CN105194659B - 截短型钠钾ATP酶β亚单位的药物用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药领域，尤其涉及截短型钠钾ATP酶β亚单位的药物用途。截短型钠钾ATP酶β亚单位在对胰岛移植缺血再灌注损伤的保护作用的药物用途。明确tNKAβ对胰岛细胞缺血再灌注损伤的保护，进一步优化防治肾脏缺血再灌注损伤的措施。揭示tNKAβ在胰岛细胞缺血再灌注损伤保护作用的机制，为临床实验研究提供理论依据。有益效果：能在胰岛缺血再灌注作用中有效改变营养不足的状况，改善缺氧的情况。

Description

截短型钠钾ATP酶β亚单位的药物用途

技术领域

本发明涉及医药领域，尤其涉及截短型钠钾ATP酶β亚单位的药物用途。

背景技术

缺血再灌注损伤是移植器官早期无功能及长期存活的主要因素

机体组织器官正常代谢、功能的维持，有赖良好的血液循环。各种原因造成的局部组织器官的缺血，常常使组织细胞发生缺血性损伤（ischemia injury）。缺血后再灌注具有两重性,多数情况下,缺血后再灌注使组织、器官功能得到恢复,损伤的结构得到修复。但是有时缺血后再灌注,不仅不能使组织、器官功能恢复,反而加重组织、器官的功能障碍和结构的损伤,这种现象称为缺血再灌注损伤（ischemia -reperfusion injury）。该概念首先由Jennings于1960年提出。缺血再灌注损伤在许多重要器官包括心、肝、肺、肾、胰岛、胃肠道等均可发生。

胰岛移植治疗糖尿病的现状及存在问题

成人胰岛移植一直是糖尿病研究领域的热点，但由于胰岛分离纯化技术的缺陷，使移植所需胰岛的数量、纯度等达不到理想要求，移植效果较差，加之胎胰本身获取的胰岛数量少、存在伦理学等问题，因而限制了在临床上的开展和应用，胰岛移植一度陷入低谷。近年来随着胰岛分离、纯化技术的改进和提高，在高纯度胰岛移植方面取得了较快发展。2000年，加拿大Edmonton的Shapiro实验室改良免疫抑制剂的用药方案，取得了连续7例胰岛移植病例的成功，成为胰岛移植历史上具有里程碑意义的事件。自那以后，1型糖尿病患者接受胰岛移植（Edmonton方案）的数量呈指数增长，到2005年，全球共有471例1型糖尿病接受Edmonton方案的治疗，短短5年的数量比过去30年的胰岛移植数量都多。在北美的三个中（Edmonton、Miami、Minnesota），118例受者中，1年不依赖胰岛素率达82%。在对Edmonton方案进行国际多中心验证的研究中，其中三个主要的中心取得了80%以上的成功率。虽然胰岛移植取得了令人鼓舞的成绩，但是胰岛移植在实施过程中仍存在许多不足，极大限制了胰岛移植的进一步开展。胰岛的营养不足导致的细胞缺氧损伤、即刻血液介导的炎症反应(instant blood-mediated inflammatory reaction，IBMIR)[6]和免疫排斥是影响胰岛移植开展和效果主要障碍。因此，如何解决改善胰岛移植物的低氧状态、减轻免疫性损伤是胰岛移植亟待解决的问题。

钠钾ATP酶，又被称为钠钾泵，几乎分布于所有哺乳动物细胞膜上。主要由α和β亚单位构成，主要通过对细胞内外钠钾离子浓度的调节，来维持细胞静息电位,调节细胞体积等功能。近年来，很多不同的试验室几乎同时发现，钠钾ATP酶除了具有离子运输的功能外，在心肌细胞内信号通路传导中发挥着重要的作用。钠钾ATP酶通过传递哇巴因结合到细胞膜的信号来调控蛋白酪氨酸磷酸化，哇巴因触发的蛋白磷酸化事件的下游信号包括丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路的激活，线粒体活性氧（ROS）的产生以及磷脂酶C（PLC）和三磷酸肌醇（IP3）的受体激活（IP3受体）。蛋白质相互作用在钠钾ATP酶介导的信号转导中发 挥着非常重要的作用。

但是截短型的钠钾ATP酶β亚单位对胰岛的缺血再灌注损伤的防护作用尚未见到研究，也没有相关药物。

发明内容

发明的目的：为了提供一种效果更好的截短型钠钾ATP酶β亚单位的药物用途，具体目的见具体实施部分的多个实质技术效果。

为了达到如上目的，本发明采取如下技术方案：

方案一：

截短型钠钾ATP酶β亚单位在对胰岛移植缺血再灌注损伤的保护作用的药物用途。

方案二：

截短型钠钾ATP酶β亚单位在制备对胰岛移植缺血再灌注损伤的保护作用的药物中的用途。

方案三：

截短型钠钾ATP酶β亚单位，其特征在于，其蛋白质序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成。

方案四：

截短型钠钾ATP酶β亚单位，其特征在于，其用于表达的基因序列为SEQ ID NO.2所示的序列。

方案五：

如上任一所述的截短型钠钾ATP酶β亚单位的制备方法，其特征在于，截短型钠钾ATP酶β亚单位的制备:用胰岛细胞RNA，逆转录为cDNA后，以tNKAβ引物，该引物的正义链：5’-ctc gag atg ctg aaa ccc acg tac cag -3’，反义链：5’-gga tcc tca gct ctt aacttc aat-3’，以此进行扩增，回收后目的产物克隆至pET-15b表达载体中，表达纯化；

基因序列为SEQ ID NO.3所示的序列；

最后得到蛋白质序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

采用如上技术方案的本发明，相对于现有技术有如下有益效果：能在胰岛缺血再灌注作用中有效改变营养不足的状况，改善缺氧的情况。

附图说明

为了进一步说明本发明，下面结合附图进一步进行说明：

图1，钠钾ATP酶激活的细胞信号传导通路；

图2为治疗组胰岛细胞胰岛素（中部以及右侧）和CD31(左侧)表达情况。可见胰岛呈椭圆形，表面颗粒状，包膜完整。胰岛素分泌功能较强，且内部可见血管内皮细胞表达。

图3为治疗组胰岛细胞胰岛素表达（免疫组织化学）

图4为Western Blot 揭示TNKAβ对胰岛组织抗缺血再灌注损伤能力的分子机制与ERK和PKC-ε活化密切相关。1，对照组；2 TNKAβ（2.5mg/kg）；3，假手术组。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施例进行说明，实施例不构成对本发明的限制：

总体思路：

首先制备tNKAβ，分离纯化培养大鼠胰岛细胞，模拟体外缺血再灌注条件，鉴定tNKAβ对胰岛细胞耐受缺氧条件下的保护作用，从与细胞存活相关的信号通路蛋白激酶活化着手，深入研究PI3K/Akt，ERK 及PKCε等蛋白激酶在胰岛细胞缺血再灌注损伤中所发挥的作用，并研究其相关机制；之后建立SD（Sprague-Dawley）大鼠胰岛移植模型，进一步研究上述蛋白激酶活化水平与缺血再灌注组织中ROS 水平，中性粒细胞浸润程度以及各种炎症因子的表达水平的关系，在实验动物模型水平验证tNKAβ在胰岛缺血再灌注损伤中的保护作用。

β对胰岛细胞的保护作用的研究

(1)截短型钠钾ATP酶β亚单位的制备:首先提取外周血淋巴细胞RNA（可以从脱离人体的样本中提取），逆转录为cDNA后，以tNKAβ引物，

正义链：5’-ctc gag atg ctg aaa ccc acg tac cag -3’反义链：5’-gga tcctca gct ctt aac ttc aat-3’进行扩增，回收后目的产物克隆至pET-15b表达载体中，表达纯化。

基因序列：CTG AAA CCC ACG TAC CAG GAC CGT GTG GCC CCG CCA GGA TTG ACA

蛋白序列：L K P T Y Q D R V A P P G L T

基因序列：CAG ATT CCT CAG ATC CAA AAG ACT GAA ATT TCC TTC CGT CCT AAT

蛋白序列：Q I P Q I Q K T E I S F R P N

基因序列：GAC CCC AAG AGC TAC GAG GCC TAT GTG CTA AAC ATC ATC AGG TTC

蛋白序列：D P K S Y E A Y V L N I I R F

基因序列：CTG GAA AAG TAC AAA GAT TCG GCC CAG AAG GAC GAC ATG ATT TTC

蛋白序列：L E K Y K D S A Q K D D M I F

基因序列：GAG GAT TGT GGC AGT ATG CCC AGT GAA CCC AAG GAG CGG GGA GAG

蛋白序列：E D C G S M P S E P K E R G E

基因序列：TTC AAT CAT GAA CGA GGA GAG CGC AAG GTG TGC AGG TTC AAG CTT

蛋白序列：F N H E R G E R K V C R F K L

基因序列：GAC TGG CTG GGG AAC TGC TCT GGT CTC AAT GAT GAA TCC TAC GGC

蛋白序列：D W L G N C S G L N D E S Y G

基因序列：TAC AAA GAG GGG AAG CCC TGT ATC ATT ATC AAG CTC AAC CGA GTG

蛋白序列：Y K E G K P C I I I K L N R V

基因序列：CTG GGC TTC AAA CCT AAG CCT CCC AAG AAT GAA TCC TTG GAG ACT

蛋白序列：L G F K P K P P K N E S L E T

基因序列：TAC CCT CTG ACG ATG AAG TAT AAT CCA AAC GTC CTA CCT GTC CAG

蛋白序列：Y P L T M K Y N P N V L P V Q

基因序列：TGC ACT GGC AAG CGC GAT GAG GAT AAG GAT AAA GTT GGA AAC ATA

蛋白序列：C T G K R D E D K D K V G N I

基因序列：GAG TAC TTT GGG ATG GGC GGA TTC TAT GGC TTT CCT CTG CAG TAC

蛋白序列：E Y F G M G G F Y G F P L Q Y

基因序列：TAT CCC TAC TAC GGC AAA CTC CTG CAG CCC AAG TAC CTG CAG CCC

蛋白序列：Y P Y Y G K L L Q P K Y L Q P

基因序列：CTG CTG GCC GTG CAG TTC ACC AAC CTC ACC TTG GAC ACT GAA ATC

蛋白序列：L L A V Q F T N L T L D T E I

基因序列：CGC ATT GAG TGT AAG GCG TAT GGT GAG AAC ATT GGG TAC AGT GAG

蛋白序列：R I E C K A Y G E N I G Y S E

基因序列：AAA GAC CGT TTT CAG GGA CGC TTT GAT GTA AAA ATT GAA GTT AAG

蛋白序列：K D R F Q G R F D V K I E V K

基因序列：AGC

蛋白序列：S

(2) 采用免疫学方法检测tNKAβ免疫学特性；

(3) 体外模拟缺血再灌注条件检测tNKAβ对胰岛细胞抗缺血再灌注损伤的保护作用；

(4) 在分子水平上研究tNKAβ对胰岛细胞抗缺血再灌注损伤的保护作用机制。

对胰岛移植模型胰岛细胞的保护作用

(1)SD 大鼠胰岛移植模型的建立。

(2)利用SD大鼠胰岛移植模型检测tNKAβ对胰岛细胞的保护作用。

(3)检测模型鼠胰岛移植后各项生化指标组织病理形态学改变。

(4) tNKAβ对移植胰岛细胞缺血再灌注损伤的保护作用机制的研究。

目前对于缺血/再灌注损伤的研究，绝大部分是在实验动物身上进行的，值得临床上参考的防治措施多为物理治疗方法，鲜有生物治疗的药物出现。本项目基于tNKAβ在肾脏缺血再灌注损伤中的保护作用的发现，以及tNKAβ通过诱导钠钾ATP酶活化而激活MAPK及PI3K/Akt信号传导通路的机制，首次提出了研究tNKAβ在胰岛细胞缺血再灌注损伤中的保护作用及机制。本项目的实施对于填补缺血再灌注损伤生物治疗的空缺，完善目前防治胰岛细胞缺血再灌注损伤的措施具有举足轻重的意义，同时对于其它组织器官缺血再灌注损伤的防治也具有深远的意义。

β对胰岛细胞抗缺血再灌注损伤的保护作用

(1) MTT 法检测tNKAβ对胰岛细胞抗缺血再灌注损伤能力的影响：胰岛细胞接种于6孔板培养过夜。细胞分为6组，包括空白对照组，阴性对照组（纯化EGFP）和实验组（tNKAβ），PI3K/Akt 激酶抑制剂组（LY294002+ tNKAβ），ERK 激酶抑制剂组（PD98059+ tNKAβ）和PKCε激酶抑制剂组（EAVSLKPT+ tNKAβ）,每组加入相应的蛋白及激酶抑制剂，1 小时后PBS洗涤细胞两次，加入致缺氧溶液（5 mM C3H5NaO3，20 mM 2-DOG，20 mM Na2S2O4）模拟体外缺氧条件处理15 分钟， 然后换用新鲜DMEM 培养液继续培养细胞10 分钟，之后每孔加入20ulMTT 溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。小心吸去孔内培养液，每孔加入150ul 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。酶联免疫检测仪OD570nm 处测量各孔的光密度值。

(2) Western Blot 揭示tNKAβ对胰岛细胞抗缺血再灌注损伤能力的分子机制：胰岛细胞分组同MTT 法，每组加入相应的蛋白及激酶抑制剂。37℃培养于1 小时后收集细胞，RIPA 裂解液裂解细胞，细胞质蛋白行10% SDS-PAGE 分析后，转印于硝酸纤维素膜上，检测与细胞存活相关的PI3K/Akt 激酶，ERK 激酶及PKCε激酶的磷酸化水平。

(3)胰岛细胞形态活力功能测定：胰岛细胞分组同MTT 法，倒置显微镜每天观察培养细胞的生长情况并纪录，透射电镜及扫描电镜观察随时的延长细胞微观结构的变化，活力检测（AO/PI 染色），同时测定胰岛素和淀粉酶的含量。

β对大鼠胰岛移植模型缺血再灌注损伤的保护作用

(1) 糖尿病大鼠模型制作：雄性SD大鼠按55mg/kg的剂量给大鼠腹腔一次性注射链脲佐菌素（STZ）溶液，诱发糖尿病模型。造模120h 后，以随机血糖≥13.8mmol/L为造模成功。

(2) 实验分组：160只造模成功的糖尿病模型SD大鼠随机分为四组，组内又分为4个小组，每小组10只大鼠。1)治疗组：术前60 min尾静脉注射tNKAβ2.5mg/kg； 2)空白对照组：术前60 min尾静脉注射等量生理盐水；3）阴性对照组: 术前60 min尾静脉注射等量对照蛋白2.5mg/kg；4）假手术组:处理同空白对照组。糖尿病模型SD大鼠术前12h禁食，自由进水，戊巴比妥钠30mg/kg腹腔注射麻醉后，沿腹正中线切开腹腔，假手术组仅行左肾暴露,其余组左肾暴露后肾包膜下输注200IEQ胰岛细胞。术后3天之内给予SD大鼠叔丁啡（0.006mg/kg）镇痛，7天之内给予恩诺沙星（25mg/kg）抗菌消炎。每天观察SD大鼠伤口是否感染，并称量体重，及时处理感染，减轻SD大鼠痛苦。实验结束后，SD大鼠在笼中以4.5L/min 的CO2流量保持至安乐死。

(3) 观察指标于手术后1，3，5，7 天分别留取血清及胰岛组织1)一般性指标：观察移植前后动物的摄食量、饮水量及体重变化。2)生化检测：手术前后眼睛框后取血，血液经离心后取血清测定空腹血糖水平及胰岛素含量。3)各组血清中IL-2、IL-4、IL-10、TGF-β细胞因子水平及胰岛组织炎症介质mRNA 水平的检测：流式微载体技术检测血清炎症介质水平；实时定量逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)法测定胰岛组织内肿瘤坏死因子a(TNF-a)、白细胞介素6(IL-6)、IL-18 和IL-17 mRNA 的水平。4) 胰岛组织病理形态学观察：再灌注后1,3,5,7 天取各组胰岛组织，10％中性缓冲甲醛固定，石蜡包埋，切成4mm 厚的切片，HE染色，在普通光学显微镜下观察，并用免疫荧光双标CD31及胰岛素，激光共聚焦下观察胰岛细胞的胰岛素分泌及血管新生情况 5) Western Blot 揭示TNKAβ对胰岛组织抗缺血再灌注损伤能力的分子机制：新鲜胰岛组织加适量RIPA裂解液，组织研磨器研磨后，12000g离心取上清，行10%SDS-PAGE分析，转印于硝酸纤维素膜上，检测与细胞存活相关的PI3K/Akt激酶，ERK激酶及PKCε激酶的磷酸化水平。6)统计学分析：实验数据以均数±标准差表示，多组间比较用单因素方差分析，用SPSS13.0统计软件进行统计分析，P<0.05认为有统计学意义。

移植前各组糖尿病大鼠体重无明显差异（P＞0.05），移植后假手术组体重持续下降，其余3组体重均逐渐升高，但治疗组体重增加最多，增长优势明显，且多饮、多食、多尿症状明显改善，皮毛干净，反应灵敏，垫料干燥。

假手术组血糖较移植前无明显下降（P＞0.05），其余各组移植后3d血糖开始下降，与移植前比较差异有显著性（P＜0.01）。治疗组移植后血糖较空白对照、阴性对照组血糖下降明显，组间比较差异有显著性（P＜0.01） （表１）

血清大鼠胰岛素与血糖变化相似，假手术组胰岛素无明显变化，其余各组大鼠在移植后3d开始胰岛素水平均明显升高，假手术组：1.92±0.31 μU/ml，治疗组：7.87±0.45μU/ml，空白对照组：7.14.±0.62 μU/ml，阴性对照组：7.23±0.51 μU/ml；空白对照组大鼠移植后7 d 维持在5.32±0.26 μU/ml，至移植后14 d已降至移植前水平；阴性对照组大鼠胰岛素水平下降趋势同空白组相似；治疗组大鼠胰岛素水平在移植后7 d 有所上升，达到12.41±0.63 μU/ml，此后也出现缓慢下降但仍能维持在较高水平；分析结果显示，各组间血清胰岛素水平有显著性差异（P<0.05），其中以治疗组血糖水平维持最佳。

移植后14天，检测各组细胞因子表达水平，治疗组IL-10、IL-4及TGF-β较其他3组水平升高，IL-2较空白对照组及阴性对照组水平明显降低，差异具统计学意义（P＜0.05）。

表1 各种大鼠术后血糖变化 （n=10，x±s，mmol/L）

表2 移植后14天大鼠血清细胞因子浓度（n=10，x±s，ng/L）

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本领域的技术人员应该了解本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的范围内。

<110> 西安交通大学第一附属医院

<120> 截短型钠钾ATP酶β亚单位的药物用途

<160> 3

<210> 1

<211> 241 <212> PRT <213> 人工序列

<400> 1

LKPTYQDRVAPPGLTQIPQIQKTEISFRPNDPKSYEAYVLNIIRFLEKYKDSAQKDDMIFEDCGSMPSEPKERGEFNHERGERKVCRFKLDWLGNCSGLNDESYGYKEGKPCIIIKLNRVLGFKPKPPKNESLETYPLTMKYNPNVLPVQCTGKRDEDKDKVGNIEYFGMGGFYGFPLQYYPYYGKLLQPKYLQPLLAVQFTNLTLDTEIRIECKAYGENIGYSEKDRFQGRFDVKIEVKS

<210>2

<211> 723 <212> DNA <213>人工序列

<400>2

ctgaa acccacgtac caggaccgtg tggccccgcc

aggattgaca cagattcctc agatccaaaa gactgaaatt tccttccgtc ctaatgaccc

caagagctac gaggcctatg tgctaaacat catcaggttc ctggaaaagt acaaagattc

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<110> 西安交通大学第一附属医院

<120> 截短型钠钾ATP酶β亚单位的药物用途

<160> 3

<210> 1

<211> 241

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

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<210>2

<211> 723

<212> DNA

<213>人工序列

<400>2

ctgaa acccacgtac caggaccgtg tggccccgcc

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Claims (2)

1.截短型钠钾ATP酶β亚单位用于制备对胰岛移植缺血再灌注损伤的保护作用的药物中的用途，所述的截短型钠钾ATP酶β亚单位的蛋白序列为SEQ ID NO.1。

2.一种对胰岛移植缺血再灌注损伤具有保护作用的药物，其特征在于，所述药物为截短型钠钾ATP酶β亚单位，所述的截短型钠钾ATP酶β亚单位的蛋白序列为SEQ ID NO.1。