CN114107282A - 一种改性硅藻土提取核酸的方法及应用 - Google Patents

一种改性硅藻土提取核酸的方法及应用 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种改性硅藻土提取核酸的方法及应用。该改性硅藻土对核酸扩增反应没有抑制作用且可以富集大量核酸，提高核酸可扩增反应灵敏度。将该改性硅藻土应用于扩增反应，可集核酸提取、扩增、检测于一体，结合快速扩增手段，整个反应可在40min内完成，降低了核酸检测成本，提高了检测效率。

Description

一种改性硅藻土提取核酸的方法及应用
技术领域
本申请涉及核酸提取技术领域，尤其涉及一种改性硅藻土提取核酸的方法及应用。
背景技术
基于核酸的分子诊断技术可以短时间检测病原样本中核酸，提高了检测效率，降低了检测成本。然而，基于核酸检测的传统方法需要对核酸进行繁琐的提取处理，对操作、试剂盒仪器配备要求高。现有提取方法主要有磁珠提取法和热裂解法，磁珠法试剂昂贵，提取样本量往往不足。热裂解法往往对核酸造成不可逆的结构破坏，降低了提取后检测的准确性。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明旨在提供一种操作简单，无需复杂的反应溶剂和仪器，成本低，灵敏度高，特别适用于资源匮乏地区的核酸富集提取新方法，特别适用于下游分子生物学研究。
第一方面，本申请实施例公开了用于提取核酸的改性硅藻土，所述改性硅藻土具有硅藻土以及偶联在所述硅藻土表面的壳聚糖的结构。
本申请实施例中，所述壳聚糖分子量为1800～80000。
第二方面，本申请实施例公开了一种核酸提取方法，包括由向待提取样本中依次加入裂解液和第一方面所述的改性硅藻土的步骤；其中，所述裂解液用于从细胞、细菌、组织或有机体中释放出游离核酸，以便被所述改性硅藻土吸附提取。
在本申请实施例中，所述改性硅藻土吸附目的核酸的溶液pH值为4～6。
第三方面，本申请实施例公开了一种核酸检测方法，包括以下步骤：
获得第一方面所述的改性硅藻土；
向吸附核酸后的改性硅藻土中加入用于核酸扩增的反应体系；
扩增反应获得扩增产物；以及
检测所述扩增产物。
第四方面，本申请实施例公开了一种核酸提取试剂盒，包含第一方面所述的改性硅藻土。
第五方面，本申请实施例公开了一种核酸扩增试剂盒，包含第一方面所述的的含改性硅藻土。
第六方面，本申请实施例公开了第一方面所述的改性硅藻土的制备方法，该方法包括将硅藻土与壳聚糖通过(3-乙氧基丙基)甲基二乙氧基硅烷进行偶联反应得到；其中，所述壳聚糖的分子量为1800～80000，所述反应体系中壳聚糖的初始浓度为5～30mg/mL。
在本申请实施例中，所述反应体系中，(3-乙氧基丙基)甲基二乙氧基硅烷的初始浓度为0.1～10％，乙酸的初始浓度为0.01～0.5mol/L。
与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果：
本申请公开了一种改性硅藻土，其表面偶联壳聚糖，利用壳聚糖的等电点为6.3，在pH小于6.3时，由于静电吸附作用，带正电的壳聚糖会与带负电的核酸结合；在pH大于6.3时，壳聚糖与核酸分离，核酸被洗脱下来。
利用该改性硅藻土对核酸扩增反应没有抑制作用且可以富集大量核酸，提高了核酸扩增反应灵敏度。将该改性硅藻土应用于扩增扩增反应，可集核酸提取、扩增、检测于一体，结合快速扩增手段，整个反应可在40min内完成。
另外，本申请提供的核酸提取方法单次使用成本低于0.3元，相比于磁珠试剂盒提取，反应快速，具有更高的灵敏度，能够实现单拷贝靶标的检测。
附图说明
图1为本申请实施例1提供的改性硅藻土的红外图谱，谱线1对应硅藻土样本，谱线2对应改性硅藻土样本。
图2为本申请实施例1、对比例2～4分别提供的改性硅藻土对核酸吸附后洗脱液的琼脂糖凝胶电泳图；其中，泳道M为15000bp Marker；泳道1：提取前的核酸样本；泳道2：实施例1提供的改性硅藻土提取样本的洗脱液；泳道3：对比例2提供的改性硅藻土提取样本的洗脱液；泳道4：对比例3提供的改性硅藻土提取样本的洗脱液；泳道5：对比例4提供的改性硅藻土提取样本的洗脱液。
图3为本申请实施例1～4和对比例1分别提供的改性硅藻土对核酸吸附后洗脱液的琼脂糖凝胶电泳图；其中，泳道M为15000bp Marker；泳道1：提取前的核酸样本；泳道2：实施例3提供的改性硅藻土提取样本的洗脱液；泳道3：对比例1提供的硅藻土提取样本的洗脱液；泳道4：实施例1提供的改性硅藻土提取样本的洗脱液；泳道5：实施例2提供的改性硅藻土提取样本的洗脱液；泳道6：实施例4提供的改性硅藻土提取样本的洗脱液。
图4为本申请实施例1提供的改性硅藻土在不同pH MES缓冲液中对核酸的提取效率结果图。
图5为本申请实施例1提供的改性硅藻土在不同pH MES缓冲液中对核酸提取的洗脱液琼脂糖凝胶电泳图；其中，泳道M为15000bp Marker；泳道1：提取前的核酸样本；泳道2：pH＝4MES缓冲条件下提取样本后的洗脱液；泳道3：pH＝4.5MES缓冲条件下提取样本后的洗脱液；泳道4：pH＝5MES缓冲条件下提取样本后的洗脱液；泳道5：pH＝5.5MES缓冲条件下提取样本后的洗脱液；泳道6：pH＝6MES缓冲条件下提取样本后的洗脱液；泳道7：pH＝6.5MES缓冲条件下提取样本后的洗脱液。
图6为本申请实施例1提供的改性硅藻土对核酸样本富集后的PCR扩增曲线；图中，－■－代表改性硅藻土提取并富集纯核酸的扩增曲线；－●－代表20μL反应体系中含有4μL纯核酸靶标直接扩增的曲线；－▲－代表20μL反应体系中不含靶标时的扩增曲线。
图7为本申请实施例提供的三种不同方法提取核酸样本富集后的PCR扩增曲线图；图中，－■－代表改性硅藻土提取并富集纯核酸的扩增曲线；－▲－代表磁珠法提取核酸的扩增曲线；－●－代表热裂解法提取核酸的扩增曲线；－*－代表20μL反应体系中不含靶标时的扩增曲线。
图8为本申请实施例1提供的改性硅藻土应用于沙门氏菌核酸检测结果图；图8A为随样本沙门氏菌浓度的变化的PCR反应荧光曲线图；
图8B为沙门氏菌浓度对数与PCR扩增反应Ct值关系图；图8C为不同沙门氏菌浓度样本的电泳图；图8D为不同沙门氏菌浓度样本的荧光变化图(添加改性硅藻土和未添加改性硅藻土)；图8E为为不同沙门氏菌浓度样本对数与扩增反应Ct值关系图(添加改性硅藻土和未添加改性硅藻土)；样本1～6的沙门氏菌浓度分别为：1.0×105CFU/mL～1.0×100CFU/mL，7：阴性对照。
图9为本申请实施例1提供的改性硅藻土应用于沙门氏菌人工污染样本的核酸检测结果；图9A为来自牡蛎人工污染样本的浓度与Ct值关系图；图9B为来自鸡人工污染样本的浓度与Ct值关系图；图9C为来自羔羊人工污染样本的浓度与Ct值关系图；图9D为来自牡蛎人工污染样本的扩增反应产物的荧光变化图；图9E为来自鸡人工污染样本的扩增反应产物的荧光变化图；图9F为来自羔羊人工污染样本的扩增反应产物的荧光变化图。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验试剂及仪器，如无特殊说明，均可由常规商业途径获得。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
一、改性硅藻土的制备
具体的实施例1，其改性硅藻土的制备实施过程如下：
(1)称取适量硅藻土(购自上海生工公司)用食人鱼溶液(体积比为2:1，H2SO4/H2O2)在70℃条件下洗涤10min(在强氧化作用下，硅藻土表面的硅氧键暴露，更易于结合壳聚糖。)离心去上清，用去离子水洗涤，离心取沉淀干燥。
(2)向烘干的硅藻土中加入混合均匀的(3-乙氧基丙基)甲基二乙氧基硅烷(Sigma)、壳聚糖(分子量为1800，购自云州生物技术有限公司)溶液。并且使得反应体系中(3-乙氧基丙基)甲基二乙氧基硅烷的初始浓度为1％，壳聚糖的初始浓度为10mg/mL，乙酸的初始浓度为50mM，将体系置于摇床中过夜。
(3)将上述体系用50mM乙酸溶液洗涤后用去离子水洗涤3次，取沉淀干燥，即可得到改性硅藻土。
对上述过程得到的改性硅藻土进行红外光谱分析，结果如图1所示。图1中，谱线1对应硅藻土，谱线2对应改性硅藻土，可见谱线2相对谱线1于1635cm-1处多出了明显的吸收峰，由此说明改性硅藻土成功连接了壳聚糖。
可选的实施例2中，其改性硅藻土的制备过程与上述实施例大致相同，不同之处在于，加入的反应体系中的壳聚糖的终浓度为5mg/mL。
可选的实施例3中，其改性硅藻土的制备过程与上述实施例大致相同，不同之处在于，加入的反应体系中的壳聚糖的终浓度为15mg/mL。
可选的实施例4中，其改性硅藻土的制备过程与上述实施例大致相同，不同之处在于，加入的反应体系中的壳聚糖的终浓度为30mg/mL。
具体的对比例1中，其改性硅藻土的制备过程与上述实施例大致相同，不同之处在于，加入的反应体系中的壳聚糖的终浓度为50mg/mL。
具体的对比例2中，其改性硅藻土的制备过程与上述实施例大致相同，不同之处在于，使用的壳聚糖的分子量为20000。
具体的对比例3中，其改性硅藻土的制备过程与上述实施例大致相同，不同之处在于，使用的壳聚糖的分子量为60000。
具体的对比例4中，其改性硅藻土的制备过程与上述实施例大致相同，不同之处在于，使用的壳聚糖的分子量为80000。
二、不同改性硅藻土的核酸提取效果
本实验采用上述实施例1～4和对比例1～4提供的改性硅藻土对经过试剂盒初步提取的样本进行核酸再提取，具体步骤如下：
核酸初提取：采用TIANamp Bacteria DNAkit细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)提取大肠杆菌基因组DNA。
核酸再提取：取50μL、50ng/μL大肠杆菌基因组DNA)与500μL 50mM的MES溶液混合，用0.1M盐酸溶液调节反应体系pH值为5，分别加入0.02g的实施例1～4和对比例1～4提供的改性硅藻土(作为不同组别)，涡旋振荡10s后，利用硅藻土的自沉降能力，待溶液完全沉淀后去除上清液，向离心管中分别加入50μL Tris缓冲溶液洗脱核酸，待溶液完全沉淀，上清液即为提取的核酸。使用超微量分光光度计测量洗脱液DNA浓度，并计算出改性硅藻土对核酸的提取效率。其中，提取效率用下式进行计算得到。
Figure BDA0003372982490000071
表3
实施方式 提取效率(％)
实施例1 61.34％
实施例2 60％
实施例3 48.66％
实施例4 52％
对比例1 34％
对比例2 20％
对比例3 3.34％
对比例4 6.66％
由图2和表3可知，使用浓度为5～30mg/mL以及分子量为1800的壳聚糖改性的硅藻土提取核酸效果较佳，由表3可知，各实施例和对比例对核酸的提取效果。
三、核酸提取体系实验
采用不同pH的MES结合缓冲液体系下，使用实施例1提供的改性硅藻土进行核酸提取，具体步骤如下：
取50μL试剂盒提取的浓度为50ng/μL大肠杆菌基因组DNA(与上述实施例相同)与500μL 50mM的MES溶液混匀后，将其分为6组，分别调节pH值至4、4.5、5、5.5、6、6.5；每组均加入0.02g用实施例1提供的改性硅藻土，涡旋振荡10s后，利用硅藻土的自沉降能力，待溶液完全沉淀后去除上清液，向离心管中分别加入50μL Tris缓冲溶液洗脱核酸，待溶液完全沉淀，上清液即为提取的核酸。使用超微量分光光度计测量洗脱液DNA浓度，并计算出壳聚糖修饰的硅藻土对核酸的提取效率(参照上述实验)，结果如图4所示；对洗脱液进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图5所示。
从图4、5中可以看出：结合缓冲液MES与样本的混合溶液pH＝5.5时，改性硅藻土对核酸提取效果最好，该方法洗脱后对核酸的提取效率可以达到70％。由此说明，本申请实施例提供的改性硅藻土在pH值较低的情况下，提取核酸较多，这是由于壳聚糖等电点为6.3，在缓冲液体系低于其等电点时，但又不能多低的pH值缓冲体系下，该改性硅藻土表面带正电而更易于与带负电的核酸结合，从而实现提取核酸的目的。
四、改性硅藻土应用于核酸扩增
为此，本申请实施例提供的改性硅藻土还能直接应用于与核酸扩增反应过程中，使用该改性硅藻土能够利用其对核酸的富集作用，缩短扩增时间，提供扩增效率，为试剂的核酸PCR检测效率提供帮助。
1、改性硅藻土富集核酸可行性验证实验
本实验通过将本发明提出的方法提取纯核酸与提取前对比进行扩增反应，研究本提取方法的富集效果。具体步骤如下：
取200μL购自青岛简码基因科技有限公司的SARS-CoV-2Nucleic Acid DetectionKit(Rapid PCR Flurescence Method)配套的阳性质控靶标，加入10μL 50mM MES缓冲液，调至pH＝5.5，加入2.25mg改性硅藻土(实施例1制得)，将溶液涡旋振荡混匀30s，简短离心1min，待沉淀完全吸去上清液，将扩增buffer直接加入含有沉淀的离心管中作为待测样本。
以直接加入4μL阳性质控靶标为阳性对照，以未加入靶标核酸(NTC)作为阴性对照，利用购自青岛简码的ND2600荧光定量PCR仪进行检测，观察起峰早晚判断硅藻土富集效果。
从图6中可以看出：壳聚糖-硅藻土具有富集核酸的能力，通过该方法提取的核酸进行扩增反应，起峰时间比原核酸早3个Ct。
2、采用本申请提供的改性硅藻土提取核酸方法与其他核酸方法对比试验
通过不同方法对咽拭子样本进行提取，以核酸扩增反应表征。具体步骤如下：
取一咽拭子(实验室自取)，将拭子置于1mL生理盐水中，涡旋振荡混匀待用。
1)沉淀法提取：取200μL上述咽拭子样本，加入20μL购自简码的RS5裂解液，10μL50mM MES缓冲液，调至pH＝5.5，加入2.25mg改性硅藻土(实施例1制得)，将溶液涡旋振荡混匀2min，简短离心1min，待沉淀完全吸去上清液，将扩增buffer直接加入含有沉淀的离心管中作为待测样本。
2)磁珠法提取：取200μL上述样本，采用TIANGEN Magnetic Viral DNA/RNA Kit提取，取4μL直接用于扩增。
3)热裂解提取：取200μL上述样本，95℃热裂解5min，取4μL直接用于扩增。
采用购自青岛简码基因科技有限公司的SARS-CoV-2Nucleic Acid DetectionKit(Rapid PCR Flurescence Method)检测内参基因，ND2600光定量PCR仪进行检测，其扩增曲线如图7所示。
从图7中可以看出：采用本申请实施例提供的改性硅藻土提取的样本核酸比市售试剂盒提取的样本核酸早起峰，说明该改性硅藻土提取方法既能提高反应灵敏度，同时无需复杂的前处理步骤，无需大型仪器，为现场检测提供了理论依据。
五、改性硅藻土应用于核酸检测
本申请进一步利用制备的改性硅藻土进行沙门氏菌核酸检测。具体过程如下：
取50μL样品溶液(肠炎沙门氏菌，货号B81103，明舟生物)加入含有50μLMES缓冲液(pH＝5)和2.25mg改性硅藻土(实施例1制得)的试管中，与移液管轻轻混合，95℃孵育3min。在此期间，由于DE具有其自沉淀能力而固定在管的底部。去除上清液后，20μL ASEA混合物(新英格兰生物实验室(MA，US))吸入含有核酸结合DE沉淀的试管中。然后将试管置于PCR系统中，在12min内进行ASEA扩增。
为评价单管ASEA对沙门氏菌的敏感性，参照上述方法，将样品溶液稀释成不同浓度的沙门氏菌菌悬液，然后进行上述实验。
结果如图8A，随着样本沙门氏菌浓度从1.0×105CFU/mL到1CFU/mL，信号刚出现的起峰时间不断推移，二者之间成正比关系。如图8B为扩增反应的Ct值随着沙门氏菌培养液浓度负对数(lg)的增加呈线性增加，回归方程为Ct＝13.299(-lgC)-134.35，R2＝0.9796。如图8C为上述扩增反应产物的凝胶电泳士，不同沙门氏菌浓度样本对应的泳道均出现了一中39bp条带，并且其深浅与样本沙门氏菌浓度变化趋势相反。
如图8D、8E所示，分别采用本申请实施例提供的改性硅藻土对EP管中的沙门氏菌进行富集，结果表明，相对并未添加改性硅藻土进行富集的EP管，ASEA反应后产物的荧光值变化更为明显，其扩增反应的Ct值变化趋势亦更为明显。并且，采用本申请提供的改性硅藻土对样本核酸进行富集后，其检测限低至1CFU/mL的沙门氏菌；而没有采用改性硅藻土进行单管富集的传统ASEA方法只能检测到100CFU/mL的沙门氏菌
由此说明，本申请实施例提供的改性硅藻土在样本核酸检测过程中，具有富集核酸作用，实现更高的检测灵敏度。
本申请进行一步对从新鲜的牡蛎、鸡肉和羊肉样品均从当地市场购买的人工污染样本，根据中国国家标准(GB4789.4-2016)，有3份样本检测到沙门氏菌阴性。
3个人工污染样品(沙门氏菌阳性)：首先将25g样品加入225mL缓冲肽酯水(10.0g/L肽酯、5.0g/L氯化钠、9.0g/L十二水磷酸氢二钠、1.5g/L磷酸二氢钾)，均质2min。对所有人工污染样品分别装入ep单管中进行ASEA检测。
如图9中，随着添加样品中沙门氏菌含量的降低，各样品Ct值随间距的增加而增加，并且Ct值与沙门氏菌浓度对数呈高度线性关系。由此说明，本申请实施例提供的硅藻土能够应用于不同种类病原微生物的检测中，能够提高检测的灵敏度。
以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种用于提取核酸的改性硅藻土，所述改性硅藻土具有硅藻土以及偶联在所述硅藻土表面的壳聚糖的结构。
2.根据权利要求1所述的改性硅藻土，其特征在于，所述壳聚糖分子量为1800～80000。
3.一种核酸提取方法，包括由向待提取样本中依次加入裂解液和如权利要求1或2所述的改性硅藻土的步骤；其中，所述裂解液用于从细胞、细菌、组织或有机体中释放出游离核酸，以便被所述改性硅藻土吸附提取。
4.根据权利要求3所述的核酸提取方法，其特征在于，所述改性硅藻土吸附目的核酸的溶液pH值为4～6。
5.一种核酸检测方法，包括以下步骤：
获得如权利要求1或2所述的改性硅藻土；
向吸附核酸后的改性硅藻土中加入用于核酸扩增的反应体系；
扩增反应获得扩增产物；以及
检测所述扩增产物。
6.一种核酸提取试剂盒，包含如权利要求1或2所述的改性硅藻土。
7.一种核酸扩增试剂盒，包含如权利要求1或2所述的改性硅藻土。
8.权利要求1或2所述的硅藻土的制备方法，包括将硅藻土与壳聚糖通过(3-乙氧基丙基)甲基二乙氧基硅烷进行偶联反应得到；其中，所述壳聚糖的分子量为1800～80000，所述反应体系中壳聚糖的初始浓度为5～30mg/mL。
9.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述反应体系中，(3-乙氧基丙基)甲基二乙氧基硅烷的初始浓度为0.1～10％，乙酸的初始浓度为0.01～0.5mol/L。
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