CN102584975A

CN102584975A - 一种核仁定位信号肽及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN102584975A
Application number: CN2012100271057A
Authority: CN
Inventors: 黄来强; 陈红波; 李俊畅; 梅林�; 周兰贞; 郑义
Original assignee: Shenzhen Graduate School Tsinghua University
Current assignee: Shenzhen Graduate School Tsinghua University
Priority date: 2012-02-08
Filing date: 2012-02-08
Publication date: 2012-07-18
Anticipated expiration: 2032-02-08
Also published as: CN102584975B

Abstract

本发明公开了一种核仁定位信号肽及其编码基因和应用。本发明提供的核仁定位信号肽，为如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的多肽；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有核仁定位信号肽功能的由序列1衍生的多肽。本发明提供了一种核仁定位信号肽及其编码基因。本发明提供的核仁定位信号肽可将目标蛋白的靶向核仁定位。将本发明提供的核仁定位信号肽和适宜的目标蛋白形成融合蛋白，可以得到用于治疗恶性肿瘤、血液病，病毒感染等疾病的药物，并实现高效给药。本发明对于生物技术领域和医药领域具有重大价值。

Description

一种核仁定位信号肽及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及一种核仁定位信号肽及其编码基因和应用。

背景技术

真核生物与原核生物最大的区别是真核生物的细胞发展出了复杂的膜系统，这些生物膜将真核生物的细胞分割成为多个区域，进而形成了多个不同细胞器和空间，比如溶酶体、内质网、高尔基体、线粒体、细胞核等等。真核细胞内膜系统的出现大大增加了细胞内膜的表面积，并且将细胞分隔成为多个特定的功能区域，为多种酶类提供了特定的结合部位和发挥功能的环境，同时也增加了细胞信号调控的深度和广度，是真核生物发挥复杂生物功能的基础。

每个细胞大约含10亿个蛋白质分子，蛋白质的基本组成单位是氨基酸，氨基酸首先按照不同的组成和顺序靠共价键形成一条多肽链，然后多肽链再折叠成为具有高级空间构象的活性蛋白质，分布到细胞不同的区域去执行不同的生理功能，有的构成细胞骨架蛋白，有的成为受体分子，有的具有酶活性等等。那么这些蛋白是通过什么机制被进行分选然后定位到特定的细胞区域的？这个问题直到20世纪70年代才有了初步的答案。60年代后期Blobel进入了由George Palade领导的洛克菲勒大学细胞生物学实验室研究新生蛋白质转运和分泌的机制。他于1971年第一次提出了“信号假说”，认为分泌到细胞外的蛋白质有一个内源信号，是这个信号指导了蛋白质穿越细胞膜；随后在一系列可靠的生化试验基础上。Blobel于1975年描述了其从合成到分泌到胞外的各个步骤的详细过程，指导蛋白分泌到胞外的是一段疏水性多肽，蛋白质在合成的过程中依赖于这段多肽通过一个通道穿过内质网膜，然后经过分选进入分泌途径。后来的研究表明，不同的蛋白质具有不同的细胞定位信号，指导其靶向转运到不同的细胞器上去，比如靶向内质网、溶酶体、线粒体、细胞核等等。

蛋白质的转运和定位机制对于细胞的正常的生理功能至关重要，许多人类的遗传性疾病就是由于这种信号和转运机制出错所致，比如原发性草酸尿症是由于蛋白质的分选信号改变导致蛋白质的定位出错，使人在早年便出现肾结石。某些家族性高胆固醇血症也是由于运输信号缺失造成血液中高胆固醇累积。

研究蛋白质的转运和定位信号具有很大的应用价值，比如将蛋白药物与分泌表达的信号肽融合表达，可以得到分泌形式的成熟蛋白，此技术已经在多肽药物生产方面被广泛应用。此外，多肽在药物靶向运送及疾病治疗中也具有广泛的应用，比如可以利用HIV的rev蛋白具有核定位信号的机制，可以将治疗基因通过慢病毒载体转移到细胞核中，以进行疾病的细胞定向基因治疗。

实际上，在细胞内除了上述的具有膜结构的细胞器外，还有一些非膜结构重要的细胞器，比如染色体、中心粒、核糖体、核仁等等。这些特化的大分子结构对细胞功能的正常发挥也具有重要的作用。比如中心粒是由排列成圆筒状的9束三体微管组成的非膜结构细胞器，其与细胞分裂过程中纺锤体的形成有关，并能决定细胞分裂的方向。核仁是哺乳动物细胞核内的一个亚细胞非膜性细胞器，主要由rDNA，rRNA和多种核仁定位蛋白组成。以前认为核仁的主要功能是合成和组装核糖体亚单位，但是最近随着研究的深入，目前发现核仁还具有很多重要的生物学功能，与DNA损伤修复、细胞周期调控、衰老以及胁迫反应等众多重要的细胞事件有关，而且发现很多与疾病和癌症发生和发展相关的蛋白质在细胞核仁中具有定位现象。因此研究核仁定位信号，不仅可以揭示核仁定位蛋白质基本的生物学功能和机制，同时还能为特异的核仁靶向生物技术药物开发提供技术支持。

发明内容

本发明的目的是提供一种核仁定位信号肽及其编码基因和应用。

本发明提供的多肽，是一种核仁定位信号肽，为如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的多肽；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有核仁定位信号肽功能的由序列1衍生的多肽。

所述取代和/或缺失和/或添加位于五个结构域以外；所述五个结构域依次为序列表的序列1自N末端第4至6位(RLR基序)、第12至13位(LR基序)、第16至18位(RLR基序)、24至26位(RLR基序)、第34至35位(LR基序)、第41至46位(核定位信号)。

序列表中序列1所示的氨基酸即序列表的序列3自N末端第347至400位氨基酸残基。

编码所述多肽的基因也属于本发明的保护范围。

所述基因是如下1)至3)中任一所述的DNA分子：

1)序列表中序列2所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码具有核仁定位信号肽功能蛋白的DNA分子；

3)与1)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码具有核仁定位信号肽功能蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。所述重组表达载体具体可为将所述基因插入质粒pEGFP-C1的多克隆位点得到的重组质粒。

本发明还保护所述多肽在将目标蛋白定位于核仁中的应用。

所述目标蛋白具体可如序列表中序列4自N末端第1至346位氨基酸残基所示。

本发明还保护一种将目标蛋白定位于核仁中的方法，是采用所述多肽作为核仁定位信号肽将目标蛋白定位于核仁中。所述核仁为细胞的核仁。所述细胞具体可为HeLa细胞、U251细胞或HEK293细胞。所述方法具体可为：将融合基因导入细胞并表达，从而将目标蛋白定位于所述细胞的核仁中；所述融合基因自上游至下游依次包括所述多肽的编码基因和所述目标蛋白的编码基因。

本发明提供了一种核仁定位信号肽及其编码基因。本发明提供的核仁定位信号肽可将目标蛋白的靶向核仁定位。将本发明提供的核仁定位信号肽和适宜的目标蛋白形成融合蛋白，可以得到用于治疗恶性肿瘤、血液病，病毒感染等疾病的药物，并实现高效给药。本发明对于生物技术领域和医药领域具有重大价值。

附图说明

图1为重组质粒pEGFP-C1-PICT-1的酶切电泳图。

图2为GFP-PICT-1融合蛋白的亚细胞定位的激光共聚焦观察；绿色荧光为PICT-1蛋白的定位，蓝色荧光代表DAPI染色的细胞核，Merge是将PICT-1蛋白定位和DAPI染色的两个图片叠加。

图3为内源PICT-1蛋白亚细胞定位的激光共聚焦观察；绿色荧光为PICT-1蛋白的定位，蓝色荧光代表DAPI染色的细胞核，Merge是将PICT-1蛋白定位和DAPI染色的两个图片叠加。

图4为含有各个核仁定位蛋白的编码基因的重组质粒的的酶切电泳图。

图5为PICT-1蛋白与UBF1蛋白、B23蛋白、S5蛋白、L9蛋白亚细胞共定位的激光共聚焦观察；红色荧光代表PICT-1蛋白，绿色荧光代表GFP-B23融合蛋白、GFP-UBF1融合蛋白、GFP-L9融合蛋白或GFP-S5融合蛋白，蓝色蛋白DAPI染色的细胞核，Merge代表前三者的图片叠加；A：GFP-UBF1融合蛋白；B：GFP-B23融合蛋白；C：GFP-S5融合蛋白；DGFP-L9融合蛋白。

图6为PICT-1蛋白与内源nucleolin蛋白的亚细胞共定位的激光共聚焦观察；红色代表PICT-1蛋白，绿色代表nucleolin蛋白的定位，蓝色代表DAPI染色的细胞核，Merge代表前三者的图片叠加。

图7为PICT-1蛋白片段亚细胞定位的激光共聚焦研究；绿色荧光代表各个PICT-1蛋白片段，蓝色代表DAPI染色的细胞核，Merge代表前两者的图片叠加。

图8为PICT-1蛋白的347-386片段、347-400片段和347-400突变片段的亚细胞定位；绿色荧光代表PICT-1各片段的亚细胞定位，蓝色代表DAPI染色的细胞核，Merge代表前两者的图片叠加。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

HeLa细胞：购自ATCC，目录号为CCL-2^TM。

U251细胞：购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，资源编号为3115CNCB00312。

HEK293细胞：购自ATCC，目录号为CRL-1573。

实施例1、PICT-1蛋白核定位性能的发现

研究发现在人弥散性神经胶质瘤(Diffuse glioma)的19号染色体长臂上一段150Kb的片段经常发生等位缺失现象(LOH)，这说明在这个区域可能存在有肿瘤抑制基因，其缺失能导致人类神经胶质瘤的发生和发展。2000年，Smith等人在这个区域鉴定了5个基因，其中两个为已知的SEPW1和CRX基因，另外三个是新基因，将其分别命名为GLTSCR1、EHD2和GLTSCR2。2004年，Okahara等利用酵母双杂交技术以PTEN的C末端作为诱饵蛋白，筛选人脑cDNA文库，得到了一个阳性克隆，将其命名为PICT-1，分析发现其编码基因就是GLTSCR2。Okahara等人证明重要抑癌基因PTEN和PICT-1之间存在物理相互作用。PICT-1蛋白与PTEN的结合是由PTEN的C末端介导的。进一步研究表明PICT-1能够通过与PTEN结合促进PTEN的磷酸化，稳定PTEN，进而抑制PI3K/AKT信号的过度活化，抑制肿瘤的发生和生长。然而，PICT-1的结构、细胞定位以及其所参与的细胞信号调控途径还远没有研究清楚。

一、全长PICT-1基因的克隆和表达载体的构建

1、提取HeLa细胞的总RNA提取。

2、将步骤1的总RNA反转录为cDNA。

3、以步骤2的cDNA为模板，用PICT-1F和PICT-1R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

PICT-1F：5’-CGGAATTCTATGGCGGCAGGAGGCAGTGGCG-3’；

PICT-1R：5’-CGGGATCCCTACAACTGGATCTCACGGAACGCCCGC-3’。

PCR扩增体系(50μl)：PFU DNA聚合酶0.5μl、10×buffer 5μl、cDNA模板1μl、dNTP Mixture(2.5mM)4μl、PICT-1F引物1μl、PICT-1R引物1μl，其余为ddH₂O。

PCR扩增条件：95℃5min；95℃30s、57℃30s、72℃1min，35个循环；72℃10min。

4、用限制性内切酶EcoRI和BamHI双酶切步骤3的PCR扩增产物(37℃酶切4小时)，得到酶切产物。

5、用限制性内切酶EcoRI和BamHI双酶切质粒pEGFP-C1(Clontech公司，Catalog#6084-1)，回收约4.7kb的载体骨架。

6、将步骤4的酶切产物和步骤5的载体骨架连接，得到重组质粒pEGFP-C1-PICT-1。重组质粒pEGFP-C1-PICT-1的酶切电泳图见图1(EcoRI和BamHI)，1为marker，2为酶切产物，释放出一条约1500bp的DNA片段。根据测序结果，对重组质粒pEGFP-C1-PICT-1进行结构描述如下：在质粒pEGFP-C1的EcoRI和BamHI酶切位点之间插入了序列表的序列4所示的全长PICT-1基因(GenBank编号NM_015710.4)，全长PICT-1基因与载体上的GFP基因形成融合基因，表达GFP-PICT-1融合蛋白。

二、外源PICT-1蛋白的亚细胞定位研究

用重组质粒pEGFP-C1-PICT-1分别转染不同细胞(HeLa细胞、U251细胞或HEK293细胞)，具体方法如下：

1、转染前一天，将细胞消化成单细胞，以1.0×10⁶的密度重新接种入激光共聚焦观察专用培养皿；第二天细胞生长到80-90％汇合度时开始进行如下转染：转染前先用PBS缓冲液洗涤细胞两次，然后加入无双抗无血清的DMEM培养基。

2、在两个EP管中分别用250μl DMEM培养基(无双抗无血清)悬浮2μg重组质粒和5μl Lipofectamin TM 2000(购自invitrogen)，室温放置5min后将两管混合混匀并室温放置20min，然后将混合液均匀的滴加入步骤1的培养皿中，在5％CO2、37℃培养箱中培养5小时；然后将培养基更换为含10％胎牛血清和双抗(100U/mL青霉素、100mg/L链霉素)的完全DMEM培养基，继续培养24小时；然后用PBS缓冲液洗涤，加入1ml甲醇固定2分钟，吸弃甲醇，加入含有100μg/ml DAPI的PBS缓冲液室温染色10分钟，用PBS缓冲液洗涤后向培养皿的凹槽内滴加甘油覆盖细胞。

3、将培养皿置于激光共聚焦显微镜下，观察GFP-PICT-1融合蛋白的亚细胞定位情况。转染U251细胞的结果见图2，蓝色代表细胞核(DAPI染色显示为蓝色)，绿色代表GFP-PICT-1融合蛋白(GFP显示为绿色)。可以观察到，GFP-PICT-1融合蛋白以颗粒状形态分布于细胞核内。转染HeLa细胞的结果、转染HEK293细胞的结果均与转染U251细胞的结果一致。结果表明，PICT-1蛋白中具有核定位信号。

三、内源PICT-1蛋白亚细胞定位的研究

为了研究是否内源PICT-1蛋白是否具有与GFP-PICT-1融合蛋白具有相似的定位和形态，对HeLa细胞进行了免疫荧光实验，具体步骤如下：

1、同步骤二的1。

2、第二天用PBS缓冲液洗涤细胞，然后加入4％的多聚甲醛室温轻摇固定15分钟；用PBS缓冲液洗涤细胞，加入0.1％的Triton-100室温放置7分钟，用PBS缓冲液洗涤细胞，加入含有3％牛血清白蛋白的PBS缓冲液室温封闭1小时，吸弃上清，加入一抗稀释液(用含有3％牛血清白蛋白的PBS缓冲液按照1∶50的体积比稀释Santa Cruz公司生产的PICT-1蛋白一抗)4℃孵育4小时，用PBS缓冲液洗涤细胞，加入二抗稀释液(用含有1.5％牛血清白蛋白的PBS缓冲液按照1∶50的体积比稀释KPL公司生产的FITC标记的二抗)室温放置1小时，用PBS缓冲液洗涤细胞，然后加入含有100μg/ml DAPI的PBS缓冲液室温染色10分钟，用PBS缓冲液洗涤，向培养皿的凹槽内的细胞上滴加荧光防淬灭剂。

3、将培养皿置于激光共聚焦显微镜下，观察PICT-1蛋白的亚细胞定位情况。结果见图3，蓝色代表细胞核，绿色代表PICT-1蛋白。可以观察到，与GFP-PICT-1融合蛋白相似，内源的PICT-1蛋白也是定位于细胞核内，且呈现点状分布。

四、PICT-1蛋白是一个核仁定位蛋白

分别从HeLa细胞中提取总RNA并反转录为cDNA，以该cDNA为模板分别克隆几个已知的核仁定位蛋白的编码基因(B23基因、UBF1基因、L9基因和S5基因)并分别连接入质粒pEGFP-C1中，得到各种重组质粒(具体方法同步骤一)，各个编码基因分别于载体上的GFP基因融合，表达各个融合蛋白(GFP-B23融合蛋白、GFP-UBF1融合蛋白、GFP-L9融合蛋白、GFP-S5融合蛋白)。

扩增B23基因的引物如下：

B23F：5’-CGGAATTCTATGGAAGATTCGATGGACATG-3’；

B23R：5’-CGGGATCCTTAAAGAGACTTCCTCCACTG-3’。

扩增UBF1基因的引物如下：

UBF1F：5’-CGGAATTCTATGAACGGAGAAGCCGACTGC-3’；

UBF1R：5’-CGGGATCCTCAGTTGGAGTCAGAGTCTGAGGA-3’。

扩增L9基因的引物如下：

L9F：5’-CGGAATTCTATGAAGACTATTCTCAGCAAT-3’；

L9R：5’-CGGGATCCTTATTCATCAGCCTGCTGAAC-3’。

扩增S5基因的引物如下：

S5F：5’-CGGAATTCTATGACCGAGTGGGAGACAGCA-3’；

S5R：5’-CGGGATCCTCAGCGGTTGGACTTGGCCAC-3’。

各个重组质粒的酶切电泳图见图4(EcoRI和BamHI)，M为marker，1和2为插入UBF1基因的重组质粒的酶切产物，3和4为插入B23基因的重组质粒的酶切产物，5和6为插入S5基因的重组质粒的酶切产物，7和8为插入L9基因的重组质粒的酶切产物。

酶切重组质粒pEGFP-C1-PICT-1，回收目的基因片段，插入质粒DsRed-C1的相应酶切位点中(全长PICT-1基因与载体上的红色荧光蛋白基因融合，表达RFP-PICT-1融合蛋白)，得到重组质粒DsRedC1-PICT-1。将重组质粒DsRedC1-PICT-1分别与含有各个核仁定位蛋白的编码基因的重组质粒共转染细胞(HeLa细胞、U251细胞或HEK293细胞)。转染24小时后，DAPI染色后进行激光共聚焦观察。U251细胞的结果见图5，蓝色代表细胞核，绿色代表GFP-B23融合蛋白、GFP-UBF1融合蛋白、GFP-L9融合蛋白或GFP-S5融合蛋白，红色代表RFP-PICT-1融合蛋白。可以观察到RFP-PICT-1融合蛋白与GFP融合的几种已知核仁蛋白具有非常好的定位，说明PICT-1的确是一个核仁定位蛋白。为了进一步证明PICT-1是一个核仁定位蛋白，首先用重组质粒DsRedC1-PICT-1转染HeLa细胞，转染24小时后，利用一个已知的核仁蛋白nucleolin的特异性一抗对细胞进行免疫荧光染色，然后进行激光共聚焦观察。结果见图6。可以观察到，虽然内源的nucleolin核仁指示蛋白与PICT-1蛋白不具有完全一致的形态，但PICT-1蛋白的确分布于核仁内。

实施例2、核仁定位信号肽的发现及其功能鉴定

一、重组质粒的构建

1、重组质粒I的构建

(1)以重组质粒pEGFP-C1-PICT-1为模板，用PICT-1F和346R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

PICT-1F：5’-CGGAATTCTATGGCGGCAGGAGGCAGTGGCG-3’；

346R：5’-CGGGATCCTCACTTCTCCCGCCGCCGCTGCTGCT-3’。

步骤(2)至(5)依次同实施例一的步骤一的2至5。

(6)将步骤(4)的酶切产物和步骤(5)的载体骨架连接，得到重组质粒I。根据测序结果，对重组质粒I进行结构描述如下：在质粒pEGFP-C1的EcoRI和BamHI酶切位点之间插入了序列表的序列4自5’末端第1至1038位核苷酸所示的DNA片段(表达序列表的序列3所示PICT-1蛋白自N末端第1至346位氨基酸残基组成的片段，简称1-346片段)。

2、重组质粒II的构建

(1)以重组质粒pEGFP-C1-PICT-1为模板，用347F和PICT-1R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

347F：5’-CGGAATTCTGCTGTGCACAGGCTGCGGGTA-3’；

PICT-1R：5’-CGGGATCCCTACAACTGGATCTCACGGAACGCCCGC-3’。

步骤(2)至(5)依次同实施例一的步骤一的2至5。

(6)将步骤(4)的酶切产物和步骤(5)的载体骨架连接，得到重组质粒II。根据测序结果，对重组质粒II进行结构描述如下：在质粒pEGFP-C1的EcoRI和BamHI酶切位点之间插入了序列表的序列4自5’末端第1039至1437位核苷酸所示的DNA片段(表达序列表的序列3所示PICT-1蛋白自N末端第347至479位氨基酸残基组成的片段，简称347-479片段)。

3、重组质粒III的构建

(1)以重组质粒pEGFP-C1-PICT-1为模板，用PICT-1F和356R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

PICT-1F：5’-CGGAATTCTATGGCGGCAGGAGGCAGTGGCG-3’；

356R：5’-CGGGATCCTCAGGCCTGCTGTACCCGCAGCCTGT-3’。

步骤(2)至(5)依次同实施例一的步骤一的2至5。

(6)将步骤(4)的酶切产物和步骤(5)的载体骨架连接，得到重组质粒III。根据测序结果，对重组质粒III进行结构描述如下：在质粒pEGFP-C1的EcoRI和BamHI酶切位点之间插入了序列表的序列4自5’末端第1至1068位核苷酸所示的DNA片段(表达序列表的序列3所示PICT-1蛋白自N末端第1至356位氨基酸残基组成的片段，简称1-356片段)。

4、重组质粒IV的构建(1-386片段)

(1)以重组质粒pEGFP-C1-PICT-1为模板，用PICT-1F和386R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

PICT-1F：5’-CGGAATTCTATGGCGGCAGGAGGCAGTGGCG-3’；

386R：5’-CGGGATCCTCACGCCAGCTCCGCCAGCCTCA-3’。

步骤(2)至(5)依次同实施例一的步骤一的2至5。

(6)将步骤(4)的酶切产物和步骤(5)的载体骨架连接，得到重组质粒IV。根据测序结果，对重组质粒IV进行结构描述如下：在质粒pEGFP-C1的EcoRI和BamHI酶切位点之间插入了序列表的序列4自5’末端第1至1158位核苷酸所示的DNA片段(表达序列表的序列3所示PICT-1蛋白自N末端第1至386位氨基酸残基组成的片段，简称1-386片段)。

5、重组质粒V的构建(1-400片段)

(1)以重组质粒pEGFP-C1-PICT-1为模板，用PICT-1F和400R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

PICT-1F：5’-CGGAATTCTATGGCGGCAGGAGGCAGTGGCG-3’；

400R：5’-CGGGATCCTCAAGCCTCAGCCTCCCGCCGCGCCT-3’。

步骤(2)至(5)依次同实施例一的步骤一的2至5。

(6)将步骤(4)的酶切产物和步骤(5)的载体骨架连接，得到重组质粒V。根据测序结果，对重组质粒V进行结构描述如下：在质粒pEGFP-C1的EcoRI和BamHI酶切位点之间插入了序列表的序列4自5’末端第1至1200位核苷酸所示的DNA片段(表达序列表的序列3所示PICT-1蛋白自N末端第1至400位氨基酸残基组成的片段，简称1-400片段)。

二、各个蛋白片段的细胞定位研究

用步骤一构建的各个重组质粒分别转染HeLa细胞，具体方法同实施例1的步骤二。

结果见图7，蓝色代表细胞核，绿色代表与GFP融合的各个PICT-1蛋白片段。1-346片段虽然还是定位在细胞核内，但已经弥散到整个细胞核，说明这个片段中不包含有核仁定位信号。347-479片段也分布于细胞核内，而且与野生型PICT-1具有相同的形态，即呈斑点状分布于细胞核内，说明这段序列中含有核仁定位信号。1-356片段虽然还是主要以弥散状分布于细胞核内，但在核仁内也出现了斑点状分布。1-386片段和1-400片段都呈现出了与野生型完全一致的分布特点。

三、重组质粒VI的构建(347-386片段)

1、以重组质粒pEGFP-C1-PICT-1为模板，用347F和386R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

347F：5’-CGGAATTCTGCTGTGCACAGGCTGCGGGTA-3’；

386R：5’-CGGGATCCTCACGCCAGCTCCGCCAGCCTCA-3’。

步骤2至5依次同实施例一的步骤一的2至5。

6、将步骤4的酶切产物和步骤5的载体骨架连接，得到重组质粒VI。根据测序结果，对重组质粒VI进行结构描述如下：在质粒pEGFP-C1的EcoRI和BamHI酶切位点之间插入了序列表的序列4自5’末端第1039至1158位核苷酸所示的DNA片段(表达序列表的序列3所示PICT-1蛋白自N末端第347至386位氨基酸残基组成的片段，简称347-386片段)。

四、蛋白片段的细胞定位研究

用步骤三构建的重组质粒转染HeLa细胞，具体方法同实施例1的步骤二。

结果见图8A，蓝色代表细胞核，绿色代表与GFP融合的347-386片段。347-386片段并没有表现出严格的核仁定位。

五、重组质粒VII的构建(347-400片段)

1、以重组质粒pEGFP-C1-PICT-1为模板，用347F和400R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

347F：5’-CGGAATTCTGCTGTGCACAGGCTGCGGGTA-3’；

400R：5’-CGGGATCCTCAAGCCTCAGCCTCCCGCCGCGCCT-3’。

步骤2至5依次同实施例一的步骤一的2至5。

6、将步骤4的酶切产物和步骤5的载体骨架连接，得到重组质粒VII。根据测序结果，对重组质粒VII进行结构描述如下：在质粒pEGFP-C1的EcoRI和BamHI酶切位点之间插入了序列表的序列4自5’末端第1039至1200位核苷酸所示的DNA片段(表达序列表的序列3所示PICT-1蛋白自N末端第347至400位氨基酸残基组成的片段，简称347-400片段)。

六、蛋白片段的细胞定位研究

用步骤五构建的重组质粒转染HeLa细胞，具体方法同实施例1的步骤二。

结果见图8B，蓝色代表细胞核，绿色代表与GFP融合的347-400片段。347-400片段表现出了与野生型PICT-1蛋白一样严格的核仁定位状态。

以上结果表明，序列表的序列1所示多肽片段为具有核仁定位功能的信号肽，该信号肽的编码序列具体如序列表的序列2所示。

实施例3、信号肽的氨基酸残基突变及其功能验证

因为核定位或者核仁定位信号一般都含有精氨酸基序，所以发明人认为在序列1中，RLR和LR基序应该对其核仁靶向起重要作用。

一、重组表达载体的构建

1、以重组质粒pEGFP-C1-PICT-1为模板，采用PICT-1F和mutR组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PICT-1F和mutR组成的引物对的靶序列为序列表的序列4自5’末端第1至1074位核苷酸所示的DNA片段，且当将其中第1048至1056位核苷酸由“aggctgcgg”突变为了“GCGGCTGCA”，即第一个“RLR基序”突变成“AAA”。

PICT-1F：5’-CGGAATTCTATGGCGGCAGGAGGCAGTGGCG-3’；

mutR：5’-ACGCGGCCTGCTGTACTGCAGCCGCGTGCACAGCCTTCTC-3’。

2、以重组质粒pEGFP-C1-PICT-1为模板，采用mutF和PICT-1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PICT-1F和mutR组成的引物对的靶序列为序列表的序列4自5’末端第1037至1437位核苷酸所示的DNA片段，且当将其中第1048至1056位核苷酸由“aggctgcgg”突变为了“GCGGCTGCA”，即第一个“RLR基序”突变成“AAA”。

mutF：5’-GAGAAGGCTGTGCACGCGGCTGCAGTACAGCAGGCCGCGT-3’；

PICT-1R：5’-CGGGATCCCTACAACTGGATCTCACGGAACGCCCGC-3’。

3、将步骤1和PCR扩增产物和步骤2的PCR扩增产物的等质量混合物作为模板，采用PICT-1F和PICT-1R进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

PICT-1F：5’-CGGAATTCTATGGCGGCAGGAGGCAGTGGCG-3’；

PICT-1R：5’-CGGGATCCCTACAACTGGATCTCACGGAACGCCCGC-3’。

4、以步骤3的PCR扩增产物为模板，采用347F和400R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

347F：5’-CGGAATTCTGCTGTGCACAGGCTGCGGGTA-3’；

400R：5’-CGGGATCCTCAAGCCTCAGCCTCCCGCCGCGCCT-3’。

5、用限制性内切酶EcoRI和BamHI双酶切步骤4的PCR扩增产物(37℃酶切4小时)，得到酶切产物。

6、用限制性内切酶EcoRI和BamHI双酶切质粒pEGFP-C1(Clontech公司，Catalog#6084-1)，回收约4.7kb的载体骨架。

7、将步骤5的酶切产物和步骤6的载体骨架连接，得到重组质粒VIII。根据测序结果，对重组质粒VIII进行结构描述如下：在质粒pEGFP-C1的EcoRI和BamHI酶切位点之间插入了突变DNA片段(突变DNA片段与序列表的序列4自5’末端第1039至1200位核苷酸所示的DNA片段的差异仅在于将其中第1048至1056位核苷酸由“aggctgcgg”突变为了“GCGGCTGCA”)，突变DNA片段表达突变蛋白片段(突变蛋白片段与序列表的序列3所示PICT-1蛋白自N末端第347至400位氨基酸残基组成的片段的差异仅在于将第350至352位氨基酸残基由“RLR”突变成“AAA”，突变蛋白片段简称347-400mt片段)。

二、蛋白片段的细胞定位研究

用步骤一构建的重组质粒转染HeLa细胞，具体方法同实施例1的步骤二。

结果见图8C，347-400mt片段虽然也有核仁定位，但也弥散到了整个细胞核，这说明第一个RLR基序的突变影响了核仁定位信号的靶向能力。

综上所述，发明人鉴定得到了核仁定位信号序列，其典型特征是包含有三个RLR和两个LR基序，另外还包含一个典型的核定位信号(RRRRRR)。