CN104232587A - 稳定表达施马伦贝格病毒核衣壳蛋白的细胞系及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种稳定表达施马伦贝格病毒(SBV)核衣壳蛋白的BHK-21细胞系，其保藏号为CGMCC No.7616，命名为BHK-21-pLV-EGFP-SBV-N。细胞免疫荧光试验结果表明，该细胞系不仅与SBV的单克隆抗体2C8发生特异性反应，而且还能识别SBV感染牛的阳性血清。稳定表达SBV N蛋白的BHK-21细胞系可用于施马伦贝格病的检测，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程及免疫技术领域，具体地说，涉及稳定表达施马伦贝格病毒核衣壳蛋白的BHK-21细胞系及其制备方法。
背景技术
施马伦贝格病(Schmallenberg disease)是由施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus，SBV)引起的一种虫媒性病毒病，传播媒介为库蠓，主要感染绵羊、牛和山羊等反刍动物，可导致成年家畜生产性能下降，怀孕母畜发生流产、产死胎或畸形胎儿。
SBV归属布尼亚病毒科(Bunyaviride)正布尼亚病毒属(Orthobunyavirus)辛波血清群(Simbu serogroup)。SBV病毒粒子呈球形，直径为80～120nm，表面有纤突和囊膜，基因组为单股负链RNA，可分为L、M和S三个基因节段。L编码RNA依赖性RNA聚合酶，M编码2种表面糖蛋白Gn和Gc以及一个非结构蛋白NSm，S编码核衣壳蛋白N和另一非结构蛋白NSs。S节段基因序列高度保守，M节段内部Gc蛋白编码区的N端存在一个基因序列高度变异区域。Gn和Gc是诱导机体产生中和抗体的主要抗原蛋白；N蛋白是SBV病毒粒子中含量最丰富的蛋白，具有很强的免疫原性，可诱导机体产生早期抗体，为该病分子生物学和血清学诊断的靶蛋白。
SBV在KC(杂斑库蠓幼虫细胞)、BHK-21和Vero细胞上生长良好，能够产生明显的细胞病变，表现为细胞皱缩、聚集乃至崩解。此外，SBV还能感染绵羊脉络丛细胞(CPT-Tert)、胎牛主动脉内皮细胞(BFAE)、293T、BSR T7/5(一种稳定表达T7RNA聚合酶BHK-21细胞)和MDCK细胞。
自2011年FLI首次发现和报道以来，施马伦贝格病已传播至欧洲很多国家。近来，有研究报道在非洲莫桑比克Zambezia省的奶牛、绵羊和山羊血清中均检出SBV抗体。截至目前，我国尚未出现相关疫情。2013年，在国家质量监督检验检疫总局和农业部联合发布的《中华人民共和国进境动物检疫疫病名录》中将施马伦贝格病列为二类传染病。
施马伦贝格病是一种新发动物疫病，尚未被列入OIE法定通报性疾病名录。目前，国内外针对该病尚无任何检疫标准可供参考。根据临床症状和病理变化可对本病做出初步诊断，但确诊还需要实验室诊断。实验室诊断包括(1)病原学诊断：①病毒分离和鉴定：利用KC细胞、BHK-21细胞和Vero细胞可从患病动物血液(EDTA抗凝血)、畸形胎脑组织等样品中分离施马伦贝格病毒。②荧光定量RT-PCR：FLI已经针对SBV的S基因节段建立了检测施马伦贝格病的荧光定量RT-PCR方法，可从患病动物的血液、脑干、小脑、大脑、脐带、胎水、羊水、胎粪、胎盘、精液、脊髓、胸腺、脾脏、肠系膜淋巴结和肋软骨等组织、器官或体液中检测到SBV，但血液和脑组织更适于病毒检测。随着越来越多SBV不同毒株全基因序列的测定和公布，FLI又针对SBV的M和L基因节段建立了检测该病的荧光定量RT-PCR方法，用于对S基因节段检测结果的确证。③病毒核苷酸序列测定：由于SBV的S基因片段与沙门达病毒和道格拉斯病毒等辛波血清群病毒的核酸序列同源性较高，因此，当SBV荧光定量RT-PCR检测结果为阳性时，需要对样品进行核酸序列测定与分析。④组织病理学检查：将患病动物的中枢神经系统(包括脑干、小脑、大脑和脊髓)用福尔马林固定后可进行组织病理学检查。(2)血清学诊断：①ELISA：可采集患病动物的血液、血清、心包液和奶液等液体样品进行ELISA检测。目前，国外已有施马伦贝格病间接ELISA和竞争ELISA商品化试剂盒。国内张永宁等人原核表达了SBV的N蛋白，并制备了SBV的单克隆抗体和多克隆抗体，并赴德国FLI验证了单抗、多抗与SBV的反应性和特异性，以此为基础所建的施马伦贝格病ELISA检测方法正在FLI进行验证和比对。②间接免疫荧光试验：可利用SBV感染的BHK-21和Vero细胞对患病动物的血液、血清和心包液等液体样品进行间接免疫荧光检测。③中和试验：当ELISA和间接免疫荧光试验检出SBV抗体阳性样品时，需利用血清中和试验对检测结果进行确证。
虽然我国与欧洲疫区空间距离较远，该病在自然条件下难以通过带毒库蠓飞越的方式传播至我国，但是随着我国与欧盟畜产品贸易量的逐年增加，人员、交通运输工具往来日益频繁，该病具有传入我国的潜在风险。综上可知，从维持我国畜牧业持续健康发展、保障国民身体健康以及维护国家利益的角度出发，预先开展该病的检测技术储备研究意义重大。
免疫荧光技术(Immunofluorescence technique)又称荧光抗体技术，是融合免疫学、生物化学和显微镜技术而建立起来的一项诊断技术。用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术，因为荧光色素不但能与免疫球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体。该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、检测速度快，可用于对ELISA试验结果的复核和验证。
发明内容
本发明的目的是提供稳定表达施马伦贝格病毒核衣壳蛋白的BHK-21细胞系、其制备方法及应用。
为了实现本发明目的，本发明的一种稳定表达施马伦贝格病毒(SBV)核衣壳蛋白(N)的BHK-21细胞系，其保藏号为CGMCC No.7616。
本发明还提供一种制备稳定表达施马伦贝格病毒核衣壳蛋白的BHK-21细胞系的方法，包括以下步骤：利用基因工程技术在SBV N蛋白编码基因的C端加入6个组氨酸(6×His)标签后，将其克隆至慢病毒载体pLV-EGFP-C的C端以构建重组慢病毒载体pLV-EGFP-SBV-N，然后将重组慢病毒载体与慢病毒包装质粒pH1和pH2共转染293V细胞，包装表达SBV N蛋白的慢病毒。将收获的慢病毒在聚凝胺(Polybrene)的介导下感染BHK-21细胞，采用嘌呤霉素筛选和细胞有限稀释法筛选出一株稳定表达SBV N蛋白的BHK-21细胞系，命名为BHK-21-pLV-EGFP-SBV-N。免疫荧光试验结果表明，该细胞系不仅与SBV的单克隆抗体2C8发生特异性反应，而且还能识别SBV感染牛的阳性血清。稳定表达SBV N蛋白的BHK-21细胞系的成功构建为施马伦贝格病免疫荧光检测方法的建立奠定了物质基础。
本发明还提供了一种重组慢病毒载体pLV-EGFP-SBV-N，其是通过以下步骤构建得到的：
(1)以施马伦贝格病毒SBV的RNA为模板，利用RT-PCR扩增SBV N基因序列并实现与6×His标签的融合；预期扩增片段的大小为735bp；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后进行胶回收；
(2)用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切PCR胶回收产物以及慢病毒载体pLV-EGFP-C，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后进行胶回收，并利用T4DNA连接酶连接回收的SBV-N-6×His基因片段与pLV-EGFP-C载体回收片段，构建重组慢病毒载体pLV-EGFP-SBV-N。
其中，上述步骤(1)中，用于扩增SBV N基因的特异性引物对为：上游引物序列为：5’-GGTGAATTCATGTCAAGCCAATTCATTTTTGAAGATGTACCACAACGGAATGC-3’，下划线处为EcoRⅠ识别位点；下游引物序列为：5’-TAAGGATCCTTAGATGTTGATACCGAATTGCTGCA-3’，下划线处为BamHⅠ识别位点，黑色斜体为6×His编码序列。
其中，步骤(1)中，50μL的RT-PCR反应体系包括：10×One-StepRNA PCR缓冲液5μL、MgCl2(25mmol/L)10μL、dNTP混合物(10mmol/L)5μL、RNase抑制剂(40U/μL)1μL、AMV RTase XL(5U/μL)1μL、AMV-Optimized Taq(5U/μL)1μL、上游引物(10μmol/L)2μL、下游引物(10μmol/L)2μL、SBV RNA 4μL、无RNA酶双蒸水19μL。反应条件为：50℃反转录30min；94℃热灭活反转录酶2min；94℃变性30s；62℃退火30s；72℃延伸45s，进行30个循环。琼脂糖凝胶电泳结果表明，扩增产物的大小约为735bp。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后进行胶回收，并测定回收产物的浓度。
进一步地，本发明提供了上述慢病毒载体pLV-EGFP-SBV-N在表达施马伦贝格病毒蛋白中的应用。以及慢病毒载体pLV-EGFP-SBV-N在制备施马伦贝格病毒诊断试剂中的应用。
经筛选，本发明最终获得一株可稳定表达施马伦贝格病毒核衣壳蛋白的BHK-21细胞(BHK-21-pLV-EGFP-SBV-N)，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC No.7616，分类命名为：稳定表达SBV-N基因BHK-21细胞系，保藏日期2013年5月23日。
本发明利用荧光定量RT-PCR、Western Blot和间接免疫荧光试验对BHK-21-pLV-EGFP-SBV-N细胞系进行了鉴定。结果表明，该细胞系可稳定表达SBV N蛋白，不仅能与SBV的单克隆抗体2C8发生特异性反应，而且还能识别SBV感染牛的阳性血清。稳定表达SBV N蛋白的BHK-21细胞系的成功构建为施马伦贝格病免疫荧光检测方法的建立提供了物质保障。
本发明进一步提供了利用BHK-21-pLV-EGFP-SBV-N细胞系对SBV感染牛阳性血清进行检测的间接免疫荧光检测方法。将BHK-21-pLV-EGFP-SBV-N细胞培养至细胞爬片上，用预冷无水乙醇固定，5％BSA封闭，PBS洗涤，然后加入待检牛血清；经过一定时间反应后，洗去未结合的血清抗体；再加入罗丹明标记的兔抗牛IgG；经过一定时间反应后，PBS洗涤；利用荧光显微镜观察结果。
本发明提供了BHK-21细胞系BHK-21-pLV-EGFP-SBV-N在表达施马伦贝格病毒核衣壳蛋白中的应用。
基于本领域技术人员的认知水平，上述的BHK-21细胞系在制备施马伦贝格病毒诊断用抗原试剂中的应用也属于本发明的内容。
本发明还提供了上述BHK-21细胞系在制备施马伦贝格病毒诊断用阳性血清试剂中的应用。
本发明还提供了上述BHK-21细胞系在制备施马伦贝格病毒治疗用抗血清试剂中的应用。
本发明还提供了上述BHK-21细胞系在制备施马伦贝格病毒疫苗中的应用。
本发明还提供了上述BHK-21细胞系在制备施马伦贝格病毒检测试剂盒中的应用。
本发明的优点在于：
(一)本发明提供的稳定表达施马伦贝格病毒核衣壳蛋白的BHK-21-pLV-EGFP-SBV-N细胞不仅能识别SBV的单克隆抗体2C8，而且还能与SBV感染牛的阳性血清发生特异性反应。
(二)本发明提供的BHK-21-pLV-EGFP-SBV-N细胞传代稳定性好，生长速度快，培养条件简单，能保证大量供应。
(三)本发明针对SBV病毒粒子内表达量最丰富、抗原保守性最强、最先刺激动物机体产生免疫球蛋白的N蛋白构建了其稳定表达BHK-21细胞系，为施马伦贝格病免疫荧光检测方法的建立提供了优选的生物材料。
(四)本发明制备的BHK-21-pLV-EGFP-SBV-N细胞携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)，在荧光显微镜下可见细胞自发绿色荧光信号，方便观察和分析。
(五)本发明特异在施马伦贝格病毒核衣壳蛋白编码基因的C端人工插入6×His标签，为利用镍柱(Ni-NTA)纯化BHK-21-pLV-EGFP-SBV-N细胞表达的施马伦贝格病毒核衣壳蛋白奠定了基础。
附图说明
图1为本发明实施例1中施马伦贝格病毒核衣壳蛋白编码基因与6×His标签融合RT-PCR产物电泳结果；其中，1为DNA相对分子质量标准(DL2000)，2为SBV RNA，3为阴性对照。
图2为本发明实施例1中稳定表达施马伦贝格病毒核衣壳蛋白的BHK-21细胞(BHK-21-pLV-EGFP-SBV-N)的荧光显微结果；其中，A为BHK-21-pLV-EGFP-SBV-N细胞自发的绿色荧光；B为Hoechst33342染色后的细胞核(放大倍数400×)。
图3为本发明实施例1中稳定表达施马伦贝格病毒核衣壳蛋白的BHK-21细胞(BHK-21-pLV-EGFP-SBV-N)的荧光定量RT-PCR鉴定结果；其中，A为针对SBV N基因的荧光定量RT-PCR检测结果，1为BHK-21-pLV-EGFP-SBV-N细胞RNA；2为阳性对照(SBV RNA 10-3)；3为BHK-21-EGFP细胞RNA；4为BHK-21细胞RNA；5为阴性对照；B为针对β-actin内参基因的荧光定量RT-PCR检测结果；1为BHK-21-pLV-EGFP-SBV-N细胞RNA；2为BHK-21-EGFP细胞RNA；3为BHK-21细胞RNA；4为阳性对照(SBV RNA 10-3)；5为阴性对照。
图4为本发明实施例1中稳定表达施马伦贝格病毒核衣壳蛋白的BHK-21细胞(BHK-21-pLV-EGFP-SBV-N)的Western Blot鉴定结果；其中，1泳道为稳定表达施马伦贝格病毒核衣壳蛋白的BHK-21细胞(BHK-21-pLV-EGFP-SBV-N)；2泳道为稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的BHK-21细胞(BHK-21-EGFP)；3泳道为BHK-21细胞。
图5为本发明实施例4中稳定表达施马伦贝格病毒核衣壳蛋白的BHK-21细胞(BHK-21-pLV-EGFP-SBV-N)与鼠抗SBV N蛋白单抗2C8反应的激光共聚焦免疫荧光试验结果(BHK-21-EGFP放大标尺：10μm，BHK-21-pLV-EGFP-SBV-N放大标尺7.5μm)。
图6为本发明实施例4中稳定表达施马伦贝格病毒核衣壳蛋白的BHK-21细胞(BHK-21-pLV-EGFP-SBV-N)与SBV感染牛血清反应的激光共聚焦免疫荧光试验结果(BHK-21-EGFP放大标尺：10μm，BHK-21-pLV-EGFP-SBV-N放大标尺7.5μm)。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1稳定表达施马伦贝格病毒核衣壳蛋白的BHK-21细胞系的构建
1主要仪器
ABI Veriti 96孔PCR扩增仪，Applied Biosystems公司产品；3111型水套式二氧化碳培养箱，Thermo Electron Corporation公司产品；Nikon Eclipse Ti-U型倒置荧光显微镜，Nikon公司产品。
2主要试剂、耗材和细胞
DMEM(货号11995-065)、胎牛血清(货号10099-133)、胰蛋白酶(货号25200-056)，Life Technologies公司产品；Gel Extraction Kit(货号D2500-01)，OMEGA公司产品；慢病毒载体pLV-EGFP-C、辅助载体pH1和pH2，北京英茂盛业生物科技有限公司产品；QiagenPlasmid Plus Maxi Kit(货号12965)，Qiagen公司产品；EcoRⅠ(货号1040A)、BamHⅠ(货号1010A)限制性内切酶、DNA连接酶(货号6022)、One Step RNA PCR Kit(AMV)(货号RR024A)，TaKaRa公司产品。
SBV(BH80/11-4株)RNA，德国FLI的Bernd Hoffmann博士惠赠。该毒株已公开在文献Zhang et al.,2013,Protein Expression andPurification,92(1):1-8.中。
293V细胞和BHK-21细胞，中国检验检疫科学研究院动物检疫实验室保存。
T25细胞培养瓶(货号430168)、6孔板(货号3516)、24孔板(货号3524)、96孔板细胞培养板(货号3599)、10cm细胞培养皿(货号430167)，Corning公司产品。
3操作步骤
3.1SBV N基因的扩增及其与6×His标签的融合
根据GenBank中已公布的SBV S基因序列(登录号HE649914，S基因序列中含N基因序列)设计了一对用于N基因克隆及与6×His标签融合的特异性引物，并分别在上下游引物的5’端引入了限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ的识别序列。其中，上游引物序列为：5’-GGTGAATTCATGTCAAGCCAATTCATTTTTGAAGATGTACCACAACGGAATGC-3’(下划线处为EcoRⅠ识别位点)，下游引物序列为：5’-TAAGGATCCTTAGATGTTGATACCGAATTGCTGCA-3’(下划线处为BamHⅠ识别位点)，黑色斜体为6×His编码序列，预期扩增片段的大小为735bp(包括EcoRⅠ、BamHⅠ的识别序列和保护性碱基)。以德国FLI提供的SBV(BH80/11-4株)RNA为模板，利用RT-PCR扩增SBV N基因序列并实现与6×His标签的融合。50μL的RT-PCR反应体系包括：10×One-Step RNA PCR缓冲液5μL、MgCl2(25mmol/L)10μL、dNTP混合物(10mmol/L)5μL、RNase抑制剂(40U/μL)1μL、AMV RTase XL(5U/μL)1μL、AMV-Optimized Taq(5U/μL)1μL、上游引物(10μmol/L)2μL、下游引物(10μmol/L)2μL、SBV RNA 4μL、无RNA酶双蒸水19μL。反应条件为：50℃反转录30min；94℃热灭活反转录酶2min；94℃变性30s；62℃退火30s；72℃延伸45s，进行30个循环。琼脂糖凝胶电泳结果表明，扩增产物的大小约为735bp，与预期大小一致(图1)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后进行胶回收，并测定回收产物的浓度。
3.2重组慢病毒载体pLV-EGFP-SBV-N的构建与鉴定
用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切PCR胶回收产物以及慢病毒载体pLV-EGFP-C，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后进行胶回收，并利用T4DNA连接酶连接回收的SBV-N-6×His基因片段与pLV-EGFP-C载体回收片段，以构建重组慢病毒载体pLV-EGFP-SBV-N，并将其送北京六合华大基因科技有限公司测序。测序结果表明，SBV-N-6×His基因序列、插入位置以及阅读框都准确无误。
3.3慢病毒包装
3.3.1细胞培养：在转染前24h将合适数量的293V细胞接种到10cm培养皿内，培养至90～95％细胞单层。
3.3.2细胞转染：将构建的重组慢病毒载体pLV-EGFP-SBV-N(5μg)与辅助载体pH1(3.75μg)和pH2(1.25μg)共转染293V细胞。
3.3.3换液：转染24h后更换新鲜DMEM培养基。
3.3.4收集重组慢病毒：转染48h后，收集细胞培养上清即为所需重组慢病毒，用0.45μm滤器过滤后，置-70℃冰箱冻存备用。
3.4BHK-21细胞嘌呤霉素使用浓度测试
3.4.1将BHK-21细胞以5×104个/孔接种到24孔板。24h后加入嘌呤霉素至下列浓度：0、0.5μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、7.5μg/mL和10μg/mL。
3.4.2每2d换液一次，并重新添加嘌呤霉素。
3.4.3选择3～4d内全部细胞死亡的浓度为筛选用药浓度。最终试验结果表明，适合于BHK-21的嘌呤霉素筛选浓度为5μg/mL。
3.5慢病毒感染BHK-21细胞
3.5.1感染前一天将BHK-21细胞以合适密度铺板，感染病毒时细胞密度为60～70％。
3.5.2取出病毒上清液，室温融化。每毫升细胞培养基中加入病毒液0.1mL，加入聚凝胺(Polybrene)至终浓度为6μg/mL，混匀制备为病毒感染液。
3.5.3用病毒感染液替换原细胞培养基，37℃培养24h。
3.5.4用新的DMEM培养基替换病毒感染液，继续培养24h。
3.6克隆分选及稳定细胞株筛选
3.6.1感染病毒48h后，用胰蛋白酶细胞消化。按照每个平皿200～500个细胞的浓度将BHK-21细胞铺到10cm培养皿。加入嘌呤霉素到终浓度为5μg/μL。继续培养，每3d换液一次，重新添加嘌呤霉素。
3.6.2筛选2周后细胞克隆出现。在荧光显微镜下挑取表达荧光信号强的BHK-21单克隆细胞株，接种到96孔板中继续培养，待细胞长满后，将其转移至6孔细胞培养板内扩大培养。
3.6.3细胞冻存：用胰蛋白酶消化BHK-21细胞，加入细胞冻存液后，置液氮保存备用。
4试验结果
经过嘌呤霉素筛选和细胞有限稀释法最终获得一株稳定表达SBV N蛋白的BHK-21单克隆细胞株，在荧光显微镜下可见该细胞发出绿色荧光，且SBV N蛋白的绿色荧光信号呈现点状分布(图2)。
实施例2稳定表达施马伦贝格病毒核衣壳蛋白的BHK-21细胞系的荧光定量RT-PCR鉴定
1主要仪器：
Bio-Rad iQ5荧光定量PCR仪，Bio-Rad公司产品。
2主要试剂、细胞和引物、探针：
Mini Kit(货号74104)，Qiagen公司产品；AgPath-IDTMOne-Step RT-PCR Kit(货号AM1005)，Life Technologies公司产品。
稳定表达SBV N蛋白的BHK-21细胞(BHK-21-EGFP-SBV-N)、稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的BHK-21细胞(BHK-21-EGFP)和BHK-21细胞：均由中国检验检疫科学研究院动物检疫实验室制备和保存。
检测SBV N基因的引物BHK-21-SBV-N-F(5’-TCAGATTGTCATGCCCCTTGC-3’)、BHK-21-SBV-N-R(5’-TTCGGCCCCAGGTGCAAATC-3’)及其TaqMan探针BHK-21-SBV-N-Probe(5’-FAM-TTAAGGGATGCACCTGGGCCGATGGT-BHQ1-3’)；检测BHK-21细胞内参β-actin的引物BHK-21-β-actin-F(5’-CAGCACCATGAAGATCAAGATCATT-3’)、BHK-21-β-actin-R(5’-CGGACTCATCGTACTCCTGCTT-3’)及其TaqMan探针BHK-21-β-actin-Probe(5’-HEX-TCACTGTCCACCTTCCAGCAGATGT-BHQ1-3’)，由北京六合华大基因科技有限公司合成。
3操作步骤
3.1细胞总RNA的提取
按照Mini Kit说明书分别提取约6×106个BHK-21-pLV-EGFP-SBV-N、BHK-21-EGFP和BHK-21细胞总RNA。
3.2反应预混液配制
检测SBV N基因的引物和探针预混液(Primer-probe-mix1)：TEBuffer(pH8.0)156.25μL、BHK-21-SBV-N-F(100pmol/μL)20μL、BHK-21-SBV-N-R(100pmol/μL)20μL、BHK-21-SBV-N-Probe(100pmol/μL)3.75μL。
检测BHK-21细胞内参β-actin基因的引物和探针预混液(Primer-probe-mix2)：TE Buffer(pH8.0)187.5μL、BHK-21-β-actin-F(100pmol/μL)5μL、BHK-21-β-actin-R(100pmol/μL)5μL、BHK-21-β-actin-Probe(100pmol/μL)2.5μL。
3.3荧光定量RT-PCR检测
利用TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测BHK-21-pLV-EGFP-SBV-N、BHK-21-EGFP和BHK-21细胞内SBV N基因和内参β-actin的RNA水平。
荧光定量RT-PCR反应体系：
按照上述体系配制荧光定量RT-PCR反应预混液，每个样品做3个重复。
荧光定量RT-PCR反应条件：
反转录：45℃，10min；
预变性：95℃，10min；
95℃变性15s；56℃退火20s，72℃延伸30s，42个循环。
4试验结果
针对SBV N基因的荧光定量RT-PCR检测结果表明，除了BHK-21-pLV-EGFP-SBV-N细胞在Ct值为14.66±0.25、阳性对照(SBVRNA 10-3)在Ct值为24.59±0.11处出现特异性扩增外，BHK-21-EGFP细胞、BHK-21细胞和阴性对照均未出现特异性扩增(图3A)。
针对β-actin内参基因的荧光定量RT-PCR检测结果表明，BHK-21-pLV-EGFP-SBV-N细胞、BHK-21-EGFP细胞和BHK-21细胞在Ct值10.66±0.63处出现特异性扩增(图3B)；而阳性对照(SBV RNA10-3)和阴性对照均未出现特异性扩增(图3B)。
实施例3稳定表达施马伦贝格病毒核衣壳蛋白的BHK-21细胞系的Western Blot鉴定
1主要仪器
PowerPac1000型蛋白质电泳仪及其转印系统，Bio-Rad公司产品；102型Kodak医用X光洗片机，Kodak公司产品；EU-88型图像扫描仪，Epson公司产品；VCX605型超声波破碎仪，Sonics&Materials公司产品。
2主要试剂、耗材和细胞
DMEM(货号11995-065)、胎牛血清(货号10099-133)、胰蛋白酶(货号25200-056)，Life Technologies公司产品；辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(货号ZB-2305)、辣根酶标记山羊抗兔IgG(货号ZB-2301)，北京中杉金桥生物技术有限公司产品；RIPA细胞裂解液(货号P0013B)，碧云天生物技术研究所产品；兔抗β-actin多克隆抗体(货号A2066)，Sigma公司产品；鼠抗增强型绿色荧光蛋白(EGFP)单抗(货号ABM-0005)，南京钟鼎生物技术有限公司产品；West Pico化学发光底物试剂盒(货号34079)，Thermo Fisher Scientific公司产品；鼠抗SBV N蛋白的单克隆抗体2C8(专利号ZL201310221585.5)，由中国检验检疫科学研究院动物检疫实验室制备和保存。
稳定表达SBV N蛋白的BHK-21细胞(BHK-21-pLV-EGFP-SBV-N)、稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的BHK-21细胞(BHK-21-EGFP)和BHK-21细胞：均由中国检验检疫科学研究院动物检疫实验室制备和保存。
T25细胞培养瓶(货号430168)，Corning Incorporated公司产品；X光胶片(货号MXG-1)，Kodak公司产品。
3操作步骤
3.1蛋白样品的制备
将BHK-21-pLV-EGFP-SBV-N、BHK-21-EGFP和BHK-21细胞培养至95～100％单层(约6×106个/瓶)，倒掉培养液，用PBS漂洗细胞后，向各瓶内加入500μL RIPA细胞裂解液，待细胞完全裂解后将溶液吸至1.5mL Eppendorf管内进行超声破碎(30％工作循环，破碎2s，间歇8s，破碎3次)，4℃14000×g离心5min，上清液即为所需蛋白样品，置-20℃冰箱保存备用。
3.2SDS-PAGE
3.2.1制胶①按比例配制分离胶，混匀，将凝胶液注入两层玻璃空隙，在液面上小心注入一层去离子水，静置约30min使分离胶完全聚合；②按比例配制浓缩胶，吸去分离胶上面的去离子水后，将浓缩胶注入分离胶上层，插入梳子，静置约30min使胶液完全聚合。
3.2.2煮样按照1:4比例混合蛋白样品和5×蛋白上样缓冲液，沸水煮5min，冷却至室温后，12000rpm离心5min，保留上清液。
3.2.3加样取5μL蛋白Marker和10μL蛋白样品上样至SDS-PAGE胶加样孔内。
3.2.4电泳加样完毕，120V电泳约90min，电泳至溴酚蓝染料前沿到达凝胶末端，停止电泳。
3.3Western Blot
3.3.1转膜采用湿式转印法(200mA，1h)将蛋白质从SDS-PAGE凝胶中转移至PVDF膜上。
3.3.2膜封闭将PVDF膜放入含5％脱脂奶的PBS内，于摇床上室温摇动封闭1h。
3.3.3一抗孵育将单抗2C8做1:4000、EGFP单抗做1:1000、β-actin多抗做1:1000倍稀释后，将剪开的PVDF膜的对应部分分别放入上述抗体稀释液中，于摇床上室温摇动孵育1h。
3.3.4洗膜用PBST洗膜3次，每次5min。
3.3.5酶标二抗孵育将HRP标记的山羊抗小鼠IgG和HRP标记的山羊抗兔IgG各做1:10000稀释后，将剪开的PVDF膜的对应部分分别置于二抗稀释液中，于摇床上室温摇动孵育1h。
3.3.6洗膜用PBST洗膜3次，每次5min。
3.3.7底物反应配制化学发光检测液ECL，将发光液均匀滴至PVDF膜上，室温避光反应5min。
3.3.8曝光将蛋白面朝上的PVDF膜装入洁净的保鲜袋内，并将其固定在X光片暗盒内，在暗室中取出X光片置于暗盒内的保鲜袋上进行曝光。
3.3.9显影、定影将达到曝光时间的X光片从暗盒中取出，置于加入显影液和定影液的洗片机中进行洗片。
3.3.10胶片扫描利用扫描仪对胶片进行扫描，保存图片。
4试验结果
Western Blot结果表明，通过慢病毒包装系统构建的稳定表达施马伦贝格病毒核衣壳蛋白的BHK-21细胞(BHK-21-pLV-EGFP-SBV-N)能够与SBV的单抗2C8发生特异性反应，而且还与抗EGFP标签的单抗发生特异性反应；相比之下，慢病毒载体对照细胞——即稳定表达增强型绿色荧光蛋白的BHK-21细胞(BHK-21-EGFP)只能与抗EGFP标签的单抗发生特异性反应，而不与2C8发生反应；而BHK-21细胞对照与2C8和抗EGFP标签的单抗均不反应(图4)。
实施例4稳定表达施马伦贝格病毒核衣壳蛋白的BHK-21细胞系的间接免疫荧光试验
1主要仪器
Leica TCS SP5激光共聚焦荧光显微镜，Leica公司产品。
2主要试剂、耗材和细胞
DMEM(货号11995-065)、胎牛血清(货号10099-133)，LifeTechnologies公司产品；封片剂(ZLI-9556)，北京中杉金桥生物技术有限公司产品；罗丹明(TRITC)标记山羊抗小鼠IgG(货号T5393)，Sigma公司产品；TRITC标记兔抗牛IgG(货号RbxBo-003-DRHOX)，ImmunoReagents公司产品。
T25细胞培养瓶(货号430168)、6孔细胞培养板(货号3516)，Corning Incorporated公司产品。
鼠抗SBV N蛋白的单克隆抗体2C8(专利号ZL201310221585.5)，由中国检验检疫科学研究院动物检疫实验室制备和保存；SBV感染牛阳性血清R1，德国FLI的Martin Beer博士惠赠。
稳定表达SBV N蛋白的BHK-21细胞(BHK-21-pLV-EGFP-SBV-N)、稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的BHK-21细胞(BHK-21-EGFP)和BHK-21细胞：均由中国检验检疫科学研究院动物检疫实验室制备和保存。
3操作步骤
3.1制作细胞爬片在6孔细胞培养板孔内预先放置灭菌盖玻片，将生长状态良好的细胞用胰酶消化后，将单细胞悬液以约105个/mL的密度接种于6孔细胞培养板孔内，每孔2mL；于37℃5％CO2培养箱中过夜培养，形成90％左右的单层细胞。
3.2固定小心吸弃各孔内的细胞培养基，向每孔加入2mL预冷无水乙醇，于室温固定15min。
3.3一抗孵育用镊子取出孔内的细胞爬片，将鼠抗SBV N蛋白单抗2C8(1:1000)和SBV感染牛血清R1(1:100)稀释后，向细胞爬片滴加500μL抗体稀释液，于室温、湿盒内孵育1h。
3.4洗涤用TBST洗涤3次，每次5min。
3.5二抗孵育将TRITC标记的山羊抗小鼠IgG(1:100)和TRITC标记的兔抗牛IgG(1:100)稀释后，向对应的细胞爬片滴加500μL抗体稀释液，于室温、湿盒内孵育1h。
3.6洗涤用TBST洗涤3次，每次5min。
3.7封片用吸水纸吸除爬片上的残留液体，向爬片细胞面滴加5μL含防荧光猝灭剂的封片剂，制作封片。
3.8荧光显微镜观察寻找最佳拍照区域，调整对比度及放大倍数后，进行拍照，保存照片。
4试验结果
免疫荧光试验结果表明，通过慢病毒包装系统构建的稳定表达施马伦贝格病毒核衣壳蛋白的BHK-21细胞(BHK-21-pLV-EGFP-SBV-N)不仅能够与鼠抗SBV N蛋白的单抗2C8发生特异性反应(图5)，而且还能识别SBV感染牛阳性血清(图6)，同时观察到SBV N蛋白的绿色点状荧光信号(图5、6，EGFP)能够与单抗/牛血清的红色染色信号(图5、6，2C8/Serum)发生共定位(图5、6，Merge)；相比之下，慢病毒载体对照细胞——即稳定表达绿色荧光蛋白的BHK-21细胞(BHK-21-EGFP)与2C8、SBV感染牛阳性血清均不发生反应(图5、6)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.稳定表达施马伦贝格病毒核衣壳蛋白的BHK-21细胞系，其为BHK-21-pLV-EGFP-SBV-N，保藏号为CGMCC No.7616。
2.权利要求1所述的BHK-21细胞系在表达施马伦贝格病毒核衣壳蛋白中的应用。
3.权利要求1所述的BHK-21细胞系在制备施马伦贝格病毒诊断用抗原试剂中的应用。
4.权利要求1所述的BHK-21细胞系在制备施马伦贝格病毒诊断用阳性血清试剂中的应用。
5.权利要求1所述的BHK-21细胞系在制备施马伦贝格病毒治疗用抗血清试剂中的应用。
6.权利要求1所述的BHK-21细胞系在制备施马伦贝格病毒疫苗中的应用。
7.权利要求1所述的BHK-21细胞系在制备施马伦贝格病毒检测试剂盒中的应用。
8.权利要求1所述的BHK-21细胞系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：利用基因工程技术在SBV N蛋白编码基因的C端加入6个组氨酸标签后，将其克隆至慢病毒载体pLV-EGFP-C的C端以构建重组慢病毒载体pLV-EGFP-SBV-N，然后将重组慢病毒载体与慢病毒包装质粒pH1和pH2共转染293V细胞，包装表达SBV N蛋白的慢病毒；将收获的慢病毒在聚凝胺的介导下感染BHK-21细胞，采用嘌呤霉素筛选和细胞有限稀释法筛选出一株稳定表达SBV N蛋白的BHK-21细胞系，命名为BHK-21-pLV-EGFP-SBV-N。
9.一种重组慢病毒载体pLV-EGFP-SBV-N，其特征在于，通过以下步骤构建得到：
(1)以施马伦贝格病毒SBV的RNA为模板，利用RT-PCR扩增SBV N基因序列并实现与6×His标签的融合；预期扩增片段的大小为735bp；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后进行胶回收；
(2)用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切PCR胶回收产物以及慢病毒载体pLV-EGFP-C，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后进行胶回收，并利用T4DNA连接酶连接回收的SBV-N-6×His基因片段与pLV-EGFP-C载体回收片段，构建重组慢病毒载体pLV-EGFP-SBV-N。
10.如权利要求9所述的重组慢病毒载体pLV-EGFP-SBV-N，其特征在于，步骤(1)中，用于扩增SBV N基因的特异性引物对为：上游引物序列为：5’-GGTGAATTCATGTCAAGCCAATTCATTTTTGAAGATGTACCACAACGGAATGC-3’，下划线处为EcoRⅠ识别位点；下游引物序列为：5’-TAAGGATCCTTAGATGTTGATACCGAATTGCTGCA-3’，下划线处为BamHⅠ识别位点，黑色斜体为6×His编码序列。
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