JP2023503637A - マイクロジストロフィン遺伝子治療コンストラクト及びその使用 - Google Patents

マイクロジストロフィン遺伝子治療コンストラクト及びその使用 Download PDF

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Abstract

遺伝子治療に使用するためのマイクロジストロフィンタンパク質をコードする新規遺伝子コンストラクトに部分的に基づく発明が提供される。マイクロジストロフィン遺伝子コンストラクト及び発現カセットは、筋肉細胞及び／またはＣＮＳ細胞においてウイルスベクターによって発現された場合に、対象に対する有効性、効力及び安全性に関して改善された治療となるように設計された。【選択図】図１Ａ

Description

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含有し、その全体は、参照により本明細書に援用される。当該ＡＳＣＩＩのコピーは、２０２０年１１月２５日に作成され、名称は、３８０１３＿０００９Ｐ１＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔであり、サイズは、２４９，４１７バイトである。
本発明は、新規マイクロジストロフィン及び新規マイクロジストロフィンをコードする組み換えＡＡＶベクターなどの遺伝子治療用ベクター、ならびにその組成物及び使用、ならびにそれを使用した治療方法に関する。
ジストロフィノパチーと呼ばれる一群の神経筋疾患は、ＤＭＤ遺伝子の変異によって引き起こされる。各ジストロフィノパチーは、明確に異なる表現型を有し、全ての患者が筋肉低下を患い、最終的には様々な重症度の心筋症を発症する。デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、深刻なＸ連鎖性の進行性神経筋疾患であり、出生男性の３，６００～９，２００名に約１人が罹患している。この障害は、ジストロフィンタンパク質の発現を無効にするジストロフィン遺伝子におけるフレームシフト変異によって引き起こされる。ジストロフィンタンパク質が欠乏することで、骨格筋、最終的には心筋及び呼吸筋（例えば、肋間筋及び横隔膜）が変性し、早期死亡となる。進行性の筋肉低下及び筋萎縮が小児期に始まる。罹患者は、呼吸困難、呼吸器感染、及び嚥下障害などを経験する。ほぼ全てのＤＭＤ患者が心筋症を発症する。心臓病変によって悪化した肺炎が最も多い死因であり、３０年以内に発症することが多い。
ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）は、ＤＭＤよりも症状は軽いが、それでも早期死亡に至る。ＤＭＤと比較して、ＢＭＤは、遅発性の骨格筋低下を特徴とする。ＤＭＤ患者は、１３歳までに車椅子に依存するようになるが、ＢＭＤ患者は、１６歳以降に歩けなくなり、車椅子が必要となる。ＢＭＤ患者はまた、ＤＭＤ患者とは異なり、頸部屈筋力の維持も示す。骨格筋病変は軽度であるが、ＤＭＤに関連する拡張型心筋症（ＤＣＭ）による心不全がＢＭＤの死亡率の一般的な原因で、最も一般的な死因であり、平均して４０代半ばで生じている。
ジストロフィンは、ＤＭＤ遺伝子によってコードされる細胞質タンパク質であり、細胞骨格アクチンフィラメントと膜タンパク質を連結する機能を持つ。通常、ジストロフィンタンパク質は、主に骨格筋及び心筋に存在し、脳でも少量発現しているが、収縮装置のアクチンを各筋繊維を囲む結合組織層に連結することによって、筋繊維の収縮時の緩衝装置として機能している。筋肉では、ジストロフィンは、筋細胞膜の細胞質側の面に局在している。
ＤＭＤ遺伝子は、既知のなかで最も大きいヒト遺伝子である。ＤＭＤまたはＢＭＤを引き起こす最も一般的な変異は、１つ以上のエクソンの大きな欠失変異（６０～７０％）であるが、重複変異（５～１０％）、及び単一ヌクレオチドバリアント（小さな欠失または挿入、一塩基変化、及びスプライス部位の変化を含み、ＤＭＤの男性では病原性バリアントのおよそ２５～３５％、ＢＭＤの男性では約１０～２０％を占める）もまた病原性ジストロフィンバリアントを引き起こす可能性がある。ＤＭＤでは、変異がフレームシフトにつながることが多く、終止コドンが早く生じたり、短くて機能しないまたは不安定なタンパク質が生じる。ナンセンス点変異もまた、終止コドンが早く生じることで、同じ結果をもたらすことがある。ＤＭＤを引き起こす変異は、いかなるエクソンにも影響し得るが、エクソン２～２０及び４５～５５が大きな欠失及び重複変異がよく生じるホットスポットである。インフレーム欠失では、患者は、部分的に機能する短いジストロフィンを発現し、重症度の低いベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）となる。
全長ジストロフィンは、大きな（４２７ｋＤａ）タンパク質であり、その機能に寄与する多数のサブドメインを含む。これらのサブドメインには、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって順に、Ｎ末端アクチン結合ドメイン、中央にあるいわゆる「ロッド」ドメイン、システインリッチドメイン、そして最後にカルボキシ末端ドメインまたは領域が含まれる。ロッドドメインは、次の順序：第１のヒンジドメイン（Ｈ１）、３つのスペクトリン様リピート（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３）、第２のヒンジドメイン（Ｈ２）、１６以上のスペクトリン様リピート（Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９）、第３のヒンジドメイン（Ｈ３）、５以上のスペクトリン様リピート（Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４）、及び４番目のヒンジドメイン（Ｈ４）（ＷＷドメインを含む）である、４つのプロリンリッチヒンジドメイン（Ｈと略される）、及び２４スペクトリン様リピート（Ｒと略される）を含む。ロッドドメインの後には、システインリッチドメイン、及びＣＯＯＨ（Ｃ）末端（ＣＴ）ドメインがある。
様々な稀少疾患を治療する可能性のあるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性遺伝子治療の使用が進歩するにつれ、ＡＡＶをＤＭＤ、ＢＭＤ及び重症度の低いジストロフィノパチーの治療に使用できることに期待及び関心が寄せられている。ＡＡＶベクターのペイロードサイズには限度があるので、全長タンパク質の少なくとも一部の機能を維持しながら、必須ではないサブドメインを除去した小型のジストロフィンであるマイクロまたはミニジストロフィンを作製することに注目が集まっている。ＤＭＤの動物モデルであるｍｄｘマウスにおけるＡＡＶ媒介性ミニジストロフィン遺伝子治療は、筋肉での効率的な発現及び筋機能の改善を示すことが報告されている（例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ． Ｒｅｓ．２７：４２１（２００９）参照）。
したがって、当該技術分野において、ＤＭＤまたはＢＭＤを有する対象の形質導入細胞において有効なレベルで発現され、好ましくは、治療用タンパク質に対する免疫応答を最小限に抑えることができる、マイクロまたはミニジストロフィンをコードするＡＡＶベクターが必要とされている。
遺伝子治療に使用するためのマイクロジストロフィンタンパク質をコードする新規遺伝子コンストラクトに部分的に基づく発明が提供される。マイクロジストロフィン遺伝子コンストラクト及び発現カセットは、筋肉細胞及び／またはＣＮＳ細胞においてウイルスベクターによって発現された場合に、対象に対する有効性、効力及び安全性に関して改善された治療となるように設計された。ｉｎ ｖｉｖｏ治療モデルに基づいて、本開示のマイクロジストロフィン遺伝子治療は、握力、最大筋力及び比筋力の測定値の改善及び／または臓器及び筋肉重量の減少を示した。したがって、改善された遺伝子治療ベクター、例えば、マイクロジストロフィンタンパク質の遺伝子治療発現のためのこれらのコンストラクトを含む組み換えＡＡＶ８またはＡＡＶ９ベクターなどの組み換えＡＡＶベクター、及び治療法におけるこれらの遺伝子治療ベクターの使用方法、及び本明細書に記載されるようなこれらの遺伝子治療ベクターの作製方法が提供される。
Ｎ末端アクチン結合ドメインならびにヒンジ、ロッド及びスペクトリンドメインのサブセット、続いて、システインリッチドメイン、また、任意選択により、Ｃ末端ドメインの全てまたは一部、例えば、ヘリックス１含有部分を含む、マイクロジストロフィンタンパク質及び同タンパク質をコードする核酸コンストラクトが提供される。特定の実施形態において、マイクロジストロフィンは、Ｃ末端ドメインの全てまたは一部、またはそのα１－シントロフィン及び／またはα－ジストロブレビン結合部分を有する。Ｃ末端ドメイン、またはそのα１－シントロフィン及び／またはα－ジストロブレビン結合部分を有するマイクロジストロフィンは、改善された心臓保護活性を有し、及び／または低下した心筋機能の改善またはその進行の減少／遅延をもたらし得る。
例示的なマイクロジストロフィンをコードするコンストラクトは、図１Ａ及び図２２に示される。本明細書に記載される実施形態は、アミノ末端からカルボキシ末端へ：
ＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ、
ＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴ
ＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ１６－Ｒ１７－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴ、または
ＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ１６－Ｒ１７－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲを有するマイクロジストロフィンタンパク質であり、
ここで、ＡＢＤは、ジストロフィンのアクチン結合ドメインであり、Ｈ１は、ジストロフィンのヒンジ１領域であり、Ｒ１は、ジストロフィンのスペクトリン１領域であり、Ｒ２は、ジストロフィンのスペクトリン２領域であり、Ｒ３は、ジストロフィンのスペクトリン３領域であり、Ｈ３は、ジストロフィンのヒンジ３領域であり、Ｒ１６は、ジストロフィンのスペクトリン１６領域であり、Ｒ１７は、ジストロフィンのスペクトリン１７領域であり、Ｒ２４は、ジストロフィンのスペクトリン２４領域であり、ＣＲは、ジストロフィンのシステインリッチ領域またはその少なくともβ－ジストログリカンに結合する部分であり、ＣＴは、ジストロフィンのＣ末端領域の少なくとも一部であって、その部分は、α１－シントロフィン結合部位及び／またはα－ジストロブレビン結合部位を含む。ある特定の実施形態において、ＣＴドメインは、配列番号３５、７０、または８３のアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態において、Ｈ３ドメインは、配列番号１１の全配列である。ＣＲドメインは、全長ＣＲドメインまたは短縮型ＣＲドメイン、特にβ－ジストログリカンに結合する短縮型ＣＲドメインであり得る。ある特定の実施形態において、ＣＲドメインは、配列番号１５または９０のアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態において、内因性リンカー配列は、ドメインを連結し、例えば、内因性ヒトジストロフィンタンパク質のＲ２３とＲ２４の間のリンカーの全てまたは３アミノ酸部分は、Ｈ３ドメインとＲ２４ドメインを連結する。あるいは、いくつかの実施形態において、Ｈ３は、ジストロフィンのヒンジ２領域（Ｈ２）で置換することができる。
本明細書で提供されるマイクロジストロフィンは、（１）アクチン、β－ジストログリカン、α１－シントロフィン、α－ジストロブレビン、及びｎＮＯＳ（α１－シントロフィンを介して間接的に結合するｎＮＯＳを含む）のうちの１つ、それらの組み合わせ、もしくはその全てに結合すること；（２）動物モデル（例えば、本明細書に記載されるｍｄｘマウスモデル）もしくはヒト対象において、筋機能の改善を促進すること、もしくは筋機能の減少の進行を遅らせること；及び／または（３）動物モデルもしくはヒト患者において、心臓保護機能を有すること、もしくは心筋機能の改善もしくは心機能障害の緩和を促進すること、もしくは心臓機能の低下の進行を遅らせることなどのジストロフィン機能を示す（図１３参照）。
特定の実施形態において、マイクロジストロフィンは、配列番号１、２、７９、９１、９２、または９３のアミノ酸配列を有する。
本明細書で提供されるのは、遺伝子治療に使用するための導入遺伝子または遺伝子カセットを含むマイクロジストロフィンをコードする核酸である。実施形態において、マイクロジストロフィンは、配列番号２０、２１、８１、１０１、１０２、もしくは１０３のヌクレオチド配列、または配列番号１、２、７９、９１、９２、もしくは９３のアミノ酸配列をコードする任意のヌクレオチド配列によってコードされる。例示的なコンストラクトは、図１Ａ及び図２２に示される。ある特定の実施形態において、コンストラクトは、マイクロジストロフィンコード配列の５’側にイントロンを含む。いくつかの実施形態において、イントロンは、１００ヌクレオチド長未満である。特定の実施形態において、コンストラクトは、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）４（ＶＨ４）イントロンを含み、イントロンは、マイクロジストロフィンコード配列の５’側に位置する。ＶＨ４イントロンの存在は、ＶＨ４イントロンを持たない核酸コンストラクトからの発現と比べて、細胞におけるマイクロジストロフィンの発現の改善をもたらし得る。
本明細書で提供される導入遺伝子は、筋肉細胞（骨格筋、心筋、及び／または平滑筋を含む）及び／またはＣＮＳ細胞などの適切な細胞種において、マイクロジストロフィンの発現を駆動するプロモーターを含有する。組み換えＡＡＶベクター療法などの遺伝子治療において使用される導入遺伝子のサイズを小さくすることは、組み換えＡＡＶベクターの有効性及び効率性を改善し得る。本明細書で提供されるのは、プロモーターが筋特異的プロモーター、ＣＮＳ特異的プロモーター、またはその両方である、導入遺伝子である。ある特定の実施形態において、プロモーターは、長さが３５０ｋｂ未満の筋特異的プロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ＳＰｃ５－１２プロモーター（配列番号３９）である。本明細書で提供されるのは、導入遺伝子であって、そのプロモーターが、マイクロジストロフィンの発現を誘導し、本明細書でより完全に記載されるＳＰｃ５－１２プロモーターよりも短い切断型ＳＰｃ５－１２プロモーター（配列番号４０）である、導入遺伝子である。ある特定の実施形態において、プロモーターは、ＣＮＳ特異的プロモーターである。
発現増加のためにマイクロジストロフィンコード配列がコドン最適化されている導入遺伝子または遺伝子カセットも提供される。付加的にまたは代替的に、マイクロジストロフィンコード配列及び／または導入遺伝子配列は、免疫原性を減少させるために、ＣｐＧが除去され得る。いくつかの実施形態において、マイクロジストロフィン導入遺伝子は、ふたつ（２）未満のＣｐＧアイランド、またはひとつ（１）のＣｐＧアイランド（特に、本明細書で定義されるもの）を有し、ある特定の実施形態においてはＣｐＧアイランドを有しない。２未満、１または０のＣｐＧアイランドを有する導入遺伝子は、抗薬物抗体価によって測定した場合、２を超えるＣｐＧアイランドを有するマイクロジストロフィンコンストラクトと比較して、免疫原性が低下した。
本明細書で提供されるのは、例示的な遺伝子カセットまたは導入遺伝子をコードする配列番号５３、５４、５５、５６、８２、１０４、１０５、または１０６のヌクレオチド配列を含む核酸である。
本明細書に記載される導入遺伝子を送達するための組み換えベクターは、非複製組み換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）を含み、ＡＡＶ８もしくはＡＡＶ９血清型であっても、または骨格筋及び心筋の両方を含む筋肉細胞及び／またはＣＮＳ細胞へのマイクロジストロフィンコード配列の送達に適切な任意の他の血清型であってもよく、マイクロジストロフィンを発現し、患者に追加の利益をもたらし、及び／または筋肉細胞に送達する。
また、薬学的に許容される賦形剤をともに含む、本明細書で提供されるマイクロジストロフィンをコードする組み換えベクターを含む医薬組成物、ならびにそれを必要とする対象に本明細書に記載される遺伝子治療ベクターを投与することによる、任意のジストロフィノパチー、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）及びベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、Ｘ連鎖性拡張型心筋症、及びＤＭＤまたはＢＭＤ女性キャリアのための治療方法も提供される。本明細書に記載される導入遺伝子または遺伝子カセットを含有するｒＡＡＶを投与することによる、マイクロジストロフィンが筋肉（骨格筋、心筋、及び／または平滑筋を含む）及び／またはＣＮＳに送達されるようにそれを必要とする対象に投与することによる、ジストロフィノパチー、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）及びベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、Ｘ連鎖性拡張型心筋症の治療、その症状の改善、または管理の方法が提供される。特定の実施形態において、ｒＡＡＶは、全身投与される。
また、ウイルスベクター、特にＡＡＶベースのウイルスベクターを製造する方法、及び同ベクターを生産する宿主細胞も提供される。特定の実施形態において、組み換えＡＡＶを生産する方法であって、宿主細胞を培養することであって、宿主細胞は、ＡＡＶ ＩＴＲによって挟まれたｃｉｓ発現カセットを含む人工ゲノムであって、ｃｉｓ発現カセットは、ヒト細胞における導入遺伝子の発現を制御する発現制御エレメントに作動可能に連結された治療用マイクロジストロフィンをコードする導入遺伝子を含む、人工ゲノム、ＡＡＶ ＩＴＲを欠くｔｒａｎｓ発現カセットであって、培養中の宿主細胞においてＡＡＶｒｅｐ及びカプシドタンパク質の発現を駆動し、トランスでｒｅｐ及びｃａｐタンパク質を供給する発現制御エレメントに作動可能に連結されたＡＡＶ ｒｅｐ及びカプシドタンパク質をコードする、ｔｒａｎｓ発現カセット、ＡＡＶカプシドタンパク質による人工ゲノムの複製及びパッケージングを可能にする十分なアデノウイルスヘルパー機能を含有する、培養することと、人工ゲノムがカプシドで内包された組み換えＡＡＶを細胞培養物から回収することとを含む、方法が提供される。
本発明は、マイクロジストロフィンベクターの構築及び作製ならびに有効性を示すｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏアッセイについて以下に記載される例により示される。
例示的な実施形態
１．マイクロジストロフィンタンパク質をコードする核酸配列を含む、核酸組成物であって、マイクロジストロフィンタンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端へ：ＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴに配置されているジストロフィンドメインを含むか、またはそれからなり、ここで、ＡＢＤは、ジストロフィンのアクチン結合ドメインであり、Ｈ１は、ジストロフィンのヒンジ１領域であり、Ｒ１は、ジストロフィンのスペクトリン１領域であり、Ｒ２は、ジストロフィンのスペクトリン２領域であり、Ｒ３は、ジストロフィンのスペクトリン３領域であり、Ｈ３は、ジストロフィンのヒンジ３領域であり、Ｒ２４は、ジストロフィンのスペクトリン２４領域であり、Ｈ４は、ジストロフィンのヒンジ４領域であり、ＣＲは、ジストロフィンのシステインリッチ領域またはそのβ－ジストログリカン結合部分であり、ＣＴは、ジストロフィンのＣ末端領域またはα１－シントロフィン結合部位もしくはジストロブレビン結合部位を含むＣ末端領域の部分である、核酸組成物。
２．（１）配列番号１もしくは９１のアミノ酸配列を有するマイクロジストロフィンタンパク質をコードする核酸配列、またはそれらに対して少なくとも９０％、９５％もしくは９８％同一である核酸配列、または治療上機能的なマイクロジストロフィンタンパク質をコードするそれらの逆相補鎖を含むか、あるいは、（２）配列番号２０もしくは１００の核酸配列、もしくはそれらに対して少なくとも９０％、９５％もしくは９８％同一である核酸配列、もしくはそれらの逆相補鎖を含むか、またはそれらからなり、核酸配列は、治療上機能的なマイクロジストロフィンタンパク質をコードする、実施形態１に記載の核酸組成物。
３．（１）配列番号７９のアミノ酸配列を有するマイクロジストロフィンタンパク質をコードする核酸配列、またはそれらに対して少なくとも９０％、９５％もしくは９８％同一である核酸配列、または治療上機能的なマイクロジストロフィンタンパク質をコードするそれらの逆相補鎖を含むか、あるいは、（２）配列番号８１の核酸配列、もしくはそれらに対して少なくとも９０％、９５％もしくは９８％同一である核酸配列、もしくはそれらの逆相補鎖を含むか、またはそれらからなり、核酸は、治療上機能的なマイクロジストロフィンタンパク質をコードする、実施形態１に記載の核酸組成物。
４．マイクロジストロフィンタンパク質をコードする核酸配列の５’末端に連結されたイントロン（Ｉ）を含む核酸配列を含む、核酸組成物であって、マイクロジストロフィンタンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端へ：ＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲに配置されているジストロフィンドメインを含むか、またはそれからなり、ここで、ＡＢＤは、ジストロフィンのアクチン結合ドメインであり、Ｈ１は、ジストロフィンのヒンジ１領域であり、Ｒ１は、ジストロフィンのスペクトリン１領域であり、Ｒ２は、ジストロフィンのスペクトリン２領域であり、Ｒ３は、ジストロフィンのスペクトリン３領域であり、Ｈ３は、ジストロフィンのヒンジ３領域であり、Ｒ２４は、ジストロフィンのスペクトリン２４領域であり、Ｈ４は、ジストロフィンのヒンジ４領域であり、ＣＲは、ジストロフィンのシステインリッチ領域である、核酸組成物。
５．（１）配列番号２のアミノ酸配列を有するマイクロジストロフィンタンパク質をコードする核酸配列、またはそれに対して少なくとも９０％、９５％もしくは９８％同一である核酸配列、またはそれらの逆相補鎖を含むか、あるいは、（２）配列番号２１の核酸配列、もしくはそれに対して少なくとも９０％、９５％もしくは９８％同一である核酸配列、もしくはそれらの逆相補鎖を含むか、またはそれらからなり、核酸は、治療上機能的なジストロフィンをコードする、実施形態４に記載の核酸組成物。
６．マイクロジストロフィンタンパク質をコードする核酸配列の５’末端に連結されたイントロン（Ｉ）を更に含む、実施形態１～３に記載の核酸組成物。
７．Ｉが、マイクロジストロフィンコード配列の５’側に位置する、ヒト免疫グロビン重鎖可変領域（ＶＨ）４イントロン（ＶＨ４）またはＳＶ４０イントロンまたはキメライントロンである、実施形態４～６のいずれかに記載の核酸組成物。
８．ＶＨ４イントロンをコードする核酸配列が、配列番号４１の核酸配列、もしくはそれに対して少なくとも９０％、９５％もしくは９８％同一である核酸配列、もしくはそれらの逆相補鎖を含むか、またはそれらからなり、ＶＨ４イントロン配列を欠く参照核酸と比べて、マイクロジストロフィン発現を増加させるか、キメライントロンをコードする核酸配列が、配列番号７５の核酸配列、もしくはそれに対して少なくとも９０％、９５％もしくは９８％同一である核酸配列、もしくはそれらの逆相補鎖を含むか、またはそれらからなり、キメライントロン配列を欠く参照核酸と比べて、マイクロジストロフィン発現を増加させるか、あるいは、ＳＶ４０イントロンをコードする核酸配列が、配列番号７６の核酸配列、もしくはそれに対して少なくとも９０％、９５％もしくは９８％同一である核酸配列、もしくはそれらの逆相補鎖を含むか、またはそれらからなり、キメライントロン配列を欠く参照核と比べて、マイクロジストロフィン発現を増加させる、実施形態７に記載の核酸組成物。
９．ＣＴドメインをコードする核酸配列が、配列番号３５の核酸配列、もしくはそれに対して少なくとも９０％、９５％もしくは９８％同一である核酸配列、もしくはそれらの逆相補鎖を含むか、またはそれらからなり、ＣＴドメイン配列を欠く参照マイクロジストロフィンと比べて、マイクロジストロフィンのα１－シントロフィン、β－シントロフィン、及び／またはジストロブレビンへの結合を増加させるか、ＣＴドメインをコードする核酸配列が、配列番号７０の核酸配列、もしくはそれに対して少なくとも９０％、９５％もしくは９８％同一である核酸配列、もしくはそれらの逆相補鎖を含むか、またはそれらからなり、ＣＴドメイン配列を欠く参照マイクロジストロフィンと比べて、マイクロジストロフィンのα１－シントロフィン、β－シントロフィン、及び／またはジストロブレビンへの結合を増加させるか、あるいは、最小ＣＴドメインをコードする核酸配列が、配列番号８０の核酸配列、またはそれに対して少なくとも９０％、９５％もしくは９８％同一である核酸配列、またはそれらの逆相補鎖からなり、ＣＴドメイン配列を欠く参照マイクロジストロフィンと比べて、マイクロジストロフィンのα１－シントロフィンへの結合を増加させる、実施形態１～３または６～８のいずれかに記載の核酸組成物。
１０．ＣＴドメインが、配列番号１６もしくは８３のアミノ酸配列を有するか、または配列番号８４のアミノ酸配列を含む、実施形態９に記載の核酸組成物。
１１．ＣＲドメインをコードする核酸配列が、配列番号３４もしくは６９の核酸配列、もしくはそれらに対して少なくとも９０％、９５％もしくは９８％同一である核酸配列、もしくはそれらの逆相補鎖を含むか、またはそれらからなり、ＣＲドメイン配列を欠く参照マイクロジストロフィンと比べて、マイクロジストロフィンのβ－ジストログリカンへの結合を増加させ、ＣＲドメインをコードする核酸配列が、配列番号１００もしくは１０９の核酸配列、もしくはそれらに対して少なくとも９０％、９５％もしくは９８％同一である核酸配列、もしくはそれらの逆相補鎖を含むか、またはそれらからなり、ＣＲドメイン配列を欠く参照マイクロジストロフィンと比べて、マイクロジストロフィンのβ－ジストログリカンへの結合を増加させる、先行実施形態のいずれかに記載の核酸組成物。
１２．ＣＲドメインが、配列番号１５または９０のアミノ酸配列を有する、実施形態１１に記載の核酸組成物。
１３．ＡＢＤをコードする核酸配列が、配列番号２２もしくは５７、または配列番号２２もしくは５７に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、Ｈ１をコードする核酸配列が、配列番号２４もしくは５９、または配列番号２４もしくは５９に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、Ｒ１をコードする核酸配列が、配列番号２６もしくは６１、または配列番号２６もしくは６１に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、Ｒ２をコードする核酸配列が、配列番号２７もしくは６２、または配列番号２７もしくは６２に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、Ｒ３をコードする核酸配列が、配列番号２９もしくは６４、または配列番号２９もしくは６４に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、Ｈ２をコードする核酸配列が、配列番号３８、または配列番号３８に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、Ｈ３をコードする核酸配列が、配列番号３０もしくは６５、または配列番号３０もしくは６５に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、Ｒ２４をコードする核酸配列が、配列番号３２もしくは６７、または配列番号３２もしくは６７に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、Ｈ４をコードする核酸配列が、配列番号３３もしくは６８、または配列番号３３もしくは６８に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、ＣＲをコードする核酸配列が、配列番号３４、６９、１００もしくは１０９、または配列番号３４、６９、１００もしくは１０９に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、ＣＴをコードする核酸配列が、存在する場合、配列番号３５、７０もしくは８０、または配列番号３５、７０もしくは８０に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、任意選択により、Ｉ核酸配列が、マイクロジストロフィンをコードする核酸配列の５’末端に連結された、配列番号４１の核酸配列、または配列番号４１に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列である、先行実施形態のいずれか１つに記載の核酸組成物。
１４．ＡＢＤをコードする核酸配列が配列番号２２もしくは５７からなり、Ｈ１をコードする核酸配列が配列番号２４もしくは５９からなり、Ｒ１をコードする核酸配列が配列番号２６もしくは６１からなり、Ｒ２をコードする核酸配列が配列番号２７もしくは６２からなり、Ｒ３をコードする核酸配列が配列番号２９もしくは６４からなり、Ｈ２をコードする核酸配列が配列番号３８からなり、Ｈ３をコードする核酸配列が配列番号３０もしくは６５からなり、Ｈ４をコードする核酸配列が配列番号３３もしくは６８からなり、Ｒ２４をコードする核酸配列が配列番号３２もしくは６７からなり、ＣＲをコードする核酸配列が配列番号３４、６９、１００もしくは１０９からなり、Ｉは、配列番号４１からなり、及び／またはＣＴをコードする核酸配列が配列番号３５、７０もしくは８０からなる、先行実施形態のいずれか１つに記載の核酸組成物。
１５．マイクロジストロフィンタンパク質が、アミノ末端からカルボキシ末端へ：ＡＢＤ－Ｌ１－Ｈ１－Ｌ２－Ｒ１－Ｒ２－Ｌ３－Ｒ３－Ｈ３－Ｌ４－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴもしくはＡＢＤ－Ｌ１－Ｈ１－Ｌ２－Ｒ１－Ｒ２－Ｌ３－Ｒ３－Ｈ３－Ｌ４－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲに配置されているジストロフィン配列を含むか、またはそれらからなり、ここで、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４は、リンカーである、先行実施形態のいずれか１つに記載の核酸組成物。
１６．Ｌ１をコードする核酸配列が配列番号２３もしくは５８を含むか、またはそれらからなり、Ｌ２が配列番号２５もしくは６０を含むか、またはそれらからなり、Ｌ３が配列番号２８もしくは６３を含むか、またはそれらからなり、Ｌ４が配列番号３１、３６、３７、６６、７１もしくは７２を含むか、またはそれらからなる、先行実施形態のいずれか１つに記載の核酸組成物。
１７．マイクロジストロフィンタンパク質をコードする核酸配列を含む、核酸組成物であって、マイクロジストロフィンタンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端へ：ＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ１６－Ｒ１７－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲに配置されているジストロフィンドメインを含むか、またはそれからなり、ここで、ＡＢＤは、ジストロフィンのアクチン結合ドメインであり、Ｈ１は、ジストロフィンのヒンジ１領域であり、Ｒ１は、ジストロフィンのスペクトリン１領域であり、Ｒ２は、ジストロフィンのスペクトリン２領域であり、Ｒ１６は、ジストロフィンのスペクトリン１６領域であり、Ｒ１７は、ジストロフィンのスペクトリン１７領域であり、Ｒ２４は、ジストロフィンのスペクトリン２４領域であり、Ｈ４は、ジストロフィンのヒンジ４領域であり、ＣＲは、ジストロフィンのシステインリッチ領域である、核酸組成物。
１８．（１）配列番号９３のアミノ酸配列を有するマイクロジストロフィンタンパク質をコードする核酸配列、またはそれに対して少なくとも９０％、９５％もしくは９８％同一である核酸配列、またはそれらの逆相補鎖を含むか、あるいは、（２）配列番号１０３の核酸配列、もしくはそれに対して少なくとも９０％、９５％もしくは９８％同一である核酸配列、もしくはそれらの逆相補鎖を含むか、またはそれらからなり、核酸は、治療上機能的なマイクロジストロフィンをコードする、実施形態１７に記載の核酸組成物。
１９．ＣＲドメインのＣ末端の終端にα１－シントロフィン結合部位及び／またはジストロブレビン結合部位を含むＣＴドメインをコードするヌクレオチド配列を更に含む、実施形態１７または１８に記載の核酸組成物。
２０．（１）配列番号９２のアミノ酸配列を有するマイクロジストロフィンタンパク質をコードする核酸配列、またはそれに対して少なくとも９０％、９５％もしくは９８％同一である核酸配列、またはそれらの逆相補鎖を含むか、あるいは、（２）配列番号１０２の核酸配列、もしくはそれに対して少なくとも９０％、９５％もしくは９８％同一である核酸配列、もしくはそれらの逆相補鎖を含むか、またはそれらからなり、核酸は、治療上機能的なマイクロジストロフィンをコードする、実施形態１９のいずれか１つに記載の核酸組成物。
２１．ＣＴドメインをコードする核酸配列が、配列番号３５の核酸配列、もしくはそれに対して少なくとも９０％、９５％もしくは９８％同一である核酸配列、もしくはそれらの逆相補鎖を含むか、またはそれらからなり、ＣＴドメイン配列を欠く参照マイクロジストロフィンと比べて、マイクロジストロフィンのα１－シントロフィン、β－シントロフィン、及び／またはジストロブレビンへの結合を増加させるか、ＣＴドメインをコードする核酸配列が、配列番号７０の核酸配列、もしくはそれに対して少なくとも９０％、９５％もしくは９８％同一である核酸配列、もしくはそれらの逆相補鎖を含むか、またはそれらからなり、ＣＴドメイン配列を欠く参照マイクロジストロフィンと比べて、マイクロジストロフィンのα１－シントロフィン、β－シントロフィン、及び／またはジストロブレビンへの結合を増加させるか、あるいは、最小ＣＴドメインをコードする核酸配列が、配列番号８０の核酸配列、またはそれに対して少なくとも９０％、９５％もしくは９８％同一である核酸配列、またはそれらの逆相補鎖からなり、ＣＴドメイン配列を欠く参照マイクロジストロフィンと比べて、マイクロジストロフィンのα１－シントロフィンへの結合を増加させる、実施形態１９または２０に記載の核酸組成物。
２２．ＡＢＤをコードする核酸配列が、配列番号２２もしくは５７、または配列番号２２もしくは５７に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、Ｈ１をコードする核酸配列が、配列番号２４もしくは５９、または配列番号２４もしくは５９に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、Ｒ１をコードする核酸配列が、配列番号２６もしくは６１、または配列番号２６もしくは６１に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、Ｒ２をコードする核酸配列が、配列番号２７もしくは６２、または配列番号２７もしくは６２に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、Ｒ１６をコードする核酸配列が、配列番号９４もしくは９８、または配列番号９４もしくは９８に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、Ｒ１７をコードする核酸配列が、配列番号９５もしくは９９、または配列番号９５もしくは９９に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、Ｒ２４をコードする核酸配列が、配列番号３２もしくは６７、または配列番号３２もしくは６７に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、Ｈ４をコードする核酸配列が、配列番号３３もしくは６８、または配列番号３３もしくは６８に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、ＣＲをコードする核酸配列が、配列番号３４、６９、１００もしくは１０９、または配列番号３４もしくは６９に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、ＣＴをコードする核酸配列が、配列番号３５、７０もしくは８０、または配列番号３５、７０もしくは８０に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、機能活性を有するマイクロジストロフィンをコードする、実施形態１７～２１のいずれかに記載の核酸組成物。
２３．ＡＢＤをコードする核酸配列が配列番号２２もしくは５７からなり、Ｈ１をコードする核酸配列が配列番号２４もしくは５９からなり、Ｒ１をコードする核酸配列が配列番号２６もしくは６１からなり、Ｒ２をコードする核酸配列が配列番号２７もしくは６２からなり、Ｒ１６をコードする核酸配列が配列番号９４もしくは９８からなり、Ｒ１７をコードする核酸配列が配列番号９５もしくは９９からなり、Ｈ４をコードする核酸配列が配列番号３３もしくは６８からなり、Ｒ２４が配列番号３２もしくは６７からなり、ＣＲをコードする核酸配列が配列番号３４、６９、１００もしくは１０９からなり、存在する場合、ＣＴをコードする核酸配列が配列番号３５、７０もしくは８０からなる、実施形態１７～２２のいずれか１つに記載の核酸組成物。
２４．マイクロジストロフィンタンパク質をコードする核酸配列の５’末端に連結されたイントロン（Ｉ）を更に含む、実施形態１７～２３に記載の核酸組成物。
２５．Ｉが、マイクロジストロフィンコード配列の５’側に位置する、ヒト免疫グロビン重鎖可変領域（ＶＨ）４イントロン（ＶＨ４）またはＳＶ４０イントロンまたはキメライントロンである、実施形態２４のいずれかに記載の核酸組成物。
２６．ＶＨ４イントロンをコードする核酸配列が、配列番号４１の核酸配列、もしくはそれに対して少なくとも９０％、９５％もしくは９８％同一である核酸配列、もしくはそれらの逆相補鎖を含むか、またはそれらからなり、ＶＨ４イントロン配列を欠く参照核酸と比べて、マイクロジストロフィン発現を増加させるか、キメライントロンをコードする核酸配列が、配列番号７５の核酸配列、もしくはそれに対して少なくとも９０％、９５％もしくは９８％同一である核酸配列、もしくはそれらの逆相補鎖を含むか、またはそれらからなり、キメライントロン配列を欠く参照核酸と比べて、マイクロジストロフィン発現を増加させるか、あるいは、ＳＶ４０イントロンをコードする核酸配列が、配列番号７６の核酸配列、もしくはそれに対して少なくとも９０％、９５％もしくは９８％同一である核酸配列、もしくはそれらの逆相補鎖を含むか、またはそれらからなり、キメライントロン配列を欠く参照核酸と比べて、マイクロジストロフィン発現を増加させる、実施形態２５に記載の核酸組成物。
２７．マイクロジストロフィンタンパク質が、アミノ末端からカルボキシ末端へ：ＡＢＤ－Ｌ１－Ｈ１－Ｌ２－Ｒ１－Ｒ２－Ｌ３－Ｒ１６－Ｌ４．１－Ｒ１７－Ｌ４．２－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴもしくはＡＢＤ－Ｌ１－Ｈ１－Ｌ２－Ｒ１－Ｒ２－Ｌ３－Ｒ１６－Ｌ４．１－Ｒ１７－Ｌ４．２－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲに配置されているジストロフィン配列を含むか、またはそれらからなり、ここで、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４．１及びＬ４．２は、リンカーである、実施形態１７～２６のいずれか１つに記載の核酸組成物。
２８．Ｌ１をコードする核酸配列が配列番号２３もしくは５８を含むか、またはそれらからなり、Ｌ２をコードする核酸配列が配列番号２５もしくは６０を含むか、またはそれらからなり、Ｌ３をコードする核酸配列が配列番号２８もしくは６３を含むか、またはそれらからなり、Ｌ４．１をコードする核酸配列が配列番号１０７もしくは１２５を含むか、またはそれらからなり、Ｌ４．２をコードする核酸配列が配列番号１０８もしくは１２６を含むか、またはそれらからなる、実施形態２７に記載の核酸組成物。
２９．核酸が、マイクロジストロフィンタンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結された、筋肉及び／またはＣＮＳ組織における発現を促進する転写調節エレメントを含む核酸ベクターである、先行実施形態のいずれか１つに記載の核酸組成物。
３０．転写調節エレメントが、筋特異的プロモーター、任意選択により、骨格筋、平滑筋、または／または心筋特異的プロモーターを含む、実施形態２９に記載の核酸組成物。
３１．プロモーターが、ＳＰｃ５－１２またはその転写活性部分である、実施形態２９または３０に記載の核酸組成物。
３２．プロモーターが、配列番号３９または４０の核酸配列からなる、実施形態３１に記載の核酸組成物。
３３．転写調節エレメントが、ＣＮＳ特異的プロモーターを含む、実施形態２９に記載の核酸組成物。
３４．プロモーターが、ＣＢ７プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＭＭＴプロモーター、ＥＦ－１アルファプロモーター（配列番号１１８）、ＵＢ６プロモーター、ニワトリベータ－アクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター（配列番号１１６）、ＲＰＥ６５プロモーター、オプシンプロモーター、ＴＢＧ（チロキシン結合グロブリン）プロモーター、ＡＰＯＡ２プロモーター、ＳＥＲＰＩＮＡ１（ｈＡＡＴ）プロモーター、ＭＩＲ１２２プロモーター、または低酸素誘導性もしくはラパマイシン誘導性プロモーターなどの誘導性プロモーターである、実施形態２９に記載の核酸組成物。
３５．筋特異的転写調節エレメントが、ＣＫ１プロモーター、ＣＫ４プロモーター、ＣＫ５プロモーター、ＣＫ６プロモーター、ＣＫ７プロモーター、ＣＫ８プロモーター（配列番号１１５）、ＭＣＫプロモーター（またはその切断型）（配列番号１２１）、デスミンプロモーター（配列番号１１９）、ＭＨＣＫ７プロモーター（配列番号１２０）、ｅｎｈ３５８ＭＣＫプロモーター、ｄＭＣＫプロモーター、またはｔＭＣＫプロモーターのうちの１つである、実施形態２９または３０に記載の核酸組成物。
３６．ヌクレオチド配列が、マイクロジストロフィンをコードするヌクレオチド配列の３’側にポリアデニル化シグナルを含む、先行実施形態のいずれかに記載の核酸組成物。
３７．ポリアデニル化シグナルが、配列番号４２のヌクレオチド配列を有する、実施形態３６に記載の核酸組成物。
３８．核酸が、５’から３’へ、（ｉ）ＡＡＶ ＩＴＲ－転写調節エレメント－Ｎ末端からＣ末端へＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴに配置されているマイクロジストロフィンドメインをコードする核酸配列－ポリアデニル化配列－ＡＡＶ ＩＴＲ；（ｉｉ）ＡＡＶ ＩＴＲ－転写調節エレメント－Ｎ末端からＣ末端へＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲに配置されているマイクロジストロフィンドメインをコードする核酸配列－ポリアデニル化配列－ＡＡＶ ＩＴＲ；（ｉｉｉ）ＡＡＶ ＩＴＲ－転写調節エレメント－Ｎ末端からＣ末端へＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ１６－Ｒ１７－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴに配置されているマイクロジストロフィンドメインをコードする核酸配列－ポリアデニル化配列－ＡＡＶ ＩＴＲ；または（ｉｖ）ＡＡＶ ＩＴＲ－転写調節エレメント－Ｎ末端からＣ末端へＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ１６－Ｒ１７－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲに配置されているマイクロジストロフィンドメインをコードする核酸配列－ポリアデニル化配列－ＡＡＶ ＩＴＲを含む、ＡＡＶベクターヌクレオチド配列を含み、ＡＡＶ ＩＴＲは、任意選択により、ＡＡＶ２ ＩＴＲである、先行実施形態のいずれか１つに記載の核酸組成物。
３９．ヌクレオチド配列が、コドン最適化及び／またはＣｐＧ配列除去されている、先行実施形態のいずれかに記載の核酸組成物。
４０．２つ未満、もしくは１つのＣｐＧアイランドを有するか、またはＣｐＧアイランドを有しない、先行実施形態のいずれかに記載の核酸組成物。
４１．ヒト対象に投与した場合、抗薬物抗体価によって測定すると、０を超えるＣｐＧアイランドを有するマイクロジストロフィンコンストラクトと比較して、免疫原性の低下を示す、実施形態４０の核酸組成物。
４２．配列番号５３、５４、５５、５６、８２、１０４、１０５、または１０６の核酸配列を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の核酸組成物。
４３．核酸配列の５’及び３’末端にＡＡＶ ＩＴＲを含むＡＡＶベクターヌクレオチド配列を含み、ＡＡＶ ＩＴＲは、任意選択により、ＡＡＶ２ ＩＴＲである、先行実施形態のいずれか１つに記載の核酸組成物。
４４．５’ ＩＴＲは、配列番号７３のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなり、３’ ＩＴＲは、配列番号７４のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる、実施形態４３に記載の核酸組成物。
４５．先行実施形態のいずれか１つに記載の核酸組成物を含む発現カセットを含む、ｒＡＡＶ粒子。
４６．ＡＡＶタイプ１（ＡＡＶ１）、タイプ２（ＡＡＶ２）、タイプ３（ＡＡＶ３）、タイプ４（ＡＡＶ４）、タイプ５（ＡＡＶ５）、タイプ６（ＡＡＶ６）、タイプ７（ＡＡＶ７）、タイプ８（ＡＡＶ８）、タイプｒｈ８（ＡＡＶｒｈ８）、タイプ９（ＡＡＶ９）、タイプＰＨＰ．Ｂ（ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ）、タイプｈｕ３７（ＡＡＶ．ｈｕ３７）、タイプｈｕ３１（ＡＡＶ．ｈｕ３１）、タイプｈｕ３２（ＡＡＶ．ｈｕ３２）、タイプｒｈ１０（ＡＡＶｒｈ１０）、タイプｒｈ２０（ＡＡＶｒｈ２０）、タイプｒｈ３９（ＡＡＶｒｈ３９）、及びタイプｒｈ７４（ＡＡＶｒｈ７４）から選択される少なくとも１つのＡＡＶタイプに由来するカプシドタンパク質を有する、実施形態４５に記載のｒＡＡＶ粒子。
４７．当該カプシドタンパク質が、配列番号７７（ＡＡＶ８カプシド）に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するか、または配列番号７７のアミノ酸配列を有する、実施形態４５または４６に記載のｒＡＡＶ粒子。
４８．当該カプシドタンパク質が、配列番号７８（ＡＡＶ９カプシド）に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するか、または配列番号７８のアミノ酸配列を有する、実施形態４５または４６に記載のｒＡＡＶ粒子。
４９．治療上有効な量の実施形態４５～４８のいずれか１つに記載のｒＡＡＶ粒子と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
５０．導入遺伝子を細胞に送達する方法であって、当該細胞を実施形態４５～４９のいずれか１つに記載のｒＡＡＶ粒子と接触させることを含み、当該細胞は、ベクターと接触する、方法。
５１．ジストロフィノパチーを治療することを、それを必要とするヒト対象において行うための医薬組成物であって、治療上有効な量の実施形態４５～４９のいずれか１つに記載のｒＡＡＶ粒子を含み、任意選択により、当該ｒＡＡＶ粒子は、当該対象当該対象の循環、筋肉組織、またはＣＮＳへの投与のために製剤化される、医薬組成物。
５２．ジストロフィノパチーを治療することを、それを必要とするヒト対象において行う方法であって、
治療上有効な量の実施形態４５～４９のいずれか１つに記載のｒＡＡＶ粒子を含む医薬組成物を当該対象に投与し、それにより、当該対象の筋肉中に、マイクロジストロフィンタンパク質を放出するデポーを形成する、方法。
５３．ジストロフィノパチーの子孫への伝達を防ぐことを、それを必要とするヒト対象において行う方法であって、
治療上有効な量の実施形態４５～４９のいずれか１つに記載のｒＡＡＶ粒子を含む医薬組成物を当該対象に投与し、それにより、マイクロジストロフィンをコードする核酸が当該対象の生殖細胞に組み込まれる、方法。
５４．ジストロフィノパチーが、ＤＭＤ、ＢＭＤ、Ｘ連鎖性拡張型心筋症であるか、または対象が、女性のＤＭＤもしくはＢＭＤキャリアである、実施形態に５１～５３に記載の医薬組成物または方法。
５５．組成物が、ジストロフィノパチーの治療に有効な少なくとも第２の薬剤とともに投与される、実施形態５１～５４に記載の医薬組成物または方法。
５６．第２の薬剤が、ＤＭＤ遺伝子のエクソンスキッピングを引き起こすアンチセンスオリゴヌクレオチド、抗ミオスタチン抗体、ナンセンス変異のリボソームリードスルーを促進する薬剤、早発終止コドンを抑制する薬剤、アナボリックステロイド及びコルチコステロイドからなる群から選択される、実施形態５５に記載の医薬組成物または方法。
５７．当該投与が、患者の握力を改善し、最大筋力及び比筋力を増加させ、及び／または臓器及び筋肉重量を減少させる、実施形態５１～５６のいずれか１つに記載の医薬組成物または方法。
５８．ｒＡＡＶ粒子の投与が、心機能を改善もしくは維持するか、または心機能の低下を遅くする、実施形態５１～５７のいずれか１つに記載の医薬組成物または方法。
５９．ｒＡＡＶ粒子の投与が、筋肉量もしくは筋力を増加させるか、または筋肉量もしくは筋力を維持するか、または筋肉量もしくは筋力の喪失の可能性を低減させる、実施形態５１～５８のいずれか１つに記載の医薬組成物または方法。
６０．アミノ末端からカルボキシ末端へＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴに配置されているジストロフィンドメインを含むか、またはそれからなり、ここで、ＡＢＤは、ジストロフィンのアクチン結合ドメインであり、Ｈ１は、ジストロフィンのヒンジ１領域であり、Ｒ１は、ジストロフィンのスペクトリン１領域であり、Ｒ２は、ジストロフィンのスペクトリン２領域であり、Ｒ３は、ジストロフィンのスペクトリン３領域であり、Ｈ３は、ジストロフィンのヒンジ３領域であり、Ｒ２４は、ジストロフィンのスペクトリン２４領域であり、ＣＲは、ジストロフィンのシステインリッチ領域であり、ＣＴは、α１－シントロフィン結合部位、β－シントロフィン結合部位、及び／またはジストロブレビン部位を含むジストロフィンのＣ末端領域の少なくとも一部である、マイクロジストロフィンタンパク質。
６１．配列番号１、７９、もしくは９１のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる、実施形態６０に記載のマイクロジストロフィンタンパク質
６２．ＣＴドメインが、α１－シントロフィン結合部位を含む切断型ＣＴドメインである、実施形態６０または６１に記載のマイクロジストロフィンタンパク質。
６３．ＣＴドメインが、配列番号１６もしくは８３のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなるか、あるいは、配列番号８４のアミノ酸配列を含む、実施形態６０～６２のいずれか１つに記載のマイクロジストロフィンタンパク質。
６４．ＣＲドメインが、β－ジストログリカン結合部位を含む、実施形態６０～６３のいずれか１つに記載のマイクロジストロフィンタンパク質。
６５．ＣＲドメインが、配列番号１５もしくは９０のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる、実施形態６０～６４のいずれか１つに記載のマイクロジストロフィンタンパク質。
６６．ＡＢＤが、配列番号３、または配列番号３に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、Ｈ１が、配列番号５、または配列番号５に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、Ｒ１が、配列番号７、または配列番号７に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、Ｒ２が、配列番号８、または配列番号８に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、Ｈ３が、配列番号１１、または配列番号１１に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、Ｒ２４が、配列番号１３、または配列番号１３に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、Ｈ４が、配列番号１４、または配列番号１４に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ＣＲが、配列番号１５もしくは９０、または配列番号１５もしくは９０に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ＣＴが、配列番号１６もしくは８３、または配列番号１６もしくは８３に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、実施形態６０～６６のいずれか１つに記載のマイクロジストロフィンタンパク質。
６７．ＡＢＤが配列番号３からなるか、Ｈ１が配列番号５からなるか、Ｒ１が配列番号７からなるか、Ｒ２が配列番号８からなるか、Ｒ３が配列番号１０からなるか、Ｈ３が配列番号１１からなるか、Ｒ２４が配列番号１３からなるか、Ｈ４が配列番号１４からなるか、ＣＲが配列番号１５もしくは９０からなるか、またはＣＴが配列番号１６もしくは８３からなる、実施形態６０～６６のいずれか１つに記載のマイクロジストロフィンタンパク質。
６８．アミノ末端からカルボキシ末端へ：ＡＢＤ－Ｌ１－Ｈ１－Ｌ２－Ｒ１－Ｒ２－Ｌ３－Ｒ３－Ｈ３－Ｌ４－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴに配置されているジストロフィンドメインを含み、ここで、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４は、リンカーである、実施形態６０～６７のいずれか１つに記載のマイクロジストロフィンタンパク質。
６９．Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号４、６、９、及び１２からなる、実施形態６８に記載のマイクロジストロフィンタンパク質。
７０．アミノ末端からカルボキシ末端へＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ１６－Ｒ１７－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲに配置されているジストロフィンドメインを含むか、またはそれからなり、ここで、ＡＢＤは、ジストロフィンのアクチン結合ドメインであり、Ｈ１は、ジストロフィンのヒンジ１領域であり、Ｒ１は、ジストロフィンのスペクトリン１領域であり、Ｒ２は、ジストロフィンのスペクトリン２領域であり、Ｒ１６は、ジストロフィンのスペクトリン１６領域であり、Ｒ１７は、ジストロフィンのスペクトリン１７領域であり、Ｒ２４は、ジストロフィンのスペクトリン２４領域であり、ＣＲは、ジストロフィンのシステインリッチ領域である、マイクロジストロフィンタンパク質。
７１．配列番号９３のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる、実施形態７０に記載のマイクロジストロフィンタンパク質。
７２．アミノ末端からカルボキシ末端へＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ１６－Ｒ１７－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴに配置されているジストロフィンドメインを含むか、またはそれからなり、ここで、ＣＴは、α１－シントロフィン結合部位またはジストロブレビン結合部位を含むジストロフィンのＣ末端領域の少なくとも一部である、実施形態７０に記載のマイクロジストロフィンタンパク質。
７３．ＣＴドメインが、配列番号１６もしくは８３のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなるか、あるいは、配列番号８４のアミノ酸配列を含む、実施形態７２に記載のマイクロジストロフィンタンパク質。
７４．配列番号９２のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、実施形態７２または７３に記載のマイクロジストロフィンタンパク質。
７５．Ｈ４ドメインが、β－ジストログリカン結合部位を含む、実施形態７０～７４のいずれか１つに記載のマイクロジストロフィンタンパク質。
７６．ＡＢＤが、配列番号３、または配列番号３に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、Ｈ１が、配列番号５、または配列番号５に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、Ｒ１が、配列番号７、または配列番号７に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、Ｒ２が、配列番号８、または配列番号８に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、Ｒ１６が、配列番号８６、または配列番号８６に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、Ｒ１７が、配列番号８７、または配列番号８７に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、Ｒ２４が、配列番号１３、または配列番号１３に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、Ｈ４が、配列番号１４、または配列番号１４に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ＣＲが、配列番号１５もしくは９０、または配列番号１５もしくは９０に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、実施形態７０～７５のいずれか１つに記載のマイクロジストロフィンタンパク質。
７７．ＣＲドメインのＣ末端にＣＴドメインを含むか、またはそれからなり、ＣＴが、配列番号１６もしくは８３、または配列番号１６もしくは８３に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、実施形態７０～７６のいずれかに記載のマイクロジストロフィンタンパク質。
７８．ＡＢＤが配列番号３からなるか、Ｈ１が配列番号５からなるか、Ｒ１が配列番号７からなるか、Ｒ２が配列番号８からなるか、Ｒ１６が配列番号８６からなるか、Ｒ１７が配列番号８７からなるか、Ｒ２４が配列番号１３からなるか、Ｈ４が配列番号１４からなるか、ＣＲが配列番号１５もしくは９０からなるか、及び／またはＣＴが配列番号１６もしくは８３からなる、実施形態７０～７７のいずれか１つに記載のマイクロジストロフィンタンパク質。
７９．ＣＴが、配列番号１６または８３からなる、実施形態７０～７８のいずれか１つに記載のマイクロジストロフィンタンパク質。
８０．アミノ末端からカルボキシ末端へ：ＡＢＤ－Ｌ１－Ｈ１－Ｌ２－Ｒ１－Ｒ２－Ｌ３－Ｒ１６－Ｌ４．１－Ｒ１７－Ｌ４．２－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴまたはＡＢＤ－Ｌ１－Ｈ１－Ｌ２－Ｒ１－Ｒ２－Ｌ３－Ｒ１６－Ｌ４．１－Ｒ１７－Ｌ４．２－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲに配置されているジストロフィンドメインを含み、ここで、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４．１及びＬ４．２は、リンカーである、実施形態７０～８０のいずれか１つに記載のマイクロジストロフィンタンパク質。
８１．Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４．１及びＬ４．２のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号４、６、９、１１０、及び８９からなる、実施形態８０のマイクロジストロフィンタンパク質。
８２．ジストロフィノパチーを治療することを、それを必要とするヒト対象において行う方法であって、当該ヒト対象の循環、筋肉組織及び／または脳脊髄液に、治療上有効な量の実施形態６０～８１のいずれか１つに記載のマイクロジストロフィンタンパク質を送達することを含む、方法。
８３．ヒト対象におけるジストロフィノパチーの治療のための医薬組成物であって、当該ヒト対象の循環、筋肉組織及び／または脳脊髄液への送達のために製剤化された、治療上有効な量の実施形態６０～８１のいずれか１つに記載のマイクロジストロフィンタンパク質を含む、医薬組成物。
８４．ジストロフィノパチーが、ＤＭＤ、ＢＭＤまたはＸ連鎖性拡張型心筋症である、実施形態８２または８３に記載の方法または医薬組成物。
８５．ＣＴドメインが、α１－シントロフィン結合部位、β－シントロフィン結合部位、及び／またはジストロブレビン結合部位を含む、実施形態８２～８４のいずれか１つに記載の方法または医薬組成物。
８６．ＣＴドメインが、α１－シントロフィン結合部位を含む切断型ＣＴドメインである、実施形態８５に記載の方法または医薬組成物。
８７．Ｈ４が、β－ジストログリカン結合部位を含む、実施形態８２～８６のいずれか１つに記載の方法または医薬組成物。
８８．組み換えＡＡＶを生産する方法であって、
（ａ）宿主細胞を培養することであって、宿主細胞は、
（ｉ）ｃｉｓ発現カセットを含む人工ゲノムであって、ｃｉｓ発現カセットは、実施形態３８～４４のいずれか１つに記載の核酸組成物を含む、人工ゲノム、
（ｉｉ）ＡＡＶ ＩＴＲを欠くｔｒａｎｓ発現カセットであって、培養中の宿主細胞においてＡＡＶ ｒｅｐ及びカプシドタンパク質の発現を駆動し、トランスでｒｅｐ及びｃａｐタンパク質を供給する発現制御エレメントに作動可能に連結されたＡＡＶ ｒｅｐ及びカプシドタンパク質をコードする、ｔｒａｎｓ発現カセット、
（ｉｉｉ） ＡＡＶカプシドタンパク質による人工ゲノムの複製及びパッケージングを可能にする十分なアデノウイルスヘルパー機能
を含有する、培養することと、
（ｂ）人工ゲノムがカプシドで内包された組み換えＡＡＶを細胞培養物から回収することと
を含む、方法。
８９．ａ．ｃｉｓ発現カセットを含む人工ゲノムであって、ｃｉｓ発現カセットは、実施形態３８～４４のいずれか１つに記載の核酸組成物を含む、人工ゲノム、
ｂ．ＡＡＶ ＩＴＲを欠くｔｒａｎｓ発現カセットであって、培養中の宿主細胞においてＡＡＶ ｒｅｐ及びカプシドタンパク質の発現を駆動し、トランスでｒｅｐ及びｃａｐタンパク質を供給する発現制御エレメントに作動可能に連結されたＡＡＶ ｒｅｐ及びカプシドタンパク質をコードする、ｔｒａｎｓ発現カセット、ならびに
ｃ．ＡＡＶカプシドタンパク質による人工ゲノムの複製及びパッケージングを可能にする十分なアデノウイルスヘルパー機能
を含む、宿主細胞。
遺伝子治療のためのＣｉｓプラスミドに使用されるベクター遺伝子発現カセット及びマイクロジストロフィンコンストラクトを示す。各コンストラクトの各構成要素及び完全な導入遺伝子のＤＮＡ長を記載する。ＳＰｃ５－１２：合成筋特異的プロモーター；Ｍｉｎｉ－ＳＰｃ：切断型合成筋特異的プロモーター；ＣＴ１．５：切断型／最小ＣＴドメイン；ＶＨ４：ヒト免疫グロビン重鎖可変領域イントロン；ＡＢＤ：アクチン結合ドメイン；Ｈ：ヒンジ；Ｒ：ロッド；ＣＲ：システインリッチドメイン；ＣＴ：Ｃ末端ドメイン；ｓｍＰＡ：小ポリＡ；ＡＢＤ：アクチン結合ドメイン１（ＡＢＤ１）。 ウェスタンブロット（ジストロフィンに対する抗体（１ｃ７））によって検出されたタンパク質バンドを示し、プラスミドＲＧＸ－ＤＹＳ１、ＲＧＸ－ＤＹＳ３及びＲＧＸ－ＤＹＳ５から発現されたマイクロジストロフィンタンパク質の相対サイズを示す。 ウェスタンブロット（ジストロフィンに対する抗体（１ｃ７））によって検出されたタンパク質バンドを示し、プラスミドＲＧＸ－ＤＹＳ１，ＲＧＸ－ＤＹＳ３及びＲＧＸ－ＤＹＳ５から発現されたマイクロジストロフィンタンパク質の相対サイズを示す。 様々な投与量（画像の上に表示：５×１０ｅ５ｖｇ／細胞（Ａ、Ｄ）、１×１０ｅ５ｖｇ／細胞（Ｂ、Ｅ）、０．２×１０ｅ５ｖｇ／細胞（Ｃ、Ｆ））でのレポーターＡＡＶベクターのＡＡＶ８－ＧＦＰ（Ａ～Ｃ）及びＡＡＶ８－ＶＨ４－ＧＦＰ（Ｄ～Ｆ）による感染から３日後の分化したＣ２Ｃ１２細胞の蛍光顕微鏡検査を示す。スケールバー：２００μＭ。ｖｇ：ベクターゲノム。 ３つの異なる投与量：５×１０ｅ５ｖｇ／細胞、１×１０ｅ５ｖｇ／細胞、及び０．２×１０ｅ５ｖｇ／細胞でのＡＡＶ８－ＧＦＰ及びＡＡＶ８－ＶＨ４－ＧＦＰベクターによる感染から３日後に測定した形質導入Ｃ２Ｃ１２細胞の平均蛍光強度（単位）を示す。 ＡＡＶ８－ＣＡＧ－ＧＦＰによる感染から６日後の分化したＣ２Ｃ１２細胞の蛍光顕微鏡検査を示す。画像Ａ～Ｃは、ＥＶＯＳ（商標）顕微鏡を透過光及びＧＦＰチャンネルで同じ倍率を使用して毎日撮影されたものである。Ａ：ＧＦＰチャンネルに設定した顕微鏡画像；Ｂ：細胞のコンフルエンスを観察するための明視野（または位相差）；Ｃ：感染細胞の数（およそ５０％）を観察するためにＡとＢを統合した画像。 ジストロフィンタンパク質の免疫蛍光染色による参照対照（ＲＧＸ－ＤＹＳ－ＲＳ、Ａ～Ｄ）と比較したマイクロジストロフィンベクター（ＲＧＸ－ＤＹＳ１－０３、Ｅ～Ｈ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ効力試験を示す。各投与量（それぞれの画像の上に表示）：１ｅ１２ｖｇ／ｍｌ（Ａ、Ｅ）、４ｅ１１ｖｇ／ｍｌ（Ｂ、Ｆ）、１．６ｅ１１ｖｇ／ｍｌ（Ｃ、Ｇ）、及び６．４ｅ１０ｖｇ／ｍｌ（Ｄ、Ｈ）につき３反復した。 ベクター効力の指標として、マウス筋肉細胞株Ｃ２Ｃ１２細胞における各ベクターの感染力データを示す。各ベクターバッチＲＧＸ－ＤＹＳ１－０１、ＲＧＸ－ＤＹＳ１－０２、ＲＧＸ－ＤＹＳ２－０１、ＲＧＸ－ＤＹＳ３－０１、ＲＧＸ－ＤＹＳ３－０２、ＲＧＸ－ＤＹＳ４－０１、及びＲＧＸ－ＤＹＳ１－ＲＳの正規化データ（ベクターコピー数／参照対照）を示す。ＤＹＳ１の初期バッチに基づく内部対照ベクター（ＲＧＸ－ＤＹＳ１－ＲＳ）を参照標準（１．０）とした。 ｍＲＮＡ発現の指標として、それぞれ同じプロセスを使用した異なる生産バッチの各ベクター（ＲＧＸ－ＤＹＳ１－０１、ＲＧＸ－ＤＹＳ１－０２、ＲＧＸ－ＤＹＳ２－０１、ＲＧＸ－ＤＹＳ３－０１、ＲＧＸ－ＤＹＳ３－０２、ＲＧＸ－ＤＹＳ４－０１、及びＲＧＸ－ＤＹＳ１－ＲＳ）のマウス筋肉細胞株Ｃ２Ｃ１２細胞におけるマイクロジストロフィンデータを示す。Ｃ２Ｃ１２細胞の感染には、２つの異なるベクター投与量が使用された（１ｅ５ｖｇ／細胞及び５ｅ４ｖｇ／細胞）。各バッチのｍＲＮＡ発現レベルは、同じｃＤＮＡサンプルのマイクロジストロフィン及び内因性対照マウスＧＡＰＤＨのプライマー／プローブ間のｑＰＣＲにおける倍率変化（デルタＣＴ）として算出した。グラフは、倍率増加を示し、ＲＧＸ－ＤＹＳ１－ＲＳを１００％参照標準とし、１に設定した。 体重（ｇ）の週単位の変化を示す。データは、平均±ＳＥＭとして示される。ｍｄｘ ＲＧＸ－ＤＹＳ１群はｎ＝１２；ｍｄｘビヒクル群はｎ＝１３；ＢＬ１０ビヒクル群はｎ＝１４。 マウスの筋肉及び臓器の重量測定値を示す（体重に正規化、ｇ／ｋｇ）。大腿四頭筋及びヒラメ筋の重量を示す。データは、平均±ＳＥＭで示される。ｍｄｘ ＲＧＸ－ＤＹＳ１群はｎ＝１２；ｍｄｘビヒクル群はｎ＝１３；ＢＬ１０ビヒクル群はｎ＝１４。＊＊＊Ｐ≦０．００１（一元配置ＡＮＯＶＡ）；＃＃＃Ｐ≦０．００１（ｔ検定）。 マウスの筋肉及び臓器の重量測定値を示す（体重に正規化、ｇ／ｋｇ）。三頭筋及びＴＡの重量を示す。データは、平均±ＳＥＭで示される。ｍｄｘ ＲＧＸ－ＤＹＳ１群はｎ＝１２；ｍｄｘビヒクル群はｎ＝１３；ＢＬ１０ビヒクル群はｎ＝１４。＊＊＊Ｐ≦０．００１（一元配置ＡＮＯＶＡ）；＃＃＃Ｐ≦０．００１（ｔ検定）。 握力測定を示す（ＫＧＦ／ｋｇ）。＊：一元配置ＡＮＯＶＡ（＊＊＊Ｐ≦０．００１）；＃：ｔ検定（＃＃＃ｐ≦０．００１）。前腕筋の握力は、筋肉重量で各マウスについて正規化した。ｍｄｘ ＲＧＸ－ＤＹＳ１群はｎ＝１２；ｍｄｘビヒクル群はｎ＝１３；ＢＬ１０ビヒクル群はｎ＝１４。 ＲＧＸ－ＤＹＳ１で処置したｍｄｘマウスの筋力がビヒクルで処置したｍｄｘマウスと比較して有意に改善されることを明らかにした、処置後６週でのｉｎ ｖｉｔｒｏ筋力収縮力分析を示す。最大力（ｍＮ）及び比筋力（ｋＮ／ｍ２）を示す。＊＊＊：一元配置ＡＮＯＶＡでｐ＜０．００１。＃＃＃：Ｔ検定でｐ＜０．００１。ｍｄｘ ＲＧＸ－ＤＹＳ１群はｎ＝１２；ｍｄｘビヒクル群はｎ＝１３；ＢＬ１０ビヒクル群はｎ＝１４。 ｄｄＰＣＲ法による骨格筋、心筋、及び肝臓におけるベクターコピー数（ｖｇ／二倍体ゲノム）を示す。Ｓｔｉｌｌａ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＮａｉｃａ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍを使用した。各処置組織につきｎ＝１３。記載される数は、平均±Ｓｔｄｅｖである。ベクターコピー数は、２Ｘマイクロジストロフィン導入遺伝子コピー数／内因性対照マウスグルカゴンコピー数として算出した。注射なしのｍｄｘ肝臓サンプルｓ（ｎ＝１３）を陰性対照サンプルとして使用した。ＴＡ：前脛骨筋；ＥＤＬ：長指伸筋。 野生型ジストロフィンまたはジストロブレビン及びα１－シントロフィン及びβ１－シントロフィン結合部位を含有するマイクロジストロフィン、例えば、ＲＧＸ－ＤＹＳ１とジストロフィン関連タンパク質複合体（ＤＡＰＣ）との間のアクチン細胞骨格との相互作用を示す筋鞘のイラストを示す。ジストロブレビン、α１－シントロフィン、及びβ１－シントロフィン結合部位を有するＲＧＸ－ＤＹＳ１は、ｎＮＯＳをある程度動員し、α１－シントロフィンを介して筋鞘に固定することが想定される。 ｍｄｘ ＲＧＸ－ＤＹＳ１群、ｍｄｘ対照群、及びＷＴ対照群の腓腹筋の免疫蛍光染色を示す。クライオ切片を抗α－ジストロブレビン、抗－ジストログリカン、抗ｎＮｏｓ、抗ジストロフィン（抗ｄｙｓ）、及び抗α－シントロフィンで染色した。二次抗体をＣＹ３で標識し、全ての切片をＤＡＰＩで対比染色してからマウントした。 図１４－１の続きである ＡＡＶ－μ－ジストロフィンベクターを注射した腓腹筋組織から抽出したジストロフィンに対するウェスタンブロットを示す。レーン１～４＝ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１を注射したｍｄｘマウスからのタンパク質サンプル、レーン５～８＝ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ５を注射したｍｄｘマウスらのタンパク質サンプル、及びレーン９～１２＝ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ３を注射したｍｄｘマウスらのタンパク質サンプル。α１－アクチンは、各レーンのローディング対照として機能する。Ｍｄｘ（レーン１３）は、注射していないｍｄｘマウスを示す。ジストロフィンブロットの場合、マウス抗ジストロフィンモノクローナル抗体を使用した（１：１００希釈）。抗アルファ１－アクチンブロットの場合、ポリクローナル抗体は、１：１０，０００の希釈率で使用され、二次（抗ウサギ）抗体は１：２０，０００で使用された。 ウェスタンブロットによるμ－ジストロフィンバンドの定量を示す。＊ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０００１。 ｄｄＰＣＲによるＡＡＶ－μ－Ｄｙｓベクターコピー数を示す。＊ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０００１。 ＡＡＶ－μ－Ｄｙｓベクターコピー数によって正規化したμ－ジストロフィンバンドの定量を示す。＊ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０００１。 骨格筋（腓腹筋）におけるμ－ジストロフィン及び野生型（ＷＴ）ジストロフィンのｍＲＮＡ発現を示す。トータルＲＮＡを骨格筋から抽出し、ｃＤＮＡを合成した。デジタルＰＣＲ（Ｎａｉｃａ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ、Ｓｔｉｌｌａ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、μ－ジストロフィン、ＷＴ－ジストロフィン、及び内因性対照グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のｍＲＮＡコピー数を測定した。相対μ－ジストロフィンまたはＷＴ－ジストロフィンのｍＲＮＡ発現をＧＡＰＤＨで正規化した。Ｂ６－ＷＴ骨格筋におけるＷＴ－ジストロフィンとＧＡＰＤＨの比を１とみなした。 単一細胞における相対μ－ジストロフィンまたはＷＴ－ジストロフィンのｍＲＮＡ発現を示す。μ－ジストロフィンまたはＷＴ－ジストロフィンのｍＲＮＡ発現コピー数は、細胞あたりのＧＡＰＤＨ及びゲノムコピー数で正規化した。 腓腹筋をｍｄｘマウスから摘出し、組織切片を調製し、ジストロフィンならびにジストロブレビン、β－ジストログリカン、及びシントロフィンを含むジストロフィン関連タンパク質複合体に対して免疫蛍光（ＩＦ）染色した。マウスを記載の通りに処置した：Ｂｌ６（未処置の野生型マウス）；ＲＧＸ－ＤＹＳ１（マウスＩＤ３５５３、及びマウスＩＤ３５８８）；ＲＧＸ－ＤＹＳ３（マウスＩＤ５、及びマウスＩＤ７）；及びＲＧＸ－ＤＹＳ５（マウスＩＤ９、及びマウスＩＤ１１）。対物レンズ：４０倍。 骨格筋におけるシントロフィン発現を示す。腓腹筋をｍｄｘマウスから摘出し、組織切片を調製し、シントロフィンに対して免疫蛍光（ＩＦ）染色した。マウスを記載の通りに処置した：Ｂｌ６（未処置の野生型マウス）；ＲＧＸ－ＤＹＳ１（マウスＩＤ３５５３、及びマウスＩＤ３５８８）；ＲＧＸ－ＤＹＳ３（マウスＩＤ５、及びマウスＩＤ７）；及びＲＧＸ－ＤＹＳ５（マウスＩＤ９、及びマウスＩＤ１１）。対物レンズ：４０倍。 筋肉組織溶解物からのシントロフィンに対するウェスタンブロットを示す。 ウェスタンブロットバンドの定量を示す。＊：ｐ＜０．０５；＊＊＊：ｐ＜０．０００１。 総筋膜タンパク質からのシントロフィンに対するウェスタンブロットを示す。 ウェスタンブロットバンドの定量。 骨格筋におけるｎＮＯＳ発現を示す。ｎＮＯＳに対する免疫蛍光染色を示す。 ｎＮＯＳに対するウェスタンブロットを示す。 ウェスタンブロットバンドの定量を示す。 μ－ジストロフィン遺伝子をコードするＡＡＶベクターによる衛星細胞の形質導入及び細胞再生の緩和。Ａ～Ｂは、ＲＧＸ－ＤＹＳ１で処置したｍｄｘマウスのＲＮＡＳｃｏｐｅ画像を示す。μ－ジストロフィン（赤）及びｐａｘ７衛星細胞（緑）の共発現が明らかになった。ＡＡＶ導入遺伝子及びＰａｘ７のｍＲＮＡ発現のＲＮＡｓｃｏｐｅマルチプレックス蛍光解析サービスは、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ（Ｎｅｗａｒｋ，ＣＡ）で実施された。 μ－ジストロフィン遺伝子をコードするＡＡＶベクターによる衛星細胞の形質導入及び細胞再生の緩和。Ｃは、ＡＡＶ－ＤＭＤが形質導入された衛星細胞のパーセンテージを示す。Ｄは、ＲＮＡｓｃｏｐｅ画像における衛星細胞の総カウントを示す。 μ－ジストロフィン遺伝子をコードするＡＡＶベクターによる衛星細胞の形質導入及び細胞再生の緩和。Ｅは、ｄｄＰＣＲによって明らかにされた異なる群の骨格筋におけるＰａｘ７ ｍＲＮＡ発現を示す。μ－ジストロフィンに対するプライマー及びプローブは、前述のものと同じであった。Ｂ６－ＷＴ骨格筋におけるｐａｘ７とＧＡＰＤＨの比を１とみなした。未処置ｍｄｘマウスと比較した場合、＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１；＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１。 追加の改変したμ－ジストロフィンコンストラクトのイラストを示す。短縮ＣＲ：システインリッチドメインが野生型ジストロフィンよりも１５０ｂｐ短いもの。Ｒ１６／Ｒ１７：ジストロフィンスペクトリン様リピート１６及び１７。 異なるバージョンのＡＡＶ８－μ－ジストロフィンコンストラクトによるＣ２Ｃ１２筋管のｉｎ ｖｉｔｒｏ感染を示す。Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞を分化培地で誘導し、次いで、ＡＡＶベクターを感染させた。ウェスタンブロットまたはｍＲＮＡ発現のために、感染から５日後に細胞を回収した。１：陰性対照；２：ＲＧＸ－ＤＹＳ８；３：ＲＧＸ－ＤＹＳ７；４：ＲＧＸ－ＤＹＳ６；５：ＲＧＸ－ＤＹＳ３；６：ＲＧＸ－ＤＹＳ５；７：ＲＧＸ－ＤＹＳ１；８：ＲＧＸ－ＤＹＳ１；９：ＲＧＸ－ＤＹＳ１；１０：ＲＧＸ－ＤＹＳ１；１１：ＲＧＸ－ＤＹＳ１。Ｃ２Ｃ１２細胞からのμ－ジストロフィン発現のウェスタンブロット解析。 ウェスタンブロット解析の定量を示す。 ｄｄＰＣＲによるμ－ジストロフィンｍＲＮＡ発現の検出を示す。
マイクロジストロフィンタンパク質、例えば、図１Ａ及び図２２に示されるもの、ならびに同タンパク質をコードする核酸組成物及びｒＡＡＶベクター、ならびにそれらに関する医薬組成物及び治療法が提供される。
５．１．定義
「ＡＡＶ」または「アデノ随伴ウイルス」という用語は、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科のウイルス属内のデペンドパルボウイルスを指す。ＡＡＶは、天然に存在する「野生型」ウイルスに由来するＡＡＶ、天然に存在するｃａｐ遺伝子によってコードされるカプシドタンパク質を含むカプシドにパッケージングされたｒＡＡＶゲノムに由来するＡＡＶ及び／または天然に存在しないカプシドｃａｐ遺伝子によってコードされるカプシドタンパク質を含むカプシドにパッケージングされたｒＡＡＶゲノムに由来するＡＡＶであり得る。後者の例としては、天然に存在するカプシドのアミノ酸配列に改変された配列及び／またはペプチド挿入物を有するカプシドタンパク質を有するｒＡＡＶが挙げられる。
「ｒＡＡＶ」という用語は、「組み換えＡＡＶ」を指す。いくつかの実施形態において、組み換えＡＡＶは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子の一部分または全てが異種配列で置き換えられているＡＡＶゲノムを有する。
「ｒｅｐ－ｃａｐヘルパープラスミド」という用語は、ウイルスのｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子機能を提供し、機能的なｒｅｐ及び／またはｃａｐ遺伝子配列を欠くｒＡＡＶゲノムからのＡＡＶの生産を助けるプラスミドを指す。
「ｃａｐ遺伝子」という用語は、ウイルスのカプシド被膜を形成するか、またはその形成に役立つカプシドタンパク質をコードする核酸配列を指す。ＡＡＶの場合、カプシドタンパク質は、ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３であり得る。
「ｒｅｐ遺伝子」という用語は、ウイルスの複製及び生産に必要な非構造タンパク質をコードする核酸配列を指す。
「核酸」及び「ヌクレオチド配列」という用語は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ分子とＲＮＡ分子の組み合わせまたはハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ分子、及びＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子のアナログを含む。そのようなアナログは、例えば、ヌクレオチドアナログを使用して生成することができ、これらには、イノシンまたはトリチル化塩基が含まれるが、これらに限定されない。そのようなアナログはまた、例えば、ヌクレアーゼ耐性または細胞膜を通過する能力の増加などの分子に有益な属性を与える修飾骨格を含むＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を含み得る。核酸またはヌクレオチド配列は、一本鎖、二本鎖であり得、一本鎖及び二本鎖の部分の両方を含有し得、三本鎖の部分を含有し得るが、好ましくは、二本鎖ＤＮＡである。
本明細書で開示されるアミノ酸残基は、全体的なポリペプチド構造及び／または機能を維持または実質的に維持する保存的置換によって修飾され得る。本明細書で使用されるとき、「保存的アミノ酸置換」は、以下を示す：疎水性アミノ酸（すなわち、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、ｌｉｅ、及びＬｅｕ）は、他の疎水性アミノ酸で置換することができること、嵩高い側鎖を持つ疎水性アミノ酸（すなわち、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、及びＴｒｐ）は、嵩高い側鎖を持つ他の疎水性アミノ酸で置換することができること、正電荷を帯びた側鎖を持つアミノ酸（すなわち、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、及びＬｙｓ）は、正電荷を帯びた側鎖を持つ他のアミノ酸で置換することができること、負電荷を帯びた側鎖を持つアミノ酸（すなわち、Ａｓｐ及びＧｌｕ）は、負電荷を帯びた側鎖を持つ他のアミノ酸で置換することができること、極性非電荷側鎖を持つアミノ酸（すなわち、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、及びＧｌｎ）は、極性非電荷側鎖を持つ他のアミノ酸で置換することができること。
「対象」、「宿主」、及び「患者」という用語は、区別なく使用される。対象は、好ましくは、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）または霊長類（例えば、サル及びヒト）などの哺乳動物であり、最も好ましくは、ヒトである。
「治療上機能的なマイクロジストロフィン」という用語は、本明細書のセクション５．４に記載される治療有用性のアッセイのうちの１つ以上において、または本明細書のセクション５．５に記載される治療方法の評価において、マイクロジストロフィンが治療有効性を示すことを意味する。
「対象」、「宿主」、及び「患者」という用語は、区別なく使用される。対象は、好ましくは、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）または霊長類（例えば、サル及びヒト）などの哺乳動物であり、最も好ましくは、ヒトである。
「治療薬」という用語は、疾患または障害に関連する症状の治療、管理、または改善に使用することができる任意の薬剤を指し、当該疾患または障害は、導入遺伝子によって提供される機能に関連する。「治療上有効な量」は、目的の疾患または障害の治療または管理において、それを罹患している対象に投与した場合、少なくとも１つの治療上の利益を提供する薬剤の量（例えば、導入遺伝子によって発現される生成物の量）を指す。更に、本発明の薬剤に関する治療上有効な量とは、疾患または障害の治療または管理において少なくとも１つの治療上の利益を提供する、薬剤単独の量、または他の治療法と組み合わせた場合の量を意味する。
「予防薬剤」という用語は、疾患または障害の予防、発生の可能性の低減、遅延、または進行の鈍化において使用することができる任意の薬剤を指し、当該疾患または障害は、導入遺伝子によって提供される機能に関連する。「予防上有効な量」は、目的の疾患または障害の予防または遅延において、その素因がある対象に投与された場合、少なくとも１つの予防上の利益を提供する予防薬剤の量（例えば、導入遺伝子によって発現される生成物の量）を指す。予防上有効な量はまた、目的の疾患もしくは障害の発生の予防、その可能性の低減、もしくは遅延、もしくは目的の疾患もしくは障害の進行の遅延に十分な薬剤の量、目的の疾患もしくは障害の発症の遅延もしくは最小化に十分な量、またはその再発もしくは拡大の予防もしくは遅延に十分な量を指し得る。予防上有効な量はまた、目的の疾患または障害の症状の増悪の予防または遅延に十分な薬剤の量を指し得る。更に、本発明の予防薬剤に関する予防上有効な量は、疾患または障害の予防または遅延において少なくとも１つの予防上の利益を提供する、予防薬剤単独の量、または他の薬剤と組み合わせた場合の量を意味する。
本発明の予防薬剤は、目的の疾患または障害の「素因がある」対象に投与することができる。疾患または障害の「素因がある」対象は、疾患もしくは障害の発症に関連する症状を示すもの、またはそのような疾患もしくは障害についての遺伝子構造、環境曝露、もしくは他のリスク要因を有するが、疾患もしくは障害として診断されるレベルの症状ではまだないものである。例えば、欠損遺伝子（導入遺伝子によって提供されるもの）に関連する疾患について家族歴を有する患者は、その疾患の素因があるものとしてみなされ得る。更に、原発性腫瘍の除去後に持続する休眠腫瘍のある患者は、腫瘍の再発の素因があるものとしてみなされ得る。
「ＣｐＧアイランド」という用語は、ジヌクレオチドＣｐＧ（例えば、Ｃ（シトシン）塩基の直後にＧ（グアニン）塩基があるもの（ＣｐＧ））を高い頻度で含有するゲノムの特徴的な領域を意味し、したがって、ＣｐＧアイランドのＧ＋Ｃ含量は、非アイランドＤＮＡよりも大幅に高くなる。ＣｐＧアイランドは、ヌクレオチド長、ヌクレオチド組成、及びＣｐＧジヌクレオチドの頻度の分析によって同定することができる。任意の特定のヌクレオチド配列またはゲノムにおけるＣｐＧアイランド含量は、次の基準を使用して測定することができる：アイランドの大きさが１００超、ＧＣパーセントが５０．０％超、及びセグメント中のＧ及びＣの数に基づいたＣＧジヌクレオチドの予測数に対する実測数の比が０．６超（Ｏｂｓ／Ｅｘｐが０．６超）。
ＣｐＧ実測／予測＝ＣｐＧの数＊Ｎ／（Ｃの数＊Ｇの数）
式中、Ｎ＝配列の長さ。
そのような計算には、ｗｏｒｌｄ－ｗｉｄｅ－ｗｅｂ．ｕｒｏｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｍｅｔｈｐｒｉｍｅｒ／ｍｅｔｈｐｒｉｍｅｒ．ｃｇｉ、ｗｏｒｌｄ－ｗｉｄｅ－ｗｅｂ．ｃｐｇｉｓｌａｎｄｓ．ｕｓｃ．ｅｄｕ／、ｗｏｒｌｄ－ｗｉｄｅ－ｗｅｂ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｅｍｂｏｓｓ／ｃｐｇｐｌｏｔ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ及びｗｏｒｌｄ－ｗｉｄｅ－ｗｅｂ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｏｒｇ／ｓｍｓ２／ｃｐｇ＿ｉｓｌａｎｄｓ．ｈｔｍｌなどの様々なソフトウェアツールが利用可能である（Ｇａｒｄｉｎｅｒ－Ｇａｒｄｅｎ ａｎｄ Ｆｒｏｍｍｅｒ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９８７ Ｊｕｌ ２０；１９６（２）：２６１－８２；Ｌｉ ＬＣ ａｎｄ Ｄａｈｉｙａ Ｒ．ＭｅｔｈＰｒｉｍｅｒ：ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ＰＣＲｓ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００２ Ｎｏｖ；１８（１１）：１４２７－３１も参照のこと）。一実施形態において、ＣｐＧアイランドを同定するためのアルゴリズムは、ｗｗｗ．ｕｒｏｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｍｅｔｈｐｒｉｍｅｒ／ｍｅｔｈｐｒｉｍｅｒ．ｃｇｉにある。
５．２．マイクロジストロフィン導入遺伝子
５．２．１マイクロジストロフィン
本明細書に記載される実施形態は、アミノ末端からカルボキシ末端へ：ＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ（例えば、配列番号２）またはＡＢＤ１－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ１６－Ｒ１７－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ（配列番号９３）を有するマイクロジストロフィンタンパク質を含み、ここで、ＡＢＤは、ジストロフィンのアクチン結合ドメインであり、Ｈ１は、ジストロフィンのヒンジ１領域であり、Ｒ１は、ジストロフィンのスペクトリン１領域であり、Ｒ２は、ジストロフィンのスペクトリン２領域であり、Ｒ３は、ジストロフィンのスペクトリン３領域であり、Ｈ３は、ジストロフィンのヒンジ３領域であり、Ｒ１６は、ジストロフィンのスペクトリン１６領域であり、Ｒ１７は、ジストロフィンのスペクトリン１７領域であり、Ｒ２４は、ジストロフィンのスペクトリン２４領域であり、Ｈ４は、ジストロフィンのヒンジ４領域であり、ＣＲは、ジストロフィンのシステインリッチ領域である。
上で説明されるように、本開示に係るマイクロジストロフィンは、ＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ２４－Ｈ４またはＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ１６－Ｒ１７－Ｒ２４－Ｈ４を含む。ジストロフィンのＮＨ２末端及びロッドドメイン中の領域は、細胞骨格アクチンに直接結合するが、架橋はしない。野生型ジストロフィンのロッドドメインは、２４個の繰り返し単位からなり、スペクトリンの三重螺旋リピートと類似している。この繰り返し単位は、ジストロフィンタンパク質の大部分を占めており、β－スペクトリンと類似した柔軟なロット様構造を分子に与えていると考えられる。これらのα－ヘリカルコイルドコイルリピートは、４つのプロリンリッチヒンジ領域によって中断されている。２４番目のリピートの末端には、４番目のヒンジ領域があり、その直後にＷＷドメインが続く［Ｂｌａｋｅ，Ｄ．ｅｔ ａｌ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ａｎｄ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ－Ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｍｕｓｃｌｅ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．８２：２９１－３２９，２００２］。本明細書で開示されるマイクロジストロフィンは、Ｒ４からＲ２３を含まないか、あるいは、Ｒ３（またはいくつかの実施形態ではＲ４）からＲ１５及びＲ１８からＲ２３を含まず（すなわち、マイクロジストロフィンは、Ｒ１６及びＲ１７を含み、ある特定の実施形態では、Ｒ３を含まない場合もある）、４つのヒンジ領域またはその一部のうちの２つまたは３つのみを含む。実施形態は、ｎＮＯＳを筋鞘に固定すると考えられているジストロフィンスペクトリン様リピート１６及び１７を含有し得る。いくつかの実施形態において、新規のアミノ酸残基またはリンカーは、マイクロジストロフィンに導入されない。
いくつかの実施形態において、マイクロジストロフィンＨ３を含む（例えば、配列番号１、２、または７９）。実施形態において、Ｈ３は、Ｎ末端からＣ末端までの完全な内因性Ｈ３ドメイン、例えば、配列番号１１であり得る。別の言い方をすれば、いくつかのマイクロジストロフィン実施形態は、Ｈ３ドメインの断片を含有するのではなく、Ｈ３ドメイン全体を含有する。いくつかの実施形態において、Ｒ３ドメインのＣ末端アミノ酸は、Ｈ３ドメインのＮ末端アミノ酸に直接（または共有結合的に）結合される。いくつかの実施形態において、Ｈ３ドメインのＮ末端アミノ酸に連結するＲ３ドメインのＣ末端アミノ酸は、Ｑである。いくつかの実施形態において、Ｒ３ドメインに結合するＨ３ドメインの５’アミノ酸は、Ｑである。
他の実施形態において、マイクロジストロフィンは、Ｈ３の代わりにＨ２を含む。Ｈ２は、完全な内因性Ｈ２ドメインであり得る（配列番号１９）。そのようなマイクロジストロフィンタンパク質の実施形態は、アミノ末端からカルボキシ末端へ：ＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ２－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲを有する。いくつかの実施形態において、ヒンジドメインのＮ末端アミノ酸に連結するＲ３ドメインのＣ末端アミノ酸は、Ｑである。他の実施形態において、Ｒ３ドメインに連結するＨ２ドメインのＮ末端アミノ酸は、Ｐである。ある特定の実施形態において、Ｒ３ドメインのＣ末端アミノ酸は、ヒンジドメインのＮ末端アミノ酸に直接連結され、ここで、ヒンジドメインのＮ末端アミノ酸は、ＰまたはＱである。更に他の実施形態において、Ｒ３ドメインのＣ末端アミノ酸は、Ｈ２ドメインのＮ末端アミノ酸に直接連結され、ここで、Ｈ２ドメインのＮ末端アミノ酸は、Ｐである。
いかなる理論に束縛されるものではないが、完全なヒンジドメインは、由来となるマイクロジストロフィンタンパク質に基づく完全な活性をもたらすために、いかなるマイクロジストロフィンコンストラクトにも適切であり得る。ジストロフィンのヒンジセグメントは、天然でプロリンに富むことが認識されており、それにより、タンパク質生成物に柔軟性が付与され得る（Ｋｏｅｎｉｇ ａｎｄ Ｋｕｎｋｅｌ，２６５（６）：４５６０－４５６６，１９９０）。ヒンジの一部の欠失、特に１つ以上のプロリン残基の除去により、その柔軟性が低下し、したがって、ＤＡＰ複合体中の他のタンパク質との相互作用が妨げられることによって、その有効性も低下し得る。
本明細書で開示されるマイクロジストロフィンは、野生型ジストロフィンＨ４配列（ＷＷドメインを含有）からＣＲドメイン（配列番号１５において一重下線によって表されるＺＺドメイン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ１１５３２ ａａ ３３０７－３３５４）を含有）までを含む。ＷＷドメインは、いくつかのシグナル伝達及び調節分子にみられるタンパク質結合モジュールである。ＷＷドメインは、ｓｒｃ相同３（ＳＨ３）ドメインと類似した方法でプロリンに富む基質に結合する。この領域は、β－ジストログリカンの細胞質ドメインがプロリンに富むことから、β－ジストログリカンとジストロフィンとの間の相互作用を媒介する。ＷＷドメインは、ヒンジ４（Ｈ４領域）内にある。ＣＲドメインは、α－アクチニンと同様の２つのＥＦハンドモチーフを含有し、細胞内Ｃａ２＋に結合し得る。ＺＺドメインは、多数の保存的システイン残基を含有し、これは、Ｚｎ２＋などの二価金属カチオンの配位部位を形成することが予測される。ＺＺドメインは、多くのタイプのジンクフィンガーに類似しており、核内と細胞質タンパク質の両方に存在する。ジストロフィンのＺＺドメインは、Ｃａ２＋依存的にカルモジュリンに結合する。したがって、ＺＺドメインは、機能的なカルモジュリン結合部位を表し得、カルモジュリンの他のジストロフィン関連タンパク質への結合に影響し得る。
ある特定の実施形態は、ＺＺドメインを含む、切断されたＣＲドメインの部分を含む。例えば、マイクロジストロフィンタンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端へ：ＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ（短縮）－ＣＴ（例えば、配列番号９１、図２２のＲＧＸ－ＤＹＳ６参照）を含む。ある特定の実施形態において、ＣＲドメインは、例えば、配列番号９０のアミノ酸配列を有する。
ＡＡＶベクターに典型的なパッケージング制限を克服するために、臨床用途に開発された多くのマイクロジストロフィン遺伝子は、ＣＴドメインを欠いている。一部の研究者は、ＤＡＰＣの組み立てにはＣ末端ドメインは必要でないとさえ、またはＣ末端が必須でないことを示している［Ｃｒａｗｆｏｒｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２０００，１５０（６）：１３９９－１４０９；及びＲａｍｏｓ，Ｊ．Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１９，２７（３）：１－１３］。しかしながら、ジストロフィンタンパク質のＣＴドメインは、心筋症に有益な効果をもたらし得る。ジストロフィンのＣＴドメインと心筋のβ－ジストログリカンとの間の特別な相互作用が示されており、原形質膜界面での直接的な分子相互作用が存在することから、心筋細胞膜上にＤＡＰ複合体を固定するＣＴドメインの直接的な役割が示されている［Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｐａｔｉａｌ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ ｔｈｅ Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ａｎｄ ｂｅｔａ－ｄｙｓｔｒｏｇｌｙｃａｎ ｉｎ ｃａｒｄｉａｃ ｍｕｓｃｌｅ ｓｕｐｐｏｒｔ ａ ｄｉｒｅｃｔ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ． Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ，１９９８．８２（１）：ｐ．８２－９３］。２７４人のデュシェンヌ型及びベッカー型筋ジストロフィー患者の研究におけるジストロフィンの遺伝子型と心臓の表現型の補正により、Ｎ末端アクチン結合ドメイン（ＡＢＤ１）及びＣＲドメイン＋ＣＴドメインが存在することで、心筋症のリスクが低下することが明らかとなり、更に、ジストロフィンタンパク質のＣＴドメインの有益な心臓保護効果が指摘されている［Ｔａｎｄｏｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｇｅｎｏｔｙｐｅ－ｃａｒｄｉａｃ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ａｎｄ Ｂｅｃｋｅｒ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ｃａｒｄｉａｃ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ． Ａｍ Ｊ Ｃａｒｄｉｏｌ，２０１５．１１５（７）：ｐ．９６７－７１］。したがって、ｍｄｘマウスの骨格筋における、ＣＴドメインのコイルドコイルモチーフのヘリックス１を含有するマイクロジストロフィン遺伝子の過剰発現は、筋細胞膜に動員されるシグナル伝達タンパク質のモジュラーアダプターとして機能するＤＡＰ複合体のメンバーであるα１－シントロフィン及びα－ジストロブレビンの動員を増加させる［Ｋｏｏ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＡＡＶ２／９－ｍｉｃｒｏｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｇｅｎｅｓ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ ｈｅｌｉｘ １ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ ｍｏｔｉｆ ｉｎ ｔｈｅ Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｍｕｓｃｌｅ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｒｅｓｔｏｒｅｓ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ α１－ｓｙｎｔｒｏｐｈｉｎ ａｎｄ α－ｄｙｓｔｒｏｂｒｅｖｉｎ ｉｎ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅｓ ｏｆ ｍｄｘ ｍｉｃｅ． Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２０１１．２２（１１）：ｐ．１３７９－８８］。より長いバージョンのマイクロジストロフィンの過剰発現もまた、短いバージョンと比較して、ｍｄｘマウスの伸張性収縮による筋損傷に対する筋肉耐性を改善した［Ｋｏｏ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．２０１１、上掲］。
ＤＭＤ患者では心機能が著しく低下した状態が持続することがわかっている。神経性一酸化窒素合成酵素（ｎＮＯＳ）機能を回復させる治療は、心機能を改善させることによって有益であると考えられ、収縮期血圧、短縮率及び駆出率の大幅な改善ならびに心筋線維化の減少につながる。心筋線維化の進行は、まず患者が左心室（ＬＶ）の拡張及び肥大を示し、それが拡張型心筋症（ＤＣＭ）として知られる段階へ進行することで示される。
ジストロフィンのＣＴドメインは、ロッドドメインと同様のα－ヘリカルコイルドコイルを形成することが予想される２つのポリペプチドストレッチを含有する（以下の表１の配列番号１６において一重下線によって示されるＨ１及び二重下線によって示されるＨ２を参照されたい）。各コイルドコイルは、ロイシンジッパーにみられるものと同様の保存的繰り返しヘプタッド（ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆ，ｇ）ｎを有し、「ｄ」の位置にロイシンが優位に存在する。このドメインは、ＣＣ（コイルドコイル）ドメインと呼ばれている。ジストロフィンのＣＣ領域は、ジストロブレビンの結合部位を形成し、α１－シントロフィンと他のジストロフィン関連タンパク質との間の相互作用を調節し得る。
シントロフィンアイソフォームであるα１－シントロフィンとβ１－シントロフィンはいずれもジストロフィンエクソン７３及び７４の２つ以上の結合部位を介してジストロフィンと直接相互作用すると考えられる（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ，ＪＢＣ ２７０（１０）：４９７５－８（１９９５））。α１－シントロフィン及びβ１－シントロフィンは、ジストロフィンＣ末端ドメインに別々に結合し、α１－シントロフィンの結合部位は、少なくともアミノ酸残基３４４７～３４８１内に存在し、β１－シントロフィンの結合部位は、アミノ酸残基３４９５～３５３５内に存在する（表１、配列番号１６、イタリック体）。アルファ１－（α１－）シントロフィン及びアルファ－シントロフィンは、本明細書中、区別なく使用される。
マイクロジストロフィン遺伝子カセットのＣ末端（ＣＴ）ドメインにあるコイルドコイルモチーフのヘリックス１（以下の表１の配列番号１６のうちで一重下線が引かれた配列として示されているＨ１を参照されたい）は、心筋細胞保護及び別様にジストロフィン関連（糖）タンパク質（ＤＡＰ）複合体（ＤＡＰＣ）の安定化に有利であり得る。ＤＡＰＣは、構造的な役割だけでなく、重要なシグナル伝達の役割にも関与し得る。確かに、一酸化窒素（ＮＯ）の生成の変化、ならびにこの複合体の不安定化及び消失によって生じる他の機能の変化の可能性が指摘されている。
予想外にも、本明細書で開示されるある特定のマイクロジストロフィンコンストラクトは、アルファ－シントロフィン、アルファ－ジストロブレビン及びベータ－ジストログリカンだけでなく、ｎＮＯＳに結合し、ｎＮＯＳを動員することがわかった。ジストロフィンＣ末端ドメインのｎＮＯＳへの結合を含むマイクロジストロフィンコンストラクトの文脈において、ｎＮＯＳへの結合とは、筋肉組織で発現されたマイクロジストロフィンコンストラクトを適切な抗体で免疫染色することで、アルファ－シントロフィン、アルファ－ジストロブレビン、及びｎＮＯＳのそれぞれが形質導入された筋肉組織の切片中の筋鞘上または筋鞘近くで同定されることによって決定されることを意味する。以下のセクション６．５及び６．７の実施例５及び７を参照されたい。ある特定の実施形態において、マイクロジストロフィンタンパク質は、Ｃ末端ドメインを含有しない同等のマイクロジストロフィン（それ以外は同じアミノ酸配列であり、すなわち、「参照マイクロジストロフィンタンパク質」である）と比較して、α１－シントロフィン、β－シントロフィン及び／またはジストロブレビンへの「結合を増加させる」Ｃ末端ドメインを有し、これは、α１－シントロフィン、β－シントロフィン、α－ジストロブレビン、β－ジストログリカンまたはｎＮＯＳを含む１つ以上のＤＡＰＣ構成要素に関する筋肉切片の免疫染色または筋肉組織溶解物もしくは筋膜調製物のウェスタンブロット解析によって、筋膜中の１つ以上のＤＡＰＣ構成要素が、Ｃ末端ドメインを有するマイクロジストロフィンで処置したｍｄｘマウス筋肉において、参照マイクロジストロフィンタンパク質（Ｃ末端ドメインを有しないこと以外は同じ配列及びジストロフィン構成要素を有する）で処理したｍｄｘマウス筋肉と比較してより大きいレベルであることによって決定されるように、Ｃ末端ドメインを有しない（それ以外はマイクロジストロフィンと同じアミノ酸配列を有する）参照マイクロジストロフィンよりも、ＤＡＰＣが大きな程度で筋鞘に安定化または固定化されることを意味する（以下のセクション６．５及び６．７参照）。
いくつかの実施形態において、ジストロフィンのＣ末端ドメインを含むマイクロジストロフィンコンストラクトは、Ｃ末端ドメインにシントロフィン結合部位及び／またはジストロブレビン結合部位を含む。いくつかの実施形態において、α１－シントロフィン結合部位を含むＣ末端ドメインは、切断型Ｃ末端ドメインである。ある特定の実施形態において、切断型Ｃ末端ドメインのアミノ酸配列は、配列番号８３である。ある特定の実施形態において、切断型Ｃ末端ドメインは、アミノ酸配列ＭＥＮＳＮＧＳＹＬＮＤＳＩＳＰＮＥＳＩＤＤＥＨＬＬＩＱＨＹＣＱＳＬＮＱ（α１－シントロフィン結合部位）（配列番号８４）を含む。ある特定の実施形態において、切断型Ｃ末端ドメインは、α１－シントロフィン結合部位を含み、その結合部位は、アミノ酸配列ＭＥＮＳＮＧＳＹＬＮＤＳＩＳＰＮＥＳＩＤＤＥＨＬＬＩＱＨＹＣＱＳＬＮＱ（配列番号８４）を有するが、β１－シントロフィンまたはジストロブレビン結合部位を有しない。
本開示のマイクロジストロフィンコンストラクトは、マイクロジストロフィンコンストラクトの投与後における、心筋マクロファージ濃度の減少、接着分子の発現の減少、及び／または心電図（ＥＣＧ）測定値、例えば、収縮末期容積（左心室）、拡張末期容積、一回拍出量、駆出率、心拍数、もしくは心拍出量の正常化によって測定されるように、進行性の心室線維化を更に防止し得る。収縮末期容積及び他の心臓測定値は、ＭＲＩ（磁気共鳴断層撮影）、心臓ＣＴ（コンピュータ断層撮影）またはＳＰＥＣＴ（単一光子放射コンピュータ断層撮影）を使用して測定することもできる。本発明のマイクロジストロフィンコンストラクトの投与後における心機能の改善は、ＤＢＡ／２Ｊ－ｍｄｘマウスモデルで試験することもできる。
したがって、本明細書に記載される実施形態は、コイルドコイルモチーフのヘリックス１を含むＣＴドメインの全てまたは一部を更に含み得る。例えば、マイクロジストロフィンタンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端へ：ＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴ（例えば、配列番号１、７９または９１）またはＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ１６－Ｒ１７－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴ（例えば、配列番号９２）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＴは、図１４に示されるように、α１－シントロフィン結合部位及び／またはジストロブレビン結合部位を含むジストロフィンのＣ末端ドメインの少なくとも一部である。ある特定の実施形態において、ＣＴドメインは、α１－シントロフィン結合部位を含み、β１－シントロフィンまたはジストロブレビン結合部位を有さず、例えば、配列番号８３のアミノ酸配列を有し、部分的には、α１－シントロフィンを介してｎＮＯＳを筋鞘に動員及び固定するように機能する。いくつかの実施形態において、ＣＴは、配列番号１６または８３のアミノ酸配列を含む。
マイクロジストロフィン実施形態は、次に示されるように、ドメインを接続するリンカー（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ４．１及び／またはＬ４．２）またはその一部を更に含み得る：ＡＢＤ１－Ｌ１－Ｈ１－Ｌ２－Ｒ１－Ｒ２－Ｌ３－Ｒ３－Ｈ３－Ｌ４－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴ（例えば、配列番号１、７９、または９１）、ＡＢＤ１－Ｌ１－Ｈ１－Ｌ２－Ｒ１－Ｒ２－Ｌ３－Ｒ３－Ｈ３－Ｌ４－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ（例えば、配列番号２）、ＡＢＤ１－Ｌ１－Ｈ１－Ｌ２－Ｒ１－Ｒ２－Ｌ３－Ｒ１６－Ｌ４．１－Ｒ１７－Ｌ４．２－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ（例えば、配列番号９２）、またはＡＢＤ１－Ｌ１－Ｈ１－Ｌ２－Ｒ１－Ｒ２－Ｌ３－Ｒ１６－Ｌ４．１－Ｒ１７－Ｌ４．２－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴ（例えば、配列番号９３）。Ｌ１は、ＡＢＤ１をＨ１に連結することができる内因性リンカーＬ１（例えば、配列番号４）であり得る。Ｌ２は、Ｈ１をＲ１に連結することができる内因性リンカーＬ２（例えば、配列番号６）であり得る。Ｌ３は、Ｒ２をＲ３またはＲ１６に連結することができる内因性リンカーＬ３（例えば、配列番号９）であり得る。
Ｌ４もまた、Ｈ３及びＲ２４を連結することができる内因性リンカーであり得る。いくつかの実施形態において、Ｌ４は、３アミノ酸、例えば、天然型ジストロフィン配列においてＲ２４に先行するＴＬＥ（配列番号１２）である。他の実施形態において、Ｌ４は、天然型ジストロフィン配列においてＲ２４に先行する４アミノ酸（配列番号１７）またはＲ２４に先行する２アミノ酸（配列番号１８）であり得る。他の実施形態において、Ｈ３とＲ２４との間には、Ｌ４または別のリンカーは存在しない。Ｈ３の５’末端には、上記のように、リンカーは存在せず、むしろ、Ｒ３は、Ｈ３または代替的としてＨ２に直接連結される。
Ｌ４．１は、Ｒ１６及びＲ１７を連結することができる内因性リンカーであり得る。いくつかの実施形態において、Ｌ４．１は、２アミノ酸、例えば、天然型ジストロフィン配列においてＲ１７に先行するＳＶ（配列番号１１０）である。他の実施形態において、Ｌ４．２は、Ｒ１７及びＲ２４を連結することができる内因性リンカーまたは内因性リンカーの一部分であり得る。いくつかの実施形態において、Ｌ４．２は、４アミノ酸、例えば、Ｒ１７に続くＱ及びＲ２４に先行するＴＬＥ（配列番号１２）である（配列番号８９）。
特に記載されていないマイクロジストロフィンの他のドメインの上記の構成要素は、以下の表１に提供されるアミノ酸配列を有し得る。本明細書で提供されるドメインのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ１１５３２（ＤＭＤ＿ＨＵＭＡＮ）のジストロフィンアイソフォームに対応し、これは、参照により本明細書に援用される。他の実施形態は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ａ０Ａ０７５Ｂ６Ｇ３（Ａ０Ａ０７５Ｂ６Ｇ３＿ＨＵＭＡＮ）（参照により本明細書に援用される）などの、当該技術分野において知られている天然に存在する機能的ジストロフィンアイソフォームに由来するドメインを含み得、例えば、Ｒ２４は、配列番号１３のアミノ酸３のＱに置換されたＲを有する。
Figure 2023503637000002
Figure 2023503637000003
Figure 2023503637000004
本開示はまた、各ドメイン及びリンカーの機能が実質的に維持され、及び／またはこれらのバリアントを含むマイクロジストロフィンの治療効果が実質的に維持される限り、そのような配列のバリアントも企図する。機能活性には、（１）アクチン、β－ジストログリカン、α１－シントロフィン、α－ジストロブレビン、及びｎＮＯＳのうちの１つ、それらの組み合わせ、もしくはその全てへの結合；（２）動物モデル（例えば、本明細書に記載されるｍｄｘマウスモデル）もしくはヒト対象における筋機能の改善；及び／または（３）動物モデルもしくはヒト患者における心筋機能の心臓保護もしくは改善が含まれる。特に、マイクロジストロフィンは、配列番号３または配列番号３に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＡＢＤ；配列番号５または配列番号５に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＨ１；配列番号７または配列番号７に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＲ１；配列番号８または配列番号８に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＲ２；配列番号１９または配列番号１９に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＨ２；配列番号１１または配列番号１１に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＨ３；配列番号１３または配列番号１３に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＲ２４；配列番号１４または配列番号１４に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＨ４；配列番号１５もしくは９０または配列番号１５もしくは９０に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＣＲ；配列番号１６もしくは８３または配列番号１６もしくは８３に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＣＴ、あるいは配列番号８４を含むＣＴを含み得る。代替的な実施形態は、Ｈ３ドメインが、配列番号１９または配列番号１９に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなるＨ２ドメインによって置き換えられていることを除いて前述と同様であり、同様に機能活性を有するマイクロジストロフィンをコードするものである。前述に加えて、マイクロジストロフィンは、上記の位置に、次の配列を含むか、またはそれらからなるリンカーを含み得る：配列番号４または配列番号４に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＬ１；配列番号６または配列番号６に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＬ２；配列番号９または配列番号９に対して少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列またはＬ３の両方の残基に保存的置換を有するバリアントからなるＬ３；及び配列番号１２、１７、もしくは１８または配列番号１２、１７、もしくは１８に対して少なくとも５０％、少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＬ４。
特に、マイクロジストロフィンは、配列番号３または配列番号３に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＡＢＤ；配列番号５または配列番号５に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＨ１；配列番号７または配列番号７に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＲ１；配列番号８または配列番号８に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＲ２；配列番号８６または配列番号８６に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＲ１６；配列番号８７または配列番号８７に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＲ１７；配列番号１３または配列番号１３に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＲ２４；配列番号１４または配列番号１４に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＨ４；配列番号１５もしくは９０または配列番号１５もしくは９０に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＣＲ；配列番号１６もしくは８３または配列番号１６もしくは８３に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＣＴ、あるいは配列番号８４を含むＣＴを含み得る。前述に加えて、マイクロジストロフィンは、上記の位置に、次の配列を含むか、またはそれらからなるリンカーを含み得る：配列番号４または配列番号４に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＬ１；配列番号６または配列番号６に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＬ２；配列番号９または配列番号９に対して少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列またはＬ３の両方の残基に保存的置換を有するバリアントからなるＬ３；配列番号１１０または配列番号１１０に対して少なくとも５０％、少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＬ４．１；及び配列番号８９または配列番号８９に対して少なくとも５０％、少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＬ４．２。
表２は、本開示に係るマイクロジストロフィン実施形態のアミノ酸配列を提供する。また、他の実施形態は、配列番号１、２、７９、９１、９２、または９３によって定義されるマイクロジストロフィンの置換バリアントであることが企図される。例えば、保存的置換を配列番号１、２、７９、９１、９２、または９３に行い、その機能活性を実質的に維持することができる。実施形態において、マイクロジストロフィンは、配列番号１、２、７９、９１、９２、または９３のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有し、例えば、以下のセクション５．４に開示されるｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイまたは動物モデルでのｉｎ ｖｉｖｏアッセイのうちの１つ以上によって決定されるように、機能的なマイクロジストロフィン活性を維持し得る。
Figure 2023503637000005
Figure 2023503637000006
Figure 2023503637000007
Figure 2023503637000008
Figure 2023503637000009
Figure 2023503637000010
Figure 2023503637000011
５．２．２ マイクロジストロフィンをコードする核酸組成物
本開示の別の態様は、本明細書に記載されるマイクロジストロフィンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸である。そのような核酸は、Ｎ末端からＣ末端へ次のように配置されているドメインを有するマイクロジストロフィンをコードするヌクレオチド配列を含む：ＡＢＤ１－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴ、ＡＢＤ１－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ、ＡＢＤ１－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ１６－Ｒ１７－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴ、またはＡＢＤ１－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ１６－Ｒ１７－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ。ヌクレオチド配列は、ドメインをコードする任意のヌクレオチド配列であり得る。ヌクレオチド配列は、適切な状況における発現のために、コドン最適化及び／またはＣｐＧアイランドの除去がなされ得る。特定の実施形態において、ヌクレオチド配列は、配列番号１、２、７９、９１、９２、または９３のアミノ酸配列を有するマイクロジストロフィンをコードする。ヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号７９、配列番号９１、配列番号９２、または配列番号９３のマイクロジストロフィンを含むマイクロジストロフィンをコードする任意の配列であり得、ヌクレオチド配列は、コードの縮重により変動し得る。表３及び４は、ＤＭＤドメインをコードする例示的なヌクレオチド配列を提供する。以下の通り、表３は、構成要素の野生型ＤＭＤヌクレオチド配列を提供し、表４は、コドン最適化及び／またはＣｐＧアイランドのＣｐＧ除去がなされた配列を含む、本明細書のコンストラクトに使用されるＤＭＤ構成要素のヌクレオチド配列を提供する。
Figure 2023503637000012
Figure 2023503637000013
Figure 2023503637000014
Figure 2023503637000015
Figure 2023503637000016
Figure 2023503637000017
Figure 2023503637000018
Figure 2023503637000019
Figure 2023503637000020
Figure 2023503637000021
いくつかの実施形態において、そのような組成物は、機能活性を有するマイクロジストロフィンをコードする、配列番号２２、または配列番号２２に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなるＡＢＤ１をコードする核酸配列；配列番号２４、または配列番号２４に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなるＨ１をコードする核酸配列；配列番号２６、または配列番号２６に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなるＲ１をコードする核酸配列；配列番号２７、または配列番号２７に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなるＲ２をコードする核酸配列；配列番号２９、または配列番号２９に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなるＲ３をコードする核酸配列；配列番号３０、または配列番号３０に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなるＨ３をコードする核酸配列；配列番号３２、または配列番号３２に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなるＲ２４をコードする核酸配列；配列番号３３、または配列番号３３に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなるＨ４をコードする核酸配列；配列番号３４もしくは１０９、または配列番号３４もしくは１０９に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなるＣＲをコードする核酸配列；及び／または配列番号３５、または配列番号３５に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなるＣＴをコードする核酸配列を含む。代替的な実施形態は、Ｈ３核酸配列が、配列番号３８、または配列番号３８に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなるＨ２をコードする核酸によって置き換えられていることを除いて前述と同様であり、同様に機能活性を有するマイクロジストロフィンをコードするものである。
いくつかの実施形態において、そのような組成物は、配列番号２２または配列番号２２に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、配列番号３のＡＢＤ１ドメインをコードする、ＡＢＤ１をコードする核酸配列；配列番号２４または配列番号２４に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、配列番号５のＨ１ドメインをコードする、Ｈ１をコードする核酸配列；配列番号２６または配列番号２６に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、配列番号７のＲ１ドメインをコードする、Ｒ１をコードする核酸配列；配列番号２７または配列番号２７に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、配列番号８のＲ２ドメインをコードする、Ｒ２をコードする核酸配列；配列番号２９または配列番号２９に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、配列番号１０のＲ３ドメインをコードする、Ｒ３をコードする核酸配列；配列番号３０または配列番号３０に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、配列番号１１のＨ３ドメインをコードする、Ｈ３をコードする核酸配列；配列番号３２または配列番号３２に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、配列番号１３のＲ２４ドメインをコードする、Ｒ２４をコードする核酸配列；配列番号３３または配列番号３３に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、配列番号１４のＨ４ドメインをコードする、Ｈ４をコードする核酸配列；配列番号３４もしくは１０９または配列番号３４もしくは１０９に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、配列番号１５または９０のＣＲドメインをコードする、ＣＲをコードする核酸配列；及び／または配列番号３５もしくは８０または配列番号３５もしくは８０に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、配列番号１６または８３のＣＴドメインをコードする、ＣＴをコードする核酸配列を含む。代替的な実施形態は、Ｈ３核酸配列が、配列番号３８または配列番号３８に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、配列番号１９のＨ２ドメインをコードする、Ｈ２をコードする核酸によって置換されていることを除いて、前述と同じである。
前述に加えて、核酸組成物は、上記の位置に、次の配列を含むか、またはそれらからなるリンカーをコードするヌクレオチド配列を任意選択により含み得る：配列番号２３または配列番号２３に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列からなるＬ１をコードする（例えば、配列番号４のＬ１ドメインをコードする）核酸配列；配列番号２５または配列番号２５に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列からなるＬ２をコードする（例えば、配列番号６のＬ２ドメインをコードする）核酸配列；配列番号２８または配列番号２８に対して少なくとも５０％の同一性を有する配列からなるＬ３をコードし、配列番号９のＬ３ドメインまたはＬ３の両方の残基に保存的置換を有するバリアントをコードする核酸配列；及び配列番号３１、３６、もしくは３７または配列番号３１、３６、もしくは３７に対して少なくとも５０％、少なくとも７５％の配列同一性を有する配列からなるＬ４をコードする（例えば、配列番号１２、１７、もしくは１８のＬ４ドメインまたはＬ４残基のいずれかに保存的置換を有するバリアントをコードする）核酸配列。
いくつかの実施形態において、そのような組成物は、機能活性を有するマイクロジストロフィンをコードする、配列番号２２、または配列番号２２に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなるＡＢＤ１をコードする核酸配列；配列番号２４、または配列番号２４に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなるＨ１をコードする核酸配列；配列番号２６、または配列番号２６に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなるＲ１をコードする核酸配列；配列番号２７、または配列番号２７に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなるＲ２をコードする核酸配列；配列番号９４、または配列番号９４に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなるＲ１６をコードする核酸配列；配列番号９５、または配列番号９５に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなるＲ１７をコードする核酸配列；配列番号３２、または配列番号３２に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなるＲ２４をコードする核酸配列；配列番号３３、または配列番号３３に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなるＨ４をコードする核酸配列；配列番号３４もしくは１０９、または配列番号３４もしくは１０９に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなるＣＲをコードする核酸配列；及び／または配列番号３５、または配列番号３５に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなるＣＴをコードする核酸配列を含む。代替的な実施形態は、Ｈ３核酸配列が、配列番号３８、または配列番号３８に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなるＨ２をコードする核酸によって置き換えられていることを除いて前述と同様であり、同様に機能活性を有するマイクロジストロフィンをコードするものである。
いくつかの実施形態において、そのような組成物は、配列番号２２または配列番号２２に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、配列番号３のＡＢＤ１ドメインをコードする、ＡＢＤ１をコードする核酸配列；配列番号２４または配列番号２４に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、配列番号５のＨ１ドメインをコードする、Ｈ１をコードする核酸配列；配列番号２６または配列番号２６に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、配列番号７のＲ１ドメインをコードする、Ｒ１をコードする核酸配列；配列番号２７または配列番号２７に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、配列番号８のＲ２ドメインをコードする、Ｒ２をコードする核酸配列；配列番号９４または配列番号９４に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、配列番号８６のＲ１６ドメインをコードする、Ｒ１６をコードする核酸配列；配列番号９５または配列番号９５に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、配列番号８７のＲ１７ドメインをコードする、Ｒ１７をコードする核酸配列；配列番号３２または配列番号３２に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、配列番号１３のＲ２４ドメインをコードする、Ｒ２４をコードする核酸配列；配列番号３３または配列番号３３に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、配列番号１４のＨ４ドメインをコードする、Ｈ４をコードする核酸配列；配列番号３４もしくは１０９または配列番号３４もしくは１０９に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、配列番号１５または９０のＣＲドメインをコードする、ＣＲをコードする核酸配列；及び／または配列番号３５もしくは８０または配列番号３５もしくは８０に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、配列番号１６または８３のＣＴドメインをコードする、ＣＴをコードする核酸配列を含む。代替的な実施形態は、Ｈ３核酸配列が、配列番号３８または配列番号３８に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、配列番号１９のＨ２ドメインをコードする、Ｈ２をコードする核酸によって置換されていることを除いて、前述と同じである。
前述に加えて、核酸組成物は、上記の位置に、次の配列を含むか、またはそれらからなるリンカーをコードするヌクレオチド配列を任意選択により含み得る：配列番号２３または配列番号２３に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列からなるＬ１をコードする（例えば、配列番号４のＬ１ドメインをコードする）核酸配列；配列番号２５または配列番号２５に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列からなるＬ２をコードする（例えば、配列番号６のＬ２ドメインをコードする）核酸配列；配列番号２８または配列番号２８に対して少なくとも５０％の同一性を有する配列からなるＬ３をコードし、配列番号９のＬ３ドメインまたはＬ３の両方の残基に保存的置換を有するバリアントをコードする核酸配列；配列番号１２５または配列番号１２５に対して少なくとも５０％、少なくとも７５％の配列同一性を有する配列からなるＬ４．１をコードする（例えば、配列番号１１０のＬ４．１ドメインまたはＬ４．１残基のいずれかに保存的置換を有するバリアントをコードする）核酸配列；及び配列番号１２６または配列番号１２６に対して少なくとも５０％、少なくとも７５％の配列同一性を有する配列からなるＬ４．２（例えば、配列番号８９のＬ４．２ドメインまたはＬ４．２残基のいずれかに保存的置換を有するバリアントをコードする）核酸配列。
種々の実施形態において、核酸は、配列番号１、配列番号２、配列番号７９、配列番号９１、配列番号９２、または配列番号９３のアミノ酸配列を有するマイクロジストロフィンをコードするヌクレオチド配列を含む。実施形態において、核酸は、配列番号２０、配列番号２１、配列番号８１、配列番号１０１、配列番号１０２、または配列番号１０３であるヌクレオチド配列を含む（それぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号７９、配列番号９１、配列番号９２、及び配列番号９３のマイクロジストロフィンをコードする）。種々の実施形態において、マイクロジストロフィンをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２０、２１、８３、１０１、１０２、もしくは１０３のヌクレオチド配列（表５）またはそれらの逆相補鎖に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有し、治療上効果的なマイクロジストロフィンをコードし得る。
Figure 2023503637000022
Figure 2023503637000023
Figure 2023503637000024
Figure 2023503637000025
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５．２．２．１コドン最適化及びＣｐＧ除去
一態様において、マイクロジストロフィンカセットをコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化ならびにＣｐＧジヌクレオチド及びＣｐＧアイランドの除去によって改変される。マイクロジストロフィン導入遺伝子に対する免疫応答は、最初のデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）遺伝子治療臨床試験及びイヌ科動物モデルにおけるいくつかのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）－ミニジストロフィン遺伝子治療で実証されたように、ヒト臨床用途における懸念事項である［Ｍｅｎｄｅｌｌ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ’ｓ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，２０１０．３６３（１５）：ｐ．１４２９－３７；ａｎｄ Ｋｏｒｎｅｇａｙ，Ｊ．Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ｍｕｓｃｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｎ ＡＡＶ９ ｈｕｍａｎ ｍｉｎｉ－ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｖｅｃｔｏｒ ａｆｔｅｒ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｎｅｏｎａｔａｌ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｄｏｇｓ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，２０１０．１８（８）：ｐ．１５０１－８］。
ＡＡＶによる免疫応答は、ＡＡＶゲノム中のＣｐＧジヌクレオチドの数を減らすことによって抑制することができる［Ｆａｕｓｔ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，ＣｐＧ－ｄｅｐｌｅｔｅｄ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｅｖａｄｅ ｉｍｍｕｎｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，２０１３．１２３（７）：ｐ．２９９４－３００１］。導入遺伝子配列からＣｐＧモチーフを除去することで、導入遺伝子を非自己と認識した際の自然免疫の活性化におけるＴＬＲ９の役割が減少することから、安定的かつ長期間の導入遺伝子発現がもたらされ得る。［Ｗａｎｇ，Ｄ．，Ｐ．Ｗ．Ｌ．Ｔａｉ，ａｎｄ Ｇ．Ｇａｏ，Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ａｓ ａ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｄｅｌｉｖｅｒｙ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ，２０１９．１８（５）：ｐ．３５８－３７８．；及びＲａｂｉｎｏｗｉｔｚ，Ｊ．，Ｙ．Ｋ．Ｃｈａｎ，ａｎｄ Ｒ．Ｊ．Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）ｖｅｒｓｕｓ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ． Ｖｉｒｕｓｅｓ，２０１９．１１（２）も参照されたい］。実施形態において、マイクロジストロフィンカセットは、ＣｐＧ除去とともにヒトコドン最適化される。コドン最適化及びＣｐＧ除去がなされたヌクレオチド配列は、例えば、ＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒを活用するＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＧｅｎｅＡｒｔ Ｇｅｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓツール（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ ＵＳＡ））を含む当該技術分野において知られている任意の方法によって設計され得る。本明細書に記載される配列番号２０、２１、５７～７２、８０、８１、及び１０１～１０３のヌクレオチド配列は、コドン最適化及びＣｐＧ除去がなされた配列を表す。
ＣｐＧジヌクレオチド配列の数を減らすことで、その結果として、ＣｐＧアイランドの数を減少させた、マイクロジストロフィン導入遺伝子が提供される。ある特定の実施形態において、マイクロジストロフィンヌクレオチド配列は、ふたつ（２）未満のＣｐＧアイランド、またはひとつ（１）のＣｐＧアイランド、またはゼロ（０）のＣｐＧアイランドを有する。実施形態において、抗薬物抗体価によって測定した場合、２を超えるＣｐＧアイランドを有するマイクロジストロフィン導入遺伝子と比較して免疫原性が低下した、２未満もしくは１のＣｐＧアイランド、または０のＣｐＧアイランドを有するマイクロジストロフィン導入遺伝子が提供される。ある特定の実施形態において、配列番号２０、２１、８１、１０１、１０２または１０３から基本的になるマイクロジストロフィンヌクレオチド配列は、ゼロ（０）のＣｐＧアイランドを有する。他の実施形態において、プロモーターに作動可能に連結されたマイクロジストロフィン遺伝子から基本的になるマイクロジストロフィン導入遺伝子のヌクレオチド配列は、ふたつ（２）未満のＣｐＧアイランドを有し、ここで、マイクロジストロフィンは、配列番号２０、２１、８１、１０１、１０２または１０３からなる。更なる他の実施形態において、プロモーターに作動可能に連結されたマイクロジストロフィン遺伝子から基本的になるマイクロジストロフィン導入遺伝子のヌクレオチド配列は、ひとつ（１）のＣｐＧアイランドを有し、ここで、マイクロジストロフィンは、配列番号２０、２１、８１、１０１、１０２または１０３からなる。
５．３．遺伝子カセット及び調節エレメント
本発明の別の態様は、マイクロジストロフィンの発現を付与または増強するように設計された調節エレメントを含む核酸発現カセットに関する。本発明は、プロモーターエレメント、また、任意選択により、エンハンサーエレメント及び／またはイントロンを含む、導入遺伝子の発現を増強または促進するための調節エレメントを更に含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターはまた、対象の標的細胞内において、核酸（導入遺伝子）によってコードされるＲＮＡ及び／またはタンパク質生成物の発現に影響を与えることが当業者に知られている調節制御エレメントを含む。調節制御エレメントは、組織特異的であり得、すなわち、標的細胞／組織においてのみ活性であり得る（または実質的により活性が高いもしくは著しく活性が高い）。
５．３．１ プロモーター
５．３．１．１ 組織特異的プロモーター
特定の実施形態において、ＡＡＶベクターの発現カセットは、標的組織での発現を可能にする、導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターなどの調節配列を含む。プロモーターは、構成的プロモーター、例えば、ＣＢ７プロモーターであり得る。追加のプロモーターには、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＭＭＴプロモーター、ＥＦ－１アルファプロモーター（配列番号１１８）、ＵＢ６プロモーター、ニワトリベータ－アクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター（配列番号１１６）、ＲＰＥ６５プロモーター、オプシンプロモーター、ＴＢＧ（チロキシン結合グロブリン）プロモーター、ＡＰＯＡ２プロモーター、ＳＥＲＰＩＮＡ１（ｈＡＡＴ）プロモーター、またはＭＩＲ１２２プロモーターが含まれる。いくつかの実施形態において、特に導入遺伝子発現をオフにすることが望ましい場合、誘導性プロモーター、例えば、低酸素誘導性またはラパマイシン誘導性プロモーターが使用される。
ある特定の実施形態において、プロモーターは、筋特異的プロモーターである。「筋特異的」、「筋選択的」または「筋指向的」という文言は、核酸要素であって、その活性を、かかる要素と筋肉細胞の細胞内環境との相互作用により、筋肉細胞または組織に適応させた核酸要素を指す。そのような筋肉細胞には、筋細胞、筋管細胞、心筋細胞などが含まれ得る。心筋細胞、骨格細胞、及び平滑筋細胞などの明確に異なる特性を持つ筋細胞の特殊な形態も含まれる。様々な治療が導入遺伝子の筋特異的発現から利益を得ると思われる。特に、筋肉細胞に送達され、高い形質導入効率を可能にする、様々な形態の筋ジストロフィーを治療する遺伝子治療は、導入遺伝子が最も必要とされる細胞において、導入遺伝子の発現を誘導するという追加の利点を有する。心臓組織もまた導入遺伝子の筋指向性発現から利益を得るであろう。筋特異的プロモーターは、本発明の導入遺伝子に作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態において、筋特異的プロモーターは、ＳＰｃ５－１２プロモーター、筋肉クレアチンキナーゼミオシン軽鎖（ＭＬＣ）プロモーター、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）プロモーター、デスミンプロモーター（配列番号１１９）、ＭＨＣＫ７プロモーター（配列番号１２０）、ＣＫ６プロモーター、ＣＫ８プロモーター（配列番号１１５）、ＭＣＫプロモーター（またはその切断型）（配列番号１２１）、アルファアクチンプロモーター、ベータアクチンプロモーター、ガンマアクチンプロモーター、Ｅ－ｓｙｎプロモーター、心筋トロポニンＣプロモーター、トロポニンＩプロモーター、ｍｙｏＤ遺伝子ファミリープロモーター、または眼球型Ｐｉｔｘ３のイントロン１内に存在する筋選択的プロモーターから選択される。
ＳＰｃ５－１２プロモーターとして知られる合成プロモーターｃ５－１２（Ｌｉ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１７，ｐｐ．２４１－２４５，ＭＡＲＣＨ １９９９）は、細胞種に制限された発現、特に筋肉細胞に特異的な発現を有することがわかっている。ＳＰｃ５－１２プロモーターは、長さが３５０ｂｐ未満であり、ほとんどの内因性プロモーターよりも長さが短く、治療用タンパク質をコードする核酸の長さが比較的長い場合、有利になり得る。実施形態において、ＳＰｃ５－１２プロモーター（配列番号３９）を有する遺伝子治療カセットが提供される。
ベクターの長さを更に短くするために、調節エレメントは、本明細書に記載されるプロモーターのいずれか１つの縮小型または短縮型（本明細書において「最小プロモーター」と称される）であってもよい。最小プロモーターは、少なくとも全長型の転写活性ドメインを含み、したがって、依然として発現を駆動することが可能である。例えば、いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、治療用タンパク質導入遺伝子に作動可能に連結された筋特異的プロモーターの転写活性ドメイン、例えば、最小ＳＰｃ５－１２プロモーター（例えば、配列番号４０）を含み得る。実施形態において、治療用タンパク質は、本明細書に記載されるマイクロジストロフィンである。本開示の最小プロモーターは、組織特異的な発現の調節に寄与するプロモーター配列の部分を含有してもよいし、含有しなくてもよい。
したがって、実施形態において、ＳＰｃ５－１２プロモーター（配列番号３９）を有する遺伝子治療カセットが提供される。実施形態において、筋肉細胞におけるマイクロジストロフィンの発現を誘導する最小プロモーターを含む遺伝子治療カセットが提供される。そのようなプロモーターの１つは、配列番号４０の最小ＳＰｃ５－１２プロモーターである。これらのプロモーターの配列は、表６に提供される。
Figure 2023503637000042
Figure 2023503637000043
Figure 2023503637000044
ある特定の実施形態において、プロモーターは、ＣＮＳ特異的プロモーターである。例えば、発現カセットは、神経特異エノラーゼ（ＮＳＥ）の遺伝子から単離されたプロモーター、ドーパミン－１受容体またはドーパミン－２受容体のプロモーターなどの任意の神経プロモーター、シナプシンプロモーター、ＣＢ７プロモーター（ニワトリβ－アクチンプロモーター及びＣＭＶエンハンサー）、ＲＳＶプロモーター、ＧＦＡＰプロモーター（グリア線維性酸性タンパク質）、ＭＢＰプロモーター（ミエリン塩基性タンパク質）、ＭＭＴプロモーター、ＥＦ－１α、Ｕ８６プロモーター、ＲＰＥ６５プロモーターまたはオプシンプロモーター、誘導性プロモーター、例えば、低酸素誘導性プロモーター、ならびにラパマイシン及び関連薬剤によって誘導されるプロモーターなどの薬物誘導性プロモーターから選択されるプロモーターを含み得る。
更に他の実施形態において、発現カセットは、マイクロジストロフィン導入遺伝子を含む発現カセットにタンデムに配置され得る複数のプロモーターを含み得る。したがって、タンデムまたはハイブリッドプロモーターは、発現を増強するために、及び／または複数の組織種に発現を誘導するために採用されてもよく（例えば、参照により本明細書に援用される、２０１９年８月１５日に公開されたＰＣＴ国際公開第ＷＯ２０１９１５４９３９Ａ１号を参照）、特に、２０２０年７月２４日に出願されたＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０４３５７８号に開示されている（参照により本明細書に援用される）ＬＭＴＰ６、ＬＭＴＰ１３、ＬＭＴＰ１４、ＬＭＴＰ１５、ＬＭＴＰ１８、ＬＭＴＰ１９、またはＬＭＴＰ２０が採用され得る。
５．３．２ イントロン
本開示の他の態様は、調節カセット内にイントロンを含むＡＡＶベクターに関する。実施例２は、マイクロジストロフィンコード配列の５’側ＶＨ４イントロンが適切なスプライシングを促進し、したがって、マイクロジストロフィン発現を促進することを示している。したがって、いくつかの実施形態において、イントロンは、マイクロジストロフィンタンパク質、例えば、ＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ、ＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴ、ＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ１６－Ｒ１７－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ、またはＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ１６－Ｒ１７－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴをコードする配列の５’末端に連結される。特に、イントロンは、アクチン結合ドメインに連結され得る。他の実施形態において、イントロンは、１００ヌクレオチド長未満である。
実施形態において、イントロンは、ＶＨ４イントロンである。ＶＨ４イントロン核酸は、以下の表７に示される配列番号４１を含み得る。
Figure 2023503637000045
他の実施形態において、イントロンは、ヒトβ－グロビン及びＩｇ重鎖に由来するキメライントロンである（β－グロビンスプライスドナー／免疫グロブリン重鎖スプライスアクセプターイントロン、またはβ－グロビン／ＩｇＧキメライントロンとしても知られる）（表７、配列番号７５）。ニワトリβ－アクチンイントロン、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）イントロン、ヒト第ＩＸ因子イントロン（例えば、ＦＩＸ切断型イントロン１）、β－グロビンスプライスドナー／免疫グロブリン重鎖スプライスアクセプターイントロン、アデノウイルススプライスドナー／免疫グロブリンスプライスアクセプターイントロン、ＳＶ４０後期スプライスドナー／スプライスアクセプター（１９Ｓ／１６Ｓ）イントロン（表７、配列番号７６）などの当業者によく知られている他のイントロンが採用されてもよい。
５．３．３ 他の調節エレメント
５．３．３．１ ポリＡ
本開示の別の態様は、マイクロジストロフィン導入遺伝子のコーディング領域の下流にポリアデニル化（ポリＡ）部位を含む発現カセットに関する。転写の終了を合図し、ポリＡテールの合成を誘導する任意のポリＡ部位は、本開示のＡＡＶベクターにおける使用に好適である。例示的なポリＡシグナルは、限定するものではないが、次に由来する：ＳＶ４０後期遺伝子、ウサギβ－グロビン遺伝子、ウシ成長ホルモン（ＢＰＨ）遺伝子、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）遺伝子、及び合成ポリＡ（ＳＰＡ）部位。一実施形態において、ポリＡシグナルは、表８に示す配列番号４２を含む。
Figure 2023503637000046
５．３．４ ウイルスベクター
本開示に係るマイクロジストロフィン導入遺伝子は、ヒト対象への遺伝子治療投与のためのＡＡＶベクターに含まれ得る。いくつかの実施形態において、組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターは、ＡＡＶウイルスカプシドと、ＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）によって挟まれた発現カセットを含むウイルスゲノムまたは人工ゲノムとを含み得、発現カセットは、ヒト筋肉またはＣＮＳ細胞における導入遺伝子の発現を制御してマイクロジストロフィンを発現及び送達するように１つ以上の調節配列に作動可能に連結されたマイクロジストロフィン導入遺伝子を含む。提供される方法は、本明細書に記載されるマイクロジストロフィンを送達するための任意の単離された組み換えＡＡＶ粒子の生産における使用、マイクロジストロフィンをコードする任意の単離された組み換えＡＡＶ粒子を含む組成物の生産における使用、またはマイクロジストロフィンによる治療に適した疾患もしくは障害を治療することを、それを必要とする対象に行うための方法であって、本明細書に記載されるマイクロジストロフィンをコードする任意の単離された組み換えＡＡＶ粒子の投与を含む、方法における使用に好適である。したがって、ｒＡＡＶは、当該技術分野において知られている任意の血清型、そのバリアント、改変体、ハイブリッド、もしくは誘導体、またはこれらの任意の組み合わせ（「血清型」と総称される）であり得る。特定の実施形態において、ＡＡＶ血清型は、筋肉組織に対する向性を有する。他の実施形態において、ＡＡＶ血清型は、ＣＮＳに対する向性を有する。他の実施形態において、ＡＡＶ血清型は、筋肉組織とＣＮＳの両方に対する向性を有する。また、他の実施形態において、ＡＡＶ血清型は、肝臓に対する向性を有し、この場合、ＡＡＶを形質導入した肝細胞は、マイクロジストロフィン分泌細胞のデポーを形成し、マイクロジストロフィンを循環中に分泌する。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６またはその誘導体、改変体、もしくはシュードタイプから選択されるＡＡＶ血清型に由来するカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ｒＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６、またはその誘導体、改変体、もしくはシュードタイプから選択されるＡＡＶカプシド血清型のＶＰ１、ＶＰ２及び／またはＶＰ３配列に対して少なくとも８０％以上同一、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％同一であるカプシドタンパク質を含む。
例えば、ｒＡＡＶ粒子の集団は、２つ以上の血清型を含み得、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６または他のｒＡＡＶ粒子のうちの２つ以上、あるいはこれらの２つ以上の組み合わせ）を含む。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、Ｚｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１２（６）：１０５６－１０６８に記載されるように、Ａｎｃ８０またはＡｎｃ８０Ｌ６５のカプシドを含み、当該文献は、その全体が参照により援用される。ある特定の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、米国特許第９，１９３，９５６号；同第９４５８５１７号；及び同第９，５８７，２８２号ならびに米国特許出願公開第２０１６／０３７６３２３号に記載されるように、次のアミノ酸挿入：ＬＧＥＴＴＲＰまたはＬＡＬＧＥＴＴＲＰのうちの１つを含むカプシドを含み、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に援用される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、米国特許第９，１９３，９５６号；同第９，４５８，５１７号；及び同第９，５８７，２８２号ならびに米国特許出願公開第２０１６／０３７６３２３号に記載されるように、ＡＡＶ．７ｍ８のカプシドを含み、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に援用される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、米国特許第９，５８５，９７１号に開示されているＡＡＶＰＨＰ．Ｂなどの任意のＡＡＶカプシドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、米国特許第９，８４０，７１９号及びＷＯ２０１５／０１３３１３に開示されているＡＡＶ．Ｒｈ７４及びＲＨＭ４－１などの任意のＡＡＶカプシドを含み、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に援用される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＷＯ２０１４／１７２６６９に開示されているＡＡＶ ｒｈ．７４などの任意のＡＡＶカプシドを含み、当該特許は、その全体が参照により本明細書に援用される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、Ｇｅｏｒｇｉａｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２３：８５７－８６２及びＧｅｏｒｇｉａｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２５：４５０に記載されるように、ＡＡＶ２／５のカプシドを含み、これらのそれぞれは、その全体が参照により援用される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＷＯ２０１７／０７０４９１に開示されているＡＡＶ２ｔＹＦなどの任意のＡＶカプシドを含み、当該特許は、その全体が参照により本明細書に援用される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、Ｐｕｚｚｏ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ． Ｍｅｄ．２９（９）：４１８に記載されるように、ＡＡＶＬＫ０３またはＡＡＶ３Ｂのカプシドを含み、この文献は、その全体が参照により援用される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、米国特許第８，６２８，９６６号；同第８，９２７，５１４号；同第９，９２３，１２０号及びＷＯ２０１６／０４９２３０に開示されているＨＳＣ１、ＨＳＣ２、ＨＳＣ３、ＨＳＣ４、ＨＳＣ５、ＨＳＣ６、ＨＳＣ７、ＨＳＣ８、ＨＳＣ９、ＨＳＣ１０、ＨＳＣ１１、ＨＳＣ１２、ＨＳＣ１３、ＨＳＣ１４、ＨＳＣ１５、またはＨＳＣ１６などの任意のＡＡＶカプシドを含み、これらのそれぞれは、その全体が参照により援用される。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、次の特許及び特許出願のいずれかに開示されているＡＡＶカプシドを含み、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に援用される：米国特許第７，２８２，１９９号；同第７，９０６，１１１号；同第８，５２４，４４６号；同第８，９９９，６７８号；同第８，６２８，９６６号；同第８，９２７，５１４号；同第８，７３４，８０９号；同第９，２８４，３５７号；同第９，４０９，９５３号；同第９，１６９，２９９号；同第９，１９３，９５６号；同第９４５８５１７号；及び同第９，５８７，２８２号；米国特許出願公開第２０１５／０３７４８０３号；同第２０１５／０１２６５８８号；同第２０１７／００６７９０８号；同第２０１３／０２２４８３６号；同第２０１６／０２１５０２４号；同第２０１７／００５１２５７号；ならびに国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３４７９９号；同第ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５３３３５号。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、次の特許及び特許出願のいずれかに開示されているＡＡＶカプシドのＶＰ１、ＶＰ２及び／またはＶＰ３配列に対して少なくとも８０％以上同一、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％同一であるカプシドタンパク質を有し、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に援用される：米国特許第７，２８２，１９９号；同第７，９０６，１１１号；同第８，５２４，４４６号；同第８，９９９，６７８号；同第８，６２８，９６６号；同第８，９２７，５１４号；同第８，７３４，８０９号；同第９，２８４，３５７号；同第９，４０９，９５３号；同第９，１６９，２９９号；同第９，１９３，９５６号；同第９４５８５１７号；及び同第９，５８７，２８２号；米国特許出願公開第２０１５／０３７４８０３号；同第２０１５／０１２６５８８号；同第２０１７／００６７９０８号；同第２０１３／０２２４８３６号；同第２０１６／０２１５０２４号；同第２０１７／００５１２５７号；ならびに国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３４７９９号；同第ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５３３３５号。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、国際出願公開第ＷＯ２００３／０５２０５１号（例えば、’０５１号の配列番号２参照）、同第ＷＯ２００５／０３３３２１号（例えば、’３２１号の配列番号１２３及び８８参照）、同第ＷＯ０３／０４２３９７号（例えば、’３９７号の配列番号２、８１、８５、及び９７参照）、同第ＷＯ２００６／０６８８８８号（例えば、’８８８号の配列番号１及び３～６参照）、同第ＷＯ２００６／１１０６８９号（例えば、’６８９号の配列番号５～３８参照）、同第ＷＯ２００９／１０４９６４号（例えば、’９６４号の配列番号１～５、７、９、２０、２２、２４及び３１参照）、同第ＷＯ２０１０／１２７０９７号（例えば、’０９７号の配列番号５～３８参照）、及び同第ＷＯ２０１５／１９１５０８号（例えば、’５０８号の配列番号８０～２９４参照）、ならびに米国出願公開第２０１５００２３９２４号（例えば、’９２４号の配列番号１、５～１０参照）に開示されているカプシドタンパク質を有し、これらの内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、国際出願公開第ＷＯ２００３／０５２０５１号（例えば、’０５１号の配列番号２参照）、同第ＷＯ２００５／０３３３２１号（例えば、’３２１号の配列番号１２３及び８８参照）、同第ＷＯ０３／０４２３９７号（例えば、’３９７号の配列番号２、８１、８５、及び９７参照）、同第ＷＯ２００６／０６８８８８号（例えば、’８８８号の配列番号１及び３～６参照）、同第ＷＯ２００６／１１０６８９号（例えば、’６８９号の配列番号５～３８参照）、同第ＷＯ２００９／１０４９６４号（例えば、’９６４号の配列番号１～５、７、９、２０、２２、２４及び３１参照）、同第ＷＯ２０１０／１２７０９７号（例えば、’０９７号の配列番号５～３８参照）、及び同第ＷＯ２０１５／１９１５０８号（例えば、’５０８号の配列番号８０～２９４参照）、ならびに米国出願公開第２０１５００２３９２４号（例えば、’９２４号の配列番号１、５～１０参照）に開示されているＡＡＶカプシドのＶＰ１、ＶＰ２及び／またはＶＰ３配列に対して少なくとも８０％以上同一、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％同一であるカプシドタンパク質を有し、これらの特許のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に援用される。
ＡＡＶベースのウイルスベクターの核酸配列ならびに組み換えＡＡＶ及びＡＡＶカプシドの作製方法は、例えば、米国特許第７，２８２，１９９号；同第７，９０６，１１１号；同第８，５２４，４４６号；同第８，９９９，６７８号；同第８，６２８，９６６号；同第８，９２７，５１４号；同第８，７３４，８０９号；同第９，２８４，３５７号；同第９，４０９，９５３号；同第９，１６９，２９９号；同第９，１９３，９５６号；同第９４５８５１７号；及び同第９，５８７，２８２号；米国特許出願公開第２０１５／０３７４８０３号；同第２０１５／０１２６５８８号；同第２０１７／００６７９０８号；同第２０１３／０２２４８３６号；同第２０１６／０２１５０２４号；同第２０１７／００５１２５７号；国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３４７９９号；同第ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５３３３５号；ＷＯ２００３／０５２０５１、ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ０３／０４２３９７、ＷＯ２００６／０６８８８８、ＷＯ２００６／１１０６８９、ＷＯ２００９／１０４９６４、ＷＯ２０１０／１２７０９７、及びＷＯ２０１５／１９１５０８、ならびに米国出願公開第２０１５００２３９２４号に教示されている。
追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、シュードタイプ化ＡＡＶカプシドを含む。いくつかの実施形態において、シュードタイプ化ＡＡＶカプシドは、ｒＡＡＶ２／８またはｒＡＡＶ２／９シュードタイプ化ＡＡＶカプシドである。シュードタイプ化ｒＡＡＶ粒子を生産及び使用する方法は、当該技術分野において知られている（例えば、Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５：７６６２－７６７１（２００１）；Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４：１５２４－１５３２（２０００）；Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８：１５８－１６７（２００２）；及びＡｕｒｉｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ． Ｇｅｎｅｔ．１０：３０７５－３０８１，（２００１）参照。
ある特定の実施形態において、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）が使用され得る。ある特定の実施形態において、自己相補性ベクター、例えば、ｓｃＡＡＶが使用され得る（例えば、Ｗｕ，２００７，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１８（２）：１７１－８２，ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ，２００１，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ．８，Ｎｕｍｂｅｒ １６，Ｐａｇｅｓ １２４８－１２５４；ならびに米国特許第６，５９６，５３５号；同第７，１２５，７１７号；及び同第７，４５６，６８３号を参照されたく、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に援用される）。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９から選択されるＡＡＶカプシド血清型に由来するカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３１、ＡＡＶ．ｈｕ３２、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群から選択されるＡＡＶカプシド血清型に由来するカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３１、ＡＡＶ．ｈｕ３２、及びＡＡＶ．ｈｕ３７などのＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対して高い配列相同性を有するカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１またはその誘導体、改変体、もしくはシュードタイプのＡＡＶカプシド血清型を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ４またはその誘導体、改変体、もしくはシュードタイプのＡＡＶカプシド血清型を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ５またはその誘導体、改変体、もしくはシュードタイプのＡＡＶカプシド血清型を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはその誘導体、改変体、もしくはシュードタイプのＡＡＶカプシド血清型を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９またはその誘導体、改変体、もしくはシュードタイプのＡＡＶカプシド血清型を有する。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９カプシドタンパク質の誘導体、改変体、またはシュードタイプであるカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８カプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２及び／またはＶＰ３配列に対して少なくとも８０％以上同一、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％同一であるＡＡＶ８カプシドタンパク質を有するカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質の誘導体、改変体、またはシュードタイプであるカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２及び／またはＶＰ３配列に対して少なくとも８０％以上同一、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％同一であるＡＡＶ８カプシドタンパク質を有するカプシドタンパク質を含む。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３１、ＡＡＶ．ｈｕ３２、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、またはＡＡＶ．７ｍ８カプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２及び／またはＶＰ３配列に対して少なくとも８０％以上の同一性、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％の同一性を有するカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３１、ＡＡＶ．ｈｕ３２、及びＡＡＶ．ｈｕ３７などのＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対して高い配列相同性を有するＡＡＶカプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２及び／またはＶＰ３配列に対して少なくとも８０％以上の同一性、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％同一性を有するカプシドタンパク質を含む。
追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、モザイクカプシドを含む。モザイクＡＡＶ粒子は、異なる血清型のＡＡＶに由来するウイルスカプシドタンパク質の混合物から構成される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択される血清型のカプシドタンパク質を含有するモザイクカプシドを含む。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ．８、及びＡＡＶｒｈ．１０から選択される血清型のカプシドタンパク質を含有するモザイクカプシドを含む。
追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、シュードタイプ化ｒＡＡＶ粒子を含む。いくつかの実施形態において、シュードタイプ化ｒＡＡＶ粒子は、（ａ）ＡＡＶ ＩＴＲを含む核酸ベクター、及び（ｂ）ＡＡＶｘ（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５及びＡＡＶ１６）に由来するカプシドタンパク質から構成されるカプシドを含む。追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３１、ＡＡＶ．ｈｕ３２、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質から構成されるシュードタイプ化ｒＡＡＶ粒子を含む。追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８カプシドタンパク質を含有するシュードタイプ化ｒＡＡＶ粒子を含む。追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質から構成されるシュードタイプ化ｒＡＡＶ粒子を含む。いくつかの実施形態において、シュードタイプ化ｒＡＡＶ８またはｒＡＡＶ９粒子は、ｒＡＡＶ２／８またはｒＡＡＶ２／９シュードタイプ化粒子である。シュードタイプ化ｒＡＡＶ粒子を生産及び使用する方法は、当該技術分野において知られている（例えば、Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５：７６６２－７６７１（２００１）；Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４：１５２４－１５３２（２０００）；Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８：１５８－１６７（２００２）；及びＡｕｒｉｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ． Ｇｅｎｅｔ．１０：３０７５－３０８１，（２００１）参照。
追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、２つ以上のＡＡＶカプシド血清型のカプシドタンパク質キメラを含有するカプシドを含む。更なる実施形態において、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ｒＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶ血清型に由来する２つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質のキメラである。更なる実施形態において、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ．８、及びＡＡＶｒｈ．１０から選択されるＡＡＶ血清型に由来する２つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質のキメラである。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８カプシドタンパク質と、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶ血清型に由来する１つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質とのＡＡＶカプシドタンパク質キメラを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８カプシドタンパク質と、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ．８、及びＡＡＶｒｈ．１０から選択されるＡＡＶ血清型に由来する１つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質とのＡＡＶカプシドタンパク質キメラを含む。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質 ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択される１つ以上のＡＡＶカプシド血清型のカプシドタンパク質のＡＡＶカプシドタンパク質キメラを含む。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質 ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．８、及びＡＡＶｒｈ．１０から選択される１つ以上のＡＡＶカプシド血清型のカプシドタンパク質のＡＡＶカプシドタンパク質キメラを含む。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、Ｃｌａｄｅ Ａ、Ｂ、Ｅ、またはＦのＡＡＶカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、Ｃｌａｄｅ ＦのＡＡＶカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、Ｃｌａｄｅ ＥのＡＡＶカプシドタンパク質を含む。
以下の表９は、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ｒｈ７４、ＡＡＶ．ｈｕ３１、ＡＡＶ．ｈｕ３２、及びＡＡＶ．ｈｕ３７カプシドタンパク質のアミノ酸配列ならびにＡＡＶ２の５’－ＩＴＲ及び３’－ＩＴＲの核酸配列の例を提供する。
Figure 2023503637000047
Figure 2023503637000048
Figure 2023503637000049
Figure 2023503637000050
Figure 2023503637000051
提供される方法は、導入遺伝子をコードする組み換えＡＡＶの生産における使用に好適である。ある特定の実施形態において、導入遺伝子は、本明細書に記載されるマイクロジストロフィンである。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、次の構成要素：（１）発現カセットを挟むＡＡＶ末端逆位反復配列；（２）調節制御エレメント、例えば、ａ）プロモーター／エンハンサー、ｂ）ポリＡシグナル、及びｃ）任意選択によりイントロン；ならびに（３）記載される導入遺伝子をコードする核酸配列を含むベクターを含む。特定の実施形態において、本明細書に記載されるコンストラクトは、次の構成要素：（１）発現カセットを挟むＡＡＶ２またはＡＡＶ８末端逆位反復配列（ＩＴＲ）；（２）筋特異的ＳＰｃ５．１２プロモーター及び小ポリＡシグナルを含む制御エレメント；ならびに（３）本明細書に記載されるマイクロジストロフィンをコードする核酸を提供する（例えば、コードする）導入遺伝子を含む。特定の実施形態において、本明細書に記載されるコンストラクトは、次の構成要素：（１）発現カセットを挟むＡＡＶ２またはＡＡＶ８ ＩＴＲ；（２）ａ）筋特異的ＳＰｃ５．１２プロモーター、ｂ）小ポリＡシグナルを含む制御エレメント；ならびに（３）Ｎ末端からＣ末端へＡＢＤ１－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ、ＡＢＤ１－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴ、ＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ１６－Ｒ１７－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ、またはＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ１６－Ｒ１７－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴを含むマイクロジストロフィンカセットを含む。特定の実施形態において、本明細書に記載されるコンストラクトは、次の構成要素：（１）発現カセットを挟むＡＡＶ２またはＡＡＶ８ ＩＴＲ；（２）ａ）ＣＮＳプロモーター、ｂ）小ポリＡシグナルを含む制御エレメント；ならびに（３）Ｎ末端からＣ末端へＡＢＤ１－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ、ＡＢＤ１－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴ、ＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ１６－Ｒ１７－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ、またはＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ１６－Ｒ１７－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴを含むマイクロジストロフィンカセットを含む。特定の実施形態において、本明細書に記載されるコンストラクトは、次の構成要素：（１）発現カセットを挟むＡＡＶ２またはＡＡＶ８ ＩＴＲ；（２）ａ）筋特異的ＳＰｃ５．１２プロモーター、ｂ）イントロン（例えば、ＶＨ４）及びｃ）小ポリＡシグナルを含む制御エレメント；ならびに（３）Ｎ末端からＣ末端へＡＢＤ１－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ、ＡＢＤ１－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴ、ＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ１６－Ｒ１７－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ、またはＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ１６－Ｒ１７－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴを含むマイクロジストロフィンカセット（ＡＢＤ１はＶＨ４に直接連結されている）を含む。特定の実施形態において、本明細書に記載されるコンストラクトは、次の構成要素：（１）発現カセットを挟むＡＡＶ２またはＡＡＶ８ ＩＴＲ；（２）ａ）ＣＮＳプロモーター、ｂ）イントロン（例えば、ＶＨ４）及びｃ）小ポリＡシグナルを含む制御エレメント；ならびに（３）Ｎ末端からＣ末端へＡＢＤ１－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ、ＡＢＤ１－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴ、ＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ１６－Ｒ１７－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ、またはＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ１６－Ｒ１７－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴを含むマイクロジストロフィンカセット（ＡＢＤ１はＶＨ４に直接連結されている）を含む。特定の実施形態において、本明細書に記載されるコンストラクトは、次の構成要素：（１）発現カセットを挟むＡＡＶ２またはＡＡＶ８ ＩＴＲ；（２）ａ）筋特異的ＳＰｃ５．１２プロモーターまたはＣＮＳプロモーター、ｂ）イントロン（例えば、ＶＨ４）及びｃ）小ポリＡシグナルを含む制御エレメント；ならびに（３）Ｎ末端からＣ末端へＡＢＤ１－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ２－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ、ＡＢＤ１－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ２－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴ、ＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ１６－Ｒ１７－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ、またはＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ１６－Ｒ１７－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴを含むマイクロジストロフィンカセット（ＡＢＤ１はＶＨ４に直接連結されている）を含む。特定の実施形態において、本明細書に記載されるコンストラクトは、次の構成要素：（１）発現カセットを挟むＡＡＶ２またはＡＡＶ８ ＩＴＲ；（２）ａ）筋特異的ＳＰｃ５．１２プロモーター、ｂ）イントロン（例えば、ＶＨ４）及びｃ）小ポリＡシグナルを含む制御エレメント；ならびに（３）Ｎ末端からＣ末端へＡＢＤ１－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ２－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ、ＡＢＤ１－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ２－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴ、ＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ１６－Ｒ１７－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ、またはＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ１６－Ｒ１７－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴを含むマイクロジストロフィンカセット（ＡＢＤ１はＶＨ４に直接連結されている）を含む。いくつかの実施形態において、マイクロジストロフィン発現カセットを挟むＡＡＶ ＩＴＲを含む本明細書に記載されるコンストラクトは、Ｎ末端からＣ末端へＡＢＤ１－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ２－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ、ＡＢＤ１－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ２－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴ、ＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ１６－Ｒ１７－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ、またはＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ１６－Ｒ１７－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴを含み、４０００ｎｔ～５０００ｎｔの間の長さであり得る。いくつかの実施形態において、そのようなコンストラクトは、４９００ｎｔ、４８００ｎｔ、４７００ｎｔ、４６００ｎｔ、４５００ｎｔ、４４００ｎｔ、または４３００ｎｔ未満の長さである。
本開示のいくつかの核酸実施形態は、以下の表１０に提供される配列番号５３、５４、５５、５６、または８２のヌクレオチド配列を含むか、またはそれらからなるマイクロジストロフィンをコードするｒＡＡＶベクターを含む。種々の実施形態において、配列番号５３、５４、５５、５６、８２のヌクレオチド配列またはそれらの逆相補鎖に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有し、筋肉細胞における治療上効果的なマイクロジストロフィンの発現に好適なｒＡＡＶベクターをコードするヌクレオチド配列を含む、ｒＡＡＶベクター。
Figure 2023503637000052
Figure 2023503637000053
Figure 2023503637000054
Figure 2023503637000055
Figure 2023503637000056
Figure 2023503637000057
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Figure 2023503637000060
Figure 2023503637000061
Figure 2023503637000062
Figure 2023503637000063
Figure 2023503637000064
Figure 2023503637000065
Figure 2023503637000066
Figure 2023503637000067
Figure 2023503637000068
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Figure 2023503637000070
Figure 2023503637000071
Figure 2023503637000072
Figure 2023503637000073
Figure 2023503637000074
Figure 2023503637000075
Figure 2023503637000076
Figure 2023503637000077
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Figure 2023503637000080
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Figure 2023503637000082
Figure 2023503637000083
５．３．５ ｒＡＡＶ粒子を作製する方法
本発明の別の態様は、本明細書に開示される分子を作製することを含む。いくつかの実施形態において、本発明に係る分子は、本明細書のカプシドタンパク質分子のいずれかをコードする核酸配列を含むヌクレオチドを提供することと、パッケージング細胞系を使用してカプシドタンパク質から構成されるカプシド被覆を有する対応するｒＡＡＶ粒子を調製することとによって作製される。そのようなカプシドタンパク質は、上記セクション５．３．４に記載される。いくつかの実施形態において、核酸配列は、本明細書に記載されるカプシドタンパク質分子の配列に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％、好ましくは、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．９％の同一性を有する配列をコードし、カプシドタンパク質、及び異種タンパク質またはそのドメインからの挿入ペプチドの生物学的機能を保持している（または実質的に保持している）。いくつかの実施形態において、核酸は、ＡＡＶ８カプシドタンパク質の配列に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％、好ましくは、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．９％の同一性を有する配列をコードし、同時にＡＡＶ８カプシドタンパク質及び挿入ペプチドの生物学的機能を保持している（または実質的に保持している）。
カプシドタンパク質、被覆、及びｒＡＡＶ粒子は、当該技術分野において知られている技術によって生産され得る。いくつかの実施形態において、ウイルスゲノムは、ベクターへのパッケージングを可能にする少なくとも１つの末端逆位反復配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルスゲノムは、ｃａｐ遺伝子及び／またはｃａｐ遺伝子の発現及びスプライシングのためのｒｅｐ遺伝子を更に含む。実施形態において、ｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子は、パッケージング細胞によって提供され、ウイルスゲノムに存在しない。
いくつかの実施形態において、操作されたカプシドタンパク質をコードする核酸は、既存のカプシド遺伝子の代わりにＡＡＶ Ｒｅｐ－Ｃａｐプラスミドにクローニングされる。宿主細胞に一緒に導入される場合、このプラスミドは、ｒＡＡＶゲノムを、カプシド被覆として操作されたカプシドタンパク質にパッケージするのを助ける。パッケージング細胞は、ＡＡＶゲノムの複製、カプシドの組み立て、及びパッケージングを促進するのに必要な遺伝子を持つ任意の細胞種であり得る。
ｒＡＡＶ粒子の生産には多くの細胞培養系が当該技術分野において知られており、そのいずれも本明細書で開示される方法を実施するために使用することができる。細胞培養系には、トランスフェクション、安定細胞株生産、及び感染性ハイブリッドウイルス生産系が含まれ、これらには、限定するものではないが、アデノウイルス－ＡＡＶハイブリッド、ヘルペスウイルス－ＡＡＶハイブリッド及びバキュロウイルス－ＡＡＶハイブリッドが含まれる。ｒＡＡＶウイルス粒子の生産のためのｒＡＡＶ生産培養は、次を必要とする：（１）例えば、ヒト由来細胞株、哺乳動物細胞株、または昆虫由来細胞株を含む、好適な宿主細胞；（２）野生型もしくは変異型アデノウイルス（温度感受性アデノウイルスなど）、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、またはヘルパー機能を提供するプラスミドコンストラクトによってもたらされる好適なヘルパーウイルス機能；（３）ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子及び遺伝子産物；（４）ＡＡＶ ＩＴＲ配列に挟まれた導入遺伝子（治療用導入遺伝子など）及び任意選択により調節エレメント；ならびに（５）細胞の成長／生存及びｒＡＡＶ生産をサポートするのに好適な培地及び培地成分（栄養素）。
宿主細胞の非限定的な例としては、Ａ５４９、ＷＥＨＩ、１０Ｔ１／２、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０、ＶＥＲＯ、Ｗ１３８、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３及びこれらの誘導体（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞）、Ｓａｏｓ、Ｃ２Ｃ１２、Ｌ、ＨＴ１０８０、ＨｅｐＧ２、初代線維芽細胞、肝細胞、筋芽細胞、ＣＨＯ細胞もしくはＣＨＯ由来細胞、またはＳＦ－９などの昆虫由来細胞株（例えば、バキュロウイルス生産系の場合）が挙げられる。概説については、Ａｐｏｎｔｅ－Ｕｂｉｌｌｕｓ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０２：１０４５－１０５４を参照されたく、製造技術について、その全体が参照により本明細書に援用される。
一態様において、本明細書で提供されるのは、（ａ）昆虫細胞を含む細胞培養物を提供すること、（ｂ）ｉ．パッケージされるｒＡＡＶゲノム、ｉｉ．パッケージングに十分なＡＡＶ ｒｅｐタンパク質、及びｉｉｉ．パッケージングに十分なＡＡＶ ｃａｐタンパク質のうちの少なくとも１つをコードする１つ以上のバキュロウイルスベクターを細胞に導入すること、（ｃ）細胞培養物に十分な栄養素を添加すること及びｒＡＡＶ粒子の生産を可能にする条件下に細胞培養物を維持することを含む、ｒＡＡＶ粒子を生産する方法である。いくつかの実施形態において、方法は、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする第１のバキュロウイルスベクターと、ｒＡＡＶゲノムをコードする第２のバキュロウイルスベクターとを使用することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、ｒＡＡＶゲノムをコードするバキュロウイルスと、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を発現する昆虫細胞とを使用することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子ならびにｒＡＡＶゲノムをコードするバキュロウイルスベクターを使用することを含む。いくつかの実施形態において、昆虫細胞は、Ｓｆ－９細胞である。いくつかの実施形態において、昆虫細胞は、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする１つ以上の安定的に統合された異種ポリヌクレオチドを含むＳｆ－９細胞である。
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、バキュロウイルス生産系を使用する。いくつかの実施形態において、バキュロウイルス生産系は、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする第１のバキュロウイルスと、ｒＡＡＶゲノムをコードする第２のバキュロウイルスとを使用する。いくつかの実施形態において、バキュロウイルス生産系は、ｒＡＡＶゲノムをコードするバキュロウイルスと、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を発現する宿主細胞とを使用する。いくつかの実施形態において、バキュロウイルス生産系は、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子ならびにｒＡＡＶゲノムをコードするバキュロウイルスを使用する。いくつかの実施形態において、バキュロウイルス生産系は、Ｓｆ－９細胞などの昆虫細胞を使用する。
当業者は、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ＡＡＶヘルパー遺伝子（例えば、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子）、ならびにｒＡＡＶゲノム（末端逆位反復配列（ＩＴＲ）によって挟まれた１つ以上の目的遺伝子を含む）を細胞内に導入してｒＡＡＶを生産またはパッケージすることができる方法を多数認識している。「アデノウイルスヘルパー機能」という文言は、ＡＡＶが細胞内で効率的に成長するように、細胞内で（ＲＮＡまたはタンパク質として）発現される、多数のウイルスヘルパー遺伝子を指す。当業者は、アデノウイルス及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）を含むヘルパーウイルスがＡＡＶ複製を促進すること、また、必須機能を提供するある特定の遺伝子が同定されていることを理解しており、例えば、ヘルパーは、そのようなＡＡＶ遺伝子の発現及び複製を容易にする細胞環境への変化を誘発し得る。本明細書で開示される方法のいくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ヘルパー遺伝子、ならびにｒＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ヘルパー遺伝子、ならびにｒＡＡＶゲノムをコードする１つ以上のプラスミドベクターを用いたトランスフェクションによって、細胞内に導入される。本明細書で開示される方法のいくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ヘルパー遺伝子、ならびにｒＡＡＶゲノムは、ウイルスベクター、例えば、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ヘルパー遺伝子、ならびにｒＡＡＶゲノムをコードするｒＨＳＶベクターを用いた形質導入によって、細胞内に導入され得る。本明細書で開示される方法のいくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ヘルパー遺伝子、ならびにｒＡＡＶゲノムのうちの１つ以上は、ｒＨＳＶベクターを用いた形質導入によって、細胞内に導入される。いくつかの実施形態において、ｒＨＳＶベクターは、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする。いくつかの実施形態において、ｒＨＳＶベクターは、ヘルパー遺伝子をコードする。いくつかの実施形態において、ｒＨＳＶベクターは、ｒＡＡＶゲノムをコードする。いくつかの実施形態において、ｒＨＳＶベクターは、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする。いくつかの実施形態において、ｒＨＳＶベクターは、ヘルパー遺伝子及びｒＡＡＶゲノムをコードする。いくつかの実施形態において、ｒＨＳＶベクターは、ヘルパー遺伝子ならびにＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする。
一態様において、本明細書で提供されるのは、（ａ）宿主細胞を含む細胞培養物を提供すること、（ｂ）ｉ．パッケージされるｒＡＡＶゲノム、ｉｉ．ｒＡＡＶ粒子のパッケージングに必要なヘルパー機能、ｉｉｉ．パッケージングに十分なＡＡＶ ｒｅｐタンパク質、及びｉｖ．パッケージングに十分なＡＡＶ ｃａｐタンパク質のうちの少なくとも１つをコードする１つ以上のｒＨＳＶベクターを細胞に導入すること、（ｃ）細胞培養物に十分な栄養素を添加すること及びｒＡＡＶ粒子の生産を可能にする条件下に細胞培養物を維持することを含む、ｒＡＡＶ粒子を生産する方法である。いくつかの実施形態において、ｒＨＳＶベクターは、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする。いくつかの実施形態において、ｒＨＳＶベクターは、ヘルパー機能をコードする。いくつかの実施形態において、ｒＨＳＶベクターは、ヘルパー機能をコードする１つ以上の内因性遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ｒＨＳＶベクターは、ヘルパー機能をコードする１つ以上の異種遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ｒＨＳＶベクターは、ｒＡＡＶゲノムをコードする。いくつかの実施形態において、ｒＨＳＶベクターは、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする。いくつかの実施形態において、ｒＨＳＶベクターは、ヘルパー機能及びｒＡＡＶゲノムをコードする。いくつかの実施形態において、ｒＨＳＶベクターは、ヘルパー機能ならびにＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする１つ以上の安定的に統合された異種ポリヌクレオチドを含む。
一態様において、本明細書で提供されるのは、（ａ）哺乳動物細胞を含む細胞培養物を提供すること、（ｂ）ｉ．パッケージされるｒＡＡＶゲノム、ｉｉ．ｒＡＡＶ粒子のパッケージングに必要なヘルパー機能、ｉｉｉ．パッケージングに十分なＡＡＶ ｒｅｐタンパク質、及びｉｖ．パッケージングに十分なＡＡＶ ｃａｐタンパク質のうちの少なくとも１つをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを細胞に導入すること、（ｃ）細胞培養物に十分な栄養素を添加すること及びｒＡＡＶ粒子の生産を可能にする条件下に細胞培養物を維持することを含む、ｒＡＡＶ粒子を生産する方法である。いくつかの実施形態において、ヘルパー機能は、アデノウイルス遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする１つ以上の安定的に統合された異種ポリヌクレオチドを含む。
ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ヘルパー遺伝子、及び／またはｒＡＡＶゲノムをコードするプラスミドまたはウイルスベクターを開発するための分子生物学技術は、当該技術分野において一般に知られている。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、１つのプラスミドベクターによってコードされる。いくつかの実施形態において、ＡＡＶヘルパー遺伝子（例えば、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子）は、１つのプラスミドベクターによってコードされる。いくつかの実施形態において、Ｅ１ａ遺伝子またはＥ１ｂ遺伝子は、宿主細胞によって安定的に発現され、残りのＡＡＶヘルパー遺伝子は、１つのウイルスベクターによるトランスフェクションによって細胞内に導入される。いくつかの実施形態において、Ｅ１ａ遺伝子及びＥ１ｂ遺伝子は、宿主細胞によって安定的に発現され、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子は、１つのプラスミドベクターによるトランスフェクションによって細胞内に導入される。いくつかの実施形態において、１つ以上のヘルパー遺伝子は、宿主細胞によって安定的に発現され、１つ以上のヘルパー遺伝子は、１つのプラスミドベクターによるトランスフェクションによって細胞内に導入される。いくつかの実施形態において、ヘルパー遺伝子は、宿主細胞によって安定的に発現される。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、１つのウイルスベクターによってコードされる。いくつかの実施形態において、ＡＡＶヘルパー遺伝子（例えば、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子）は、１つのウイルスベクターによってコードされる。いくつかの実施形態において、Ｅ１ａ遺伝子またはＥ１ｂ遺伝子は、宿主細胞によって安定的に発現され、残りのＡＡＶヘルパー遺伝子は、１つのウイルスベクターによるトランスフェクションによって細胞内に導入される。いくつかの実施形態において、Ｅ１ａ遺伝子及びＥ１ｂ遺伝子は、宿主細胞によって安定的に発現され、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子は、１つのウイルスベクターによるトランスフェクションによって細胞内に導入される。いくつかの実施形態において、１つ以上のヘルパー遺伝子は、宿主細胞によって安定的に発現され、１つ以上のヘルパー遺伝子は、１つのウイルスベクターによるトランスフェクションによって細胞内に導入される。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、パッケージングに必要なアデノウイルスヘルパー機能、及びパッケージされるｒＡＡＶゲノムは、１つ以上のポリヌクレオチド、例えば、ベクターを用いたトランスフェクションによって細胞に導入される。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、３つのポリヌクレオチド：ｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子をコードするもの、パッケージングに必要なアデノウイルスヘルパー機能をコードするもの（例えば、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子）、及びパッケージされるｒＡＡＶゲノムをコードするものの混合物を細胞にトランスフェクトすることを含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶのｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９のｃａｐ遺伝子である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶのｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ、またはＡＡＶ．７ｍ８ｃａｐ遺伝子である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶのｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７などのＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対して高い配列相同性を有するカプシドタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、パッケージされるｒＡＡＶゲノムをコードするベクターは、ＡＡＶ ＩＴＲによって挟まれた目的遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６または他のＡＡＶ血清型に由来する。
ベクターの任意の組み合わせを使用して、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ＡＡＶヘルパー遺伝子、ならびにｒＡＡＶゲノムを、ｒＡＡＶ粒子が生産またはパッケージされる細胞に導入することができる。本明細書で開示される方法のいくつかの実施形態において、ＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）によって挟まれた目的遺伝子を含むｒＡＡＶゲノムをコードする第１のプラスミドベクター、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする第２のベクター、ならびにヘルパー遺伝子をコードする第３のベクターが使用され得る。いくつかの実施形態において、３つのベクターの混合物が細胞にコトランスフェクトされる。いくつかの実施形態において、プラスミドベクターとウイルスベクターの両方を使用することによって、トランスフェクションと感染の組み合わせが使用される。
いくつかの実施形態において、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ならびにＡＡＶヘルパー遺伝子のうちの１つ以上は、細胞によって構成的に発現され、細胞にトランスフェクトまたは形質導入する必要がない。いくつかの実施形態において、細胞は、ｒｅｐ及び／またはｃａｐ遺伝子を構成的に発現する。いくつかの実施形態において、細胞は、１つ以上のＡＡＶヘルパー遺伝子を構成的に発現する。いくつかの実施形態において、細胞は、Ｅ１ａを構成的に発現する。いくつかの実施形態において、細胞は、ｒＡＡＶゲノムをコードする安定した導入遺伝子を含む。
いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ、ｃａｐ、及びヘルパー遺伝子（例えば、Ｅｌａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、またはＶＡ遺伝子）は、任意のＡＡＶ血清型であり得る。同様に、ＡＡＶ ＩＴＲも任意のＡＡＶ血清型であり得る。例えば、いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６または他のＡＡＶ血清型（例えば、２つ以上の血清型に由来する配列を有するハイブリッド血清型）に由来する。いくつかの実施形態において、ＡＡＶのｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９ｃａｐ遺伝子に由来する。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ＡＡＶ．ＨＳＣ１６、ＡＡＶ．ｒｈ７４、ＡＡＶ．ｈｕ３１、ＡＡＶ．ｈｕ３２、もしくはＡＡＶ．ｈｕ３７または他のＡＡＶ血清型（例えば、２つ以上の血清型に由来する配列を有するハイブリッド血清型）に由来する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子の生産のためのＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、異なる血清型に由来する。例えば、ｒｅｐ遺伝子は、ＡＡＶ２に由来するが、ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ８に由来する。別の例において、ｒｅｐ遺伝子は、ＡＡＶ２に由来するが、ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ９に由来する。
いくつかの実施形態において、ｒｅｐ遺伝子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６または他のＡＡＶ血清型（例えば、２つ以上の血清型に由来する配列を有するハイブリッド血清型）に由来する。他の実施形態において、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、同じ血清型に由来する。更に他の実施形態において、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、同じ血清型に由来し、ｒｅｐ遺伝子は、少なくとも１つの改変タンパク質ドメインまたは改変プロモータードメインを含む。ある特定の実施形態において、少なくとも１つの改変ドメインは、カプシド血清型とは異なる血清型のヌクレオチド配列を含む。ｒｅｐ遺伝子内の改変ドメインは、異なる血清型の断片からなるハイブリッドヌクレオチド配列であり得る。
ハイブリッドｒｅｐ遺伝子は、４ｋｂ超超、４．１ｋｂ超、４．２ｋＢ超、４．３ｋｂ超、４．４ｋＢ超、４．５ｋｂ、または４．６ｋｂ超のマイクロジストロフィン導入遺伝子を含むウイルスゲノムのパッケージングを含む、ｒＡＡＶ粒子のパッケージング効率の改善をもたらす。ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子は、ウイルスの複製及び生産に必要な非構造タンパク質をコードする核酸配列からなる。ｒｅｐ遺伝子の転写は、ｐ５またはｐ１９プロモーターから開始され、それぞれ、２つの大きな非構造Ｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８）及び２つの小さな非構造Ｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０）が生成される。更に、Ｒｅｐ７８／６８ドメインは、ＩＴＲ内の特定のＩＴＲ配列を認識するＤＮＡ結合ドメインを含有する。４つのＲｅｐタンパク質は全て共通のヘリカーゼ及びＡＴＰａｓｅドメインを有し、ゲノム複製及び／またはカプシド形成において機能する（Ｍａｕｒｅｒ ＡＣ，２０２０，ＤＯＩ：１０．１０８９／ｈｕｍ．２０２０．０６９）。ｃａｐ遺伝子の転写は、ｐ４０プロモーターから開始されるが、この配列はｒｅｐ遺伝子のＣ末端内にあるので、ｒｅｐ遺伝子中の他のエレメントがｐ４０プロモーター活性を誘導する可能性が示唆されている。ｐ４０プロモータードメインは、転写因子結合エレメントであるＥＦ１Ａ、ＭＬＴＦ、及びＡＴＦ、Ｆｏｓ／Ｊｕｎ結合エレメント（ＡＰ－１）、Ｓｐ１様エレメント（Ｓｐ１及びＧＧＴ）、ならびにＴＡＴＡエレメントを含む（Ｐｅｒｅｉｒａ ａｎｄ Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｊｕｎｅ １９９７，７１（６）：４３００－４３０９）。いくつかの実施形態において、ｒｅｐ遺伝子は、改変ｐ４０プロモーターを含む。いくつかの実施形態において、ｐ４０プロモーターは、ＥＦ１Ａ結合エレメント、ＭＬＴＦ結合エレメント、ＡＴＦ結合エレメント、Ｆｏｓ／Ｊｕｎ結合エレメントｓ（ＡＰ－１）、Ｓｐ１様エレメント（Ｓｐ１またはＧＧＴ）、またはＴＡＴＡエレメントのうちのいずれか１つ以上が改変されている。他の実施形態において、ｒｅｐ遺伝子は、血清型１、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、ｒｈ８、ｒｈ１０、ｒｈ２０、ｒｈ３９、ｒｈ．７４、ＲＨＭ４－１、またはｈｕ３７であり、ｐ４０プロモータードメインの一部またはエレメントが血清型２に改変されている。更に他の実施形態において、ｒｅｐ遺伝子は、血清型８または９であり、ｐ４０プロモータードメインの一部またはエレメントが血清型２に改変されている。
ＩＴＲは、Ａ及びＡ’の相補配列、Ｂ及びＢ’の相補配列、ならびにＣ及びＣ’の相補配列を含有し、Ｄ配列は、ｓｓＤＮＡゲノムと連続する。ＩＴＲの相補配列は、自己アニーリングによってヘアピン構造を形成する（Ｂｅｒｎｓ ＫＩ． Ｔｈｅ Ｕｎｕｓｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＡＡＶ Ｉｎｖｅｒｔｅｄ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｒｅｐｅａｔ． Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０２０）。Ｄ配列は、Ｒｅｐ結合エレメント（ＲＢＥ）及び末端分解部位（ＴＲＳ）を含有し、これらが一緒になってＡＡＶ複製起点を構成する。ＩＴＲはまた、複製後のゲノムのカプシド内包化のパッケージングシグナルとしても必要である。いくつかの実施形態において、ＩＴＲ配列及びｃａｐ遺伝子は、Ａ及びＡ’の相補配列、Ｂ及びＢ’の相補配列、Ｃ及びＣ’の相補配列、またはＤ配列のうちの１つ以上が、カプシドとは異なる血清型に由来する配列を含有するように改変されていてもよいことを除き、同じ血清型に由来する。いくつかの実施形態において、改変ＩＴＲ配列は、ｒｅｐ遺伝子と同じ血清型に由来する。他の実施形態において、ＩＴＲ配列及びｃａｐ遺伝子は、Ａ及びＡ’の相補配列、Ｂ及びＢ’の相補配列、Ｃ及びＣ’の相補配列、またはＤ配列から選択されるＩＴＲ配列のうちの１つ以上がカプシド（ｃａｐ遺伝子）と同じ血清型に由来し、ＩＴＲ配列のうちの１つ以上がｒｅｐ遺伝子と同じ血清型に由来することを除き、異なる血清型に由来する。
いくつかの実施形態において、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、同じ血清型に由来し、ｒｅｐ遺伝子は、改変されたＲｅｐ７８ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、エンドヌクレアーゼドメイン、ＡＴＰａｓｅドメイン、ヘリカーゼドメイン、ｐ５プロモータードメイン、Ｒｅｐ６８ドメイン、ｐ５プロモータードメイン、Ｒｅｐ５２ドメイン、ｐ１９プロモータードメイン、Ｒｅｐ４０ドメインまたはｐ４０プロモータードメインを含む。他の実施形態において、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、同じ血清型に由来し、ｒｅｐ遺伝子は、異なる血清型に由来する少なくとも１つのタンパク質ドメインまたはプロモータードメインを含む。一実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列によって挟まれた導入遺伝子、ＡＡＶ８ ｃａｐ、及びハイブリッドＡＡＶ２／８ ｒｅｐを含む。別の実施形態において、ＡＡＶ２／８ ｒｅｐは、ｐ４０プロモータードメインまたはその一部が血清型２ｒｅｐに由来することを除き、血清型８ ｒｅｐを含む。他の実施形態において、ＡＡＶ２／８ ｒｅｐは、ｐ４０プロモータードメインまたはその一部が血清型８ ｒｅｐに由来することを除き、血清型２ ｒｅｐを含む。いくつかの実施形態において、ハイブリッドｒｅｐ／ｃａｐプラスミドを構築するために、３つ以上の血清型が利用されてもよい。
細胞のトランスフェクトには、当該技術分野において知られている任意の好適な方法を使用することができ、本明細書で開示される方法に係るｒＡＡＶ粒子の産生にも使用することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、化学的トランスフェクション法を使用して細胞にトランスフェクションすることを含む。いくつかの実施形態において、化学的トランスフェクション法は、リン酸カルシウム、高度に分岐した有機化合物（デンドリマー）、カチオン性ポリマー（例えば、ＤＥＡＥデキストランまたはポリエチレンイミン（ＰＥＩ））、リポフェクションを使用する。いくつかの実施形態において、化学的トランスフェクション法は、カチオン性ポリマー（例えば、ＤＥＡＥデキストランまたはポリエチレンイミン（ＰＥＩ））を使用する。いくつかの実施形態において、化学的トランスフェクション法は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用する。いくつかの実施形態において、化学的トランスフェクション法は、ＤＥＡＥデキストランを使用する。いくつかの実施形態において、化学的トランスフェクション法は、リン酸カルシウムを使用する。
組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養及び形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）には、標準的な技術を使用することができる。酵素反応及び精製技術は、製造業者の仕様書に従って、または当該技術分野において一般的に達成されるように、または本明細書に記載されるように行うことができる。前述の技術及び手順は、一般に、当該技術分野においてよく知られている従来の方法に従って、また、本明細書全体を通して引用及び考察される、一般的かつより具体的な様々な参考文献に記載されるように行うことができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照されたく、この文献は、あらゆる目的のために、参照により本明細書に援用される。特定の定義が提供されない限り、本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、ならびに医薬品化学及び製薬化学に関連して利用される命名法、ならびにその研究室手順及び技術は、当該技術分野においてよく知られ、かつ一般的に使用されているものである。化学合成、化学分析、医薬品の調製、製剤化及び送達、ならびに患者の治療には、標準的な技術が使用され得る。
ＡＡＶベースのウイルスベクターの核酸配列、ならびに組み換えＡＡＶ及びＡＡＶカプシドを作製する方法は、例えば、ＵＳ７，２８２，１９９；ＵＳ７，７９０，４４９；ＵＳ８，３１８，４８０；ＵＳ８，９６２，３３２；及びＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０７６４６６に教示されており、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に援用される。
好ましい実施形態において、ｒＡＡＶは、以下により詳細に論述されるように、治療及び予防用途において使用され得る導入遺伝子送達ベクターを提供する。
５．４．治療有用性
本明細書で開示されるマイクロジストロフィンをコードする組み換え遺伝子治療ベクターを含むコンストラクトを治療有効性についてアッセイする方法が提供される。方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験及び本明細書に記載される動物モデルでのｉｎ ｖｉｖｏ試験の両方、またはマイクロジストロフィンの活性及び有効性を試験するための当該技術分野において知られている任意の他の方法を使用することを含む。
５．４．１ ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ
５．４．１．１ 筋肉細胞のためのｉｎ ｉｔｒｏ感染系
本明細書で開示される組み換えベクター、例えば、ｒＡＡＶ粒子の感染力を試験する方法が提供される。例えば、筋肉細胞における組み換え遺伝子治療ベクターの感染力は、本明細書の実施例２に記載されるように、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞で試験することができる。限定するものではないが、Ｔ００３４（ヒト）、Ｌ６（ラット）、ＭＭ１４（マウス）、Ｐ１９（マウス）、Ｇ－７（マウス）、Ｇ－８（マウス）、ＱＭ７（ウズラ）、Ｈ９ｃ２（２－１）（ラット）、Ｈｓ７４．Ｈｔ（ヒト）、及びＨｓ１７１．Ｈｔ（ヒト）細胞株を含む、いくつかの筋肉細胞株または心臓細胞株を利用することができる。ベクターコピー数は、ポリメラーゼ連鎖反応技術を使用して評価することができ、マイクロジストロフィン発現レベルは、細胞におけるマイクロジストロフィンのｍＲＮＡレベルを測定することによって試験され得る。
５．４．２ 動物モデル
本明細書に記載されるマイクロジストロフィンをコードする導入遺伝子を含有するウイルスベクターの有効性は、例えば、ｍｄｘマウス及び／またはゴールデンレトリバー筋ジストロフィー（ＧＲＭＤ）モデルを使用することによって、動物モデルに投与して変異ジストロフィンを置き換え、導入遺伝子発現の生体内分布、発現及び治療効果を評価することによって試験することができる。治療効果は、例えば、マイクロジストロフィン導入遺伝子を投与した動物における筋力の変化を評価することによって、評価することができる。また、大型の哺乳動物ならびに非哺乳動物の脊椎動物及び無脊椎動物を使用する動物モデルを使用して、本明細書に記載されるベクターの前臨床治療有効性を評価することもできる。したがって、本明細書で開示される治療有効性を評価する方法に従って有効であることが実証された量で、本明細書で開示されるベクターをコードするマイクロジストロフィンの用量を含む、治療投与のための組成物及び方法が提供される。
５．４．２．１ マウスモデル
遺伝子治療ベクターの有効性は、ＤＭＤのマウスモデルで評価することができる。ｍｄｘマウスモデル（Ｙｕｃｅｌ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍａｎｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｍｄｘ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ＤＭＤ：ｔｈｅ ｌｏｎｇ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｈｏｒｔ ｏｆ ｉｔ，Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｖｏｌｕｍｅ ３，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：４（２０１８））は、エクソン２３にナンセンス変異を持つことから、早期終止コドン及び切断型タンパク質（ｍｄｘ）をもたらす。Ｍｄｘマウスは、同腹仔対照と比較して、ピルビン酸キナーゼの血中濃度が３倍高い。ヒトＤＭＤ疾患と同様に、ｍｄｘ骨格筋は、活発な筋線維壊死、細胞浸潤、広範囲の筋線維サイズ及び多数の中心核を持つ再生筋線維を示す。この表現型は、横隔膜で強まり、進行性の変性及び筋線維の損失が生じ、これにより、等尺性筋収縮がおよそ５倍低下する。後肢筋における壊死及び再生は、生後３～４週間前後でピークを迎え、その後は、停滞する。ｍｄｘマウス及び他のマウスバックグラウンド（例えば、ＤＢＡ／２Ｊ）と交配させたｍｄｘマウスでは、軽度だが有意な心駆出率の低下が観察される（Ｖａｎ Ｗｅｓｔｅｒｉｎｇ，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１５，２０，８８２３－８８５５）。心機能障害を有するこのようなＤＭＤモデルマウスを使用して、本明細書に記載される遺伝子治療ベクターの心臓保護効果または心機能の改善もしくは維持または心機能障害の緩和を評価することができる。本明細書の実施例３は、マイクロジストロフィンをコードする遺伝子治療ベクターを評価するためのｍｄｘマウスモデルの使用について詳述する。
更なるｍｄｘマウスモデル：ｍｄｘ２ｃｖ、ｍｄｘ３ｃｖ、ｍｄｘ４ｃｖ、及びｍｄｘ５ｃｖ系統（Ｃ５７ＢＬ／６遺伝子バックグラウンド）を含む、異なる遺伝子バックグラウンドを持つ多くの代替的なバージョンが作製されている。これらのモデルは、化学的突然変異原であるＮ－エチル－Ｎ－ニトロソ尿素で処置することによって作製された。各系統は、異なる点変異を持つ。全体として、ｍｄｘｃｖモデルでは、ｍｄｘマウスと比較して、疾患表現型の提示にほとんど違いがない。ｍｄｘ系統を様々なノックアウトマウスモデル（例えば、Ｍｙｏｄ１－／－、α－インテグリン７－／－、α－ジストロブレビン－／－、及びウトロフィン－／－）と交配することによって、更なるマウスモデルが作製されている。ＤＭＤの研究に現在使用されている全マウスモデルについては、Ｙｕｃｅｌ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍａｎｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｍｄｘ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ＤＭＤ：ｔｈｅ ｌｏｎｇ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｈｏｒｔ ｏｆ ｉｔ，ｎｐｊ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｖｏｌｕｍｅ ３，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：４（２０１８）に詳述されており、参照により本明細書に援用される。
５．４．２．２ イヌ
ほとんどのイヌ研究は、ゴールデンレトリバー筋ジストロフィー（ＧＲＭＤ）モデルで実施されている（Ｋｏｒｎｅｙｇａｙ，Ｊ．Ｎ．，ｅｔ ａｌ，Ｔｈｅ ｇｏｌｄｅｎ ｒｅｔｒｉｅｖｅｒ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ． Ｓｋｅｌｅｔ Ｍｕｓｃｌｅ．２０１７；７：９、その全体が参照により援用される）。ＧＲＭＤのイヌは、骨格筋及び心筋の表現型を持ち、選択的な筋肉病変を伴う進行性の致死性疾患を患い、これは、ＤＭＤの表現型により近似した重症の表現型である。ＧＲＭＤのイヌは、エクソンスキッピング及びアウトオブフレームＤＭＤ転写物をもたらす単一のヌクレオチド変化を持つ。イヌにおける表現型の特徴には、血清ＣＫの上昇、ＥＭＧにおけるＣＲＤ、ならびに群発性の筋線維の壊死及び再生の病理組織的証拠が含まれる。表現型のばらつきは、ヒトと同様にＧＲＭＤでも頻繁に観察される。ＧＲＭＤのイヌは、罹患したイヌの表現型に関与していると思われる逆説的な筋肉肥大を発症し、歩行時の硬直、関節可動域の減少、及び開口障害を一般的な特徴とする。疾患の進行を評価する客観的なバイオマーカーとしては、強直性屈曲、脛腓関節角度、伸張性収縮率の減少、最大股関節屈曲角度、骨盤角度、前縫工筋外周、及び大腿四頭筋量が挙げられる。
５．５．治療方法
機能的ジストロフィンを提供することによって治療することができる任意の筋ジストロフィー疾患についてヒト対象を治療する方法が提供される。ＤＭＤは、そのような疾患のなかでも最も一般的な疾患であるが、本明細書で提供されるマイクロジストロフィンを発現する遺伝子治療ベクターは、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、筋強直性ジストロフィー（シュタイネルト病）、顔面肩甲上腕型疾患（ＦＳＨＤ）、肢帯筋ジストロフィー、Ｘ連鎖性拡張型心筋症、または眼咽頭型筋ジストロフィーを治療するために投与することができる。本開示のマイクロジストロフィンは、本明細書に記載される任意のマイクロジストロフィンであり得、Ｎ末端からＣ末端の順にＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ、ＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴ、ＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ１６－Ｒ１７－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ、またはＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ１６－Ｒ１７－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴのドメインを有するものを含み、ここで、ＡＢＤは、ジストロフィンのアクチン結合ドメインであり、Ｈ１は、ジストロフィンのヒンジ１領域であり、Ｒ１は、ジストロフィンのスペクトリン１領域であり、Ｒ２は、ジストロフィンのスペクトリン２領域であり、Ｒ３は、ジストロフィンのスペクトリン３領域であり、Ｈ３は、ジストロフィンのヒンジ３領域であり、Ｒ１６は、ジストロフィンのスペクトリン１６領域であり、Ｒ１７は、ジストロフィンのスペクトリン１６領域であり、Ｒ２４は、ジストロフィンのスペクトリン２４領域であり、ＣＲは、ジストロフィンのシステインリッチ領域であり、ＣＴは、α１－シントロフィン結合部位及び／またはα－ジストロブレビン結合部位を含むジストロフィンのＣ末端領域の少なくとも一部である。実施形態において、マイクロジストロフィンは、配列番号１、２、７９、９１、９２、または９３のアミノ酸配列を有する。マイクロジストロフィンをコードするベクターは、ある特定の実施形態において、構成的発現、筋特異的発現（骨格筋、平滑筋及び心筋特異的発現を含む）、またはＣＮＳ特異的発現のための調節エレメント、及びポリＡ部位などの他の調節エレメントに作動可能に連結された、配列番号２０、２１、８１、１０１、１０２または１０３の核酸配列を有するものを含む。そのような核酸は、例えば、ＩＴＲ配列、特に、ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列によって挟まれたｒＡＡＶゲノムとの関係におけるものであり得る。ある特定の実施形態において、配列番号５３、５４、５５、５６、８２、１０４、１０５、または１０６の核酸配列を有するコンストラクトを含むｒＡＡＶを、それを必要とする対象に投与することを含む、方法及び組成物。実施形態において、患者は、ＤＭＤと診断されており、及び／またはＤＭＤに関連する症状（複数可）を有する。マイクロジストロフィンをコードする導入遺伝子を送達するために使用される組み換えベクターは、セクション５．３．４．１に記載される。そのようなベクターは、ヒト筋肉細胞（骨格筋、平滑筋及び／または心筋を含む）に対して向性を有する必要があり、非複製ｒＡＡＶ、特にＡＡＶ８カプシドを有するものを含み得る。図１Ａ及び図２２に示されるものなどの組み換えベクターは、組み換えベクターが筋肉組織またはＣＮＳに入るような任意の様式で投与することができ、好ましくは、組み換えベクターを血流中に導入することによって投与され得る。
そのような遺伝子治療がなされる対象は、マイクロジストロフィンの筋肉への送達を介した遺伝子治療に応答する対象であり得る。特定の実施形態において、方法は、ＤＭＤもしくはベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、筋強直性ジストロフィー（シュタイネルト病）、顔面肩甲上腕型疾患（ＦＳＨＤ）、肢帯筋ジストロフィー、Ｘ連鎖性拡張型心筋症、もしくは眼咽頭型筋ジストロフィーなどの他の筋ジストロフィー疾患と診断されているか、またはそれらに関連する１つ以上の症状を有し、マイクロジストロフィンによる治療に応答することが確認されているか、またはマイクロジストロフィンの送達を介した遺伝子による治療の良い候補者であるとみなされた患者を治療することを包含する。特定の実施形態において、患者は、合成版のジストロフィンによる治療を以前に受けたことがあり、合成版のジストロフィンのうちの１つ以上に対して応答することがわかっている。反応性を決定するために、合成版のジストロフィン（例えば、ヒト細胞培養、バイオリアクターなどで生産されたもの）が対象に直接投与され得る。
治療上有効な用量の任意のそのような組み換えベクターは、組み換えベクターが筋肉（例えば、骨格筋または心筋）に入るような任意の様式で投与されるべきであり、好ましくは、組み換えベクターを血流中に導入することによって投与される。特定の実施形態において、ベクターは、皮下、筋肉内または静脈内投与される。筋肉内、皮下、または静脈内投与では、筋肉（骨格筋、心筋、及び／または平滑筋を含む）及び／またはＣＮＳの細胞内で可溶性導入遺伝子産物の発現が生じるはずである。導入遺伝子産物の発現は、筋肉及び／またはＣＮＳにおける導入遺伝子産物の送達及び維持をもたらす。あるいは、送達は、遺伝子治療送達及び肝臓におけるマイクロジストロフィンの発現をもたらし得、次いで、可溶性マイクロジストロフィン生成物が血流を通って筋肉に運ばれ、そこでその治療効果を付与することができる。他の実施形態において、組み換えベクターは、ＣＮＳ、例えば、限定するものではないが、髄腔内、脳室内、鼻腔内または脈絡膜上に送達されるように投与され得る。
特定の対象に投与される実際の用量は、限定するものではないが、体重、状態の重症度、疾患タイプ、以前もしくは現在の治療的介入、対象の特発症、及び／または投与経路を含む身体的及び生理学的要因などのパラメーターを考慮して、臨床医によって決定され得る。
用量は、１×１０８ベクターゲノム／（ｖｇ／ｋｇ）～１×１０１５ｖｇ／ｋｇの範囲であり得る。治療上有効な量は、治療レジメンの過程（すなわち、日、週、月など）で単回または複数回用量を投与することによって達成することができる。
静脈内、筋肉内、皮下または肝臓投与に好適な医薬組成物は、生理学的に適合する水性緩衝液を含む製剤緩衝液中の、マイクロジストロフィンをコードする導入遺伝子を含む組み換えベクターの懸濁液を含む。製剤緩衝液は、多糖、界面活性剤、高分子、または油のうちの１つ以上を含み得る。
本明細書で提供される遺伝子治療ベクターは、コルチコステロイド、ベータ遮断剤及びＡＣＥ阻害剤を含む、筋ジストロフィーのための他の治療薬と組み合わせて投与され得る。
５．５．１ 筋肉の変性／再生
ジストロフィンの欠損は、機会的不安定性をもたらし、筋線維が弱くなり、最終的には収縮中に崩壊する。ＤＭＤ患者は、まず小児期の早い段階で骨格筋の低下を示し、その後、急速に筋肉量の減少、後弯症として知られる脊柱の湾曲、麻痺へと進行し、最終的には、３０歳前に心肺機能不全により死亡する。ＤＭＤ患者の骨格筋はまた、筋肉肥大、特にふくらはぎの筋肉肥大、局所的な壊死性筋線維のエビデンス、筋線維径の異常な変動、脂肪堆積の増加及び線維症、ならびに免疫組織切片におけるジストロフィン染色の欠如も示す。
本明細書で提供される遺伝子治療の処置の目標は、ＤＭＤもしくは他の筋ジストロフィー疾患の進行を遅延または阻止すること、またはＤＭＤもしくは他の筋ジストロフィー疾患に関連する１つ以上の症状の重症度を軽減することである。特に、本明細書で提供される遺伝子治療の目標は、筋肉変性を減少させること、筋肉再生の誘導／改善すること、及び／または筋肉再生を妨げ、運動能力の低下、整形外科的合併症、また最終的には呼吸不全及び心不全を引き起こす炎症及び線維症を含む下流の病態を予防／減少させることである。
有効性は、Ｎｏｒｔｈ Ｓｔａｒ Ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ（ＮＳＡＡ）（３４を最高値として完全な自立機能を示す序数法による尺度）または年齢に応じた修正評価を使用して、総運動機能におけるベースラインからの変化を測定すること、歩行機能の変化を評価すること（例えば、６分（歩行距離＜３００ｍ、３００～４００ｍ、または＞４００ｍ））、背臥位から立ち上がりまでに要する時間のベースラインからの変化を測定する時間機能試験を実施すること（１～８秒（良好）、８～２０秒（中程度）、及び２０～３５秒（不良））、階段昇り時間（４段）及び走行／歩行時間評価（１０メートル）、ならびに上肢及び下肢の筋力のベースラインからの変化を評価する筋力測定を実施することによって、モニタリングすることができる［Ｍａｚｚｏｎｅ ｅｔ ａｌ，Ｎｏｒｔｈ Ｓｔａｒ Ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ，６－ｍｉｎｕｔｅ ｗａｌｋ ｔｅｓｔ ａｎｄ ｔｉｍｅｄ ｉｔｅｍｓ ｉｎ ａｍｂｕｌａｎｔ ｂｏｙｓ ｗｉｔｈ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ，Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ２０（２０１０）７１２－７１６］。
有効性はまた、筋肉が損傷した時に異常に高い値になる酵素である血清クレアチンキナーゼ（ＣＫ）レベルのベースラインからの変化（低下）（正常値：３５～１７５Ｕ／Ｌ、ＤＭＤ：５００～２０，０００Ｕ／Ｌ）、血清または尿中クレアチニンレベル（ＤＭＤ：１０～２５μｍｏｌ／Ｌ、軽度ＢＭＤ：２０～３０μｍｏｌ／Ｌ、正常＞５３μｍｏｌ／Ｌ、ＤＭＤ）及び筋肉生検におけるマイクロジストロフィンタンパク質レベルを測定することによって、モニタリングすることができる。また、骨格筋への脂肪組織の浸潤（脂肪率）を評価するために、磁気共鳴断層撮影（ＭＲＩ）が実施され得る（Ｂｕｒａｋｉｅｗｉｃｚ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．“Ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ ｆａｔ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｍｕｓｃｌｅ ｂｙ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＭＲＩ ｉｎ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．２６４，１０（２０１７）：２０５３－２０６７．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００４１５－０１７－８５４７－３）。
したがって、例えば、歩行機能を評価するＮｏｒｔｈ Ｓｔａｒｔ Ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔを使用して測定した場合、未治療の対照または核酸組成物による治療前の対象と比較して、総運動機能を改善するか、または総運動機能の低下を遅らせる、核酸組成物及び当該組成物を投与する方法が提供される。あるいは、本明細書に記載される核酸組成物及び核酸組成物を投与する方法は、背臥位から立ち上がりまでに要する時間を測定する時間機能試験、筋力測定によって評価した場合の総運動機能の改善または総運動機能の低下の減少、または血清クレアチニンキナーゼ（ＣＫ）レベルの低下もしくは脂肪組織の浸潤の減少をもたらす。血清クレアチニンキナーゼ手ベルは、更に、そのアイソザイム分画であるＭＭ－ＣＰＫ（骨格筋）、ＢＢ－ＣＰＫ（脳）、及びＭＢ－ＣＰＫ（心臓）に分けることができる。
また、例えば、歩行機能を評価するＮｏｒｔｈ Ｓｔａｒｔ Ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔを使用して測定した場合、または背臥位から立ち上がりまでに要する時間を測定する時間機能試験によって評価した場合、未治療の対照または核酸組成物による治療前の対象と比較して、総運動機能を改善するか、または総運動機能の低下を遅らせること、あるいは、筋力測定による改善、または血清クレアチニンキナーゼレベルの低下を示すことに有効である、本明細書に記載されるマイクロジストロフィンをコードする核酸配列を含む、特に、ベクター、ウイルスベクター、及びＡＡＶベクターを含有する遺伝子カセットを含む、ある量の核酸組成物を含む組成物が提供される。
５．５．２ 心拍出量
骨格筋の症状がＤＭＤの決定的な特徴であるとみなされるが、患者は、呼吸不全または心不全で亡くなることが最も一般的である。ＤＭＤ患者は、収縮機能に必要なジストロフィンが心筋細胞に存在しないため、拡張型心筋症（ＤＣＭ）を発症する。これにより、細胞外カルシウムの流入が生じ、プロテアーゼ活性化、心筋細胞死、組織の壊死、及び炎症のトリガーとなり、最終的には、脂肪の蓄積及び線維症を引き起こす。この過程は、まず、左心室（ＬＶ）に影響を与える。左心室は、血液を身体の大部分に送出する役割を担い、より厚く、したがって、より大きな仕事量を経験する。萎縮した心筋細胞は、横紋筋の喪失、空胞化、断片化、及び核変性を示す。機能上、萎縮及び瘢痕化は、ＬＶの構造的な不安定化及び運動低下を引き起こし、最終的には一般的なＤＣＭに進行する。ＤＭＤは、洞頻脈、概日指標の低下、心拍変動の減少、ＰＲ感覚の短縮、右心室肥大、Ｓ－Ｔセグメント低下及びＱＴｃ延長などの様々なＥＣＧ変化を伴い得る。
本明細書で提供される遺伝子治療の処置は、ＤＭＤ及び他のジストロフィノパチーの進行を遅延または阻止することができ、特に、心機能障害の進行を低減もしくは緩和すること及び／または心機能を維持もしくは改善することができる。有効性は、連続心電図、及び非侵襲的な連続画像検査（例えば、心エコー検査または心臓磁気共鳴画像法（ＣＭＲ））を使用して、試験集団の年齢及び病期に応じた心臓病変または心不全の徴候及び症状を定期的に評価することによって、モニタリングすることができる。ＣＭＲは、努力肺活量（ＦＶＣ）、１秒量（ＦＥＶ１）、最大吸気圧（ＭＩＰ）、最大呼気圧（ＭＥＰ）、最大呼気流速（ＰＥＦ）、咳嗽時最大呼気流速、左室駆出率（ＬＶＥＦ）、左室内径短縮率（ＬＶＦＳ）、炎症、及び線維症のベースラインからの変化をモニタリングするために使用することができる。ＥＣＧは、伝導異常及び不整脈をモニタリングするために使用することができる。特に、ＥＣＧは、ＰＲ間隔、Ｖ１のＲ波、Ｖ６のＱ波、心室再分極、下及び／または上側壁におけるＱＳ波、右脚ブロックにおける伝導障害、ＱＴ Ｃ、及びＱＲＳの正常化を評価するために使用することができる。
したがって、本明細書で開示されるマイクロジストロフィンタンパク質をコードする核酸を含む、遺伝子発現カセット及びウイルスベクターを含む組成物を含む、核酸組成物、ならびにその組成物を投与する方法が提供され、当該組成物は、連続心電図、及び／または非侵襲的な連続画像検査（例えば、心エコー検査または心臓磁気共鳴画像法（ＣＭＲ））によって測定した場合、例えば、ＬＶＥＦ４５％未満への低下及び／または機能の正常化（ＬＶＦＳ≧２８％）の減少を防ぐことによって、心機能を改善もしくは維持するか、または心機能の損失を遅らせる。測定値は、未治療の対照または核酸組成物による治療前の対象と比較され得る。あるいは、本明細書に記載される核酸組成物及び核酸組成物を投与する方法は、努力肺活量（ＦＶＣ）、１秒量（ＦＥＶ１）、最大吸気圧（ＭＩＰ）、最大呼気圧（ＭＥＰ）、最大呼気流速（ＰＥＦ）、咳嗽時最大呼気流速、左室駆出率（ＬＶＥＦ）、左室内径短縮率（ＬＶＦＳ）、炎症、及び線維症のベースラインからの変化をモニタリングすることによって評価した場合、心機能の改善または心機能の損失の減少をもたらす。ＥＣＧは、伝導異常及び不整脈をモニタリングするために使用することができる。特に、ＥＣＧは、ＰＲ間隔、Ｖ１のＲ波、Ｖ６のＱ波、心室再分極、下及び／または上側壁におけるＱＳ波、右脚ブロックにおける伝導障害、ＱＴ Ｃ、及びＱＲＳの正常化を評価するために使用することができる。
５．５．３ 中枢神経系
ＤＭＤ患者の一部には、てんかん、学習及び認知障害、失読症、神経発達障害、例えば、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、自閉症、及び／または強迫性障害、不安障害もしくは睡眠障害などの精神障害を有する場合がある。
本明細書で開示される遺伝子治療の処置の目標は、認知機能を改善することまたはてんかん及び／または精神障害の症状を緩和することであり得る。有効性は、試験集団の年齢及び病期に応じた行動及び認知機能の定期的評価、または発作事象の定量化及び定性化によって、評価され得る。
したがって、認知機能を改善し、発作の発生または重症度を軽減し、ＡＤＨＤ、強迫性障害、不安障害及び／または睡眠障害の症状を緩和する、核酸組成物及びマイクロジストロフィン遺伝子治療組成物を投与する方法が提供される。
５．５．４ 患者主要評価項目
本明細書に記載される組成物（組成物の用量を含む）及び方法の有効性は、治療される対象の臨床評価において評価され得る。患者の主要評価項目には、努力肺活量（ＦＶＣ）、１秒量（ＦＥＶ１）、最大吸気圧（ＭＩＰ）、最大呼気圧（ＭＥＰ）、最大呼気流速（ＰＥＦ）、咳嗽時最大呼気流速、左室駆出率（ＬＶＥＦ）、左室内径短縮率（ＬＶＦＳ）のベースラインからの変化、ＮＳＡＡのベースラインからの変化、Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ Ｕｐｐｅｒ Ｌｉｍｐ（ＰＵＬ）スコアのベースラインからの変化、及びＢｒｏｏｋｅ Ｕｐｐｅｒ Ｅｘｔｒｅｍｉｔｙ Ｓｃａｌｅスコア（Ｂｒｏｏｋｅスコア）のベースラインからの変化、握力、ピンチ力のベースラインからの変化、ＭＲＩによる心筋線維化スコアの変化、ＭＲＩによって評価した上腕（二頭筋）筋脂肪及び線維化、ダイナモメーターを使用した脚力測定、６分間歩行試験、１０分間歩行試験、３Ｄ歩行記録による歩行分析における変化、免疫染色された生検切片の定量的画像化を介したウトロフィン膜染色の変化、ならびに線維サイズと胎児型ミオシン陽性の組み合わせを測定することによる（筋肉生検を介する）再生線維の変化をモニタリングすることを含み得る。例えば、Ｍａｚｚｏｎｅ Ｅ ｅｔ ａｌ，Ｎｏｒｔｈ Ｓｔａｒ Ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ，６－ｍｉｎｕｔｅ ｗａｌｋ ｔｅｓｔ ａｎｄ ｔｉｍｅｄ ｉｔｅｍｓ ｉｎ ａｍｂｕｌａｎｔ ｂｏｙｓ ｗｉｔｈ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ． Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ２０（２０１０）７１２－７１６．；Ａｂｄｅｌｒａｈｉｍ Ａｂｄｒａｂｏｕ Ｓａｄｅｋ，ｅｔ ａｌ，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｄｉａｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｗｉｔｈ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ：Ａ ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｃａｓｅ－ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｔｕｄｙ． Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ（２０１７）Ｎｏｖ；９（１１）：５７３２－５７３９；Ｍａｇｒａｔｈ，Ｐ．ｅｔ ａｌ，Ｃａｒｄｉａｃ ＭＲＩ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ． ＢＩＯＭＡＲＫＥＲＳ ＩＮ ＭＥＤＩＣＩＮＥ（２０１８）ＶＯＬ．１２，ＮＯ．１１．；Ｐａｎｅ，Ｍ．ｅｔ ａｌ，Ｕｐｐｅｒ ｌｉｍｂ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ：２４ ｍｏｎｔｈ ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ｄａｔａ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１８ Ｊｕｎ ２０；１３（６）：ｅ０１９９２２３を参照されたい。
６．１ 実施例１－Ｃｉｓプラスミドを挿入するためのマイクロジストロフィン（ＤＭＤ）遺伝子発現カセットの構築。
同様の骨格を持つＤＭＤコンストラクト：５’－ＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－３’（図１）。４つのコンストラクトは、プロモーターの長さが異なり、１つは、Ｃ末端がなく（ＲＧＸ－ＤＹＳ３）、１つは、イントロンがなく（ＲＧＸ－ＤＹＳ１）、１つは、切断型筋特異的プロモーターを有する（ＲＧＸ－ＤＹＳ４）。全てをＩＴＲによって挟まれたＣｉｓプラスミドにクローニングした。ＤＭＤ遺伝子をコードする全てのＤＮＡ配列は、コドン最適化及びＣｐＧ除去を行う。
６．１．１．ＲＧＸ－ＤＹＳ１及びＲＧＸ－ＤＹＳ２導入遺伝子の組み換え操作
簡潔に述べると、図１Ａに示される、Ｎ末端－ＡＢＤ１－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴ－Ｃ末端をコードする、ＲＧＸ－ＤＹＳ１及びＲＧＸ－ＤＹＳ２のマイクロジストロフィンコンストラクトのヒトコドン最適化及びＣｐＧ除去ヌクレオチド配列を、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｇｅｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して合成した。所望のＣ末端は、次の２つのプライマー：５′：ＴＧＡ ＣＴＣ ＧＡＧ ＡＧＧ ＣＣＴ ＡＡＴ ＡＡＡ ＧＡＧ Ｃ（配列番号 ４３），３′：ＣＣＴ ＴＧＧ ＡＧＡ ＣＴＧ ＴＧＧ ＡＧＡ ＧＧＴ Ｇ（配列番号 ４４）を使用した部位特異的変異導入によって作製した。ＶＨ４イントロン配列（以下のセクション６．１．４参照）を有するＲＧＸ－ＤＹＳ２を生成するために、マイクロジストロフィンをコードするヌクレオチド配列を含有する断片を、ＡＡＶ ＩＴＲ、複製起点、及び抗生物質耐性を含有する骨格プラスミドに凝集的にライゲートして、ＲＧＸ－ＤＹＳ２プラスミド構築体を作製した。配列解析により、イントロンの５′スプライシング部位に余分なシトシン（Ｃ）があることがわかったため、余分なＣヌクレオチドを部位特異的変異導入法によって除去した。これにより得られたコンストラクトＲＧＸ－ＤＹＳ２は、ＶＨ４イントロンを含有する。同様に、部位特異的変異導入を利用してＶＨ４イントロンを除去し、ＲＧＸ－ＤＹＳ１を得た。
６．１．２．ＲＧＸ－ＤＹＳ３及びＲＧＸ－ＤＹＳ４導入遺伝子の組み換え操作
コンストラクトＲＧＸ－ＤＹＳ３（図１Ａ）は、上に詳述したＲＧＸ－ＤＹＳ１及びＲＧＸ－ＤＹＳ２コンストラクトのマイクロジストロフィンをコードするがＣＴドメインを含まないように操作した。このコンストラクトは、コンストラクトの５’末端にＶＨ４イントロンを含む。
ＲＧＸ－ＤＹＳ４（図１Ａ）は、全長ＳＰｃ５－１２プロモーターではなく最小ＳＰｃ５－１２プロモーター（配列番号４０；セクション６．１．３参照）に連結したＲＧＸ－ＤＹＳ２と同様のマイクロジストロフィン及びＶＨ４イントロンをコードするカセットを含有する。
６．１．３．ＲＧＸ－ＤＹＳ５の組み換え操作
コンストラクトＲＧＸ－ＤＹＳ５（図１Ａ）は、１４０アミノ酸長のＣ末端ドメイン（配列番号８３のアミノ酸配列を有する切断型Ｃ末端ドメイン）を有し、α１－シントロフィン結合部位を含有するが、ジストロブレビン結合部位を含有しない、ＤＹＳ５（配列番号７９のアミノ酸配列）と名付けられたマイクロジストロフィンをコードするように操作した。プラスミドは、ヒトコドン最適化及びＣｐＧ除去バージョンのマイクロジストロフィンＤＹＳ５導入遺伝子、合成筋肉プロモーター（例えば、ｓｐｃ５－１２）、及び小ポリ（Ａ）シグナル配列をコードし、ＩＴＲによって挟まれている（配列番号８２のヌクレオチド配列）。
プラスミドＲＧＸ－ＤＹＳ５は、プラスミドＲＧＸ－ＤＹＳ１のＤＹＳ１の長いバージョンのＣ末端を、中間の長さのバージョンのＣ末端テールに置き換えることによって作製した。簡潔に述べると、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから、ＥｃｏＲＶ部位とＮｈｅＩ部位に挟まれた中間バージョンのＣ末端及びＲＧＸ－ＤＹＳ１プラスミドの１７ｂｐの重複配列を含有するｇＢｌｏｃｋ－ＤＭＤ－１．５テールを合成した。供給源のプラスミドＲＧＸ－ＤＹＳ１を制限酵素ＮｈｅＩ及びＥｃｏＲＶ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、次いで、ｇＢｌｏｃｋ－ＤＭＤ１．５テールとｉｎ－ｆｕｓｉｏｎライゲーションを行った。酵素消化及び後続のシーケンシングよって、最終プラスミドＲＧＸ－ＤＹＳ５を確認した。
タンパク質の長さ及び発現は、ウェスタンブロットによって確認した。この目的のために、筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２細胞に異なるプラスミドをトランスフェクトした。分化の４日後、細胞を溶解緩衝液中に回収した。各プラスミドサンプルから得た２０μｇの細胞溶解物をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにロードした。マイクロジストロフィンタンパク質バンドを検出するために、ジストロフィンに対する抗体（１ｃ７）（ＭＡＮＥＸ１０１１Ｂ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ）を使用した。プラスミドＲＧＸ－ＤＹＳ５（ＤＹＳ５を発現）から生成されるマイクロジストロフィンタンパク質バンドは、ＲＧＸ－ＤＹＳ１（ＤＹＳ１を発現）よりも著しく短く、ＤＹＳ３よりも長かった（図１Ｂ及びＣ）。図１Ｂを生成した実験において、ＤＹＳ３導入遺伝子は、ユビキタスＣＢプロモーターによって駆動されたが、ＤＹＳ１及びＤＹＳ５導入遺伝子発現は、筋特異的プロモーターによって駆動された。一貫した総タンパク質回収の指標として、α－アクチンタンパク質対照を使用した（図１Ｃ）。
ＲＧＸ－ＤＹＳ５のパッケージング効率を調べるために、ＨＥＫ２９３細胞を使用してＲＧＸ－ＤＹＳ５をＡＡＶ８ベクターにパッケージし、振盪フラスコ培養及びアフィニティー精製後にベクターＲＧＸ－ＤＹＳ５の力価を決定した。平均力価は、これらのベンチトップ生産実験において、ＲＧＸ－ＤＹＳ１をパッケージしたＡＡＶ８よりも高く、ＲＧＸ－ＤＹＳ３をパッケージしたＡＡＶ８と同等であった。（データ示さず。）
６．１．４．ＶＨ４イントロン及びｍｉｎＳＰｃ５－１２プロモーター
ＲＧＸ－ＤＹＳ２、ＲＧＸ－ＤＹＳ３及びＲＧＸ－ＤＹＳ４のＶＨ４イントロンは、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域（配列番号４１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０１９４３８．１）から得られる。ＶＨ４イントロンのスプライシング効率及び正確性を、Ｃ２Ｃ１２細胞においてｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した。まず、逆転写ＰＣＲ産物のシーケンシングを実施して、正しいスプライシングイベントが起きたかどうかを調べた。ＲＧＸ－ＤＹＳ２プラスミドをＣ２Ｃ１２筋芽細胞にトランスフェクトし、細胞を分化培地で３日間培養した。次いで、細胞をＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成及びＰＣＲに供した。ＰＣＲに使用したプライマーは、プライマー１：ＧＧＣ ＣＣＡ ＣＧＡ ＧＣＴ ＡＣＣ ＣＧＧ ＡＧ（配列番号 ４５）、プライマー２：ＣＴＴ ＣＣＡ ＧＣＡ ＧＡＴ ＣＣＡ ＧＣＡ ＧＣＣ（配列番号４６）であった。予想されるＰＣＲ産物をゲル精製し、サンガーシーケンシングに供した。シーケンシングの結果、正確なスプライシングイベントが起きたことが判明した。次いで、マイクロジストロフィンコード配列をＧＦＰレポータータンパク質のコード配列に置き換えたコンストラクトで、ＶＨ４イントロンの機能を試験した。また、分化Ｃ２Ｃ１２細胞において、ＶＨ４イントロン含有または不含有のＳＰｃ５－１２プロモーターによって駆動されるＧＦＰ遺伝子を含有するＡＡＶ８ベクターを様々な投与量で試験した。画像を撮り、Ｃｙｔａｔｉｏｎ ５ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒを使用して定量した。定量化及び画像データは全て、ＶＨ４イントロンがＧＦＰ発現をほぼ５倍増加させることを示した（図２Ａ～Ｆ及び図３）。
６．２ 実施例２－分化Ｃ２Ｃ１２細胞を使用したマイクロジストロフィンベクターのｉｎ ｖｉｔｒｏ効力アッセイ
ＨＥＫ２９３細胞におけるＡＡＶ８－ＣＡＧ－ＧＦＰベクターの感染力をアッセイすることによる、マイクロジストロフィンベクターの効力を試験するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを開発した。感染３日後（１×１０Ｅ５ｖｇ／細胞）、ＧＦＰ陽性ＨＥＫ２９３細胞はほとんど観察されず（データ示さず）、ＡＡＶ８ベクターのＨＥＫ２９３細胞への感染力は低いことが示された。次いで、ＡＡＶ８－ＣＡＧ－ＧＦＰベクターがＣ２Ｃ１２筋芽細胞を形質転換する能力を同様に試験した。未分化Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞にＡＡＶ８－ＣＡＧ－ＧＦＰベクターを感染させ（１×１０ｅ６ｖｇ／細胞）、次いで、３日間、分化させた。ＨＥＫ２９３細胞と同様に、ＧＦＰ陽性細胞はほとんど観察されず、未分化Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞はｒＡＡＶ８による感染力が低いことが示された（データ示さず）。Ｃ２Ｃ１２細胞を分化培地（ＤＭＥＭ＋２％ウマ血清）で３日間培養し、次いで、ＡＡＶ８－ＣＡＧ－ＧＦＰを感染させることによって、分化したＣ２Ｃ１２細胞での感染力を試験した。感染から３日後及び分化から３日後に画像を撮った。多くのＧＦＰ陽性細胞が視認されたことから、分化した筋管細胞がＡＡＶ８ベクターによる形質導入に感受性があることが示唆された（図４Ａ～Ｃ）。
筋肉細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ感染系の確立が成功した後に、マイクロジストロフィンベクターの効力をアッセイした。例えば、数ヶ月の間をあけて同じ生産プロセスを使用して作製した２つのバッチのベクター（ＲＧＸ－ＤＹＳ１－ＲＳ及びＲＧＸ－ＤＹＳ１－０３）の効力を、分化したＣ２Ｃ１２細胞で試験した。使用した一次抗体は、ヒトジストロフィンに対するモノクローナル抗体（ＤＳＨＢカタログ番号ＭＡＮＨＩＮＧＥ１Ａ（６Ｆ１１））であった。データの解析には、ＪＭＰソフトウェアを使用した。試験ベクター（ＲＧＸ－ＤＹＳ１－０３）の相対効力は、参照対照（ＲＧＸ－ＤＹＳ１－ＲＳ、１００％）の８１．４７％であったことから、これら２つのベクターの感染力は非常に類似していることが示された（図５Ａ～Ｈ）。
ＤＹＳ１、ＤＹＳ２、ＤＹＳ３、またはＤＹＳ４ベクターをパッケージした組み換えＡＡＶのバッチを生産し、ベクター効力の指標として、その相対感染力を、分化した筋肉細胞株のＣ２Ｃ１２細胞において比較した（図６）。簡潔に述べると、マウス筋肉細胞株のＣ２Ｃ１２細胞を６ウェルプレートに２×１０Ｅ５細胞／ウェルで播種し、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で１０％ウシ胎児（ＦＢＳ）とともに培養した。次いで、２日目に、細胞を分化培地（インスリン（１ｕｇ／ｍｌ）を添加した２％ウシ血清含有ＤＭＥＭ）に移した。３日の分化後、細胞に異なるＤＭＤベクターを２．５Ｅ４ｖｇ／細胞の用量で感染させた。感染から３日後に、感染細胞を回収し、ＤＮＡ抽出、続いて、Ｑ－ＰＣＲを行った。ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（カタログ番号：６９５０４、Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ＤＮＡを抽出した。内因性対照（グルカゴン遺伝子）及びＡＡＶベクターのいずれにもＴａｑｍａｎアッセイを使用した。内因性対照としてのマウスグルカゴン遺伝子により、ベクターのコピー数を正規化することができた。マウスグルカゴンプライマー及びプローブの配列は、次の通りであった：グルカゴン－リアル－Ｆ（マウス）：ＡＡＧＧＧＡＣＣＴＴＴＡＣＣＡＧＴＧＡＴＧＴＧ（配列番号４７）；グルカゴン－リアル－Ｒ（マウス）：ＡＣＴＴＡＣＴＣＴＣＧＣＣＴＴＣＣＴＣＧＧ（配列番号４８）；Ｔａｑｍａｎマウスグルカゴンプローブ：ＦＡＭ－ＣＡＧＣＡＡＡＧＧＡＡＴＴＣＡ－ＭＧＢ（配列番号４９）。標的ＡＡＶベクターについては、プライマー及びプローブをｍｉｃｒｏ－ｄｙｓ配列を認識するように設計し、次の通りであった：Ｄｙｓ－Ｃ－Ｆ：ＴＧＧ ＧＣＣ ＴＧＣ ＴＣＣ ＴＧＣ ＡＴＧ（配列番号５０）；Ｄｙｓ－Ｃ－Ｒ：ＡＴＣ ＴＣＡ ＧＧＣ ＴＴＧ ＧＣＡ ＡＡＣ（配列番号５１）；Ｄｙｓ－Ｃ－プローブ：ＦＡＭ－ＣＡＡ ＴＡＴ ＴＧＡ ＧＣＣ ＡＴＣ ＡＧＴ Ｃ－ＭＧＢ（配列番号５２）。二倍体細胞あたりのコピー数は、以下に従って算出した：
Figure 2023503637000084
ＤＹＳ１－ＲＳバッチを参照対照とみなし（１．０に設定）、他の全てのベクターを参照対照と比較した（ベクターコピー数／参照対照（倍率変化））。図６に示されるように、全てのＡＡＶ８ベクターの感染力は同等であり（５０～１５０％感染力が許容範囲）、良好な品質のベクターであることが示された。
分化したＣ２Ｃ１２細胞に様々なＡＡＶ８ベクターを２つの異なる用量（１ｅ５ｖｇ／細胞及び５ｅ４ｖｇ／細胞）で感染させた後に、マイクロジストロフィン遺伝子のＲＮＡ発現レベルを決定した。ＲＧＸ－ＤＹＳ３ベクターをトランスフェクトした細胞は、ＲＧＸ－ＤＹＳ１ベクターをトランスフェクトした細胞におけるマイクロジストロフィンｍＲＮＡレベルと比較して、２～３倍高いマイクロジストロフィンｍＲＮＡレベルを有した（図７）。この差は、ＲＧＸ－ＤＹＳ３安定化ｍＲＮＡにＶＨ４イントロンが存在することに起因すると思われる。
６．３ 実施例３－ｍｄｘマウスモデルへの遺伝子治療投与
６．３．１．試験方法
ＨＥＫ２９３細胞を使用してＲＧＸ－ＤＹＳ１をＡＡＶ８ベクターにパッケージしたところ、ベクターＲＧＸ－ＤＹＳ１の力価は、４．６Ｅ１３ｖｇ／ｍｌであった。簡潔に述べると、ＲＧＸ－ＤＹＳ１ ＡＡＶ８ベクターを２Ｅ１４ｖｇ／ｋｇの用量で５週齢のオスのｍｄｘマウスに尾静脈注射により全身送達した（ｎ＝１３）。マウスの体重を定期的に測定した。処置後５週目に筋握力を測定し、注射後６週目にｉｎ ｖｉｔｒｏ筋肉収縮機能アッセイを実施した。結果を表１１に示す。
Figure 2023503637000085
６．３．２．体重及び組織重量
骨格筋の変性及び再生の病因があるため、ｍｄｘマウスは、通常、野生型マウスよりも重い。図８から明らかなように、ＲＧＸ－ＤＹＳ１ベクターによる処置は、体重を大幅に減少させた。事実、処置したマウスの体重は、処置後２週間では、野生型マウスと同等であった。
注射後６週目に全てのマウスを安楽死させ、各種臓器及び筋肉の重量を測定した。ＲＧＸ－ＤＹＳ１処置マウスは、臓器及び筋肉（ヒラメ筋、大腿四頭筋、及び三頭筋ならびに前脛骨筋（ＴＡ）を含む）の重量に大幅な減少を示した（図９Ａ及び９Ｂ）。
６．３．３． 握力
握力を測定するために、マウスを試験室におよそ１０分間馴化させてから、手順を開始した。実験者は処置を盲検化し、測定するマウスは別の人から実験者に手渡された。マウスを前肢のワイヤーグリッドの上に静かに置き、前足だけが水平バーの１つを掴むことができるようにした。両前足が同じバーを掴んでおり、胴体が地面に対して水平でバーに対して平行であることを確認した後、グリップを離すまで、マウスをグリッドの全長にわたって均一な力で一定に引っ張った。馴化及び試験のために、連続５日間にわたって、各動物で５回の良好な引っ張りを行った。個々のマウスの最大握力を分析するために、１つの最も良い記録値（最大力）を算出した。体重に基づいて、正規化した筋力（ＫＧＦ／ｋｇ）を算出した。
処置後５週目での握力測定では、処置により、罹患したビヒクル対照と比較して、ＲＧＸ－ＤＹＳ１処置マウスの筋力が有意に増加したことが明らかとなった（ｐ≦０．００１）（図１０）。
６．３．４．ｉｎ ｖｉｔｒｏ筋力
ケタミン及びキシラジンを使用してマウスに麻酔をかけた。各マウスから右後肢のＥＤＬ筋を摘出し、リンゲル液（ｐＨ７．４）を入れた２５℃の酸素浴（９５％Ｏ２、５％ＣＯ２）中に浸漬した。非疲労性単収縮を使用して、力の生成に最適な長さに筋肉を調整した。電極で筋肉を刺激して強縮性収縮を誘発し、２分間の休息間隔を置いた。後続の強縮ごとに、力がプラトーに達するまで（通常２５０Ｈｚ付近で生じる）、刺激周波数を２０、３０または５０Ｈｚの刻みで増加させた。筋肉量、線維長、組織密度に基づいて、筋肉の断面積を測定した。最後に、筋肉の断面積に基づいて、比筋力（ｋＮ／ｍ２）を算出した。
ビヒクルｍｄｘマウス（ｎ＝１３）は、健常なＢＬ１０マウス（履歴データ、ｎ＝１４）と比較して、最大筋力及び比筋力の有意な低下を示した。ＲＧＸ－ＤＹＳ１によるｍｄｘマウスの処置は、６週目にビヒクル対照と比較して、最大筋力及び比筋力の両方の有意な改善をもたらした（図１１）。
６．３．５．心機能
血圧（ＢＰ）を測定するために、１．５％イソフルオランを使用してマウスを鎮静化させ、麻酔水準を常にモニタリングし、体温をａｔ３６．５～３７．５８℃に維持する。心拍数は、４５０～５５０拍／分に維持する。ＢＰカフを尾部周辺に付け、次いで、尾部をセンサーアセンブリーに配置して、麻酔中、非侵襲ＢＰをモニタリングする。ＢＰ測定を１０回連続で行う。尾部ＢＰの定性的及び定量的測定は、収縮期圧、拡張期圧及び平均圧を含め、解析ソフトウェアを使用してオフラインで行う。例えば、Ｗｅｈｌｉｎｇ－Ｈｅｎｒｉｃｋｓ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．１４；Ｕａｅｓｏｏｎｔｒａｃｈｏｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０１４，Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．１２を参照されたい。
覚醒状態で自由に動くマウスのＥＣＧの波高と間隔時間をモニタリングするために、無線式テレメトリー装置が使用される。送信ユニットを麻酔したマウスの腹腔内に埋め込み、２つの電気リードをリードＩＩ方向で心尖及び右肩峰の近くに固定する。データ記録用のコンピュータシステムに接続されたアンテナ受信機の上のケージにマウスを一匹ずつ収容する。フィルタリングしていないＥＣＧデータを、１時間ごとに１０秒間、３５日間収集する。外科手術からの回復を考慮し、麻酔の影響がおさまったことを確実にするために、最初の７日間のデータは破棄する。データ波形及びパラメーターをＤＳＩ解析パッケージ（ＡＲＴ ３．０１及びＰｈｙｓｉｏｓｔａｔ ４．０１）で解析し、測定値を集計及び平均して、心拍数、ＥＣＧ波高及び間隔時間を決定する。不整脈について、２人の独立した観察者が未加工のＥＣＧ波形を精査する。
試験マウスの心臓での線維化の程度を測定するために、ピクロシリウスレッド染色が実施される。簡潔に述べると、試験終了時に、安楽死の直後、心筋を摘出し、後の処理のために、１０％ホルマリンに固定する。心臓を切片化し、パラフィン切片をキシレンで脱パラフィンし、続いて、ワイゲルトヘマトキシリンによる核染色を８分間行う。次いで、洗浄してから、ピクロシリウスレッド（０．５ｇのシリウスレッドＦ３Ｂ、ピクリン酸飽和水溶液）で更に３０分間染色する。切片をキシレンで３回透徹し、Ｐｅｒｍｏｕｎｔに封入する。Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ８００（Ｎｉｋｏｎ，Ｊａｐａｎ）顕微鏡を使用して、無作為に５枚のデジタル画像を撮影し、Ｉｍａｇｅ Ｊ（ＮＩＨ）を使用して盲検化分析を行う。
動物を安楽死させる際に血液サンプルを心臓穿刺で採取し、採取した血清を筋肉のＣＫレベルの測定に使用する。
６．４ 実施例４ ベクターの生体内分布
ビヒクル処置ｍｄｘマウス及びＲＧＸ－ＤＹＳ１処置ｍｄｘマウスを処置後６週目に屠殺し、Ｓｔｉｌｌａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＮａｉｃａ ｃｒｙｓｔａｌ ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍを使用して、骨格筋、心筋、及び肝細胞を含む様々な組織におけるベクターコピー数を評価した。
４週齢のオスの筋ジストロフィーｍｄｘマウスに尾静脈注射を介してＲＧＸ－ＤＹＳ１ベクターを投与した。注射後６週目に、マウスを屠殺し、ベクターコピー数を得るために組織をトータルＤＮＡ抽出及びｄｄＰＣＲアッセイに供した。
採取した組織からトータルＤＮＡをＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔで抽出し、ＤＮＡ濃度をＮａｎｏｄｒｏｐ分光光度計を使用して測定した。組織のベクターコピー数を決定するために、Ｎａｉｃａ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ （Ｓｔｉｌｌａ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でデジタルＰＣＲを実施した。ここでは、ジストロフィン導入遺伝子及び内因性対照遺伝子を同時に測定するために、２色のマルチプレックスシステムを適用した。簡潔に述べると、ジストロフィンプローブをＦＡＭ（６－カルボキシフルオレセイン）色素で標識し、内因性対照グルカゴンプローブをＶＩＣ蛍光色素で標識した。マウスグルカゴンプライマー及びプローブの配列は、次の通りであった：グルカゴン－リアル－Ｆ（マウス）：ＡＡＧ ＧＧＡ ＣＣＴ ＴＴＡ ＣＣＡ ＧＴＧ ＡＴＧ ＴＧ（配列番号 Ｘ）；グルカゴン－リアル－Ｒ（マウス）：ＡＣＴ ＴＡＣ ＴＣＴ ＣＧＣ ＣＴＴ ＣＣＴ ＣＧＧ；Ｔａｑｍａｎマウスグルカゴンプローブ：ＶＩＣ－ＣＡＧ ＣＡＡ ＡＧＧ ＡＡＴ ＴＣＡ－ＭＧＢ。ＡＡＶベクターについては、プライマー及びプローブをジストロフィン遺伝子のＣ末端を認識するように設計した：Ｄｙｓ－ｄｄ－Ｆ２：ＡＣＡ ＧＡＴ ＡＣＣ ＴＧＴ ＴＣＡ ＡＧＣ ＡＡＧ ＴＧＧ Ｃ（配列番号 １２２）；Ｄｙｓ－ｄｄ－Ｒ２：ＴＣＡ ＡＴＣ ＴＣＡ ＧＧＣ ＴＴＧ ＧＣ（配列番号 １２３）；Ｄｙｓ－Ｃ－プローブ：ＦＡＭ－ＣＡＡ ＴＡＴ ＴＧＡ ＧＣＣ ＡＴＣ ＡＧＴ Ｃ－ＭＧＢ（配列番号 １２４）。二倍体細胞あたりの特定組織における送達ベクターのコピー数は、以下に従って算出した：
Figure 2023503637000086
ＲＧＸ－ＤＹＳ１投与により、肝組織で最大のベクターコピー数が得られた（４３７±７８コピー／細胞、ｎ＝１３）。心筋（２３±９、ｎ＝１３）及び骨格筋（前脛骨筋（ＴＡ）２８±１０コピー／細胞、長指伸筋（ＥＤＬ）２３±１１コピー／細胞、横隔膜筋２８±２９コピー／細胞、三頭筋４９±２２コピー／細胞）及び全てが顕著なベクター分布を示した（図１２）。
６．５ 実施例５－ｎＮＯＳを含むＤＡＰＣの回復
ジストロフィン関連タンパク質は、ジストロフィンとともにジストロフィン関連タンパク質複合体（ＤＡＰＣ）として知られる複合体を形成し、橋渡しとして機能し、細胞内の細胞骨格アクチンを細胞外マトリックスを通して基底膜に接続する。Ｓａｄｏｕｌｅｔ－Ｐｕｃｃｉｏ，Ｈ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ，Ｄｙｓｔｒｏｂｒｅｖｉｎ ａｎｄ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ：ａｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ ｍｏｔｉｆｓ．（１９９７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４：１２４１３－８。ＤＡＰＣは、いくつかのサブ複合体：ジストログリカン、サルコグリカン、及びシントロフィン／ジストロブレビンから構成され、収縮と弛緩の繰り返しサイクル中における線維の完全性の維持及び細胞シグナル伝達に集合的に関与している。同上（図１３）。野生型ジストロフィンにおいて、β－ジストログリカン結合部位は、ヒンジ４及びシステインリッチ（ＣＲ）ドメインに位置する。ジストロフィンのＷＷドメインは、ベータ－ジストログリカンと相互作用するＥＦハンド領域を必要とする（Ｒｅｎｔｓｃｈｌｅｒ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．１９９９，Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ３８０：４３１－４２）。ＲＧＸ－ＤＹＳ１は、ジストロブレビン及びシントロフィン結合ドメインを含有するＣ末端の一部を含む（配列番号１６）（表１参照）。シントロフィンの重要な機能の１つは、神経性一酸化窒素合成酵素（ｎＮＯＳ）などのシグナル伝達タンパク質を筋鞘に固定することである。Ａｄａｍｓ，Ｍ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ，２０００． Ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ α１－ｓｙｎｔｒｏｐｈｉｎ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ ａｂｅｒｒａｎｔ ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ ｓｙｎａｐｓｅｓ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ｕｔｒｏｐｈｉｎ． Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １５０：１３８５－９８。したがって、ｍｄｘマウスの筋肉におけるＲＧＸ－ＤＹＳ１からのマイクロジストロフィンの発現は、ジストロブレビン、シントロフィン、及びｎＮＯＳを筋膜に回復させることが期待される。
ジストロフィン、ｎＮＯＳ、α１－シントロフィン、α－ジストロブレビンに対する免疫蛍光染色を処置及び対照腓腹筋のｃｒｙ－ｔｈｉｎセクションで実施した。実験手順に使用した試薬及び抗体を表１２及び表１３に列挙する。
Figure 2023503637000087
新しく単離したマウス組織をイソペンタン／液体窒素二重浴に即時浸漬することによって急速凍結させ、その後、－８０℃で保存した。数滴のＯＣＴ（最適切断温度）化合物を加えることによって組織を切断ブロックに固定し、次いで、組織を所望の切断方向でブロック上に置いた。ＯＣＴ及び組織をクライオスタットで凍結し（ＯＣＴが固まるまで組織を所望の方向に維持）、組織を１０μｍ（許容範囲８～１０μｍ）で薄切した。４～６個の切片を各スライドに配置し、－８０℃で保存した。
筋肉の凍結切片スライドを－８０℃の保存環境から取り出し、室温（ＲＴ）で１０分間風乾した。次いで、組織切片部分の周囲にＰＡＰペンでマークを付けた。一次抗体がマウスモノクローナル抗体由来である場合には、２回のブロッキング工程が必要である。まず、ＰＡＰペンで囲んだ全領域を覆うように、適切な量の１×Ｍ．Ｏ．Ｍをピペットで加えてサンプルをブロックし、室温で１．５時間インキュベートする。Ｍ．Ｏ．Ｍ．を吸引によって除去し、その後、１０％ウマ血清（ＰＢＳ中）を用いて室温で１時間ブロックする。一次抗体がマウス由来でない場合には、ＰＡＰペンで囲んだ全領域を覆うように、ピペットを使用して適切な量のＰＢＳを加えることで、サンプルを１０％ウマ血清（ＰＢＳ中）で直接ブロッキングし、その後、室温で１時間インキュベートする。
一次抗体を２％ウマ血清（ＰＢＳ中）で希釈し、サンプルを室温で１～２時間インキュベートした。次いで、ＰＡＰペンで囲んだ全領域を覆うように、適切な量のＰＢＳを加えることによって、スライドを１Ｘ ＰＢＳで洗浄し、続いて、室温で３分間インキュベーションし、吸引した。全部で３～４回繰り返した。二次抗体（ＣＹ３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４または４８８結合抗体と同等のもの）をＰＢＳ中２％ウマ血清で希釈し、スライドを室温で１時間インキュベートした。スライドを１ＸＰＢＳで３～４回、室温で３分間洗浄した。
核を示すために、ＤＡＰＩによる対比染色を、ＰＢＳで希釈した１ｘＤＡＰＩを用いてスライドを室温で５～８分間インキュベートすることによって実施した。ＤＡＰＩ染色後、スライドを１×ＰＢＳで室温で３分間洗浄し、次いで、褪色防止封入剤を１～２滴／スライドで室温でマウントした。マウント後、スライドを室温で風乾し、遮光した。蛍光顕微鏡を使用して蛍光を解析し、画像を撮影した。
Figure 2023503637000088
図１４に示されるように、いくつかの復帰突然変異した線維を除き、ジストロフィンタンパク質及び調査したＤＡＰＣタンパク質は、ＲＧＸ－ＤＹＳ１で処置したｍｄｘマウス筋肉では全て存在しなかった。ＲＧＸ－ＤＹＳ１の全身送達は、ジストロフィン発現を効率的に回復させ、α１－シントロフィン、α－ジストロブレビン、β－ジストログリカン及びｎＮＯＳを筋鞘に固定化した（表１４）。なお、ｎＮＯＳ染色には、２つの市販抗体を使用した。いずれの場合においても、筋膜へのｎＮＯＳ発現は、未処置対照群と比較して有意に回復した。結論として、ＲＧＸ－ＤＹＳ１マイクロジストロフィンは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ジストロフィン関連タンパク質複合体を、ｎＮＯＳを含め、筋鞘に回復させることができた。
Figure 2023503637000089
６．６実施例６－ｍｄｘマウスモデルへの遺伝子治療投与
ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ３及びＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ５ベクターのｉｎ ｖｉｖｏ試験を１３匹のオスのＣ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ－Ｄｍｄｍｄｘ／Ｊ（ｍｄｘ）マウスで実施した。全てベクターを５週齢のｍｄｘマウスに２Ｅ１４ｖｇ／ｋｇの投与量で尾静脈注射によって全身送達した（グループ１、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ３、ｎ＝５；グループ２、ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ５、ｎ＝５ｆまたは；ｍｄｘ陰性（投与なし）対照、ｎ＝３）。投与日の動物の体重は、１５．９ｇ～２２．０ｇの範囲であった。ベクター投与後６週間目に、血清のために採血し、組織採取のために動物を安楽死させ、剖検を行った。腓腹筋（Ｇａｓ）、前脛骨筋（ＴＡ）、横隔膜、三頭筋、大腿四頭筋を含む主要骨格筋、心臓、肝臓及び主要臓器を採取し、イソペンタン／液体窒素二重浴で急速凍結し、予め冷却したクライオチューブ中に入れた。
各動物の体重を週２回記録し、各群の体重変化の平均値を算出した。動物＃１２（Ｒ１３－１３５－０１２）を除く全ての動物の体重が、予想通り、７週間にわたって増えた。
Figure 2023503637000090
ｍｄｘマウスには骨格筋の変性及び再生の病因があるため、典型的に、野生型マウスよりも重くなる。表１５にみられるように、ＲＧＸ－ＤＹＳ３またはＲＧＸ－ＤＹＳ５ベクターで処置したｍｄｘマウスは、処置を受けていないｍｄｘマウスと比較して、体重変化が著しく小さかった。
６．７ 実施例７－処置ｍｄｘマウスにおけるマイクロジストロフィン（μ－Ｄｙｓ）タンパク質発現の評価
６．７．１ ウェスタンブロットによるμ－Ｄｙｓ発現比較、ｍＲＮＡ発現及びＤＮＡベクターコピー数。
ＲＧＸ－ＤＹＳ１実験に関連して本実施例に記載されるデータ及びサンプルは、以下のセクション６．３に記載される処置後に取得した（ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１を投与したマウス、ｎ＝１３）。ＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ３及びＡＡＶ８－ＲＧＸ－ＤＹＳ５を投与した動物での実験に関する後述のデータ及びサンプルは、上記セクション６．６に記載される処置の後に取得した（処置ｍｄｘマウス群につきｎ＝５）。実験は、異なる設備で実施した。
処置したｍｄｘマウスから採取した腓腹筋のマイクロジストロフィンタンパク質発現をウェスタンブロットによって調べた。簡潔に述べると、２０～３０ｍｇの組織をタンパク質溶解緩衝液（１５％ＳＤＳ、７５ｍＭ Ｔｒｉ－ＨＣｌｐＨ６．８、プロテアーゼ阻害剤、２０％グリセロール、５％ベータ－メルカプトエタノール）中でホモジナイズした（Ｂｅａｄ Ｍｉｌｌ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ Ｂｅａｄ Ｒｕｐｔｏｒ １２，ＳＫＵ：１９０５０Ａ，ＯＭＮＩ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）。ホモジナイズ後、サンプルを最高速度で室温で５分間スピンダウンし、上清をタンパク質の定量に供した。タンパク質ストック上清をＱｕｂｉｔタンパク質アッセイキット（カタログ番号Ｑ３３２１１、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量した。ストックあたりの総タンパク質濃度を算出し、次いで、２０ｕｇのタンパク質ストック上清をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにロードした。ウェスタンブロットは、一次抗ジストロフィン抗体（ＭＡＮＥＸ１０１１Ｂ（１Ｃ７）、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ）を１：１０００希釈で使用して実施し、アプライした二次抗体は、ヤギ抗マウスＩｇＧ２ａセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号６２－６５２０）であった。α１－アクチンは、ゲルの各レーンにおけるローディング対照として機能する。抗α１－アクチンブロットの場合、ウサギポリクローナル抗α１－アクチン抗体（ＰＡ５－７８７１５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を１：１０，０００の希釈率で使用し、二次ヤギ抗ウサギ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号３１４６０）を１：２０，０００で使用した。タンパク質シグナルを、ＥＣＬ Ｐｒｉｍｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを使用して検出し（製造元の説明書に従う；ＡＭＥＲＳＨＡＭ， ＲＰＮ２２３２）、Ｉｍａｇｅ Ｌａｂ ソフトウェア（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）によってガイドされたデンシトメトリーによって定量した。
ウェスタンブロットの結果（図１５）により、いくつかの知見が明らかになった：第１に、各μ－ジストロフィンタンパク質の推定サイズは、ゲル上で観察された移動量と十分に対応し、例えば、ＲＧＸ－ＤＹＳ１μ－ジストロフィンタンパク質は１４８ｋＤａであるが、ＲＧＸ－ＤＹＳ５及びＲＧＸ－ＤＹＳ３タンパク質のサイズはそれぞれ１４２ｋＤａ及び１３２ｋＤａであった。第２に、バンドの強度は、腓腹筋組織に存在するタンパク質ごとで異なっていた。μ－ジストロフィンの長いバージョンであるＲＧＸ－ＤＹＳ１ベクターが最も強い導入遺伝子発現を示し、次に中間バージョンのＲＧＸ－ＤＹＳ５及び短いバージョンのＲＧＸ－ＤＹＳ３が続いた（図１５及び図１６Ａ）。これら３つのコンストラクト間でのμ－ジストロフィンの発現レベルの違いは、ＡＡＶベクターゲノムのレベルのばらつきまたは長さの異なるμ－ジストロフィンコンストラクトタンパク質の安定性のいずれかに起因すると思われる。
細胞あたりのゲノムコピー数を解明するために、セクション６．４（実施例４）で前述した方法を使用して、ｄｄＰＣＲを実施し、これらの組織中のＡＡＶ－μ－ｄｙｓベクターゲノムコピー数を調べた。図１６Ｂに示されるように、ＲＧＸ－ＤＹＳ１ベクターを送達した組織は、実際、ＲＧＸ－ＤＹＳ５（１７±４ｇｃ／細胞）及びＲＧＸ－ＤＹＳ３（１６±５ｇｃ／細胞）ベクターを送達した組織よりも高いベクターゲノムコピー数（５０±１４ｇｃ／細胞）を示した（値はグルカゴンゲノムコピーに対して正規化した）。次いで、相対μ－ジストロフィン発現をベクターコピー数と比較した。図１６Ｃに示されるように、ＲＧＸ－ＤＹＳ１で処置した筋肉（１．３３±０．３９）及びＲＧＸ－ＤＹＳ５で処置した筋肉（１．７７４±０．４０）における相対μ－ジストロフィンの発現は全てＲＧＸ－ＤＹＳ３で処置した筋肉（０．７７±０．２２、ｐ＜０．０５、ｎ＝３～５）よりも有意に高かった。このデータは、ＲＧＸ－ＤＹＳ１及びＲＧＸ－ＤＹＳ３ベクターによって生成された長いバージョンのμ－ジストロフィン（Ｃ末端を有する）が、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、筋肉細胞のμ－ジストロフィンタンパク質の安定性を向上させることを示している。
更に、未処置の野生型Ｂ６マウス及びｍｄｘマウスの骨格筋におけるμ－ジストロフィン及び野生型（ＷＴ）ジストロフィンのｍＲＮＡ発現を、処置したマウスと比較して、ｄｄＰＣＲを用いて測定した。ＲＮｅａｓｙ Ｆｉｂｒｏｕｓ Ｔｉｓｓｕｅ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＲＥＦ ７４７０４、Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、筋肉組織からトータルＲＮＡを抽出し、Ｈｉｇｈ－ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＫｉｔをＲＮＡｓｅ 阻害剤とともに使用してｃＤＮＡを合成した（Ｒｅｆ ４３７４９６６、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃによるＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計を使用して、ＲＮＡ濃度を測定した。デジタルＰＣＲ（Ｎａｉｃａ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ、Ｓｔｉｌｌａ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、μ－ジストロフィン、ＷＴ－ジストロフィン、及び内因性対照グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のｍＲＮＡコピー数を測定した。マウスＷＴ－ジストロフィンに対するプライマー及びプローブ（ｍｍ０１２１６９５１＿ｍ１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（上記セクション６．４（実施例４）の生体内分布試験試験においても記載）、ならびにマウスＧＡＰＤＨ（ｍｍ９９９９９９１５＿ｇ１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）は市販のものであった。図１７Ａに示されるように、ナイーブＢ６マウスにおける相対ＷＴ－ジストロフィン転写物は、１±０．６４であり、ｍｄｘマウスにおけるＷＴ－ジストロフィンｍＲＮＡ発現は、１．５５±０．７７（ｐ＝０．１５、ｎ＝４）であった。処置した動物における相対μ－ジストロフィンｍＲＮＡは、次の通りであった：ＲＧＸ－ＤＹＳ１処置筋肉２２．６６±１１．６（ｐ＜０．０１、ｎ＝５）；ＲＧＸ－ＤＹＳ５処置１６．８３±１１．０７（ｐ＝０．０６、ｎ＝３）及びＲＧＸ－ＤＹＳ３処置筋肉１１．８７±７．９０（ｐ＜０．０５、ｎ＝４）。このデータにより、ＲＧＸ－ＤＹＳ１群、ＲＧＸ－ＤＹＳ５群、及びＲＧＸ－ＤＹＳ３群の全てにおいてμ－ジストロフィンベクターを送達すると、野生型レベルよりも極めて高いμ－ジストロフィン転写物が生成されることが示された。更に、ＧＡＰＤＨ正規化に加えて、μ－ジストロフィンｍＲＮＡコピー数を細胞あたりのＡＡＶベクターゲノムコピー数に正規化し、ＷＴ－ジストロフィンｍＲＮＡを細胞あたりのゲノムコピー数（２コピー／細胞）に正規化した。図１７Ｂに示されるように、全ての群が、１ゲノムを基準として本質的に同じレベルのｍＲＮＡ発現を示した。（ｎ＝３～５、ｐ＞０．０５） これにより、ＡＡＶ－μ－ジストロフィン導入遺伝子の発現を駆動する筋特異的Ｓｐｃ５－１２プロモーターは、マウス骨格筋細胞の天然型ジストロフィンプロモーターと同程度に強力であることが示された。
６．７．２ 免疫蛍光（ＩＦ）染色によるμ－ジストロフィン発現及びジストロフィン関連タンパク質複合体（ＤＡＰＣ）の会合
次に、免疫蛍光（ＩＦ）染色を実施して、異なる群の腓腹筋におけるジストロフィンならびにジストロブレビン、β－ジストログリカン、シントロフィン、及びｎＮｏｓを含むジストロフィン関連タンパク質複合体の発現を調べた。ＩＦ染色プロトコル及びアプライした抗体は、上記セクション６．５に先に記載した通りであった（実施例５）。図１８に示されるように、ジストロフィンタンパク質及び調査したＤＡＰＣタンパク質は、未処置のｍｄｘ筋肉では全て存在しなかったが、野生型Ｂ６筋膜には強く存在した。３つの全ての処置群において、μ－ジストロフィンタンパク質は、ほぼ１００％の筋線維で発現しており、異なる処置群で区別はなかった。３つの処置群は、筋膜上でのジストロブレビン発現の回復を示し、非常に似たパターンが観察された。β－ジストログリカン染色では、ＲＧＸ－ＤＹＳ１処置群の筋肉は、より均一でより強いβ－ジストログリカン染色（発現）を示した。
処置群間でより劇的な差は、シントロフィン染色で観察された。筋膜上でのシントロフィンの発現は、長さのより長いμ－ジストロフィンを含有するＲＧＸ－ＤＹＳ１群で極めて増強され、それにＲＧＸ－ＤＹＳ５及びＲＧＸ－ＤＹＳ３が続いた（図１８及び図１９Ａ）。筋肉溶解物のウェスタンブロット分析によっても同じ傾向が更に実証された（図１９Ｂ）。シントロフィンに対するウェスタンブロットを骨格筋組織溶解物で実施した（処置ｍｄｘ及び未処置群からそれぞれ３つの腓腹筋組織、１つの腓腹筋及び２つの三頭筋はＢ６マウス群に由来）。ポリクローナル抗シントロフィン抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ１１１８７）を１：１０，０００で使用し、室温で１時間インキュベーションした。α－アクチニンに対するウサギモノクローナル（ａｂ６８１６７、Ａｂｃａｍ）を１：５０００希釈でアプライした。二次ヤギ抗ウサギ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ－１０６８５）をアプライした。ＷＴ筋肉におけるシントロフィン発現と内因性対照アクチニン発現の比は、ｍｄｘ群（０．８４±０．２２）と比較して、４．５６±０．７６であった（ｎ＝３、一元配置ＡＮＯＶＡでｐ＜０．００１）。ＲＧＸ－ＤＹＳ１群及びＲＧＸ－ＤＹＳ５群における比は、それぞれ２．７２±０．９７（ｎ＝３、ｐ＜０．０５、ｍｄｘ群と比較）及び１．３５±０．０３であった（図１９Ｃ）。更に、骨格筋におけるシントロフィン発現のレベルをウェスタンブロットによって全筋膜抽出物で調べた。Ｍｅｍ－Ｐｅｒ Ｐｌｕｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（カタログ番号８９８４２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、全骨格筋タンパク質を抽出した（処置及び未処置のｍｄｘ群それぞれの腓腹筋組織、及びＢ６マウス群の大腿四頭筋）。２０ｕｇの全膜タンパク質を各レーンにローディングした（図１９Ｄ）。ポリクローナル抗シントロフィン抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ１１１８７）を１：１０，０００で使用し、４℃で一晩インキュベーションした。ローディング対照のポリクローナル抗アクチン（ＰＡ５－７８７１５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を１：１０，０００希釈でアプライし、４℃で一晩インキュベーションした。ＷＴ筋肉が最も高いシントロフィン発現レベルを示した、全溶解物ウェスタン実験とは若干異なり、全膜タンパク質ウェスタンブロットは、図１９Ｅにみられるように、ＲＧＸ－ＤＹＳ１群（０．８１±０．２６、ｎ＝３）で最も高い相対シントロフィン発現が示され、それにＢ６＿ＷＴ群（０．６６２３±０．０５、ｎ＝３）、ＲＧＸ－ＤＹＳ３群（０．５９±０．０８）、及びｍｄｘ群（０．３２±０．０７、ｎ＝３）が続いた。これらの結果により、μ－ジストロフィンベクターによって生成されたμ－ジストロフィンは、筋膜シントロフィン発現を回復することが可能であり、長いバージョンのＲＧＸ－ＤＹＳ１が短いバージョンのＲＧＸ－ＤＹＳ３よりもシントロフィンを筋膜に固定する能力に優れることが明確に示された。
筋膜を使用して、ｎＮＯＳウェスタンブロットを同様に調製した（腓腹筋組織／ｍｄｘ群、及び大腿四頭筋／Ｂ６群）。Ｍｅｍ－Ｐｅｒ Ｐｌｕｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（カタログ番号８９８４２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、全筋膜タンパク質を抽出した。２０ｕｇの全膜タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの各レーンにローディングした。ｎＮＯＳに対する一次抗体（ＳＣ－５３０２、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を１：５００で使用し、ポリクローナル抗アクチン（ＰＡ５－７８７１５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を１：１０，０００希釈でアプライした。二次ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体ＨＲＰ（６２－６５２０、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）をアプライした。ｎＮＯＳ発現に関して、ＩＦ染色後のＲＧＸ－ＤＹＳ１群とＲＧＸ－ＤＹＳ３群の画像間に顕著な差が観察された（図２０Ａ）。しかしながら、ウェスタンブロットの結果では、ＲＧＸ－ＤＹＳ１、ＲＧＸ－ＤＹＳ３、及び未処置のｍｄｘ群の間で、いかなる有意な差も認められず（図２０Ｂ～Ｃ）、ＲＧＸ－ＤＹＳ１ベクターによるｎＮＯＳの回復が低いことが示された。
全体として、ＲＧＸ－ＤＹＳ１、ＲＧＸ－ＤＹＳ３、及びＲＧＸ－ＤＹＳ５ベクターのｍｄｘマウスにおける送達は全てロバストなμ－ジストロフィン発現及びジストロフィン関連タンパク質複合体（ＤＡＰＣ）の回復をもたらした。長いバージョンのＲＧＸ－ＤＹＳ１ベクターは、ＤＡＰＣ、特にシントロフィン及びβ－ジストログリカンの回復を促進した。ＲＧＸ－ＤＹＳ１ベクターによる膜ＤＡＰＣへのｎＮＯＳの回復能力は低かったが、ＩＦ染色では視認できた。
６．８ 実施例８－ＲＧＸ－ＤＹＳ１ベクターによる衛星細胞の形質導入及び筋ジストロフィー筋肉の再生緩和
骨格筋幹細胞、または衛星細胞（ＳＣ）は、通常、静止状態にあり、筋線維の基底膜と筋鞘との間に位置する。成長期及び筋肉損傷後にＳＣの筋原性プログラムが活性化されると、ＳＣは自己再生してそのプールを維持し、及び／または分化して筋芽細胞を形成し、最終的に筋線維となる。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、分化した筋線維の形質導入についてよく知られているので、衛星細胞がＡＡＶベクターによって形質転換できるかどうかを調査した。衛星細胞は、小さく、細胞質が非常に少ないため、これらの細胞で導入遺伝子発現を研究することは技術的に困難である。ここで、ＲＮＡｓｃｏｐｅを応用して、ＡＡＶが衛星細胞を形質転換できるかどうかを調査した。ＲＮＡｓｃｏｐｅは、シグナルの増幅及びバックグラウンドノイズの抑制を同時に可能にする最先端のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）技術であり、１分子の遺伝子発現をインタクトな組織で１細胞の解像度で直接可視化することができる。ＲＮＡｓｃｏｐｅマルチプレックス蛍光解析では、蛍光色素Ｏｐａｌ ５７０（赤色）で標識したＡＡＶ μ－ジストロフィンプローブ及び蛍光色素Ｏｐａｌ５２０（緑）で標識した筋肉衛星細胞マーカーｐａｘ７を使用した。ＡＡＶ導入遺伝子及びＰａｘ７のｍＲＮＡ発現のＲＮＡｓｃｏｐｅマルチプレックス蛍光解析は、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ（Ｎｅｗａｒｋ，ＣＡ）で実施された。ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｆｉｂｒｏｕｓ Ｔｉｓｓｕｅ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号７４７０４）を使用して、骨格筋からトータルＲＮＡを抽出し、Ｈｉｇｈ－ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＫｉｔをＲＮＡｓｅ阻害剤とともに使用してｃＤＮＡを合成した（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号４３７４９６６）。デジタルＰＣＲ（Ｎａｉｃａ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ、Ｓｔｉｌｌａ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、μ－ジストロフィンｍＲＮＡ及び内因性対照ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの絶対コピー数を測定した。μ－ジストロフィンに対するプライマー及びプローブは、前述のものと同じであった。マウスｐａｘ７プライマー及びプローブセット（ＴａｑＭａｎ（商標）ＭＧＢプローブ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号４３１６０３４）は、市販のものを購入した。
図２１Ａ～Ｂに示されるように、赤色（左パネル、図２１Ａ）は、μ－ジストロフィンシグナル（ｍＲＮＡ発現またはＡＡＶゲノムの存在のいずれか）を示し、緑色は、ｐａｘ７＋衛星細胞を指す（図２１Ａ～Ｂ中矢印で示す）。ＤＡＰＩ染色の青色（左及び右パネル、図２１Ａ～Ｂ）は、核染色を示す。緑、赤及び青の共局在（白矢印）は、筋衛星細胞へのＡＡＶ－ＤＭＤベクターの形質導入を示し、緑と青のみの細胞（黒線のある白矢印）は、ＡＡＶの形質導入のない衛星細胞を示す。μ－ジストロフィンが形質導入された衛星細胞をカウントし、衛星細胞の形質導入率を算出した。ＡＡＶ－μ－ｄｙｓが形質導入された骨格筋において、衛星細胞の形質導入率は、２３±１．５％であった（図２１Ｃ）。これにより、成熟した筋線維よりも極めて低い形質導入率ではあるが、ＡＡＶベクターで筋衛星細胞を形質導入できることが示された。
次に、ｐａｘ７＋衛星細胞の総数をＲＮＡｓｃｏｐｅ画像でカウントして、衛星細胞の数が、異なる治療群で同様であるかどうかを調べた。図２１Ｄに示されるように、未処置ｍｄｘの１イメージあたりのｐａｘ７陽性細胞カウントは、３９．１２±１５．１４であり、野生型Ｂ６マウス及びＤＭＤベクター処置マウスの陽性細胞カウントは、それぞれ１１．８７±３．２３（８画像でのカウント、一元配置ＡＮＯＶＡでｐ＜０．０００１）及び１４．６６±５．９１（１２画像でのカウント、一元配置ＡＮＯＶＡでｐ＜０．０００１）であった。未処置ｍｄｘ筋肉における衛星細胞数の増加は、筋ジストロフィー筋肉の再生性を示す。ＲＧＸ－ＤＹＳ１ベクターでのμ－ジストロフィンの送達により、この病態が逆転し、筋肉再生が緩和された。
ＲＮＡｓｃｏｐｅ技術による解析に加えて、トータル筋ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡ解析を実施した。ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｆｉｂｒｏｕｓ Ｔｉｓｓｕｅ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号７４７０４）を使用して、骨格筋からトータルＲＮＡを抽出し、Ｈｉｇｈ－ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＫｉｔをＲＮＡｓｅ阻害剤とともに使用してｃＤＮＡを合成した（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号４３７４９６６）。マウスｐａｘ７特異的プライマー及びプローブセットを使用して、サンプルをｄｄＰＣＲ解析に供した（市販のもの：それぞれｍｍ０１３５４４８４＿ｍ１ Ｐａｘ７、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；及びＡｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＴａｑＭａｎ（商標）ＭＧＢプローブ、カタログ番号４３１６０３４）。マウスＧＡＰＤＨプライマー及びプローブセットを使用して、ＲＮＡ及びｃＤＮＡの入力を正規化した。デジタルＰＣＲ（Ｎａｉｃａ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ、Ｓｔｉｌｌａ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、μ－ジストロフィンｍＲＮＡ及び内因性対照ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの絶対コピー数を測定した。ｐａｘ７ ｍＲＮＡコピー数とＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡコピー数の比を群間で比較した（図２１Ｅ）。予想した通り、ｍｄｘマウスにおけるｐａｘ７発現の相対発現は、７．５６±３．１４であり、ＷＴ－Ｂ６マウスよりも極めて高かった（１±０．６８、ｎ＝５、一元配置ＡＮＯＶＡでｐ＜０．００１）。３つの異なるμ－ジストロフィンベクターで処置した群における相対ｐａｘ７発現は、極めて減少した（ＲＧＸ－ＤＹＳ５では４．４０±１．５０（ｎ＝３、ｐ＝０．０６）、ＲＧＸ－ＤＹＳ３群では３．１２±０．７４（ｎ＝５、ｐ＜０．０１）、ＲＧＸ－ＤＹＳ１では２．９８±０．６８（ｎ＝５、ｐ＜０．０１）。ｄｄＰＣＲ法によるｐａｘ７ ｍＲＮＡ発現の減少は、ＲＮＡｓｃｏｐｅ技術での所見と一致しており、筋ジストロフィー筋肉における本発明のμ－ジストロフィンベクターを介した治療メカニズムの１つが、筋肉再生の緩和によるものであることが更に証明された。
６．９ 実施例９－更なるマイクロジストロフィン（ＤＭＤ）遺伝子発現カセットの構築
μ－ジストロフィンの機能を潜在的に更に向上させ、全体的な導入遺伝子サイズ（ｋＢ）を小さくするために、いくつかの追加のμ－ジストロフィンコンストラクトを組み換え操作した（図２２）。ＲＧＸ－ＤＹＳ６（配列番号９１）では、効率的なパッケージングのために、システインリッチドメインのおよそ５０アミノ酸を除去して（短縮ＣＲ、配列番号９０）、ＡＡＶゲノムを小さくした。ＲＧＸ－ＤＹＳ７（配列番号９２）では、先のコンストラクトを組み換え操作の足場として使用して、ｎＮＯＳアンカリングスペクトリンリピートドメインＲ１６及びＲ１７（配列番号８６及び８７）をＲ２領域とＲ２４領域の間に挿入した。ＲＧＸ－ＤＹＳ８（配列番号９３）は、ｎＮＯＳアンカリングドメインＲ１６及びＲ１７が挿入されている点で、ＲＧＸ－ＤＹＳ７と同様であるが、Ｃ末端ドメイン（ＣＴ）を除去して、ＡＡＶベクターのサイズを小さくした。
全てのμ－ジストロフィンＣｉｓプラスミドをＡＡＶ８ベクターにパッケージし、セクション６．２（実施例２）に記載されているように、分化したＣ２Ｃ１２筋管にベクター（２×１０５ｇｃ／細胞）を感染させた。感染５日後に細胞を回収し、抗ジストロフィン一次抗体（ＭＡＮＥＸ１０１１Ｂ（１Ｃ７）を本明細書に記載されるように使用したウェスタンブロット解析に供して、μ－ジストロフィンタンパク質を検出した。使用した全ての方法は、セクション６．７（実施例７）に記載のものと同様である。図２３Ａに示されるように、異なるバージョンのμ－ジストロフィンを搭載したＡＡＶベクターは、異なる長さのμ－ジストロフィンタンパク質を生成し、そのサイズは予想される通りに引き継がれた。２つの注目すべき知見があった：１）概して、長いバージョンのμ－ジストロフィンタンパク質がより強いバンドを有した（図２３Ａ～Ｂ）。ｄｄＰＣＲによって調査したμ－ジストロフィンｍＲＮＡ発現レベル（図２３Ｃ）は、タンパク質発現レベルと相関しなかった。これは、長いバージョンのμ－ジストロフィンによって生成された強いバンドがｍＲＮＡ発現の増加によるものではなく、むしろ、タンパク質の安定性の増加によるものと考えられた。２）μ－ジストロフィンＲＧＸ－ＤＹＳ６は、他と比較して、特に安定ではなかった。ＣＲドメインの５０アミノ酸の欠失がμ－ジストロフィンの安定性に影響を与えるのではないかと推論した。
本発明は、その具体的な実施形態を参照して詳細に記載されるが、機能的に同等な変形形態は、本発明の範囲内であることが理解されよう。実際、本明細書に示され、記載されるものに加えて、本発明の様々な変更が前述の説明及び添付の図面から当業者に明らかになるであろう。そのような変更は、添付する特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。当業者であれば、通常の実験を使用するだけで、本明細書に記載される本発明の具体的な実施形態の均等物を数多く認識または確認することができるであろう。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
本明細書で言及される全ての公開物、特許及び特許出願は、それぞれ個々の公開物、特許または特許出願の全体が参照により本明細書に援用されることが具体的かつ個別に示される場合と同様に、参照により本明細書に援用される。
本明細書における議論は、当該技術が直面している課題の本質をよりよく理解するために提供されるものであり、いかなる意味においても、先行技術に関する自認として解釈されるべきではなく、本明細書におけるいかなる文献の引用も、当該文献が本出願に対する「先行技術」を構成することを自認するものとして解釈されるものではない。
本明細書で引用される特許出願及び公開物を含む全ての参考文献は、それぞれ個々の公開物または特許もしくは特許出願の全体が、全ての目的のために、参照により援用されることが具体的かつ個別に示される場合と同様に、全ての目的のために、その全体が参照により本明細書に援用される。本発明は、当業者には明らかなように、その主旨及び範囲から逸脱することなく多くの変更及び変形を行うことができる。本明細書に記載される具体的な実施形態は、例示としてのみ提供され、本発明は、添付する特許請求の範囲によってのみ限定されるものであり、かかる請求項が権利を有する全ての均等物の範囲も含まれる。

Claims (35)

  1. マイクロジストロフィンタンパク質をコードする核酸配列を含む、核酸組成物であって、前記マイクロジストロフィンタンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端へ：ＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴに配置されているジストロフィンドメインを含むか、またはそれからなり、ここで、ＡＢＤは、ジストロフィンのアクチン結合ドメインであり、Ｈ１は、ジストロフィンのヒンジ１領域であり、Ｒ１は、ジストロフィンのスペクトリン１領域であり、Ｒ２は、ジストロフィンのスペクトリン２領域であり、Ｒ３は、ジストロフィンのスペクトリン３領域であり、Ｈ３は、ジストロフィンのヒンジ３領域であり、Ｒ２４は、ジストロフィンのスペクトリン２４領域であり、Ｈ４は、ジストロフィンのヒンジ４領域であり、ＣＲは、ジストロフィンのシステインリッチ領域またはそのβ－ジストログリカン結合部分であり、ＣＴは、ジストロフィンのＣ末端領域またはα１－シントロフィン結合部位もしくはジストロブレビン結合部位を含むＣ末端領域の部分である、前記核酸組成物。
  2. （１）配列番号１、７９もしくは９１のアミノ酸配列を有するマイクロジストロフィンタンパク質をコードする核酸配列、またはそれらに対して少なくとも９０％、９５％もしくは９８％同一である核酸配列、または治療上機能的なマイクロジストロフィンタンパク質をコードするそれらの逆相補鎖を含むか、あるいは、（２）配列番号２０、８１もしくは１００の核酸配列、もしくはそれらに対して少なくとも９０％、９５％もしくは９８％同一である核酸配列、もしくはそれらの逆相補鎖を含むか、またはそれらからなり、前記核酸配列は、治療上機能的なマイクロジストロフィンタンパク質をコードする、請求項１に記載の核酸組成物。
  3. （１）前記ＣＴドメインをコードする核酸配列が、配列番号３５の核酸配列、もしくはそれに対して少なくとも９０％、９５％もしくは９８％同一である核酸配列、もしくはそれらの逆相補鎖を含むか、またはそれらからなり、前記ＣＴドメイン配列を欠く参照マイクロジストロフィンと比べて、前記マイクロジストロフィンタンパク質のα１－シントロフィン及び／またはジストロブレビンへの結合を増加させるか、前記ＣＴドメインをコードする核酸配列が、配列番号７０の核酸配列、もしくはそれに対して少なくとも９０％、９５％もしくは９８％同一である核酸配列、もしくはそれらの逆相補鎖を含むか、またはそれらからなり、前記ＣＴドメイン配列を欠く参照マイクロジストロフィンと比べて、前記マイクロジストロフィンタンパク質のα１－シントロフィン及び／またはジストロブレビンへの結合を増加させるか、最小ＣＴドメインをコードする核酸配列が、配列番号８０の核酸配列、またはそれに対して少なくとも９０％、９５％もしくは９８％同一である核酸配列、またはそれらの逆相補鎖からなり、前記ＣＴドメイン配列を欠く参照マイクロジストロフィンと比べて、前記マイクロジストロフィンタンパク質のα１－シントロフィンへの結合を増加させるか、あるいは、（２）前記ＣＴドメインをコードする核酸が、配列番号１６もしくは８３アミノ酸配列をコードするか、または配列番号８４のアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の核酸組成物。
  4. マイクロジストロフィンタンパク質をコードする核酸配列の５’末端に連結されたイントロン（Ｉ）を含む核酸配列を含む、核酸組成物であって、前記マイクロジストロフィンタンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端へ：ＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲに配置されているジストロフィンドメインを含むか、またはそれからなり、ここで、ＡＢＤは、ジストロフィンのアクチン結合ドメインであり、Ｈ１は、ジストロフィンのヒンジ１領域であり、Ｒ１は、ジストロフィンのスペクトリン１領域であり、Ｒ２は、ジストロフィンのスペクトリン２領域であり、Ｒ３は、ジストロフィンのスペクトリン３領域であり、Ｈ３は、ジストロフィンのヒンジ３領域であり、Ｒ２４は、ジストロフィンのスペクトリン２４領域であり、Ｈ４は、ジストロフィンのヒンジ４領域であり、ＣＲは、ジストロフィンのシステインリッチ領域である、前記核酸組成物。
  5. （１）配列番号２のアミノ酸配列を有するマイクロジストロフィンタンパク質をコードする核酸配列、またはそれに対して少なくとも９０％、９５％もしくは９８％同一である核酸配列、またはそれらの逆相補鎖を含むか、あるいは、（２）配列番号２１の核酸配列、もしくはそれに対して少なくとも９０％、９５％もしくは９８％同一である核酸配列、もしくはそれらの逆相補鎖を含むか、またはそれらからなり、前記核酸は、治療上機能的なジストロフィンをコードする、請求項４に記載の核酸組成物。
  6. （１）前記ＣＲドメインをコードする核酸配列が、配列番号３４もしくは６９の核酸配列、もしくはそれらに対して少なくとも９０％、９５％もしくは９８％同一である核酸配列、もしくはそれらの逆相補鎖を含むか、またはそれらからなり、前記ＣＲドメイン配列を欠く参照マイクロジストロフィンタンパク質と比べて、前記マイクロジストロフィンタンパク質のβ－ジストログリカンへの結合を増加させるか、（２）前記ＣＲドメインをコードする核酸配列が、配列番号１００もしくは１０９の核酸配列、もしくはそれらに対して少なくとも９０％、９５％もしくは９８％同一である核酸配列、もしくはそれらの逆相補鎖を含むか、またはそれらからなり、前記ＣＲドメイン配列を欠く参照マイクロジストロフィンタンパク質と比べて、前記マイクロジストロフィンのβ－ジストログリカンへの結合を増加させるか；あるいは、（２）前記ＣＲドメインをコードする核酸配列が、配列番号１５もしくは９０のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなるＣＲドメインをコードする、請求項１～５のいずれか１項に記載の核酸組成物。
  7. ＡＢＤをコードする核酸配列が、配列番号２２もしくは５７、または配列番号２２もしくは５７に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、Ｈ１をコードする核酸配列が、配列番号２４もしくは５９、または配列番号２４もしくは５９に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、Ｒ１をコードする核酸配列が、配列番号２６もしくは６１、または配列番号２６もしくは６１に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、Ｒ２をコードする核酸配列が、配列番号２７もしくは６２、または配列番号２７もしくは６２に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、Ｒ３をコードする核酸配列が、配列番号２９もしくは６４、または配列番号２９もしくは６４に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、Ｈ２をコードする核酸配列が、配列番号３８、または配列番号３８に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、Ｈ３をコードする核酸配列が、配列番号３０もしくは６５、または配列番号３０もしくは６５に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、Ｒ２４をコードする核酸配列が、配列番号３２もしくは６７、または配列番号３２もしくは６７に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、Ｈ４をコードする核酸配列が、配列番号３３もしくは６８、または配列番号３３もしくは６８に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、ＣＲをコードする核酸配列が、配列番号３４、６９、１００もしくは１０９、または配列番号３４、６９、１００もしくは１０９に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、ＣＴをコードする核酸配列が、存在する場合、配列番号３５、７０もしくは８０、または配列番号３５、７０もしくは８０に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなり、任意選択により、Ｉ核酸配列が、マイクロジストロフィンをコードする核酸配列の５’末端に連結された、配列番号４１の核酸配列、または配列番号４１に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列である、請求項１～６のいずれか１項に記載の核酸組成物。
  8. ＡＢＤをコードする核酸配列が配列番号２２もしくは５７からなり、Ｈ１をコードする核酸配列が配列番号２４もしくは５９からなり、Ｒ１をコードする核酸配列が配列番号２６もしくは６１からなり、Ｒ２をコードする核酸配列が配列番号２７もしくは６２からなり、Ｒ３をコードする核酸配列が配列番号２９もしくは６４からなり、Ｈ２をコードする核酸配列が配列番号３８からなり、Ｈ３をコードする核酸配列が配列番号３０もしくは６５からなり、Ｈ４をコードする核酸配列が配列番号３３もしくは６８からなり、Ｒ２４をコードする核酸配列が配列番号３２もしくは６７からなり、ＣＲをコードする核酸配列が配列番号３４、６９、１００もしくは１０９からなり、Ｉは、配列番号４１からなり、及び／またはＣＴをコードする核酸配列が配列番号３５、７０もしくは８０からなる、請求項１～７のいずれか１項に記載の核酸組成物。
  9. 前記マイクロジストロフィンタンパク質が、アミノ末端からカルボキシ末端へ：ＡＢＤ－Ｌ１－Ｈ１－Ｌ２－Ｒ１－Ｒ２－Ｌ３－Ｒ３－Ｈ３－Ｌ４－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴもしくはＡＢＤ－Ｌ１－Ｈ１－Ｌ２－Ｒ１－Ｒ２－Ｌ３－Ｒ３－Ｈ３－Ｌ４－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲに配置されているジストロフィン配列を含むか、またはそれらからなり、ここで、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４は、リンカーである、請求項１～８のいずれか１項に記載の核酸組成物。
  10. Ｌ１をコードする核酸配列が、配列番号２３もしくは５８を含むか、またはそれらからなり、Ｌ２をコードする核酸配列が、配列番号２５もしくは６０を含むか、またはそれらからなり、Ｌ３をコードする核酸配列が、配列番号２８もしくは６３を含むか、またはそれらからなり、Ｌ４をコードする核酸配列が、配列番号３１、３６、３７、６６、７１もしくは７２を含むか、またはそれらからなる、請求項１～９のいずれか１項に記載の核酸組成物。
  11. マイクロジストロフィンタンパク質をコードする核酸配列を含む、核酸組成物であって、前記マイクロジストロフィンタンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端へ：ＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ１６－Ｒ１７－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲに配置されているジストロフィンドメインを含むか、またはそれからなり、ここで、ＡＢＤは、ジストロフィンのアクチン結合ドメインであり、Ｈ１は、ジストロフィンのヒンジ１領域であり、Ｒ１は、ジストロフィンのスペクトリン１領域であり、Ｒ２は、ジストロフィンのスペクトリン２領域であり、Ｒ１６は、ジストロフィンのスペクトリン１６領域であり、Ｒ１７は、ジストロフィンのスペクトリン１７領域であり、Ｒ２４は、ジストロフィンのスペクトリン２４領域であり、Ｈ４は、ジストロフィンのヒンジ４領域であり、ＣＲは、ジストロフィンのシステインリッチ領域である、前記核酸組成物。
  12. 前記ＣＲドメインのＣ末端の終端にα１－シントロフィン結合部位及び／またはジストロブレビン結合部位を含むＣＴドメインをコードするヌクレオチド配列を更に含む、請求項１１に記載の核酸組成物。
  13. （１）配列番号９２もしくは９３のアミノ酸配列を有するマイクロジストロフィンタンパク質をコードする核酸配列、またはそれらに対して少なくとも９０％、９５％もしくは９８％同一である核酸配列、またはそれらの逆相補鎖を含むか、あるいは、（２）配列番号１０２もしくは１０３の核酸配列、もしくはそれらに対して少なくとも９０％、９５％もしくは９８％同一である核酸配列、もしくはそれらの逆相補鎖を含むか、またはそれらからなり、前記核酸は、治療上機能的なジストロフィンをコードする、請求項１１または１２に記載の核酸組成物。
  14. 前記マイクロジストロフィンタンパク質をコードする核酸配列の５’末端に連結されたイントロン（Ｉ）を更に含み、任意選択により、Ｉは、前記マイクロジストロフィンコード配列の５’側に位置する、ヒト免疫グロビン重鎖可変領域（ＶＨ）４イントロン（ＶＨ４）またはＳＶ４０イントロンまたはキメライントロンである、請求項１～３または６～１３のいずれか１項に記載の核酸組成物。
  15. 前記核酸が、前記マイクロジストロフィンタンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結された、筋肉及び／またはＣＮＳ組織における発現を促進する転写調節エレメントを含む核酸ベクターである、請求項１～１４のいずれか１項に記載の核酸組成物。
  16. 前記プロモーターが、ＳＰｃ５－１２またはその転写活性部分である、請求項１５に記載の核酸組成物。
  17. 前記核酸が、５’から３’へ、（ｉ）ＡＡＶ ＩＴＲ－転写調節エレメント－Ｎ末端からＣ末端へＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴに配置されているマイクロジストロフィンドメインをコードする核酸配列－ポリアデニル化配列－ＡＡＶ ＩＴＲ；（ｉｉ）ＡＡＶ ＩＴＲ－転写調節エレメント－Ｎ末端からＣ末端へＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲに配置されているマイクロジストロフィンドメインをコードする核酸配列－ポリアデニル化配列－ＡＡＶ ＩＴＲ；（ｉｉｉ）ＡＡＶ ＩＴＲ－転写調節エレメント－Ｎ末端からＣ末端へＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ１６－Ｒ１７－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴに配置されているマイクロジストロフィンドメインをコードする核酸配列－ポリアデニル化配列－ＡＡＶ ＩＴＲ；または（ｉｖ）ＡＡＶ ＩＴＲ－転写調節エレメント－Ｎ末端からＣ末端へＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ１６－Ｒ１７－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲに配置されているマイクロジストロフィンドメインをコードする核酸配列－ポリアデニル化配列－ＡＡＶ ＩＴＲを含む、ＡＡＶベクターヌクレオチド配列を含み、前記ＡＡＶ ＩＴＲは、任意選択により、ＡＡＶ２ ＩＴＲである、請求項１～１６のいずれか１項に記載の核酸組成物。
  18. 前記ヌクレオチド配列がコドン最適化及び／またはＣｐＧ配列除去されている、請求項１～１７のいずれか１項に記載の核酸組成物。
  19. 配列番号５３、５４、５５、５６、８２、１０４、１０５、または１０６の核酸配列を含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の核酸組成物。
  20. 請求項１～１９のいずれか１項に記載の核酸組成物を含む発現カセットを含む、ｒＡＡＶ粒子。
  21. 前記カプシドタンパク質が、配列番号７７（ＡＡＶ８カプシド）に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するか、配列番号７７のアミノ酸配列を有するか、配列番号７８（ＡＡＶ９カプシド）に対して少なくとも９５％であるアミノ酸配列を有するか、または配列番号７８のアミノ酸配列を有する、請求項２０に記載のｒＡＡＶ粒子。
  22. 治療上有効な量の請求項２０または２１に記載のｒＡＡＶ粒子と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
  23. 細胞に導入遺伝子を送達する方法であって、前記細胞を請求項２０または２１に記載のｒＡＡＶ粒子と接触させることを含み、前記細胞は、前記ベクターと接触する、前記方法。
  24. ジストロフィノパチーを治療することを、それを必要とするヒト対象において行うための医薬組成物であって、治療上有効な量の請求項２０または２１に記載のｒＡＡＶ粒子を含み、任意選択により、前記ｒＡＡＶ粒子は、前記対象の循環、筋肉組織、またはＣＮＳへの投与のために製剤化される、前記医薬組成物。
  25. ジストロフィノパチーを治療することを、それを必要とするヒト対象において行う方法であって、
    治療上有効な量の請求項２０または２１に記載のｒＡＡＶ粒子を含む医薬組成物を前記対象に投与することを含み、前記投与は、前記対象の筋肉またはＣＮＳに前記マイクロジストロフィンタンパク質の送達をもたらす、前記方法。
  26. 前記ジストロフィノパチーが、ＤＭＤ、ＢＭＤ、Ｘ連鎖性拡張型心筋症であるか、または前記対象が、女性のＤＭＤもしくはＢＭＤキャリアである、請求項２４または２５に記載の医薬組成物または方法。
  27. アミノ末端からカルボキシ末端へＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴに配置されているジストロフィンドメインを含むか、またはそれからなり、ここで、ＡＢＤは、ジストロフィンのアクチン結合ドメインであり、Ｈ１は、ジストロフィンのヒンジ１領域であり、Ｒ１は、ジストロフィンのスペクトリン１領域であり、Ｒ２は、ジストロフィンのスペクトリン２領域であり、Ｒ３は、ジストロフィンのスペクトリン３領域であり、Ｈ３は、ジストロフィンのヒンジ３領域であり、Ｒ２４は、ジストロフィンのスペクトリン２４領域であり、ＣＲは、ジストロフィンのシステインリッチ領域であり、ＣＴは、α１－シントロフィン結合部位またはジストロブレビン結合部位を含むジストロフィンのＣ末端領域の少なくとも一部である、マイクロジストロフィンタンパク質。
  28. 配列番号１、７９、もしくは９１のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる、請求項２７に記載のマイクロジストロフィンタンパク質
  29. アミノ末端からカルボキシ末端へＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ１６－Ｒ１７－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲに配置されているジストロフィンドメインを含むか、またはそれからなり、ここで、ＡＢＤは、ジストロフィンのアクチン結合ドメインであり、Ｈ１は、ジストロフィンのヒンジ１領域であり、Ｒ１は、ジストロフィンのスペクトリン１領域であり、Ｒ２は、ジストロフィンのスペクトリン２領域であり、Ｒ１６は、ジストロフィンのスペクトリン１６領域であり、Ｒ１７は、ジストロフィンのスペクトリン１７領域であり、Ｒ２４は、ジストロフィンのスペクトリン２４領域であり、ＣＲは、ジストロフィンのシステインリッチ領域である、マイクロジストロフィンタンパク質。
  30. アミノ末端からカルボキシ末端へＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ１６－Ｒ１７－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴに配置されているジストロフィンドメインを含むか、またはそれからなり、ここで、ＣＴは、α１－シントロフィン結合部位またはジストロブレビン結合部位を含むジストロフィンのＣ末端領域の少なくとも一部である、請求項２９に記載のマイクロジストロフィンタンパク質。
  31. 配列番号９２もしくは９３のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる、請求項２９または３０に記載のマイクロジストロフィンタンパク質。
  32. ジストロフィノパチーを治療することを、それを必要とするヒト対象において行う方法であって、前記ヒト対象の循環、筋肉組織及び／または脳脊髄液に、治療上有効な量の請求項２７～３１のいずれか１項に記載のマイクロジストロフィンタンパク質を送達することを含む、前記方法。
  33. ヒト対象におけるジストロフィノパチーの治療のための医薬組成物であって、前記ヒト対象の循環、筋肉組織及び／または脳脊髄液への送達のために製剤化された、治療上有効な量の請求項２７～３１のいずれか１項に記載のマイクロジストロフィンタンパク質を含む、前記医薬組成物。
  34. 組み換えＡＡＶを生産する方法であって、
    （ａ）宿主細胞を培養することであって、前記宿主細胞は、
    （ｉ）ｃｉｓ発現カセットを含む人工ゲノムであって、前記ｃｉｓ発現カセットは、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の核酸組成物を含む、前記人工ゲノム、
    （ｉｉ）ＡＡＶ ＩＴＲを欠くｔｒａｎｓ発現カセットであって、培養中の前記宿主細胞においてＡＡＶ ｒｅｐ及びカプシドタンパク質の発現を駆動し、トランスで前記ｒｅｐ及びｃａｐタンパク質を供給する発現制御エレメントに作動可能に連結された前記ＡＡＶ ｒｅｐ及びカプシドタンパク質をコードする、前記ｔｒａｎｓ発現カセット、
    （ｉｉｉ）前記ＡＡＶカプシドタンパク質による前記人工ゲノムの複製及びパッケージングを可能にする十分なアデノウイルスヘルパー機能を含有する、
    前記培養することと、
    （ｂ）前記人工ゲノムがカプシドで内包された組み換えＡＡＶを前記細胞培養物から回収することと
    を含む、前記方法。
  35. ａ．ｃｉｓ発現カセットを含む人工ゲノムであって、前記ｃｉｓ発現カセットは、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の核酸組成物を含む、前記人工ゲノム、
    ｂ．ＡＡＶ ＩＴＲを欠くｔｒａｎｓ発現カセットであって、培養中の前記宿主細胞においてＡＡＶ ｒｅｐ及びカプシドタンパク質の発現を駆動し、トランスで前記ｒｅｐ及びｃａｐタンパク質を供給する発現制御エレメントに作動可能に連結された前記ＡＡＶ ｒｅｐ及びカプシドタンパク質をコードする、前記ｔｒａｎｓ発現カセット、ならびに
    ｃ．前記ＡＡＶカプシドタンパク質による前記人工ゲノムの複製及びパッケージングを可能にする十分なアデノウイルスヘルパー機能
    を含む、宿主細胞。
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