CN103397094B

CN103397094B - 一种检测转基因水稻品系Bt63的方法及试剂盒

Info

Publication number: CN103397094B
Application number: CN201310334366.8A
Authority: CN
Inventors: 黄新; 翟聪聪
Original assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2013-08-02
Filing date: 2013-08-02
Publication date: 2016-08-10
Anticipated expiration: 2033-08-02
Also published as: CN103397094A

Abstract

本发明公开了一种特异性检测转基因水稻品系Bt63的方法及试剂盒。本发明提供的检测方法和试剂盒涉及一组引物组合物，所述引物组合物具有序列表中SEQ ID №.1‑SEQ ID №.5所示的核苷酸序列。本发明提供的检测方法及试剂盒可用于特异性检测转基因水稻品系Bt63，具有快速、灵敏、准确、成本低廉的优点。

Description

一种检测转基因水稻品系Bt63的方法及试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测转基因水稻品系Bt63的方法及试剂盒。

背景技术

据国际农业生物技术应用咨询服务中心(international service for theacquisition of agri-biotech application，ISAAA)最新数据，全球已有100多种转基因作物被批准进行商业化种植，转基因作物的种植面积由1996年的170万公顷增加到2012年的1.703亿公顷，十六年间增长了100倍。全球59个国家或地区批准了2497项申请，涉及25种作物319个转化体。

转基因水稻Bt63是将抗虫基因cry1Ac/cry1Ab融合基因导入水稻明恢63基因组中，经过多代选育获得的抗虫水稻品系，其防虫效果在95%以上。2009年8月，Bt汕优63获得了农业部颁发的湖北省安全生产证书，但未被批准进行全球化种植。由于中国大米制品受到转基因水稻Bt63污染的事件屡屡发生，2008年4月欧盟委员会采用2008/289/EC决议对来源于中国的转基因水稻采取紧急措施。要求进口商在进口前应出具报告，证明该米制品货物未被转基因大米Bt63污染。

目前转基因水稻Bt63及其产品的检测方法主要PCR、荧光定量PCR、半巢式PCR等，这些方法都需要昂贵的扩增仪器。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异性检测转基因水稻品系Bt63的引物组合物、方法及试剂盒。

本发明提供的一种检测转基因水稻品系Bt63的引物组合物，所述引物组合物中各引物分别具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №.1-SEQ ID №.5所示的核苷酸序列；

2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №.1-SEQ ID №.5所限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且可特异性检测转基因水稻品系Bt63的核苷酸序列；具体的，所述同源性为95%以上；再具体的为96%以上；再具体的为97%以上；再具体的为98%以上；再具体的为99%以上。

所述引物组合物中，依次具有序列表中SEQ ID №.1-SEQ ID №.5所示核酸序列的引物的体积比为5:3:3:1:1

本发明提供的一种检测转基因水稻品系Bt63的方法，所述方法为以权力要求1所述的引物组合物为引物，以待测植物的基因组DNA或cDNA为模板，进行交叉引物扩增；若能扩增出产物，则所述待测植物为转基因水稻品系Bt63；若不能扩增出产物，则所述待测植物不是转基因水稻品系Bt63。

所述方法中，所述交叉引物扩增的反应体系包括：权力要求1所述的引物组合物、模板DNA或cDNA、交叉引物扩增专用酶、交叉引物扩增专用缓冲液、dNTPs混合物、甜菜碱溶液、MgSO₄和H₂O。

所述方法中，所述模板DNA或cDNA是从待测样品中获得的。

所述方法中，所述交叉引物扩增专用酶具体为Bst DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶大片段；所述Bst DNA聚合酶大片段是指具有Bst DNA聚合酶活性或功能的Bst DNA聚合酶大片段；所述Bst DNA聚合酶大片段可从NEB公司购买获得，货号M0275M。

所述方法中，所述交叉引物扩增专用缓冲液具体为ThermoPol缓冲液；所述ThermoPol缓冲液具体为Bst DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶大片段专用缓冲液；再具体为可从NEB公司购买获得，货号M0275M。

所述方法中，所述dNTPs混合物具体为dATP、dGTP、dCTP和dTTP的混合物。

所述方法中，所述甜菜碱溶液为PCR级甜菜碱溶液。

所述方法中，所述H₂O具体为ddH₂O或无菌水。

所述方法中，除模板DNA或cDNA以外，所述交叉引物扩增的反应体系具体为：每10μL反应体系中含有10×ThermoPol缓冲液1.0μL、10mM dNTPs混合物0.8μL、5M甜菜碱溶液0.5μL、1.0M MgSO₄水溶液0.06μL、20μM具有序列表中SEQ ID №.1所示核酸序列的引物0.5μL、20μM具有序列表中SEQ ID №.2所示核酸序列的引物0.3μL、20μM具有序列表中SEQ ID №.3所示核酸序列的引物0.3μL，20μM具有序列表中SEQ ID№.4所示核酸序列的引物0.1μL，20μM具有序列表中SEQ ID №.5所示核酸序列的引物0.1μL，Bst DNA聚合酶大片段6.4U，加入模板DNA或cDNA后用H₂O补齐至10μL。

所述方法中，所述模板DNA或cDNA是从待测样品中获得的。

所述方法中，所述dNTPs混合物具体为dATP、dGTP、dCTP和dTTP的混合物；所述10mMdNTPs混合物指dNTPs混合物中dATP、dGTP、dCTP和dTTP的浓度各为10mM。

所述方法中，所述甜菜碱溶液为PCR级甜菜碱溶液。

所述方法中，所述H₂O具体为ddH₂O或无菌水。

所述方法中，所述交叉引物扩增的反应条件为62℃，50min。

本发明提供的一种检测转基因水稻品系Bt63的试剂盒，所述试剂盒包括权力要求1所述的引物组合物。

所述试剂盒还包括：交叉引物扩增专用酶、交叉引物扩增专用缓冲液、dNTPs混合物、甜菜碱溶液、MgSO₄和H₂O。

所述试剂盒中，所述交叉引物扩增专用酶具体为Bst DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶大片段；所述Bst DNA聚合酶大片段是指具有Bst DNA聚合酶活性或功能的Bst DNA聚合酶大片段；所述Bst DNA聚合酶大片段可从NEB公司购买获得，货号M0275M。

所述试剂盒中，所述交叉引物扩增专用缓冲液具体为ThermoPol缓冲液；所述ThermoPol缓冲液具体为Bst DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶大片段专用缓冲液；再具体为可从NEB公司购买获得，货号M0275M。

所述试剂盒中，所述dNTPs混合物具体为dATP、dGTP、dCTP和dTTP的混合物。

所述试剂盒中，所述甜菜碱溶液为PCR级甜菜碱溶液。

所述试剂盒中，所述H₂O具体为ddH₂O或无菌水。

本发明的另一个目的是提供一种检测转基因水稻品系Bt63的PCR试剂，所述PCR试剂为，每10μL PCR试剂中含有10×ThermoPol缓冲液1.0μL、10mM dNTPs混合物0.8μL、5M甜菜碱溶液0.5μL、1.0M MgSO₄水溶液0.06μL、20μM具有序列表中SEQ ID №.1所示核酸序列的引物0.5μL、20μM具有序列表中SEQ ID №.2所示核酸序列的引物0.3μL、20μM具有序列表中SEQ ID №.3所示核酸序列的引物0.3μL，20μM具有序列表中SEQ ID №.4所示核酸序列的引物0.1μL，20μM具有序列表中SEQ ID №.5所示核酸序列的引物0.1μL，Bst DNA聚合酶大片段6.4U，加H₂O补齐至10μL。

所述PCR试剂中，所述Bst DNA聚合酶大片段是指具有Bst DNA聚合酶活性或功能的Bst DNA聚合酶大片段；所述Bst DNA聚合酶大片段可从NEB公司购买获得，货号M0275M。

所述PCR试剂中，所述交叉引物扩增专用缓冲液具体为ThermoPol缓冲液；所述ThermoPol缓冲液具体为Bst DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶大片段专用缓冲液；再具体为可从NEB公司购买获得，货号M0275M。

所述PCR试剂中，所述dNTPs混合物具体为dATP、dGTP、dCTP和dTTP的混合物；所述10mM dNTPs混合物指dNTPs混合物中dATP、dGTP、dCTP和dTTP的浓度各为10mM。

所述PCR试剂中，所述甜菜碱溶液为PCR级甜菜碱溶液。

所述PCR试剂中，所述H₂O具体为ddH₂O或无菌水。

本发明的还一个目的是提供所述的引物组合物、所述的试剂盒或所述的PCR试剂在检测转基因水稻品系Bt63中的应用。

本发明的再一个目的是提供所述的引物组合物在制备检测转基因水稻品系Bt63试剂盒或PCR试剂中的应用。

附图说明

图1为CPA检测的特异性结果，其中泳道M为Marker；泳道1为转基因水稻Bt63；泳道2为转基因水稻“科丰6号”；泳道3为转基因水稻克螟稻；泳道4为转基因玉米MON810；泳道5为转基因棉花GHB119；泳道6为转基因大豆Roundup Ready；泳道7为转基因番茄华番一号；泳道8为非转基因水稻。

图2为CPA检测的灵敏度结果，其中泳道M为Marker；泳道1-6依次为转基因水稻Bt63质量百分含量为100%，10%，1%，0.1%，0.01%，0.001%的样品；泳道7为非转基因水稻。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、应用交叉引物扩增技术(CPA)检测转基因水稻品系Bt63

(一)实验材料及试剂

转基因水稻Bt63，转基因水稻“科丰6号”，转基因水稻克螟稻，转基因玉米MON810，转基因棉花GHB119，转基因大豆Roundup Ready，转基因番茄华番一号，非转基因水稻均由中国检验检疫科学院提供。

Bst DNA聚合酶大片段及ThermoPol缓冲液购于NEB公司，货号M0275M；dNTPs混合物也购于NEB公司，甜菜碱溶液(5M)购于sigma公司。

(二)CPA法检测转基因水稻品系Bt63的特异性

1.样品中基因组DNA的提取

提取转基因水稻Bt63，转基因水稻“科丰6号”，转基因水稻克螟稻，转基因玉米MON810，转基因棉花GHB119，转基因大豆Roundup Ready，转基因番茄华番一号，非转基因水稻的基因组DNA，提取过程如下：

1)取样品粉末200mg，放入2.0ml的离心管中；

2)向离心管中加入1.0ml的CTAB提取液，20微升的蛋白酶K，震荡混匀，65℃金属浴1h，每10min混匀一次；

3)加入10微升RNase，充分混匀，置于37℃下5min；

4)12000rpm离心10min，上清液转移到新离心管中，加入2倍体积CTAB沉淀液，混匀，室温下1h；

5)12000rpm离心5min，弃上清，沉淀中加入350微升1.2mol/l的氯化钠和350微升的氯仿，混匀，12000rpm离心10min；

6)上清转移到新离心管中，加入0.6倍体积的异戊醇，混匀，12000rpm离心10min，弃上清。沉淀加入500微升70%的乙醇，小心震荡，12000rpm离心10min，弃上清。

7)干燥DNA，乙醇挥发完全后用50微升水溶解；

8)用NanoDrop ND-1000Spectrophotometer定量分析仪判定其纯度。

2.CPA引物的获得

表1

表1中，命名为1s的核苷酸序列见序列表中SEQ ID №.1所示；命名为2a的核苷酸序列见序列表中SEQ ID №.2所示；命名为3a的核苷酸序列见序列表中SEQ ID №.3所示；命名为4s的核苷酸序列见序列表中SEQ ID №.4所示；命名为5a的核苷酸序列见序列表中SEQ ID №.5所示。

人工合成具有序列表中SEQ ID №.1-SEQ ID №.5所示核苷酸序列的核酸片段，即得CPA引物。

3.交叉引物扩增过程

以上述提取的转基因水稻Bt63，转基因水稻“科丰6号”，转基因水稻克螟稻，转基因玉米MON810，转基因棉花GHB119，转基因大豆Roundup Ready，转基因番茄华番一号，非转基因水稻的基因组DNA为模板，以具有上述命名为1s、2a、3a、4s、5a的核苷酸序列的核酸片段为引物，进行CPA扩增，CPA扩增过程如下：

CPA反应体系：10×ThermoPol缓冲液1.0μL,10mM dNTPs混合物0.8μL，5M PCR级甜菜碱溶液0.5μL，1.0M MgSO₄水溶液0.06μL，引物1s(20μM)0.5μL，引物2a(20μM)0.3μL，引物3a(20μM)0.3μL，引物4s(20μM)0.1μL，引物5a(20μM)0.1μL，模板DNA2μL，Bst DNA聚合酶大片段6.4U，加ddH₂O补齐至10μL。

CPA反应条件：62℃50min。

4.CPA检测结果与分析

CPA反应结束，取5μL CPA产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统结果见图1。图1结果显示，在上述CPA反应条件下，只有转基因水稻Bt63能够看到扩增条带，而其他的转基因水稻、非转基因水稻及其他转基因作物均没有扩增产物的产生。实验结果说明上述CPA引物和CPA方法有很好的特异性，可用于特异性检测转基因水稻Bt63。

(三)CPA法检测转基因水稻品系Bt63的灵敏度

1.不同质量百分比样品的配制

将转基因水稻Bt63和非转基因水稻用研磨仪充分研磨，取1g转基因水稻Bt63粉末与9g非转基因水稻粉末充分混合，得到质量百分比为10%的混合样品；取1g10%的转基因水稻Bt63粉末与9g非转基因水稻粉末充分混合，得到质量百分比为1%的混合样品；依此方法，分别配制得到质量百分比梯度为0.1%，0.01%，0.001%的一系列水稻混合样品。

2.样品中基因组DNA的提取

提取上述配制得到的转基因水稻Bt63质量百分比含量为100%，10%，1%，0.1%，0.01%，0.001%的一系列样品以及非转基因水稻的基因组DNA，提取方法同本实施例的(二)中所述。

3.交叉引物扩增过程

以上述提取的一系列质量百分比含量不同的转基因水稻Bt63样品以及非转基因水稻的基因组DNA为模板，以本实施例(二)中所述的具有命名为1s、2a、3a、4s、5a的核苷酸序列的核酸片段为引物，进行CPA扩增，CPA反应体系和反应条件也同本实施例(二)中所述，不同的是将CPA反应体系中的模板DNA做相应的替换。

4.CPA检测结果与分析

CPA反应结束，取5μL CPA产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统结果见图2。图2结果显示，在上述CPA反应条件下，质量分数为0.1%以上的样品能检测到比较清晰的条带，因此该方法的最低检测限为0.1%。具有较高的灵敏度。

Claims

1.一种检测转基因水稻品系Bt63的引物组合物，所述引物组合物中各引物分别为序列表中SEQ ID No.1-SEQ ID No.5所示的核苷酸。

2.一种检测转基因水稻品系Bt63的方法，所述方法为以权利要求1所述的引物组合物为引物，以待测植物的基因组DNA或cDNA为模板，进行交叉引物扩增；若能扩增出产物，则所述待测植物为转基因水稻品系Bt63；若不能扩增出产物，则所述待测植物不是转基因水稻品系Bt63。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述交叉引物扩增的反应体系包括：权利要求1所述的引物组合物、模板DNA或cDNA、交叉引物扩增专用酶、交叉引物扩增专用缓冲液、dNTPs混合物、甜菜碱溶液、MgSO₄和H₂O；

所述交叉引物扩增专用酶为Bst DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶大片段；

所述交叉引物扩增专用缓冲液为ThermoPol缓冲液。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：除模板DNA或cDNA以外，所述交叉引物扩增的反应体系具体为：每10μL反应体系中含有10×ThermoPol缓冲液1.0μL、10mM dNTPs混合物0.8μL、5M甜菜碱溶液0.5μL、1.0M MgSO₄水溶液0.06μL、20μM序列表中SEQ ID No.1所示核酸序列的引物0.5μL、20μM序列表中SEQ ID No.2所示核酸序列的引物0.3μL、20μM序列表中SEQ ID No.3所示核酸序列的引物0.3μL，20μM序列表中SEQ ID No.4所示核酸序列的引物0.1μL，20μM序列表中SEQ ID No.5所示核酸序列的引物0.1μL，BstDNA聚合酶大片段6.4U，加入模板DNA或cDNA后用H₂O补齐至10μL。

5.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述交叉引物扩增的反应条件为62℃，50min。

6.一种检测转基因水稻品系Bt63的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组合物。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括：交叉引物扩增专用酶、交叉引物扩增专用缓冲液、dNTPs混合物、甜菜碱溶液、MgSO₄和H₂O；

所述交叉引物扩增专用缓冲液为ThermoPol缓冲液。

8.一种检测转基因水稻品系Bt63的PCR试剂，所述PCR试剂为，每10μL PCR试剂中含有10×ThermoPol缓冲液1.0μL、10mM dNTPs混合物0.8μL、5M甜菜碱溶液0.5μL、1.0MMgSO₄水溶液0.06μL、20μM序列表中SEQ ID No.1所示核酸序列的引物0.5μL、20μM序列表中SEQ IDNo.2所示核酸序列的引物0.3μL、20μM序列表中SEQ ID No.3所示核酸序列的引物0.3μL，20μM序列表中SE Q ID No.4所示核酸序列的引物0.1μL，20μM序列表中SEQ ID No.5所示核酸序列的引物0.1μL，Bst DNA聚合酶大片段6.4U，加H₂O补齐至10μL。

9.权利要求1所述的引物组合物、权利要求6或7任一所述的试剂盒或权利要求8所述的PCR试剂在检测转基因水稻品系Bt63中的应用。

10.权利要求1所述的引物组合物在制备检测转基因水稻品系Bt63试剂盒或PCR试剂中的应用。