CN110184300A - 一种利用稳定细胞株生产膜蛋白的方法 - Google Patents

一种利用稳定细胞株生产膜蛋白的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110184300A
CN110184300A CN201910424632.3A CN201910424632A CN110184300A CN 110184300 A CN110184300 A CN 110184300A CN 201910424632 A CN201910424632 A CN 201910424632A CN 110184300 A CN110184300 A CN 110184300A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
memebrane protein
sampling
cell culture
cell line
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
CN201910424632.3A
Other languages
English (en)
Inventor
雍金贵
张伦
李森
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Anhui Global Gene Technology Co Ltd
Original Assignee
Anhui Global Gene Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Anhui Global Gene Technology Co Ltd filed Critical Anhui Global Gene Technology Co Ltd
Priority to CN201910424632.3A priority Critical patent/CN110184300A/zh
Publication of CN110184300A publication Critical patent/CN110184300A/zh
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M33/00—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus
    • C12M33/04—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus by injection or suction, e.g. using pipettes, syringes, needles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/26—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of pH
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
    • C12M41/34—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of gas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

本发明公开一种利用稳定细胞株生产膜蛋白的方法，主要包括重组质粒的构建、高表达细胞株的培育与膜蛋白的提取和纯化，本发明运用重组慢病毒载体将膜蛋白基因整合到细胞染色体上，使膜蛋白基因在细胞内能够持续、稳定表达，利于后期大规模培养，解决了现有技术中膜蛋白的过表达对细胞膜蛋白生产的影响，同时本发明通过特制的细胞培养装置来对筛选出的高表达细胞株进行培育，细胞培养装置通过设置多层结构的细胞培育池，并通过无菌采样避免将空气中的杂质引入细胞培育池或对所采集样本造成污染，适用于长期频繁的进行样本采集，适用于规模化的细胞培育。

Description

一种利用稳定细胞株生产膜蛋白的方法
技术领域
本发明涉及医药分子生物学领域，具体的，提供了一种利用稳定细胞株生产膜蛋白的方法。
背景技术
膜蛋白在细胞间接触、表面识别、信号转导和物质运输方面都有重要作用。由于其重要作用使其成为理想的药物靶点，基因组序列中大约有30％的基因编码的是膜蛋白，而这其中有50％是目前已知药物的靶点。然而，由于膜蛋白在天然生物体中的含量很低，而且膜蛋白的过表达对细胞有毒性，并且含有一个或多个强烈疏水性的跨膜区域，在表达中容易形成包涵体，是膜蛋白生产过程中最大的瓶颈，因此运用常规的蛋白表达方式很难得到大量可用于研究的有活性可溶的膜蛋白。
慢病毒(Lentivirus)是逆转录病毒的一种，具有目的片段容量大、感染率高、安全性高，可以感染静止细胞与不产生嵌合体动物等优点，目的基因可以在宿主细胞中长期有效地表达。基因转染技术是指将纯化的含有靶基因的质粒DNA送入细胞内，并在细胞内表达。为了解决上述问题，提供一种能够使膜蛋白基因持续稳定的表达，适用于膜蛋白大规模培养的方法，本发明提供了以下技术方案。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用稳定细胞株生产膜蛋白的方法。
本发明需要解决的技术问题为：
1、现有技术中，在进行膜蛋白的的生产时，由于膜蛋白在生物体内的含量很低，而且膜蛋白的过表达会对细胞具有毒害作用，因此无法适用于膜蛋白的大规模培养。
2、大部分细胞具有贴壁生长的特性，为了满足大规模生产的需要，就需要对细胞的培育过程进行监测，并为其提供良好的生存环境，与现有技术中的小规模培育不同，大规模培育需要进行频繁的采样调查以了解其生长状况，但是采样过程容易引入空气中的细菌，无菌环境又会大大提高培育成本。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种利用稳定细胞株生产膜蛋白的方法，包括如下步骤：
步骤一、重组质粒的构建
以重组慢病毒载体pLenti-puro为骨架，将目的蛋白基因构建到重组慢病毒载体上获得重组质粒pLenti-puro-P；
步骤二、高表达细胞株的培育
利用PEI转染方法将上述重组质粒与辅助质粒pSPAX2和pMD2G共转染293T细胞获得重组慢病毒；
将上一步骤收获的慢病毒转导293T细胞，经嘌呤霉素筛选获得多个单克隆细胞株，细胞培养进行细胞膜制备后，经Elisa方法检测各细胞中目标膜蛋白含量，确定高表达细胞株；
将筛选得到的高表达细胞株加入细胞培养装置中进行培育，培育过程中每隔设定时间T1进行采样，对细胞培养装置内的细胞培养液的成分进行测定；
步骤三、膜蛋白的提取与纯化
S1、通过细胞刮刀采集细胞培养装置内的细胞，将采集的细胞加入PBS缓冲液中，清洗后3000g条件下离心除去表面上清液，加PBS缓冲液到收集的细胞中，匀浆破碎细胞，将匀浆液加入离心管中；
S2、将离心管放入离心机中，13000g离心20min后收集上清液，上清液在40000g条件下离心2h；
S3、除去上清液，在沉淀中加入膜蛋白溶解缓冲液，重悬沉淀溶解膜蛋白，再将溶解缓冲液在400000g条件下离心2h，收集上清液，得到膜蛋白溶解液；
S5、根据目标膜蛋白的性质将其与其它蛋白质进行分离纯化，根据蛋白质种类不同，选用的药剂与方法均有所不同，蛋白质的分离技术是现有的公知技术，因此在这里不再做详细描述。
所述PBS缓冲液中加有核酸酶与蛋白酶抑制剂；
步骤二中提到高表达细胞株是在细胞培养装置中进行培养，所述细胞培养装置包括细胞培育池、采样接头、采样容器与负压泵，所述细胞培育池的一侧面上分别设置有进液口、氧气浓度传感器、二氧化碳浓度传感器与pH传感器，所述细胞培育池的另一侧面上设置有采样口，采样口上设置有阀门，所述采样口也作为出液口进行使用，为了适用于规模化生产，本发明中细胞培育池设置有多个，且细胞培育池堆叠设置；
作为本发明的进一步方案，在不进行采样工作时，所述采样口通过橡胶塞进行密封堵塞，防止空气中的杂质大量进入管内；
所述采样接头包括外端套管、插入管与引气管，所述外端套管与插入管同轴设置且相互接通，插入管的外壁上设置有若干圈橡胶圈，所述引气管的一端与外端套管的侧壁接通，在进行采样时，所述引气管垂直设置且管口朝上，防止在采样时，细胞培养液沿着引气管流动对第一软管造成污染；
所述插入管插入采样口中并与采样口过盈配合，这样在抽取样品时，细胞培养液不会对采样口造成污染，方便清理，降低细胞培育池内培养环境被污染的几率，所述引气管通过第一软管连接三通阀的出气口，三通阀的两个进气口分别连接有臭氧发生器与氧气瓶，所述外端套管通过第二软管与采样容器接通，采样容器通过第三软管连接负压泵，所述负压泵还可以更换为注射器，用于抽取气体，营造负压环境。
本发明所述细胞培养装置的采样方法为：
SS1、当传感器检测到数值出现问题或达到采样时间时，开始进行采样工作；
SS2、对采样口的管道内壁进行清洗干燥后，将采样接头的插入管一端插入采样口内，再依次连接采样容器、负压泵、三通阀、臭氧发生器与氧气瓶等配件，在该步骤中不对采样口的管道内壁进行消毒，一方面采用液体消毒剂会对工作环境造成影响，而且若未将液体消毒剂排出干净，可能会对培育环境与采样样本造成污染，而且细胞培育池为透明材料制成(为了方便观察并使装置同样能够用于植物细胞的培养)，光照消毒也无法方便的进行；
SS3、调节三通阀，接通臭氧发生器，臭氧发生器工作并通过臭氧对各部件进行消毒；
SS4、消毒结束后，调节三通阀，开启氧气瓶，通过氧气将管道中的臭氧与残余的空气排出，在采样容器内形成氧气气氛；
SS5、开启负压泵调节压强、开启采样口上的阀门，将采样口内的细胞培养液抽取部分进入采样容器中，采样结束后，关闭负压泵，继续开启氧气瓶一段时间，调节采样容器中的气压至一个大气压后，拆除管道连接；
SS6、对第二软管、采样接头进行清洗消毒以方便循环使用。
通过本发明所述的细胞培养装置，能够对细胞进行规模化培养，并能够安全快速的进行采样，在采样过程中不会在采样容器中引入空气中的杂质，也不会对细胞培育池内的气压与气体组分造成影响，减少了采样后的细胞培育池内气体环境的条件，并使样品中处于富氧环境中，抑制培养液中混入细胞的无氧呼吸，防止在培养液转移过程中细胞无氧呼吸产生乳酸等物质对检测造成影响。
本发明的有益效果：
1、本发明提供的利用稳定细胞株生产膜蛋白的方法，运用重组慢病毒载体将膜蛋白基因整合到细胞染色体上，使膜蛋白基因在细胞内持续、稳定表达，利于后期大规模培养。
2、本发明提供的细胞培养装置通过设置多层结构的细胞培育池，并通过无菌采样避免将空气中的杂质引入细胞培育池或对所采集样本造成污染，适用于长期频繁的进行样本采集，适用于规模化的细胞培育。
附图说明
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细描述。
图1是本发明的结构示意图；
图2是采样接头的结构示意图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种利用稳定细胞株生产膜蛋白的方法，包括如下步骤：
步骤一、重组质粒的构建
以重组慢病毒载体pLenti-puro为骨架，将目的蛋白基因构建到重组慢病毒载体上获得重组质粒pLenti-puro-P；
步骤二、高表达细胞株的培育
利用PEI转染方法将上述重组质粒与辅助质粒pSPAX2和pMD2G共转染293T细胞获得重组慢病毒；
将上一步骤收获的慢病毒转导293T细胞，经嘌呤霉素筛选获得多个单克隆细胞株，细胞培养进行细胞膜制备后，经Elisa方法检测各细胞中目标膜蛋白含量，确定高表达细胞株；
将筛选得到的高表达细胞株加入细胞培养装置中进行培育，培育过程中每隔6h进行采样，对细胞培养装置内的细胞培养液的成分进行测定；
步骤三、膜蛋白的提取与纯化
S1、通过细胞刮刀采集细胞培养装置内的细胞，将采集的细胞加入PBS缓冲液中，清洗后3000g条件下离心除去表面上清液，加PBS缓冲液到收集的细胞中，匀浆破碎细胞，将匀浆液加入离心管中；
S2、将离心管放入离心机中，13000g离心20min后收集上清液，上清液在40000g条件下离心2h；
S3、除去上清液，在沉淀中加入膜蛋白溶解缓冲液，重悬沉淀溶解膜蛋白，再将溶解缓冲液在400000g条件下离心2h，收集上清液，得到膜蛋白溶解液；
S5、根据目标膜蛋白的性质将其与其它蛋白质进行分离纯化；
所述PBS缓冲液中加有核酸酶与蛋白酶抑制剂；
步骤二中提到高表达细胞株是在细胞培养装置中进行培养，如图1所示，所述细胞培养装置包括细胞培育池1、采样接头2、采样容器3与负压泵4，所述细胞培育池1的一侧面上分别设置有进液口12、氧气浓度传感器13、二氧化碳浓度传感器14与pH传感器15，所述细胞培育池1的另一侧面上设置有采样口11，采样口11上设置有阀门，所述采样口11也作为出液口进行使用，为了适用于规模化生产，本发明中细胞培育池1设置有多个，且细胞培育池1堆叠设置；
作为本发明的进一步方案，在不进行采样工作时，所述采样口11通过橡胶塞进行密封堵塞；
如图2所示，所述采样接头2包括外端套管21、插入管23与引气管22，所述外端套管21与插入管23同轴设置且相互接通，插入管23的外壁上设置有若干圈橡胶圈，所述引气管22的一端与外端套管21的侧壁接通，在进行采样时，所述引气管22垂直设置且管口朝上，防止在采样时，细胞培养液沿着引气管22流动对第一软管51造成污染；
所述插入管23插入采样口11中并与采样口过盈配合，所述引气管22通过第一软管51连接三通阀5的出气口，三通阀5的两个进气口分别连接有臭氧发生器52与氧气瓶53，所述外端套管21通过第二软管31与采样容器3接通，采样容器3通过第三软管41连接负压泵4。
本发明所述细胞培养装置的采样方法为：
SS1、当传感器检测到数值出现问题或达到采样时间时，开始进行采样工作；
SS2、对采样口11的管道内壁进行清洗干燥后，将采样接头2的插入管23一端插入采样口11内，再依次连接采样容器3、负压泵4、三通阀5、臭氧发生器52与氧气瓶53等配件，在该步骤中不对采样口的管道内壁进行消毒；
SS3、调节三通阀5，接通臭氧发生器52，臭氧发生器52工作并通过臭氧对各部件消毒40min；
SS4、消毒结束后，调节三通阀5，开启氧气瓶53，通过氧气将管道中的臭氧与残余的空气排出，在采样容器3内形成氧气气氛；
SS5、开启负压泵4调节压强、开启采样口11上的阀门，将采样口11内的细胞培养液抽取部分进入采样容器3中，采样结束后，关闭负压泵4，继续开启氧气瓶53一段时间，调节采样容器3中的气压至一个大气压后，拆除管道连接；
SS6、对第二软管31、采样接头2进行清洗消毒以方便循环使用。
以上内容仅仅是对本发明结构所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的结构或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种利用稳定细胞株生产膜蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、重组质粒的构建
以重组慢病毒载体pLenti-puro为骨架，将目的蛋白基因构建到重组慢病毒载体上获得重组质粒pLenti-puro-P；
步骤二、高表达细胞株的培育
利用PEI转染方法将上述重组质粒与辅助质粒pSPAX2和pMD2G共转染293T细胞获得重组慢病毒；
将上一步骤收获的慢病毒转导293T细胞，经嘌呤霉素筛选获得多个单克隆细胞株，细胞培养进行细胞膜制备后，经Elisa方法检测各细胞中目标膜蛋白含量，确定高表达细胞株；
将筛选得到的高表达细胞株加入细胞培养装置中进行培育，培育过程中每隔设定时间T1进行采样，对细胞培养装置内的细胞培养液的成分进行测定；
步骤三、膜蛋白的提取与纯化。
2.根据权利要求1所述的一种利用稳定细胞株生产膜蛋白的方法，其特征在于，所述步骤三中膜蛋白的提取与纯化方法具体为：
S1、通过细胞刮刀采集细胞培养装置内的细胞，将采集的细胞加入PBS缓冲液中，清洗后3000g条件下离心除去表面上清液，加PBS缓冲液到收集的细胞中，匀浆破碎细胞，将匀浆液加入离心管中；
S2、将离心管放入离心机中，13000g离心20min后收集上清液，上清液在40000g条件下离心2h；
S3、除去上清液，在沉淀中加入膜蛋白溶解缓冲液，重悬沉淀溶解膜蛋白，再将溶解缓冲液在400000g条件下离心2h，收集上清液，得到膜蛋白溶解液；
S5、根据目标膜蛋白的性质将其与其它蛋白质进行分离纯化。
3.根据权利要求2所述的一种利用稳定细胞株生产膜蛋白的方法，其特征在于，所述PBS缓冲液中加有核酸酶与蛋白酶抑制剂。
4.根据权利要求1所述的一种利用稳定细胞株生产膜蛋白的方法，其特征在于，所述细胞培养装置的采样方法为：
SS1、当传感器检测到数值出现问题或达到采样时间时，开始进行采样工作；
SS2、对采样口(11)的管道内壁进行清洗干燥后，将采样接头(2)的插入管(23)一端插入采样口(11)内，再依次连接采样容器(3)、负压泵(4)、三通阀(5)、臭氧发生器(52)与氧气瓶(53)，在该步骤中不对采样口的管道内壁进行消毒；
SS3、调节三通阀(5)，接通臭氧发生器(52)，臭氧发生器(52)工作并通过臭氧对各部件进行消毒；
SS4、消毒结束后，调节三通阀(5)，开启氧气瓶(53)，通过氧气将管道中的臭氧与残余的空气排出，在采样容器(3)内形成氧气气氛；
SS5、开启负压泵(4)调节压强、开启采样口(11)上的阀门，将采样口(11)内的细胞培养液抽取部分进入采样容器(3)中，采样结束后，关闭负压泵(4)，继续开启氧气瓶(53)一段时间，调节采样容器(3)中的气压至一个大气压后，拆除管道连接；
SS6、对第二软管(31)、采样接头(2)进行清洗消毒。
5.根据权利要求1所述的一种利用稳定细胞株生产膜蛋白的方法，其特征在于，步骤二中所述细胞培养装置包括细胞培育池(1)、采样接头(2)、采样容器(3)与负压泵(4)，所述细胞培育池(1)的一侧面上分别设置有进液口(12)、氧气浓度传感器(13)、二氧化碳浓度传感器(14)与pH传感器(15)，所述细胞培育池(1)的另一侧面上设置有采样口(11)，采样口(11)上设置有阀门；
所述采样接头(2)包括外端套管(21)、插入管(23)与引气管(22)，所述外端套管(21)与插入管(23)同轴设置且相互接通，插入管(23)的外壁上设置有若干橡胶圈，所述引气管(22)的一端与外端套管(21)的侧壁接通；
所述插入管(23)插入采样口(11)中并与采样口过盈配合，所述引气管(22)通过第一软管(51)连接三通阀(5)的出气口，三通阀(5)的两个进气口分别连接有臭氧发生器(52)与氧气瓶(53)，所述外端套管(21)通过第二软管(31)与采样容器(3)接通，采样容器(3)通过第三软管(41)连接负压泵(4)。
6.根据权利要求5所述的一种利用稳定细胞株生产膜蛋白的方法，其特征在于，所述细胞培育池(1)设置有多个，且细胞培育池(1)堆叠设置。
7.根据权利要求5所述的一种利用稳定细胞株生产膜蛋白的方法，其特征在于，在不进行采样工作时，所述采样口(11)通过橡胶塞进行密封堵塞。
8.根据权利要求5所述的一种利用稳定细胞株生产膜蛋白的方法，其特征在于，所述引气管(22)在进行采样时，垂直设置且管口朝上。
CN201910424632.3A 2019-05-21 2019-05-21 一种利用稳定细胞株生产膜蛋白的方法 Withdrawn CN110184300A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910424632.3A CN110184300A (zh) 2019-05-21 2019-05-21 一种利用稳定细胞株生产膜蛋白的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910424632.3A CN110184300A (zh) 2019-05-21 2019-05-21 一种利用稳定细胞株生产膜蛋白的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110184300A true CN110184300A (zh) 2019-08-30

Family

ID=67717065

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910424632.3A Withdrawn CN110184300A (zh) 2019-05-21 2019-05-21 一种利用稳定细胞株生产膜蛋白的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110184300A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112852594A (zh) * 2021-01-21 2021-05-28 刘寿明 一种生物技术研究用细胞培养装置

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101792713A (zh) * 2010-03-18 2010-08-04 张少华 一种杂交瘤细胞连续培养装置
CN103228790A (zh) * 2010-09-02 2013-07-31 莫尔梅德股份有限公司 慢病毒载体的稳定生产
CN104232587A (zh) * 2014-09-02 2014-12-24 中国检验检疫科学研究院 稳定表达施马伦贝格病毒核衣壳蛋白的细胞系及其应用
CN105658783A (zh) * 2013-10-16 2016-06-08 麦迪康公司 用于连续地培养细胞的装置和方法
CN107488635A (zh) * 2017-09-22 2017-12-19 中国人民解放军第三军医大学第三附属医院 单克隆细胞及其制备方法和用途
CN107937349A (zh) * 2017-11-27 2018-04-20 中国检验检疫科学研究院 稳定表达非洲猪瘟病毒p54蛋白的细胞系及其制备与应用
CN207405183U (zh) * 2017-06-23 2018-05-25 昆明培根生物科技有限公司 一种可监测细胞培养液体环境的细胞培养装置
CN108949697A (zh) * 2018-08-29 2018-12-07 山西医科大学第医院 一种稳定表达绿色荧光蛋白的喉癌细胞株的构建方法
CN109234162A (zh) * 2018-10-22 2019-01-18 广东省心血管病研究所 一种干细胞自动培养系统
CN109306324A (zh) * 2017-07-26 2019-02-05 广州中国科学院先进技术研究所 细胞培养及检测装置

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101792713A (zh) * 2010-03-18 2010-08-04 张少华 一种杂交瘤细胞连续培养装置
CN103228790A (zh) * 2010-09-02 2013-07-31 莫尔梅德股份有限公司 慢病毒载体的稳定生产
CN105658783A (zh) * 2013-10-16 2016-06-08 麦迪康公司 用于连续地培养细胞的装置和方法
CN104232587A (zh) * 2014-09-02 2014-12-24 中国检验检疫科学研究院 稳定表达施马伦贝格病毒核衣壳蛋白的细胞系及其应用
CN207405183U (zh) * 2017-06-23 2018-05-25 昆明培根生物科技有限公司 一种可监测细胞培养液体环境的细胞培养装置
CN109306324A (zh) * 2017-07-26 2019-02-05 广州中国科学院先进技术研究所 细胞培养及检测装置
CN107488635A (zh) * 2017-09-22 2017-12-19 中国人民解放军第三军医大学第三附属医院 单克隆细胞及其制备方法和用途
CN107937349A (zh) * 2017-11-27 2018-04-20 中国检验检疫科学研究院 稳定表达非洲猪瘟病毒p54蛋白的细胞系及其制备与应用
CN108949697A (zh) * 2018-08-29 2018-12-07 山西医科大学第医院 一种稳定表达绿色荧光蛋白的喉癌细胞株的构建方法
CN109234162A (zh) * 2018-10-22 2019-01-18 广东省心血管病研究所 一种干细胞自动培养系统

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SACHIN GUPTA ET AL.: "Latent Membrane Protein 1 as a molecular adjuvant for single-cycle lentiviral vaccines", 《RETROVIROLOGY》 *
孙丹丹等: "HIV-1包膜蛋白ENV慢病毒载体的构建及表达", 《中国免疫学杂志》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112852594A (zh) * 2021-01-21 2021-05-28 刘寿明 一种生物技术研究用细胞培养装置

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101890000B1 (ko) 교대 공압 막 세포 분리 시스템
Belli et al. Transmission of a grapevine leafroll associated closterovirus by the scale insect Pulvinaria vitis L.
US7645608B2 (en) Microorganism specimen storage, hydrating, transfer and applicator device
CN201756550U (zh) 一种全封闭集菌安瓿培养器
CN109777824A (zh) 植物作为宿主在表达hiv中和抗体中的应用
CN100497583C (zh) 安全高效连续封闭式细胞培养病毒生产/灭活系统
Calvillo‐Medina et al. Identification and biofilm development by a new fungal keratitis aetiologic agent
CN114807060B (zh) 柯萨奇病毒a6型毒株及其免疫原性组合物和应用
CN110184300A (zh) 一种利用稳定细胞株生产膜蛋白的方法
CN109071594A (zh) 具有恒流泵/管道系统的固定床生物反应器
CN105255746B (zh) 一株对柑橘木虱具强致病力的宛氏拟青霉菌株及其应用
CN106916851A (zh) 一种复制缺陷型人14型腺病毒载体及其制备方法和应用
CN107129962A (zh) 一种日本医蛭唾液腺细胞的原代培养方法
CN114774293B (zh) 一株葡萄穗霉hn17496菌株、生防菌剂及其制备方法和应用
Schneider et al. Sporulation of Clostridium botulinum types A, B, and E, Clostridium perfringens, and putrefactive anaerobe 3679 in dialysis sacs
CN105936936A (zh) 一种猕猴桃花粉中Psa的检测方法
EP0365756A1 (en) Air lift fermentor
CN112494661B (zh) Dvl3-DEP肽段在制备修复睾丸中支持细胞损伤的药物中的应用
CN203700344U (zh) 卫生检验中大肠菌群测定用梯级反应乳糖胆盐发酵管
CN107964036A (zh) 呼吸道合胞病毒重组蛋白及其制备方法和应用
JP7058006B2 (ja) 遠心バッグと一体になった動物細胞培養用バッグ
CN208023012U (zh) 一种软式内镜细菌监测的采样收集系统和培养系统
CN111748469A (zh) 一种培养皿
CN109666696A (zh) 一种连续收获腺相关病毒的生产工艺
CN210085472U (zh) 一种培养皿

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WW01 Invention patent application withdrawn after publication
WW01 Invention patent application withdrawn after publication

Application publication date: 20190830