CN103893168A - 异虎耳草素作为制备抗肿瘤药物以及抗癌逆转剂方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及异虎耳草素在作为制备抗肿瘤药物以及抗癌逆转剂方面的应用。本发明针对肿瘤的病理生理特点，既可以改变肿瘤的病理变化，又可以增强其他化疗药物在肿瘤组织和细胞的药物浓度，以达到化疗药物的增效减毒作用。本发明公开了高纯度的异虎耳草素光谱分析结构确证、制备工艺方法、稳定性研究、急性毒性研究、含异虎耳草素的药物组合物，以及该天然产物新的药物用途。将中药蛇床子经过乙醇提取，大孔吸附树脂脱色富集，以及树脂分离纯化等工艺步骤处理，得到纯度在98％以上的异虎耳草素。本发明异虎耳草素药理活性的研究表明，其具有明显的抗肺癌、抗肝癌、抗宫颈癌肿以及对白细胞减少症有升白作用等药理活性。异虎耳草素有望研制成为低毒高效且具有多种药理功效的天然中药成分的肿瘤防治新药及抗癌逆转剂，即肿瘤辅助治疗用药。

Description

异虎耳草素作为制备抗肿瘤药物以及抗癌逆转剂方面的应用

技术领域：本发明涉及从蛇床子中分离得到的高纯度天然化合物异虎耳草素及其用于肿瘤防治和肿瘤辅助治疗用药方面的应用。 

背景技术：恶性肿瘤是目前危害人类健康导致死亡最为严重的疾病之一。流行病学调查表明我国不仅肿瘤死亡率呈明显上升趋势，而且兼有发展中国家和发达国家高发谱并存的特点。20世纪90年代我国肿瘤发病率已上升为127例/10万人。近年来我国每年新增肿瘤患者160万～170万人，总数估计在450万人左右。为此，世界各国都投入大量的人力和财力对肿瘤的防治进行研究。目前，肿瘤的治疗一般采用手术切除、放射治疗、化学药物治疗以及上述方法结合应用等治疗方法。放化疗在临床使用上由于其较大的副作用而收效甚微，而手术切除又难以防止其复发，为了防止其复发，手术后仍然要使用化疗药物进一步治疗。最近，研究发现很大程度上化疗药物在治疗肿瘤方面疗效发挥不佳的主要原因，与肿瘤细胞多药耐药性基因编码的存在于细胞膜上的一种固有蛋白——P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)有关。单克隆抗体免疫定位研究表明，P-gp分布于多数肿瘤细胞与正常组织细胞中，特别是胃、肠道下段的柱状上皮细胞、脑与睾丸毛细血管内皮细胞、肝细胞的胆管侧膜与肾近曲小管刷状缘，其在不同个体之间的表达差异由MDR/mdr基因型决定。这些细胞大多位于药物吸收、分布、代谢与排泄的关键部位，对药物的体内过程起重要作用。P-gp选择性分布于体内药物的“入口”与“出口”等关键部位，对药物吸收、分布、代谢与排泄等体内过程具有重要意义。在肿瘤细胞和组成血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)的脑毛细血管内皮细胞(braincapillary endothelial cells，BCEC)上均有高度表达。它以一种ATP依赖性的方式将多种化疗药物以及其它疏水性化合物经主动转运排出细胞外，阻止许多治疗药进入肿瘤细胞和脑内，是肿瘤产生MDR以及许多药物难以透过BBB的主要原因之一。如果能够寻找和开发抑制P-gp功能的P-gp逆转剂，将治疗药物与P-gp逆转剂合用能增加治疗药在靶组织的药物浓度，这将有助于更好地治疗恶性肿瘤和中枢神经系统(CNS)疾病。 

从中药蛇床子中分离得到的天然化合物异虎耳草素，一方面具有抗肿瘤作用，另一方面又具有抑制P-糖蛋白(P-gp)的作用，从而可以作为抗癌逆转剂开发应用，即和化疗药物联合使用既能够增强抗肿瘤的作用，又能够减少化疗药物的毒副作用，这一发现和应用尚未见报道。 

发明内容

本发明的目的在于公开了从中药蛇床子中分离得到的高纯度天然化合物异虎耳草素作为 制备肿瘤治疗药物和肿瘤辅助治疗药物中的应用，它一方面具有抗肿瘤作用，一方面又具有抑制P-糖蛋白(P-gp)的作用，可以作为P-gp逆转剂和化疗药物联合用药，既能够增强抗肿瘤的作用，又能够减少化疗药物的毒副作用的特点。 

本发明涉及的高纯度天然化合物异虎耳草素是从伞形科蛇床属植物蛇床(Cnidiummonnieri(L.)cusson)的果实中分离得到的单体化合物，其结构为： 

分子式：C₁₃H₁₀O₅

我们对天然单体化合物异虎耳草素进行加速实验考察(高温、高湿、强光照射)，结果发现其对高温、高湿、强光照射稳定，无分解，纯度及理化指标不变。技术指标达到一类新药报批的要求。结果见表1。 

表1异虎耳草素加速稳定性实验考察 

异虎耳草素经UV、IR、MS、¹H-NMR、¹³C-NMR、熔点测定、TLC及性状分析与文献报道相一致。 

异虎耳草素具有如下性质：在显微镜下其为草绿色针状结晶，在紫外灯下显棕黄色荧光。 

熔点Mp：149-151℃； 

TLC比移值Rf为：0.456(石油醚∶乙酸乙酯8∶2) 

光谱分析 

UVλ^EtOHmax(nm)：241，248，270，313 

IR v^KBrmax(cm^-1)：3125-3050(CH)，1720(＞C＝O)，1582，1470(苯环)。 

¹H-NMR(CDCl₃)：4.17(6H，s，C_5，8-OCH₃)，6.28(1H，d，J＝20Hz，C₃-H)，6.99(1H，d，J＝5Hz，C_4′-H)，7.62(1H，d，J＝5Hz，C_5′-H)，8.12(1H，d，J＝20Hz，C₄-H)。 

¹³C-NMR：60(2-OCH₃)，105(呋喃环碳)，112(苯环碳)，139(共轭碳)， 

145(羰基碳)。 

MS m/z：246(M⁺)，231，203，175，160。 

以上光谱数据与文献比较，并与标准品一起测混合熔点不下降，故确定该化合物为异虎耳草素(Isopimpinellin)。 

其在伞形科植物蛇床的干燥成熟果实蛇床子(Fructus.cnidii)中含量较低，平均得率为0.04％。异虎耳草素虽然含量不高，但却是蛇床子中所含的主要活性成分之一。其具有广泛的药理活性：如抗过敏、抗病毒，镇痛解痉、抗骨质疏松、抑制血小板聚集、治疗肝炎、增强免疫功能和补肾壮阳等功效，因而受到人们的普遍关注，通过专利和文献检索，目前尚未有将其作为抗肿瘤药物和抗癌逆转剂方面的研究开发。 

本发明的目的在于公开了异虎耳草素在用于制备抗肿瘤药物和抗癌逆转剂方面的应用；本发明的另一个目的在于公开了含有治疗有效量的异虎耳草素及一种或一种以上的药学上可接受的载体组成的药物组合物。 

药物组合物 

本发明的以异虎耳草素为活性成分的药物组合物，含有治疗有效量的异虎耳草素及一种或一种以上的药学上可接受的载体，其中所述的异虎耳草素治疗有效量为2-100mg/kg，较好为5-50mg/kg，最佳为10-25mg/kg。 

所述的组合物包括口服制剂、注射油剂或外用制剂，其中口服制剂为片剂、各种胶囊、缓释片或滴丸；液体制剂为注射用油剂，外用制剂为霜剂、膏剂、油剂或甘油制剂。 

所述的药学上可接受的载体，包括制剂中常规的稀释剂、填充剂(如甘露醇、乳糖、聚 乙二醇)、粘合剂(淀粉、微晶纤维素)、崩解剂(如羧甲基纤维素、低取代羟丙基纤维素)、润滑剂(如滑石粉、硬脂酸镁)、湿润剂(如丙二醇、乙醇)、稳定剂(EDTA-2Na，硫代硫酸钠、烟酰胺)等。上述辅料可以是常用剂量，以常用的配比与异虎耳草素混合，当异虎耳草素用量确定后，各药用辅料之间的配比可以根据需要适当调节。 

压片制成片剂使用，用作赋形剂的辅料有MgSO4、淀粉、滑石粉，规格有：2mg、5mg、10mg、15mg、20mg。 

异虎耳草素油剂：将异虎耳草素溶于注射用茶油、豆油等配制成注射油剂。 

各种药物制剂的制备具体操作如下： 

(1)按配制总量计称取含10-70％异虎耳草素，加入30-90％的填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂等，充分搅拌混合制成颗粒，在60-70℃干燥24小时，压制成片剂，使每片含异虎耳草素2-20mg。 

(2)将制成的湿颗粒直接在60-70℃干燥24小时，然后填充入空胶囊壳中，使每粒胶囊含含异虎耳草素2-20mg。 

(3)油剂的制备：是取1-10％的异虎耳草素与注射用油，如茶油配制油剂，分装灭菌制得。 

(4)按配制总量计，称取10-60％异虎耳草素，加入40-90％的填充剂、抗氧剂等，加热熔融温度100-150℃，使原料和辅料充分混熔，滴制成丸，使每粒滴丸含异虎耳草素2-20mg。 

本发明的施药量可根据用药途径、患者年龄、体重、疾病类型和严重程度等诸多因素加以调整，日剂量一般为2-100mg/kg；较好为5-50mg/kg；最佳为10-25mg/kg，可根据临床的病例表现适当加以改变。 

本发明公开了高纯度天然化合物异虎耳草素在用于制备抗肿瘤药物和抗癌逆转剂方面的应用，其中所述的抗肿瘤活性包括：制备治疗肺癌、肝癌、宫颈癌药物方面的应用。 

下面的药理实验证实了异虎耳草素具有上述药理作用。 

药效学实验研究包括： 

(1)体外抗肿瘤实验 

(2)体内抗肿瘤实验 

(3)P-糖蛋白抑制实验 

(4)与化疗药物联合使用的增效减毒作用的实验 

(5)提高免疫功能实验 

(6)升高白细胞实验 

(7)急性毒性实验 

一、体外抑瘤实验 

(1)接种细胞：取对数生长期细胞，经0.02％EDTA消化后加入含有10-15％胎牛血清的RPMI-1640溶液，将细胞稀释成单细胞悬液，计数并调整细胞数，并接种于96孔板，将接种后的细胞置37℃二氧化碳培养箱内培养24小时。 

(2)加药：将样品A、B分设1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200、400ug/ml等不同浓度，每浓度设4个复孔，对照设8个以上复孔。被检样品用RPMI-1640稀释，用DMSO助溶。加药后仍将细胞置37℃二氧化碳培养箱内继续培养72小时。 

(3)加MTT：MTT以RPMI-1640溶解，每孔加50ul。再置37℃二氧继续培养4小时后取出。 

(4)测OD值：弃除96孔板内的上清液，每孔加入DMSO150ul，在酶标仪630nm处测OD值。 

评价指标：细胞生长抑制率：抑制率＝(1-实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100％，以直线回归方法计算IC₅₀。 

结果：对人肺腺癌细胞系A549的细胞毒性作用，IC₅₀为58.76ug/ml，对肝癌细胞系Bel-7402的细胞毒性作用，IC₅₀为96.67ug/ml。见表2 

表2异虎耳草素体外细胞毒性参数测定结果 

二、体内抑瘤实验 

(一)对小鼠S₁₈₀肉瘤的抑制作用： 

1.材料 

1.1动物选择：45天昆明种雄性小鼠，体重18-22g，共60只，小鼠购自南京中医药大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK(苏)2002-0012。 

1.2S₁₈₀肉瘤：瘤株由上海肿瘤研究所提供；环磷酰胺(CPP)：上海华联制药公司生产，批号：20031205。 

1.3药物配制：取含量为98.7％的异虎耳草素，研细并配制成浓度为0.03mg/ml、0.06mg/ml、0.12mg/ml、的混悬液，溶剂为蒸馏水，给药时摇匀。 

2.抑瘤实验：无菌条件下，抽取接种传代第8天S₁₈₀肉瘤小鼠的腹水，用生理盐水1：4稀释，混匀后加少量肝素，于动物右侧腋窝皮下注射0.2ml/只，然后随机分为7组，即治疗组(阳性对照组)、肿瘤对照组(阴性对照组)和试验组(I-III组)。每组10只。接种后第2天，开始口服灌胃给药0.3ml/只，折合剂量为0.45mg/kg，0.9mg/kg，1.8mg/kg，连续给药10天。肿瘤对照组不给药，治疗组(阳性对照组)给予腹腔注射环磷酰胺(CPP)20mg/kg连续10天。10天后处死小鼠并称体重，然后分离瘤体、肝、脾及胸腺称重，计算抑瘤率、脾指数和胸腺指数，统计体重增长和肝重。 

3.疗效评价 

3.1肿瘤生长抑制率 

计算公式：肿瘤生长抑制率＝(1-试验组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100％ 

3.2统计分析方法：数据以“x±s”表示，组间比较采用t和F检验。 

4.结果 

4.1抑制S₁₈₀肉瘤的生长：异虎耳草素在剂量为0.45～1.8mg/kg之间对S₁₈₀肉瘤有明显的抑制作用，与肿瘤空白对照组比较具有显著性差异(P＜0.01)。表明异虎耳草素在0.45～1.8mg/kg剂量能较明显地抑制昆明小鼠S₁₈₀肉瘤的生长，其中中剂量组0.9mg/kg抑瘤率达到71.82％，实验结果见表3。 

4.2异虎耳草素对荷肉瘤S₁₈₀小鼠各脏器指标的影响 

阳性对照组(CPP)使荷瘤小鼠的体重、肝重及免疫指标(脾指数和胸腺指数)明显下降，与空白对照组比较具有显著差异，而异虎耳草素组的这些指标与空白对照组无显著差异。表明环磷酰胺(CPP)对荷瘤小鼠的损伤较大，经统计学比较与空白对照组具有显著性差异(P＜0.001)；而异虎耳草素的几个剂量组对荷瘤小鼠的体重、肝重、脾指数和胸腺指数均无明显变化，表明异虎耳草素对肿瘤具有低毒、高效的抑瘤活性，这是其区别与化疗药物的不同之处。实验结果见表4。 

表3异虎耳草素对S₁₈₀肉瘤的抑制率及对小鼠体重的影响 

与肿瘤对照组比较^*P＜0.01，^**P＜0.001 

表4异虎耳草素对荷肉瘤S₁₈₀小鼠各脏器指标的影响 

与肿瘤对照组比较^**P＜0.001 

(二)对小鼠肺腺癌spc-A-1的抑制作用： 

1.材料 

1.1实验动物：6-7周龄雄性BALB/C裸鼠，购自南京中医药大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK(苏)2002-0012。 

羟基喜树碱：湖北黄石飞云制药有限公司生产(批号：20030321，5mg/支) 

1.2肿瘤细胞：肺腺癌spc-A-1瘤株由上海肿瘤研究所提供。 

1.3DR-70试剂盒：即肺癌酶联定量试剂盒，购自北京美迪克公司(AMDL.INC.公司产品编号BP-89) 

2.方法 

2.1肺腺癌(spc-A-1)荷瘤小鼠的建立：spc-A-1细胞常规培养于含12％新生小牛血清、0.25mmol/L Hepes、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的RP-MI1640培养基中，调整细胞数为5×10⁵/ml。经台盼兰染色，细胞存活力大于95％。取细胞悬液0.2ml/只接种于裸 鼠背部皮下。 

2.2药物配制：取含量为98.7％的异虎耳草素，研细并配制成浓度为0.05mg/ml、0.10mg/ml、0.15mg/ml、的混悬液，溶剂为蒸馏水，给药时摇匀。 

2.抑瘤实验：皮下接种肺腺癌spc-A-1细胞的50只裸鼠，随机分为5组，即治疗组(阳性对照组)、肿瘤对照组(阴性对照组)和试验组(I-III组)。每组10只。接种后第2天，开始口服灌胃给药0.3ml/只，折合剂量为0.75mg/kg，1.50mg/kg，2.25mg/kg，连续给药10天。肿瘤对照组不给药，只注射同体积的生理盐水；治疗组(阳性对照组)给予腹腔注射羟基喜树碱(OPT)1.5mg/kg连续10天。停药后分别处死动物，分离瘤体，用电子天平称瘤重和体重，记录体重变化情况。 

3.疗效评价 

3.1肿瘤生长抑制率 

计算公式：肿瘤生长抑制率＝(1-试验组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100％ 

3.2测定DR-70：用小鼠血清10ul按说明书在波长λ＝450nm处测OD值。在试验中，采10只健康裸鼠血清测定DR-70的OD值，以其平均值作为裸鼠的正常值。(健康人的DR-70^Tm＜8ug/ml)。 

3.4统计分析方法：数据以“x±s”表示，组间比较采用t和F检验。 

4.结果 

4.1抑制肺腺癌spc-A-1的生长：异虎耳草素在剂量为0.75～2.25mg/kg之间对肺腺癌spc-A-1有明显的抑制作用，与肿瘤空白对照组比较具有显著性差异(P＜0.01)。表明异虎耳草素在0.75～2.25mg/kg剂量能较明显地抑制昆明小鼠肺腺癌spc-A-1的生长，其中高剂量组2.25mg/kg抑瘤率达到72.41％，并随着剂量的增加对小鼠肺腺癌spc-A-1的抑制作用逐渐增强，呈现一定的剂量关系。阳性对照组(OPT)使小鼠的体重明显下降，与空白对照组比较具有显著差异，而异虎耳草素的3个剂量组对小鼠体重的影响与空白对照组无显著差异。表明羟基喜树碱(OPT)对荷瘤小鼠的损伤较大；而异虎耳草素毒副作用较低，这是其区别与化疗药物的不同之处。 

实验结果见表5。 

表5异虎耳草素对肺腺癌spc-A-1的抑制率及对小鼠体重的影响 

与肿瘤对照组比较^**P＜0.01 

4.2异虎耳草素对DR-70值的影响：DR-70是肺癌标志物，在一定程度上反映癌症的转归和治疗效果。异虎耳草素3个剂量组与对照组比较，血清DR-70水平明显降低，表明异虎耳草素对癌组织浸润机体有一定抑制作用。实验结果见表6。 

表6异虎耳草素对DR-70值的影响 

与肿瘤对照组比较^*P＜0.01 

(三)对小鼠肝癌H₂₂的抑制作用： 

1.材料 

1.1实验动物：所用实验动物为昆明种小鼠60只，雌雄各半，体重为20±2g，购自南京中医药大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK(苏)2002-0012。 

1.2肿瘤细胞：肝癌H₂₂瘤株由上海肿瘤研究所提供。 

2.方法 

2.1肝癌H₂₂荷瘤小鼠的建立：解剖前实验室用紫外灯消毒3小时，选择生长6-7天的传代腹水癌小鼠数只，脱臼处死后酒精消毒腹部，取出生长较好的腹水癌按1∶2的比例稀释，癌细胞计数为5.2×10⁷个/ml接种在小鼠的右上肢腋下，每只接种0.2ml。 

2.2药物配制：取含量为98.7％的异虎耳草素，研细并配制成浓度为0.05mg/ml、0.10mg/ml、0.15mg/ml、的混悬液，溶剂为蒸馏水，给药时摇匀。 

2.抑瘤实验：接种肝癌细胞H₂₂的50只小鼠，随机分为5组，即治疗组(阳性对照组)、肿瘤对照组(阴性对照组)和试验组(I-III组)。每组10只。接种后第2天，开始口服灌胃给药0.3ml/只，折合剂量为0.75mg/kg，1.50mg/kg，2.25mg/kg，连续给药10天。肿瘤对照组不给药，只注射同体积的生理盐水；治疗组(阳性对照组)给予腹腔注射顺 铂4mg/kg，每间隔1天每只ip给药0.2ml/d，给药3次。 

3.观察指标：停药后分别处死动物，分离瘤体、肝、脾及胸腺，分别用电子天平称重和体重，记录体重变化情况，计算抑瘤率、脾指数和胸腺指数，统计体重增长和肝重。 

3.1肿瘤生长抑制率 

计算公式：肿瘤生长抑制率＝(1-试验组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100％ 

3.2统计分析方法：数据以“x±s”表示，组间比较采用t检验。 

4.结果 

4.1抑制肝癌H₂₂的生长：异虎耳草素在剂量为0.75～2.25mg/kg之间对肝癌H₂₂有明显的抑制作用，与肿瘤空白对照组比较具有显著性差异(P＜0.01)。表明异虎耳草素在0.75～2.25mg/kg剂量能较明显地抑制昆明小鼠肝癌H₂₂的生长，其中中剂量组1.50mg/kg抑瘤率达到62.13％，实验结果见表7。剂量为0.75mg/kg，1.50mg/kg，2.25mg/kg的异虎耳草素能较明显地抑制肝癌H₂₂的生长。 

表7异虎耳草素对肝癌H₂₂的抑制率及对小鼠体重的影响 

与肿瘤对照组比较^*P＜0.01，^**P＜0.001 

4.2异虎耳草素对肝癌H₂₂小鼠各脏器指标的影响 

阳性对照组(顺铂)使荷瘤小鼠的体重、肝重及免疫指标(脾指数和胸腺指数)明显下降，与空白对照组比较具有显著差异，而异虎耳草素组的这些指标与空白对照组无显著差异。表明顺铂对荷瘤小鼠的脏器有较大损伤，经统计学比较与空白对照组具有显著性差异(P＜0.001)；而异虎耳草素的几个剂量组对荷瘤小鼠的体重、肝重、脾指数和胸腺指数均无明显变化，表明异虎耳草素对肿瘤具有低毒、高效的抑瘤活性，这是其不同与化疗药物的显著特点。实验结果见表8。 

表8异虎耳草素对肝癌H₂₂小鼠各脏器指标的影响 

与肿瘤对照组比较*^*P＜0.001 

(四)对小鼠宫颈癌U₁₄的抑制作用： 

1.材料 

1.1实验动物：所用实验动物为昆明种小鼠60只，雌雄各半，体重为20±2g，购自南京中医药大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK(苏)2002-0012。 

1.2肿瘤细胞：宫颈癌U₁₄瘤株由上海肿瘤研究所提供。 

2.方法 

2.1宫颈癌U₁₄荷瘤小鼠的建立：解剖前实验室用紫外灯消毒3小时，选择生长6-7天的传代腹水癌小鼠数只，脱臼处死后酒精消毒腹部，取出生长较好的腹水癌按1∶2的比例稀释，癌细胞计数为3.5×10⁷个/ml接种在小鼠的左侧腋窝处皮下，每只接种0.2ml。 

2.2药物配制：取含量为98.7％的异虎耳草素，研细并配制成浓度为0.05mg/ml、0.10mg/ml、0.15mg/ml、的混悬液，溶剂为蒸馏水，给药时摇匀。 

2.抑瘤实验：接种宫颈癌U₁₄的50只小鼠，随机分为5组，即治疗组(阳性对照组)、肿瘤对照组(阴性对照组)和试验组(I-III组)。每组10只。接种后第2天，开始口服灌胃给药0.3ml/只，折合剂量为0.75mg/kg，1.50mg/kg，2.25mg/kg，连续给药10天。肿瘤对照组不给药，只注射同体积的生理盐水；治疗组(阳性对照组)给予腹腔注射环磷酰胺(CPP)20mg/kg，每只ip给药0.3ml/d，连续给药10天。 

3.观察指标：停药后分别处死动物，分离瘤体、肝、脾及胸腺，分别用电子天平称重和体重，记录体重变化情况，计算抑瘤率、脾指数和胸腺指数，统计体重增长和肝重。 

3.1肿瘤生长抑制率 

计算公式：肿瘤生长抑制率＝(1-试验组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100％ 

3.2统计分析方法：数据以“x±s”表示，组间比较采用t检验。 

4.结果 

4.1抑制宫颈癌U₁₄的生长：剂量为0.75mg/kg，1.50mg/kg，2.25mg/kg的异虎耳草素能较明显地抑制宫颈癌U₁₄的生长。与肿瘤对照组比较，经统计学分析上述3个 剂量组瘤重和抑瘤率都呈显著性差异(P＜0.01)，而小剂量组0.75mg/kg抑瘤效果最佳，抑瘤率为60.62％，表明异虎耳草素对不同肿瘤的抑制作用具有一定的剂量选择性；从下表可以看出阳性对照组环磷酰胺(CPP)能够使荷瘤小鼠的体重明显下降，与空白对照组比较具有显著差异(P＜0.001)，而异虎耳草素组与空白对照组无显著差异。表明环磷酰胺对荷瘤小鼠有一定的损伤；而异虎耳草素的几个剂量组对荷瘤小鼠的体重均无明显影响，表明异虎耳草素具有低毒、高效的特点。实验结果见表9。 

表9异虎耳草素对宫颈癌U₁₄的抑制率及对小鼠体重的影响 

与肿瘤对照组比较^*P＜0.01 

三、P-糖蛋白抑制试验 

1.材料： 

1.1药物：异虎耳草素由本室自行制备，含量：98.7％；K562/ADM MDR 

细胞株：上海细胞所提供；阿霉素、维拉帕米均为Sigma公司产品。 

2、方法：K562/ADM MDR细胞株用含15％小牛血清的RPMI 1640培养基温孵，于5％CO₂，37℃培养，培养基中加入阿霉素(2μM)以维持其耐药性，并于筛选实验前一周，用不含阿霉素的RPMI1640进行培养，以免影响筛选结果。胞内Rh123的积累采用流式细胞仪测定。在受试管中，分别加入培养液200μl(细胞浓度约为5*10⁸个/L)；Rh123 25μl(终浓度5μM)；药液25μl(受试药物浓度为0.1-100μM)。在阳性对照管中，分别加入同样体积与浓度的培养液和Rh123，维拉帕米25μl(终浓度为10μM)。另外，在空白管中，分别加入同样体积与浓度的培养液和Rh123，DMSO缓冲液25μl。各管孵育90min，用冰冷的PBS洗两次重悬，在激发波长为488nm，发射波长为535nm条件下，用流式细胞仪检测胞内荧光强度，每个样品取10000个细胞，经统计分析，取平均值，胞内Rh123的累积浓度通过标准曲线求得，结果见表10和图1。 

Effect of compounds on intracellur accumulation of Rh 123 in K562/ADM cells。Cellswere preincubated with each compound at 37℃ for 30min and then the accumulationof Rh123(10μmol.L^-1)was measured for 90min.n＝3. 

Increased percentage of fluorescence(％)＝(fluorescence of drug treated-fluorescenceof solvent control)/fluorescence of solvent control x 100％ 

表10异虎耳草素对K562/ADM MDR细胞株的抑制作用 

[0152] 附图说明

图1异虎耳草素的对MDR细胞株抑制作用的IC50曲线图 

四、异虎耳草素对荷瘤小鼠免疫功能影响试验 

(一)、异虎耳草素对体液免疫功能影响 

1.材料： 

1.1药物：异虎耳草素由本室自行制备，含量：98.7％；环磷酰胺，上海华联制药有限公司生产，批号：20031205。 

1.2实验动物：所用实验动物为昆明种小鼠，雌性，体重为20±2g，购自南京中医药大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK(苏)2002-0012。 

1.3S₁₈₀肉瘤：瘤株由上海肿瘤研究所提供。 

2.方法与结果 

2.1药物配制：取含量为98.7％的异虎耳草素，研细并配制成浓度为0.03mg/ml、0.06mg/ml、0.12mg/ml、的混悬液，溶剂为蒸馏水，给药时摇匀。 

2.2实验方法与结果：取昆明种小鼠50只，均皮下接种S₁₈₀肉瘤，次日随机分成5组，即阳性对照组(环磷酰胺组)、空白对照组和试验组(I-III组)。每组10只。试验组开始口服灌胃给药0.3ml/只，折合剂量为0.75mg/kg，1.50mg/kg，2.25mg/kg，连续给药10天。肿瘤对照组不给药，只注射同体积的生理盐水；阳性对照组给予腹腔注射环磷酰胺(CPP)20mg/kg，每只ip给药0.3ml/d，连续给药10天。给药第5天各动物腹腔注射羊红细胞0.2ml(约4×10⁸个细胞)致敏，各小组小鼠在致敏后第4日，摘眼球取血，收集血清，进行溶血素测定，结果用HC₅₀(抗体积数)表示。结果见表11。 

表11异虎耳草素对S₁₈₀荷瘤小鼠体液免疫功能的影响(X±SD) 

注：*表示抑制作用；☆表示促进作用 

从表中可以看出，异虎耳草素三个剂量组均具有明显地促进荷瘤小鼠的体液免疫功能的作用，与空白对照组比较具有显著差异(P＜0.05)；而环磷酰胺具有显著地抑制体液免疫功能的作用(P＜0.001)。 

(二)、异虎耳草素对非特异性免疫功能影响 

1.材料： 

1.1药物：异虎耳草素由本室自行制备，含量：98.7％。 

1.2实验动物：所用实验动物为昆明种小鼠，雌性，体重为20±2g，购自南京中医药大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK(苏)2002-0012。 

1.3S₁₈₀肉瘤：瘤株由上海肿瘤研究所提供。 

2.方法与结果 

2.1药物配制：取含量为98.7％的异虎耳草素，研细并配制成浓度为0.03mg/ml、0.06mg/ml、0.12mg/ml、的混悬液，溶剂为蒸馏水，给药时摇匀。 

2.2实验方法与结果：取昆明种小鼠50只，其中40只均皮下接种S₁₈₀肉瘤，次日随机分成4组，即空白对照组(肿瘤对照组)和试验组(I-III组)。每组10只。试验组开始口服灌胃给药0.3ml/只，折合剂量为0.75mg/kg，1.50mg/kg，2.25mg/kg，连续给药10天。肿瘤对照组不给药，只注射同体积的生理盐水；正常对照组10只小鼠不接种肿瘤细胞，只注射同体积的生理盐水。实验第12天脱颈椎处死小鼠，腹腔注射给Hank’s液5ml，轻揉1分钟，经腹腔吸取腹腔洗液，离心，取沉淀细胞，用完全1640调整MΦ(吞噬细胞)浓度至1×10⁵/ml，每一样品吸取0.1ml加入96孔板中，一式2份，再加入³H-TdR标志的L₉₂₉细胞(2×10⁴/ml)0.1ml，37℃5％二氧化碳培养箱内培养16小时，收集细胞，测定CPM，结果用细胞毒指数(CI)表示。结果见表12。 

表12异虎耳草素对S₁₈₀荷瘤小鼠MΦ功能的影响(X±SD) 

从表中可以看出，异虎耳草素三个剂量组均具有明显地提高荷瘤小鼠吞噬细胞功能的作用，表明其具有促进荷瘤小鼠非特异性免疫功能的作用，与空白对照组比较具有显著差异(P＜0.05)。 

(三)、异虎耳草素对细胞免疫的影响 

取昆明种小鼠60只，其中50只均皮下接种Lewis肺癌，次日随机分成5组，即阳性对照组(环磷酰胺组)、空白对照组(肿瘤对照组)和试验组(I-III组)。每组10只。试验组开始口服灌胃给药0.3ml/只，折合剂量为0.45mg/kg，0.9mg/kg，1.8mg/kg，连续给药20天。肿瘤对照组不给药，只注射同体积的生理盐水；正常对照组10只小鼠不接种肿瘤细胞，只注射同体积的生理盐水。实验第22天，处死小鼠，无菌取脾脏，采用Con诱导的³H-TdR掺入法测定T淋巴细胞转化功能，结果见表13。 

表13异虎耳草素对Lewis肺癌小鼠T淋巴细胞转化功能的影响(X±SD) 

注：*表示抑制作用；☆表示促进作用 

从表中可以看出，异虎耳草素各剂量组对Lewis肺癌荷瘤小鼠的T淋巴细胞功能均有一定地促进作用，其中0.9mg/kg和1.8mg/kg剂量组作用最显著(P＜0.01)；而环磷酰胺对Lewis肺癌荷瘤小鼠的T淋巴细胞功能均有明显地抑制作用。 

以上实验表明，异虎耳草素可以通过提高机体的免疫功能而发挥其抗癌的作用，从而降低化疗药物的毒副作用。 

五、异虎耳草素升高白细胞试验 

1.材料 

1.1药物：异虎耳草素由本室自行制备，含量：98.7％。环磷酰胺，上海华联制药有限公司生产，批号：20031205。人参养荣丸，哈尔滨制药厂生产，批号：20030512。 

1.2实验动物：所用实验动物为昆明种小鼠，雌性70只，体重为20±2g，购自南京中医药大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK(苏)2002-0012。 

2.方法 

2.1分组：取昆明种小鼠随机分为6组，即正常对照组、空白对照组、阳性对照组(人参养荣丸)、试验组I～III。 

2.2白细胞抑制模型的建立：腹腔注射环磷酰胺，剂量20mg/kg，连续10天，造成白细胞减少模型。 

2.3药物配制：取含量为98.7％的异虎耳草素，研细并配制成浓度为0.05mg/ml、0.10mg/ml、0.15mg/ml、的混悬液，溶剂为蒸馏水，给药时摇匀。 

2.3给药：正常对照组、空白对照组灌胃生理盐水0.3ml/只，阳性对照组灌胃给药人参养荣丸相当于10g生药/kg，试验组I～III分别灌胃给药0.3ml/只，分别相当于0.75mg/kg、1.5mg/kg、2.25mg/kg，连续给药10天。 

3.结果分析 

造模前后及给药前后分别采取小鼠外周血作白细胞计数和分类，采用t检验进行数据处理，试验结果见表14、15。 

表14异虎耳草素对环磷酰胺所致小鼠白细胞总数减少的影响 

注：^△与给CPP前比较P＜0.001；^*与对照组比较P＜0.05；^☆P＜0.01 

表15异虎耳草素对环磷酰胺所致小鼠白细胞分类的影响 

注：^△与给CPP前比较P＜0.001；^*与对照组比较P＜0.05；^☆P＜0.01 

通过上表可以看出，造模前后小鼠外周血白细胞变化明显，腹腔注射环磷酰胺后小鼠外周血白细胞数量显著下降(P＜0.001)，而口服灌胃给予中药和异虎耳草素后，小鼠外周血白细胞数量显著上升，其中异虎耳草素2.25mg/kg组最为显著(P＜0.01)；而免疫抑制剂环磷酰胺主要杀伤外周血白细胞中的中性粒细胞，对骨髓造血干细胞起抑制作用，而口服灌胃给予中药和异虎耳草素后，小鼠外周血白细胞中的中性粒细胞显著恢复上升，其中异虎耳草素2.25mg/kg组最为显著(P＜0.01)；表明异虎耳草素具有明显地使因化学因素引发白细胞数量降低的小鼠白细胞数量恢复上升的作用，且在剂量合适的情况下可以完全恢复到正常水平。 

六、急性毒性试验 

选取昆明种健康小鼠[体重(20±2)g]50只，由南京中医药大学实验动物中心提供。进行分组，雌雄各半，按体重、性别随机分组，每组10只。 

精密称取抗肿瘤成分C 10mg，以DMSO为溶剂配制成5mg/ml的高浓度药物溶液，再用生理盐水配成不同浓度的水溶液，并用其对小鼠进行半数致死量(LD₅₀)急性毒性实验，对照品为0.9％氯化钠溶液。 

结果：抗肿瘤成分C的LD₅₀(13.57±4.37)mg/g，95％可信区间为11.07-19.21mg/g，与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.01)。结论：抗肿瘤成分C几乎无毒性。 

Claims (7)

1.异虎耳草素在制备肿瘤防治新药及肿瘤辅助治疗用药中的应用。

2.根据权利要求1的应用，其特征在于其中所述的异虎耳草素为高纯度的天然化合物，其纯度大于98％。

3.根据权利要求1制备以异虎耳草素为活性成分的药物组合物，该组合物含有治疗有效剂量的异虎耳草素及一种或一种以上的药学上可接受的载体。

4.如权利要求3所述的药物组合物，其中该组合物可以是口服制剂、注射剂或外用制剂的形式。

5.如权利要求4所述的药物组合物，其中，口服制剂为片剂、各种胶囊剂、缓释片剂或滴丸剂；注射剂为液体油制剂；外用制剂为霜剂、膏剂、油剂。

6.权利要求1、2所述的高纯度异虎耳草素在用于制备防治肿瘤、抗癌逆转剂，即肿瘤化疗药物增效减毒、肿瘤放疗增敏、增强机体免疫功能等药物方面的应用。

7.权利要求1所述的高纯度异虎耳草素在制备防治肺癌、肝癌、宫颈癌、前列腺癌等药物中的应用。

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