CN105950541B - 一种hFGF21基因敲除人肝细胞株的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种hFGF21基因敲除人肝细胞株的构建方法，该方法通过设计hFGF21靶位点引物并合成sgRNA寡核苷酸链序列，然后构建重组慢病毒质粒，获得重组慢病毒转染细胞，稳定敲除hFGF21基因，获得hFGF21基因敲除人肝细胞株；本发明方法简单，sgRNA靶向性好，敲除效率高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及hFGF21基因敲除人肝细胞株的构建方法。
背景技术
成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor,FGF)作为一大类多肽分子可以与细胞膜上的受体特异性地结合并发挥生物学功能。到目前为止该家族已有22个成员被发现，其中hFGF21就是人类FGF亚家族中的重要成员。现有的研究表明，FGF21是新发现的一种参与糖脂代谢过程调控的细胞因子并与糖脂代谢密切相关，主要在肝脏组织中形成高表达。人FGF21蛋白质序列有210个氨基酸组成，包括前端的28个氨基酸的信号肽序列和后段182个氨基酸序列的成熟肽，该基因位于α1,2-墨角藻糖基转移酶基因5-侧翼区。人FGF21蛋白与肝素不能特异性地直接结合，这也是它在FGF家族中比较特殊的一个特点，即使在肝素的参与下hFGF21也不能与可溶性的FGF受体(Fibroblast growth factor receptors,FGFRs)直接结合。但如果有配体βKlotho存在的情况下，FGF21便可以稳定地结合FGFRs，进而激活FGF的信号通路并在体内发挥调控糖脂代谢的相关生物学功能。
近年来发现，FGF21在内分泌系统中可以有效调控各种内分泌功能来促进糖脂代谢，对治疗代谢综合症方面，如2型糖尿病，有很大的发展潜力。早在2005年就有研究发现FGF21能明显增加人脂肪细胞葡萄糖吸收，既不依靠于胰岛素作用调节也不依赖外源性肝素的作用，这与胰岛素的快速作用是不同，FGF21促进细胞的葡萄糖摄取是独立的，并且此项研究发现了FGF21蛋白的半衰期虽然较短，但是与胰岛素相比较药效发挥的时间却相对很长。这为FGF21称为治疗2型糖尿病的新型靶点药物提供了可能性。而随着科技的进步，人们对健康问题的研究也越来越多。有研究者发现，FGF21可以抑制小鼠和猴对糖的偏好。这是FGF21配合在中枢神经系统中的配体βKlotho来降低大脑中多巴胺的奖赏通路而进行作用的，同时另有美国的科学家表示这种FGF21促进细胞对单糖的吸收作用主要是肝脏分泌的FGF21进行作用。这个症状与2型糖尿病人爱吃甜食，饮酒而引起的发病症状不谋而合，又为临床上2型糖尿病的治疗提供了新思路。而FGF21的作用远不止于糖代谢。近期有研究表明FGF21可以结合代谢和免疫系统来防止胸腺的损伤，从而达到延长寿命的效果。这样看来，FGF21的功能似乎很多，但没有全然研究清楚。所以，对于FGF21基因的功能研究，就显得尤为重要。
CRSRP-Cas9体系是一种近几年来流行的基因组修饰技术，因其操作方便，进行基因编辑的效率更高，更易得到纯合的突变体并且可以进行多位点突变而受到人们的青睐。CRISPR系统原本是细菌用来抵御外界侵袭的免疫反应系统，全称为规律成簇的间隔短回文重复序列(Clustered Regμlarly Interspaced Short Palindromic Repeats)，最早是在1987年日本科学家们意外发现基因的编码区附近有规律的间隔重复序列，且该区域附近还存在一段短序列，而这时他们正在研究大肠杆菌编码的碱性磷酸酶基因，之后的科学家又发现细菌的CRISPR系统可以在转移组织外源的质粒，或在细菌免疫方面发挥作用。2013年科学家发现并利用CRISPR-Cas9系统，在多种细胞的特定基因位点上进行基因编辑。
慢病毒载体是由一些逆转录病毒改造而来的，以假病毒颗粒的形式携带外源基因进入宿主细胞内，可以把外源基因整合到宿主细胞基因组中，由于慢病毒颗粒是一种临时组装的假病毒颗粒，只有一次感染能力，不能在宿主细胞内扩增，因此感染后宿主细胞不会产生CPE现象而导致细胞死亡，同时因外源基因在被感染细胞基因组中形成稳定表达并可稳定传代。同时，由于慢病毒载体系统不具备增殖的能力，它对机体的免疫原性很低，因此这也是慢病毒载体作为基因治疗和特定基因表达细胞株构建研究以及转基因动物制备等的常用工具的原因。故而，利用lenti-CRISPR-V2慢病毒系统，构建的人肝细胞HL7702的hFGF21基因稳定敲除细胞株，意在为今后研究hFGF21基因的功能及其可能作为糖尿病靶点药物和基因治疗方面的研究做进一步的准备。
发明内容
本发明目的在于提供hFGF21基因敲除人肝细胞株的构建方法，通过构建人肝细胞HL7702的hFGF21基因稳定敲除细胞株。
本发明通过下列技术方案实现本发明目的：
1、sgRNA靶点设计及其寡核苷酸链的合成
根据NCBI发布的hFGF21编码区序列，寻找启动子后富含NGG的序列区域，应用http://crispr.mit.edu/网站设计了2对针对hFGF21的sgRNA序列，采用如下引物分别合成sgRNA寡核苷酸链序列sgRNA2、sgRNA3
hFGF21 sgRNA2 F:caccgGAGACCGGGTTCGAGCACTC
R:aaacGAGTGCTCGAACCCGGTCTCc
hFGF21 sgRNA 3 F:caccgGGAAACTCACCGATCCATAC
R:aaacGTATGGATCGGTGAGTTTCCc；
2、lenti-CRISPR-V2-sgRNA重组慢病毒质粒构建及鉴定
对lenti-CRISPR-V2质粒的BsmBⅠ酶位点进行酶切，然后将步骤(1)的2个sgRNA寡核苷酸链互补序列退火分别连接在酶切后的lenti-CRISPR-V2质粒上，将连接产物转化到STBL3感受态细胞中，鉴定构建成功，获得2个lenti-CRISPR-V2-sgRNA重组慢病毒质粒；
3、lenti-CRISPR-V2-sgRNA重组慢病毒的制备及鉴定
按常规方法制备：运用polyfect-v试剂和opti-DEME培养基，将2个质粒分别转入三个不同圆盘的293T细胞中，培养8-12h后换液，再培养至转染的48h后，可以收集培养液，得到慢病毒颗粒，将慢病毒颗粒进行浓缩，获得慢病毒颗粒sgRNA2、sgRNA3；
4、稳定敲除hFGF21的人肝细胞株构建及筛选
以8μg/mL的聚凝胺(polybrene)来使慢病毒颗粒sgRNA2和慢病毒颗粒sgRNA3同时感染HL7702细胞；在感染细胞24h后，更换新鲜的培养基继续培养细胞；最后用嘌呤霉素来筛选感染细胞，获得hFGF21基因敲除人肝细胞株；
5、稳定敲除hFGF21的人肝细胞株的鉴定。
本发明具备的优点及效果：
糖尿病是一种综合代谢疾病，是由于胰岛素功能异常而导致的非调控性血糖升高而引起的一系列并发症。而FGF21基因是新发现的一种参与糖脂代谢过程调控的细胞因子并与糖脂代谢密切相关。它可以独立于胰岛素信号通路来调控血糖吸收，降低血糖。而FGF21的功能研究却鲜有报道，故而对FGF21的功能研究成为该领域的热点。本次研究获得的hFGF21基因稳定敲除的人肝细胞株是第一次被构建出来，这对FGF21功能的研究提供了很重要的技术支持，使我们开展以FGF21基因作为治疗糖尿病靶点的研究成为可能。
本发明经嘌呤霉素逐代筛选已形成稳定的细胞株，经Western Blot鉴定，sgRNA2和sgRNA3组合实验方案的HL7702细胞的hFGF21蛋白已经完全不表达；证明本发明真实可靠。
附图说明
图1为本发明中lenti-CRISPR-V2-sgRNA1重组慢病毒质粒测序结果；
图2为本发明中lenti-CRISPR-V2-sgRNA2重组慢病毒质粒测序结果；
图3为本发明中lenti-CRISPR-V2-sgRNA3重组慢病毒质粒测序结果；
图4为包装慢病毒48h后收获的病毒原液及浓缩液检测，其中1：水为阴性对照；2：慢病毒质粒sgRNA1为阳性对照；3：慢病毒浓缩液sgRNA1；4:慢病毒浓缩液sgRNA2；5：慢病毒原液sgRNA3；6：慢病毒原液sgRNA2；7：慢病毒原液sgRNA1；M：Maker DL2000；
图5为加入嘌呤霉素筛选48h后的HL7702细胞状态，其中a图：lenti-v2-crispr/cas9重组慢病毒感染的细胞，仅可见部分圆形死亡细胞,大部分存活；b图：正常培养的细胞，全部死亡；
图6为Western blot检测敲除hFGF21的人肝细胞株结果,sgRNA2+sgRNA3实验组能高效敲除hFGF21基因。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中使用的试剂和方法，如无特殊说明，均采用常规试剂和使用常规方法。
实验材料：293T细胞、人肝细胞HL7702、质粒、大肠杆菌菌株STBL3均为中国医学科学院医学生物学研究所GLP实验室保存。
主要试剂：BsmBⅠ限制性内切酶、Bradgord蛋白检测试剂盒购于TAKARA公司，2xPCR mix购于Tiangen公司，病毒DNA/RNA提取试剂盒购于Axygen公司，小量质粒提取试剂盒购于Omega公司，预染全蓝蛋白Maker、快速预染蛋白电泳系统和Western blot半干转系统购于Bio-rad公司，Opti-MEM、高糖DMEM、胎牛血清和双抗购于Gibco公司，慢病毒包装试剂盒和浓缩试剂盒均购于广州GeneCopoeia公司，Polybrene购于Sigma公司，鼠抗GAPDH单克隆抗体、兔源二抗购于碧云天公司，兔抗hFGF21单克隆抗体、鼠源二抗购于abcom公司，化学发光HRP底物试剂盒购于Millipore公司，嘌呤霉素购于solarbio公司。引物合成均由TaKaRa公司完成。
实施例1：sgRNA靶点设计及其寡核苷酸链的合成
应用http://crispr.mit.edu/网站设计了3对针对hFGF21的sgRNA序列。设计方法如下：(1)根据NCBI发布的hFGF21编码区序列，寻找启动子后富含NGG的序列区域，并提交至http://crispr.mit.edu/网站。(2)根据网站给出的结果的得分，选择得分较高并且可能的突变碱基离PAM位点较远的一对序列作为sgRNA候选序列。根据载体说明书在sgRNA互补序列两端分别加上相应的酶切位点，即在每条sgRNA序列的F链的5′端加CACC，另外在每条sgRNA序列的R链的5′端加上AAAC，这可以与lenti-CRISPR-V2质粒经BsmBⅠ酶切后形成的黏性末端形成互补。需要注意的是，如果sgRNA序列F链的5′端的开头的第一个碱基不是G，那么应该人为地添加在CACC的后面，然后在其互补的R链的3′端就要增加一个C。
hFGF21靶位点及sgRNA寡核苷酸链序列
hFGF21 sgRNA1 F:caccgTTGATGGACTCGGACGAGAC
R:aaacGTCTCGTCCGAGTCCATCAAc
hFGF21 sgRNA2 F:caccgGAGACCGGGTTCGAGCACTC
R:aaacGAGTGCTCGAACCCGGTCTCc
hFGF21 sgRNA3 F:caccgGGAAACTCACCGATCCATAC
R:aaacGTATGGATCGGTGAGTTTCCc；
将sgRNA的退火引物按如下体系进行退火合成sgRNA寡核苷酸链，将表内各成分混合均匀后，煮沸5min，自然冷却后于-20℃保存。
退火体系：
实施例2：lenti-CRISPR-V2-sgRNA重组慢病毒质粒构建及鉴定
1、酶切及连接
按酶切体系对lenti-CRISPR-V2质粒在BsmBⅠ酶位点进行酶切，将各成分充分混合均匀后，于37℃水浴加热40min后，得到带有粘性末端慢病毒质粒载体。随后按连接体系将sgRNA分别连接在慢病毒质粒载体上，将各成分混合均匀后，在16℃下反应16h后得到lenti-CRISPR-V2-sgRNA重组慢病毒质粒。
酶切体系
连接体系
2、感受态细胞的制备
(1)-80℃保存的用STBL3甘油菌解冻，在无抗生素的LB琼脂平板上划线，置于细菌培养箱中37℃培养16h。次日挑取LB琼脂平板上的白色单克隆菌落，放入5ml的无抗生素的LB培养液中250rmp/min、37℃摇菌16h。
(2)然后把1mL以上菌液转接到100mL无抗生素的LB培养液中250rmp/min、37℃摇菌2h左右，观察培养液的细菌浓度，若有少量菌体出现即可判断已经进入对数生长期并收菌。
(3)此时将100mL菌液移至预冷的50mL离心管中，冰浴10min。
(4)10000g、4℃、10min离心，然后弃上清；再把10mL预冷的0.1mol/L的CaCl2加入50mL的离心管中，为防止细胞破裂用移液管轻轻重悬沉淀，并立即冰浴30min。
(5)冰浴30min后10000g、4℃、10min离心，然后弃上清；按初始培养液每25mL加入200μl 80％甘油和1mL预冷的0.1mol/L的CaCl2，并轻轻重悬细胞沉淀，此时并可按100μl/管的量将感受态细胞分装，-80℃冻存备用。
3、转化
(1)把100μl的STBL3感受态细胞置于冰上，再把20μl的连接产物加入感受态细胞中(若是纯质粒转化则加1μl)，轻轻混匀后，立即冰浴45min。
(2)冰45min后，立即放入42℃的水浴锅中热激90s。
(3)热激90s后再立即冰浴3min。
(4)然后加入800μl无抗生素的LB培养液，混匀后先37℃水浴30min，再转至37℃的恒温摇床250rpm/min摇菌30min。
(5)摇菌结束后10000g、2min离心，弃部分上清，剩余约100μl培养液轻轻将沉淀重悬，再把重悬液转入LB琼脂平板(含100μg/mL氨苄青霉素)上均匀涂布，把培养皿倒置于37℃细菌培养箱中过夜培养。
(6)次日观察平板，若有单克隆菌落长出，并可挑菌，摇菌。
4、质粒小量抽提及测序鉴定
将慢病毒系统的携带sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3重组慢病毒质粒和包装质粒psPAx2和PMD2.G分别转化扩增。根据Biomiga去内毒素质粒小量抽提试剂盒说明书进行质粒抽提，具体实验操作步骤如下：
(1)实验前需准备：
a、首先把RNaseA进行适当离心，然后全部加入BufferA1中混匀，并置于4℃保存；
b、在使用前加入60mL无水乙醇到DNA Wash Buffer中混匀；
c、Buffer B1若产生沉淀可于50℃水浴中加热至沉淀溶解，且用完要扭紧瓶盖；
d、Buffer N3若低于10℃会产生沉淀可于37℃水浴中加热至沉淀溶解；所有离心操作均在室温下进行。
(2)操作步骤：
a、分别对以上各个质粒进行转化，把相应的单克隆菌挑到5mL LB培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中250rmp/min、37℃摇菌16h。
b、菌液以10000g、1min离心，弃上清，收集菌体沉淀。
c、把250μl Buffer A1加入沉淀中，充分重悬沉淀。
d、再把250μl预热Buffer B1加入以上的重悬液中，反转5-10次轻轻混合均匀，室温静置2-5min直至看到溶液粘稠澄清透明。
e、然后再加入60μl预热Buffer N3，立即反转5-10次充分混匀并可看到白色絮状沉淀，13000rpm、20min室温离心。
f、小心把上清移至新的1.5mL离心管中，加入上清液1倍体积的Buffer RET和无水乙醇250μl，充分混匀。
g、把700μl的以上混合溶液加入到DNA吸附柱内的收集管中，13000rpm、20s室温离心，弃滤液，再把剩下的混合溶液加入到DNA吸附柱内的收集管中重复此步骤，直至全部溶液转移完毕。
h、然后把500μl Buffer KB加入到吸附柱内，13000rpm、1min室温离心，弃滤液。
i、再把500μl DNA Wash Buffer加入到吸附柱内，13000rpm、20s室温离心，弃滤液，并重复进行以上步骤。
j、最后把60μl Elution Buffer小心悬空滴入吸附柱内，再把吸附柱内置于新的离心管内，室温静置孵育2min，13000rpm、1min室温离心，把滤液重新吸回到吸附柱内，重复以上步骤，即质粒提取完毕。
重组质粒基因测序结果显示，插入在质粒酶切位点之间的片段与预期一致，证明lenti-CRISPR-sgRNA1，lenti-CRISPR-sgRNA2，lenti-CRISPR-sgRNA3，重组质粒构建成功，见图1、2、3。
将构建好的重组慢病毒质粒各取15μl测序，剩余的于-20℃保存。
实施例3：lenti-CRISPR-V2-sgRNA重组慢病毒的制备及鉴定
1、重组慢病毒的包装
转染前两天，将用于包装慢病毒的细胞293T细胞接种于15cm圆碟中，加入高糖DEME完全培养基(89％高糖DMEM、10％FBS，1％双抗)在5％CO2、37℃细胞培养箱中培养。根据细胞的生长速度及时观察，当细胞进入对数生长期且密度达到70％-80％便可进行慢病毒质粒的共转染。按下列体系配制A、B两管混合液,将两管混合液分别混匀后，将B管加入A管中，混匀，静置20min后，将细胞中原培养基吸出更换为新鲜培养基，按实验分组分别沿壁加入AB混合液后，在5％CO2、37℃细胞培养箱中培养8至12h后，弃原来的培养基并更换为新鲜的培养基继续培养。
慢病毒包装混合液配制
A管(重组慢病毒质粒)
B管(转染试剂)
Polyfect-V 60μl
Opti-DEME 1440μl
共1500μl；
2、慢病毒原液的收集与浓缩
在转染48h后吸出细胞培养基于新的15mL离心管内，500g、4℃、10min离心，上清即为重组慢病毒原液；把上清液小心转入超滤管中，3000g、4℃、20min离心，收集浓缩柱中液体，即为重组慢病毒浓缩液液，重组慢病毒浓缩液分装后可于-80℃可长期保存。
3、慢病毒颗粒的PCR鉴定
用AXYGEN病毒DNA/RNA提取试剂盒提取慢病毒原液及浓缩液中的慢病毒RNA，具体步骤如下：
(1)实验前准备：
a、根据试剂盒说明书在Bμffer W1A和Bμffer W2concentrate中加入相应体积的无水乙醇；
b、配制含1％冰乙酸的异丙醇溶液，室温密闭贮存。
(2)操作步骤：
a、取慢病毒原液或浓缩液200μl加入新的1.5mL离心管内。
b、再加入Bμffer V-L 200μl，振荡混匀，室温静置5min加入Bμffer V-N 75μl，再振荡混匀，然后12000g、5min离心；
c、将上清转移到试剂盒内装配的2mL离心管内，再加入含1％冰乙酸的异丙醇300μl，颠倒混匀；
d、然后将液体转移到制备管里，6000g、1min离心，弃滤液，继续重复该步骤至液体全部转完；
e、之后加入Bμffer W1A 500μl，在室温静置1min后，12000g、1min离心，弃滤液；
f、接着加入Bμffer W2 800μl，12000g、1min离心。
g、把以上的制备管放回2mL离心管，12000g、1min离心。
h、然后把制备管转移至1.5mL新的离心管内，加入40μl Bμffer TE到制备管中央，室温静置孵育1min，12000g、1min离心洗脱DNA，把离心管内液体吸回重新加入到制备管中央，重复以上步骤，1.5mL离心管内的液体即为RNA，-80℃保存备用。
将从慢病毒液中提取出来的总RNA用All-in-OneTM First-Strand cDNASynthesis Kit逆转录试剂盒(GeneCopeia公司)进行逆转录，具体步骤如下：准备PCR小管，按下列体系配制RNA-Prime Mix，将RNA-Prime Mix轻轻混匀，65℃的水浴10min，立即置于冰上操作。
RNA-Prime Mix体系如下：
按下列体系配制RNA逆转录反应的后续体系，然后37℃反应60min，85℃反应5min，合成cDNA后-20℃保存备用。
逆转录反应体系如下：
以重组质粒基因序列两端来设计引物，用多聚酶链式反应将提取的慢病毒基因组进行扩增，进行2％琼脂糖凝胶电泳，观察条带大小。
CRISPR慢病毒鉴定引物序列(5’-3’)：
CRISPR慢病毒鉴定F：TGGAAGGACGAAACACCG
CRISPR慢病毒鉴定R：TCTTGCTGGGCACCTTGT；
PCR体系如下：
PCR反应条件：
PCR扩增后经琼脂糖凝胶电泳，相比于阳性对照(重组质粒)，在包装病毒后48h收获的病毒原液，有明显的特异条带，而且片段大小与预期的502bp一致(见图4)。
实施例4：稳定敲除hFGF21的人肝细胞株构建及筛选
1、HL7702细胞的复苏、培养与传代
(1)液氮冻存的正常人肝细胞系HL7702细胞37℃水浴中迅速解冻复苏，离心后弃冻存液，在高糖DMEM完全培养基中5％CO2、37℃培养。
(2)观察细胞的生长当细胞80％以上融合时，弃培养基，用PBS洗涤残余血清，加入1mL胰酶消化细胞，在倒置显微镜下观察，当大部分细胞收缩变圆时，弃胰酶加入完全培养基终止消化，按1：3传代。
2、慢病毒颗粒感染HL7702细胞
(1)感染前一天，将生长状态良好的HL7702细胞接种于24孔板内，待细胞密度达到70％-80％时便可进行转染，此时应该在24孔板上做好2个实验组和对照组的标记。
(2)先将聚凝胺(polybrene)用培养基稀释为8μg/mL备用。
(3)弃去实验组细胞的旧培养基，加入已稀释好的(polybrene)，再在每个实验组中先加入50μl sgRNA3慢病毒浓缩液。
(4)而后将50μl sgRNA1加入到标记有sg1+sg3的实验组中，将50μl sgRNA2加入到标记有sg2+sg3的实验组中。对照组就以新鲜的完全培养基进行换液。
(5)轻轻摇动24孔板使重组慢病毒颗粒均匀分布，然后在5％CO2、37℃培养24h后，更换为新鲜的的培养基继续培养。
实施例5：稳定敲除hFGF21的人肝细胞株的鉴定
1、嘌呤霉素筛选hFGF21稳定表达的HL7702细胞株
(1)在进行细胞筛选前应先进行嘌呤霉素最小致死量实验：
a、提前培养好细胞密度长至80％的HL7702细胞仪24孔板内。
b、将1mL水加入100mg的白色粉末状嘌呤霉素中，漩涡震荡溶解后，在无菌间内用0.22μm的过滤嘴进行过滤。然后再取约10mL左右的细胞间无菌水，用相同滤嘴进行过滤备用。
c、准备10个1.5mL的EP管，将滤好的无菌水900μl/管加入EP管中，再加入100μl溶解好的嘌呤霉素溶液，配制为10mg/mL的嘌呤霉素贮存液，-20℃储存。
d、查阅相关资料可以知道HL7702细胞对嘌呤霉素的最小致死量约在0.2μg/mL左右。依此设计了嘌呤霉素梯度范围。
e、在8mL的完全培养基中加入1.6mL嘌呤霉素贮存液，浓度为2mg/mL，设为A管；然后把3mL A管中的溶液加入3mL完全培养基中，浓度为1mg/mL，设为B管。据后面梯度，做相应稀释。
f、设嘌呤霉素梯度(mg/mL)为：2，1.75，1.5，1.25，1，0.8，0.6，0.4，0.3，0.2，0.1，0，设1个副孔，以嘌呤霉素0mg/mL设为正常对照组，将不同嘌呤霉素浓度的培养基以500μl/孔的量加入相应组的24孔板细胞中，5％CO2、37℃培养观察。
g、48h后观察发现培养的HL7702细胞嘌呤霉素最小致死量为0.3μg/mL。
(2)在慢病毒颗粒感染HL7702细胞5d后，用含0.3μg/mL嘌呤霉素(经最小致死量实验得出0.3μg/mL为正常培养的HL7702细胞的最小致死量)的选择培养基筛选阳性克隆。选取空白对照组细胞全部死亡后实验组存活的细胞为阳性克隆，挑取阳性单克隆细胞至含0.3μg/mL嘌呤霉素培养基，继续培养并进行持续筛选。
CRISPR/cas9敲除后则会带有嘌呤霉素抗性基因筛选标记，加入0.3ug/mL的嘌呤霉素后，正常HL7702细胞在48h后死亡，lenti-v2-crispr/cas9感染的只有部分死亡，大部分存活(见图5)。
2、稳定敲除hFGF21的人肝细胞株的Western鉴定
(1)单层贴壁细胞蛋白提取：
a、待25T细胞培养瓶的嘌呤霉素抗性筛选的HL7702细胞和正常对照细胞长满后，弃培养基，用PBS洗涤两遍，置于冰上。
b、在2mL蛋白裂解液中加入100mM的PMSF 20μl和蛋白酶抑制剂4μl，充分混匀后置于冰上备用。
c、每瓶洗涤干净的细胞加入400μl上述配制好蛋白裂解液，放于冰上裂解30min。
d、裂解后把含有细胞碎片的裂解液移至新的1.5mL离心管中，12000rpm、4℃、5min离心。
e、将上清液即为裂解后的蛋白，然后按需要分装至干净的离心管，-20℃冻存备用。
(2)用Bradford法蛋白质浓度测定试剂盒对各抽提细胞蛋白进行蛋白定量，具体步骤如下：
a、BSA蛋白的浓度梯度制备：分别取6支新的1.5mL离心管，按下列体系进行配制。BSA蛋白浓度梯度配制表
b、酶标板法测定位置样品蛋白质浓度：将样品用蒸馏水做适当稀释(若样品浓度超过标曲范围，则测定的浓度会不准确，因此应该把较高浓度的蛋白进行一定程度的稀释)，在酶标板上选择相应数量的孔，分别加上以上制备的0-5号管中不同浓度的蛋白质溶液和相应的样品稀释液各20μl，然后各孔中分别加入200μl Bradford试剂轻轻混匀，把酶标版置于37℃静置10min。以所制备的0号管为空白对照组，在酶标仪上测出相应各个孔的A595的平均吸光度值，再以1-5号管的A595平均吸光度值为纵坐标，与之相对应的蛋白质浓度作为横坐标，绘制出标准曲线。根据样品稀释液A595的平均吸光度值对标准曲线上的蛋白质浓度，乘以稀释倍数，即为样品蛋白质浓度。
(3)将需要检测的蛋白质按体积4：1比例加入5x loading Bμffer混匀，100℃处理5-10min，放4℃保存备用。
(4)利用Bio-Rad进行预染快速SDS-PAGE，以18μg/孔的蛋白样品量上样。以225V电泳30min。然后以2.5A、25V恒电流半干转转移至PVDF膜上(5min)(注意避免气泡产生，要用玻璃棒将气泡赶出转运体系外)。以1％TBST配制的5％BSA室温封闭1h，加入以1：1000稀释的兔抗hFGF21(abcom公司)或以1：2000稀释的鼠抗GAPDH抗体(碧云天公司)，4℃孵育过夜。次日用1％TBST以10min/次，洗膜3次；然后以兔源1：2000和鼠源1：5000稀释的二抗室温孵育1h，再用1％TBST以10min/次，洗膜3次。将膜竖直在滤纸上吸走残留的TBST后，将化学发光HRP底物试剂A、B液按1：1充分混匀，加在PVDF膜表面，然后进行发光显色拍照。相比于正常HL7702细胞，实验组sg2+sg3的蛋白没有表达，而实验组sg1+sg3的蛋白表达量几乎相同(见图6)。
Claims (1)
1.一种hFGF21基因敲除人肝细胞株的构建方法，其特征在于，方法如下：
（1）采用如下引物分别合成sgRNA寡核苷酸链序列sgRNA2、sgRNA3
hFGF21 sgRNA2 F: caccgGAGACCGGGTTCGAGCACTC
R: aaacGAGTGCTCGAACCCGGTCTCc,
hFGF21 sgRNA3 F: caccgGGAAACTCACCGATCCATAC
R: aaacGTATGGATCGGTGAGTTTCCc；
（2）lenti-CRISPR-V2-sgRNA重组慢病毒质粒构建
对lenti-CRISPR-V2质粒的BsmBⅠ酶位点进行酶切，然后将步骤（1）的2个sgRNA寡核苷酸链序列分别连接在酶切后的lenti-CRISPR-V2质粒上，将连接产物转化到STBL3感受态细胞中，鉴定构建成功，获得2个lenti-CRISPR-V2-sgRNA重组慢病毒质粒；
（3）lenti-CRISPR-V2-sgRNA重组慢病毒的制备
按常规方法将步骤（2）获得的2个lenti-CRISPR-V2-sgRNA重组慢病毒质粒分别转入细胞中，培养，收集培养液，浓缩获得慢病毒颗粒sgRNA2、sgRNA3；
（4）敲除hFGF21的人肝细胞株构建
以浓度8μg/mL的聚凝胺来使慢病毒颗粒sgRNA2和慢病毒颗粒sgRNA3同时感染HL7702细胞；在感染细胞24h后，更换新鲜的培养基继续培养细胞；最后用嘌呤霉素来筛选感染细胞，获得hFGF21基因敲除人肝细胞株。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |