JP2017221192A - コロイデレミアの遺伝子治療に使用するためのaavベクター - Google Patents
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Abstract
Description
する。
この疾患は、X染色体21q領域に位置するREP1遺伝子(Rab escort protein 1)の変異により生じる。体内のほとんどの細胞では、REP1と75%相同であるREP2タンパク質がREP1欠損を補う。しかしながら、理由はまだ不明であるが、眼ではREP2がREP1欠損を補うことができない。したがって、眼では、REPポリペプチド活性が標的タンパク質(Rab GTPases)の通常のプレニル化を維持するのに十分ではなく、
主に外側の網膜と脈絡膜に影響を与え、細胞の機能障害と最終的な死に至る。
コロイデレミアの治療法はなく、治療戦略を評価するモデルも存在しない。そのような治療法を提供する必要がある。
本発明のベクターはウイルスベクターであり、具体的にはアデノ随伴ウイルス(AAV)ゲノムに基づくものである。該ベクターは、REP1又はその変異体をコードする配列を含み、それにより、標的細胞でのREP1機能の発現が可能となる。本発明の方法及び用途は、具体的にはコロイデレミアを治療又は予防するために、直接網膜に注射、網膜下に注射、又は硝子体内注射により患者にベクターを投与することを含む。
したがって、本発明は、アデノ随伴ウイルス(AAV)ゲノム又はその誘導体とREP1又はその変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。さらに本発明は、それを必要とする患者のコロイデレミアを治療又は予防する方法であって、直接網膜に注射、網膜下に注射、又は硝子体内注射により、該患者に前記請求項のいずれか1項に記載のベクターを治療有効量投与することを含み、それにより該患者のコロイデレミアを治療又は予防する方法を提供する。加えて、本発明は、直接網膜に注射、網膜下に注射、又は硝子体内注射により患者にベクターを投与することでコロイデレミアを治療又は予防する方法で用いるために本発明のベクターを提供する。
配列番号1は、AAV2ゲノムのDNA配列である。
配列番号2は、ヒトRep−1タンパク質、転写変異体1をコードするDNA配列である。
配列番号3は、ヒトRep−1タンパク質、転写変異体1のアミノ酸配列である。
配列番号4は、5’UTRの一部を含むヒトRep−1タンパク質、転写変異体1をコードするDNA配列である。
配列番号5は、woodchuck hepatitis postregulatory element(WPRE)のDNA配列である。
配列番号6は、chicken beta actin(CBA)プロモーターのDNA配列である。
配列番号7は、Bovine Growth Hormone(bGHpolyA)由来ポリアデニレーショ
ン部位のDNA配列である。
配列番号8は、AAV2の5’inverted terminal repeat(ITR)のDNA配列である。
配列番号9は、AAV2の3’ITRのDNA配列である。
対する遺伝子治療アプローチに基づいている。該遺伝子コンストラクトは、REP1又はその変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含むアデノ随伴ウイルス(AAV)ゲノムに基づくベクターである。本ポリヌクレオチド配列を「導入遺伝子」ともいう。本願発明者らは、コロイデレミアの治療のための戦略を評価するためのモデルを構築し、そして驚くべきことに、この病気の根底にある細胞の機能障害を標的とする本発明のベクターの使用を実証する。
AAVゲノム
本発明のベクターは、アデノ随伴ウイルス(AAV)ゲノム又はその誘導体を第一に含む。AAVゲノムは、AAVウイルス粒子の製造に必要とされる機能をコードするポリヌクレオチド配列である。これらの機能は、AAVウイルス粒子へのAAVゲノムのカプシド形成を含む、宿主細胞でのAAVの複製とパッケージング周期でのこれらのオペレーティングを含む。天然に生じるAAVウイルスは複製欠損性であり、かつ、複製とパッケージング周期の完了のためにトランスに作用するヘルパー機能の提供に依存する。したがって、本発明のベクターのAAVゲノムは、典型的に複製欠損性である。
AAVゲノムは、天然由来の血清、又はAAVの分離株(isolates)若しくはクレード(系統群)のいずれでもよい。そして、AAVゲノムは、天然に生じるAAVウイルスの全長ゲノムであってよい。当業者に既知のとおり、天然に生じるAAVウイルスは、様々な生物学的システムに従って分類され得る。
一般に、AAVウイルスはその血清型の観点から参照される。血清型は、カプシド表面抗原の発現のプロファイルのため、他の様々な亜種とそれを区別するのに使用され得る独自の反応性を有する様々なAAV亜種に対応する。概して、特定のAAV血清型を有するウイルスは、他のいかなるAAV血清型特異的な中和抗体とも効率的に交差しない。AAV血清型は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10及びAAV11、また、霊長類脳から最近同定されたRec2、Rec3等の組み換え血清型も含む。
Adeno-associated virus 1 NC_002077, AF063497; Adeno-associated virus 2 NC_001401; Adeno-associated virus 3 NC_001729; Adeno-associated virus 3B NC_001863; Adeno-associated virus 4 NC_001829; Adeno-associated virus 5 Y18065, AF085716; Adeno-associated virus 6 NC_001862; Avian AAV ATCC VR-865 AY186198, AY629583, NC_004828; Avian AAV strain DA-1 NC_006263, AY629583; Bovine AAV NC_005889, AY388617。
Vウイルスと限定された遺伝的混合を経験したAAVウイルス集団をいい、それにより、遺伝的レベルではっきり異なる集団を定義する。
本発明で使用し得るAAVのクレード及び分離株の例は以下を含む:
Clade A: AAV1 NC_002077, AF063497, AAV6 NC_001862, Hu. 48 AY530611,Hu 43 AY530606, Hu 44 AY530607, Hu 46 AY530609
Clade B: Hu. 19 AY530584, Hu. 20 AY530586, Hu 23 AY530589, Hu22 AY530588, Hu24
AY530590, Hu21 AY530587, Hu27 AY530592, Hu28 AY530593, Hu 29 AY530594, Hu63 AY530624, Hu64 AY530625, Hu13 AY530578, Hu56 AY530618, Hu57 AY530619, Hu49 AY530612, Hu58 AY530620, Hu34 AY530598, Hu35 AY530599, AAV2 NC_001401, Hu45 AY530608, Hu47 AY530610, Hu51 AY530613, Hu52 AY530614, Hu T41 AY695378, Hu S17 AY695376, Hu T88 AY695375, Hu T71 AY695374, Hu T70 AY695373, Hu T40 AY695372, Hu T32 AY695371, Hu T17 AY695370, Hu LG15 AY695377,
Clade C: Hu9 AY530629, Hu10 AY530576, Hu11 AY530577, Hu53 AY530615, Hu55 AY530617, Hu54 AY530616, Hu7 AY530628, Hu18 AY530583, Hu15 AY530580, Hu16 AY530581, Hu25 AY530591, Hu60 AY530622, Ch5 AY243021, Hu3 AY530595, Hu1 AY530575, Hu4 AY530602 Hu2, AY530585, Hu61 AY530623
Clade D: Rh62 AY530573, Rh48 AY530561, Rh54 AY530567, Rh55 AY530568, Cy2 AY243020, AAV7 AF513851, Rh35 AY243000, Rh37 AY242998, Rh36 AY242999, Cy6 AY243016, Cy4 AY243018, Cy3 AY243019, Cy5 AY243017, Rh13 AY243013
Clade E: Rh38 AY530558, Hu66 AY530626, Hu42 AY530605, Hu67 AY530627, Hu40 AY530603, Hu41 AY530604, Hu37 AY530600, Rh40 AY530559, Rh2 AY243007, Bb1 AY243023, Bb2 AY243022, Rh10 AY243015, Hu17 AY530582, Hu6 AY530621, Rh25 AY530557, Pi2 AY530554, Pi1 AY530553, Pi3 AY530555, Rh57 AY530569, Rh50 AY530563, Rh49 AY530562, Hu39 AY530601, Rh58 AY530570, Rh61 AY530572, Rh52 AY530565, Rh53 AY530566, Rh51 AY530564, Rh64 AY530574, Rh43 AY530560, AAV8 AF513852, Rh8 AY242997, Rh1 AY530556
Clade F: Hu14 (AAV9) AY530579, Hu31 AY530596, Hu32 AY530597, Clonal Isolate AAV5 Y18065, AF085716, AAV 3 NC_001729, AAV 3B NC_001863, AAV4 NC_001829, Rh34 AY243001, Rh33 AY243002, Rh32 AY243003
成功した補正から証明されるように、効率的に霊長類錐体光受容体を導入することが示されている(Mancuso et al., Nature 2009, 461:784-7)。
しかしながら、本発明は未だ同定又は特徴付けられていないかもしれない他の血清型のAAVゲノム使用も包含することを理解されるべきである。AAV血清型は、AAVウイルスの感染(又は指向性)の組織特異性を決定する。したがって、本発明に従って患者に投与されるAAVウイルスでの使用に好ましいAAV血清型は、天性の指向性を有するか、又はコロイデレミアの変性している網膜内での標的細胞の感染に高効率を示すものである。よって、患者に投与されるAAVウイルスでの使用に好ましいAAV血清型は、神経感覚網膜及び網膜色素上皮の細胞に感染するものである。
伝子を発現するために通常使用される。一方、p40プロモーターは、cap遺伝子を発現するために通常使用される。
上述のとおり、本発明のベクターで使用されたAAVゲノムは、それ故、天然に生じるAAVウイルスの全ゲノムであり得る。例えば、in vitroでAAVウイルスを調製するために、全AAVゲノムを含むベクターを使用することができる。しかしながら、このようなベクターは、原理的には患者に投与され得るとしても、実際問題としては稀であろう。好ましくは、AAVゲノムは患者への投与目的のために誘導体化されるだろう。このような誘導体化は、当該分野で一般的であり、本発明はAAVゲノムの任意の既知の誘導体の使用を含み、また誘導体は当該分野で既知の技術を適用して作成され得る。AAVゲノムの誘導体やAAVカプシドの誘導体は、CouraとNardi(Virology Journal, 2007, 4:99)に掲載されており、Choi et alとWu et alは上記参照。
含む。概して、上記機能を保持したままで、最小限のウイルス配列を含むようにAAVゲノムを著しく短くすることが可能である。これは、野生型ウイルスとベクターとの組み換えの危険性を減らし、標的細胞でのウイルス遺伝子タンパク質の存在により、細胞性免疫応答を引起すことを避けるためにも、安全上の理由から好ましい。
者、すなわち、自己相補性AAVゲノムを含む1本鎖ゲノムを生み出すゲノムを継続的に複製することが可能となる。これにより、標的細胞でのDNA複製のバイパスが可能となり、導入遺伝子の促進的な発現が可能となる。
核内への改善されたトラフィッキング(trafficking)、ウイルス粒子の改善された脱殻
、1本鎖ゲノムから2本鎖形態への改善された変換により影響され得る。効率向上は、変化した指向性の範囲又は特定の細胞集団のターゲッティングにも関連し得るため、ベクター量はそれが必要でない組織への投与により希釈されない。
ーアプローチにより実行され得る。異なる血清型のカプシド配列が、新たなキメラカプシドタンパク質を製造するために、細胞内において相同組換えにより変更され得る。
キメラカプシドタンパク質は、特定のカプシドタンパク質ドメイン、表面ループ、又は2以上のカプシドタンパク質、例えば、異なる血清型の2以上のカプシドタンパク質内の特定のアミノ酸残基を転移するためのカプシドタンパク質配列をエンジニアリングにより作製されたものも含む。
連するAAV遺伝子配列のランダムな断片化、例えば、多数の異なる血清型カプシドタンパク質をコードする配列を、配列ホモロジーの領域内でクロスオーバーを起こすかもしれない自己プライミングポリメラーゼ反応内で、フラグメントをその後再構成することにより作り出すことができる。幾つかの血清型のカプシド遺伝子のシャッフリングによるこの方法で作り出されたハイブリッドAAV遺伝子ライブラリーは、所望の機能を有するウイルスクローンを同定するためにスクリーニングされ得る。同様に、エラープローンPCRは、所望の特性のために選択され得る多様な変異体ライブラリーを作り出すためにランダムに変異したAAVカプシド遺伝子に使用してもよい。
関連のないタンパク質又はペプチドは、有利に、特定の細胞型のリガンドとして作用するものであってよい。それにより、標的細胞への改善された結合や特定の細胞集団へのベクターのターゲティングの特異性の改善をもたらす。1例として、網膜色素上皮での取込みをブロックするためのRGDペプチドの使用を含み、それにより、網膜組織周辺のトランスダクションの増強を含み得る(Cronin et al., 2008 ARVO Abstract: D1048)。関連のないタンパク質は、製造工程、すなわち、エピトープ又はアフィニティタグの一環として、ウイルスの精製を補助するものであってよい。挿入部位は、ウイルス粒子の他の機能、例えば、ウイルス粒子の内在化、トラフィッキングを干渉しないよう通常選択される。当業者は、技術常識に基づいて挿入に適した部位を同定することができる。特定の部位がChoi et al上記参照、に開示されている。
本発明はさらに、天然のAAVゲノムに対して異なるオーダーと異なる形態でのAAVゲノム配列の提供も含む。本発明は、2以上のウイルス由来の配列からなる他のウイルス又はキメラ遺伝子由来の配列での1以上のAAV配列又は遺伝子の置換も含む。このようなキメラ遺伝子は、異なるウイルス種の2以上の関連するウイルスタンパク質由来の配列からなり得る。
錯誤回避のために詳述するならば、本発明は、本発明のベクターを含むAAVウイルス粒子も提供する。本発明のAAV粒子は、AAVゲノム又は1つの血清型のITRを有する誘導体が異なる血清型のカプシドに包まれたトランスにカプシドに包まれた(transcapsidated)形態も含む。本発明のAAV粒子は、2以上の異なる血清型由来の未修飾(unmodified)カプシドタンパク質の混合によりウイルスエンベロープを構成するモザイク形
態も含む。AAV粒子は、カプシド表面に吸着するリガンド、例えば、このようなリガンドは、特定の細胞表面受容体をターゲッティングするための抗体を含んでいてもよい、を生じるように化学的に修飾した形態も含む。
本発明はさらに、本発明のベクター又はAAVウイルス粒子を含む宿主細胞を提供する。
本発明のベクターはさらに、REP1ポリペプチド又はその変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含む。REP1のヒトcDNA配列(又はRab escort protein-1、Rab protein geranylgeranyltransferase component Aとしても既知である)を配列番号2に
示し、そのタンパク質をコードする配列を配列番号3に示す。さらなるREP1のcDNA配列を配列番号4に示す。
列は、Rab−1GTPaseのためのプレニル化活性で補助するタンパク質をコードする任意の配列である。好ましくは、該配列は配列番号3のポリペプチドと比べて同様か、又はより高いRab−1GTPaseのためのプレニル化活性を提供するために補助するタンパク質をコードする。
相同性は既知の方法を用いて測定することができる。例えば、UWGCGPackageは、相同性を計算するのに使用することができるBESTFITプログラム(例えば、そのデフォルト設定において用いられる)を提供する(Devereux et al., Nucleic Acids
Research 12, p387-395 (1984))。PILEUP及びBLASTアルゴリズムは、相同
性の計算又は配列のラインアップに(典型的にデフォルト設定において)、例えば、Altschul S. F.(1993)J Mol Evol 36: 290-300、Altschul, S, F et al(1990) J Mol Biol 215: 403-10に記載されているように、使用することができる。BLAST分析を実行する
ためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/L)を通じて公的に利用可能である。
あるいは、そして好ましくは、変異体配列は、全長配列番号3の全長配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、より好ましくは少なくとも95%、97%又は99%相同性を有するポリペプチドをコードしてもよい。概して、変異体配列は、少なくとも2、5、10、20、40、50又は60又は2、5、10、20、40、50又は60未満の変異(それぞれは、置換、挿入又は欠失であり得る)により配列番号3の関連領域と異なる。
配列番号3の変異体は、トランケーションも含む。変異体がRab−1GTPase基質ポリペプチドをプレニル化することができる限り、任意のトランケーションを使用し得る。トランケーションは概して、プレニル化活性のために必須でない、及び/又は折り畳まれたタンパク質のコンフォメーション、特に、活性部位での折り畳みに影響しない配列を除去するためになされる。適したトランケーションは、N末端又はC末端から可変長の配列のシステマティックなトランケーションにより慣用的に同定され得る。好ましいトランケーションは、N末端であり、触媒ドメイン以外の他の全ての配列を除去してよい。
定されるように、20の主要アミノ酸の特性に従って選択することができる。
本発明のベクターは、in vitro又はin vivoでREP1導入遺伝子の発現を可能にする調節エレメントも含む。したがって、該ベクターは概して、Rep−1又はその変異体をコードするポリヌクレオチド配列と作動可能に連結されたプロモーター配列を含む。任意の適したプロモーターを用いてよい。プロモーター配列は、恒常的活性型(constitutively active)、すなわち、任意の宿主細胞バックグラウンドにおいて作動
可能、又はある特定の宿主細胞環境下でのみ活性である特別な細胞系でのみ導入遺伝子の標的発現を行う。プロモーターは、他の因子、例えば、ある宿主細胞で存在するある因子、の存在に応じて誘導可能に発現してもよい。いずれにせよ、該ベクターが治療のために投与される場合、プロモーターは網膜細胞バックグラウンドにおいて機能的でなければならない。
et al. 2009, Nature)、及び/又は網膜色素上皮のためのRPE65(Bainbridge et al., 2008, N Eng J Med)を含む。
好ましいポリアデニル化部位は、配列番号7に示されるように、ウシ成長ホルモンのポリAシグナルである。本発明のベクターとの関係において、このような調節配列は、シス作用性である。しかしながら、本発明は追加的な遺伝的コンストラクト上に存在するトランス作用性調節配列の使用も包含する。本発明のベクターの使用に好ましいポスト調節エレメントは、woodchuck hepatitis postregulatory element(WPRE)又はその変異体である。WPREの配列を配列番号5に提示する。本発明は、WPREがないベクターと比べてREP1導入遺伝子の発現を増加するWPREの任意の変異体配列の使用も包含する。好ましくは、変異体配列は、配列番号5の全長配列と少なくとも70%、より好ましくは、75%、80%、85%、90%、より好ましくは少なくとも95%、97%又は99%の相同性を示す。
本発明のベクターで使用され得る別の調節配列は、scaffold-attachment region(SAR)である。追加的調節配列は、技術常識に基づいて当業者が選択することができる。
本発明のベクターは、遺伝子治療のためのベクターを提供するために当該分野で既知の標準的手法により調製し得る。したがって、確立されたパブリックドメイントランスフェクション、パッケージング、及び精製法を、適したベクター調製を準備するために使用し得る。
上述のとおり、本発明のベクターは、Rep−1又はその変異体をコードするポリヌクレオチド配列に加えて、天然に生じるAAVウイルスの全長ゲノムを含んでよい。しかしながら、一般に、誘導体化されたゲノム、例えば、少なくとも1つのITR配列を有するが、rep又はcap等の任意のAAV遺伝子を欠いてよい誘導体、が使用される。
このような実施形態において、誘導体化されたゲノムをAAVウイルス粒子のアセンブリに提供するために、AAV及び/又はヘルパーウイルス機能を提供する追加的な遺伝子コンストラクトが、該誘導体化されたゲノムと組み合わせて宿主細胞中で提供される。これら追加的コンストラクトは、構造的なAAVカプシドタンパク質、すなわち、cap、VP1、VP2、VP3及びrep等AAVのライフサイクルに必要とされる他の機能をコードする遺伝子を概して含む。追加的コンストラクトに提供される構造的カプシドタンパク質の選択は、パッケージ化されたウイルスベクターの血清型を決定する。
本発明の使用において特に好ましいパッケージ化されたウイルスベクターは、AAV5又はAAV8カプシドタンパク質と組み合わせたAAV2の誘導体化されたゲノムを含む。このパッケージ化されたウイルスベクターは、任意に、配列番号8及び/又は9、あるいはその変異体として示される1以上のAAV2ITRを概して含む。
上記追加的コンストラクトのすべてが、宿主細胞中でプラスミド、又は他のエピソーマルエレメントとして提供されてもよい。あるいは、1以上のコンストラクトが、宿主細胞のゲノム中に挿入されてもよい。
これらの点に関し、本発明は、本発明のベクター製造のための方法を提供する。該方法は、アデノ随伴ウイルス(AAV)ゲノム又はその誘導体と宿主細胞でのRep−1又はその変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターの提供、そして、該ベクターの複製とAAVウイルス粒子へのアセンブリ手段の提供を含む。好ましくは、該方法は、1以上のAAV及び/又はヘルパーウイルス機能をコードする追加的な遺伝的コンストラクトと共に、AAVゲノムの誘導体とRep−1又はその変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターの提供を含む。概して、AAVゲノムの誘導体は少なくとも1つのITRを含む。任意に、該方法はさらに組み立てられたウイルス粒子を精製する工程を含む。加えて、該方法は治療用途のためにウイルス粒子を製剤化する工程を含み得る。
上述のとおり、本願発明者らは驚くべきことに、本発明のベクターが根本的なコロイデレミアの細胞の機能障害を対処するために使用できることを実証した。特に、該ベクターの使用により、コロイデレミアに関連するプレニル化欠陥を補正(correct)し得ること
を示している。これにより、この病気の変性過程を治療、停止、緩和又は抑制し得る手段を提供する。
本発明はしたがって、直接網膜に注射、網膜下に注射、又は硝子体内注射により患者に、有効量の本発明のベクターを投与することを含み、それを必要とする患者のコロイデレミアを治療又は予防する方法を提供する。
関連態様において、本発明は、直接網膜に注射、網膜下に注射、又は硝子体内注射により患者に該ベクターを投与することで、コロイデレミアを治療又は予防する方法における本発明のベクターの使用を提供する。さらに、本発明は、直接網膜に注射、網膜下に注射、又は硝子体内注射によりコロイデレミアを治療又は予防するための医薬の製造において、本発明のベクターの使用を提供する。
あるいは、対象でこの病気の症状が一旦現れた、すなわち、この病気の今の症状を治療するために、該ベクターを投与してもよい。アンタゴニストの治療的な有効量をそのような対象に投与する。治療的な有効量は、該病気の1以上の症状を改善する量である。一般的に、そのような量は、眼のRabGTPaseプレニル化のレベルを上昇させる。これは、後述のように確かめられる。そのような量は、コロイデレミアに関連する周辺視野の損失をある程度止める、遅らせるあるいは食い止め得る。そのような量は、夜盲症の発症も止める、遅らせるあるいは食い止め得る。
対象は、男性でも女性でもよい。コロイデレミアは、X連鎖疾患であるため、男性対象はより深刻な症状を示すが、女性対象もこの病気の症状を示し、深刻な表現型の場合がある。対象は、好ましくは、この病気のリスクがある、又はこの病気であることが確認されている。網膜は、最初に脈絡膜が菲薄化し、そして所々に下層強膜の露出まで進むという特徴的な外観を示し得る。周辺的に網膜電図の増幅の消失があるかもしれない。多くのケースにおいて、コロイデレミアの家族歴があるだろう。通常、しかし、いつもではないが、X染色体上のREP1遺伝子において変異が同定されるかもしれない。
該ベクターの投与は、概して、直接網膜に又は網膜下に注射される。これは、上皮又は光受容体等の神経感覚網膜及び網膜色素上皮の細胞への直接伝達を含む。該伝達は、一般的にコロイデレミア患者の網膜に、直接的又は網膜下になされる。該ベクターは、いずれの他の細胞集団に入ることなく、上記標的細胞を導入する。
本発明のベクターの投与量は、様々なパラメーター、特に、治療されるべき患者の年齢、体重、状態;投与経路;所要のレジメンにより決定することができる。また、医師は、任意の特定の患者の所要の投与経路と投与量を決定することができる。
通常の単回投与は、ゲノム粒子1010から1012であり、導入を必要とする残りの網膜組織の量に依存する。ゲノム粒子は、ここでは配列特異的方法(リアルタイムPCR等)で定量化し得る単一標準DNA分子を含むAAVカプシドとして定義される。この投与量は、単回投与として提供される。しかし、ベクターがどのような理由であれ(外科的合併症等)、ベクターが網膜の正しい領域を命中しなかった場合、他眼で繰り返される。治療は、好ましくは各眼の一回の永続的治療が好ましい。しかし、例えば今後において及び/又は異なるAAV血清型での反復注射は考えられるかもしれない。
本発明は、直接網膜に注射、網膜下に注射、又は硝子体内注射により本発明のAAVベクターを投与した該患者から得た網膜細胞のex vivoでのプレニル化活性の測定を含む、コロイデレミア患者の治療又は予防をモニタリング方法も提供する。これにより、治療効果の決定も行うことができる。
本発明のベクターは、医薬組成物に配合され得る。これらの組成は、ベクターに加えて、薬学的に許容可能な賦形剤、担体、緩衝液、安定剤、又は当業者に周知の他の物質を含んでいてもよい。そのような物質は、非毒性であるべきであり、活性成分の効果を妨げるべきでない。該担体又は他の物質の正確な性質は、投与経路、すなわち、ここでは直接的網膜注射、網膜下注射、又は硝子体内注射に従って、当業者が決定し得る。
医薬組成物は、概して液体の形態である。液体医薬組成物は、通常、水、石油、動物性油若しくは植物油、鉱物油若しくは合成油等の液体担体を含む。生理食塩水、塩化マグネシウム、デキストロース、若しくは他の糖溶液、若しくは、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のグリコールを含んでもよい。場合によっては、0.001%プルロニック酸(PF68)等の界面活性剤を使用してもよい。
苦痛部位での注射のために、活性成分は、発熱物質を含まず、適したpH、等張性と安定性を有する水溶液の形態である。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンガー(リンゲル)液、乳酸加リンガー(リンゲル)液等の等張溶媒を用いて適した溶液を調製することができる。防腐剤、安定剤、緩衝液、抗酸化剤及び/又は他の添加剤を必要に応じて含ませることができる。
徐放のために、当分野で既知の方法に従い、生体適合ポリマーから成るマイクロカプセル中やリポソームキャリアシステム中等の徐放のために形成される医薬組成物中に、ベクターを含ませることができる。
ヒトREP1cDNAのクローニング及びCBA−REP−1−WPRE発現カセットの作製、pAAV−CBA−REP−1−WPRE−bGHpAの構築及びAAVREP−1ウイルスのパッケージング
PCR増幅及び既知のREP1配列と相同性のあるプライマーを用いて、ヒトcDNA
ライブラリーからヒトREP1のcDNAを単離した。単離したcDNAのシークエンスから、Genbank Accession Number NM_000390として登録されているREP1のmRNA配列の既知の翻訳変異体1と相同性を有することが示された。該cDNAは配列番号4の配列を有する。
このcDNAをpAAVシスプラスミドに挿入し、pAMと命名した。pAMはpBR322に由来する高コピー数プラスミドであるが、選択発現カセットに隣接する安定化されたAAV−2左右末端逆位配列(ITR)を含む。AAV−REP1ベクターのために、修飾されたCBA/CAGプロモーター(CMVエンハンサーを伴うchicken beta-actin)を、REP1発現を引き出すために使用し、修飾されたWPRE配列及びbGHpolyAを該cDNAの3’に供した。このプラスミドをpAAV2−CBA−hREP−1−WPRE−bGH(pAAV−REP−1)と命名した。
確立されたパブリックドメインの3回繰り返しのトランスフェクションパッケージングと精製方法を用いて、組み換えAAV−Rep−1を産生するために、pAAV−REP−1を使用した。この方法を使用して作製したベクターストックは、ゲノムタイターに従って変化した。しかし、概して精製後に得られたストックは、1012−1013gp/ml(gp=ゲノム粒子−上記参照)。該ストックは後述のように、in vivoで使用するためにその後希釈した。
ヒトコロイデレミア(Chm)細胞でのベクターからのREP1の発現
ヒトコロイデレミア(Chm)線維芽細胞でのAAV2REP1ベクターからのREP1の発現を評価した。これらの線維芽細胞は、コロイデレミア患者から倫理的同意を得て皮膚生検により摂取した。コントロールベクターからのGFP発現をコントロールとした。ヒト細胞で作用する前に、マウスにAAV−REP1ベクターを網膜下注射した後、ウェスタンブロットで、ヒトREP1は認識するが、マウスREP1は認識しない抗体をプローブとして、発現も確認した。
結果を図1に示す。REP1は、非トランスフェクションChm線維芽細胞において、抗hREP1抗体での免疫染色で検出されなかったのに対し(レーン2)、正常な(WT=ヒト野生型)線維芽細胞ではREP1が検出された(レーン1)。AAV2.REP1ベクターでのトランスフェクション後、40μg細胞溶解物と同量で、5μgまでの希釈は、Chm細胞でのAAV2.REP1ベクターにより発現されたhREP1のレベルは、野生型細胞(レーン1)でのレベルより、約10倍高いことが読み取れる(レーン3−6)。この程度の過剰発現では、細胞増殖への毒性作用は認められなかった。
Chm細胞でのベクターによるプレニル化欠陥の補正
コロイデレミアマウスは、ヒト患者と同様の網膜変性表現型を有さないため、遺伝子治療アプローチを用いて網膜救済の直接的な評価を行うことができない。そのため、この表現型の補正は、ヒトChm細胞でのin vitro評価で評価した。
結果を図2に示す。AAV2.REP1でのトランスフェクションは、Chm細胞でのプレニル化欠陥の補正を示し、AAV2.REP1の1.5×1010ウイルスゲノム粒子、2×105細胞での治療後、通常レベルより顕著に高いプレニル化活性をもたらした。これは、AAV2.REP1ベクターが、コロイデレミアに罹患したヒト細胞での機能的なREP1タンパク質を発現することを裏付けている。
より詳細には、通常の野生型(WT)線維芽細胞でのプレニル化活性は、[3H]−GGPPの約0.32pmolを産出し、コロイデレミア(Chm)線維芽細胞で0.19pmolまで減少する。予測通り、AAV.GFPコントロールベクターでのChm線維芽細胞のトランスフェクション後、プレニル化活性は変化しなかった。しかし、AAV2.REP1ベクターでのトランスフェクション後、プレニル化活性は[3H]−GGPPの0.42pmolにまで顕著に上昇した(n=4、p<0.01)。
マウスでのベクラー由来レポーター遺伝子の標的in vivo発現
AAV2 ベクターのCBAプロモーター及び調節配列のユビキタスな活性を裏付けるために、REP1をコードする遺伝子をgreen fluorescent protein(GFP)遺伝子を
コードするレポーター遺伝子で置換し、AAV2.CBA.GFP.WPRE.BGH(AAV2.GFP)を作製した。
ウェスタンブロットでの同定は容易であるが、ヒトREP1タンパク質は網膜切片で間接免疫組織化学法で容易に検出されないため、in vivo発現を評価するためにGFPを選択した。AAV2.GFPコンストラクトをマウス網膜下腔に投与し、GFPの発現を顕微鏡でモニターした。ベクターが神経感覚網膜上皮及び網膜色素上皮の両方で予測された指向性を有していたことを裏付ける結果を図3に示す。これは、カプシド配列と調節エレメントが、光受容体及び網膜色素上皮での高レベル遺伝子発現をもたらしたことを裏付けている。
毒性試験
非常に高用量で、網膜機能において起こり得る任意の毒性作用を決定するために、AAV2.REP1ベクターを野生型マウス(n=9)の網膜下腔に投与した。患者への使用が想定される高濃度及び低濃度(1010gp/ml及び1011gp/ml)より高いlog単位であるベクター濃度(1011gp/ml及び1012gp/ml)をマウスで試験した。
結果を図4に示す。AAV−REP1ベクターの高用量(n=5)又は低用量(n=4)のいずれの網膜下投与後6ヶ月でも、網膜電図(ERG)に毒性作用が検出されなかった。網膜手術又はAAV2ベクターによる任意の非特異的効果のコントロールのために、他眼には、非常に類似した網膜下注射を行い、AAV2.GFP力価を有していた。
最も高用量のAAV2.GFPで、ERG振幅が緩やかに減少した。これは、この強力なプロモーターでGFPを発現するベクターの最大投与量による緩やかな既知の毒性作用を反映しており、用量依存的効果を検出するにあたるこの試験の感度を裏付けるものである。それにもかかわらず、網膜でのREP1過剰発現が、GFPより毒性が低いと示唆されている各投与量でAAV2.REP1処置された眼において、ERG減少が検出されなかった。
Claims (15)
- アデノ随伴ウイルス(AAV)ゲノム又はその誘導体及びREP1又はその変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含む、ベクター。
- 誘導体が、キメラ、シャッフル又はカプシド修飾誘導体である、請求項1に記載のベクター。
- AAVゲノムが、天然由来の血清型、又はAAVの分離株若しくはクレードである、請求項1又は2に記載のベクター。
- 血清型が、AAV血清型2(AAV2)である、請求項3に記載のベクター。
- 配列番号1又はその誘導体を含む、請求項4に記載のベクター。
- 配列番号3の全長配列と少なくとも70%の相同性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列である、前記請求項のいずれか1つに記載のベクター。
- ポリヌクレオチド配列が、配列番号2の全長配列と少なくとも70%の相同性を有する、請求項6に記載のベクター。
- REP1又はその変異体をコードするポリヌクレオチド配列と作動可能に連結したプロモーター配列を含む、前記請求項のいずれか1つに記載のベクター。
- プロモーターが、恒常的に活性である、請求項8に記載のベクター。
- プロモーターからの発現が、網膜細胞特異的である、請求項8に記載のベクター。
- 1以上の追加的な調節配列を含む、前記請求項のいずれか1つに記載のベクター。
- 配列番号5の全長配列と少なくとも70%の相同性を有する配列を含む、請求項11に記載のベクター。
- それを必要とする患者のコロイデレミアを治療又は予防する方法であって、直接網膜に注射、網膜下に注射、又は硝子体内注射により、該患者に前記請求項のいずれか1つに記載のベクターの治療有効量を投与することを含む、該患者のコロイデレミアを治療又は予防する方法。
- ベクターが直接的に網膜下に投与される、請求項13に記載の方法。
- 直接網膜に注射、網膜下に注射、又は硝子体内注射により、患者にベクターを投与することで、コロイデレミアを治療又は予防する方法における使用のための請求項1〜12のいずれか1項に記載のベクター。
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