BR112013021318B1

BR112013021318B1 - Vetor e usos de um vetor

Info

Publication number: BR112013021318B1
Application number: BR112013021318-3A
Authority: BR
Inventors: Robert Maclaren; Matthew John During; Miguel Seabra
Original assignee: Isis Innovation Limited
Priority date: 2011-02-22
Filing date: 2012-02-21
Publication date: 2021-12-07
Also published as: US20230332176A1; KR20140044793A; US20210032656A1; WO2012114090A1; KR102299430B1; US20180135078A1; AU2012220404B2; MX356525B; US20140107185A1; BR112013021318A2; EP2678435B2; PL2678435T3; DK2678435T3; KR102139203B1; JP2017221192A; MX2013009604A; HK1258917A1; KR20210112407A; CN103562396A; US9834788B2

Abstract

vetor e método de tratar ou prevenir coroideremia em um paciente com necessidade do mesmo a presente invenção refere-se a terapia gênica para tratamento ou prevenção de coroideremia.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a terapia gênica para tratamento ou prevenção de coroideremia.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Coroideremia é uma degeneração progressiva ligada ao X rara da coroide, epitélio pigmentar da retina e fotorreceptores do olho. A história natural típica em homens afligidos tem início de cegueira noturna durante a adolescência, e, em seguida, perda progressiva da visão periférica durante os 20 e 30 anos levando à cegueira completa aos 40 anos. Portadoras femininas têm sintomas moderados mais notavelmente cegueira noturna, mas podem ocasionalmente ter um fenótipo mais grave.

[003] A doença é causada por mutações no gene REP1, (proteína acompanhante de Rab 1), que está localizado na região 21q do cromossomo X. Na maioria das células no corpo, a proteína REP2, que é 75% homóloga a REP1, compensa a deficiência de REP1. No olho, no entanto, por razões que ainda não são claras, REP2 é incapaz de compensar a deficiência de REP1. Então, no olho, a atividade polipeptídica de REP é insuficiente para manter prenilação normal das proteínas alvo (Rab GTPases) levando à disfunção celular e morte final, afetando principalmente a retina externa e a coroide.

[004] Não há nenhum tratamento para coroideremia, e existe uma falta de modelos para avaliar estratégias terapêuticas. Existe uma necessidade de provisão dessa terapia.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[005] A presente invenção refere-se a um vetor que pode ser usado para terapia gênica de coroideremia, e métodos de prevenir ou tratar essa doença com o uso de do vetor. A invenção também se refere ao uso do vetor em métodos de prevenção ou tratamento de coroideremia.

[006] O vetor da invenção é um vetor viral, especificamente baseado no genoma do vírus adeno-associado (AAV). O vetor compreende uma sequência que codifica REP1 ou uma variante da mesma, permitindo assim a expressão de função de REP1 em uma célula alvo. Os métodos e usos da invenção especificamente envolvem a administração do vetor a um paciente por injeção direta retiniana, sub-retiniana ou intravítrea para tratar ou prevenir coroideremia.

[007] Consequentemente, a invenção fornece um vetor que compreende um genoma do vírus adeno-associado (AAV) ou um derivado do mesmo e uma sequência de polinucleotídeos que codifica REP1 ou uma variante da mesma. A invenção ainda fornece um método de tratar ou prevenir coroideremia em um paciente com necessidade do mesmo, que compreende administração de uma quantidade terapeuticamente efetiva de um vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores ao dito paciente por injeção direta retiniana, sub-retiniana ou intravítrea, e através disso tratar ou prevenir coroideremia no dito paciente. A invenção adicionalmente fornece um vetor da invenção para uso em um método de tratar ou prevenir coroideremia por administração do dito vetor a um paciente por injeção direta retiniana, sub- retiniana ou intravítrea.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[008] A Figura 1 mostra que o vetor AAV.REP1 (AAV-CAG- REP1) pode transduzir fibroblastos humanos isolados a partir de um paciente com coroideremia (Chm) de forma eficiente. Os níveis relativos de expressão de proteína REP1 humana (hREP1) são comparados por Western blot, permitindo quantificação de atividade do vetor AAV2.REP1 por comparação da quantidade de hREP1 em diferentes concentrações de lisado celular. Em relação à marcação, CAG é a Actina beta de Frango com sequência promotora enhancer CMV - de forma intercambiável citado como ‘CBA’ em várias publicações e partes deste documento.

[009] Os Western blots são mostrados nos painéis da esquerda para REP1 (painel superior) e alfa-tubulina (painel inferior) como um controle de carregamento. Coluna 1: 40 μg de lisado celular de fibroblastos tipo selvagem (WT) de controle. Pista 2: 40 μg de lisado celular de fibroblastos Chm. Colunas 3 a 6: 40, 20, 10 e 5μg de lisado celular de fibroblastos Chm transduzidos com vetor AAV2.REP1. Coluna 7: proteína recombinante REP1 humana. Uma vez que os 5 μg de banda de hREP1 lisada tem uma densidade semelhante a 40 μg do lisado de fibroblasto WT, o nível de hREP1 alcançado com o vetor AAV2.REP1 pode alcançar pelo menos 8 vezes (40/5) os níveis tipo selvagem normais mediante essas condições.

[010] Como um controle positivo para o promotor e outras sequências não-REP1 nesse ensaio, os resultados de um vetor de AAV de controle que expressa a proteína fluorescente verde (GFP) no lugar de REP1 (AAV-CAG-GFP), também são mostrados.

[011] Os Western blots são mostrados nos painéis da direita para GFP (painel superior) e alfa-tubulina (painel inferior) como um controle de carregamento. Coluna 1:40 μg de lisado celular de fibroblastos tipo selvagem (WT). Coluna 2: 40 μg de lisado celular de fibroblastos Chm transduzidos com vetor AAV2.GFP (AAV-CAG-REP1). Os altos níveis de GFP mostrados confirmam a eficiência desse cassete de expressão do vetor em transdução de células humanas que são deficientes de atividade REP1, como seria o caso em pacientes com coroideremia.

[012] A Figura 2 mostra uma avaliação da atividade de prenilação em fibroblastos humanos WT (primeira coluna à esquerda - cinza claro), fibroblastos Chm (segunda coluna - cinza escuro), fibroblastos Chm transduzidos com vetor AAV-CAG-GFP (terceira coluna - branca, controle negativo) e fibroblastos Chm transduzidos com AAV-CAG-REP1 (quarta coluna - branca). O eixo y mostra a quantidade de substrato GGPP [3H] marcado radioativamente transferido em pmol, que é uma medida de prenilação, à função de REP1. As colunas mostram barras de erro como desvios padrão (n=4 para cada coluna). Os níveis de [3H]-GGPP foram medidos em 10 mg de extrato de proteína. A quarta coluna da esquerda de ciano confirma que a função da prenilação também é restaurado a níveis tipo selvagem e depois, após transdução com o vetor AAV.REP1. Isso confirma que a proteína REP1 detectada por Western blot na Figura 1 tem a função prevista.

[013] A Figura 3 mostra que o vetor de AAV tem o tropismo correto para células da retina externa (fotorreceptores e coroide) após injeção sub-retiniana em um modelo de camundongo. O painel da direita mostra a expressão apropriada de um marcador (setas) de proteína fluorescente verde (GFP) nos fotorreceptores da camada nuclear externa (ONL) e epitélio pigmentar da retina (EPR), após injeção sub-retiniana do vetor AAV2.CBA.GFP.WPRE.BGH no olho do camundongo. O painel da esquerda mostra tons de cinza da mesma imagem. Isso confirma que as sequências reguladoras AAV2.CBA.WPRE.BGH são capazes de expressão do transgene altamente eficiente nas células da retina que precisam ser direcionadas em pacientes com coroideremia.

[014] A Figura 4 mostra que o vetor AAV.REP1 não afeta contrariamente a função da retina externa em altas doses na retina do camundongo. São mostrados os resultados de um estudo de toxicidade com medição de um eletrorretinograma (ERG), seis meses após a injeção sub- retiniana de 2 x 1 microlitro tanto de dose alta (n=5) como baixa (n=4) de vetor AAV.REP1 no espaço sub-retiniano do camundongo. Dose baixa = 1 x 1011 e dose alta = 1 x 1012 de partículas de genoma (gp) por mL (a dose inicial para ensaios clínicos humanos é 1 x 1011 gp por mL). O vetor AAV.GFP tem um cassete de expressão idêntico e também é diluído para a mesma dose de antes da injeção, para atuar como um controle. O eixo Y mostra o traço ERG em aumento de intensidade de brilho que varia de respostas de haste escotópica (adaptada ao escuro) acima para claro para respostas fotópicas abaixo (que também incluem cones fotorreceptores). Os traços em todos os pontos mostram amplitudes ERG semelhantes, tanto após exposição a dose de AAV.REP1 alta como baixa. No grupo de dose alta as amplitudes GFP equivalentes são ligeiramente reduzidas, de acordo com o efeito marginal conhecido sobre a função da retina de GFP em níveis altos. Esse efeito GFP também atua como um controle positivo para confirmar a sensibilidade desse teste.

DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIAS

[015] SEQ ID NO: 1 é uma sequência de DNA para o genoma de AAV2.

[016] SEQ ID NO: 2 é uma sequência de DNA que codifica a proteína Rep-1 humana, transcrito variante 1.

[017] SEQ ID NO: 3 é uma sequência de aminoácidos para a proteína Rep-1 humana, transcrito variante 1.

[018] SEQ ID NO: 4 é uma sequência de DNA que codifica a proteína Rep-1 humana, transcrito variante 1, que inclui uma porção da 5’UTR.

[019] SEQ ID NO: 5 é uma sequência de DNA para o elemento pós-regulador de hepatite da marmota (WPRE).

[020] SEQ ID NO: 6 é uma sequência de DNA para um promotor beta actina de frango (CBA).

[021] SEQ ID NO: 7 é uma sequência de DNA para um local de poliadenilação de Hormônio de Crescimento Bovino (bGH poliA).

[022] SEQ ID NO: 8 é uma sequência de DNA para uma repetição terminal 5’ invertida (ITR) de AAV2.

[023] SEQ ID NO: 9 é uma sequência de DNA para uma 3’ITR de AAV2.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[024] A presente invenção fornece uma terapia para a coroideremia, a qual baseia-se em uma abordagem de terapia gênica com o uso de um constructo genético que fornece um transgene que restabeleça a função de REP1. O constructo genético é um vetor baseado no genoma do vírus adeno-associado (AVV), que compreende uma sequência de polinucleotídeo que codifica REP1 ou uma variante da mesma. Essa sequência de polinucleotídeo também é chamada no presente pedido como “transgene”. Os presentes inventores estabeleceram um modelo para a avaliação das estratégias para o tratamento da coroideremia e, de forma surpreendente, demonstraram o uso de um vetor da invenção para direcionar a disfunção celular subjacente à doença. VETOR GENOMA DE AAV

[025] O vetor da invenção compreende, em primeiro lugar, um genoma do vírus adeno-associado (AAV) ou um derivado do mesmo.

[026] Um genoma de AAV é uma sequência que codifica funções necessárias à produção de uma partícula viral de AAV. Essas funções incluem aquelas que operam no ciclo de replicação e empacotamento para AAV em uma célula hospedeira, incluindo encapsulação do genoma de AAV em uma partícula viral de AAV. Os vírus AAV que ocorrem naturalmente são deficientes na replicação e dependem do provimento de funções de auxiliares em trans para a conclusão de um ciclo de replicação e empacotamento. Consequentemente, o genoma de AAV do vetor da invenção é tipicamente deficiente na replicação.

[027] O genoma de AAV pode estar na forma fita simples, tanto sense positivo como negativo ou, alternativamente, na forma fita dupla. O uso de uma forma fita dupla permite evitar a etapa de replicação do DNA na célula alvo e, dessa forma, pode acelerar a expressão do transgene.

[028] O genoma de AAV pode ser de um sorotipo derivado naturalmente, isolado ou clado de AAV. Dessa forma, o genoma de AAV pode ser o genoma inteiro de um vírus AAV que ocorre naturalmente. Como um técnico no assunto sabe, os vírus AAV que ocorrem naturalmente podem ser classificados de acordo com os vários sistemas biológicos.

[029] Geralmente, os vírus AAV são chamados em termos de seus sorotipos. Um sorotipo corresponde a um subespécie de variantes de AAV, que devido a seu perfil de expressão dos antígenos de superfície do capsídeo tem uma reatividade distinta, que pode ser usada para diferenciá-lo de outras subespécies de variantes. Tipicamente, um vírus com um sorotipo de AAV específico não possui reatividade cruzada com anticorpos neutralizadores específicos para qualquer outro sorotipo de AAV. Os sorotipos de AAV incluem AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 e AAV11, também sorotipos recombinantes, como Rec2 e Rec3, recentemente identificados no cérebro de primatas.

[030] Um sorotipo preferencial de AAV para uso na invenção é o AAV2. Um genoma de AAV2 pode ter a sequência de SEQ ID NO: 1. Outros sorotipos específicos de interesse para uso na invenção incluem AAV4, AAV5 e AAV8, que transduzem eficientemente o tecido do olho, como o epitélio pigmentar da retina. O sorotipo de AAV que é usado pode ser um sorotipo de AAV que não é o AAV4. Revisões dos sorotipos de AAV podem ser encontradas em Choi et al. (Curr Gene Ther. 2005; 5(3); 299-310) e Wu et al. (Molecular Therapy. 2006; 14(3), 316-327). As sequências dos genomas de AAV ou dos elementos dos genomas de AAV incluem sequências ITR, os genes rep e cap para uso na invenção podem ser derivados dos números de acesso a seguir para as sequências genômicas inteiras de AAV: vírus adeno- associado 1 NC_002077, AF063497; vírus adeno-associado 2 NC_001401; vírus adeno-associado 3 NC_001729; vírus adeno-associado 3B NC_001863; vírus adeno-associado 4 NC_001829; vírus adeno-associado 5 Y18065, AF085716; vírus adeno-associado 6 NC_001862; AAV aviária ATCC VR-865 AY186198, AY629583, NC_004828; linhagem de AAV aviária DA-1 NC_006263, AY629583; AAV bovino NC_005889, AY388617.

[031] Os vírus AAV também podem ser referidos em termos de clados ou clones, que referem-se ao relacionamento filogenético de vírus AAV naturalmente derivados e, tipicamente, a um grupo filogenético de vírus AAV que pode ser rastreado a um ancestral comum e inclui todos os descendentes do mesmo. Adicionalmente, os vírus AAV podem ser referidos em termos de um isolado específico, isto é, um isolado genético descreve uma população de um vírus AAV específico encontrado na natureza. O termo isolado genético descreve uma população de vírus AAV que foi submetida à mistura genética limitada com outros vírus AAV que ocorrem naturalmente, através disso definindo uma população distinta reconhecível em um nível genético.

[032] Os exemplos de clados e isolados de AAV que podem ser usados na invenção incluem: Clado A: AAV1 NC_002077, AF063497, AAV6 NC_001862, Hu48 AY530611, Hu43 AY530606, Hu44 AY530607, Hu46 AY530609; Clado B: Hu19 AY530584, Hu20 AY530586, Hu23 AY530589, Hu22 AY530588, Hu24 AY530590, Hu21 AY530587, Hu27 AY530592, Hu28 AY530593, Hu29 AY530594, Hu63 AY530624, Hu64 AY530625, Hu13 AY530578, Hu56 AY530618, Hu57 AY530619, Hu49 AY530612, Hu58 AY530620, Hu34 AY530598, Hu35 AY530599, AAV2 NC_001401, Hu45 AY530608, Hu47 AY530610, Hu51 AY530613, Hu52 AY530614, Hu T41 AY695378, Hu S17 AY695376, Hu T88 AY695375, Hu T71 AY695374, Hu T70 AY695373, Hu T40 AY695372, Hu T32 AY695371, Hu T17 AY695370, Hu LG15 AY695377; Clado C: Hu9 AY530629, Hu10 AY530576, Hu11 AY530577, Hu53 AY530615, Hu55 AY530617, Hu54 AY530616, Hu7 AY530628, Hu18 AY530583, Hu15 AY530580, Hu16 AY530581, Hu25 AY530591, Hu60 AY530622, Ch5 AY243021, Hu3 AY530595, Hu1 AY530575, Hu4 AY530602 Hu2, AY530585, Hu61 AY530623; Clado D: Rh62 AY530573, Rh48 AY530561, Rh54 AY530567, Rh55 AY530568, Cy2 AY243020, AAV7 AF513851, Rh35 AY243000, Rh37 AY242998, Rh36 AY242999, Cy6 AY243016, Cy4 AY243018, Cy3 AY243019, Cy5 AY243017, Rh13 AY243013; Clado E: Rh38 AY530558, Hu66 AY530626, Hu42 AY530605, Hu67 AY530627, Hu40 AY530603, Hu41 AY530604, Hu37 AY530600, Rh40 AY530559, Rh2 AY243007, Bb1 AY243023, Bb2 AY243022, Rh10 AY243015, Hu17 AY530582, Hu6 AY530621, Rh25 AY530557, Pi2 AY530554, Pi1 AY530553, Pi3 AY530555, Rh57 AY530569, Rh50 AY530563, Rh49 AY530562, Hu39 AY530601, Rh58 AY530570, Rh61 AY530572, Rh52 AY530565, Rh53 AY530566, Rh51 AY530564, Rh64 AY530574, Rh43 AY530560, AAV8 AF513852, Rh8 AY242997, Rh1 AY530556; Clado F: Hu14 (AAV9) AY530579, Hu31 AY530596, Hu32 AY530597, isolado clonal AAV5 Y18065, AF085716, AAV 3 NC_001729, AAV 3B NC_001863, AAV4 NC_001829, Rh34 AY243001, Rh33 AY243002, Rh32 AY243003.

[033] Um técnico no assunto pode selecionar um sorotipo, clado, clone ou isolado de AAV adequado para uso na presente invenção com base em seu conhecimento geral comum. Por exemplo, mostrou-se que o capsídeo de AAV5 transduz eficientemente os fotorreceptores cones de primatas, como evidenciado pela correção bem sucedida de um defeito herdado de visão de cores (Mancuso et al., Nature 2009, 461:784-7).

[034] Deve-se entender, no entanto, que a invenção também engloba o uso de um genoma de AAV de outros sorotipos, que podem não terem sido ainda identificados ou caracterizados. O sorotipo de AAV determina a especificidade do tecido da infecção (ou tropismo) de um vírus AAV. Consequentemente, os sorotipos de AAV preferenciais para uso na administração do vírus AAV em pacientes, de acordo com a invenção, são aqueles que têm tropismo natural pelas células alvo ou uma eficiência alta de infecção na retina em regeneração com coroideremia. Dessa forma, os sorotipos de AAV para uso na administração em pacientes são aqueles que infectam as células da retina neurosensorial e o epitélio pigmentar da retina.

[035] Tipicamente, o genoma de AAV de um sorotipo naturalmente derivado ou isolado ou clado de AAV compreende, pelo menos, uma sequência repetida terminal (ITR). Uma sequência ITR age em cis para fornecer uma origem funcional de replicação, e permite a integração e excisão do vetor do genoma de uma célula. Em realizações preferenciais, uma ou mais sequências ITR estão adjacentes à sequência de polinucleotídeo que codifica Rep-1 ou uma variante da mesma. As sequências ITR preferenciais são aquelas de AAV2, incluindo aquelas de SEQ ID NO: 8 e 9, e variantes das mesmas. O genoma de AAV também compreende tipicamente genes de empacotamento, como os genes rep e/ou cap, que codificam funções de empacotamento para a partícula viral de AAV. O gene rep codifica uma ou mais das proteínas Rep78, Rep68, Rep52 e Rep40 ou variantes das mesmas. O gene cap codifica uma ou mais proteínas do capsídeo, como VP1, VP2 e VP3 ou variantes das mesmas. Essas proteínas produzem o capsídeo de uma partícula viral de AAV. As variantes do capsídeo são discutidas abaixo.

[036] Um promotor será ligado de maneira operacional a cada um dos genes de empacotamento. Exemplos específicos desses promotores incluem os promotores de p5, p19 e p40 (Laughlin et al., 1979, PNAS, 76:55675571). Por exemplo, os promotores de p5 e p19 são geralmente usados para expressar o gene rep, enquanto o promotor de p40 é geralmente usado para expressar o gene cap.

[037] Como discutido acima, o genoma de AAV usado no vetor da invenção pode, portanto, ser o genoma inteiro de um vírus AAV que ocorre naturalmente. Por exemplo, um vetor que compreende um genoma inteiro de AAV in vitro. No entanto, enquanto esse vetor pode em princípio ser administrado em pacientes, isso será raramente feito na prática. Preferencialmente, o genoma de AAV será derivado para a administração em pacientes. Essa derivação é padrão na técnica e a presente invenção engloba o uso de qualquer derivado conhecido de um genoma de AAV, e os derivados que poderiam ser gerados pela aplicação de técnicas conhecidas no assunto. A derivação do genoma do AAV e o capsídeo de AAV são revisados em Coura e Nardi (Virology Journal, 2007, 4:99) e em Choi et al. e Wu et al. referenciados acima.

[038] Os derivados de um genoma de AAV incluem qualquer forma truncada ou modificada de um genoma de AAV que permite a expressão de um transgene Rep-1 a partir de um vetor da invenção in vivo. Tipicamente, é possível truncar significativamente o genoma de AAV para incluir uma sequência viral mínima, ainda mantendo a função acima. Isso é desejável por razões de segurança, para reduzir o risco de recombinação do vetor com vírus do tipo selvagem, e também para evitar o acionamento de uma resposta imune celular pela presença de proteínas dos genes virais na célula alvo.

[039] Tipicamente, um derivado incluirá, pelo menos, uma sequência repetida terminal invertida (ITR), preferencialmente mais de uma ITR, como por exemplo duas ITRs ou mais. Uma ou mais ITRs podem ser derivadas dos genomas de AAV de diferentes sorotipos, ou podem ser uma ITR quimérica ou mutante. Uma ITR mutante preferencial é aquela que tem uma deleção de uma trs (sítio de resolução terminal). Essa deleção permite a replicação continuada do genoma para gerar um genoma de fita simples que contém tanto a sequência codificadora como a complementar, isto é, um genoma de AAV auto-complementar. Isso permite evitar a replicação do DNA na célula alvo e, dessa forma, permite a expressão acelerada do transgene.

[040] A sequência ou as sequências ITRs são preferencialmente adjacentes à sequência do polinucleotídeo que codifica REP1 ou uma variante da mesma, em ambas as extremidades. A inclusão de uma ou mais ITRs é preferível para auxiliar a formação do concatâmero do vetor da invenção no núcleo de uma célula hospedeira, por exemplo, após a conversão do DNA fita simples do vetor em DNA fita dupla pela ação das DNA polimerases da célula hospedeira. A formação desses concatâmeros epissomais protege o constructo vetorial durante a vida da célula hospedeira e, através disso, permite a expressão prolongada do transgene in vivo.

[041] Em realizações preferenciais, os elementos ITR serão as únicas sequências retidas no derivado do genoma de AAV nativo. Dessa forma, um derivado, preferencialmente, não incluirá os genes rep e/ou cap do genoma nativo e quaisquer outras sequências do genoma nativo. Isso é preferível pelas razões descritas acima, e também para reduzir a possibilidade de integração do vetor ao genoma da célula hospedeira. Adicionalmente, a redução do tamanho do genoma de AAV permite flexibilidade aumentada na incorporação de outros elementos da sequência (como elementos reguladores) dentro do vetor além do transgene.

[042] Com referência ao genoma de AAV2 de SEQ ID NO: 1, as porções a seguir poderiam, portanto, ser removidas em um derivado da invenção: uma sequência repetida terminal invertida (ITR), os genes de replicação (rep) e de capsídeo (cap) (NB: o gene rep no genoma de AAV do tipo selvagem não deve ser confundido com REP1, o gene humano afetado na coroideremia). No entanto, em algumas realizações, incluindo realizações in vivo, os derivados podem incluir adicionalmente um ou mais genes rep e/ou cap ou outras sequências virais do genoma de AAV. Vírus AAV que ocorrem naturalmente integram-se, com uma alta frequência, a um sítio específico no cromossomo humano 19, e mostra uma frequência desprezível de integração aleatória, de modo que a retenção de uma capacidade integradora no vetor pode ser tolerada em uma configuração terapêutica.

[043] Onde um genoma derivado compreende genes que codificam proteínas de capsídeo, isto é, VP1, VP2 e/ou VP3, o derivado pode ser um derivado quimérico, misturado ou capsídeo modificado de um ou mais vírus AAV que ocorrem naturalmente. Em particular, a invenção engloba o provimento de sequências de proteínas de capsídeo de diferentes sorotipos, clados, clones ou isolados de AAV dentro do mesmo vetor, isto é, a pseudotipagem.

[044] Derivados quiméricos, misturados ou capsídeo modificados serão tipicamente selecionados para fornecer uma ou mais funcionalidades desejadas ao vetor viral. Dessa forma, esses derivados podem apresentar eficiência aumentada no fornecimento de gene, imunogenicidade reduzida (humoral ou celular), uma faixa de tropismo alterado e/ou direcionamento melhorado a um tipo celular específico em comparação a um vetor viral de AAV que compreende um genoma de AAV que ocorre naturalmente, como aquele de AAV2. A eficiência aumentada no fornecimento do gene pode ser realizada pela ligação melhorada do receptor ou coreceptor na superfície celular, internalização melhorada, tráfego melhorado dentro da célula ou do núcleo, descobrimento melhorado da partícula viral e conversão melhorada de um genoma fita simples em fita dupla. A eficiência aumentada também pode estar relacionada a uma faixa de tropismo alterada ou ao direcionamento de uma população celular específica, de modo que a dose do vetor não é diluída pela administração aos tecidos onde ele não é necessário.

[045] As proteínas quiméricas de capsídeo incluem aquelas geradas pela recombinação entre duas ou mais sequências codifcadoras de sorotipos de AAV que ocorrem naturalmente. Isso pode ser realizado, por exemplo, por uma abordagem de resgate ao marcador, na qual as sequências de capsídeo não infeccioso de um sorotipo são cotransfectadas junto a sequências de capsídeo de um sorotipo diferente, e a seleção direcionada é usada para selecionar sequências de capsídeo que tenham propriedades desejadas. As sequências de capsídeos de diferentes sorotipos podem ser alteradas pela recombinação homóloga dentro das células para produzir novas proteínas quiméricas de capsídeo.

[046] As proteínas quiméricas de capsídeo também incluem aquelas geradas pela elaboração genética de sequências de proteínas de capsídeo para transferir domínios específicos de proteínas de capsídeo, alças de superfície ou resíduos de aminoácidos específicos entre duas ou mais proteínas de capsídeo, por exemplo, entre duas ou mais proteínas de capsídeo de diferentes sorotipos.

[047] As proteínas de capsídeo misturadas ou quiméricas também podem ser geradas pelo embaralhamento do DNA ou pelo PCR propenso a erros. Os genes de capsídeo de AAV híbrido podem ser criados pela fragmentação aleatória das sequências de genes de AAV relacionados, por exemplo, aquelas que codificam proteínas de capsídeo de múltiplos sorotipos diferentes e, então, posterior reagrupação dos fragmentos em uma reação polimerase de auto-priming, que também pode causar intersecções em regiões de homologia de sequência. Uma biblioteca de genes de AAV híbrido criados pelo embaralhamento dos genes de capsídeo de vários sorotipos podem ser triados para identificar clones virais que têm uma funcionalidade desejada. De forma similar, o PCR propenso a erros pode ser usado para mutar aleatoriamente os genes de capsídeo de AAV para criar uma biblioteca diversa de variantes, as quais podem então ser selecionadas para uma propriedade desejada.

[048] As sequências dos genes de capsídeo também podem ser geneticamente modificadas para introduzir deleções, substituições ou inserções específicas na sequência nativa do tipo selvagem. Em particular, os genes de capsídeo podem ser modificados pela inserção de uma sequência de uma proteína ou peptídeos não relacionados dentro de um quadro aberto de leitura de uma sequência codificadora de capsídeo, ou no N e/ou C-terminal da sequência codificadora de capsídeo.

[049] A proteína ou peptídeo não relacionado podem, de forma vantajosa, ser um que age como um ligante de um tipo celular específico e, através disso, confere ligação melhorada a uma célula alvo ou melhora a especificidade de direcionamento do vetor a uma população celular específica. Um exemplo pode incluir o uso do peptídeo RGD para bloquear a captação no epitélio pigmentar da retina e, através disso, aprimorar a transdução nos tecidos retinais adjacentes (Cronin et al., 2008 ARVO Resumo: D1048). A proteína não relacionada também pode ser uma que auxilia na purificação da partícula viral como parte do processo de produção, isto é, um epítopo ou marcador de afinidade. O sítio de inserção será tipicamente selecionado de modo a não interferir com outras funções da partícula viral, por exemplo, internalização, tráfego da partícula viral. Um técnico no assunto pode identificar os sítios adequados para inserção com base no seu conhecimento geral comum. Sítios específicos são divulgados em Choi et al., referenciado acima.

[050] A invenção, adicionalmente, engloba o provimento de sequências de um genoma de AAV em uma ordem e configuração diferentes daquelas do genoma de AAV nativo. A invenção também engloba a substituição de uma ou mais sequências ou genes de AAV com sequências de outros vírus ou com genes quiméricos compostos de sequências de mais de um vírus. Esses genes quiméricos podem ser compostos por sequências de duas ou mais proteínas virais relacionadas de diferentes espécies virais.

[051] O vetor da invenção assume a forma de uma sequência de polinucleotídeos que compreende um genoma de AAV ou derivado do mesmo, e uma sequência que codifica REP1 ou uma variante da mesma.

[052] Para evitar dúvidas, a invenção também fornece uma partícula viral de AAV que compreende um vetor da invenção. As partículas de AAV da invenção incluem formas transencapsidadas, nas quais um genoma de AAV ou derivado que tenha um ITR de um sorotipo é empacotado no capsídeo de um sorotipo diferente. As partículas de AAV da invenção também incluem formas mosaicas, nas quais uma mistura de proteínas de capsídeo não modificadas de dois ou mais sorotipos diferentes produz o envelope viral. A partícula de AAV também inclui formas quimicamente modificadas que carregam ligantes adsorvidos à superfície do capsídeo. Por exemplo, alguns ligantes podem incluir anticorpos para o direcionamento a um receptor de específico de superfície celular.

[053] A invenção fornece adicionalmente uma célula hospedeira que compreende um vetor ou partícula viral de AAV da invenção. REP1

[054] O vetor da invenção ainda compreende uma sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo REP1 ou uma variante do mesmo. A sequência de cDNA humano para REP1 (ou proteína-1 acompanhante de Rab, também conhecida como componente A da proteína Rab geranilgeranil transferase) é mostrada na SEQ ID NO: 2 e codifica a proteína mostrada na SEQ ID NO: 3. Uma sequência de cDNA adicional para REP1 é mostrada em SEQ ID NO: 4.

[055] Um polipeptídeo REP1 ou variante do mesmo é um polipeptídeo que auxilia na prenilação de uma proteína GTPase Rab. A capacidade de um polipeptídeo REP1 ou variante do mesmo em auxiliar a prenilação de uma proteína GTPase Rab pode ser, rotineiramente, determinada por um técnico no assunto. Uma sequência de polinucleotídeo codificadora de uma variante de REP1 é qualquer sequência que codifica uma proteína que auxilia a atividade de prenilação para uma GTPase Rab-1. Preferencialmente, a sequência codifica uma proteína que auxilia no fornecimento de uma atividade de prenilação similar ou mais alta para a GTPase Rab-1 em comparação ao polipeptídeo de SEQ ID NO: 3.

[056] Com mais preferência, a sequência de polinucleotídeo codifica SEQ ID NO: 3 ou uma variante do mesmo, e é uma variante da sequência de polinucleotídeo de SEQ ID NO: 2. Uma variante de SEQ ID NO: 2 ou 3 pode compreender truncações, mutantes ou homólogos do mesmo, e quaisquer variantes do transcrito do mesmo que codifica um polipeptídeo REP funcional.

[057] Quaisquer homólogos mencionados no presente pedido são tipicamente, pelo menos, 70% homólogos a uma região relevante de SEQ ID NO: 2 ou 3. Um homólogo específico é o polipeptídeo REP2, que é 75% homólogo a REP1, e pode compensar funcionalmente a deficiência de REP1.

[058] A homologia pode ser medida com o uso de métodos conhecidos. Por exemplo, o Pacote UWGCG fornece o programa BESTFIT, que pode ser usado para calcular a homologia (usado, por exemplo, em sua configuração padrão) (Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, 387395). Os algoritmos PILEUP e BLAST podem ser usados para calcular a homologia ou alinhar as sequências (tipicamente em suas configurações padrões), por exemplo como descrito em Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul, S, F et al (1990) J Mol Biol 215:403-10. O programa de computação para a realização das análises com BLAST está disponível publicamente através do Centro Nacional para Informação em Biotecnologia (National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

[059] Em realizações preferenciais, uma sequência variante pode codificar um polipeptídeo que é, pelo menos, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% e, com mais preferência, pelo menos 95%, 97% ou 99% homólogo a uma região relevante de SEQ ID NO: 3, ao longo de pelo menos 20, preferencialmente pelo menos 30, por exemplo, pelo menos 40, 60, 100, 200, 300, 400 ou mais aminoácidos contíguos, ou ainda ao longo da sequência inteira da variante. A região relevante será aquela que fornece atividade funcional de REP1 no auxílio da atividade de prenilação para uma GTPase Rab-1.

[060] Alternativamente, e preferencialmente, a sequência variante pode codificar um polipeptídeo que seja, pelo menos, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% e, com mais preferência, pelo menos 95%, 97% or 99% homólogo à SEQ ID NO: 3 completa ao longo de sua sequência inteira. Tipicamente, a sequência variante difere da região relevante da SEQ ID NO: 3 em pelo menos ou menos do que 2, 5, 10, 20, 40, 50 ou 60 mutações (cada uma delas pode ser substituições, inserções ou deleções).

[061] Um polipeptídeo Rep-1 variante pode ter uma porcentagem de identidade com uma região específica de SEQ ID NO: 3 que é a mesma de quaisquer valores de porcentagem de homologia específicos (isto é, pode ter pelo menos 70%, 80% ou 90% e, com mais preferência, de pelo menos 95%, 97% ou 99% de identidade) ao longo de quaisquer comprimentos de sequência mencionados acima.

[062] Variantes de SEQ ID NO: 3 também incluem truncações. Qualquer truncação pode ser usada contanto que a variante ainda seja capaz de prenilar um polipeptídeo substrato de GTPase Rab-1. As truncações serão tipicamente realizadas para remover sequências que não são essenciais para a atividade de prenilação e/ou não afetam a conformação da proteína dobrada, em particular, o dobramento do sítio ativo. Truncações adequadas podem ser rotineiramente identificadas pela truncação sistemática de sequências de comprimento variável do N ou C-terminal. Truncações preferenciais são N- terminais e podem remover todas as outras sequências, exceto o domínio catalítico.

[063] As variantes de SEQ ID NO: 3 ainda incluem mutantes que tenham uma ou mais, por exemplo, 2, 3, 4, 5 a 10, 10 a 20, 20 a 40 ou mais, inserções, substituições ou deleções de aminoácidos com respeito a uma região específica de SEQ ID NO: 3. As deleções e inserções são realizadas preferencialmente fora do domínio catalítico como descrito abaixo. As substituições também são tipicamente realizadas em regiões que não são essenciais para a atividade de protease e/ou que não afetam a conformação da proteína dobrada.

[064] As substituições introduzem, preferencialmente, uma ou mais alterações conservadoras, que substituem aminoácidos por outros de estrutura química similar, propriedades químicas similares ou volume da cadeia lateral similar. Os aminoácidos introduzidos podem ter polaridade, hidrofobicidade, alcalinidade, acidez, neutralidade ou carga similar aos aminoácidos que eles substituem. Alternativamente, a alteração conservadora pode introduzir outro aminoácido que é aromático ou alifático no lugar de um aminoácido aromático ou alifático pré-existente. Alterações conservadoras de aminoácidos são bem conhecidas na técnica e podem ser selecionadas de acordo com as propriedades dos 20 aminoácidos, como definidas na Tabela A abaixo.

[065] Similarmente, variantes preferenciais da sequência de polinucleotídeo de SEQ ID NO: 2 incluem polinucleotídeos que sejam, pelo menos, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% e, com mais preferência, pelo menos 95%, 97% ou 99% homólogas a uma região relevante de SEQ ID NO: 2. Preferencialmente, a variante apresenta esses níveis de homologia a SEQ ID NO: 2 completa ao longo de sua sequência inteira. TABELA A PROPRIEDADES QUÍMICAS DE AMINOÁCIDOS

SEQUÊNCIAS PROMOTORAS E REGULADORAS

[066] O vetor da invenção também inclui elementos que permitem a expressão do transgene REP1 in vitro e in vivo. Dessa forma, o vetor tipicamente compreende uma sequência promotora ligada de maneira operacional à sequência do polinucleotídeo que codifica Rep-1 ou a uma variante do mesmo.

[067] Qualquer promotor adequado pode ser usado. A sequência promotora pode estar ativa constitutivamente, isto é, operacional em qualquer contexto da célula hospedeira ou, alternativamente, pode estar ativa somente em um meio específico da célula hospedeira, dessa forma, permitindo a expressão direcionada do transgene a um tipo celular específico. O promotor pode mostrar expressão induzível em resposta à presença de outro fator, por exemplo, um fator presente em uma célula hospedeira. Em qualquer evento em que o vetor é administrado para terapia, o promotor deve estar operacional em um contexto de células da retina.

[068] Em algumas realizações, é preferível que o promotor mostre expressão específica na célula da retina para permitir que a expressão do transgene ocorra somente nas populações de células da retina. Dessa forma, a expressão a partir do promotor pode ser específica para a célula da retina, por exemplo, confinada somente às células neurosensoriais da retina e ao epitélio pigmentar da retina.

[069] Promotores preferenciais para o transgene Rep-1 incluem o promotor de beta-actina de galinha (CBA), opcionalmente, em combinação com um elemento aprimorador de citomegalovírus (CME). Um promotor preferencialmente preferencial é um promotor CBA/CAG híbrido, por exemplo, o promotor usado no cassete de expressão rAVE (GeneDetect.com). Um promotor preferencial adicional é mostrado na SEQ ID NO: 6. Os exemplos de promotores baseados nas sequências humanas que induziriam a expressão gênica específica na retina incluem rodopsina quinase para os cones e bastonetes (Allocca et al., 2007, J Virol 81:11372-80), PR2.1 para cones somente (Mancuso et al. 2009, Nature) e/ou RPE65 para o epitélio pigmentar da retina (Bainbridge et al., 2008, N Eng J Med).

[070] O vetor da invenção também pode compreender uma ou mais sequências reguladoras adicionais que podem agir pré ou pós- transcricionalmente. A sequência reguladora pode ser parte do locus do gene REP1 nativo ou pode ser uma sequência reguladora heteróloga. O vetor da invenção pode compreender porções do 5’UTR ou 3’UTR do transcrito nativo de REP1. Por exemplo, o polinucleotídeo de SEQ ID NO: 4 inclui uma parte da sequência 5’UTR do transcrito nativo de REP1.

[071] As sequências reguladoras são quaisquer sequências que facilitam a expressão do transgene, isto é, agem para aumentar a expressão de um transcrito, melhorar a exportação nuclear de mRNA ou aprimorar sua estabilidade. Essas sequências reguladoras incluem, por exemplo, elementos enhancers, elementos pós-reguladores e sítios de poliadenilação. Um sítio de poliadenilação preferencial é o sinal poli-A do Hormônio de Crescimento Bovino, que pode ser como mostrado na SEQ ID NO: 7. No contexto do vetor da invenção, essas sequências reguladoras serão cis-atuantes. No entanto, a invenção também engloba o uso de sequências reguladoras trans-atuantes localizadas nos constructos genéticos adicionais.

[072] Um elemento pós-regulador preferencial para uso em um vetor da invenção é o elemento pós-regulador da hepatite de marmota (WPRE) ou uma variante do mesmo. A sequência do WPRE é fornecida na SEQ ID NO: 5. A invenção engloba o uso de qualquer sequência variante do WPRE que aumenta a expressão do transgene REP1 em comparação a um vetor sem um WPRE. Preferencialmente, as sequências variantes apresentam pelo menos 70% de homologia pela SEQ ID NO: 5 ao longo da sequência inteira, com mais preferência, 75%, 80%, 85%, 90% e, com mais preferência, pelo menos 95%, 97% ou 99% de homologia à SEQ ID NO: 5 ao longo de sua sequência inteira.

[073] Outra sequência reguladora que pode ser usada em um vetor da presente invenção é uma região de acoplamento ao arcabouço (SAR). Sequências reguladoras adicionais podem ser selecionadas por um técnico no assunto com base em seu conhecimento geral comum. PREPARAÇÃO DO VETOR

[074] O vetor da invenção pode ser preparado por meios padrões conhecidos na técnica para o provimento de vetores para a terapia gênica. Dessa forma, métodos de transfecção, empacotamento e purificação de domínio público bem estabelecidos podem ser usados para o preparo de uma preparação adequada do vetor.

[075] Como discutido acima, um vetor da invenção pode compreender o genoma completo de um vírus AAV que ocorre naturalmente, além de uma sequência de polinucleotídeo codificadora de REP1 ou uma variante da mesma. No entanto, geralmente um genoma derivado será usado, por exemplo, um derivado que tem, pelo menos, uma sequência repetida invertida terminal (ITR), mas que pode ser desprovida de quaisquer genes de AAV, como rep ou cap.

[076] Em algumas realizações, para fornecer a união do genoma derivado em uma partícula viral AAV, constructos genéticos adicionais que fornecem funções de AAV e/ou de vírus auxiliar serão fornecidos em uma célula hospedeira junto ao genoma derivado. Esses constructos adicionais conterão, tipicamente, genes que codificam proteínas estruturais do capsídeo de AAV, isto é, cap, VP1, VP2, VP3, e genes que codificam outras funções necessárias para o ciclo de vida do AAV, como rep. A seleção das proteínas estruturais do capsídeo fornecidas no constructo adicional determinarão o sorotipo do vetor viral empacotado.

[077] Um vetor viral empacotado, particularmente, preferencial para uso na invenção compreende um genoma derivado de AAV2 em combinação com proteínas de capsídeo de AAV5 ou AAV8. Esse vetor viral empacotado tipicamente compreende uma ou mais ITRs de AAV2, opcionalmente, como mostrado na SEQ ID NO: 8 e/ou 9, ou variantes das mesmas.

[078] Como mencionado acima, vírus AAV são incompetentes quanto à replicação e, dessa forma, funções de vírus auxiliares, preferencialmente funções auxiliares do vírus adenovírus, também serão tipicamente fornecidas em um ou mais constructos adicionais para permitir a replicação do AAV.

[079] Todos os constructos adicionais acima podem ser fornecidos como plasmídeos ou outros elementos epissomais na célula hospedeira ou, alternativamente, um ou mais constructos podem ser integrados ao genoma da célula hospedeira.

[080] Nesses aspectos, a invenção fornece um método para a produção de um vetor da invenção. O método engloba o fornecimento de um vetor que compreende o genoma de um vírus adeno-associado (AAV), ou um derivado do mesmo, e uma sequência de polinucleotídeo codificadora de REP1, ou uma variante da mesma, em uma célula hospedeira, e o fornecimento de meios para a replicação e união do dito vetor em uma partícula viral de AAV. Preferencialmente, o método engloba o fornecimento de um vetor que compreende um derivado de um genoma de AAV e uma sequência de polinucleotídeo codificadora de REP1 ou uma variante da mesma, junto com um ou mais constructos genéticos adicionais que codificam funções de AAV e/ou de vírus auxiliar. Tipicamente, o derivado de um genoma de AAV compreende, pelo menos uma ITR. Opcionalmente, o método ainda compreende uma etapa de purificação das partículas virais unidas. Adicionalmente, o método pode compreender uma etapa de formulação de partículas virais para uso terapêutico. MÉTODOS DE TERAPIA E USOS MÉDICOS

[081] Como discutido acima, os presentes inventores demonstraram de forma surpreendente que um vetor da invenção pode ser usado para abordar a disfunção celular subjacente à coroideremia. Em particular, eles mostraram que o uso do vetor pode corrigir o defeito de prenilação associado à coroideremia. Isso fornece meios através dos quais o processo degenerativo da doença pode ser tratado, detido, atenuado ou prevenido.

[082] A invenção, portanto, fornece um método de tratamento ou prevenção da coroideremia em um paciente em necessidade do mesmo, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente efetiva de um vetor da invenção ao paciente por injeção direta retiniana, sub-retiniana ou intravítrea. Consequentemente, a coroideremia é através disso tratada ou prevenida no dito paciente.

[083] Em um aspecto relacionado, a invenção fornece o uso de um vetor da invenção em um método de tratamento ou prevenção da coroideremia pela administração do dito vetor a um paciente por injeção direta retiniana, sub-retiniana ou intravítrea. Adicionalmente, a invenção fornece o uso de um vetor da invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção da coroideremia pela injeção direta retiniana, sub-retiniana ou intravítrea.

[084] Em todas essas realizações, o vetor da invenção pode ser administrado para prevenir o surgimento de um ou mais sintomas da coroideremia. O paciente pode ser assintomático. O sujeito pode ter uma predisposição à doença. O método ou uso pode compreender uma etapa de identificação se um sujeito está ou não em risco de desenvolvimento ou já tem coroideremia. Uma quantidade profilaticamente efetiva do vetor é administrada a esse sujeito. Uma quantidade profilaticamente efetiva é uma quantidade que previne o surgimento de um ou mais sintomas da doença.

[085] Alternativamente, o vetor pode ser administrado uma vez que os sintomas da doença aparecerem em um sujeito, isto é, curar os sintomas existentes da doença. Uma quantidade terapeuticamente efetiva do antagonista é administrada a esse sujeito. Uma quantidade terapeuticamente efetiva é uma quantidade que é efetiva para melhorar um ou mais sintomas da doença. Tipicamente, essa quantidade aumenta o nível de prenilação das GTPases Rab no olho. Isso pode ser confirmado como descrito abaixo. Essa quantidade também pode deter, desacelerar ou reverter alguma perda de visão periférica associada à coroideremia. Essa quantidade também pode deter, desacelerar ou reverter o surgimento da cegueira noturna.

[086] O sujeito pode ser do sexo masculino ou feminino. Sujeitos do sexo masculino mostram sintomas mais severos, uma vez que a coroideremia é uma doença ligada ao X, mas sujeitos do sexo feminino também apresentam sintomas da doença e, ocasionalmente, têm um fenótipo severo. O sujeito é preferencialmente identificado como estando em risco ou tendo a doença. A retina pode mostrar aparência característica inicial de afinamento da coroide e progredir até a exposição da esclera subjacente em manchas. Pode haver perda de amplitude da eletroretinograma periférica. Em muitos casos, pode haver um histórico familiar de coroideremia. Usualmente, mas não sempre, uma mutação pode ser identificada no gene REP1 localizado no cromossomo X.

[087] A administração do vetor é tipicamente por injeção direta retiniana ou sub-retiniana. Isso inclui o fornecimento direto às células neurosensoriais da retina e ao epitélio pigmentar da retina como, por exemplo, as células epiteliais e fotorreceptoras. O fornecimento é realizado, de maneira típica, diretamente ou sub-retinianamente à retina em degeneração em um paciente com coroideremia. O vetor pode transduzir as células alvo acima sem a entrada em quaisquer outras populações celulares. A injeção intravítrea também pode ser usada para fornecer o vetor da invenção. O fornecimento pode não ser sub-retiniano ou pode não ser por injeção sub-retiniana. O fornecimento pode não ser transvítreo.

[088] A dose de um vetor da invenção pode ser determinada de acordo com vários parâmetros, especialmente de acordo com a idade, peso e condição do paciente a ser tratado; a via de administração; e o regime necessário. De novo, um médico será capaz de determinar a via de administração e a dosagem necessária para qualquer paciente específico.

[089] Uma dose única típica está entre 1010 e 1012 partículas de genoma, dependendo da quantidade de tecido retiniano remanescente que necessita de transdução. Uma partícula de genoma é definida, no presente pedido, como um capsídeo de AAV que contém uma molécula de DNA fita simples, que pode ser quantificada por um método específico da sequência (como PCR em tempo real). Aquela dose pode ser fornecida como uma dose única, mas pode ser repetida para o outro olho ou em casos onde o vetor pode não ter sido direcionado à região correta da retina por qualquer razão (como, por exemplo, complicações cirúrgicas). O tratamento é preferencialmente um tratamento permanente único para cada olho, mas injeções repetidas, por exemplo, em anos futuros e/ou com diferentes sorotipos de AAV podem ser consideradas.

[090] A invenção também fornece um método de monitoramento do tratamento ou prevenção da coroideremia em um paciente, compreendendo a medição da atividade de prenilação ex vivo em células da retina obtidas do dito paciente após a administração do vetor AAV da invenção por injeção direta retiniana, sub-retiniana ou intravítrea. Esse método permite a determinação da eficácia do tratamento. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

[091] O vetor da invenção pode ser formulado em composições farmacêuticas. Essas composições podem compreender, além do vetor, um excipiente, carreador, tampão, estabilizante ou outros materiais farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos por técnicos no assunto. Esses materiais devem ser não tóxicos e não devem interferir na eficácia do ingrediente ativo. A natureza precisa do carreador ou outro material pode ser determinada por um técnico no assunto de acordo com a via de administração, isto é, no presente pedido, injeção direta retiniana, sub-retiniana ou intravítrea.

[092] A composição farmacêutica está tipicamente na forma líquida. As composições farmacêuticas líquidas geralmente incluem um carreador líquido, como água, petróleo, óleos animais e vegetais, óleo mineral ou sintético. Solução salina fisiológica, cloreto de magnésio, dextrose ou outra solução de sacarídeo ou glicóis, como etileno glicol, propileno glicol ou polietileno glicol, podem ser incluídos. Em alguns casos, um surfactante, como o ácido plurônico (PF68) a 0,001% pode ser usado.

[093] Para a injeção no local de aflição, o ingrediente ativo estará na forma de uma solução aquosa livre de pirógeno e com pH, isotonicidade e estabilidade adequados. Os técnicos no assunto serão capazes de preparar soluções adequadas com o uso, por exemplo, de veículos isotônicos, como Injeção de Cloreto de Sódio, Injeção de Ringer, Injeção de Ringer Lactado. Conservantes, estabilizantes, tampões, antioxidantes e/ou outros aditivos podem ser incluídos se necessário.

[094] Para liberação retardada, o vetor pode ser incluído em uma composição farmacêutica que é formulada para liberação lenta como, por exemplo, em microcápsulas formadas a partir de polímeros biocompatíveis ou em sistemas de carreadores lipossomais, de acordo com os métodos conhecidos na técnica. EXEMPLOS

[095] Os presentes Exemplos descrevem um modelo para o teste das estratégias terapêuticas para a coroideremia e correção do fenótipo da doença. Mostrou-se que constructos genéticos que consistem de um promotor, do cDNA REP1 e dos elementos reguladores 3’, quando empacotados em um vetor viral recombinante, transduzem as células alvo dentro da retina em degeneração. EXEMPLO 1 CLONAGEM DO CDNA DE REP1 HUMANA, GERAÇÃO DO CASSETE DE EXPRESSÃO CBA-REP-1-WPRE, CONSTRUÇÃO DO PAAV-CBA-REP-1-WPRE-BGHPA E EMPACOTAMENTO DO VÍRUS AAV REP-1

[096] Um cDNA de REP1 humana foi isolado de uma biblioteca de cDNA humano com o uso de amplificação por PCR e primers homólogos à sequência de REP1 conhecida. O cDNA isolado foi sequenciado e mostrou-se ser homólogo à variante 1 traduzida conhecida da sequência de mRNA de REP1, conforme depositado no Genbank sob número de acesso NM_000390. O cDNA tem a sequência de SEQ ID NO: 4.

[097] Esse cDNA foi inserido em um plasmídeo cis pAAV, chamado pAM. O pAM é um plasmídeo de elevado número de cópias originalmente derivado do pBR322, mas inclui as repetições terminais invertidas à esquerda e à direita do AAV2, que são adjacentes ao cassete de expressão de escolha. Para o vetor AAV-REP1, um promotor CBA/CAG modificado (beta-actina de galinha com enhancer de CMV) foi usado para dirigir a expressão de REP1 e uma sequência WPRE e cauda poli-A de bGH foram fornecidas a 3’ ao cDNA. Esse plasmídeo foi chamado de pAAV2-CBA- hREP-1-WPRE-bGH, (pAAV-REP-1).

[098] O pAAV-REP-1 foi usado para gerar o AAV-REP1 recombinante com o uso de métodos de transfecção tripla, empacotamento e purificação bem estabelecidos e de domínio público. Os estoques do vetor foram gerados com o uso desse método com variação na titulação genômica, mas mais comumente, os estoques obtidos após a purificação foram de 1012-1013 gp/mL (gp = partículas de genoma - consulte acima). Os estoques foram posteriormente diluídos para uso in vivo, como descrito abaixo. EXEMPLO 2 EXPRESSÃO DE REP1 A PARTIR DO VETOR EM CÉLULAS COM COROIDEREMIA HUMANA (CHM)

[099] A expressão de REP1 a partir do vetor AAV2-REP1 foi avaliada em fibroblastos com coroideremia humana (Chm). Essas células fibroblásticas foram obtidas com permissão ética para uma biópsia de pele a partir de um paciente com coroideremia. A expressão de GFP de um vetor controle foi usada como controle. Como um prelúdio para o trabalho com células humanas, a expressão também foi confirmada após a injeção sub- retiniana do vetor AAV-REP1 em camundongos por Western blot, uma vez que a sonda de anticorpo reconhece as formas humanas da proteína REP1, mas não as formas de camundongos.

[0100] Os resultados são mostrados na Figura 1. REP1 não foi detectada por imunoblotting com um anticorpo anti-hREP1 em fibroblastos Chm não transduzidos (coluna 2), enquanto REP1 é detectada em fibroblastos normais (WT = do tipo selvagem humana) (coluna 1). Após a transdução com o vetor AAV2-REP1, a doses iguais de 40 μg do lisado e diluição para 5 μg, pode-se ver que o nível de hREP1 expresso pelo vetor AAV2-REP1 em células Chm é aproximadamente 10 vezes mais alta (colunas 3 a 6) do que os níveis em células do tipo selvagem (coluna 2). Nenhum efeito tóxico sobre o crescimento celular foi observado com esse grau de superexpressão. EXEMPLO 3 CORREÇÃO DO DEFEITO DE PRENILAÇÃO PELO VETOR EM CÉLULAS CHM

[0101] Os camundongos com coroideremia não têm um fenótipo de degeneração retiniana da mesma forma que em pacientes humanos, portanto, não é possível realizar uma avaliação direta da recuperação da retina com o uso de uma abordagem de terapia gênica. Por essa razão, a correção do fenótipo da doença foi avaliada em células humanas Chm in vitro.

[0102] Os resultados são mostrados na Figura 2. A transdução com AAV2-REP1 mostrou uma correção do defeito de prenilação vista em células Chm, aumentando a atividade de prenilação a níveis significativamente mais altos do que os normais após o tratamento com 2 x 105 células com 1.5 x 1010 partículas do genoma viral de AAV2-REP1. Isso confirma que o vetor AAV2-REP1 expressa a proteína funcional REP1 em células humanas afetadas pela coroideremia.

[0103] Em mais detalhe, a atividade de prenilação normal nos fibroblastos do tipo selvagem (WT) rende aproximadamente 0,32 pmol de [3H]- GGPP; em fibroblastos com coroideremia (Chm), o rendimento é reduzido para 0,19 pmol. Como esperado, a atividade de prenilação foi inalterada após a transdução dos fibroblastos Chm com o vetor controle AAV-GFP. Após a transdução com o vetor AAV-REP1, no entanto, a atividade de prenilação aumentou significativamente, rendendo 0,42 pmol de [3H]-GGPP (n=4, p<0.01). EXEMPLO 4 EXPRESSÃO IN VIVO DIRECIONADA DO GENE REPÓRTER A PARTIR DO VETOR EM CAMUNDONGOS

[0104] Para confirmar a atividade ubíqua das sequências promotora CBA e reguladora no vetor AAV2, o gene que codifica REP1 foi substituído por um gene repórter codificador da proteína fluorescente verde (GFP) para criar AAV2-CBA-GFP-WPRE-BGH (AAV2-GFP).

[0105] GFP foi selecionado para avaliar a expressão in vivo, uma vez que apesar de ser de fácil identificação no Western blot, a proteína humana REP1 não é facilmente detectada por imunohistoquímica indireta nas seções da retina.

[0106] O constructo AAV2-GFP foi injetado no espaço sub- retiniano de camundongos e a expressão de GFP foi monitorada por microscopia. Os resultados são mostrados na Figura 3, que confirmam que o vetor tinha o tropismo previsto tanto para a retina neurosensorial como para o epitélio pigmentar da retina. Isso confirma que a sequência de capsídeo e os elementos reguladores levaram a altos níveis de expressão gênica nos fotorreceptores e no epitélio pigmentar da retina. EXEMPLO 5 ESTUDO DE TOXICIDADE

[0107] As doses do vetor AAV2-REP1 foram injetadas no espaço sub-retiniano de camundongos do tipo selvagem (n=9) para determinar quaisquer efeitos tóxicos possíveis na função da retina nas doses mais altas. Testou-se as concentrações em camundongos (1 x 1011 e 1 x 1012 gp por mL), as quais foram uma unidade de log mais altas do que as concentrações altas e baixas propostas a serem usadas em pacientes (1010 e 1011 gp por mL).

[0108] Os resultados são mostrados na Figura 4. Nenhum efeito tóxico no eletroretinograma (ERG) foi detectado seis meses após a injeção sub-retiniana, tanto com a dose do vetor AAV-REP1 alta (n=5) como com a baixa (n=4). Para controlar os efeitos não específicos da cirurgia retiniana ou do vetor AAV2, o outro olho foi submetido a uma injeção e titulação de AAV2- GFP muito similares.

[0109] Na dose mais alta de AAV2-GFP, houve uma sutil redução da amplitude do ERG, o que reflete um leve efeito tóxico conhecido com o uso da dose máxima do vetor que expressa GFP com esse promotor mais forte, e confirma a sensibilidade desse teste na detecção de um efeito relacionado à dose. Entretanto, não houve redução detectável no ERG nos olhos tratados com AAV2-REP1 em qualquer dose, sugerindo que a superexpressão de REP1 na retina foi menos tóxica do que GFP.

Claims

1. VETOR, que consiste em uma partícula de vírus adeno- associado de sorotipo 2 (AAV2), caracterizado pelo genoma da partícula ser um genoma de AAV2 que compreende uma sequência de polinucleotídeo de SEQ IN NO: 2 ou uma sequência degenerada da mesma que codifica um polipeptídeo REP1, como representada na SEQ ID NO: 3, em que dita sequência de polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo REP1 é ligada de maneira operacional a uma sequência promotora.

2. VETOR, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo genoma ser como representado na SEQ ID NO: 1 e/ou ser ausente em um ou mais do grupo dentre uma sequência repetida terminal invertida (ITR), a sequência do gene de replicação (rep) e a sequência do gene do capsídeo (cap).

3. VETOR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado por dito promotor ser constitutivamente ativo.

4. VETOR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pela expressão de dito promotor ser específica de célula da retina.

5. VETOR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por compreender uma ou mais sequências reguladoras adicionais.

6. VETOR, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por dito genoma compreender SEQ ID NO: 5.

7. VETOR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pela partícula de vetor ser administrada por injeção direta retiniana, sub-retiniana ou intravítrea.

8. VETOR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por dita partícula de vetor ser administrada diretamente no espaço sub-retiniano.

9. USO DE UM VETOR, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por ser na fabricação de um medicamento para tratar ou prevenir coroideremia em um paciente em necessidade do mesmo.

10. USO DE UM VETOR, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por ser na fabricação de um medicamento, que é uma injeção direta na retina, sub-retiniana ou intravítrea, para tratar ou prevenir coroideremia em um paciente em necessidade do mesmo.