CN104694658A - 土壤中植物病原菌含量的检测方法 - Google Patents

土壤中植物病原菌含量的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了土壤中植物病原菌含量的检测方法。本发明所提供的土壤中植物病原菌含量的检测方法包括：包括S1)和S2)：S1)用提取土壤微生物DNA的方法提取待测土壤微生物DNA，得到待测土壤微生物DNA；S2)以待测土壤微生物DNA为模板，用鉴定植物病原菌的成套试剂进行荧光定量PCR，通过PCR产物的荧光强度确定待测土壤中植物病原菌的含量；提取土壤微生物DNA的方法包括S21)和S22)：S21)向土壤中加入提取缓冲液得到细胞悬液；S22)向细胞悬液中加入SDS得到细胞裂解液，所述细胞裂解液中的SDS的质量百分比浓度为4％，裂解细胞，得到裂解液；除去所述裂解液中的杂质得到所述待测土壤微生物DNA。

Description

土壤中植物病原菌含量的检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域中土壤中植物病原菌含量的检测方法。
背景技术
土传病害对植物危害严重。其病原微生物存在于土壤中，环境稳定、病原抗逆能力强，难以进行化学防治。如：十字花科根肿病(Clubroot)是由专性寄生的芸薹根肿菌(Plasmodiophorabrassicae Woronin.)引起的世界性土传病害。该病为害十字花科白菜、油菜、甘蓝、薹菜等多种栽培品种，致使根部肿大，生长不良，萎蔫、矮化，产量和质量受损，严重威胁十字花科作物的生产。植物土传病害发生的主要决定因子是播种前土壤中病原菌的含量，对土壤中植物病原菌的定量检测是采取合理防治措施的基础。
土壤中植物病原菌的检测有多种方法，如：种植感病植株、荧光显微镜检测、血清学检测、常规PCR检测和荧光定量PCR检测等。我国不同地区的土壤类别、有机质含量和pH值差异很大。同时，土壤中富含酚类、酯类、腐植酸、重金属离子等，影响DNA的提取和后续的PCR反应。目前，土壤样品DNA的制备多采用试剂盒方法，土壤样品的处理量为0.25g-1g，其生物学代表意义差，不适合大量土壤样品检测。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何检测土壤中植物病原菌的含量。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了土壤中植物病原菌含量的检测方法。
本发明所提供的土壤中植物病原菌含量的检测方法，包括如下S1)和S2)：
S1)、用提取土壤微生物DNA的方法提取待测土壤微生物DNA，得到待测土壤微生物DNA；
S2)、以所述待测土壤微生物DNA为模板，用鉴定植物病原菌的成套试剂进行荧光定量PCR，通过PCR产物的荧光强度确定所述待测土壤中所述植物病原菌的含量；所述鉴定植物病原菌的成套试剂由鉴定所述植物病原菌的PCR引物对和探针组成；所述PCR引物对由序列表中SEQ ID No.1所示的单链DNA和SEQ ID No.2所示的单链DNA组成；所述探针的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示；
S1)所述提取土壤微生物DNA的方法包括如下S21)和S22)的步骤：
S21)向所述土壤中加入提取缓冲液得到细胞悬液；
S22)向所述细胞悬液中加入SDS得到细胞裂解液，所述细胞裂解液中的SDS的质量百分比浓度为4％，裂解细胞，得到裂解液；除去所述裂解液中的杂质得到所述待测土壤微生物DNA；
所述提取缓冲液由溶剂和溶质组成；所述溶剂为磷酸缓冲液，所述溶质及其浓度为1M Tris-HCl、0.1M EDTA、1.5M NaCl、2％(质量百分比浓度)CTAB、2％(质量百分比浓度)PVP(聚乙烯吡咯烷酮)；所述磷酸缓冲液为由溶质和溶剂组成的缓冲液，所述溶剂为水，所述溶质为NaH2PO4和Na2HPO4，所述NaH2PO4在所述磷酸缓冲液中的浓度为6.8mM，所述Na2HPO4在所述磷酸缓冲液中的浓度为93.2mM(即所述磷酸缓冲液中H2PO4 -和HPO4 2-的浓度之和为100mM)，所述磷酸缓冲液的pH为8.0。
上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述裂解细胞的时间可为2小时，所述裂解细胞的温度可为65℃。
上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述探针可标记有报告基团和荧光淬灭基团。所述报告基团具体可为FAM或ROX；所述荧光淬灭基团具体可为TAMARA或Eclipse。
在本发明的一个实施例中，所述探针的5’端标记有FAM，所述探针的3’端标记有TAMARA。
上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，S21)可包括下述S21a)和S21b)：
S21a)向所述土壤中加入所述提取缓冲液得到土壤悬液；
S21b)破碎所述土壤悬液中的土壤颗粒得到所述细胞悬液。
上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述细胞悬液中土壤颗粒的直径在50微米以下。
上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述破碎所述土壤悬液中的土壤颗粒可用德国Retsch生产的PlanetaryBall Mill PM 400仪器处理所述土壤悬液。所述处理的时间可为5-20分钟，具体可为10分钟。
上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述除去所述裂解液中的杂质得到所述待测土壤微生物DNA包括S22a)和S22b)：
S22a)向所述裂解液中加入PEG溶液除去所述裂解液中的杂质得到DNA溶液；
S22b)用PVPP(交联聚乙烯吡咯烷酮)除去所述DNA溶液中的杂质得到所述待测土壤微生物DNA；
上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述PEG溶液由水、NaCl和PEG组成；所述PEG溶液中所述PEG的质量百分浓度为20％-50％，所述NaCl的浓度为1.6M。所述PEG具体可为PEG8000。所述20％-50％具体可为30％。
上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述S22a)包括A1)和A2)：
A1)将所述裂解液进行离心，使DNA进入上清液中，收集上清液，将该上清液称为上清液a1，向所述上清液a1中加入氯仿，得到含有DNA的提取液，将该提取液称为提取液b1；
A2)将所述提取液b1进行离心，使DNA进入上清液中，收集上清液，将该上清液称为上清液a2，向所述上清液a2中加入所述PEG溶液，得到含有DNA的提取液，将该提取液称为提取液b2，除去所述提取液b2中的杂质，得到所述DNA溶液；
上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述PEG溶液的体积可为所述上清液a2体积的1/2。
上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述上清液a2和所述PEG溶液的反应温度可为4℃；所述上清液a2和所述PEG溶液的反应时间可为1小时。
上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述除去所述提取液b2中的杂质可包括如下步骤：将所述提取液b2进行离心，使DNA进入沉淀中，收集沉淀，将该沉淀称为沉淀c1，向所述沉淀c1中加入体积百分比浓度为75％的乙醇水溶液，得到含有DNA的提取液，将该提取液称为提取液b3，除去所述提取液b3中的杂质，得到所述DNA溶液。
上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述除去所述提取液b3中的杂质可包括如下步骤：将所述提取液b3进行离心，使DNA进入沉淀中，收集沉淀，将该沉淀称为沉淀c2，向所述沉淀c2中加入TE buffer，得到所述DNA溶液；
所述TE buffer由水和溶质组成，所述TE buffer的pH为8.0，所述溶质及其浓度为10mM Tris-HCl、1mM EDTA。
上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述向所述沉淀c2中加入TE buffer的温度可为50-60℃。所述50-60℃具体可为55℃。
上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述S22b)包括如下步骤：将所述DNA溶液加入PVPP纯化柱中进行离心，收集流出液，得到含有DNA的提取液，将该提取液称为提取液b4，除去提取液b4中的杂质，得到所述待测土壤微生物DNA；
所述PVPP纯化柱的制备方法如下：先在纯化柱底部加入一层滤纸，然后向所述纯化柱中加入混合物A，离心，得到所述PVPP纯化柱；所述混合物A的pH为7.0，所述混合物A为向磷酸缓冲液甲中加入PVPP得到的混合物，所述混合物A中所述PVPP的质量百分比浓度为20％；所述磷酸缓冲液甲为由溶质和溶剂组成的缓冲液，所述溶剂为水，所述溶质为NaH2PO4和Na2HPO4，所述NaH2PO4在所述磷酸缓冲液甲中的浓度为57.7mM，所述Na2HPO4在所述磷酸缓冲液甲中的浓度为42.3mM(即所述磷酸缓冲液甲中H2PO4 -和HPO4 2-的浓度之和为100mM)，所述磷酸缓冲液甲的pH为7.0。所述离心可在455×g下进行，所述离心的时间可为1分钟。
上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述将所述DNA溶液加入PVPP纯化柱中进行离心可为将所述DNA溶液加入PVPP纯化柱中于2200×g下离心10-20min(如15min)。
上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述除去提取液b4中的杂质包括如下步骤：向所述提取液b4中加入Tris饱和酚，得到含有DNA的提取液，将该提取液称为提取液b5，除去所述提取液b5中的杂质，得到所述待测土壤微生物DNA。
所述Tris饱和酚可为北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司产品，货号为NEP038。
上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述Tris饱和酚和所述提取液b4的体积相等。
上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述除去所述提取液b5中的杂质包括如下步骤：将所述提取液b5进行离心，使DNA进入上清液中，收集上清液，将该上清液称为上清液a3，向所述上清液a3中加入溶液A，得到含有DNA的提取液，将该提取液称为提取液b6，除去所述提取液b6中的杂质，得到所述待测土壤微生物DNA；
所述溶液A由氯仿和异戊醇组成，所述溶液A中氯仿和异戊醇的体积比为24：1。
上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述溶液A和所述上清液a3的体积相等。
上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述除去所述提取液b6中的杂质包括如下步骤：将所述提取液b6进行离心，使DNA进入上清液中，收集上清液，将该上清液称为上清液a4，向所述上清液a4中加入醋酸钠水溶液和异丙醇，得到含有DNA的提取液，将该提取液称为提取液b7，除去所述提取液b7中的杂质，得到所述待测土壤微生物DNA；
所述醋酸钠水溶液中醋酸钠的浓度为3M，pH值为5.2。
上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述醋酸钠水溶液的体积可为所述上清液a4的体积的1/10；所述异丙醇的体积可为所述上清液a4的体积的7/10。
上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述植物病原菌可为十字花科根肿病菌。
本发明所要解决的另一个技术问题是如何提取土壤微生物的DNA。
为解决上述技术问题，本发明提供了提取土壤微生物DNA的方法。
本发明所提供的提取土壤微生物DNA的方法，为上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中所述提取土壤微生物DNA的方法。
本发明所要解决的另一个技术问题是如何检测土壤中十字花科根肿病菌的含量。
为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定植物病原菌的成套试剂。
本发明所提供的鉴定植物病原菌的成套试剂，为上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中所述成套试剂；所述植物病原菌为十字花科根肿病菌。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一应用：
I、所述土壤中植物病原菌含量的检测方法在检测土壤中植物病原菌含量中的应用；
II、所述土壤中植物病原菌含量的检测方法在预测植物发病风险中的应用；
III、所述提取土壤微生物DNA的方法在检测土壤中植物病原菌含量中的应用；
IV、所述提取土壤微生物DNA的方法在预测植物发病风险中的应用；
V、所述成套试剂在检测土壤中植物病原菌含量中的应用；
VI、所述成套试剂在预测植物发病风险中的应用。
上述应用中，所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。所述双子叶植物具体可为十字花科植物，如白菜、油菜、甘蓝、薹菜。
上述应用中，所述植物病原菌可为十字花科根肿病菌。
上文中，所述荧光定量PCR的反应体系可为：TaKaRa TaqTM HS(5U/μl)0.5μl，10×TaKaRa TaqTM Buffer 2.5μl，25mM MgCl2 3μl，浓度均为2.5mM的dATP、dTTP、dCTP和dGTP的混合物dNTP mix 2.5μl，SEQ ID No.1所示的单链DNA和SEQ ID No.2所示的单链DNA(SEQ ID No.1所示的单链DNA和SEQ ID No.2所示的单链DNA在反应体系中的浓度均为0.8μM)，所述探针(所述探针在反应体系中的浓度为0.4μM)，土壤微生物DNA，用ddH2O补足25μL。
其中，所述TaKaRa TaqTM HS为TaKaRa产品，货号为R007Q；所述10×TaKaRaTaqTM Buffer为TaKaRa产品，货号为9151AM。
实验证明，本发明的土壤中植物病原菌含量的检测方法可以用来检测土壤中十字花科根肿病菌的含量；利用本发明的土壤中植物病原菌含量的检测方法检测土壤中十字花科根肿病菌的含量的回收效率可达92％±12％，本发明的提取土壤微生物DNA的方法得到的土壤微生物DNA对荧光定量PCR的影响很小，I值为-7.3±7.2，本发明的提取土壤微生物DNA的方法得到的土壤微生物DNA可以用于荧光定量PCR反应。利用本发明的土壤中十字花科根肿病菌含量的检测方法检测的土壤样品的量可达到100g，该检测方法中的鉴定十字花科根肿病菌的成套试剂的灵敏度达到5拷贝/25μl，该检测方法最低可检测100个十字花科根肿病菌休眠孢子/g干土，该检测方法可以特异性检测土壤中的十字花科根肿病菌，单个样品的检测时间可缩短为1小时，可同时进行大批量样本分析，具有良好的特异性、重复性和稳定性，适用于各地区十字花科作物播前土壤带菌量检测和发病风险预报。
附图说明
图1为根据线性载体T的Ct值和浓度绘制的标准曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的十字花科根肿病菌(Plasmodiophora brassicae)(Directevidence of surface infestation of seeds and tubers by Plasmodiophorabrassicae and quantification of spore loads，D.C.Rennie等，Plant Pathology(2011)60,811–819)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的爪哇异水霉(Allomyces javanicus)、烟草赤星病菌(Alternaria alternata)、白菜黑斑病菌(Alternaria brassicae)、白萝卜黑斑病菌(Alternaria raphani)、黑曲霉(Aspergillus niger)、平脐蠕孢属(Bipolarissp.)、炭疽病菌(Botrytis sp.)、黑线刺盘孢(Colletotrichum dematium)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、青霉菌(Penicillium sp.)和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)均记载在文献(Directevidence of surface infestation of seeds and tubers by Plasmodiophorabrassicae and quantification of spore loads，D.C.Rennie等，Plant Pathology(2011)60,811–819)中公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)(Development andValidation of a Real-Time PCR Assay for the Quantification of Verticilliumdahliae in Potato，J.S.Pasche，I.Mallik，Plant Disease(2013)，Vol.97No.5：608-618)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的TE buffer由水和溶质组成，TE buffer的pH为8.0，溶质及其浓度为10mM Tris-HCl、1mM EDTA。
下述实施例中的PVPP(交联聚乙烯吡咯烷酮)纯化柱的制备方法如下：先在纯化柱底部加入一层滤纸，然后向纯化柱中加入700μL混合物A，455×g离心1min，得到PVPP纯化柱；混合物A的pH为7.0，混合物A为向磷酸缓冲液甲中加入PVPP得到的混合物，混合物A中PVPP的质量百分比浓度为20％；磷酸缓冲液甲为由溶质和水组成的缓冲液，溶质为NaH2PO4和Na2HPO4，NaH2PO4在磷酸缓冲液甲中的浓度为57.7mM，Na2HPO4在磷酸缓冲液甲中的浓度为42.3mM(即磷酸缓冲液甲中H2PO4 -和HPO4 2-的浓度之和为100mM)，磷酸缓冲液甲的pH为7.0。其中PVPP为SIGMA-ALDRICH公司产品，货号为9003-39-8。
下述实施例中的提取缓冲液由溶剂和溶质组成；所述溶剂为磷酸缓冲液，所述溶质及其浓度为1M Tris-HCl、0.1M EDTA、1.5M NaCl、2％(质量百分比浓度)CTAB、2％(质量百分比浓度)PVP；磷酸缓冲液为由溶质和水组成的缓冲液，溶质为NaH2PO4和Na2HPO4，NaH2PO4在磷酸缓冲液中的浓度为6.8mM，Na2HPO4在磷酸缓冲液中的浓度为93.2mM(即磷酸缓冲液甲中H2PO4 -和HPO4 2-的浓度之和为100mM)，磷酸缓冲液的pH为8.0。
下述实施例中的Tris饱和酚为北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司产品，货号为NEP038，该Tris饱和酚为用1M Tris(pH8.0)饱和过的重蒸酚，为浅黄色透明液体，上层为Tris-HCl溶液层，pH>7.5，溶液内加有抗氧化的0.25％8-羟基喹啉和0.1％β-巯基乙醇。。
下述实施例中的TaKaRa TaqTM HS为TaKaRa产品，货号为R007Q；下述实施例中的10×TaKaRa TaqTM Buffer为TaKaRa产品，货号为9151AM。
土壤中植物病原菌含量的检测方法，包括如下S1)和S2)：
S1)、用提取土壤微生物DNA的方法提取待测土壤微生物DNA，得到待测土壤微生物DNA；
S2)、以待测土壤微生物DNA为模板，用鉴定植物病原菌的成套试剂进行荧光定量PCR，通过PCR产物的荧光强度确定待测土壤中植物病原菌的含量。
下面以十字花科根肿病菌为例具体阐述土壤中植物病原菌含量的检测方法。
实施例1、利用土壤中植物病原菌含量的检测方法检测土壤中十字花科根肿病菌的含量
鉴定十字花科根肿病菌的成套试剂由鉴定十字花科根肿病菌的PCR引物对和探针组成；鉴定十字花科根肿病菌的引物对由序列表中SEQ ID No.1所示的单链DNA和SEQ ID No.2所示的单链DNA组成；所述探针为序列表中SEQ ID No.3所示的单链DNA，所述探针的5’端标记有FAM，所述探针的3’端标记有TAMARA。
土壤中十字花科根肿病菌含量检测方法的具体步骤如下：
1、标准曲线的制备
1.1标准质粒的构建
将在美国国家生物信息中心NCBI基因库(GenBank)中基因登录号为AB526843.1的十字花科根肿病菌的DNA序列所示的DNA分子命名为十字花科根肿病菌基因1，利用引物PbITS1：5’-ACTTGCATCGATTACGTCCC-3’和PbITS2：5’-GGCATTCTCGAGGGTATCAA-3’扩增得到该十字花科根肿病菌基因1上的一段序列，将扩增得到的正确序列命名为基因2，该基因2在十字花科根肿病菌中的拷贝数为1拷贝/十字花科根肿病菌休眠孢子。将上述基因2连接在载体pMD18-T(pMD18-T为TaKaRa公司产品，货号为D101A)上，得到重组载体T。
1.2模板的制备
用TaKaRa公司的内切酶PstⅠ对步骤1.1中的重组载体T进行酶切并回收，得到浓度为1×109拷贝/μl的线性载体T溶液。用ddH2O对线性载体T溶液进行10倍梯度稀释，得到浓度分别为1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100拷贝/μl的线性载体T溶液。
1.3鉴定十字花科根肿病菌的成套试剂的制备
鉴定十字花科根肿病菌的成套试剂由鉴定十字花科根肿病菌的PCR引物对和探针组成；鉴定十字花科根肿病菌的引物对由序列表中SEQ ID No.1所示的单链DNA和SEQ ID No.2所示的单链DNA组成；所述探针为序列表中SEQ ID No.3所示的单链DNA，所述探针的5’端标记有FAM，所述探针的3’端标记有TAMARA。
1.4荧光定量PCR反应
实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：
分别以步骤1.2的浓度分别为1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100拷贝/μl的线性载体T溶液为模板，用步骤1.3的鉴定十字花科根肿病菌的成套试剂进行荧光定量PCR反应，分别得到浓度分别为1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100拷贝/μl的线性载体T的Ct值。
荧光定量PCR的反应体系均为下述25μl反应体系：TaKaRa TaqTM HS(5U/μl)0.5μl，10×TaKaRa TaqTM Buffer(Mg2+ free)2.5μl，25mM MgCl23μl，浓度均为2.5mM的dATP、dTTP、dCTP和dGTP的混合物dNTP mix 2.5μl，步骤1.3的SEQID No.1所示的单链DNA和SEQ ID No.2所示的单链DNA(SEQ ID No.1所示的单链DNA和SEQ ID No.2所示的单链DNA在反应体系中的浓度均为0.8μM)，步骤1.3的探针(探针在反应体系中的浓度为0.4μM)，步骤1.2的线性载体T溶液5μl(每个反应体系中一种浓度的线性载体T溶液)，用ddH2O补足25μL。
荧光定量PCR反应的仪器为德国analyticjena qTOWER 2.0，荧光定量PCR的反应程序均为：95℃预变性1min；95℃15s，60℃30s，45个循环。
1.5标准曲线的制备
实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：
分析步骤1.4的浓度分别为1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100拷贝/μl的线性载体T的Ct值和浓度间的线性关系，绘制标准曲线(图1)，标准曲线为：y＝-3.27x+36.26，R2＝0.996，E＝1.02。
2、土壤中十字花科根肿病菌的回收效率
实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：
2.1标准土壤的制备及标准土壤微生物DNA的提取
向不含十字花科根肿病菌的土壤中添加十字花科根肿病菌休眠孢子，得到标准土壤，使标准土壤中十字花科根肿病菌休眠孢子的含量为107个/g干土，按照提取土壤微生物DNA的方法提取标准土壤微生物DNA，提取土壤微生物DNA的方法如下：
将标准土壤置于室温下避光自然风干，得到风干后的土壤；将风干后的土壤采用Philips HR2168搅拌机进行搅拌破碎土壤颗粒，得到搅拌后的土壤；将搅拌后的土壤过20目筛，去除土壤大颗粒和其他杂质，得到过筛后的土壤；向100g过筛后的土壤中加入200ml提取缓冲液，得到土壤悬液，用德国Retsch生产的PlanetaryBall Mill PM 400仪器处理土壤悬液10min，使土壤悬液中的土壤颗粒直径在50微米以下，得到细胞悬液；
向1ml细胞悬液(该1ml细胞悬液中含有0.4g上述过筛后的土壤)中加入SDS得到细胞裂解液，细胞裂解液中SDS的浓度为4％(质量百分比浓度)，于65℃下裂解2小时，期间间断摇匀，得到裂解液；将裂解液于12000rpm、4℃下离心15min，使DNA进入上清液中，收集上清液，将该上清液称为上清液a1，向所述上清液a1中加入是上清液a11/2体积的4℃下预冷的氯仿，得到含有DNA的提取液，将该提取液称为提取液b1；将提取液b1于12000rpm、4℃下离心15min，使DNA进入上清液中，收集上清液，将该上清液称为上清液a2；向上清液a2中加入是上清液a21/2体积的30％(质量百分比浓度)PEG8000溶液，于4℃下反应1小时，得到含有DNA的提取液，将该提取液称为提取液b2；将提取液b2于12000rpm、4℃下离心15min，使DNA进入沉淀中，收集沉淀，将该沉淀称为沉淀c1，向所述沉淀c1中加入体积百分比浓度为75％的乙醇水溶液，得到含有DNA的提取液，将该提取液称为提取液b3，将提取液b3于12000rpm、4℃下离心5min，使DNA进入沉淀中，收集沉淀，将该沉淀称为沉淀c2，向沉淀c2中加入500μL TE buffer于55℃溶解，得到DNA溶液；
将DNA溶液加入PVPP纯化柱，于2200×g下离心15min，收集流出液，得到含有DNA的提取液，将该提取液称为提取液b4；向提取液b4中加入与提取液b4等体积的Tris饱和酚，得到含有DNA的提取液，将该提取液称为提取液b5，将提取液b5于12000rpm下离心15min，使DNA进入上清液中，收集上清液，将该上清液称为上清液a3；向上清液a3中加入与上清液a3等体积的溶液A(溶液A由氯仿和异戊醇组成，溶液A中氯仿和异戊醇的体积比为24：1)，得到含有DNA的提取液，将该提取液称为提取液b6，将提取液b6进行离心，使DNA进入上清液中，收集上清液，将该上清液称为上清液a4，向所述上清液a4中加入是上清液a41/10体积的醋酸钠水溶液(醋酸钠水溶液中醋酸钠的浓度为3M)和是上清液a47/10体积的异丙醇，得到含有DNA的提取液，将该提取液称为提取液b7，将所述提取液b7于4℃下孵育15min，并于12000rpm离心15min，使DNA进入沉淀中，收集沉淀，向该沉淀中加入800μL体积百分比浓度为75％的乙醇水溶液，得到含有DNA的提取液，将该提取液于12000rpm下离心5min，使DNA进入沉淀中，收集沉淀，向该沉淀中加入50μL TE buffer，得到标准土壤微生物DNA。
利用上述提取土壤微生物DNA的方法得到的土壤微生物DNA的量为41.6±17.3μg/g干土。
2.2土壤中十字花科根肿病菌的回收效率
按照步骤1.4的荧光定量PCR反应的体系和程序、以步骤2.1的标准土壤微生物DNA为模板，用步骤1.3的鉴定十字花科根肿病菌的成套试剂进行荧光定量PCR反应，得到标准土壤微生物DNA的Ct值。通过步骤1.5的标准曲线和标准土壤微生物DNA的Ct值得到标准土壤十字花科根肿病菌的基因2的拷贝数，十字花科根肿病菌的基因2的拷贝数为9.2×106±1.2×106拷贝/g干土，标准土壤十字花科根肿病菌休眠孢子的检测量为9.2×106±1.2×106个/g干土。
计算土壤中十字花科根肿病菌休眠孢子的回收效率，土壤中十字花科根肿病菌休眠孢子的回收效率为92％±12％。土壤中十字花科根肿病菌休眠孢子的回收效率(％)＝标准土壤十字花科根肿病菌休眠孢子的检测量/标准土壤中十字花科根肿病菌休眠孢子的含量×100％(标准土壤中十字花科根肿病菌休眠孢子的含量为107个/g干土)。
实施例2、土壤中十字花科根肿病菌含量的检测方法的灵敏度实验
1、鉴定十字花科根肿病菌的成套试剂的灵敏度实验
将实施例1中的浓度为1×109拷贝/μl的线性载体T溶液用无菌水进行梯度稀释，得到浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2拷贝/μl的线性载体T溶液。
以浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2拷贝/μl的线性载体T溶液中的DNA为模板，用实施例1步骤1.3的鉴定十字花科根肿病菌的成套试剂进行荧光定量PCR反应，反应体系分别为1拷贝/25μl反应体系、2拷贝/25μl反应体系、3拷贝/25μl反应体系、4拷贝/25μl反应体系、5拷贝/25μl反应体系和6拷贝/25μl反应体系。
1拷贝/25μl反应体系的配制方法如下：TaKaRa TaqTM HS(5U/μl)0.5μl，10×TaKaRa TaqTM Buffer(Mg2+ free)2.5μl，25mM MgCl23μl，浓度均为2.5mM的dATP、dTTP、dCTP和dGTP的混合物dNTP mix 2.5μl，实施例1步骤1.3的SEQ IDNo.1所示的单链DNA和SEQ ID No.2所示的单链DNA(SEQ ID No.1所示的单链DNA和SEQ ID No.2所示的单链DNA在反应体系中的浓度均为0.8μM)，实施例1步骤1.3的探针(探针在反应体系中的浓度为0.4μM))，0.2拷贝/μl的线性载体T溶液5μl，用ddH2O补足25μL。
按照上述方法，将0.2拷贝/μl的线性载体T溶液分别替换为0.4、0.6、0.8、1.0和1.2拷贝/μl的线性载体T溶液，其他步骤均不变，分别得到2拷贝/25μl反应体系、3拷贝/25μl反应体系、4拷贝/25μl反应体系、5拷贝/25μl反应体系和6拷贝/25μl反应体系。
按照实施例1步骤1.4的荧光定量PCR反应的程序进行荧光定量PCR反应，结果显示，该检测方法中的鉴定十字花科根肿病菌的成套试剂的灵敏度达到5拷贝/25μl。
2、土壤中十字花科根肿病菌含量的检测方法的灵敏度实验
按照实施例1步骤2的方法，将107个/g干土分别替换为106个/g干土、105个/g干土、104个/g干土、103个/g干土、102个/g干土和10个/g干土，其他步骤均不变，分别检测这些标准土壤中十字花科根肿病菌休眠孢子的含量。
结果显示，该检测方法最低可以检测到100个十字花科根肿病菌休眠孢子/g干土。结果表明，利用本发明的土壤中植物病原菌含量的检测方法可以检测到100个十字花科根肿病菌休眠孢子/g干土。
实施例3、土壤中十字花科根肿病菌含量的检测方法的特异性实验
按照实施例1步骤2的2.1的方法，将十字花科根肿病菌分别替换为爪哇异水霉(Allomyces javanicus)、烟草赤星病菌(Alternaria alternata)、白菜黑斑病菌(Alternaria brassicae)、白萝卜黑斑病菌(Alternaria raphani)、黑曲霉(Aspergillus niger)、平脐蠕孢属(Bipolaris sp.)、炭疽病菌(Botrytis sp.)、黑线刺盘孢(Colletotrichum dematium)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、青霉菌(Penicillium sp.)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)和大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)，其他步骤均不变，分别得到爪哇异水霉标准土壤微生物DNA、烟草赤星病菌标准土壤微生物DNA、白菜黑斑病菌标准土壤微生物DNA、白萝卜黑斑病菌标准土壤微生物DNA、黑曲霉标准土壤微生物DNA、平脐蠕孢属标准土壤微生物DNA、炭疽病菌标准土壤微生物DNA、黑线刺盘孢标准土壤微生物DNA、禾谷镰刀菌标准土壤微生物DNA、尖孢镰刀菌标准土壤微生物DNA、青霉菌标准土壤微生物DNA、立枯丝核菌标准土壤微生物DNA和大丽轮枝菌标准土壤微生物DNA。
按照实施例1步骤1的1.4的荧光定量PCR反应的体系和程序，分别以爪哇异水霉标准土壤微生物DNA、烟草赤星病菌标准土壤微生物DNA、白菜黑斑病菌标准土壤微生物DNA、白萝卜黑斑病菌标准土壤微生物DNA、黑曲霉标准土壤微生物DNA、平脐蠕孢属标准土壤微生物DNA、炭疽病菌标准土壤微生物DNA、黑线刺盘孢标准土壤微生物DNA、禾谷镰刀菌标准土壤微生物DNA、尖孢镰刀菌标准土壤微生物DNA、青霉菌标准土壤微生物DNA、立枯丝核菌标准土壤微生物DNA和大丽轮枝菌标准土壤微生物DNA为模板，用实施例1步骤1的1.3的鉴定十字花科根肿病菌的成套试剂进行荧光定量PCR反应。
结果显示，以爪哇异水霉标准土壤微生物DNA、烟草赤星病菌标准土壤微生物DNA、白菜黑斑病菌标准土壤微生物DNA、白萝卜黑斑病菌标准土壤微生物DNA、黑曲霉标准土壤微生物DNA、平脐蠕孢属标准土壤微生物DNA、炭疽病菌标准土壤微生物DNA、黑线刺盘孢标准土壤微生物DNA、禾谷镰刀菌标准土壤微生物DNA、尖孢镰刀菌标准土壤微生物DNA、青霉菌标准土壤微生物DNA、立枯丝核菌标准土壤微生物DNA和大丽轮枝菌标准土壤微生物DNA为模板的荧光定量PCR反应均无荧光定量PCR反应的曲线，结果表明，利用本发明的土壤中十字花科根肿病菌含量的检测方法可以特异检测土壤中的十字花科根肿病菌。
实施例4、提取土壤微生物DNA的方法对于荧光定量PCR影响
将实施例2步骤2中103个/g干土提取得到的标准土壤十字花科根肿病菌的基因2的拷贝数记为Qs。
向实施例2步骤2中103个/g干土提取的标准土壤微生物DNA中加入实施例1步骤1.2的104拷贝线性载体T溶液，得到DNA溶液，将该DNA溶液称为s+sp。按照实施例1步骤1.4的荧光定量PCR反应的体系和程序、以s+sp为模板，用实施例1步骤1.3的鉴定十字花科根肿病菌的成套试剂进行荧光定量PCR反应，得到s+sp的Ct值，通过实施例1步骤1.5的标准曲线计算s+sp的十字花科根肿病菌基因2的拷贝数，将s+sp的十字花科根肿病菌基因2的拷贝数记为Qs+sp。
向ddH2O中加入实施例1步骤1.2的104拷贝线性载体T溶液，得到DNA溶液，将该DNA溶液称为sp。按照实施例1步骤1.4的荧光定量PCR反应的体系和程序、以sp为模板，用实施例1步骤1.3的鉴定十字花科根肿病菌的成套试剂进行荧光定量PCR反应，得到sp的Ct值，通过实施例1步骤1.5的标准曲线计算sp的十字花科根肿病菌基因2的拷贝数，将sp的十字花科根肿病菌基因2的拷贝数记为Qsp。
按照下述公式计算利用上述提取土壤微生物DNA的方法得到的土壤微生物DNA对荧光定量PCR的影响：I＝100×[(Qs+sp)-(Qs+Qsp)]/(Qs+Qsp)，I值为-7.3±7.2。结果表明，上述提取土壤微生物DNA的方法得到的土壤微生物DNA对荧光定量PCR的影响很小。
实验证明，本发明的土壤中植物病原菌含量的检测方法可以用来检测土壤中十字花科根肿病菌的含量；本发明的提取土壤微生物DNA的方法得到的土壤微生物DNA对荧光定量PCR的影响很小，可以用于荧光定量PCR反应。

Claims (10)

1.土壤中植物病原菌含量的检测方法，包括如下S1)和S2)：
S1)、用提取土壤微生物DNA的方法提取待测土壤微生物DNA，得到待测土壤微生物DNA；
S2)、以所述待测土壤微生物DNA为模板，用鉴定植物病原菌的成套试剂进行荧光定量PCR，通过PCR产物的荧光强度确定所述待测土壤中所述植物病原菌的含量；所述鉴定植物病原菌的成套试剂由鉴定所述植物病原菌的PCR引物对和探针组成；所述PCR引物对由序列表中SEQ ID No.1所示的单链DNA和SEQ ID No.2所示的单链DNA组成；所述探针的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示；
S1)所述提取土壤微生物DNA的方法包括如下S21)和S22)的步骤：
S21)向所述土壤中加入提取缓冲液得到细胞悬液；
S22)向所述细胞悬液中加入SDS得到细胞裂解液，所述细胞裂解液中的SDS的质量百分比浓度为4％，裂解细胞，得到裂解液；除去所述裂解液中的杂质得到所述待测土壤微生物DNA；
所述提取缓冲液由溶剂和溶质组成；所述溶剂为磷酸缓冲液，所述溶质及其浓度为1M Tris-HCl、0.1M EDTA、1.5M NaCl、2％(质量百分比浓度)CTAB、2％(质量百分比浓度)PVP；所述磷酸缓冲液由溶质和溶剂组成的缓冲液，所述溶剂为水，所述溶质为NaH2PO4和Na2HPO4，所述NaH2PO4在所述磷酸缓冲液中的浓度为6.8mM，所述Na2HPO4在所述磷酸缓冲液中的浓度为93.2mM，所述磷酸缓冲液的pH为8.0。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：S21)包括下述S21a)和S21b)：
S21a)向所述土壤中加入所述提取缓冲液得到土壤悬液；
S21b)破碎所述土壤悬液中的土壤颗粒得到所述细胞悬液。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述提取土壤微生物DNA的方法中，所述除去所述裂解液中的杂质得到所述待测土壤微生物DNA包括S22a)和S22b)：
S22a)向所述裂解液中加入PEG溶液除去所述裂解液中的杂质得到DNA溶液；
S22b)用PVPP除去所述DNA溶液中的杂质得到所述待测土壤微生物DNA；
所述PEG溶液由水、NaCl和PEG组成；所述PEG溶液中所述NaCl的浓度为1.6M，所述PEG的质量百分浓度为30％-50％。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述S22a)包括A1)和A2)：
A1)将所述裂解液进行离心，使DNA进入上清液中，收集上清液，将该上清液称为上清液a1，向所述上清液a1中加入氯仿，得到含有DNA的提取液，将该提取液称为提取液b1；
A2)将所述提取液b1进行离心，使DNA进入上清液中，收集上清液，将该上清液称为上清液a2，向所述上清液a2中加入所述PEG溶液，得到含有DNA的提取液，将该提取液称为提取液b2，除去所述提取液b2中的杂质，得到所述DNA溶液；
和/或，
所述S22b)包括如下步骤：将所述DNA溶液加入PVPP纯化柱中进行离心，收集流出液，得到含有DNA的提取液，将该提取液称为提取液b4，除去提取液b4中的杂质，得到所述待测土壤微生物DNA；
所述PVPP纯化柱的制备方法如下：先在纯化柱底部加入滤纸，然后向所述纯化柱中加入混合物A，离心，得到所述PVPP纯化柱；所述混合物A为向磷酸缓冲液甲中加入PVPP得到的混合物，所述混合物A中所述PVPP的质量百分比浓度为20％；所述磷酸缓冲液甲为由溶质和溶剂组成的缓冲液，所述溶剂为水，所述溶质为NaH2PO4和Na2HPO4，所述NaH2PO4在所述磷酸缓冲液甲中的浓度为57.7mM，所述Na2HPO4在所述磷酸缓冲液甲中的浓度为42.3mM，所述磷酸缓冲液甲的pH为7.0。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述除去提取液b4中的杂质包括如下步骤：向所述提取液b4中加入Tris饱和酚，得到含有DNA的提取液，将该提取液称为提取液b5，除去所述提取液b5中的杂质，得到所述待测土壤微生物DNA。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述除去所述提取液b5中的杂质包括如下步骤：将所述提取液b5进行离心，使DNA进入上清液中，收集上清液，将该上清液称为上清液a3，向所述上清液a3中加入溶液A，得到含有DNA的提取液，将该提取液称为提取液b6，除去所述提取液b6中的杂质，得到所述待测土壤微生物DNA；
所述溶液A由氯仿和异戊醇组成，所述溶液A中氯仿和异戊醇的体积比为24：1。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述除去所述提取液b6中的杂质包括如下步骤：将所述提取液b6进行离心，使DNA进入上清液中，收集上清液，将该上清液称为上清液a4，向所述上清液a4中加入醋酸钠水溶液和异丙醇，得到含有DNA的提取液，将该提取液称为提取液b7，除去所述提取液b7中的杂质，得到所述待测土壤微生物DNA；
所述醋酸钠水溶液中醋酸钠的浓度为3M，pH值为5.2。
8.权利要求1-7中任一所述提取土壤微生物DNA的方法。
9.权利要求1所述的鉴定植物病原菌的成套试剂；所述植物病原菌为十字花科根肿病菌。
10.下述任一应用：
I、权利要求1-7中任一所述土壤中植物病原菌含量的检测方法在检测土壤中植物病原菌含量中的应用；
II、权利要求1-7中任一所述土壤中植物病原菌含量的检测方法在预测植物发病风险中的应用；
III、权利要求8所述提取土壤微生物DNA的方法在检测土壤中植物病原菌含量中的应用；
IV、权利要求8所述提取土壤微生物DNA的方法在预测植物发病风险中的应用；
V、权利要求1所述的成套试剂在检测土壤中植物病原菌含量中的应用；
VI、权利要求1所述的成套试剂在预测植物发病风险中的应用。
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