계 집합의 맥락에서 평가된다. 이러한 구체예에서, 하나 이상의 H1, L2, H2, 및 L2는 검출 및 분석을 용이하게 하기 위해 태깅될 수 있다. 쌍을 형성한 중사슬 및 경사슬로 생성된 종은 각각의 종의 분자량 차이를 기초로 LCMS (액체 크로마토그래피 - 질량 분석법)을 이용하여 평가된다. 항원 활성 어세이가 또한 각각의 경사슬을 내포하는 상대적 이종이합체를 정량하기 위해 사용될 수 있고 이때 측정된 결합의 정도(대조군에 비교한 것)가 각각의 개별 이종이합체 집단을 예측하기 위해 사용될 수 있다.
열 안정성
이종이합체의 열 안정성은 당해 분야에 공지된 방법에 따라 결정될 수 있다. 각각의 이종이합체의 용해 온도가 이의 열 안정성을 나타낸다. 이종이합체의 용해점은 시차 주사 열량법(Chen 등 (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando 등 (1999) Immunol Lett 68:47-52)과 같은 기술을 이용하여 측정될 수 있다. 대안적으로, 이종이합체의 열 안정성은 원편광 이색성(circular dichroism)(Murray 등 (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9)을 이용하여 측정될 수 있다.
항원에 대한 친화성
각각의 항원에 대한 이종이합체의 결합 친화성 및 상호작용의 탈결합-속도는 당해 분야에 널리 공지된 방법에 따른 경쟁적 결합 어세이에 의해 결정될 수 있다. 경쟁적 결합 어세이의 한 예시는 증가하는 양의 미표지 항원의 존재에서 표지된 항원(예컨대, 관심의 분자(예컨대, 본 명세서에 기술된 이종이합체)를 3H 또는 125I로 표지된 항원을 항온처리하고, 표지된 리간드에 결합된 분자를 검출하는 것을 포함하는 방사면역측정법이다. 항원에 대한 이종이합체의 친화성 및 탈결합-속도는 Scatchard 분석에 의한 포화도 데이터로부터 결정될 수 있다.
본 명세서에 기술된 이종이합체의 역학 척도는 또한 당해 분야에 공지된 표면 플라스몬 공명(SPR) 기반 어세이(예컨대, BIAcore 역학 분석)를 이용하여 결정될 수 있다. SPR-기반 기술의 검토를 위해서는 Mullet 등, 2000, Methods 22: 77-91; Dong 등, 2002, Review in Mol. Biotech., 82: 303-23; Fivash 등, 1998, Current Opinion in Biotechnology 9: 97-101; Rich 등, 2000, Current Opinion in Biotechnology 11: 54-61을 참조하라. 추가적으로, U.S. 특허 번호 6,373,577호; 6,289,286호; 5,322,798호; 5,341,215호; 6,268,125호에 기술된 단백질-단백질 상호작용을 측정하기 위한 임의의 SPR 장비 및 SPR 기반 방법이 본 발명의 방법 내에 포함된다. FACS가 또한 당해 분야에 공지된 바와 같이, 친화성을 측정하기 위해 사용될 수 있다.
약제학적 조성물
또한 본 명세서에 제공된 것은 본 명세서에 기술된 항원-결합 폴리펩티드 구조체를 포함하는 약제학적 조성물이다. 그러한 조성물은 치료적으로 효과적인 양의 항원-결합 폴리펩티드 구조체, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 특정 구체예에서, 용어 "약제학적으로 허용되는"은 동물, 및 더 상세하게는 인간에서 사용하기 위해 연방 또는 주정부의 규제기관에 의해 승인된 것 또는 U.S. 약전 또는 다른 일반적으로 인식되는 다른 약전에 나열된 것을 의미한다. 용어 "담체"는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 보강제, 부형제, 또는 비히클을 가리킨다. 그러한 약제학적 담체는 무균 액체, 가령 물 및 오일, 예컨대 석유, 동물, 식물 또는 합성 유래의 것을, 가령 땅콩 오일, 대두 오일, 광물 오일, 참깨 오일 등일 수 있다. 물은 약제학적 조성물이 정맥내로 투여되는 경우에 바람직한 담체다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 또한 특히 주사용 용액을 위한 액체 담체로서 사용될 수 있다. 적절한 약제학적 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 몰트, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 건조 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 조성물은, 요망되는 경우, 또한 미량의 습윤제 또는 에멀전화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 알약, 캅셀, 분말, 지연-방출 제형 등의 형태를 가질 수 있다. 조성물은 전통적인 결합제 및 담체 가령 중성지방과 함께 좌제로 제형화될 수 있다. 경구 제형은 표준 담체 가령 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로오스, 마그네슘 카르보네이트, 등을 포함할 수 있다. 적절한 약제학적 담체의 예시는 E. W. Martin에 의한 "Remington's Pharmaceutical Sciences"에 기술되어 있다. 그러한 조성물은 바람직하게는 정제된 형태로 된 치료적으로 효과적인 양의 화합물을, 환자에게 적절히 투여하기 위한 형태를 제공할 수 있는 적절한 양의 담체와 함께 함유할 것이다. 제형은 투여 방식에 적합해야 한다.
특정한 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드 구조체를 포함하는 조성물은 인간에게 정맥내 투여하기에 적합한 약제학적 조성물로서 일상적인 절차에 따라 제형화된다. 전형적으로, 정맥내 투여를 위한 조성물은 무균 등장성 수성 완충액 내 용액이다. 필요한 경우, 조성물은 또한 가용화제 및 주사 부위의 통증을 줄여주기 위한 국부 마취제 가령 리그노카인을 포함할 수 있다. 일반적으로, 성분들은 단위 제형, 예를 들면, 건조 동결건조된 분말 또는 무수 농축물로서 활성 물질의 양을 나타내는 차단 밀봉된 용기 가령 앰플 또는 사셰 내에 개별적으로 공급되거나 혼합된다. 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우, 무균 약제학적 등급 물 또는 식염수를 함유하는 주입 병에 담길 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 투여 전에 성분이 혼합될 수 있도록 무균 주사용수 또는 식염수의 앰플이 제공될 수 있다.
특정한 구체예에서, 본 명세서에 기술된 조성물은 중성 또는 염 형태로 제형화된다. 약제학적으로 허용되는 염은 음이온 가령 염화수소산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 등으로부터 유래한 것들로 형성된 염, 및 양이온 가령 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 제2철 하이드록사이드 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인, 등으로부터 유래한 것들로 형성된 염을 포함한다.
치료적 단백질의 비정상적인 발현 및/또는 활성과 연관된 질환 또는 장애의 치료, 저해 및 예방에 효과적일 본 명세서에 기술된 조성물의 양은 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 또한, 시험관 내 어세이가 최적 투여 범위를 확인하는 것을 돕기 위해 임의로 사용될 수 있다. 제형 내에 사용되어야 하는 정확한 용량은 또한 투여의 경로, 및 질환 또는 장애의 심각도에 의존할 것이며, 의사의 판단 및 각 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 효과적인 용량은 시험관 내 또는 동물 모델 시험 시스템에서 도출한 용량-반응 곡선으로부터 추정된다.
항원-결합 폴리펩티드 구조체의 용도
상기 기술된 바와 같이, 본 명세서에 기술된 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 모 항체로부터 수득되고 여기서 항원-결합 폴리펩티드 구조체의 각각의 이종이합체는 모 항체의 그것과 상응하며, 이종이합체를 구성하는 면역글로불린 중사슬 및 경사슬의 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 변형을 포함하도록 조작된다. 따라서, 본 명세서에 기술된 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 모 항체 또는 모 항체의 조합이 사용되는 동일한 질환, 장애, 또는 감염의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
또다른 구체예에서, 본 명세서에 기술된 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 또한 암, 자가면역 질환, 염증 장애 또는 감염성 질환의 치료 또는 예방을 위한 당해 분야에 공지된 다른 치료제와 함께 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 명세서에 기술된 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 예를 들면, 분자와 상호작용하고 면역 반응을 증가시키는 이펙터 세포의 수 또는 활성을 증가시키도록 기능하는 단클론 또는 키메라 항체, 림포카인, 또는 조혈 성장 인자(가령, 예컨대, IL-2, IL-3 및 IL-7)와 함께 사용될 수 있다. 본 명세서에 기술된 항원-결합 폴리펩티드 구조체는 또한 질환, 장애, 또는 감염을 치료하기 위해 사용되는 하나 이상의 약물 가령, 예를 들면 항암제, 항-염증제 또는 항-바이러스제와 함께 사용될 수 있다.
Mab 설계 집합 라이브러리를 이용한 이중특이적 항체의 생성
한 구체예에서, 본 명세서에 기술된 Mab 설계 집합은 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 본 명세서에 기술된 Mab 설계 집합은 Mab 설계 집합 라이브러리의 형태로 사용될 수 있고, 여기서 Mab 설계 집합 라이브러리는 우선적 쌍 형성을 촉진하여 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체를 형성하는 유용성을 보이는 Mab 설계 집합을 포함한다. 한 구체예에서, Mab 설계 집합 라이브러리는 표 4A 및 표 4B에 포함된 Mab 설계 집합으로 표현된다. 한 구체예에서, Mab 설계 집합 라이브러리는 하나 이상의 표 10-A1 내지 10-A12, 및 10-B1 내지 10-B10 내 Mab 설계 집합으로 표현된다. 또다른 구체예에서, Mab 설계 집합 라이브러리는 하나 이상의 표 10-A1 내지 10-A12로 표현된다. 한구체예에서, Mab 설계 집합 라이브러리는 하나 이상의 표 10-B1, 10-B2, 10-B3, 10-B4, 10-B6, 10-B8, 및 10-B10로 표현된다. Mab 설계 집합 라이브러리는 이하와 같이 두 가지 모 항체(즉, Mab1 및 Mab2)로부터 출발하여 항원-결합 폴리펩티드 구조체를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 예시의 목적을 위해, Mab1은 람다 Fab를 포함하고 면역글로불린 중사슬 폴리펩티드 H1 및 면역글로불린 경사슬 폴리펩티드 L1를 포함하는 반면, Mab2는 카파 Fab를 포함하고 면역글로불린 중사슬 폴리펩티드 H2 및 면역글로불린 경사슬 폴리펩티드 L2를 포함한다.
Mab 설계 집합 라이브러리의 Mab 설계 집합 아미노산 변형(H1L1H2L2)은 Mab1(H1 및 L2)의 면역글로불린 중사슬 및 경사슬 및 Mab2(H2 및 L2)의 면역글로불린 중사슬 및 경사슬 내에 도입된다. H1, L1, H2, 및 L2는 이후 동시-발현되고 올바르게 쌍을 형성한 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체의 양이 결정된다. Mab 설계 집합 라이브러리의 하나 이상의 Mab 설계 집합은 어느 것이 요망되는 양의 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체을 제공하는지 결정하기 위해 개별적으로 시험 또는 선별될 수 있다. 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체의 각각의 이종이합체는 본 명세서에 기술된 바와 같이, 항원에 결합하는 각각의 이종이합체의 능력을 평가하기 위해 또는 열 안정성을 평가하기 위해 추가로 시험될 수 있다. 평가될 수 있는 추가적인 특성은 모 항체 또는 모 항체의 Fab 영역에 비해 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체의 용해성, 응집, 결합(kon) 및 탈결합(koff) 속도, 산, 염기, 산화, 동결/해동 주기, 교반, 압력 등에의 노출을 견디는 능력을 포함한다. 후자의 특성은 관심의 항체의 상보성 결정부위(CDR)의 영향을 받을 수 있고, 따라서 생성된 각각의 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체에 대해 시험될 수 있다.
일부 구체예에서 올바르게 쌍을 형성한 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체의 양은 LCMS에 의해 평가된다. 일부 구체예에서 올바르게 쌍을 형성한 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체의 양은 전하 기반 분리 기술 가령 모세관 등전점 맞춤(cIEF) 기술 또는 크로마토그래피 기술에 의해 평가된다. Mab 설계 집합 라이브러리를 이용하여 Mab1 및 Mab2로부터 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체를 제조하기 위한 절차는 도 9에 도식적으로 나타난다.
한 구체예에서, Mab 설계 집합 라이브러리는 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체를 설계하기 위한 Mab 설계 집합 라이브러리의 사용을 용이하게 하기 위해 컴퓨터-판독가능한 저장 매체에 저장된다.
컴퓨터 실행
한 구체예에서, 컴퓨터는 칩셋에 연결된 적어도 하나의 프로세서를 포함한다. 또한 칩셋에 연결된 것은 메모리, 저장 장치, 키보드, 그래픽 어댑터, 포인팅 장치, 및 네트워크 어댑터이다. 디스플레이는 그래프 어댑터에 연결된다. 한 구체예에서, 칩셋의 기능성은 메모리 컨트롤러 허브 및 I/O 컨트롤러 허브에 의해 제공된다. 또다른 구체예에서, 메모리는 칩셋 대신 프로세서에 직접 연결된다.
저장 장치는 하드 드라이브, 콤팩트 디스크 판독용 메모리(CD-ROM), DVD, 또는 고체 메모리 장치 같이 데이터를 보유할 수 있는 임의의 장치이다. 메모리는 프로세서에 의해 사용되는 지시와 데이터를 보유한다. 포인팅 장치는 마우스, 트랙 볼, 또는 다른 유형의 포인팅 장치일 수 있고, 키보드와 함께 데이터를 컴퓨터 시스템에 입력하기 위해 사용된다. 그래픽 어댑터는 영상 및 다른 정보를 디스플레이 상에 전시한다. 네트워크 어댑터는 로컬 또는 광역 네트워크에 컴퓨터 시스템을 연결시킨다.
당해 분야에 공지된 바와 같이, 컴퓨터는 앞서 기술된 것들과 상이한 및/또는 다른 구성요소를 가질 수 있다. 또한, 컴퓨터는 특정 구성요소가 없을 수 있다. 게다가, 저장 장치는 컴퓨터로부터 국지 및/또는 원격일 수 있다(가령 저장 영역 네트워크(SAN)에 구현된 것).
당해 분야에 공지된 바와 같이, 컴퓨터는 본 명세서에 기술된 기능을 제공하기 위한 컴퓨터 프로그램 모듈을 실행하도록 조정될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "모듈"은 특정된 기능을 제공하기 위해 사용되는 컴퓨터 프로그램 로직을 가리킨다. 따라서, 모듈은 하드웨어, 펌웨어, 및/또는 소프트웨어로 실행될 수 있다. 한 구체예에서, 프로그램 모듈은 저장 장치에 저장되고, 메모리에 담기고, 프로세서에 의해 실행된다.
본 명세서에 기술된 실시예와 구체예는 단지 예시의 목적을 위한 것이고, 이에 비추어 다양한 변형 및 변화가 당해 분야의 숙련가에게 시사될 것이며 본 명세서의 기술적 사상과 이해범위 및 첨부된 청구항의 범위 내에 포함되는 것이 이해된다.
실시예
이하는 본 명세서에 기술된 항원-결합 폴리펩티드 구조체를 제조하고 사용하기 위한 특정 구체예의 예시이다. 실시예는 단지 예시의 목적을 위해 제공되며, 어떠는 방식으로도 본 개시의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 사용된 숫자(예컨대, 양, 온도, 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력하였으나, 일부 실험적 오류 및 편차는 당연히 허용되어야 한다.
본 명세서에 기술된 구조체 및 방법은 달리 지정되지 않는 한, 단백질 화학, 생화학, 재조합 DNA 기술 및 제약학의 통상적인 방법을 이용하여 당해 분야의 기술 내에서 제조되고 수행될 수 있다. 그러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 뮬졍 , T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., 최신판); Sambrook, 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2판, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18판 (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Carey 및 Sundberg Advanced Organic Chemistry 3판 (Plenum Press) Vols A 및 B(1992)를 참조하라.
실시예
실시예 1: Fab 접점의 분자 모델링 및 컴퓨터 유도 조작
구조- 및 컴퓨터 분자 모델링-유도 접근법을 사용하여 하나의 Fab가 카파 경사슬을 가지고 다른 Fab가 람다 경사슬을 가지는(즉 카파-람다 시스템, 또는 K-L 시스템) 이중특이적 항체의 제조를 위한 카파-람다(K-L) 설계 라이브러리를 만들었다. K-L 설계 라이브러리는 이들 중사슬 및 경사슬이 동시-발현되는 경우 요망되는 이중특이적 항체의 우선적 형성을 촉진하는 Fab의 중사슬 및 경사슬 내에 아미노산 변형을 가지는 설계를 포함한다. K-L 설계 라이브러리는 이중특이적 항체 내 카파 및 람다 경사슬 사이에 내재된 차이점의 장점을 이용하며 따라서 카파-람다 시스템을 위해 최적화되었다. K-L 설계 라이브러리는 대표적인 Fab들, 카파 경사슬을 내포하는 대표적인 Fab(카파 Fab)로서 D3H44(항-조직 인자 항체), 및 람다 경사슬을 내포하는 대표적인 Fab(람다 Fab)로서 CAT-2200(항-IL-17A 항체)의 구조를 연구함으로써 생성되었으나, 라이브러리는 다른 이중특이적 K-L 시스템 항체 또는 이들의 단편의 맥락에서 관심의 항체에서 요망되는 쌍 형성 특이성을 나타내는 설계를 확인하기 위해 사용될 수 있다.
대표적인 Fab는 표 1에 나타난 기준을 기초로 하여 선택하였다. 이들 기준은 Fab이 인간 또는 인간화되고, 공통적으로 사용되는 VH 및 VL 하위군을 가지며 최소 프레임워크 영역 돌연변이를 내포하는 것을 포함하였다. 또한, 입수가능한 비-과다(90% 서열 동일성 역치) 카파 및 람다 구조를 가지는 쌍방식의 3D 중첩을 수행하였다(구조는 Rutgers University(Camden, NJ) 및 University of California at San Diego(San Diego, CA)에서 유지하는 데이터베이스인 RSCB PDB로부터 수득함), 인터넷에서 www.rcsb.org를 참조하라. 표 1에 기술된 다른 척도와 함께, VH-VL 또는 CH1-CL에 대한 낮은 H-L 교차 도메인 RMSD(제곱-평균-제곱근 편차)을 카파 및 람다 시스템 중 각각 하나에 대한 대표적인 구조를 선별하기 위해 사용하였다. 대표적인 Fab로서 D3H44 (PDB ID 1JPT) 및 CAT-2200 (PDB ID 2VXS)을 선별한 후에, 중사슬 및 경사슬 사이의 상호작용을 위해 중요한 잔기를 확인하고 이해하기 위해, 2-갈래 접근법을 이용하여 이들 Fab 접점의 가상계산 내(in silico) 구조적 분석을 수행하였다.
먼저, 공지의 항체의 서열 및 구조 정렬을 통해 Fab 가변 및 불변 접점에 걸친 서열 보존의 전반적인 분석을 수행하였다. D3H44 및 항-HER2 항체 페르투주맙(둘다 카파 경사슬 내포) 및 CAT-2200 (람다 경사슬 내포)의 서열에 비교한 다양한 항체 하위군으로부터의 불변 및 가변 도메인 서열의 정렬이 도 1에 나타난다. 도 1a 및 도 1e는 대표적인 인간 VH 생식계열 하위군을 각각 D3H44/페르투주맙 및 CAT-2200의 그것과 비교하는 정렬을 도시한다. 도 1b는 대표적인 인간 카파 VL 생식계열 하위군과 D3H44/페르투주맙을 비교하는 정렬을 도시한다. 도 1c 및 도 1g는 인간 CH1 알릴 서열을 각각 D3H44/페르투주맙 및 CAT-2200의 그것과 비교하는 정렬을 도시한다. 도 1d는 인간 카파 알릴 서열과 D3H44/페르투주맙을 비교하는 정렬을 도시한다. 도 1f는 대표적인 인간 람다 VL 생식계열 하위군과 CAT-2200을 비교하는 정렬을 도시한다. 도 1h는 인간 람다 알릴 서열과 CAT-2200을 비교하는 정렬을 도시한다. 이러한 분석은 페르투주맙 및 D3H44가 카파 불변 및 가변 도메인 생식계열과 높은 정도의 서열 보존을 보여주는 반면, CAT-2200이 람다 불변 및 가변 도메인 생식계열과 높은 정도의 서열 보존을 보여줌을 드러냈다. 이들 정렬은 또한 두 중사슬 및 경사슬 모두의 불변 도메인에서 더 높은 정도의 보존을 예시하며, 불변 도메인 접점 내 설계가 다른 항체로 더 잘 이동가능할 수 있게 한다.
제2 접근법은 도 2(예컨대 ResidueContactsTM 및 AffinityDecompositionTM)에 나타난 바와 같은 수많은 분자 모델링 수단을 이용하는 D3H44 및 CAT-2200 결정 구조 접점의 분석을 포함하였다. 다른 항체 또는 단편으로의 이동가능성을 향상하기 위해 분석은 서열 보존이 더 높은 불변 도메인에 집중되었다(도 1 참조). 이들 분석은 표 2에 나타난 바와 같이, 대표적인 카파 Fab (D3H44) 및 람다 Fab (CAT-2200) 구조 사이의 핫스팟 위치(핵심 접점 잔기) 차이를 확인하기 위해 사용되었다. CH1-CL (카파) 및 CH1-CL (람다) 구조 사이의 불변 도메인 내에 눈에 띄는 형태적 차이점이 존재한다. CH1 도메인 상의 이용가능한 Fab 구조의 중첩은 CL (카파) 구조가 매우 유사한 형태를 이루며 밀접한 집단을 형성함을 보여주었다. CL (람다) 형태는, 그러나, 두 가지 구별된 집단으로 나뉘는 경향을 가지며: 하나는 카파 방향에 가깝고(카파-유사 집단) 및 하나는 더욱 부정합의 방향을 가진다(람다 집단). 이러한 분석으로 D3H44는 전형적인 카파 구조를 나타내고 CAT-2200는 전형적인 람다 구조를 나타낸다(람다 집단). 도 3은 대표적인 구조로서 D3H44 및 CAT-2200를 사용하여 전형적인 불변 도메인 카파-람다 형태적 차이를 예시한다. 이들 차이점은 주로 CH1 도메인에 비해 경사슬 불변 도메인의 강체 이동을 저해하는 것으로 보이며, 이는 람다 시스템과 비교했을 때 카파의 불변 도메인 내 H-L 접점의 성질을 변화시킨다. 규명된 핫스팟 부정합(표 2) 뿐만 아니라 상기-언급된 형태적 차이점(도 3)이 카파 Fab 및 람다 Fab를 내포하는 이중특이적 시스템을 위한 H-L 쌍 형성 설계의 유전조작을 위한 출발점으로서 기능했다. Kabat에 따른 모 D3H44 및 CAT-2200 서열 내 아미노산의 번호는 표 3A 및 표 3B에 제공된다.
다음으로, 핫스팟 위치 뿐만 아니라 3D 결정 구조 내 관심의 핫스팟과 이웃하는 위치에서 가능한 돌연변이를 가상계산 내 돌연변이유발 및 ZymepackTM을 이용한 팩킹/모델링을 통해 모사 및 규명하였다. ZymepackTM는 유입 구조 및 돌연변이의 집합이 제공되면, 공급된 돌연변이에 따른 유입 구조 내 잔기 유형을 변화시키고, 돌연변이 단백질의 물리적 구조에 대한 추정인 신규한 구조를 생성하는 소프트웨어 팩이다. 추가적으로, Zymepack™는 다양한 정량적 계량을 산출하여 돌연변이 단백질의 특성을 평가한다. 이들 계량은 돌연변이 단백질의 안정성, 결합 친화성, 또는 이종이합체 특이성과 연관될 수 있는 입체 및 정전 상보성의 측정을 포함한다.
접점 부정합을 이용함으로써, 돌연변이는 도입되어 요망되는 또는 바람직한 폴리펩티드 사슬 또는 이종이합체의 선택적 쌍 형성을 촉진하는 반면 부정확한 쌍 또는 오류쌍형성된 폴리펩티드 사슬 또는 이종이합체의 형성은 방지하였다. 예를 들면, 하나의 카파 Fab 및 하나의 람다 Fab를 가지는 이중특이적 항체를 제조하기 위해, 네 가지 폴리펩티드 사슬이 필요하다. 카파 Fab은 중사슬 1(H1) 및 카파 경사슬 1(L1)을 포함하는 반면, 람다 Fab는 중사슬 2(H2) 및 람다 경사슬 2(L2)을 포함한다. 이러한 경우에, 요망되는 H-L 쌍은 H1L1 및 H2L2인 반면, 부정확한 쌍은 H1L2 및 H2L1일 것이다. 여기서 폴리펩티드 사슬의 표시/번호는 임의적임에 주의하라. 따라서, 오류쌍형성된 CH1-CL (람다) 접점 (H1L2)보다 쌍형성된 CH1-CL (카파) 접점 (H1L1)를 촉진하는 돌연변이 및 오류쌍형성된 CH1-C L (카파) 접점 (H2L1)보다 쌍형성된 CH1-CL (람다) 접점 (H2L2)를 촉진하는 돌연변이를 규명하여 불변 도메인 내에 카파 Fab-람다 Fab 맞춤 설계를 생성하였다. ZymepackTM을 비롯한 컴퓨터 방법을 사용하여, 입체 상보성을 모델링하고 또한 반데어발스 팩킹, 공동 효과 및 소수성 기의 긴밀한 접촉과 같은 에너지 요인을 기초로 계산하였다. 유사하게, 정전 상호작용 에너지를 모델링하고 전하 사이의 쿨롬(coulomb) 상호작용, 수소 결합, 및 탈용매화 효과를 기초로 평가하였다. 관심의 돌연변이를 도입하여 수득한 두 가지 바람직한 중사슬 및 경사슬 쌍 모델 H1L1 및 H2L2, 및 부정확한 쌍 모델 H1L2 및 H2L1를 모사하여 상대적인 입체 및 정전 점수를 계산하였다. 이는 특정 돌연변이 집합이 부정확한 쌍에 비해 바람직한 중사슬 - 경사슬 쌍에 대해 유리한 에너지 즉 더 높은 입체 및/또는 정전 상보성을 유도하는지 결정하는 것을 가능하게 한다. 산출된 입체 및 정전 에너지는 경사슬 및 중사슬 쌍 형성과 연관된 자유 에너지의 성분이다. 따라서 더 높은 입체 및 정전 상보성은 부정확한 쌍의 쌍 형성에 비해 요망되는 쌍의 쌍 형성과 연관된 더 큰 자유 에너지 변화를 시사한다. 더 높은 입체 및/또는 정전 상보성은 부정확한 쌍에 대한 입체 페널티 및/또는 정전 척력에 비해 요망되는 중사슬 및 경사슬의 우선적 (선택적) 쌍 형성을 생성한다.
실시예 2: 설계의 선별 및 설명
실시예 1에 기술된 접근법은 H-L 이종이합체 쌍 중 하나가 카파 경사슬을 포함하고 다른 하나가 람다 경사슬을 포함하는 경우 선택적 또는 우선적 쌍 형성을 나타내는 중사슬-경사슬 이종이합체 쌍(즉 H1L1 및 H2L2)을 설계하기 위해 사용되었다. 이종이합체는 "Mab 설계" 또는 "Mab 설계 집합"으로 지칭되는 쌍으로 설계되었고 우선적 쌍 형성을 촉진하는 H1, L1, H2, 및 L2 사슬 상의 아미노산 치환의 집합을 포함한다. Mab 설계 집합은 처음에는 "LCCA 설계"로서 시험되었고 여기서 상대적 쌍 형성을 평가하기 위해 Mab 설계 집합의 하나의 중사슬이 Mab 설계 집합의 두 가지 경사슬, 하나의 카파 및 하나의 람다와 동시-발현되었다. 실시예 전반에 걸쳐 기술된 아미노산 치환은 달리 지정되지 않는 한 Kabat 및 Wu, 1991; Kabat 등, Sequences of proteins of immunological interest. 5판 - US Department of Health and Human Services, NIH 공개 번호 91-3242, p 647 (1991)에 기술된 KABAT 번호 시스템을 이용하는 표 3A 및 표 3B(페르투주맙 및 CAT-2200 Fab에 대해)를 참고로 확인된다. 참고를 위해, 그러나, 표 22A, 22B, 및 22C는 적용가능한 대로 IMGT, 1JPT, 및 EU 번호 시스템을 이용하여 중사슬, 카파 경사슬, 및 람다 경사슬 내 선택된 아미노산 위치의 식별을 제공한다.
Mab 설계는 D3H44 및 CAT-2200의 분자 모델 상에 팩킹되고 계량은 실시예 1에 기술된 바와 같이 산출되었다. 최고의 설계가 이후 위험(안정성 뿐만 아니라 면역원성에 대한 효과 최소화) 및 영향(이는 유도 쌍 형성 특이성의 제안된 강도를 고려함)을 기반으로 선택되었다. 최고의 설계는 이후 쌍 형성 특이성을 실험적으로 결정하기 위한 경사슬 경쟁 어세이 (LCCA)로 시험되었다(실시예 4 참조). 비록 Mab 설계가 대표적인 Fab로서 D3H44 및 CAT-2200를 이용하여 확인되었지만, 이들은 카파 Fab로서 페르투주맙 및 람다 Fab로서 CAT-2200를 이용하는 K-L 시스템(페르투주맙-CAT-2200 K-L 시스템)에서 시험되었다. 도 1c 및 도 1d에 나타난 바와 같이, D3H44 및 페르투주맙은 불변 도메인에 동일한 서열을 가지고, 두 시스템 사이에 매끄러운 상호변환을 가능하게 한다. 이들 Mab 설계는 K-L 설계로 지칭된다.
두 번째 설계 집합이 또한 페르투주맙/CAT-2200 K-L 시스템에서 시험되었다. 이들 설계는 출발점으로서 국제 특허 출원 번호 PCT/CA2013/050914호(국제 특허 공개 번호 WO2014/082179호)의 표 30에 기술된 카파-카파 (K-K) 설계 라이브러리로부터의 설계의 다양성을 반영하는 대표적인 설계를 이용하여 제안되었다. 이들 대표적인 K-K-유래 설계는 가능한 경우 K-L 시스템에 대한 변형 없이 적용되거나, 또는 카파 및 람다 경사슬 사이의 서열 및 구조적 차이를 설명하기 위해 필요한 경우 아미노산 잔기를 변형함으로써 카파-람다-시스템으로 조정된 설계의 하위집합을 포함한다. 대표적인 K-K-유래 설계의 두 유형은 K-K-유래 K-L 설계로 지칭된다.
K-L 설계 및 K-K-유래 K-L 설계에 대한 쌍 형성 특이성은 실시예 4에 기술된 바와 같이 카파-람다 시스템 내 LCCA에 의한 LCCA 설계로서 실험적으로 평가되었다.
실시예 3: 페르투주맙 IgG 중사슬, 페르투주맙 IgG 경사슬, CAT-2200 IgG 중사슬, 및 CAT-2200 IgG 경사슬을 인코딩하는 Fab 구조체의 제조.
항-HER2 항체 페르투주맙 및 항-IL17 항체 CAT-2200의 야생형 Fab 중사슬 및 경사슬은 다음과 같이 제조하였다. 페르투주맙 Fab 경사슬(유전자은행 등록번호. HC359025.1, 서열 번호:2) 및 중사슬 (유전자은행 등록번호. HC359024.1, 서열 번호:1)의 단백질 서열을 DNA, 포유류 발현에 최적화된 코돈, 및 합성된 유전자(각각 서열번호: 8 및 7)로 역 번역하였다. CAT-2200 Fab 경사슬 (2VXS 사슬 L, 서열 번호:4) 및 중사슬 (2VXS 사슬 H, 서열 번호:3)의 단백질 서열을 PDB 접근 2VXS로부터 얻어서, DNA, 포유류 발현에 최적화된 코돈, 및 합성된 유전자(각각 서열 번호:10 및 9)로 역 번역하였다. 이들 항체 중사슬 및 경사슬의 폴리펩티드 및 DNA 서열은 표 3C에 나타난다.
5'-EcoRI 절단부위 - HLA-A 신호 펩티드 - HA 또는 FLAG 태그 - 경사슬 Ig 클론 - 'TGA 또는 TAA 중지' - BamH1 절단부위-3'로 이루어진 경사슬 벡터 삽입체를 pTT5 벡터(Durocher Y 등, Nucl. Acids Res. 2002; 30,No.2 e9)에 결찰시켜 경사슬 발현 벡터를 제작하였다. 생성된 경사슬 발현 벡터는 암호화 DNA의 정확한 판독 프레임 및 서열을 확인하기 위해 서열분석하였다. 유사하게, 5'-EcoR1 제한 부위 - HLA-A 신호 펩티드 - 중사슬 클론(T238에서 종결; 표 3A 참조) - ABD2-His6태그 - TGA 중지 - BamH1 절단부위-3'로 이루어진 중사슬 벡터 삽입체를 pTT5 벡터(ABD2=알부민 결합 도메인 단백질의 두 복제물, 직렬)에 결찰시켜 중사슬 발현 벡터를 제작하였다. 생성된 중사슬 발현 벡터를 또한 암호화 DNA의 정확한 판독 프레임 및 서열을 확인하기 위해 서열분석하였다. Mab 설계 집합을 위해 아미노산 치환을 내포하는 다양한 페르투주맙 또는 CAT-2200 Fab 구조체를 유전자 합성 또는 부위-지정 돌연변이유발에 의해 생성하였다(Braman J, Papworth C & Greener A., Methods Mol. Biol. (1996) 57:31-44).
중사슬 및 경사슬은 경쟁 어세이-SPR 선별(LCCA)을 통한 우선적 쌍 형성의 평가를 용이하게 하기 위해 각각 C- 및 N-말단에 태깅되었다. ABD2-His6 중사슬 태그는 H-L 복합체가 항-His 태그 SPR 칩 표면에 포획되게 하는 반면, FLAG 및 HA 경사슬 태그는 상대적인 L1 및 L2 집단이 정량화되게 한다.
실시예 4: 경사슬 경쟁 어세이(LCCA)에 의한 설계된 Fab 이종이합체의 우선적 쌍 형성의 평가
아미노산 변형을 포함하는 Fab 형태로 CAT-2200 및 페르투주맙 IgG 중사슬 및 경사슬을 인코딩하는 구조체를 실시예 3에 기술된 바와 같이 제조하였다. LCCA 설계 집합(H1, L1, L2 또는 H2, L2, L1)의 맥락에서 우선적으로 쌍을 이뤄 요망되는 H-L 이종이합체를 형성하는 구조체의 능력을 경사슬 경쟁 어세이(LCCA)를 이용하여 측정하였다.
LCCA는 하나의 중사슬의 적어도 두 가지 고유한 경사슬, 하나는 카파 및 하나는 람다,에 대한 상대적 쌍 형성을 정량화하며, 다음과 같이 요약될 수 있다. 람다 Fab에 대한 쌍 형성 특이성을 측정하기 위해, 하나의 CAT-2200 중사슬 Fab 구조체를 하나의 CAT-2200 경사슬 Fab 구조체(쌍형성된 Fab 산물 H1L1) 및 하나의 페르투주맙 경사슬 Fab 구조체(오류쌍형성된 Fab 산물 H1L2)와 함께 동시-발현하였고 상대적인 경사슬 쌍 형성 특이성(H1L1:H1L2)을 경쟁 어세이-SPR 선별로부터,이중복으로 수행하여 측정하였다. 역으로, 카파 Fab에 대한 쌍 형성 특이성을 측정하기 위해, 하나의 페르투주맙 중사슬 Fab 구조체를 하나의 페르투주맙 경사슬 Fab 구조체(쌍형성된 Fab 산물 H2L2) 및 하나의 CAT-2200 경사슬 Fab 구조체(오류쌍형성된 Fab 산물 H2L1)와 함께 동시-발현하였고 상대적인 경사슬 쌍 형성 특이성(H2L2:H2L1)을 경쟁 어세이-SPR 선별로부터,이중복으로 수행하여 측정하였다.
LCCA 어세이는 중사슬은 제한된 양으로 하고, H1:L1:L2 또는 H2:L2:L1에 대한 1:1:1의 비율(중량으로)로 중사슬 및 경사슬의 동시적 발현에 의해 수행하였다. 각각의 이종이합체 형태(즉 H1L1 및 H1L2 또는 H2L2 및 H2L1)의 양을 his-태그 침강을 통해 SPR 칩에 중사슬을 결합시키고, 이어서 이들 태그에 특이적인 항체를 이용하여 각각의 경사슬 태그 (HA 또는 FLAG)의 양을 검출함으로써 측정하였다. 이후, 선택된 이종이합체 히트를 경사슬 경쟁 어세이 검증을 통해 검증하였고 이때 L1:L2 DNA 비율을 다시 1:1 비율로 확인하는 반면, 중사슬은 제한된 양으로 유지하였다. 이들 특정 카파-람다 시스템 조합물에 있어서 경사슬 태그는 야생형 LCCA 쌍 형성에 대한 효과를 가져서, 예상된 중립 50%:50% 비율로부터 편차를 야기할 수 있다. 이런 이유로 인해 HA 태그를 갖는 페르투주맙 경사슬 및 FLAG 태그를 갖는 CAT-2200 경사슬을 융합함으로써 중립으로부터의 편차의 최소량을 갖는 배치를 선택하였다. 어세이 설계를 나타내는 도식이 도 4에 나타난다. 도 5는 중사슬 및 경사슬이 어떻게 태깅되며 우선적 쌍 형성이 어떻게 평가되는지 도시한다. LCCA의 실험적 세부내용이 하기에 제공된다.
형질주입 방법
실시예 3에 기술된 바와 같이 제조된 하나의 중사슬 구조체 및 두 가지 경사슬 구조체를 포함하는 LCCA 설계를 다음과 같이 CHO-3E7 세포에 형질주입시켰다. 1.7 - 2 x 106 세포/ml의 밀도의 CHO-3E7 세포를 4 mM 글루타민 및 0.1% KoliphorP188 (Sigma #K4894)로 보충된 FreeStyleTM F17 배지(Invitrogen cat# A-1383501)에 37°C에서 배양하였다. 2 ml의 총 부피를 1:2.5의 DNA:PEI 비로 PEI-프로 (Polyplus 형질주입 # 115-375)를 이용하여 총 2 μg DNA로 형질주입시켰다. 모든 형질주입은 333 ng의 각각의 중사슬 및 각각의 경사슬(즉 H1:L1:L2 또는 H2:L2:L1 = 1:1:1 비율), 300 ng의 AKTdd pTT22(구성적 활성 단백질 키나아제 B 돌연변이를 내포하는 벡터), 및 700 ng의 ssDNA(연어 정자 DNA)를 이용하여 수행하였다. DNA-PEI 혼합물을 부가하고 24시간 후, 0.5 mM 발프로산(최종 농도) 및 1% w/v 트립톤(최종 농도)을 세포에 부가하고 이를 이후 32°C로 이동시켰다. 상청액을 발현 제7일에 비-환원 SDS-PAGE 분석으로 시험하고 이후 밴드를 시각화하기 위한 쿠마시 블루 염색으로 처리하였다.
경쟁 어세이 SPR 방법
LCCA 설계에서 각각의 두 경사슬에 대한 우선적 중사슬 쌍 형성 정도를 각각의 경사슬의 N-말단에 위치한 고유한 에피토프 태그의 SPR-기반 판독을 이용하여 평가하였다. CAT-2200 LC 구조체는 FLAG 태그를 내포하고 페르투주맙 LC 구조체는 HA 태그를 내포한다.
표면 플라스몬 공명 (SPR) 공급물. GLC 센서칩, Biorad ProteOn 아민 커플링 키트(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 염화수소산염(EDC), N-하이드록시설포석신이미드(sNHS) 및 에탄올아민), 및 10 mM 나트륨 아세테이트 완충액을 Bio-Rad Laboratories (Canada) Ltd. (Mississauga, ON)로부터 구입하였다. 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산(HEPES) 완충액, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 및 NaCl을 Sigma-Aldrich (Oakville, ON)로부터 구입하였다. 10% Tween 20 용액을 Teknova (Hollister, CA)로부터 구입하였다.
SPR 바이오센서 어세이. 모든 표면 플라즈몬 공명 어세이는 BioRad ProteOn XPR36 장비(Bio-Rad Laboratories (Canada) Ltd. (Mississauga, ON))와 PBST 러닝 완충액(0.05% Tween20 포함 PBS Teknova Inc)를 이용하여 25°C의 온도에서 수행하였다. 항-펜타 HisTM 포획 표면은 피분석물(수평) 방향으로 100 μL/분에서 140초 동안 주사된 표준 BioRad sNHS/EDC 용액의 1:5 희석에 의해 활성화된 GLC 센서칩을 이용하여 생성하였다. 활성화 직후, 10 mM NaOAc pH 4.5 내 항-펜타 HisTM 항체의(Qiagen Inc.) 25 μg/mL 용액을 대략 3000 공명 단위(RU)가 고정될 때까지 25 μL/분의 유속으로 피분석물(수직) 방향으로 주사하였다. 잔여 활성 기를 피분석물 방향으로 100 μL/분으로 1M 에탄올아민을 140초 주사하여 퀀칭시켰고, 이는 또한 블랭크 기준을 위해 모의-활성화 중간스팟을 생성하도록 보장한다.
항-FLAG(Sigma Inc.) 및 항-HA(Roche Inc.) 단클론 항체에 대한 결합을 위한 이종이합체의 스크리닝은 두 단계로 일어났다: 리간드 방향으로 항-펜타 His™ 표면 상에의 이종이합체를 간접 포획한 후 피분석물 방향으로 항-FLAG 및 항-HA를 주사. 먼저, 리간드 방향으로 100 μL/분으로 30초 동안 PBST의 한 회 주사를 사용하여 기준선을 안정화하였다. 각각의 이종이합체 포획을 위해, 세포-배양 배지 내 비정제 이종이합체를 PBST 내에 4%로 희석하였다. 하나 내지 다섯 개 이종이합체 또는 대조군(즉 100% HA-경사슬 또는 100% FLAG-경사슬을 내포하는 대조군)을 개별적인 리간드 통로에 240초동안 25 μL/분 유량으로 동시 주사하여, 항-펜타 His 표면 상에 대량 300 내지 400 RU의 포화 이종이합체를 포획하였다. 첫 번째 리간드 통로는 필요시 블랭크 대조군으로 사용하기 위해 비워두었다. 이러한 이종이합체 포획 단계는 즉시 기초선을 안정화하기 위한 피분석물 방향으로의 두 차례 완충액 주사로 이어졌고, 이후 5 nM 항-FLAG 및 5 nM 항-HA가 각각 이중복으로 50 μL/분으로 120초간 주사되고 180초간 해리 기간을 가졌고, 이는 각각의 포획된 이종이합체에 대한 완충액 기준을 이용한 결합 센서그램의 집합을 도출하였다. 이종이합체를 100 μL/분으로 18초 동안 0.85% 인산의 18초 펄스로 재생시켜 다음 주사 주기를 위한 항-펜타 HisTM 표면을 제조하였다. 센서그램을 완충액 블랭크 주사 및 인터스팟을 이용하여 정렬 및 이중-기준하였고, 생성된 센서그램을 ProteOn Manager 소프트웨어 v3.0을 이용하여 분석하였다.
LCCA 계량의 데이터 분석 및 설명
각각의 설계에 있어서, H1L1H2L2 형태로 존재하는 우선적 쌍 형성의 평가는 두 가지 상보적 LCCA 설계 집합, 하나는 H1L1L2 조합 및 다른 하나는 H2L1L2 조합,에 의해 평가되었다. 각각의 LCCA 설계 집합은 '고유한 식별자'로 표시된다(예를 들면, 10629 또는 10695). 각각의 Mab 설계 집합(H1L1H2L2)은 결론적으로 두 가지 구성 LCCA(예컨대 10629-10695)에 대한 LCCA 설계 집합 수에 의해 확인된다.
각각의 Mab 설계 집합의 LCCA 설계 집합(H1L1L2 또는 H2L1L2)을 LCCA로 시험하였고, 관심의 설계 집합을 다음의 포함 기준을 기초로 확인하였다. 관심의 설계로 간주되기 위해, 설계는 중립 구역을 넘는 적어도 하나의 양성 LCCA 결과(> 60:40 올바른 쌍 형성:오류쌍형성 비율)를 보유해야 하는 반면 다른 상보적 LCCA는 도 6에 예시된 바와 같이 중립 구역의 하한(40:60 올바른 쌍 형성:오류쌍형성 비율)을 넘어야 한다. 중립 구역은 H1-L1:H1-L2 및 H2-L2:H2-L1에 대한 중간 정상화 수치를 이용하여 40%:60% 및 60%:40% 올바른 쌍 형성:오류쌍형성 비율 사이의 영역으로 정의되었다. 예를 들면, 도 6의 시나리오 A 및 B는 포함 기준을 넘는 설계를 나타낸다. 시나리오 B가 포함된 이유는 H2L2:H2L1 LCCA가 중립 구역을 넘으며 H1L1:H1L2 LCCA가 중립 구역 내부(아래에 있지 않음)에 있기 때문이다. 시나리오 C는 LCCA 결과가 모두 양성이지만, 어느 것도 중립 구역 위에 있지 않고, 따라서 포함되지 않은 설계를 나타낸다. 시나리오 D 및 E는 필터링 후 배제된 설계를 나타내며 그 이유는 다른 LCCA가 중립 구역 위에 있더라도 적어도 하나의 LCCA 결과가 중립 구역 아래에 있기 때문이다(시나리오 D 참조). 표 4A(K-L 설계) 및 4B(K-K-유래 K-L 설계)는 이들 기준을 충족하는 Mab 설계집합을 나열하는 반면, 표 5A 및 5B는 이들 설계에 대한 LCCA 결과를 나타낸다. 표 4A 및 4B 및 LCCA 설계 집합 또는 Mab 설계 집합의 아미노산 치환을 나열하는 모든 이어지는 표에서, 표 내 치환의 부재, 또는 "-"는 폴리펩티드 사슬이 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 치환을 포함하지 않음을 나타낸다.
각각의 LCCA 설계 집합의 성능은 두 가지 스칼라 수치, ln(r1/f1) 또는 ln(r2/f2)에 의해 기술되며, 여기서 r1 및 r2는 각각 비율 H1L1:H1L2 및 H2L2:H2L1의 중간값에 해당하고, f1 및 f2는 비율 H1L1:H1L2 및 H2L2:H2L1의 각각의 중간값에 해당한다. 정상화된 스칼라 수치는 설계로부터 WT(야생형) 시스템의 기여를 차감하여 생성된다; ln(r1/f1)설계 - ln(r1/f1)WT 또는 ln(r2/f2)설계 - ln(r2/f2)WT. CAT-2200 (LC-FLAG) 더하기 페르투주맙(LC-HA)에 대해 경쟁한 야생형 CAT-2200 (HC)에 있어서 ln(r1/f1)WT = -0.48이다. 페르투주맙(LC-HA) 더하기 CAT-2200(LC-FLAG)에 대해 경쟁한 야생형 페르투주맙(HC)에 있어서 ln(r2/f2)WT = 0.66이다. 이러한 절차는 임의의 존재하는 WT 쌍 형성 편향을 효과적으로 제거하였고 중립 50%:50% L1:L2 WT 시스템에 비교한 특이성을 정상화하였다. 이들 수치는 표 5A 및 5B의 컬럼 2 및 5에 보고된다.
또한, 정상화된 스칼라 수치는 또한 순수 정상화된 중간 비율 H1L1:H1L2 및 H2L2:H2L1로 다시 전환되었다. 이러한 전환은 LCCA 비율을 H1L1 및 H1L2, 또는 H2L2 및 H2L1의 총량이 100%와 상당히 상이한 일부 설계된 Fab에서 관찰되는 것처럼 100%까지 효과적으로 정상화하였다. 총 경사슬 백분율 내 이러한 차이는 부분적으로 SPR 칩 상의 초기 이종이합체 포획 도중 가변 비-특이적 결합의 발생 때문으로 여겨진다. 이들 수치는 표 5A 및 5B의 컬럼 4 및 7에 보고된다.
게다가, 설계(H1L1:H1L2 및 H2L2:H2L1 실험)의 각각의 정상화된 LCCA에 대한 스칼라 범위 뿐만 아니라 오류쌍형성된 Fab 이종이합체에 대해 올바른 쌍 형성의 정상화된 비율에 대한 범위(범위는 정상화된 비율에서 L1의 백분율 및 L2의 백분율과 동일함)가 나타난다. 단일 측정으로부터 보고된 결과에 있어서 범위 수치는 NA(적용 불가)로 표시된다. 이들 수치는 표 5A 및 5B의 컬럼 3 및 6에 보고된다.
참조를 위해, 표 23은 쌍형성:오류쌍형성 이종이합체의 % 및 상응하는 LCCA 스칼라 수치 사이의 상응성을 나타낸다.
결과
LCCA 결과가 Mab 설계 집합의 맥락에서 표 5A 및 5B에 나타난다. 표 5A는 실시예 2에 기술된 K-L 설계와 연관된 LCCA 데이터를 제공하는 반면, 표 5B는 실시예 2에 역시 기술된 K-K-유래 K-L 설계와 연관된 LCCA 데이터를 제공한다. 모든 LCCA 실험이 불변 도메인에 위치한 사슬-간 Fab 이황화 결합을 내포하는 구조체(H/C233-L/C214, KABAT 번호)에 대해 수행되었음에 주의하라.
표 4A는 포함 기준을 충족하는 231개의 K-L 설계를 나열한다. 이들 설계와 연관된 LCCA 데이터가 표 5A에 나타난다. 표 4B는 포함 기준을 충족하는 44개의 K-K-유래 K-L 설계를 나열하며 표 5B는 이들 설계와 연관된 LCCA 데이터를 나타낸다. 상기-언급된 PCT 출원 번호 PCT/CA2013/050914호의 표 30으로부터의 본래의 K-K 설계 라이브러리 및 신규한 카파-람다 시스템(즉 변형 없이 적용된 것) 사이의 100% 동일성을 유지하는 설계는 표 4B에서 별표(*)로 확인된다. 표 4B의 대부분의 설계는 불변 영역에만 아미노산 변형을 가지며, 적은 수의 설계가 또한 가변 영역에도 아미노산 변형을 포함한다. 이들 설계는 쌍 형성 특이성을 추가로 추진한다고 제안되는 반면 또한 다른 항체 시스템으로의 이동가능성을 좋게 하였다.
설계 강도는 특정 설계에 대한 두 LCCA 스칼라 수치의 합으로서 정의될 수 있다. K-L 설계와 K-K-유래 K-L 설계의 설계 강도를 비교함으로써 표 7에 요약된 바와 같이 K-L 시스템에 대해 특이적으로 맞춤된 설계가 K-L 시스템으로 이동된 K-K 설계보다 더 나은 쌍 형성 특이성을 보이는 경향이 명백하였다. K-K-유래 K-L 설계에 대한 중간 설계 강도는 1.86였고, 최대 설계 강도는 3.53였다. K-L 설계에 대한 중간 설계 강도는 2.69였고, 최대 설계 강도는 5.23였다.
실시예 5: 생체물리적 특징분석을 위한 설계된 Fab 이종이합체의 대량생산
고유한 식별자 집합(표 4A 및 4B)에 나타난 바와 같이 올바른 쌍을 형성한 이종이합체 H1L1 또는 H2L2를 대량생산(전형적으로 20 ml까지)하고 열 안정성 및 항원 결합에 대해 시험하기 위해 다음과 같이 정제하였다. 이들 실험을 위해, Fab의 중사슬을 ABD2 태그 없이 발현시킨 반면, 경사슬은 LCCA에서 사용된 동일한 HA 또는 FLAG 태그와 함께 발현시켰다. 각각의 이종이합체의 중사슬 및 경사슬을 CHO-3E7 세포의20 ml 배양물에서 발현시켰다. 1.7 - 2 x 106 세포/ml의 밀도의 CHO-3E7 세포를 4 mM 글루타민 및 0.1% Koliphor P188 (Sigma #K4894)로 보충된 FreeStyleTM F17 배지(Invitrogen cat# A-1383501)에 37°C에서 배양하였다. 20 ml의 총 부피를 1:2.5의 DNA:PEI 비로 PEI-프로 (Polyplus cat# 115-375)를 이용하여 총 20 μg DNA로 형질주입시켰다. DNA-PEI 혼합물을 부가하고 24시간 후, 0.5 mM 발프로산(최종 농도) 및 1% w/v 트립톤(최종 농도)을 세포에 부가하고 이를 이후 32°C로 이동시켰다.
형질주입 후 7일에 세포를 원심분리하고, 이종이합체를 IgG-CH1 CaptureSelect™ (Life Technologies™, Catalog No.: 194-320-005)를 이용한 친화성 포획에 의해 4°C에서 하기와 같이 상청액으로부터 정제하였다. 상청액을 평형 완충액(칼슘, 마그네슘, 및 페놀 레드(HyClone™# SH30028.02)가 없는 Dulbecco 포스페이트 완충 식염수(DPBS)) 내에 20 - 25% 세포 배양 상청액으로 희석하고 이후 역시 사전에 평형 완충액으로 평형화시킨 IgG-CH1 CaptureSelect™으로 16시간 동안 교반하면서 항온처리하였다. 수지를 이후 원심분리로 수집하고, 96 웰-자기질 플레이트로 옮기고, 평형 완충액으로 세 차례 세척하였다. 결합된 샘플을 1 내지 4 층 부피의 용리 완충액: 100 mM 글리신 pH 2.6으로 용리하였다. 용리된 샘플을 각각의 웰이 10%의 용리 부피로 중화 완충액: 1M Tris pH9.0를 함유하는 96-웰 UV-투과성 리시버 플레이트 내로 원심분리하여 수집하였다.
정제 후, 이종이합체 발현을 Caliper LabChip GXII (Perkin Elmer #760499)를 이용하는 비-환원 High Throughput Protein Express 어세이에 의해 평가하였다. 절차는 다음의 변형을 갖는 HT Protein Express LabChip User Guide 버전2 LabChip GXII User Manual에 따라 수행하였다. 2 μl 또는 5 μl(농도 범위 5-2000 ng/μl)의 이종이합체 샘플을 7 μl의 HT Protein Express Sample Buffer(Perkin Elmer # 760328)와 함께 96 웰 플레이트(BioRad # HSP9601) 내 개별 웰에 부가하였다. 이종이합체 샘플을 이후 70°C에서 15분간 변성시켰다. HT Protein Express Chip(Perkin Elmer #760499) 및 Ab-200 어세이 설정을 이용하여 LabChip 장비를 작동시켰다. 사용 후, 칩을 MilliQ 물로 세척하고 4°C에 저장하였다.
Mab 설계 집합 변형의 포함은 단백질 발현에 중요한 영향을 끼치지 않았다. 설계 변형을 내포하는 CAT-2200 Fab에 대해 수득한 발현 수준은 야생형 Fab에 대한 0.64 mg/20mL 발현(0.1 mg의 SD)와 비교할 때 0.45 mg/20mL 발현(0.16 mg의 SD)이었다. 설계 변형을 내포하는 페르투주맙 Fab는 야생형 Fab에 대한 0.4 mg/20mL 발현 (0.03 mg의 SD)과 비교할 때 0.39 mg/20 mL 발현(0.14 mg의 SD)을 발현하였다. 캘리퍼 분석은 WT Fab에 필적하는 순도 수준을 나타내었다.
실시예 6: 설계된 Fab 이종이합체의 항원 친화성 측정.
아미노산 치환이 항원에 결합하는 이종이합체의 능력에 임의의 영향을 끼치는지 확인하기 위해 IL-17A에 결합하는 CAT-2200 Fab 이종이합체 및 HER2-ECD에 결합하는 페르투주맙 Fab의 능력을 평가하였다. Fab 이종이합체를 실시예 5에 기술된 바와 같이 제조하였다. 항원에 대한 각각의 Fab 이종이합체의 친화성을 다음과 같이 SPR로 측정하였다.
SPR 공급물. GLC 센서칩, Biorad ProteOn 아민 커플링 키트(EDC, sNHS 및 에탄올아민), 및 10mM 나트륨 아세테이트 완충액을 Bio-Rad Laboratories (Canada) Ltd. (Mississauga, ON)로부터 구입하였다. 0.05% Tween20을 갖는 PBS 러닝 완충액(PBST)를 Teknoca Inc. (Hollister, CA)로부터 구입하였다. 재조합 HER2 단백질을 eBioscience (San Diego, CA)로부터 구입하였다. 염소 다클론 항-인간 Fc 항체를 Jackson Immuno Research Laboratories Inc. (West Grove, PA)로부터 구입하였다. 재조합 인간 IL-17A를 R&D Systems (Mineapolis, MN)로부터 구입하였다.
CAT-2200:IL-17A 친화성 측정.모든 표면 플라즈몬 공명 어세이는 BioRad ProteOn XPR36 장비(Bio-Rad Laboratories (Canada) Ltd. (Mississauga, ON))와 PBST 러닝 완충액을 이용하여 25°C의 온도에서 수행하였다. IL-17A 표면은 리간드(수직) 방향으로 100 μL/분에서 140초 동안 주사된 표준 BioRad sNHS/EDC 용액의 1:10 희석에 의해 활성화된 GLC 센서칩을 이용하여 생성하였다. 활성화 직후, 10 mM NaOAc pH 4.5 내 IL-17A의 2 마이크로g/mL 용액을 대략 50 공명 단위(RU)가 고정될 때까지 25 마이크로L/분의 유속으로 리간드(수평) 방향으로 주사하였다. 잔여 활성 기를 리간드 방향으로 역시 100 μL/분으로 1M 에탄올아민을 140초 주사하여 퀀칭시켰다.
IL-17A에 대한 결합을 위해 설계된 Fab의 선별을 피분석물(수평) 방향으로 정제된 CAT-2200 Fab를 주사하여 수행하였다. 먼저, 피분석물(수평) 방향으로 100 마이크로L/분으로 30초간의 두 가지 완충액 주사를 사용하여 기초선을 안정화하였다. 각각의 CAT-2200 설계된 Fab의 다섯 가지 농도의 세-배 희석 시리즈(60nM, 20nM, 6.7nM, 2.2nM, 0.74nM)를 블랭크 완충액 대조군과 함께 50 마이크로L/분으로 120초간 동시에 주입하고 15 분 해리 기간을 가져서, 완충액 기준을 가지는 결합 센서그램의 집합을 도출하였다. SPR 표면 상의 CAT-2200:IL-17A 복합체는 해리되고 IL-17A 표면은 다음 주사 주기를 위해 0.85% 인산의 두 펄스로 18초간 100 마이크로L/분으로 재생시켰다. 센서그램을 완충액 블랭크 주사 및 인터스팟을 이용하여 정렬 및 이중-기준하였고, 생성된 센서그램을 ProteOn Manager 소프트웨어 v3.1을 이용하여 분석하였다. 이중-기준 센서그램을 Langmuir 결합 모델에 정합시켰다.
페르투주맙:HER2 친화성 측정.모든 표면 플라즈몬 공명 어세이는 BioRad ProteOn XPR36 장비(Bio-Rad Laboratories (Canada) Ltd. (Mississauga, ON))와 PBST 러닝 완충액을 이용하여 25°C의 온도에서 수행하였다. 항-펜타 HisTM 항체(Qiagen) 포획 표면은 피분석물(수평) 방향으로 100 μL/분에서 140초 동안 주사된 표준 BioRad sNHS/EDC 용액의 1:10 희석에 의해 활성화된 GLC 센서칩을 이용하여 생성하였다. 활성화 직후, 10 mM NaOAc pH 4.5 내 항-펜타-His 항체의 10 마이크로g/mL 용액을 대략 3000 공명 단위(RU)가 고정될 때까지 25 μL/분의 유속으로 리간드(수평) 방향으로 주사하였다. 잔여 활성 기를 피분석물 방향으로 100 μL/분으로 1M 에탄올아민을 140초 주사하여 퀀칭시켜 블랭크 기준을 위해 모의-활성화 중간스팟이 생성되도록 보장하였다.
HER2에 대한 결합을 위해 설계된 Fab의 선별은 두 단계로 일어났다: 리간드 방향으로 항-펜타 His™ 항체 표면 상에의 설계된 Fab를 간접 포획한 후 피분석물 방향으로 5 농도의 정제된 HER2 항원 및 이중 기준을 위한 하나의 완충액 블랭크를 동시에 주사. 먼저, 리간드 방향으로 100 마이크로L/분으로 30초 동안 한 회의 완충액 주사를 사용하여 기준선을 안정화하였다. 각각의 설계된 Fab 포획을 위해, 설계된 Fab를 PBST 내에 2 마이크로g/mL으로 희석하였다. 하나 내지 다섯 가지의 설계된 Fab 또는 대조군을 개별적인 리간드 통로에 240초동안 25 μL/분 유량으로 동시에 주사하였다. 이는 항-인간 Fc 표면 상에 대략 400 내지 600 RU의 표획을 도출하였다. 첫 번째 리간드 통로는 필요시 블랭크 대조군으로 사용하기 위해 비워두었다. 이러한 포획 단계는 즉시 기초선을 안정화하기 위한 피분석물 방향으로의 두 차례 완충액 주사로 이어졌고, 이후 100nM, 33.3nM, 11.1nM, 3.7nM 및 0.41nM Her2가 완충액 블랭크와 함께 50 μL/분으로 120초간 동시에 주사되고 1200초간 해리 기간을 가졌다. 포획된 항체 표면을 100 μL/분으로 0.85% 인산의 18초 펄스로 재생시켜 다음 주사 주기를 위해 준비하였다. 센서그램을 완충액 블랭크 주사 및 인터스팟을 이용하여 정렬 및 이중-기준하였고, 생성된 센서그램을 ProteOn Manager 소프트웨어 v3.1을 이용하여 분석하였다. 이중-기준 센서그램을 1:1 결합 모델에 정합시켰다.
결과. 설계된 Fab 이종이합체 샘플에 대한 항원 친화성 (KD) 수치가 설계 쌍의 맥락에서 표 6A(K-L 설계) 및 표 6B(K-K-유래 K-L 설계)에 보고된다. H1L1 및 H2L2 Fab의 KD 수치는 컬럼 2 및 4(각각 H1L1 CAT-2200 Fab 이종이합체 및 H2L2 페르투주맙 Fab 이종이합체의 KD), 및 3 및 5(각각의 야생형에 비교한 H1L1 또는 H2L2 Fab 이종이합체의 KD 변화)에 포함된다. KD 수치는 적어도 100 RU의 Fab 이종이합체 포획을 나타냈던 Fab 이종이합체 샘플에 대해서만 측정하였다. 설계된 이종이합체와 비교를 위해 사용된 IL-17A에 결합된 야생형 CAT-2200의 기준 KD 수치는 0.273 nM였다. 이러한 수치는 경사슬이 FLAG 태그를 내포하는 야생형 CAT-2200 Fab 이종이합체의 복수 측정을 기초로 하는 중간값이다. 유사하게, HER2에 결합된 야생형 페르투주맙에 대한 기준 KD 수치는 8.055 nM였다. 이러한 수치는 경사슬이 HA 태그를 내포하는 야생형 페르투주맙 Fab 이종이합체의 복수 측정을 기초로 하는 중간값이다. 표 6에서, 야생형 항원 결합 친화성과 관련한 KD의 차이가 계산 -(로그(KD_설계) - 로그(KD_wt))을 이용하여 나타나며, 그래서 양성 수치는 더 낮은 KD 수치를 나타내는 반면 음성 수치는 항원에 대한 야생형 결합 친화성과 비교된 Fab 이종이합체의 증가된 KD 수치를 나타낸다. NB는 결합이 검출되지 않았음을 나타낸다. 일부 Fab 이종이합체에 측정된 KD 수치가 없고 따라서 측정되지 않음(ND)으로 표시되었음에 주의하라. 이들 경우 일부에 있어서, Fab 이종이합체를 평가하였지만 기술적 어려움(가령 SPR 실험에서 낮은, 즉 100 RU 미만의 Fab 포획)이 KD 수치의 정확한 측정을 방해하였다.
대부분의 시험된 설계된 Fab 이종이합체에 있어서, 아미노산 치환은 KD 수치에 영향을 주지 않거나 거의 주지 않았다. K-L 설계 라이브러리 상의 세 가지 설계(고유한 식별자 10881-11412, 10883-11236, 및 10888-11415)는 CAT-2200 Fab 상에서 KD의 > 5-배 감소를 나타내었다. K-K-유래 K-L 설계 라이브러리에 있어서, 하나의 페르투주맙 Fab 이종이합체(고유한 식별자에서 10724 암호를 내포하는 설계)는 페르투주맙 쪽에서 KD의 >5-배 감소를 나타내었다.
실시예 7: DSF에 의한 설계된 Fab 이종이합체의 열 안정성 측정.
야생형, 변형되지 않은 중사슬-경사슬 쌍의 그것과 비교한 올바른 쌍 형성 이종이합체의 열 안정성을 측정하기 위해 시차 주사 형광분석법(DSF)을 사용하였다. 비록 DSF는 용해 온도를 측정하기에 덜 정확한 방법으로 알려져 있지만, 여기서 사용된 이유는 이것이 열 안정성을 측정하는 고처리량 방법이며 따라서 수많은 Fab 이종이합체에 대해 수득되는 열 안정성의 일정한 측정을 가능하게 하기 때문이다. Fab 이종이합체를 실시예 5에 기술된 바와 같이 제조하였다.
DSF에 의한 열 안정성의 측정
설계된 Fab 이종이합체 쌍의 열 안정성을 DSF를 이용하여 다음과 같이 측정하였다. 각각의 이종이합체를 실시예 5에 기술된 바와 같이 정제하고 DPBS (Dulbecco 포스페이트 완충 식염수, HyClone Cat # SH30028.02)에 0.5 mg/mL로 희석하였다. 대부분의 샘플에 있어서, Sypro Orange 겔 스테인(Life Technologies Cat # S-6650)의 작업 스톡은 4 μL의 Sypro Orange 겔 스테인을 2 ml DPBS에 희석하여 제조하였다. DSF 샘플은 14 μL의 0.5 mg/mL 단백질을 60 μL의 희석된 Sypro Orange 겔 스테인 작업 스톡에 부가하여 제조하였다. 그러나, 0.5 mg/mL 미만을 가지는 단백질에 있어서, 각각의 DSF 샘플은 14 μL의 미희석된 단백질을 60 μL의 Sypro Orange 염료(이는 DPBS에 1:1500로 희석되었음)의 작업 스톡에 부가하여 제조하였다. DSF 분석을 이후 Rotor-Gene 6000 qPCR 장비(QiaGen Inc)를 이용하여 20 μl 분취액에 대해 이중복으로 수행하였다. 각각의 샘플을 각각의 단계 사이에 10초의 평형 및 시작시 30초 대기 시간을 가지고 1 °C 간격을 이용하여 30 °C부터 94 °C까지 스캔하였다. 9의 증가분으로 470 nM의 여기 필터 및 610 nM의 방출 필터를 사용하였다. 데이터를 Tm으로서 변성 곡선의 제1 유도체로부터의 최대 수치를 이용하는 Rotor-Gene 6000 소프트웨어로 분석하였다. 잔여 DSF 샘플을 제조하고 측정된 Tm 수치를 변형시키지 않는 다음의 프로토콜 변형을 이용하여 유사하게 분석하였다: 1) 1 μL의 Sypro Orange 겔 스테인을 2 ml DPBS에 희석하여 작업 스톡을 제조하였고, 2) 30 μl 분취액을 분석하였고 3) 10의 증가분을 사용하였다.
설계된 Fab 이종이합체 샘플에 대한 DSF 결과가 Mab 설계 집합의 맥락에서 표 6A(K-L 설계) 및 6B(K-K-유래 K-L 설계)에 보고되었다. H1L1 및 H2L2 Fab의 열 안정성은 표 6A 및 6B의 컬럼 6 및 8(H1L1은 CAT-2200 Fab 이종이합체를 가리키고 H2L2는 페르투주맙 Fab 이종이합체를 가리킴)에 포함된다. 반복을 수행한 Fab 이종이합체에 있어서, 보고된 Tm 수치는 중간값이다. 야생형 Fab 이종이합체의 Tm 수치에 대한 설계된 Fab 이종이합체 Tm 수치의 비교는 CAT-2200 H1L1에 대한 컬럼 7 및 페르투주맙 H2L2에 대한 컬럼 9에 보고된다. FLAG 태그를 내포하는 야생형 CAT-2200 Fab 구조체에 대한 중간 Tm은 76.9°C로 측정되었다.HA 태그를 내포하는 야생형 페르투주맙 Fab 이종이합체에 대한 중간 Tm은 82.4°C로 측정되었다. Mab 설계 집합에 의해 생성된 많은 수의 Fab 이종이합체의 대량생산 절차에서 처리율 제한이 있는 경우, DSF 측정은 설계된 Fab 이종이합체의 하위집합을 샘플링하여 수행하였다. 그런 이유로, 일부 Fab 이종이합체에 DSF에 의해 측정된 Tm 수치가 없고 따라서 측정되지 않음(ND)으로 표시되었다. 대부분의 시험된 설계는 야생형 Fab에 대해 공통적으로 관찰되는 예상된 Tm 수치 범위 이내인 양호한 열안정성을 나타냈다. 돌연변이 K145T_V177D_S188D를 HC 내에 및 S176K_Y178L를 람다 LC에 또는 S176K_T178L를 카파 LC에 내포하는 설계된 Fab 이종이합체는 이들 돌연변이를 내포하는 Fab 이종이합체에서 Tm 수치에 >10oC로 부정적인 영향을 주었다.
실시예 8: DSC에 의한 설계된 Fab 이종이합체의 열 안정성 측정.
DSF에 의한 열 안정성 측정을 보충하기 위해, 시차 주사 열량법(DSC)의 더욱 정확한 방법을 또한 사용하여 야생형, 변형되지 않은 중사슬-경사슬 쌍의 그것과 비교하여 올바르게 쌍을 형성한, 설계된 Fab 이종이합체의 열 안정성을 측정하였다. Fab 이종이합체를 실시예 5에 기술된 바와 같이 제조하였다.
DSC에 의한 열 안정성의 측정.
설계된 Fab 이종이합체 쌍의 열 안정성을 DSC를 이용하여 다음과 같이 측정하였다. 먼저 PBS 내에 0.2 mg/ml 또는 0.4 mg/mL의 농도인 400 μL의 정제된 샘플을 VP-Capillary DSC(GE Healthcare)를 이용한 DSC 분석을 위해 사용하였다. 각각의 DSC 런을 시작할 때, 5회의 완충액 블랭크 주사를 수행하여 기초선을 안정화하였고, 기준을 위해 완충액 주사를 각각의 샘플 주사 전에 배치하였다. 각각의 샘플을 낮은 피드백, 8 초 필터, 5 분 preTstat, 및 70 psi 질소 압력에서 60˚C/hr 속도로 20 부터 100˚C까지 스캔하였다. 생성된 써모그램은 Origin 7 소프트웨어를 이용하여 기준설정 및 분석하였다.
H1L1 및 H2L2 Fab의 열 안정성은 표 6의 컬럼 10 및 12(각각 H1L1은 CAT-2200 Fab 이종이합체를 가리키고 H2L2는 페르투주맙 Fab 이종이합체를 가리킴)에 포함된다. 반복을 수행한 각각의 Fab 이종이합체에 있어서, 보고된 Tm 수치는 중간값이다. 야생형 Fab 이종이합체의 Tm 수치에 대한 설계된 Fab 이종이합체 Tm 수치의 비교는 CAT-2200 H1L1에 대한 컬럼 11(FLAG 태그를 내포하는 야생형 CAT-2200 Fab 구조체, 중간 Tm은 70.7°C) 및 페르투주맙 H2L2에 대한 컬럼 13(HA 태그를 내포하는 야생형 페르투주맙 Fab 구조체, 중간 Tm은 78.7°C)에 보고된다. DSC의 높은 샘플 양 조건 및 낮은 처리율 특성으로 인해, 측정은 설계의 하위집합을 샘플링하여 수행하였다. 이런 이유로, 일부 Fab 이종이합체에 DSC에 의해 측정된 Tm 수치가 없고 따라서 측정되지 않음(ND)으로 표시되었다. DSC에 의한 모든 설계된 Fab 이종이합체 어세이는 양호한 열안정성을 나타냈다. DSC-유래 Tm 수치는 일반적으로 DSF로 관찰된 것들보다 더 낮았다(실시예 7).
실시예 9: 최적화 설계
선택적 쌍 형성을 추진하는 설계의 능력을 더욱 이해하는 것을 돕기 위해 ː 표 5A 및 5B에 나타난 바와 같은 페르투주맙/CAT-2200 시스템 내 K-L 설계 및 K-K-유래 K-L 설계의 성능을 검사하였다. 이러한 검사는 가능한 경우 쌍 형성 특이성을 향상 및/또는 이종이합체의 안정성을 증가시키는 이어지는 설계 최적화 주기를 가능하게 했다 설계 최적화는 특정 치환된 아미노산 잔기에서 해당 잔기의 대안적인 아미노산 치환의 효과를 평가하기 위한 K-L 설계 및 K-K-유래 K-L 설계의 변형, 추가적인 아미노산 잔기에서 아미노산 치환의 부가, 및/또는 특정 잔기에서 아미노산 치환의 제거(즉 야생형 잔기로 다시 전환)을 포함한다. 설계의 설계 과정 및 선별은 실시예 1 및 2에 기술된 바와 같이 수행하였고, 생성된 설계를 페르투주맙/CAT-2200 K-L 시스템에서 시험하였다.
K-L 설계의 추가적인 집합은 향상된 쌍 형성 특이성으로 설계의 다양성을 증가시키는 대안적인 방법을 이용하여 제안되며, 여기서 표 4A 및 4B로부터 선택된 불변 도메인 설계, 뿐만 아니라 앞의 단락에서 기술된 선택된 불변 도메인 최적화 설계 후보는 두 가지 K-K 가변 도메인 설계와 조합되었다. 두 가지 K-K 가변 도메인 설계은 표 4B에 포함되며, 고유한 식별자 10621-10733 및 10623-10745를 가진다. 이들 설계는 이들 자신에 대한 강한 쌍 형성 특이성을 촉진하지 않고 항원 결합에 영향을 주지 않았지만, 카파-카파 항체 시스템에서 특정 Fab 불변 도메인 설계와 조합되는 경우 쌍 형성 특이성을 보였다. 이러한 K-L 설계의 추가적인 집합은 또한 불변 도메인 설계만의 조합을 포함하고, 여기서 불변 도메인 설계는 표 4A, 4B 및 앞의 단락에서 기술된 최적화 설계 후보로부터 선택된다.
마지막으로, K-K-유래 K-L 설계의 더욱 추가적인 집합이 PCT 출원번호 PCT/IB2015/054107호의 표5에 기술된 K-K 설계 라이브러리로부터의 대표적인 설계를 출발점으로 이용하여 제안되며, 페르투주맙/CAT-2200 K-L 시스템에서 시험되었다. 실시예 2에 기술된 바와 같이, 대표적인 K-K-유래 설계는 카파 및 람다 경사슬 사이의 서열 및 구조적 차이를 설명하기 위해 필요한 경우 아미노산 잔기를 변형함으로써 카파-람다-시스템으로 조정되었다.
이러한 실시예에 기술된 추가적인 K-L 설계 및 K-K-유래 K-L 설계의 쌍 형성 특이성은 실시예 10에 기술된 바와 같이 페르투주맙-CAT-2200 K-L 시스템에서 LCCA에 의해 실험적으로 평가되었다.
실시예 10: LCCA에 의한 설계된 Fab 이종이합체의 우선적 쌍 형성의 제조 및 평가
Mab 설계 집합에 상응하는 아미노산 치환을 포함하는 페르투주맙 및 CAT-2200 Fab 구조체를 실시예 3에 기술된 바와 같이 제조하였다. 실시예 4에 기술된 바와 같이, 모든 LCCA 실험은 불변 도메인에 위치한 사슬-간 Fab 이황화 결합을 내포하는 구조체(H/C233-L/C214, KABAT 번호)에 대해 수행되었다.Mab 설계 집합에 의해 나타나는 우선적 쌍 형성을 평가하기 위해, 상응하는 LCCA 설계 집합에 의해 나타나는 우선적 쌍 형성을 다음의 예외를 제외하고, 실시예 4에 기술된 바와 같이 측정하였다.
LCCA 설계 집합 내 우선적 쌍 형성의 평가는 H1:L1:L2 또는 H2:L2:L1에 대해 1:1:1이 아닌 1:1:3의 비율(중량으로)의 중사슬 및 경사슬로 수행한 것을 제외하면 실시예 4에 기술된 바와 같이 LCCA에 의해 수행하였고, 중사슬은 제한된 양으로 존재하며, 오류쌍형성된 경사슬은 과량으로 존재한다. 실시예 9에 기술된 설계가 표 4A 및 4B에 기술된 것들의 버전으로 최적화되거나, 두 설계의 조합을 이루었기 때문에, 이들 중 일부는 이미 비교적 높은 쌍 형성 특이성을 나타내며, 그러한 특이성의 추가적인 증가(달성된 경우)가 어세이의 한계로 인해, 1:1:1의 H1:L1:L2 또는 H2:L2:L1에서는 LCCA로 검출되지 않는 경우도 가능했다. 따라서, 특이성의 향상을 검출하기 위해 1:1:1보다 1:1:3의 DNA 비율을 사용하였다. 모든 형질주입은 300 ng의 H1, 300 ng의 L1 및 900 ng의 L2(즉 H1:L1:L2 또는 H2:L2:L1 = 1:1:3 비율), 100 ng의 AKTdd pTT22(구성적 활성 단백질 키나아제 B 돌연변이를 내포하는 벡터), 및 400 ng의 ssDNA(연어 정자 DNA)를 이용하여 수행하였다.
LCCA 계량의 데이터 분석 및 설명
데이터 분석을 하기에 제시된 바와 같이 실시예 4에 기술된 분석의 변형된 버전을 이용하여 수행하였다.
모든 LCCA 설계 집합을 LCCA로 시험하였고, 관심의 설계를 다음의 포함 기준을 기초로 확인하였다. 관심의 설계로 간주되기 위해, 설계는 95% WT 스칼라 신뢰도 간격의 하한을 넘는 적어도 하나의 양성 LCCA 결과를 보유해야 하는 반면 다른 상보적 LCCA는 95% WT 스칼라 신뢰도 간격의 하한을 넘어야 한다. 상기 기준을 넘는 모든 설계가 표 7A에서 확인되는 바와 같은 제2 K-L 설계 라이브러리, 또는 표 7B에서 확인되는 바와 같은 제2 K-K 유래 K-L 설계 라이브러리에 포함되었다.
표 8A 및 표 8B는 Mab 설계의 맥락에서 각각 제2 K-L 설계 라이브러리 및 제2 K-K-유래 K-L 라이브러리에 대하여 수득된 LCCA 데이터를 기술한다. 이러한 실시예에서 각각의 LCCA 설계 집합의 성능은 각각 H1L1:H1L2의 비율(중간값) 및 H2L2:H2L1의 비율(중간값)의 자연 로그에 해당되는 두 스칼라 수치에 의해 기술된다. 이들 스칼라 수치가 실시예 4에서 산출된 스칼라 수치와 살짝 상이하지만, 유사하게 우선적 쌍 형성을 평가하기 위해 사용되었음에 유의하라. 이들 스칼라 수치는 제2 K-L 설계 라이브러리에 대한 표 8A의 컬럼 2 및 5 및 제2 K-K-유래 K-L 라이브러리에 대한 표 8B에 보고된다. CAT-2200(LC-FLAG) 더하기 페르투주맙(LC-HA)에 대해 경쟁한 야생형 CAT-2200(HC)에 있어서 95% 스칼라 신뢰성 간격은 -3.24 (하한) 내지 -2.94 (상한)이었다. 페르투주맙(LC-HA) 더하기 CAT-2200(LC-FLAG)에 대해 경쟁한 야생형 페르투주맙(HC)에 있어서 95% 스칼라 신뢰성 간격은 -0.9 (하한) 내지 -0.6 (상한)이었다.
설계(H1L1L2 및 H2L1L2 실험)의 각각의 LCCA에 있어서 스칼라 범위는 결과의 재현성의 척도로서 표 8A 및 8B에서 컬럼 3 및 6에 나타나고, 설계에 대해 측정된 가장 높고 가장 낮은 스칼라 수치 사이의 차이를 나타낸다. 단일 측정으로부터 보고된 결과에 있어서 범위 수치는 NA(적용 불가)로 표시된다.또한, 스칼라 수치는 또한 순수 중간 비율 H1L1:H1L2 및 H2L2:H2L1로 다시 전환되었다. 이러한 전환은 LCCA 비율을 H1L1 및 H1L2, 또는 H2L2 및 H2L1의 총량이 100%와 상당히 상이한 일부 경우에 관찰되는 것처럼 100%까지 효과적으로 정상화하였다. 이들 수치는 표 8A 및 8B의 컬럼 4 및 7에 보고된다.
결과
상기 언급한 바와 같이, LCCA 결과가 Mab 설계 집합의 맥락에서 표 8A 및 8B에 나타난다. 표 8A는 실시예 9에 기술된 K-L 설계와 연관된 LCCA 데이터를 제공한다. 151개의 K-L 설계가 포함 기준을 충족하였고, 대부분의 설계가 불변 영역만 아미노산 변형을 가지며, 적은 수의 설계가 또한 가변 영역에도 아미노산 변형을 포함한다(표 7A 참조). 이들 설계는 쌍 형성 특이성 및 안정성을 추가로 추진한다고 제안되는 반면 또한 다른 항체 시스템으로의 이동가능성을 좋게 하였다.
표 8B는 실시예 9에 역시 기술된 K-K-유래 K-L 설계와 연관된 LCCA 데이터를 제공한다. 21개의 K-K-유래 K-L 설계가 포함 기준을 충족하였다. 이들 설계는 불변 도메인 설계만을 포함한다.
실시예 11: 생체물리적 특징분석을 위한 설계된 Fab 이종이합체의 대량생산
올바르게 쌍을 형성한 이종이합체의 생체물리적 특징을 검사하기 위해, 표 7A 및 7B에 나타난 고유한 식별자 집합에서 확인된 선택된 올바르게 쌍을 형성한 이종이합체 H1L1 또는 H2L2(설계된 Fab)의 제조를 예외로 20 ml 대신 50 ml 대량생산을 수행한 것 외에는, 실시예 5에 기술된 바와 같이 대량생산하였다. 발현된 Fab를 열 안정성 및 항원 결합에 대해 시험하기 위해 실시예 5에 기술된 바와 같이 정제하였다. 정제 프로토콜을 IgG-CH1 CaptureSelect™ 수지를 이용하여 평형 완충액 내 임의의 초기 희석 없이 상청액을 항온처리하도록 변형하였고 결합된 샘플의 용리를 4 층 부피의 용리 완충액으로 수행하였다.
정제 후, 이종이합체 발현을 앞서 실시예 5에서 기술한 바와 같이, Caliper LabChip GXII를 이용하는 비-환원 및 환원 High Throughput Protein Express 어세이에 의해 평가하였다.
데이터는 정제후 수율로 판단하여, 설계된 Fab 내 Mab 설계 집합 변형의 포함이 단백질 발현에 중요한 영향을 주지 않았음을 보여주었다. 설계된 CAT-2200 Fab에 대해 수득된 정제-후 수율은 야생형 Fab에 대한 1.9 mg/50 ml 발현(0.5의 SD)과 비교할 때 1.3 mg/50 ml 발현(0.6의 SD)이었다. 설계된 페르투주맙 Fab는 야생형 Fab에 대한 1.1 mg/50 ml 발현(0.2의 SD)과 비교할 때 0.9 mg/50 ml 발현(0.4의 SD)의 수율로 제조되었다. 캘리퍼 분석은 WT Fab에 필적하는 순도의 정도를 나타내었다(데이터 나타나지 않음).다수의 설계된 Fab가 정제 후 이와 연관된 침전물을 가졌다(표 9A 및 9B에 '*'로 표시). 상기 제공된 수율 정보는 침전물을 제거한 후에 측정하였다.
실시예 12: 설계된 Fab 이종이합체의 항원 친화성 측정
아미노산 치환이 항원에 결합하는 이종이합체의 능력에 임의의 영향을 끼치는지 확인하기 위해 IL-17A에 결합하는 CAT-2200 설계된 Fab 이종이합체 및 HER2-ECD에 결합하는 페르투주맙 설계된 Fab 이종이합체의 능력을 평가하였다. 항원-결합을 실시예 6에 기술된 바와 같이 평가하였고, 예외로 CAT-2200 설계된 Fab를 50 μL/분으로 120초동안 주사하였고 900초 해리 기간 대신, 600 내지 800초의 해리 기간을 가졌다. 게다가, HER2에 결합하기 위해 설계된 페르투주맙 Fab의 선별을 실시예 6에 기술된 바와 같이 수행하였고, 다음의 변형을 두었다: 각각의 Fab 포획을 위해, Fab를 2μg/ml 대신 2.5 μg/ml으로 희석하고 주사 시간은 240초 대신 120초로 하였다. 주사된 가장 낮은 HER2 항원 농도는 0.41 nM 대신 1.23nM이었다. 농축 시리즈를 위한 해리 기간은 1200초 대신 600초였다.
결과.설계된 Fab 이종이합체 샘플에 대한 항원 친화성 (KD) 수치가 Mab 설계 쌍의 맥락에서 표 9A(K-L 설계) 및 표 9B(K-K-유래 K-L 설계)에 보고된다. H1L1 및 H2L2 Fab의 KD 수치는 컬럼 2 및 4(각각 H1L1 CAT-2200 Fab 이종이합체 및 H2L2 페르투주맙 Fab 이종이합체의 KD), 및 3 및 5(각각의 야생형에 비교한 H1L1 또는 H2L2 Fab 이종이합체의 KD 변화)에 포함된다. KD 수치는 적어도 100 RU의 Fab 이종이합체 포획을 나타냈던 Fab 이종이합체 샘플에 대해서만 측정하였다. 설계된 이종이합체와 비교를 위해 사용된 IL-17A에 결합된 야생형 CAT-2200 Fab의 기준 KD 수치는 0.209 nM였다. 이러한 수치는 경사슬이 FLAG 태그를 내포하는 야생형 CAT-2200 Fab 이종이합체의 복수 측정을 기초로 하는 중간값이며 실시예 6에 보고된 수치와 크게 다르지 않다. 유사하게, HER2에 결합된 야생형 페르투주맙에 대한 기준 KD 수치는 7.8 nM였다. 이러한 수치는 또한 경사슬이 HA 태그를 내포하는 야생형 페르투주맙 Fab 이종이합체의 복수 측정을 기초로 하는 중간값이며 실시예 6에 보고된 수치와 크게 다르지 않다. 표 9A 및 9B에서, 야생형 항원 결합 친화성과 관련한 KD의 차이가 계산 -(로그(KD_설계) - 로그(KD_wt))을 이용하여 나타나며, 그래서 양성 수치는 더 낮은 KD 수치를 나타내는 반면 음성 수치는 항원에 대한 야생형 결합 친화성과 비교된 Fab 이종이합체의 증가된 KD 수치를 나타낸다. 앞서 언급한 바와 같이, Mab 설계 집합에 의해 생성된 많은 수의 Fab 이종이합체의 대량생산 절차에서 처리율 제한으로 인해, SPR 측정은 설계된 Fab 이종이합체의 하위집합을 샘플링하여 수행하였다. 그런 이유로, 일부 Fab 이종이합체에 SPR에 의해 측정된 KD 수치가 없고 따라서 측정되지 않음(ND)으로 표시되었다. 시험된 설계된 Fab 이종이합체에 있어서, 아미노산 치환은 KD 수치에 영향을 주지 않거나 거의 주지 않았다(WT의 2-배 이내).
실시예 13: DSF에 의한 설계된 Fab 이종이합체의 열 안정성 측정
야생형 Fab의 그것과 비교한 올바른 쌍 형성 설계된 Fab 이종이합체의 열 안정성을 측정하기 위해 시차 주사 형광분석법(DSF)을 사용하였다. Fab 이종이합체를 실시예 11에 기술된 바와 같이 제조하였다.
DSF에 의한 열 안정성의 측정
설계된 Fab 이종이합체의 열 안정성을 DSF를 이용하여 다음과 같이 측정하였다. 각각의 정제된 이종이합체를 DPBS(Dulbecco 포스페이트 완충 식염수, HyClone Cat # SH30028.02)에 0.67 mg/mL로 희석하였다. Sypro Orange 겔 스테인(Life Technologies Cat # S-6650)의 작업 스톡은 DPBS에 1:1000으로 희석하여 제조하였다. DSF 샘플은 15 μL의 0.67 mg/mL 단백질을 15 μL의 Sypro Orange 겔 스테인 작업 스톡에 부가하여 제조하였다. 그러나, 0.67 mg/mL 미만의 농도를 가지는 단백질에 있어서, 각각의 DSF 샘플은 15 μL의 미희석된 단백질을 15 μL의 Sypro Orange 염료의 작업 스톡에 부가하여 제조하였다. DSF 분석을 이후 Rotor-Gene 6000 qPCR 장비(QiaGen Inc)를 이용하여 30 μl 분취액에 대해 수행하였다. 각각의 샘플을 각각의 단계 사이에 10초의 평형 및 시작시 30초 대기 시간을 가지고 1 °C 간격을 이용하여 30 °C부터 94 °C까지 스캔하였다. 8의 증가분으로 470 nM의 여기 필터 및 610 nM의 방출 필터를 사용하였다. 데이터를 Tm으로서 변성 곡선의 제1 유도체로부터의 최대 수치를 이용하는 Rotor-Gene 6000 소프트웨어로 분석하였다.
설계된 Fab 이종이합체 샘플에 대한 DSF 결과가 Mab 설계 집합의 맥락에서 표 9A(K-L 설계) 및 9B(K-K-유래 K-L 설계)에 보고되었다. H1L1 및 H2L2 Fab의 열 안정성은 표 9A 및 9B의 컬럼 6 및 8(H1L1은 CAT-2200 Fab 이종이합체를 가리키고 H2L2는 페르투주맙 Fab 이종이합체를 가리킴)에 포함된다. 반복을 수행한 Fab 이종이합체에 있어서, 보고된 Tm 수치는 중간값이다. 야생형 Fab 이종이합체의 Tm 수치에 대한 설계된 Fab 이종이합체 Tm 수치의 비교는 CAT-2200 H1L1에 대한 컬럼 7 및 페르투주맙 H2L2에 대한 컬럼 9에 보고된다. FLAG 태그를 내포하는 야생형 CAT-2200 Fab 구조체에 대한 중간 Tm은 77.0°C로 측정되었다.HA 태그를 내포하는 야생형 페르투주맙 Fab 이종이합체에 대한 중간 Tm은 81.7°C로 측정되었다. 앞서 설계된 Fab 이종이합체의 하위집합을 샘플링하여 수행했다고 언급했던 것처럼, 따라서 일부 Fab 이종이합체에 DSF에 의해 측정된 Tm 수치가 없고 측정되지 않음(ND)으로 표시되었다. 대부분의 시험된 설계는 야생형 Fab에 대해 다음의 예외를 제외하고 공통적으로 관찰되는 예상된 Tm 수치 범위 이내인 양호한 열안정성(WT에 비해 최대 4-5°C의 Tm 감소를 나타냄)을 나타냈다. 두 Fab 이종이합체에서 카파 중사슬 내 L124E_K145T 돌연변이와 조합된 카파 경사슬 내 S131K_L135K 돌연변이의 존재는 이들의 Tm 수치에 > 10 °C의 부정적인 영향을 나타냈다. 또한 유의할 점으로, 일부의 CAT-2200 설계된 Fab에 있어서, 주요 Fab 피크의 한 어깨가 DSC 스펙트럼에서 관찰되었다(이들 Fab은 표 9A 및 9B에서 '#'으로 표시됨). 그러한 프로파일은 또한 야생형 CAT-2200 Fab에 대해서도 관찰되었다.
실시예 14: DSC에 의한 설계된 Fab 이종이합체의 열 안정성 측정
DSF에 의한 열 안정성 측정을 보충하기 위해, 시차 주사 열량법(DSC)의 더욱 정확한 방법을 또한 사용하여 야생형, 변형되지 않은 중사슬-경사슬 쌍의 그것과 비교하여 올바르게 쌍을 형성한, 설계된 Fab 이종이합체의 열 안정성을 측정하였다. Fab 이종이합체를 실시예 11에 기술된 바와 같이 제조하고 열 안정성을 실시예 8에 기술된 바와 같이 DSC에 의해 측정하였다. 그러나, 프로토콜에 나타난 것보다 더 낮은 샘플 농도를 가지는 Fab 이종이합체에 있어서, DSC를 입수가능한 농도로 수행하였다.
H1L1 및 H2L2 Fab의 열 안정성 측정은 표 9A 및 9B의 컬럼 10 및 12(각각 H1L1은 CAT-2200 Fab 이종이합체를 가리키고 H2L2는 페르투주맙 Fab 이종이합체를 가리킴)에 나타난다. 반복을 수행한 각각의 Fab 이종이합체에 있어서, 보고된 Tm 수치는 중간값이다. 야생형 Fab 이종이합체의 Tm 수치에 대한 설계된 Fab 이종이합체 Tm 수치의 비교는 CAT-2200 H1L1에 대한 컬럼 11(FLAG 태그를 내포하는 야생형 CAT-2200 Fab 구조체, 중간 Tm은 70.7°C) 및 페르투주맙 H2L2에 대한 컬럼 13(HA 태그를 내포하는 야생형 페르투주맙 Fab 구조체, 중간 Tm은 78.1°C)에 보고된다. DSC의 샘플 양에 대한 높은 조건 및 낮은 처리율 특성으로 인해, 측정은 DSF에 의해 특징화된 설계의 하위집합을 샘플링하여 수행하였다. 그런 이유로, 일부 Fab 이종이합체에 DSC에 의해 측정된 Tm 수치가 없고 따라서 측정되지 않음(ND)으로 표시되었다. DSC에 의한 모든 설계된 Fab 이종이합체 어세이는 양호한 열안정성을 나타냈다(Tm이 WT에 비해 2-3 C 감소). DSC-유래 Tm 수치는 일반적으로 DSF로 관찰된 것들보다 더 낮았다(실시예 13). 비록 WT에 비해 설계된 Fab의 Tm에서 절대적 차이가 DSF든 DSC든 사용된 방법과 의존적으로 관찰되었지만, 야생형 Fab와 관련한 설계된 Fab의 상대적 랭킹은 사용된 방법과 독립적으로 동일했다.
실시예 15: 대표적인 설계의 설계 집단 분류 및 선별
실시예 2 내지 14는 K-L 설계 및 K-K-유래 K-L 설계의 설계 및 시험을 기술했다. 쌍 형성을 촉진하는 이들 설계의 능력을 LCCA에서, Fab 형태로 시험하였고, 적절한 경사슬과 쌍을 이루는 각각의 LCCA 설계 집합의 한 중사슬의 능력이 측정되었다. 생성된 올바르게 쌍을 형성한 이종이합체(하나의 중사슬 및 하나의 경사슬)의 안정성 및 항원-결합에 대한 아미노산 치환의 효과를 또한 평가하였다.
K-L 설계 및 K-K-유래 K-L 설계에 대해 LCCA 형태(H1, L1, 및 L2, 또는 H2, L1, 및 L2의 동시-발현)로 수득된 Mab 설계 집합 (H1L1H2L2)에 대한 우선적 쌍 형성 결과가 Mab 설계 집합의 폴리펩티드 사슬이 동시-발현된 경우(즉 H1, L1, H2 및 L2이 동시-발현된 경우)에도 적용되는지 시험하기 위해, 표 4A, 4B, 7A, 및 7B에 기술된 대표적인 수의 400개가 넘는 설계를 선택하였고,이는 이러한 방식으로 모든 설계를 시험하는 것이 실현가능하지 않기 때문이었다. 대표적인 설계를 "SMCA"로 지칭되는 어세이로 시험하였다(실시예 16에 자세히 기술됨).
대표적인 설계를 선택하기 위해, 표 4A 및 7A에 확인된 K-L 설계(n=404)를 조합하고 치환된 아미노산 잔기 위치에서의 동일성에 따라 집단으로 분류하였다. 7B로부터의 K-K-유래 K-L 설계가 본래의 K-K 설계로부터 상당히 변형된 일부 경우에, 이것은 또한 집단 분류를 위한 이러한 K-L 설계 군에 포함되었다. 표 10-A1 내지 10-A12는 K-L 설계에 대해 생성된 집단 1 내지 12를 나타낸다. 유사하게, 표 4B 및 7B에 보고된 K-K-유래 K-L 설계(n=43)를 K-L 설계 군으로 이동된 것들을 제외하고, 또한 조합하고 집단 분류하였다. 표 10-B1 내지 10-B10는 K-K-유래 K-L 설계에 대해 생성된 집단 1 내지 10를 나타낸다. 각각의 집단으로부터 대표적인 설계를 이후 하기 기술된 바와 같이 선택하였다. 선택된 대표적인 설계의 최종 집합은 또한 SMCA 설계 ID 명칭을 포함하는 표 11A(K-L 설계) 및 11B(K-K 유래 K-L 설계)에 포함된다.
SMCA에 대한 대표적인 설계
대표적인 설계는 쌍 형성 특이성을 나타내고 항원 결합에 영향을 최소로 주거나 주지 않는 일차 기준, 뿐만 아니라 설계 안정성, 치환 수 최소화, WT에 필적하는 발현과 같은 이차 기준을 고려하여 선택하였다. 하나의 Fab이 이종이합체의 다른 Fab보다 쌍을 덜 잘 형성하지만, 여전히 야생형보다 더 나은 쌍 형성을 보여주는는 경우에 최대 쌍 형성 특이성은 두 Fab을 고려할뿐만 아니라 각각의 Fab을 개별적으로 고려하여 평가하였다(도 6에 나타난 바와 같은 시나리오 A 및 B). 또한, 집단 내 다양성 및 집단 내 설계의 수는 추가로 선택된 대표적인 집단의 유형 및 수를 안내하였다.
총 33개의 대표적인 K-L 설계가 SMCA 형태로 시험하기 위해 집단 1 내지 12로부터 선택되었다. 유사하게, 높은 내지 중간 평균 LCCA 성능 수치를 가지는7 K-K-유래 K-L 설계가 확인된 10 집단 중 7 집단으로부터 선택되었다. 세 가지 K-K-유래 K-L 설계 집단은 일차 기준 가령 LCCA 성능 기준에 대한 대표적인 기준을 충족하는 설계를 포함하지 않거나 항원 결합에 대한 효과가 없었다.
적어도 하나의 대표적인 설계를 각각의 집단으로부터 선택하였다. 단 하나의 대표적인 설계로 나타나는 집단은 K-L 설계 집단 5 및 11, 및 모든 7 K-K-유래 K-L 설계 집단을 포함하였다. 잔여 집단은 하나 초과의 대표적인 설계를 가졌고 이는 집단이 크거나(즉 집단 2, 3, 4, 6, 7, 8) 및/또는 더 많은 설계 하위-다양성(소수 집단) (즉 집단 1, 9, 10, 12)을 가졌기 때문이다.비록 각각의 집단 내 설계들은 서열 유사성을 공유했지만, 집단 내 소수 집단은 적어도 하나의 추진자(아미노산 치환)에서 상이했다. 각각의 집단에 대한 대표적인 설계는 표 10-A1 내지 10-A12 및 10-B1 내지 10-B10에 굵게 강조된다. 본 명세서의 다른 곳에서 언급된 바와 같이, 이들 표에서 "-"는 특정 폴리펩티드 사슬에 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 치환이 존재하지 않았음을 나타낸다.
추진자 및 이차 치환
대표적인 것으로 선택된 집단은 본 명세서에서 LCCA에 의해 평가된 바와 같이 각각의 집단에서 요망되는 쌍 형성 특이성을 촉진하는 "추진자" 또는 "추진 집합" (아미노산 위치 및/또는 치환)을 확인하는데 강조점을 두고 기술된다. 용어 "추진 집합"은 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 위치 및 치환의 집합을 가리키는 반면, 용어 "추진"은 추진 집합 내부의 단일 위치/치환을 가리킨다. 그러나, 다른 잔기 및 치환이 때때로 집단에서 설계 또는 설계의 집합과 연관된다. 이들 잔기 및 치환은 "이차" 치환으로 지칭되며, 때때로 Mab 설계 집합 내에 포함되어 사용된 추진 집합 또는 추진 집합들의 성능을 향상하였다. 기계론적으로, 이들 이차 치환은 i) 추진자의 입체 여건을 촉진, ii) 중사슬 및 경사슬 사이의 접점에서 추진 집합 위치에서의 치환시 잃게 되는 접촉을 위해 접촉 또는 치환의 수를 증가, iii) 추진 집합을 기초로 수소-결합 네트워크를 최적화, 및/또는 iv) 추진 집합의 향상된 성능에 기여하는 환경을 만들기 위해 작용할 수 있다. 하나 이상의 이들 메커니즘은 각각의 집단에서 추진자의 성능을 향상하기 위해 사용/의도될 수 있다.
이들 이차 치환 중 일부는 몇몇 집단에 걸쳐 공통적이었다. 예를 들면, 중사슬 내 K145T 치환이 H1L1 또는 H2L2에서 사용되어 음으로 하전된 추진자 또는 추진자들이 근접한 곳에 설계된 경우 양전하를 제거하였다. 수많은 집단에서, 람다 경사슬 내 K129T 치환이 때때로 사용되어 음으로 하전된 추진자 또는 추진자들이 근접한 곳에 설계된 경우 양전하를 제거하였다(예컨대 K-L 설계 집단 4 및 집단 8-12). 게다가, 람다 경사슬 내 E124Q 치환이 일부 집단에서 사용되어 양으로 하전된 추진자 또는 추진자들이 근접할 때 음전하를 제거하였다(예컨대 K-L 설계 집단 1-3). V133G 치환은 대부분 일부 설계 내 카파 경사슬에 적용되어 특정 추진 집합을 입체적으로 제공했다(예컨대 대부분 K-L 설계 집단 1, 3, 4, 6, 7, 10, 12 및 K-K-유래 K-L 설계 집단 10 내). 람다 경사슬 내 Y178T는 각각의 H1L1에서 특이적 추진 집합의 입체 여건을 위한 설계에 도입되었다(예컨대 K-L 집단 4, 5, 8 및 12). 경사슬 내 V133S는 향상된 수소 결합 네트워크를 표적하는 또다른 추진 집합(예컨대 K-L 집단 1, 2 및 12)에 적용되었다.
K-L 설계 집단의 설명
집단 1에 있어서, 두 가지 설계(13175-13486 및 13180-13515)는 이들 설계가 유사한 공간을 점유하는 유사한 정전 추진을 이용하므로 집단을 대표하도록 선택되었다(표 10-A1 참조). 이러한 집단의 모든 구성원에 있어서, 두 추진 집합의 조합이 사용되었다. 제1 정전 추진 집합은 H1 내 음으로 하전된 치환(대부분 L143D)이 L1 내 양으로 하전된 치환(T131K/R)과 염 가교를 형성할 수 있도록 설계된 반면, H2는 a) 양으로 하전된 치환, S188K 또는 L124R_S186R이 L2 내 음으로 하전된 치환(S176D_T178E 또는 S176D_T180E)과 염 가교를 형성하거나 b) H2 내 L143R 또는 S186K 및 L2 내 Q124E_V133D과 염 가교를 형성할 수 있도록 설계되었다. "이황화물 조종 추진 집합"으로 불리는 제2 정전 추진 집합은 부가되어 H-L 조립 과정의 초기 단계에서 오류쌍형성된 이종이합체 내에 H-L 또는 이종이합체 이황화 결합이 형성되지 않게 하였다. 이황화물 조종 추진 집합은 H1 내 양으로 하전된 치환(A125R), L1 내 음으로 하전된 치환(S122D), H2 내 음으로 하전된 치환(K228D), 및 L2 내 양으로 하전된 치환(S121K)을 사용하였다. 이들 아미노산 치환은 이황화 결합과 가깝게, K-L 설계 내 대부분의 아미노산 치환이 위치하는 매복된 (주요) H-L 접점으로부터 멀리 위치한다. 두 가지 추진 집합은 우선적으로 쌍을 형성한 이종이합체에서 염 가교를 형성하도록 설계된 반면 미스매치 쌍은 주로 정전 척력으로 인해 저해할 것이었다.
집단 2에 있어서, 네 가지 대표적인 설계(13282-13484, 13287-13494, 13218-13482 및 10945-11377)가 이러한 집단에서 다양성의 정도를 반영하는 것으로 선택되었다(표 10-A2 참조). 이러한 집단의 모든 구성원은 집단 1 제1 정전 추진 집합에서와 유사하게 설계된 H1을 기초로 하여, 음으로 하전된 치환(L143D 또는 L143D_Q179E)이 L1 내 양으로 하전된 치환 (T131K/R)과 염 가교를 형성하게 하는 반면, H2는 a) 양으로 하전된 치환(S186K)가 L2 내 음으로 하전된 치환, 주로 V133D 또는 V133D_Q160E과 염 가교를 형성하도록; b) S188K가 L2의 S131D/E와 쌍을 이루도록; 또는 c) L143R/K가 L2의 Q124E_V133D와 쌍을 이루도록 설계되었다. 집단 2의 일부 구성원은 또한 정전 추진 집합에 더하여 입체 추진 집합을 포함하였다. "입체 1" 및 "입체 2"로 불리는 두 가지 입체 추진 집합이 사용되었다. 입체 1 추진 집합은 L1의 S176F 또는 T116F_S176F와 입체적으로 상보적이 되도록 설계된 H1 내 F174G, 및 L2의 L135A와 입체적으로 상보성인 H2의 V190F를 포함하였다. 입체 2 추진 집합은 L1의 WT 잔기와 입체적으로 적합한 H1 내 A139W 및 L2의 L135W와 입체적으로 적합한 H2의 WT를 포함하였다. 따라서 이러한 집단에서, H1L2 및 H2L1의 미스매치 쌍은 입체적 부적합성과 더불어 주로 정전 척력 또는 정전 척력으로 인해 저해될 것이었다. 또한 정전 추진 집합에 더하여 H2 사슬 (Q39E 또는 L45P) 및 L2 사슬 (각각 Q38R 또는 P44F) 내에 가변 설계 성분("가변 도메인 추진 집합")을 내포하는 두 집단 구성원이 존재하며 이들은 대표적인 것으로 선택되지 않았으나, 쌍 형성을 향상할 것으로 예상되었다.
집단 3에 있어서, 다섯 가지 대표적인 설계(10931-11263, 13221-13411, 10987-11257, 10983-11306 및 10947-11392)가 선택되었다(표 10-A3 참조). 이러한 집단의 구성원은 집단 2에서와 유사한 정전 추진 집합을 H1 (L143E 또는 L143E_Q179E) 및 L1 (T131R/K)에서 사용하였으나, H2L2의 설계와 관련하여 차이가 있었다. H2L2의 설계는 주로 a) L2의 S176D_T178E 또는 S176D_T180E와 쌍을 형성하는 H2의 L124R_S186R/K 또는 L124R_Q179K 또는 S188K; 또는 b) L2의 Q124E_V133D_S176D_T178D/E와 쌍을 형성하는 H2의 L143R_S188K에 기반하였고, 이는 주로 정전 척력으로 인해 미스매치 쌍을 저해한다. 집단 2와 같이, 집단의 일부 구성원은 또한 정전 추진 집합에 더하여 입체 1 또는 입체 2 추진 집합을 사용하였다. 그러한 추진 집합 조합의 대표적인 것이 13221-13411이다. 이 집단은 또한 정전 추진 집합에 더하여 '가변 도메인 추진 집합'을 내포하는 두 가지 설계를 포함하였다.
세 가지 대표적인 설계(13335-13361, 13209-13364 및 11100-11205)가 집단 4를 위해 선택되었다(표 10-A4 참조). 이러한 집합의 대부분의 구성원은 H1 (S188K) 및 L1 (S176E/D_Y178E) 상에서의 유사한 정전 추진과 함께 H2L2 쌍에서 몇몇 변화: a) L2의 S176K_T178R/K와 쌍을 형성하는 H2의 V177D_S188D; 또는 b) L2의 S176K/R 또는 S131K/R_S176R/K와 쌍을 형성하는 H2의 S186E 또는 L124E 또는 L124E_Q179E를 사용하였고, 이는 우선적으로 쌍을 형성한 이종이합체에서 염 가교의 형성을 가능하게 하는 반면 미스매치 쌍은 주로 정전 척력으로 인해 저해할 것이었다. 이 집단의 일부 구성원은 정전 추진 집합에 더하여, 단 하나의 입체 추진 집합, 즉 입체 3 추진 집합 또는 입체 3 추진 집합의 일부 성분을 사용하였다. 입체 3 추진 집합은 L2 내 S176V 또는 S176A_T178A에 입체적으로 상보적이 되도록 설계된 H1L1 내 WT 잔기 또는 H1 내 S188A 및 L1 내 S176A_Y178W 및 H2 내 S188W 또는 S186I/L_S188W를 기초로 하였다. 게다가, 이 집단의 일부 구성원은 또한 정전 추진 집합에 더하여 이황화 조종 추진 집합을 포함하였다. 또한, 적은 수의 집단 구성원은 정전 추진에 더하여 가변 도메인 추진 집합(들)을 포함하였다.
집단 5는 고유한 식별자 11066-11181로 표현하였다(표 10-A5 참조). 이러한 집단의 모든 구성원은 정전 추진 집합을 사용하였다. 정전 추진의 제1 집합은 L1 내 V133D와 쌍을 형성하는 H1 내 S186K 및 L2에서 각각 S131K 또는 S176K_T178R/K와 쌍을 형성하는 H2의 S188D 또는 V177D_S188D를 기반으로 하였다. 정전 추진의 제2 집합은 L1 내 L135KD와 쌍을 형성하는 H1 내 L124E_V190D 및 L2에서 S176D 또는 S176D_T178E와 쌍을 형성하는 H2의 L124R 또는 S188K를 기초로 하였다.
집단 6에 있어서, 두 가지 대표적인 설계(10808-11308 및 10814-11233)가 선택되었다(표 10-A6 참조).이러한 집단의 모든 구성원은 H1L1 쌍에서 유사한 정전 추진 집합: H1의 V177D_S188D와 L1의 S176K_Y178K/R 및 H2L2 쌍에서 더 다양한 추진 집합, 즉 a) L2의 S176E/D_T178E 또는 S131D/E와 쌍을 형성하는 H2의 S188K; b) L2의 V133D 또는 Q124E_Q160E_T180E와 쌍을 형성하는 H2의 S186K/R; c) L2의 S176D 또는 S176D_T178D 또는 S176D_T180E와 쌍을 형성하는 H2의 L124R 또는 L124R_Q179K; 또는 d) L2의 V133D 또는 Q124E_V133D와 쌍을 형성하는 H2의 L143K/R을 사용하였다. 이들 치환은 우선적 쌍 이종이합체 내에 염 가교를 형성하게 한 반면 미스매치 쌍은 주로 정전 척력으로 인해 저해할 것이었다.
집단 7에 있어서, 세 가지 설계(13167-13514, 13263-13493 및 12878-11240)가 집단을 대표하는 것으로 선택되었다(표 10-A7를 참조). 모든 집단 구성원은 H1L1에서 공통적인 추진 집합: H1 내S188E 및 L1 내 Y178K를 기초로 하는 정전 추진 집합과 함께, H2L2 쌍에서 일부 추진 집합 다양성: 주로 L2의 S176D/E_T178D/E 또는 S176D/E_T180E 또는 Q124E와 함께 쌍을 형성하는 주로 H2의 L124R 또는 S188K(또한 L143K 또는 S186R 또는 Q179K과 함께)을 사용하였다. 일부 집단 구성원은 또한 정전 추진 집합에 더하여 이황화 조종 추진 집합, 입체 2 추진 집합 또는 가변 도메인 추진 집합을 포함하였다.
집단 8에 있어서, 다섯 가지 설계(13320-13370, 12938-13469, 13226-13434, 11026-11270 및 13316-13451)가 집단을 대표하는 것으로 선택되었다(표 10-A7를 참조). 이 집단의 구성원은 H1L1 정전 쌍 내에 더 많은 다양성을 가졌던 반면 H2L2 쌍은 주로 L2 내 Q124R/K_T178R 또는 Q124R_Q160R/K_T178R 추진자와 쌍을 형성하는 H2 내 L143E 또는 L143E_Q179E 추진자를 기초로 하였다. H1L1 추진 다양성은 다음과 같았다: a) 주로 L1의 S180E 추진자와 쌍을 형성한 H1 내 추진자로서 사용된 S186R 또는 Q179K(L1 내 V133D 추진자와 쌍을 형성하는 H1 내 S186K 변이); b) L1의 V133D 또는 T131E/D_V133D와 쌍을 형성한 H1의 L143K 추진자; 또는 c) L1의 S176D/E_Y178E와 주로 쌍을 형성하는 H1의 S188K. 일부 집단 구성원은 정전 추진 집합에 더하여 L2 내 V133A에 입체적으로 상보적이도록 조작된 H2 내 L124W를 기초로 하는 입체 2 또는 입체 3 추진 집합 또는 입체 4 추진 집합을 포함하였다(일부 집단 구성원은 후자 설계의 부분으로써 또한 H1 내 L143A 치환 및 L1 내 V133W를 사용하였다). 게다가, 적은 수의 집단 구성원은 대표적이라고 선택된 것들에 있어서 정전 집합체 더하여 가변 도메인 추진 집합을 포함하거나, H2의 F122C 및 L2의 Q124C 사이에 조작된 이황화 결합을 포함하였다.
집단 9에 있어서, 두 가지 대표적인 설계(13208-13455 및 13194-13427)가 선택되었다(표 10-A9 참조). 이러한 집단의 거의 모든 구성원은 두 가지 정전 추진 집합의 조합을 사용하였다. 제1 추진 집합은 대부분 H1 내 Q179K 또는 S186R 및 L1 내 S180E와 함께 H2 내 L143E 또는 L143E_Q179E 및 L2 내 S131K 또는 Q124R_T178R 또는 Q124R_Q160K_T178R로 구성되었고, 제2 추진 집합은 이황화 조종 추진 집합이었다.
집단 10에 있어서, 두 가지 대표적인 설계(13238-13463 및 13304-13466)가 선택되었다(표 10-A10 참조). 이 집단의 구성원은 입체 1 추진 단독, 또는 집단 9에서 사용된 정전 추진 집합을 함께 기초로 하였다.
집단 11에 있어서, 하나의 대표적인 설계(13306-13375)가 선택되었다(표 10-A11 참조). 이러한 집단의 모든 구성원은 다음 추진자를 기초로, 이종이합체의 우선적 쌍 형성을 추진하기 위해 정전 추진 집합을 사용하였다: H1 내 L143K_V190K 및 L1 내 V133D 및 H2 내L124E 및 L2 내 S131K_L135K.
집단 12에 있어서, 세 가지 대표적인 설계(13227-13383, 11065-11206 및 11034-11204)가 선택되었다(표 10-A12 참조). 이 집단의 구성원은 이종이합체의 우선적 쌍 형성을 추진하기 위해 주로 정전 치환을 사용하였다. 이들은 H1 내 L143K 또는 S186K 및 L1 내 V133D 또는 T131D/E_V133D 그리고 주로 H2 내 L124E_Q179E 및 L2 내 S131K/R_S176R를 포함하였다. 일부 집단 구성원은 추가적으로 이황화 조종, 입체 2, 입체 3, 또는 가변 도메인 추진 집합을 포함하였다.
K-K-유래 K-L 설계 집단의 설명
K-K-유래 K-L 설계의 상당히 더 작은 집합을 K-L 설계에 비교하여 LCCA로 시험하였다(n=43). 따라서, 각각의 열 가지 카파-카파 적용된 집단은 단일 설계를 나타내었다. 대부분의 집단은 입체 추진 집합을 사용하는 두 가지를 제외하고는 정전 추진 집합을 사용하였다. 게다가, 두 집단은 가변 도메인 내 설계만으로 이루어진 반면, 나머지 집단은 불변 도메인 설계를 포함하였다.
집단 1은 다음의 추진 집합: H1 내 L143E_Q179E, L1 내 E124K_Y178R, H2 내 S186R, 및 L2 내 T178E_T180E 또는 Q160E_T180E을 기초로 하는 정전 설계를 포함하였고 설계 10657-10760로 대표된다.
집단 2는 H1 내 L143E, L1 내 E124R 및 H2 내 S186R 또는 Q179K, L2 내 Q124E_Q160E_T180E를 특징으로 하는 정전 추진 집합을 포함하였다(대표적인 설계 10652-10734).
집단 3은 L1 내 음으로 하전된 추진자 S180E에 상보적인 H1 내 양으로 하전된 추진자 S186R, 및 L2 내 양으로 하전된 추진자 Q124K_T178R에 대부분 상보적인 H2 내 음으로 하전된 추진자 L143E 또는 Q179E 또는 이들의 조합을 포함하였다(대표적인 설계 10685-10726).
집단 4는 다음의 추진자:H1 내 Q179K, L1 내 S180E 및 H2 내 L143E, L2 내 Q124R 또는 Q124R_Q160K_T178R를 사용하였다(대표적인 설계 10665-10724).
집단 6 구성원은 한 팔 내 Q39K/R 및 Q38E/D 및 다른 팔 내 Q39E/D와 Q38K/R의 정전 쌍을 기초로 하는 가변 도메인 설계를 포함하였다(두 전하 쌍 배향이 모두 H1L1 및 H2L2 팔에서 사용되었다) (대표적인 설계 10681-10741).
집단 8 구성원은 입체적 성질의 가변 도메인 추진의 제2 집합: L1 내 WT에 상보적인 H1 내 WT 또는 L45F, 및 L2 내 P44F에 상보적인 H2 내 L45A/P를 포함하였다(대표적인 설계10621-10733).
집단 10은 H1 내 L124E, L1 내 S176R 및 H2 내 L124R, L2 내 S176D를 기초로 하는 단일 설계를 포함하였다(설계 10640-10713).
집단 5, 7 및 9에 대한 대표는 이들이 모 Fab에 비해 성능 기준, 가령 중간 내지 강한 추진을 충족하지 않았거나 항원 결합에 대한 영향이 없었기 때문에 선택되지 않았다.
실시예 16: 이중특이적 항체 형태의 Mab 설계 집합에서 설계된 이종이합체의 우선적 쌍 형성의 측정
실시예 2 내지 4, 및 10은 LCCA 설계의 맥락에서(즉 H1, L1, L2, 또는 H2, L1, L2, 여기서 하나의 중사슬은 Fab 형태로 두 개의 경사슬과 동시-발현되었다) 우선적으로 쌍을 형성하는 설계된 Fab의 능력을 입증하였다. 이러한 실시예에서, Mab 설계 집합(H1, L1, H2, L2) 내 설계된 이종이합체는 이들이 이중특이적 항체 형태(즉 여기서 H1, L1, H2, 및 L2는 동시-발현됨)에서 우선적 쌍 형성을 촉진하는지 확인하기 위해 평가되었다. Mab 설계 집합의 아미노산 치환에 더하여, 각각의 이종이합체의 전장 중사슬의 Fc 영역은 하나의 중사슬이 아미노산 치환 T350V, L351Y, F405A 및 Y407V (사슬 A)을 포함하고 다른 중사슬이 아미노산 치환 T350V, T366L, K392L 및 T394W (사슬 B)을 포함하도록 비대칭적으로 변형되었고 여기서 Fc의 아미노산 번호는 EU 번호 시스템에 따른다. 이들 비대칭 Fc 변형은 고유한 중사슬의 이종이합체를 촉진하기 위해 포함되었다.
이중특이적 항체의 맥락에서 Mab 집합에서 설계된 이종이합체의 우선적 쌍 형성을 촉진하는 능력은 앞선 실시예에 기술된 CAT-2200 및 페르투주맙 항체, 및 CR8071(항-인플루엔자 B 혈구응집소 단백질) 항체 및 SGN-CD19a (항-CD19)의 조합을 이용하는 3가지 이중특이적 시스템에서 평가되었다. 시험된 3가지 이중특이적 시스템은: A) CAT-2200 (람다 경사슬을 가짐)/페르투주맙 (카파 경사슬을 가짐), B) CAT-2200 (람다 경사슬을 가짐)/SGN-CD19a (카파 경사슬을 가짐), 및 C) CR8071 (람다 경사슬을 가짐)/SGN-CD19a (카파 경사슬을 가짐)이었다. CAT-2200 및 CR8071은 인간 항체인 반면, 페르투주맙 및 SGN-CD19a는 인간화된 항체이다.
어세이 형태 (SMCA)
Mab 설계 집합의 아미노산 치환을 내포하여 우선적으로 쌍을 형성하여 올바르게 쌍을 형성한 이중특이적 항체를 형성하는 이종이합체의 능력을 하기 기술된 바와 같이 평가하였다. 어세이는 네 가지 사슬(하나의 항체로부터의 H1 및 L1 사슬과 다른 항체로부터의 H2 및 L2 사슬)을 동시-발현시키고 질량 분석법(LC-MS)을 이용하여 올바르게 형성된 이중특이적 항체의 존재를 검출하는 단계를 기초로 한다. 도 8은 네 가지 출발 폴리펩티드 사슬 및 이종이합체 쌍의 중사슬 및 경사슬(Fab 및 Fc 영역 둘다) 사이에 우선적 쌍 형성의 부재에서 이들 출발 폴리펩티드 사슬의 동시-발현으로 생성된 가능한 산물을 도시하는 도식을 제공한다. 두 가지 고유한 전장 중사슬 구조체가 두 가지 고유한 경사슬 구조체와 동시-발현되어, 열 가지 가능한 항체 종(또한 Mab 종으로 지칭됨): H1L1_H1L1, H1L2_H1L2, H1L1_H1L2, H2L1_H2L1, H2L2_H2L2, H2L1_H2L2, H1L1_H2L1, H1L2_H2L2, H1L2_H2L1 및 H1L1_H2L2를 얻었다. H1L1_H2L2 종은 올바르게 쌍을 형성한 이중특이적 항체이다(도 8 참조). 도 8에 나타난 바와 같이, 네 가지 유형의 반쪽-항체(반쪽-Ab) 종이 또한 가능하다. 변형이 Fc 영역 내로 도입되어 고유한 중사슬의 이종이합체화를 촉진하는 경우, 가능한 Mab 종의 수는 감소한다(즉 더 적은 종 E 내지 J가 관찰됨).올바르게 쌍을 형성한 이중특이적 항체 종 H1L1_H2L2 vs. 다른 종의 양 측면에서 상대적인 쌍 형성 특이성은 단백질 A (pA) 정제 및 탈당화 후에 LC-MS를 이용하여 측정되었다. 가능한 경우, 사슬은 태깅되지 않은 채 존재하며, 단 이때 모든 Mab 종 및 반쪽-Ab 종은 서로 적어도 50 Da 상이해야 한다. 질량 차이가 이러한 가능성을 막는 경우, 경사슬에 N-말단 태그(HA 또는 FLAG)를 부가하여 종류 사이에 충분한 질량 차이를 제공하였고, 때때로 HA 태그의 절단이 관찰되었기 때문에 가능한 경우 FLAG 태그의 사용이 강조된다(CR8071을 내포하는 구조체의 경우에는 FLAG 태그만 사용하였다).
이중특이적 항체의 H1, L1, H2, 및 L2의 발현, 및 이어지는 쌍형성 산물의 분석을 포함하는 이러한 어세이는 SMCA로 지칭된다.
구조체의 제조
설계에 따른 아미노산 변형을 포함하는 CAT-2200, 페르투주맙, CR8071 및 SGN-CD19a IgG 중사슬 및 경사슬을 인코딩하는 구조체를 하기와 같이 제조하였다. CAT-2200 및 페르투주맙 경사슬 서열을 실시예 3에 기술된 바와 같이 제조한 반면, 이들 항체를 위한 전장 중사슬 서열은 부분적 경첩-CH2-CH3 도메인 [서열 번호:6]을 인코딩하는 IgG1*01 DNA 서열을 첨가하여 생성하고, Fab 중사슬의 CH1 도메인의 C-말단 상에 이종이합체화를 촉진하도록 변형시켰고(경첩의 부분을 내포하고 LCCA에서 구조체를 위해 사용된 ABD2 연장을 배제) 이의 제조는 실시예 3에 기술되어 있다. Mab 설계 집합을 위해 아미노산 치환을 내포하는 구조체를 실시예 3에 언급된 바와 같이 유전자 합성 또는 부위-지정 돌연변이유발에 의해 생성하였다. 특히, C-말단 라이신 깍임으로 인한 LC-MS 신호 이질성을 방지하기 위해 표준 C-말단 중사슬 라이신 잔기를 제거하였다(Lawrence W. Dick Jr. 등, Biotechnol. Bioeng. (2008) 100:1132-43).
CR8071의 중사슬의 Fab 부분을 위한 염기 DNA 서열(서열 번호:18) 및 경사슬의 DNA 서열(서열 번호:19)이 표 3C에 나타난다. 중사슬 (서열 번호:14) 및 경사슬 (서열 번호:15)을 위한 CR8071 Fab 아미노산 서열은 PDB 침입 4FQJ (Fab CR8071 및 혈구응집소의 복합체) 내 그것과 상응하며 여기서 중사슬 내 R222K 치환이 만들어져 가장 공통적인 IGHG1*01 서열로 전환되었다.
SGN-CD19a의 중사슬의 Fab 부분을 위한 염기 DNA 서열(서열 번호:16) 및 경사슬의 DNA 서열(서열 번호:17)이 또한 표 3C에 나타난다. SGN-CD19a 서열은 U.S. 특허 번호 8,242,252호에 보고된 서열 번호: 7 및 17과 상응하고 본 명세서에서 서열 번호:12 (중사슬) 및 서열 번호:13 (경사슬)로서 포함된다.
상기 언급한 바와 같이, Mab 집합에서 일부의 설계된 이종이합체 내 CAT-2200, CR8071, 페르투주맙 및 SGN-CD19a 경사슬 서열은 종 사이에 충분한 질량 차이를 제공하기 위해 FLAG 또는 HA 태그와 함께 또는 없이 제조되었다. 태그를 갖는 경사슬은 실시예 3에 기술된 바와 같이 제조하였다.
또한 각각의 시스템에서의 자연적인 편향을 평가하고, 쌍 형성에 대한 HA 및 FLAG 태그의 잠재 효과를 식별하고 설계된 구조체가 야생형보다 우선적 쌍을 형성하는지 확인하기 위해 이들 구조체의 야생형 버전을 제조하였다.
구조체의 형질주입, 발현 및 정제
야생형이든 시험된 각각의 Mab 설계 집합에 상응하는 아미노산 치환을 가졌든, 각각의 이중특이적 항체 시스템의 두 가지 중사슬 및 두 가지 경사슬을 인코딩하는 구조체를 다음과 같이 CHO-3E7 세포 내로 형질주입시켰다. 1.7 - 2 x 106세포/ml의 밀도의 CHO-3E7 세포를 4 mM 글루타민 및 0.1% KoliphorP188 (Sigma #K4894)로 보충된 FreeStyle(TM) F17 배지(Invitrogen cat# A-1383501)에 37°C에서 배양하였다. 200 ml의 총 부피를 PEI-맥스(Polysciences Cat #24765-2)를 이용하여 1:4의 DNA:PEI 비율로 다양한 비율의 H1:H2:L1:L2(이는 100 μg의 항체 DNA 및 100 μg의 GFP/AKT/스터퍼(stuffer) DNA로 이루어짐)를 가지는 총 200 μg DNA로 형질주입시켰다. DNA-PEI 혼합물을 부가하고 24시간 후, 0.5 mM 발프로산(최종 농도) 및 1% w/v 트립톤 N1(최종 농도)을 세포에 부가하고 이를 이후 32°C로 이동시키고 수확 전까지 7일간 항온처리하였다. 배양 배지를 원심분리로 수확하고 Stericup 0.22 μm 필터 (Millipore Cat # SCGPU05RE)를 이용하여 진공 여과하였다. 여과된 배양 배지를 이후 PBS pH 7.4로 사전에 평형화시킨 단백질 A MabSelect SuRe 수지(GE Healthcare #17-5438-02)를 이용하여 정제하였다. 수지에 결합된 항체 종을 이후 PBS pH 7.4로 세척하고 100 mM 구연산나트륨 완충액 pH 3.6으로 용리하였다. 용리된 항체 종을 농축하고 완충액을 PBS pH 7.4로 Amicon 울트라 15 원심분리 필터 Ultracel 10 K (Millipore # SCGP00525)를 이용한 원심분리에 의해 교환하였다. 항체 종을 함유하는 생성된 단백질 A-정제된 SMCA 샘플을 탈당화 및 LC-MS 전에 캘리퍼로 평가하였다.
질량 분석 방법
이중특이적 항체의 맥락에서 Mab 설계 집합에 의해 추진된 이종이합체의 우선적 쌍 형성의 정도를 단백질 A 정제 및 비-변성 탈당화 후에 질량 분석법을 이용하여 평가하였다.이종이합체는 Fc N-연결된 글리칸만 내포하기 때문에, SMCA 샘플을 단 하나의 효소, N-글리코시다아제 F (PNGase-F)로 처리하였다. 정제된 샘플을 다음과 같이 PNGase F로 탈-당화하였다.: 50mM Tris-HCl pH 7.0 내 0.2U PNGase F/μg의 항체, 37°C로 밤새 배양, 0.5 mg/mL의 최종 단백질 농도. 탈당화 후, 샘플을 LC-MS 분석 전까지 4°C에 저장하였다.
탈당화 단백질 샘플을 Ion Max 전자분무 공급원(ThermoFisher)을 통해 LTQ-Orbitrap XL 질량 분석기 (ThermoFisher Scientific)에 연결된 Agilent 1100 HPLC 시스템을 이용하여 완전 LC-MS로 분석하였다. 샘플(5 μg)을 2.1 x 30 mm Poros R2 역상 컬럼(Applied Biosystems) 상에 주입하고 다음의 구배 조건: 0-3 분: 20% 용매 B; 3-6 분: 20-90% 용매 B; 6-7 분: 90-20% 용매 B; 7-9 분: 20% 용매 B로 용해하였다. 용매 A는 탈기된 0.1% 포름산 수성이었고 용매 B는 탈기된 아세토니트릴이었다. 유속은 3 mL/분이었다. 흐름은 컬럼-후 즉시 100μL씩 전자분무 표면으로 갈라졌다. 컬럼을 82.5°C로 가열하고 단백질 피크 모양을 향상하기 위해 용매를 컬럼-전에 80°C까지 가열하였다. LTQ-Orbitrap XL를 ThermoFisher Scientific's LTQ Positive Ion ESI 보정 용액(카페인, MRFA and Ultramark 1621)을 이용하여 보정하였고, CsI의 10 mg/mL 용액을 이용하여 조율하였다.원뿔체 전압(공급원 단편화 설정)은 48 V였고, FT 해상도는 7,500였으며 스캔 범위는 m/z 400-4,000였다. LTQ-Orbitrap XL를 대형 단백질(>50 kDa)의 최적 검출을 위해 조율하였다.
전-크기 항체(m/z 2000-3800) 및 반쪽-항체(m/z 1400-2000)로부터의 복수로 하전된 이온을 내포하는 범위를 MassLynx의 MaxEnt 1 모듈, 장비 제어 및 데이터 분석 소프트웨어(Waters)를 이용하여 개별적으로 분자량 프로파일로 디콘볼루션시켰다. 간단히, 미정제 단백질 LC-MS 데이터를 먼저 Xcalibur(Thermo Scientific)의 스펙트럼 가시화 모듈인 QualBrower에서 열고 Waters에서 제공하는 파일 전환 프로그램인 Databridge를 이용하여 MassLynx와 호환가능하도록 전환시켰다. 전환된 단백질 스펙트럼을 MassLynx의 스펙트럼 모듈에서 보고 MaxEnt 1을 이용하여 디콘볼루션시켰다. 각각의 샘플 내 각각의 항체 종의 양을 도출된 분자량 프로파일로부터 직접 결정하였다.
LC-MS 결과 분석
전반적으로, 대부분의 경우, 탈당화 처리는 LC-MS로 확인된 모든 가능한 상이한 항체 종을 확인할 수 있게 했다. 많은 경우, 각각의 항체 종은 단일 LC-MS 피크로 나타났다. 예외는 요망되는 이중특이적 종에 역시 해당할 수 있는 사이드 피크(가능하게는 첨가물 또는 선도서열 펩티드의 절단에서의 이질성)를 포함했으나; 그러나, 사이드 피크에서 생성되는 종의 정체가 불투명하므로, 이들 사이드 피크는 이중특이적 종에 속하는 것으로 간주하지 않았다. 게다가, 요망되는 이중특이적 종, H1L1_H2L2는 일반적으로 LC-MS를 근거로 오류쌍형성된 유형인, H1L2_H2L1과 실험적으로 구별할 수 없었다. 따라서, 이중특이적 항체 함량이 표에 보고될 때, 표가 이러한 유형의 오류쌍형성된 종을 내포하지 않는다고 완전히 배제할 수 없다. 그러나, H1L2_H1L2 및 H2L1_H2L1 뿐만 아니라 H1L2 및 H2L1 반쪽 항체와 같은 종에 대해 관찰되는 매우 낮은 함량은 존재하는 경우 생겨난 오류쌍형성된 종으로 이중특이적 종이 미량으로 오염되었음을 나타낸다.
야생형 시스템에서 쌍 형성에 대한 자연적인 편향 및 태그의 효과의 평가
첫 단계로서, 각각의 시험된 세 가지 이중특이적 시스템에 있어서, 야생형(하나의 경사슬은 필요시 종간의 충분한 질량 차이를 위해 태그를 내포), 각각의 시스템에 대한 모 항체의 변형되지 않은 중사슬 및 경사슬을 H1:H2:L1:L2에 대한 다양한 DNA 비율을 이용하여 동시-발현시키고, 생성된 항체 종을 확인하고 정량화하였다. 이는 각각의 시스템에서 임의의 내재된 쌍 형성 편향(또는 태그의 존재로 도입된 것)을 식별할 수 있게 하였고(예를 들면, 이중특이적 시스템 내 한 모 항체의 경사슬이 이중특이적 시스템 내 다른 모 항체의 중사슬에 우선적으로 결합하는 경우), 또한 가장 적은 양의 반쪽-Ab를 가지는 가장 많은 양의 이중특이적 항체를 제공한 H1:H2:L1:L2에 대한 DNA 비율을 식별할 수 있게 하였다. DNA 비율은 발현 수준의 자연적인 차이 및/또는 두 가지 모 항체의 중사슬 및 경사슬 사이의 고유한 쌍 형성 편향 및/또는 각각의 시스템에 대한 태그 영향을 보상하도록 선택하였다. 시험된 야생형 이중특이적 시스템 A 및 B에서, L2을 FLAG 태그로 태깅하였다. 이중특이적 시스템 C에서, 경사슬 중 어느 것에도 태깅하지 않았다.
표 12는 이러한 평가의 결과를 나타낸다. 가장 적은 양의 반쪽-Ab를 가진 가장 많은 양의 이중특이적 항체를 제공한 H1:H2:L1:L2에 대한 DNA 비율은 시스템 A에 있어서 10:20:24:46, 시스템 B에 있어서 15:15:35:35, 및 시스템 C에 있어서 15:15:35:35였다. 특히, CAT-2200/페르투주맙 이중특이적 Ab 시스템(시스템 A)에서, 페르투주맙 중사슬(H2)이 CAT-2200 경사슬(L1)과 우선적으로 쌍을 형성하는 편향성을 관찰하였다. 이러한 편향은 균등한 비율의 중사슬 1 및 중사슬 2, 그러나 역비율의 경사슬 1 및 경사슬 2에 대한 데이터가 고려되는 경우(예컨대 표 12 내 8:22:17:53 및 8:22:53:17의 H1:H2:L1:L2에서 역 L1:L2 DNA 비율을 고려하라) 명백하였다. H1:H2:L1:L2=8:22:53:17의 이들 조건 하에서, H1L1_H2L1의 우세한 오류쌍형성된 Mab 종은 H1:H2:L1:L2=8:22:17:53인 경우보다 훨씬 더 풍부(79.6%)하며, 여기서 H1L2_H2L2의 우세한 오류쌍형성된 종이 약 38.4%을 구성하였다. 이는 페르투주맙 경사슬이 FLAG 태그를 가진 경우, 페르투주맙 중사슬이 이러한 시스템에서 CAT-2200 경사슬과 우선적으로 쌍을 형성하는 것으로 보임을 나타내었다.
한 경사슬 상에 N-말단 태그(HA 또는 FLAG)를 내포한 설계 SMCA 구조체는 중사슬과 쌍을 이루는 경사슬의 능력에 대한 태그의 가능한 영향에 대해 조사되었던 유사한 WT SMCA 구조체의 제조를 유도하였다. 표 13은 이 실험의 결과를 나타내며, 일부 경우에, 태그가 실제로 중사슬과 경사슬의 쌍 형성에 영향을 주었다는 것을 나타낸다. 예를 들면, 페르투주맙 경사슬이 FLAG 태그를 내포할 때 페르투주맙 중사슬과 CAT-2200 경사슬의 우선적 쌍 형성이 존재했던 상기 언급된 시스템 A 경우와 관련하여, CAT-2200 경사슬이 HA 태그를 내포하고 4가지 폴리펩티드 사슬이 동일한 DNA 비율로 발현되었을 때, 페르투주맙 경사슬에 대한 CAT-2200 중사슬의 우선적 쌍 형성이 관찰되었다(표 13, '시스템 A, L1-HA'을 참조하고 10:20:24:46의 동일한 비율의 '시스템 A, L1-HA'와 '시스템 A, L2-FLAG'를 비교하라). 게다가, SGN-CD19a/CAT-2200 이중특이적 시스템(시스템 B)에 있어서, FLAG-태깅된 SGN-CD19a 경사슬을 내포하는 시스템에서 SGN-CD19a의 중사슬과 CAT-2200 경사슬 사이의 오류쌍형성의 정도는 동일한 비율의 동일한 시스템의 다른 두 변형에서의 정도를 초과하였다(표 13, '시스템 B, L1-FLAG' 및 15:15:35:35의 동일한 비율의 '시스템 B, L1-FLAG와 '시스템 B, L2-FLAG 및 L2-HA'를 비교하라).표 13이 수행된 모든 반복에 대한 누적된 데이터를 반영하며, 따라서 종 백분율이 일부 경우에 표 12에 제공된 초기 평가 단계에서의 데이터와 다를 수 있음에 유의하라.
각각의 이중특이적 시스템 내의 각각의 40가지 대표적인 설계를 시험함에 있어서, 사용된 H1:H2:L1:L2 DNA 비율은 가장 많은 양의 이중특이적 Ab 종 및 가장 적은 양의 반쪽-Ab를 수득한 상응하는 야생형 이중특이적 시스템으로부터의 비율이었다. 상기 나타난 바와 같이, CAT-2200/페르투주맙 시스템에 있어서, 사용된 비율은 10:20:24:46(H1:H2:L1:L2)였고, 여기서 H1 및 L1은 CAT-2200을 가리키고 H2 및 L2는 페르투주맙을 가리킨다. SGN-CD19a/CAT-2200 및 SGN-CD19a/CR8071 시스템에 있어서, 사용된 비율은 15:15:35:35(H1:H2:L1:L2)였다.
이중특이적 항체 형태에서 우선적 쌍 형성 결과
시험된 40가지 대표적인 설계를 이용한 SMCA의 결과는 표 14 내지 17에 나타난다. 표 14 내지 17은 "설계"로서 Mab 설계 집합을 가리키고 4-자리 숫자로 식별되었다. 각각의 4-자리 숫자는 표 10-A1 내지 A12 및 10-B1 내지 10-B10에서의 Mab 설계 집합 고유 식별자(LCCA 집합 고유 식별자)에 상응한다. 표 24는 SMCA에서 시험된 설계 사이의 대응 표 및 LCCA 집합 고유 식별자를 제공한다. 우선적 쌍 형성의 분석은 두 가지 유형의 계산을 기초로 수행되었다. 제1 유형의 계산은 표에서 "% H1L1 및 % H2L2 쌍 형성"으로 언급되고, 단 하나의 올바르게 쌍을 형성한 팔을 가질 수 있었던 Mab 종을 비롯하여, 관찰된 모든 Mab 종 및 반쪽-Ab 종에 걸쳐, H1 및 L1 및 사이 H2 및 L2 사이에 올바른 쌍 형성의 양을, 총 산물의 백분율로서 나타낸다(H1L1_H2L2_및_H1L2_H2L1 + H1L1_H1L1 + H2L2_H2L2 + H1L1 + H2L2 + 0.5 x (H1L1_H2L1 + H1L1_H1L2 + H1L2_H2L2 + H2L1_H2L2)). 이러한 계산은 '총 쌍 형성' 계산으로 지칭된다. 제2 유형의 계산은 표에서 "H1L1_H2L2 및 H1L2_H2L1**"로 언급되고, 올바르게 쌍을 형성한 이중특이적 항체의 양을 관찰된 모든 Mab 종(즉 도 8의 Mab 종 A-J)의 백분율로서 나타낸다(H1L1_H2L2_및_H1L2_H2L1 / (H1L1_H2L2_및_H1L2_H2L1 + H1L1_H1L1 + H2L2_H2L2 + H1L1_H2L1 + H1L2_H2L2 + H1L1_H1L2 + H2L1_H2L2 + H1L2_H1L2 + H2L1_H2L1)). 이러한 계산은 '총 이중특이성' 계산으로 지칭된다. 반쪽 항체는, 존재하는 경우, 분취 SEC 또는 추가적인 H1:H2:L1:L2 DNA 적정을 통해 제거/최소화될 수 있기 때문에 이 계산에서 고려하지 않았다. 표 12는 DNA 적정이 발현된 반쪽-Ab의 백분율을 조정하는데 효과적임을 보여준다. 유형 'Fc 사슬 A'의 반쪽-Ab의 양을 감소하는 데 있어서 분취-SEC 정제의 효과성은 실시예 18에서 나타난다.
상기 기술된 바와 같이, 일부 야생형 이중특이적 시스템에서 관찰된 편향성을 설명하기 위해, 우선적 쌍 형성 데이터를 동일한 H1:H2:L1:L2 DNA 비율의 상응하는 야생형 이중특이적 구조체에 대한 비교로서 보고하였다. 이러한 비교를 컬럼 "야생형에 대한 % H1L1 및 % H2L2 쌍 형성 변화"(즉 WT에 대한 총 쌍 형성 변화) 및 "야생형에 대한 H1L1_H2L2 및 H1L2_H2L1** 변화"(즉 WT에 대한 총 이중특이성의 변화)에서 보고하였다. 상응하는 야생형 이중특이적 구조체가 SMCA로 평가되지 않은 경우에, 비교는 유사한 야생형 구조체에 대해 이루어졌다. 이들 경우는 보고된 수치 옆에 "‡"로 표시된다. 비교를 위해 선택된 유사한 야생형 구조체를 다음과 같이 선택하였다. 각각의 이중특이적 시스템 및 구조체(태그가 있거나 없는 것)에 있어서, "H1L1_H2L2 및 H1L2_H2L1**"에 대한 중간값 및 "% H1L1 및 % H2L2 쌍 형성"에 대한 평균 수치를 DNA 비율당 반복 SMCA 실험으로부터 취했다. 각각의 구조체 내의 임의의 비율로부터 가장 큰 수치를 취하고, 모든 구조체 중에서 중간을 특정 시스템에 대한 WT 기준을 나타내기 위해 사용하였다(도 16a 및 16b 참조).
표 14 및 15는 시험된 대표적인 K-L 설계에 대한 SMCA 결과의 요약을 제공하며, 여기서 설계는 "야생형에 대한 % H1L1 및 % H2L2 쌍 형성 변화"(표 14) 또는 "야생형에 대한 H1L1_H2L2 및 H1L2_H2L1** 변화"(표 15)에 따라 넣어졌다. 유사하게, 표 16 및 17은 시험된 대표적인 K-K-유래 K-L 설계에 대한 SMCA 결과의 요약을 제공하며, 여기서 설계는 총 쌍 형성 변화(표 16) 또는 총 이중특이성 변화(표 17) 계산에 따라 넣어졌다.
성능
각각의 대표적인 설계에 있어서, 올바른 중사슬 및 경사슬의 우선적 쌍 형성을 촉진하는 성능, 또는 능력을 총 쌍 형성 계산을 이용하고 총 이중특이성 계산을 이용하여 평가하였다. 먼저, 컬럼 "야생형에 대한 % H1L1 및 % H2L2 쌍 형성 변화"(WT에 대한 총 쌍 형성 변화) 내 양의 수치는 Mab 설계 집합이 우선적 쌍 형성을 촉진할 수 있었음을 나타내었다. 다음으로, 컬럼 "야생형에 대한 H1L1_H2L2 및 H1L2_H2L1** 변화"(WT에 대한 총 이중특이성 변화) 내 양의 수치는 또한 Mab 설계 집합이 우선적 쌍 형성을 촉진할 수 있었음을 나타내었다.
모든 K-L 설계 및 21개 중 18개의 K-K-유래 K-L 설계는, 비록 일부 경우에는 상이한 오류쌍형성된 종의 양이 야생형에 비해 증가했지만, 야생형에 비해 주요 오류쌍형성된 종(H1L2_H2L2 또는 H1L1_H2L1)의 감소된 양을 나타냈다. 평균적으로, K-L 및 K-K-유래 K-L 설계는 둘다 시스템 A (48.8 %), 이어서 시스템 B (31.1 %), 및 시스템 C (14.5 %)에서 야생형에 비해 요망되는 이중특이성의 가장 큰 증가를 생성하였다(WT에 대한 총 이중특이성의 변화). 평균적으로, 시험된 모든 설계는 반쪽 항체의 총 양이 야생형에 비해, 24.1 %에서 27.9 %로 비교적 미미하게 상승했으나, 오류쌍형성된 반쪽 항체에 쌍을 형성한 평균 비율을 1.5에서 6.9로 향상시켰다.
이동가능성
다중 시스템에서 우선적 쌍 형성을 촉진하는 Mab 설계의 대표적인 집합의 능력을 설계의 "이동가능성"의 척도로 시험하였다. 'WT에 대한 총 쌍 형성 변화' 계산을 이용하여, 33개의 K-L 설계 중 29개가 3가지 시험된 시스템 중 3가지에서 이동가능했고 3개의 설계가 시험된 3가지 시스템 중 2가지에서 이동가능했다(표 14). 달리 말하면, 이들 설계는 양의 수치의 'WT에 대한 쌍 형성 변화"를 나타냈다.우선적 쌍 형성을 'WT에 대한 총 이중특이성 변화' 계산을 이용하여 측정했을 때, 33개의 K-L 설계 중 24개가 3가지 시스템 중 3가지에서 이동가능하다고 확인되었고 8개의 설계가 3가지 시스템 중 2가지에서 이동가능했다(표 15). K-K-유래 K-L 설계에 있어서, 'WT에 대한 총 쌍 형성 변화' 계산을 이용하여 7개의 설계 중 2개가 3가지 시스템 중 3가지에서 이동가능했고 4개의 설계가 3가지 시스템 중 2가지에서 이동가능했다(표 16). 'WT에 대한 총 이중특이성 변화' 계산을 이용하여, 7개의 설계 중 1개가 3가지 시스템 중 3가지에서 이동가능했고 5개의 설계가 3가지 시스템 중 2가지에서 이동가능했다(표 17). 33개의 K-L 설계 중 23개 및 7개의 K-K-유래 K-L 설계 중 1개가 두 계산을 모두 이용하여 평가했을 때 3가지 시스템 중 3가지에서 이동가능했다.
집단의 성능과 관련하여, 12개의 K-L 집단 중 9개 내의 모든 설계는 'WT에 대한 총 쌍 형성 변화' 계산에 따라 3/3 시스템에서 이동가능성이었고, 및 12개 중 4개가 'WT에 대한 총 이중특이성 변화' 계산에 따라 이동가능성이었다. 집단 kl-4, kl-9, 및 kl-12 내의 모든 설계는 두 계산 모두를 이용하여 3/3 시스템에서 이동가능성이었다. 도 10은 'WT에 대한 총 이중특이성 변화' 계산 (도 10a, 이중특이성% 변화) 또는 'WT에 대한 총 쌍 형성 변화' 계산 (도 10b, 쌍 형성% 변화)를 기초로 하여, 각각의 집단으로부터의 대표적인 설계의 성능을 비교하는 박스 도표를 나타낸다. K-K-유래 K-L 집단에 있어서, 집단당 단 하나의 설계만 시험되었고 따라서 집단 이동가능성은 상기 논의된 설계 이동가능성과 균등했다.
전반적으로, K-L 설계는 K-K-유래 K-L 설계보다 더 효과적으로 우선적 쌍 형성을 촉진할 수 있었다. 도 11은 'WT에 대한 총 이중특이성 변화' 계산을 기초로 하여, 시험된 각각의 시스템에서 우선적 쌍 형성을 촉진하는 K-L 설계 및 K-K-유래 K-L 설계의 능력을 도시하는 박스 도표를 나타낸다. 예를 들면, 도 11은 K-L 설계가 일반적으로 이중특이적 항체의 양에 있어서 WT에 비해 K-K-유래 K-L 설계가 그랬던 것보다도 더 큰 증가를 촉진했음을 나타낸다(각각의 시스템에 대해 "kl 모두" 수치를 "kk 모두" 수치에 비교함). 이는 또한 2가지 이상 또는 모든 3가지 시스템에서 이동가능한 설계만을 고려할 때 참이다.
실시예 17: 생체물리적 특징분석을 위해 선택된 SMCA 이중특이적 항체 및 모 Mab의 분취용 크기 배제 크로마토그래피(SEC).
실시예 16에 기술된 SMCA에서 생성된 이중특이적 항체의 생체물리적 특징을 평가하기 위해, 시험된 대표적인 설계의 하위집합으로부터의 단백질 A-정제된 SMCA 샘플을 분취 SEC로 처리하여 반쪽-Ab 종을 제거하였다. 적어도 60 % "H1L1_H2L2 및 H1L2_H2L1**" (총 이중특이성)을 가지는 SMCA 샘플을 이 단계를 위해 선택하였다(총 36개). 이 기준을 충족하지 못하는 일부 SMCA 샘플이 또한 완전성을 위해 포함되었다. 예를 들면, SMCA 샘플이 소정의 설계에 있어서 시험된 세 가지 이중특이적 시스템 중 두 가지에서 기준을 충족하는 경우에, SMCA 샘플은 이 기준을 충족하지만, 세 가지를 충족하지 않으며, 모든 3가지 시스템에 대한 SMCA 샘플이 포함되었다. 분취용 SEC를 다음과 같이 수행하였다. SMCA 샘플 내 항체 종을 샘플을 컬럼에 주사하기 위해 사용되는 ALIAS Bio Cool 자동샘플러(Spark-Holland)가 구비된 GE Healthcare AKTA Avant25 시스템에 고정된 Superdex 200 10/300 Increase (GE Healthcare) 컬럼을 이용하여 분리하였다. PBS pH 7.4 내 SMCA 샘플 (0.9 ml)(Hyclone DPBS/변형된, 무칼슘, 무마그네슘, Cat. No. SH-300028.02)을 PBS로 채워진 2 ml 루프에 자동으로 로딩시켰다. 샘플을 이후 컬럼 상에 자동으로 주입하고 1 CV 용리 부피로 0.5 ml/분으로 용해시켰다. 단백질 용리를 OD280에서 모니터링하고 0.5 ml 분획으로 수집하였다. 각각의 SMCA 샘플에 있어서, 주요 피크를 포함한 분획(분획은 캘리퍼로 평가하였음)을 모아 풀(pool)을 만들고 추가로 실시예 19 및 20에 기술된 바와 같이 생체물리적 특징을 분석하였다.
실시예 18: 분취용 크기 배제 크로마토그래피에 의한 반쪽-항체의 제거
실시예 16에서, 반쪽-Ab는, 생산된 반쪽-Ab의 백분율이 DNA 적정에 의해 조정될 수 있거나, 유형 'Fc 사슬 A'의 경우에는 이들이 단백질-A 정제된 SMCA 샘플의 분취용 SEC 정제에 의해 제거/최소화될 수 있기 때문에 '총 이중특이성' 계산에 따른 쌍 형성의 계산에서 배제되었다고 언급되었다. "Fc 사슬 A 반쪽-Ab"의 제거를 증명하기 위해, 모든 세 가지 이중특이적 시스템에서 두 개의 K-L 설계를 위해 실시예 17로부터의 정제된 SMCA 샘플을 실시예 16에 기술된 바와 같이 LC-MS 분석으로 처리하였다. 선택된 두 개의 K-L 설계는 2901 및 3972였다(표 11A에서 확인되는 바와 같음). 결과는 표 18에 나타난다.
표 18 내 LC-MS 데이터를 표 14 내 단백질-A 정제된 SMCA 샘플에 대한 각각의 LC-MS 데이터와 비교하는 것은 분취 SEC가 유형 'Fc 사슬 A'의 반쪽-Ab 종(2901 및 3972 내 H1L1)의 제거/최소화에 효과적일 수 있음을 나타낸다. 시험된 모든 샘플에서, 요망되는 이중특이적 항체 종(H1L1_H2L2 및 H1L2_H2L1)의 높은 백분율 뿐만 아니라 유형 'Fc 사슬 A'의 반쪽 항체 종(표 18 내 H1L1)의 백분율 감소가 존재하였다.
실시예 19: SMCA 이중특이적 항체의 열 안정성.
분취용 SEC 후에, 분취-SEC 정제된 SMCA 이중특이적 항체의 열 안정성을 측정하고 아미노산 치환이 열 안정성에 임의의 효과를 가지는지 확인하기 위해 모 CAT-2200, 페르투주맙, CR8071 및 SGN-CD19a 단클론 항체와 비교하였다.
열 안정성의 측정.
선택된 이중특이적 이종이합체 항체 및 야생형 대조군의 열 안정성을 다음과 같이 시차 주사 열량법(DSC)을 이용하여 측정하였다. 분취용 SEC 처리 후에, 주로 PBS 내 0.4 mg/mL 농도의 400 mL 샘플을 VP-모세관 DSC (GE Healthcare)을 이용한 DSC 분석을 위해 사용하였다. 각각의 DSC 런을 시작할 때, 5회의 완충액 블랭크 주사를 수행하여 기초선을 안정화하였고, 기준을 위해 완충액 주사를 각각의 샘플 주사 전에 배치하였다. 각각의 샘플을 낮은 피드백, 8 초 필터, 3분 preTstat, 및 70 psi 질소 압력에서 60˚C/hr 속도로 20 부터 100˚C까지 스캔하였다. 생성된 써모그램은 Origin 7 소프트웨어를 이용하여 기준설정 및 분석하였다.
결과는 표 20 및 표 21에 나타난다. 표에 보고된 바와 같이 "야생형으로부터 Fab Tm의 평균 차이(°C)"를 계산하기 위해 사용된 야생형 Fab Tm 수치는 CAT-2200 (71.2˚C), 페르투주맙 (76.7˚C), CR8071 (66.9˚C, 최초 피크에 해당) 및 SGN-CD19a (91.0˚C)의 모 항체의 DSC 써모그램으로부터 수득하였다. CR8071 모 항체는 두 가지 Fab 전이를 전시하였다. 모 항체에 있어서, 추가적인 열 전이를 Fc의 CH2 및 CH3 도메인(각각 대략 71˚C 및 82˚C에서)에 대해 관찰하였고 여기서 이들의 Fab 전이는 중첩되지 않았다(도 12). 많은 양의 H2L2 'Fc 사슬 B' 반쪽 항체를 가지는 일부 설계는, 아마도 비-공유 동종이합체의 존재로 인해 대략 60˚C에서 추가적인 열 전이를 전시하였다. 일부 경우에, 설계는 페르투주맙 Fab의 Tm 감소를 야기하였고 그래서 이들 샘플 내 CAT-2200 Fab, 페르투주맙 Fab, 및 CH2 피크와 중첩되게 하였다(도 12a, 대표적인 설계 3972). 유사하게, 많은 설계가 SGN-CD19a Fab의 Tm을 이들 항체 대 CH3 피크와 중첩을 야기하는 정도까지 감소시켰다(도 12b 및 12c, 대표적인 설계 3972). 이들 중첩은 기여하는 Fab 성분의 Tm 지정에 일부 불명료성을 야기하였고, 따라서 표 20 및 21에 보고된 Tm 수치는 추정치로 간주된다. 흥미롭게도, 설계를 내포하는 CR8071/SGN-CD19a 이중특이적 항체가 야생형 이중특이적 항체에서 관찰되는 두 가지 전이 대신 단일 CR8071 Fab 전이를 전시하였다(예컨대 도 12c).
시험된 모든 K-L 설계 중에서, 모든 시스템에 걸친 야생형으로부터의 Fab Tm의 평균 차이는 6개 설계에 있어서 0˚C 내지 -1.5˚C, 11개 설계에 있어서 -1.5˚C 내지 -3.0˚C, 및 15개 설계에 있어서 -3.0˚C 내지 -4.5˚C였다(표 20). 시험된 모든 K-K-유래 K-L 설계 중에서, 평균 차이는 2개 설계에 있어서 0˚C 내지 -1.5˚C, 1개 설계에 있어서 -1.5˚C 내지 -3.0˚C, 및 1개 설계에 있어서 -3.0˚C 내지 -4.5˚C였다(표 21). 시험된 설계에 걸친 야생형으로부터의 Fab Tm의 평균 차이는 CAT-2200에 있어서 -0.9˚C(STDEV = 1.4), 페르투주맙에 있어서 -4.6˚C(STDEV = 1.6), SGN-CD19a에 있어서 -5.8˚C(STDEV = 3.5), 및 CR8071에 있어서 +1.1˚C(STDEV = 0.8)였다. 도 13은 시험된 설계에 대해, 모든 시험된 설계("모두"), 또는 파라토프(CAT-2200, 페르투주맙, CR8071, 또는 SGN-CD19a)에 대해 모 항체와 비교한 Fab Tm의 변화의 박스 도표를 도시한다.
실시예 20: 이중특이적 항체의 항원 친화성 측정
아미노산 치환이 항원 결합에 임의의 영향을 끼치는지 확인하기 위해 적절한 항원에 결합하는 이중특이적 항체의 능력을 평가하였다.　　항원 결합 친화성을 다음과 같이 SPR로 측정하였다.　
SPR 바이오센서 어세이
Biacore T200 연구를 위해: CM5 Series S 센서 칩, Biacore 아민 커플링 키트(NHS, EDC 및 1 M 에탄올아민), 및 10 mM 나트륨 아세테이트 완충액을 GE Healthcare Life Science (Mississauga, ON, Canada)로부터 구입하였다.　Biorad ProteOn 연구를 위해: GLC 센서칩, Biorad ProteOn 아민 커플링 키트(EDC, sNHS 및 에탄올아민), 및 10mM 나트륨 아세테이트 완충액을 Bio-Rad Laboratories (Canada) Ltd. (Mississauga, ON)로부터 구입하였다. 0.05% Tween20을 갖는 PBS 러닝 완충액(PBST)를 Teknova Inc. (Hollister, CA)로부터 구입하였다.　염소 다클론 항-인간 Fc 항체를 Jackson Immuno Research Laboratories Inc. (West Grove, PA)로부터 구입하였다.　항원: His-태깅된 재조합 인간 CD-19를 Abcam (Cambridge, UK)로부터 구입하였고 His-태깅된 인플루엔자 B 혈구응집소(B/Brisbane/60/2008)를 Sino Biological (Beijing, China)로부터 구입하였다. 재조합 Her2 세포외 도메인(ECD) 단백질을 eBioscience (San Diego, CA)로부터 구입하였다.　재조합 인간 IL-17A를 R&D Systems (Mineapolis, MN)로부터 구입하였다.　
항원 혈구응집소 및 CD-19를 이용한 표면 플라스몬 공명(SPR) 어세이는 PBST 러닝 완충액(0.5 M EDTA 스톡 용액을 3.4 mM 최종 농도까지 부가한 것)을 가지는 Biacore T200 장비(GE Healthcare)를 이용하여 25 °C의 온도에서 수행하였다.　항원 HER2 ECD 및 IL-17를 이용한 표면 플라스몬 공명 어세이는 PBST 러닝 완충액을 가지는 BioRad ProteOn XPR36 장비(Bio-Rad Laboratories (Canada) Ltd. (Mississauga, ON))를 이용하여 25C의 온도에서 수행하였다.
SGN-CD19a:CD-19 친화성 측정 을 다음과 같이 수행하였다. CD-19 항원에의 결합을 위한 항체(분취용 SEC 정제된 SMCA 샘플 및 OAA 대조군)의 선별은 두 단계로 일어났다: His-태그 CD-19의 항-His IgG 표면 상에의 간접적 포획, 이후 단일 주기 동역학을 이용한 역학 분석을 위해 다섯 가지 농도의 정제된 항체를 주사.　항-His 포획 표면은 제조사의 설명에 따라, 대략 12000 RU의 항-His IgG(His Capture Kit, GE Healthcare)를 활성 및 기준 유동 세포에 아민 커플링하여 CM5 Series S 센서 칩 위에 제조하였다. CD-19를 10 μg/ml의 활성 유동 세포 위에 10 μl/분의 유속으로 60초간 주사하였다. 일반적으로, 이는 항-His IgG 표면 위에 대략 250 RU의 CD-19의 포획을 야기하였다. CD-19는 기준 (블랭크) 유동 세포 상에는 포획되지 않았다. 포획 단계 이후 다섯 가지 농도의 정제된 항체(항체에 따라; 200 nM 및 2-배 희석, 80nM 및 2-배 희석, 또는 40 nM 및 2-배 희석)를 활성 및 기준 유동 세포 위에 40 μl/분으로 180초간 연속적으로 주입하였고 600초 해리 기간을 가졌다.　　포획된 항체 표면을 10 mM 글리신 pH 1.5로 120초간 30 μl/분으로 재생시켜 다음 주사 주기를 위한 표면을 준비하였다.　적어도 두 가지 모의-완충액 주사를 각각의 피분석물 주사에 대해 수행하였고 기준 설정을 위해 사용하였다. 생성된 단일 주기 동역학 센서그램을 Biacore T200 BiaEvaluation 소프트웨어 버전 3.0을 이용하여 분석하고 1:1 결합 모델에 정합시켰다.　
CR8071: 친혈구응집소 친화성 측정 을 다음과 같이 수행하였다. 혈구응집소(HA)를 10 mM 아세테이트 완충액 pH 5.5에 희석하고 아민 커플링을 통해 CM5 Series S 센서 칩에 직접 고정시켰다. 이는 대략 120-130 RU의 고정된 HA를 생성하였다. 기준 흐름 세포를 블랭크 대조군으로서 사용하기 위해 빈 상태(에탄올아민 차단시킴)로 두었다. 항체를 단일 주기 동역학을 이용한 역학 분석을 위해 HA 표면에 주입하였다.　다섯 가지 농도(40 nM 및 2-배 희석)의 정제된 항체(분취용 SEC 정제된 SMCA 샘플 및 OAA 대조군)를 활성 및 기준 유동 세포 위에 50 μl/분으로 300초간 연속적으로 주입하였고 3600초 해리 기간을 가졌다.　HA 표면을 2주기의 10 mM 글리신 pH 1.5로 120분간 30 μl/분으로 재생시켜 다음 주사 주기를 위한 표면을 준비하였다.　적어도 두 가지 모의-완충액 주사를 기준 설정을 위해 사용할 각각의 피분석물 주사에 대해 수행하였다. 생성된 단일 주기 동역학 센서그램을 Biacore T200 BiaEvaluation 소프트웨어 버전 3.0을 이용하여 분석하고 1:1 결합 모델에 정합시켰다.　
CAT-2200:IL-17 친화성 측정 을 앞서 실시예 6에 기술된 바와 같이 다음의 변형을 가지고 수행하였다: 시험된 항체는 CAT-2200 Fab 대신 분취용 SEC 정제된 SMCA 샘플 및 OAA 대조군이었다. 대조군 항체 13612 중 하나를 출발시 60 nM 대신 10 nM로 주사하였다.
페르투주맙: HER2 친화성 측정 을 다음과 같이 수행하였다. 모든 라인을 25μg/ml 염소 항-인간 IgG, Fcγ 단편 특이적(항-인간 Fc)으로 수평으로 고정하였다. 4058 공명 단위(RU)의 평균을 고정하였다. 항-인간 Fc 항체 포획 표면은 피분석물(수평) 방향으로 100 μl/분에서 140초 동안 주사된 표준 BioRad sNHS/EDC 용액의 1:10 희석에 의해 활성화된 GLC 센서칩을 이용하여 생성하였다. 활성화 직후, 10 mM NaOAc pH 4.5 내 항-인간 Fc 항체의 25μg/mL 용액을 대략 4000 공명 단위(RU)가 고정될 때까지 240초 동안 25 μl/분의 유속으로 피분석물(수직) 방향으로 주사하였다. 잔여 활성 기를 피분석물 방향으로 300초 동안 30 μl/분으로 1M 에탄올아민을 140초 주사하여 퀀칭시켜 블랭크 기준을 위해 모의-활성화 중간스팟이 생성되도록 보장하였다. HER2에 대한 결합을 위한 항체의 선별은 두 단계로 일어났다: 항-인간 IgG (Fcγ 단편 특이적) 표면 상에 리간드 방향으로 항체(분취용 SEC 정제된 SMCA 샘플 및 OAA 대조군)의 간접적 포획 이후 5가지 농도의 정제된 HER2 ECD 및 이중 기준을 위한 하나의 완충액 블랭크를 피분석물 방향으로 동시에 주사. 먼저, 리간드 방향으로 100 μl/분으로 30초 동안 한 회의 완충액 주사를 사용하여 기준선을 안정화하였다. 각각의 항체 포획을 위해, 항체를 PBST 내에 2 μg/ml로 희석하였다. 하나 내지 다섯 가지의 항체 또는 대조군을 개별적인 리간드 통로에 480초동안 25 μl/분 유량으로 동시에 주사하였다. 이는 항-인간 Fc 표면 상에 대략 800-1200 RU의 표획을 도출하였다. 첫 번째 리간드 통로는 필요시 블랭크 대조군으로 사용하기 위해 비워두었다. 이러한 포획 단계는 즉시 기초선을 안정화하기 위한 피분석물 방향으로의 한 차례 완충액 주사로 이어졌고, 이후 100nM, 33.3nM, 11.1nM, 3.7nM 및 0.41nM HER2가 완충액 블랭크와 함께 50 μl/분으로 120초간 동시에 주사되고 300초간 해리 기간을 가졌다. 포획된 항체 표면을 100 μL/분의 두 차례의 0.85% 인산의 18초 펄스로 재생시켜 다음 주사 주기를 위해 준비하였다. 센서그램을 완충액 블랭크 주사 및 인터스팟을 이용하여 정렬 및 이중-기준하였고, 생성된 센서그램을 ProteOn Manager 소프트웨어 v3.1을 이용하여 분석하였다. 이중-기준 센서그램을 Langmuir 결합 모델에 정합시켰다.
이종이합체 항체의 항원 친화성을 각각의 OAA (하나의-팔을 가진) 야생형 대조을 기준으로 하여 평가하였다. 항원 친화성을 또한 야생형 이중특이적 항체에 대해서 수득하였으나; 그러나, WT 이중특이성의 SPR 포획은 불균일해서(예컨대 오류쌍형성된 이종이합체의 포획을 포함), 이를 통해 KD 측정을 간섭할 수 있다. 게다가, 야생형 친화성을 항체에 존재하는 관련 경사슬 태그를 내포하는 OAA 형태로 측정하였다. 태그의 존재는 CD19에 대한 SGN-CD-19a 친화성을 4-5배만큼 감소하는 것으로 관찰되었다(표 19). 예를 들면, 측정된 CD19에 대한 SGN-CD-19a 결합 친화성은 경사슬에의 FLAG 태그의 부가로 인해 67.5 nM에서 224.5 nM로 감소하였다. 그러므로, 야생형에 대한 친화성 변화의 모든 계산은 태깅된 야생형 구조체를 매칭시키는 중간값을 이용하여 수행하였다.
CD-19에 대한 결합을 측정할 때, 일부 항체의 센서그램은 1:1 결합 모델에 정합시킬 수 없었다. 이들 경우에, 항체는 동종이합체를 쉽게 형성하는 많은 양의 'Fc 사슬 B' 반쪽 항체를 내포하였고, 이는 친화성 효과를 야기하고 Fab 결합 거동을 이해하기 어렵게 하였다. 영향을 받은 항체에 있어서, 결합 친화성은 추가로 OAA 형태로 평가되었다.
대부분의 시험된 설계(만들어진 96개의 이중특이적 항체에 상응하는 36개의 설계)는 각각의 야생형의 그것에 필적하는 KD 수치를 나타냈다(표 20 및 21, 도 14). 아홉 개의 설계된 Fab는 WT에 비해 2- 내지 3-배의 감소된 친화성을 나타냈고, 단일 설계된 Fab에서는친화성의 4-배 감소가 관찰되었다. 10가지 Fab 중에서, 단 하나의 설계(#34)만 두 차례 나타났고, 10개의 영향받은 Fab 중 8개는 CR8071였다. 설계를 보유하는 모든 탄두에 있어서 WT로부터 로그(KD)의 평균 차이(-(로그 KD_항체- 로그 KD_wt))는 0.187의 표준 편차를 가지는 0.003였다(예컨대 -0.3은 친화성의 2-배 감소에 해당하고, -0.6은 친화성의 4-배 감소에 해당함). 이들 결과는 시험된 설계에 대해, 모든 시험된 설계("모두"), 또는 파라토프(CAT-2200, 페르투주맙, CR8071, 또는 SGN-CD19a)에 대해 모 항체와 비교한 친화성 변화의 박스 도표를 도시하는 도 14에 요약되었다.
실시예 21: 모 항체에 비교하여 조작된 이중특이적 항체의 초고성능 액체 크로마토그래피 크기 배제 크로마토그래피(UPLC-SEC) 프로파일
조작된 이중특이적 항체의 품질을 평가하기 위해, 실시예 17에서와 같이 분취용 SEC에 의해 정제된 항체를 UPLC-SEC로 처리하였다. UPLC-SEC를 30 °C로 설정하고 PDA 검출기를 갖는 Waters Acquity UPLC 시스템에 고정된 Waters BEH200 SEC 컬럼 (2.5 mL, 4.6 x 150 mm, 스테인리스강, 1.7 μm 입자)을 이용하여 수행하였다. 러닝 시간은 7분 및 2.8 mL의 주사당 총 부피 그리고 0.4 ml/분의 PBS 및 0.02% Tween 20 pH 7.4의 러닝 완충액으로 이루어졌다. 용리를 범위 210-400 nm의 UV 흡광도로 관찰하였고, 크로마토그램을 280 nm로 추출하였다. 피크 통합을 Empower 3 소프트웨어를 이용하여 수행하였다.
도 15a-d는 모 항체의 UPLC-SEC 프로파일을 도시하고 도 15e-g는 세 가지 이중특이적 시스템에서 설계 3972 항체에 상응하는 것들을 도시한다. 예시적인 설계 3972를 여기서 사용하여 높은 이중특이적 함량 (>80%)의 설계된/조작된 이중특이적 항체가 모 항체의 그것에 필적하는 UPLC-SEC 프로파일을 가짐을 증명하였다. 그러한 조작된 이중특이적 항체에 있어서 단량체 종의 중간 백분율은 95.2 %였다(즉 고 분자량 종은 없거나 거의 검출되지 않았음).
본 명세서의 본문에 언급된 모든 참고, 발행된 특허, 특허 출원, 및 서열 접근 번호(예컨대, 유전자은행 접근 번호)는 모든 목적에 있어서 그 전체가 본 명세서에 참고로서 포함된다.
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SEQUENCE LISTING <110> Zymeworks Inc. <120> ANTIGEN-BINDING POLYPEPTIDE CONSTRUCTS COMPRISING KAPPA AND LAMBDA LIGHT CHAINS AND USES THEREOF <130> V810793WO <140> NOT YET ASSIGNED <141> 2016-10-07 <150> US 62/239,206 <151> 2015-10-08 <150> US 62/261,769 <151> 2015-12-01 <160> 20 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic Pertuzumab heavy chain Fab (Domain boundaries: VH; E1 - S119, CH1; A120 - V217, Hinge (partial); E218 - T227) <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr 225 <210> 2 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic Pertuzumab light chain (kappa) (Domain boundaries: VL; D1 - K107, CL; R108 - C214) <400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 3 <211> 226 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic CAT-2200 heavy chain Fab (Domain boundaries: VH; E1 - S118, CH1; A119 - V216, Hinge(partial); E217 - T226) <400> 3 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Leu Ile His Gly Val Thr Arg Asn Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Gln Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr 225 <210> 4 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic CAT-2200 light chain (lambda) (Domain boundaries: VL; N1 - L110, CL; G111 - S216) <400> 4 Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Leu Ala Asn Tyr 20 25 30 Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Ile Val 35 40 45 Ile Phe Ala Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly 65 70 75 80 Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Thr Tyr Asp Pro 85 90 95 Tyr Ser Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 115 120 125 Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr 130 135 140 Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys 145 150 155 160 Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr 165 170 175 Ala 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tgaaaggctt ctatcctagt gatattgctg tggagtggga atcaaatgga 480 cagccagaga acaattacaa gaccacacct ccagtgctgg acagcgatgg cagcttcttc 540 ctgtattcca agctgacagt ggataaatct cgatggcagc aggggaacgt gtttagttgt 600 tcagtgatgc atgaagccct gcacaatcat tacactcaga agagcctgtc cctgtctccc 660 ggcaaa 666 <210> 7 <211> 681 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic Pertuzumab heavy chain Fab <400> 7 gaagtgcagc tggtcgaatc tggaggagga ctggtgcagc caggagggtc cctgcgcctg 60 tcttgcgccg ctagtggctt cacttttacc gactacacca tggattgggt gcgacaggca 120 cctggaaagg gcctggagtg ggtcgccgat gtgaacccaa atagcggagg ctccatctac 180 aaccagcggt tcaagggccg gttcaccctg tcagtggacc ggagcaaaaa caccctgtat 240 ctgcagatga atagcctgcg agccgaagat actgctgtgt actattgcgc ccggaatctg 300 gggccctcct tctactttga ctattggggg cagggaactc tggtcaccgt gagctccgcc 360 tccaccaagg gaccttctgt gttcccactg gctccctcta gtaaatccac atctggggga 420 actgcagccc tgggctgtct ggtgaaggac tacttcccag agcccgtcac agtgtcttgg 480 aacagtggcg ctctgacttc tggggtccac acctttcctg cagtgctgca gtcaagcggg 540 ctgtacagcc tgtcctctgt ggtcaccgtg ccaagttcaa gcctgggaac acagacttat 600 atctgcaacg tgaatcacaa gccatccaat acaaaagtcg acaagaaagt ggaacccaag 660 tcttgtgata aaacccatac a 681 <210> 8 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic Pertuzumab light chain (kappa) <400> 8 gatattcaga tgacccagtc cccaagctcc ctgagtgcct cagtgggcga ccgagtcacc 60 atcacatgca aggcttccca ggatgtgtct attggagtcg catggtacca gcagaagcca 120 ggcaaagcac ccaagctgct gatctatagc gcctcctacc ggtataccgg cgtgccctct 180 agattctctg gcagtgggtc aggaacagac tttactctga ccatctctag tctgcagcct 240 gaggatttcg ctacctacta ttgccagcag tactatatct acccatatac ctttggccag 300 gggacaaaag tggagatcaa gaggactgtg gccgctccct ccgtcttcat ttttccccct 360 tctgacgaac agctgaaaag tggcacagcc agcgtggtct gtctgctgaa caatttctac 420 cctcgcgaag ccaaagtgca gtggaaggtc gataacgctc tgcagagcgg caacagccag 480 gagtctgtga ctgaacagga cagtaaagat tcaacctata gcctgtcaag cacactgact 540 ctgagcaagg cagactacga gaagcacaaa gtgtatgcct gcgaagtcac acatcagggg 600 ctgtcctctc ctgtgactaa gagctttaac agaggagagt gt 642 <210> 9 <211> 678 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic CAT-2200 heavy chain Fab <400> 9 gaggtgcagc tgctggaatc tggggggggc ctggtgcagc ctggggggtc cctgagactg 60 tcatgtgctg ccagcgggtt tactttcagc tcctacgcta tgtcctgggt gcgacaggca 120 cccgggaagg gactggagtg ggtctctgca atcagtgggt caggcgggag tacttactat 180 gccgacagcg tgaagggacg gttcactatc tcaagagata acagcaagaa caccctgtat 240 ctgcagatga acagcctgag agcagaagac acagccgtgt actattgcgc cagggatctg 300 atccacggag tcactcgcaa ttggggccag gggactctgg tgaccgtctc tagtgctagc 360 acaaaggggc cctctgtgtt tccactggcc ccctcaagca aaagcacatc cggaggaact 420 gcagctctgg gatgtctggt gaaggactac ttcccccagc ctgtgaccgt ctcttggaac 480 agtggagccc tgaccagcgg cgtgcacaca tttcctgctg tcctgcagtc ctctggcctg 540 tactccctga gttcagtggt cacagtgcct agctcctctc tggggaccca gacatatatt 600 tgcaacgtga atcataaacc aagcaacact aaggtcgaca agaaagtgga gcccaagagc 660 tgtgataaaa ctcatacc 678 <210> 10 <211> 648 <212> DNA 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gagggccacc 60 ctgtcctgct ctgccagctc cagcgtgagc tacatgcact ggtatcagca gaagccagga 120 caggccccta ggctgctgat ctacgacacc agcaagctgg cctccggcat ccccgcaaga 180 ttcagcggct ccggctctgg cacagacttt accctgacaa tcagctccct ggagcctgag 240 gatttcgccg tgtactattg ttttcagggc agcgtgtatc cattcacctt tggccagggc 300 acaaagctgg agatcaagcg gacagtggcg gcgcccagtg tcttcatttt tccccctagc 360 gacgaacagc tgaagtctgg gacagccagt gtggtctgtc tgctgaacaa cttctaccct 420 agagaggcta aagtgcagtg gaaggtcgat aacgcactgc agtccggaaa ttctcaggag 480 agtgtgactg aacaggactc aaaagatagc acctattccc tgtcaagcac actgactctg 540 agcaaggccg actacgagaa gcataaagtg tatgcttgtg aagtcaccca ccaggggctg 600 agttcaccag tcacaaaatc attcaacaga ggggagtgc 639 <210> 18 <211> 699 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic CR8071 heavy chain Fab <400> 18 caggtgcagc tggtccagtc cggggctgaa gtgaaaaaac ctggggcatc cgtgcgggtg 60 tcatgtcggg caagcgggta tatctttact gagtctggaa tcacctgggt gaggcaggct 120 cccggacagg gactggaatg gatgggatgg atttctggat acagtggcga cacaaagtat 180 gcacagaaac tgcagggccg cgtcaccatg acaaaggata cttcaaccac aactgcctac 240 atggagctgc ggagcctgag atatgacgat acagccgtgt actattgcgc ccgggacgtg 300 cagtacagcg ggtcctacct gggggcatac tacttcgatt actggtcacc tggaactctg 360 gtcaccgtct cttcagctag caccaagggc ccttctgtgt ttccactggc accctcaagc 420 aaaagcacct ccggaggaac agcagcactg ggatgtctgg tcaaggacta tttccccgag 480 cctgtgaccg tctcatggaa tagcggcgca ctgactagtg gggtgcacac ctttcccgcc 540 gtcctgcagt cctctgggct gtacagcctg agttcagtgg tcacagtgcc aagctcctct 600 ctgggaactc agacctatat ctgcaacgtc aatcataaac ccagcaacac aaaggtcgac 660 aagaaagtgg agcccaagag ctgtgataaa actcatacc 699 <210> 19 <211> 648 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic CR8071 light chain (lambda) <400> 19 cagagcgtcc tgactcagcc tccctccgcc tccggaacac ctgggcagag agtgactatc 60 tcctgtagcg gatcaagctc aaacattgga accaactacg tgtattggta ccagcagttc 120 cccggcacag ctcctaagct gctgatctat cggagctacc agagaccaag cggggtcccc 180 gacaggtttt ctggcagtaa atcagggagc tccgccagcc tggctatttc cggcctgcag 240 tctgaggacg aagcagatta ctattgcgcc acctgggacg attccctgga tggatgggtc 300 ttcggcggcg gcacaaaact gaccgtcctg aggcagccaa aggcggcgcc cagtgtcaca 360 ctgtttcccc ctagctccga ggaactgcag gctaacaaag caacactggt gtgtctgatc 420 agcgacttct accctggagc tgtgactgtc gcctggaagg ctgattctag tccagtgaaa 480 gcaggcgtcg agaccacaac tccctctaag cagagtaaca acaagtacgc agcctcaagc 540 tatctgtcac tgaccccaga acagtggaag agccaccgga gctattcctg ccaggtcact 600 cacgaaggct ccactgtcga gaaaaccgtc gctcccaccg aatgttca 648 <210> 20 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic variant Human IgG1 Fc sequence 231-447 (EU-numbering), without hinge <220> <221> MISC_FEATURE <222> (120)..(120) <223> Xaa is Thr or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (121)..(121) <223> Xaa is Leu or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (136)..(136) <223> Xaa is Thr or Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (160)..(160) <223> Xaa is Asn or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (162)..(162) <223> Xaa is Lys, Met or Leu <220> <221> 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Xaa 145 150 155 160 Tyr Xaa Thr Xaa Pro Pro Val Leu Asp Xaa Asp Gly Ser Phe Xaa Leu 165 170 175 Xaa Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215

Claims (44)

  1. 제1 이종이합체 및 제2 이종이합체를 포함하는 항원-결합 폴리펩티드 구조체이되,
    제1 이종이합체(H1L1)는 제1 면역글로불린 중사슬 폴리펩티드 서열(H1), 및 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1 Fab 영역을 형성하는 면역글로불린 람다 경사슬 폴리펩티드 서열(L1)을 포함하고; 제2 이종이합체(H2L2)는 제2 면역글로불린 중사슬 폴리펩티드 서열(H2), 및 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 Fab 영역을 형성하는 면역글로불린 카파 경사슬 폴리펩티드 서열(L2)을 포함하고,
    여기서,
    H1은 H2와 구별되며, H1 및 H2는 각각 중사슬 가변 도메인(VH 도메인) 및 중사슬 불변 도메인 1(CH1 도메인)을 포함하고;
    L1은 람다 경사슬 가변(VL-람다) 도메인 및 람다 경사슬 불변(CL-람다) 도메인을 포함하고, L2는 카파 경사슬 가변(VL-카파) 도메인 및 카파 경사슬 불변(CL-카파) 도메인을 포함하며;
    H1, H2, L1, 및 L2 중 하나 이상은 상응하는 야생형 H1, H2, L1, 및 L2 폴리펩티드 서열에 비해, H1의 L2보다 L1과의 우선적 쌍 형성을 촉진하고/거나 H2의 L1보다 L2와의 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 변형을 포함하고, 여기서 아미노산 변형은 자연발생적 시스테인 잔기를 제거하지 않는, 항원-결합 폴리펩티드 구조체.
  2. 제1항에 있어서, H1, H2, L1 및 L2가 세포 또는 포유류 세포에서 동시-발현되는 경우, 또는 H1, H2, L1 및 L2가 무-세포 발현 시스템에서 동시-발현되는 경우, 또는 H1 및 L1이 한 세포에서 생산되고 H2 및 L2가 다른 세포에서 생산되며 두 세포의 산물이 산화환원 생산 방법을 통해 혼합되는 경우, 또는 H1 및 L1이 하나의 무-세포 발현 시스템에서 생산되고 H2 및 L2가 다른 무-세포 발현 시스템에서 생산되며 두 무-세포 발현 시스템의 산물이 혼합되는 경우, 아미노산 변형이 H1의 L2보다 L1과의 우선적 쌍 형성을 촉진하고/거나 H2의 L1보다 L2와의 우선적 쌍 형성을 촉진하는, 구조체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 각각의 이종이합체가 단일 Fab를 포함하는, 항원-결합 폴리펩티드 구조체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    a. H2는 위치 143에 아미노산 치환을 포함하고; L2는 위치 124에 아미노산 치환을 포함하고;
    i. H1은 위치 186 또는 179에 아미노산 치환을 포함하고, L1은 위치 180에 아미노산 치환을 포함하거나;
    ii. H1은 위치 186에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 133에 아미노산 치환을 포함하거나;
    iii. H1은 위치 143에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 133에 아미노산 치환을 포함하거나; 또는
    iv. H1은 위치 188에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 178에 아미노산 치환을 포함하거나;
    b. H1은 위치 143에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 131에 아미노산 치환을 포함하고;
    i. H2는 위치 186 또는 124_186에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 133 또는 133_160 또는 124_133 또는 176_180에 아미노산 치환을 포함하거나; 또는
    ii. H2는 위치 188에 아미노산 치환을 포함하고; L2는 위치 131에 아미노산 치환을 포함하거나;
    iii. H2는 위치 143에 아미노산 치환을 포함하고; L2는 위치 124_133 또는 124_133_180에 아미노산 치환을 포함하거나;
    c. H1은 위치 143에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 131에 아미노산 치환을 포함하고;
    i. H2는 위치 124_186 또는 124_179 또는 188에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 176_178 또는 176_180 또는 131에 아미노산 치환을 포함하거나; 또는
    ii. H2는 위치 143_188 또는 143 또는 124_143에 아미노산 치환을 포함하고; L2는 위치 124_176_178 또는 124_178 또는 124_180 또는 124_176_180, 또는 124, 또는 124_176에 아미노산 치환을 포함하거나;
    d. H1은 위치 179, 186, 143 및/또는 188에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 180, 133 및/또는 176_178에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 143에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 131 및/또는 124에 아미노산 치환을 포함하거나;
    e. H1은 위치 39에 아미노산 치환을 포함하거나 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 치환을 포함하지 않고; L1은 위치 38에 아미노산 치환을 포함하거나 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 치환을 포함하지 않고; H2는 위치 39에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 38에 아미노산 치환을 포함하거나;
    f. H1은 위치 143에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 131에 아미노산 치환을 포함하고;
    i. H2는 위치 188 또는 124_186에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 176_178 또는 176_180 또는 131에 아미노산 치환을 포함하거나; 또는
    ii. H2는 위치 143 또는 186에 아미노산 치환을 포함하고; L2는 위치 124_133 또는 124_133_180에 아미노산 치환을 포함하거나;
    g. H1은 위치 188에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 176_178 또는 178에 아미노산 치환을 포함하고;
    i. H2는 위치 177_188에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 176_178에 아미노산 치환을 포함하거나; 또는
    ii. H2는 위치 186 또는 124 또는 124_179에 아미노산 치환을 포함하고; L2는 위치 176 또는 131_176에 아미노산 치환을 포함하거나;
    h. H1은 위치 186에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 133에 아미노산 치환을 포함하고;
    i. H2는 위치 188에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 131에 아미노산 치환을 포함하거나; 또는
    ii. H2는 위치 177_188에 아미노산 치환을 포함하고; L2는 위치 176_178에 아미노산 치환을 포함하거나; 또는
    H1은 위치 124_190에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 135에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 124 또는 188에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 176 또는 176_178에 아미노산 치환을 포함하거나;
    i. H1은 위치 177_188에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 176_178에 아미노산 치환을 포함하고;
    i. H2는 위치 188에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 176_178 또는 131에 아미노산 치환을 포함하거나;
    ii. H2는 위치 186에 아미노산 치환을 포함하고; L2는 위치 133 또는 124_160_180에 아미노산 치환을 포함하거나;
    iii. H2는 위치 124 또는 124_179 또는 124_186에 아미노산 치환을 포함하고; L2는 위치 176 또는 176_178 또는 176_180에 아미노산 치환을 포함하거나; 또는
    iv. H2는 위치 143에 아미노산 치환을 포함하고; L2는 위치 133 또는 124_133에 아미노산 치환을 포함하거나;
    j. H1은 위치 188에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 178에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 124 또는 188에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 176_178 또는 176_180 또는 176에 아미노산 치환을 포함하거나;
    k. H1은 위치 145_188에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 178에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 124 및/또는 188에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 124, 133, 및 178 중 하나 이상에 아미노산 치환을 포함하거나;
    l. H1은 위치 174, 179 또는 186에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 176 또는 180에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 143 또는 190에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 131, 135 또는 124에 아미노산 치환을 포함하거나; 또는
    m. H1은 위치 174에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 176에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 190에 아미노산 치환을 포함하고; L2는 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 치환을 포함하지 않거나 위치 135에 아미노산 치환을 포함하거나;
    n. H1은 위치 143_190에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 133에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 124에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 131_135에 아미노산 치환을 포함하거나;
    o. H1은 위치 143 및/또는 186에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 133에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 124에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 131에 아미노산 치환을 포함하거나;
    p. H1은 위치 143_179에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 124_178에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 186에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 178_180 또는 160_180에 아미노산 치환을 포함하거나;
    q. H1은 위치 143에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 124에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 179 또는 186에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 124_160_180에 아미노산 치환을 포함하거나;
    r. H1은 위치 186에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 180 또는 178_180에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 143 및/또는 179에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 124_178 또는 131에 아미노산 치환을 포함하거나;
    s. H1은 위치 179에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 180에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 143에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 124에 아미노산 치환을 포함하거나;
    t. H1은 위치 143 또는 186에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 180에 아미노산 치환을 포함하거나 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 치환을 포함하지 않고; H2는 위치 143_145에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 124에 아미노산 치환을 포함하거나;
    u. H1은 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 치환을 포함하지 않고; L1은 위치 135에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 139에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 116에 아미노산 치환을 포함하거나;
    v. H1은 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 치환을 포함하지 않거나 위치 45에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 치환을 포함하지 않고; H2는 위치 45에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 44에 아미노산 치환을 포함하거나;
    w. H1은 위치 139에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 116에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 치환을 포함하지 않고, L2는 위치 135에 아미노산 치환을 포함하거나; 또는
    x. H1은 위치 124에 아미노산 치환을 포함하고; L1은 위치 176에 아미노산 치환을 포함하고; H2는 위치 124에 아미노산 치환을 포함하고, L2는 위치 176에 아미노산 치환을 포함하는, 항원-결합 폴리펩티드 구조체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원에 대한 제1 Fab 영역의 친화성은 제1 항원에 대한 상응하는 야생형 H1 및 L1 폴리펩티드 서열에 의해 형성된 Fab 영역의 친화성의 약 100-배 이내이고/거나, 제2 항원에 대한 제2 Fab 영역의 친화성은 제2 항원에 대한 상응하는 야생형 H2 및 L2 폴리펩티드 서열에 의해 형성된 Fab 영역의 친화성의 약 100-배 이내인, 항원-결합 폴리펩티드 구조체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 Fab 영역의 용해 온도(Tm)는 제1 항원에 대한 상응하는 야생형 H1 및 L1 폴리펩티드 서열에 의해 형성된 Fab 영역의 Tm의 약 20℃ 이내이고/거나, 제2 Fab 영역의 용해 온도(Tm)는 제2 항원에 대한 상응하는 야생형 H2 및 L2 폴리펩티드 서열에 의해 형성된 Fab 영역의 Tm의 약 20℃ 이내인, 항원-결합 폴리펩티드 구조체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    a. H1 및 L1은 야생형 폴리펩티드 서열이고, H2 및 L2는 각각 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하거나;
    b. H1, L1, 및 H2 중 하나 이상은 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하고, L2는 야생형 폴리펩티드 서열이거나;
    c. H1, L1, 및 L2 중 하나 이상은 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하고, H2는 야생형 폴리펩티드 서열이거나;
    d. H1, H2, 및 L2 중 하나 이상은 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하고, L1은 야생형 폴리펩티드 서열이거나;
    e. L1, H2, 및 L2 중 하나 이상은 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하고 H1은 야생형 폴리펩티드 서열이거나; 또는
    f. H1, L1, H2, 및 L2는 각각 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하는, 항원-결합 폴리펩티드 구조체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 변형은
    a. H1의 CH1 도메인 중 적어도 둘, H2의 CH1 도메인, L1의 CL-람다 도메인 및 L2의 CL-카파 도메인;
    b. H1 및 H2의 CH1 및 VH 도메인 중 적어도 둘, L1의 CL-람다 도메인 및 VL-람다 도메인, 및 L2의 CL-카파 도메인 및 VL-카파 도메인, 또는
    c. H1의 VH 도메인 중 적어도 둘, H2의 VH 도메인, L1의 VL-람다 도메인, 및 L2의 VL-카파 도메인 내에 있는, 항원-결합 폴리펩티드 구조체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, H1, L1, H2, 및/또는 L2는 각각 Fab 영역 내에 적어도 1개의 아미노산 변형을 포함하는, 구조체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, H1, H2, L1 및 L2 중 적어도 하나는 적어도 하나의 불변 도메인 및/또는 적어도 하나의 가변 도메인의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 변형을 포함하는, 구조체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 변형은 H1의 L2보다 L1과의 우선적 쌍 형성을 촉진하여 H1L1을 형성하거나, 또는 H2의 L1보다 L2와의 우선적 쌍 형성을 촉진하여 H2L2를 형성함으로써, H1L1 또는 H2L2 중 적어도 하나의 상대적인 쌍 형성은 야생형에 비해 적어도 약 10% 더 많고, 다른 것의 상대적인 쌍 형성은 야생형의 약 10% 이내 또는 야생형에 비해 적어도 약 10% 더 많게 되는, 구조체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 Fab 영역의 열 안정성은 상응하는 야생형 H1 및 L1 폴리펩티드 서열에 의해 형성된 Fab 영역의 Tm의 약 0, 1, 2, 또는 3℃ 이내이고/거나, 제2 Fab 영역의 열 안정성은 상응하는 야생형 H2 및 L2 폴리펩티드 서열에 의해 형성된 Fab 영역의 Tm의 약 0, 1, 2, 또는 3℃ 이내인, 구조체.
  13. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 변형은 표 10-A1 내지 10-A12 중 하나 이상에 나타난 고유한 식별자 Mab 설계 집합으로 이루어진 군에서 선택된, 구조체.
  14. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 변형은 표 10-B1 내지 10-B10 중 하나 이상에 나타난 고유한 식별자 Mab 설계 집합으로 이루어진 군에서 선택된, 구조체.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, CH3 도메인 서열을 각각 포함하고 링커로 또는 링커 없이 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역 중 하나에 커플링된 2개의 Fc 폴리펩티드를 가지는 이량체 Fc를 추가로 포함하는 구조체.
  16. 제15항에 있어서, Fc는 인간 Fc, 인간 IgG1 Fc, 인간 IgA Fc, 인간 IgG Fc, 인간 IgD Fc, 인간 IgE Fc, 인간 IgM Fc, 인간 IgG2 Fc, 인간 IgG3 Fc, 또는 인간 IgG4 Fc인, 구조체.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, Fc는 야생형에 비해 하나 이상의 변형을, 이종이합체 Fc의 형성을 촉진하는 CH3 도메인 서열 중 적어도 하나에 포함하는, 구조체.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, Fc는
    i) 제1 Fc 폴리펩티드 내에 변형 L351Y_F405A_Y407V, 및 제2 Fc 폴리펩티드 내에 변형 T366L_K392M_T394W를 가지는 이종이합체 IgG1 Fc;
    ii) 제1 Fc 폴리펩티드 내에 변형 L351Y_F405A_Y407V, 및 제2 Fc 폴리펩티드 내에 변형 T366L_K392L_T394W를 가지는 이종이합체 IgG1 Fc;
    iii) 제1 Fc 폴리펩티드 내에 변형 T350V_L351Y_F405A_Y407V, 및 제2 Fc 폴리펩티드 내에 변형 T350V_T366L_K392L_T394W를 가지는 이종이합체 IgG1 Fc;
    iv) 제1 Fc 폴리펩티드 내에 변형 T350V_L351Y_F405A_Y407V, 및 제2 Fc 폴리펩티드 내에 변형 T350V_T366L_K392M_T394W를 가지는 이종이합체 IgG1 Fc; 또는
    v) 제1 Fc 폴리펩티드 내에 변형 T350V_L351Y_S400E_F405A_Y407V, 및 제2 Fc 폴리펩티드 내에 변형 T350V_T366L_N390R_K392M_T394W를 가지는 이종이합체 IgG1 Fc를 포함하는, 구조체.
  19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, Fc는 추가로 적어도 하나의 CH2 도메인 서열을 포함하는, 구조체.
  20. 제19항에 있어서, H1, L1, H2 및 L2가 동시-발현되는 경우,
    a) H1L1 및 H2L2 쌍 형성의 합으로 측정되는 올바른 쌍 형성의 총량의 변화가 우선적 쌍 형성을 촉진하는 Fab 영역 내 아미노산 치환이 없는 상응하는 H1, L1, H2 및 L2 폴리펩티드 사슬의 쌍 형성에 비해 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 또는 45%를 초과하거나;
    b) 생성된 반쪽-항체가 아닌 종류의 백분율로서 생성된 이중특이적 항체의 양으로 측정되는 올바른 쌍 형성의 총량의 변화가 우선적 쌍 형성을 촉진하는 Fab 영역 내 아미노산 치환이 없는 상응하는 H1, L1, H2 및 L2 폴리펩티드 사슬의 쌍 형성에 비해 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 또는 80%를 초과하거나; 또는
    c) 생성된 모든 종류의 백분율로서 생성된 이중특이적 항체의 양으로 측정되는 올바른 쌍 형성의 총량의 변화가 우선적 쌍 형성을 촉진하는 Fab 영역 내 아미노산 치환이 없는 상응하는 H1, L1, H2 및 L2 폴리펩티드 사슬의 쌍 형성에 비해 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 또는 80%를 초과하는, 구조체.
  21. 제20항에 있어서, Fc는 Fc-감마 수용체의 선택적 결합을 촉진하거나, Fc-감마 수용체에 대한 결합을 감소 또는 제거하거나, 또는 FcRn에 대한 결합을 촉진하는 하나 이상의 변형을 포함하는, 구조체.
  22. 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 링커는 하나 이상의 폴리펩티드 링커인, 구조체.
  23. 제22항에 있어서, 링커는 하나 이상의 항체 경첩 부위를 포함하는, 구조체.
  24. 제23항에 있어서, 링커는 하나 이상의 IgG1 경첩 부위를 포함하는, 구조체.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 하나 이상의 폴리펩티드 링커는 야생형 폴리펩티드 링커에 비해 하나 이상의 변형을 포함하는, 구조체.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 변형은 아미노산 치환인, 구조체.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, H1, H2, L1, 및 L2의 각각의 서열은 인간 서열 또는 인간화된 서열로부터 유래된, 구조체.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제 또는 약물에 공액결합된 구조체.
  29. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 구조체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 집합.
  30. 제29항에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 집합 중 하나 이상을 포함하는 벡터 또는 벡터의 집합.
  31. 제30항에 있어서, 벡터 또는 벡터의 집합 중 적어도 하나의 벡터는 다중-시스트론성(multi-cistronic)인, 벡터 또는 벡터의 집합.
  32. 제29항에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 집합, 또는 제30항 또는 제31항의 벡터 또는 벡터의 집합을 포함하는 단리된 세포.
  33. 제32항에 있어서, 효모 세포, 박테리아 세포, 곤충 세포, 또는 포유류 세포인, 단리된 세포.
  34. 제33항에 있어서, 제30항 또는 제31항의 벡터 또는 벡터의 집합으로 안정하게 형질주입되거나 일시적으로 형질주입된, 단리된 세포.
  35. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항의 항원-결합 폴리펩티드 구조체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  36. 제35항에 있어서, 완충액, 항산화제, 저분자량 분자, 약물, 단백질, 아미노산, 탄수화물, 지질, 킬레이트제, 안정화제, 및 부형제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질을 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
  37. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 구조체를 제조하는 방법이되,
    (d) 항원-결합 폴리펩티드 구조체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 집합을 포함하는 숙주 세포를 수득하는 단계;
    (e) 항원-결합 폴리펩티드 구조체의 발현을 허용하는 조건 하에 숙주 세포 배양물에서 숙주 세포를 배양하는 단계, 및
    (f) 숙주 세포 배양물로부터 항원-결합 폴리펩티드 구조체를 수집하는 단계를 포함하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 숙주 세포는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 집합으로 일시적으로 형질주입되거나 안정하게 형질주입된, 방법.
  39. 제1 면역글로불린 중사슬 폴리펩티드 서열(H1) 및 제1 면역글로불린 람다 경사슬 폴리펩티드 서열(L1)을 포함하는 제1 이종이합체; 및 제2 면역글로불린 중사슬 폴리펩티드 서열(H2) 및 제2 면역글로불린 카파 경사슬 폴리펩티드 서열(L2)을 포함하는 제2 이종이합체 내 상보적 아미노산 변형을 나타내는 데이터를 포함하는 데이터 집합을 저장하는 컴퓨터-판독가능한 저장 매체이되, 여기서 H1 및 H2는 각각 적어도 중사슬 가변 도메인(VH 도메인) 및 중사슬 불변 도메인(CH1 도메인)을 포함하고 서로 구별되며; L1 및 L2는 각각 적어도 경사슬 가변 도메인(VL 도메인) 및 경사슬 불변 도메인(CL 도메인)을 포함하고, 상보적 아미노산 변형은 H1의 L2보다 L1과의 우선적 쌍 형성 및 H2의 L1보다 L2와의 우선적 쌍 형성을 촉진하고, 데이터 집합은 표 10-A1 내지 10-A12 또는 표 10-B1 내지 10-B10 중 하나 이상에 나열된 변형들 또는 이들 변형의 하위 집합을 나타내는 데이터를 포함하는, 컴퓨터-판독가능한 저장 매체.
  40. 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체를 제조하는 방법이되, 구조체는
    a. 제1 면역글로불린 중사슬 폴리펩티드 서열(H1) 및 제1 면역글로불린 람다 경사슬 폴리펩티드 서열(L1)을 포함하는 제1 이종이합체; 및
    b. 제2 면역글로불린 중사슬 폴리펩티드 서열(H2) 및 제2 면역글로불린 카파 경사슬 폴리펩티드 서열(L2)을 포함하는 제2 이종이합체를 포함하고,
    여기서 H1 및 H2는 각각 적어도 중사슬 가변 도메인(VH 도메인) 및 중사슬 불변 도메인(CH1 도메인)을 포함하고 서로 구별되며; L1 및 L2는 각각 경사슬 가변 도메인(VL 도메인) 및 경사슬 불변 도메인(CL 도메인)을 포함하고, 여기서 H1, L1, H2, 및 L2 중 하나 이상은 H1의 L2보다 L1과의 우선적 쌍 형성 및 H2의 L1보다 L2와의 우선적 쌍 형성을 촉진하는 아미노산 변형을 포함하며,
    방법은
    a. 제37항의 데이터 집합으로부터의 하나 이상의 상보적 아미노산 변형을 H1, L1, H2 및/또는 L2 내로 도입하는 단계; 및
    b. 숙주 세포에서 H1, L1, H2 및 L2를 동시-발현시켜 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체를 포함하는 발현 산물을 제조하는 단계를 포함하는, 방법.
  41. 제40항에 있어서, 발현 산물 내에서 다른 폴리펩티드 산물에 비한 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체의 양을 확인하여 야생형 H1, L1, H2 및 L2의 동시-발현으로 생성된 발현 산물 내 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체의 양에 비해 증가된 양의 이중특이적 항원-결합 폴리펩티드 구조체를 제공하는 상보적 아미노산 변형의 바람직한 하위 집합을 선별하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서, 구조체는 적어도 2개의 CH3 도메인 서열을 포함하는 Fc를 포함하며, 여기서 Fc는 하나 이상의 링커로 또는 링커 없이 제1 이종이합체 및 제2 이종이합체에 커플링된, 방법.
  43. 제42항에 있어서, Fc는 동종이합체 Fc 보다 이종이합체 Fc의 형성을 촉진하는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 이종이합체 Fc인, 방법.
  44. 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, H1, L1, H2 및 L2가 동시-발현되는 경우,
    a) %H1L1 및 %H2L2의 합으로 측정되는 올바른 쌍 형성의 총량의 변화가 우선적 쌍 형성을 촉진하는 Fab 영역 내 아미노산 치환이 없는 상응하는 H1, L1, H2 및 L2 폴리펩티드 사슬의 쌍 형성에 비해 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 또는 45%를 초과하거나;
    b) 생성된 반쪽-항체가 아닌 종류의 백분율로서 생성된 이중특이적 항체의 양으로 측정되는 올바른 쌍 형성의 총량의 변화가 우선적 쌍 형성을 촉진하는 Fab 영역 내 아미노산 치환이 없는 상응하는 H1, L1, H2 및 L2 폴리펩티드 사슬의 쌍 형성에 비해 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 또는 80%를 초과하거나; 또는
    c) 생성된 모든 종류의 백분율로서 생성된 이중특이적 항체의 양으로 측정되는 올바른 쌍 형성의 총량의 변화가 우선적 쌍 형성을 촉진하는 Fab 영역 내 아미노산 치환이 없는 상응하는 H1, L1, H2 및 L2 폴리펩티드 사슬의 쌍 형성에 비해 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 또는 80%를 초과하는, 방법.
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