CN103562396A - 用于无脉络膜的基因疗法的aav载体 - Google Patents

用于无脉络膜的基因疗法的aav载体 Download PDF

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Abstract

本发明涉及无脉络膜的治疗或预防的基因疗法。

Description

用于无脉络膜的基因疗法的AAV载体
发明领域
本发明涉及无脉络膜的治疗或预防的基因疗法。
发明背景
无脉络膜是罕见的眼的脉络膜、视网膜色素上皮和感光器的X连锁渐进变性。受扰男性中的典型自然史是青少年时期开始夜盲症，然后在20多岁和30多岁期间渐进地丧失周边视觉，导致在40多岁完全失明。女性携带者具有轻的症状，大多数患有显著的夜盲症，但可偶尔具有更严重的表型。
该疾病由REP1基因（Rab护卫蛋白1）中的突变引起，该基因位于X染色体21q区。在身体的大多数细胞中，REP2蛋白——与REP175%同源——补偿REP1缺乏。然而，在眼中，由于尚不清楚的原因，REP2不能补偿REP1缺乏。因此在眼中REP多肽活性不足以保持靶蛋白（Rab GTP酶）的正常异戊烯化——导致细胞功能障碍和最终死亡，主要影响外部视网膜和脉络膜。
不存在针对无脉络膜的治疗，并且缺少评价治疗策略的模型。存在提供这样的疗法的需要。
发明概述
本发明涉及载体，其可用于无脉络膜的基因疗法，和利用载体预防或治疗该疾病的方法。本发明还涉及载体在预防或治疗无脉络膜的方法中的应用。
本发明的载体是病毒载体，具体地基于腺相关病毒（AAV）的基因组。载体包括编码REP1或其变体的序列，因此考虑在靶细胞中表达REP1功能。本发明的方法和应用特别涉及通过直接的视网膜、视网膜下或玻璃体内注射将载体施用给患者以治疗或预防无脉络膜。
相应地，本发明提供载体，其包含腺相关病毒（AAV）基因组或其衍生物和编码REP1或其变体的多核苷酸序列。本发明进一步提供在需要其的患者中治疗或预防无脉络膜的方法，包括将治疗有效量的根据在前权利要求中任一项的载体通过直接的视网膜、视网膜下或玻璃体内注射施用给所述患者，和由此在所述患者中治疗或预防无脉络膜。本发明另外提供通过直接的视网膜、视网膜下或玻璃体内注射将所述载体施用给患者的本发明的载体在治疗或预防无脉络膜的方法中的应用。
附图简述
图1显示AAV.REP1（AAV-CAG-REP1）载体可有效地转导从患有无脉络膜（Chm）的患者分离的人成纤维细胞。人REP1蛋白（hREP1）表达的相对水平通过蛋白质印迹来比较，允许通过比较不同浓度细胞裂解物中hREP1的量进行AAV2.REP1载体活性定量。关于标记，CAG是具有CMV增强子启动子序列的鸡β肌动蛋白——在各种出版物和该文件的部分中可互换地称作‘CBA’。
左侧的图显示REP1的蛋白质印迹（上面的图）和作为荷载对照的α-微管蛋白的蛋白质印迹（下面的图）。泳道1：40μg来自对照野生型（WT）成纤维细胞的细胞裂解物。泳道2：40μg来自Chm成纤维细胞的细胞裂解物。泳道3-6：40、20、10和5μg来自用AAV2.REP1载体转导的Chm成纤维细胞的细胞裂解物。泳道7：人REP1重组蛋白。由于5μg裂解物hREP1带具有与40μg WT成纤维细胞裂解物相似的密度，所以用AAV2.REP1载体获得的hREP1水平可达到在这些条件下正常的野生型水平的至少8倍（40/5）。
作为该试验中启动子和其它非REP1序列的阳性对照，还显示来自表达绿色荧光蛋白（GFP）代替REP1的对照AAV载体（AAV-CAG-GFP）的结果。
右侧的图显示GFP的蛋白质印迹（上面的图）和作为荷载对照的α-微管蛋白的蛋白质印迹（下面的图）。泳道1：40μg来自野生型（WT）成纤维细胞的细胞裂解物。泳道2：40μg来自用AAV2.GFP载体（AAV-CAG-REP1）转导的Chm成纤维细胞的细胞裂解物。显示的高水平GFP证实该载体表达盒在转导缺乏REP1活性的人细胞中的有效性，其将是患有无脉络膜的患者中的情况。
图2显示WT人成纤维细胞（左侧第一个柱–浅灰色）、Chm成纤维细胞（第二个柱–深灰色）、AAV-CAG-GFP载体-转导的Chm成纤维细胞（第三个柱–白色，阴性对照）和AAV-CAG-REP1转导的Chm成纤维细胞（第四个柱–白色）中异戊烯化活性的评估。y轴显示以pmol表示的转移的放射性标记的底物[3H]GGPP底物的量，其是异戊烯化的测量结果，REP1的功能。柱显示误差条为标准差（对于每个柱，n=4）。在10mg蛋白提取物中测量[3H]-GGPP的水平。从左侧起第四个的青色柱证实用AAV.REP1载体转导之后，异戊烯化的功能还被恢复到野生型水平和超过野生型水平。这证实图1中蛋白质印迹检测的REP1蛋白具有预期的功能。
图3显示在小鼠模型中视网膜下注射之后，AAV载体具有外部视网膜（感光器和脉络膜）的细胞的正确向性。右侧的图显示在小鼠眼中视网膜下注射AAV2.CBA.GFP.WPRE.BGH载体之后，外核层（ONL）和视网膜色素上皮（RPE）的感光器中绿色荧光蛋白（GFP）标记（箭头）的适当表达。左侧的图显示相同图象的灰度。这证实AAV2.CBA.WPRE.BGH调节序列能在无脉络膜的患者中需要被靶向的视网膜细胞中高度有效的转基因表达。
图4显示AAV.REP1载体在小鼠视网膜中在高剂量下没有不利地影响外部视网膜功能。显示毒性研究的结果，其中在2×1微升的八个高剂量（n=5）或低剂量（n=4）AAV.REP1载体视网膜下注射到小鼠视网膜下空间之后六个月视网膜电图（ERG）的测量结果。低剂量=1×1011和高剂量=1×1012基因组颗粒(gp）/ml（人临床试验的起始剂量是1×1011gp/ml）。AAV.GFP载体具有相同的表达盒和在注射之前也稀释到相同剂量以充当对照。Y轴显示以从上面的暗适应（暗适应的）杆反应到明亮的到下面的明适应反应（其还将包括锥感光器）的范围渐增的闪光强度的ERG踪迹。在所有点的踪迹显示高剂量和低剂量AAV.REP1暴露之后相似的ERG振幅。在高剂量组中相等的GFP振幅被轻微地减低，与已知的在高水平下对GFP的视网膜功能的边缘效果一致。该GFP作用还充当阳性对照以证实该试验的灵敏度。
序列的描述
SEQ ID NO:1是AAV2基因组的DNA序列。
SEQ ID NO:2是编码人Rep-1蛋白，转录物变体1的DNA序列。
SEQ ID NO:3是人Rep-1蛋白，转录物变体1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4是编码人Rep-1蛋白，转录物变体1的DNA序列，其包括5’UTR部分。
SEQ ID NO:5是土拨鼠肝炎后调节元件（WPRE）的DNA序列。
SEQ ID NO:6是鸡β肌动蛋白（CBA）启动子的DNA序列。
SEQ ID NO:7是来自牛生长激素的多聚腺苷酸化位点的DNA序列（bGH多聚A）。
SEQ ID NO:8是AAV2的5’反向末端重复（ITR）的DNA序列。
SEQ ID NO:9是AAV2的3’ITR的DNA序列。
发明详述
本发明提供无脉络膜的治疗。这是基于疾病的基因治疗方法，利用基因构建物递送转基因以恢复REP1功能。基因构建物是基于腺相关病毒（AAV）基因组的载体，其包含编码REP1或其变体的多核苷酸序列。该多核苷酸序列在本文也被称作“转基因”。本发明人建立了评价无脉络膜治疗策略的模型和令人惊讶地显示本发明的载体靶向引起疾病的细胞功能障碍的应用。
载体
AAV基因组
本发明的载体首先包含腺相关病毒（AAV）基因组或其衍生物。
AAV基因组是编码产生AAV病毒颗粒需要的功能的多核苷酸序列。这些功能包括在宿主细胞中AAV的复制和包装周期中起作用的那些功能，包括将AAV基因组包入AAV病毒颗粒。天然存在的AAV病毒是复制缺陷的，和依赖于反式辅助者功能的提供，用于复制和包装周期的完成。相应地，本发明的载体的AAV基因组通常是复制缺陷的。
AAV基因组可以是单链形式，正义或反义，或可选地双链形式。双链形式的使用允许靶细胞中DNA复制步骤的旁路，并且这样可加速转基因表达。
AAV基因组可来自任何天然衍生的AAV血清型或分离群或进化枝。因此，AAV基因组可以是天然存在的AAV病毒的全基因组。如技术人员所知，存在于自然界的AAV病毒可根据多种生物系统进行分类。
通常，AAV病毒以它们的血清型的形式被提及。血清型对应于AAV的变体亚种，由于其壳体表面抗原的表达概况，其具有独特的反应性，该反应性可用于将其与其它变体亚种区分。通常，具有特定AAV血清型的病毒不能有效地与对任何其它AAV血清型特异的中和抗体交叉反应。AAV血清型包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10和AAV11，还有重组血清型，如Rec2和Rec3——最近从灵长类脑中鉴定的。
用于本发明的AAV优选血清型是AAV2。AAV2基因组可具有SEQ ID NO:1的序列。用于本发明的具有特定意义的其它血清型包括AAV4、AAV5和AAV8，其在眼，如视网膜色素上皮中有效地转导。使用的AAV血清型可以是不是AAV4的AAV血清型。AAV血清型的评论可在Choi et al（Curr Gene Ther.2005;5(3）;299-310）和Wu et al(Molecular Therapy.2006;14(3）,316-327）中找到。用于本发明的AAV基因组的序列或包括ITR序列、rep或cap基因的AAV基因组元件的序列可来自以下AAV全基因组序列登录号：腺相关病毒1NC_00207，AF063497；腺相关病毒2NC_001401；腺相关病毒3NC_001729；腺相关病毒3B NC_001863；腺相关病毒4NC_001829；腺相关病毒5Y18065，AF085716；腺相关病毒6NC_001862；禽AAV ATCC VR-865AY186198，AY629583，NC_004828；禽AAV毒株DA-1NC_006263,AY629583；牛AAV NC_005889,AY388617。
AAV病毒还可以以它们的进化枝或克隆的形式被提及。这指天然衍生的AAV病毒的种系发生关系，和通常指可被追溯到共同祖先的AAV病毒的种系发生群并包括其所有后代。另外，AAV病毒可以以特定的分离群，即自然界中发现的特定AAV病毒的遗传分离群的形式被提及。术语遗传分离群描述这样的AAV病毒群体，其已与其它天然存在的AAV病毒进行有限的遗传混合，由此在遗传水平限定可识别的独特群体。
可用于本发明的AAV的进化枝和分离群的实例包括：
进化枝A：AAV1NC_002077、AF063497、AAV6NC_001862、Hu.48AY530611、Hu43AY530606、Hu44AY530607、Hu46AY530609
进化枝B：Hu.19AY530584、Hu.20AY530586、Hu23AY530589、Hu22AY530588、Hu24AY530590、Hu21AY530587、Hu27AY530592、Hu28AY530593、Hu29AY530594、Hu63AY530624、Hu64AY530625、Hu13AY530578、Hu56AY530618、Hu57AY530619、Hu49AY530612、Hu58AY530620、Hu34AY530598、Hu35AY530599、AAV2NC_001401、Hu45AY530608、Hu47AY530610、Hu51AY530613、Hu52AY530614、Hu T41AY695378、Hu S17AY695376、Hu T88AY695375、Hu T71AY695374、Hu T70AY695373、Hu T40AY695372、Hu T32AY695371、Hu T17AY695370、Hu LG15AY695377、
进化枝C：Hu9AY530629、Hu10AY530576、Hu11AY530577、Hu53AY530615、Hu55AY530617、Hu54AY530616、Hu7AY530628、Hu18AY530583、Hu15AY530580、Hu16AY530581、Hu25AY530591、Hu60AY530622、Ch5AY243021、Hu3AY530595、Hu1AY530575、Hu4AY530602Hu2、AY530585、Hu61AY530623
进化枝D：Rh62AY530573、Rh48AY530561、Rh54AY530567、Rh55AY530568、Cy2AY243020、AAV7AF513851、Rh35AY243000、Rh37AY242998、Rh36AY242999、Cy6AY243016、Cy4AY243018、Cy3AY243019、Cy5AY243017、Rh13AY243013
进化枝E：Rh38AY530558、Hu66AY530626、Hu42AY530605、Hu67AY530627、Hu40AY530603、Hu41AY530604、Hu37AY530600、Rh40AY530559、Rh2AY243007、Bb1AY243023、Bb2AY243022、Rh10AY243015、Hu17AY530582、Hu6AY530621、Rh25AY530557、Pi2AY530554、Pi1AY530553、Pi3AY530555、Rh57AY530569、Rh50AY530563、Rh49AY530562、Hu39AY530601、Rh58AY530570、Rh61AY530572、Rh52AY530565、Rh53AY530566、Rh51AY530564、Rh64AY530574、Rh43AY530560、AAV8AF513852、Rh8AY242997、Rh1AY530556
进化枝F：Hu14(AAV9）AY530579、Hu31AY530596、Hu32AY530597、克隆分离群AAV5Y18065、AF085716、AAV3NC_001729、AAV3B NC_001863、AAV4NC_001829、Rh34AY243001、Rh33AY243002、Rh32AY243003/
技术人员可以在它们的共同常用知识基础上选择用于本发明的AAV的适当血清型、进化枝、克隆或分离群。例如，AAV5壳体已显示有效地转导灵长类锥感光器，如遗传的彩色视觉缺陷的成功纠正所证明（Mancuso et al.,Nature2009,461:784-7）。
然而，应当理解，本发明还包括使用还未被鉴定或表征的其它血清型的AAV基因组。AAV血清型决定AAV病毒感染（或向性）的组织特异性。相应地，根据本发明用于给予患者的AAV病毒优选的AAV血清型是这样的AAV血清型，其对无脉络膜中变性视网膜内靶细胞具有天然向性或高效率感染。因此，用于给予患者的AAV病毒的优选AAV血清型是感染神经感觉的视网膜和视网膜色素上皮细胞的AAV血清型。
通常，AAV的天然衍生的血清型或分离群或进化枝的AAV基因组包括至少一个反向末端重复序列（ITR）。ITR序列顺式起作用以提供有功能的复制起点，和允许来自细胞基因组的载体的整合和切除。在优选实施方式中，一个或多个ITR序列位于编码Rep-1或其变体的多核苷酸序列的侧翼。优选的ITR序列是AAV2的那些ITR序列，包括SEQ ID NOs8和9和其变体的那些ITR序列。AAV基因组通常还包括包装基因，如rep和/或cap基因，其编码对AAV病毒颗粒的包装功能。rep基因编码蛋白Rep78、Rep68、Rep52和Rep40或其变体中的一个或多个。cap基因编码一个或多个壳体蛋白如VP1、VP2和VP3或其变体。这些蛋白构成AAV病毒颗粒的壳体。壳体变体在下面讨论。
启动子将被可操作地连接至每个包装基因。这样的启动子的具体实例包括p5、p19和p40启动子(Laughlin et al.,1979,PNAS,76:5567-5571）。例如，p5和p19启动子通常用于表达rep基因，而p40启动子通常用于表达cap基因。
如上面所讨论的，用于本发明的载体的AAV基因组可因此是天然存在的AAV病毒的全基因组。例如，包括全AAV基因组的载体可用于体外制备AAV病毒。然而，虽然这样的载体可原则上给予患者，但是在实践中将很少这样做。优选将衍生AAV基因组用于给予患者的目的。这样的衍生在本领域中是标准的，并且本发明包括使用AAV基因组的任何已知衍生物和可通过应用本领域已知的技术产生的衍生物。AAV基因组的衍生和AAV壳体的衍生在上面引用的Coura和Nardi（Virology Journal,2007,4:99）中和在Choi et al和Wu et al中被评论。
AAV基因组的衍生物包括AAV基因组的任何截短的或修改形式，其允许来自本发明载体的Rep-1转基因的体内表达。通常，有可能显著地截短AAV基因组以包括最小的病毒序列而保留以上功能。由于安全原因，这是优选的以减小载体与野生型病毒重组的危险，并且还避免触发由于靶细胞中病毒基因蛋白的存在引起的细胞免疫反应。
通常，衍生物将包括至少一个反向末端重复序列（ITR），优选一个以上ITR，如两个ITR或更多。ITR中的一个或多个可来自具有不同血清型的AAV基因组，或可以是嵌合或突变ITR。优选突变ITR是具有trs（末端分解位点（termial resolution site））缺失的ITR。该缺失允许基因组连续复制以产生单链基因组，该单链基因组含有编码序列和互补序列，即自身互补的AAV基因组。这允许靶细胞中DNA复制的旁路，并因此能够进行加速的转基因表达。
一个或多个ITR将优选位于编码REP1或其变体的多核苷酸序列任一端的一侧。包含一个或多个ITR是优选的以辅助本发明的载体在宿主细胞核中形成多联体(concatamer），例如通过宿主细胞DNA聚合酶的作用，单链载体DNA转变成双链DNA之后。这样的游离型多联体的形成在宿主细胞生命期间保护载体构建物，由此允许转基因延长的体内表达。
在优选实施方式中，ITR元件将是衍生物中天然AAV基因组保留的唯一序列。因此，衍生物优选将不包括天然基因组的rep和/或cap基因和天然基因组的任何其它序列。由于上面描述的原因，这是优选的，并还减小载体整合进宿主细胞基因组的可能性。另外，减小AAV基因组的大小允许增加在载体内掺入除转基因外的其它序列元件（如调节元件）的灵活性。
关于SEQ ID NO:1的AAV2基因组，以下部分可因此在本发明的衍生物中去除：一个反向末端重复（ITR）序列、复制（rep）和壳体（cap）基因（注意：不应将野生型AAV基因组中的rep基因与REP1——无脉络膜中受影响的人基因——混淆）。然而，在一些实施方式——包括体外实施方式——中，衍生物可另外包括一个或多个rep和/或cap基因或AAV基因组的其它病毒序列。天然存在的AAV病毒在人染色体19上的特定位点高频整合，并显示可忽略不计的随机整合频率，以至于载体中整合容量的保留可在治疗环境中被耐受。
如果衍生物基因组包括编码壳体蛋白即VP1、VP2和/或VP3的基因，则衍生物可以是一个或多个天然存在的AAV病毒的嵌合的、改组的或壳体改变的衍生物。特别地，本发明包括提供来自相同载体内AAV的不同血清型、进化枝、克隆或分离群的壳体蛋白序列，即假型化。
通常将选择嵌合的、改组的或壳体改变的衍生物以为病毒载体提供一个或多个期望的功能性。因此，与包括天然存在的AAV基因组，如AAV2的基因组的AAV病毒载体相比，这些衍生物可显示增加的基因递送效率、降低的免疫原性（体液的或细胞的免疫原性）、改变的向性范围和/或提高的特定细胞类型的靶向作用。增加的基因递送效率可受到以下的影响：在细胞表面提高的受体或共同受体结合、提高的内化、提高的细胞内运输和运输进细胞核、提高的病毒颗粒脱壳和提高的单链基因组转变成双链形式。增加的效率还可涉及改变的向性范围或特定细胞群的靶向作用，以至于载体剂量没有因为给予到不需要其的组织而稀释。
嵌合壳体蛋白包括天然存在的AAV血清型的两个或多个壳体编码序列之间的重组而产生的那些壳体蛋白。这可例如通过标记拯救方法进行，在该方法中将一个血清型的非感染的壳体序列与不同血清型壳体序列共转染，并且定向选择用于选择具有期望性质的壳体序列。不同血清型的壳体序列可通过细胞内的同源重组而改变以产生新的嵌合壳体蛋白。
嵌合壳体蛋白还包括通过壳体蛋白序列的工程改造产生的那些壳体蛋白，以转移两个或更多个壳体蛋白之间，例如不同血清型的两个或更多个壳体蛋白之间特定的壳体蛋白结构域、表面环或特定氨基酸残基。
改组的或嵌合的壳体蛋白还可通过DNA改组或通过易错PCR而产生。杂合AAV壳体基因可通过以下步骤产生：随机片段化相关AAV基因例如编码多个不同血清型的壳体蛋白的那些基因的序列，和然后在自身引发聚合酶反应中再装配片段，这还可引起序列同源性区域中的交叉。以该方式通过改组几个血清型的壳体基因而产生的杂合AAV基因文库可被筛选以鉴定具有期望的功能性的病毒克隆。相似地，易错PCR可用于随机突变AAV壳体基因以产生多样的变体文库，然后可针对期望的性质筛选该文库。
壳体基因的序列还可进行遗传修饰以相对于天然的野生型序列引入特定缺失、置换或插入。特别地，壳体基因可通过在壳体编码序列的开放阅读框内或在壳体编码序列的N末端和/或C末端插入不相关蛋白或肽的序列而被改变。
不相关的蛋白或肽可有利地是充当特定细胞类型的配体的蛋白或肽，由此给予与靶细胞的提高的结合或提高载体对特定细胞群的靶向作用的特异性。实例可包括RGD肽用于阻断视网膜色素上皮中的摄取和由此增强周围视网膜组织的转导（Croninet al.,2008ARVO Abstract:D1048）。不相关的蛋白还可以是这样的蛋白，其辅助作为产生过程的部分即表位或亲和标签的病毒颗粒的纯化。通常将选择插入位点以不干扰病毒颗粒的其它功能例如病毒颗粒的内化、运输。技术人员能够基于他们的共同一般知识来识别合适的插入位点。特定的位点在上面引用的Choi et al中被公开。
本发明另外包括提供与天然的AAV基因组不同顺序和构型的AAV基因组的序列。本发明还包括用来自另一个病毒的序列或用由来自一个以上病毒的序列组成的嵌合基因替换一个或多个AAV序列或基因。这样的嵌合基因可以由来自不同病毒种类的两个或更多个相关的病毒蛋白的序列组成。
本发明的载体采取多核苷酸序列的形式，该多核苷酸序列包括AAV基因组或其衍生物和编码REP1或其变体的序列。
为了避免怀疑，本发明还提供包括本发明载体的AAV病毒颗粒。本发明的AAV颗粒包括壳体转移的形式，其中具有一个血清型的ITR的AAV基因组或衍生物被包装在不同血清型的壳体中。本发明的AAV颗粒还包括镶嵌形式，其中来自两个或更多个不同血清型的未改变的壳体蛋白的混合物构成病毒包膜。AAV颗粒还包括化学修饰的形式——带有吸附到壳体表面的配体。例如，这样的配体可包括靶向特定的细胞表面受体的抗体。
本发明另外提供宿主细胞，其包含本发明的载体或AAV病毒颗粒。
REP1
本发明的载体进一步包括编码REP1多肽或其变体的多核苷酸序列。人REP1的cDNA序列（或Rab护卫蛋白-1，也称作Rab蛋白牻牛儿基牻牛儿基转移酶组分A）显示在SEQ ID NO:2中并编码SEQ ID NO:3所示的蛋白质。REP1的另外的cDNA序列显示在SEQ ID NO:4中。
REP1多肽或其变体是辅助Rab GTPase蛋白异戊烯化的任何多肽。REP1多肽或其变体辅助Rab GTPase蛋白异戊烯化的能力可由本领域技术人员常规地测定。编码REP1变体的多核苷酸序列是编码辅助Rab-1GTPase异戊烯化活性的蛋白质的任何序列。优选地，序列编码这样的蛋白质，该蛋白质在提供与SEQ ID NO:3的多肽相比相似或更高的Rab-1GTPase异戊烯化活性中提供辅助作用。
更优选，多核苷酸序列编码SEQ ID NO:3或其变体，并且是SEQ ID NO:2的多核苷酸序列的变体。SEQ ID NO:2或3的变体可包括其平截物、突变体或同系物，和编码功能性REP多肽的其任何转录物变体。
本文提到的任何同系物通常与SEQ ID NO:2或3的相关区域至少70%同源。特定的同系物是REP2多肽，其与REP175%同源，并且可在功能上补偿REP1缺乏。
同源性可利用已知方法测量。例如UWGCG Package提供BESTFIT程序，其可用于计算同源性（例如在其默认设置上使用）（Devereux et al(1984）Nucleic AcidsResearch12,387-395）。PILEUP和BLAST算法可用于计算同源性或调整序列（通常在其默认设置上），例如如Altschul S.F.(1993）J Mol Evol36:290-300；Altschul,S,F etal(1990）J Mol Biol215:403-10中所描述的。进行BLAST分析的软件通过国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）公开的获得。
在优选实施方式中，变体序列可编码多肽，该多肽在至少20、优选至少30、例如至少40、60、100、200、300、400或更多个连续氨基酸中，或甚至在变体的全部序列中与SEQ ID NO:3的相关区域至少55%、65%、70%、75%、80%、85%、90%和更优选至少95%、97%或99%同源。相关区域将是这样的区域，其在辅助Rab-1GTP酶异戊烯化活性中提供REP1的功能活性。
可选地和优选地，变体序列可编码多肽，该多肽在其全部序列中具有与全长SEQID NO:3至少70%、75%、80%、85%、90%和更优选至少95%、97%或99%同源。通常，变体序列与SEQ ID NO:3的相关区域差异至少、或小于2、5、10、20、40、50或60个突变（每个突变可以是置换、插入或缺失）。
变体Rep-1多肽可与SEQ ID NO:3的特定区域的具有一定的百分比同一性，该百分比同一性与上面提到的序列的任何长度范围内的特定百分比同源性值中任何一个相同（即它可具有至少70%、80%或90%和更优选至少95%、97%或99%同一性）。
SEQ ID NO:3的变体还包括平截。可利用任何平截，只要变体仍然能使Rab-1GTPase底物多肽异戊二烯化。通常进行平截以去除对异戊烯化活性非必需的和/或不影响折叠蛋白构象——特别地活性部位的折叠的序列。适当的平截可常规地从N末端或C末端变化长度的序列的体系平截来鉴定。优选的平截是N末端的和可去除除催化结构域外的所有其它序列。
SEQ ID NO:3的变体进一步包括具有关于SEQ ID NO:3特定区域的一个或多个，例如，2、3、4、5至10、10至20、20至40或更多的氨基酸插入、置换或缺失的突变体。缺失和插入优选在催化结构域外面进行，如下面所描述的。置换也通常在对蛋白酶活性非必需的和/或不影响折叠蛋白的构象的区域进行。
置换优选引入一个或多个保守的改变，其用具有相似化学结构、相似化学性质或相似侧链大小的其它氨基酸替换氨基酸。引入的氨基酸可具有与它们替换的氨基酸相似的极性、亲水性、疏水性、碱性、酸性、中性或电荷。可选地，保守的改变可引入另一个芳香族或脂肪族氨基酸，替换先前存在的芳香族或脂肪族氨基酸。保守的氨基酸改变在本领域是已知的并可和根据如下面的表A中所定义的20种主要氨基酸的性质来选择。
相似地，SEQ ID NO:2的多核苷酸序列的优选变体包括与SEQ ID NO:2的相关区域具有至少70%、75%、80%、85%、90%和更优选至少95%、97%或99%同源性的多核苷酸。优选地，变体在其全部序列中显示与全长SEQ ID NO:2的这些水平的同源性。
表A–氨基酸的化学性质
Figure BDA0000399087340000101
启动子和调节序列
本发明的载体还包括允许REP1转基因体外或体内表达的元件。因此，载体通常包括可操作地连接到编码Rep-1或其变体的多核苷酸序列的启动子序列。
可利用任何合适的启动子。启动子序列可以是组成型活性的，即在任何宿主细胞背景中都起作用的，或可选地可以只在特定的宿主细胞环境中有活性，因此允许转基因在特定的细胞类型中靶向表达。启动子可响应另一个因子——例如存在于宿主细胞中的因子——的存在而显示可诱导的表达。无论如何，在给予载体用于治疗的情况下，启动子在视网膜细胞背景中必须是有功能的。
在一些实施方式中，优选，启动子显示视网膜细胞特异的表达以允许转基因只在视网膜细胞群中表达。因此，来自启动子的表达可以是视网膜细胞特异的，例如只限定于神经感觉视网膜细胞和视网膜色素上皮细胞。
Rep-1转基因的优选的启动子包括鸡β-肌动蛋白（CBA）启动子，任选地与巨细胞病毒（CME）增强子元件组合。特别优选的启动子是杂合CBA/CAG启动子，例如rAVE表达盒中使用的启动子（GeneDetect.com）。进一步优选的启动子显示在SEQID NO:6中。基于将诱导视网膜特异基因表达的人序列的启动子的实例包括针对视杆细胞和视锥细胞的视紫红质激酶（Allocca et al.,2007,J Virol81:11372-80）、只针对视锥细胞的PR2.1（Mancuso et al.2009,Nature）和/或针对视网膜色素上皮的RPE65（Bainbridge et al.,2008,N Eng J Med）。
本发明的载体还可包括一个或多个另外的调节序列，其可在转录前或转录后起作用。调节序列可以是天然的REP基因座的部分或可以是异源的调节序列。本发明的载体可包括来自天然的REP1转录物的5’UTR或3’UTR部分。例如，SEQ ID NO:4的多核苷酸包括来自天然的REP1转录物的5’UTR序列中的一些。
调节序列是促进转基因表达即起作用以增加转录物表达、提高mRNA的出核转运或增强其稳定性的任何序列。这样的调节序列包括例如增强子元件、后调节元件和多聚腺苷酸化位点。优选的多聚腺苷酸化位点是牛生长激素多聚A信号，其可如SEQID NO:7所示。在本发明的载体的上下文中，这样的调节序列将是顺式作用的。然而，本发明还包括使用位于另外基因构建物上的反式作用调节序列。
用于本发明载体的优选的后调节元件是土拨鼠肝炎后调节元件（WPRE）或其变体。WPRE的序列提供在SEQ ID NO:5中。本发明包括使用WPRE的任何变体序列，与没有WPRE的载体相比，该序列增加REP1转基因的表达。优选地，变体序列显示在其全部序列中与SEQ ID NO:5具有至少70%的同源性，更优选在其全部序列中与SEQ ID NO:5具有75%、80%、85%、90%和更优选至少95%、97%或99%的同源性。
可用于本发明载体的另一个调节序列是支架连接区（SAR）。另外的调节序列可以由技术人员在他们的共同常用知识的基础上选择。
载体的制备
本发明的载体可通过本领域已知的标准方法来制备而提供用于基因疗法的载体。因此，良好建立的公开区域转染、包装和纯化方法可用于制备合适的载体制剂。
如上面所讨论的，除了编码REP1或其变体的多核苷酸序列，本发明的载体可包括天然存在的AAV病毒的全基因组。然而，通常将利用衍生的基因组，例如这样的衍生物，其具有至少一个反向末端重复序列（ITR），但是其可缺少任何AAV基因如rep或cap。
在这样的实施方式中，为了提供衍生的基因组装配进AAV病毒颗粒，提供AAV和/或辅助病毒功能的另外基因构建物将与衍生的基因组结合被提供在宿主细胞中。这些另外的构建物将通常含有编码结构AAV壳体蛋白，即cap、VP1、VP2、VP3的基因和编码AAV生命周期需要的其它功能的基因，如rep。提供在另外的构建物上的结构壳体蛋白的选择将决定包装的病毒载体的血清型。
用于本发明的特别优选的包装的病毒载体包括AAV2结合AAV5或AAV8壳体蛋白的衍生的基因组。该包装的病毒载体通常包含一个或多个AAV2ITR——任选地如SEQ ID NO:8和/或9所示——或其变体。
如上面所提到的，AAV病毒是无复制能力的，所以辅助病毒功能，优选腺病毒辅助者功能将通常也提供在一个或多个另外的构建物上以允许AAV复制。
所有上面的另外的构建物可作为质粒或宿主细胞中的其它游离元件而提供，或可选地一个或多个构建物可被整合进宿主细胞基因组。
在这些方面，本发明提供产生本发明的载体的方法。该方法包括在宿主细胞中提供包含腺相关病毒（AAV）基因组或其衍生物和编码REP1或其变体的多核苷酸序列的载体，和提供将所述载体复制和装配进AAV病毒颗粒的方法。优选地，该方法包括提供包含AAV基因组衍生物和编码REP1或其变体的多核苷酸序列的载体，连同一个或多个编码AAV和/或辅助病毒功能的另外的基因构建物。通常，AAV基因组衍生物包括至少一个ITR。任选地，该方法进一步包括纯化装配的病毒颗粒的步骤。另外，该方法可包括配制病毒颗粒用于治疗用途的步骤。
治疗方法和医学用途
如上面所讨论的，本发明人已令人惊讶地证明本发明的载体可用于解决引起无脉络膜的细胞功能障碍。特别地，他们已显示载体的使用可纠正与无脉络膜相关的异戊烯化缺陷。这提供方法，借此疾病的变性过程可被治疗、阻止、减轻或预防。
本发明因此提供在需要其的患者中治疗或预防无脉络膜的方法，包括通过直接的视网膜、视网膜下或玻璃体内注射给予患者治疗有效量的本发明的载体。相应地，在所述患者中无脉络膜由此被治疗或预防。
在相关的方面，本发明提供本发明的载体在通过直接的视网膜、视网膜下或玻璃体内注射给予患者所述载体的治疗或预防无脉络膜的方法中的应用。另外，本发明提供本发明的载体在制备用于通过直接的视网膜、视网膜下或玻璃体内注射治疗或预防无脉络膜的药物中的应用。
在所有这些实施方式中，可给予本发明的载体以预防无脉络膜的一个或多个症状的开始。患者可以是无症状的。对象可具有对该疾病的易感性。方法或应用可包括鉴定对象是否濒临发展无脉络膜的危险或患有无脉络膜的步骤。将预防有效量的载体给予这样的对象。预防有效量是预防疾病的一个或多个症状的开始的量。
可选地，一旦疾病的症状已在对象中出现，可给予载体，即以治疗存在的疾病症状。将治疗有效量的拮抗物给予这样的对象。治疗有效量是有效改善一个或多个疾病症状的量。通常，这样的量增加眼中Rab GTPase的异戊烯化水平。这可被证实，如下面所描述的。这样的量还可阻止、减慢或逆转一些与无脉络膜相关的周边视觉的丧失。这样的量还可阻止、减慢或逆转夜盲症的开始。
对象可以是男性或女性。男性对象显示更严重的症状，因为无脉络膜是X连锁疾病，但是女性对象也显示疾病症状和偶尔具有严重的表型。对象优选被鉴定为濒临疾病危险或患有疾病。视网膜可显示最初脉络膜变薄和发展成下面的巩膜碎片暴露的特征性外观。可存在外周的视网膜电图振幅的丧失。在许多情况中，可存在无脉络膜的家族史。通常但不经常，突变可在位于X-染色体上的REP1基因中鉴定到。
载体的给予通常通过直接的视网膜或视网膜下注射。这包括直接递送到神经感觉视网膜细胞和视网膜色素上皮细胞，如上皮或感光细胞。递送通常直接或视网膜下地进行到无脉络膜患者中的变性视网膜。载体可转导以上靶细胞而无需进入任何其它细胞群。玻璃体内注射也可用于递送本发明的载体。递送可不是视网膜下或可不通过视网膜下注射。递送可不经玻璃体。
本发明载体的剂量可根据多种参数，特别是根据将被治疗的患者的年龄、重量和状况；给药途径；和需要的方案来确定。此外，医师将能针对任何特定患者确定需要的给药途径和剂量。
通常的单剂量是1010和1012基因组颗粒之间，取决于需要转导的剩余视网膜组织的量。基因组颗粒在本文被定义为含有可用序列特异方法（如实时PCR）定量的单链DNA分子的AAV壳体。该剂量可作为单剂量提供，但对于对侧眼或在无论什么原因（如手术并发症）载体没有靶向视网膜的正确区域的情况中可重复。治疗优选是对于每只眼的单个持久治疗，但是重复注射，例如在将来一些年里和/或可考虑不同的AAV血清型。
本发明还提供在患者中监测无脉络膜的治疗或预防的方法，包括在通过直接的视网膜、视网膜下或玻璃体内注射给予本发明的AAV载体之后，离体测量获自所述患者的视网膜细胞中的异戊烯化活性。该方法允许测定治疗的有效性。
药物组合物
本发明的载体可被配制成药物组合物。这些组合物可包括除载体外的药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员熟知的其它材料。这样的材料应是无毒的和不应该干扰活性成份的有效性。载体或其它材料的准确性质可由技术人员根据给药途径，即本文直接视网膜、视网膜下或玻璃体内注射来测定。
药物组合物通常是液体形式。液体药物组合物通常包括液体载体如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可包括生理盐水溶液、氯化镁、葡萄糖或其它糖溶液或二醇如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。在一些情况中，可使用表面活性剂如普朗尼克酸（PF68）0.001%。
为了在受累部位进行注射，活性成分将是水溶液的形式，其是无热原的和具有合适的pH、等渗性和稳定性。本领域中相关技术人员完全能够利用，例如，等张赋形剂如氯化钠注射液、林格注射液、乳酸林格注射液来制备合适的溶液。如需要，可包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其它添加剂。
为了延迟释放，根据本领域已知的方法，载体可包括在配制用于缓慢释放的药物组合物中，如在由生物相容性聚合物形成的微胶囊中或在脂质体载体系统中。
实施例
本实施例描述用于测试无脉络膜的治疗策略和疾病表型纠正的模型。当包装进重组病毒载体中时，由启动子、REP1cDNA和3’调节元件组成的基因构建物显示了在变性视网膜内有效地转导靶细胞。
实施例1
人REP1cDNA的克隆、和CBA-REP-1-WPRE表达盒的产生、pAAV-CBA-REP-1-WPRE-bGHpA的构建和AAV REP-1病毒的包装。
利用PCR扩增和与已知REP1序列同源的引物从人cDNA文库分离人REP1的cDNA。分离的cDNA被测序并显示与如保存在Genbank中的登录号NM_000390的REP1mRNA序列的已知翻译变体1同源。cDNA具有SEQ ID NO:4的序列。
将该cDNA插入pAAV顺式质粒，将其称作pAM。pAM是最初衍生自pBR322的高拷贝数质粒，但包括稳定化的AAV-2左侧和右侧反向末端重复——其位于选择的表达盒侧翼。对于AAV-REP1载体，修饰的CBA/CAG启动子（具有CMV增强子的鸡β-肌动蛋白）用于驱动REP1的表达，并且将修饰的WPRE序列和bGH多聚A提供给cDNA的3’端。将该质粒称作pAAV2-CBA-hREP-1-WPRE-bGH，（pAAV-REP-1）。
pAAV-REP-1用于利用良好建立的和公开的区域三倍转染包装和纯化方法产生重组AAV-Rep-1。利用该方法产生的载体原液的基因组滴度不同，但纯化之后获得的原液最常见地是1012-1013gp/ml（gp=基因组颗粒–参见上面）。随后将原液稀释用于体内使用，如下面所描述的。
实施例2
来自载体的REP1在人无脉络膜（Chm）细胞中的表达
在人无脉络膜（Chm）成纤维细胞中评价来自AAV2REP1载体的REP1的表达。这些成纤维细胞获自取自无脉络膜患者的皮肤活体解剖，其得到伦理同意。来自对照载体的GFP表达充当对照。作为用人细胞工作的前序，表达还在小鼠中AAV.REP1载体的视网膜下注射之后通过蛋白质印迹来证实，因为抗体探针识别人而不是小鼠形式的REP1蛋白。
结果显示在图1中。通过用抗hREP1抗体的免疫印迹，在非转导的Chm成纤维细胞（泳道2）中没有检测到REP1，而REP1在正常的（WT=人野生型）成纤维细胞（泳道1）中被检测到。用AAV2.REP1载体转导之后，以裂解物的40μg的相同剂量和稀释到5μg，可以看到在Chm细胞中AAV2.REP1载体表达的hREP1水平高于野生型细胞（泳道1）中的水平大约十倍（泳道3-6）。对于该过量表达的程度，没有观察到对细胞生长的毒性作用。
实施例3
Chm细胞中载体引起的异戊烯化缺陷的纠正
无脉络膜小鼠没有与人类患者相同的方式的视网膜变性表型，因此不可能利用基因治疗方法进行视网膜拯救的直接评价。因为该原因，在人Chm细胞中体外评价疾病表型的纠正。
结果显示在图2中。用AAV2.REP1的转导显示Chm细胞中所见的异戊烯化缺陷的纠正，用1.5×1010AAV2.REP1的病毒基因组颗粒处理2×105个细胞之后，异戊烯化活性升高到显著高于正常水平。这证实AAV2.REP1载体在受无脉络膜影响的人细胞中表达功能性REP1蛋白。
更详细地，野生型（WT）成纤维细胞中正常的异戊烯化活性产生大约0.32pmol[3H]-GGPP；在无脉络膜（Chm）成纤维细胞中，这被减少到0.19pmol。如期望的，在用AAV.GFP对照载体转导Chm成纤维细胞之后，异戊烯化活性未改变。然而，用AAV2.REP1载体转导之后，异戊烯化活性显著增加，产生0.42pmol[3H]-GGPP（n=4，p<0.01）。
实施例4
来自载体的报告基因在小鼠中的靶向体内表达
为证实AAV2载体中CBA启动子和调节序列的普遍存在的活性，将编码REP1的基因用编码绿色荧光蛋白（GFP）的报告基因替换，产生AAV2.CBA.GFP.WPRE.BGH（AAV2.GFP）。
选择GFP以评价体内表达，因为虽然容易在蛋白质印迹上鉴定，但是人REP1蛋白不容易通过视网膜切片上的间接免疫组织化学来检测。
将AAV2.GFP构建物注射到小鼠视网膜下空间，GFP的表达通过显微镜检查来监测。结果显示在图3中，其证实载体对神经感觉视网膜和视网膜色素上皮均具有预期的向性。这证实壳体序列和调节元件导致在感光器和视网膜色素上皮中的高水平基因表达。
实施例5
毒性研究
将多种AAV2.REP1载体的剂量注射进野生型小鼠（n=9）的视网膜下空间以在最高剂量下测定对视网膜功能的任何可能的毒性作用。我们测试了小鼠中的载体浓度（1×1011和1×1012gp/ml），其是高于提出的将用于患者的高浓度和低浓度（1010和1011gp/ml）的log单位。
结果显示在图4中。在用高剂量（n=5）或低剂量（n=4）的AAV.REP1载体视网膜下注射之后六个月，在视网膜电图（ERG）上没有检测到毒性作用。为了控制视网膜手术或AAV2载体的任何非特异性作用，侧眼具有非常相似AAV2.GFP的视网膜下注射和滴度。
在最高的AAV2.GFP剂量，存在ERG振幅的轻微减小，其反映利用最大剂量的表达GFP的具有该强启动子的载体的轻的已知毒性作用，并且证实在检测与剂量相关的效应中该试验的灵敏度。然而在任何一个剂量在AAV2.REP1处理的眼中不存在可检测的ERG减小，这提示视网膜中REP1过量表达的毒性比GFP小。
Figure IDA0000399087400000011
Figure IDA0000399087400000031
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Figure IDA0000399087400000071
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Claims (15)

1.载体，其包含腺相关病毒（AAV）基因组或其衍生物和编码REP1或其变体的多核苷酸序列。
2.根据权利要求1的载体，其中所述衍生物是嵌合的、改组的或壳体修饰的衍生物。
3.根据权利要求1或2的载体，其中所述AAV基因组来自AAV的天然衍生的血清型或分离群或进化枝。
4.根据权利要求3的载体，其中所述血清型是AAV血清型2（AAV2）。
5.根据权利要求4的载体，其包含SEQ ID NO:1或其衍生物。
6.根据在前权利要求中任一项的载体，其中所述多核苷酸序列编码与SEQID NO:3在其全部序列中具有至少70%同源性的多肽。
7.根据权利要求6的载体，其中所述多核苷酸序列与SEQ ID NO:2在其全部序列中具有至少70%的同源性。
8.根据在前权利要求中任一项的载体，其包含可操作地连接到编码REP1或其变体的所述多核苷酸序列的启动子序列。
9.根据权利要求8的载体，其中所述启动子是组成型活性的。
10.根据权利要求8的载体，其中来自所述启动子的表达是视网膜细胞特异的。
11.根据在前权利要求中任一项的载体，其包含一个或多个另外的调节序列。
12.根据权利要求11的载体，其包含与SEQ ID NO:5在其全部序列中具有至少70%同源性的序列。
13.在需要的患者中治疗或预防无脉络膜的方法，包括通过直接的视网膜、视网膜下或玻璃体内注射将治疗有效量的根据在前权利要求中任一项的载体给予所述患者，和由此在所述患者中治疗或预防无脉络膜。
14.根据权利要求13的方法，其中将所述载体直接给予到视网膜下空间。
15.根据权利要求1至12中任一项的载体在通过直接的视网膜、视网膜下或玻璃体内注射给予患者所述载体治疗或预防无脉络膜的方法中的应用。
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