CN101352434B - 雷公藤内酯醇在制备治疗与c-KIT酪氨酸激酶相关肿瘤的药物的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及雷公藤内酯醇在制备治疗与c-KIT酪氨酸激酶相关的肿瘤的药物的用途。本发明首次证实小分子天然产物雷公藤内酯醇(TPL)能下调D816V点突变c-KIT蛋白的表达，并抑制其磷酸化；诱导STI571抵抗性c-KIT点突变(D816V)细胞凋亡。本发明找到了一种新的酪氨酸激酶小分子抑制物，尤其是克服了目前临床上使用的第一线酪氨酸激酶小分子抑制药物STI571的抵抗性问题。TPL可用于开发治疗c-KIT突变相关性肿瘤如胃肠间质瘤、系统性肥大细胞增多症、小细胞肺癌等的新型特效药物。
Description
技术领域
本发明涉及雷公藤内酯醇的新用途，尤其是涉及雷公藤内酯醇在制备治疗与c-KIT酪氨酸激酶相关的肿瘤的药物的用途。
背景技术
肿瘤分子靶向治疗是基于对肿瘤生长密切相关的关键分子通过化学或生物学手段选择性杀伤肿瘤细胞的一种治疗方法。酪氨酸激酶是肿瘤分子靶向治疗的重要靶点。Bcr-Ab1和c-KIT为酪氨酸激酶。
Bcr-Ab1是引起慢性粒细胞性白血病(CML)的一种融合蛋白。c-KIT的编码产物是一种分子量为145千道尔顿的具有酪氨酸激酶活性的跨膜受体蛋白，它在细胞外区域有5个免疫球蛋白G样结构域，因此，它属于III型酪氨酸激酶超家族成员。生理情况下，c-KIT少量表达于肥大细胞、干细胞、精细胞及肠Cajal细胞等。生理情况下，当干细胞因子(c-KIT的配体)结合c-KIT的免疫球蛋白G样结构域时，c-KIT分子发生同源二聚化，使得临膜域的Y568和Y570酪氨酸残基发生自动磷酸化，进而导致细胞内许多底物蛋白的酪氨酸残基发生磷酸化，引起细胞增殖有关的多条信号转导通路激活，包括Jak-Stat3/Stat5通路、Src激酶、Ras-MEK-Erk1/2及PI3K-AKT通路，从而使细胞增殖。c-KIT酪氨酸激酶域的功能获得性点突变可引起配体非依赖性持续激活，进而导致细胞的失控性生长和对凋亡的抵抗。已经明确c-KIT突变是造成胃肠间质瘤(GIST)、系统性肥大细胞增多症的原因，与小细胞肺癌有密切关系。
2001年美国FDA批准了第一个靶向治疗药物STI571(Gleevec，中文名“格列卫”，诺华制药公司)用以治疗慢性粒细胞性白血病(CML)1，2。CML的分子病因是费城染色体，即Bcr-Abl融合蛋白的形成3。绝大部分(95％以上)CML病人、约30％的成人型急性淋巴细胞性白血病呈Bcr-Abl阳性4。Bcr-Abl中的Abl部分所表现出来的酪氨酸激酶活性可以将磷酸根从ATP上转移到各种底物的酪氨酸残基上5，从而引起CML2。STI571能阻断ATP连接到Bcr-Abl酪氨酸激酶，阻断酪氨酸激酶的自动磷酸化，切断异常的酪氨酸激酶的信号转导，从而可抑制肿瘤生长2，6。临床上STI571单药治疗可使98％的CML病人获得临床血液学的缓解，53％获得细胞遗传学缓解1，7。STI571不仅能强效靶向抑制Bcr-Abl酪氨酸激酶，而且能强效靶向抑制c-KIT酪氨酸激酶，对胃肠间质瘤、系统性肥大细胞增多症、小细胞肺癌等取得满意的疗效。
目前临床上使用的第一线酪氨酸激酶小分子抑制物是STI571，然而随着STI571在临床上的广泛应用，耐药问题日益突出：部分癌症病人对STI571天然耐受；另一部分病人开始用药时有反应，但在用药治疗过程中逐渐出现获得性耐药8。长期服用的患者易产生耐药性。耐受性是指慢性期患者经STI571治疗后未出现完全血液学反应或加速期和急变期患者经STI571治疗后未能恢复到慢性期。临床上，急变期的CML、Bcr-Abl阳性的ALL病人对STI571耐受较普遍，约70％的这两类病人在用药3～6个月出现对STI571耐药9。而且一旦出现耐药，病情往往进展迅速。获得性耐受被认为是肿瘤细胞为逃避杀伤的一种防卫，其机制有多种，包括：①靶基因(Bcr-Abl、c-KIT、血小板衍生的生长因子受体)突变；②靶基因扩增；③靶基因非依赖性肿瘤克隆的形成；④α-1酸性糖蛋白的产生和多药耐受基因MDR1的过度表达。但目前公认的主要机制是靶基因(Bcr-Abl、c-KIT、血小板衍生的生长因子受体)表达产物激酶域的继发突变10。研究表明与STI571耐受关系明确的靶基因的常见点突变位点包括Bcr-Abl的E255K、E255V、T315I及D276G、c-KIT的D816V等2，7，8，11。携有这些突变的患者容易复发，预后不好。有报道指出仅有50％的转移性胃肠间质瘤(GIST)病人对STI571反应，效果可靠，而这部分病人携带有c-KIT临膜域V560G突变。此外，尚有50％的转移性GIST病人对STI571缺乏反应。c-KIT酪氨酸激酶域的点突变(如D816V)则对STI571非常耐受12。体外实验用8～10μM STI571处理培养细胞，不能抑制携有D816V c-KIT细胞的增殖；携有D816V c-KIT的系统性肥大细胞增多症病人对STI571也不反应；AMN107对c-KIT D816V点突变细胞无效。Dasatinib(BMS-354825)在体外可杀伤STI571抵抗性c-KIT点突变细胞13，然而其临床疗效仍有待观察。
如何克服STI571抵抗性是当今肿瘤医学的重要课题14。寻找新型的酪氨酸激酶小分子抑制物是克服STI571抵抗性的重要途径。例如，最近上市的酪氨酸激酶小分子抑制物Nilotinib(AMN107)、Dasatinib(BMS-354825)对部分(而不是全部)STI571抵抗性Bcr-Abl点突变(除T315I之外)病例有效15-17。AMN107结合Abl激酶的位置与STI571相同，也是竞争性结合到非活化构型的Abl激酶，但与Abl的亲和力比STI571更强，药效约是后者的10～50倍18。AMN107对除了T315I之外的15种点突变细胞有明显的抑制作用，IC50在10～1000纳摩尔。与STI571和AMN107不同，BMS-354825可以同时结合和抑制未活化和已活化的Bcr-Abl。BMS-354825对除了T315I之外的15种点突变细胞有明显的抑制作用，IC50在10～125纳摩尔。可见，AMN107和Dasatinib对T315IBcr-Abl无效(马军，中华肿瘤防治杂志，2006；13：561-4)。同样，AMN107和STI571对c-KITD816V点突变细胞无效。因此，研制出新型的、能有效杀伤STI571抵抗性c-KIT点突变(D816V)和Bcr-Abl点突变(包括T315I)携带细胞的小分子化合物在全球肿瘤治疗科学界和产业界都显得十分必要和迫切19。当前，国内使用的酪氨酸激酶小分子抑制物产品主要来自进口，研发技术基本受控于跨国药业垄断集团。设计、筛选和研制新型的尤其能克服STI571抵抗性的新型酪氨酸激酶小分子抑制物对我国制药业具有战略意义。
中药雷公藤系卫矛科植物，有抗炎、抗免疫、抗肿瘤、抗菌及抗生育等作用20，21。雷公藤作为中药在中国主要用于治疗类风湿性关节炎、慢性肾炎、红斑狼疮和银屑病等。雷公藤的主要活性成分雷公藤内酯醇(triptolide，TPL；也称雷公藤甲素，PG490)是一种具有松香烷骨架的二萜，并含有一个独特的三环氧结构和一个α，β-不饱和五元内酯环，其分子结构式见图6。
研究显示，TPL除了具有抗炎和抗移植排斥反应外21，还有较强的抗肿瘤作用。Fidler JM等人报道把TPL改造成PG490-88，其分子结构式见图6。PG490-88为TPL的可溶解于水的衍生物，口服后在血清中转化为TPL22。目前，PG490-88治疗肿瘤处于I期临床试验阶段22，23。TPL的抗肿瘤活性很强。早在1972年，Kupchan24就报道，TPL在体内有明显的抗鼠白血病细胞的作用。以后发现TPL对早幼粒细胞白血病、慢性粒细胞性白血病1及T细胞淋巴瘤25，多发性骨髓瘤也有抑制作用。最近Carter B等26的研究指出TPL对多种白血病细胞系包括OCI-AML3，U937，Jurkat，KBM5，KG1，HL-60，K562在纳摩尔浓度水平(～100纳摩尔，24～48h)抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡。在同一报道中，100纳摩尔TPL使培养的原代急性粒细胞性白血病(AML)细胞丧失70％的活力。在临床试验方面，福建省血液研究所于1983-1990年曾对该药物进行了初步的临床研究，根据对45例急性白血病的治疗观察，完全缓解率达47.6％，尤其对急性粒细胞白血病疗效更好，完全缓解率高达75.0％(邓福孝等，药学学报22(5)：377，1987；陈发文，陈元仲，中国博士论文数据库，2004)，提示TPL对急性粒细胞白血病的治疗很有应用前景。但是，已报道的这些肿瘤都不是c-KIT相关肿瘤，迄今尚未有TPL可以抑制c-KIT表达和治疗c-KIT相关肿瘤的文献报道。
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发明内容
本发明的目的在于提供雷公藤内酯醇的一种新用途，具体是雷公藤内酯醇(TPL)在制备治疗与c-KIT酪氨酸激酶相关的肿瘤的药物的用途。
如前所述，酪氨酸激酶是肿瘤分子靶向治疗的重要靶点。c-KIT在酪氨酸激酶域发生点突变是造成对酪氨酸激酶抑制剂STI571抵抗的重要因素。本发明首次证实小分子天然产物雷公藤内酯醇(TPL)能下调D816V点突变c-KIT蛋白的表达，并抑制其磷酸化；TPL在纳摩尔浓度水平显著抑制携有STI571抵抗性D816V c-KIT的细胞株HMC-1.2和P815的增殖(这些细胞是STI571耐受细胞)，诱导癌细胞凋亡及G1期停滞。
本发明找到了一种新的酪氨酸激酶小分子抑制物，尤其是克服了目前临床上使用的第一线酪氨酸激酶小分子抑制药物STI571的抵抗性问题。TPL可用于开发治疗c-KIT突变相关性肿瘤如胃肠间质瘤、系统性肥大细胞增多症、小细胞肺癌等的新型特效药物。
根据本发明所述的用途，所述的药物可以与抑制酪氨酸激酶的现有药物制备成复合药物制剂，例如可以将TPL与STI571(即“格列卫”)制备成复合抗癌药。
根据本发明所述的用途，所述的药物可包含有效治疗量的雷公藤内酯醇化合物和药学上可接受的药物载体。所述的雷公藤内酯醇化合物是以其在药学上可接受的盐、溶剂化物或者水合物的形式来提供的，例如前述的TPL的衍生物PG490-88等。
推测剂量和疗程：用MTS法测定TPL对细胞培养体系中的c-KIT突变细胞的IC50在100 nM，根据经验，它在临床上达到治疗效果的剂量会很低。
根据本发明所述的用途，所述的药物是口服剂型的。所述的口服剂型选自片剂或者胶囊。成人用量一般为每日0.5～100mg，1～3次口服。
根据本发明所述的用途，所述的药物是注射剂型的。所述的注射剂型选自注射液或者粉针剂。成人用量一般为每日0.05～50mg，1～2次注射。
附图说明
图1为TPL在c-KIT D816V点突变细胞对癌蛋白c-KIT表达的Western blot检测图。图中“Actin”为蛋白定量的内参标准。
图2A为TPL对携带D816V c-KIT的HMC-1.2细胞的剂量-细胞活力曲线和半数抑制率的示意图。
图2B为TPL对携带D814Y c-KIT的P815细胞的剂量-细胞活力曲线和半数抑制率的示意图。
图2C为TPL对携带V560G c-KIT的HMC-1.1细胞的剂量-细胞活力曲线和半数抑制率的示意图。
图3为TPL诱导c-KIT突变细胞凋亡的流式细胞术测定图。该图表明TPL诱导c-KIT突变细胞凋亡。
图4为用双染料标记法测定了线粒体膜电位的图；其中CMXRos和MTGreen为标记线粒体膜电位的染料，II表示线粒体膜电位降低的部分。该图表明TPL诱导细胞凋亡是通过线粒体途径。
图5为用流式细胞术(PI标记法)测定细胞周期的图。A图为正常细胞周期分布图，B图为TPL0.25μM作用c-KITD816V点突变HMC-1.2细胞24小时后细胞周期分布图。
图6为雷公藤内酯醇(triptolide，TPL)与PG490-88的分子结构式示意图。
具体实施方式
实施例一：TPL在c-KIT D816V点突变细胞对癌蛋白c-KIT表达的影响
采用小鼠源性肥大细胞瘤(mastocytoma)的P815细胞进行实验，该细胞系携带有c-KIT D814Y突变(相当于人c-KIT D816V突变)，对STI571耐受。P815为小鼠源性肥大细胞瘤，携带有KIT D814Y突变(相当于人KIT D816V突变)，对STI571不敏感。实验在P815细胞的培养体系中分别加入不同浓度的TPL，继续培养24h。对照组细胞或经不同浓度药物处理后的细胞，在不同时间收取，离心去除上清，用PBS洗2次。细胞用RIPA缓冲液(1xPBS缓冲液，1％NP-40裂解液，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS变性剂)悬浮[RIPA需新鲜加入10 mMβ-甘油磷酸、1mM原钒酸钠、10mMNaF、1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)与1x罗氏完全蛋白酶抑制剂(Roche公司，Indianapolis，IN)]。冰上孵育30min，超声粉碎，4℃、14000rpm离心10min，取上清。用Bradford法测定蛋白浓度。取20鹏蛋白经12％SDS-聚丙稀酰胺电泳(SDS-PAGE)分离。电转移至硝酸纤维素(NC)膜上。5％脱脂牛奶封闭1h，加一抗，4℃摇床过液，PBST洗3次，用HRP标记的抗鼠或抗兔二抗反应1h，PBST缓冲液洗2次，PBS缓冲液洗1次。ECL显影暗室曝光。
蛋白免疫印迹(Westem blot)检测结果如图1所示，TPL在P815细胞呈剂量依赖性下调c-KIT水平，说明TPL对STI571抵抗性c-KIT点突变细胞有效。实验结果表明，100nM的TPL显著抑制c-KIT的表达，相应的磷酸化形式的蛋白酪氨酸激酶水平也受到抑制。
结论：TPL下调STI571抵抗性D816V c-KIT蛋白酪氨酸激酶的表达。
实施例二：MTS法测定TPL在纳摩尔浓度水平对D816V c-KIT携带细胞的增殖的影响
(1)实验材料
细胞系：选择HMC-1.1、HMC-1.2和P815细胞系。HMC-1.1为人SM细胞，仅携带V560G突变，c-KIT对STI571敏感，用作对照。HMC-1.2为人SM细胞，携带D816V和V560G突变c-KIT，对STI571耐受。小鼠源性肥大细胞瘤的P815携带有KIT D814Y突变，相当于人c-KIT D816V突变，该细胞系对STI571耐受。
HMC-1.1和HMC-1.2用IMDM(Gibco公司)+10％胎牛血清(Hyclone公司)，P815用DMEM(Gibco公司)+10％胎牛血清(Hyclone公司)培养。
培养液含100u/ml青霉素，100ug/ml链霉素，于37℃、5％CO2饱和湿度条件下培养，实验所用的细胞均处于指数生长期。
TPL：购自Sigma公司，HPLC级纯品，纯度在98％以上。
(2)实验方法
用MTS法检测了TPL是否对D816V c-KIT的细胞的增殖有抑制作用。MTS(新型四唑氮盐)法与MTT(噻唑蓝)法类似，但更为简单。MTS为Promega产品。测定方法按厂家提供的说明进行。我们用对数生长的HMC-1.2、P815及HMC-1.1(用作对照)细胞分别接种于96孔板，每孔20000个细胞。设空白组(仅加培养液)对照组和药物系列倍比稀释组，每组设6个重复孔。每孔容积为100μl。加不同浓度的TPL，培养72小时终止。在终止培养前4h，加MTS20μl/孔。继续培养4h，用酶标仪读取吸光度值(A值)。按公式计算细胞活力(CellViability)，细胞活力＝(药物处理组A值-空白组A值)/(对照组A值-空白组A值)×100％。实验重复3次。绘制细胞活力(CellViability)vs药物浓度曲线。
(3)实验结果：
如图2A所示，D816Vc-KIT的HMC-1.2细胞IC50在100nM以下，提示TPL对D816Vc-KIT细胞的高效性。如图2B所示，D814Yc-KIT的P815细胞IC50在100nM以下，提示TPL对D814Yc-KIT细胞的高效性。如图2C所示，V560Gc-KIT的HMC-1.1细胞IC50在100nM以下，提示TPL对V560Gc-KIT细胞的高效性，这里用作对照。
表1.半数抑制率
| 癌基因 | 点突变 | STI571 | TPL |
| HMC-1.1 | V560G | 75nM | 14nM |
| HMC-1.2 | D816V，V560G | 耐受 | 7.1nM |
| P815 | D814Y | 耐受 | 64nM |
结论：TPL在纳摩尔浓度水平显著抑制D816Vc-KIT携带细胞的增殖。
实施例三：Annexin V/PI双标记法流式细胞术测定细胞凋亡
采用Annexin V-FITC/PI标记法用流式细胞术测定细胞凋亡。该法具有较高特异性和高敏感性，能区分正常细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞及坏死细胞。
按Sigma-Aldrich公司提供的试剂盒进行。对照组细胞或经不同浓度药物处理后的细胞，在不同时间收取，离心去除上清，用1×结合缓冲液(10mM HEPES，[pH7.4]；0.15M NaCl；5mM KCl；1mM MgCl2；1.8mM CaCl2)洗涤一次，将细胞悬浮在1×结合缓冲液中，浓度调整为2×105/mL将细胞悬液和FTIC-Annexin V混合，室温孵育15min，PI(碘化丙啶)染色细胞，迅速用流式细胞仪分析。实验至少重复3次。
结果如图3的A图所示，右下象限(LR)为早期凋亡细胞，右上象限(UR)为晚期凋亡细胞，取LR和UR的总和(即Annexin V阳性细胞群)计为凋亡细胞。实验结果提示，100nM TPL处理P815细胞24小时后，凋亡细胞(Annexin阳性细胞)达85％(图3的A图)。0.25μM TPL处理HMC-1.1细胞和HMC-1.2细胞72小时后，凋亡细胞(Annexin阳性细胞)分别达60％和33％(图3的B图)。
结论：TPL诱导c-KIT突变细胞凋亡。
实施例四：流式细胞术测定线粒体跨膜电位(ΔΨm)
本实验要阐明的问题是：TPL引起c-KIT突变细胞发生凋亡通过什么通路？TPL是否引起线粒体损伤？
用双染料标记法测定了线粒体膜电位。对照组或药物处理组细胞，在不同时间收取，离心去除上清，用PBS洗2次，细胞用线粒体染剂Mito Tracker Red(chloromethyl-X-rosamine[CMXRos])和MitoTracker Green FM(MTGreen；)暗处室温标记1h，PBS洗涤1次，细胞悬于0.5ml PBS，上流式细胞仪分析。在CMXRos vs MTGreen图上(图4)，I区为正常细胞群，II区为ΔΨm降低的细胞群。比较对照组和加药组II区细胞群，可发现TPL导致II区的细胞比例由对照组的4％升高到90％。
结论：TPL导致c-KIT突变细胞的线粒体损伤。
实施例五：TPL对c-KIT突变细胞的细胞周期分布的影响
实验目的：由于TPL抑制c-KIT突变细胞的生长，因此有必要检查TPL是否影响c-KIT突变细胞的细胞周期分布。
实验方法：将TPL处理的三株c-KIT突变细胞(HMC-1.2、P815及HMC-1.1)，在不同时间点收取，然后经酒精固定，用流式细胞术(PI标记法)测定细胞周期。
实验结果：如图5所示，025μM的TPL在72h诱导HMC-1.2细胞发生G1期停滞，而对HMC-1.1和P815细胞的细胞周期分布无明显影响。该图表明TPL影响c-KIT突变细胞周期分布，引起细胞生长停滞。
结论：TPL诱导HMC-1.2细胞发生G1期停滞。
基于上述实施例一至五的实验结果，TPL是一种作用机制与STI571不同的新型c-KIT小分子抑制剂，可用于开发治疗c-KIT突变相关性肿瘤如胃肠间质瘤、系统性肥大细胞增多症、小细胞肺癌等的特效药物。
实施例六：以TPL配制的片剂
将TPL加入适量淀粉制成软材，用10目筛制粒，干燥，干粒加入硬脂酸镁，混匀，压片机压片成片剂，薄膜包衣，分装，即得包衣片剂。
TPL可以其在药学上可接受的盐、溶剂化物或者水合物的形式来提供，以类似的方法配制为片剂。
实施例七：以TPL配制的胶囊剂
将TPL与辅料混合制成粉末，过100-120目左右筛，装胶囊，分装，即得胶囊剂。
TPL可以其在药学上可接受的盐、溶剂化物或者水合物的形式来提供，以类似的方法配制为胶囊剂。
实施例八：以TPL配制的注射液
取TPL的水溶性盐100g，加入注射用水溶解样品，用盐酸调pH值，补充水至10000毫升，无菌罐装于1毫升安瓿瓶中，即得注射剂。
TPL可以其在药学上可接受的盐、溶剂化物或者水合物的形式来提供，以类似的方法配制为注射液。
实施例九：以TPL配制的粉针剂
取TPL的水溶性盐100g，加入注射用水溶解样品，用盐酸调pH值，补充水至10000毫升，无菌灌装于1毫升安瓿瓶中，经冷冻干燥后，在无菌条件下密封，即得粉针剂。
TPL可以其在药学上可接受的盐、溶剂化物或者水合物的形式来提供，以类似的方法配制为粉针剂。
Claims (8)
1.雷公藤内酯醇作为唯一活性成分在制备治疗与c-KIT酪氨酸激酶相关的胃肠间质瘤或系统性肥大细胞增多症的药物的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的药物与抑制酪氨酸激酶的现有药物制备成复合药物制剂。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的药物包含有效治疗量的雷公藤内酯醇化合物和药学上可接受的药物载体。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述的雷公藤内酯醇化合物是以其在药学上可接受的盐的形式来提供的。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的药物是口服剂型的。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述的口服剂型选自片剂或者胶囊。
7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的药物是注射剂型的。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述的注射剂型选自注射液或者粉针剂。
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