MX2013009604A - Vectores de virus asociados con adeno (aav) para uso en terapia de genes de coroideremia. - Google Patents

Abstract

La invención actual se refiere a terapia de genes para tratamiento o prevención de coroideremia.

Description

VECTORES DE VIRUS ASOCIADOS CON ADENO (AAV) PARA USO EN TERAPIA DE GENES DE COROIDEREMIA Campo de la Invención La invención actual se refiere a terapia de genes para tratamiento o prevención de coroideremia .

Antecedentes de la Invención La coroideremia es una degeneración rara progresiva ligada a X del coroide, epitelio del pigmento retinal y fotoreceptores del ojo. La historia natural típica en sujetos del sexo masculino que la padecen es inicio de nictalopía o ceguera nocturna durante los años de adolescencia, y luego la pérdida progresiva de visión periférica durante los 20 y 30, llevando a la ceguera completa en los 40. Los portadores del sexo femenino tienen síntomas moderados, más notablemente nictalopía; pero ocasionalmente pueden tener un fenotipo más severo .

La enfermedad es causada por mutaciones en el gen REP1, (Proteína 1 acompañante Rab) , que se localiza en la región 21q del cromosoma X. En la mayoría de las células en el cuerpo, la proteína REP2, que es 75% homologa con REP1, compensa la deficiencia de REP1. En el ojo, sin embargo, por razones que aún no son claras, REP2 no es capaz de compensar la deficiencia de REP1. Por lo tanto en el ojo, la actividad del polipéptido REP es insuficiente para mantener la Ref: 243235 prenilación normal de las proteínas objetivo (Rab GTPasas) lo que lleva a la disfunción celular y finalmente la muerte, afectando primariamente la retina externa y coroide.

No hay tratamiento para coroideremia, y se carece de modelos para evaluar estrategias terapéuticas. Hay una necesidad para la provisión de tal terapia.

Breve Descripción de la Invención La invención actual se refiere a un vector que puede usarse para terapia de genes de coroideremia, y métodos para prevenir o tratar esta enfermedad usando el vector. La invención también se refiere al uso del vector en métodos para prevenir o tratar coroideremia.

El vector de la invención es un vector vírico, basado específicamente en el genoma de virus asociado con adeno (AAV, por sus siglas en inglés) . El vector comprende una secuencia que codifica REP1 o una variante del mismo, permitiendo de esta manera la expresión de la función REP1 en una célula objetivo. Los métodos y usos de la invención involucran específicamente la administración del vector a un paciente por inyección retinal, subretinal o intravítrea directa para tratar o prevenir coroideremia.

En consecuencia, la invención proporciona un vector, que comprende un genoma de virus asociado con adeno (AAV) o un derivado del mismo y una secuencia de polinucleótido que codifica REP1 o una variante del mismo. La invención proporciona además un método para tratar o prevenir coroideremia en un paciente que necesita del mismo, .que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes al paciente por inyección retinal, subretinal o intravitrea directa, y por ello tratar o prevenir la coroideremia en el paciente. La invención proporciona adicionalmente un vector de la invención para uso en un método para tratar o prevenir coroideremia al administrar el vector a un paciente por inyección retinal, subretinal o intravitrea directa.

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 muestra que el vector AAV.REP1 (AAV-CAG-REP1) puede transducir fibroblastos humanos aislados de un paciente con coroideremia (Chm) eficientemente. Los niveles de expresión relativos de proteina REP1 humana (hREPl) se comparan por Western blot, permitiendo la cuantificación de la actividad del vector AAV2.REP1 al comparar la cantidad de hREPl en concentraciones diferentes de lisado celular. Con respecto al etiquetado, CAG es la Actina beta de Pollo con secuencia del promotor aumentador C V - referido intercambiablemente como 'CBA1 en varias publicaciones y partes de este documento.

Los Western blots se muestran en los paneles izquierdos para REP1 (panel superior) y alfa-tubulina (panel del fondo) como un control de carga. Carril 1: 40 pg lisado celular de fibroblastos de tipo natural (TN) de control. Carril 2: 40 g de lisado celular de fibroblastos Chm. Carriles 3-6: 40, 20, 10 y 5pg lisado celular de fibroblastos Chm transducidos con vector AAV2.REP1. Carril 7: proteina recombinante REP1 humana. Ya que la banda hREPl de 5 pg de lisado tiene una densidad similar a 40 pg del lisado de fibroblasto TN, el nivel de hREPl alcanzado con el vector AAV2.REP1 puede alcanzarse al menos 8 veces (40/5) los niveles de tipo natural normales bajo estas condiciones.

Como un control positivo para el promotor y otras secuencias no REP1 en este ensayo, también se muestran resultados de un vector AAV de control que expresa proteina fluorescente verde (GFP, por sus siglas en inglés) en lugar de REP1 (AAV-CAG-GFP) .

Los Western blots se muestran en los paneles derechos para GFP (panel superior) y alfa-tubulin (panel del fondo) como un control de carga. Carril 1: 40 pg de lisado celular de fibroblastos de tipo natural (TN) . Carril 2: 40 pg de lisado celular de fibroblastos Chm transducidos con vector AAV2.GFP (AAV-CAG-REPl). Los niveles altos de GFP mostrados confirman la eficiencia de este cásete de expresión del vector en células humanas transducidas que son deficientes de actividad REP1, como seria el caso en paciente con coroideremia .

La Figura 2 muestra una evaluación de actividad de prenilación en fibroblastos TN humanos (primera columna en la izquierda - linea gris) , fibroblastos Chm (segunda columna -gris oscuro) , fibroblastos Chm transducidos con vector AAV-CAG-GFP (tercera columna - blanco, control negativo) y fibroblastos Chm transducidos AAV-CAG-REP1 (cuarta columna -blanco) . El eje y muestra la cantidad de sustrato radioactivamente etiquetado [3H] sustrato GGPP transferido en pmol, que es una medición de la prenilación, la función de REP1. Las columnas muestran barras de error como desviaciones estándar (n=4 para cada columna). Los niveles de [3H]-GGPP se midieron en 10 mg de extracto de proteina. La cuarta columna cyan de la izquierda confirma que la función de prenilación también se restaura hasta niveles de tipo natural y más allá, después de la transducción con el vector AAV.REP1. Esto confirma que la proteina REP1 detectada por Western blot en la Figura 1 tiene la función predicha.

La Figura 3 muestra que el vector AAV tiene el tropismo correcto para células de la retina exterior ( fotoreceptores y coroide) después de la inyección subretinal en un modelo de ratón. El panel derecho muestra la expresión apropiada de un marcador de proteina fluorescente verde (GFP) (flechas) en los fotoreceptores de la capa nuclear exterior (ONL, por sus siglas en inglés) y epitelio de pigmento retinal (RPE, por sus siglas en inglés) después de la inyección subretinal del vector AAV2. CBA. GFP. WPRE. BGH en el ojo del ratón. El panel izquierdo muestra una escala en gris de la misma imagen. Esto confirma que las secuencias reguladoras AAV2. CBA. WPRE . BGH son capaces de expresión de transgenes altamente eficiente en las células retínales que necesitan dirigirse en pacientes con coroideremia .

La Figura 4 muestra que el vector AAV.REP1 no afecta adversamente la función retinal exterior a dosis altas en la retina de ratón. Se muestran los resultados de un estudio de toxicidad con medición de un electroretinograma (ERG) seis meses después de la inyección subretinal de 2 x 1 microlitros de dosis ya sea alta (n=5) o baja (n=4) del vector AAV.REP1 en el espacio subretinal de ratón. Dosis baja = 1 x 1011 y dosis alta = 1 x 1012 partículas de genoma (GP, por sus siglas en inglés) por mi (la dosis de partida para ensayos clínicos humanos es 1 x 1011 gp por mi) . El vector AAV.GFP tiene un cásete de expresión idéntico y también se diluye a la misma dosis antes de la inyección para actuar como un control. El eje Y muestra el residuo ERG en intensidades instantáneas incrementadas en el intervalo desde respuestas de barra escotópica (adaptada a la oscuridad) arriba del brillo hasta respuestas fotópicas debajo (que también incluirían fotoreceptores de cono) . Los residuos en todos los puntos muestran amplitudes ERG similares después de la exposición AAV.REP1 en dosis tanto alta como baja. En el grupo de dosis alta, las amplitudes GFP equivalentes se reducen ligeramente, en mantener con el efecto marginal conocido en la función retinal de GFP a niveles altos. Este efecto GFP también actúa como un control positivo para confirmar la sensibilidad de esta prueba .

Breve Descripción del Listado de Secuencias La SEQ ID NO: 1 es una secuencia de ADN para el genoma AAV2.

La SEQ ID NO: 2 es una secuencia de ADN que codifica la proteina Rep-1 humana, variante 1 del transcripto La SEQ ID NO: 3 es una secuencia de aminoácidos para la proteina Rep-1 humana, variante 1 del transcripto La SEQ ID NO: 4 es una secuencia de ADN que codifica la proteina Rep-1 humana, variante 1 del transcripto, que incluye una porción de la 5' UTR.

La SEQ ID NO: 5 es una secuencia de ADN para el elemento postregulador de la hepatitis de marmota ( PRE, por sus siglas en inglés) .

La SEQ ID NO: 6 es una secuencia de ADN para un promotor de beta actina de pollo (CBA, por sus siglas en inglés) .

La SEQ ID NO: 7 es una secuencia de ADN para un sitio de poliadenilación de la Hormona de Crecimiento de Bovino (bGH poliA) .

La SEQ ID NO: 8 es una secuencia de ADN para una repetición de terminal invertida 5' (ITR, por sus siglas en inglés) de AAV2.

La SEQ ID NO: 9 es una secuencia de ADN para una ITR 3' de AAV2.

Descripción Detallada de la Invención La invención actual proporciona una terapia para coroideremia . Esta se basa en un enfoque de terapia de genes para la enfermedad que utiliza un constructo genético para suministrar un transgen para restaurar la función REP1. El constructo genético es un vector con base en un genoma del virus asociado con adeno (AAV) que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica REP1 o una variante, del mismo. Esta secuencia de polinucleótido también se refiere en la presente como el "transgen". Los inventores actuales establecen un modelo para evaluar estrategias para tratamiento de coroideremia y demuestran sorprendentemente el uso de un vector de la invención para dirigir la disfunción celular que es el trasfondo de la enfermedad.

Vector Genoma AAV El vector de la invención comprende en primer lugar un genoma del virus asociado con adeno (AAV) o un derivado del mismo .

Un genoma AAV es una secuencia de polinucleótido que codifica funciones necesarias para la producción de una partícula vírica AAV. Estas funciones incluyen aquellas que operan en la replicación y ciclo de empaque para AAV en una célula hospedera, incluyendo encapsidación del genoma AAV en una partícula vírica AAV. Los virus AAV que se presentan naturalmente son deficientes en replicación y depende de la condición de funciones auxiliares en trans para completar la replicación y ciclo de empacado. En consecuencia, el genoma AAV del vector de la invención típicamente es deficiente en replicación .

El genoma AAV puede estar en forma de hebra sencilla, en sentido ya sea positivo o negativo, o alternativamente en forma de hebra doble. El uso de una forma de hebra doble permite la desviación de la etapa de replicación de ADN en la célula objetivo y de esta manera puede acelerar la expresión del transgen.

El genoma AAV puede ser de cualquier serotipo naturalmente derivado o aislado o Ciado de AAV. De esta manera, el genoma AAV puede ser el genoma completo de un virus AAV que se presenta naturalmente. Como se conoce por la persona experta, los virus AAV que se presentan en la naturaleza pueden clasificarse de acuerdo con varios sistemas biológicos .

Comúnmente, los virus AAV se refieren en términos de su serotipo. Un serotipo corresponde a una subespecie variante de AAV que debido a su perfil de expresión de antígenos de superficie de cápsida tienen una reactividad distintiva que puede usarse para distinguirse de otra subespecie variante. Típicamente, un virus que tiene un serotipo AAV particular no reacciona de manera cruzada eficientemente con anticuerpos neutralizantes específico para cualquier otro serotipo AAV. Los serotipos AAV incluyen AAV1, AAV2, AAV3 , AAV , AAV5, AAV6 , AAV7 , AAV8, AAV9 , AAV10 y AAV11, también serotipos recombinantes, tales como Rec2 y Rec3, recientemente identificados de cerebro de primate.

Un serotipo preferido de AAV para uso en la invención es AAV2. Un genoma AAV2 puede tener la secuencia de SEQ ID NO: 1. Otros serotipos de interés particular para uso en la invención incluyen AAV4 , AAV5 y AAV8 que transducen eficientemente tejido en el ojo, tal como el epitelio pigmentado retinal. El serotipo de AAV que se usa puede ser un serotipo AAV que no es AAV4. Las revisiones de serotipos AAV pueden encontrarse en Choi et al (Curr Gene Ther. 2005; 5(3); 299-310) y Wu et al {Molecular Therapy. 2006; 14(3), 316-327) . Las secuencias de genomas AAV o de elementos de genomas AAV incluyendo secuencias ITR, genes rep o cap para uso en la invención pueden derivarse de los siguientes números de acceso para secuencias de genoma entero AAV: Virus asociado con adeno 1 NC_002077, AF063497; Virus asociado con adeno 2 NC_001401; Virus asociado con adeno 3 NC_001729; Virus asociado con adeno 3B NC 001863; Virus asociado con adeno 4 NC_001829; Virus asociado con adeno 5 Y18065, AF085716; Virus asociado con adeno 6 NC_001862; AAV de ave ATCC VR-865 AY186198, AY629583, NC_004828; Cepa AAV de ave DA-1 NC_006263, AY629583; AAV de bovino NC_005889, AY388617.

Los virus AAV también pueden referirse en términos de ciados o clones. Esto se refiere a la relación filogenética de virus AAV derivados naturalmente, y típicamente a un grupo filogenético de virus AAV que pueden rastrearse de nuevo hasta un ancestro común, e incluye todos los descendientes del mismo. Adicionalmente , los virus AAV pueden referirse en términos de un aislado específico, es decir un aislado genético de un virus AAV específico encontrado en la naturaleza. El término aislado genético describe una población de virus AAV que experimenta mezclado genético limitado con otros virus AAV que se presentan naturalmente, por ello definiendo una población reconociblemente distinta en un nivel genético.

Los ejemplos de ciados y aislados de AAV que pueden usarse en la invención incluyen: Ciado A: AAV1 NC_002077, AF063497, AA 6 NC_001862, Hu . 48 AY530611, Hu 43 AY530606, Hu 44 AY530607, Hu 46 AY530609, Ciado B: Hu. 19 AY530584, Hu . 20 AY530586, Hu 23 AY530589, Hu22 AY530588, Hu24 AY530590, Hu21 AY530587, Hu27 AY530592, Hu28 AY530593, Hu 29 AY530594, Hu63 AY530624, Hu6 AY530625, Hul3 AY530578, Hu56 AY530618, Hu57 AY530619, Hu49 AY530612, Hu58 AY530620, Hu34 AY530598, Hu35 AY530599, AAV2 NC_001401, Hu45 AY530608, Hu47 AY530610, Hu51 AY530613, Hu52 AY530614, Hu T41 AY695378, Hu S17 AY695376, Hu T88 AY695375, Hu T71 AY695374, Hu T70 AY695373, Hu T40 AY695372, Hu T32 AY695371, Hu T17 AY695370, Hu LG15 AY695377, Ciado C: Hu9 AY530629, HulO AY530576, Hull AY530577, Hu53 AY530615, Hu55 AY530617, Hu54 AY530616, Hu7 AY530628, Hul8 AY530583, Hul5 AY530580, Hul6 AY530581, Hu25 AY530591, Hu60 AY530622, Ch5 AY243021, Hu3 AY530595, Huí AY530575, Hu4 AY530602 Hu2, AY530585, Hu61 AY530623, Ciado D: Rh62 AY530573, Rh48 AY530561, Rh54 AY530567, Rh55 AY530568, Cy2 AY243020, AAV7 AF513851, Rh35 AY243000, Rh37 AY242998, Rh36 AY242999, Cy6 AY243016, Cy4 AY243018, Cy3 AY243019, Cy5 AY243017, Rhl3 AY243013, Ciado E: Rh38 AY530558, Hu66 AY530626, Hu42 AY530605, Hu67 AY530627, Hu40 AY530603, Hu41 AY530604, Hu37 AY530600, Rh40 AY530559, Rh2 AY243007, Bbl AY243023, Bb2 AY243022, RhlO AY243015, Hul7 AY530582, Hu6 AY530621, Rh25 AY530557, Pi2 AY530554, Pil AY530553, Pi3 AY530555, Rh57 AY530569, Rh50 AY530563, Rh49 AY530562, Hu39 AY530601, Rh58 AY530570, Rh61 AY530572, Rh52 AY530565, Rh53 AY530566, Rh51 AY530564, Rh64 AY530574, Rh43 AY530560, AAV8 AF513852, Rh8 AY242997, Rhl AY530556, .

Ciado F: Hul4 (AAV9) AY530579, Hu31 AY530596, Hu32 AY530597, Clonal Isolate AAV5 Y18065, AF085716, AAV 3 NC_001729, AAV 3B NC_001863, AAV4 NC_001829, Rh34 AY243001, Rh33 AY243002, Rh32 AY243003/' La persona experta puede seleccionar un serotipo, ciado, clon o aislado de AAV apropiado para uso en la invención actual con base en su conocimiento general común. Por ejemplo, la cápsida AAV5 . ha mostrado que transduce fotoreceptores cono de primate eficientemente como se pone en evidencia por la corrección exitosa 'de un defecto de visión de color heredado (Mancuso et al., Nature 2009, 461:784-7).

Debe entenderse sin embargo que la invención también abarca el uso de un genoma AAV de otros serotipos que puede aún no haberse identificado o caracterizado. El serotipo AAV determina la especificidad del tejido de infección (o tropismo) de un virus AAV. En consecuencia, los serotipos AAV preferidos para uso en los virus AAV administrados a pacientes de acuerdo con la invención son aquellos que tienen tropismo natural para o una alta eficiencia de infección de células objetivo dentro de la retina degenerada en coroideremia . De esta manera, los serotipos AAV preferidos para uso en los virus AAV administrados a pacientes son aquellos que infectan células de la retina neurosensorial y epitelio del pigmento retinal.

Típicamente, el genoma AAV de un serotipo naturalmente derivado o aislado o Ciado de AAV comprende al menos una secuencia de repetición de terminal invertida (ITR, por sus siglas en inglés) . Una secuencia ITR actúa en cis para proporcionar un origen de replicación funcional, y permite la integración y remoción del vector a partir del genoma de una célula. En modalidades preferidas, una o más secuencias ITR flanquean la secuencia, de polinucleótido que codifica Rep-1 o una variante del mismo. Las secuencias ITR preferidas son aquellas de AAV2 , incluyendo aquellas de SEQ ID NOs 8 y 9 y variantes de las mismas. El genoma AAV típicamente también comprende genes de empacado, tal como genes rep y/o cap que codifican funciones de empacado para una partícula vírica AAV. El gen rep codifica una o más de las proteínas Rep78, Rep68, Rep52 y Rep40 o variantes de las mismas. El gen cap codifica una o más proteínas de cápsida tal como VP1, VP2 y VP3 o variantes de las mismas. Estas proteínas hacen a la cápsida una partícula vírica AAV. Las variantes de cápsida se discuten enseguida.

Se ligará operablemente un promotor a cada uno de los genes de empacado. Los ejemplos específicos de tales promotores incluyen los promotores p5, pl9 y p40 (Laughlin et al., 1979, PNAS, 76:5567-5571). Por ejemplo, los promotores p5 y pl9 se usan generalmente para expresar el gen rep, mientras que el promotor p40 se usa generalmente para expresar el gen cap.

Como se discute arriba, el genoma AAV usado en el vector de la invención puede ser por lo tanto el genoma completo de un virus AAV que se presenta naturalmente. Por ejemplo, un vector que comprende un genoma AAV completo puede usarse para preparar virus AAV in vitro. Sin embargo, aunque tal vector puede en principio administrarse a pacientes, este raramente se da en la práctica. Preferiblemente el genoma AAV se derivará para el propósito de administración a pacientes. Tal derivación es estándar en el campo y la invención actual abarca el uso de cualquier derivado conocido de un genoma AAV, y los derivados que pueden generarse al aplicar técnicas conocidas en el campo. La derivación del genoma AAV y de la cápsida AAV se revisan en Coura and Nardi [Virology Journal, 2007, 4:99), y en Choi et al y Wu et al, referenciados anteriormente .

Los derivados de un genoma AAV incluyen cualquiera de las formas truncadas o modificadas de un genoma AAV que permiten la expresión de un transgen Rep-1 a partir de un vector de la invención in vivo. Típicamente, es posible truncar el genoma AAV de manera importante para incluir la secuencia vírica mínima manteniendo aún la función anterior. Se prefiere por razones de seguridad reducir el riesgo de recombinación del vector con el virus de tipo natural, y también evitar disparar una respuesta inmunitaria celular por la presencia de proteínas de gen víricas en la célula obj etivo .

Típicamente, un derivado incluirá al menos una secuencia de repetición de terminal invertida (ITR), preferiblemente más de una ITR, tal como dos ITRs o más. Uno o más de las ITRs puede derivarse de genomas AAV que tienen serotipos diferentes, o pueden ser una ITR quimérica o mutante. La ITR mutante preferida es una que tiene una eliminación de un trs (sitio de resolución terminal) . Esta eliminación permite continuar la replicacion del genoma para generar un genoma de hebra sencilla que contiene secuencias tanto de codificación como complementarias, es decir, un genoma AAV auto-complementario. Esto permite la desviación de la replicacion de ADN en la célula objetivo, y de esta manera permite acelerar la expresión de trangen.

La una o más ITRs preferiblemente flanqueará la secuencia de polinucleótido que codifica REP1 o una variante del mismo en cualquier extremo. La inclusión de una o más ITRs se prefiere para ayudar a la formación del concatámero del vector de la invención en los núcleos de la célula hospedera, por ejemplo después de la conversión del ADN de vector de hebra sencilla en ADN de hebra doble por la acción de polimerasas de ADN de célula hospedera. La formación de tales concatámeros episomales protege el constructo vector durante la vida de la célula hospedera, permitiendo por ello la expresión prolongada del transgen in vivo.

En modalidades preferidas, los elementos ITR serán las únicas secuencias que se mantienen del genoma AAV nativo en el derivado. De esta manera, el derivado preferiblemente no incluirá los genes rep y/o cap del genoma nativo y cualquiera otra de las secuencias del genoma nativo. Esto se prefiere por las razones descritas arriba, y también para reducir la posibilidad de integración del vector en el genoma de célula hospedera. Adicionalmente , al reducir el tamaño del genoma AAV se permite incrementar la flexibilidad en la incorporación de otros elementos de secuencias (tal como elementos reguladores) dentro del vector además del transgen.

Con referencia al genoma AAV2 de la SEQ ID NO: 1, las siguientes porciones pueden por lo tanto removerse en un derivado de la invención: una secuencia de repetición de terminal invertida (ITR), la replicación (rep) y genes de cápsida (cap) (NB: el gen rep en el genoma AAV de tipo natural no deben confundirse con REP1, el gen humano afectado en la coroideremia ) . Sin embargo, en algunas modalidades, incluyendo modalidades in vítro, los derivados pueden adicionalmente incluir uno o más genes rep y/o cap u otras secuencias víricas de un genoma AAV. El virus AAV que se presenta naturalmente se integra con una frecuencia alta en un sitio específico sobre el cromosoma humano 19, y muestra una frecuencia insignificante de integración aleatoria, de manera que la retención de una capacidad integrativa en el vector puede tolerarse en un ajuste terapéutico.

Donde un genoma derivado comprende genes que codifican proteínas de cápsida esto es VP1, VP2 y/o VP3, el derivado puede ser un derivado quimérico, de transposición o modificado por cápsida de uno o más virus AAV que se presentan naturalmente. En particular, la invención abarca la provisión de secuencias de proteína de cápsida de diferentes serotipos, ciados, clones, o aislados de AAV dentro del mismo vector esto es pseudotipificado .

Los derivados quiméricos, de transposición o modificados por cápsida típicamente se seleccionarán para proporcionar una o más funcionalidades para el vector vírico. De esta manera, estos derivados pueden exhibir eficiencia incrementada del . suministro de gen, inmunogenicidad disminuida (humoral o celular) , un intervalo de tropismo alterado y/o direccionamiento mejorado de un tipo celular particular comparado con un vector vírico AAV que comprende un genoma AAV que se presenta naturalmente, tal como aquel de AAV2. La eficiencia incrementada del suministro de gen puede efectuarse por enlace del co-receptor o receptor mejorado en la superficie celular, internalización mejorada, tráfico mejorado dentro de la célula y dentro del núcleo, sin recubrimiento mejorado de la partícula vírica y conversión mejorada de un genoma de hebra sencilla para la forma de hebra doble. La eficiencia incrementada también puede referirse a un intervalo de tropismo alterado o direccionamiento de una población celular específica, de manera que la dosis del vector no se diluye por la administración a los artículos donde no se necesita.

Las proteínas de cápsida quiméricas incluyen aquellas generadas por recombinación entre dos o más secuencias de codificación de cápsida de serotipos AAV que se presentan naturalmente. Esto puede realizarse por ejemplo por un enfoque de rescate marcador en el cual las secuencias de cápsida no infecciosas de un serotipo se cotransfectan con secuencias de cápsida de un serotipo diferente, y se usa selección dirigida para seleccionar secuencias de cápsida que tienen propiedades deseadas. Las secuencias de cápsida de los diferentes serotipos pueden alterarse por recombinación homologa dentro de la célula para producir proteínas de cápsida quiméricas novedosas.

Las proteínas de cápsida quiméricas también incluyen aquellas generadas por ingeniería de secuencias de proteína de cápsida para transferir dominios de proteína de cápsida específicos, bucles de superficie o residuos de aminoácido específicos entre dos o más proteínas de cápsida, por ejemplo entre dos o más proteínas de cápsida de diferentes serotipos.

Las proteínas de cápsida de transposición o quiméricas también pueden generarse por transposición de ADN o por PCR propenso a error. Los genes de cápsida AAV híbridos pueden crearse al fragmentar aleatoriamente las secuencias de genes AAV relacionados por ejemplo aquellos que codifican proteínas de cápsida de múltiples serotipos diferentes y luego posteriormente volver a ensamblar los fragmentos en una reacción de polimerasa auto-cebado, que también puede provocar cruces en regiones de la homología de secuencia. Una colección de genes AAV híbridos creados de esta forma al transponer los genes de cápsida de varios serotipos pueden seleccionarse para identificar clones víricos que tienen una funcionalidad deseada. Similarmente, el PCR propenso a erros puede usarse para mutar aleatoriamente genes de cápsida AAV para crear una colección diversa de variantes que luego pueden seleccionarse para una propiedad deseada.

Las secuencias de los genes de cápsida también pueden modificarse genéticamente para introducir eliminaciones, sustituciones o inserciones específicas con respecto a la secuencia de tipo natural nativa. En particular, los genes de cápsida pueden modificarse por la inserción de una secuencia de un pépLido o proteína no relacionada dentro de una estructura de lectura abierta de una secuencia de codificación de cápsida, o en la N-terminal y/o C-terminal de una secuencia de codificación de cápsida.

El péptído o proteína no relacionada puede ventajosamente ser una que actúa como un ligando para un tipo celular particular, por ello confiere enlace mejorado para una célula objetivo o mejora la especificidad de direccionamiento del vector a una. población celular particular. Un ejemplo puede incluir el uso de péptido RGD para bloquear la reabsorción en el epitelio de pigmento retinal y por ello aumentar la transducción de tejidos retínales que lo rodean (Cronin et al., 2008 ARVO resumen: D1048) . La proteína no relacionada también puede ser una que ayuda a la purificación de la partícula vírica como parte del proceso de producción esto es un epítopo o etiqueta de afinidad. El sitio de inserción típicamente se seleccionará ya que no interfiere con otras funciones de la partícula vírica por ejemplo internalización, tráfico de la partícula vírica. La persona experimentada puede identificar sitios adecuados para inserción con base en su conocimiento general común. Los sitios particulares se describen en Choi et al, referenciado arriba.

La invención adicionalmente abarca la provisión de secuencias de un genoma AAV en una configuración y orden diferente a aquellas de un genoma AAV nativo. La invención también abarca el reemplazo de uno o más genes o secuencias AAV con secuencias de otro virus o con genes quiméricos compuestos de secuencias de más de un virus. Tales genes quiméricos pueden estar compuestos de secuencias de dos o más proteínas víricas relacionadas de diferentes especies víricas .

' El vector de la invención toma la forma de una secuencia de polinucleotido que comprende un genoma AAV o derivado del mismo y una secuencia que codifica REP1 o una variante del mismo.

Para evitar dudas, la invención también proporciona una partícula vírica AAV que comprende un vector de la invención. Las partículas AAV de la invención incluyen formas transcapsidadas en donde un genoma AAV o derivado que tiene un ITR de un serotipo se empaca en la cápsida de un serotipo diferente. Las partículas AAV de la . invención también incluyen formas en mosaico en donde una mezcla de proteínas de cápsida no modificadas de dos o más serotipos diferentes hace la envoltura vírica. La partícula AAV también incluye formas químicamente modificadas que portan ligandos adsorbidos a la superficie de cápsida. Por ejemplo, tales ligandos pueden incluir anticuerpos para direccionar un receptor de superficie celular particular.

La invención proporciona adicionalmente una célula hospedera que comprende un vector o partícula vírica AAV de la invención.

REP1 El vector de la invención comprende además una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido REP1 o una variante del mismo. La secuencia cADN humana para REP1 (o proteína-1 acompañante Rab, también conocida como componente A de geranilgeraniltransferasa de proteína Rab) se muestra en la SEQ ID NO: 2 y codifica la proteína mostrada en la SEQ ID NO: 3. Una secuencia de cADN adicional para REP1 se muestra en la SEQ ID NO: 4.

Un polipéptido REP1 o variante del mismo es cualquier polipéptido que ayuda en la prenilación de una proteina Rab GTPasa. La capacidad de un polipéptido REP1 o variante del mismo para ayudar en la prenilación de una proteina Rab GTPasa puede determinarse rutinariamente por una persona experimentada en el arte. Una secuencia de polinucleótido que codifica una variante de REP1 es cualquier secuencia que codifica una proteina que ayuda en la actividad de prenilación para una Rab-1 GTPasa. Preferiblemente la secuencia codifica una proteina que ayuda al proporcionar actividad de prenilación similar o superior para Rab-1 GTPasa comparada con el polipéptido de la SEQ ID NO: 3.

Más preferiblemente, la secuencia de polinucleótido codifica la SEQ ID NO: 3 o una variante del mismo, y es una variante de la secuencia de polinucleótido de la SEQ ID NO: 2. Una variante de la SEQ ID NO: 2 o 3 puede comprender truncaciones, mutantes u homólogos de los mismos, y cualquiera de las variantes del transcripto de los mismos que codifican un polipéptido REP funcional.

Cualquiera de los homólogos mencionados en la presente son típicamente al menos 70% homólogos a una región relevante de la SEQ ID NO: 2 o 3. Un homólogo específico es el polipéptido REP2, que es 75% homólogo a REP1, y puede compensarse funcionalmente para la deficiencia REP1.

La homología puede medirse usando métodos conocidos. Por ejemplo el paquete UWGCG proporciona el programa BESTFIT que puede usarse para calcular la homología (por ejemplo usarse en sus ajuste por omisión) (Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, 387-395) . Los algoritmos PILEUP y BLAST pueden usarse para calcular la homología o secuencias en línea (típicamente sobre sus ajuste por omisión), por ejemplo como se describe en Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul, S, F et al (1990) J Mol Biol 215:403-10. El software para realizar análisis BLAST está disponible públicamente a través del Centro Nacional para Información de Biotecnología (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) .

En modalidades preferidas, una secuencia variante puede codificar un polipéptido que es al menos 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% y más preferiblemente al menos 95%, 97% o 99% homólogo a una región relevante de la SEQ ID NO: 3 sobre al menos 20, preferiblemente al menos 30, por ejemplo al menos 40, 60, 100, 200, 300, 400 o más aminoácidos contiguos, o aún sobre la secuencia completa de la variante. La región relevante será una que se proporciona para actividad funcional de REP1 al ayudar en la actividad de prenilación para una Rab-1 GTPasa.

Alternativamente, y preferiblemente, la secuencia variante puede codificar un polipéptido que tiene al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90% y más preferiblemente al menos 95%, 97% o 99% homólogo a la SEQ ID NO: 3 de longitud completa sobre su secuencia completa. Típicamente la secuencia variante difiere de la región relevante de la SEQ ID NO: 3 por al menos, o menos de, 2, 5, 10, 20, 40, 50 o 60 mutaciones (cada una de las cuales pueden ser sustituciones, inserciones o eliminaciones) .

Un polipéptido Rep-1 variante puede tener una identidad de porcentaje con una región particular de la SEQ ID NO: 3 que es la misma como cualquiera de los valores de homología de porcentaje específico (esto es puede tener al menos 70%, 80% o 90% y más preferiblemente al menos 95%, 97% o 99% de identidad) a través de cualquiera de las longitudes de secuencia mencionadas arriba.

Las variantes de la SEQ ID NO: 3 también incluyen truncaciones . Cualquier truncación puede usarse siempre que la variante todavía sea capaz de prenilar un polipéptido del sustrato Rab-1 GTPasa. Las truncaciones típicamente se harán para remover secuencias que no son esenciales para la actividad de prenilacion y/o no afectan la conformación de la proteína plegada, en particular plegado del sitio activo. Las truncaciones apropiadas pueden identificarse rutinariamente por truncación sistemática de secuencias de longitud variada de la N-terminal o C-terminal . Las truncaciones preferidas son N-terminal y pueden remover todas las otras secuencias excepto para el dominio catalítico.

Las variantes de la SEQ ID NO: 3 incluyen además mutantes que tienen una o más, por ejemplo, 2, 3, 4, 5 hasta 10, 10 hasta 20, 20 hasta 40 o más, inserciones, sustituciones o eliminaciones de aminoácido con respecto a una región particular de la SEQ ID NO: 3. Las eliminaciones e inserciones se hacen preferiblemente dentro del dominio catalítico como se describe a continuación. Las sustituciones también típicamente se hacen en regiones que no son esenciales para actividad de proteasa y/o no afectan la conformación de la proteína plegada.

Las sustituciones preferiblemente introducen uno o más cambios conservados, que reemplazan aminoácidos con otros aminoácidos de estructura química similar, propiedades químicas similares o volumen de cadena lateral similar. Los aminoácidos introducidos pueden tener polaridad, hidrofilicidad, alcalinidad, acidez, neutralidad o carga similar para los aminoácidos que reemplazan. Alternativamente, el cambio conservado puede introducir otro aminoácido que es aromático o alifático en el lugar de un aminoácido alifático o aromático pre-existente . Los- cambios de aminoácido conservados son bien conocidos en el arte y pueden seleccionarse de acuerdo con las propiedades de los 20 aminoácidos principales como se define en la Tabla A enseguida.

De manera similar, las variantes preferidas de la secuencia de polinucleótido de la SEQ ID NO: 2 incluyen polinucleótidos que tienen al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90% y más preferiblemente al menos 95%, 97% o 99% homologas a una región relevante de la SEQ ID NO: 2. Preferiblemente la variante exhibe estos niveles de homología para SEQ ID NO: 2 de longitud completa sobre su secuencia completa.

Tabla A - Propiedades químicas de los aminoácidos Secuencias reguladoras y promotoras El vector de la invención también incluye elementos para permitir la expresión del transgen REP1 in vitro o in vivo. De esta manera, el vector típicamente comprende una secuencia promotora ligada operativamente a la secuencia de polinucleótido que codifica Rep-1 o una variante del mismo.

Puede usarse cualquier promotor adecuado. La secuencia promotora puede activarse ' constitutivamente esto es operacional en cualquier antecedente de célula hospedera, o alternativamente puede activarse únicamente en un ambiente de célula hospedera específico, de esta manera para permitir la expresión direccionada del transgen en un tipo de célula particular. El promotor puede mostrar expresión inducible en respuesta a la presencia de otro factor, por ejemplo un factor presente en una célula hospedera. En cualquier caso, donde se administra el vector para terapia, el promotor debe ser funcional en un antecedente de célula retinal.

En algunas modalidades, se prefiere que el promotor muestre expresión especifica de la célula retinal con objeto de permitir al transgen únicamente expresarse en poblaciones con célula retinal. De esta manera, la expresión del promotor puede ser especifico de la célula retinal, por ejemplo confinado únicamente a células de la retina neurosensorial y epitelio del pigmento retinal.

Los promotores preferidos para el transgen Rep-1 incluyen el promotor beta-actina de pollo (CBA, por sus siglas en inglés), opcionalmente en combinación con un elemento aumentador de citomegalovirus (C E) . Un promotor particularmente preferido es un promotor CBA/CAG híbrido, por ejemplo el promotor usado en el cásete de expresión rAVE (GeneDetect.com). Un promotor preferido adicional se muestra en la SEQ ID NO: 6. Los ejemplos de promotores con base en secuencias humanas que inducirán la expresión del gen específico de la retina incluyen rodospin cinasa para barras y conos (Allocca et al., 2007, J Virol 81:11372-80), PR2.1 para conos únicamente (Mancuso et al. 2009, Nature) y/o RPE65 para el epitelio de pigmento retinal (Bainbridge et al., 2008, N Eng J Med) .

El vector de la invención también puede comprender una o más secuencias reguladoras adicionales que pueden actuar pre o post-transcripcionalmente . La secuencia reguladora puede ser parte de la ubicación del gen REPl nativo o puede ser una secuencia reguladora heteróloga. El vector de la invención puede comprender porciones del 5'UTR o 3'UTR del transcripto REP1 nativo. Por ejemplo, el polinucleótido de la SEQ ID NO: 4 incluye alguna de la secuencia 5'UTR del transcripto REP1 nativo.

Las secuencias reguladoras son cualquiera de ¦ las secuencias que facilitan la expresión del transgen esto es actúa para incrementar la expresión de un transcripto, mejora la exportación nuclear de mARN o aumenta su estabilidad. Tales secuencias reguladoras incluyen por ejemplo elementos aumentadores , elementos post-reguladoras y sitios de poliadenilación . Un sitio de poliadenilación preferido es la señal poly-A de la Hormona del Crecimiento Bovino que puede ser como se muestra en la SEQ ID NO: 7. En el contexto del vector de la invención tales secuencias reguladoras serán de acción cis. Sin embargo, la invención también abarca el uso de secuencias reguladoras de acción trans ubicadas en los constructos genéticos adicionales.

Un elemento post-regulador preferido para uso en un vector de la invención es el elemento post-regulador de la hepatitis de marmota (WPRE) o una variante del mismo. La secuencia del WPRE se proporciona en la SEQ ID NO: 5. La invención abarca el uso de cualquier secuencia variante del WPRE que incrementa la expresión del transgen REP1 comparado con un vector sin un WPRE. Preferiblemente, las secuencias variantes exhiben al menos 70% de homología con la SEQ ID NO: 5 sobre su secuencia completa, más preferiblemente 75%, 80%, 85%, 90% y' más preferiblemente al menos 95%, 97% o 99% de homología con la SEQ ID NO: 5 sobre su secuencia completa. Otra secuencia reguladora que puede usarse en un vector de la invención actual es una región de unión de andamio (SAR, por sus siglas en inglés) . Las secuencias reguladoras adicionales pueden seleccionarse por la persona experimentada sobre la base de su conocimiento general común.

Preparación del vector El vector de la invención puede prepararse por medios estándares conocidos en el arte para suministro de vectores para terapia de genes. De esta manera, la transfección del dominio público, métodos de empacado y purificación bien establecidos pueden usarse para preparar una preparación del vector adecuado.

Como se discute arriba, un vector de la invención puede comprender el genoma completo de un virus AAV que se presenta naturalmente además de una secuencia de polinucleótido que codifica REP1 o una variante del mismo. Sin embargo, comúnmente se usará un genoma derivado, por ejemplo un derivado que tiene al menos una secuencia de repetición de terminal invertida (ITR), pero que puede carecer de cualquiera de los genes AAV tales como rep o cap.

En tales modalidades, con objeto de proporcionar el ensamble del genoma derivado dentro de una partícula vírica AAV, los constructos genéticos adicionales que proporcionan funciones del virus auxiliar y/o AAV se proporcionarán en una célula hospedera en combinación con el genoma derivado. Estos constructos adicionales típicamente contendrán genes que codifican proteínas de cápsida AAV estructural esto es cap, VP1, VP2, VP3, y genes que codifican otras funciones requeridas para el ciclo de vida AAV, tales como rep. La selección de proteínas de cápsida estructurales proporcionadas en el constructo adicional determinará el serotipo del vector vírico empacado.

Un vector vírico empacado particularmente preferido para uso en la invención comprende un genoma derivado de AAV2 en combinación con proteínas de cápsida AAV5 o AAV8. Este vector vírico empacado típicamente comprende uno o más AAV2 ITRs opcionalmente como se muestra en la SEQ ID NO: 8 y/o 9, o variantes del mismo.

Como se menciona arriba, los virus AAV son replicación incompetente y así ayudan a las funciones del virus, preferiblemente . el adenovirus ayuda a la funciones típicamente también serán proporcionadas en uno o más constructos adicionales para permitir la replicación AAV.

Todos de los constructos adicionales de arriba pueden proporcionarse como plásmidos u otros elementos episomático en la célula hospedera, o alternativamente uno o más constructos pueden integrarse dentro del genoma de la célula hospedera .

En estos aspectos, la invención proporciona un método para la producción de un vector de la invención. El método comprende proporcionar un vector que comprende un genoma del virus asociado con adeno (AAV) o un derivado del mismo y una secuencia de polinucleótido que codifica REPl o una variante del mismo en una célula hospedera, y proporcionar medios para la replicación y ensamble del vector dentro de una partícula vírica AAV. Preferiblemente, el método comprende proporcionar un vector que comprende un derivado de un genoma AAV y una secuencia de polinucleótido que codifica REPl o una variante del mismo, junto con uno o más constructos genéticos adicionales que codifican el AAV y/o ayudan a las funciones del virus. Típicamente, el derivado de un genoma AAV comprende al menos un ITR. Opcionalmente, el método comprende además una etapa para purificar las partículas víricas ensambladas. Adicionalmente, el método puede comprender una etapa para formular las partículas víricas para uso terapéutico.

Métodos de terapia y usos médicos Como se discute arriba, los presentes inventores han demostrado sorpresivamente que un vector de la invención puede usarse para direccionar la disfunción celular subyacente a> la coroideremia . En particular, se ha mostrado que el uso del vector puede corregir el defecto de prenilación asociado con coroideremia . Esto proporciona un medio por ello el proceso degenerativo de la enfermedad puede tratarse, detenerse, mitigarse o prevenirse.

La invención por lo tanto proporciona un método para tratar o prevenir coroideremia en un paciente que necesita del mismo, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un vector de la invención al paciente por inyección retinal, subretinal o intravitrea directa. En consecuencia, la coroideremia por ello se trata o previene en el paciente.

En un aspecto relacionado, la invención proporciona el uso de un vector de la invención en un método para tratar o prevenir coroideremia al administrar el vector a un paciente por inyección retinal, subretinal o intravitrea directa. Adicionalmente, la invención proporciona el uso de un vector de la invención en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir coroideremia por inyección retinal, subretinal o intravitrea directa.

En todas estas modalidades, el vector de la invención puede administrarse con objeto de prevenir el comienzo de uno o más síntomas de coroideremia. El paciente puede ser asintomático . El sujeto puede tener una predisposición para la enfermedad. El método o uso puede comprender una etapa para identificar sí o no un sujeto está en riesgo de desarrollar, o tiene, coroideremia . Una cantidad profilácticamente efectiva del vector se administra a tal sujeto. Una cantidad profilácticamente efectiva es una cantidad que previene el comienzo de uno o más síntomas de la enfermedad.

Alternativamente, el vector puede administrarse una vez que los síntomas de la enfermedad han aparecido en un sujeto esto es para curar síntomas existentes de la enfermedad. Una cantidad terapéuticamente efectiva del antagonista se administra a tal sujeto. Una cantidad terapéuticamente efectiva es una cantidad la cual es efectiva para mejorar uno o más síntomas de la enfermedad. Típicamente, tal cantidad incrementa el nivel de prenilación de Rab GTPasas en el ojo. Esto puede confirmarse como se describe a continuación. Tal cantidad también puede detener, disminuir o invertir alguna pérdida de visión periférica asociada con coroideremia. Tal cantidad también puede detener, disminuir o invertir el comienzo de ceguera nocturna.

El sujeto puede ser del sexo masculino o femenino. Los sujetos del sexo masculino muestran síntomas más severos, ya que la coroideremia es una enfermedad ligada a X, pero los sujetos del sexo femenino también exhiben síntomas de la enfermedad y ocasionalmente tienen un fenotipo severo. El sujeto se identifica preferiblemente como que está en riesgo de, o que tiene, la enfermedad. La retina puede mostrar la apariencia característica inicialmente de la reducción del coroide y el progreso a la exposición de la esclera subyacente en los parches. Puede existir pérdida de amplitud del electroretinogramo periférico. En muchos casos puede existir una historia familiar de coroideremia . Usualmente, pero no siempre, una mutación puede identificarse en el REP1 ubicado en el cromosoma X.

La administración del vector es típicamente por inyección retinal o subretinal directa. Esto incluye suministro directo a las células de la retina neurosensorial y epitelio del pigmento retinal, tales como células epiteliales o fotoreceptoras . El suministro se hace típicamente de manera directa a o subretinalmente a la retina degenerada en un paciente con coroideremia. El vector puede transducir las células objetivo de arriba sin dejar entrar ninguna de otras poblaciones celulares. La inyección intravítrea también puede usarse para suministrar el vector de la invención. El suministro no puede ser subretinal o no puede ser por inyección subretinal. El suministro no- puede ser transvítreo.

La dosis de un vector de la invención puede determinarse de acuerdo con varios parámetros, especialmente de acuerdo con la edad, peso y afección del paciente a tratarse; la ruta de administración; y el régimen requerido. De nuevo, un médico será capaz de determinar la ruta requerida de administración y dosificación para cualquier paciente particular .

Una dosis sencilla típica está entre 1010 y 1012 partículas del genoma, dependiendo de la cantidad de tejido retinal restante que requiera transducción . Una partícula del genoma se define en la presente como una cápsida AAV que contiene una molécula de ADN de hebra sencilla que puede cuantificarse con un método específico de secuencia (tal como PCR en tiempo real). Tal dosis puede proporcionarse como una dosis sencilla, pero puede repetirse para el ojo contralateral o en casos donde el vector no ha podido dirigir la región correcta de la retina por cualquier razón (tal como complicación quirúrgica) . El tratamiento es preferiblemente un tratamiento permanente sencillo para cada ojo, pero inyecciones repetidas, por ejemplo pueden considerarse en años futuros y/o con serotipos AAV diferentes.

La invención también proporciona un método para vigilar el tratamiento o prevención de coroideremia en un paciente que comprende medir la actividad de prenilación ex vivo en células retínales obtenidas del paciente después de la administración del vector AAV de la invención por inyección retinal, subretinal o intravítrea directa. Esto método permite la determinación de la eficacia del tratamiento.

Composiciones farmacéuticas El vector de la invención puede formularse dentro de las composiciones farmacéuticas. < Estas composiciones pueden comprender, además del vector, una solución amortiguadora, portador, excipiente farmacéuticamente aceptable, estabilizador u otros materiales bien conocidos para aquellos experimentados en el arte. Tales materiales deben ser no tóxicos y deben no interferir con la eficacia del ingrediente activo. La naturaleza precisa del portador u otro material puede determinarse por la persona experimentada de acuerdo con la ruta de administración, ésto es aquí inyección retinal, subretinal o intravitrea directa.

La composición farmacéutica está típicamente en forma líquida. Las composiciones farmacéuticas líquidas generalmente incluyen un portador líquido tal como agua, petróleo, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintético. Pueden incluirse la solución salina fisiológica, cloruro de magnesio, dextrosa u otra solución de sacarina o glicoles tales como etilen glicol, propilen glicol o polietilen glicol. En algunos casos, puede usarse un tensoactivo, tal como ácido plurónico (PF68) 0.001%.

Para inyección en el sitio de aflicción, el ingrediente activo estará en la forma de una solución acuosa que está libre de pirógeno ' y tiene pH adecuado, isotonicidad y estabilidad. Aquellos de experiencia relevante en el arte son muy capaces de preparar soluciones adecuadas usando, por ejemplo, vehículos isotónicos tales como Inyección de Cloruro de Sodio, Inyección de Ringer, Inyección de Ringer Lactada. Los conservadores, estabilizadores, soluciones amortiguadoras, antioxidantes y/u otros aditivos puede incluirse, como se requiera .

Para liberación retardada, el vector puede incluirse en una composición farmacéutica que se formula para liberación lenta, tal como en microcápsulas formadas de polímeros biocompatibles o en sistemas portadores liposomales de acuerdo con métodos conocidos en el arte.

Ejemplos Los Ejemplos actuales describen un modelo para probar estrategias terapéuticas para coroideremia y corrección del fenotipo de la enfermedad. Los constructosi genéticos, que consisten de un promotor, el cADN REP1, y elementos reguladores 3' , cuando se empacan en un vector vírico recombinante, se muestran para transducir eficientemente las células objetivo dentro de la retina degenerada.

Ejemplo 1 Clonación de cADN REP1 humano, y generación del cásete de expresión CBA-REP-l-WPRE, construcción de pAAV-CBA-REP-l-WPRE-bGHpA y empacado de virus AAV REP-1.

Un cADN de REP1 humano se aisló de una colección de cADN humana usando amplificación PCR y cebadores homólogos a la secuencia REP1 conocida. El cADN aislado se procesó por secuencia y mostró para ser homólogo a la Variante 1 trasladada conocida de la secuencia mARN REP1 como se deposita en el Genbank, Número de Acceso NM_000390. El cADN tiene la secuencia de SEQ ID NO: 4.

Este cADN se insertó en un plásmido cis pAAV, nombrado pAM. El pAM es un plásmido de número de copia alto derivado originalmente de pBR322, pero incluye repeticiones de terminal invertidas izquierda y derecha AAV-2 estabilizadas que flanquean el cásete de expresión de elección. Para el vector AAV-REP1, se usó un promotor CBA/CAG modificado (beta-actina de pollo con potenciador CMV) para conducir la expresión de REP1 y una secuencia WPRE modificada y bGH polyA se proporcionaron 3' al cADN. Este plásmido se nombró pAAV2-CBA-hREP-l- PRE-bGH, (pAAV-REP-1) .

Se usó pAAV-REP-1 para generar AAV-Rep-1 recombinante usando métodos de purificación y empacado de transfección triple, de dominio público y bien establecidos. Las reservas del vector generadas usando este método varían en titulación genómica, pero más comúnmente las reservas obtenidas después de la purificación fueron 1012-1013 gp/ml (gp = partículas de genoma - ver arriba) . Las reservas se diluyeron posteriormente para uso in vivo como se describe a continuación.

Ejemplo 2 Expresión de REP1 del vector en células de coroideremia humana (Chm) La expresión de REP1 del vector AAV2 REP1 se evaluó en fibroblastos de coroideremia humana (Chm) . Estas células de fibroblasto se obtuvieron con consentimiento ético de una biopsia de piel tomada de un paciente con coroideremia. La expresión de GFP de un vector de control sirve como un control. Como un preludio para el trabajo con células humanas, la expresión también se confirmó después de la inyección subretinal del vector AAV.REP1 en ratones por Western blot, ya que la sonda del anticuerpo reconoce las formas humanas pero no de ratón de la proteina REPl.

Los resultados se muestran en la Figura 1. No se detectó REPl por inmutransferencia con un anticuerpo anti-hREPl en fibroblastos Chm no transducidos (carril 2) , mientras que REPl se detecta en fibroblastos normales (TN = tipo natural humano) (carril 1) . Después de la transducción con el vector AAV2.REP1, en dosis iguales de 40 g de Usado y dilución hasta 5 pg puede apreciarse que el nivel de hREPl expresado por el vector AAV2. REPl en células Chm es aproximadamente diez veces mayor (carriles 3-6) que los niveles en células de tipo natural (carril 1) . No se observaron efectos tóxicos en el crecimiento celular con este grado de sobre-expresión.

Ejemplo 3 Corrección de defecto de prenilacion por el vector en células Chm Los ratones con coroideremia no tienen un fenotipo de degeneración retinal de la misma forma como los pacientes humanos así no es posible realizar una evaluación directa de rescate retinal usando un enfoque de terapia de genes. Por esta razón, la corrección del fenotipo de la enfermedad se evalúo en. células Chm humanas in vitro.

Se muestran los resultados en la Figura 2. La transducción con el AAV2.REP1 muestra una corrección del defecto de prenilación apreciado en células Chm, elevando la actividad de prenilación a significativamente mayor que los niveles normales después del tratamiento de 2 x 105 células con 1.5 x 1010 partículas del genoma vírico de AAV2.REP1. Esto confirma que el vector AAV2.REP1 expresa la proteína REP1 funcional en células humanas afectadas por coroideraemia .

En más detalle, la actividad de prenilación normal en fibroblastos de tipo natural (TN) proporciona aproximadamente 0.32 pmol de [3H]-GGPP; en fibroblastos de coroideremia (Chm) que se reduce hasta 0.19 pmol. Como se espera la actividad de prenilación no se cambió después de la transducción de los fibroblastos Chm con el vector de control AAV.GFP. Después de la transducción con el vector AAV2.REP1, sin embargo, la actividad de prenilación incrementa significativamente para proporcionar 0.42 pmol de [3H]-GGPP (n=4, p<0.01).

Ejemplo 4 Expresión in vivo objetivo del gen reportero del vector en ratones Para confirmar la actividad ubicua del promotor CBA y las secuencias regulador en el vector AAV2, el gen que codifica REP1 se reemplazó con un gen reportero que codifica la proteina fluorescente verde (GFP) para crear AAV2.CBA.GFP.WPRE.BGH (AAV2.GFP). Se seleccionó GFP para evaluar la expresión in vivo, ya que aunque es fácil de identificar en Western blots, la proteina REP1 humana no se detecta fácilmente por inmunohistoquimica indirecta sobre secciones retínales.

El constructo AAV2. GFP se inyectó en el espacio subretinal de ratón y la expresión de GFP se vigiló por microscopía. Los resultados se muestran en la Figura 3, que confirman que el vector tiene el tropismo predicho para tanto las retina neurosensorial como el epitelio de pigmento retinal. 'Esto confirma la secuencia de cápsida y los elementos reguladores llevan a niveles altos de expresión del gen en fotoreceptores y el epitelio de pigmento retinal.

Ejemplo 5 Estudio de toxicidad Se inyectaron dosis del vector AAV2.REP1 dentro del espacio subretinal de ratones de tipo natural (n=9) con objeto de determinar cualquiera de los efectos tóxicos posibles en la función retinal en las dosis muy altas. Hemos probado las concentraciones del vector en ratones (1 x 1011 y 1 x 10 gp por mi) que fueron una unidad log mayor que las concentraciones bajas y altas propuestas a usarse en los pacientes (10 y 10 gp por mi).

Se muestran los resultados en la Figura . No se detectaron efectos tóxicos en el electroretinograma (ERG) seis meses después de la inyección subretinal con ya sea la dosis alta (n=5) o baja (n=4) del vector AAV.REP1. Para controlar cualquier de los efectos no específicos de cirugía retinal o el vector AAV2 , el ojo contralateral tiene una inyección subretinal muy similar y titulación de AAV2.GFP.

En la dosis AAV2.GFP más alta hubo una reducción leve en la amplitud ERG, la cual refleja un efecto tóxico conocido leve usando la dosis máxima del vector que expresa GFP con este promotor fuerte, y confirma la sensibilidad de esta prueba al detectar un efecto relacionado con la dosis. Sin embargo no hubo reducción ERG detectable en ojos tratados con AAV2.REP1 en cualquier dosis que sugiere que la sobre-expresión REP1 en la retina fue menos tóxica que GFP.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (15)

REIVI DICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un vector, caracterizado porque comprende un genoma de virus asociado con adeno (AAV) o un derivado del mismo y una secuencia . de polinucleótido que codifica REP1 o una variante del mismo.

2. El vector de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el derivado es un derivado quimérico, derivado modificado por cápsida o de transposición.

3. El vector de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el genoma AAV es de un serotipo naturalmente derivado o aislado o ciado de AAV.

4. El vector de conformidad con la .reivindicación 3, caracterizado porque el serotipo es serotipo 2 de AAV (AAV2) .

5. El vector de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque comprende SEQ ID NO: 1 o un derivado del mismo .

6. El vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la secuencia de polinucleótido codifica un polipéptido que tiene al menos 70% de homología a la SEQ ID NO: 3 sobre su secuencia completa.

7. El vector de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la secuencia de polinucleótido tiene al menos 70% de homología a la SEQ ID NO: 2 sobre su secuencia completa .

8. El vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque comprende una secuencia promotora ligada operativamente a la secuencia de polinucleótido que codifica REPl o una variante del mismo.

9. El vector de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el promotor está activo constitutivamente.

10. El vector de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la expresión del. promotor es específica de célula retinal.

11. El vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque comprende una o más secuencias reguladoras adicionales.

12. El vector de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque comprende una secuencia que tiene al menos 70% de homología a la SEQ ID NO: 5 sobre su secuencia completa.

13. Un método para tratar o prevenir coroideremia en un paciente que necesita del mismo, caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, al paciente por inyección retinal, subretinal o intravitrea directa, y por ello tratar o prevenir coroideremia en el paciente.

14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el vector se administra directamente dentro del espacio subretinal.

15. El vector de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 a 12, para usarse en un método para tratar o prevenir coroideremia al administrar el vector a un paciente por inyección retinal, subretinal o intravítrea directa.