JP2023036618A

JP2023036618A - コロイデレミアの遺伝子治療に使用するためのａａｖベクター

Info

Publication number: JP2023036618A
Application number: JP2022193831A
Authority: JP
Inventors: マクラーレン、ロバート; Maclaren Robert; シーブラ、ミゲル; Seabra Miguel; ジョンデュアリング、マシュウ; John During Matthew
Original assignee: Oxford University Innovation Ltd
Current assignee: Oxford University Innovation Ltd
Priority date: 2011-02-22
Filing date: 2022-12-02
Publication date: 2023-03-14
Also published as: US20230332176A1; KR20140044793A; US20210032656A1; WO2012114090A1; KR102299430B1; US20180135078A1; AU2012220404B2; MX356525B; BR112013021318B1; US20140107185A1; BR112013021318A2; EP2678435B2; PL2678435T3; DK2678435T3; KR102139203B1; JP2017221192A; MX2013009604A; HK1258917A1; KR20210112407A; CN103562396A

Abstract

【課題】本発明は、コロイデレミアの治療又は予防のための遺伝子治療法を提供する。【解決手段】アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノム又はその誘導体及びＲＥＰ１又はその変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含む、ベクターを提供する。【選択図】図１

Description

本発明は、コロイデレミア（choroideremia）の治療又は予防のための遺伝子治療に関
する。

コロイデレミアは、眼の脈絡膜、網膜色素上皮、及び光受容体の稀なＸ連鎖進行性変性である。罹患男性の典型的な自然史は、１０代半ばで夜盲症を発症し、その後２０代３０代の間に進行的に周辺視野を失い、４０代で完全に失明する。女性のキャリアは、緩やかな症状であり、中でも注目すべきは夜盲症であるが、さらに深刻な表現型の場合がある。
この疾患は、Ｘ染色体２１ｑ領域に位置するＲＥＰ１遺伝子（Rab escort protein 1）の変異により生じる。体内のほとんどの細胞では、ＲＥＰ１と７５％相同であるＲＥＰ２タンパク質がＲＥＰ１欠損を補う。しかしながら、理由はまだ不明であるが、眼ではＲＥＰ２がＲＥＰ１欠損を補うことができない。したがって、眼では、ＲＥＰポリペプチド活性が標的タンパク質（Rab GTPases）の通常のプレニル化を維持するのに十分ではなく、
主に外側の網膜と脈絡膜に影響を与え、細胞の機能障害と最終的な死に至る。
コロイデレミアの治療法はなく、治療戦略を評価するモデルも存在しない。そのような治療法を提供する必要がある。

本発明は、コロイデレミアの遺伝子治療に使用することができるベクター、該ベクターを用いてこの疾患を予防又は治療する方法に関する。本発明は、コロイデレミアの予防又は治療方法における該ベクターの使用にも関する。
本発明のベクターはウイルスベクターであり、具体的にはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムに基づくものである。該ベクターは、ＲＥＰ１又はその変異体をコードする配列を含み、それにより、標的細胞でのＲＥＰ１機能の発現が可能となる。本発明の方法及び用途は、具体的にはコロイデレミアを治療又は予防するために、直接網膜に注射、網膜下に注射、又は硝子体内注射により患者にベクターを投与することを含む。
したがって、本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノム又はその誘導体とＲＥＰ１又はその変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。さらに本発明は、それを必要とする患者のコロイデレミアを治療又は予防する方法であって、直接網膜に注射、網膜下に注射、又は硝子体内注射により、該患者に前記請求項のいずれか１項に記載のベクターを治療有効量投与することを含み、それにより該患者のコロイデレミアを治療又は予防する方法を提供する。加えて、本発明は、直接網膜に注射、網膜下に注射、又は硝子体内注射により患者にベクターを投与することでコロイデレミアを治療又は予防する方法で用いるために本発明のベクターを提供する。

図１は、ＡＡＶ．ＲＥＰ１（ＡＡＶ－ＣＡＧ－ＲＥＰ１）ベクターが、コロイデレミア（Ｃｈｍ）の患者から単離されたヒト線維芽細胞に効率的に形質導入することができることを示す。human REP1 protein（ｈＲＥＰ１）の相対的な発現レベルをウェスタンブロットで比較し、それにより、細胞溶解物の異なる濃度におけるｈＲＥＰ１の量を比較することで、ＡＡＶ２．ＲＥＰ１ベクター活性の定量化が可能となる。標識に関し、ＣＡＧは、ＣＭＶエンハンサープロモーター配列を伴うChicken beta Actinであり－互換的に、様々な文献及び本記載の一部において「ＣＢＡ」と称される。ウェスタンブロットは、左パネルがＲＥＰ１（上のパネル）、ローディングコントロールとしてalpha-tubulin（下のパネル）を示す。レーン１：コントロール野生型（ＷＴ）線維芽細胞由来の４０μｇ細胞溶解物、レーン２：Ｃｈｍ線維芽細胞由来の４０μｇ細胞溶解物、レーン３－６：ＡＡＶ２．ＲＥＰ１ベクターで形質導入されたＣｈｍ線維芽細胞由来の４０、２０、１０及び５μｇ細胞溶解物、レーン７：ヒトＲＥＰ１組み換えタンパク質。５μｇ溶解物ｈＲＥＰ１のバンドは、ＷＴ線維芽細胞溶解物の４０μｇのバンドと同様の密度であるため、ＡＡＶ２．ＲＥＰ１ベクターで達成されたｈＲＥＰ１レベルは、これらの条件下において、正常の野生型レベルの少なくとも８倍（４０／５）達成することができる。本アッセイのプロモーター及び他の非ＲＥＰ１配列のポジティブコントロールとして、ＲＥＰ１の位置にgreen fluorescent protein（ＧＦＰ）を発現するコントロールＡＡＶベクター（ＡＡＶ－ＣＡＧ－ＧＦＰ）の結果も示す。ウェスタンブロットは、右パネルがＧＦＰ（上のパネル）、ローディングコントロールとして、alpha-tubulin（下のパネル）を示す。レーン１：野生型（ＷＴ）線維芽細胞由来の４０μｇ細胞溶解物、レーン２：ＡＡＶ２．ＧＦＰベクター（ＡＡＶ－ＣＡＧ－ＲＥＰ１）で形質導入したＣｈｍ線維芽細胞由来の４０μｇ細胞溶解物。示されたＧＦＰの高発現レベルは、コロイデレミアの患者でのケースのように、ＲＥＰ１活性が欠損したヒト細胞に形質導入する際の本ベクター発現カセットの効率を裏付けている。図２は、ＷＴヒト線維芽細胞（左の第１カラム－ライトグレー）、Ｃｈｍ線維芽細胞（第２カラム－ダークグレー）、ＡＡＶ－ＣＡＧ－ＧＦＰベクター形質導入Ｃｈｍ線維芽細胞（第３カラム－白、ネガティブコントロール）、及びＡＡＶ－ＣＡＧ－ＲＥＰ１形質導入Ｃｈｍ線維芽細胞（第４カラム－白）でのプレニル化活性の評価を示す。Ｙ軸（縦軸）は、転移された放射標識された基質である［３Ｈ］ＧＧＰＰ基質の量（ｐｍｏｌ）を示し、それはＲＥＰ１機能であるプレニル化の基準になる。カラムは、標準偏差（各カラム、ｎ＝４）としてエラーバーを示す。［３Ｈ］－ＧＧＰＰのレベルは、１０ｍｇのタンパク質抽出物で測定した。左から４番目のシアンカラムは、ＡＡＶ．ＲＥＰ１ベクターでの形質転換後、プレニル化の機能も野生型レベルを超えるまで回復していることを裏付ける。これは、図１のウェスタンブロットで検出されたＲＥＰ１タンパク質が予測された機能を有することを裏付けている。図３は、ＡＡＶベクターが、マウスモデルにおいて網膜投与された後、網膜の外側の細胞（光受容体及び脈絡膜）へ正しい指向性を有することを示す。右側のパネルは、マウスの眼に、ＡＡＶ２．ＣＢＡ．ＧＦＰ．ＷＰＲＥ．ＢＧＨベクターを網膜下に投与後、outer nuclear layer（ＯＮＬ；外顆粒層）と網膜色素上皮（ＲＰＥ）の光受容体でのgreen fluorescent protein（ＧＦＰ）マーカーの適切な発現を示している。左側のパネルは、同じ像のグレースケールを示す。これは、ＡＡＶ２．ＣＢＡ．ＷＰＲＥ．ＢＧＨ調節配列が、コロイデレミア患者の標的にされる必要がある網膜細胞で、高効率的の導入遺伝子の発現が可能であることを裏付けている。図４は、ＡＡＶ．ＲＥＰ１ベクターが、マウス網膜において高用量で外側の網膜機能に悪影響を与えないことを示している。マウス網膜下腔に、ＡＡＶ．ＲＥＰ１ベクターをそれぞれ高（ｎ＝５）又は低（ｎ＝４）用量、２×１μＬの網膜下投与６ヶ月後の網膜電図（ＥＲＧ）の測定での毒性試験の結果を示す。低用量＝１×１０^１１及び高用量＝１×１０^１２ゲノム粒子（ｇｐ）／ｍｌ（ヒト臨床試験のための初期投与量は１×１０^１１ｇｐ／ｍｌ）。ＡＡＶ．ＧＦＰベクターは、同一の発現カセットを有し、また、注射前にコントロールとして作用するよう同量にまで希釈されている。Ｙ軸は、上位に閃光（bright）に対する暗順応（暗順応した）杆体応答（rod response）から、下位に明所視応答（photopic response）（錐体光受容体も含む）まで、増加フラッシュ強度（increasing flash intensities）でのＥＲＧトレースを示す。すべてのポイントでのトレースは、ＡＡＶ．ＲＥＰ１露出高用量及び低用量後、類似のＥＲＧ振幅を示している。高用量群において、等価のＧＦＰ振幅は、高レベルでのＧＦＰ網膜機能での既知の限界効果を維持しつつわずかに減少している。このＧＦＰ効果もこの試験の感受性を裏付けるためのポジティブコントロールとして作用する。

配列の説明
配列番号１は、ＡＡＶ２ゲノムのＤＮＡ配列である。
配列番号２は、ヒトＲｅｐ－１タンパク質、転写変異体１をコードするＤＮＡ配列である。
配列番号３は、ヒトＲｅｐ－１タンパク質、転写変異体１のアミノ酸配列である。
配列番号４は、５’ＵＴＲの一部を含むヒトＲｅｐ－１タンパク質、転写変異体１をコードするＤＮＡ配列である。
配列番号５は、woodchuck hepatitis postregulatory element（ＷＰＲＥ）のＤＮＡ配列である。
配列番号６は、chicken beta actin（ＣＢＡ）プロモーターのＤＮＡ配列である。
配列番号７は、Bovine Growth Hormone（ｂＧＨｐｏｌｙＡ）由来ポリアデニレーショ
ン部位のＤＮＡ配列である。
配列番号８は、ＡＡＶ２の５’inverted terminal repeat（ＩＴＲ）のＤＮＡ配列である。
配列番号９は、ＡＡＶ２の３’ＩＴＲのＤＮＡ配列である。

発明の詳細な説明

本発明は、コロイデレミアの治療法を提供する。これは、ＲＥＰ１機能を回復するための導入遺伝子を伝達する遺伝子コンストラクト（genetic construct）を用いる、疾患に
対する遺伝子治療アプローチに基づいている。該遺伝子コンストラクトは、ＲＥＰ１又はその変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムに基づくベクターである。本ポリヌクレオチド配列を「導入遺伝子」ともいう。本願発明者らは、コロイデレミアの治療のための戦略を評価するためのモデルを構築し、そして驚くべきことに、この病気の根底にある細胞の機能障害を標的とする本発明のベクターの使用を実証する。

ベクター
ＡＡＶゲノム
本発明のベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノム又はその誘導体を第一に含む。ＡＡＶゲノムは、ＡＡＶウイルス粒子の製造に必要とされる機能をコードするポリヌクレオチド配列である。これらの機能は、ＡＡＶウイルス粒子へのＡＡＶゲノムのカプシド形成を含む、宿主細胞でのＡＡＶの複製とパッケージング周期でのこれらのオペレーティングを含む。天然に生じるＡＡＶウイルスは複製欠損性であり、かつ、複製とパッケージング周期の完了のためにトランスに作用するヘルパー機能の提供に依存する。したがって、本発明のベクターのＡＡＶゲノムは、典型的に複製欠損性である。

ＡＡＶゲノムは、１本鎖形態、ポジティブ又はネガティブセンスのいずれであってもよく、あるいは、２本鎖形態であってもよい。２本鎖形態の使用により、標的細胞でのＤＮＡ複製ステップのバイパスが可能となり、その結果、導入遺伝子の発現を加速することができる。
ＡＡＶゲノムは、天然由来の血清、又はＡＡＶの分離株（isolates）若しくはクレード（系統群）のいずれでもよい。そして、ＡＡＶゲノムは、天然に生じるＡＡＶウイルスの全長ゲノムであってよい。当業者に既知のとおり、天然に生じるＡＡＶウイルスは、様々な生物学的システムに従って分類され得る。
一般に、ＡＡＶウイルスはその血清型の観点から参照される。血清型は、カプシド表面抗原の発現のプロファイルのため、他の様々な亜種とそれを区別するのに使用され得る独自の反応性を有する様々なＡＡＶ亜種に対応する。概して、特定のＡＡＶ血清型を有するウイルスは、他のいかなるＡＡＶ血清型特異的な中和抗体とも効率的に交差しない。ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０及びＡＡＶ１１、また、霊長類脳から最近同定されたＲｅｃ２、Ｒｅｃ３等の組み換え血清型も含む。

本発明での使用に好ましいＡＡＶ血清型はＡＡＶ２である。ＡＡＶ２ゲノムは配列番号１の配列を有し得る。本発明での使用で特に興味深い他の血清型は、網膜色素上皮等、眼で効率的に組織を形質導入するＡＡＶ４、ＡＡＶ５及びＡＡＶ８を含む。使用されるＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ４ではないＡＡＶ血清型であり得る。ＡＡＶ血清型の総説；Choi et al （Curr Gene Ther. 2005; 5(3); 299-310）及びWu et al （Molecular Therapy. 2006; 14（3）, 316-327）を参照してよい。本発明で使用するＡＡＶゲノム配列、又はＩＴＲ配列、ｒｅｐ若しくはｃａｐ遺伝子を含むＡＡＶゲノムのエレメントは、ＡＡＶ全ゲノム配列に対する以下のアクセッション番号から得ることができる。
Adeno-associated virus 1 NC_002077, AF063497; Adeno-associated virus 2 NC_001401; Adeno-associated virus 3 NC_001729; Adeno-associated virus 3B NC_001863; Adeno-associated virus 4 NC_001829; Adeno-associated virus 5 Y18065, AF085716; Adeno-associated virus 6 NC_001862; Avian AAV ATCC VR-865 AY186198, AY629583, NC_004828; Avian AAV strain DA-1 NC_006263, AY629583; Bovine AAV NC_005889, AY388617。

ＡＡＶウイルスは、クレード又はクローンの観点からも参照され得る。これは、天然に由来するＡＡＶウイルスとの系統関係に関連し、概して、共通の祖先に遡り得るＡＡＶウイルスの系統群に関連し、それら全ての子孫を含む。さらに、ＡＡＶウイルスは、特定の分離株、すなわち、天然に見出された特定のＡＡＶウイルスの遺伝的分離株（genetic isolate）の観点からも参照され得る。遺伝的分離株という単語は、他の天然に生じるＡＡ
Ｖウイルスと限定された遺伝的混合を経験したＡＡＶウイルス集団をいい、それにより、遺伝的レベルではっきり異なる集団を定義する。
本発明で使用し得るＡＡＶのクレード及び分離株の例は以下を含む：
Clade A: AAV1 NC_002077, AF063497, AAV6 NC_001862, Hu. 48 AY530611,Hu 43 AY530606, Hu 44 AY530607, Hu 46 AY530609
Clade B: Hu. 19 AY530584, Hu. 20 AY530586, Hu 23 AY530589, Hu22 AY530588, Hu24
AY530590, Hu21 AY530587, Hu27 AY530592, Hu28 AY530593, Hu 29 AY530594, Hu63 AY530624, Hu64 AY530625, Hu13 AY530578, Hu56 AY530618, Hu57 AY530619, Hu49 AY530612, Hu58 AY530620, Hu34 AY530598, Hu35 AY530599, AAV2 NC_001401, Hu45 AY530608, Hu47 AY530610, Hu51 AY530613, Hu52 AY530614, Hu T41 AY695378, Hu S17 AY695376, Hu T88 AY695375, Hu T71 AY695374, Hu T70 AY695373, Hu T40 AY695372, Hu T32 AY695371, Hu T17 AY695370, Hu LG15 AY695377,
Clade C: Hu9 AY530629, Hu10 AY530576, Hu11 AY530577, Hu53 AY530615, Hu55 AY530617, Hu54 AY530616, Hu7 AY530628, Hu18 AY530583, Hu15 AY530580, Hu16 AY530581, Hu25 AY530591, Hu60 AY530622, Ch5 AY243021, Hu3 AY530595, Hu1 AY530575, Hu4 AY530602 Hu2, AY530585, Hu61 AY530623
Clade D: Rh62 AY530573, Rh48 AY530561, Rh54 AY530567, Rh55 AY530568, Cy2 AY243020, AAV7 AF513851, Rh35 AY243000, Rh37 AY242998, Rh36 AY242999, Cy6 AY243016, Cy4 AY243018, Cy3 AY243019, Cy5 AY243017, Rh13 AY243013
Clade E: Rh38 AY530558, Hu66 AY530626, Hu42 AY530605, Hu67 AY530627, Hu40 AY530603, Hu41 AY530604, Hu37 AY530600, Rh40 AY530559, Rh2 AY243007, Bb1 AY243023, Bb2 AY243022, Rh10 AY243015, Hu17 AY530582, Hu6 AY530621, Rh25 AY530557, Pi2 AY530554, Pi1 AY530553, Pi3 AY530555, Rh57 AY530569, Rh50 AY530563, Rh49 AY530562, Hu39 AY530601, Rh58 AY530570, Rh61 AY530572, Rh52 AY530565, Rh53 AY530566, Rh51 AY530564, Rh64 AY530574, Rh43 AY530560, AAV8 AF513852, Rh8 AY242997, Rh1 AY530556
Clade F: Hu14 （AAV9） AY530579, Hu31 AY530596, Hu32 AY530597, Clonal Isolate AAV5 Y18065, AF085716, AAV 3 NC_001729, AAV 3B NC_001863, AAV4 NC_001829, Rh34 AY243001, Rh33 AY243002, Rh32 AY243003

当業者は技術常識に基づいて、本発明の使用に適した血清、ＡＡＶのクレード、クローン又は分離株を選択することができる。例えば、ＡＡＶ５カプシドは、遺伝的色覚欠如の
成功した補正から証明されるように、効率的に霊長類錐体光受容体を導入することが示されている（Mancuso et al., Nature 2009, 461:784-7）。
しかしながら、本発明は未だ同定又は特徴付けられていないかもしれない他の血清型のＡＡＶゲノム使用も包含することを理解されるべきである。ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶウイルスの感染（又は指向性）の組織特異性を決定する。したがって、本発明に従って患者に投与されるＡＡＶウイルスでの使用に好ましいＡＡＶ血清型は、天性の指向性を有するか、又はコロイデレミアの変性している網膜内での標的細胞の感染に高効率を示すものである。よって、患者に投与されるＡＡＶウイルスでの使用に好ましいＡＡＶ血清型は、神経感覚網膜及び網膜色素上皮の細胞に感染するものである。

概して、天然由来の血清型、又はＡＡＶの分離株若しくはクレードのＡＡＶゲノムは、少なくとも１つのinverted terminal repeat（ＩＴＲ）配列を含む。ＩＴＲ配列は、機能的な複製開始点を提供するようシスに作用し、それにより細胞のゲノムから、ベクターの挿入と切り出しが可能となる。好ましい実施態様では、１以上のＩＴＲ配列は、Ｒｅｐ－１またはその変異体をコードするポリヌクレオチド配列と隣接する。好ましいＩＴＲ配列は、配列番号８、９及びそれらの変異体の配列を含むＡＡＶ２のものである。ＡＡＶゲノムは、概してＡＡＶウイルス粒子のためのパッケージング機能をコードするｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子等のパッケージング遺伝子も含む。ｒｅｐ遺伝子は、１以上のＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０タンパク質又はそれらの変異体をコードする。ｃａｐ遺伝子は、１以上のＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３等のカプシドタンパク質又はそれらの変異体をコードする。これらのタンパク質は、ＡＡＶウイルス粒子のカプシドを構成する。カプシド変異体は後述する。

プロモーターは各パッケージング遺伝子と作動可能に連結される。このようなプロモーターの具体的な例として、ｐ５、ｐ１９及びｐ４０プロモーター（Laughlin et al., 1979, PNAS, 76:5567-5571）が含まれる。例えば、ｐ５とｐ１９プロモーターは、ｒｅｐ遺
伝子を発現するために通常使用される。一方、ｐ４０プロモーターは、ｃａｐ遺伝子を発現するために通常使用される。
上述のとおり、本発明のベクターで使用されたＡＡＶゲノムは、それ故、天然に生じるＡＡＶウイルスの全ゲノムであり得る。例えば、ｉｎｖｉｔｒｏでＡＡＶウイルスを調製するために、全ＡＡＶゲノムを含むベクターを使用することができる。しかしながら、このようなベクターは、原理的には患者に投与され得るとしても、実際問題としては稀であろう。好ましくは、ＡＡＶゲノムは患者への投与目的のために誘導体化されるだろう。このような誘導体化は、当該分野で一般的であり、本発明はＡＡＶゲノムの任意の既知の誘導体の使用を含み、また誘導体は当該分野で既知の技術を適用して作成され得る。ＡＡＶゲノムの誘導体やＡＡＶカプシドの誘導体は、CouraとNardi（Virology Journal, 2007, 4:99）に掲載されており、Choi et alとWu et alは上記参照。

ＡＡＶゲノムの誘導体は、ｉｎｖｉｖｏで本発明のベクターからＲｅｐ－１導入遺伝子の発現を可能にする、ＡＡＶゲノムのいかなる欠失（truncated）形態又は修飾形態を
含む。概して、上記機能を保持したままで、最小限のウイルス配列を含むようにＡＡＶゲノムを著しく短くすることが可能である。これは、野生型ウイルスとベクターとの組み換えの危険性を減らし、標的細胞でのウイルス遺伝子タンパク質の存在により、細胞性免疫応答を引起すことを避けるためにも、安全上の理由から好ましい。

概して、誘導体は少なくとも１つのinverted terminal repeat（ＩＴＲ）配列、好ましくは２つのＩＴＲまたはそれ以上等、２以上のＩＴＲを含む。１以上のＩＴＲは、異なる血清型を有するＡＡＶゲノム由来であってよく、あるいはキメラＩＴＲ又は変異ＩＴＲであってよい。好ましい変異ＩＴＲは、ｔｒｓ（terminal resolution site；末端解離部位）の１つの欠失を有するものである。この欠失により、コーディング配列と相補配列の両
者、すなわち、自己相補性ＡＡＶゲノムを含む１本鎖ゲノムを生み出すゲノムを継続的に複製することが可能となる。これにより、標的細胞でのＤＮＡ複製のバイパスが可能となり、導入遺伝子の促進的な発現が可能となる。

１以上のＩＴＲは、どちらかの端で、Ｒｅｐ－１又はその変異体をコードするポリヌクレオチド配列と隣接することが好ましい。１以上のＩＴＲを包含することが、例えば、宿主細胞のＤＮＡポリメラーゼの作用により、１本鎖ベクターＤＮＡを２本鎖ＤＮＡへ変換した後、宿主細胞の核内で本発明のベクターのコンカテマー形成を補助するために好ましい。このようなエピソームコンカテマーの形成は、宿主細胞が生きている間ベクターコンストラクトを保護し、ｉｎｖｉｖｏでの導入遺伝子の長期発現が可能となる。

好ましい実施形態において、ＩＴＲエレメントは、誘導体中の天然ＡＡＶゲノムから保持されている唯一の配列である。したがって、誘導体は天然ゲノムのｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子並びに天然ゲノムの他のいかなる配列を好ましくは含まない。これは、上述の理由により好ましく、また、宿主細胞ゲノムへのベクターの挿入の可能性を減少するためにも好ましい。さらに、ＡＡＶゲノムサイズを減少することにより、導入遺伝子に加えてベクター内での他の配列エレメント（調節エレメント等）の取込みにおける柔軟性の増大が可能となる。

配列番号１のＡＡＶ２ゲノムに関して、故に、以下の部分が本発明の誘導体の中から削除され得る。１つのinverted terminal repeat（ＩＴＲ）配列、複製（ｒｅｐ）遺伝子とカプシド（ｃａｐ）遺伝子（ＮＢ：野生型ＡＡＶゲノムにおけるｒｅｐ遺伝子は、コロイデレミアでヒト遺伝子に影響するＲＥＰ１と混乱されるべきでない）。しかしながら、いくつかの実施形態では、ｉｎｖｉｔｒｏでの実施形態を含め、誘導体は、１以上のｒｅｐ遺伝子及び／又はｃａｐ遺伝子あるいはＡＡＶゲノムの他のウイルス配列をさらに含んでいてもよい。天然に生じるＡＡＶウイルスは、ヒト第１９染色体の特異的な部位に高頻度でインテグレート（組み込まれ）、ランダムインテグレーションは無視できる頻度を示す。したがって、ベクターでの組み込み能力の保持は、治療的設定で容認され得る。

誘導体化されたゲノムがカプシドタンパク質、すなわち、ＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶＰ３をコードする遺伝子を含む場合、誘導体は天然に生じるＡＡＶウイルスの１以上のキメラ、シャッフルあるいはカプシド修飾誘導体であってよい。特に、本発明は、同じベクター、すなわち、シュードタイピング内での異なるＡＡＶの血清型、クレード、クローン又は分離株に由来するカプシドタンパク質配列の提供を含む。

キメラ、シャッフル又はカプシド修飾誘導体は、概して、１以上のウイルスベクターの所望の機能を提供するために選択される。したがって、これらの誘導体は、遺伝子伝達の効率向上、減少した免疫原性（体液性又は細胞性）、変化した指向性範囲、及び／又は、ＡＡＶ２等天然に生じるＡＡＶゲノムを含むＡＡＶウイルスベクターと比べて、特定の細胞タイプの改善されたターゲッティングを示し得る。遺伝子伝達の効率向上は、細胞表面で、改善された受容体又は共受容体（co-receptor）結合、改善された内在化、細胞内と
核内への改善されたトラフィッキング（trafficking）、ウイルス粒子の改善された脱殻
、１本鎖ゲノムから２本鎖形態への改善された変換により影響され得る。効率向上は、変化した指向性の範囲又は特定の細胞集団のターゲッティングにも関連し得るため、ベクター量はそれが必要でない組織への投与により希釈されない。

キメラカプシドタンパク質は、天然に生じるＡＡＶ血清型の２以上のカプシドコーディング配列の間で組み換えにより生じたものを含む。これは、ある１つの血清型の非感染性カプシド配列が異なる血清型のカプシド配列で共トランスフェクトされ、所望の特性を有するカプシド配列を選択するために直接的な選択が使用される、例えばマーカーレスキュ
ーアプローチにより実行され得る。異なる血清型のカプシド配列が、新たなキメラカプシドタンパク質を製造するために、細胞内において相同組換えにより変更され得る。
キメラカプシドタンパク質は、特定のカプシドタンパク質ドメイン、表面ループ、又は２以上のカプシドタンパク質、例えば、異なる血清型の２以上のカプシドタンパク質内の特定のアミノ酸残基を転移するためのカプシドタンパク質配列をエンジニアリングにより作製されたものも含む。

シャッフル又はキメラカプシドタンパク質は、ＤＮＡシャッフリング又はエラープローン（error-prone）ＰＣＲで作製されてよい。ハイブリッドＡＡＶカプシド遺伝子は、関
連するＡＡＶ遺伝子配列のランダムな断片化、例えば、多数の異なる血清型カプシドタンパク質をコードする配列を、配列ホモロジーの領域内でクロスオーバーを起こすかもしれない自己プライミングポリメラーゼ反応内で、フラグメントをその後再構成することにより作り出すことができる。幾つかの血清型のカプシド遺伝子のシャッフリングによるこの方法で作り出されたハイブリッドＡＡＶ遺伝子ライブラリーは、所望の機能を有するウイルスクローンを同定するためにスクリーニングされ得る。同様に、エラープローンＰＣＲは、所望の特性のために選択され得る多様な変異体ライブラリーを作り出すためにランダムに変異したＡＡＶカプシド遺伝子に使用してもよい。

カプシド遺伝子の配列は、天然の野生型配列に対して、特定の欠失、置換又は挿入を導入するために遺伝的に修飾され得る。特に、カプシド遺伝子は、カプシドコーディング配列のＯＲＦ内あるいは、カプシドコーディング配列のＮ末端及び／又はＣ末端で、関連のないタンパク質又はペプチドの配列の挿入により修飾され得る。
関連のないタンパク質又はペプチドは、有利に、特定の細胞型のリガンドとして作用するものであってよい。それにより、標的細胞への改善された結合や特定の細胞集団へのベクターのターゲティングの特異性の改善をもたらす。１例として、網膜色素上皮での取込みをブロックするためのＲＧＤペプチドの使用を含み、それにより、網膜組織周辺のトランスダクションの増強を含み得る（Cronin et al., 2008 ARVO Abstract: D1048）。関連のないタンパク質は、製造工程、すなわち、エピトープ又はアフィニティタグの一環として、ウイルスの精製を補助するものであってよい。挿入部位は、ウイルス粒子の他の機能、例えば、ウイルス粒子の内在化、トラフィッキングを干渉しないよう通常選択される。当業者は、技術常識に基づいて挿入に適した部位を同定することができる。特定の部位がChoi et al上記参照、に開示されている。
本発明はさらに、天然のＡＡＶゲノムに対して異なるオーダーと異なる形態でのＡＡＶゲノム配列の提供も含む。本発明は、２以上のウイルス由来の配列からなる他のウイルス又はキメラ遺伝子由来の配列での１以上のＡＡＶ配列又は遺伝子の置換も含む。このようなキメラ遺伝子は、異なるウイルス種の２以上の関連するウイルスタンパク質由来の配列からなり得る。

本発明のベクターは、ＡＡＶゲノム又はその誘導体及びＲｅｐ－１又はその変異体をコードする配列を含むポリヌクレオチド配列の形式を採る。
錯誤回避のために詳述するならば、本発明は、本発明のベクターを含むＡＡＶウイルス粒子も提供する。本発明のＡＡＶ粒子は、ＡＡＶゲノム又は１つの血清型のＩＴＲを有する誘導体が異なる血清型のカプシドに包まれたトランスにカプシドに包まれた（transcapsidated）形態も含む。本発明のＡＡＶ粒子は、２以上の異なる血清型由来の未修飾（unmodified）カプシドタンパク質の混合によりウイルスエンベロープを構成するモザイク形
態も含む。ＡＡＶ粒子は、カプシド表面に吸着するリガンド、例えば、このようなリガンドは、特定の細胞表面受容体をターゲッティングするための抗体を含んでいてもよい、を生じるように化学的に修飾した形態も含む。
本発明はさらに、本発明のベクター又はＡＡＶウイルス粒子を含む宿主細胞を提供する。

ＲＥＰ１
本発明のベクターはさらに、ＲＥＰ１ポリペプチド又はその変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含む。ＲＥＰ１のヒトｃＤＮＡ配列（又はRab escort protein-1、Rab protein geranylgeranyltransferase component Aとしても既知である）を配列番号２に
示し、そのタンパク質をコードする配列を配列番号３に示す。さらなるＲＥＰ１のｃＤＮＡ配列を配列番号４に示す。

ＲＥＰ１ポリペプチド又はその変異体は、ＲａｂＧＴＰａｓｅタンパク質のプレニル化において補助する任意のポリペプチドである。ＲａｂＧＴＰａｓｅタンパク質のプレニル化において補助するＲＥＰ１ポリペプチド又はその変異体の能力を、当業者は日常的に（routinely）決定することができる。ＲＥＰ１の変異体をコードするポリヌクレオチド配
列は、Ｒａｂ－１ＧＴＰａｓｅのためのプレニル化活性で補助するタンパク質をコードする任意の配列である。好ましくは、該配列は配列番号３のポリペプチドと比べて同様か、又はより高いＲａｂ－１ＧＴＰａｓｅのためのプレニル化活性を提供するために補助するタンパク質をコードする。

より好ましくは、該ポリヌクレオチド配列は、配列番号３又はその変異体をコードし、配列番号２のポリヌクレオチド配列の変異体である。配列番号２又は３の変異体は、それらのトランケーション、変異、又は相同を含み、機能的なＲＥＰポリペプチドをコードする任意の転写変異体を含んでいてもよい。

ここでいう任意の相同体は、配列番号２又は３の関連領域と通常少なくとも７０％の相同である。特定の相同体は、ＲＥＰ１と７５％相同であるＲＥＰ２ポリペプチドであり、ＲＥＰ１欠損を機能的に補うことができる。
相同性は既知の方法を用いて測定することができる。例えば、ＵＷＧＣＧＰａｃｋａｇｅは、相同性を計算するのに使用することができるＢＥＳＴＦＩＴプログラム（例えば、そのデフォルト設定において用いられる）を提供する（Devereux et al., Nucleic Acids
Research 12, p387-395 (1984)）。ＰＩＬＥＵＰ及びＢＬＡＳＴアルゴリズムは、相同
性の計算又は配列のラインアップに（典型的にデフォルト設定において）、例えば、Altschul S. F.(1993)J Mol Evol 36: 290-300、Altschul, S, F et al(1990) J Mol Biol 215: 403-10に記載されているように、使用することができる。ＢＬＡＳＴ分析を実行する
ためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/L）を通じて公的に利用可能である。

好ましい実施形態において、変異体配列は、少なくとも２０、より好ましくは３０、例えば、少なくとも４０、６０、１００、２００、３００、４００又はそれ以上の連続するアミノ酸にわたる配列番号３の関連領域、あるいは該変異体の全長配列にわたってさえ、少なくとも５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、より好ましくは、少なくとも９５％、９７％又は９９％相同であるポリペプチドをコードし得る。関連領域は、Ｒａｂ－１ＧＴＰａｓｅのためのプレニル化活性を補助する際に機能的なＲＥＰ１活性を提供するものである。
あるいは、そして好ましくは、変異体配列は、全長配列番号３の全長配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９７％又は９９％相同性を有するポリペプチドをコードしてもよい。概して、変異体配列は、少なくとも２、５、１０、２０、４０、５０又は６０又は２、５、１０、２０、４０、５０又は６０未満の変異（それぞれは、置換、挿入又は欠失であり得る）により配列番号３の関連領域と異なる。

変異Ｒｅｐ－１ポリペプチドは、上述の配列の長さのいずれかと特定の相同％値（すなわち、それは少なくとも７０％、８０％又は９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９７％又は９９％の同一性を有し得る）のいずれかと同じである配列番号３の特定の領域と同一％を有してよい。
配列番号３の変異体は、トランケーションも含む。変異体がＲａｂ－１ＧＴＰａｓｅ基質ポリペプチドをプレニル化することができる限り、任意のトランケーションを使用し得る。トランケーションは概して、プレニル化活性のために必須でない、及び／又は折り畳まれたタンパク質のコンフォメーション、特に、活性部位での折り畳みに影響しない配列を除去するためになされる。適したトランケーションは、Ｎ末端又はＣ末端から可変長の配列のシステマティックなトランケーションにより慣用的に同定され得る。好ましいトランケーションは、Ｎ末端であり、触媒ドメイン以外の他の全ての配列を除去してよい。

さらに、配列番号３の変異体は配列番号３の特定の領域に対して、１以上の、例えば、２、３、４、５～１０、１０～２０、２０～４０又はそれ以上のアミノ酸の挿入、置換あるいは欠失を有する変異を含む。欠失及び挿入は、後述の触媒ドメインの外側になされることが好ましい。置換もまた、プロテアーゼ活性に必須でない、及び／又は折り畳まれたタンパク質のコンフォメーションに影響しない領域内で概してなされる。置換は、アミノ酸を他の類似の化学構造、類似の化学的特性又は類似の側鎖体積の他のアミノ酸で置換する、１以上の保存的変化を好ましくは導入する。導入されたアミノ酸は、置換するアミノ酸と類似の極性、親水性、疎水性、塩基性、酸性、中性、又は荷電を有し得る。あるいは、保存的変化は、既存の芳香族又は脂肪族アミノ酸の代わりに、芳香族又は脂肪族である別のアミノ酸を導入し得る。保存的アミノ酸変化は当該分野で周知であり、下記表Aで規
定されるように、２０の主要アミノ酸の特性に従って選択することができる。

同様に、配列番号２のポリヌクレオチド配列の好ましい変異体は、配列番号２の関連領域と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９７％又は９９％相同性を有するポリヌクレオチドを含む。好ましくは、該変異体は全長配列番号２の全長配列に対してこれらの相同性レベルを示す。

プロモーター及び調節配列
本発明のベクターは、ｉｎｖｉｔｒｏ又はｉｎｖｉｖｏでＲＥＰ１導入遺伝子の発現を可能にする調節エレメントも含む。したがって、該ベクターは概して、Ｒｅｐ－１又はその変異体をコードするポリヌクレオチド配列と作動可能に連結されたプロモーター配列を含む。任意の適したプロモーターを用いてよい。プロモーター配列は、恒常的活性型（constitutively active）、すなわち、任意の宿主細胞バックグラウンドにおいて作動
可能、又はある特定の宿主細胞環境下でのみ活性である特別な細胞系でのみ導入遺伝子の標的発現を行う。プロモーターは、他の因子、例えば、ある宿主細胞で存在するある因子、の存在に応じて誘導可能に発現してもよい。いずれにせよ、該ベクターが治療のために投与される場合、プロモーターは網膜細胞バックグラウンドにおいて機能的でなければならない。

いくつかの実施態様において、網膜細胞集団でのみ導入遺伝子を発現可能にするために、網膜細胞特異的な発現を示すプロモーターが好ましい。したがって、該プロモーターからの発現は、網膜細胞特異的、例えば神経感覚網膜及び網膜色素上皮の細胞でのみに制限される。Ｒｅｐ－１導入遺伝子のための好ましいプロモーターは、chicken beta-actin（ＣＢＡ）プロモーターを含み、任意にサイトメガロウイルス（ＣＭＥ）エンハンサーエレメントと併用する。特に好ましいプロモーターは、ハイブリッドＣＢＡ／ＣＡＧプロモーターであり、例えば、該プロモーターは、ｒＡＶＥ発現カセット（GeneDetect.com）で使用される。さらに好ましいプロモーターを配列番号６に示す。網膜特異的遺伝子発現を誘導するヒト配列に基づくプロモーターの例は、桿状体と桿状体のロドプシンキナーゼ（Allocca et al., 2007, J Virol 81:11372-80）、桿状体のみのためのＰＲ２．１（Mancuso
et al. 2009, Nature）、及び／又は網膜色素上皮のためのＲＰＥ６５（Bainbridge et al., 2008, N Eng J Med）を含む。

本発明のベクターは、転写的に前又は後に作用し得る１以上の追加的な調節配列も含み得る。調節配列は、天然のＲＥＰ１遺伝子座の一部、あるいは、ヘテロ調節配列であり得る。本発明のベクターは、天然のＲＥＰ１転写産物からの５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲの一部を含み得る。例えば、配列番号４のポリヌクレオチドは、天然のＲＥＰ１転写産物からの５’ＵＴＲの一部を含む。

調節配列は、導入遺伝子の発現を促進する、すなわち、転写産物の発現を増加する、ｍＲＮＡの核輸送を改善する、あるいはその安定性を高める、任意の配列である。このような調節配列は、例えば、エンハンサーエレメント、ポスト調節（postregulatory）エレメント及びポリアデニル化部位を含む。
好ましいポリアデニル化部位は、配列番号７に示されるように、ウシ成長ホルモンのポリＡシグナルである。本発明のベクターとの関係において、このような調節配列は、シス作用性である。しかしながら、本発明は追加的な遺伝的コンストラクト上に存在するトランス作用性調節配列の使用も包含する。本発明のベクターの使用に好ましいポスト調節エレメントは、woodchuck hepatitis postregulatory element（ＷＰＲＥ）又はその変異体である。ＷＰＲＥの配列を配列番号５に提示する。本発明は、ＷＰＲＥがないベクターと比べてＲＥＰ１導入遺伝子の発現を増加するＷＰＲＥの任意の変異体配列の使用も包含する。好ましくは、変異体配列は、配列番号５の全長配列と少なくとも７０％、より好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９７％又は９９％の相同性を示す。
本発明のベクターで使用され得る別の調節配列は、scaffold-attachment region（ＳＡＲ）である。追加的調節配列は、技術常識に基づいて当業者が選択することができる。

ベクターの調製
本発明のベクターは、遺伝子治療のためのベクターを提供するために当該分野で既知の標準的手法により調製し得る。したがって、確立されたパブリックドメイントランスフェクション、パッケージング、及び精製法を、適したベクター調製を準備するために使用し得る。
上述のとおり、本発明のベクターは、Ｒｅｐ－１又はその変異体をコードするポリヌクレオチド配列に加えて、天然に生じるＡＡＶウイルスの全長ゲノムを含んでよい。しかしながら、一般に、誘導体化されたゲノム、例えば、少なくとも１つのＩＴＲ配列を有するが、ｒｅｐ又はｃａｐ等の任意のＡＡＶ遺伝子を欠いてよい誘導体、が使用される。
このような実施形態において、誘導体化されたゲノムをＡＡＶウイルス粒子のアセンブリに提供するために、ＡＡＶ及び／又はヘルパーウイルス機能を提供する追加的な遺伝子コンストラクトが、該誘導体化されたゲノムと組み合わせて宿主細胞中で提供される。これら追加的コンストラクトは、構造的なＡＡＶカプシドタンパク質、すなわち、ｃａｐ、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びｒｅｐ等ＡＡＶのライフサイクルに必要とされる他の機能をコードする遺伝子を概して含む。追加的コンストラクトに提供される構造的カプシドタンパク質の選択は、パッケージ化されたウイルスベクターの血清型を決定する。
本発明の使用において特に好ましいパッケージ化されたウイルスベクターは、ＡＡＶ５又はＡＡＶ８カプシドタンパク質と組み合わせたＡＡＶ２の誘導体化されたゲノムを含む。このパッケージ化されたウイルスベクターは、任意に、配列番号８及び／又は９、あるいはその変異体として示される１以上のＡＡＶ２ＩＴＲを概して含む。

上記のとおり、ＡＡＶウイルスは複製不全であり、そのためヘルパーウイルス機能、好ましくは、アデノウイルスヘルパー機能もＡＡＶ複製を可能にするために、１以上の追加的コンストラクト上に概して提供される。
上記追加的コンストラクトのすべてが、宿主細胞中でプラスミド、又は他のエピソーマルエレメントとして提供されてもよい。あるいは、１以上のコンストラクトが、宿主細胞のゲノム中に挿入されてもよい。
これらの点に関し、本発明は、本発明のベクター製造のための方法を提供する。該方法は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノム又はその誘導体と宿主細胞でのＲｅｐ－１又はその変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターの提供、そして、該ベクターの複製とＡＡＶウイルス粒子へのアセンブリ手段の提供を含む。好ましくは、該方法は、１以上のＡＡＶ及び／又はヘルパーウイルス機能をコードする追加的な遺伝的コンストラクトと共に、ＡＡＶゲノムの誘導体とＲｅｐ－１又はその変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターの提供を含む。概して、ＡＡＶゲノムの誘導体は少なくとも１つのＩＴＲを含む。任意に、該方法はさらに組み立てられたウイルス粒子を精製する工程を含む。加えて、該方法は治療用途のためにウイルス粒子を製剤化する工程を含み得る。

治療方法及び医学的用途
上述のとおり、本願発明者らは驚くべきことに、本発明のベクターが根本的なコロイデレミアの細胞の機能障害を対処するために使用できることを実証した。特に、該ベクターの使用により、コロイデレミアに関連するプレニル化欠陥を補正（correct）し得ること
を示している。これにより、この病気の変性過程を治療、停止、緩和又は抑制し得る手段を提供する。
本発明はしたがって、直接網膜に注射、網膜下に注射、又は硝子体内注射により患者に、有効量の本発明のベクターを投与することを含み、それを必要とする患者のコロイデレミアを治療又は予防する方法を提供する。
関連態様において、本発明は、直接網膜に注射、網膜下に注射、又は硝子体内注射により患者に該ベクターを投与することで、コロイデレミアを治療又は予防する方法における本発明のベクターの使用を提供する。さらに、本発明は、直接網膜に注射、網膜下に注射、又は硝子体内注射によりコロイデレミアを治療又は予防するための医薬の製造において、本発明のベクターの使用を提供する。

これらの態様すべてにおいて、本発明のベクターは、コロイデレミアの１以上の症状の発症を予防するために投与してもよい。患者は無症状であってよい。対象は、コロイデレミアになりやすい性質であってよい。方法又は使用は、対象が、コロイデレミアが進行のリスクがある、又はコロイデレミアであるか否かを同定する構成を含んでもよい。該ベクターの予防的な有効量をそのような対象に投与する。予防的な有効量は、該病気の１以上の症状の発症を防ぐ量である。
あるいは、対象でこの病気の症状が一旦現れた、すなわち、この病気の今の症状を治療するために、該ベクターを投与してもよい。アンタゴニストの治療的な有効量をそのような対象に投与する。治療的な有効量は、該病気の１以上の症状を改善する量である。一般的に、そのような量は、眼のＲａｂＧＴＰａｓｅプレニル化のレベルを上昇させる。これは、後述のように確かめられる。そのような量は、コロイデレミアに関連する周辺視野の損失をある程度止める、遅らせるあるいは食い止め得る。そのような量は、夜盲症の発症も止める、遅らせるあるいは食い止め得る。
対象は、男性でも女性でもよい。コロイデレミアは、Ｘ連鎖疾患であるため、男性対象はより深刻な症状を示すが、女性対象もこの病気の症状を示し、深刻な表現型の場合がある。対象は、好ましくは、この病気のリスクがある、又はこの病気であることが確認されている。網膜は、最初に脈絡膜が菲薄化し、そして所々に下層強膜の露出まで進むという特徴的な外観を示し得る。周辺的に網膜電図の増幅の消失があるかもしれない。多くのケースにおいて、コロイデレミアの家族歴があるだろう。通常、しかし、いつもではないが、Ｘ染色体上のＲＥＰ１遺伝子において変異が同定されるかもしれない。
該ベクターの投与は、概して、直接網膜に又は網膜下に注射される。これは、上皮又は光受容体等の神経感覚網膜及び網膜色素上皮の細胞への直接伝達を含む。該伝達は、一般的にコロイデレミア患者の網膜に、直接的又は網膜下になされる。該ベクターは、いずれの他の細胞集団に入ることなく、上記標的細胞を導入する。

硝子体内注射も、本発明のベクターを伝達するために使用してよい。該伝達は、網膜下でないかもしれないし、網膜下注射によらないかもしれない。該伝達は、経硝子体でないかもしれない。
本発明のベクターの投与量は、様々なパラメーター、特に、治療されるべき患者の年齢、体重、状態；投与経路；所要のレジメンにより決定することができる。また、医師は、任意の特定の患者の所要の投与経路と投与量を決定することができる。
通常の単回投与は、ゲノム粒子１０^１０から１０^１２であり、導入を必要とする残りの網膜組織の量に依存する。ゲノム粒子は、ここでは配列特異的方法（リアルタイムＰＣＲ等）で定量化し得る単一標準ＤＮＡ分子を含むＡＡＶカプシドとして定義される。この投与量は、単回投与として提供される。しかし、ベクターがどのような理由であれ（外科的合併症等）、ベクターが網膜の正しい領域を命中しなかった場合、他眼で繰り返される。治療は、好ましくは各眼の一回の永続的治療が好ましい。しかし、例えば今後において及び／又は異なるＡＡＶ血清型での反復注射は考えられるかもしれない。
本発明は、直接網膜に注射、網膜下に注射、又は硝子体内注射により本発明のＡＡＶベクターを投与した該患者から得た網膜細胞のｅｘｖｉｖｏでのプレニル化活性の測定を含む、コロイデレミア患者の治療又は予防をモニタリング方法も提供する。これにより、治療効果の決定も行うことができる。

医薬組成物
本発明のベクターは、医薬組成物に配合され得る。これらの組成は、ベクターに加えて、薬学的に許容可能な賦形剤、担体、緩衝液、安定剤、又は当業者に周知の他の物質を含んでいてもよい。そのような物質は、非毒性であるべきであり、活性成分の効果を妨げるべきでない。該担体又は他の物質の正確な性質は、投与経路、すなわち、ここでは直接的網膜注射、網膜下注射、又は硝子体内注射に従って、当業者が決定し得る。
医薬組成物は、概して液体の形態である。液体医薬組成物は、通常、水、石油、動物性油若しくは植物油、鉱物油若しくは合成油等の液体担体を含む。生理食塩水、塩化マグネシウム、デキストロース、若しくは他の糖溶液、若しくは、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のグリコールを含んでもよい。場合によっては、０．００１％プルロニック酸（ＰＦ６８）等の界面活性剤を使用してもよい。
苦痛部位での注射のために、活性成分は、発熱物質を含まず、適したｐＨ、等張性と安定性を有する水溶液の形態である。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンガー（リンゲル）液、乳酸加リンガー（リンゲル）液等の等張溶媒を用いて適した溶液を調製することができる。防腐剤、安定剤、緩衝液、抗酸化剤及び／又は他の添加剤を必要に応じて含ませることができる。
徐放のために、当分野で既知の方法に従い、生体適合ポリマーから成るマイクロカプセル中やリポソームキャリアシステム中等の徐放のために形成される医薬組成物中に、ベクターを含ませることができる。

本実施例は、コロイデレミアとこの疾患の表現型の補正のための試験的治療戦略のためのモデルを開示する。プロモーター、ＲＥＰ１ｃＤＮＡ及び３’調節エレメントからなる遺伝的コンストラクトは、組み換えウイルスベクターにパッケージ化された場合、変性している網膜内の標的細胞を効率的に形質導入することを示す。

実施例１
ヒトＲＥＰ１ｃＤＮＡのクローニング及びＣＢＡ－ＲＥＰ－１－ＷＰＲＥ発現カセットの作製、ｐＡＡＶ－ＣＢＡ－ＲＥＰ－１－ＷＰＲＥ－ｂＧＨｐＡの構築及びＡＡＶＲＥＰ－１ウイルスのパッケージング
ＰＣＲ増幅及び既知のＲＥＰ１配列と相同性のあるプライマーを用いて、ヒトｃＤＮＡ
ライブラリーからヒトＲＥＰ１のｃＤＮＡを単離した。単離したｃＤＮＡのシークエンスから、Genbank Accession Number NM_000390として登録されているＲＥＰ１のｍＲＮＡ配列の既知の翻訳変異体１と相同性を有することが示された。該ｃＤＮＡは配列番号４の配列を有する。
このｃＤＮＡをｐＡＡＶシスプラスミドに挿入し、ｐＡＭと命名した。ｐＡＭはｐＢＲ３２２に由来する高コピー数プラスミドであるが、選択発現カセットに隣接する安定化されたＡＡＶ－２左右末端逆位配列（ＩＴＲ）を含む。ＡＡＶ－ＲＥＰ１ベクターのために、修飾されたＣＢＡ／ＣＡＧプロモーター（ＣＭＶエンハンサーを伴うchicken beta-actin）を、ＲＥＰ１発現を引き出すために使用し、修飾されたＷＰＲＥ配列及びｂＧＨｐｏｌｙＡを該ｃＤＮＡの３’に供した。このプラスミドをｐＡＡＶ２－ＣＢＡ－ｈＲＥＰ－１－ＷＰＲＥ－ｂＧＨ（ｐＡＡＶ－ＲＥＰ－１）と命名した。
確立されたパブリックドメインの３回繰り返しのトランスフェクションパッケージングと精製方法を用いて、組み換えＡＡＶ－Ｒｅｐ－１を産生するために、ｐＡＡＶ－ＲＥＰ－１を使用した。この方法を使用して作製したベクターストックは、ゲノムタイターに従って変化した。しかし、概して精製後に得られたストックは、１０^１２－１０^１３ｇｐ／ｍｌ（ｇｐ＝ゲノム粒子－上記参照）。該ストックは後述のように、ｉｎｖｉｖｏで使用するためにその後希釈した。

実施例２
ヒトコロイデレミア（Ｃｈｍ）細胞でのベクターからのＲＥＰ１の発現
ヒトコロイデレミア（Ｃｈｍ）線維芽細胞でのＡＡＶ２ＲＥＰ１ベクターからのＲＥＰ１の発現を評価した。これらの線維芽細胞は、コロイデレミア患者から倫理的同意を得て皮膚生検により摂取した。コントロールベクターからのＧＦＰ発現をコントロールとした。ヒト細胞で作用する前に、マウスにＡＡＶ－ＲＥＰ１ベクターを網膜下注射した後、ウェスタンブロットで、ヒトＲＥＰ１は認識するが、マウスＲＥＰ１は認識しない抗体をプローブとして、発現も確認した。
結果を図１に示す。ＲＥＰ１は、非トランスフェクションＣｈｍ線維芽細胞において、抗ｈＲＥＰ１抗体での免疫染色で検出されなかったのに対し（レーン２）、正常な（ＷＴ＝ヒト野生型）線維芽細胞ではＲＥＰ１が検出された（レーン１）。ＡＡＶ２．ＲＥＰ１ベクターでのトランスフェクション後、４０μｇ細胞溶解物と同量で、５μｇまでの希釈は、Ｃｈｍ細胞でのＡＡＶ２．ＲＥＰ１ベクターにより発現されたｈＲＥＰ１のレベルは、野生型細胞（レーン１）でのレベルより、約１０倍高いことが読み取れる（レーン３－６）。この程度の過剰発現では、細胞増殖への毒性作用は認められなかった。

実施例３
Ｃｈｍ細胞でのベクターによるプレニル化欠陥の補正
コロイデレミアマウスは、ヒト患者と同様の網膜変性表現型を有さないため、遺伝子治療アプローチを用いて網膜救済の直接的な評価を行うことができない。そのため、この表現型の補正は、ヒトＣｈｍ細胞でのｉｎｖｉｔｒｏ評価で評価した。
結果を図２に示す。ＡＡＶ２．ＲＥＰ１でのトランスフェクションは、Ｃｈｍ細胞でのプレニル化欠陥の補正を示し、ＡＡＶ２．ＲＥＰ１の１．５×１０^１０ウイルスゲノム粒子、２×１０^５細胞での治療後、通常レベルより顕著に高いプレニル化活性をもたらした。これは、ＡＡＶ２．ＲＥＰ１ベクターが、コロイデレミアに罹患したヒト細胞での機能的なＲＥＰ１タンパク質を発現することを裏付けている。
より詳細には、通常の野生型（ＷＴ）線維芽細胞でのプレニル化活性は、［^３Ｈ］－ＧＧＰＰの約０．３２ｐｍｏｌを産出し、コロイデレミア（Ｃｈｍ）線維芽細胞で０．１９ｐｍｏｌまで減少する。予測通り、ＡＡＶ．ＧＦＰコントロールベクターでのＣｈｍ線維芽細胞のトランスフェクション後、プレニル化活性は変化しなかった。しかし、ＡＡＶ２．ＲＥＰ１ベクターでのトランスフェクション後、プレニル化活性は［^３Ｈ］－ＧＧＰＰの０．４２ｐｍｏｌにまで顕著に上昇した（ｎ＝４、ｐ＜０．０１）。

実施例４
マウスでのベクラー由来レポーター遺伝子の標的ｉｎｖｉｖｏ発現
ＡＡＶ２ベクターのＣＢＡプロモーター及び調節配列のユビキタスな活性を裏付けるために、ＲＥＰ１をコードする遺伝子をgreen fluorescent protein（ＧＦＰ）遺伝子を
コードするレポーター遺伝子で置換し、ＡＡＶ２．ＣＢＡ．ＧＦＰ．ＷＰＲＥ．ＢＧＨ（ＡＡＶ２．ＧＦＰ）を作製した。
ウェスタンブロットでの同定は容易であるが、ヒトＲＥＰ１タンパク質は網膜切片で間接免疫組織化学法で容易に検出されないため、ｉｎｖｉｖｏ発現を評価するためにＧＦＰを選択した。ＡＡＶ２．ＧＦＰコンストラクトをマウス網膜下腔に投与し、ＧＦＰの発現を顕微鏡でモニターした。ベクターが神経感覚網膜上皮及び網膜色素上皮の両方で予測された指向性を有していたことを裏付ける結果を図３に示す。これは、カプシド配列と調節エレメントが、光受容体及び網膜色素上皮での高レベル遺伝子発現をもたらしたことを裏付けている。

実施例５
毒性試験
非常に高用量で、網膜機能において起こり得る任意の毒性作用を決定するために、ＡＡＶ２．ＲＥＰ１ベクターを野生型マウス（ｎ＝９）の網膜下腔に投与した。患者への使用が想定される高濃度及び低濃度（１０^１０ｇｐ／ｍｌ及び１０^１１ｇｐ／ｍｌ）より高いｌｏｇ単位であるベクター濃度（１０^１１ｇｐ／ｍｌ及び１０^１２ｇｐ／ｍｌ）をマウスで試験した。
結果を図４に示す。ＡＡＶ－ＲＥＰ１ベクターの高用量（ｎ＝５）又は低用量（ｎ＝４）のいずれの網膜下投与後６ヶ月でも、網膜電図（ＥＲＧ）に毒性作用が検出されなかった。網膜手術又はＡＡＶ２ベクターによる任意の非特異的効果のコントロールのために、他眼には、非常に類似した網膜下注射を行い、ＡＡＶ２．ＧＦＰ力価を有していた。
最も高用量のＡＡＶ２．ＧＦＰで、ＥＲＧ振幅が緩やかに減少した。これは、この強力なプロモーターでＧＦＰを発現するベクターの最大投与量による緩やかな既知の毒性作用を反映しており、用量依存的効果を検出するにあたるこの試験の感度を裏付けるものである。それにもかかわらず、網膜でのＲＥＰ１過剰発現が、ＧＦＰより毒性が低いと示唆されている各投与量でＡＡＶ２．ＲＥＰ１処置された眼において、ＥＲＧ減少が検出されなかった。

Claims

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノム又はその誘導体及びＲＥＰ１又はその変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含む、ベクター。
誘導体が、キメラ、シャッフル又はカプシド修飾誘導体である、請求項１に記載のベクター。
ＡＡＶゲノムが、天然由来の血清型、又はＡＡＶの分離株若しくはクレードである、請求項１又は２に記載のベクター。
血清型が、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）である、請求項３に記載のベクター。
配列番号１又はその誘導体を含む、請求項４に記載のベクター。
配列番号３の全長配列と少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列である、前記請求項のいずれか１つに記載のベクター。
ポリヌクレオチド配列が、配列番号２の全長配列と少なくとも７０％の相同性を有する、請求項６に記載のベクター。
ＲＥＰ１又はその変異体をコードするポリヌクレオチド配列と作動可能に連結したプロモーター配列を含む、前記請求項のいずれか１つに記載のベクター。
プロモーターが、恒常的に活性である、請求項８に記載のベクター。
プロモーターからの発現が、網膜細胞特異的である、請求項８に記載のベクター。
１以上の追加的な調節配列を含む、前記請求項のいずれか１つに記載のベクター。
配列番号５の全長配列と少なくとも７０％の相同性を有する配列を含む、請求項１１に記載のベクター。
それを必要とする患者のコロイデレミアを治療又は予防する方法であって、直接網膜に注射、網膜下に注射、又は硝子体内注射により、該患者に前記請求項のいずれか１つに記載のベクターの治療有効量を投与することを含む、該患者のコロイデレミアを治療又は予防する方法。
ベクターが直接的に網膜下に投与される、請求項１３に記載の方法。
直接網膜に注射、網膜下に注射、又は硝子体内注射により、患者にベクターを投与することで、コロイデレミアを治療又は予防する方法における使用のための請求項１～１２のいずれか１項に記載のベクター。