CN111471696A - 一种构建d型流感病毒反向遗传操作系统的方法及其应用 - Google Patents

一种构建d型流感病毒反向遗传操作系统的方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111471696A
CN111471696A CN202010365861.5A CN202010365861A CN111471696A CN 111471696 A CN111471696 A CN 111471696A CN 202010365861 A CN202010365861 A CN 202010365861A CN 111471696 A CN111471696 A CN 111471696A
Authority
CN
China
Prior art keywords
virus
influenza
seq
constructing
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010365861.5A
Other languages
English (en)
Inventor
于志君
朱彤
吴家强
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Poultry Research Institute Shandong Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Poultry Research Institute Shandong Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Poultry Research Institute Shandong Academy of Agricultural Sciences filed Critical Poultry Research Institute Shandong Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN202010365861.5A priority Critical patent/CN111471696A/zh
Publication of CN111471696A publication Critical patent/CN111471696A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供一种构建D型流感病毒反向遗传操作系统的方法及其应用。所述构建方法包括：将包含D型流感病毒PB2、PB1、P3、HEF、NP、M和NS基因的重组载体共同导入宿主细胞进行包装得到重组病毒。本发明为D型流感病毒跨种传播机制的研究奠定了良好基础，并提供了可行的技术平台；同时有利于制备预防/治疗D型流感病毒的相关产品；另外，本发明构建方法还具有操作简便、成本较低等优点，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

一种构建D型流感病毒反向遗传操作系统的方法及其应用
技术领域
本发明属于病毒反向遗传系统构建技术领域，具体涉及一种构建D型流感病毒反向遗传系统的方法、构建所述反向遗传系统的引物及其应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
以往，流感病毒根据病毒抗原性的不同被分为A型流感病毒(Influenza A virus，IAV)、B型流感病毒(Influenza B virus，IBV)和C型流感病毒(Influenza C virus，ICV)三种。近年来有学者从猪体内分离到一种与C型流感病毒结构及基因组成相似的流感病毒，随后发现该病毒与IAV、IBV和ICV均无交叉抗原性，因此在2016年，国际病毒分类委员会将该病毒正式命名为D型流感病毒(Influenza D virus,IDV)。研究者们发现尽管空气传播能力有限，但D型流感病毒可以通过接触传播的方式在兽群中传播，对兽群的潜在危害不容忽视。因此加强对D型流感病毒致病性的研究以及研发疫苗候选株十分重要。
近年来反向遗传系统被广泛应用于流感病毒致病性和疫苗候选株研发之中。通过反向遗传系统，实现了从分子水平上对流感病毒基因组的操作，成为流感病毒研究与疫苗研发的重要工具之一。构建D型流感病毒反向遗传系统可为该病毒致病性研究和疫苗研发奠定重要的基础。
发明内容
针对背景技术记载的技术问题，本发明目的在于提供一种构建D型流感病毒反向遗传系统的方法。本发明首次成功构建D型流感病毒反向遗传系统，为D型流感病毒跨种传播机制的研究及相关医疗检测制品的研究开发奠定了良好基础。
基于以上技术效果，本发明提供以下技术方案：
本发明第一方面，提供一种构建D型流感病毒反向遗传系统的方法，所述方法包括将D型流感病毒的PB2、PB1、P3、HEF、NP、M和NS基因片段共同导入宿主细胞进行培养获得D型流感病毒。
本发明提供了一种D型流感病的七质粒反向遗传系统，相比经典的十二质粒反向遗传系统降低了交叉感染的概率，也提高了检测的效率。本发明将D型流感病毒的7个基因节段与线性化的双向转录表达载体pFluDD连接、转化、菌落PCR鉴定、摇菌和提质粒来获得7个含有病毒不同基因节段的感染性克隆；将7个感染性克隆按比例共转染293T细胞，将293T细胞悬液接种ST细胞，最终获得重组D型流感病毒，经验证所述D型流感病毒具有良好的效价。
本发明第二方面，提供第一方面所述构建D型流感病毒反向遗传系统的方法制备得到的重组D型流感病毒。
本发明第三方面，提供一组序列，所述序列如下：
SEQ ID NO:1
5’-ACCTCCGAAGTTGGGGGGGAGGCATAAGCAGAGGATGTCA-3’
SEQ ID NO:2
5’-TTTTGGGCCGCCGGGTTATTAGCAGTAGCAAGAGGATTTT-3’
SEQ ID NO:3
5’-ACCTCCGAAGTTGGGGGGGAGGCATAAGCAGAGGATTTTA-3’
SEQ ID NO:4
5’-ACCTCCGAAGTTGGGGGGGAGGCATAAGCAGGAGATTTAG-3’
SEQ ID NO:5
5’-ACCTCCGAAGTTGGGGGGGAAGCATAAGCAGGAGATTTTC-3’
SEQ ID NO:6
5’-ACCTCCGAAGTTGGGGGGGAGGCATAAGCAGGAGATTATT-3’
SEQ ID NO:7
5’-ACCTCCGAAGTTGGGGGGGAGGCATAAGCAGAGGATATTT-3’
SEQ ID NO:8
5’-ACCTCCGAAGTTGGGGGGGAAGCATAAGCAGGGGTGTACA-3’。
本发明第四方面，提供第三方面所述序列在构建重组D型流感病毒中的应用。
所述引物设计目的在于包含所述病毒基因阶段的编码区及部分非编码区，经本发明验证，上述序列作为引物对能够完整扩增相应基因的非编码区和编码区。
本发明第五方面，提供第二方面所述重组D型流感病毒或第三方面所述序列在以下任意一个方面的应用：
1)D型流感病毒跨种传播机制研究；
2)制备预防/治疗流感病毒产品。
以上一个或多个技术方案的有益效果是：
本发明基于D型流感病毒M628病毒株，采用反向遗传操作技术，成功拯救出重组D型流感病毒；D型流感病毒反向遗传系统的成功构建为D型流感病毒跨种传播机制的研究奠定了良好基础，并提供了可行的技术平台；同时有利于制备预防/治疗D型流感病毒的相关产品；另外，本发明构建方法还具有操作简便、成本较低等优点，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为实施例1中所述D型流感病毒反向遗传操作系统的技术路线图；
图2为实施例1中所述拯救的重组D型流感病毒RT-PCR电泳鉴定图片。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
正如背景技术所介绍的，现有技术中针对D型流感病毒的反向遗传构建还处于空白，提供可靠的D型流感病毒研究模型对于该病毒致病性和疫苗的研发具有重要意义。
为了解决如上的技术问题，本发明提出了一种构建D型流感病毒反向遗传系统的方法。
本发明第一方面，提供一种构建D型流感病毒反向遗传系统的方法，所述方法包括将D型流感病毒的PB2、PB1、P3、HEF、NP、M和NS基因片段共同导入宿主细胞进行培养获得D型流感病毒。
优选的，所述PB2、PB1、P3、HEF、NP、M、NS基因片段中的一个或几个来源于流感病毒D/bovine/Minnesota/628/2013(简称M628株)，其GenBank登记号为KF425652.1-KF425658.1。
优选的，所述PB2、PB1、P3、HEF、NP、M、NS基因片段通过构建重组载体的方式共同导入宿主细胞中。
进一步优选的，所述重组载体构建方式如下：将PB2、PB1、P3、HEF、NP、M或NS基因片段入表达载体的多克隆位点中进行构建；
在一些具体的实施方式中，所述表达载体为pFluDD，所述载体由pUC18载体(Thermo Fisher Scientific公司)改造而成，具体是将CMV启动子、鼠RNA聚合酶I终止子、人RNA聚合酶I启动子和SV40多聚腺苷酸化信号依次插入到pUC18载体上构建获得。
在又一具体实施方式中，为了提高连接效率，克服酶切位点的限制，采用同源重组酶来连接PCR产物与载体。
优选的，所述宿主细胞为293T细胞、COS7细胞、MDCK细胞、VERO细胞、HL-8细胞中的一种或多种，在更加优选的方案中，所述宿主细胞为293T细胞。
在一些具体的实施方式中，所述重组载体按比例共转染293T细胞，每种质粒加入0.6微克，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养48小时，转染后的293T细胞接种ST细胞，培养48小时，获得重组D型流感病毒。
在又一具体实施方式中，为保持质粒的纯度和完整性，采用脂质体3000作为转染试剂，以提高质粒转染效率。
本发明第二方面，提供第一方面所述构建D型流感病毒反向遗传系统的方法制备得到的重组D型流感病毒。
本发明第三方面，提供一组序列，所述序列如下：
SEQ ID NO:1
5’-ACCTCCGAAGTTGGGGGGGAGGCATAAGCAGAGGATGTCA-3’
SEQ ID NO:2
5’-TTTTGGGCCGCCGGGTTATTAGCAGTAGCAAGAGGATTTT-3’
SEQ ID NO:3
5’-ACCTCCGAAGTTGGGGGGGAGGCATAAGCAGAGGATTTTA-3’
SEQ ID NO:4
5’-ACCTCCGAAGTTGGGGGGGAGGCATAAGCAGGAGATTTAG-3’
SEQ ID NO:5
5’-ACCTCCGAAGTTGGGGGGGAAGCATAAGCAGGAGATTTTC-3’
SEQ ID NO:6
5’-ACCTCCGAAGTTGGGGGGGAGGCATAAGCAGGAGATTATT-3’
SEQ ID NO:7
5’-ACCTCCGAAGTTGGGGGGGAGGCATAAGCAGAGGATATTT-3’
SEQ ID NO:8
5’-ACCTCCGAAGTTGGGGGGGAAGCATAAGCAGGGGTGTACA-3’。
本发明第四方面，提供第三方面所述序列在构建重组D型流感病毒中的应用。
本发明第五方面，提供第二方面所述重组D型流感病毒或第三方面所述序列在以下任意一个方面的应用：
1)D型流感病毒跨种传播机制研究；
2)制备预防/治疗流感病毒产品。
优选的，所述产品为药物或试剂盒。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1D型流感病毒基因组
根据GenBank上公布的D型流感病毒亲本病毒D/bovine/Minnesota/628/2013(简称M628株)的基因组序列，送青岛擎科梓熙生物技术有限公司合成病毒基因。
实施例2基因节段的PCR扩增
(1)根据M628株的基因序列来设计D型流感病毒7个基因节段的扩增引物，PCR引物的序列如下表1所示：
表1：D型流感病毒基因节段PCR扩增引物
Figure BDA0002476720970000061
Figure BDA0002476720970000071
(2)PCR的反应体系为50μL。反应体系的成分如下所示：5×Phusion HF缓冲液10μL，dNTP(10mM)1μL，ddH2O 34.5μL，上游、下游引物各1μL，携带目的基因的质粒2μL，PhusionDNA聚合酶0.5μL。PCR反应条件如下：98℃预变性30s，35个循环(98℃变性，10s；60℃复性，30s；72℃延伸，2min)，72℃总延伸10min，4℃保存∞；
(3)1％琼脂糖凝胶电泳，120V、30min，电泳鉴定PCR产物长度，鉴定正确的PCR产物待回收。
实施例3D型流感病毒感染性克隆制备
(1)按胶回收试剂盒的说明来切胶回收D型流感病毒的PCR产物；
(2)将线性化双向转录表达载体pFluDD与回收后的PCR产物通过同源重组的方式连接。连接体系10μL，连接体系成分如下所示：ddH2O 4μL，PCR产物1μL，同源重组酶5μL。连接条件为：50℃，15min；
(3)连接产物的转化和摇菌：
a)将DH5α感受态置于冰上15min；
b)连接产物加入到感受态中；
c)冰上30min；
d)42℃热激90s；
e)冰上3min，而后加入1ml的LB培养基；
f)37℃、200rpm摇菌1h；
g)菌液均匀涂抹在氨苄抗性的LB平板上；
h)倒置37℃温箱12h；
i)挑取菌落PCR鉴定为阳性的单菌落摇菌；
j)37℃、200rpm摇12-14h；
k)按照QIAGEN质粒小提试剂盒说明书提取质粒并测序鉴定；
(4)测序鉴定正确的质粒即为制备完成的感染性克隆，将7个感染性克隆命名如下pFluDD-M628-PB2、pFluDD-M628-PB1、pFluDD-M628-P3、pFluDD-M628-HEF、pFluDD-M628-NP、pFluDD-M628-M和pFluDD-M628-NS；感染性克隆pFluDD-M628-PB2携带D型流感病毒的PB2基因，感染性克隆pFluDD-M628-PB1携带D型流感病毒的PB1基因，感染性克隆pFluDD-M628-P3携带D型流感病毒的P3基因，感染性克隆pFluDD-M628-HEF携带D型流感病毒的HEF基因，感染性克隆pFluDD-M628-NP携带D型流感病毒的NP基因，感染性克隆pFluDD-M628-M携带D型流感病毒的M基因，感染性克隆pFluDD-M628-NS携带D型流感病毒的NS基因。
实施例4感染性克隆共转染293T细胞拯救重组的D型流感病毒
(1)6孔细胞培养板加入293T细胞，37℃、5％CO2的细胞培养箱过夜培养成单层细胞；
(2)取一个新的1.5mL的EP管，加入250μl的无血清的OPTI-MEM，并加入拯救特定重组病毒所需的7个感染性克隆FluDD-M628-PB2、pFluDD-M628-PB1、pFluDD-M628-P3、pFluDD-M628-HEF、pFluDD-M628-NP、pFluDD-M628-M和pFluDD-M628-NS，每个感染性克隆加入0.6μg，并加入10μL的P3000试剂，轻柔混匀；
(3)再一个新的取1.5mL的EP管，加入250μl的无血清的OPTI-MEM，再加入16μL的脂质体3000(Lipofectamine 3000)，轻柔混匀，静置5min；
(4)将(3)中EP管中的液体加入到(2)中的EP管中，轻柔混匀，静置30min；
(5)弃去细胞液，加入(4)中的混合液于细胞孔中；
(6)37℃、5％CO2培养6h后换液，弃去原液，并加入新的2ml无血清OPTI-MEM(内含2μg/ml终浓度的TPCK胰酶)，37℃、5％CO2培养48h；
(7)293T细胞悬液接种ST细胞，培养48h；
(8)用0.75％鸡红细胞检测ST细胞上清液的血凝效价为24。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省农业科学院家禽研究所（山东省无特定病原鸡研究中心）
<120> 一种构建D型流感病毒反向遗传操作系统的方法及其应用
<130> 2010
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acctccgaag ttggggggga ggcataagca gaggatgtca 40
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ttttgggccg ccgggttatt agcagtagca agaggatttt 40
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
acctccgaag ttggggggga ggcataagca gaggatttta 40
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
acctccgaag ttggggggga ggcataagca ggagatttag 40
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
acctccgaag ttggggggga agcataagca ggagattttc 40
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
acctccgaag ttggggggga ggcataagca ggagattatt 40
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
acctccgaag ttggggggga ggcataagca gaggatattt 40
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
acctccgaag ttggggggga agcataagca ggggtgtaca 40

Claims (10)

1.一种构建D型流感病毒反向遗传系统的方法，其特征在于，所述方法包括将D型流感病毒的PB2、PB1、P3、HEF、NP、M和NS基因片段共同导入宿主细胞进行培养获得D型流感病毒。
2.如权利要求1所述构建D型流感病毒反向遗传系统的方法，其特征在于，所述PB2、PB1、P3、HEF、NP、M、NS基因片段来源于流感病毒M628株，其GenBank登记号为KF425652.1-KF425658.1。
3.如权利要求1所述构建D型流感病毒反向遗传系统的方法，其特征在于，所述PB2、PB1、P3、HEF、NP、M、NS基因片段通过构建重组载体的方式共同导入宿主细胞中。
4.如权利要求3所述构建D型流感病毒反向遗传系统的方法，其特征在于，所述重组载体构建方式如下：将PB2、PB1、P3、HEF、NP、M或NS基因片段入表达载体的多克隆位点中进行构建；
优选的，所述表达载体为pFluDD，所述载体由pUC18载体(Thermo Fisher Scientific公司)改造而成，具体是将CMV启动子、鼠RNA聚合酶I终止子、人RNA聚合酶I启动子和SV40多聚腺苷酸化信号依次插入到pUC18载体上构建获得。
5.如权利要求1所述构建D型流感病毒反向遗传系统的方法，其特征在于，所述宿主细胞为293T细胞、COS7细胞、MDCK细胞、VERO细胞、HL-8细胞中的一种或多种，优选的，所述宿主细胞为293T细胞。
6.权利要求1-5任一项所述构建D型流感病毒反向遗传系统的方法制备得到的重组D型流感病毒。
7.一组序列，其特征在于，所述序列如下：
SEQ ID NO:1所示：
5’-ACCTCCGAAGTTGGGGGGGAGGCATAAGCAGAGGATGTCA-3’
SEQ ID NO:2所示：
5’-TTTTGGGCCGCCGGGTTATTAGCAGTAGCAAGAGGATTTT-3’
SEQ ID NO:3所示：
5’-ACCTCCGAAGTTGGGGGGGAGGCATAAGCAGAGGATTTTA-3’
SEQ ID NO:4所示：
5’-ACCTCCGAAGTTGGGGGGGAGGCATAAGCAGGAGATTTAG-3’
SEQ ID NO:5所示：
5’-ACCTCCGAAGTTGGGGGGGAAGCATAAGCAGGAGATTTTC-3’
SEQ ID NO:6所示：
5’-ACCTCCGAAGTTGGGGGGGAGGCATAAGCAGGAGATTATT-3’
SEQ ID NO:7所示：
5’-ACCTCCGAAGTTGGGGGGGAGGCATAAGCAGAGGATATTT-3’
SEQ ID NO:8所示：
5’-ACCTCCGAAGTTGGGGGGGAAGCATAAGCAGGGGTGTACA-3’。
8.权利要求7所述序列在构建重组D型流感病毒中的应用。
9.权利要求6所述重组D型流感病毒或权利要求7所述序列在以下任意一个方面的应用：
1)D型流感病毒跨种传播机制研究；
2)制备预防/治疗流感病毒产品。
10.如权利要求9所述重组D型流感病毒或序列在以下方面的应用，其特征在于，所述产品为药物或试剂盒。
CN202010365861.5A 2020-04-30 2020-04-30 一种构建d型流感病毒反向遗传操作系统的方法及其应用 Pending CN111471696A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010365861.5A CN111471696A (zh) 2020-04-30 2020-04-30 一种构建d型流感病毒反向遗传操作系统的方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010365861.5A CN111471696A (zh) 2020-04-30 2020-04-30 一种构建d型流感病毒反向遗传操作系统的方法及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111471696A true CN111471696A (zh) 2020-07-31

Family

ID=71756090

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010365861.5A Pending CN111471696A (zh) 2020-04-30 2020-04-30 一种构建d型流感病毒反向遗传操作系统的方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111471696A (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109913496A (zh) * 2019-04-08 2019-06-21 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 含有a/b型嵌合ha质粒的嵌合病毒株和嵌合减毒株拯救方法
CN110724709A (zh) * 2019-10-25 2020-01-24 山东省农业科学院家禽研究所 一种h13n8亚型流感病毒的拯救方法及应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109913496A (zh) * 2019-04-08 2019-06-21 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 含有a/b型嵌合ha质粒的嵌合病毒株和嵌合减毒株拯救方法
CN110724709A (zh) * 2019-10-25 2020-01-24 山东省农业科学院家禽研究所 一种h13n8亚型流感病毒的拯救方法及应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YU JIESHI等: "《Development and Characterization of a Reverse-Genetics System for Influenza D Virus》", 《JOURNAL OF VIROLOGY》 *
夏青: "D型流感病毒反向遗传系统的构建及其HE基因免疫原性的研究", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士)基础科学辑》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2733834C1 (ru) Искусственный ген EctoS_SC2, кодирующий эктодомен гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2 с C-концевым тримеризующим доменом, рекомбинантная плазмида pStem-rVSV-EctoS_SC2, обеспечивающая экспрессию искусственного гена, и рекомбинантный штамм вируса везикулярного стоматита rVSV-EctoS_SC2, используемый для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2
EP1035209A1 (en) Stable recombinant influenza viruses free of helper viruses
WO1997016539A1 (fr) Virus sendai recombinant
CA2406100A1 (en) Dna transfection system for the generation of infectious influenza virus
CN110079541B (zh) 一种构建冠状病毒感染性克隆的方法及其应用
Flick et al. Functional analysis of the noncoding regions of the Uukuniemi virus (Bunyaviridae) RNA segments
CN111218477B (zh) 靶向感染哺乳动物细胞的禽4型腺病毒载体及其应用
Du et al. Efficient replication and generation of recombinant bovine adenovirus‐3 in nonbovine cotton rat lung cells expressing I‐SceI endonuclease
WO2023227124A1 (zh) 一种构建mRNA体外转录模板的骨架
CN111363727B (zh) 携带幽门螺杆菌的重组流感病毒、宿主细胞及其制备方法与应用
CN113308493A (zh) 新型冠状病毒Ad26腺病毒载体疫苗及其制备方法与应用
Mebatsion et al. Identification of a mutation in editing of defective Newcastle disease virus recombinants that modulates P-gene mRNA editing and restores virus replication and pathogenicity in chicken embryos
CN111471696A (zh) 一种构建d型流感病毒反向遗传操作系统的方法及其应用
CN112111467B (zh) 一种基因vii型新城疫标记疫苗株及其制备方法与应用
RU2326943C1 (ru) Способ создания рекомбинантного аденовируса птиц для вакцинации против вируса гриппа птиц н5n1
CN109957550B (zh) 流感病毒的拯救方法及其组合物
CN113736799A (zh) 山羊副流感病毒3型感染性cDNA克隆构建方法及其应用
AU2021301381A1 (en) Compositions for genome editing and methods of use thereof
CN113481171A (zh) 一种携带hiv-1基因的重组流感病毒株及其制备方法与应用
CN110628819A (zh) 一种构建h13n2亚型流感病毒反向遗传操作系统的方法及其应用
CN110724709A (zh) 一种h13n8亚型流感病毒的拯救方法及应用
KR102129584B1 (ko) 목적 유전자를 선형 벡터에 삽입하는 방법
RU2750882C1 (ru) Гены, кодирующие открытые рамки считывания М и L-сегментов ККГЛ, и рекомбинантные конструкции, обеспечивающие экспрессию структурных гликопротеинов и РНК-зависимой РНК-полимеразы (L) вируса Крым-Конго геморрагической лихорадки
WO2022166176A1 (zh) 一种用于表达外源蛋白的新型流感病毒载体及其构建方法
CN117448284A (zh) 一种稳定传代的表达egfp的重组坦布苏病毒及构建方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200731