CN109735568A - 稳定表达fgf-1蛋白细胞株的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种稳定表达FGF‑1蛋白细胞株的构建方法。在pLenti‑CMV‑Gag‑Mcherry‑Puro载体的Not I和Avr II多克隆位点处插入FGF‑1基因，用构建好的pLenti‑CMV‑FGF‑1‑Emcherry‑Puro重组质粒与病毒包装质粒共转染293T细胞，培养、出毒、收取病毒上清、过滤得重组慢病毒液。将包装好的重组慢病毒感染293T细胞，通过嘌呤霉素筛选及鉴定，得稳定表达FGF‑1蛋白细胞株。本发明利用重组慢病毒系统制备一种融合标签蛋白并能稳定表达FGF‑1蛋白的细胞株，该细胞株为研究FGF‑1蛋白的生物学功能提供一个很好的工具。

Description

稳定表达FGF-1蛋白细胞株的构建方法

技术领域

本发明设计医学分子生物学技术领域，尤其是一种稳定表达FGF-1蛋白细胞株的构建方法。

背景技术

目前，全球超过4亿成人患有糖尿病，估计未来10年会增加到6亿人以上。糖尿病是一种受遗传、环境和生活习惯综合影响导致的慢性代谢疾病，主要分为胰岛素依赖型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)、非胰岛素依赖型糖尿病(type 2 diabetesmellitus，T2DM)和妊娠期糖尿病。其临床表现为人体自身不能产生胰岛素或者不能利用胰岛素，导致血糖高于正常血糖范围，从而引起一些并发性疾病。糖尿病及其并发症降低了患者的预期寿命和生活质量，而且每年糖尿病的死亡率、发病率和相关的卫生保健支出都在逐步上升。常规糖尿病治疗药物大多存在疗效不持久、副作用较多及易出现胰岛素耐受等弊端。因此，迫切需要研发更有效与更安全的糖尿病治疗药物。

2014年，发现新型的调节血糖因子——酸性成纤维细胞生长因子(acidicfibroblast growth factor，aFGF或FGF1)，同时具备胰岛素增敏效果，为治疗胰岛素抵抗的T2DM带来了新的希望。近年来，FGF1作为胰岛素增敏剂的发现，在显著降低血糖、改善胰岛素抵抗、减少副作用方面已被证实。并且，结构优化后的重组FGF1蛋白促有丝分裂的能力更低。因此，比野生型FGF1在实验动物体内代谢作用更为有效。和临床降糖药相比，作用持续时间更长、安全性更高；在治疗T2DM方面，FGF1与FGF家族的其他成员相比，有着特异性降糖作用。

发明内容

本发明的目的是：提供一种稳定表达FGF-1蛋白细胞株的构建方法，利用重组慢病毒系统制备一种融合标签蛋白并能稳定表达FGF-1蛋白的细胞株，该细胞株为研究FGF-1蛋白的生物学功能提供一个很好的工具。

本发明是这样实现的：稳定表达FGF-1蛋白细胞株的构建方法，包括如下步骤：

1)FGF-1基因的扩增；

2)将FGF-1基因与载体pLenti-CMV-Gag-Mcherry-Puro(购自北京基石生命科技有限公司)连接，构建重组慢病毒表达质粒pLenti-CMV-FGF-1-Emcherry-Puro；

3)将重组慢病毒表达质粒pLenti-CMV-FGF-1-Emcherry-Puro与慢病毒包装质粒psPAX2及pVSV-G共转染293T细胞，48h后，收集上清，72000×g离心4h获得高度浓缩的慢病毒颗粒；

4)将包装好的重组慢病毒CMV-mcherry-LVP转染293T细胞，通过嘌呤霉素筛选阳性细胞株，对阳性细胞株进行细胞免疫荧光鉴定，获得稳定表达FGF-1蛋白细胞株。

所述的步骤1)具体是，以FGF-1-F和FGF-1-R为特异性引物，添加酶切位点Not I和Avr II，以质粒pEmcherry-N1-FGF-1为模板，进行PCR扩增；所述的特异性引物FGF-1-F的序列如序列表SEQ ID 1所示，FGF-1-R的序列如序列表SEQ ID 2所示。

PCR扩增体系为：PCR反应程序：94℃变性2min，56℃复性1min，72℃延伸2min，共循环30次，最后72℃再延伸10min。PCR结束后，取2μl扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳，分离、回收纯化。

步骤(3)中，所述的病毒包装质粒是psPAX2和pVSV-G。

由于采用了上述技术方案，与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

1.本发明以重组慢病毒为载体，将其感染293T人胚肾细胞，筛选获得能稳定表达FGF-1蛋白的细胞株，所述FGF-1蛋白融合表达mcherry标签，方便FGF-1蛋白表达的检测。

2.本发明建立了能稳定表达FGF-1蛋白的293T细胞株，该细胞株为进一步深入研究FGF-1蛋白的生物学特性奠定了坚实基础。

3.本发明构建一种带有标签的过表达FGF-1蛋白的细胞株，为FGF-1蛋白生物学特性及功能的研究提供一个良好的工具。

具体实施方式

本发明的实施例：稳定表达FGF-1蛋白细胞株的构建方法

(一)FGF-1基因扩增

1、FGF-1基因PCR扩增

根据NCBI中FGF-1基因序列(Gene ID:2246)，利用软件LSPrimer(http://ccsipb.lnu.edu.cn/primer/)设计FGF-1基因的特异性引物FGF-1-F和FGF-1-R，添加酶切位点Not I和Avr II，引入的酶切位点Not I序列详见序列表SEQ ID 5，引入的酶切位点AvrII序列详见序列表SEQ ID 6，所述的特异性引物FGF-1-F的序列详见序列表SEQ ID 1，FGF-1-R的序列详见序列表SEQ ID 2。

以pEmcherry-N1-FGF-1质粒为模板，进行PCR扩增，PCR反应体系为：

PCR反应程序：94℃变性4min，56℃复性1min，72℃延伸3min，共循环35次，最后72℃再延伸10min。PCR结束后，取2μl扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳，分离、回收纯化。

2、DNA琼脂糖凝胶电泳

配置1％的琼脂糖，微波炉加热使琼脂糖颗粒完全溶解；将洗净、干燥的制胶板水平放置在工作台上；混匀，灌胶，插入梳子，避免产生气泡；待凝胶凝固后，小心拔去梳子；将胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液；将PCR产物上样，经100V电泳40min。

3、PCR产物凝胶回收

按照康为世纪公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书进行DNA回收。

(二)构建重组慢病毒表达质粒pLenti-CMV-FGF-1-Emcherry-Puro

1、pLenti-CMV-Gag-Mcherry-Puro载体酶切

将pLenti-CMV-Gag-Mcherry-Puro载体用Not I和Avr II酶切，酶切体系于37℃水浴过夜，电泳，将正确的目的条带进行凝胶回收。酶切体系如下：(ddH₂O:11ul；Not I:1.5ul；Avr II:1.5ul；DNA:1ul(1ug/ul)；Enzyme Buffer:5ul；总体系：20ul，温度37℃，反应时间：30min)

2、FGF-1基因与pLenti-CMV-Gag-Mcherry-Puro载体连接

将(一)中凝胶回收后的FGF-1基因与酶切后的载体pLenti-CMV-Gag-Mcherry-Puro，在16℃反应24h，构建重组慢病毒表达质粒pLenti-CMV-FGF-1-Emcherry-Puro。

3、质粒转化感受态大肠杆菌E.coli DH 5α

取E.coli DH 5α感受态细胞于冰上放置10min溶解；取5ul构建好的重组慢病毒表达质粒pLenti-CMV-FGF-1-Emcherry-Puro加入50ul感受态细胞，混匀，冰浴30min；于42℃水浴中热休克大肠杆菌45s，移入冰中，静置2min；加入500ul已37℃预热无抗生素的SOC培养液，于37℃恒温箱摇床培养1h(300rpm)。取120ul感受态细胞涂于含Ampicillin(100μg/mL)的LB琼脂平板上，于37℃的培养箱中培养，12h后检查培养皿中是否出现菌落。挑选琼脂平板上的单菌落接种到8mL氨苄抗性的LB培养基中，37℃摇床培养12h(1500rpm)。

4、pLenti-CMV-FGF-1-Emcherry-Puro重组菌株的质粒提取

对测序正确的重组菌株进行质粒小提与大提，得到pLenti-CMV-FGF-1-Emcherry-Puro重组慢病毒表达质粒。用NanoDrop测定OD 260及OD 280，计算质粒纯度及浓度。

(三)重组慢病毒CMV-mcherry-LVP的获得

1、重组慢病毒的包装

将重组慢病毒表达质粒pLenti-CMV-FGF-1-Emcherry-Puro和病毒包装质粒psPAX2及pVSV-G共转染293T细胞(转染pLenti-CMV-Gag-Mcherry-Puro空病毒载体作为对照)。转染前24h，用胰蛋白酶消化处于对数生长期的293T细胞，调整细胞密度为5×10⁵细胞，用10mL含10％FBS的DMEM培养基重新接种于10cm细胞培养皿，置于5％CO₂培养箱内培养(37℃)，待细胞密度达90％时转染质粒。

转染前2h将细胞培养液更换为无血清的DMEM培养基。取无菌离心管(2mL)，向其中加入pLenti-CMV-FGF-1-Emcherry-Puro载体8μg，以及病毒包装质粒psPAX₂及pVSV-G各8μg，与1.5mL的无血清DMEM培养基混合均匀。取48ul Lipofectamine 2000试剂在另一管中与1mL DMEM混合。将上述两种溶液进行混合，室温下静置20min，形成转染复合物。将混合液转移至293T细胞的培养液中，于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养。24h后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞中加入含10％血清的细胞培养基10mL，于5％CO₂培养箱内(37℃)继续培养。24h后更换含10％FBS的DMEM培养基继续培养。

2、重组慢病毒的收集及浓缩

转染48h后，收集培养液到无菌离心管中(50mL)，于4℃离心，4500×g，10min。取上清，4℃超速离心，72000×g，3h，去除上清，加入500ul完全培养液，用1000ul枪头缓慢充分重悬后，将病毒浓缩液分装后保存在病毒管中，-80℃长期保存，获得重组慢病毒CMV-mcherry-LVP。

3、重组慢病毒的滴度测定

胰酶消化293T细胞，接种于96孔板中(3×10⁴个/孔)，24h后在EP管中做10倍梯度稀释：准备8个2.0mL EP管，每管加入297μl含10％FBS的L-15培养液，向第一个管中加入33μl病毒原液，混匀后，吸取30μl加入第二个管混匀。依此类推，做8个稀释度。每个稀释度设置3个重复孔，每孔加入稀释好的病毒液100μl并做好标记。第四天用倒置荧光显微镜对荧光阳性细胞进行计数。数出最后两个能观察到荧光的孔内荧光细胞数，计算3个重复孔内细胞的平均数。

(四)稳定转染细胞株的筛选

1、稳定转染细胞株筛选

胰酶消化293T细胞，接种于24孔细胞培养板中，3×10⁴个/孔。每孔500μl。24h后感染病毒，每孔加10μl聚凝胺(1mg/mL)，感染24小时后换培养基：弃去旧培养基，每孔加入1mL新鲜的培养基。在感染细胞72小时后，通过加入并维持2ug/mL的嘌呤霉素杀死未被有效感染的细胞；每隔3天换一次新鲜培养基(聚凝胺终浓度2ug/mL)；倒置荧光显微镜下观察，进行亚克隆筛选，挑选出正常生长细胞群传代，逐步放大培养；从而在嘌呤霉素的维持下筛选阳性细胞株。

3、阳性细胞株的检测

用荧光显微镜对阳性细胞进行免疫荧光鉴定。最后获得稳定转染FGF-1基因的293T细胞株。

重组慢病毒表达质粒pLenti-CMV-FGF-1-Emcherry-Puro的测序序列详见序列表SEQ ID 3，测序序列的目的基因片段的序列详见序列表SEQ ID 4。

序列表

<110> 贵州大学

<120> 稳定表达FGF-1蛋白细胞株的构建方法

<130> nm:

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 46

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

ataagaatgc ggccgcgcca ccatggctga aggggaaatc accacc 46

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 2

ttcctaggtt aatcagaaga gactggcagg g 31

<210> 3

<211> 999

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 3

tatgggtgtc gtgagcatgc gatgactgat catgaccctc gaggtcgacg gtatcgataa 60

gctcgcttca cgagattcca gcaggtcgag ggacctaata acttcgtata gcatacatta 120

tacgaagtta tattaagggt tccaagctta agcggccgcg ccaccatggc tgaaggggaa 180

atcaccacct tcacagccct gaccgagaag tttaatctgc ctccagggaa ttacaagaag 240

cccaaactcc tctactgtag caacgggggc cacttcctga ggatccttcc ggatggcaca 300

gtggatggga caagggacag gagcgaccag cacattcagc tgcagctcag tgcggaaagc 360

gtgggggagg tgtatataaa gagtaccgag actggccagt acttggccat ggacaccgac 420

gggcttttat acggctcaca gacaccaaat gaggaatgtt tgttcctgga aaggctggag 480

gagaaccatt acaacaccta tatatccaag aagcatgcag agaagaattg gtttgttggc 540

ctcaagaaga atgggagctg caaacgcggt cctcggactc actatggcca gaaagcaatc 600

ttgtttctcc ccctgccagt ctcttctgat taacctaggg atggatccat atatttcgac 660

catagccaat tcaatatggc gtatatggac tcatgccaat tcaatatggt ggatctggac 720

ctgtgccaat tcaatatggc gtatatggac tcgtgccaat tcaatatggt ggatctggac 780

cccagccaat tcaatatggc ggacttggac catgccaaat ttcaaaattg gcggacctgg 840

cactgtgcca actggggagg ggtctacttg gcacggtgcc aagtttgagg aggggtcttg 900

gccctgtgcc aagtccgcca tattgaattg gcatggtgcc ataatggcgg gcatattggc 960

tatatgccag gatcatattt aggcatatcc aaatggcct 999

<210> 4

<211> 474

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 4

gccaccatgg ctgaagggga aatcaccacc ttcacagccc tgaccgagaa gtttaatctg 60

cctccaggga attacaagaa gcccaaactc ctctactgta gcaacggggg ccacttcctg 120

aggatccttc cggatggcac agtggatggg acaagggaca ggagcgacca gcacattcag 180

ctgcagctca gtgcggaaag cgtgggggag gtgtatataa agagtaccga gactggccag 240

tacttggcca tggacaccga cgggctttta tacggctcac agacaccaaa tgaggaatgt 300

ttgttcctgg aaaggctgga ggagaaccat tacaacacct atatatccaa gaagcatgca 360

gagaagaatt ggtttgttgg cctcaagaag aatgggagct gcaaacgcgg tcctcggact 420

cactatggcc agaaagcaat cttgtttctc cccctgccag tctcttctga ttaa 474

<210> 5

<211> 8

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 5

gcggccgc 8

<210> 6

<211> 6

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 6

ggatcc 6

Claims (4)

1.一种稳定表达FGF-1蛋白细胞株的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)FGF-1基因的扩增；

2)将FGF-1基因与载体pLenti-CMV-Gag-Mcherry-Puro连接，构建重组慢病毒表达质粒pLenti-CMV-FGF-1-Emcherry-Puro；

3)将重组慢病毒表达质粒pLenti-CMV-FGF-1-Emcherry-Puro与慢病毒包装质粒psPAX2及pVSV-G共转染293T细胞，48h后，收集上清，72000×g离心4h获得高度浓缩的慢病毒颗粒；

4)将包装好的重组慢病毒CMV-mcherry-LVP转染293T细胞，通过嘌呤霉素筛选阳性细胞株，对阳性细胞株进行细胞免疫荧光鉴定，获得稳定表达FGF-1蛋白细胞株。

2.根据权利要求1所述的稳定表达FGF-1蛋白细胞株的构建方法，其特征在于：所述的步骤1)具体是，以FGF-1-F和FGF-1-R为特异性引物，添加酶切位点Not I和Avr II，以质粒pEmcherry-N1-FGF-1为模板，进行PCR扩增；所述的特异性引物FGF-1-F的序列如序列表SEQID 1所示，FGF-1-R的序列如序列表SEQ ID 2所示。

3.根据权利要求2所述的稳定表达FGF-1蛋白细胞株的构建方法，其特征在于：PCR扩增体系为：PCR反应程序：94℃变性2min，56℃复性1min，72℃延伸2min，共循环30次，最后72℃再延伸10min。PCR结束后，取2μl扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳，分离、回收纯化。

4.根据权利要求1所述的稳定表达FGF-1蛋白细胞株的构建方法，其特征在于：步骤(3)中，所述的病毒包装质粒是psPAX2和pVSV-G。