CN115819546A - 表达微缩抗肌营养不良蛋白基因的腺相关病毒载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了表达微缩抗肌营养不良蛋白基因的腺相关病毒载体及其应用。人微缩抗肌营养不良蛋白μDystrophin，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。编码本发明所述的人微缩抗肌营养不良蛋白μDystrophin的基因，序列如SEQID NO.3所示。在此基础上，我们使用了肌肉组织特异性启动子，可在C2C12肌肉细胞中高效地产生微缩抗肌营养不良蛋白。最后，我们构建高效组织特异表达微缩抗肌营养不良蛋白的AAV9病毒载体及重组腺相关病毒，可在DMD疾病模型中高效的转导肌肉细胞，并高效地表达有功能的截短的抗肌营养不良蛋白，实现DMD治疗的目标。

Description

表达微缩抗肌营养不良蛋白基因的腺相关病毒载体及其应用

技术领域

本发明属于基因药物领域，涉及表达微缩抗肌营养不良蛋白基因的腺相关病毒载体及其应用。

背景技术

杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy，DMD)是一种X染色体连锁的隐性遗传性疾病，患者自婴幼儿时期发病，神经肌肉障碍表现为进行性肌肉无力、萎缩、消瘦、脂肪浸润和纤维化，从而导致患者自主行走能力逐渐丧失、呼吸衰竭、心肌病和过早的死亡(PMID:33602943)。DMD发病原因是抗肌营养不良蛋白(dystrophin)基因的突变，从而导致dystrophin蛋白表达的缺失。

dystrophin基因由79个外显子组成，编码形成分子量为427kDa的dystrophin蛋白(PMID:7719347)。Dystrophin蛋白由四个结构域组成：N端结构域；棒状结构域；半胱氨酸富集结构域和C端结构域(PMID:3607877)。Dystrophin是一种细胞骨架蛋白，与肌聚糖、肌酵素、神经元一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)等共同组成dystrophin相关蛋白复合物，参与细胞信号转导，在肌纤维膜的稳定中起着至关重要的作用(PMID:26140716)。Dystrophin的缺失会导致肌膜的易损性增强，继而在收缩过程中诱导肌纤维分裂、功能缺血、自由基介导的氧化损伤和胞质钙超载，最终导致线粒体功能障碍和肌纤维死亡(PMID:3173492；PMID:18345011；PMID:11087833)。此外，由于DMD患者肌纤维再生能力的受损，会导致肌肉组织逐渐发生纤维化(PMID:26246170)。引发DMD的基因突变主要为移码突变和无义突变，从而导致dystrophin蛋白表达的完全缺失(PMID:21399986)。

随着医疗水平的发展与进步，越来越多的针对DMD的新兴治疗技术和治疗手段逐渐进入大众视野，如干细胞疗法、外显子跳跃法、基因编辑法和基因替代法等。2021年2月Sarepta Therapeutics公司的Amondys 45(商品名casimersen)，被美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准，可用于具有45号外显子跳跃基因突变的DMD患者。该款药物为一种磷酸二酰胺吗啉寡聚物，利用外显子跳跃疗法，即通过改变表达抗肌营养不良蛋白的mRNA的剪接过程，跳过让蛋白合成过早中断的基因变异，这一策略生成的抗肌营养不良蛋白虽然比正常蛋白要小一些，但是保留了大部分与其他蛋白结合的结构域，因此仍然可以行使蛋白的部分正常功能，达到对外显子45跳跃基因突变的DMD患者治疗的目的。

除了外显子跳跃法和基因编辑法外，备受关注的基因治疗药物还有基因替代疗法，即通过合适的载体，将外源基因导入靶细胞，替代或补偿异常基因实现疾病治疗的目的。目前最领先的是基因疗法SRP-9001(也称：AAVrh74.MHCK7.micro-Dystrophin)。该疗法将MHCK7启动子与AAVrh74载体结合，以提供微缩抗肌营养不良蛋白的表达用于恢复DMD患者的肌肉功能。其中微缩抗肌营养不良蛋白的结构包含N端结构域NT、螺旋状重复区R(1,2,3,24)、铰链区H(1,2,4)及半胱氨酸富集功能区CR，排列方式为NT-H1-R1-R2-R3-H2-R24-H4-CR。目前，SRP-9001正在进行临床研究，SRP-9001中期试验的最新结果未能达到评估改善的主要功能终点。辉瑞公司开发的fordadistrogene movaparvovec(PF-06939926)是一款在研静脉注射基因疗法。它将由人类肌肉特异性启动子控制的“迷你”抗肌营养不良蛋白(mini-dystrophin)转基因装在腺相关病毒9(AAV9)载体中。“迷你”抗肌营养不良蛋白其中的结构包含N端结构域NT、螺旋状重复区R(1,2,22,23,24)、铰链区H(1,3,4)及半胱氨酸富集功能区CR，排列方式为NT-H1-R1-R2-H3-R22-R23-R24-H4-CR。该药物在Ib期临床试验的卧床队列中发生了一例患者死亡。这一消息引发了行业关于基因疗法治疗DMD安全性的新担忧。

DMD的遗传方式为X染色体隐性遗传，其致病基因是抗肌营养不良蛋白基因，该基因为人体最大的基因，远远超出了单个AAV的最佳包装容量(<4.7kb)。现有针对DMD的基因治疗策略大多采用包装截短的但保留关键结构域的肌营养不良蛋白基因，表达截短的但具有生物学功能的肌营养不良蛋白，解决因完整DMD基因过大无法进行包装的问题。DMD基因治疗策略最关键的是截短蛋白结构的设计，不同结构域的保留或去除将极大程度地影响蛋白功能。有研究针对抗肌营养不良蛋白的结果设计了多种不同结构域组合的截短型的蛋白，不同的结构域组合表现出了不同的体内治疗效果(如抗肌营养不良蛋白阳性肌纤维比例、截短蛋白的表达效果、nNOS的募集能力等)。不同结构域的保留和组合所产生的蛋白显示出了不同的功能特性和表达水平。SRP-9001和PF-06939926这两款基因治疗产品均不包含nNOS结合区域R16和R17。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种人微缩抗肌营养不良蛋白μDystrophin及其编码基因。

本发明的另一目的是提供表达微缩抗肌营养不良蛋白基因的腺相关病毒载体和重组腺相关病毒。

本发明的又一目的是提供所述基因、腺相关病毒载体、重组腺相关病毒的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

人微缩抗肌营养不良蛋白μDystrophin，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

编码本发明所述的人微缩抗肌营养不良蛋白μDystrophin的基因。

作为本发明的一种优选，所述的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。

含有编码本发明所述的人微缩抗肌营养不良蛋白μDystrophin的基因的人μDysco蛋白表达框。

作为本发明的一种优选，所述的人μDysco蛋白表达框由增强子-启动子-目的基因序列-polyA信号组成或者由启动子-目的基因序列-polyA信号组成，其中，启动子选自序列如SEQ ID NO.4所示的的肌肉特异的Spc512启动子、序列如SEQ ID NO.5所示的肌肉特异的MCK启动子、序列如SEQ ID NO.7所示的肌肉特异的CK8启动子；目的基因选自本发明所述的基因，优选经密码子优化的编码本发明所述的人微缩抗肌营养不良蛋白μDystrophin的基因。

作为本发明的一种优选，所述的增强子选自序列如SEQ ID NO.6所示的MCK增强子序列，polyA信号序列选自rBG ployA，序列如SEQ ID NO.8所示。

作为本发明的一种优选，所述的增强子、启动子、目的基因序列和polyA之间通过键或核苷酸连接序列连接。

作为本发明的一种优选，Spc512-μDysco蛋白表达框的核苷酸序列如SEQ IDNO.9，MCK-μDysco蛋白表达框的核苷酸序列如SEQ ID NO.11，CK8-μDysco蛋白表达框的核苷酸序列如SEQ ID NO.13。

一种载体，其特征在于含有本发明所述的基因、或本发明所述的人μDysco蛋白表达框。

作为本发明的一种优选，所述载体选自以下任意一种重组腺相关病毒载体血清型：AAV1、AAV2、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10、AAV-LK03或AAVAnc80d，优选AAV2、AAV5、AAV8或AAV9。

一种组织特异性表达Micro-dystrophin蛋白的重组腺相关病毒，将AAV的REP蛋白及CAP蛋白表达质粒、辅助质粒和本发明所述的载体共转染HEK293细胞包装制备得到。

作为本发明的一种优选，所述的AAV的REP蛋白及CAP蛋白表达质粒选自pAAV2/9；所述的辅助质粒选自pAdΔF6。

作为本发明的一种优选，AAV9表达μDysco蛋白的病毒基因组序列如SEQ IDNO.10，SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.14所示。

本发明所述的编码本发明所述的人微缩抗肌营养不良蛋白μDystrophin的基因、所述的人μDysco蛋白表达框、所述的载体、所述的重组腺相关病毒在制备治疗杜氏肌营养不良症的药物中的应用。

作为本发明的一种优选本发明所述的编码本发明所述的人微缩抗肌营养不良蛋白μDystrophin的基因、所述的人μDysco蛋白表达框、所述的载体、所述的重组腺相关病毒在制备恢复DMD疾病小鼠肌肉Dystrophin、nNOS的表达、降低DMD疾病小鼠肌肉纤维化程度、恢复DMD小鼠的肌肉组织形态、恢复DMD小鼠的肌肉力量的药物中的应用。

有益效果：

本发明首先针对抗肌营养不良蛋白的结构进行分析设计了微缩的抗肌营养不良蛋白，该蛋白包含了抗肌营养不良蛋白发挥功能所必须的关键结构域，同时解决了抗肌营养不良蛋白巨大尺寸无法完整包装进AAV的问题。随后我们对微缩抗肌营养不良蛋白基因进行密码子优化，提高了微缩抗肌营养不良蛋白的表达水平。在此基础上，我们使用了肌肉组织特异性启动子，可在C2C12肌肉细胞中高效地产生微缩抗肌营养不良蛋白。最后，我们构建高效组织特异表达微缩抗肌营养不良蛋白的AAV9病毒载体，用于DMD疾病的基因治疗研究。在DMD疾病模型中，将含有新设计微缩抗肌营养不良蛋白表达框的AAV9载体(1×10¹²GC/只，每只注射体积150μl)通过尾静脉注射至疾病小鼠循环系统后评估基因治疗效果。在给药后8周，免疫荧光结果显示各治疗组的肌肉组织中均有抗肌营养不良蛋白和神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)的表达，而未治疗组的DMD小鼠无阳性信号。Masson染色结果显示，治疗组相较于未治疗组，肌肉的纤维化程度得到了一定程度的改善，胶原容积分数下降。通过对各组小鼠肌肉组织的病理形态检测我们发现，治疗组小鼠的肌肉形态得到了不同程度的恢复，炎症浸润的面积大大减少。在肌肉力量检测中，我们发现，治疗组小鼠的抓力值要高于未治疗组，肌肉力量衰减速度更低。以上结果显示，通过新设计优化的微缩抗肌营养不良蛋白编码序列以及对微缩抗肌营养不良蛋白AAV9表达框的设计，可在DMD疾病模型中高效的转导肌肉细胞，并高效地表达有功能的截短的抗肌营养不良蛋白，实现杜氏肌营养不良症疾病治疗的目标。

附图说明

图1μDystrophin蛋白结构示意图

图2密码子优化验证表达载体质粒图谱

图3μDystrophin表达载体体外表达水平验证

A为WB对各组载体μDystrophin表达水平进行比较

B为体外μDystrophin蛋白表达水平WB检测灰度值统计。用image J对(A)图进行分析统计相对灰度值。

图4基因治疗候选载体表达验证

A-C为基因治疗候选载体的质粒图谱

D为WB对各组载体μDystrophin表达水平进行比较

E为体外μDystrophin蛋白表达水平WB检测灰度值统计。用image J对(D)图进行分析统计相对灰度值。

图5重组腺相关病毒结构示意图

图6Dystrophin免疫荧光检测

标尺＝200μm

图7nNOS免疫荧光检测

标尺＝200μm

图8肌肉纤维化检测

A为各组肌肉组织的Masson染色结果，标尺＝200μm

B为用image J对(A)图进行分析统计胶原容积分数

图9肌肉组织形态检测

标尺＝100μm

图10抓力检测结果

A为各组小鼠前肢连续抓力统计图

B为各组小鼠后肢连续抓力统计图

C为各组小鼠前肢平均抓力统计图

D为各组小鼠后肢平均抓力统计图

Untreated：n＝10，WT：n＝15，Spc512：n＝15，MCK：n＝15，CK8：n＝15；ns表示没有显著性差异，*p<0.05,**p<0.01。

具体实施方式

实施例1：人微缩抗肌营养不良蛋白的设计

抗肌营养不良蛋白(Dystrophin)是在定位于肌膜的一种跨膜细胞骨架蛋白，其N端(N-terminal，NT)与细胞内肌动蛋白(F-actin)结合，杆状区域包含24个螺旋状重复区(Repeat，R)和4个铰链区(Hinge，H)，靠近C端附近有一个半胱氨酸富集(Cysteine Rich，CR)的功能区，与β-肌营养不良蛋白-糖蛋白复合物(β-Dystrophin-glycoproteincomplex，β-DGC)相连，在收缩运动过程中负责与钙调蛋白的结合，C端(C-terminal，CT)与dystrobrevin和syntrophin相连，共同参与维持肌细胞膜的稳定。本发明自主设计的人微缩抗肌营养不良蛋白(Micro-dystrophin，μDystrophin)包括Dystrophin蛋白的NT，H1，R1，R16，R17，R24，H4，CR和CT结构域(图1)。这是一种截短的但具有部分生物学功能的抗肌营养不良蛋白，它包含了抗肌营养不良蛋白发挥功能所必须的最重要的结构域，同时解决了抗肌营养不良蛋白巨大尺寸无法完整包装进AAV的问题。

实施例2：微缩抗肌营养不良蛋白目的基因序列优化及表达载体构建

全基因合成野生型微缩抗肌营养不良蛋白基因(μDyswt，SEQ ID NO.2)和密码子优化的微缩抗肌营养不良蛋白基因(μDysco，SEQ ID NO.3)，全质粒合成pAAV.CB7.μDyswt.bGH(图2A，SEQ ID NO.15)和pAAV.CB7.μDysco.bGH(图2B，SEQ ID NO.16)质粒表达载体。

实施例3：μDystrophin表达载体体外表达水平验证

分别将实施例2中的pAAV.CB7.μDyswt.bGH和pAAV.CB7.μDysco.bGH与表达EGFP的质粒以相同的质粒量(1μg),通过Lipo3000转染试剂转染培养于6孔板中的HEK293细胞，72h后提取蛋白，利用蛋白免疫印迹法(Western blot，WB)对μDystrophin的表达水平进行比较。结果显示密码子优化可以显著提高蛋白的表达水平(图3A)，通过对蛋白条带灰度值进行对比，密码子优化后μDystrophin蛋白表达水平提高了1.2倍(图3B)。

实施例4：基因治疗候选载体设计构建及体外表达水平验证

为了进一步评估μDystrophin蛋白在体内的表达，基因治疗疗效和安全性，我们全质粒合成病毒包装顺式质粒载体pAAV.Spc512.μDysco.rBG(图4A，SEQ ID NO.17)、pAAV.MCK.μDysco.rBG(图4B，SEQ ID NO.18)和pAAV.CK8.μDysco.rBG(图4C，SEQ IDNO.19)三个载体。分别将上述的三个质粒载体以及实施例2中的pAAV.CB7.μDysco.bGH载体和表达EGFP的质粒分别以相同的质粒量(1μg),通过Lipo3000转染试剂转染培养于6孔板中的C2C12肌肉细胞，以72h后提取蛋白，利用Western blot对各组载体μDystrophin的表达水平进行比较。通过对蛋白条带灰度值进行对比，pAAV.Spc512.μDysco.rBG载体μDystrophin蛋白表达水平最高，与使用广谱启动子的pAAV.CB7.μDysco.bGH表达水平相当，pAAV.CK8.μDysco.rBG次之，pAAV.MCK.μDysco.rBG表达水平相对最低(图4D和E)，但三个肌肉组织特异性启动子均可以实现在肌肉细胞中表达μDystrophin蛋白。

实施例5：AAV病毒制备与纯化

参考Martin Lock等报道包装和纯化重组AAV病毒的方法，采用PEI将AAV的Rep及Cap蛋白表达质粒(pAAV2/9)、辅助质粒(pAdΔF6)和AAV包装顺式质粒(pAAV.Spc512.μDysco.rBG，SEQ ID NO.17；pAAV.MCK.μDysco.rBG，SEQ ID NO.18；pAAV.CK8.μDysco.rBG，SEQ ID NO.19)分别共转染HEK293细胞包装制备病毒AAV9.Spc512.μDysco(图5A,SEQ IDNO.10)、AAV9.MCK.μDysco(图5B,SEQ ID NO.12)和AAV9.CK8.μDysco病毒(图5C，SEQ IDNO.14)，转染48h后，收获细胞和培养上清，使用碘克沙醇超速梯度离心纯化AAV病毒，用数字定量PCR(ddPCR)法测定病毒滴度，AAV9.Spc512.μDysco病毒滴度为4.44×10¹⁵GC/mL，AAV9.MCK.μDysco病毒滴度为2.35×10¹⁵GC/mL，AAV9.CK8.μDysco病毒滴度为5.51×10¹⁵GC/mL。

实施例6：AAV9μDysco基因治疗恢复DMD疾病小鼠肌肉Dystrophin的表达

使用实施例5中制备的AAV9.Spc512.μDysco、AAV9.MCK.μDysco和AAV9.CK8.μDysco病毒，分别通过尾静脉注射DMD疾病小鼠(4周龄，每种病毒注射15只)，病毒注射剂量为1×10¹²GC/只。病毒注射后8周，我们收集各组小鼠的肌肉组织(每组5只小鼠)，通过冰冻切片和免疫荧光检测各治疗组、未治疗组、野生型小鼠各肌肉组织(心肌，Heart；三头肌，Triceps；胫骨前肌，Tibialis Anterior；臀肌，Gluteus；腓肠肌，Gastrocnemius)中Dystrophin的表达情况。检测结果显示，在病毒给药后8周后，未治疗组不同肌肉组织中都未检出Dystrophin蛋白信号，AAV9.Spc512.μDysco组在胫骨前肌和臀肌中有较弱的Dystrophin蛋白信号检出，AAV9.MCK.μDysco组在心肌、腓肠肌和臀肌中检测到了较强信号，AAV9.CK8.μDysco组和野生型在所有肌肉组织中均检测到了强信号表达(图6)。这说明经过AAV9μDysco基因治疗后，肌膜上的Dystrophin蛋白表达得到了恢复，其中AAV9.CK8.μDysco组表达量最高，治疗效果相对最好。

实施例7：AAV9μDysco基因治疗恢复DMD疾病小鼠肌肉nNOS的表达

病毒注射后8周，我们收集各组小鼠的肌肉组织(每组5只小鼠)，通过冰冻切片和免疫荧光检测各治疗组、未治疗组、野生型小鼠各肌肉组织(心肌，Heart；胫骨前肌，Tibialis Anterior；腓肠肌，Gastrocnemius)中nNOS的表达情况。检测结果显示，在病毒给药后8周后，未治疗组不同肌肉组织中都未检出nNOS蛋白信号，三个治疗组和野生型小鼠均在胫骨前肌和腓肠肌中检测到了较强的信号。在心肌组织中，AAV9.Spc512.μDysco组和AAV9.MCK.μDysco组检测到了微弱的nNOS信号，只有AAV9.CK8.μDysco组和野生型组有较强信号检出(图7)。以上结果说明经过AAV9μDysco基因治疗后，可以恢复nNOS蛋白的表达，其中AAV9.CK8.μDysco组治疗效果是三个治疗组中最好的。

实施例8：AAV9μDysco基因治疗降低DMD小鼠的肌肉纤维化程度

病毒注射后8周，我们收集各组小鼠的肌肉组织(每组5只小鼠)，通过冰冻切片和Masson染色检测各治疗组、未治疗组、野生型小鼠各肌肉组织(心肌，Heart；胫骨前肌，Tibialis Anterior；腓肠肌，Gastrocnemius)中的纤维化及间质钙化的情况，判断肌肉组织的健康状况。Masson染色中小分子染料会进入肌纤维使其呈红色，而分子量大的苯胺只能进入结构疏松的胶原纤维中使其呈蓝色，此外产生钙化的地方会被染成深红色(图8A箭头所示)。经统计分析各组胶原容积分数结果可知，未治疗组在胫骨前肌、腓肠肌和心肌中胶原容积分数分别为16％，25％和，26％，大量的肌纤维受损发生纤维化。经过AAV9μDysco基因治疗后，治疗组AAV9.Spc512.μDysco组在腓肠肌中的胶原容积分数为5％，心肌中胶原容积分数为8％，较未治疗组纤维化程度有一定程度的改善；AAV9.MCK.μDysco组和AAV9.CK8.μDysco组各肌肉组织中胶原容积分数均下降到4％以下，这说明经基因治疗后μDystrophin蛋白的表达保护了肌膜，使得肌纤维的抵抗机械损伤的能力大大提高。

实施例9：AAV9μDysco基因治疗恢复DMD小鼠的肌肉组织形态

病毒注射后8周，我们收集各组小鼠的肌肉组织(每组5只小鼠)，通过冰冻切片和H&E染色检测各治疗组、未治疗组、野生型小鼠各肌肉组织(心肌，Heart；三头肌，Triceps；胫骨前肌，Tibialis Anterior；臀肌，Gluteus；腓肠肌，Gastrocnemius)的组织形态情况。通过H&E染色结果可以看到，未治疗组的各肌肉组织中存在大量的炎症细胞浸润(图9箭头所示)，经过AAV9μDysco基因治疗后8周的小鼠，三个治疗组在各肌肉组织中的肌肉形态均得到了不同程度的恢复，肌肉组织中的炎症浸润的面积大大减少。AAV9.Spc512.μDysco组在三头肌和臀肌组织中仍能看到较明显的炎症浸润情况，AAV9.CK8.μDysco组的恢复水平是三个治疗组中最好的，其肌肉形态恢复到了与野生型对照组相当的水平(图9)。

实施例10：AAV9μDysco基因治疗恢复DMD小鼠的肌肉力量

在病毒注射后的第8周，我们对各组小鼠进行了三次重复实验的抓力测试，评价其肌肉力量大小以及抓力衰减的情况。根据抓力测试统计结果分析，三次连续间隔的握力测量反映了小鼠的肌肉力量衰减的变化情况(图10A和B)，AAV9.Spc512.μDysco组小鼠前肢与未治疗组相较有所提高但无统计学差异，AAV9.MCK.μDysco组力量提高较未治疗组有统计学差异(p<0.05)，AAV9.CK8.μDysco组前肢力量恢复水平最佳，与未治疗组相比具有显著性差异(p<0.01)。后肢力量经统计，三个治疗组其肌肉力量均有明显的提高，较未治疗组均有统计学差异(p<0.05)。此外，我们还通过统计抓力平均值的情况，分析经治疗后小鼠的总体抓力情况，从统计结果中可以看出(图10C和D)，AAV9.MCK.μDysco和AAV9.CK8.μDysco组较未治疗组均有统计学差异(p<0.05)。以上结果说明，AAV9μDysco基因治疗可以恢复DMD小鼠的肌肉力量，AAV9.CK8.μDysco组治疗后的恢复效果最佳。

Claims (14)

1.人微缩抗肌营养不良蛋白μDystrophin，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述的人微缩抗肌营养不良蛋白μDystrophin的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于所述的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。

4.含有权利要求2-3中任一项所述的基因的人μDysco蛋白表达框。

5.根据权利要求4所述的人μDysco蛋白表达框，其特征在于由增强子-启动子-目的基因序列-polyA信号组成或者由启动子-目的基因序列-polyA信号组成，其中，启动子选自序列如SEQ ID NO.4所示的的肌肉特异的Spc512启动子、序列如SEQ ID NO.5所示的肌肉特异的MCK启动子、序列如SEQ ID NO.7所示的肌肉特异的CK8启动子；目的基因选自权利要求2-3中任一项所述的基因。

6.根据权利要求5所述的人μDysco蛋白表达框，其特征在于所述的增强子选自序列如SEQ ID NO.6所示的MCK增强子序列，polyA信号序列选自rBG ployA，序列如SEQ ID NO.8所示。

7.根据权利要求5所述的所述的人μDysco蛋白表达框，其特征在于人μDysco蛋白表达框的核苷酸序列选自SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.13中的任意一种。

8.一种载体，其特征在于含有权利要求2-3中任一项所述的基因、或权利要求4-7中任一项所述的人μDysco蛋白表达框。

9.根据权利要求8所述的载体，其特征在于所述载体选自以下任意一种重组腺相关病毒载体血清型：AAV1、AAV2、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10、AAV-LK03或AAVAnc80d，优选AAV2、AAV5、AAV8或AAV9。

10.一种组织特异性表达Micro-dystrophin蛋白的重组腺相关病毒，其特征在于将AAV的REP蛋白及CAP蛋白表达质粒、辅助质粒和权利要求8或9所述的载体共转染HEK293细胞包装制备得到。

11.根据权利要求10所述的重组腺相关病毒，其特征在于所述的AAV的REP蛋白及CAP蛋白表达质粒选自pAAV2/9；所述的辅助质粒选自pAdΔF6。

12.根据权利要求10所述的重组腺相关病毒，其特征在于AAV9表达μDysco蛋白的病毒基因组序列如SEQ ID NO.10，SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.14所示。

13.权利要求2-3中任一项所述的基因、权利要求4-7中任一项所述的人μDysco蛋白表达框、权利要求8-9中任一项所述的载体、权利要求10-12中任一项所述的重组腺相关病毒在制备治疗杜氏肌营养不良症的药物中的应用。

14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于权利要求2-3中任一项所述的基因、权利要求4-7中任一项所述的人μDysco蛋白表达框、权利要求8-9中任一项所述的载体、权利要求10-12中任一项所述的重组腺相关病毒在制备恢复DMD疾病患者肌肉Dystrophin、nNOS的表达、降低DMD疾病患者肌肉纤维化程度、恢复DMD患者的肌肉组织形态、恢复DMD患者的肌肉力量的药物中的应用。

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