CN1762346A - 雷公藤甲素在制备抗卵巢癌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及雷公藤甲素在制备抗卵巢癌药物中的应用。雷公藤甲素对卵巢癌细胞和正常细胞的毒性作用具有高度的选择性，用雷公藤甲素制备的抗卵巢癌药物对卵巢癌具有较好的疗效，且副作用少。可以作为抗人卵巢癌的化疗药物。

Description

雷公藤甲素在制备抗卵巢癌药物中的应用

技术领域

本发明涉及雷公藤甲素在制备抗卵巢癌药物中的应用。

背景技术

卵巢癌是女性生殖器官常见的恶性肿瘤，其发病率占女性生殖器官恶性肿瘤的第三位，仅次于宫颈癌和子宫内膜癌，而且有逐年增多的趋势。近10年来在我国的发病率一直处于持续和明显上升的状态，目前已跃居我国女性恶性肿瘤之首或第二位。由于受卵巢解剖部位置的影响，卵巢癌早期诊断困难，晚期治疗效果差。卵巢癌的治疗从以外科解剖学为主导的阶段发展到了现代的以生物学概念为主导的阶段，包括外科手术、化学治疗、放射治疗、内分泌治疗及生物治疗等综合措施，化疗在卵巢癌的综合治疗中占有极其重要的地位。尽管卵巢癌细胞减灭术的水平不断提高，新的化疗药物不断被开发利用，卵巢癌总的5年生存率仍然很低，徘徊在25％～30％。目前的肿瘤化疗药物尽管其抑制或杀灭肿瘤细胞的作用肯定，但对人体的毒副作用较大，易产生耐受，因而限制了在肿瘤临床方面的应用。因此，寻找新型的化疗药物对卵巢癌的综合治疗就显得很重要。

雷公藤甲素是是卫矛科雷公藤属木质藤本植物雷公藤的主要活性成分，已有多家文献报道雷公藤甲素在体内外对肿瘤的化学预防和治疗作用，但雷公藤甲素对人卵巢癌细胞的体内外抑制作用却未见报道。

发明内容

本发明就是针对上述问题提供雷公藤甲素在制备抗卵巢癌药物中的应用，用雷公藤甲素制备的抗卵巢癌药物对卵巢癌具有较好的疗效，且副作用少。

本发明提供的技术方案是：雷公藤甲素在制备抗卵巢癌药物中的应用。

本发明经口给予雷公藤甲素2μg/kg或40μg/kg，一天两次，20天后，抑瘤率为43.29％，23.99％。

附图说明

图1为本发明IC₃₀，IC₆₀，IC₉₀雷公藤甲素处理48小时对A2780卵巢癌细胞凋亡及死亡的影响图；

图2为本发明IC₃₀，IC₆₀，IC₉₀雷公藤甲素处理48小时对OVCAR-3卵巢癌细胞凋亡及死亡的影响图；

图3为本发明IC₆₀雷公藤甲素处理24，48，72小时对A2780卵巢癌细胞周期的影响图；

图4为本发明IC₆₀雷公藤甲素处理24，48，72小时对OVCAR-3卵巢癌细胞周期的影响图；

具体实施方式

本发明通过以下实施例作进一步说明

中医学在抗肿瘤方面发挥着重要作用，具有减毒、增效等特点。本发明选择雷公藤甲素作为抗癌药物，用MTT实验及流式细胞术，探讨雷公藤甲素对卵巢癌细胞活性的影响及药物作用机制。旨在选择一种抗肿瘤作用强、毒性小的药物。

本发明通过MTT法、流式细胞仪等技术揭示雷公藤甲素对人卵巢癌细胞的生长、增殖的影响及其在细胞周期调控方面的机制。

                            材料与方法

1实验材料

1.1细胞株

(1)人卵巢癌细胞株A2780(p53基因野生型)：由同济医院妇产科肿瘤研究室提供；

(2)人卵巢癌细胞株OVCAR-3(p53基因突变型)，HIO-180，CCD-19Lu，J774A.1：由美国Virginia Commonwealth University免疫学教研室提供；

1.2药物

雷公藤甲素，由福建福州凯华药业有限公司提供，纯度99.7％，用DMSO配成储备液置于-20℃保存，使用时用PBS液稀释，使DMSO终浓度为0.4％。

2实验方法

2.1MTT法检测细胞活力及药物敏感性

取指数生长期细胞，经0.25％胰酶消化后，加入培养液吹打混匀，以5.0×10⁴个细胞接种于96孔培养板，置37℃，5％CO₂培养箱培养24h。雷公藤甲素配成0.5ng/mL、1.5ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL、120ng/mL、160ng/mL 10种终浓度。实验设空白对照组(不含细胞)、细胞对照组(含0.4％的DMSO的PBS溶液，不含药物)和药物实验组(0.5ng/mL、1.5ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL、120ng/mL、160ng/mL组)，每种浓度的药物分别加入培养后的96孔板内，20μL/孔，每个剂量3个平行孔。在CO2箱内分别培养24，48，72h，1000r·min-1离心10min，弃上清每孔加入5mg/mL MTT 20μL，37℃培养箱中培养4h。培养后，再离心吸弃孔内培养液，加入200μL/孔DMSO振荡10min，使结晶物充分溶解，应用酶联免疫检测仪570mm波长下测各孔吸光度A值，本实验重复3次。按公式：细胞存活率＝OD(药物组)/OD(对照组)×100％，抑制率＝1-存活率，来计算药物对细胞的抑制率。

以药物浓度为因变量，细胞抑制率为应变量，即X＝药物浓度，Y＝抑制率，建立回归方程。利用该回归方程求出雷公藤甲素分别作用A2780和OVCAR-3细胞24、48、72h时的IC₃₀、IC₅₀、IC₆₀、IC₉₀浓度。

2.2流式细胞仪检测雷公藤甲素作用A2780和OVCAR-3细胞后的细胞凋亡

实验设细胞对照组(含0.4％的DMSO PBS溶液，不含药物)，药物实验组(A2780细胞：IC₃₀-0.59ng/mL、IC₆₀-1.67ng/mL、IC₉₀-2.74ng/mL三组；OVCAR-3细胞：IC₃₀-3.26ng/mL、IC₆₀-13.6ng/mL、IC₉₀-24.2ng/mL三组)。细胞长至对数生长期，用0.25％胰酶消化成单细胞悬液，按浓度2×10⁶/mL接种6孔板中，置37℃，5％CO₂培养箱培养24h，分别加入IC₃₀、IC₆₀、IC₉₀浓度的雷公藤甲素培养48h，用0.25％胰酶消化成单细胞悬液，离心1000rpm，5min，吸去上清液，PBS液洗2次，用1×Binding Buffer将细胞调整至1×10⁶/mL浓度，取100μL转至5mL流式专用试管，加入5μL FITC-Annexin V(浓度1mg/mL，1×Binding Buffer稀释)，混匀细胞，避光孵育15min，加入10μL PI(浓度250μg/mL)溶液，再加入400μL 1×Binding Buffer，1小时之内上机检测。

2.3流式细胞仪检测雷公藤甲素对各细胞的细胞周期的影响

分别取雷公藤甲素作用24，48，72h的IC₆₀浓度作为以下实验的药物浓度。实验设各时间点细胞对照组(含0.4％的DMSO PBS溶液，不含药物)，药物实验组(A2780细胞：24h-2.6ng/mL、48h-1.8ng/mL、72h-1.5ng/mL三组；OVCAR-3细胞：24h-123ng/mL、48h-13.6ng/mL、72h-8.3ng/mL三组)。细胞长至对数生长期，用0.25％胰酶消化成单细胞悬液，按浓度2×10⁶/mL接种6孔板中，置37℃，5％CO₂培养箱培养24h。加入对照溶液和IC₆₀浓度的雷公藤甲素分别培养24，48，72h。用0.25％胰酶消化成单细胞悬液，4℃离心1000rpm，5min，吸去上清液，PBS液洗2次，将细胞悬液转入EP管中，离心1000rpm，5min，去上清，一滴一滴加入冷(-20℃)乙醇(终浓度70％)固定细胞，并且一边加入固定剂一边振荡，防止形成细胞团，4℃固定过夜(固定的细胞可以保存一段时间)，离心除去乙醇，PBS洗1次，去上清。将细胞数调整到1×10⁶/mL，加入250μg/mL的RNA酶(含0.1％TritonX-100)，50μg/mL碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)，4℃暗处放置30min。将样品放入FCM的样品室，用激发波长488nm测定。

2.4雷公藤甲素对荷瘤小鼠肿瘤生长抑制作用的影响

纯系Balb/c小鼠8周龄，体重20±2g，雌性。右侧腋窝皮下接种A2780和OVCAR-3细胞(5×10⁶个)后，分为A2780对照组，A2780给药组(ig雷公藤甲2μg/kg，Bid)；OVCAR-3对照组，OVCAR-3给药组(ig雷公藤甲素20μg/kg，Bid)，20天后，断颈处死小鼠，取腋窝瘤组织称重。

3实验结果

3.1雷公藤甲素对各细胞的敏感性

本实验采用MTT法检测不同浓度的雷公藤甲素分别作用24，48，72h后对人卵巢癌细胞株及正常细胞株的抑制作用，结果如下表。由表(1-4)可见，人卵巢癌细胞株A2780比人卵巢癌细胞株OVCAR-3对雷公藤甲素更为敏感，不同浓度雷公藤甲素均可抑制A2780和OVCAR-3细胞的生长，并且呈浓度依赖性。雷公藤甲素对正常细胞如HIO-180，CCD-19Lu，J774A.1细胞的细胞毒作用也表现呈剂量依赖性，雷公藤甲素作用人卵巢癌细胞A2780的IC₅₀值比作用于正常细胞的IC₅₀值低得多，雷公藤甲素分别作用于A2780细胞后24，48，72h的IC₅₀值比HIO-180低47，65，65倍；比CCD-19Lu细胞低65，84，85倍；比J774A.1细胞低269，165，168倍。人卵巢癌OVCAR-3细胞对雷公藤甲素的敏感性不及A2780细胞株，雷公藤甲素分别作用于OVCAR-3细胞后24，48，72h的IC₅₀值比HIO-180低1.1，8.3，11倍；比CCD-19Lu细胞低1.5，8.3，14倍；比J774A.1细胞低6.3，21，28倍(见表2)。

表1.雷公藤甲素对卵巢癌细胞A2780，OVCAR-3 30％抑制率的时间浓度关系

表2.雷公藤甲素对卵巢癌细胞A2780，OVCAR-3及正常细胞株HIO-180，CCD-19Lu，J774A.1 50％抑制率的时间浓度关系

表3.雷公藤甲素对卵巢癌细胞A2780，OVCAR-3 60％抑制率的时间浓度关系

表4.雷公藤甲素对卵巢癌细胞A2780，OVCAR-3 90％抑制率的时间浓度关系

3.2流式细胞仪检测雷公藤甲素对细胞凋亡的影响

应用流式细胞仪采用Annexin V-PI双染法对不同浓度的雷公藤甲素诱导人卵巢癌细胞A2780和OVCAR-3产生早期细胞凋亡进行了分析。结果显示(参见图1、图2)，IC₃₀浓度雷公藤甲素对A2780和OVCAR-3细胞都能诱导细胞凋亡的发生，凋亡率在6～15％，并且大多数细胞处于早期凋亡状态；IC₆₀浓度雷公藤甲素对A2780细胞作用48h后，只有5％的细胞处于早期凋亡状态，65％的细胞处于晚期凋亡状态，10％的细胞坏死；而IC₆₀浓度雷公藤甲素对OVCAR-3细胞作用48h后，50％的细胞处于早期凋亡状态，65％的细胞处于晚期凋亡状态，10％的细胞坏死；随着雷公藤甲素浓度的增高，A2780细胞对雷公藤甲素越敏感，IC₉₀浓度雷公藤甲素对A2780细胞作用48h后，细胞凋亡率反而降低，但是对于OVCAR-3细胞而言，它对雷公藤甲素的敏感度不及A2780细胞，IC₉₀浓度雷公藤甲素对OVCAR-3细胞作用48h后，细胞凋亡率比同浓度的雷公藤甲素对A2780细胞的凋亡率高。

3.3流式细胞仪检测雷公藤甲素对各细胞的细胞周期的影响

IC₆₀浓度的雷公藤甲素对A2780细胞分别作用24h(2.6ng/ml)，48h(1.8ng/ml)，72h(1.5ng/ml)以及对OVCAR-3细胞分别作用24h(123ng/ml)，48h(13.6ng/ml)，72h(8.3ng/ml)后细胞周期和DNA含量变化如下图3，图4。由图可见，雷公藤甲素作用24h后，处于S期的细胞比例增加，这种情况一直持续到48h，从24h到72h A2780细胞sub-G1期的细胞比例逐渐增加；与此同时，雷公藤甲素作用48h后，OVCAR-3细胞在G2/M期阻滞，一直到作用后72h，并且与A2780细胞相同的是，也有sub-G1期的细胞比例逐渐增加的趋势。

3.4雷公藤甲素对荷瘤小鼠肿瘤生长抑制作用的影响

由表5可见，雷公藤甲素对A2780荷瘤小鼠的抑瘤率为43.29％，对OVCAR-3荷瘤小鼠的抑瘤率为23.99％，均有显著性差异。

表5.雷公藤甲素对荷瘤小鼠肿瘤生长抑制作用的影响

组别	n	瘤重(g)
			A2780对照组A2780给药组OVCAR-3对照组OVCAR-3给药组	7756	2.98±0.45g1.69±0.34g**3.96±0.95g3.01±0.71g**

与对照组相比**p＜0.01

4讨论

本研究探讨了雷公藤甲素对人卵巢癌细胞的细胞毒性作用及其作用机理。当雷公藤甲素的浓度超过IC₆₀时，卵巢癌细胞A2780和OVCAR-3的细胞凋亡率不随浓度的升高而增大，而随时间的延长而加强，说明雷公藤甲素超过IC₆₀浓度诱导该卵巢癌细胞凋亡不呈剂量依赖性，而呈时间依赖性。

实验发现，雷公藤甲素对人卵巢癌A2780细胞的细胞毒作用在0.5 to 5.0ng/mL浓度范围内表现为剂量和时间依赖性，一旦浓度超过这个范围继续增加，其细胞毒作用没有明显增强；对于人卵巢癌OVCAR-3细胞，当雷公藤甲素浓度在2.5 to 10ng/mL范围内时，其细胞毒作用表现为呈剂量依赖性，超过这个浓度范围则呈时间依赖性。另外，研究还发现，雷公藤甲素对正常细胞如HIO-180，CCD-19Lu，J774A.1细胞的细胞毒作用也表现呈剂量依赖性，雷公藤甲素作用人卵巢癌细胞A2780的IC₅₀值比作用于正常细胞的IC₅₀值低得多，雷公藤甲素分别作用于A2780细胞后24，48，72h的IC₅₀值比HIO-180低47，65，65倍；比CCD-19Lu细胞低65，84，85倍；比J774A.1细胞低269，165，168倍。人卵巢癌OVCAR-3细胞对雷公藤甲素的敏感性不及A2780细胞株，雷公藤甲素分别作用于OVCAR-3细胞后24，48，72h的IC₅₀值比HIO-180低1.1，8.3，11倍；比CCD-19Lu细胞低1.5，8.3，14倍；比J774A.1细胞低6.3，21，28倍。提示雷公藤甲素对卵巢癌细胞和正常细胞的毒性作用具有高度的选择性，可以作为抗人卵巢癌的化疗药物。

Claims (1)

1.雷公藤甲素在制备抗卵巢癌药物中的应用。

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