CN109913496A - 含有a/b型嵌合ha质粒的嵌合病毒株和嵌合减毒株拯救方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含有A/B型嵌合HA质粒的嵌合病毒株和嵌合减毒株拯救方法，先对H5亚型流感2.3.4.4谱系的HA序列进行碱性裂解位点改造，使其由高致病性病毒变为低致病性病毒，然后合成H5亚型流感2.3.4.4谱系的HA基因，以合成的HA基因和构建好的pBD‑Ya1688‑HA转染质粒为模板，设计并合成构建A/B型嵌合HA质粒的扩增引物，其次采用无缝克隆方法将H5亚型流感病毒的HA基因定向克隆到pBD‑Ya1688‑HA转染质粒中，形成A/B型嵌合HA质粒，最后利用A/B型嵌合HA质粒拯救含有A/B型嵌合HA质粒的嵌合病毒株和嵌合减毒株。解决了流感减毒疫苗容易引起毒力返祖的问题。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种含有表达H5亚型2.3.4.4谱系流感病毒HA蛋白的A/B型嵌合HA质粒的嵌合病毒株和嵌合减毒株拯救方法。
背景技术
目前临床上主要有灭活疫苗和冷适应减毒疫苗。灭活疫苗只能引起体液免疫，每年需要定期免疫；冷适应减毒疫苗可引起粘膜免疫，免疫效果好，但是安全性不如灭活疫苗，因为是活的病毒，有毒力返祖的风险。
灭活疫苗与减毒活疫苗诱导不同的免疫反应：灭活疫苗一般通过肌肉注射的方式给药，主要引起体液免疫；减毒活疫苗可以通过滴鼻的方式接种，模拟流感病毒的自然感染，引起更持久，更广泛的体液免疫和细胞免疫，在此基础上减毒活疫苗还可引起粘膜免疫。减毒活疫苗在用量较少的情况下具有比灭活疫苗更加良好的免疫效果，而且减毒活疫苗的制造不需要纯化HA蛋白，更加节省时间和成本，但是在安全性和耐受性方面减毒活疫苗不如灭活疫苗。减毒活疫苗使用受限的一个非常重要的原因是疫苗株存在与流感流行株基因重配的风险。H5亚型流感减毒活疫苗的制备需要考虑疫苗毒株与自然界流行的A型流感病毒发生型间重配的问题，疫苗株与流行株的错配不仅可以导致疫苗效力的降低，还容易产生出毒力未知的新病毒。
发明内容
本发明的目的在于提供一种含有A/B型嵌合HA质粒的嵌合病毒株和嵌合减毒株拯救方法，以解决目前减毒活疫苗因疫苗株容易引起毒力返祖的问题。
本发明所采用的技术方案是，含有A/B型嵌合HA质粒的嵌合病毒株拯救方法，具体步骤如下：
步骤S1、合成H5亚型流感2.3.4.4谱系的HA基因；
步骤S2、构建A/B型嵌合HA质粒：以合成的H5亚型流感2.3.4.4谱系的HA基因和构建好的B型流感病毒B/Yamagata/16/88 8质粒反向遗传操作系统中的pBD-Ya1688-HA转染质粒为模板，设计并合成构建A/B型嵌合HA质粒的扩增引物，最后采用无缝克隆方法将H5亚型流感病毒的HA基因定向克隆到pBD-Ya1688-HA转染质粒中，形成A/B型嵌合HA质粒；
步骤S3、采用A/B型嵌合HA质粒拯救含有A/B型嵌合HA质粒的嵌合病毒株。
进一步的，所述步骤S1中合成H5亚型流感2.3.4.4谱系的HA基因前需要对H5亚型流感2.3.4.4谱系A/cat/Sichuan/SC18/2014的HA序列进行碱性裂解位点改造，使其由高致病性病毒变为低致病性病毒。
进一步的，所述碱性裂解位点改造是去除碱性裂解位点附近的三个碱性氨基酸，并改变其附近三个氨基酸密码子，具体是去除H5亚型流感2.3.4.4谱系A/cat/Sichuan/SC18/2014的HA序列第342位到第344位的三个碱性氨基酸，同时改变第339位、第341位和第345位的氨基酸的密码子进行。
进一步的，所述步骤S2设计的扩增引物为：对于H5亚型流感2.3.4.4谱系的HA基因，其引物名称为INFUSION-HA-F和INFUSION-HA-R；对于pBD-Ya1688-HA转染质粒，其引物名称为pBD-F-INFUSION和pBD-R-INFUSION；所述INFUSION-HA-F序列为CTGGGACCATGCCGGCCA CAGAAGCAGAGCATT；所述INFUSION-HA-R序列为TGGGCCGCCGGGTTATTAGTA GTAACAAGAGCATTTTTCA；所述pBD-F-INFUSION序列为TAACCCGGCGGCCCAAAA；所述pBD-R-INFUSION序列为CCGGCATGGTCCCAGCCT。
进一步的，所述步骤S2采用无缝克隆方法将H5亚型流感病毒的HA基因定向克隆到pBD-Ya1688-HA转染质粒中，形成A/B型嵌合HA质粒，具体实现方法如下：
步骤S21、扩增带有同源序列的目的片段：取合成的H5亚型流感2.3.4.4谱系的HA基因片段，用ddH2O对其进行稀释使其浓度为1ng/μl，作为PCR的扩增模板，用引物INFUSION-HA-F及INFUSION-HA-R扩增HA基因胞外区目的片段，并用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物；
步骤S22、回收PCR产物：利用EastepTM凝胶及PCR回收试剂盒从琼脂糖凝胶中回收和纯化PCR产物；
步骤S23、制备线性化载体：取构建好的pBD-Ya1688-HA转染质粒，用ddH2O对其进行稀释使其浓度为1ng/μl，作为PCR的扩增模板，分别以引物pBD-F-INFUSION及pBD-R-INFUSION扩增载体片段，获得线性化载体；
步骤S24、制备重组产物：将纯化的PCR产物与线性化载体混合，与2×预混液共同于50℃水浴中孵育15分钟后，在冰块上冷却混合物5分钟获得重组产物；
步骤S25、重组反应体系转化感受态细胞，筛选出含有目的片段的克隆；
步骤S26、提取重组质粒即A/B型嵌合HA质粒。
进一步的，所述PCR扩增条件分别为：先在95℃预变性2min，然后将依次进行的94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸2min循环30次，再72℃延伸5min，最后4℃保存。
进一步的，所述步骤S25具体步骤如下：
步骤S251、取100μl DH5α感受态细胞置于离心管后放于冰块上，取5μl重组产物加入感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴静置30min；
步骤S252、将水浴锅温度设置为42℃，将离心管置于其内水浴90秒，然后迅速将离心管转移置于冰块上，使DH5α感受态细胞冷却3min；
步骤S253、向冷却后的离心管中加入700μl SOC培养基，在37℃摇床上以200rpm的转速振荡培养1小时；
步骤S254、37℃培养1小时后，从含有SOC培养基的离心管中吸取100μl涂布于制备好的Amp+的LB平板上，37℃培养12～16h后挑取LB平板上的单个菌落，用2ml液体Amp+的LB培养基37℃摇床振荡培养6h后进行菌液PCR，最后利用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，如电泳时PCR反应扩增出的目的基因片段大小正确，则插入的目的片段正确。
进一步的，所述步骤S26具体步骤如下：
步骤S261、在Buffer P1中以1:1000的比例加入LyseBlue颜色指示试剂以及RNaseA溶液，混合后于4℃存储；
步骤S262、在室温中以13000rpm离心4ml步骤S254经37℃、12～16小时培养的菌液3分钟，弃去上清，用250μl Buffer P1重悬细菌，将混悬液转移入干净的离心管中；
步骤S263、加入250μl Buffer P2，彻底颠倒混合溶液4～6次，使溶液变蓝；
步骤S264、加入350μl Buffer N3，快速彻底颠倒混合溶液4-6次，使溶液变为无色；
步骤S265、将混合液13000rpm离心10min；
步骤S266、吸取800μl离心后的上清液转移入核酸纯化柱中，13000rpm离心30～60s，丢弃流出液；
步骤S267、加入0.5ml的Buffer PB清洗核酸纯化柱，离心30～60s后弃去流出液；
步骤S268、在Buffer PE中加入无水乙醇，振荡混匀，向核酸纯化柱中加入0.75ml的Buffer PE与无水乙醇的混合液进行清洗，离心30-60s后弃去流出液；
步骤S269、13000rpm离心1min除去残留的Buffer，将核酸纯化柱移入干净的离心管中，加入50μl ddH2O洗脱质粒，静置1min后13000rpm离心1min，然后将洗脱的质粒送测序，测序正确的重组质粒即为A/B型嵌合HA质粒，于-20℃保存。
进一步的，所述步骤S3具体步骤如下：
步骤S31、将293T细胞培养在含有10％胎牛血清和1×Anti-Anti的DMEM中，以每孔1×106个293T细胞平铺于6孔细胞培养板中，培养至单层细胞的密度达到80％～90％后取出备用；
步骤S32、取B型流感病毒B/Yamagata/16/88 8质粒反向遗传操作系统中的7种质粒pBD-PB2、pBD-PB1、pBD-PA、pBD-NA、pBD-M、pBD-NP、pBD-NS及A/B型嵌合HA质粒各0.6μg，在含有250μl Opti-MEM的离心管中混匀，室温下静置5分钟；
步骤S33、在另一支离心管中加入250μl Opti-MEM，与其内的15μl转染试剂缓慢混匀；
步骤S34、将步骤S32所得混合质粒与步骤S33所得稀释好的转染试剂充分混匀，室温静置20分钟；
步骤S35、弃去6孔板中的细胞培养液，用Opti-MEM多次清洗6孔板，最后清洗后使每孔剩余200μl无血清培养基；
步骤S36、将混合质粒与转染试剂的混合液滴加入剩余200μl无血清培养基的孔中，33℃、5％CO2条件下培养；
步骤S37、12小时后换液，弃去6孔板中的液体，加入2ml含有浓度为0.2μg/ml TPCK胰酶的Opti-MEM培养液，33℃、5％CO2条件下培养；
步骤S38、72小时后收集转染细胞上清液，即为含有质粒A/B型嵌合HA的嵌合病毒株，于-70℃保存。
本发明的另一技术方案时，含有A/B型嵌合HA质粒的嵌合减毒株拯救方法，是在上述含有A/B型嵌合HA质粒的嵌合病毒株的拯救方法的基础上，将其步骤S32“取B型流感病毒B/Yamagata/16/88 8质粒反向遗传操作系统中的7种质粒pBD-PB2、pBD-PB1、pBD-PA、pBD-NA、pBD-M、pBD-NP、pBD-NS及A/B型嵌合HA质粒各0.6μg”替换为“取B型流感病毒B/Yamagata/16/88 8质粒反向遗传操作系统中的6种质粒pBD-PB2、pBD-PB1、pBD-PA、pBD-NA、pBD-M、pBD-NP及pBD-NS110质粒、A/B型嵌合HA质粒各0.6μg”，拯救含有A/B型嵌合HA质粒的嵌合减毒株。
本发明的有益效果是，利用自然界中A型流感病毒与B型流感病毒不能重配的特点，获得一种A/B型嵌合HA质粒，其包含A型流感病毒HA基因的胞外区，保留了B型流感病毒HA基因两端的包装信号序列，并采用该A/B型嵌合HA质粒在实验室水平上实现A/B嵌合疫苗株的拯救，获得表达H5亚型2.3.4.4谱系流感病毒HA蛋白的A/B型嵌合流感病毒株以及嵌合流感减毒株，有效解决了流感减毒疫苗容易引起毒力返祖的问题，具有安全性高、免疫原性强的优势。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是A/B型嵌合HA质粒结构示意图。
图2是转染质粒pBD-Ya1688与重组质粒pBD-H5-HA结构图。
图3是H5亚型流感2.3.4.4谱系的HA序列碱性裂解位点改造示意图。
图4是A/B型嵌合HA质粒测序结果图。
图5是嵌合病毒株rA/B-H5-NS 8个基因片段PCR结果图。
图6是嵌合减毒株rA/B-H5-NS110 8个基因片段PCR结果图。
图7是感染嵌合减毒株rA/B-H5-NS110的小鼠存活率统计图。
图8是感染嵌合减毒株rA/B-H5-NS110的小鼠体重变化图。
图9是感染嵌合减毒株rA/B-H5-NS110的小鼠肺脏中的病毒滴度结果图。
图10是单次免疫组小鼠的血凝抑制抗体效价图。
图11是两次免疫组小鼠的血凝抑制抗体效价图。
图12是单次免疫组攻毒后小鼠的存活率统计图。
图13是单次免疫组攻毒后小鼠的体重变化图。
图14是单次免疫组攻毒后小鼠肺脏中的病毒滴度结果图。
图15是两次免疫组攻毒后小鼠的存活率统计图。
图16是两次免疫组攻毒后小鼠的体重变化图。
图17是两次免疫组攻毒后小鼠肺脏中的病毒滴度结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
A/B型嵌合HA质粒的构建方法，具体步骤如下：
步骤S1、基因合成：将H5亚型流感2.3.4.4谱系A/cat/Sichuan/SC18/2014的HA序列的碱性裂解位点改造，如图3所示，去除碱性裂解位点附近的三个碱性氨基酸，并改变其附近三个氨基酸密码子，即将HA序列第342位到第344位的三个碱性氨基酸去掉，同时将第339位、第341位及第345位的氨基酸的密码子进行改变，使H5亚型流感由高致病性病毒变为低致病性病毒，然后人工进行H5亚型流感2.3.4.4谱系的HA基因合成。
步骤S2、构建重组质粒：以人工合成的H5亚型流感2.3.4.4谱系的HA基因和构建好的B型流感病毒B/Yamagata/16/88 8质粒反向遗传操作系统中的pBD-Ya1688-HA转染质粒为模板，设计并合成构建嵌合HA质粒的扩增引物，如表1所示，引物设计是根据无缝克隆实验原理设计的，利用设计的引物，在无缝克隆实验中，可以使得构建质粒容易一些，然后采用无缝克隆方法将H5亚型流感病毒的HA基因定向克隆到pBD-Ya1688-HA转染质粒中。
表1无缝克隆引物设计合成序列
采用无缝克隆方法将H5亚型流感病毒的HA基因定向克隆到pBD-Ya1688-HA转染质粒中，如图1～2所示，具体实现过程如下：
步骤S21、扩增带有同源序列的目的片段：取合成的H5亚型流感2.3.4.4谱系的HA基因片段，用ddH2O对其进行稀释使其浓度为1ng/μl，作为PCR的扩增模板，用引物INFUSION-HA-F及INFUSION-HA-R扩增HA基因胞外区目的片段，最后用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物。
步骤S22、回收PCR产物：利用EastepTM凝胶及PCR回收试剂盒从琼脂糖凝胶中回收和纯化PCR产物，具体实现过程如下：
步骤S221、电泳结束后，在紫外灯下切下含有目的片段的琼脂糖凝胶胶块，放入干净的1.5ml离心管中，称量胶块的质量并标记；
步骤S222、以10mg胶块加入10μl膜结合液的比例加入试剂盒中自带的膜结合液，与胶块振荡混匀后，在56℃水浴中孵育10min直至胶块完全溶解；
步骤S223、插入微量纯化柱吸取完全溶解的胶块混合液，室温孵育1min，16000×g室温离心1min，弃去滤液；
步骤S224、加入700μl膜清洗液，16000×g室温离心1min，弃去滤液；
步骤S225、加入500μl试剂盒中自带的膜清洗液，16000×g室温离心5min，弃去滤液，再次以最大速度空柱离心1min以除去乙醇；
步骤S226、将微量纯化柱转移至1.5ml离心管中，加入50μl ddH2O，室温静置1min后16000×g离心1min，将洗脱下来的目的片段水溶液于-20℃保存。
步骤S23、制备线性化载体：取构建好的B型流感病毒B/Yamagata/16/88 8质粒反向遗传操作系统中的pBD-Ya1688-HA转染质粒，用ddH2O对其进行稀释使其浓度为1ng/μl，作为PCR的扩增模板；分别以引物pBD-F-INFUSION及pBD-R-INFUSION扩增载体片段，获得线性化载体。
步骤S24、制备重组产物：将纯化的PCR产物与线性化载体混合，与2×预混液(无缝克隆试剂)共同于50℃水浴中孵育15分钟后，在冰上冷却混合物5分钟获得重组产物，各组分剂量见表2。
表2无缝克隆重组反应体系
| 组成成分 | 用量 |
| 线性化载体 | 50ng |
| 插入片段 | 100ng |
| 2×EasyGenoAssemblyMix | 5μl |
| ddH<sub>2</sub>O | 补足到10μl |
步骤S25、重组反应体系转化感受态细胞，筛选出含有目的片段的克隆，具体实现过程如下：
步骤S251、取100μl DH5α感受态细胞置于离心管后放于冰块上，取5μl重组产物加入感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴静置30min；
步骤S252、将水浴锅设置为42℃，将离心管置于其内水浴90秒，然后迅速将离心管转移置于冰块上，使感受态细胞冷却3min；
步骤S253、向冷却后的离心管中加入700μl SOC培养基，37℃摇床上以200rpm振荡培养1小时；
步骤S254、37℃培养1小时后，从含有SOC培养基的离心管中吸取100μl涂布于制备好的Amp+的LB平板上，37℃培养12～16h后挑取LB平板上的单个菌落，用2ml液体Amp+的LB培养基37℃摇床振荡培养6h后进行菌液PCR，最后利用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，鉴定插入的片段是否正确，如PCR反应扩增出目的基因片段，电泳时目的片段大小正确，即可说明插入的目的片段正确。
菌液PCR，是先在95℃预变性2min，然后将依次进行的94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸2min循环30次，然后再72℃延伸5min，最后4℃保存。
步骤S26、提取重组质粒即A/B型嵌合HA质粒。
利用质粒小提试剂盒进行重组质粒的提取，提取具体步骤如下：
步骤S261、在Buffer P1中以1:1000的比例加入颜色指示试剂LyseBlue试剂以及RNase A溶液，混合后存储于4℃冰箱中；LyseBlue试剂在后续步骤中，起到指示色的作用。
步骤S262、在室温中以13000rpm离心4ml经过12～16小时培养的菌液3分钟，弃去上清，用250μl Buffer P1重悬细菌，将混悬液转移入干净的2.0ml离心管中；
步骤S263、加入250μl Buffer P2，彻底颠倒混合溶液4～6次，使溶液变蓝；
步骤S264、加入350μl Buffer N3，快速彻底颠倒混合溶液4-6次，使溶液变为无色；
步骤S265、将混合液13000rpm离心10min；
步骤S266、吸取800μl离心后的上清液转移入核酸纯化柱中，13000rpm离心30～60s，丢弃流出液；
步骤S267、加入0.5ml的Buffer PB清洗核酸纯化柱，离心30～60s后弃去流出液；
步骤S268、在Buffer PE中加入无水乙醇，振荡混匀，向核酸纯化柱中加入0.75ml的Buffer PE与无水乙醇的混合液进行清洗，离心30-60s后弃去流出液；
步骤S269、13000rpm离心1min除去残留的Buffer，将核酸纯化柱移入干净的1.5ml离心管中，加入50μl ddH2O来洗脱质粒，静置1min后13000rpm离心1min，然后将洗脱的质粒送测序，测序正确的重组质粒即为A/B型嵌合HA质粒，将其命名为pBD-H5-HA，如图1所示，置于-20℃冰箱中保存。
将构建完成的重组质粒进行PCR鉴定，并进行测序，测序结果如图4所示，显示A/B嵌合重组质粒去除了碱性裂解位点。
病毒的拯救与鉴定：对H52.3.4.4谱系HA进行改造，利用反向遗传技术拯救A/B型嵌合流感病毒株和A/B型嵌合流感减毒株，对拯救成功的两种病毒株进行形态学和序列鉴定。
应用pBD-H5-HA重组质粒即A/B型嵌合HA质粒拯救含有A/B型嵌合HA质粒的嵌合病毒株的方法，具体步骤如下：
步骤1、将293T细胞培养在含有10％胎牛血清和1×Anti-Anti的DMEM中，以每孔1×106个293T细胞平铺于6孔细胞培养板中，培养至单层细胞的密度达到80％-90％后取出备用；
步骤2、取B型流感病毒B/Yamagata/16/88 8质粒反向遗传操作系统中的7种质粒pBD-PB2、pBD-PB1、pBD-PA、pBD-NA、pBD-M、pBD-NP、pBD-NS及构建的A/B型嵌合HA质粒各0.6μg，在含有250μl Opti-MEM的1.5ml离心管中一起混匀，室温下静置5分钟；
步骤3、在另一支1.5ml离心管中加入250μl Opti-MEM，与15μl转染试剂缓慢混匀；
步骤4、将步骤2所得混合质粒与步骤3所得稀释好的转染试剂充分混匀，室温静置20分钟；
步骤5、弃去6孔板中的细胞培养液，用Opti-MEM多次清洗6孔板，最后清洗后使每孔剩余200μl无血清培养基；
步骤6、将混合质粒与转染试剂的混合液滴加入剩余200μl无血清培养基的孔中，33℃、5％CO2条件下培养；
步骤7、12小时后换液，弃去6孔板中的液体，加入2ml含有浓度为0.2μg/ml TPCK胰酶的Opti-MEM培养液，33℃、5％CO2条件下培养；
步骤8、72小时后收集转染细胞上清液，于-70℃冰箱中保存。
含有A/B型嵌合HA质粒及重组质粒NS110嵌合减毒株的拯救：将上述应用pBD-H5-HA重组质粒拯救含有A/B型嵌合HA质粒嵌合病毒株的方法中步骤2所用质粒替换为：B型流感病毒B/Yamagata/16/88 8质粒反向遗传操作系统中的6种质粒pBD-PB2、pBD-PB1、pBD-PA、pBD-NA、pBD-M、pBD-NP及NS110质粒、重组质粒pBD-H5-HA，进行嵌合减毒株拯救，获得第二种转染细胞上清液。
将收集到的两种转染细胞上清液采用鸡胚尿囊腔接种法接种鸡胚，具体步骤如下：
步骤一、检验准备接种的8日龄SPF鸡胚：首先检查鸡胚外观是否有裂痕等问题，然后用照蛋器检测鸡胚，选择血管清晰，胎动明显，可见丰富血管网的鸡胚，在无血管处标记尿囊腔注射部位；
步骤二、将选好的鸡胚气室朝上放置于卵架上，用酒精给蛋壳表面消毒后，用打孔器打孔；
步骤三、用1ml规格的一次性无菌注射器吸取收集到的两种转染细胞上清液0.1ml，由打孔处垂直进针注入鸡胚尿囊腔中；
步骤四、用无毒白胶在接种后将针孔封闭，标记接种的日期时间以及样品名称；
步骤五、33℃温箱中孵育鸡胚，接种后24小时照胚，将死亡的鸡胚检出丢弃；
步骤六、接种后72小时，将鸡胚置于4℃环境下过夜，然后将冷却后的鸡胚表面消毒后置于无菌的生物安全柜中，敲破鸡胚气室处的卵壳并将其剥除，用移液枪吸取尿囊液测定鸡胚尿囊液的血凝效价。
测定鸡胚尿囊液血凝效价，具体步骤如下：
1.吸取50μl生理盐水加入96孔V型微量反应板第一行12个孔中；
2.将吸取的鸡胚尿囊液50μl加入第1孔中，反复抽打3-5次混匀，然后吸取50μl倍比稀释至第11孔，从第11孔吸取50μl弃去；
3.每孔加入50μl 1％鸡红细胞悬液；
4.在室温下振荡反应板2min，静置30min，将反应板倾斜60°观察红细胞是否凝集于孔底；
5.收集血凝效价最高、清亮的鸡胚尿囊液作为种毒，将拯救出的两种嵌合毒株分别命名为rA/B-H5-NS和rA/B-H5-NS110，4000rpm离心5min后以300μl/管分装入干净的1.5ml离心管中，于-70℃冰箱中保存。
拯救成功的A/B型嵌合毒株rA/B-H5-NS的血凝效价为28，嵌合减毒株rA/B-H5-NS110的血凝效价为26。
拯救病毒株总RNA的提取：病毒RNA提取步骤按照Simply P总RNA提取试剂盒的说明书进行。
病毒总RNA的反转录：合成禽流感病毒反转录通用引物Uni12(5’-AgCAAAAgCAgg-3’)，Uni13(5’-TCATCTTTgTTCC-3’)，将反转录体系混匀，42℃水浴1小时，即可获得嵌合毒株rA/B-H5-NS和rA/B-H5-NS110的全基因cDNA，cDNA是进行PCR反应所必须的模板，PCR模板一般用病毒的基因组，因为流感病毒是RNA病毒，并且RNA容易降解，所以要将RNA反转录成稳定的cDNA，以此作为PCR模板。
将两种拯救出的嵌合病毒株作为H5亚型2.3.4.4流感疫苗的候选株，对拯救的两种嵌合病毒进行鉴定，评价两毒株的致病性及免疫原性，最后评价两疫苗候选株对接受致死剂量的同源H5亚型2.3.4.4谱系流感病毒感染的BALB/c小鼠的保护效果。为新型流感疫苗的研发及B型流感病毒包装机制的研究提供新思路。
拯救病毒株的PCR鉴定：设计并合成两种嵌合病毒各片段基因序列的鉴定引物，如表3所示，按照表4的PCR体系进行扩增，PCR反应结束后，将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，实验结果表明目的片段大小一致。成功拯救出了2种A/B型嵌合流感病毒株，其中A/B型嵌合流感病毒株命名为rA/B-H5-NS，A/B型嵌合流感减毒株命名为rA/B-H5-NS110。测序结果表明两株拯救病毒的序列与预期一致，并在电镜下可见流感病毒样粒子。
琼脂糖凝胶电泳结果显示，两株嵌合毒株8个基因片段大小与预期相符，如图5～6所示。
表3嵌合病毒各片段基因序列的鉴定引物
表4 PCR反应体系
| 试剂 | 剂量(μl) |
| cDNA | 2 |
| 上游引物 | 1 |
| 下游引物 | 1 |
| 5×FastPfu Buffer | 10 |
| 2.5mM dNTPs | 4 |
| FastPfu DNA Polymerase | 1 |
| ddH<sub>2</sub>O | 31 |
| 总体积 | 50 |
嵌合减毒株BALB/c小鼠的致病性实验：
将嵌合减毒株分别以104EID50/50μl，103EID50/50μl，102EID50/50μl等不同剂量滴鼻感染小鼠，连续14天观察并记录小鼠的死亡情况和小鼠的体重变化，死亡情况如图7所示，Mock组(阴性对照组)、rA/B-H5-NS110 104EID50/50μl组、rA/B-H5-NS110103EID50/50μl组及rA/B-H5-NS110 102EID50/50μl组小鼠生存率均为100％，没有小鼠死亡。小鼠的体重变化如图8所示，rA/B-H5-NS110 104EID50组小鼠在感染后第6-8天体重出现轻微下降，体重变化不大，rA/B-H5-NS110 103EID50组及102EID50组小鼠体重变化不大，略有上升，Mock组小鼠体重轻微上升。感染后第3天和第6天取小鼠的肺脏，研磨后滴定SPF鸡胚测定小鼠肺脏中的病毒滴度，小鼠肺脏病毒滴定结果如图9所示，rA/B-H5-NS110 104EID50组、rA/B-H5-NS110103EID50组及rA/B-H5-NS110 102EID50组三组小鼠在感染后第3天可在肺脏中检测出病毒的轻微复制，第6天除rA/B-H5-NS110102EID50组外，其它两组小鼠检测不到肺脏中病毒的复制(虚线表示最低检测线)。实验结果显示，以不同剂量的嵌合减毒株感染小鼠，小鼠体重均无明显下降，小鼠的存活率均为100％，在感染的第3天在小鼠肺脏中均检测到较低的病毒滴度，102EID50/50μl剂量感染组小鼠在第6天检测到轻微的肺脏病毒滴度。嵌合毒株rA/B-H5-NS和嵌合减毒株rA/B-H5-NS110在MDCK细胞上的病毒滴度分别为107.64TCID50/ml和105.25TCID50/ml。嵌合毒株rA/B-H5-NS和嵌合减毒株rA/B-H5-NS110在鸡胚上的病毒滴度分别为106.25EID50/ml和104.50EID50/ml。
两种A/B嵌合疫苗候选株的小鼠免疫实验：
免疫实验分为单次免疫组和两次免疫组，均以滴鼻方式进行免疫。单次免疫实验中，A/B型嵌合流感病毒株rA/B-H5-NS的免疫剂量分别是105EID50/50μl，104EID50/50μl，A/B型嵌合流感减毒株rA/B-H5-NS110的免疫剂量分别是104EID50/50μl，103EID50/50μl和102EID50/50μl。阳性对照组选择H52.3.4.4谱系的商品化H5N1灭活疫苗(RE-8)，免疫方式为肌肉注射，阴性对照组小鼠用DMEM滴鼻接种。在免疫第0天，第21天采集小鼠血清并测定血凝抑制抗体效价。两次免疫实验中，小鼠在第一次免疫后第21天进行第二次免疫，免疫剂量和免疫方式与单次免疫相同，在免疫第0天，第21天，第42天采集小鼠血清，测定小鼠血清中的血凝抑制抗体效价。两次免疫实验中，小鼠在第一次免疫后第21天进行第二次免疫，免疫剂量和免疫方式与单次免疫相同，在免疫第0天，第21天，第42天采集小鼠血清，测定小鼠血清中的血凝抑制抗体效价。
单次免疫实验结果如图10所示，除阴性对照组外，单次免疫后的小鼠血清中均能检测到针对H5亚型2.3.4.4谱系流感病毒标准抗原的血凝抑制抗体，即不同免疫剂量的A/B型嵌合流感减毒株rA/B-H5-NS110均可诱导小鼠产生血凝抑制抗体(HI抗体)，其中第3周时rA/B-H5-NS110-104EID50组小鼠血凝抑制抗体效价最高，效价可达1:640。嵌合病毒株和RE-8也可诱导小鼠产生HI抗体。
两次免疫实验结果如图11所示，除了阴性对照组外，两次免疫后的小鼠血清中均能检测到针对H5亚型2.3.4.4谱系流感病毒标准抗原的血凝抑制抗体，不同免疫剂量的嵌合减毒株均可诱导小鼠产生血凝抑制抗体(HI抗体)，血凝抑制效价最高达到1:640。嵌合病毒株也可诱导小鼠产生HI抗体，抗体效价可达1:640。经两次免疫后，各组小鼠血清中HI抗体普遍升高。
两种A/B嵌合疫苗候选株的免疫保护实验：
单次免疫组小鼠在免疫后第21天以10LD50(3.63log10EID50/50μl)剂量的A/cat/Sichuan/SC18/2014(H5N6)野毒株进行攻毒，连续14天观察并记录小鼠的死亡情况和小鼠的体重变化情况。在攻毒后的第3天和第6天取小鼠的肺脏，研磨后滴定SPF鸡胚来测定小鼠肺脏中的病毒滴度。两次免疫组小鼠在免疫后第42天以100LD50(4.63log10EID50/50μl)剂量的A/cat/Sichuan/SC18/2014(H5N6)的野毒株进行攻毒。观察并记录小鼠的死亡情况和体重变化，在攻毒后的第3天和第6天取小鼠的肺脏，研磨后滴定SPF鸡胚来测定小鼠肺脏中的病毒滴度。
单次免疫组的小鼠免疫保护实验结果：嵌合减毒株组、RE-8组和嵌合病毒株组小鼠存活率均为100％。Mock组小鼠存活率为60％，攻毒后第6天开始死亡，到第14天时仍有3只小鼠没有死亡，如图12所示，但存活小鼠的体重下降了15％左右，如图13所示，且表现出了明显的临床症状，包括前期被毛粗糙无光，小鼠聚集蜷缩，后期活动大幅减少，食欲明显减退，被毛逆立等。嵌合减毒株组小鼠中仅102EID50剂量组小鼠在攻毒后第3天检测到肺脏病毒的复制，并且第6天检测不到病毒的复制。RE-8组小鼠在攻毒后第3天和第6天均检测到肺脏病毒复制，且第6天其肺脏病毒滴度下降。嵌合病毒株组小鼠在攻毒后第3天和第6天均为检测到肺脏病毒复制。但是，Mock组小鼠在攻毒后第3天和第6天均检测到高水平的肺脏病毒滴度，如图14所示。
两次免疫组的小鼠免疫保护实验结果：如图15所示，嵌合减毒株组、嵌合病毒株组和RE-8组小鼠生存率均为100％，Mock组小鼠死亡率为100％，在攻毒后第6天小鼠开始死亡，到第7天时小鼠全部死亡。如图16所示，嵌合减毒株组小鼠体重变化不明显，无明显下降；嵌合病毒株组和RE-8组小鼠体重无明显变化；Mock组小鼠攻毒后体重持续下降，至第7天小鼠全部死亡。如图17所示，嵌合减毒株组和嵌合病毒株组小鼠攻毒后第3天和第6天均未检测到肺脏的病毒复制，RE-8组小鼠在攻毒后第3天和第6天可检测到低水平的肺脏病毒滴度，Mock组小鼠在攻毒后可产生较高水平的肺脏病毒复制，并且攻毒后第3天高于攻毒后第6天。
上述实验结果表明拯救的嵌合减毒株可抵抗致死性流感病毒的攻击，有较好的免疫保护效果，同时发现嵌合病毒株亦可诱导产生HI抗体，并对小鼠产生免疫保护作用。
以B型流感病毒为载体，首次构建了近年来在禽类中流行并导致人类感染事件的2.3.4.4谱系H5Nx病毒疫苗候选株，嵌合减毒疫苗，该嵌合疫苗株不与自然界存在的A型流感病毒发生重配，解决目前减毒活疫苗因疫苗株存在与流感流行株基因重配的风险的问题；构建的疫苗候选株可经滴鼻方式诱导小鼠产生高滴度体液免疫反应，降低了H5亚型减毒活疫苗的生产成本和使用难度。本发明将H5亚型流感病毒HA片段的胞外域进行修饰，使其带有B型流感病毒的包装信号，从而在克服了A型流感病毒与B型流感病毒自然条件下不能重配的问题之上，也实现了防止H5亚型流感病毒与其它流感流行株的重配。在实现HA基因的嵌合基础上，对NA基因进行嵌合的拯救。HA基因是流感病毒产生中和抗体的主要抗原，但是也有报道NA基因同样可以引起一定的免疫反应。
除了H5亚型流感的HA基因外，其他任何亚型流感的HA基因均可通过此方法实现嵌合疫苗的拯救。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.含有A/B型嵌合HA质粒的嵌合病毒株拯救方法，其特征在于，具体步骤如下：
步骤S1、合成H5亚型流感2.3.4.4谱系的HA基因；
步骤S2、构建A/B型嵌合HA质粒：以合成的H5亚型流感2.3.4.4谱系的HA基因和构建好的B型流感病毒B/Yamagata/16/88 8质粒反向遗传操作系统中的pBD-Ya1688-HA转染质粒为模板，设计并合成构建A/B型嵌合HA质粒的扩增引物，最后采用无缝克隆方法将H5亚型流感病毒的HA基因定向克隆到pBD-Ya1688-HA转染质粒中，形成A/B型嵌合HA质粒；
步骤S3、采用A/B型嵌合HA质粒拯救含有A/B型嵌合HA质粒的嵌合病毒株。
2.根据权利要求1所述的含有A/B型嵌合HA质粒的嵌合病毒株拯救方法，其特征在于，所述步骤S1中合成H5亚型流感2.3.4.4谱系的HA基因前需要对H5亚型流感2.3.4.4谱系A/cat/Sichuan/SC18/2014的HA序列进行碱性裂解位点改造，使其由高致病性病毒变为低致病性病毒。
3.根据权利要求2所述的含有A/B型嵌合HA质粒的嵌合病毒株拯救方法，其特征在于，所述碱性裂解位点改造是去除碱性裂解位点附近的三个碱性氨基酸，并改变其附近三个氨基酸密码子，具体是去除H5亚型流感2.3.4.4谱系A/cat/Sichuan/SC18/2014的HA序列第342位到第344位的三个碱性氨基酸，同时改变第339位、第341位和第345位的氨基酸的密码子。
4.根据权利要求1～3任一项所述的含有A/B型嵌合HA质粒的嵌合病毒株拯救方法，其特征在于，所述步骤S2设计的扩增引物为：对于H5亚型流感2.3.4.4谱系的HA基因，其引物名称为INFUSION-HA-F和INFUSION-HA-R；对于pBD-Ya1688-HA转染质粒，其引物名称为pBD-F-INFUSION和pBD-R-INFUSION；
所述INFUSION-HA-F序列为CTGGGACCATGCCGGCCACAGAAGCAGAGCATT；
所述INFUSION-HA-R序列为TGGGCCGCCGGGTTATTAGTAGTAACAAGAGCATTTTTCA；
所述pBD-F-INFUSION序列为TAACCCGGCGGCCCAAAA；
所述pBD-R-INFUSION序列为CCGGCATGGTCCCAGCCT。
5.根据权利要求4所述的含有A/B型嵌合HA质粒的嵌合病毒株拯救方法，其特征在于，所述步骤S2采用无缝克隆方法将H5亚型流感病毒的HA基因定向克隆到pBD-Ya1688-HA转染质粒中，形成A/B型嵌合HA质粒，具体实现方法如下：
步骤S21、扩增带有同源序列的目的片段：取合成的H5亚型流感2.3.4.4谱系的HA基因片段，用ddH2O对其进行稀释使其浓度为1ng/μl，作为PCR的扩增模板，用引物INFUSION-HA-F及INFUSION-HA-R扩增HA基因胞外区目的片段，并用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物；
步骤S22、回收PCR产物：利用EastepTM凝胶及PCR回收试剂盒从琼脂糖凝胶中回收和纯化PCR产物；
步骤S23、制备线性化载体：取构建好的pBD-Ya1688-HA转染质粒，用ddH2O对其进行稀释使其浓度为1ng/μl，作为PCR的扩增模板，分别以引物pBD-F-INFUSION及pBD-R-INFUSION扩增载体片段，获得线性化载体；
步骤S24、制备重组产物：将纯化的PCR产物与线性化载体混合，与2×预混液共同于50℃水浴中孵育15分钟后，在冰块上冷却混合物5分钟获得重组产物；
步骤S25、重组反应体系转化感受态细胞，筛选出含有目的片段的克隆；
步骤S26、提取重组质粒即A/B型嵌合HA质粒。
6.根据权利要求5所述的含有A/B型嵌合HA质粒的嵌合病毒株拯救方法，其特征在于，所述PCR扩增条件分别为：先在95℃预变性2min，然后将依次进行的94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸2min循环30次，再72℃延伸5min，最后4℃保存。
7.根据权利要求5所述的含有A/B型嵌合HA质粒的嵌合病毒株拯救方法，其特征在于，所述步骤S25具体步骤如下：
步骤S251、取100μl DH5α感受态细胞置于离心管后放于冰块上，取5μl重组产物加入感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴静置30min；
步骤S252、将水浴锅温度设置为42℃，将离心管置于其内水浴90秒，然后迅速将离心管转移置于冰块上，使DH5α感受态细胞冷却3min；
步骤S253、向冷却后的离心管中加入700μl SOC培养基，在37℃摇床上以200rpm的转速振荡培养1小时；
步骤S254、37℃培养1小时后，从含有SOC培养基的离心管中吸取100μl涂布于制备好的Amp+的LB平板上，37℃培养12～16h后挑取LB平板上的单个菌落，用2ml液体Amp+的LB培养基37℃摇床振荡培养6h后进行菌液PCR，最后利用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，如电泳时PCR反应扩增出的目的基因片段大小正确，则插入的目的片段正确。
8.根据权利要求7所述的含有A/B型嵌合HA质粒的嵌合病毒株拯救方法，其特征在于，所述步骤S26具体步骤如下：
步骤S261、在Buffer P1中以1:1000的比例加入LyseBlue颜色指示试剂以及RNase A溶液，混合后于4℃存储；
步骤S262、在室温中以13000rpm离心4ml步骤S254经37℃、12～16小时培养的菌液3分钟，弃去上清，用250μl Buffer P1重悬细菌，将混悬液转移入干净的离心管中；
步骤S263、加入250μl Buffer P2，彻底颠倒混合溶液4～6次，使溶液变蓝；
步骤S264、加入350μl Buffer N3，快速彻底颠倒混合溶液4-6次，使溶液变为无色；
步骤S265、将混合液13000rpm离心10min；
步骤S266、吸取800μl离心后的上清液转移入核酸纯化柱中，13000rpm离心30～60s，丢弃流出液；
步骤S267、加入0.5ml的Buffer PB清洗核酸纯化柱，离心30～60s后弃去流出液；
步骤S268、在Buffer PE中加入无水乙醇，振荡混匀，向核酸纯化柱中加入0.75ml的Buffer PE与无水乙醇的混合液进行清洗，离心30-60s后弃去流出液；
步骤S269、13000rpm离心1min除去残留的Buffer，将核酸纯化柱移入干净的离心管中，加入50μl ddH2O洗脱质粒，静置1min后13000rpm离心1min，然后将洗脱的质粒送测序，测序正确的重组质粒即为A/B型嵌合HA质粒，于-20℃保存。
9.根据权利要求1～3或5～8任一项所述的含有A/B型嵌合HA质粒的嵌合病毒株拯救方法，其特征在于，所述步骤S3具体步骤如下：
步骤S31、将293T细胞培养在含有10％胎牛血清和1×Anti-Anti的DMEM中，以每孔1×106个293T细胞平铺于6孔细胞培养板中，培养至单层细胞的密度达到80％～90％后取出备用；
步骤S32、取B型流感病毒B/Yamagata/16/88 8质粒反向遗传操作系统中的7种质粒pBD-PB2、pBD-PB1、pBD-PA、pBD-NA、pBD-M、pBD-NP、pBD-NS及A/B型嵌合HA质粒各0.6μg，在含有250μl Opti-MEM的离心管中混匀，室温下静置5分钟；
步骤S33、在另一支离心管中加入250μl Opti-MEM，与其内的15μl转染试剂缓慢混匀；
步骤S34、将步骤S32所得混合质粒与步骤S33所得稀释好的转染试剂充分混匀，室温静置20分钟；
步骤S35、弃去6孔板中的细胞培养液，用Opti-MEM多次清洗6孔板，最后清洗后使每孔剩余200μl无血清培养基；
步骤S36、将混合质粒与转染试剂的混合液滴加入剩余200μl无血清培养基的孔中，33℃、5％CO2条件下培养；
步骤S37、12小时后换液，弃去6孔板中的液体，加入2ml含有浓度为0.2μg/ml TPCK胰酶的Opti-MEM培养液，33℃、5％CO2条件下培养；
步骤S38、72小时后收集转染细胞上清液，即为含有质粒A/B型嵌合HA的嵌合病毒株，于-70℃保存。
10.含有A/B型嵌合HA质粒的嵌合减毒株拯救方法，其特征在于，是在如权利要求9所述的含有A/B型嵌合HA质粒的嵌合病毒株的拯救方法的基础上，将其步骤S32“取B型流感病毒B/Yamagata/16/88 8质粒反向遗传操作系统中的7种质粒pBD-PB2、pBD-PB1、pBD-PA、pBD-NA、pBD-M、pBD-NP、pBD-NS及A/B型嵌合HA质粒各0.6μg”替换为“取B型流感病毒B/Yamagata/16/88 8质粒反向遗传操作系统中的6种质粒pBD-PB2、pBD-PB1、pBD-PA、pBD-NA、pBD-M、pBD-NP及pBD-NS110质粒、A/B型嵌合HA质粒各0.6μg”，拯救含有A/B型嵌合HA质粒的嵌合减毒株。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190621 |
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