CN1798502A - 治疗恶性肿瘤的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了癌性肿瘤受试者的治疗方法。治疗方案方法包括给癌性肿瘤注射有效剂量编码治疗蛋白的质粒继之以给肿瘤实施电穿孔治疗，该电穿孔治疗包括给肿瘤实施至少一个高压短脉冲。

Description

治疗恶性肿瘤的方法
发明背景
对转移的有效治疗是所有癌症治疗的挑战。对于转移疾病有效的免疫疗法而言，免疫系统必须识别全身的肿瘤细胞，可以通过诱导系统性免疫应答或者通过在识别原发肿瘤后形成记忆T细胞实现。
已经集中地研究了作为潜在抗癌剂的许多细胞因子。在已评价的许多细胞因子中，白介素-12(IL-12)已经显示出显著的抗肿瘤活性。IL-12可以上调T细胞以及自然杀伤(NK)细胞的增殖以及成熟，诱导IFN-γ的产生，抑制血管生成以及上调辅助分子诸如HLA的表达。令人遗憾地，以重组蛋白质形式递送IL-12引起严重的毒性以及不良副作用包含死亡。因此，已经研究了递送IL-12的基因治疗策略诸如通过利用病毒载体，基因枪，微球体，直接注射质粒以及电穿孔。
IL-12的抗肿瘤潜能已经报道在许多免疫疗法研究中。IL-12的的可能抗肿瘤机制包含作用于免疫系统诸如诱导IFN-γ，上调T细胞，以及增殖自然杀伤(NK)细胞。此外，IL-12抑制血管生成，形成新血管。这种对免疫系统的广泛作用以及抗血管生成的特性产生潜在有效的抗肿瘤治疗。令人遗憾地，使用系统性施用重组体IL-12的临床前以及临床试验显示出潜在的不良副作用。已经报道了局部或者系统施用重组体IL-12在多种鼠肿瘤模型中诱导有效的抗肿瘤活性，引起已形成的肿瘤的消退。然而，在这些研究中，需要每日基础上反复递送重组体IL-12从而实现最大治疗活性，并且通常也与剂量依赖的毒性相关。通过基因枪利用递送IL-12的基因治疗比重组蛋白质治疗产生相对较少的副作用。使用病毒以及非病毒基因递送技术的若干研究已经报道了在减缓和/或预防肿瘤生长方面的成功。然而，这些研究的有限成功在于缺乏免疫原性的B16.F10黑色素瘤的完全消退以及随后对于攻击的抗性。
体内电穿孔是已经成功用于将质粒DNA有效递送到许多不同组织的基因递送技术。研究已经报道了体内实施电穿孔以将质粒DNA递送到B16黑色素瘤及其他肿瘤组织。虽然系统施用重组体IL-12显示了其抗肿瘤潜能，在肿瘤位点表达IFN-γ已经被证明是肿瘤成功消退的决定性因素。系统以及局部表达基因或者由质粒编码的cDNA可以由体内电穿孔的实施获得。使用体内电穿孔加强了在肿瘤组织中质粒DNA的吸收，引起肿瘤内的表达以及将质粒递送到肌肉组织，引起系统性细胞因子的表达。
已经显示电穿孔可用于用质粒DNA体内转染细胞。近来的研究已经显示电穿孔能够加强质粒DNA作为抗肿瘤剂的递送。电穿孔已经被用于治疗鼠模型的肝细胞癌，腺癌，乳房肿瘤，鳞状上皮细胞癌以及B16.F10黑色素瘤。B16.F10鼠黑色素瘤模型已经广泛用于测试递送IL-12及其他作为重组蛋白质或者由基因治疗使用的细胞因子的潜在免疫治疗方案。
IL-12对免疫系统的广泛作用及其抗血管生成特性使其成为用作免疫治疗剂的优秀候选者。因为其潜在毒性，慎重选择IL-12的递送方法是非常重要的。体内电穿孔是安全的无毒性输送系统并且已经被用来有效递送化疗剂以及质粒DNA，包含编码IL-12的质粒。
电穿孔介导的体内递送表达质粒中鼠白介素-12(IL-12)基因已经显示出可以提供抗肿瘤以及抗转移活性。本领域已知多种用于利用体内电穿孔递送编码IL-12的质粒进行癌症治疗的方案。本领域已知的方案描述了基于电穿孔介导细胞因子的基因治疗，肿瘤内以及肌内，利用低压以及长脉冲电流。现有技术的方法已经鉴定了这些低压电平小于300V并且长脉冲在50ms的区域内。合理化使用低压电平以及长脉冲长度用于递送编码IL-12的质粒进行肿瘤治疗是基于电穿孔以及电化学疗法的众所周知的要素。众所周知中等电场强度的电脉冲可以引起细胞膜的暂时性透化，从而可以引起多种细胞类型包含细菌，酵母，动物以及人细胞等快速的遗传转化以及操作。反之，高电场强度的电脉冲可以引起细胞膜永久性破裂以及组织损伤。所有描述实施电穿孔方案递送IL-12的现有技术的方法都是基于实施低压，长脉冲。本领域已知的这些治疗方案并没有有效显示出对肿瘤包含B16.F10黑色素瘤肿瘤可以接受的治愈率。另外，已知的治疗方案不能显示出长期受试者存活率的改进。
因此，本领域需要递送编码治疗蛋白，诸如IL-12的电穿孔方案，从而将提供癌症肿瘤，诸如黑色素瘤消退的显著改进，同时显著改进的长期存活率。
发明概述
本发明提供了恶性肿瘤的治疗方法，其中与电穿孔结合施用编码治疗蛋白的质粒对原发肿瘤以及远距离肿瘤以及转移具有治疗效果。
根据本发明的一个实施方案，提供了癌性肿瘤受试者的治疗方法，该方法包含将有效剂量编码治疗蛋白的质粒注射癌性肿瘤并且给肿瘤实施电穿孔治疗。电穿孔治疗更进一步包含实施至少一个具有高压短脉冲。
本发明的方法可有效治疗多种癌性肿瘤包含黑色素瘤。给出的数据是本发明治疗小鼠B16.F10黑色素瘤的示范性实施方案。然而，给出的示范性实施方案以及数据并非是意欲将本发明的方法限于B16.F10黑色素瘤的治疗。本发明的方法适于治疗多种癌症，包含那些与人共患的癌症。
多种细胞因子已被鉴定为可有效治疗癌症。白介素12(IL-12)是已经作为抗肿瘤剂广泛研究的细胞因子。在本发明的特定实施方案中，施用于受试者的编码治疗蛋白的质粒是编码IL-12的质粒。其它的有效细胞因子也在本发明的范围内。
用于本发明的电穿孔治疗的特征在于高压短脉冲。根据本发明，高压脉冲被限定为大于约400V/cm。另外，根据本发明短脉冲被限定为小于约1毫秒。
在特定实施方案中，实施于受试者肿瘤的电穿孔治疗包含至少一个具有约100微秒的持续时间的约1500V/厘米的高压脉冲。
在另一实施方案中，本发明的方法更进一步包括给受试者的肌肉组织注射有效剂量的编码治疗蛋白的质粒并且使用至少一个具有长脉冲宽度的低压脉冲给受试者肌内实施电穿孔的步骤。编码用于该步骤的治疗蛋白的质粒可以是编码IL-12的质粒或者所有其它的有效质粒。
在肌内电穿孔治疗步骤的特定实施方案中，电压电平为约100v/cm的电压并且脉冲持续时间为约20毫秒。
当本发明的治疗方法多次实施时观察到治疗有效性的增加。在这一情况下，提供了癌性肿瘤受试者的治疗方法，包含给癌性肿瘤注射第一有效剂量的编码治疗蛋白的质粒，给肿瘤实施第一电穿孔治疗，第一电穿孔治疗更进一步包括实施至少一个高压短脉冲，随后给癌性肿瘤注射第二有效剂量的编码治疗蛋白的质粒，以及给肿瘤实施第二电穿孔治疗，第二电穿孔治疗更进一步包括实施至少一个高压短脉冲。另外，可以给肿瘤实施第三有效剂量的编码治疗蛋白的质粒以及第三电穿孔治疗，第三电穿孔治疗更进一步包括实施至少一个高压短脉冲。该两或者三个步骤的过程可以继之以给受试者的肌肉组织注射有效剂量的编码治疗蛋白的质粒并且使用至少一个具有长脉冲宽度的低压脉冲给受试者肌内实施电穿孔的步骤。
大量高压，短脉冲持续时间的电穿孔治疗条件在本发明的范围内。在示范性的实施方案中，本发明的方法包含给癌性肿瘤注射第一有效剂量的编码IL-12的质粒，给肿瘤实施第一电穿孔治疗，第一电穿孔治疗更进一步包括实施6个在1500V/cm在100微秒脉冲持续时间传递的脉冲，给癌性肿瘤注射第二有效剂量的编码IL-12的质粒，给肿瘤实施第二电穿孔治疗，第二电穿孔治疗更进一步包括实施6个在1500V/cm在100微秒脉冲持续时间传递的脉冲，给癌性肿瘤注射第三有效剂量的编码IL-12的质粒，以及给肿瘤实施第三电穿孔治疗，第三电穿孔治疗更进一步包括实施6个在1500V/cm在100微秒脉冲持续时间传递的脉冲。另外，该方法可以包括给受试者的肌肉组织注射有效剂量的编码治疗蛋白的质粒，使用在100V/cm的20毫秒持续时间传递的12个脉冲给受试者肌内实施电穿孔。
在本发明示范性的实施方案中，提供了治疗恶性肿瘤的方法，其中该方法包括在第0天实施第一治疗，第一治疗包括给癌性肿瘤注射第一有效剂量的编码IL-12的质粒以及给肿瘤实施第一电穿孔治疗，第一电穿孔治疗更进一步包括实施在1500V/cm在100微秒脉冲持续时间传递的6个脉冲。在第4天实施第二治疗，包括给癌性肿瘤注射第二有效剂量的编码IL-12的质粒以及给肿瘤实施第二电穿孔治疗，第二电穿孔治疗更进一步包括实施在1500V/cm在100微秒脉冲持续时间传递的6个脉冲。在第7天实施第三治疗，包括给癌性肿瘤注射第三有效剂量的编码IL-12的质粒以及给肿瘤实施第三电穿孔治疗，第三电穿孔治疗更进一步包括实施在1500V/cm在100微秒的脉冲持续时间传递的6个脉冲。附加的步骤可以包括给受试者的肌肉组织注射有效剂量的编码IL-12的质粒，使用在100V/cm的20毫秒持续时间传递的12个脉冲给受试者肌内实施电穿孔。
如详细说明中所提供结果所示，本发明的方法提供了使用编码IL-12的质粒以及电穿孔引起存活率统计上显著优于其它本领域已知方法的癌症治疗方案。本发明的方案使用高压短脉冲。所有本领域已知的递送以及表达IL-12的其它方案都使用低压，长电穿孔脉冲。因而，本发明基于编码蛋白的质粒的递送以及电穿孔的新方案产生新的以及出乎意料的结果。
附图说明
为了更全面了解本发明的特性以及目的，应该参考下列详细说明连同附图，其中：
图1是施用编码IL-12的质粒DNA继之以电穿孔引起肿瘤完全消退的图解说明。(A)治疗后比第0天肿瘤体积增加的倍数。P，pIRESIL-12；V，对照质粒，pND2Lux；E，电穿孔。递送的治疗方式：i.t.，肿瘤内；i.m.，肌内。加号表示施治疗；减号表示没有实施治疗。最初治疗的天数为第0天；小鼠再次治疗在第7天。所有组(除了P-E+i.t.以及V+E+i.t.)的结果都表示为来自三个重复实验的组合数据，并且误差线表示标准平均误差。P-E+i.t.以及V+E+i.t.治疗组在一个试验中进行因为在我们实验室的已有数据显示这些治疗是无效的。这两个组的误差线表示标准偏差。每一治疗组的样品总数如下：P-E-，n＝16；P-E+i.t.以及V+E+i.t.，n＝8；并且其余组，n＝17。当肿瘤体积超过1000mm3时处死小鼠。显示每天存活的小鼠的数据。(B)表示(A)中小鼠的存活百分比。当肿瘤体积超过1000mm3时小鼠死于疾病或者被处死。
图2为IL-12以及IFN-γ表达的血清以及肿瘤组织分析结果的图解说明。P，pIRES IL-12；E，电穿孔。递送方式：i.t.，肿瘤内；i.m.，肌内。(A)具有肿瘤的小鼠体内IL-12以及IFN-γ的血清水平。每一试验天的每一治疗组，n＝4只小鼠。误差线表示标准偏差。(B)IL-12以及IFN-γ的平均肿瘤表达。每一试验天的每一治疗组，n＝4只小鼠。误差线表示标准偏差。
图3是处理后5天肿瘤由浸润免疫细胞H&E染色分析的肿瘤组织的典型切片的图解。每一肿瘤检验了三个切片。所有的切片显示为250放大率。包含免疫细胞的区域标记为方框。(A)没有治疗。(B)电穿孔i.m.施用IL-12。(C)电穿孔i.t.施用IL-12。
图4是处理后5天由染褐色免疫组织化学分析的肿瘤组织的典型切片的图解。(B)中的箭头指向表示阳性染色的细胞。(A，B)分别来自未经治疗的肿瘤的CD4+淋巴细胞以及CD8+淋巴细胞的染色。(C，D)分别来自接受i.t注射编码IL-12的质粒DNA继之以电穿孔的肿瘤的CD4+淋巴细胞以及CD8+淋巴细胞的染色。(E，F)来自i.m.施用编码IL-12的质粒DNA连同电穿孔的肿瘤CD4+淋巴细胞以及CD8+淋巴细胞的分别染色。
图5是施用IL-12继之以电穿孔不引起裸鼠模型的肿瘤消退的图解说明。(A)治疗后比第0天肿瘤体积增加的倍数。P，pIRES IL-12；V，对照质粒，pND2Lux；E，电穿孔。递送方式：i.t.，肿瘤内。最初治疗的天数为第0天；小鼠再次治疗在第7天。数据表示每个两次试验，每组4只小鼠。误差线表示标准偏差。当肿瘤体积超过1000mm3时处死小鼠。显示每天存活的小鼠的数据。(B)表示为(A)中小鼠的存活百分比。当肿瘤体积超过1000mm3时小鼠死于疾病或者被处死。
图6是肿瘤组织存在的血管的免疫组织化学分析的图解。描绘了每一治疗中富含血管的典型切片。每一肿瘤检验了三个切片。所有的切片显示为400放大率。(A)中的箭头指向代表性的血管。(A)治疗之前第0天肿瘤内存在的血管。(B)在第5天未经治疗的肿瘤。(C)在第5天来自接受i.m.注射编码IL-12的质粒DNA继之以电穿孔的小鼠的肿瘤。(D)在第5天来自接受i.t.施用编码IL-12的质粒DNA继之以电穿孔的小鼠的血管。
图7是说明每一治疗组从C57BL/6小鼠计数的肿瘤血管的表。
图8是本发明三个治疗方案的图解说明。对于三个治疗方案而言，第0天是最初治疗的日子并且小鼠再次在第4天和第7天进行治疗。(A)与第一处理天肿瘤体积相比肿瘤体积增加的倍数。(B)良好治疗后存活的百分比。结果表示三个重复实验的组合数据并且误差线表示标准平均误差。每一治疗组的样品总数是50。当肿瘤体积超过1000mm3时给小鼠实施安乐死。对于(A)以及(B)而言，表达每天存活小鼠的数据。P＝pIRES IL-12；V＝对照质粒，pND2Lux；E＝电穿孔。对于治疗位点而言，i.t.＝肿瘤内递送；i.m.＝肌内递送。
图9是根据本发明第二肿瘤的短期预防的图解说明。在第0，4，以及7天实施三次治疗，并且在第0以及7天实施两次治疗。(A)没有接受治疗的右侧腹形成肿瘤的小鼠的百分比。(B)治疗后小鼠的存活百分比；在第0天治疗左侧腹已形成的肿瘤的时候将5×105的B16.F10细胞注射右侧腹。当肿瘤体积超过1000mm3时给小鼠实施安乐死。数据表示为三个重复实验，每个n为5。P＝pIRES IL-12；V＝对照质粒，pND2Lux；E＝电穿孔。对于治疗位点而言，i.t.＝肿瘤内递送；i.m.＝肌内递送。
图10是开始治疗之前诱导的第二肿瘤的预防的图解说明。在第0，4，以及7天实施三次治疗，并且在第0以及7天实施两次治疗。(A)没有接受治疗的右侧腹形成肿瘤的小鼠的百分比。(B)治疗后小鼠的存活百分比；将5×105的B16.F10细胞注射右侧腹。3天后将细胞注射左侧腹。当肿瘤体积超过1000mm3时给小鼠实施安乐死。数据表示为三个重复实验，每个n为5。P＝pIRES IL-12；V＝对照质粒，pND2Lux；E＝电穿孔。对于治疗位点而言，i.t.＝肿瘤内递送；i.m.＝肌内递送。
图11是说明由电穿孔肌内施用IL-12的治疗结果以及治疗预防肺中肿瘤小结发育的结果。
图12是接受静脉内高剂量B16细胞的小鼠的存活率的图解说明。在第0，4以及7天实施3次治疗。跟踪小鼠21天然后实施安乐死。数据表示为两个重复实验，每个n为4。小鼠在第0天进行肌内递送质粒治疗的时候接受向尾静脉注射5×105B16.F10细胞。P＝pIRESIL-12；V＝对照质粒，pND2Lux；E＝电穿孔。
优选实施方案的详细说明
在下面优选实施方案的详细描述中，参考作为本发明一部分的附图，以及实施本发明的图示的特定实施方案所示。应该理解可以使用其它实施方案并且可以在不背离本发明的范围内进行结构变化。
材料和方法
肿瘤细胞以及小鼠.将B16.F10鼠黑色素瘤细胞(CRL 6475；美国模式培养物保藏中心，Rockville，MD)培养在补充有10％FCS以及0.2％庆大霉素的Dulbecco’s基础Eagle’s培养基(DMEM)中。在注射之前胰蛋白酶处理细胞并且在无菌PBS中冲洗。对C57BL/6小鼠(National CancerInstitute，Bethesda，MD)的左侧腹剃毛并且皮下注射1×106细胞的50μl无菌PBS溶液。当攻击时，在右侧腹给小鼠注射5×105的B16.F10细胞。使用数字卡尺测量肿瘤，当注射后约7-10天肿瘤直径达到3-5mm时开始治疗。使用公式v＝a2bπ/6计算肿瘤体积(v)，其中a＝最小直径并且b＝垂直直径。根据AALAM指南饲养小鼠。
质粒DNA。pIRES IL-12由Karin Moelling(University of Zurich，Zurich，Switzerland)赠送。简而言之，pIRES IL-12包含两个由单巨细胞病毒(CMV)启动子之后的内部核糖体进入位点(IRES)连接的亚基。Robert Malone(Gene Delivery Alliance，Inc.，Rockville，MD)赠予pND2Lux，其编码报告基因荧光素酶。Qiagen Mega试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)用于质粒制备。pIRES IL-12用不含内毒素的试剂盒制备。所有的质粒DNA稀释在无菌可注射的盐水(0.9％)中并且储藏在-20℃。
肿瘤内治疗。小鼠使用97％氧以及3％异氟烷进行麻醉。使用具有25-号针头的结核菌素注射器给肿瘤注射50μl(1μg/ml)质粒DNA的无菌盐水溶液。包含6个约1cm直径的渗入电极的施药器被插入肿瘤中。使用BTX T820脉冲发生器(BTX，San Diego，CA)在1500V/cm(99μs，1Hz)传递6个脉冲。
肌内治疗.如前所述麻醉小鼠。对围绕腓肠肌的皮肤剃毛。使用结核菌素注射器以及25-号的针头将稀释在无菌盐水(50μl，1μg/ml)的质粒DNA注射到腓肠肌中。包含四个矩形渗入电极的为小鼠腓肠肌特别设计的施药器被插入围绕注射部位的肌肉中。使用BTX T820脉冲发生器在100V/cm(20ms，1Hz)分段传递总共12个脉冲。
ELISA.使用CO2窒息人道地处死小鼠，然后每天从每一治疗组的4只小鼠收集血液以及肿瘤。为了检测血清中的细胞因子，由心脏穿刺收集血液并且在4℃储藏过夜。通过4℃离心(在5000rpm 3分钟)从血样提取血清并且储藏在-20℃直到分析。为了测定肿瘤组织内细胞因子的水平，取出肿瘤，立即在干冰上冷冻，称重然后储藏在-80℃。为了分析，融解肿瘤，加入1ml包含PBS以及10％蛋白酶抑制剂混合物的溶液(P8340；Sigma，St.路易，MO)。组织保存在冰上，使用PowerGen700(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)匀化，4℃在5000rpm离心3分钟，然后通过ELISA分析上清液。使用鼠IFN-γ以及IL-12 p70ELISA试剂盒分析血清以及肿瘤样品(R&D Systems，Minneapolis，MN)。血清水平计算为每一ml血清中细胞因子的pg数。肿瘤中的细胞因子水平计算为每一mg肿瘤细胞因子的pg数。
组织学.通过CO2窒息人道处死小鼠。切除肿瘤并且放入含有10ml 10％甲醛的50-ml锥形管中。固定后用H&E对组织进行如下染色：固定在10％中性缓冲的甲醛液6小时后，使用Miles VIP组织处理器(Miles公司，Mishawaka，IN)将代表性的组织样品加工成石蜡块。简言之，在逐渐上升梯度的乙醇中对组织脱水，在二甲苯中澄清化并且浸润在石蜡中(Tissue Prep 2；Fisher Scientific)。包埋后，在标准旋转切片机上对组织切片并且将4-m切片从水浴取回并且放置在载玻片上。每一肿瘤检验了三个切片。加热干燥切片并且使用标准组织技术用H&E(Richard-Allan Scientific，Kalamazoo，MI)进行染色。使用合成的固定介质，然后放置盖玻片。
免疫组织化学.利用下列抗体进行免疫组织化学染色检验肿瘤分别是否存在CD4+淋巴细胞，CD8+淋巴细胞以及血管：大鼠抗小鼠CD4，大鼠抗小鼠CD8a(Ly2)，以及大鼠抗小鼠CD31(PECAM-)(PharMingen，Cambridge，MA)。通过CO2窒息人道处死小鼠。用剪刀切除肿瘤并且除去皮肤，然后立即冷冻在干冰和乙醇混合物中，并且储藏在-80℃。获得5μm的冷冻切片。为了进行免疫组织化学分析，将大鼠抗小鼠CD4，大鼠抗小鼠CD8a(Ly2)，或者大鼠抗小鼠CD31(PECAM-1)以1∶50的稀释度施用于组织切片并且培养30分钟，继之以用Vector Elite Rat IgG-Peroxidase试剂盒在2浓缩物(分别在生物素酰化的抗大鼠IgG以及ABC复合物中15分钟)的检测。在Dako自动染色仪上进行免疫染色。在400放大率分析切片。
治疗裸鼠。BALB/c无胸腺裸鼠获自National Cancer Institute并且使用7周龄的裸鼠。B16.F10细胞的制备如前所述。在左侧腹给小鼠皮下注射1×106的B16.F10细胞的50ml无菌PBS溶液。当肿瘤达到直径为3-5mm时开始治疗。如前所述小鼠接受肿瘤内治疗。
统计方法.由ANOVA或者双尾Student’s t检验进行统计分析。
图1-7提供了根据本发明两个治疗方案的结果。依据该方案，由体内电穿孔递送IL-12。通过向肿瘤或者腓肠肌注射50μg(1μg/ml)编码IL-12的质粒DNA(pIRES IL-12)的无菌盐水溶液继之以电穿孔治疗C57BL/6小鼠形成的皮下B16.F10黑色素瘤。包含6个渗入电极的施药器用来肿瘤内传递1500-V/cm，100-μs的脉冲。为了肌内递送，特意为小鼠腓肠肌设计并且包含四个渗入电极的施药器用来实施100-V/cm，20-ms的脉冲，这种方案显示引起IL-12以及IFN-γ的高系统性表达。单个治疗不引起长期的动物存活。因此，最初治疗(第0天)后第7天(7天)下列试验实施了第二治疗。在整个试验中评价肿瘤大小，并且结果表示为如图1A所示的每一治疗组超过第0天肿瘤体积的倍数。用肿瘤内注射的pIRES IL-12继之以电穿孔进行的治疗减慢了肿瘤生长几乎一半，17只小鼠只有8只显示出其肿瘤的完全消退。在接受肌肉注射编码IL-12质粒继之以电穿孔的小鼠体内观察到了渐进性肿瘤生长。未接受电脉冲，(P+E-)的小鼠显示持续的肿瘤生长直到所有的小鼠被处死或者死于肿瘤负荷。单独实施电穿孔(P-E+)以及肿瘤内(i.t.)递送对照载体(pND2Lux)连同电穿孔(V+E+)都不能减缓肿瘤生长。这些结果提供了单独的电脉冲以及质粒DNA都不能使肿瘤消退的证据。除了P+E+i.t.组，其它的治疗组都未显示肿瘤消退，虽然P+E-i.t.比P-E-在14天中显示较慢的肿瘤生长(P＜0.05)。
最初治疗后100天的小鼠的评估显示47％，17只接受肿瘤内递送IL-12连同电穿孔的小鼠中有8只如图1B所示不具有肿瘤。这些小鼠被认为被治愈了。所有接受IL-12的i.t.治疗连同电穿孔的小鼠经历了与其它治疗组动物相比延长的存活期。对照组中的所有小鼠都没有存活超过35天。具体地，如果未经治疗或者仅仅用脉冲治疗，小鼠不能存活超过21天。
我们攻击了7只在右侧腹有B16.F10肿瘤细胞显示完全消退并且保持健康50天的动物。没有实施额外的治疗。在7只攻击的动物中，5只在右侧腹抗肿瘤的生长，而肿瘤在100％首次用于实验的小鼠体内生长。该结果显示在最初左侧腹形成的皮下肿瘤的治疗后免疫记忆应答的发展。
如上所述，IL-12诱导对免疫系统的几个作用。为了评价由肌内或者肿瘤治疗诱导的细胞因子的表达，分析血清以及IL-12和IFN-γ的肿瘤水平。如图2A所示肌肉注射继之以电穿孔后两种细胞因子的血清水平最高。血清IL-12峰值在处理后10天的320pg/ml，而由IL-12表达诱导的血清IFN-γ峰值在第14天的177pg/ml。肌内连同电穿孔治疗的小鼠的两种细胞因子的血清水平比在第5，10和14天的其它治疗显著高(P＜0.05)。用肿瘤内注射继之以电穿孔治疗的小鼠的这些细胞因子的血清水平并不显著高于没有接受治疗的小鼠的表达(P＞0.05)。
肿瘤内IL-12和IFN-γ的表达分析显示连同电穿孔的肿瘤内治疗引起这些细胞因子在肿瘤位点的存在(图2B)。肿瘤内IL-12在第5天达到肿瘤组织的3pg/mg并且保持在该水平直至第10天，而在第5天IFN-γ水平达到8.16pg/mg肿瘤的峰值。用pIRES IL-12肿瘤内注射继之以电穿孔治疗在第5和第10天生产比其它治疗组显著高(P＜0.05)的IFN-γ水平。虽然肿瘤内治疗使肿瘤的IL-12的肿瘤表达达到3pg/mg，与肌内治疗达到肿瘤的0.64pg/mg形成对比，但是这些水平并不显著高(P＞0.05)，因为肿瘤内治疗后这些肿瘤中表达水平宽范围(肿瘤组织的0.5-6.9pg/mg)。
如图2B所示，肌肉注射继之以电穿孔治疗不引起肿瘤内细胞因子的显著表达(P＞0.05)。肌内治疗后，测定的最高IFN-γ表达为在第17天肿瘤的1pg/mg。因此，不引起肿瘤消退的治疗方案也不生产肿瘤内IL-12或者IFN-γ的表达。这些结果支持了先前肿瘤内细胞因子表达的临界需要的报道。
肿瘤成功消退后对攻击的抗性显示了免疫记忆应答的发展。最初治疗后5天对肿瘤进行组织检查以评价免疫细胞向肿瘤的流入。用苏木精以及曙红(H&E)对肿瘤切片染色以从肿瘤细胞分辨出浸润免疫细胞。如图3C所示，H&E-染色的切片显示接受肿瘤内注射pIRES IL-12继之以电穿孔后第5天淋巴细胞向小鼠肿瘤的渗透。相反，未治疗或者接受肌内治疗连同电穿孔的小鼠如图3A以及3B所示未显示较高的淋巴细胞流入。在体内电穿孔(P+E-或者肿瘤内或者肌内)中不包括的治疗方案也不引起淋巴细胞的流入(数据未显示)。
通过免疫组织化学的表型分类，证实了如图4C以及4D所示用IL-12以及电穿孔肿瘤内治疗后观察到的肿瘤中淋巴细胞为CD4+以及CD8+T细胞。比较起来，如图4A以及4B所示，未治疗的肿瘤中观察到有限数量的淋巴细胞。用肌肉注射继之以电穿孔治疗小鼠也引起淋巴细胞的有限浸润，类似于图4E以及4F未处理对照组的特征。另外，接受编码IL-12(P+E-肿瘤内或者肌内)的质粒或者对照质粒注射连同电穿孔(V+E+肿瘤内)的小鼠没有显示浸润的淋巴细胞(数据未显示)。
为了更进一步评价对T淋巴细胞在肿瘤消退中的需要，无胸腺缺乏T细胞的裸鼠代替C57BL/6小鼠用作小鼠模型。这些小鼠皮下注射B16.F10肿瘤细胞并且当肿瘤达到直径为3-5毫米时开始治疗。先前解释的接受肿瘤内治疗的小鼠：肿瘤内注射编码IL-12的质粒没有电穿孔，肿瘤内注射对照质粒继之以电穿孔，或者肿瘤内注射编码IL-12的质粒继之以电穿孔。因为缺乏肌内注射后C57BL/6小鼠的成功应答，我们仅仅实施肿瘤内治疗。裸鼠模型中没有一种治疗引起如图5A所述的肿瘤消退。此外，在所有治疗组中没有小鼠存活超过30天。这些观察更进一步暗示了T细胞应答对于B16.F10黑色素瘤肿瘤成功消退的必要性。
IL-12在肿瘤消退上的另一可能作用是其对血管生成的作用。为了评价IL-12对C57BL/6小鼠中B16.F10肿瘤的抗血管生成作用，用标记内皮细胞的抗CD31抗体对来自每个治疗组的三个肿瘤的典型切片进行染色。如图6所示，检验了每一组x400放大率的最高血管分布的5个不同区域。在图6A中显示了第0天未治疗肿瘤的血管的代表性切片。图6B以及6C显示了第5天，在未治疗的肿瘤或者接受肌肉注射继之以电穿孔的小鼠的肿瘤内存在的大量血管。相比之下，图6D显示了在第5天肿瘤内注射以及电穿孔后血管的减少。来自接受编码IL-12的质粒的注射没有电穿孔(P+E-肿瘤内或者肌内)或者对照质粒连同电穿孔(V+E+)小鼠的肿瘤没有显示血管结构的减少(数据未显示)。
此外，对未治疗小鼠，接受肌内IL-12以及电穿孔的小鼠，以及接受肿瘤内IL-12以及电穿孔的小鼠切下的3个肿瘤中的每一个的血管进行计数。图7中，表1显示了3个切除肿瘤的每一个x400放大率的最高血管分布区域的血管数目。只有肿瘤内注射继之以电穿孔(P+E+肿瘤内)引起与未经治疗动物相比血管的显著减少(P＜0.05)。虽然肿瘤内治疗连同电穿孔后观察到了抗血管生成作用，裸鼠模型应答的缺乏显示了T细胞可能是获得B16.F10黑色素瘤消退的关键因素。然而抗血管生成应答可以促进肿瘤大小的稳定同时免疫应答增加。
这个报告已经显示借助于电穿孔以质粒DNA形式递送的IL-12可以引起B16.F10肿瘤的成功消退。动物保持健康并且抗远距离位点的攻击。两个治疗方案的结果显示了基因治疗形成的皮下B16.F10黑色素瘤后几乎47％的存活率。
总之，本发明提供了在攻击后可以根除形成的B16.F10黑色素瘤并且引起对重建肿瘤生长的抗性的治疗方式。利用这2种治疗方案，通过体内电穿孔i.t.递送编码IL-12的质粒DNA后，47％的小鼠显示其肿瘤的完全消退并且保持健康。这些小鼠用B16.F10肿瘤细胞攻击，7只小鼠中的5只在另外100天保持无肿瘤，其后人道处死。同样，证实了i.t.注射编码IL-12的质粒DNA以及电穿孔比i.m.递送对于促进肿瘤消退以及延长动物存活期更有效。这种治疗在肿瘤模型中的成功源于IL-12以及IFN-γ的局部表达，淋巴细胞的浸润，以及治疗肿瘤内的血管生成的抑制。
图8-12图解了根据本发明的三个治疗方案。对于短期预防远距离位点的皮下肿瘤而言，C57B1/6小鼠在两个侧腹进行剃毛。在左侧腹给小鼠皮下注射1×106的B16.F10细胞的50μl无菌PBS溶液。一旦肿瘤形成，测定直径为3-5mm开始治疗。进行2种实验。第一组实验，第一治疗当天，将5×105的B16.F10细胞的50μl无菌PBS溶液注射在小鼠的右侧腹。第二组实验，在左侧腹注射后3天将5×105的B16.F10细胞的50μl的无菌PBS溶液注射到小鼠的右侧腹。对于两组试验而言，如前所述，小鼠接受左侧腹原发肿瘤的肿瘤内或者肿瘤内以及肌内治疗的组合。脉冲方案更进一步描述在结果部分。如前所述连续测量在侧腹形成的肿瘤，并且监控小鼠右侧腹的肿瘤发育。
对于肺定殖的分析而言，如前皮下注射详述制备B16.F10细胞。使用具有30-号针头的1cc注射器将1×105或者5×105 B16.F10细胞的50μl的无菌PBS溶液注射尾部静脉。如前所述在接种的当天以及四天后小鼠接受肌内治疗。接种后21天，麻醉小鼠并将其胸腔暴露。在肺表面出现作为黑色肿瘤小结的肺定殖并计数。
如前两个治疗方案所示，用i.t.注射编码IL-12质粒以及电穿孔治疗两次的具有形成的皮下B16.F10肿瘤的小鼠47％的健康存活时间超过100天。7只无病小鼠中5只在相对侧腹另外接种肿瘤细胞后抗攻击。我们先前注意到对第一治疗的较差应答常常在未完全消退的肿瘤中观察到。通过第二治疗7天后，这些肿瘤显示大范围的生长并且可能已经太大以至于不能通过另外的治疗成功消退。在两种方法中均获得健康存活率的增加。首先，用3个治疗代替2个治疗在第0，4以及7天递送给小鼠。第二，添加肌内治疗。如前所述，已经显示IL-12质粒的肌内递送引起IL-12以及IFN-((41)的系统产生。这些小鼠同样接受3次治疗。
如图8所示，单独i.t.或者与i.m.组合的3次治疗的实施引起肿瘤的完全消退以及超过2次治疗的健康存活率。3-治疗方案(单独i.t.或者i.t.和i.m.)产生80％的健康存活率，统计上显著(p＜0.05)优于2-治疗方案(图1b)的60％的健康存活率。2-治疗方案的健康存活率稍微超过我们先前的2次治疗(60％对47％)的结果统计上并不显著。所有的3个通过电穿孔递送IL-12质粒的治疗方案引起肿瘤的完全消退并且在100天的时间内保持健康状态。当用B16.F10细胞攻击时，3个治疗组中的所有12(100％)只健康小鼠都具有抗性，并且2-治疗组的9只小鼠中有8只(88.9％)具有抗性，显示了免疫记忆应答的发展。这些治疗方案在多种肿瘤以及转移模型中被进一步检验。
上述实验显示了新肿瘤(相对侧腹)的形成在具有完全应答以及长期健康存活的小鼠中可以高百分比地被预防。为了更进一步检验这种治疗方法的潜能，在原发肿瘤消退之前评价阻断新肿瘤形成的能力是非常重要的。在小鼠接受左侧腹形成的B16.F10肿瘤第一治疗的当天，将B16.F10细胞的第二注射施用于右侧腹。然后评价小鼠第一肿瘤的消退以及第二肿瘤形成的预防。
包括i.t.或者i.t./i.m.注射以及电穿孔的治疗方案引起原发肿瘤的消退以及继发肿瘤形成的预防(图9a，b)。27％接受2次治疗的小鼠以及33％接受3种治疗方案之一的小鼠发展了继发瘤(图9a)。接受i.t.注射对照质粒继之以电穿孔的小鼠中77％的小鼠发展了继发瘤。在非治疗组中，55％的小鼠发展了继发瘤并且在只接受i.t.注射的组中58％的小鼠生长了第二肿瘤(图9a)。因为这种肿瘤模型的侵入性，对照治疗组中的几只小鼠在继发瘤可以形成之前死于其原发肿瘤。因此，形成继发瘤小鼠的百分比也许在这些小鼠存活了较长时间的组中较高。与无治疗，单独注射质粒以及注射对照质粒继之以电穿孔的组相比在所有3个接受了IL-12质粒以及电穿孔的组中存活时间(图9b)显著提高(p＜0.01)。每一组的平均存活时间如下：无治疗＝17.9+/-6.7天；单独注射质粒＝30.1+/-28.9天；对照质粒继之以电穿孔＝20.6+/-6.0天；i.t.以及i.m.质粒注射以及电穿孔(3次治疗)＝59.5+/-27.7天；i.t.质粒注射以及电穿孔(2次治疗)＝65.2+/-24.0天；i.t.质粒注射以及电穿孔(3次治疗)＝68.6+/-31.8天。15只用i.t.质粒注射以及电穿孔(3次治疗)治疗的小鼠中有7只(47％)被认为是“治愈了”，因为它们在处理后100天没有疾病症状。在i.t./i.m.3治疗以及i.t.2治疗组中15只小鼠中有4只(26％)被“治愈了”。
进行了第二系列实验以便检验这种方法是否可以预防治疗之前注射肿瘤细胞时远距离皮下肿瘤的形成。小鼠左侧腹接受B16细胞注射后3天(大约在小鼠接受左侧腹形成的B16.F10肿瘤的治疗之前4天)，我们在右侧腹实施了B16.F10细胞的第二注射。如先前实验所述，评价小鼠第一肿瘤的消退以及第二肿瘤形成的预防(图10a，b)。在50％接受两或者三次i.t.治疗的小鼠以及25％接受3次i.t.以及i.m.治疗的小鼠中发展了继发瘤(图10a)。在对照组中：100％接受i.t.注射IL-12质粒没有电穿孔的小鼠，87.5％的无治疗组以及75％接受i.t.注射对照质粒继之以电穿孔的小鼠发展了继发瘤(图10a)。与3个对照组相比只在接受3次i.t.或者i.t./i.m.治疗(图10b)的小鼠体内观察到存活时间的显著增加(p＜0.05)。i.t.2治疗组小鼠的存活时间与任意其他组并不显著不同。每一组的平均存活时间如下：无治疗＝21.8+/-4.8天；单独注射质粒＝26.0+/-8.8天；对照质粒继之以电穿孔＝23.5+/-6.6天；i.t.以及i.m.质粒注射以及电穿孔(3次治疗)＝37.9+/-11.2天；i.t.质粒注射以及电穿孔(2次治疗)＝38.1+/-24.5天；i.t.质粒注射以及电穿孔(3次治疗)＝47.8+/-26.1天。只有2只小鼠，1只在i.t./i.m.组以及另1只在i.t.2治疗组中在100天时无肿瘤并且被认为是“治愈了”。
B16.F10黑色素瘤细胞将在i.v.注射后在肺中形成肿瘤小结。这种模型的治疗需要不包括初级或者皮下肿瘤的方案。因此，建议的治疗必须诱导可以应答肺中肿瘤负荷的系统性免疫应答。我们先前证实了i.m.注射IL-12质粒继之以电穿孔引起IL-12以及IFN-γ的高血清水平。此外，这种血清水平可以通过在最初治疗后增加4天的第二治疗从而持续较长的时间段。
在这种模型中，具有1×105的B16.F10细胞的C57B1/6小鼠被注射以及i.m.施用50μg编码IL-12的质粒以及电穿孔的治疗。注射以及最初治疗后4天，我们实施了第二治疗。21天后麻醉小鼠并且寻找它们肺部的肿瘤小结。图11的表显示了37.5％接受IL-12以及电穿孔治疗的小鼠发展了肺定殖。在这3只小鼠中，2只小鼠只有一个小结。相比之下，87.5％未治疗的小鼠发展了肺定殖并且75％接受了i.m.注射编码IL-12的质粒没有电穿孔的小鼠或者接受i.m.注射对照质粒连同电穿孔的小鼠发展了肿瘤小结。
为了评价这种治疗对巨大肿瘤接种的效力，i.v.注射5×105的B16.F10细胞，然后实施如上所述的治疗。因为对照组中的小鼠21天之前开始死亡，数据显示为存活率(图11)。100％接受i.m.注射编码IL-12质粒连同电穿孔的小鼠组在整个实验期间存活。对照组中，无治疗组中62.5％存活，只注射组中75％的小鼠存活，并且接受对照质粒继之以电穿孔的组中50％的小鼠存活。由此，i.m.注射编码IL-12的质粒继之以电穿孔引起较少肺定殖的形成以及重肿瘤接种小鼠存活率的提高。
根据本发明证实了通过电穿孔递送编码IL-12的质粒引起皮下肿瘤以及肺转移的成功治疗。我们也已经证明这种方法不仅有效治疗形成的肿瘤而且可同样有效预防新肿瘤的形成。该结果同时暗示这种方法可用于治疗多种皮下肿瘤。当只治疗原发肿瘤时远距离第二肿瘤的形成减少。当肿瘤细胞注射发生在治疗当天或者治疗前4天时可以观察到这种效果。虽然使用质粒IL-12施用其它电穿孔方案已经显示肿瘤生长的一些消退或者延缓，在这里给出的治疗方案已经显示出抗鼠B16.F10黑色素瘤的最高成功率。
缺乏实施电脉冲本身的不良副作用是其应用的诱人因素。实施电脉冲递送化疗剂的I以及II阶段人临床试验显示了抗局部肿瘤的成功。不需要全身麻醉，并且病人没有报道任何严重的不利事件。实施脉冲期间，病人承认感受到单独的脉冲但是没有报道任何其它的感觉。由此，通过利用电脉冲当然可以应用于人的应用。
此外，对于基因治疗研究而言，电穿孔可以有效加强裸DNA的递送。质粒DNA不需要细胞分裂，与递送重组蛋白质或者使用病毒载体相比也不引起严重的毒性或者免疫反应。如前所述，Lohr等人对电穿孔递送IL-12与腺病毒进行了比较并且发现电穿孔治疗方案后小鼠副作用的显著减少。虽然利用体内电穿孔递送质粒DNA是发育的相对早期阶段，已有几个预临床研究显示这种方法可用于抗几种癌症类型。本发明提供了施用编码IL-12的质粒连同电穿孔的方法对，原发肿瘤以及远距离肿瘤以及转移具有治疗效果。
可以看出上述的目标，以及上述描述显而易见的目标可以有效获得，并且因为可以对上述描述进行某些修改只要不背离本发明的范围，因此上述描述中含有的内容以及附图中显示的内容应该是说明性的而非限制性的。
同时应该理解下列权利要求是用来覆盖本发明在这里描述的所有一般的以及特定的特征，并且本发明范围内的所有陈述都可以落在其范围内。本发明权利要求如下。

Claims (49)

1.治疗癌性肿瘤受试者的方法，该方法包括：
给癌性肿瘤施用有效剂量的编码治疗蛋白的质粒；以及
给肿瘤实施电穿孔治疗，该电穿孔治疗更进一步包括实施至少一个高压短脉冲。
2.权利要求1的方法，其中的癌性肿瘤是黑色素瘤。
3.权利要求1的方法，其中的癌性肿瘤是B16.F10黑色素瘤。
4.权利要求1的方法，其中编码治疗蛋白的质粒是编码IL-12的质粒。
5.权利要求1的方法，其中所述递送给肿瘤的至少一个高压脉冲大于约400V/cm。
6.权利要求1的方法，其中至少一个脉冲的短持续时间小于约1毫秒。
7.权利要求1的方法，其中所述递送给肿瘤的至少一个高压脉冲为约1500v/cm。
8.权利要求1的方法，其中至少一个脉冲的短持续时间为约100微秒。
9.权利要求1的方法，更进一步包括：
给受试者的肌肉组织注射有效剂量的编码治疗蛋白的质粒；以及
使用至少一个具有长脉冲宽度的低压脉冲给受试者肌内实施电穿孔。
10.权利要求9的方法，其中编码治疗蛋白的质粒是编码IL-12的质粒。
11.权利要求9的方法，其中的低压脉冲的电压为约100V/cm。
12.权利要求9的方法，其中的长脉冲宽度为约20毫秒的脉冲宽度。
13.治疗癌性肿瘤受试者的方法，该方法包括：
给癌性肿瘤注射有效剂量的编码IL-12的质粒；
使用6个1500V/cm脉冲给肿瘤实施电穿孔，每一脉冲为100微秒的持续时间；
给受试者的肌肉组织注射有效剂量的编码IL-12的质粒；以及
使用12个100V/cm的脉冲给受试者肌内实施电穿孔，每一脉冲为20毫秒的持续时间。
14.权利要求13的方法，其中的癌性肿瘤是黑色素瘤。
15.权利要求13的方法，其中的癌性肿瘤是B16.F10黑色素瘤。
16.治疗癌性肿瘤受试者的方法，该方法包括：
在T1时实施第一治疗，其中第一治疗进一步包括给癌性肿瘤注射第一有效剂量的编码治疗蛋白的质粒以及给肿瘤实施第一电穿孔治疗，第一电穿孔治疗更进一步包括实施至少一个高压短脉冲；以及
在T2时实施第二治疗，其中T2的时间晚于T1的时间，其中第二治疗更进一步包括给癌性肿瘤注射第二有效剂量的编码治疗蛋白的质粒以及给肿瘤偶而实施第二电穿孔治疗，第二电穿孔治疗更进一步包括实施至少一个高压短脉冲。
17.权利要求16的方法，其中的癌性肿瘤是黑色素瘤。
18.权利要求16的方法，其中的癌性肿瘤是B16.F10黑色素瘤。
19.权利要求16的方法，其中编码治疗蛋白的质粒是编码IL-12的质粒。
20.权利要求16的方法，其中至少一个递送给肿瘤的高压脉冲大于约400V/cm。
21.权利要求16的方法，其中至少一个脉冲的短持续时间小于约1毫秒。
22.权利要求16的方法，其中至少一个递送给肿瘤的高压脉冲为约1500V/cm。
23.权利要求16的方法，其中至少一个脉冲的短持续时间为约100微秒。
24.权利要求16的方法，其中T1和T2之间的持续时间为7天。
25.权利要求16的方法，更进一步包括：
在T3时实施第三治疗，其中T3的时间晚于T2的时间，其中第三治疗更进一步包括给癌性肿瘤注射第三有效剂量的编码治疗蛋白的质粒以及给肿瘤实施第三电穿孔治疗，第三电穿孔治疗更进一步包括实施至少一个高压短脉冲。
26.权利要求16的方法，其中T1和T2之间的持续时间为4天。
27.权利要求25的方法，其中T2和T3之间的持续时间为3天。
28.权利要求16的方法，更进一步包括：
给受试者的肌肉组织注射有效剂量的编码治疗蛋白的质粒；
以及使用至少一个具有长脉冲宽度的低压脉冲给受试者肌内实施电穿孔。
29.权利要求28的方法，其中的低压脉冲的电压为约100V/cm。
30.权利要求28的方法，其中的长脉冲宽度为约20毫秒的脉冲宽度。
31.治疗癌性肿瘤受试者的方法，该方法包括：
在T1时实施第一治疗，其中第一治疗更进一步包括给癌性肿瘤注射第一有效剂量的编码治疗蛋白的质粒以及给肿瘤偶尔实施第一电穿孔治疗，第一电穿孔治疗更进一步包括实施至少一个高压短脉冲；
在T2时实施第二治疗，其中T2的时间晚于T1的时间，其中第二治疗更进一步包括给癌性肿瘤注射第二有效剂量的编码治疗蛋白的质粒以及给肿瘤偶而实施第二电穿孔治疗，第二电穿孔治疗更进一步包括实施至少一个高压短脉冲；以及
在T3时实施第三治疗，其中T3的时间晚于T2的时间，其中第三治疗更进一步包括给癌性肿瘤注射第三有效剂量的编码治疗蛋白的质粒以及给肿瘤实施第三电穿孔治疗，第三电穿孔治疗更进一步包括实施至少一个高压短脉冲。
32.权利要求31的方法，其中的癌性肿瘤是黑色素瘤。
33.权利要求31的方法，其中的癌性肿瘤是B16.F10黑色素瘤。
34.权利要求31的方法，其中编码治疗蛋白的质粒是编码IL-12的质粒。
35.权利要求31的方法，其中所述递送给肿瘤的至少一个高压脉冲大于约400V/cm。
36.权利要求31的方法，其中至少一个脉冲的短持续时间小于约1毫秒。
37.权利要求31的方法，其中所述递送给肿瘤的至少一个高压脉冲为约1500V/cm。
38.权利要求31的方法，其中至少一个脉冲的短持续时间为约100微秒。
39.权利要求31的方法，更进一步包括：
给受试者的肌肉组织注射有效剂量的编码治疗蛋白的质粒；以及
使用至少一个具有长脉冲宽度的低压脉冲给受试者肌内实施电穿孔。
40.权利要求39的方法，其中的低压脉冲的电压为约100V/cm。
41.权利要求39的方法，其中的长脉冲宽度为约20毫秒的脉冲宽度。
42.权利要求39的方法，其中T1和T2之间的持续时间为4天并且T2和T3之间的持续时间为3天。
43.治疗癌性肿瘤受试者的方法，该方法包括：
在第0天实施第一治疗，第一治疗包括给癌性肿瘤注射第一有效剂量的编码IL-12的质粒以及给肿瘤实施第一电穿孔治疗，第一电穿孔治疗进一步包括实施6个在1500V/cm在100微秒脉冲持续时间传递的脉冲；以及
在第7天实施第二治疗，第二治疗包括给癌性肿瘤注射第二有效剂量的编码IL-12的质粒以及给肿瘤实施第二电穿孔治疗，第二电穿孔治疗进一步包括实施6个在1500V/cm在100微秒脉冲持续时间传递的脉冲。
44.权利要求43的方法，更进一步包括：
给受试者的肌肉组织注射有效剂量的编码IL-12的质粒；以及
使用在100V/cm的20毫秒持续时间传递的12个脉冲给受试者肌内实施电穿孔。
45.治疗癌性肿瘤受试者的方法，该方法包括：
在第0天实施第一治疗，第一治疗包括给癌性肿瘤注射第一有效剂量的编码IL-12的质粒以及给肿瘤实施第一电穿孔治疗，第一电穿孔治疗进一步包括实施6个在1500V/cm在100微秒脉冲持续时间传递的脉冲；
在第7天实施第二治疗，第二治疗包括给癌性肿瘤注射第二有效剂量的编码IL-12的质粒以及给肿瘤实施第二电穿孔治疗，第二电穿孔治疗进一步包括实施6个在1500V/cm在100微秒脉冲持续时间传递的脉冲；
给受试者的肌肉组织注射有效剂量的编码IL-12的质粒；以及
使用在100V/cm的20毫秒持续时间传递的12个脉冲给受试者肌内实施电穿孔。
46.治疗癌性肿瘤受试者的方法，该方法包括：
在第0天实施第一治疗，第一治疗包括给癌性肿瘤注射第一有效剂量的编码IL-12的质粒以及给肿瘤实施第一电穿孔治疗，第一电穿孔治疗进一步包括实施6个在1500V/cm在100微秒脉冲持续时间传递的脉冲；
在第4天实施第二治疗，第二治疗包括给癌性肿瘤注射第二有效剂量的编码IL-12的质粒以及给肿瘤实施第二电穿孔治疗，第二电穿孔治疗进一步包括实施6个在1500V/cm在100微秒脉冲持续时间传递的脉冲；以及
在第7天实施第三治疗，第三治疗包括给癌性肿瘤注射第三有效剂量的编码IL-12的质粒以及给肿瘤实施第三电穿孔治疗，第三电穿孔治疗更进一步包括实施在1500V/cm在100微秒脉冲持续时间传递的6个脉冲。
47.权利要求46的方法，更进一步包括：
给受试者的肌肉组织注射有效剂量的编码IL-12的质粒；以及
使用在100V/cm的20毫秒持续时间传递的12个脉冲给受试者肌内实施电穿孔。
48.治疗癌性肿瘤受试者的方法，该方法包括：
在第0天实施第一治疗，第一治疗包括给癌性肿瘤注射第一有效剂量的编码IL-12的质粒以及给肿瘤实施第一电穿孔治疗，第一电穿孔治疗进一步包括实施6个在1500V/cm在100微秒脉冲持续时间传递的脉冲；
在第4天实施第二治疗，第二治疗包括给癌性肿瘤注射第二有效剂量的编码IL-12的质粒以及给肿瘤实施第二电穿孔治疗，第二电穿孔治疗进一步包括实施6个在1500V/cm在100微秒脉冲持续时间传递的脉冲；
在第7天实施第三治疗，第三治疗包括给癌性肿瘤注射第三有效剂量的编码IL-12的质粒以及给肿瘤实施第三电穿孔治疗，第三电穿孔治疗更进一步包括实施在1500V/cm在100微第三脉冲持续时间传递的6个脉冲；
给受试者的肌肉组织注射有效剂量的编码IL-12的质粒；以及
使用在100V/cm的20毫秒持续时间传递的12个脉冲给受试者肌内实施电穿孔。
49.权利要求48的方法，其中的癌性肿瘤是黑色素瘤。
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