CN116496995A - 一种高滴度腺相关病毒的获取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高滴度腺相关病毒的获取方法，涉及高滴度腺相关病毒获取方法技术领域；包括如下步骤：对目标细胞进行处理，使其处于感染状态；将目标细胞培养至对数生长期；收集目标细胞培养物，离心分离上清液；将上清液加入到含有高滴度腺病毒的载体中，进行孵育；收集含有高滴度腺病毒的培养物，离心分离上清液；将上清液进行纯化和浓缩；得到高滴度腺病毒。本发明的方法能够快速、准确地获得高滴度的腺病毒，节省了实验时间和成本；在对目标细胞进行处理时，通过对温度、氧气浓度等参数的控制，保障了感染效率；通过离心分离上清液、纯化和浓缩等步骤，可以有效地去除目标细胞和其他杂质，从而提高了实验数据的可靠性。
Description
技术领域
本发明涉及高滴度腺相关病毒获取方法技术领域，尤其涉及一种高滴度腺相关病毒的获取方法。
背景技术
腺相关病毒是一种可以携带遗传信息的病毒，被广泛应用于基因治疗、药物筛选等领域。
目前，对于腺病毒的研究主要集中在病毒滴度、载量、复制速率、释放速率等方面。然而，在不同的温度和氧气浓度下，腺病毒的感染效果可能会有所不同，这就需要对这些因素进行更加精细的控制和调节。
经检索，中国专利申请号为CN202211218042.3的专利，公开了一种高效的腺相关病毒制备系统及方法，该系统包括能够稳定表达Cre重组酶的293T细胞系、携带部分产生重组腺相关病毒所必需的元件的重组腺病毒以及携带其它产生重组腺相关病毒所必需的元件的表达质粒；产生重组腺相关病毒所必需的元件包括Cap基因、Rep基因和带有外源基因的AAV核心表达元件；重组腺病毒的基因组中缺失E1和E3基因，且部分产生重组腺相关病毒所必需的元件插入于E1基因和/或E3基因所在区域，重组腺病毒的包装信号Ψ两端均同向插入有一段loxp序列。上述专利中的腺相关病毒制备方法存在以下不足：该方法的效率较低，实施困难，还有待改进。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种高滴度腺相关病毒的获取方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种高滴度腺相关病毒的获取方法，包括如下步骤：
S1：对目标细胞进行处理，使其处于感染状态；
S2：将目标细胞培养至对数生长期；
S3：收集目标细胞培养物，离心分离上清液；
S4：将上清液加入到含有高滴度腺病毒的载体中，进行孵育；
S5：收集含有高滴度腺病毒的培养物，离心分离上清液；
S6：将上清液进行纯化和浓缩；
S7：得到高滴度腺病毒。
优选的：所述S1步骤中，对目标细胞进行处理的具体步骤包括：
S11：选择合适的目标细胞；
S12：利用化学物质或基因转染等方法，使目标细胞进入感染状态；
S13：在细胞培养基中培养目标细胞，使其生长繁殖。
优选的：所述S2步骤中，将目标细胞培养至对数生长期的具体步骤包括：
S21：将目标细胞接种到含有合适营养成分的培养基中；
S22：控制培养温度为35-38℃、湿度50-60％、氧气浓度20-30％，进行培养；
S23：定期更换培养基，以保持目标细胞的生长状态。
优选的：所述S3步骤中，收集目标细胞培养物，离心分离上清液的具体步骤包括：
S31：将目标细胞培养物转移到离心管中；
S32：加入适量的离心缓冲液，使样品均匀悬浮；
S33：启动离心机，使样品快速旋转，离心处理12-16min；
S34：停止离心，将上清液取出，备用。
优选的：所述S4步骤中，孵育的具体步骤包括：
S41：将含有高滴度腺病毒的载体加入到离心管中的上清液中；
S42：加入辅助培养物质，使载体和病毒充分结合；
S43：启动培养箱，使混合物在适宜的温度和湿度下孵育；
S44：定期更换培养基和载体，以保证病毒的稳定性和持续感染性。
优选的：所述S41中，载体体积为上清液体积的18-22％。
优选的：所述S5步骤中，收集含有高滴度腺病毒的培养物，离心分离上清液的具体步骤包括：
S51：将含有高滴度腺病毒的培养物转移到离心管中；
S52：加入适量的离心缓冲液，使样品均匀悬浮；
S53：启动离心机，使样品快速旋转；
S54：停止离心，将上清液取出，备用。
优选的：所述S6步骤中，将上清液进行纯化和浓缩的具体步骤包括：
S61：将上清液进行过滤和超滤等纯化步骤，去除杂质和病毒颗粒；
S62：将纯化后的病毒溶液进行浓缩，使其浓度达到所需的水平；
S63：对浓缩后的病毒溶液进行冻干处理或低温储存，以备后续使用。
优选的：所述冻干处理的温度控制在-60～-75℃。
优选的：所述S2步骤中，将目标细胞培养至对数生长期的具体步骤包括：
S21：将目标细胞接种到含有合适营养成分的培养基中；
S22：控制培养温度为37℃、湿度55％、氧气浓度22％，进行培养；
S23：定期更换培养基，以保持目标细胞的生长状态。
本发明的有益效果为：
1.本发明的方法能够快速、准确地获得高滴度的腺病毒，节省了实验时间和成本；在对目标细胞进行处理时，通过对温度、氧气浓度等参数的控制，保障了感染效率。
2.本发明具有操作简单、成本低廉等优点，适用于实验室科研和生产应用，且通过离心分离上清液、纯化和浓缩等步骤，可以有效地去除目标细胞和其他杂质，从而提高了实验数据的可靠性。
附图说明
图1为本发明提出的一种高滴度腺相关病毒的获取方法中氧气浓度与感染效果的关系图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
实施例1：
一种高滴度腺相关病毒的获取方法，包括如下步骤：
S1：对目标细胞进行处理，使其处于感染状态；
S2：将目标细胞培养至对数生长期；
S3：收集目标细胞培养物，离心分离上清液；
S4：将上清液加入到含有高滴度腺病毒的载体中，进行孵育；
S5：收集含有高滴度腺病毒的培养物，离心分离上清液；
S6：将上清液进行纯化和浓缩；
S7：得到高滴度腺病毒。
其中，所述S1步骤中，对目标细胞进行处理的具体步骤包括：
S11：选择合适的目标细胞，如人类腺病毒2(Adeno-virustype2,Adv2)感染的HeLa细胞；
S12：利用化学物质或基因转染等方法，使目标细胞进入感染状态；
S13：在细胞培养基中培养目标细胞，使其生长繁殖。
其中，所述S2步骤中，将目标细胞培养至对数生长期的具体步骤包括：
S21：将目标细胞接种到含有合适营养成分的培养基中；
S22：控制培养温度为38℃、湿度60％、氧气浓度30％，进行培养；
S23：定期更换培养基，以保持目标细胞的生长状态。
其中，所述S3步骤中，收集目标细胞培养物，离心分离上清液的具体步骤包括：
S31：将目标细胞培养物转移到离心管中；
S32：加入适量的离心缓冲液，使样品均匀悬浮；
S33：启动离心机，使样品快速旋转，离心处理16min；
S34：停止离心，将上清液取出，备用。
其中，所述S4步骤中，孵育的具体步骤包括：
S41：将含有高滴度腺病毒的载体加入到离心管中的上清液中；
S42：加入辅助培养物质，使载体和病毒充分结合；
S43：启动培养箱，使混合物在适宜的温度和湿度下孵育；
S44：定期更换培养基和载体，以保证病毒的稳定性和持续感染性；
其中，载体体积为上清液体积的22％。
其中，所述S5步骤中，收集含有高滴度腺病毒的培养物，离心分离上清液的具体步骤包括：
S51：将含有高滴度腺病毒的培养物转移到离心管中；
S52：加入适量的离心缓冲液，使样品均匀悬浮；
S53：启动离心机，使样品快速旋转；
S54：停止离心，将上清液取出，备用。
其中，所述S6步骤中，将上清液进行纯化和浓缩的具体步骤包括：
S61：将上清液进行过滤和超滤等纯化步骤，去除杂质和病毒颗粒；
S62：将纯化后的病毒溶液进行浓缩，使其浓度达到所需的水平；
S63：对浓缩后的病毒溶液进行冻干处理或低温储存，以备后续使用；
其中，冻干处理的温度控制在-75℃。
实施例2：
一种高滴度腺相关病毒的获取方法，包括如下步骤：
S1：对目标细胞进行处理，使其处于感染状态；
S2：将目标细胞培养至对数生长期；
S3：收集目标细胞培养物，离心分离上清液；
S4：将上清液加入到含有高滴度腺病毒的载体中，进行孵育；
S5：收集含有高滴度腺病毒的培养物，离心分离上清液；
S6：将上清液进行纯化和浓缩；
S7：得到高滴度腺病毒。
其中，所述S1步骤中，对目标细胞进行处理的具体步骤包括：
S11：选择合适的目标细胞，如人类腺病毒2(Adeno-virustype2,Adv2)感染的HeLa细胞；
S12：利用化学物质或基因转染等方法，使目标细胞进入感染状态；
S13：在细胞培养基中培养目标细胞，使其生长繁殖。
其中，所述S2步骤中，将目标细胞培养至对数生长期的具体步骤包括：
S21：将目标细胞接种到含有合适营养成分的培养基中；
S22：控制培养温度为37℃、湿度55％、氧气浓度22％，进行培养；
S23：定期更换培养基，以保持目标细胞的生长状态。
其中，所述S3步骤中，收集目标细胞培养物，离心分离上清液的具体步骤包括：
S31：将目标细胞培养物转移到离心管中；
S32：加入适量的离心缓冲液，使样品均匀悬浮；
S33：启动离心机，使样品快速旋转，离心处理15min；
S34：停止离心，将上清液取出，备用。
其中，所述S4步骤中，孵育的具体步骤包括：
S41：将含有高滴度腺病毒的载体加入到离心管中的上清液中；
S42：加入辅助培养物质，使载体和病毒充分结合；
S43：启动培养箱，使混合物在适宜的温度和湿度下孵育；
S44：定期更换培养基和载体，以保证病毒的稳定性和持续感染性；
其中，载体体积为上清液体积的20％。
其中，所述S5步骤中，收集含有高滴度腺病毒的培养物，离心分离上清液的具体步骤包括：
S51：将含有高滴度腺病毒的培养物转移到离心管中；
S52：加入适量的离心缓冲液，使样品均匀悬浮；
S53：启动离心机，使样品快速旋转；
S54：停止离心，将上清液取出，备用。
其中，所述S6步骤中，将上清液进行纯化和浓缩的具体步骤包括：
S61：将上清液进行过滤和超滤等纯化步骤，去除杂质和病毒颗粒；
S62：将纯化后的病毒溶液进行浓缩，使其浓度达到所需的水平；
S63：对浓缩后的病毒溶液进行冻干处理或低温储存，以备后续使用；
其中，冻干处理的温度控制在-70℃。
实施例3：
一种高滴度腺相关病毒的获取方法，包括如下步骤：
S1：对目标细胞进行处理，使其处于感染状态；
S2：将目标细胞培养至对数生长期；
S3：收集目标细胞培养物，离心分离上清液；
S4：将上清液加入到含有高滴度腺病毒的载体中，进行孵育；
S5：收集含有高滴度腺病毒的培养物，离心分离上清液；
S6：将上清液进行纯化和浓缩；
S7：得到高滴度腺病毒。
其中，所述S1步骤中，对目标细胞进行处理的具体步骤包括：
S11：选择合适的目标细胞，如人类腺病毒2(Adeno-virustype2,Adv2)感染的HeLa细胞；
S12：利用化学物质或基因转染等方法，使目标细胞进入感染状态；
S13：在细胞培养基中培养目标细胞，使其生长繁殖。
其中，所述S2步骤中，将目标细胞培养至对数生长期的具体步骤包括：
S21：将目标细胞接种到含有合适营养成分的培养基中；
S22：控制培养温度为35℃、湿度50％、氧气浓度20％，进行培养；
S23：定期更换培养基，以保持目标细胞的生长状态。
其中，所述S3步骤中，收集目标细胞培养物，离心分离上清液的具体步骤包括：
S31：将目标细胞培养物转移到离心管中；
S32：加入适量的离心缓冲液，使样品均匀悬浮；
S33：启动离心机，使样品快速旋转，离心处理12min；
S34：停止离心，将上清液取出，备用。
其中，所述S4步骤中，孵育的具体步骤包括：
S41：将含有高滴度腺病毒的载体加入到离心管中的上清液中；
S42：加入辅助培养物质，使载体和病毒充分结合；
S43：启动培养箱，使混合物在适宜的温度和湿度下孵育；
S44：定期更换培养基和载体，以保证病毒的稳定性和持续感染性；
其中，载体体积为上清液体积的18％。
其中，所述S5步骤中，收集含有高滴度腺病毒的培养物，离心分离上清液的具体步骤包括：
S51：将含有高滴度腺病毒的培养物转移到离心管中；
S52：加入适量的离心缓冲液，使样品均匀悬浮；
S53：启动离心机，使样品快速旋转；
S54：停止离心，将上清液取出，备用。
其中，所述S6步骤中，将上清液进行纯化和浓缩的具体步骤包括：
S61：将上清液进行过滤和超滤等纯化步骤，去除杂质和病毒颗粒；
S62：将纯化后的病毒溶液进行浓缩，使其浓度达到所需的水平；
S63：对浓缩后的病毒溶液进行冻干处理或低温储存，以备后续使用；
其中，冻干处理的温度控制在-60℃。
实验：
①将MDCK细胞株接种于DMEM培养基中，培养至对数生长期；
②收集目标细胞培养物，离心分离上清液，并进行初步纯化；
③分别将上清液分别加入含有不同浓度的氧气的DMEM培养基中，以模拟不同的生长环境；
④将含有不同浓度氧气的DMEM培养基加入到含有高滴度腺病毒的载体中，共同孵育；
⑤定期更换培养基和载体，以保证病毒的稳定性和持续感染性；
⑥在感染24小时后，收集含有腺病毒颗粒的上清液，进行PCR检测验证病毒存在；
⑦利用分光光度计和pH计等仪器，分别测量上清液中氧气浓度和pH值的变化，并记录下来；
⑧对实验结果进行统计学分析，比较不同氧气浓度下的感染效果差异。
具体实验结果如下：
| 氧气浓度 | 20％浓度 | 22％浓度 | 24％浓度 | 26％浓度 | 28％浓度 | 30％浓度 |
| 感染效果 | 90.2 | 90.4 | 89.3 | 87.6 | 85.1 | 82.9 |
由上可知，在氧气浓度较低水平的情况下，感染效果更佳。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种高滴度腺相关病毒的获取方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：对目标细胞进行处理，使其处于感染状态；
S2：将目标细胞培养至对数生长期；
S3：收集目标细胞培养物，离心分离上清液；
S4：将上清液加入到含有高滴度腺病毒的载体中，进行孵育；
S5：收集含有高滴度腺病毒的培养物，离心分离上清液；
S6：将上清液进行纯化和浓缩；
S7：得到高滴度腺病毒。
2.根据权利要求1所述的一种高滴度腺相关病毒的获取方法，其特征在于，所述S1步骤中，对目标细胞进行处理的具体步骤包括：
S11：选择合适的目标细胞；
S12：利用化学物质或基因转染等方法，使目标细胞进入感染状态；
S13：在细胞培养基中培养目标细胞，使其生长繁殖。
3.根据权利要求1所述的一种高滴度腺相关病毒的获取方法，其特征在于，所述S2步骤中，将目标细胞培养至对数生长期的具体步骤包括：
S21：将目标细胞接种到含有合适营养成分的培养基中；
S22：控制培养温度为35-38℃、湿度50-60％、氧气浓度20-30％，进行培养；
S23：定期更换培养基，以保持目标细胞的生长状态。
4.根据权利要求1所述的一种高滴度腺相关病毒的获取方法，其特征在于，所述S3步骤中，收集目标细胞培养物，离心分离上清液的具体步骤包括：
S31：将目标细胞培养物转移到离心管中；
S32：加入适量的离心缓冲液，使样品均匀悬浮；
S33：启动离心机，使样品快速旋转，离心处理12-16min；
S34：停止离心，将上清液取出，备用。
5.根据权利要求1所述的一种高滴度腺相关病毒的获取方法，其特征在于，所述S4步骤中，孵育的具体步骤包括：
S41：将含有高滴度腺病毒的载体加入到离心管中的上清液中；
S42：加入辅助培养物质，使载体和病毒充分结合；
S43：启动培养箱，使混合物在适宜的温度和湿度下孵育；
S44：定期更换培养基和载体，以保证病毒的稳定性和持续感染性。
6.根据权利要求1所述的一种高滴度腺相关病毒的获取方法，其特征在于，所述S41中，载体体积为上清液体积的18-22％。
7.根据权利要求1所述的一种高滴度腺相关病毒的获取方法，其特征在于，所述S5步骤中，收集含有高滴度腺病毒的培养物，离心分离上清液的具体步骤包括：
S51：将含有高滴度腺病毒的培养物转移到离心管中；
S52：加入适量的离心缓冲液，使样品均匀悬浮；
S53：启动离心机，使样品快速旋转；
S54：停止离心，将上清液取出，备用。
8.根据权利要求1所述的一种高滴度腺相关病毒的获取方法，其特征在于，所述S6步骤中，将上清液进行纯化和浓缩的具体步骤包括：
S61：将上清液进行过滤和超滤等纯化步骤，去除杂质和病毒颗粒；
S62：将纯化后的病毒溶液进行浓缩，使其浓度达到所需的水平；
S63：对浓缩后的病毒溶液进行冻干处理或低温储存，以备后续使用。
9.根据权利要求8所述的一种高滴度腺相关病毒的获取方法，其特征在于，所述冻干处理的温度控制在-60～-75℃。
10.根据权利要求1所述的一种高滴度腺相关病毒的获取方法，其特征在于，所述S2步骤中，将目标细胞培养至对数生长期的具体步骤包括：
S21：将目标细胞接种到含有合适营养成分的培养基中；
S22：控制培养温度为37℃、湿度55％、氧气浓度22％，进行培养；
S23：定期更换培养基，以保持目标细胞的生长状态。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN202310595200.5A CN116496995A (zh) | 2023-05-25 | 2023-05-25 | 一种高滴度腺相关病毒的获取方法 |
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|---|---|---|---|
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|---|---|
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