TW202103733A - 抗cd40抗體及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及專一性結合CD40的新型抗體和抗體片段以及含有所述抗體或抗體片段的組成物、藥物、組合產品和試劑盒。此外，本發明涉及編碼所述抗體或其抗體片段的核酸及包含其的宿主細胞，以及相關用途。此外，本發明涉及這些抗體和抗體片段的治療和診斷用途。

Description

抗CD40抗體及其用途
本發明涉及專一性結合CD40的新型抗體和抗體片段以及含有所述抗體或抗體片段的組成物，以及藥物、組合產品或試劑盒。此外，本發明涉及編碼所述抗體或其抗體片段的核酸及包含其的宿主細胞，以及相關用途。此外，本發明涉及這些抗體和抗體片段的治療和診斷用途。
T細胞的完全活化需要兩個訊息：抗原呈現細胞(APC)對腫瘤抗原進行攝取、加工，形成MHC-抗原複合物，呈現給T細胞並與T細胞表面的TCR結合，這是T細胞活化的第一訊息；第二或共刺激訊息則是透過CD28與B7-1 (CD80)/B7-2 (CD86)，以及共刺激因子CD40、OX40、GITR等與其配體相互作用來傳遞(Smith-Garvin, J.E., G.A. Koretzky, and M.S. Jordan, T cell activation. Annu Rev Immunol, 2009. 27：p. 591-619)。在缺乏共刺激訊息時，T細胞可能發生無反應性(無反應力)或抗原刺激後的細胞程式性死亡(細胞凋亡)。
CD40是TNF受體(TNFR)超家族的成員，主要表現在B細胞、樹突狀細胞(DC細胞)、單核細胞和巨噬細胞等多種抗原呈現細胞上(Grewal, I.S. and R.A. Flavell, CD40 and CD154 in cell-mediated immunity.Annu Rev Immunol , 1998. 16: p. 111-35)。CD40在細胞表面形成三聚體，相應配體CD40L (即CD154)主要表現於活化的T細胞表面。CD40和CD40L的相互作用是T細胞活化的共刺激訊息。根據特定的細胞類型，CD40參與作用導致特定的基因表現模式。T細胞上CD40L與CD40的結合可以活化多種途徑，包括NF-κB (核因子κB)，MAPK (絲裂原活化蛋白激酶)和STAT3 (訊息轉導與轉錄活化因子3)等(Rothe, M.,et al. , TRAF2-mediated activation of NF-kappa B by TNF receptor 2 and CD40.Science , 1995. 269(5229): p. 1424-7)。
CD40不僅由正常的免疫細胞表現，同時也由許多惡性細胞表現。具體而言，CD40在以下疾病中過度表現：B細胞NHL、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、多毛細胞白血病(HCL)、何杰金氏淋巴瘤、多發性骨髓瘤以及膀胱癌、腎癌、卵巢癌、子宮頸癌、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌和惡性黑色素瘤等(Hassan, S.B.,et al. , Anti-CD40-mediated cancer immunotherapy: an update of recent and ongoing clinical trials.Immunopharmacol Immunotoxicol , 2014. 36(2): p. 96-104)。
CD40激動劑抗體可以透過多種機制對抗腫瘤細胞：第一，CD40激動劑抗體透過活化免疫系統，媒介更強的抗腫瘤效應。具體而言，CD40激動劑抗體可以活化DC細胞增加其抗原呈現能力，這表現在共刺激分子，如B7家族(CD80, CD86)的表現增加，以及促進細胞激素分泌，如介白素12，這將導致顯著的T細胞反應(Fong, L. and E.G. Engleman, Dendritic cells in cancer immunotherapy.Annu Rev Immunol , 2000. 18: p. 245-73)；CD40激動劑抗體可以促進休止狀態的B細胞的增殖、免疫球蛋白類別轉變、抗體分泌，並且對生發中心的發展和記憶性B細胞的存活都有影響，所有這一切都是體液免疫反應必不可少的(Beatty, G.L., Y. Li, and K.B. Long, Cancer immunotherapy: activating innate and adaptive immunity through CD40 agonists.Expert Rev Anticancer Ther , 2017. 17(2): p. 175-186)。第二，CD40激動劑抗體與腫瘤細胞表面表現的CD40結合後，媒介抗體依賴性細胞毒性(ADCC)作用，由殺手細胞直接清除高度表現CD40的腫瘤細胞(Vonderheide, R.H. and M.J. Glennie, Agonistic CD40 antibodies and cancer therapy.Clin Cancer Res , 2013. 19(5): p. 1035-43)。第三，CD40激動劑抗體與腫瘤細胞表面表現的CD40結合後，直接抑制腫瘤的生長並促進其凋亡，例如CD40/CD40L訊息傳遞途徑可阻斷腫瘤細胞的細胞週期，使細胞停止於G2-M期，CD40/CD40L的相互反應還可促進腫瘤細胞表面Fas表現上升，透過Fas/FasL訊息傳遞途徑抑制高度表現CD40腫瘤細胞生長並促進其凋亡(Eliopoulos, A.G., et al., CD40 induces apoptosis in carcinoma cells through activation of cytotoxic ligands of the tumor necrosis factor superfamily.Mol Cell Biol , 2000. 20(15): p. 5503-15)。
CD40的激動劑抗體按照其激動方式不同可分兩類，第一類CD40激動活性不依賴Fc受體的交聯(如CP-870893和CDX-1140)，儘管前者顯示出令人鼓舞的抗癌療效，但是存在劑量限制性毒性，會導致全身免疫功能的失調、靜脈血栓性栓塞症和細胞激素釋放症候群(Cytokine Release Syndrome, CRS)的發生；另一類需要Fc受體交聯才具有CD40激動活性。腫瘤組織及周圍引流淋巴結有更多腫瘤相關發炎細胞的存在，FcγR2b受體在腫瘤細胞周圍有更多聚集。因此，這樣的“交聯抗體”激動劑就具有了更高的組織選擇性，在腫瘤微環境中抗體才能產生明顯的激動作用，而在身體正常組織部位，作用能力會保持在低位準，這樣就能提高治療的安全窗。
因此，儘管在本領域中已存在一些CD40抗體，例如輝瑞製藥的CP870893，但是仍然需要一些新的具有與現有抗體相當或更佳性質的CD40抗體，特別是依賴於Fc受體交聯的CD40抗體，尤其是具有更佳抗癌性質且安全性更高的抗體。
本發明因此提供了一種新的結合CD40 (特別是人CD40或恆河猴CD40)的抗體，以及其抗原結合片段。
在一些實施方案中，本發明的抗CD40抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)，其中所述VH包含 (i)    如SEQ ID NO:13、58、60、62或14所示的VH中所含的三個互補決定區域(CDR) HCDR1、HCDR2和HCDR3，或 (ii)   相對於(i)的序列，在所述三個CDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(優選胺基酸置換，優選保守置換)的序列，或 (iii) 相對於(i)的序列，在HCDR3上包含至少一個且不超過3、2或1個胺基酸改變(優選地胺基酸置換，優選地保守置換)。
在一些實施方案中，本發明的抗CD40抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區(VL)，其中所述VL包含： (i)    如SEQ ID NO:15、64、66或16所示的VL中所含的三個互補決定區域(CDR) LCDR1、LCDR2和LCDR3；或 (ii)   相對於(i)的序列，在所述三個CDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(優選胺基酸置換，優選保守置換)的序列，或 (iii) 相對於(i)的序列，在LCDR3上包含至少一個且不超過3、2或1個胺基酸改變(優選地胺基酸置換，優選地保守置換)。
在一些實施方案中，本發明的抗CD40抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，其中 (a) 所述VH包含 (i)    如SEQ ID NO:13、58、60、62或14所示的VH中所含的三個互補決定區域(CDR) HCDR1、HCDR2和HCDR3，或 (ii)   相對於(i)的序列，在所述三個CDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(優選胺基酸置換，優選保守置換)的序列； (iii) 相對於(i)的序列，在HCDR3上包含至少一個且不超過3、2或1個胺基酸改變(優選地胺基酸置換，優選地保守置換)；和/或 (b)所述VL包含： (i)    如SEQ ID NO:15、64、66或16所示的VL中所含的三個互補決定區域(CDR) LCDR1、LCDR2和LCDR3；或 (ii)   相對於(i)的序列，在所述三個CDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(優選胺基酸置換，優選保守置換)的序列；或 (iii) 相對於(i)的序列，在LCDR3上包含至少一個且不超過3、2或1個胺基酸改變(優選地胺基酸置換，優選地保守置換)。
在一些實施方案中，本發明的抗CD40抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區VH和/或輕鏈可變區VL，其中 (a) 所述VH包含 (i) 如SEQ ID NO:13、58、60或62所示的VH中所含的三個互補決定區域(CDR) HCDR1、HCDR2和HCDR3，或 (ii)   相對於(i)的序列，在所述三個CDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(優選胺基酸置換，優選保守置換)的序列； (iii) 相對於(i)的序列，在HCDR3上包含至少一個且不超過3、2或1個胺基酸改變(優選地胺基酸置換，優選地保守置換)；和/或 (b)所述VL包含： (i)    如SEQ ID NO:15、64或66所示的VL中所含的三個互補決定區域(CDR) LCDR1、LCDR2和LCDR3；或 (ii)   相對於(i)的序列，在所述三個CDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(優選胺基酸置換，優選保守置換)的序列；或 (iii) 相對於(i)的序列，在LCDR3上包含至少一個且不超過3、2或1個胺基酸改變(優選地胺基酸置換，優選地保守置換)。
在一些實施方案中，本發明的抗CD40抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，其中 (a)   所述VH包含 (i)    如SEQ ID NO:14所示的VH中所含的三個互補決定區域(CDR) HCDR1、HCDR2和HCDR3，或 (ii)   相對於(i)的序列，在所述三個CDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(優選胺基酸置換，優選保守置換)的序列； (iii) 相對於(i)的序列，在HCDR3上包含至少一個且不超過3、2或1個胺基酸改變(優選地胺基酸置換，優選地保守置換)；和/或 (b)所述VL包含： (i)    如SEQ ID NO:16所示的VL中所含的三個互補決定區域(CDR) LCDR1、LCDR2和LCDR3；或 (ii)   相對於(i)的序列，在所述三個CDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(優選胺基酸置換，優選保守置換)的序列；或 (iii) 相對於(i)的序列，在LCDR3上包含至少一個且不超過3、2或1個胺基酸改變(優選地胺基酸置換，優選地保守置換)。
在優選的實施方案中，VH包含選自SEQ ID NO:13、58、60、62或14所示的胺基酸序列，或由所述胺基酸序列組成。
在優選的實施方案中，VL包含選自SEQ ID NO:15、64、66或16所示的胺基酸序列，或由所述胺基酸序列組成。
在優選的實施方案中，本發明抗CD40抗體或其抗原結合片段包含： 如SEQ ID NO:13、58、60、62或14所示的重鏈可變區的3個互補決定區HCDR，以及如SEQ ID NO:15、64、66或16所示的輕鏈可變區的3個互補決定區LCDR。
在優選的實施方案中，本發明抗CD40抗體或其抗原結合片段包含： 如SEQ ID NO:13、58、60或62所示的重鏈可變區的3個互補決定區HCDR，以及如SEQ ID NO:15、64或66所示的輕鏈可變區的3個互補決定區LCDR。
在優選的實施方案中，本發明抗CD40抗體或其抗原結合片段包含： 如SEQ ID NO:14所示的重鏈可變區的3個互補決定區HCDR，以及如SEQ ID NO:16所示的輕鏈可變區的3個互補決定區LCDR。
在優選的實施方案中，本發明抗CD40抗體或其抗原結合片段包含： (i)    如SEQ ID NO:13所示的重鏈可變區的3個互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及如SEQ ID NO:15所示的輕鏈可變區的3個互補決定區LCDR1、LCDR2和LCDR3； (ii)   如SEQ ID NO:58所示的重鏈可變區的3個互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及如SEQ ID NO:64所示的輕鏈可變區的3個互補決定區LCDR1、LCDR2和LCDR3； (iii) 如SEQ ID NO:60或62所示的重鏈可變區的3個互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及如SEQ ID NO:66所示的輕鏈可變區的3個互補決定區LCDR1、LCDR2和LCDR3； (iv)  如SEQ ID NO:14所示的重鏈可變區的3個互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及如SEQ ID NO:16所示的輕鏈可變區的3個互補決定區LCDR1、LCDR2和LCDR3； (v)   (i)-(iv)中任一項的CDR組合，其中相比HCDR3和/或LCDR3，在所述序列上包含至少一個且不超過3、2或1個胺基酸改變(優選地胺基酸置換，優選地保守置換)。
在一些實施方案中，本發明的抗CD40抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)和/或輕鏈可變區(VL)，其中 (i)    所述VH包含互補決定區域(CDR) HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO:1或2的胺基酸序列，或由所述胺基酸序列組成，或者HCDR1包含與SEQ ID NO:1或2的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(優選胺基酸置換，優選保守置換)的胺基酸序列；HCDR2包含SEQ ID NO:3或4的胺基酸序列，或由所述胺基酸序列組成，或者HCDR2包含與選自SEQ ID NO:3或4的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(優選胺基酸置換，優選保守置換)的胺基酸序列；HCDR3包含SEQ ID NO:5、51、52、55或6的胺基酸序列或由所述胺基酸序列組成，或者HCDR3包含與SEQ ID NO:5、51、52、55或6的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(優選胺基酸置換，優選保守置換)的胺基酸序列； 和/或 (ii)   其中所述VL包含互補決定區域(CDR) LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1包含SEQ ID NO:7或8的胺基酸序列或由所述胺基酸序列組成，或者LCDR1包含與SEQ ID NO:7或8的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(優選胺基酸置換，優選保守置換)的胺基酸序列；LCDR2包含SEQ ID NO:9或10的胺基酸序列或由所述胺基酸序列組成，或者LCDR2包含與SEQ ID NO:9或10的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(優選胺基酸置換，優選保守置換)的胺基酸序列；LCDR3包含選自SEQ ID NO:11、53、54、56或12的胺基酸序列或由所述胺基酸序列組成，或者LCDR3包含與SEQ ID NO:11、53、54、56或12的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(優選胺基酸置換，優選保守置換)的胺基酸序列。
在優選的實施方案中，本發明提供抗CD40抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中 (a) 所述VH包含 (i)    包含或由下述序列組成的HCDR1、HCDR2和HCDR3：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5；或者 (ii)   包含或由下述序列組成的HCDR1、HCDR2和HCDR3：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:51；或者 (iii) 包含或由下述序列組成的HCDR1、HCDR2和HCDR3：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:52；或者 (iv)  包含或由下述序列組成的HCDR1、HCDR2和HCDR3：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6；或者 (v)   (i)-(iv)中任一項的HCDR組合，其中在所述三個CDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(優選胺基酸置換，優選保守置換)；或者 (vi)  (i)-(iv)中任一項的HCDR組合，其中在所述HCDR3包含至少一個且不超過3、2或1個胺基酸改變(優選胺基酸置換，優選保守置換)； 和/或 (b)所述VL包含 (i)    包含或由下述序列組成的LCDR1、LCDR2和LCDR3：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11；或者 (ii)   包含或由下述序列組成的LCDR1、LCDR2和LCDR3：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:53；或者 (iii) 包含或由下述序列组成的LCDR1、LCDR2和LCDR3：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:54；或者 (iv)  包含或由下述序列组成的LCDR1、LCDR2和LCDR3：SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:12；或者 (v)   (i)-(iv)中任一項的LCDR組合，其中在所述三個CDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(優選胺基酸置換，優選保守置換)；或者 (vi)  (i)-(iv)中任一項的LCDR組合，其中在所述HCDR3包含至少一個且不超過3、2或1個胺基酸改變(優選胺基酸置換，優選保守置換) 。
在優選的實施方案中，本發明提供抗CD40抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中 (a)   所述VH包含 (i)    包含或由下述序列組成的HCDR1、HCDR2和HCDR3：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5；或者 (ii)   包含或由下述序列組成的HCDR1、HCDR2和HCDR3：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:51；或者 (iii) 包含或由下述序列組成的HCDR1、HCDR2和HCDR3：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:52；或者 (iv)  (i)-(iii)中任一項的HCDR組合，其中在所述三個CDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(優選胺基酸置換，優選保守置換)；或者 (v)   (i)-(iii)中任一項的HCDR組合，其中在所述HCDR3包含至少一個且不超過3、2或1個胺基酸改變(優選胺基酸置換，優選保守置換)； 和/或 (b)   所述VL包含 (i)    包含或由下述序列組成的LCDR1、LCDR2和LCDR3：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11；或者 (ii)   包含或由下述序列組成的LCDR1、LCDR2和LCDR3：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:53；或者 (iii) 包含或由下述序列組成的LCDR1、LCDR2和LCDR3：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:54；或者 (iv)  (i)-(iii)中任一項的LCDR組合，其中在所述三個CDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(優選胺基酸置換，優選保守置換)；或者 (v)   (i)-(iii)中任一項的LCDR組合，其中在所述LCDR3包含至少一個且不超過3、2或1個胺基酸改變(優選胺基酸置換，優選保守置換)。
在優選的實施方案中，本發明提供抗CD40抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中 (a) 所述VH包含 (i)    包含或由下述序列組成的HCDR1、HCDR2和HCDR3：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6；或者 (ii)   (i)的HCDR組合，其中在所述三個CDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(優選胺基酸置換，優選保守置換)；或者 (iii) (i)中的HCDR組合，其中在所述HCDR3包含至少一個且不超過3、2或1個胺基酸改變(優選胺基酸置換，優選保守置換)； 和/或 (b)所述VL包含 (i)    包含或由下述序列組成的LCDR1、LCDR2和LCDR3：SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:12；或者 (ii)   (i)中LCDR組合，其中在所述三個CDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(優選胺基酸置換，優選保守置換)；或者 (iii) (i)中的LCDR組合，其中在所述LCDR3包含至少一個且不超過3、2或1個胺基酸改變(優選胺基酸置換，優選保守置換) 。
在優選的實施方案中，本發明提供抗CD40抗體或其抗原結合片段，其包含 (i)    包含或由下述序列組成的HCDR1、HCDR2和HCDR3：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5，以及包含或由下述序列組成的LCDR1、LCDR2和LCDR3：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11；或者 (ii)   包含或由下述序列組成的HCDR1、HCDR2和HCDR3：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:51，以及包含或由下述序列組成的LCDR1、LCDR2和LCDR3：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:53；或者 (iii) 包含或由下述序列組成的HCDR1、HCDR2和HCDR3：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:52，以及/或者包含或由下述序列組成的LCDR1、LCDR2和LCDR3：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:54；或者 (iv)  包含或由下述序列組成的HCDR1、HCDR2和HCDR3：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6，以及包含或由下述序列組成的LCDR1、LCDR2和LCDR3：SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:12； (v)   (i)-(iv)中任一項的HCDR和LCDR組合，其中在所述三個HCDR區上和/或在所述三個LCDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(優選胺基酸置換，優選保守置換)；或者 (vi)  (i)-(iv)中任一項的HCDR和LCDR組合，其中在所述HCDR3和/或LCDR3中包含至少一個且不超過3、2或1個胺基酸改變(優選胺基酸置換，優選保守置換)。
在優選的實施方案中，本發明提供抗CD40抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中 (a) 所述VH包含 (i)    包含或由下述序列組成的HCDR1、HCDR2和HCDR3：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:55；或 (ii)   (i)中的HCDR的組合，其中在所述三個HCDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(優選胺基酸置換，優選保守置換)； 和/或 (b)所述VL包含 (i)    包含或由下述序列組成的LCDR1、LCDR2和LCDR3：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:56；或 (ii)   (i)中的LCDR的組合，其中在所述三個LCDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(優選胺基酸置換，優選保守置換)。
在一些實施方案中，SEQ ID NO:55所示的胺基酸序列如下： A-R-E-R-V-G-A-X1-P-T-Y-Y-Y-X2-X3-DV，其中X1、X2或X3可以為任何胺基酸，優選地，其中X1可以為T、N、W、K、A或Y，更優選的T或N；其中X2優選的為W或Y；其中X3可以為W、Y、M、F、T，更優選地為M、W或Y。
在一些實施方案中，SEQ ID NO:56所示的胺基酸序列如下： M-X1-X2-L-X3-X4-P-Y-T，其中X1、X2、X3和X4可以為任何胺基酸，優選地，其中X1可以為Q、N或P，更優選地為Q或N；X2可以為G、Q、F、S、Y或M；更優選的為G或Q；X3可以為E、N、T、S或K；更優選地為E或N；X4可以為T、Q、V、L、P或E；更優選地為T、Q或V。
在優選的實施方案中，本發明提供抗CD40抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中所述VH包含互補決定區域(CDR) HCDR1、HCDR2和HCDR3並且所述VL包含(CDR) LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述抗體或其抗原結合片段所包含的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的組合如下表(表A)所示： 表A：本發明抗體或其抗原結合片段中HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的示例性組合
組合 HCDR1，其包含下述SEQ ID NO所示的胺基酸序列或由其組成 HCDR2，其包含下述SEQ ID NO所示的胺基酸序列或由其組成 HCDR3，其包含下述SEQ ID NO所示的胺基酸序列或由其組成 LCDR1，其包含下述SEQ ID NO所示的胺基酸序列或由其組成 LCDR2，其包含下述SEQ ID NO所示的胺基酸序列或由其組成 LCDR3，其包含下述SEQ ID NO所示的胺基酸序列或由其組成
(1) SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:11
(2) SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:51 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:53
(3) SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:52 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:54
(4) SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:55 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:56
(5) SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:6 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:10 SEQ ID NO:12
在一些實施方案中，本發明的抗CD40抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區VH和/或輕鏈可變區VL，其中， (a) 重鏈可變區VH (i)    包含與選自SEQ ID NO:13、58、60、62或14的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同性的胺基酸序列或由其組成；或者 (ii)   包含選自SEQ ID NO:13、58、60、62或14的胺基酸序列或由其組成；或者 (iii) 包含與選自SEQ ID NO:13、58、60、62或14的胺基酸序列相比具有1個或多個(優選不超過10個，更優選不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(優選胺基酸置換，更優選胺基酸保守置換)的胺基酸序列，優選地，所述胺基酸改變不發生在CDR區中，優選地，所述胺基酸改變發生在FR區中； 和/或 (b)輕鏈可變區VL (i) 包含與選自SEQ ID NO:15、64、66或16的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同性的胺基酸序列或由其組成； (ii)   包含選自SEQ ID NO:15、64、66或16的胺基酸序列或由其組成；或者 (iii) 包含與選自SEQ ID NO:15、64、66或16的胺基酸序列相比具有1個或多個(優選不超過10個，更優選不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(優選胺基酸置換，更優選胺基酸保守置換)的胺基酸序列，優選地，所述胺基酸改變不發生在CDR區中，優選地，所述胺基酸改變發生在FR區中。
在一些實施方案中，本發明的抗CD40抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區VH (i)    包含與選自SEQ ID NO:13、58、60或62的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同性的胺基酸序列或由其組成；或者 (ii)   包含選自SEQ ID NO:13、58、60或62的胺基酸序列或由其組成；或者 (iii) 包含與選自SEQ ID NO:13、58、60或62的胺基酸序列相比具有1個或多個(優選不超過10個，更優選不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(優選胺基酸置換，更優選胺基酸保守置換)的胺基酸序列，優選地，所述胺基酸改變不發生在CDR區中，優選地，所述胺基酸改變發生在FR區中。
在一些實施方案中，本發明的抗CD40抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區VL (i)    包含與選自SEQ ID NO:15、64或66的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同性的胺基酸序列或由其組成； (ii)   包含選自SEQ ID NO:15、64或66的胺基酸序列或由其組成；或者 (iii) 包含與選自SEQ ID NO:15、64或66的胺基酸序列相比具有1個或多個(優選不超過10個，更優選不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(優選胺基酸置換，更優選胺基酸保守置換)的胺基酸序列，優選地，所述胺基酸改變不發生在CDR區中，優選地，所述胺基酸改變發生在FR區中。
在一些實施方案中，本發明的抗CD40抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區VH (i) 包含與選自SEQ ID NO:14的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同性的胺基酸序列或由其組成；或者 (ii)   包含選自SEQ ID NO:14的胺基酸序列或由其組成；或者 (iii) 包含與選自SEQ ID NO:14的胺基酸序列相比具有1個或多個(優選不超過10個，更優選不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(優選胺基酸置換，更優選胺基酸保守置換)的胺基酸序列，優選地，所述胺基酸改變不發生在CDR區中，優選地，所述胺基酸改變發生在FR區中。
在一些實施方案中，本發明的抗CD40抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區VL (i)    包含與選自SEQ ID NO:16的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同性的胺基酸序列或由其組成； (ii)   包含選自SEQ ID NO:16的胺基酸序列或由其組成；或者 (iii) 包含與選自SEQ ID NO:16的胺基酸序列相比具有1個或多個(優選不超過10個，更優選不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(優選胺基酸置換，更優選胺基酸保守置換)的胺基酸序列，優選地，所述胺基酸改變不發生在CDR區中，優選地，所述胺基酸改變發生在FR區中。
在一些實施方案中，本發明的抗CD40抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區VH和/或輕鏈可變區VL，其中， (i)    重鏈可變區VH包含SEQ ID NO:13的胺基酸序列或由其組成，和輕鏈可變區VL包含SEQ ID NO:15的胺基酸序列或由其組成； (ii)   重鏈可變區VH包含SEQ ID NO:58的胺基酸序列或由其組成，和輕鏈可變區VL包含SEQ ID NO:64的胺基酸序列或由其組成； (iii) 重鏈可變區VH包含SEQ ID NO:60的胺基酸序列或由其組成，和輕鏈可變區VL包含SEQ ID NO:66的胺基酸序列或由其組成； (iv)  重鏈可變區VH包含SEQ ID NO:62的胺基酸序列或由其組成，和輕鏈可變區VL包含SEQ ID NO:66的胺基酸序列或由其組成； (v)   重鏈可變區VH包含SEQ ID NO:14的胺基酸序列或由其組成，和輕鏈可變區VL包含SEQ ID NO:16的胺基酸序列或由其組成。
在一些實施方案中，本發明的抗體的重鏈可變區的胺基酸序列與上文所述的(i)-(v)中重鏈可變區的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同性，或者其胺基酸序列相比上文所述的(i)-(v)中重鏈可變區的胺基酸序列，包含1個或多個(優選不超過10個，更優選不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(優選胺基酸置換，更優選胺基酸保守置換)的胺基酸序列，優選地，所述胺基酸改變不發生在CDR區中，優選地，所述胺基酸改變發生在FR區中。
在一些實施方案中，本發明的抗體的輕鏈可變區的胺基酸序列與上文所述的(i)-(v)中輕鏈可變區的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同性，或者其胺基酸序列相比上文所述的(i)-(v)中輕鏈可變區的胺基酸序列，包含1個或多個(優選不超過10個，更優選不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(優選胺基酸置換，更優選胺基酸保守置換)的胺基酸序列，優選地，所述胺基酸改變不發生在CDR區中，優選地，所述胺基酸改變發生在FR區中。
在優選的實施方案中，本發明提供抗CD40抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中所述抗體或其抗原結合片段所包含的重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL的組合如下表(表B)所示： 表B：本發明抗體或其抗原結合片段中重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL的示例性組合
組合 VH，其包含下述SEQ ID NO所示的胺基酸序列或由其組成 VL，其包含下述SEQ ID NO所示的胺基酸序列或由其組成
(1) SEQ ID NO:13 SEQ ID NO:15
(2) SEQ ID NO:58 SEQ ID NO:64
(3) SEQ ID NO:60 SEQ ID NO:66
(4) SEQ ID NO:62 SEQ ID NO:66
(5) SEQ ID NO:14 SEQ ID NO:16
在一些實施方案中，本發明的抗CD40抗體或其抗原結合片段包含重鏈和/或輕鏈，其中 (a) 重鏈 (i)    包含與選自SEQ ID NO:17、18、19、67、69、70或20的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同性的胺基酸序列或由其組成； (ii)   包含選自SEQ ID NO:17、18、19、67、69、70或20的胺基酸序列或由其組成；或者 (iii) 包含與選自SEQ ID NO:17、18、19、67、69、70或20的胺基酸序列相比具有1個或多個(優選不超過20個或10個，更優選不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(優選胺基酸置換，更優選胺基酸保守置換)的胺基酸序列，優選地，所述胺基酸改變不發生在重鏈的CDR區中，更優選地，所述胺基酸改變不發生在重鏈可變區中，最優選地，所述胺基酸改變發生在重鏈恆定區中； 和/或 (b)輕鏈 (i)    包含與選自SEQ ID NO:21、68、71或22的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同性的胺基酸序列或由其組成； (ii)   包含選自SEQ ID NO:21、68、71或22的胺基酸序列或由其組成；或者 (iii) 包含與選自SEQ ID NO:21、68、71或22的胺基酸序列相比具有1個或多個(優選不超過20個或10個，更優選不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(優選胺基酸置換，更優選胺基酸保守置換)的胺基酸序列，優選地，所述胺基酸改變不發生在輕鏈的CDR區中，更優選地，所述胺基酸改變不發生在輕鏈可變區中，最優選的，所述重鏈胺基酸改變發生在輕鏈恆定區中。
在一些實施方案中，本發明的抗CD40抗體或其抗原結合片段包含的重鏈 (i)    包含與選自SEQ ID NO:17、18、19、67、69或70的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同性的胺基酸序列或由其組成； (ii)   包含選自SEQ ID NO:17、18、19、67、69或70的胺基酸序列或由其組成；或者 (iii) 包含與選自SEQ ID NO:17、18、19、67、69或70的胺基酸序列相比具有1個或多個(優選不超過20個或10個，更優選不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(優選胺基酸置換，更優選胺基酸保守置換)的胺基酸序列，優選地，所述胺基酸改變不發生在重鏈的CDR區中，更優選地，所述胺基酸改變不發生在重鏈可變區中，最優選的，所述重鏈胺基酸改變發生在重鏈恆定區中。
在一些實施方案中，本發明的抗CD40抗體或其抗原結合片段包含的輕鏈 (i)    包含與選自SEQ ID NO:21、68或71的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同性的胺基酸序列或由其組成； (ii)   包含選自SEQ ID NO:21、68或71的胺基酸序列或由其組成；或者 (iii) 包含與選自SEQ ID NO:21、68或71的胺基酸序列相比具有1個或多個(優選不超過20個或10個，更優選不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(優選胺基酸置換，更優選胺基酸保守置換)的胺基酸序列，優選地，所述胺基酸改變不發生在輕鏈的CDR區中，更優選地，所述胺基酸改變不發生在輕鏈可變區中，最優選的，所述重鏈胺基酸改變發生在輕鏈恆定區中。
在一些實施方案中，本發明的抗CD40抗體或其抗原結合片段包含的重鏈 (i)    包含與選自SEQ ID NO:20的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同性的胺基酸序列或由其組成； (ii)   包含選自SEQ ID NO:20的胺基酸序列或由其組成；或者 (iii) 包含與選自SEQ ID NO:20的胺基酸序列相比具有1個或多個(優選不超過20個或10個，更優選不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(優選胺基酸置換，更優選胺基酸保守置換)的胺基酸序列，優選地，所述胺基酸改變不發生在重鏈的CDR區中，更優選地，所述胺基酸改變不發生在重鏈可變區中，最優選的，所述重鏈胺基酸改變發生在重鏈恆定區中。
在一些實施方案中，本發明的抗CD40抗體或其抗原結合片段包含的輕鏈 (i)    包含與選自SEQ ID NO:22的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同性的胺基酸序列或由其組成； (ii)   包含選自SEQ ID NO:22的胺基酸序列或由其組成；或者 (iii) 包含與選自SEQ ID NO:22的胺基酸序列相比具有1個或多個(優選不超過20個或10個，更優選不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(優選胺基酸置換，更優選胺基酸保守置換)的胺基酸序列，優選地，所述胺基酸改變不發生在輕鏈的CDR區中，更優選地，所述胺基酸改變不發生在輕鏈可變區中，最優選的，所述重鏈胺基酸改變發生在輕鏈恆定區中。
在一些實施方案中，本發明的抗CD40抗體或其抗原結合片段包含重鏈和/或輕鏈，其中， (i)    重鏈包含SEQ ID NO:17、18、19、67、69或70的胺基酸序列或由其組成，和輕鏈包含SEQ ID NO:21、68或71的胺基酸序列或由其組成， (ii)   重鏈包含SEQ ID NO:17、18或19的胺基酸序列或由其組成，和輕鏈包含SEQ ID NO:21的胺基酸序列或由其組成； (iii) 重鏈包含SEQ ID NO:67的胺基酸序列或由其組成，和輕鏈包含SEQ ID NO:68的胺基酸序列或由其組成； (iv)  重鏈包含SEQ ID NO:69或70的胺基酸序列或由其組成，和輕鏈包含SEQ ID NO:71的胺基酸序列或由其組成； (v)   重鏈包含SEQ ID NO:20的胺基酸序列或由其組成，和輕鏈包含SEQ ID NO:22的胺基酸序列或由其組成。
在一些實施方案中，本發明抗體的重鏈的胺基酸序列與上述(i)-(v)中的重鏈的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同性，或其胺基酸序列與上述(i)-(v)中的重鏈胺基酸序列相比，包含1個或多個(優選不超過20個或10個，更優選不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(優選胺基酸置換，更優選胺基酸保守置換)的胺基酸序列，優選地，所述胺基酸改變不發生在重鏈的CDR區中，更優選地，所述胺基酸改變不發生在重鏈可變區中，最優選的，所述胺基酸改變發生在重鏈的恆定區中。
在一些實施方案中，本發明抗體的輕鏈的胺基酸序列與上述(i)-(v)中的重鏈的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同性，或其胺基酸序列與上述(i)-(v)中的輕鏈胺基酸序列相比，包含1個或多個(優選不超過20個或10個，更優選不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(優選胺基酸置換，更優選胺基酸保守置換)的胺基酸序列，優選地，所述胺基酸改變不發生在輕鏈的CDR區中，更優選地，所述胺基酸改變不發生在輕鏈可變區中，最優選的，所述胺基酸改變發生在輕鏈的恆定區中。
在優選的實施方案中，本發明提供抗CD40抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈和輕鏈，其中所述抗體或其抗原結合片段所包含的重鏈和輕鏈的組合如下表(表C)所示： 表C：本發明抗體或其抗原結合片段中重鏈和輕鏈的示例性組合
組合 重鏈，其包含下述SEQ ID NO所示的胺基酸序列或由其組成 輕鏈，其包含下述SEQ ID NO所示的胺基酸序列或由其組成
(1) SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:21
(2) SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:21
(3) SEQ ID NO:19 SEQ ID NO:21
(4) SEQ ID NO:67 SEQ ID NO:68
(5) SEQ ID NO:69 SEQ ID NO:71
(6) SEQ ID NO:70 SEQ ID NO:71
(7) SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:22
在一些實施方案中，本發明抗CD40抗體或其片段的重鏈和/或輕鏈還包含訊息胜肽序列，例如所述訊息胜肽序列包含SEQ ID NO:43所示的胺基酸序列或由其組成。
在本發明的一個實施方案中，本文所述的胺基酸改變包括胺基酸的置換、插入或缺失。優選的，本文所述的胺基酸改變為胺基酸置換，優選地保守置換。
在一些實施方案中，改變發生在抗體的重鏈和/或輕鏈的CDR區(尤其是CDR3區)中。在一些實施方案中，在CDR區，例如CDR3區中可以存在1、2或3個改變。
在優選的實施方案中，本發明所述的胺基酸改變發生在CDR外的區域(例如在FR中)。在某些實施方案中，改變發生在抗體的FR區，例如抗體重鏈和/或輕鏈可變區的FR區，例如FR1、FR2、FR2或F4區。在一些實施方案中，改變發生在FR2區。在一些實施方案中，FR區可以存在1、2或3個改變。
更優選地，本發明所述的胺基酸改變發生在重鏈可變區外和/或輕鏈可變區外的區域，例如在重鏈和/或輕鏈的恆定區中。
在一些實施方案中，置換為保守性置換。保守置換是指一個胺基酸經相同類別內的另一胺基酸置換，例如一個酸性胺基酸經另一酸性胺基酸置換，一個鹼性胺基酸經另一鹼性胺基酸置換，或一個中性胺基酸經另一中性胺基酸置換。示例性的置換如下表D所示： 表D
原始殘基 示例性置換 優選的保守胺基酸置換
Ala (A) Val、Leu、Ile Val
Arg (R) Lys、Gln、Asn Lys
Asn (N) Gln、His、Asp、Lys、Arg Gln
Asp (D) Glu、Asn Glu
Cys (C) Ser、Ala Ser
Gln (Q) Asn、Glu Asn
Glu (E) Asp、Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn、Gln、Lys、Arg Arg
Ile (I) Leu、Val、Met、Ala、Phe、正白胺酸 Leu
Leu (L) 正白胺酸、Ile、Val、Met、Ala、Phe Ile
Lys (K) Arg、Gln、Asn Arg
Met (M) Leu、Phe、Ile Leu
Phe (F) Trp、Leu、Val、Ile、Ala、Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val、Ser Ser
Trp (W) Tyr、Phe Tyr
Tyr (Y) Trp、Phe、Thr、Ser Phe
Val (V) Ile、Leu、Met、Phe、Ala、正白胺酸 Leu
在某些實施方案中，置換發生在抗體的CDR區。通常，獲得的變體相對於親代抗體在某些生物學特性方面(例如，增加的親和力)具有修飾(例如，改善)和/或將具有親代抗體的基本上保留的某些生物學特性。示例性置換變體是親和力成熟抗體。在一些實施方案中，置換發生在抗體的重鏈和/或輕鏈的CDR3區中。在一些實施方案中，在CDR3區中可以存在1、2或3個置換。
在某些實施方案中，置換發生在抗體的FR區，例如抗體重鏈和/或輕鏈可變區的FR區，例如FR1、FR2、FR2或F4區。在一些實施方案中，置換發生在FR2區。在一些實施方案中，FR區可以存在1、2或3個置換。
在某些實施方案中，本發明提供包含本文公開的可變區序列或具有本文公開的CDR的可變區序列，以及具有經修飾的Fc區的恆定結構域的抗體，所述經修飾的Fc區相比於其對其他Fc受體(即活化受體)的親和力，具有對FcγRIIb增強的親和力。預期具有增強的FcγRIIb專一性的此類激動性抗CD40抗體在癌症治療和慢性感染中展示出優秀的效力(Li和Ravetch (2011)Science 333：1030；White等人 (2011)J. Immunol. 187：1754)。旨在不受理論束縛，此類FcγRIIb專一性激動性抗CD40抗體可以透過增加促進細胞毒性CD8+ T細胞的增殖和活化的樹突細胞的成熟、導致抗腫瘤反應增強來展示出增強的輔助作用。旨在不受理論束縛，由於本發明的交聯導致的FcR媒介的激動劑CD40抗體的訊息增強可以是治療效力的主要促進因素。透過抗體的Fc部分的經FcR接合的CD40激動劑抗體的交聯可以增加訊息強度並由此增強細胞活化。
能夠產生對FcγRIIb增強的親和力的Fc序列中的突變是本領域已知的，例如描述於Yu等人(2013)J. Am. Chem.Soc. 135:9723和WO 2014/184545，Chu等人(2008)Mol.Immunol. 45:3926，和Mimoto等人(2013)Protein Engineering Design & Selection 26:589。關於Fc區中突變的位置(編號)的命名法根據EU索引，如在Kabat等人(1981)Sequences of Proteins of Immunological Interest , 第5版Public Health Service， National Institutes of Health, Bethesda, Md.)，其便於比較具有不同可變結構域長度的抗體中等同位置處的Fc序列。
示例性的Fc序列中的突變包括例如E233D、G237D、H268D、P271G、A330R、S267E和/或L328F。在一個優選的實施方案中，本發明的抗體包含增強FcγRIIb專一性的突變的人IgG1恆定結構域，所述突變包括E233D，G237D，H268D，P271G和A330R，或者S267E和L328F。示例性的包含增強FcγRIIb專一性的突變的人IgG1恆定結構域的抗體重鏈的序列參見例如SEQ ID NO:18或19。
在某些實施方案中，本文中所提供的抗體可進一步經修飾為含有本領域中已知且輕易獲得的其他非蛋白質部分。適合抗體衍生作用的部分包括，但不限於，水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性實例包括，但不限於，聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二烷、聚-1,3,6-三烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或隨機共聚物)、及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚環氧丙烷/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇，及其混合物。
在某些實施方案中，本文中所提供的抗體經改變以增加或降低抗體經糖基化的程度。對抗體的糖基化位點的添加或缺失可透過改變胺基酸序列以便產生或移除一或多個糖基化位點而方便地實現。當抗體包含Fc區時，可以改變附著於其的糖類。在一些應用中，除去不想要的糖基化位點的修飾可以是有用的，例如除去岩藻糖建構單元以提高抗體依賴性細胞性細胞毒性(ADCC)功能(參見Shield等(2002) JBC277:26733)。在其它應用中，可以進行半乳糖苷化修飾以修飾補體依賴性細胞毒性(CDC)。
在某些實施方案中，可能需要產生經半胱胺酸工程改造的抗體，例如“硫代MAb”，其中抗體的一或多個殘基經半胱胺酸殘基置換。可以如，例如美國專利號7,521,541中所述地生成半胱胺酸改造的抗體。
在一些實施方案中，本發明的抗CD40抗體或其抗原結合片段顯示與本發明抗體對CD40相同或相似的結合親和力和/或專一性；和/或抑制(例如，競爭性抑制)本發明抗體與CD40的結合和/或與本發明抗體結合相同或重疊的表位；和/或與本發明抗體競爭結合CD40；和/或有本發明抗體的一個或多個生物學特性。
在一些實施方案中，本發明的抗CD40抗體是IgG1形式的抗體或IgG2形式的抗體或IgG3形式的抗體或IgG4形式的抗體。
在一些實施方案中，抗CD40抗體是單株抗體。
在一些實施方案中，抗CD40抗體是人源化的。用於使抗體人源化的不同方法是熟悉本發明所屬技藝的人士已知的，如由Almagro & Fransson綜述的，其內容透過提述完整併入本文(Almagro JC和Fransson J (2008)Frontiers in Bioscience 13:1619-1633)。
在一些實施方案中，抗CD40抗體是人抗體。可使用本領域中已知的各種技術來製備人抗體。人抗體一般描述於van Dijk和van de Winkel,Curr. Opin. Pharmacol. 5:368-74 (2001)以及Lonberg,Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)。
在一些實施方案中，抗CD40抗體是嵌合抗體。
在一個實施方案中，本發明的抗CD40抗體還涵蓋其抗體片段，優選地選自以下的抗體片段：Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、單鏈抗體(例如scFv)或(Fab’)2、單結構域抗體、diabody (dAb)或線性抗體。
在某些實施方案中，抗CD40抗體分子處於雙專一性或多專一性抗體分子形式。在一個實施方案中，雙專一性抗體分子具有針對CD40的第一結合專一性和針對PD-1或PD-L1或PD-L2或OX40或4-1BB或GITR等的第二結合專一性。在一個實施方案中，雙專一性抗體分子與CD40和TNF或IL-17結合。多專一性抗體分子可以具有任何針對前述分子的結合專一性的組合。
在一些實施方案中，本發明的抗體具有一個或多個如下的特性： (1)   選擇性結合CD40，其結合能力高於與其他TNFR家族蛋白的結合，或其不與其他TNFR家族的蛋白相結合；在一些實施方案中，該結合利用ELISA檢測。 (2)   阻斷CD40與CD40配體(CD40L)的結合。 (3)   以交聯形式或組成型形式，優選地以交聯形式活化表現CD40的細胞，例如活化NF-kappa-B訊息途徑；在一些實施方案中，用流式細胞術進行檢測；在一些實施方案中，使用的報導細胞為表現NF-κB-GFP和hCD40的細胞； (4)   與CD40，例如人CD40結合，其平衡解離常數小於或等於大約5×10-7 M、4.5×10-7 M、4.4×10-7 M、4.3×10-7 M、4.2×10-7 M、4.1×10-7 M、4×10-7 M、3.9×10-7 M、3.8×10-7 M、3.7×10-7 M、3.6×10-7 M、3.5×10-7 M、或3.4×10-7 M；在一些實施方案中，所述測量為表面電漿共振技術。 (5)   專一性地與表現CD40 (例如人CD40或恆河猴CD40)的細胞上的CD40結合；在一些實施方案中，與CD40 (例如人CD40和/或恆河猴CD40)結合的EC50小於或等於大約50 nM、40 nM、30 nM、20 nM、15 nM、14 nM、13 nM、12 nM、10 nM、9 nM、8 nM。在一些實施方案中，結合採用流式細胞術檢測；在一些實施方案中，表現CD40的細胞是293細胞，例如293FT細胞。 (6)   誘導腫瘤細胞凋亡。在一些實施方案中，EC50小於或等於大約4 nM、3.5 nM、3 nM、2.9 nM、2.8 nM、2.7 nM、或2.6 nM；在一些實施方案中，使用流式細胞術進行測量。在一些實施方案中，腫瘤細胞是Raji細胞或Ramos細胞。 (7)   具有激動劑活性，例如顯著活化(例如人) B細胞或T細胞或樹突細胞。 (8)   促進(例如人) B細胞或T細胞的增殖。 (9)   增強免疫反應。 (10) 抑制腫瘤生長，優選地同時維持個體體重。
在一些實施方案中，CD40抗體在交聯的情況下具有上述一個或多個特性。
在一些實施方案中，本發明還涵蓋與其他物質綴合的抗體(“免疫綴合物”)。
在一些實施方案中，其它物質例如治療劑或標記，如細胞毒性劑或免疫抑制劑或化療劑。細胞毒性劑包括任何對細胞有害的藥劑。適合於形成免疫綴合物的細胞毒性劑(例如化療劑)或其他物質的例子是本領域中已知的，參見例如WO 2017/004006或WO 2017/059243等。
在一些實施方案中，標記例如標記序列，例如胜肽。在優選的實施方案中，標記胺基酸序列是六組胺酸胜肽，如pQE載體(QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311)等中提供的標籤，它們中的許多是可商業獲得的。如Gentz等人, 1989,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824中所述，例如，六組胺酸提供融合蛋白的便利純化。用於純化的其他胜肽標籤包括但不限於血球凝集素(“HA”)標籤，其對應於源自流感血球凝集素蛋白的表位(Wilson等人, 1984,Cell 37:767)和“flag”標籤。
在其他實施方案中，所述標記可以是診斷劑或可檢測劑。所獲得的抗體綴合物可以作為臨床檢驗方法的部分(如確定特定療法的效力)，用於監測或預測疾病或病症的發作、形成、進展和/或嚴重性。可檢測劑或診斷劑包括但不限於多種酵素，例如辣根過氧化物酵素、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；輔基，例如鏈黴親和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；螢光物質，如但不限於繖形酮、螢光素、螢光異硫氰酸鹽、玫瑰紅、二氯三嗪胺螢光素、丹磺醯氯或藻紅蛋白；發光物質，如但不限於魯米諾；生物發光物質，如但不限於螢光素酶、螢光素和水母發光蛋白；放射性物質，如但不限於碘(131 I、125 I、123 I和121 I)、碳(14 C)、硫(35 S)、氚(3 H)、銦(115 In、113 In、112 In和111 In)、鍀(99 Tc)、鉈(201 Ti)、鎵(68 Ga、67 Ga)、鈀(103 Pd)、鉬(99 Mo)、氙(133 Xe)、氟(18 F)、153 Sm、177 Lu、159 Gd、149 Pm、140 La、175 Yb、166 Ho、90 Y、47Sc、186 Re、188 Re、142 Pr、105 Rh、97 Ru、68 Ge、57 Co、65 Zn、85 Sr、32 P、153 Gd、169 Yb、51 Cr、54 Mn、75 Se、113 Sn和117 Tin；和用於各種正電子發射攝影術中的正電子發射金屬和非放射性順磁金屬離子。
在一些實施方案中，所述治療性劑包括化療劑、細胞激素、細胞毒性劑、其它抗體、小分子藥物或免疫調節劑。
另外，本發明的抗體分子可以綴合至治療性部分(治療劑)如放射性金屬離子，如α-發射體如213 Bi或可用於使放射金屬離子(包括但不限於131 In、131 LU、131 Y、131 Ho、131 Sm)綴合至多肽的大環螯合劑。在某些實施方案中，大環螯合劑是1，4，7，10-四氮雜環十二烷-N,N’,N’’,N’’’-四乙酸(DOTA)，其可透過轉接子附著到抗體上。這類轉接子是本領域公知的並且在Denardo等人, 1998,Clin. Cancer Res. 4(10):2483-90中描述，所述文獻每篇透過引用的方式完整併入。
用於治療性部分與抗體綴合的技術是熟知的，參見，例如Arnon等人, “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”，引自Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld等人(編著), 第243-256頁(Alan R. Liss, Inc. 1985)。
在一些實施方案中，本發明提供了編碼本文所述任何抗體或其片段或其任一條鏈的核酸。在一個實施方案中，提供包含所述核酸的載體。在一個實施方案中，載體是表現載體，例如pFuse載體。在一個實施方案中，提供包含所述核酸或所述載體的宿主細胞。在一個實施方案中，宿主細胞是真核的。在另一個實施方案中，宿主細胞選自酵母細胞、哺乳動物細胞(例如CHO細胞或293細胞)或適用於製備抗體或其抗原結合片段的其它細胞。在另一個實施方案中，宿主細胞是原核的。
例如，本發明的核酸包含： 編碼選自SEQ ID NO:13-22中任一項所示胺基酸序列的核酸，或編碼與選自SEQ ID NO:13-22中任一項所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的相同性的胺基酸序列的核酸；或者 選自SEQ ID NO:39-42所示的核酸，或與選自SEQ ID NO:39-42所示的核酸具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的相同性的核酸。
本發明還涵蓋與下述核酸在嚴格性條件下雜交的核酸或與下述核酸具有一個或多個置換(例如保守性置換)、缺失或插入的核酸：包含編碼選自SEQ ID NO:1-9中任一項所示胺基酸序列的核酸序列的核酸；或包含編碼與選自SEQ ID NO:13-22中任一項所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的相同性的胺基酸序列的核酸序列的核酸；或包含選自SEQ ID NO:39-42所示的核酸序列的核酸，或包含與選自SEQ ID NO:39-42所示的核酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的相同性的核酸序列的核酸。
在一個實施方案中，提供包含所述核酸的一個或多個載體。在一個實施方案中，載體是表現載體，例如真核表現載體。載體包括但不限於病毒、質體、黏接質體、λ噬菌體或酵母人工染色體(YAC)。例如pFuse載體。一旦已經製備了用於表現的表現載體或DNA序列，則可以將表現載體轉染或引入適宜的宿主細胞中。多種技術可以用來實現這個目的，例如，原生質體融合、磷酸鈣沉澱、電穿孔、逆轉錄病毒的轉導、病毒轉染、基因槍、基於脂質的轉染或其他常規技術。在原生質體融合的情況下，將細胞在培養基中培育並且篩選適宜的活性。用於培養所產生的轉染細胞和用於回收產生的抗體分子的方法和條件是熟悉本發明所屬技藝的人士已知的並且可以基於本說明書和現有技術已知的方法，根據使用的特定表現載體和哺乳動物宿主細胞變動或最適化。另外，可以透過引入允許選擇已轉染的宿主細胞的一個或多個標記物，選出已經穩定將DNA摻入至其染色體中的細胞。標記物可以例如向營養缺陷型宿主提供原養型、生物除滅劑抗性(例如，抗生素)或重金屬(如銅)抗性等。可篩選標記基因可以與待表現的DNA序列直接連接或透過共轉化引入相同的細胞中。也可能需要額外元件以便最佳合成mRNA。這些元件可以包括剪接訊息，以及轉錄啟動子、增強子和終止訊息。
在一個實施方案中，提供了包含一種或多種本發明多核苷酸的宿主細胞。在一些實施方案中，提供了包含本發明表現載體的宿主細胞。在一些實施方案中，宿主細胞選自酵母細胞、哺乳動物細胞或適用於製備抗體或其抗原結合片段的其它細胞。
在一個實施方案中，本發明提供製備本發明抗體分子或其片段(優選的抗原結合片段)的方法，其中所述方法包括在適於表現編碼本發明抗體分子或其片段(優選的抗原結合片段)的核酸的條件下培養所述宿主細胞，以及任選地分離所述抗體或其片段(優選地抗原結合片段)。在某個實施方案中，所述方法還包括從宿主細胞回收本發明抗體分子或其片段(優選地抗原結合片段)。
在一個實施方案中，提供了製備本發明抗體分子的方法，其中所述方法包括，在適合抗體表現的條件下，培養包含編碼所述抗體(例如任意一條多肽鏈和/或多條多肽鏈)的核酸或包含所述核酸的表現載體的宿主細胞，如上文所提供的，和任選地從所述宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收所述抗體。
為了重組產生本發明抗體分子，分離編碼抗體(例如上文所描述的抗體，例如任意一條多肽鏈和/或多條多肽鏈)的核酸，並將其插入一個或多個載體，用於在宿主細胞中進一步轉殖和/或表現。此類核酸易於使用常規規程分離和定序(例如透過使用能夠與編碼抗體重鏈和輕鏈的基因專一性結合的寡核苷酸探針進行)。
如本文所述製備的抗體分子可以透過已知的現有技術如高效液相層析、離子交換層析、凝膠電泳、親和層析、粒徑篩析層析等純化。用來純化特定蛋白質的實際條件還取決於淨電荷、疏水性、親水性等因素，並且這些對熟悉本發明所屬技藝的人士是顯而易見的。可以透過多種熟知分析方法中的任一種方法確定本發明的抗體分子的純度，所述熟知分析方法包括粒徑篩析層析、凝膠電泳、高效液相層析等。
在一些實施方案中，本發明還提供了對本發明的抗體分子進行鑑定、篩選或特徵鑑定其物理/化學性質和/或生物學活性的方法。
一方面，對本發明的抗體測試其抗原結合活性，例如透過已知的方法諸如ELISA，Western墨點，等來進行。可使用本領域已知方法來測定對CD40的結合，本文中公開了例示性方法。在一些實施方案中，使用表面電漿共振測定法(例如親和測量)或ELISA測定法。
本發明還提供了用於鑑定具有生物學活性的抗CD40抗體的測定法。生物學活性可以包括例如結合CD40(例如結合人和/或恆河猴CD40)，提高CD40媒介的訊息傳導(例如提高NFkappa-B訊息傳遞途徑)，透過直接誘導腫瘤細胞凋亡削減表現CD40的細胞(例如Raji或Ramos細胞)，活化樹突細胞或B細胞或T細胞(例如透過提高T細胞的細胞激素生成)、促進T細胞(例如CD8+ T細胞，例如活化的CD8+ T細胞)或B細胞增殖或抑制腫瘤生長。
在某些實施方案中，對本發明的抗體測試此類生物學活性。
可以使用本領域已知的方法來測定T細胞(例如CD8+ T細胞)或樹突細胞或B細胞的活化。例如，透過細胞活化標誌物CD8 (T細胞)或CD86 (樹突細胞或B細胞)的位準(例如表現)。還可以使用本領域公知的方法來測定CD40訊息轉導(例如NF-κB訊息傳遞途徑)，從而測定T細胞的活化。在一個實施方案中，生成表現人CD40和報導基因(包含融合至報導基因(例如β螢光素酶，GFP)的NF-kappa B啟動子)的轉基因細胞。對細胞添加抗CD40抗體導致NF-kappa B轉錄升高，這使用針對報導基因的測定法(例如螢光素酶報導基因測定法)來檢測。
可以使用本領域已知的方法來測定抗體的ADCC效應。例如透過檢測其對腫瘤細胞凋亡的誘導(例如透過細胞凋亡標誌分子，例如CD95)、對腫瘤細胞生長的抑制或對體內腫瘤生長的抑制。
可以使用本領域已知的方法來測定T細胞(例如CD8+ T細胞，例如活化的CD8+ T細胞)或B細胞的增殖。例如透過發光法，例如CellTiter-Glo發光法，來測定B細胞的增殖。還例如，透過OVA專一性的OT-I細胞法，檢測CD8+ T細胞的增殖。
供任何上述體外測定法使用的細胞包括天然表現CD40或經改造而表現CD40細胞株。此類細胞包括天然表現CD40L的T細胞(例如CD8+ T細胞，例如活化的CD8+ T細胞)，天然表現CD40的B細胞或樹突細胞。此類細胞還包括表現CD40和並非正常情況下表現CD40的編碼CD40 DNA轉染的細胞株。
可以理解的是，能夠使用本發明的免疫綴合物替換或補充抗CD40抗體來進行任何上述測定法。
可以理解的是，能夠使用抗CD40抗體和別的活性劑來進行任何上述測定法。
在一些實施方案中，本發明提供了包含本發明抗體的藥物組成物和組合產品。
在一些實施方案中，本發明提供包含本文所述的任何抗體分子或其片段(優選地其抗原結合片段)或其免疫綴合物的組成物，優選地組成物為藥物組成物。在一個實施方案中，所述組成物還包含藥用輔料。
本發明還包括包含本發明抗體或其免疫綴合物的組成物(包括藥物組成物或藥物製劑)和/或包含編碼本發明抗體的多核苷酸的組成物(包括藥物組成物或藥物製劑)。在某些實施方案中，組成物包含一種或多種本發明抗體或其片段或一種或多種編碼一種或多種本發明抗體或其片段的多核苷酸。
這些組成物還可以包含合適的藥用輔料，如本領域中已知的藥用載體、藥用賦形劑，包括緩衝劑。
如本文所用，“藥用載體”包括生理上相容的任何和全部溶劑、分散介質、等滲劑和吸收延遲劑等。適用於本發明的藥用載體可以是無菌液體，如水和油，包括那些石油、動物、植物或合成來源的，如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。當靜脈內施用藥物組成物時，水是優選的載體。還可以將鹽水溶液和水性右旋糖以及甘油溶液用作液體載體，特別是用於可注射溶液。
合適的賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石、氯化鈉、乾燥的脫脂乳、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。對於賦形劑的使用及其用途，亦參見“Handbook of PharmaceuticalExcipients”, 第五版, R.C. Rowe, P.J. Seskey和S.C. Owen, Pharmaceutical Press, London, Chicago。
若期望的話，所述組成物還可以含有少量的潤濕劑或乳化劑，或pH緩衝劑。
本發明的組成物可以處於多種形式。這些形式例如包括液體、半固體和固體劑型，如液態溶液劑(例如，可注射用溶液劑和可輸液溶液劑)、分散體劑或懸浮液、脂質體劑和栓劑。優選的形式取決於預期的施用模式和治療用途。常見的優選組成物處於可注射用溶液劑或可輸液溶液劑形式。優選的施用模式是腸胃外[例如，靜脈內、皮下、腹腔(i.p.)、肌內]注射。在一個優選實施方案中，透過靜脈內輸液或注射施用抗體分子。在另一個優選實施方案中，透過肌內、腹腔或皮下注射施用抗體分子。
本發明的專一性結合人CD40的激動性抗體可凍乾以便於儲存，使用之前可在合適的載體中復原。此項技術已被證實對常規的蛋白製劑有效，並且可採用熟知的凍乾和復原技術。
本發明的藥物組成物或製劑還可以包含其他治療劑，所述治療劑是被治療的特定適應症所需的，優選具有不會不利地彼此影響的互補活性的那些治療劑。例如，化療劑、細胞毒性劑、疫苗、其它抗體、抗感染活性劑、小分子藥物或免疫調節劑等。
在一些實施方案中，本發明還提供了組合產品，其包含本發明的抗體或其抗原結合片段，或其免疫綴合物，以及一種或多種其它治療劑(例如化療劑、其他抗體、細胞毒性劑、疫苗、抗感染活性劑、小分子藥物或免疫調節劑等)。
在一些方案中，所述組合產品中的兩種或多種成分可以依次、分開或同時聯合施用給受試者。
在一些實施方案中，本發明還提供了包含本發明的抗體、藥物組成物、免疫綴合物或組合產品的試劑盒，以及任選的指導施用的包裝插頁。
在一些實施方案中，本發明還提供了包含本發明的抗體、藥物組成物、免疫綴合物、組合產品的藥物製品，任選地，所述藥物製品還包括指導施用的包裝仿單。
在一些實施方案中，所述其他治療劑包括例如以下中的一種或多種：抗CTLA-4抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗TIGIT抗體、抗OX40 (也稱為CD134、TNFRSF4、ACT35和/或TXGP1L)抗體、抗LAG-3抗體、抗CD73抗體、抗CD137抗體、抗CD27抗體、抗CSF-1R抗體、TLR激動劑、或IDO或TGFβ的小分子拮抗劑。可以與本發明的抗體組合的治療劑的例子還參見WO 2017/059243或WO 2017/004006。
在一些實施方案中，本發明還提供了增強受試者中的免疫反應(例如抗原專一性T細胞反應)的方法，其包括向受試者施用有效量的本發明的抗CD40抗體或其抗原結合片段，使得所述個體中的免疫反應得到增強。在一些實施方案中，個體具有腫瘤。在另一實施方案中，個體具有病毒感染，例如慢性病毒感染。
在一些實施方案中，本發明提供了利用本發明的抗體在受試者中活化T細胞(例如CD8+ T細胞)和/或樹突細胞和/或B細胞的方法，其包括向受試者施用有效量的本發明的抗CD40抗體或其抗原結合片段。本發明還提供了利用本發明的方法促進T細胞(例如活化的CD8+ T細胞)或B細胞增殖的方法，其包括向受試者施用有效量的本發明的抗CD40抗體或其抗原結合片段。因此，在一些實施方案中，考慮到本文所述的抗CD40抗體增強T細胞反應例如抗原專一性T細胞反應的共刺激的能力，本文提供使用本文所述的抗體刺激、增強或向上調控抗原專一性T細胞反應例如抗腫瘤T細胞反應的體外和體內方法。CD4+和CD8+ T細胞反應可以使用抗CD40抗體增強。T細胞可以是Teff 細胞，例如CD4+ Teff 細胞、CD8+ Teff 細胞、T輔助(Th )細胞和T毒性(Tc )細胞。
在一些實施方案中，本發明提供了使用本發明的抗體分子用來治療或預防需要在受試者中調節(例如增強)免疫反應的疾病，例如腫瘤或感染，例如慢性感染。因此，本發明還提供抑制受試者中的腫瘤生長的方法，其包括向個體施用本發明的抗CD40抗體或其抗原結合片段，使得腫瘤生長得到抑制。
在一些實施方案中，所述疾病是CD40相關疾病，例如所述疾病是CD40表現或活性降低的疾病(例如與健康對照相比)，或者所述疾病是CD40基因和/或蛋白質位準降低的疾病(例如與健康對照相比)；或所述疾病受益於活化CD40活性，例如活化CD40訊息傳遞途徑，和/或活化T細胞或B細胞或樹突細胞。在一些實施方案中，本發明涉及在個體中活化抗原活性或活化動抗原媒介的訊息傳遞途徑的方法，該方法包括向物件施用有效量的本文公開的抗體或其抗原結合片段。在一些實施方案中，活化CD40活性或活化CD40媒介的訊息傳遞途徑是指活化CD40訊息傳遞途徑。
在一些實施方案中，本發明的所述抗體或其抗原結合片段能夠引起抗體依賴性細胞媒介的細胞毒性(ADCC)，進而殺傷腫瘤細胞。因此，本發明還涉及治療腫瘤的方法，其包括向個體中施用有效量的本發明的抗體或其抗原結合片段。
在另一方面中，本發明涉及預防或治療受試者的腫瘤(例如癌症)的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的本文公開的抗體分子或藥物組成物或免疫綴合物或組合產品或試劑盒。在一些實施方案中，所述腫瘤是癌症。腫瘤可以是實體瘤或液體瘤，例如惡性血液腫瘤。在某些實施方案中，腫瘤是免疫原性腫瘤。在某些實施方案中，腫瘤是非免疫原性的。在某些實施方案中，腫瘤是PD-L1陽性的。在某些實施方案中，腫瘤是PD-L1陰性的。
在一些實施方案中，用抗體分子治療和/或預防的腫瘤包括但不限於實體瘤、血液學癌(例如，白血病、淋巴瘤、骨髓瘤，例如，多發性骨髓瘤)及轉移性病灶。在一個實施方案中，癌是實體瘤。實體瘤的例子包括惡性腫瘤，例如，多個器官系統的肉瘤和癌，如侵襲肺、乳房、卵巢、淋巴樣、胃腸道的(例如，結腸)、肛門、生殖器和生殖泌尿道(例如，腎、膀胱上皮、膀胱細胞、前列腺)、咽、CNS (例如，腦、神經的或神經膠質細胞)、頭和頸、皮膚(例如，黑色素瘤)、鼻咽(例如，分化或未分化的轉移性或局部復發性鼻咽癌)和胰的那些癌、以及腺癌，包括惡性腫瘤，如結腸癌、直腸癌、腎細胞癌、肝癌、非小細胞肺癌、小腸癌和食道癌。癌症可以處於早期、中期或晚期或是轉移性癌。
在一些實施方案中，癌症選自結直腸癌(例如，CRC)、黑色素瘤，例如，晚期黑色素瘤(例如，II-IV期黑色素瘤)或HLA-A2陽性-黑色素瘤；胰腺癌，例如，晚期胰腺癌；乳腺癌，例如，轉移性乳腺癌或三陰性乳腺癌；頭頸癌(例如，HNSCC)；食管癌；腎細胞癌(RCC)，例如，腎透明細胞癌(ccRCC)或轉移性腎細胞癌(MRCC)；肺癌(例如，NSCLC)；子宮頸癌；膀胱癌；或血液學惡性病，例如，白血病(例如，淋巴細胞白血病)或淋巴瘤(例如，何杰金氏淋巴瘤(HL)、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、被套細胞淋巴瘤(MCL)或CLL，例如，復發性或頑固性慢性淋巴細胞白血病。
在一些實施方案中，癌症的例子進一步包括但不限於B細胞增殖性病症，其進一步包括但不限於淋巴瘤[例如B細胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)]和淋巴細胞性白血病。
在一些實施方案中，所述腫瘤是需要活化T細胞或B細胞或樹突細胞的腫瘤，例如癌症，例如具有T細胞功能障礙的腫瘤或癌症。在一些實施方案中，所述腫瘤是OX40的表現或活性被降低的腫瘤。在一些實施方案中，所述腫瘤是受益於OX40訊息傳遞途徑活化的腫瘤，例如癌症。
在一些實施方案中，本文所述的癌症是淋巴瘤、結腸癌、結直腸癌、直腸癌、肺癌(例如非小細胞肺癌)、肝癌、胃癌及其轉移性癌症。
在一些實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段不適用於治療具有CD40表現的血液癌症，其可能被用CD40激動劑治療而惡化。某些癌症可能已知表現CD40並且因此經歷此類惡化，因此可以在類別上被排除。在具體的實施方案中，測試專一性腫瘤樣品的CD40表現並且基於測試結果從用本發明的CD40抗體的療法中排除。
本文公開的方法和組成物可用於治療與前述癌症相關的轉移性病灶。
本發明的專一性結合人CD40的抗體或其抗原結合片段也可預防性地施用，以降低罹患癌症的風險、延遲癌症進展中事件的發作和/或在癌症緩解後降低復發的風險。這對於腫瘤難以定位而由於其它生物因素已知患有腫瘤的患者可能尤其有用。
在另一方面中，本發明涉及預防或治療受試者的感染性疾病的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的本文公開的抗體分子或藥物組成物或免疫綴合物或組合產品或試劑盒。在一個實施方案中，感染性疾病是慢性感染。在一些實施方案中，所述感染是病毒感染。
在一些實施方案中，所述感染是急性的或慢性的。在一些實施方案中，所述慢性感染是持續性的感染、潛伏的感染或緩慢感染。在一些實施方案中，所述慢性感染是由選自細菌、病毒、真菌和原生動物的病原體導致的。
在一些實施方案中，病毒的一些實例包括HIV、肝炎(甲肝、乙肝和丙肝)、皰疹病毒(例如VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II和CMV、EB病毒)、腺病毒、流感病毒、黃病毒、埃可病毒、鼻病毒、柯薩奇病毒、冠狀病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、輪狀病毒、麻疹病毒、風疹病毒、細小病毒、牛痘病毒、HTLV病毒、登革熱病毒、乳頭瘤病毒、軟疣病毒、脊髓灰質炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒和蟲媒腦炎病毒；細菌的一些實例包括衣原體、立克次體、分枝桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、肺炎球菌、腦膜炎球菌和淋病雙球菌、克雷伯氏菌、變形桿菌、黏質訊息氏菌、假單胞菌、退伍軍人菌、白喉、沙門氏菌、芽孢桿菌、霍亂、破傷風、肉毒中毒、炭疽、鼠疫、鉤端螺旋體病和萊姆病病菌；真菌的一些實例包括假絲酵母(白色念珠菌、克魯斯念珠菌、光滑假絲酵母、熱帶假絲酵母等)、新型隱球菌(Cryptococcus neoformans )、麴黴目(煙麴黴、黑麴黴等)、毛黴目(毛黴屬、犁頭黴屬、根黴屬)、申克氏胞絲菌(Sporothrix schenckii )、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis )、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis )、粗球孢子菌(Coccidioides immitis )和莢膜組織胞漿菌(Histoplasma capsulatum )；寄生蟲的一些實例包括痢疾阿米巴(Entamoeba histolytica )、大腸纖毛蟲(Balantidium coli )、變形纖毛蟲(Naegleria fowleri )、棘變形蟲屬種(Acanthamoeba spp.)、蘭氏賈第鞭毛蟲(Giardia lambia )、隱孢子蟲屬種(Cryptosporidium spp.)、肺胞囊蟲(Pneumocystis carinii )、間日瘧原蟲(Plasmodium vivax )、田鼠巴貝氏蟲(Babesia microti )、布氏錐蟲(Trypanosoma brucei )、克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi )、黑熱病利什曼原蟲(Leishmania donovani )、剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii )、巴西日圓線蟲(Nippostrongylus brasiliensis )。
在一些實施方案中，用抗體分子治療和/或預防的感染性疾病包括目前不存在有效疫苗的病原體或常規疫苗對其未及完全有效的病原體。這些包括但不限於HIV、(甲型、乙型和丙型)肝炎、流感、皰疹、賈第鞭毛蟲(Giardia )、瘧疾、利什曼原蟲(Leishmania )、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa )。
可以用本發明公開的方法和組成物治療的疾病還參見WO 2017/059243或WO 2017/004006。
在一些實施方案中，本發明的抗體或藥物組成物或免疫綴合物或組合產品或試劑盒還能與一種或多種其它療法例如治療方式和/或其它治療劑組合施用，用於本文所述的預防和/或治療。
在一些實施方案中，治療方式包括外科手術(例如腫瘤切除術)；放射療法(例如，體外放射治療，它涉及其中設計照射區域的三維順型放射治療)、局部照射(例如，指向預選標靶或器官的照射)或聚焦照射等。聚焦照射可以選自立體定位放射手術、分割立體定位放射手術和強度調節型放射療法。聚焦照射可以具有選自粒子束(質子)、鈷-60(光子)和直線加速器(X射線)的輻射源。放射療法可以透過幾種方法之一或方法組合施用，所述方法包括而不限於體外放射治療、腔內放射治療，植入物照射、立體定位放射手術、全身放射療法、放療法和永久或短暫間質近距放射療法。
在一些實施方案中，治療劑選自化療劑、細胞毒性劑、疫苗、其它抗體、抗感染活性劑或免疫調節劑(例如共刺激分子的活化劑或免疫檢查點分子的抑制劑)。
示例性的其它抗體包括但不限於免疫檢查點抑制劑(例如，抗CTLA-4、抗TIM-3、抗CEACAM)；刺激免疫細胞的抗體(例如，激動性GITR抗體或CD137抗體)；抗癌抗體(例如，利妥昔單抗(Rituxan® 或MabThera® )、曲妥珠單抗(Herceptin® )、托西莫單抗(Bexxar® )、替伊莫單抗(Zevalin® )、阿來組單抗(Campath® )、依帕珠單抗(Lymphocide® )、貝伐珠單抗(Avastin® )、厄洛替尼(Tarceva® )、西妥昔單抗(Erbitux® )，等等。例如，其他抗體可以是抗PD-L1抗體、抗LAG-3抗體、抗PD-1抗體或抗CLA-4抗體。
示例性的疫苗包括但不限於癌症疫苗。疫苗可以是基於DNA的疫苗、基於RNA的疫苗或基於病毒轉導的疫苗。癌症疫苗可以是預防性的或治療性的，諸如癌細胞、純化的腫瘤抗原(包括重組蛋白、胜肽和碳水化合物分子)、細胞和轉染有編碼免疫刺激細胞激素的基因的細胞(He等人 (2004)J.Immunol. 173:4919-28)。可以使用的腫瘤疫苗的非限制性實例包括黑色素瘤抗原的胜肽，諸如gp100的胜肽、MAGE抗原、Trp-2、MART1和/或酪胺酸酶、或經轉染以表現細胞激素GM-CSF的腫瘤細胞。在一些實施方案中，癌症疫苗是胜肽癌症疫苗，其在一些實施方案中是個人化胜肽疫苗。在一些實施方案中，該胜肽癌症疫苗是多價長胜肽、多重胜肽、胜肽混合物、雜合胜肽，或經胜肽脈衝的樹突細胞疫苗(參見例如Yamada等人,Cancer. Sci. , 104:14-21, 2013)。在本發明的任何方法的一些實施方案中，本發明的抗體或其片段的施用與腫瘤抗原的施用組合。抗原可以例如是腫瘤抗原、病毒抗原、細菌性抗原或來自病原體的抗原。在一些實施方案中，腫瘤抗原包含蛋白質。在一些實施方案中，腫瘤抗原包含核酸。在一些實施方案中，腫瘤抗原是腫瘤細胞。
示例性的抗感染活性劑包括但不限於，抗病毒劑、抗真菌劑、抗原生動物劑、抗細菌劑，例如核苷類似物齊多夫定(AST)、更昔洛韋、膦甲酸或cidovir等。
免疫調節劑包括免疫檢查點分子抑制劑和共刺激性分子活化劑。
在一些實施方案中，免疫檢查點分子的抑制劑是CTLA-4、TIM-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CEACAM(例如，CEACAM-1和/或CEACAM-5)和/或TGFR的抑制劑。對分子的抑制可以在DNA、RNA或蛋白質位準進行。在一些實施方案中，抑制性核酸(例如，dsRNA、siRNA或shRNA)可以用來抑制免疫檢查點分子的表現。在其他實施方案中，免疫檢查點分子的抑制劑是與免疫檢查點分子結合的多肽，例如，可溶性配體或抗體或抗體片段。
在一些實施方案中，免疫調節劑是共刺激分子的活化劑或激動劑。在一個實施方案中，共刺激分子的激動劑選自以下分子的激動劑(例如，激動性抗體或其抗原結合片段、或可溶性融合物)：OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、LFA-1 (CD11a/CD18)、ICOS (CD278)、4-1BB (CD137)、GITR、CD30、CD40、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3或CD83配體。
在一些實施方案中，本發明的抗體或其片段可以與包含過繼轉移表現嵌合抗原受體(CAR)的T細胞(例如細胞毒性T細胞或CTL)的治療聯合施用。
在一些實施方案中，本發明的抗體或其片段可以與抗腫瘤劑或溶瘤病毒聯合施用。
在所有上述方法中，CD40激動作用可以與其他形式的免疫療法諸如細胞激素治療(例如干擾素、GM-CSF、G-CSF、IL-2)或雙專一性抗體療法組合，其提供增強的腫瘤抗原呈現。參見例如Holliger (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448；Poljak (1994)Structure 2:1121-1123。
在一些實施方案中，本發明的抗體或其片段可以與增強宿主免疫功能的常規方法組合，所述常規方法包括但不限於：(i)APC增強，諸如(a)向腫瘤注射編碼異源MHC同種異體抗原的DNA，或(b)用增加免疫抗原識別可能性的基因(例如免疫刺激細胞激素、GM-CSF、共刺激分子B7.1、B7.2)轉染活體組織切片的腫瘤細胞，(ii)過繼性細胞免疫療法，或用活化的腫瘤專一性T細胞治療。過繼性細胞免疫療法包括分離腫瘤浸潤的宿主T淋巴細胞，諸如透過IL-2或腫瘤或兩者刺激體外擴增該群體；此外，功能障礙的分離的T細胞也可透過體外應用本發明的抗體來活化，如此活化的T細胞可然後重新施用給宿主。
上文所述的各種組合療法可以進一步組合以用於治療。
更多的本發明抗體與其他治療方式或治療劑的組合的例子可以參見WO 2017/059243或WO 2017/004006等。
此類組合療法涵蓋組合施用(其中兩種或更多種治療劑包含在同一配製劑或分開的配製劑中)，和分開施用，在該情況中，可以在施用別的療法，例如治療方式和/或治療劑之前，同時，和/或之後發生本發明的抗體的施用。抗體分子和/或其他療法，例如治療劑或治療方式可以在活動性疾病期間或在緩解或活動度更小的疾病期間施用。抗體分子可以在其他治療前、與其他治療同時、治療後或在疾病緩解期間施用。
可以理解的是，能夠使用本發明的免疫綴合物或組成物或組合產品或試劑盒替換或補充本發明的抗體來進行任何治療。
本發明的抗體(以及包含其的藥物組成物或免疫綴合物，以及任何另外的治療劑)的施用模式可為任何合適的途徑，諸如胃腸外施用，例如真皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內或皮下、黏膜(口腔、鼻內、陰道內、直腸)或如熟悉本發明所屬技藝的人士瞭解的其它方式。專一性結合CD40的激動性抗體可使用已知的方法瘤內施用到淋巴結引流部位以局部遞送到腫瘤中。本發明的專一性結合人CD40的激動性抗體可透過任何合適的途徑，例如經腸胃外透過靜脈(i.v.)輸液或彈丸式注射、肌內或皮下或腹膜內注射施用於患者。
本文中涵蓋各種用藥時程，包括，但不限於，單次給藥或在多個時間點多次給藥、推注給藥及脈衝輸液。
為了預防或治療疾病，本發明的抗體的合適劑量(當單獨或與一種或多種其他的治療劑組合使用時)將取決於待治療疾病的類型、抗體的類型、疾病的嚴重性和進程、所述抗體是以預防目的施用還是以治療目的施用、以前的治療、患者的臨床病史和對所述抗體的反應，和主治醫師的判斷力。所述抗體以一次治療或經過一系列治療合適地施用於患者。通常，臨床醫師施用組成物直到達到獲得預期效果的劑量。本發明的抗體因此可以單一劑量施用，或者在一定時間內以兩次或更多次劑量(其可包含相同或不同量的所需分子)施用，或者透過植入裝置或導管連續輸液施用。適當的劑量可透過使用適當的劑量反應數據確定。在某些實施方案中，可在延長的時間期限內向患者施用抗體。在某些實施方案中，抗體是每週、每兩週、每月、每兩個月、每三個月、每四個月、每五個月或每六個月給藥。
在某些實施方案中，本文中提供的抗CD40抗體或其抗原結合片段可以用於檢測CD40在生物樣品中的存在。術語“檢測”用於本文中時，包括定量或定性檢測，示例性的檢測方法可以涉及免疫組織化學、免疫細胞化學、流式細胞術(例如，FACS)、抗體分子複合的磁珠、ELISA測定法、PCR-技術(例如，RT-PCR)。在某些實施方案中，生物樣品是血、血清或生物來源的其他液體樣品。在某些實施方案中，生物樣品包含細胞或組織。在一些實施方案中，生物樣品來自本文所述疾病(例如腫瘤或感染)的相關病灶。
在一些實施方案中，CD40是人CD40或食蟹猴CD40。在一些實施方案中，所述方法包括將生物樣品與如本文所述的抗CD40抗體或其抗原結合片段在允許抗CD40抗體與CD40結合的條件下接觸，並檢測在抗CD40抗體和CD40之間是否形成複合物。複合物的形成表示存在CD40。該方法可以是體外或體內方法。在一個實施方案中，抗CD40抗體被用於選擇適合利用抗CD40抗體的治療的受試者，例如其中CD40是用於選擇所述受試者的生物標記物。
在一個實施方案中，可以使用本發明抗體診斷本文所述疾病，例如評價(例如，監測)對象中本文所述疾病的治療或進展、其診斷和/或分期。在某些實施方案中，提供標記的抗CD40抗體。標記包括但不限於，被直接檢測的標記或部分(如螢光標記、發色團標記、電子緻密標記、化學發光標記和放射性標記)，以及被間接檢測的部分，如酵素或配體，例如，透過酵素催化反應或分子相互作用。示例性標記包括但不限於，放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I，螢光團如稀土螯合物或螢光素及其衍生物，玫瑰紅及其衍生物，丹磺醯(dansyl)，繖形酮(umbelliferone)，螢光素酶(luceriferase)，例如，螢火蟲螢光素酶和細菌螢光素酶(美國專利號4,737,456)，螢光素，2,3-二氫酞嗪二酮，辣根過氧化物酵素(HR)，鹼性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡萄糖澱粉酶，溶解酶，糖類氧化酶，例如，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，雜環氧化酶如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶，以及利用過氧化氫氧化染料前驅物的酵素如HR，乳過氧化物酶，或微過氧化物酶(microperoxidase)，生物素/親和素，自旋標記，噬菌體標記，穩定的自由基，等等。
在本文中提供的任何發明的一些實施方案中，樣品是在用抗CD40抗體治療之前獲得的。在一些實施方案中，樣品是在用本文所述疾病藥物治療之前獲得的。在一些實施方案中，樣品是福馬林固定、石蠟包膜(FFPE)的。在一些實施方案中，樣品是活體組織切片(例如粗針組織切片)，手術標本(例如來自手術切除的標本)，或細針吸出物。
在一些實施方案中，在治療之前，例如，在起始治療之前或在治療間隔後的某次治療之前檢測CD40。
在一些實施方案中，提供了包含本發明抗體或其抗原結合片段的檢測試劑盒，用於診斷本文所述疾病，例如腫瘤或感染。
在一些實施方案中，提供了一種治療本文所述疾病例如腫瘤或感染的方法，所述方法包括：對受試者(例如，樣品)(例如，受試者樣品)檢驗CD40的存在，因而確定CD40值，將CD40值與對照值比較，並且如果CD40值小於對照值，則向受試者施用治療有效量的任選與一種或多種其他療法組合的抗CD40抗體(例如，本文所述的抗CD40抗體)，因而治療本文所述疾病，例如腫瘤或感染。
本發明因此還涉及本發明的抗體或其抗原結合片段用於上述方法的用途，以及本發明的抗體或其抗原結合片段在製備用於上述方法的藥物或組成物或組合產品或試劑盒中的用途，和/或本發明的抗體或其抗原結合片段在製備用於診斷本文所述疾病的試劑盒中的用途。
適用於本發明的抗體或其抗原結合片段的方法和用途，同樣適用於包含本發明抗體或其抗原結合片段的免疫綴合物、組成物、組合產品或試劑盒。
在下面的附圖進一步說明本發明。然而，這些附圖和本發明的具體實施方案不應被認為限制本發明的範圍，並且本領域技術人員容易想到的改變將包括在本發明的精神和所附申請專利範圍的保護範圍內。
定義
應理解本文中使用的術語僅為了描述具體實施方案，而並不意圖限制本發明的範圍，其僅會由所附申請專利範圍限制。除非另外定義，本文中使用的所有技術和科學術語與本發明所屬領域中普通技術人員通常的理解具有相同的含義。
為了解釋本說明書，將使用以下定義，並且只要適當，以單數形式使用的術語也可以包括複數，並且反之亦然。要理解，本文所用的術語僅是為了描述具體的實施方案，並且不意欲是限制性的。
術語“約”在與數字數值聯合使用時意為涵蓋具有比指定數字數值小5%的下限和比指定數字數值大5%的上限的範圍內的數字數值。
如本文所用，術語“和/或”意指可選項中的任一項或可選項的兩項或多項。
如本文所用，術語“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整數或步驟，但是不排除任意其他要素、整數或步驟。在本文中，當使用術語“包含”或“包括”時，除非另有指明，否則也涵蓋由所述及的要素、整數或步驟組合的情形。例如，當提及“包含”某個具體序列的抗體可變區時，也旨在涵蓋由該具體序列組成的抗體可變區。
如本文所述，術語“CD40”是本領域已知的，例如人CD40或恆河猴CD40。CD40也被稱為腫瘤壞死因子受體超家族成員5 (TNFRSF5)、CD40L受體或CD154受體。人全長CD40蛋白質是具有277個胺基酸的I型膜蛋白，參見例如NCBI, NM_001250.5。恆河猴CD40參見例如NCBI, NM_001265862.1。
本文所用的術語“抗CD40抗體”、“抗CD40”、“CD40抗體”或“結合CD40的抗體”或“專一性結合CD40的抗體”是指這樣的抗體，所述抗體能夠以足夠的親合力結合(人或恆河猴) CD40亞基或其片段以致所述抗體可以用作標靶(人或恆河猴) CD40中的診斷劑和/或治療劑。在一個實施方案中，抗CD40抗體與非(人或恆河猴) CD40蛋白結合的程度低於所述抗體與(人或恆河猴) CD40結合的約10％、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%或約90%或以上，如例如透過放射性免疫測定(RIA)或生物光干涉測定法或MSD測定法測量的。
專一性地結合人CD40的抗體可能對其它相關的抗原具有交叉反應性，例如，對來自其它物種(同源)(諸如恆河猴)的相同抗原具有交叉反應性。雖然單專一性抗體專一性地結合一個抗原或一個表位，而雙專一性抗體專一性地結合兩個不同的抗原或兩個不同的表位。
“互補決定區”或“CDR區”或“CDR”是抗體可變結構域中在序列上高度變異並且形成在結構上確定的環(“超變環”)和/或含有抗原接觸殘基(“抗原接觸點”)的區域。CDR主要負責與抗原表位結合。重鏈和輕鏈的CDR通常被稱作CDR1、CDR2和CDR3，從N-端開始順序編號。位於抗體重鏈可變結構域內的CDR被稱作HCDR1、HCDR2和HCDR3，而位於抗體輕鏈可變結構域內的CDR被稱作LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一個給定的輕鏈可變區或重鏈可變區胺基酸序列中，各CDR的精確胺基酸序列邊界可以使用許多公知的抗體CDR指派系統的任一種或其組合確定，所述指派系統包括例如：基於抗體的三維結構和CDR環的拓撲學的Chothia (Chothia等人. (1989)Nature 342:877-883, Al-Lazikani等人, “Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins”,Journal of Molecular Biology , 273, 927-948 (1997))，基於抗體序列可變性的Kabat (Kabat等人,  Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第4版, U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)), AbM (University of Bath), Contact (University College London)，國際ImMunoGeneTics database (IMGT)(在全球資訊網imgt.cines.fr/上)，以及基於利用大量晶體結構的近鄰傳播分群(affinity propagation clustering)的North CDR定義。
例如，根據不同的CDR確定方案，每一個CDR的殘基如下所述。
CDR Kabat方案 AbM方案 Chothia方案 Contact方案
LCDR1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36
LCDR2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55
LCDR3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96
HCDR1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B
(Kabat編號系統)
HCDR1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35
(Chothia編號系統)
HCDR2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58
HCDR3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101
(Kabat編號系統)
CDR也可以基於與參考CDR序列(例如本發明示例性CDR之任一)具有相同的Kabat編號位置而確定。
除非另有說明，否則在本發明中，術語“CDR”或“CDR序列”涵蓋以上述任一種方式確定的CDR序列。
除非另有說明，否則在本發明中，當提及抗體可變區中的殘基位置(包括重鏈可變區殘基和輕鏈可變區殘基)時，是指根據Kabat編號系統(Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service， National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))的編號位置。
在一個實施方案中，本發明抗體的CDR透過IMGT規則確定邊界，例如利用IMGT資料庫確定邊界。
應該注意，基於不同的指派系統獲得的同一抗體的可變區的CDR的邊界可能有所差異。即不同指派系統下定義的同一抗體可變區的CDR序列有所不同。因此，在涉及用本發明定義的具體CDR序列限定抗體時，所述抗體的範圍還涵蓋了這樣的抗體，其可變區序列包含所述的具體CDR序列，但是由於應用了不同的方案(例如不同的指派系統規則或組合)而導致其所聲稱的CDR邊界與本發明所定義的具體CDR邊界不同。
“Fc區”或“Fc結構域”或“Fc”指抗體的重鏈的C末端區域，其媒介免疫球蛋白與宿主組織或因子的結合，包括結合位於免疫系統的各種細胞(例如效應細胞)上的Fc受體或結合經典補體系統的第一組分(C1q)。因此，Fc區包含排除第一恆定區免疫球蛋白結構域(例如CH1或CL)的抗體的恆定區。在IgG、IgA和IgD同種型中，Fc區包含抗體的兩條重鏈各自中的CH2和CH3恆定區；IgM和IgE Fc區包含各多肽鏈中的三個重鏈恆定結構域(CH結構域2-4)。對於IgG，Fc區包含免疫球蛋白結構域Cγ2和Cγ3以及Cγ1和Cγ2之間的樞紐。儘管免疫球蛋白重鏈的Fc區的邊界可以改變，但人IgG重鏈Fc區通常定義為從位置C226或P230處的胺基酸殘基(或這兩個胺基酸之間的胺基酸)至重鏈的羧基末端的片段，其中編號根據Kabat中的EU索引。Kabat等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD；還參見美國專利申請公開號2008/0248028的圖3c-3f。人IgG Fc區的CH2結構域從約胺基酸231延伸至約胺基酸340，而CH3結構域位於Fc區中CH2結構域的C末端側，即，其從IgG的約胺基酸341延伸至約胺基酸447(包括C末端賴胺酸)。如本文所用，Fc區可以為天然序列Fc，包括任何同種異型變體，或變體Fc(例如非天然存在的Fc)。Fc也可以孤立地或在含Fc蛋白多肽諸如“包含Fc區的結合蛋白”也稱為“Fc融合蛋白”(例如抗體或免疫黏附分子)的背景下指這一區域。
如本文所用，術語“表位”指抗原(例如，CD40)中與抗體分子專一性相互作用的部分。蛋白抗原內的表位可以從連續的胺基酸(通常為線性表位)或透過蛋白的三級摺疊而並列的不連續胺基酸(通常為構象表位)形成。由連續的胺基酸形成的表位通常(但並非總是如此)對變性溶劑保持暴露，而由三級摺疊形成的表位通常在用變性溶劑處理時喪失。表位通常包括獨特空間構象中的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸。
與參照抗體“結合相同或重疊表位的抗體”是指這樣的抗體，其在競爭分析中阻斷50%、60%、70%、80%、90%或95%以上的所述參照抗體與其抗原的結合，反言之，參照抗體在競爭分析中阻斷50%、60%、70%、80%、90%或95%以上的該抗體與其抗原的結合。
與參照抗體競爭結合其抗原的抗體是指這樣的抗體，其在競爭分析中阻斷50%、60%、70%、80%、90%或95%以上的所述參照抗體與其抗原的結合。反言之，參照抗體在競爭分析中阻斷50％、60%、70%、80%、90%或95%以上的該抗體與其抗原的結合。眾多類型的競爭性結合分析可用於確定一種抗體是否與另一種競爭，這些分析例如：固相直接或間接放射免疫分析(RIA)、固相直接或間接酵素免疫分析(EIA)、夾心競爭分析(參見例如Stahli等, 1983, Methods in Enzymology, 9：242-253)。
抑制(例如競爭性抑制)參照抗體與其抗原的結合的抗體是指這樣的抗體，其抑制50%、60%、70%、80%、90%或95%以上的所述參照抗體與其抗原的結合。反言之，參照抗體抑制50％、60%、70%、80%、90%或95%以上的該抗體與其抗原的結合。抗體與其抗原的結合可以親和力(例如平衡解離常數)衡量。測定親和力的方法是本領域已知的。
與參照抗體顯示相同或相似的結合親和力和/或專一性的抗體是指這樣的抗體，其能夠具有參照抗體的至少50%、60%、70%、80%、90%或95%以上的結合親和力和/或專一性。這可以透過本領域已知的任何測定結合親和力和/或專一性的方法進行測定。
“IgG形式的抗體”是指抗體的重鏈恆定區所屬於的IgG形式。所有同一型的抗體的重鏈恆定區都是相同的，不同型的抗體之間的重鏈恆定區不同。例如，IgG1形式的抗體是指其重鏈恆定區Ig結構域為IgG1的Ig結構域。
“人抗體(HuMAb)”指具有其中框架區和CDR區域均來源於人種系免疫球蛋白序列的可變區的抗體。此外，如果抗體含有恆定區，則恆定區也來源於人種系免疫球蛋白序列。
“人源化”抗體指這樣的抗體，所述抗體中一些、大部分或所有非人抗體(例如小鼠抗體)的CDR結構域外面的胺基酸被來源於人免疫球蛋白的相應胺基酸所替代。在抗體的人源化形式的一個實施方案中，CDR結構域外部的一些、大部分或所有胺基酸已被來自人免疫球蛋白的胺基酸所替代，而一個或多個CDR區內的一些、大部分或所有胺基酸沒有改變。胺基酸的小的添加、缺失、插入、取代或修改是容許的，只要它們沒有消除抗體結合特定抗原的能力。“人源化”抗體保留與原始抗體類似的抗原專一性。
如本文所用，“嵌合抗體”指這樣的抗體，其中可變區來源於一個物種且恆定區來源於另一物種，諸如其中可變區來源於小鼠抗體且恆定區來源於人抗體的抗體。
如本文所用，“抗體片段”指與完整抗體不同的分子，其包含完整抗體的一部分且結合完整抗體所結合的抗原。如本文所用，術語“抗原結合片段”如本文所用指保留專一性結合抗原(例如，人CD40)的能力的抗體的一種或多種片段。抗體片段的例子包括但不限於Fv，Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2 ；diabody；線性抗體；單鏈抗體(例如scFv)；單結構域抗體；雙價或雙專一性抗體或其片段；駱駝科抗體；和由抗體片段形成的雙專一性抗體或多專一性抗體。
如本文所用，“多專一性”是指專一性結合至少兩個不同抗原或抗原內兩個不同表位，例如三個、四個或五個不同的抗原或表位的抗體。
如本文所用，“雙專一性”是指專一性結合兩個不同抗原或同一抗原內的兩個不同表位的抗體。雙專一性抗體可對其它相關抗原具有交叉反應性，或者可結合兩個或更多個不同抗原之間所共用的表位。
如本文所用，術語“交聯”是指在由專一性結合人CD40的抗體結合順式或反式FcγRIIb所誘導的細胞上CD40的更高級聚合反應，導致誘導CD40的激動活性。可在體外將如本文所述的抗人F(ab’)2 用作交聯劑對交聯進行評估。
如本文所用，術語“交叉反應”指本文所述抗體結合來自不同物種的CD40的能力。例如，結合人CD40的本文所述的抗體也結合來自另一物種的CD40 (例如食蟹猴CD40)。如本文所用，交叉反應性可以透過在結合分析(例如SPR、ELISA)中用純化的抗原檢測專一性反應性或結合或以其他方式功能性地與生理表現CD40的細胞相互作用來測量。用於測定交叉反應性的方法包括如本文所述的標準結合分析，例如透過BIACORE® 表面電漿共振(SPR)分析使用BIACORE® 2000 SPR儀器(Biacore AB, Uppsala, Sweden)或流式細胞術技術。
“免疫綴合物”是與一個或多個其它物質(包括但不限於細胞毒性劑或標記)綴合的抗體。
本文所使用的術語“標記”是指被直接或間接綴合或融合至試劑(諸如多核苷酸探針或抗體)並且促進其所綴合或融合的試劑的檢測的化合物或組成物。標記本身可以是可檢測的(例如，放射性同位素標記或螢光標記)或在酵素催化標記的情況下可以催化可檢測的基質化合物或組成物的化學改變。術語旨在涵蓋透過將可檢測物質偶聯(即，物理連接)至探針或抗體來直接標記探針或抗體以及透過與直接標記的另一種試劑反應來間接標記探針或抗體。間接標記的實例包括使用螢光標記的二級抗體進行的一級抗體的檢測和具有生物素的DNA探針的末端標記，使得其可以用螢光標記的鏈黴抗生素蛋白來檢測。
“載體”是指能夠在生物系統內複製或可在這類系統之間移動的多核苷酸。載體多核苷酸通常含有諸如複製起點、聚腺苷酸化訊息或篩選標記的元件，其功能是促進這些多核苷酸在生物系統中的複製或保持。此類生物系統的示例可包括細胞、病毒、動物、植物和用能夠複製載體的生物組分再造的生物系統。包含載體的多核苷酸可為DNA或RNA分子或這些分子的雜合分子。“表現載體”是指可用於在生物系統或再造生物系統中以指導由存在於表現載體中的多核苷酸序列所編碼的多肽進行轉譯的載體。
“分離的”抗體是這樣的抗體，其已經與其天然環境的組分分離。在一些實施方案中，將抗體純化至超過95％或99％純度，如透過例如電泳(例如，SDS-PAGE，等電聚焦(IEF)，毛細管電泳)或層析(例如，離子交換或反相HPLC)確定的。對於用於評估抗體純度的方法的綜述，參見，例如，Flatman等,J. Chromatogr. B848:79-87 (2007)。
“分離的”核酸是指這樣的核酸分子，其已經與其天然環境的組分分離。分離的核酸包括包含在通常包含該核酸分子的細胞中的核酸分子，但是該核酸分子存在於染色體外或在不同於其天然染色體位置的染色體位置處。
如下進行序列之間序列相同性的計算。
為確定兩個胺基酸序列或兩個核酸序列的相同性百分比，將所述序列出於最佳比較目的比對(例如，可以為了最佳比對而在第一和第二胺基酸序列或核酸序列之一或二者中引入空位或可以為比較目的而拋棄非同源序列)。在一個優選實施方案中，為比較目的，所比對的參考序列的長度是至少30%、優選地至少40%、更優選地至少50%、60%和甚至更優選地至少70%、80%、90%、100%的參考序列長度。隨後比較在對應胺基酸位置或核苷酸位置處的胺基酸殘基或核苷酸。當第一序列中的位置由第二序列中對應位置處的相同胺基酸殘基或核苷酸佔據時，則所述分子在這個位置處是相同的。
可以利用數學演算法實現兩個序列間的序列比較和相同性百分比的計算。在一個優選實施方案中，使用已經集成至GCG套裝軟體的GAP程式中的Needlema和Wunsch ((1970)J. Mol. Biol. 48:444-453)演算法(在http://www.gcg.com可獲得)，使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣和空位權重16、14、12、10、8、6或4和長度權重1、2、3、4、5或6，確定兩個胺基酸序列之間的相同性百分比。在又一個優選的實施方案中，使用GCG套裝軟體中的GAP程式(在http://www.gcg.com可獲得)，使用NWSgapdna.CMP矩陣和空位權重40、50、60、70或80和長度權重1、2、3、4、5或6，確定兩個核苷酸序列之間的相同性百分比。特別優選的參數集合(和除非另外說明否則應當使用的一個參數集合)是採用空位罰分12、空位延伸罰分4和移碼空位罰分5的Blossum 62評分矩陣。
還可以使用PAM120加權餘數表、空位長度罰分12，空位罰分4)，利用已經併入ALIGN程式(2.0版)的E. Meyers和W. Miller演算法，((1989) CABIOS, 4:11-17)確定兩個胺基酸序列或核苷酸序列之間的相同性百分比。
額外地或備選地，可以進一步使用本文所述的核酸序列和蛋白質序列作為“查詢序列”以針對公共資料庫執行檢索，以例如鑑定其他家族成員序列或相關序列。
如本文所用，術語“在低嚴格性、中等嚴格性、高嚴格性或極高嚴格性條件下雜交”描述了雜交和洗滌條件。進行雜交反應的指導可以在透過引用方式併入的Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6中找到。參考文獻中描述了含水方法和非含水方法並且可以使用任一方法。本文中提及的專一性雜交條件如下：1)低嚴格性雜交條件是在約45℃於6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中，隨後至少在50℃(對於低嚴格性條件，可以增加洗滌的溫度至55℃)於0.2X SSC，0.1% SDS中洗滌兩次；2)中等嚴格性雜交條件是在約45℃於6X SSC中、隨後在60℃在0.2X SSC、0.1% SDS中洗滌一次或多次；3)高嚴格性雜交條件是在約45℃在6X SSC中、隨後在65℃於0.2X SSC、0.1% SDS中洗滌一次或多次；並且優選地4)極高嚴格性雜交條件是在65℃於0.5 M磷酸鈉、7%SDS中、隨後在65℃於0.2X SSC、0.1% SDS中洗滌一次或多次。極高嚴格性條件(4)是優選的條件和除非另外說明，否則應當使用的一個條件。
術語“宿主細胞”、“宿主細胞株”和“宿主細胞培養物”可交換地使用且是指其中引入外源核酸的細胞，包括這種細胞的後代。宿主細胞包括“轉化體”和“轉化的細胞”，其包括初級轉化的細胞和來源於其的後代，而不考慮傳代的數目。後代在核酸內容上可能與親代細胞不完全相同，而是可以包含突變。本文中包括在最初轉化的細胞中篩選或選擇的具有相同功能或生物學活性的突變體後代。適用於本發明的合適的宿主細胞包括原核微生物，如大腸桿菌。宿主細胞還可以是真核微生物如絲狀真菌或酵母，或各種真核細胞，例如昆蟲細胞等。也可以將脊椎動物細胞用作宿主。例如，可以使用被改造以適合於懸浮生長的哺乳動物細胞株。有用的哺乳動物宿主細胞株的例子包括SV40轉化的猴腎CV1細胞株(COS-7)；人胚腎細胞株(HEK 293或293F細胞)、293細胞、幼倉鼠腎細胞(BHK)、猴腎細胞(CV1)、非洲綠猴腎細胞(VERO-76)、人子宮頸癌細胞(HELA)、犬腎細胞(MDCK)、布法羅大鼠肝臟細胞(BRL 3A)、人肺細胞(W138)、人肝臟細胞(HepG2)、中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)、CHOK1SV細胞、CHOK1SV GS-KO細胞、CHOS細胞、NSO細胞、骨髓瘤細胞株如Y0、NS0、P3X63和Sp2/0等。適於產生蛋白質的哺乳動物宿主細胞株的綜述參見例如Yazaki和Wu, Methods in Molecular Biology, 第248卷(B.K.C. Lo編著, Humana Press, Totowa, NJ), 第255-268頁(2003)。在一個優選的實施方案中，所述宿主細胞是CHO細胞，例如CHOS細胞CHOK1SV細胞或CHOK1SV GS-KO，或所述宿主細胞是293細胞，例如HEK293細胞。
術語“激動劑”或“激動性”是指專一性結合人CD40的抗體，在結合CD40時誘導B細胞和/或樹突細胞(DC)或T細胞的增殖或活化。B細胞和DC和T細胞的增殖或活化可透過如下方式測定：測定增加的B細胞增殖，或者測定B細胞上任何表面標記物CD23、CD80、CD83、CD86，或DC上CD80、CD83、CD86和HLA-DR的向上調控。在與不含抗體的對照樣本進行比較時，激動劑能夠以統計意義上顯著的方式誘導B細胞和/或DC和/或T細胞活化。
“抑制腫瘤細胞/腫瘤生長”是指與在不存在治療劑的情況下相同腫瘤細胞或腫瘤的生長相比，在與治療劑或治療劑的組合接觸時體外或體內腫瘤細胞生長或腫瘤的可測量的下降。體外或體內腫瘤細胞或腫瘤生長的抑制可為至少約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％。
本文所述的術語“治療劑”涵蓋在預防或治療疾病，例如腫瘤(例如癌症)和感染(例如慢性感染)中有效的任何物質，包括化療劑、細胞毒性劑、疫苗、其它抗體、抗感染活性劑、小分子藥物或免疫調節劑。
“化療劑”包括在治療免疫系統疾病中有用的化學化合物，包括但不限於烷化劑；抗代謝物；抗微管抑制劑、天然產物；抗生素；酵素；雜類試劑；激素和拮抗劑；抗雌激素；抗雄激素；非類固醇抗雄激素、拓撲異構酶抑制劑、受體酪胺酸激酶抑制劑、血管生成抑制劑等等。本發明的示例性的化療劑例如阿那曲唑(Arimidex®)、比卡魯胺(Casodex®)、硫酸博來黴素(Blenoxane®)、白消安(Myleran®)、白消安注射劑(Busulfex®)、卡培他濱(Xeloda®)、N4-戊氧羰基-5-去氧-5-氟胞苷、卡鉑(Paraplatin®)、卡莫司汀(BiCNU®)、苯丁酸氮芥(Leukeran®)、順鉑(Platinol®)、克拉立濱(Leustatin®)、環磷醯胺(Cytoxan®或Neosar®)、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷(Cytosar-U®)、阿糖胞苷脂質體注射劑(DepoCyt®)、達卡巴嗪(DTIC-Dome®)、更生黴素(dactinomycin)(放線菌素D、Cosmegan)、鹽酸道諾黴素(Cerubidine®)、檸檬酸道諾黴素脂質體注射劑(DaunoXome®)、地塞米松、多西紫杉醇(Taxotere®)、鹽酸多柔比星(Adriamycin®、Rubex®)、依託泊苷(Vepesid®)、磷酸氟達拉濱(Fludara®)、5-氟脲嘧啶(Adrucil®、Efudex®)、氟他胺(Eulexin®)、tezacitibine、吉西他濱(雙氟去氧胞苷)、羥基脲(Hydrea®)、伊達比星(Idamycin®)、異環磷醯胺(IFEX®)、伊立替康(Camptosar®)、L-天冬醯胺酶(ELSPAR®)、亞葉酸鈣、美法侖(Alkeran®)、6-巰基嘌呤(Purinethol®)、甲胺蝶呤(Folex®)、米托蒽醌(米托蒽醌)、米羅他(mylotarg)、紫杉醇(Taxol®)、phoenix(釔90/MX-DTPA)、噴司他丁、聚苯丙生20聯用卡莫司汀植入物(Gliadel®)、檸檬酸他莫昔芬(Nolvadex®)、替尼泊苷(Vumon®)、6-硫鳥嘌呤、塞替派、替拉紮明(Tirazone®)、注射用鹽酸拓撲替康(Hycamptin®)、長春鹼(Velban®)、長春新鹼(Oncovin®)、長春瑞濱(長春瑞濱)、依魯替尼、吉利德(idelalisib)和貝倫妥單抗-維多汀(brentuximab vedotin)，以及任何上述物質的藥學上可接受的鹽、酸或衍生物。該定義還包括用於調節或抑制激素對腫瘤的作用的抗激素藥物諸如抗雌激素藥物，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香化酶抑制4(5)-咪唑、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬、keoxifene、LY117018、奧那司酮和托瑞米芬和抗雄激素，諸如氟他胺、尼魯米特、比卡魯胺、醋酸亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及上述任一者的藥學上可接受的鹽、酸 或衍生物。
術語“細胞毒性劑”用在本發明中指抑制或防止細胞功能和/或引起細胞死亡或破壞的物質。示例性的細胞毒性劑包括但不限於：放射性同位素，例如碘(131 I、125 I、123 I和121 I)、碳(14 C)、硫(35 S)、氚(3 H)、銦(115 In、113 In、112 In和111 In)、鍀(99 Tc)、鉈(201 Ti)、鎵(68 Ga、67 Ga)、鈀(103 Pd)、鉬(99 Mo)、氙(133 Xe)、氟(18 F)、153 Sm、177 Lu、159 Gd、149 Pm、140 La、175 Yb、166 Ho、90 Y、47Sc、186 Re、188 Re、142 Pr、105 Rh、97 Ru、68 Ge、57 Co、65 Zn、85 Sr、32 P、153 Gd、169 Yb、51 Cr、54 Mn、75 Se、113 Sn和117 Tin；生長抑制劑；烷化劑(包括但不限於氮芥、乙烯亞胺衍生物、烷基磺酸鹽、亞硝基脲和三氮烯)，例如脲嘧啶氮芥、氮芥(Chlormethine)、環磷醯胺(CYTOXANTM )、異環磷醯胺(fosfamide)、美法侖、苯丁酸氮芥、溴丙哌嗪、三乙撐蜜胺、三亞乙基硫代磷胺(Triethylenethiophosphoramine)、白消安、卡莫司汀、洛莫司汀、鏈脲黴素、達卡巴嗪和替莫唑胺；或抗代謝物(包括但不限於葉酸拮抗劑、嘧啶類似物、嘌呤類似物和腺苷脫胺酶抑制劑)：甲胺蝶呤、5-氟脲嘧啶、氟尿苷、阿糖胞苷、6-巰嘌呤、6-硫鳥嘌呤、磷酸氟達拉濱、噴司他丁(Pentostatine)和吉西他濱。在一些實施方案中，本發明的示例性的細胞毒性劑包括抗微管藥物、拓撲異構酶抑制劑、抗代謝藥、有絲分裂抑制劑、烷基化劑、蒽環類、長春鹼類生物鹼、嵌入劑、能夠干擾訊息轉導途徑的活性劑、促凋亡活性劑、蛋白酶體抑制劑和照射(例如，局部或全身照射(例如、γ輻射)。
術語“小分子藥物”是指低分子量的能夠調節生物過程的有機化合物。“小分子”被定義為分子量小於10 kD、通常小於2 kD和優選小於1 kD的分子。小分子包括但不限於無機分子、有機分子、含無機組分的有機分子、含放射性原子的分子、合成分子、胜肽模擬物和抗體模擬物。作為治療劑，小分子可以比大分子更能透過細胞、對降解更不敏感和更不易於引發免疫反應。有關小分子，例如抗體和細胞激素的胜肽模擬物，以及小分子毒素的描述參見例如Casset等, (2003)Biochem. Biophys. Res. Commun. 307:198-205；Muyldermans (2001)J. Biotechnol. 74:277-302；Li (2000)Nat. Biotechnol. 18:1251-1256；Apostolopoulos等, (2002)Curr. Med. Chem. 9:411-420；Monfardini等, (2002)Curr. Pharm. Des. 8:2185-2199；Domingues等, (1999)Nat. Struct. Biol. 6:652-656；Sato和Sone (2003)Biochem. J. 371:603-608；美國專利號6,326,482。
術語“抗感染活性劑”包括在施用濃度和給藥間隔下專一性抑制或消除微生物生長但對宿主不致命的任何分子，所述微生物諸如病毒、細菌、真菌或原生動物，例如寄生蟲。用於本文時，術語抗感染活性劑包括抗生素、抗細菌劑、抗病毒劑、抗真菌劑和抗原生動物劑。在一個具體方面中，抗感染活性劑在施用濃度和給藥間隔對宿主是無毒的。
抗細菌的抗感染活性劑或抗細菌劑可廣泛的分類為殺菌的(即，直接殺死)或抑菌的(即，阻止分裂)。抗菌的抗感染活性劑可進一步再分類為狹效型抗菌劑(即，僅影響小類細菌亞型，例如，革蘭氏陰性等)或廣效型抗菌劑(即，影響廣泛種類)。實例包括阿米卡星、慶大黴素、格爾德黴素、除莠黴素、莫匹羅星、呋喃妥因、吡嗪醯胺、奎奴普丁/達福普汀、利福平/異福醯胺或替硝唑等。
術語“抗病毒劑”包括抑制或消除病毒生長、致病和/或存活的任何物質。這包括例如阿昔洛韋、西多福韋、齊多夫定、去羥肌苷(ddI，VIDEX)、紮西他濱(ddC，HIVID)、司他夫定(d4T，ZERIT)、拉米夫定(3TC，EPIVIR)、阿巴卡韋(ZIAGEN)、恩曲他濱(EMTRIVA)等。
術語“抗真菌劑”包括抑制或消除真菌生長、致病和/或存活的任何物質。這包括例如那他黴素、龜裂殺菌素、非律平、制黴菌素、兩性黴素B、坎底辛、綠葉刺蕊草(patchouli)、印度楝樹種子油(neem seed oil)、椰子油(Coconut Oil)等。
術語“抗原生動物劑”包括抑制或消除原生動物生物體(例如寄生蟲)生長、發病和/或存活的任何物質。抗原生動物劑的實例包括抗瘧疾試劑例如，奎寧、奎尼丁等。
本文使用的術語“免疫調節劑”指抑制或調節免疫反應的天然或合成活性劑或者藥物。免疫反應可以是體液反應或細胞反應。免疫調節劑包含免疫抑制劑。
術語“免疫檢查點分子”意指免疫系統中存在的一類抑制性訊息分子，透過調節周邊組織中免疫反應的持續性和強度避免組織損傷，並參與維持對於自身抗原的耐受(Pardoll D.M., The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy.Nat. Rev. Cancer , 2012, 12(4):252-264)。研究發現，腫瘤細胞能夠逃避體內免疫系統而失控增殖的原因之一是利用了免疫檢查點分子的抑制性訊息傳遞途徑，由此抑制了T淋巴細胞活性，使得T淋巴細胞不能有效發揮對腫瘤的殺傷效應(Yao S., Zhu Y.和Chen L., Advances in targeting cell surface signaling molecules for immune modulation.Nat. Rev. Drug Discov. , 2013, 12(2):130-146)。免疫檢查點分子包括但不限於程式性細胞死亡受體1 (PD-1)、PD-L1、PD-L2、細胞毒性T淋巴細胞抗原4 (CTLA-4)、LAG-3和TIM-3。
術語“共刺激分子”是指T細胞上的與共刺激配體專一性結合從而媒介T細胞的共刺激反應(例如但不限於增殖)的相應結合配偶體。共刺激分子是除抗原受體或其配體之外的有助於有效免疫反應的細胞表面分子。共刺激分子包括但不限於MHC I類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白樣蛋白、細胞激素受體、整合蛋白、訊息傳導淋巴細胞活化分子(SLAM蛋白)、活化NK細胞受體、OX40、CD40、GITR、4-1BB (即CD137)、CD27和CD28。在一些實施方案中，“共刺激分子”是OX40、GITR、4-1BB (即CD137)、CD27和/或CD28。
術語“細胞激素”是由一種細胞群釋放，作為細胞間介質作用於另一細胞的蛋白質的通稱。此類細胞激素的例子有淋巴激素、單核因子、介白素(IL)，諸如IL-1，IL-1α，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-11，IL-12，IL-15；腫瘤壞死因子，諸如TNF-α或TNF-β；及其它多肽因子，包括LIF和kit配體(KL)和γ-干擾素。如本文中使用的，術語細胞激素包括來自天然來源或來自重組細胞培養物的蛋白質及天然序列細胞激素的生物學活性等效物，包括透過人工合成產生的小分子實體，及其藥劑學可接受的衍生物和鹽。
術語“抑制劑”或“拮抗劑”包括使所提供分子(例如，免疫檢查點分子)的某些參數(例如，活性)降低的物質。例如，這個術語包括使得所提供的分子被抑制至少5%、10%、20%、30%、40%或更多的活性(例如，PD-L1活性)的物質。因此，抑制作用不必是100%。
術語“活化劑”包括使所提供分子(例如，共刺激分子)的某些參數(例如，活性)增加的物質。例如，這個術語包括使得所提供的分子被增加至少5%、10%、20%、30%、40%或更多的活性(例如，OX40活性)的物質。因此，活化作用不必是100%。
術語“藥用輔料”指與活性物質一起施用的稀釋劑、佐劑(例如弗氏佐劑(完全和不完全的))、賦形劑、載體或穩定劑等。
術語“藥物組成物”指這樣的組成物，其以允許包含在其中的活性成分的生物學活性有效的形式存在，並且不包含對施用所述組成物的受試者具有不可接受的毒性的另外的成分。
術語“組合產品”是指一種劑量單位形式的固定組合或非固定組合或用於組合施用的部分的試劑盒，其中兩種或更多種治療劑可以獨立地在同一時間或在時間間隔內分開施用，尤其是在這些時間間隔允許組合伴侶展示協作，例如，協同效應時。術語“固定組合”是指本發明抗體和組合伴侶(例如其他治療劑，例如免疫調節劑，例如免疫抑制劑或抗炎劑)以單一實體或劑量的形式同時施用於患者。術語“非固定組合”意指本發明抗體和組合伴侶(例如其他治療劑，例如免疫調節劑，例如免疫抑制劑或抗炎劑)作為分開的實體同時、並行或依次施用於患者，沒有特定的時間限制，其中這樣的施用提供了患者體內兩種化合物的治療有效位準。後者也適用於雞尾酒療法，例如施用三種或更多種治療劑。在一個優選的實施方案中，藥物組合是非固定組合。
“免疫原性”指特定物質引發免疫反應的能力。腫瘤是免疫原性的，並且增強腫瘤免疫原性有助於透過免疫反應清除腫瘤細胞。
“免疫反應”指脊椎動物中針對外源物的生物反應，所述反應保護生物體免於這些物質和由其引起的疾病。免疫反應由免疫系統的細胞 (例如，T淋巴細胞、B淋巴細胞、自然殺手(NK)細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞、樹突細胞或嗜中性粒細胞)和由這些細胞或肝臟產生的可溶性大分子(包括抗體、細胞激素和補體)的作用媒介，其導致從脊椎動物機體選擇性標靶、結合、損傷、破壞和/或消除入侵病原體、細胞或感染有病原體的組織、癌性或其他異常細胞、或者(在自體免疫或病理性炎症的情況下)正常人細胞或組織。免疫反應包括例如活化或抑制T細胞，例如，效應T細胞或Th細胞，諸如CD4+或CD8+ T細胞，或者抑制或耗盡Treg細胞。“T效應”(“Teff ”)細胞指具有細胞溶解活性的T細胞(例如CD4+和CD8+ T細胞)以及T輔助(Th)細胞(其分泌細胞激素並活化和引導其他免疫細胞)，但不包括調節性T細胞(Treg細胞)。
術語“有效量”指本發明的抗體或片段或綴合物或組成物的這樣的量或劑量，其以單一或多次劑量施用患者後，在需要治療或預防的患者中產生預期效果。有效量可以由作為本領域技術人員的主治醫師透過考慮以下多種因素來容易地確定：諸如哺乳動物的物種；它的大小、年齡和一般健康；涉及的具體疾病；疾病的程度或嚴重性；個體患者的反應；施用的具體抗體；施用模式；施用製劑的生物利用率特徵；選擇的給藥方案；和任何伴隨療法的使用。
“治療有效量”指以需要的劑量並持續需要的時間段，有效實現所需治療結果的量。抗體或抗體片段或其綴合物或組成物的治療有效量可以根據多種因素如疾病狀態、個體的年齡、性別和重量和抗體或抗體部分在個體中激發所需反應的能力而變動。治療有效量也是這樣的一個量，其中抗體或抗體片段或其綴合物或組成物的任何有毒或有害作用不及治療有益作用。相對於未治療的物件，“治療有效量”優選地抑制可度量參數(例如腫脹率等)至少約20%、更優選地至少約40%、甚至更優選地至少約50%、60%或70%和仍更優選地至少約80%或90%。可以在預示人自體免疫疾病或炎症中的功效的動物模型系統中評價化合物抑制可度量參數(例如，腫脹率)的能力。
“預防有效量”指以需要的劑量並持續需要的時間段，有效實現所需預防結果的量。通常，由於預防性劑量在對象中在疾病較早階段之前或在疾病較早階段使用，故預防有效量將小於治療有效量。
本文所述的“個體”或“受試者”可以互換使用，包括哺乳動物。哺乳動物包括但不限於，家養動物(例如，牛，羊，貓，狗和馬)，靈長類動物(例如，人和非人靈長類動物如猴)，兔，以及齧齒類動物(例如，小鼠和大鼠)。在一些實施方案中，個體或受試者可以是哺乳動物，例如，靈長類，優選地，高級靈長類，例如，人類(例如，患有本文所述疾病或具有患有本文所述疾病的風險的患者)。在一個實施方案中，受試者患有本文所述疾病(例如，如本文所述的腫瘤或感染)或具有患有本文所述疾病的風險。在某些實施方案中，受試者接受或已經接受過其它治療，例如化療治療和/或放射療法。備選地或組合下，受試者因感染而免疫受損或具有因感染而免疫受損的風險。
術語“組合療法”是指施用兩種或更多種治療劑或治療方式(例如放射療法或手術)以治療如本公開所述的IL-23相關疾病。這種施用包括以基本上同時的方式共同施用這些治療劑，例如以具有固定比例的活性成分的單一膠囊。或者，這種施用包括對於各個活性成分在多種或在分開的容器(例如片劑、膠囊、粉末和液體)中的共同施用。粉末和/或液體可以在施用前重構或稀釋至所需劑量。此外，這種施用還包括以大致相同的時間或在不同的時間以順序的方式使用每種類型的治療劑。在任一情況下，治療方案將提供藥物組合在治療本文所述的病症或病狀中的有益作用。
用於本文時，“治療”指減緩、中斷、阻滯、緩解、停止、降低、或逆轉已存在的症狀、病症、病況或疾病的進展或嚴重性。
用於本文時，“預防”包括對疾病或病症或特定疾病或病症的症狀的發生或發展的抑制。在一些實施方式中，具有免疫系統疾病(自體免疫疾病或炎症)家族病史的受試者是預防性方案的候選。通常，在免疫系統疾病(自體免疫疾病或炎症)的背景中，術語“預防”是指在免疫系統疾病(自體免疫疾病或炎症)的病徵或症狀發生前，特別是在具有免疫系統疾病(自體免疫疾病或炎症)風險的受試者中發生前的藥物施用。
“受試者/患者樣品”指從患者或受試者得到的細胞或流體的集合。組織或細胞樣品的來源可以是實體組織，像來自新鮮的、冷凍的和/或保存的器官或組織樣品或活體組織切片樣品或穿刺樣品；血液或任何血液組分；體液，諸如腦脊液、羊膜液(羊水)、腹膜液(腹水)、或間隙液；來自受試者的妊娠或發育任何時間的細胞。組織樣品可能包含在自然界中天然不與組織混雜的化合物，諸如防腐劑、抗凝劑、緩衝劑、固定劑、營養物、抗生素、等等。
本發明的這些以及其它方面和實施方案在附圖(附圖簡述緊隨其後)和以下的發明詳述中得到描述並且示例於以下實施例中。上文以及整個本申請中所論述的任何或所有特徵可以在本發明的各種實施方案中組合。以下實施例進一步說明本發明，然而，應理解實施例以說明而非限定的方式來描述，並且本領域技術人員可以進行多種修改。實施例 實施例 1. 建構報導細胞株 Jurkat/NF-κB-GFP +hCD40
NF-κB-GFP報導基因慢病毒系統(QIAGEN，CCS-013G)的啟動子中有多個NF-κB轉錄因子結合元件，該啟動子的活化可以驅動GFP的表現。根據試劑盒的說明書，用NF-κB-GFP報導基因慢病毒感染Jurkat細胞(ATCC，TIB-152)，並用嘌呤黴素(InvivoGen，ant-pr-1)篩選感染慢病毒的Jurkat 細胞。加入10 ng/ml TNFα 蛋白(Sino Biological，10602-HNAE)刺激利用嘌呤黴素篩選到的細胞，24 h後流式細胞儀(BD，FACSAria III)分選GFP螢光的細胞亞群，獲得Jurkat/NF-κB-GFP 細胞。
將人CD40 CDS (Sino Biological，HG10774-M)建構至慢病毒核心質體pCDH (System Biosciences)中，使用標準步驟用PEI (polyscience，24885-2)向293FT細胞(Thermo Fisher Scientific，R70007)中按1：1：1：1共轉染所獲得的慢病毒核心質體和輔助質體pPACKH1-GAG、pPACKH1-REV、pVSVG (均來自System Biosciences)，轉染6 h後換液，37℃培養於含10%胎牛血清(Biological Industries，04-001-1A)的DMEM培養基(Lifetechnologies，C11995500CP)中，繼續培養48 h收集含有人CD40慢病毒的上清液。
本文所用陽性對照CD40L序列來自專利WO 2016/177771 (SEQ ID NO:15)，陰性對照HEL序列如表10所示。CD40L和HEL的DNA序列在金唯智公司進行全基因合成。對於CD40L和HEL純化，將DNA序列插入真核表現載體pFUSE (InvivoGen，pfuse-hg1fc1)中，使用標準步驟用PEI轉染至293F細胞(Thermo Fisher Scientific，R79007)；利用Freestyle培養基(Lifetechnologies，12338026)在37℃振盪器培養細胞。培養7天後收集上清液，並在AKTA系統(GE)上使用Superdex™ 200 Increase預裝柱(GE，28-9909-44)純化。
CD40訊息轉導可以活化NF-κB途徑，如果CD40成功表現於Jurkat/NF-κB-GFP細胞膜表面，CD40L刺激將會誘導GFP的表現。將如上所述分選獲得的建構好的Jurkat/NF-κB-GFP細胞用上述獲得的人CD40慢病毒上清液感染，16 h後加入100 nM上述獲得CD40L蛋白(作為陽性對照)和HEL (作為陰性對照)刺激，24 h後流式細胞儀單細胞分選GFP螢光最強的細胞至96井培養盤中。
將上述96井培養盤中的細胞在含有10%胎牛血清(Biological Industries，04-001-1A)的RPMI 1640培養基(Lifetechnologies，C11875500CP)中培養2周，待單細胞長起來後分別加入100 nM上述獲得三聚化CD40L蛋白(作為陽性對照)和HEL(作為陰性對照)，挑選CD40L強陽性、HEL陰性的單轉殖株，作為Jurkat/NF-κB-GFP +hCD40 (簡稱NF-κB-GFP +hCD40)細胞，用於後續實驗。結果如圖1，CD40L刺激後Jurkat/NF-κB-GFP +hCD40單轉殖株GFP陽性率為94.7%，HEL刺激無活化。實施例 2. 從噬菌體呈現抗體庫中篩選 CD40 結合抗體
從天津市血液中心及上海秒通生物公司購買30例健康成人周邊血，利用ficoll分離液(灝洋，LDS1075)離心獲取PBMC，離心條件：20℃，2000rpm，升5降0模式30分鐘。使用如上所述獲得的PBMC建構人天然抗體庫，庫的建構為常規方法(phage display, Tim Clackson and Henry B. Lowman)。將獲得抗體重鏈和輕鏈可變區隨機組合以單鏈抗體scFv的形式呈現於噬菌體衣殼蛋白pIII的N端，獲得噬菌體呈現抗體庫，庫容達到1010 。
噬菌體篩選為常規技術(Phage Display:A Laboratory Manual, Carlos F. Barbas III)。首先，將生物素化CD40蛋白(acrobiosystems，TN5-H82F9)與如上所述獲得的噬菌體呈現抗體庫室溫培育2h。培育結束後直接加入150 μl鏈黴親和素磁珠Dynabeads M280 (Lifetechnologies，11205D)，在室溫混合器上培育30 min。用0.05% PBS-tween (PBS：Lifetechnologies，70011044；Tween：Sigma-Aldrich，9005-64-5)洗去不與抗原結合的噬菌體，最後用0.2 M甘胺酸-鹽酸(PH2.2)洗提與抗原結合的噬菌體。應用洗提的噬菌體感染大腸桿菌XL1-blue (Agilent，200236)，加入輔助噬菌體VCSM13 (Agilent，200251)擴增後用於下一輪篩選。共進行三輪篩選。三輪後，富集與CD40結合的抗體噬菌體，篩選結果如表1。 表1    利用噬菌體呈現技術從人天然抗體庫中篩選CD40結合抗體
    第一輪 第二輪 第三輪
CD40 起始數 5.4×1013 8×1012 9.2×1012
獲得數 8×106 3×107 2×109
為了初步評估篩選到CD40結合抗體的陽性率，我們分別挑取第二、三輪29個噬菌體單轉植株，進行噬菌體ELISA分析。噬菌體ELISA為常規技術，具體如下：從深井培養盤中培養的噬菌體單轉植株中各挑取第二、三輪29個噬菌體單轉植株，37 ℃ 300 rpm搖至OD = 0.5～0.8，加入輔助噬菌體VCSM13擴增後30℃過夜誘導噬菌體，用於抗體表現。在ELISA培養盤(Corning，3690)上包被1 μg/ml的人源CD40 (Acrobiosystems，CD0-H5228)，4℃過夜培育。向過夜培育後的ELISA培養盤上加入過夜誘導的噬菌體上清液，室溫培育1h，0.05% PBST洗8次。利用BSA (Solarbio，A8020-100)作為陰性對照。加入HRP偶聯的抗-M13 (GE，27-9421-01，M13為噬菌體衣殼蛋白)檢測結合的抗體噬菌體。將CD40結合訊號是BSA對照的3倍以上定義為陽性轉殖株。結果如圖2，其中第二輪篩選、第三輪篩選的陽性率分別為6.9%、27.6%。實施例 3. 共刺激分子 CD40 的激動劑抗體篩選
首先，我們將第三輪噬菌體呈現富集到的抗體次轉殖到分泌型慢病毒載體pCDH中，同時將N27 ScFv轉殖到分泌型慢病毒載體pCDH中作為陰性對照，N27 ScFv序列見表11。向293FT 細胞中按1：1：1：1共轉染慢病毒核心質體和輔助質體pPACKH1-GAG、pPACKH1-REV、pVSVG，轉染6 h後換液，37℃培養於含10%胎牛血清(Biological Industries，04-001-1A)的DMEM培養基中，繼續培養48 h收集含有CD40結合抗體慢病毒庫的上清液；用50000 pg所獲得的CD40結合抗體的慢病毒庫感染HEK293細胞，感染16 h後，離心去除含有慢病毒的培養基，添加新鮮培養基，利用流式分選技術將感染的HEK293細胞分選到96井培養盤中，使每個井僅含有1個感染HEK293細胞，培養細胞3周，待細胞達到一定數量後取上清液。上清液加入如上所述獲得的Jurkat/NF-κB-GFP+hCD40報導細胞3×105 個，同時加入2.5 μg/ml山羊抗人Fc (SouthernBiotech，SBA-2048-01)的二抗，交聯細胞分泌的抗體以增強激動劑抗體的活化強度；培養24h後測試細胞上清液的活性，陽性抗體的檢測結果如圖3；從細胞上清液活性為陽性的HEK293細胞中萃取抗體基因，建構至pFUSE載體進行定序，獲得陽性抗體VH及VL序列，獲得的兩個陽性抗體編號為NK003和NK004，其序列(包括CDR、VH/VL和重鏈、輕鏈)參見序列表的表4至表8中的序列。實施例 4. 全長抗體 IgG 的表現和純化
抗體的表現與純化為常規方法，具體如下：
根據抗體序列，合成篩選出的激動劑抗體NK003、NK004重鏈和輕鏈DNA (金唯智)，將其分別轉殖至載體pFUSE中，使用標準步驟用PEI將分別含有重鏈和輕鏈的質體二者按1：1瞬時共轉染至293F懸浮細胞，以表現全長抗體。培養1周後在AKTA系統上使用Superdex™ 200 Increase預裝柱純化。
SDS-PAGE法鑑定純化抗體，應用粒徑篩析預裝柱 Superdex 200分析抗體的聚集。結果如圖4，其中NK003洗提峰形對稱且洗提時的滯留時間與單個分子量的單株抗體保持一致，同時抗體中存在少量聚集體。實施例 5. 人源 CD40 抗體 NK003 、 NK004 的體外特徵鑑定 5.1    NK003、NK004與CD40的結合
透過與TNFR家族成員OX40、4-1BB和GITR的直接ELISA，評價NK003的結合選擇性。在ELISA培養盤上包被含有1 μg/ml人源OX40 (Acrobiosystems，OX0-H5224)、4-1BB (Acrobiosystems，41B-H5227)、GITR (Acrobiosystems，GIR-H5228)和CD40 (Acrobiosystems，CD0-H5228)的PBS溶液，4℃過夜培育。加入如實施例4獲得的用PBS稀釋至不同濃度的NK003：0.625 μg/ml、1.25 μg/ml、2.5 μg/ml和5 μg/ml，室溫培育30 min後，0.05% PBS-Tween洗8次。加入羊抗人HRP偶聯的Fc抗體 (SouthernBiotech，2048-05)檢測結合的NK003。如圖5A所示，NK003選擇性與人CD40結合，與其他測試的TNFR家族蛋白低結合或不結合。
為了評價NK004與CD40的結合，在ELISA培養盤上包被1 μg/ml的人源CD40 (Acrobiosystems，CD0-H5228)的PB溶液，4℃過夜培育。加入如實施例4獲得的PBS稀釋至不同濃度NK004：0.002 nM、0.016 nM、0.13 nM、1 nM、8 nM、64 nM和500 nM，HEL為陰性對照抗體，室溫培育30 min後，0.05% PBS-Tween洗8次。加入羊抗人HRP偶聯的Fc抗體檢測結合的NK004。如圖5B所示，NK004可以與人CD40結合。 5.2    NK003阻斷CD40L與CD40結合
用ELISA評價NK003對CD40L與CD40結合的作用。首先，使用蛋白生物素化試劑盒(GeneCopoeia，BI001)，根據說明書生物素化CD40L。在ELISA培養盤上塗佈1 μg/ml的人源CD40，4℃過夜培育。加入如實施例4獲得的PBS稀釋至不同濃度NK003：0.156 μg/ml、0.313 μg/ml、0.625 μg/ml、1.25 μg/ml、2.5 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml和20 μg/ml，HEL為對照抗體，室溫培育1 h後，加入2.5 μg/ml 生物素化的CD40L，室溫培育30 min後，0.05% PBS-Tween洗8次。加入Streptavidin-HRP使用微量培養盤讀取儀(SpectraMax i3x)讀取OD405數值，檢測結合CD40L與CD40的結合量。結果如圖所示6，NK003阻斷CD40與CD40L的結合。 5.3    NK003、NK004以交聯形式活化NF-κB-GFP+hCD40報導細胞株
本實施例中透過流式細胞術檢測NK003、NK004抗體活化NF-κB-GFP+hCD40報導細胞株的情況，並且測定兩種抗體的EC50，具體步驟如下：
分別取3×105 個/管如實施例1中獲得NF-κB-GFP+hCD40報導細胞，分別加入如實施例4中獲得的稀釋至不同濃度的NK003或NK004：0.001 μg/ml、0.005 μg/ml、0.01 μg/ml、0.05 μg/ml、0.1 μg/ml、0.5 μg/ml、1 μg/ml、5 μg/ml和10 μg/ml，利用10 μg/ml HEL抗體做陰性對照；為了交聯，各組同時加入2.5 μg/ml濃度的二抗，即山羊抗人Fc。在含有10%胎牛血清(Biological Industries，04-001-1A)的RPMI 1640培養基(Lifetechnologies，C11875500CP)中37℃共同培養24 h後，PBS洗三次，應用流式細胞儀進行分析。獲得的資料使用GraphPad Prism 6.0擬合曲線並計算EC50。結果如圖7，NK003對CD40的活化依賴二抗交聯，以交聯形式活化NF-κB-GFP+hCD40報導細胞株，EC50為2 nM (圖7A)。NK004對CD40的活化不依賴二抗交聯，以組成型模式活化NF-κB-GFP+hCD40報導細胞株，加入二抗時EC50為4 nM (圖7B)。 5.4    表面電漿共振對NK003動力學和親和力定量分析
Biacore T200 (GE Healthcare)用於檢測抗體NK003、NK004的親和力。將NK003、NK004以10 μL/min流過Protein A晶片，捕獲在晶片上。用Running buffer (HBS-EP+，GE)連續稀釋待測抗原人CD40重組蛋白(Acrobiosystems，CD0-H5228)，濃度設置為2 μM、1 μM、500 nM、250 nM、125 nM、62.5 nM、31.25 nM。將上述不同濃度CD40按30 μL/min流速流過捕獲有抗體的晶片，結合120 s，然後晶片以30 μL/min的流速流過Running buffer，240 s，抗原逐漸從捕獲抗體的晶片上解離。資料處理使用Biacore T200儀器配套軟體BIAevaluation software S200進行，計算結合常數(Ka)、解離常數(Kd)和平衡解離常數(KD )。結果如表2所示。 表2    應用表面電漿共振技術平台測量抗體與人CD40的親和力
感測器 抗體 抗原 ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
Protein A NK003 CD40 3.67E+04 1.21E-02 3.31E-07
Protein A NK004 CD40 8.87E+04 3.90E-02 4.40E-07
5.5    NK003交叉反應
透過流式細胞術檢測表現恆河猴和人的CD40的293FT細胞與NK003的結合，測定NK003與恆河猴和人CD40的交叉反應。
將恆河猴CD40 (NCBI，NM_001265862.1)與人CD40 (NCBI，NM_001250.5)的CDS區(金唯智合成)轉殖到pCDH載體中，使用標準步驟用PEI瞬時轉染到293FT細胞中，轉染6 h後換液，37℃培養於含10%胎牛血清(Biological Industries，04-001-1A)的DMEM培養基中，表現48 h後獲得分別表現恆河猴CD40的細胞和表現人CD40的細胞。
分別取3×105 個/管如上所述獲得的表現恆河猴和人CD40的293FT細胞，加入如實施例4所述製備的用PBS稀釋至不同濃度的NK003：0.001 μg/ml、0.005 μg/ml、0.01 μg/ml、0.05 μg/ml、0.1 μg/ml、0.5 μg/ml、1 μg/ml、5 μg/ml和10 μg/ml， HEL 10 μg/ml作為陰性對照，將細胞和不同濃度NK003 4℃共同培育30 min，PBS洗三次，按1：100加入Alexa Fluro 488山羊抗人Fc螢光二抗(Lifetechnologies，A11013)，避光4℃培育30 min後採用流式細胞儀進行分析。使用GraphPad Prism 6.0擬合曲線並計算EC50，結果如圖8所示，可見NK003與恆河猴CD40 (圖8B)、人CD4 0(圖8A)均有交叉反應，與恆河猴CD40結合EC50為8 nM，與人CD40結合EC50為10 nM。 5.6    NK003誘導腫瘤細胞凋亡
淋巴瘤細胞Raji和Ramos膜表面有CD40的表現，我們使用Raji細胞(ATCC，CRL-7936)和Ramos細胞(ATCC，CRL-1596)，檢測NK003促進腫瘤細胞凋亡的能力。
將Raji和Ramos細胞以3×105 /mL的密度接種於24井培養盤，在含有10%胎牛血清(Lifetechnologies，10091148)的RPMI 1640培養基中培養，細胞接種同時加入如上文實施例4中所述製備的PBS稀釋至不同濃度的NK003：0.03 μg/ml、0.06 μg/ml、0.09 μg/ml、0.3 μg/ml、0.6 μg/ml、0.9 μg/ml、3 μg/ml、6 μg/ml和9 μg/ml，HEL 9 μg/ml作為陰性對照，同時每井按2.5 μg/ml的濃度加入山羊抗人Fc做交聯劑。共同培養24 h後，PBS洗三次，1：100加入PE-CD95 (Biolegend，305611)，避光4℃培育30 min。採用流式細胞儀分析細胞凋亡標誌分子CD95的表現(以MFI表示)，檢測細胞凋亡情況。使用GraphPad Prism 6.0擬合曲線並計算EC50。結果如圖9，NK003促進Raji的凋亡，EC50為2.6 nM (圖9A)；NK003促進Ramos細胞的凋亡，EC50為3 nM (圖9B)。實施例 6. 原代 T 細胞活性實驗 6.1    DC細胞活化
使用人周邊血單核細胞(PBMC)檢測NK003活化樹突狀細胞(DC)的能力。DC細胞的分離為常規方法，具體如下：PBMC (Hemacare，PB009C-3)在37℃含有10%胎牛血清(Lifetechnologies，10091148)的RPMI 1640培養基中培養，6小時後收穫貼壁的單核細胞；除去上清液，添加含有100 ng/mL GM-CSF (R&D Systems，204-IL)和10 ng/mL IL4 (R&D Systems，215-GM)的無血清RPMI 1640培養基培養，37℃；三天後將其中一半的培養基更換，將GM-CSF和IL4補充至100 ng/mL和10 ng/mL；培養的第六天取懸浮的細胞換至新的培養瓶，應用同樣的含有100 ng/mL GM-CSF和10 ng/mL IL4的無血清RPMI 1640培養基繼續培養24 h，獲得DC細胞。
在第七天時，將上述誘導獲得的DC細胞以1×105 個/井的數量接種於96井培養盤，加入不同濃度的NK003：0.01 μg/ml、0.05 μg/ml、0.1 μg/ml、0.5 μg/ml、1 μg/ml、10 μg/ml和100 μg/ml，100 μg/ml HEL做陰性對照；為了交聯，各組同時加入2.5 μg/ml濃度的山羊抗人Fc。
將上述DC細胞和抗體共同培育24 h後，PBS洗三次，1：100加入PE-CD11c (DC細胞標誌分子，Biolegend，117309)和APC-CD86 (DC細胞活化標誌分子，Biolegend，105007)，避光4℃培育30 min。應用流式細胞儀檢測DC細胞活化情況，以APC-CD86的MFI表示。DC細胞的活化可導致更強的抗腫瘤T細胞反應。使用GraphPad Prism 6.0擬合曲線並計算EC50。結果如圖10，NK003可以顯著活化人DC細胞，EC50為2 nM (圖10A)，加交聯劑(山羊抗人Fc， anti-Fc)後EC50為8 nM (圖10B)，且交聯形式的NK003活化DC的強度比未交聯明顯增強(MFI顯著更高)。 6.2    B細胞增殖
使用人周邊血單核細胞(PBMC)檢測NK003誘導B細胞增殖的能力。使用CD19免疫磁珠試劑盒(Miltenyi Biotec，130-050-301)，根據試劑盒說明書從人PBMC (Hemacare，PB009C-3)中分選CD19+ B細胞。
將上述分選獲得的B細胞培養於含有10%胎牛血清(Lifetechnologies，10091148)的RPMI 1640培養基中，添加10 ng/mL IL4。將B細胞以1×105 個/井的數量接種於96井培養盤，加入不同濃度的NK003：0.01 μg/ml、0.05 μg/ml、0.1 μg/ml、0.5 μg/ml、1 μg/ml、10 μg/ml和100 μg/ml，100 μg/ml HEL做陰性對照對照。37℃共同培育48 h後，使用CellTiter-Glo試劑盒(Promega，G7570)檢測細胞的增殖情況：根據試劑盒說明書取70 μl的細胞加入100 μl CellTiter-Glo® Reagent，混勻避光靜置10 min，使用微量培養盤讀取儀讀取螢光強度，強度越高表示細胞增殖越強。使用GraphPad Prism 6.0擬合曲線並計算EC50。結果如圖11，NK003可以促進人B細胞的增殖，EC50為4 nM。 6.3    B細胞活化
使用人周邊血單核細胞(PBMC)檢測NK003活化B細胞的能力。
如6.2所示，從人PBMC中用CD19免疫磁珠試劑盒分選CD19+ B細胞。將上述分選獲得的B細胞培養於含有10%胎牛血清(Lifetechnologies，10091148)的RPMI 1640培養基中。將B細胞以1×105 個/井的數量接種於96井培養盤，加入不同濃度的NK003：0.01 μg/ml、0.05 μg/ml、0.1 μg/ml、0.5 μg/ml、1 μg/ml、10 μg/ml和100 μg/ml，100 μg/ml HEL做陰性對照。為了交聯，還進一步將上述各組加入2.5 μg/ml濃度的山羊抗人Fc。共同培育48 h後，PBS洗三次，1：100加入PE-CD86 (B細胞活化標誌分子，Biolegend，105007)，避光4℃培育30 min。應用流式細胞儀檢測在加入抗體後(交聯和不交聯情況下)B細胞活化情況，以APC-CD86的MFI表示。使用GraphPad Prism 6.0擬合曲線並計算EC50。結果如圖12A和B所示，NK003可以活化人B細胞，不加交聯劑(山羊抗人Fc，anti-Fc)時EC50為70 nM (圖12A)，加交聯劑後EC50為4 nM (圖12B)，且交聯形式的NK003活化B細胞的強度比未交聯明顯增強(CD86表現顯著更高)。實施例 7. 人源 CD40 抗體 NK003 的體內特徵鑑定
進行不同的體內實驗以進一步特徵鑑定NK003人源抗體的作用。 7.1    SCID小鼠中NK003抑制腫瘤的生長
抗體依賴的細胞媒介的細胞毒性作用(ADCC)是指抗體的Fab段結合腫瘤細胞的抗原表位，其Fc段與殺手細胞(NK細胞、巨噬細胞等)表面的FcR結合，媒介殺手細胞直接殺傷標靶細胞。為了評價NK003媒介的ADCC殺傷腫瘤細胞的作用，我們使用SCID小鼠接種表現有CD40的腫瘤細胞。
八隻五周齡的雄性SCID小鼠購於維通利華，飼養於SPF級動物房。飼養一周後隨機分為兩組，背部按2.5×106 個/隻的數量皮下接種Raji細胞，每組接種四隻，接種當天記為Day 0。第一組給藥NK003抗體，第二組給藥HEL對照抗體。
Day 1起，將NK003以7.5 mg/kg的劑量腹腔注射，每7天給藥一次，共三次，HEL為對照抗體，給藥劑量和次數同NK003。每三天稱量小鼠體重並用遊標卡尺測量腫瘤的垂直尺寸，腫瘤的體積=(長×寬×寬)/2，繪製腫瘤生長曲線。
結果顯示，與對照組相比，NK003組小鼠未見明顯腫瘤(圖13 A)，且NK003組小鼠存活率為100% (圖13 B)。NK003可以透過媒介ADCC作用顯著抑制腫瘤的生長，提高小鼠生存率。 7.2    CD40人源化小鼠中NK003活化免疫系統
在C57BL/6遺傳背景下，將人源CD40及Fc受體FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA插入小鼠基因組，在表現人源CD40和Fc受體蛋白的同時取代小鼠內源CD40和Fc受體的表現。CD40人源化小鼠模型為上海交通大學李福彬建構並提供，飼養於SPF級動物房。OT-1小鼠為上海交通大學李福彬提供，飼養於SPF級動物房。頸椎脫臼處死OT-1小鼠並摘取脾臟，擠壓破碎脾臟以收集脾細胞。使用免疫磁珠試劑盒(R&D Systems，MAGM203)，按照試劑盒說明書分離CD8+ T細胞，即為OT-1 CD8+ T細胞。
選取八周齡雄性CD40人源化小鼠按2×106 個/隻的數量尾靜脈注射OT-1 CD8+ T細胞，同時腹腔注射0.1 mg/kg DEC-OVA (Sigma-Aldrich，SAB4700735)以及5 mg/kg NK003 (相同劑量的HEL為對照抗體)。接種細胞七天後，頸椎法處死小鼠分離脾臟。研磨脾臟獲得單細胞懸浮液，裂解法去除紅血球後，使用抗-CD4 (ebioscience，RM4-5)、抗-CD8 (Biolegend，53-6.7)、抗-CD45.1 (Biolegend，A20)和抗-TCR-Vα2 (Biolegend，B20.1)染色，流式細胞儀檢測OVA專一性 OT-1CD8+ T細胞的增殖。CD45.1+CD8+TCR-Vα2+ 亞群即為OT-1CD8+ T細胞(OT1細胞)。CD45.1+CD8+亞群為CD8細胞，CD45.1+CD4+亞群為CD4細胞。結果如圖14，NK003組OT-1 CD8+ T細胞比例顯著升高，細胞數顯著增加，CD8與CD4比值也相應增高。NK003可以活化CD40人源化小鼠免疫系統。 7.3    CD40人源化小鼠中NK003抑制腫瘤的生長
為了評價NK003活化免疫系統抑制腫瘤的作用，我們使用如7.2中所述的上海交通大學李福彬建構並提供的CD40人源化小鼠進行腫瘤細胞MC38 (中國醫學科學院基礎醫學研究所基礎醫學細胞中心，3111C0001CCC000523)的接種。
本文所用陽性對照抗CD40抗體CP870893序列來自專利US 7338660 (輕鏈和重鏈序列參見其中的SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:48)。將金唯智合成的CP870893輕鏈和重鏈轉染到pFUSE載體中，按1：1瞬時共轉染293F懸浮細胞，表現全長抗體，表現1周後在AKTA系統上使用Superdex™ 200 Increase預裝柱純化(具體步驟同實施例4所述)。
將八周齡的雄性CD40人源化小鼠背部按2×106 個/隻的數量皮下接種MC38細胞，當腫瘤長至約100 mm3 隨機分為三組：HEL對照組8隻，NK003及CP870893(陽性對照)組各五隻，將抗體以3 mg/kg的劑量腹腔注射，每3天給藥一次，共兩次。每三天稱量小鼠體重並用遊標卡尺測量腫瘤的垂直尺寸，腫瘤的體積=(長×寬×寬)/2，繪製腫瘤生長曲線及小鼠體重曲線。抑瘤率=(對照組平均體積一實驗組平均體積)／對照組平均體積×100％。
結果如圖15A，其中在第18天時，NK003的腫瘤抑制率為75%，而CP870893的腫瘤抑制率僅為60%。同時我們對小鼠體重進行檢測，如圖15B所示，應用NK003抗體的小鼠體重無明顯降低。因此，NK003可以顯著抑制腫瘤的生長，並且對小鼠體重沒有顯著影響。實施例 8. NK003-V12 、 NK003-S267E/L328F Fc 區突變體增加與 FcγRIIB 的結合和 CD40 激動劑活性
為了增加與FcγR的結合和增加NK003抗體的激動劑活性，NK003 Fc區(IgG1，EU編號)的第233位殘基麩胺酸(E)突變為天冬胺酸(D)，第237位殘基甘胺酸(G)突變為天冬胺酸(D)，第268位殘基組胺酸(H)突變為天冬胺酸(D)，第271位殘基脯胺酸(P)突變為甘胺酸(G)，第330位殘基丙胺酸(A)突變為精胺酸(R)，產生NK003-V12突變體。NK003 Fc區(IgG1，EU編號)的第267位殘基絲胺酸(S)突變為麩胺酸(E)，第328位殘基白胺酸(L)突變為苯丙胺酸(F)，產生NK003-S267E/L328F突變體(序列見序列表)。NK003-V12和NK003-S267E/L328F突變體建構以後透過定序確認。 表3    NK003 Fc區突變體突變位點概括
突變體 胺基酸置換
NK003-V12 E233D G237D H268D P271G A330R
NK003-S267E/L328F S267E L328F
為了評價NK003-V12和NK003-S267E/L328F突變體的激動劑活性，將金唯智合成的NK003-V12和NK003-S267E/L328F突變體的輕鏈和重鏈轉染到pFUSE載體中，按1：1瞬時共轉染293F懸浮細胞，表現全長抗體，表現1周後在AKTA系統上使用Superdex™ 200 Increase預裝柱純化(具體步驟同實施例4所述)。
將金唯智合成的FcγRIIA (NCBI， NM_001136219.1)與FcγRIIB (NCBI，NM_004001.4) CDS區轉殖到pCDH載體中，使用標準步驟用PEI瞬時轉染到293FT細胞中，轉染6 h後換液，37 ℃培養於含10%胎牛血清(Biological Industries，04-001-1A)的DMEM培養基中，表現48 h後獲得分別表現FcγRIIA的細胞和表現FcγRIIB的293FT細胞。
分別取如上所述2×105 個/管293FT-FcγRIIA或293FT-FcγRIIB細胞，每管中分別加入2×105 個/管NF-κB-GFP+hCD40報導細胞(實施例1所述)。向每管中加入製備的PBS稀釋的不同濃度NK003、NK003-V12和NK003-S267E/L328F：0.01 μg/ml、0.05 μg/ml、0.1 μg/ml、0.5 μg/ml、1 μg/ml、5 μg/ml和10 μg/ml，10 μg/ml HEL做陰性對照；37 ℃共同培養24 h後，PBS洗三次，應用流式細胞儀分析，檢測GFP的MFI。結果如圖16，NK003-V12、NK003-S267E/L328F和野生型NK003相比，激動劑活性顯著增強。實施例 9. 人源 CD40 抗體 NK003 的親和力成熟
針對NK003 VH、VL的互補決定區和框架區分別建構突變庫，以Fab形式(圖17)插入pcomb3噬菌體載體(Biovector Inc. 108925)，使用噬菌體親和力成熟方法完成NK003的最適化。 9.1    NK003 VH、VL互補決定區CDR3親和力成熟 9.1.1 NK003 VH、VL互補決定區CDR3突變庫的建構
以CDR3插入終止密碼子的NK003輕鏈DNA (SEQ ID NO:72)為模板，分別使用引子對VL1/VL2、CL1/CL2擴增輕鏈VL、CL片段。反應條件：95℃ 2 min，1 cycle；95℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 10 s，35 cycle；72℃ 5 min，1 cycle。使用天根回收試劑盒回收PCR目標片段。引子如下： VL1:5’-GCGGCCGAGCTCGATGTTGTGATGACTCAG-3’ VL2:5’-GGTCCCCTGGCCAAAAGT GTA CGG AGT TCA TAG ACC TTG CAT GCAGTAATAAAG-3’ (橫線處隨意兩處突變為MNN，由金唯智公司高通量合成) CL1:5’-TTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATC-3’ CL2:5’-TATCTAGATTAATTAAATCACTCTCCCCTGTTGAAGCTC-3’
將上述兩部分PCR產物進行overlap PCR擴增獲得NK003輕鏈突變庫。反應條件：95℃ 2 min，1 cycle；95℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 20 s，8 cycle；加入VL1/CL2引子，95℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 20 s，27 cycle；72℃ 5 min，1 cycle。用SacI (NEB， R3156L)和PacI (NEB， R0547L)分別對NK003輕鏈突變庫、pcomb3載體雙酶切，使用天根回收試劑盒回收PCR目標片段。突變庫基因與載體按莫耳比3：1經T4連接酶 (NEB， M0202L) 25℃連接3 h。將連接產物使用電穿孔法轉至XL1-Blue電穿孔勝任細胞中，建構庫容量為5×105 輕鏈突變庫，命名為pcomb3-NK003-LCDR3。
以CDR3插入終止密碼子的NK003重鏈DNA (SEQ ID NO:73)為模板，分別使用引子對VH1/VH2、CH1-1/CH1-2擴增重鏈VH、CH1片段。反應條件：95℃ 2 min，1 cycle；95℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 10 s，35 cycle；72℃ 5 min，1 cycle。引子如下： VH1:5’-TGCAGCTGCTCGAGCAGGTACAGCTGGTGCAGTC-3’ VH2:5’-CTTTGCCCCAGACGTCCAT GTA GTA GTA GTA GGT TCA AGT AGC TCC CAC TCT TTC TCTCGCACAG-3’ (橫線處隨意兩處突變為MNN，由金唯智公司高通量合成) CH1-1:5’-GACGTCTGGGGCAAAGGGACCACGGTC-3’ CH1-2:5’-GCCTGGCCACTAGTTTTGTCAACTTTCTTGTCC-3’
將上述兩部分PCR產物進行overlap PCR擴增獲得NK003重鏈突變庫，反應條件：95℃ 2 min，1 cycle；95℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 20 s，8 cycle；加入VH1/CH1-2引子，95℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 20 s，27 cycle；72℃ 5 min，1 cycle。用SpeI (NEB，R3133L)和XhoI (NEB，R0146L)分別對NK003重鏈突變庫、pcomb3-NK003-LCDR3載體雙酶切，使用天根回收試劑盒回收PCR目標片段。突變庫基因與載體按莫耳比3：1經T4連接酶25℃連接3 h。將連接產物使用電穿孔法轉至XL1-Blue電穿孔勝任細胞中，建構庫容量為2.4×107 輕重鏈雙突變庫，命名為pcomb3-NK003-AM。 9.1.2 噬菌體突變抗體庫篩選
使用pcomb3-NK003-AM抗體庫，篩選與CD40結合的抗體，具體篩選方法見實施例2。篩選結果如表12。 表12  利用噬菌體呈現技術從pcomb3-NK003-AM抗體庫中篩選CD40結合抗體
    第一輪 第二輪 第三輪
CD40 起始數 7.2×1011 8×1011 8×1011
獲得數 1.28×108 1.3×107 4.9×106
抗原濃度 20 nM 2 nM 0.2 nM
為了初步評估篩選到CD40結合抗體的陽性率，我們挑取第三輪32個噬菌體單轉殖株，進行噬菌體ELISA分析。噬菌體ELISA具體方法見實施例2。將CD40結合訊號是BSA對照的3倍以上定義為陽性轉殖株。結果如圖18，第三輪篩選陽性率為96.8%。
將第三輪洗提的噬菌體感染XL1-blue後塗培養盤，刮培養盤混勻後使用天根質體小量萃取試劑盒萃取NK003-AM質體。使用SacI和SpeI雙酶切後回收1500 bp左右的目標片段，送至金唯智進行三代定序。定序結果如圖19。依據三代定序結果，合成篩選出的抗體NK003-AM-9、NK003-AM-18重鏈和輕鏈DNA (金唯智)，將其分別轉殖至載體pFUSE中，純化表現具體方法見實施例4。NK003-AM-9、NK003-AM-18 VH/VL序列參見序列表6至表8。 9.1.3 NK003 CDR3親和力成熟活性鑑定
本實施例中透過流式細胞術檢測NK003-AM-9、NK003-AM-18抗體活化NF-κB-GFP+hCD40報導細胞株的情況，具體步驟如下：
分別取3×105 個/管如實施例1中獲得NF-κB-GFP+hCD40報導細胞，分別加入不同濃度的NK003-AM-9、NK003-AM-18及NK003：0.01 μg/ml、0.05 μg/ml、0.1 μg/ml、0.5 μg/ml和1 μg/ml；為了交聯，各組同時加入2.5 μg/ml濃度的二抗，即山羊抗人Fc (SouthernBiotech，SBA-2048-01)。在含有10%胎牛血清(Biological Industries，04-001-1A)的RPMI 1640培養基(Lifetechnologies，C11875500CP)中37℃共同培養24 h後，PBS洗三次，應用流式細胞儀進行分析。獲得的資料使用GraphPad Prism 6.0擬合曲線並計算EC50。結果如圖20，NK003-AM-9、NK003-AM-18以交聯形式活化NF-κB-GFP+hCD40報導細胞株，EC50分別為0.25 nM、0.3 nM，二者活性相似，均比野生型NK003提高了近10倍。 9.2 NK003 VH、VL框架區親和力成熟 9.2.1 NK003 VH、VL框架區突變庫的建構
以NK003輕鏈DNA (SEQ ID NO:74)為模板，使用隨機突變PCR試劑盒(Agilent Technologies，200550)和引子對VL1/VL2、VL3/VL4進行巢氏PCR擴增輕鏈VL區域，反應條件：95℃ 2 min，1 cycle；95℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 30 s，28 cycle；72℃ 10 min，1 cycle。以NK003輕鏈DNA (SEQ ID NO:11)為模板，使用引子對CL1/CL2擴增輕鏈CL區域，反應條件：95℃ 2 min，1 cycle；95℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 30 s，30 cycle；72℃ 5 min，1 cycle。使用天根回收試劑盒回收PCR目標片段。引子如下： VL1:5’-CTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTG-3’ VL2:5’-CCAGATTTCAACTGCTCATCAGATGGC-3’ VL3:5’-CTACCGTGGCCCAGGCGGCCGAGCTC-3’ VL4:5’-GAAGACAGATGGTGCAGCCACAGTTCG-3’ CL1:5’-CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTC-3’ CL2:5’-TATCTAGATTAATTAAATCACTCTCCCCTGTTGAAGCTC-3’
將上述VL、CL PCR產物進行overlap PCR擴增獲得NK003輕鏈突變庫。反應條件：95℃ 2 min，1 cycle；95℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 40 s，8 cycle；加入VL3/CL2引子，95℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 40 s，27 cycle；72℃ 10 min，1 cycle。用SacI和PacI分別對NK003輕鏈突變庫、pcomb3載體雙酶切，使用天根回收試劑盒回收PCR目標片段。突變庫基因與載體按莫耳比3：1經T4連接酶25℃連接3 h。將連接產物使用電穿孔法轉至XL1-Blue電穿孔勝任細胞中，建構庫容量為1×105 輕鏈突變庫，命名為pcomb3-NK003-VL。
以NK003重鏈DNA (SEQ ID NO:75)為模板，使用引子對VH1/VH2、VH3/VH4進行巢氏PCR擴增重鏈VH區域，反應條件3：95℃ 2 min，1 cycle；95℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 30 s，28 cycle；72℃ 10 min，1 cycle。以NK003重鏈DNA (SEQ ID NO:12)為模板，使用引子對CH1-1/CH1-2擴增重鏈CH1區域，反應條件：95℃ 2 min，1 cycle；95℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 30 s，32 cycle；72℃ 10 min，1 cycle。使用天根回收試劑盒回收PCR目標片段。引子如下： VH1:5’-GCCGCTGGATTGTTATTACTCGCTGC-3’ VH2:5’-CAGAGGTGCTCTTGGAGGAGGGTGCC-3’ VH3:5’-GCCATGGCCGAGGTGCAGCTGCTCGAG-3’ VH4:5’-GAAGACCGATGGGCCCTTGGTGGAGGC-3’ CH1-1:5’-GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTC-3’ CH1-2:5’-GCCTGGCCACTAGTTTTGTCAACTTTCTTGTCC-3’
將上述VH、CH1 PCR產物進行overlap PCR擴增獲得NK003重鏈突變庫。反應條件：95℃ 2 min，1 cycle；95℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 40 s 8 cycle；加入VH3/CH1-2引子，95℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 40 s，27 cycle；72℃ 10 min，1 cycle。用SpeI和XhoI分別對NK003重鏈突變庫、pcomb3-NK003-VL載體雙酶切，使用天根回收試劑盒回收PCR目標片段。突變庫基因與載體按莫耳比3：1經T4連接酶25℃連接3 h。將連接產物使用電穿孔法轉至XL1-Blue電穿孔勝任細胞中，建構庫容量為2.4×107 輕重鏈雙突變庫，命名為pcomb3-NK003-EP。 9.2.2 噬菌體突變抗體庫篩選
使用pcomb3-NK003-EP抗體庫，篩選與CD40結合的抗體，具體篩選方法見實施例2。篩選結果如表13。 表13  利用噬菌體呈現技術從pcomb3-NK003-EP抗體庫中篩選 CD40結合抗體
    第一輪 第二輪 第三輪
CD40 起始數 7×1011 7.6×1011 5.9×1011
獲得數 3.7×107 1.1×107 4.3×106
抗原濃度 20 nM 10 nM 2 nM
將第三輪洗提的噬菌體感染XL1-blue後塗培養盤，刮培養盤混勻後使用天根質體小量萃取試劑盒萃取NK003-EP質體。使用SacI和SpeI雙酶切後回收1500 bp左右的目標片段，送至金唯智進行三代定序。定序結果如圖21。依據三代定序結果，合成抗體NK003-AM-18-EP1重鏈DNA (金唯智)，將其轉殖至載體pFUSE中。使用標準步驟用PEI將分別含有NK003-AM-18輕鏈和NK003-AM-18-EP1重鏈的質體二者按1：1瞬時共轉染至293F懸浮細胞，以表現全長NK003-AM-18-EP1抗體。純化表現具體方法見實施例4。NK003-AM-18-EP1 VH序列參見序列表6。 9.2.3 NK003框架區親和力成熟活性鑑定
本實施例中透過流式細胞術檢測NK003-AM-18-EP1抗體活化NF-κB-GFP+hCD40報導細胞株的情況，具體步驟如下：
分別取3×105 個/管如實施例1中獲得NF-κB-GFP+hCD40報導細胞，分別加入不同濃度的NK003-AM-18、NK003-AM-18-EP1及NK003：0.0075 nM、0.025 nM、0.075 nM、0.25 nM、0. 75 nM、2.5 nM和7.5 nM；為了交聯，各組同時加入2.5 μg/ml濃度的二抗，即山羊抗人Fc。在含有10%胎牛血清(Biological Industries，04-001-1A)的RPMI 1640培養基(Lifetechnologies，C11875500CP)中37℃共同培養24 h後，PBS洗三次，應用流式細胞儀進行分析。獲得的資料使用GraphPad Prism 6.0擬合曲線並計算EC50。結果如圖22，NK003-AM-18-EP1以交聯形式活化NF-κB-GFP+hCD40報導細胞株，EC50為0.35 nM，與NK003-AM-18活性相似。序列： 表4    本發明示例性抗體重鏈可變結構域(VH)(或重鏈可變區HCVR)的FR和CDR的序列(CDR序列以IMGT規則定義)
抗體編號 VH FR1 VH CDR1 VH FR2 VH CDR2 VH FR3 VH CDR3 VH FR4
NK003 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS(SEQ ID NO:23) GYTFTGYY(SEQ ID NO:1) MHWVRQAPGQGLEWMGW(SEQ ID NO:25) INPNSGGT(SEQ ID NO:3) NYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYC(SEQ ID NO:27) ARERVGATPTYYYYMDV(SEQ ID NO:5) WGKGTTVTVSS(SEQ ID NO:29)
NK003-AM-9 SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:25 SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:27 ARERVGATPTYYYWWDV (SEQ ID NO:51) SEQ ID NO:29  
NK003-AM-18 SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:25 SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:27 ARERVGANPTYYYYWDV (SEQ ID NO:52) SEQ ID NO:29
NK003-AM-18-EP SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:1 MY WVRQAPGQGLEWMGW(SEQ ID NO:76) SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:27 SEQ ID NO:52 SEQ ID NO:29
共有序列 SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:25 SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:27 ARERVGAX1PTYYYX2X3DV (SEQ ID NO:55) SEQ ID NO:29
NK004 QVQLVESGGGLVQPGRSLRISCAGS(SEQ ID NO:24) GFTFGDSA(SEQ ID NO:2) MHWVRQAPGKGLEWVSG(SEQ ID NO:26) ISRNSDTI(SEQ ID NO:4) VYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYC(SEQ ID NO:28) ARRSGDHHAMDV(SEQ ID NO:6) WGPGTTVTVSS(SEQ ID NO:30)
表5    本發明示例性抗體輕鏈可變結構域(VL)(或輕鏈可變區LCVR)的FR和CDR的序列(CDR序列以IMGT規則定義)
抗體編號 VL FR1 VL CDR1 VL FR2 VL CDR2 VL FR3 VL CDR3 VL FR4
NK003 DVVMTQSPLSLPVTPGESATISCRSS(SEQ ID NO:31)  QSLLYSNGYNY(SEQ ID NO:7) LDWYLLKPGQSPQLLIY(SEQ ID NO:33) LGS(SEQ ID NO:9) NRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGLYYC(SEQ ID NO:35) MQGLETPYT(SEQ ID NO:11) FGQGTKLEIK(SEQ ID NO:37)
NK003-AM-9 SEQ ID NO:31  SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:33 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:35 MN GLEV PYT (SEQ ID NO:53) SEQ ID NO:37
NK003-AM-18/ NK003-AM-18-EP SEQ ID NO:31  SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:33 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:35 MQQ LEQ PYT (SEQ ID NO:54) SEQ ID NO:37
共有序列 SEQ ID NO:31  SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:33 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:35 MX1X2LX3X4PYT (SEQ ID NO:56) SEQ ID NO:37
NK004 ETTLTQSPATLSLSPGERATLSCRAS(SEQ ID NO:32) QSVNTY(SEQ ID NO:8) LAWYQQKPGQAPRLLMY(SEQ ID NO:34) DSS(SEQ ID NO:10) SRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC(SEQ ID NO:36) QQYSTVPLT(SEQ ID NO:12) FGGGTKLEIK(SEQ ID NO:38)
表6    本發明示例性抗體重鏈可變結構域(VH)(或重鏈可變區HCVR)的DNA和胺基酸的序列
抗體編號 VH DNA序列 VH 胺基酸序列
NK003 SEQ ID NO:39 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARERVGATPTYYYYMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO:13)
NK003-AM-9 SEQ ID NO:57 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARERVGATPTYYYWWDVWGKGTTVTVSS (SEQ ID NO:58)
NK003-AM-18 SEQ ID NO:59 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARERVGANPTYYYYWDVWGKGTTVTVSS (SEQ ID NO:60)
NK003-AM-18-EP1 SEQ ID NO:61 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMYWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARERVGANPTYYYYWDVWGKGTTVTVSS (SEQ ID NO:62)
NK004 SEQ ID NO:40 QVQLVESGGGLVQPGRSLRISCAGSGFTFGDSAMHWVRQAPGKGLEWVSGISRNSDTIVYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARRSGDHHAMDVWGPGTTVTVSS(SEQ ID NO:14)
表7     本發明示例性抗體輕鏈可變結構域(VL)(或輕鏈可變區LCVR)的DNA和胺基酸的序列
抗體編號 VL DNA序列 VL 胺基酸序列
NK003 SEQ ID NO:41 DVVMTQSPLSLPVTPGESATISCRSSQSLLYSNGYNYLDWYLLKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGLYYCMQGLETPYTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:15)
NK003-AM-9 SEQ ID NO:63 DVVMTQSPLSLPVTPGESATISCRSSQSLLYSNGYNYLDWYLLKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGLYYCMNGLEVPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO:64)
NK003-AM-18/ NK003-AM-18-EP1 SEQ ID NO:65 DVVMTQSPLSLPVTPGESATISCRSSQSLLYSNGYNYLDWYLLKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGLYYCMQQLEQPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO:66)
NK004 SEQ ID NO:42 ETTLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVNTYLAWYQQKPGQAPRLLMYDSSSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYSTVPLTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:16)
表8     本發明示例性抗體的重鏈和輕鏈序列
抗體編號 IgG形式 重鏈的胺基酸序列 輕鏈的胺基酸序列
NK003 IgG1 SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:21
NK003-V12 IgG1突變體 SEQ ID NO:18
NK003-S267E/L328F IgG1突變體 SEQ ID NO:19
NK003-AM-9 IgG1 SEQ ID NO:67 SEQ ID NO:68
NK003-AM-18 IgG1 SEQ ID NO:69 SEQ ID NO:71
NK003-AM-18-EP1 IgG1 SEQ ID NO:70
NK004 IgG1 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:22
表9     本發明示例性訊息胜肽DNA和胺基酸序列
抗體編號 IgG形式 重鏈的胺基酸序列 輕鏈的胺基酸序列
HEL IgG1 SEQ ID NO:45 SEQ ID NO:46
抗體編號 IgG形式 重鏈的DNA序列 輕鏈的DNA序列
HEL IgG1 SEQ ID NO:47 SEQ ID NO:48
訊息胜肽DNA序列 訊息胜肽胺基酸序列
ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACGAATTCG(SEQ ID NO:44) MYRMQLLSCIALSLALVTNS(SEQ ID NO:43)
表10   本發明對照抗體HEL的胺基酸和DNA序列 表11   本發明對照抗體N27的胺基酸和DNA序列
抗體編號 胺基酸序列
N27 SEQ ID NO:49
抗體編號 DNA序列
N27 SEQ ID NO:50
圖1顯示了透過流式細胞術測定293F細胞產生的HEL及CD40L對Jurkat/NF-κB-GFP +hCD40報導細胞單轉殖株的活化，報導細胞活化後有GFP的表現，GFP陽性率由FITC通道檢測。 圖2顯示了透過噬菌體ELISA測定第二輪(圖2A)、第三輪(圖2B)噬菌體呈現富集得到的抗體庫中CD40結合抗體的陽性率，抗體與CD40結合訊號大於與BSA結合訊號的三倍以上定義為陽性抗體。 圖3顯示了透過流式細胞術測定Jurkat/NF-κB-GFP +hCD40報導細胞單轉殖株產生的含有陰性對照N27、陽性CD40激動劑抗體的上清液對Jurkat/NF-κB-GFP +hCD40報導細胞的活化。FITC通道檢測的GFP螢光強度代表單轉殖株的活化程度。 圖4顯示了透過粒徑篩析層析測定293F細胞產生的本發明抗體NK003聚體性質。 圖5A顯示了透過ELISA測定293F細胞產生的本發明抗體NK003與CD40專一性結合，與其他TNFR家族成員OX40、4-1BB、GITR不結合或低結合。圖5B顯示了透過ELISA測定293F細胞產生的本發明抗體NK004與CD40的專一性結合。 圖6顯示了透過ELISA測定293F細胞產生的本發明抗體NK003與CD40L競爭性結合CD40。 圖7A顯示了透過流式細胞術測定293F細胞產生的本發明抗體NK003以交聯形式活化Jurkat/NF-κB-GFP+ hCD40報導細胞，圖7B顯示了透過流式細胞術測定293F細胞產生的本發明抗體NK004不依賴於交聯，以組成型形式活化Jurkat/NF-κB-GFP +hCD40 報導細胞。FITC通道檢測GFP，MFI定義為GFP陽性細胞幾何平均數(Geometrical Mean)與GFP陽性細胞百分比的乘積。 圖8顯示了透過流式細胞術測定293F細胞產生的本發明抗體NK003分佈與過度表現人CD40的293FT細胞(圖8A)、過度表現恆河猴CD40的293FT細胞(圖8B)的結合。 圖9顯示了透過流式細胞術測定293F細胞產生的本發明抗體NK003誘導Raji細胞(圖9A)和Ramos細胞(圖9B)的凋亡，細胞凋亡指標為CD95的表現。MFI定義為CD95陽性細胞幾何平均數與CD95陽性細胞百分比的乘積。 圖10顯示了透過流式細胞術測定293F細胞產生的本發明抗體NK003分別在不加交聯劑(圖10A)及加入交聯劑anti-Fc (圖10B)時對PBMC中樹突狀細胞的活化。樹突狀細胞活化指標為CD86的表現。MFI定義為CD86陽性細胞幾何平均數與CD86陽性細胞百分比的乘積。 圖11顯示了透過CellTiter-Glo法測定293F細胞產生的本發明抗體NK003對PBMC中B細胞的增殖作用，細胞增殖指標為螢光強度(RLU)，RLU值越大表示細胞越多。 圖12顯示了透過流式細胞術測定293F細胞產生的本發明抗體NK003分別在不加交聯劑(圖12A)及加入交聯劑anti-Fc (圖12B)時對PBMC中B細胞的活化。B細胞活化指標為CD86的表現。MFI定義為CD86陽性細胞幾何平均數與CD86陽性細胞百分比的乘積。 圖13顯示了SCID小鼠中接種Raji細胞的同時給藥在293F細胞中產生的本發明抗體NK003及陰性對照HEL，個體小鼠腫瘤生長曲線(圖13A)及小鼠存活率統計(圖13B)。 圖14顯示了MC38荷瘤CD40人源化小鼠中給藥在293F細胞中產生的本發明抗體NK003及陰性對照HEL對免疫系統的活化，OT1細胞數、OT1細胞與CD8細胞比值(OT1/CD8+比值)及CD8細胞與CD4細胞比值(CD8/CD4比值)的增加均可說明免疫系統有活化。 圖15顯示了MC38荷瘤CD40人源化小鼠中給藥在293F細胞中產生的本發明抗體NK003、陰性對照HEL及陽性對照CP870893，個體小鼠腫瘤生長曲線(圖15A)及小鼠體重變化曲線(圖15B)。 圖16顯示了透過流式細胞術測定293F細胞產生的本發明抗體NK003、FcγRIIB增強型突變體NK003-V12、FcγRIIA/FcγRIIB增強型突變體NK003-S267E/L328F及陰性對照HEL分別在293FT-FcγRIIA細胞(圖16A)和293FT-FcγRIIB細胞(圖16B)交聯下對Jurkat/NF-κB-GFP +hCD40報導細胞的活化。FITC通道檢測GFP，MFI定義為GFP 陽性細胞幾何平均數與GFP陽性細胞百分比的乘積。 圖17顯示了NK003以Fab形式插入pcomb3載體的質體圖譜。 圖18顯示了透過噬菌體ELISA測定第三輪噬菌體呈現得到的抗體庫中CD40結合抗體的陽性率，抗體與CD40結合訊號大於與BSA結合訊號的三倍以上定義為陽性抗體。 圖19顯示了NK003 VH (圖3A)、VL (圖3B)互補決定區CDR3親和力成熟三代定序結果。 圖20顯示了透過流式細胞術測定293F細胞產生的本發明抗體NK003-AM-9、NK003-AM-18以交聯形式活化Jurkat/NF-κB-GFP +hCD40 報導細胞， FITC通道檢測GFP，MFI定義為GFP 陽性細胞幾何平均數(Geometrical Mean)與GFP陽性細胞百分比的乘積。 圖21顯示了NK003 VH (圖21A)、VL (圖21B)框架區親和力成熟三代定序結果。 圖22顯示了透過流式細胞術測定293F細胞產生的本發明抗體NK003-AM-18-EP1以交聯形式活化Jurkat/NF-κB-GFP +hCD40報導細胞，FITC通道檢測GFP，MFI定義為GFP陽性細胞幾何平均數(Geometrical Mean)與GFP陽性細胞百分比的乘積。

Claims (22)

  1. 結合CD40的抗體或其抗原結合片段，其包含 (i)     如SEQ ID NO:13、58、60或62所示的重鏈可變區的3個互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及如SEQ ID NO:15、64或66所示的輕鏈可變區的3個互補決定區LCDR1、LCDR2和LCDR3； (ii)    如SEQ ID NO:13所示的重鏈可變區的3個互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及如SEQ ID NO:15所示的輕鏈可變區的3個互補決定區LCDR1、LCDR2和LCDR3； (iii) 如SEQ ID NO:58所示的重鏈可變區的3個互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及如SEQ ID NO:64所示的輕鏈可變區的3個互補決定區LCDR1、LCDR2和LCDR3； (iv) 如SEQ ID NO:60或62所示的重鏈可變區的3個互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及如SEQ ID NO:66所示的輕鏈可變區的3個互補決定區LCDR1、LCDR2和LCDR3； (v)     如SEQ ID NO:14所示的重鏈可變區的3個互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及如SEQ ID NO:16所示的輕鏈可變區的3個互補決定區LCDR1、LCDR2和LCDR3； (vi) (i)-(v)中任一項的CDR組合，其中相比HCDR3和/或LCDR3，在所述序列上包含至少一個且不超過3、2或1個胺基酸改變(優選地胺基酸置換，優選地保守置換)。
  2. 結合CD40的抗體或其抗原結合片段，其包含 (i)     包含或由下述序列組成的HCDR1、HCDR2和HCDR3：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5；或者 (ii)    包含或由下述序列組成的HCDR1、HCDR2和HCDR3：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:51；或者 (iii) 包含或由下述序列組成的HCDR1、HCDR2和HCDR3：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:52；或者 (iv)   (i)-(iii)中任一項的HCDR組合，其中在所述HCDR3包含至少一個且不超過3、2或1個胺基酸改變(優選胺基酸置換，優選保守置換)； 和 (i)     包含或由下述序列組成的LCDR1、LCDR2和LCDR3：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11；或者 (ii)    包含或由下述序列組成的LCDR1、LCDR2和LCDR3：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:53；或者 (iii) 包含或由下述序列組成的LCDR1、LCDR2和LCDR3：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:54；或者 (iv) (i)-(iii)中任一項的LCDR組合，其中在所述LCDR3包含至少一個且不超過3、2或1個胺基酸改變(優選胺基酸置換，優選保守置換)。
  3. 結合CD40的抗體或其抗原結合片段，其包含 (i)     包含或由下述序列組成的HCDR1、HCDR2和HCDR3：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5，以及包含或由下述序列組成的LCDR1、LCDR2和LCDR3：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11；或者 (ii)    包含或由下述序列組成的HCDR1、HCDR2和HCDR3：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:51，以及包含或由下述序列組成的LCDR1、LCDR2和LCDR3：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:53；或者 (iii) 包含或由下述序列組成的HCDR1、HCDR2和HCDR3：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:52，以及包含或由下述序列組成的LCDR1、LCDR2和LCDR3：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:54；或者 (iv) 包含或由下述序列組成的HCDR1、HCDR2和HCDR3：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6，以及包含或由下述序列組成的LCDR1、LCDR2和LCDR3：SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:12； (v)     包含或由下述序列組成的HCDR1、HCDR2和HCDR3：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:55，以及包含或由下述序列組成的LCDR1、LCDR2和LCDR3：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:56； (vi) (i)-(iv)中任一項的HCDR和LCDR組合，其中在所述HCDR3和/或LCDR3中包含至少一個且不超過3、2或1個胺基酸改變(優選胺基酸置換，優選保守置換)。
  4. 如請求項1至3中任一項的抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區VH和/或輕鏈可變區VL，其中， (a)  重鏈可變區VH (i)   包含與選自SEQ ID NO:13、58、60、62或14的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同性的胺基酸序列或由其組成；或者 (ii)  包含選自SEQ ID NO:13、58、60、62或14的胺基酸序列或由其組成；或者 (iii) 包含與選自SEQ ID NO:13、58、60、62或14的胺基酸序列相比具有1個或多個(優選不超過10個，更優選不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(優選胺基酸置換，更優選胺基酸保守置換)的胺基酸序列，優選地，所述胺基酸改變不發生在CDR區中，優選地，所述胺基酸改變發生在FR區中； 和/或 (b)  輕鏈可變區VL (i)   包含與選自SEQ ID NO:15、64、66或16的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同性的胺基酸序列或由其組成； (ii)  包含選自SEQ ID NO:15、64、66或16的胺基酸序列或由其組成；或者 (iii) 包含與選自SEQ ID NO:15、64、66或16的胺基酸序列相比具有1個或多個(優選不超過10個，更優選不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(優選胺基酸置換，更優選胺基酸保守置換)的胺基酸序列，優選地，所述胺基酸改變不發生在CDR區中，優選地，所述胺基酸改變發生在FR區中。
  5. 如請求項4的抗體或其抗原結合片段，其中 (i)     重鏈可變區VH包含SEQ ID NO:13、58、60或62的胺基酸序列或由其組成，和輕鏈可變區VL包含選自SEQ ID NO:15、64或66的胺基酸序列或由其組成； (ii)    重鏈可變區VH包含SEQ ID NO:13的胺基酸序列或由其組成，和輕鏈可變區VL包含SEQ ID NO:15的胺基酸序列或由其組成； (iii) 重鏈可變區VH包含SEQ ID NO:58的胺基酸序列或由其組成，和輕鏈可變區VL包含SEQ ID NO:64的胺基酸序列或由其組成； (iv) 重鏈可變區VH包含SEQ ID NO:60的胺基酸序列或由其組成，和輕鏈可變區VL包含SEQ ID NO:66的胺基酸序列或由其組成； (v)     重鏈可變區VH包含SEQ ID NO:62的胺基酸序列或由其組成，和輕鏈可變區VL包含SEQ ID NO:66的胺基酸序列或由其組成； (vi) 重鏈可變區VH包含SEQ ID NO:14的胺基酸序列或由其組成，和輕鏈可變區VL包含SEQ ID NO:16的胺基酸序列或由其組成。
  6. 如請求項1至5中任一項的抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈和/或輕鏈，其中 (a)  重鏈 (i)   包含與選自SEQ ID NO:17、18、19、67、69、70或20的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同性的胺基酸序列或由其組成； (ii)  包含選自SEQ ID NO:17、18、19、67、69、70或20的胺基酸序列或由其組成；或者 (iii) 包含與選自SEQ ID NO:17、18、19、67、69、70或20的胺基酸序列相比具有1個或多個(優選不超過20個或10個，更優選不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(優選胺基酸置換，更優選胺基酸保守置換)的胺基酸序列，優選地，所述胺基酸改變不發生在重鏈的CDR區中，更優選地，所述胺基酸改變不發生在重鏈可變區中，最優選地，所述胺基酸改變發生在重鏈恆定區中； 和/或 (b)  輕鏈 (i)   包含與選自SEQ ID NO:21、68、71或22的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同性的胺基酸序列或由其組成； (ii)  包含選自SEQ ID NO:21、68、71或22的胺基酸序列或由其組成；或者 (iii) 包含與選自SEQ ID NO:21、68、71或22的胺基酸序列相比具有1個或多個(優選不超過20個或10個，更優選不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(優選胺基酸置換，更優選胺基酸保守置換)的胺基酸序列，優選地，所述胺基酸改變不發生在輕鏈的CDR區中，更優選地，所述胺基酸改變不發生在輕鏈可變區中，最優選的，所述重鏈胺基酸改變發生在輕鏈恆定區中。
  7. 如請求項6的抗體或其抗原結合片段，其中 (i)     重鏈包含SEQ ID NO:17、18、19、67、69或70的胺基酸序列或由其組成，和輕鏈包含SEQ ID NO:21、68或71的胺基酸序列或由其組成， (ii)    重鏈包含SEQ ID NO:17、18或19的胺基酸序列或由其組成，和輕鏈包含SEQ ID NO:21的胺基酸序列或由其組成； (iii) 重鏈包含SEQ ID NO:67的胺基酸序列或由其組成，和輕鏈包含SEQ ID NO:68的胺基酸序列或由其組成； (iv) 重鏈包含SEQ ID NO:69或70的胺基酸序列或由其組成，和輕鏈包含SEQ ID NO:71的胺基酸序列或由其組成； (v)     重鏈包含SEQ ID NO:20的胺基酸序列或由其組成，和輕鏈包含SEQ ID NO:22的胺基酸序列或由其組成。
  8. 如請求項1至7中任一項的結合CD40的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體是單株抗體。
  9. 如請求項1至8中任一項的結合CD40的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體是人源化的抗體或人抗體或嵌合抗體。
  10. 如請求項1至9中任一項的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗原結合片段是選自以下的抗體片段：Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、單鏈抗體(例如scFv)或(Fab’)2 、單結構域抗體、diabody (dAb)或線性抗體。
  11. 分離的核酸，其編碼如請求項1至10中任一項的結合CD40的抗體的任一或多條鏈或其抗原結合片段。
  12. 載體，其包含如請求項11的核酸，優選地所述載體是表現載體。
  13. 宿主細胞，其包含如請求項11的核酸或請求項12的載體，優選地，所述宿主細胞是原核的或真核的，更優選的選自酵母細胞、哺乳動物細胞(例如所述宿主細胞是CHO細胞，例如CHOS細胞CHOK1SV細胞或CHOK1SV GS-KO，或所述宿主細胞是293細胞，例如HEK293細胞)或適用於製備抗體或其抗原結合片段的其它細胞。
  14. 製備結合CD40的抗體或其抗原結合片段的方法，所述方法包括在適於表現抗體的情況下，培養包含編碼如請求項1-10中任一項的抗體或其抗原結合片段的核酸的宿主細胞，任選地所述方法還包括從所述宿主細胞回收所述抗體或其抗原結合片段。
  15. 免疫綴合物，其包含如請求項1至10中任一項的結合CD40的抗體或其抗原結合片段和其它物質，例如治療劑或標記。
  16. 藥物組成物，其包含如請求項1至10中任一項的結合CD40的抗體或其抗原結合片段或請求項13的免疫綴合物，以及任選地一種或多種其它治療劑，以及任選地藥用輔料。
  17. 組合產品，其包含如請求項1至10中任一項的結合CD40的抗體或其抗原結合片段或請求項15的免疫綴合物，以及一種或多種其它治療劑。
  18. 如請求項15的免疫綴合物、請求項16的藥物組成物或請求項17的組合產品，其中所述治療劑選自化療劑、其他抗體、細胞毒性劑、疫苗、抗感染活性劑、小分子藥物或免疫調節劑。
  19. 在受試者中增強免疫反應(例如抗原專一性T細胞反應)的方法，其包括向受試者施用有效量的如請求項1-10中任一項的抗體或其抗原結合片段、或請求項16或18的免疫綴合物、或請求項16或18的藥物組成物，或請求項17或18的組合產品。
  20. 預防或治療受試者的需要在受試者中調節(例如增強)免疫反應的疾病或CD40相關疾病的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的如請求項1-10中任一項的抗體或其抗原結合片段、或請求項15或18的免疫綴合物、或請求項16或18的藥物組成物，或請求項17或18的組合產品，優選地，所述疾病為腫瘤，例如淋巴瘤、結腸癌、結直腸癌、直腸癌、肺癌(例如非小細胞肺癌)、肝癌、胃癌及其轉移性癌症；或感染，例如慢性感染，或病毒感染。
  21. 如請求項20所述的方法，其還包括向所述受試者聯合施用一種或多種療法，例如治療方式和/或其它治療劑，優選地，治療方式包括手術治療和/或放射療法，和/或其它治療劑選自化療劑、其他抗體、細胞毒性劑、疫苗、抗感染活性劑、小分子藥物或免疫調節劑。
  22. 檢測試劑盒，其包含如請求項1-10中任一項的抗體或其抗原結合片段或請求項15的免疫綴合物。
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