CN105349493B - Braf继发突变的耐药胃肠道间质瘤细胞系及裸鼠模型构建 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种BRAF继发突变的耐药胃肠道间质瘤细胞系及裸鼠模型构建。保藏名为甲磺酸伊马替尼耐药胃肠道间质瘤细胞系GIST‑1114，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号:CCTCC NO:C201501。所述GIST‑1114细胞系包含KIT基因exon11 V559D原发突变和BRAF基因exon15 V600E继发突变；GIST‑1114耐药细胞系的移植瘤模型的组织形态学特征：发生耐药后组织形态学和免疫表型均发生了变化，从梭形细胞型变成混合细胞型，部分区域可见横纹肌肉瘤分化，横纹肌肉瘤分化区域CD117阴性表达，但是Desmin和Myogenin呈现阳性表达。本发明可以用于解决临床上部分GIST无KIT基因二次突变的imatinib继发耐药的问题。

Description

BRAF继发突变的耐药胃肠道间质瘤细胞系及裸鼠模型构建

技术领域

本发明属肿瘤生物学领域，涉及一种胃肠道间质瘤耐药细胞系。

背景技术

胃肠道间质瘤（gastrointestinal stromal tumor，GIST）是位于胃肠道或腹腔内的表达KIT（CD117）蛋白的间叶源性肿瘤，绝大多数存在KIT基因的功能获得性突变，KIT基因突变在GIST发病过程中发挥关键的作用。Imatinib是一种口服的ATP的竞争性抑制剂，能竞争性地结合于KIT酪氨酸激酶功能区的ATP结合位点，阻断磷酸基团从ATP上转移到蛋白质底物（KIT，PDGFRA，ABL以及BCR-ABL融合蛋白）的酪氨酸残基，从而阻断了失控的信号传导通路，进而阻止细胞的持续增殖，并恢复细胞的正常凋亡程序，是靶向治疗胃肠道间质瘤的重要药物。然而一般在Imatinib平均治疗24个月后，将产生耐药，因此研究肿瘤耐药机制以及防止或逆转肿瘤耐药的发生对于提高靶向治疗效果十分重要。近年来，肿瘤耐药细胞系己成为重要的工具，大量研究利用它来揭示肿瘤细胞的耐药机制、研究肿瘤细胞的耐药性逆转、开发及评价新的抗癌方法等。建立肿瘤耐药细胞系具有重要应用价值。

发明内容

本发明的目的是建立胃肠道间质瘤Imatinib耐药细胞系，为以下相关研究提供耐药肿瘤细胞模型:研究耐药肿瘤细胞形态学及生物学特点、研究肿瘤多药耐药机制、分析靶向治疗药物敏感性及筛选靶向治疗药物、开发肿瘤耐药逆转药物、研发更有效的肿瘤治疗方法等。

一种BRAF继发突变的耐药胃肠道间质瘤细胞系，保藏名为

甲磺酸伊马替尼耐药的胃肠道间质瘤细胞系GIST-1114，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号: CCTCC NO: C201501，保藏日期：2015年1月22日；地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学，邮编430072。

所述GIST-1114细胞系包含KIT基因exon11 V559D原发突变和BRAF基因exon15V600E继发突变；GIST-1114耐药细胞系的移植瘤模型的组织形态学特征：发生耐药后组织形态学和免疫表型均发生了变化，从梭形细胞型变成混合细胞型，部分区域可见横纹肌肉瘤分化，横纹肌肉瘤分化区域CD117阴性表达，但是Desmin和Myogenin呈现阳性表达。

一种采用所述的细胞系的裸鼠移植瘤模型的构建方法，建立步骤如下：

实验动物BALB /C /nu /nu品系裸鼠，无特殊病原体级, 雌雄不限, 鼠龄3～4周,体重19.0 ± 2.0g；GIST-1114细胞系接种5只裸鼠，均接种于背部皮下；其饲养和实验均在无特殊病原体环境中进行；

耐药GIST细胞接种裸鼠：收集耐药GIST细胞系数目约1×10⁷接种于裸鼠背部皮下，次日记为接种第1天；每日观察荷瘤鼠饮食情况、精神状态、肿瘤大小与外观，用游标卡尺每10天测量一次裸鼠体重（g）和肿瘤的最长纵径（a）、与最长径垂直的最长横径（b），根据公式V（肿瘤体积）=（1/2）×ab²计算出肿瘤体积，绘制移植瘤生长曲线；经过中位时间约21天的生长静息期后，肿瘤生长速度逐渐加快，随着接种时间的推移，肿瘤的生长逐渐加速，肿瘤体积逐渐增大；从接种日期起，每10天计算移植瘤的体积描绘肿瘤生长曲线，GIST-1114细胞成瘤率60%。

本发明的有益效果：

我们发现了GIST和恶性黑色素瘤（一种在欧美国家发病率较高的恶性肿瘤）在发病机制上有一定的相似之处。西方国家的恶性黑色素瘤主要是由于BRAF基因突变引起，少部分是由于KIT基因突变导致。而我国的恶性黑色素瘤KIT基因的突变率较西方高，BRAF基因突变率则相应下降，KIT和BRAF基因突变患者约占总患者的45%（20%+25%）。因此我们借鉴恶性黑色素瘤的成功经验，是否可能是由于下游的RAS/RAF/MEK/ERK信号通路的二次突变，而非KIT基因的继发突变导致imatinib的继发耐药。基于以上科学推断，我们进一步设计了细胞和动物等基础实验，在体内外证实了部分imatinib耐药的GIST是由于KIT下游的BRAF基因继发突变引起的，并且BRAF抑制剂Vemurafenib (维罗非尼)可以很好地克服继发耐药。因此，解决了临床上部分GIST无KIT基因二次突变的imatinib继发耐药的问题。

附图说明

图1是倒置相差显微镜下Imatinib耐药的GIST-1114细胞形态图；

图2 GIST-1114细胞系体外Imatinib药物敏感性试验；

图3 GIST-1114耐药前原发突变KIT基因exon11 V559D（KIT c.1676T>A(V559D)）；

图4 GIST-1114耐药后继发突变BRAF基因exon15 V600E（BRAF c.1799T>A(V600E)）；

图5耐药胃肠道间质瘤裸鼠移植瘤生长曲线；

图6 GIST-1114 移植瘤横纹肌肉瘤分化区域HE染色；

图7 GIST-1114 移植瘤横纹肌肉瘤分化区域CD117（A部分），Desmin（B部分），Myogenin免疫组化染色（C部分）。

具体实施方式

本发明的耐药细胞系建立步骤如下: 1例Imatinib 600mg/d治疗失败的耐药GIST（根据GIST治疗的疗效评价Choi标准，CT提示肿瘤体积增加10%并且密度改变不符合 PR标准）实行减瘤术，切取部分新鲜无菌的胃肠道间质瘤组织行原代细胞培养, 建立了GIST-1114耐药细胞系。用光学显微镜观察细胞形态，MTT法检测细胞耐药指数，行耐药细胞系的基因突变分析，建立耐药细胞系裸鼠移植瘤模型（成瘤情况和移植瘤生长曲线，组织学特征，免疫组织化学检测CD117、Desmin、Myogenin，移植瘤基因突变分析）。我们发现，GIST-1114有以下特点: 耐药的GIST原代细胞在倒置显微镜下呈互不重叠的单层，细胞生长呈成纤维细胞状，为梭型（图1）。 GIST-1114对Imatinib也具有较强的耐药性，在Imatinib药物浓度在0.05-3µM之间时对细胞系的生长基本没有明显影响，3-5µM时受到轻度影响，但在>10µM的高药物浓度下部分细胞的生长受到一定的抑制（图2）。GIST-1114细胞系包含KIT基因exon11 V559D原发突变和BRAF基因exon15 V600E继发突变（图3-4），未发现PDGFRA基因突变。耐药细胞系裸鼠移植瘤模型实验显示：随着接种时间的推移，GIST-1114肿瘤的生长逐渐加速，肿瘤体积逐渐增大，细胞成瘤率为：GIST-1114组80%（4/5）（图5）。GIST-1114移植瘤形态学特征：发生耐药后组织形态学和免疫表型均发生了变化，从梭形细胞型变成混合细胞型，部分区域可见横纹肌肉瘤分化，横纹肌肉瘤分化区域CD117阴性表达，但是Desmin和Myogenin呈现阳性表达。GIST-1114移植瘤细胞包含KIT基因exon11 V559D原发突变和BRAF基因exon15 V600E继发突变。未发现PDGFRA基因突变。

实施例1

耐药细胞系建立步骤如下：

1例Imatinib 600mg/d治疗失败的耐药GIST（根据GIST治疗的疗效评价Choi标准，CT提示肿瘤体积增加10%并且密度改变不符合 PR标准）实行减瘤术，切取部分新鲜无菌的胃肠道间质瘤组织行原代细胞培养，部分新鲜组织标本-80℃保存备用，其余手术标本固定、石蜡包埋后行HE和免疫组织化学检查。

（1）组织块培养法

取手术切除的新鲜胃肠道间质瘤组织，仔细剔除外周可疑污染及坏死组织后，用0.01 mol/L的PBS液冲洗3次，再用含500µg/ml庆大霉素、500µg/ml链霉素、500U/ml青霉素的无血清RPMI-1640冲洗5-6次，将组织剪成小块，均匀地铺在25cm2培养瓶中，置于37℃，5%CO2的孵箱中培养。1h后，每孔加入培养基0.5m1，继续培养。第二天再加入培养基1ml。此后每3天换液一次。培养基为含15%FCS（胎牛血清）的RPMI-1640。

（2）消化培养法

取手术切除的新鲜胃肠道间质瘤组织，仔细剔除外周可疑污染及坏死组织后，用0.01 mol/L的PBS液冲洗3次，再用含500µg/ml庆大霉素、500µg/ml链霉素、500U/ml青霉素的无血清RPMI-1640冲洗5-6次，用眼科剪尽量剪碎组织至直径<1mm，用无血清RPMI-1640洗2次，加入2倍体积的1mg/ml的中性蛋白酶，37℃消化60min，收集单个及小块组织的瘤细胞，离心洗涤2次，接种于25c㎡培养瓶中，培养条件为含15%FCS的RPMI-1640。次日轻轻吸弃上清液，换新鲜培养液，此后每隔3天换液一次。

细胞耐药后，及时冻存该浓度耐药细胞于液氮中。冻存液由20%小牛血清、5%DMSO、75% PMI 1640培养液组成，冻存过程应逐步降温，采取4℃30分钟→-20℃1小时→-70℃过夜→液氮的顺序进行。冻存细胞的复苏按以下程序进行:在一个25c㎡的细胞培养瓶中加入至少10ml含15%胎牛血清的培养液;从液氮中取出装有细胞的冻存管，立即放入37℃水浴轻轻摇动使冻存物在1分钟内解冻，用酒精棉球擦拭冻存管外壁后拿入超净台；将解冻后的细胞悬液移入己加了培养液的培养瓶中，稍加摇动泪匀，拧松瓶盖，平放入二氧化碳培养箱中，在37℃、5%CO2、95%湿度条件下培养，约24小时细胞贴壁后换新鲜培养液3~5ml继续培养。

实施例2

对建立的GIST-1114细胞系进行形态学观察、生物学特性鉴定、基因突变检测：

1.倒置相差显微镜观察活细胞形态

刚分离接种的耐药GIST-1114原代细胞大约12小时开始贴壁，48小时伸展开，72小时完全伸展开，原代培养的细胞第5天起开始增殖，约10-12天可传代。耐药的GIST-1114细胞在倒置显微镜下呈互不重叠的单层，细胞生长呈成纤维细胞状，为梭型（图1）。传代1-2代后，细胞生长加快，约5-7天传代一次。传代10-15代后原代细胞生长变慢，细胞倍增时间延长，细胞皱缩，后出现衰老、死亡。

2. Imatinib耐药的人胃肠道间质瘤细胞系的体外药敏验证

取对数生长期的GIST-1114细胞，常规用0.25%胰蛋白酶消化各株细胞系，离心后弃上清，用培养基重悬细胞后，细胞计数板计数调整细胞浓度为3×10⁴/ml，以每孔100µl接种于96孔板，置于37℃，5%CO2的孵箱中培养。24h后，加入不同终浓度Imatinib（0.05-50µM），每个浓度设3个复孔并设对照孔。培养72h后，每孔加入5mg/ml的MTT 20µl，37℃作用4h后弃上清，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150µl，振荡10min使结晶物混匀，在酶标仪570nm波长处读取吸光度值(OD)。以上步骤在不同时间重复3次，结果取均值。根据OD值计算细胞抑制率，计算公式:细胞抑制率=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。根据每种药物不同浓度抑制率，利用SPSS17.0软件Regression中的Probit过程计算该药半数抑制浓度(IC50)，来判断细胞系对Imatinib的敏感/耐药性(图2)。 GIST-1114对Imatinib具有较强的耐药性，在Imatinib药物浓度在0.05-3µM之间时对这细胞系的生长基本没有明显影响，3-5µM时受到轻度影响，但在>10µM的高药物浓度下部分细胞的生长受到一定的抑制。

3. Imatinib耐药的GIST-1114细胞系的基因突变分析

(1).基因组DNA抽提：按照真核基因组DNA抽提（酚/氯仿抽提、乙醇沉淀DNA法）的基本方法并作改良。细胞直接胰蛋白酶消化后收集，37℃开放干燥，加500ul消化缓冲液及20µl蛋白酶K（20µg/µl,），定时混匀，过夜（55℃或更高），待管中液体变澄清后取出，置95℃煮沸10分钟灭活蛋白酶K；600µl酚氯仿抽提液，混匀45秒(手摇即可，否则容易造成DNA链断裂)，14000rpm离心5min，将上层液体移至新管中，重复抽提2次；600µl氯仿抽提液，混匀45秒(手摇即可，否则容易造成DNA链断裂)，14000rpm离心5min，再将上层液体移至新管中（注意：不要有杂质吸入）。6-7步次数可增加，视抽提后杂质存留情况而定。1/10体积3M 乙酸钠（碱性溶液，溶解核酸）混匀，再加1ml -20℃无水乙醇（促进DNA沉积）至-70℃冰箱放置2小时以上；10000rpm以上转速离心，弃酒精，加1ml -20℃70%乙醇洗涤，离心（因为DNA容易溶解于水中，酒精洗涤时间不宜过长），弃酒精，37℃干燥（注意：不能哄得太干，无水即可）；加TE 40-50µl重新悬浮DNA，紫外分光光度计测定浓度，并标化DNA浓度至1.5ng/ml，-20℃保存。测浓度前需静置1-2小时。

(2).DNA浓度测定：将抽提好的DNA溶液，用蒸馏水稀释50倍，在波长260nm处用蒸馏水校正为零，然后读出280nm的A（蒸馏水）值。将各样本分别在260nm和280nm处检测，不同样本间，必须用蒸馏水冲洗比色杯。260nm测得是DNA的A值，280nm测得是蛋白质的A值。（A值一般在0.5以上比较稳定可靠，误差小）DNA浓度换算公式（单位ug/ml）= 50×A260nm×稀释倍数。OD值= A260nm÷A280nm，OD值在1.6~1.8，DNA纯度高。

(3).PCR引物的合成及其扩增条件

1）运用软件Primer Premier5.0设计引物行PCR扩增，KIT基因第9、11、13、14、17号外显子，PDGFRA基因第12、14、l8号外显子，BRAF基因第15号外显子共9对引物均由上海生工公司合成（见表1）。扩增反应以双蒸水代替模板作为阴性对照。

另外内参照基因β-actin的引物由浙江大学肿瘤研究所馈赠：

引物序列：上游:tcctgtggcatccacgaaact 下游:gaagcatttgcggtggacgat

退火温度：58℃

产物长度：315bp。

(4).PCR产物检测：取10μl PCR产物，进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，DL 2000 DNAMarker作为标志物。紫外投射仪上观察和照相。

(5).测序分析：对PCR产物适当保存后，送上海生工生物有限公司进行DNA的纯化和测序分析(ABI3100测序仪)。有突变的病例再行反向DNA测序证实，并与NCBI基因库KIT、PDGFRA、BRAF基因序列进行比对。

KIT基因 exon 9、11、13、14、17，PDGFRA基因exon 12、14、18，BRAF基因exon 15突变分析结果显示：GIST-1114细胞系包含KIT基因exon11 V559D原发突变和BRAF基因exon15V600E继发突变 (图3,4) 未发现PDGFRA基因突变。

4.耐药GIST-1114细胞系裸鼠移植瘤模型的建立和鉴定

1）成瘤情况和移植瘤生长曲线

实验动物：BALB /C /nu /nu品系裸鼠由浙江中医药大学动物实验研究中心提供（许可证号：SYXK（浙）2008-0115）。无特殊病原体级,雌雄不拘,鼠龄3～4周,体重19.0 ±2.0g。GIST-1114细胞系接种5只裸鼠，均接种于背部皮下,其饲养和实验均在无特殊病原体( specific pathogen free)环境中进行。

耐药GIST细胞接种裸鼠：收集耐药GIS-1114细胞系数目约1×10⁷接种于裸鼠背部皮下，次日记为接种第1天。每日观察荷瘤鼠饮食情况、精神状态、肿瘤大小与外观，用游标卡尺每10天测量一次裸鼠体重( g)和肿瘤的最长纵径( a) 、与最长径垂直的最长横径(b) ,根据公式V (肿瘤体积) = (1/2)×ab²计算出肿瘤体积，绘制移植瘤生长曲线。

经过中位时间约21天的生长静息期后，肿瘤生长速度逐渐加快，随着接种时间的推移，肿瘤的生长逐渐加速，肿瘤体积逐渐增大。从接种日期起，每10天计算移植瘤的体积描绘肿瘤生长曲线（图5）。GIST-1114细胞成瘤率80%（4/5）。

2）组织学特征

手术切除标本用4％甲醛固定，石蜡切片，进行HE染色、光镜观察。光镜下GIST-1114耐药移植瘤形态学上主要由梭形细胞组成。如图6所示。

3）免疫组织化学检测结果

免疫组织化学染色：免疫组织化学采用 EnVision 二步法，切片厚4μm，二甲苯脱蜡、梯度酒精水化，置于3%H₂O₂内5min，灭活内源性过氧化物酶。置于0.01M枸橼酸缓冲溶液中，加热修复抗原20 min后，自然冷却20min。滴加一抗，室温孵育4h，PBS冲洗，2min×3次；滴加二抗，37℃温箱内孵育30min，PBS冲洗2min×3次；DAB显色，蒸馏水冲洗、苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封固。Desmin、CD117、Myogenin (多抗, 稀释度1∶100)为丹麦DAKO公司产品。用PBS代替一抗作空白对照。

GIST-1114移植瘤形态学特征：呈混合细胞型，部分区域可见横纹肌肉瘤分化，横纹肌肉瘤分化区域CD117阴性表达，但是Desmin和Myogenin呈现阳性表达，如图7所示。

4）基因突变分析

GIST组织的基因组DNA抽提，按照真核基因组DNA抽提（酚/氯仿抽提、乙醇沉淀DNA法）的基本方法并作改良，在上述细胞DNA提取步骤前增加：-80℃取出备用的GIST标本；液氮中陶瓷研钵研磨，组织呈粉状时转移到预先称重的1.5ml Eppendorf管中，称重，得组织50-100mg。组织DNA含量测定、PCR引物条件、测序方法同细胞系DNA。

KIT基因 exon 9、11、13、14、17，PDGFRA基因exon 12、14、18和BRAF exon 15突变分析结果显示，移植瘤的突变类型与接种前细胞系突变类型相一致，GIST-1114移植瘤细胞包含KIT基因exon11 V559D原发突变和BRAF基因exon15 V600E继发突变。未发现PDGFRA基因突变。

Claims (2)

1.一种BRAF继发突变的耐药胃肠道间质瘤细胞系，其特征在于，保藏名为甲磺酸伊马替尼耐药胃肠道间质瘤细胞系GIST-1114，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号:CCTCC NO: C201501，保藏日期：2015年1月22日；

所述的GIST-1114细胞系包含KIT基因exon11 V559D原发突变和BRAF基因exon15V600E继发突变；GIST-1114耐药细胞系的移植瘤模型的组织形态学特征：发生耐药后组织形态学和免疫表型均发生了变化，从梭形细胞型变成混合细胞型，部分区域可见横纹肌肉瘤分化，横纹肌肉瘤分化区域CD117阴性表达，但是Desmin和Myogenin呈现阳性表达。

2.一种采用如权利要求1所述的细胞系的裸鼠移植瘤模型的构建方法，其特征在于：建立步骤如下：

实验动物BALB /C /nu /nu品系裸鼠，无特殊病原体级, 雌雄不限, 鼠龄3～4周, 体重19.0 ± 2.0g；GIST-1114细胞系接种5只裸鼠，均接种于背部皮下；其饲养和实验均在无特殊病原体环境中进行；

耐药GIST细胞接种裸鼠：收集耐药GIST细胞系数目约1×10⁷接种于裸鼠背部皮下，次日记为接种第1天；每日观察荷瘤鼠饮食情况、精神状态、肿瘤大小与外观，用游标卡尺每10天测量一次裸鼠体重（g）和肿瘤的最长纵径（a）、与最长径垂直的最长横径（b），根据公式V（肿瘤体积）=（1/2）×ab²计算出肿瘤体积，绘制移植瘤生长曲线；经过中位时间约21天的生长静息期后，肿瘤生长速度逐渐加快，随着接种时间的推移，肿瘤的生长逐渐加速，肿瘤体积逐渐增大；从接种日期起，每10天计算移植瘤的体积描绘肿瘤生长曲线，GIST-1114细胞成瘤率60%。