CN109232742A

CN109232742A - 一种嵌合抗原受体及其应用

Info

Publication number: CN109232742A
Application number: CN201710560649.2A
Authority: CN
Inventors: 杜新; 赵永娟; 张巧霞; 安娜; 侯运楠; 黎婷
Original assignee: Peking University Shenzhen Graduate School; Shenzhen Second Peoples Hospital
Current assignee: Peking University Shenzhen Graduate School; Shenzhen Second Peoples Hospital
Priority date: 2017-07-11
Filing date: 2017-07-11
Publication date: 2019-01-18
Anticipated expiration: 2037-07-11
Also published as: CN109232742B

Abstract

本发明公开了一种基于纳米抗体的嵌合抗原受体CD38Nb‑CD8α‑CD137‑CD3ζ及其应用。该嵌合抗原受体包括依次串联的抗人CD38纳米抗体、人CD8α铰链区和跨膜区、人CD137胞内区和CD3ζ胞内区。该嵌合抗原受体用于修饰T淋巴细胞，修饰后的T细胞(CAR‑T细胞)能用于表面CD38阳性的肿瘤的治疗。

Description

一种嵌合抗原受体及其应用

技术领域

本发明涉及肿瘤的细胞免疫治疗领域，具体涉及一种依次串联的CD38Nb-CD8α-CD137-CD3ζ的嵌合抗原受体及其在制备CAR-T细胞、肿瘤治疗中的应用。

背景技术

近年研究发现，以肿瘤特异性单克隆抗体的单链可变区(scFv)取代TCR的α和β链可变区，并将scFv直接和共刺激分子(如CD28、CD137等)以及T细胞信号传导区域CD3ζ连接，形成嵌合抗原受体(CAR)表达于T细胞表面，可通过scFv识别肿瘤特异性抗原，直接产生T细胞活化的第一、第二信号，促进T细胞活化、增殖，特异性杀伤肿瘤细胞。该过程主要依赖CAR-T细胞表面的scFv对肿瘤抗原的特异性识别，免疫反应的特异性和杀伤性增强。

多发性骨髓瘤(MM)是常见的血液系统恶性肿瘤，单克隆浆细胞恶性增殖并分泌大量单克隆免疫球蛋白，正常多克隆浆细胞增生和多克隆免疫球蛋白分泌受到抑制，引起广泛骨质破坏、反复感染、贫血、高钙血征、高粘滞综合征、肾功能不全等一系列临床表现并导致不良后果。目前治疗手段包括化疗、蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂、单克隆抗体和造血干细胞移植等，效果仍不理想，CAR-T细胞有望成为治疗MM的新方法。

发明内容

本发明提供一种嵌合抗原受体CD38Nb-CD8α-CD137-CD3ζ，该嵌合抗原受体包括依次串联的抗人CD38纳米抗体1G3(CD38Nb)、人CD8α铰链区和跨膜区、人CD137胞内区和CD3ζ胞内区；其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；其核酸序列如SEQ ID NO.2所示。

该嵌合抗原受体含有的抗人CD38纳米抗体(CD38Nb)，其氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示，其核酸序列如SEQ ID NO.4所示。

该嵌合抗原受体以人CD8α铰链区和跨膜区、人CD137胞内区和CD3ζ胞内区串联而成的结构为信号传导结构域，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，其核酸序列如SEQ IDNO.6所示。

该嵌合抗原受体的氨基末端还含有一个CD8α信号肽，其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO.7所示，其核酸序列如SEQ ID NO.8所示。

该嵌合抗原受体的CD8α信号肽和抗人CD38纳米抗体序列之间含有1个Myc标签，其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO.9所示，其核酸序列如SEQ ID NO.10所示。

该嵌合抗原受体中的T细胞共刺激信号分子除了是CD137-CD3ζ，还可以是CD28-CD3ζ或CD28-CD137-CD3ζ。

所述的嵌合抗原受体在制备嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)及其在肿瘤治疗中的应用。

本发明中，抗人CD38Nb基因序列通过免疫羊驼获得，从NCBI GenBank数据库中搜索到人CD8α信号肽基因、人CD8α铰链区和跨膜区、以及人CD137胞内区和CD3ζ胞内区基因序列信息，全基因合成嵌合抗原受体CD38Nb-CD8α-CD137-CD3ζ(抗人CD38-CAR)基因片段，插入到慢病毒表达载体pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP(空载体MOCK)中，构成抗人CD38-CAR表达质粒(CAR质粒)。利用该质粒与包装质粒共转染293T细胞包装病毒，感染人T细胞，流式鉴定CAR蛋白表达。获得的CAR-T细胞在体外与CD38阳性的肿瘤细胞系LP-1、RPMI 8226、OPM2、MOLP8或CD38阴性的细胞系KO(敲除了CD38的LP-1细胞系)、K562共培养，通过流式细胞术检测靶细胞残留、ELISA检测共培养上清中细胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α水平评估杀伤活性，以证实该嵌合抗原受体修饰的T细胞对CD38阳性细胞的特异性杀伤作用。因此本发明所述的嵌合抗原受体CD38Nb-CD8α-CD137-CD3ζ可在肿瘤治疗中得到应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，对实施例描述中所使用的附图作简单地介绍。附图中：

图1为抗人CD38-CAR慢病毒表达载体示意图；

图2为抗人CD38-CAR慢病毒表达质粒的酶切鉴定电泳图；

图3为荧光显微镜下观察慢病毒感染96h后T细胞的绿色荧光表达情况；

图4为流式细胞仪检测感染后T细胞表面CAR蛋白表达情况；

图5为流式细胞仪鉴定几种细胞系的表型结果；其中，图5A为流式细胞仪检测LP-1细胞的CD38和CD138表达情况，图5B为流式细胞仪检测KO细胞的CD38和CD138表达情况；

图6为流式细胞仪检测K562细胞的CD38和CD15表达情况；

图7为不同效靶细胞共培养体系中靶细胞比例随时间的变化图；

图8为流式细胞仪监测共培养体系中LP-1细胞的示意图；

图9为不同共培养体系上清中几种细胞因子的检测结果；其中，图9A为不同共培养体系上清中IL-2水平；图9B为不同共培养体系上清中IFN-γ水平；图9C为不同共培养体系上清中TNF-α水平。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的实施例进行具体描述。

CD38广泛表达于骨髓瘤细胞表面，因此，利用抗人CD38纳米抗体(CD38Nb)构建的嵌合抗原受体CD38Nb-CD8α-CD137-CD3ζ表达于T细胞表面，可使T细胞特异性杀伤CD38阳性的肿瘤细胞，有望用于MM患者的治疗。

本发明的主要创新点在于，利用抗人CD38纳米抗体，采用基因工程技术获得编码嵌合抗原受体CD38Nb-CD8α-CD137-CD3ζ的融合基因，将该基因片段插入慢病毒表达载体，包装成慢病毒，感染人T细胞，使T细胞表达该嵌合抗原受体。这种嵌合抗原受体T细胞能够识别肿瘤细胞表面的CD38，特异性杀伤CD38阳性的肿瘤细胞，用于肿瘤的治疗。

由于不同来源的抗体特性不同，直接影响了CAR-T细胞的功能。因而本专利应用的抗人CD38纳米抗体构建出的抗人CD38-CAR(CD38Nb-CD8α-CD137-CD3ζ)具有其独特性，表达该CAR的T细胞也具有其独特性。本专利所采用的纳米抗体不同于传统的scFv，而是通过免疫羊驼获得的一种缺失轻链的重链抗体，具备传统抗体的抗原结合能力，分子小、更稳定。通过初步研究发现该CAR-T细胞具备肿瘤特异性杀伤功能，后续进一步探讨其在临床治疗中的应用。

实施例1：CD38Nb-CD8α-CD137-CD3ζ基因序列的确定和慢病毒表达质粒的构建

1.1用人源CD38蛋白免疫羊驼、噬菌体展示技术筛选，获得抗人CD38纳米抗体序列。从美国国立医学图书馆网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez)GenBank数据库中搜索到人CD8α信号肽(NM_001145873)、人CD8α铰链区和跨膜区(NM_001145873)、人CD137胞内区(NM_001561)以及人CD3ζ胞内区(NM_198053)基因序列。Myc标签蛋白为常用的10个氨基酸“EQKLISEEDL”。

1.2将上述基因序列依次按人CD8α信号肽基因、Myc标签序列、抗人CD38纳米抗体序列、人CD8α铰链区和跨膜区基因、人CD137胞内区基因、以及人CD3ζ胞内区基因序列进行连接，并在N端引入Kozac序列，在各序列连接处引入不同的酶切位点，形成完整的抗人CD38-CAR基因序列信息。各序列具体信息见序列表。

1.3全基因合成上述抗人CD38-CAR序列，克隆到pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP慢病毒表达载体中，获得抗人CD38-CAR表达质粒(结构示意图见图1)。质粒经XbaI和NotI双酶切，琼脂糖凝胶电泳得到1186bp的CAR片段和7228bp的载体片段(酶切鉴定电泳图见图2)。质粒最终经测序鉴定正确。

实施例2：慢病毒的包装、浓缩和滴度测定

以碱裂解法大量提取质粒(北京天根生化科技有限公司无内毒素质粒提取试剂盒)，用百恩维生物技术有限公司的慢病毒包装试剂盒(含慢病毒包装混合物和HET高效转染试剂盒)转染293T细胞包装病毒。

2.1慢病毒的包装和浓缩：

1)在转染的前一天，传代准备细胞：用0.25％胰蛋白酶消化293T细胞，以含10％血清的DMEM培养基调整细胞密度后，按照每10cm细胞培养皿接种6～8×10⁶细胞到10cm细胞培养皿中，置于37℃，5％CO₂培养箱培养，16h～24h后待细胞密度生长到80％～90％时转染。

2)第二天，在转染前2h～4h，用5ml不含P/S的培养基换液(DMEM+10％FBS)。

3)按照以下实验步骤进行转染：

A、加入500μl HET Buffer A到一支洁净的1.5ml EP管中(标记为A管)；

B、在另一支洁净的1.5ml EP管中(标记为B管)，加入以下试剂，终体系为500μl；

试剂名称	剂量
		目的质粒	10μl(1.0μg/μl)
慢病毒包装混合物	15μl(1.0μg/μl)
		HET Buffer B	50μl
ddH2O	425μl

C、将B管中的DNA温合液缓缓逐滴加入到A管中，用移液器轻轻混匀10min；

D、将混匀后的混合物室温静置30min，然后将混合物逐滴均匀加入到10cm细胞培养皿中，轻微混匀。置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。

4)第三天，即培养12h～16h后弃去培养基，用10ml新鲜的完全培养基换液(DMEM+10％FBS+P/S)。

5)第四天，即换液后24h，收集上清液，置于4℃冰箱保存，然后加入10ml新鲜的完全培养基至10cm细胞培养皿中，置于37℃，5％CO₂培养箱继续培养。

6)第五天：再一次收集上清，与第一次收集的上清液混合，1,000rpm离心5min，弃去细胞碎片，上清液以0.45μm PVDF滤器过滤至50ml圆底离心管中。4℃，50,000g高速离心2h，离心后用记号笔对病毒沉淀做好标记。

7)小心弃去上清，晾干，按200μl/10cm培养皿的量加入DMEM(不含血清、双抗)重悬病毒沉淀，室温静置2h，然后用移液器轻轻地吹匀(避免产生气泡)，继续室温放置30min，按每次使用的病毒量分装到洁净的1.5ml EP管中，-80℃冰箱保存。

2.2病毒滴度测定：

1)在滴度测定的前一天取一块48孔板，按照每孔3×10⁴细胞的密度接种HEK 293细胞。

2)加polybrene到新鲜的完全培养基中(DMEM+10％FBS+P/S)，使其终浓度为8μg/ml。

3)用含有polybrene的完全培养基10倍梯度稀释病毒，具体做法如下：取一个96孔板，每孔含有90μl培养基，第一个孔加入10μl待测病毒液，混匀后吸取10μl病毒混合液至第二个孔(混匀时尽量不要产生气泡)，如此稀释至第六个孔(即稀释10⁵倍)。

4)各吸取10μl病毒稀释液到相对应的48孔板中，置于37℃，5％CO₂培养箱培养过夜，16h～24h后用新鲜的完全培养基换液(DMEM+10％FBS+P/S)。

5)置于37℃，5％CO₂培养箱培养48h后，用荧光显微镜计数荧光细胞数量。一般情况下，在最高稀梯度10^m的孔数出现N(N<10)个带荧光的细胞，则病毒滴度为N×10^m TU/μl(即N×10^m+3TU/ml)，若N>10，则需要继续稀释。

实施例3：抗人CD38-CAR-T细胞的制备和鉴定

3.1T细胞的分离纯化和刺激培养

取健康供者外周血，每1ml样品中加入50μl的RosetteSep^TM人T细胞富集抗体混合物，混匀；室温孵育20min；加入等体积的PBS+2％FBS稀释上述样本后小心加到Ficoll分离液的上层；1,200g室温离心20min；吸取中间层白膜于新的离心管中；用PBS+2％FBS洗涤细胞2次，1,500rpm离心10min；细胞沉淀用含5％FBS的X-VIVO^TM15培养液重悬，台盼蓝染色计数；将抗人CD3/CD28磁珠用X-VIVO^TM15培养液洗涤2次，按1:1比例加入T细胞悬液中，调整细胞密度至1×10⁶/ml，并加入100IU/ml rhIL-2；将上述细胞悬液以1ml/孔接种到24孔板。

3.2T细胞的病毒感染和扩增

T细胞活化后24h，室温下融解CD38-CAR和空载体(MOCK)慢病毒浓缩液，每孔加入10μl CAR病毒或5μl MOCK病毒悬液(病毒滴度为1×10⁸

TU/ml，MOI值分别为1和0.5)，均加入终浓度为8μg/ml的Polybrene，混匀；将培养板32℃1,800rpm离心90min，置于孵箱培养；24h后离心换液，1,500rpm离心10min，弃上清，加入新鲜培养液重悬，以细胞密度为(0.5～1)×10⁶/ml接种到6孔板，并加入100IU/mlrhIL-2；以后每2天补液一次，将培养体系扩大，保持细胞生长密度和rhIL-2用量同前。

3.3CAR蛋白表达的鉴定

感染后96h，用倒置荧光显微镜观察T细胞的绿色荧光表达情况并照相(结果见图3)。CAR蛋白N端加入了Myc标签，可用于流式细胞仪检测T细胞的感染效率：吸取少量感染后的细胞于1.5ml EP管，3,000rpm离心3min，弃上清；用PBS离心洗涤1次，弃上清；预留约100μl液体重悬细胞团块，加入PE标记的鼠抗人Myc抗体2μl，冰上避光孵育30min；用PBS洗涤1次，细胞团块用300μl PBS重悬，过膜转移至流式管中，Beckman Coulter FC500流式细胞仪上机检测。可见GFP和Myc双阳性的CAR-T细胞群，感染效率达60％以上(结果见图4)。

实施例4：流式细胞仪鉴定几种细胞系的表型

用FITC偶联的抗人CD38抗体、PE偶联的抗人CD138抗体和Percp/Cy5.5偶联的抗人CD15抗体标记几种常见的细胞系，流式鉴定多发性骨髓瘤细胞系LP-1、RPMI 8226、OPM2和MOLP8细胞的表型为CD38⁺CD138⁺，以LP-1为例(结果见图5A)。敲除了CD38的LP-1细胞系(KO细胞)为CD38^-CD138⁺(结果见图5B)。髄系白血病细胞系K562细胞为CD38^-CD138^-CD15⁺(结果见图6)。

实施例5：体外共培养测定CAR-T细胞的肿瘤特异性杀伤作用

5.1流式细胞术监测共培养体系中靶细胞的残留水平

将效应细胞CAR-T细胞分别与CD38阳性的靶细胞(LP-1、RPMI 8226、OPM2和MOLP8)以及CD38阴性的靶细胞(KO和K562)共培养，以空载体感染的T细胞(MOCK-T细胞)作为对照组的效应细胞。设置效靶比例为1:4，于0h、24h、48h流式检测共培养体系中肿瘤细胞的比例，LP-1、RPMI8226、OPM2、MOLP8和KO细胞用PE偶联的抗人CD138抗体标记，K562细胞用Percp/Cy5.5偶联的抗人CD15抗体标记，绘制肿瘤细胞比例随时间的变化。可见CD38阳性的LP-1、RPMI 8226、OPM2和MOLP8细胞都能被CAR-T细胞完全清除，不能被MOCK-T细胞杀伤；而CD38阴性的KO和K562细胞不能被CAR-T细胞清除(结果见图7)。流式细胞仪监测LP-1细胞的示意图(见图8)。显示出抗人CD38-CAR-T细胞对CD38阳性的肿瘤细胞的高效特异性杀伤作用。

5.2ELISA法测定细胞因子的水平

为评估CAR-T细胞与不同靶细胞共培养时的活化状态，ELISA检测共培养上清中细胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α的水平。ELISA试剂盒购自R&D公司，按说明书进行操作。

1)待检测样品来自于上述各组共培养24h的上清，从-20℃取出，室温融化。

2)将浓缩洗涤液、浓缩稀释液、标准品、密封板条从冰箱中取出室温预温。

3)分别将浓缩洗涤液(25×)和浓缩稀释液(5×)用双蒸水稀释至工作浓度(1×)。

4)制备标准品：加入稀释液至冻干标准品中，轻轻震荡至少15min至彻底溶解，混匀，稀释至1000、500、250、125、62.5、31.25、15.6和0pg/ml。

5)制备样品：将步骤1)所述待检样品用稀释液做梯度稀释。

6)分别将稀释后的样品或不同浓度的标准品加入相应孔中100μl/孔，用封板胶纸封住反应孔，室温孵育2h。

7)洗板4次，200μl/孔。

8)将检测抗体平衡至室温，加入200μl/孔，用封板胶纸封住反应孔，室温孵育2h。

9)洗板4次，200μl/孔。

10)将显色底物A液和B液平衡至室温，避光，等体积混合后15min内加到各孔200μl/孔，室温避光孵育30min(视显色深浅灵活掌握)。

11)将终止液平衡至室温，加入终止液50μl/孔，混匀后30min内酶标仪450nm(检测波长)和570nm(校正波长)波长测量吸收值(OD₄₅₀和OD₅₇₀)。

12)绘出4参数(4-PL)线性标准曲线，通过样品的OD值查出其浓度。

可见CAR-T细胞与LP-1、RPMI 8226、OPM2或MOLP8共培养组细胞因子的水平明显高于MOCK-T细胞与上述靶细胞共培养组，也高于CAR-T细胞与KO或K562细胞共培养组(结果见图9)。与流式检测结果相符。

上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。

序列表

<110> 深圳市第二人民医院、北京大学深圳研究生院

<120> 一种嵌合抗原受体及其应用

<130>

<160> 10

<210> 1

<211> 391

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gly Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp

20 25 30

Leu Ala Ala Ser Gly Ala His Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly

35 40 45

Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala

50 55 60

Ser Gly Tyr Thr Asp Ser Asp Tyr Ile Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala

65 70 75 80

Pro Gly Lys Glu Arg Glu Val Val Ala Thr Ile Tyr Ile Gly Gly Thr

85 90 95

Tyr Ile His Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg

100 105 110

Asp Asn Ala Glu Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro

115 120 125

Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Thr Lys Trp Arg Pro Phe

130 135 140

Ile Ser Thr Arg Ala Ala Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

145 150 155 160

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Glu Phe Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg

165 170 175

Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg

180 185 190

Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly

195 200 205

Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr

210 215 220

Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Lys Arg Gly

225 230 235 240

Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val

245 250 255

Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu

260 265 270

Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp

275 280 285

Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn

290 295 300

Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg

305 310 315 320

Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly

325 330 335

Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu

340 345 350

Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu

355 360 365

Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His

370 375 380

Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

385 390

<210> 2

<211> 1173

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccgggatccg aacaaaaact catctcagaa gaggatctgg cagcaagcgg cgcgcatgcc 120

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 180

tcctgtgcag cctctggata caccgatagt gattacatca tggcctggtt ccgccaggct 240

ccagggaagg agcgcgaggt ggtcgcaact atttatattg gtggtacgta catccactat 300

gccgactccg tgaagggccg attcaccatc tcccgagaca atgccgagaa cacggtgtat 360

ctgcaaatga acaacctgaa acctgaagac actgccatgt actactgtgc ggccacgaaa 420

tggcgcccct ttatatcgac tcgggcagct gagtataact actggggtca ggggaccctg 480

gtcaccgtct cctcagctag cgaattcacc acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg 540

gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg 600

gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac ttcgcctgtg atatctacat ctgggcgccc 660

ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg tcactggtta tcacccttta caaacggggc 720

agaaagaaac tcctgtatat attcaaacaa ccatttatga gaccagtaca aactactcaa 780

gaggaagatg gctgtagctg ccgatttcca gaagaagaag aaggaggatg tgaactgaga 840

gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat 900

aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg 960

gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa 1020

ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg 1080

aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac 1140

gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct cgc 1173

<210> 3

<211> 134

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Ala Ala Ser Gly Ala His Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25 30

Gly Tyr Thr Asp Ser Asp Tyr Ile Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro

35 40 45

Gly Lys Glu Arg Glu Val Val Ala Thr Ile Tyr Ile Gly Gly Thr Tyr

50 55 60

Ile His Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp

65 70 75 80

Asn Ala Glu Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu

85 90 95

Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Thr Lys Trp Arg Pro Phe Ile

100 105 110

Ser Thr Arg Ala Ala Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

115 120 125

Thr Val Ser Ser Ala Ser

130

<210> 4

<211> 402

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcagcaagcg gcgcgcatgc ccaggtgcag ctggtggagt ctgggggagg ctcggtgcag 60

gctggagggt ctctgagact ctcctgtgca gcctctggat acaccgatag tgattacatc 120

atggcctggt tccgccaggc tccagggaag gagcgcgagg tggtcgcaac tatttatatt 180

ggtggtacgt acatccacta tgccgactcc gtgaagggcc gattcaccat ctcccgagac 240

aatgccgaga acacggtgta tctgcaaatg aacaacctga aacctgaaga cactgccatg 300

tactactgtg cggccacgaa atggcgcccc tttatatcga ctcgggcagc tgagtataac 360

tactggggtc aggggaccct ggtcaccgtc tcctcagcta gc 402

<210> 5

<211> 222

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile

35 40 45

Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val

50 55 60

Ile Thr Leu Tyr Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys

65 70 75 80

Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys

85 90 95

Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val

100 105 110

Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn

115 120 125

Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val

130 135 140

Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg

145 150 155 160

Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys

165 170 175

Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg

180 185 190

Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys

195 200 205

Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

210 215 220

<210> 6

<211> 666

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc 180

ctgtcactgg ttatcaccct ttacaaacgg ggcagaaaga aactcctgta tatattcaaa 240

caaccattta tgagaccagt acaaactact caagaggaag atggctgtag ctgccgattt 300

ccagaagaag aagaaggagg atgtgaactg agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc 360

cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc tataacgagc tcaatctagg acgaagagag 420

gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga 480

aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc 540

tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc cggaggggca aggggcacga tggcctttac 600

cagggtctca gtacagccac caaggacacc tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc 660

cctcgc 666

<210> 7

<211> 21

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens)

<400> 7

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 8

<211> 63

<212> DNA

<213> 人（Homo sapiens)

<400> 8

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccg 63

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens)

<400> 9

Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu

1 5 10

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人（Homo sapiens)

<400> 10

gaacaaaaac tcatctcaga agaggatctg 30

Claims

1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，包括依次串联的抗人CD38纳米抗体、人CD8α铰链区和跨膜区、人CD137胞内区和CD3ζ胞内区。

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQ IDNO.1所示，其核酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗人CD38纳米抗体其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其核酸序列如SEQ ID NO.4所示。

4.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，人CD8α铰链区和跨膜区、人CD137胞内区和CD3ζ胞内区串联而成的结构构成信号传导结构域，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，其核酸序列如SEQ ID NO.6所示。

5.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基末端还含有一个CD8α信号肽，其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO.7所示，其核酸序列如SEQ IDNO.8所示。

6.根据权利要求5所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的CD8α信号肽和抗人CD38纳米抗体序列之间含有1个Myc标签，其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO.9所示，其核酸序列如SEQ ID NO.10所示。

7.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的T细胞共刺激信号分子是CD137-CD3ζ、CD28-CD3ζ或CD28-CD137-CD3ζ。

8.如权利要求1所述的嵌合抗原受体在制备嵌合抗原受体T细胞及其在肿瘤治疗中的应用。

9.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体的应用，其特征在于，将编码所述嵌合抗原受体的基因片段插入慢病毒表达载体，包装成慢病毒，感染人T细胞，制备得到嵌合抗原受体T细胞，用于表面CD38阳性的肿瘤治疗。