JP2023539574A - Ｓｈａｎｋ３遺伝子治療アプローチ - Google Patents

Ｓｈａｎｋ３遺伝子治療アプローチ Download PDF

Info

Publication number
JP2023539574A
JP2023539574A JP2023512119A JP2023512119A JP2023539574A JP 2023539574 A JP2023539574 A JP 2023539574A JP 2023512119 A JP2023512119 A JP 2023512119A JP 2023512119 A JP2023512119 A JP 2023512119A JP 2023539574 A JP2023539574 A JP 2023539574A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
seq
less
aav
shank3
subject
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2023512119A
Other languages
English (en)
Inventor
フォン，グオピン
ガオ，シエン
メイ，ユアン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Massachusetts Institute of Technology
Original Assignee
Massachusetts Institute of Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Massachusetts Institute of Technology filed Critical Massachusetts Institute of Technology
Publication of JP2023539574A publication Critical patent/JP2023539574A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New breeds of animals
    • A01K67/027—New breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0276—Knockout animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0066—Manipulation of the nucleic acid to modify its expression pattern, e.g. enhance its duration of expression, achieved by the presence of particular introns in the delivered nucleic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination

Abstract

本開示の側面は、Shank3タンパク質をコードする非天然ポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクター、および遺伝子治療法に関する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、35 U.S.C. § 119(e)の元で、２０２０年８月１７日に出願された「SHANK3遺伝子治療アプローチ」と題する米国仮出願第63/066,570号の利益を主張する；この全開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
EFS-Webを介しテキストファイルとして提出された配列表の参照
本出願は、EFS-Webを介してASCIIフォーマットで提出された配列表を含み、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。２０２１年８月１６日に作成されたこのASCIIコピーは、B119570108WO00-SEQ-SXTの名称で、サイズは１５１，４３４バイトである。
発明の分野
本開示は、Shank3タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、神経発達障害を有するか、有する疑いがあるか、または有するリスクがある対象に送達するための遺伝子治療アプローチに関する。
背景
Shank3が関与する欠失および／または変異は、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）の全患者の約０．５～１％、および知的障害（ＩＤ）を有するＡＳＤ患者の約２％の主要因である。しかし、ＡＳＤおよび／またはＩＤの有効な処置法はない。ＡＳＤおよびＩＤに関連する多くの病的状態を修正することができる薬理学的処置法を開発するには、いくつかの課題が生じている。
本開示の側面は、Shank3変異を有する対象に対する、効果的な遺伝子治療アプローチの開発に関する。
本開示の側面は、Shank3タンパク質をコードする非天然ポリヌクレオチドに関し、ここでShank3タンパク質は、ＳＨ３ドメイン、ＰＤＺドメイン、Homer結合ドメイン、コルタクチン（Cortactin）結合ドメイン、およびＳＡＭドメインを含む。いくつかの態様において、ＳＨ３ドメインは、配列番号６の残基４７４～５２５に対して少なくとも９０％の同一性、または配列番号５の残基４７３～５２４に対して少なくとも９０％の同一性を含む。いくつかの態様において、ＰＤＺドメインは、配列番号６の残基５７３～６６２に対して少なくとも９０％の同一性、または配列番号５の残基５７２～６６１に対して少なくとも９０％の同一性を含む。いくつかの態様において、Homer結合ドメインは、配列番号５または６の残基１２９４～１３２３に対して少なくとも９０％の同一性を含む。いくつかの態様において、コルタクチン結合ドメインは、配列番号５または６の残基１４００～１４２６に対して少なくとも９０％の同一性を含む。いくつかの態様において、ＳＡＭドメインは、配列番号６の残基１６６４～１７２９に対して少なくとも９０％の同一性、または配列番号５の残基１６６３～１７２８に対して少なくとも９０％の同一性を含む。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、４．７ｋｂ未満である。
いくつかの態様において、ポリヌクレオチドはさらに、プロリンリッチ領域を含む。いくつかの態様において、ＳＨ３ドメインは、配列番号６の残基４７４～５２５または配列番号５の残基４７３～５２４を含み、ＰＤＺドメインは、配列番号６の残基５７３～６６２または配列番号５の残基５７２～６６１を含み、Homer結合ドメインは、配列番号５または６の残基１２９４～１３２３を含み；コルタクチン結合ドメインは、配列番号５または６の残基１４００～１４２６を含み、および／またはＳＡＭドメインは、配列番号６の残基１６６４～１７２９または配列番号５の残基１６６３～１７２８を含む。
いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号１または２に対して少なくとも９０％の同一性を含む。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号１または２を含む。
いくつかの態様において、ポリヌクレオチドによってコードされるShank3タンパク質はさらに、アンキリンリピートドメインを含む。いくつかの態様において、アンキリンリピートドメインは、配列番号６の残基１４８～３４５に対して少なくとも９０％の同一性、または配列番号５の残基１４７～３１３に対して少なくとも９０％の同一性を含む。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号６の残基１４８～３４５または配列番号５の残基１４７～３１３を含む。
いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号３または４に対して少なくとも９０％の同一性を含む。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号３または４を含む。
いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、約４．６ｋｂ未満、４．５ｋｂ未満、４．４ｋｂ未満、４．３ｋｂ未満、４．２ｋｂ未満、４．１ｋｂ未満、４．０ｋｂ未満、３．９ｋｂ未満、３．８ｋｂ未満、３．７ｋｂ未満、３．６ｋｂ未満、３．５ｋｂ未満、３．４ｋｂ未満、３．３ｋｂ未満、３．２ｋｂ未満、３．１ｋｂ未満、３．０ｋｂ未満、２．９ｋｂ未満、２．８ｋｂ未満、２．７ｋｂ未満、２．６ｋｂ未満、２．５ｋｂ未満、２．４ｋｂ未満、２．３ｋｂ未満、２．２ｋｂ未満、または２．１ｋｂ未満である。
いくつかの態様において、Shank3タンパク質は、配列番号５または６の全長にわたり、配列番号５または６と６５％未満の同一性である。
いくつかの態様において、Shank3タンパク質は、配列番号１７～２０のいずれか１つと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Shank3タンパク質は、配列番号１７～２０のいずれか１つを含むアミノ酸配列を含む。
本開示のさらなる側面は、本明細書に記載のポリペプチドによってコードされるShank3タンパク質に関する。
本開示のさらなる側面は、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含むベクターに関する。いくつかの態様において、ベクターはウイルスベクターである。いくつかの態様において、ベクターはＡＡＶベクターである。いくつかの態様において、ベクターは、本明細書に記載のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）に隣接している。いくつかの態様において、ＡＡＶベクターは、配列番号７または２１と少なくとも９０％同一の配列を含み、Shank3活性を有するタンパク質をコードする。いくつかの態様において、ＡＡＶベクターは、配列番号７または２１の配列を含み、Shank3活性を有するタンパク質をコードする。いくつかの態様において、ＡＡＶベクターは、配列番号２または４と少なくとも９０％同一の配列を含み、Shank3活性を有するタンパク質をコードする。いくつかの態様において、ＡＡＶベクターは配列番号２または４の配列を含み、これはShank3活性を有するタンパク質をコードする。いくつかの態様において、ＡＡＶベクターは、配列番号１または３と少なくとも９０％同一の配列を含み、Shank3活性を有するタンパク質をコードする。いくつかの態様において、ＡＡＶベクターは配列番号１または３の配列を含み、これはShank3活性を有するタンパク質をコードする。
本開示のさらなる側面は、ＡＡＶベクターおよびカプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子に関し、ここでカプシドは、ＡＡＶ１、２、５、６、８、９、ｒｈ１０、およびＰＨＰ．ｅＢから選択される血清型のものである。いくつかの態様において、血清型はＡＡＶ９である。いくつかの態様において、血清型はＡＡＶ１０である。いくつかの態様において、血清型はＰＨＰ．ｅＢである。
いくつかの態様において、ＡＡＶベクターはプロモーターをさらに含む。いくつかの態様において、プロモーターはヒトプロモーターである。いくつかの態様において、プロモーターはｈＳｙｎ１である。
本開示のさらなる側面は、本明細書に記載のＡＡＶベクターまたは粒子を、それを必要とする対象に投与することを含む方法に関する。いくつかの態様において、対象はヒト対象である。いくつかの態様において、ヒト対象は成人である。いくつかの態様において、ヒト対象は成人ではない。いくつかの態様において、ヒト対象は２５歳以下である。いくつかの態様において、ヒト対象は１０歳以下である。いくつかの態様において、対象は、神経発達障害を有するか、有する疑いがあるか、または有するリスクがある。いくつかの態様において、対象は、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）を有するか、有する疑いがあるか、または有するリスクがある。いくつかの態様において、対象は、ＡＳＤの１つ以上の症状を示す。いくつかの態様において、対象は、フェラン・マクダーミド症候群を有するか、有する疑いがあるか、または有するリスクがある。いくつかの態様において、対象は、発育遅延、知的障害（ＩＤ）、睡眠障害、筋緊張低下、発話の欠如、または言語遅延のうちの１つ以上を示す。
本開示のさらなる側面は、神経発達障害を有する対象を処置する方法に関する。いくつかの態様において、本開示は、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）を有する対象を処置する方法に関する。いくつかの態様において、本開示は、フェラン・マクダーミド症候群を有する対象を処置する方法に関する。いくつかの態様において、処置方法は、Shank3タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクターを含む組成物の有効量を、対象に投与することを含む。いくつかの態様において、組成物は、薬学的に許容し得る担体中にある。
いくつかの態様において、ＡＡＶベクターは、対象の脳に送達される。いくつかの態様において、ＡＡＶベクターは、対象の皮質、線条体および／または視床に送達される。
いくつかの態様において、対象は、対照対象と比較して、Shank3遺伝子の発現の低下を有するか、有する疑いがあるか、または有するリスクがある。いくつかの態様において、対照対象は、神経発達障害、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）、および／またはフェラン・マクダーミド症候群を有しないか、有する疑いがないか、または有するリスクがない対象である。いくつかの態様において、Shank3遺伝子の発現低下は、Shank3遺伝子の少なくとも１つのコピーの破壊によって引き起こされる。いくつかの態様において、Shank3遺伝子の破壊は、Shank3遺伝子の少なくとも１つのコピーにおける欠失を含む。いくつかの態様において、Shank3遺伝子の破壊は、Shank3遺伝子の少なくとも１つのコピー内に１つ以上の変異を含む。
本開示のさらなる側面は、配列番号１７～２０のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一である配列を含む、MiniShank3タンパク質に関する。いくつかの態様において、MiniShank3タンパク質は、配列番号１７～２０のいずれか１つの配列を含む。
図１Ａ～１Ｂは、Shank3B-/-マウスにおける皮膚病変およびグルーミングの増加を示す。
図２Ａ～２Ｃは、Shank3B変異体マウスが社会的相互作用障害を示したことを示す。図２Ａの「よそもの１」は、試験動物との社会的接触行動について試験されたパートナーを表す。図２Ａの「よそもの２」は、以前に空の有線ケージに導入された新参の社会的パートナーを表す。S1：よそもの１；S2：よそもの２；E：空のケージ。 図２Ａ～２Ｃは、Shank3B変異体マウスが社会的相互作用障害を示したことを示す。
図３Ａ～３Ｃは、Shank3B-/-マウスが線条体ＰＳＤで分子組成の変化を示したことを示す。 図３Ａ～３Ｃは、Shank3B-/-マウスが線条体ＰＳＤで分子組成の変化を示したことを示す。
図４Ａ～４Ｅは、Shank3B変異体マウスにおける皮質線条体シナプス欠陥を示す。PPR：ペアパルス比。 図４Ａ～４Ｅは、Shank3B変異体マウスにおける皮質線条体シナプス欠陥を示す。PPR：ペアパルス比。 図４Ａ～４Ｅは、Shank3B変異体マウスにおける皮質線条体シナプス欠陥を示す。PPR：ペアパルス比。
図５Ａ～５Ｃは、miniShank3-v1の設計を示す。図５Ａは、全長Shank3のタンパク質ドメイン図を示す。図５Ｂは、本開示で提供されるminiShank3-v1の概略図を示す。図５Ｃは、ヒトシナプシン１プロモーター（ｈＳｙｎ－１）を有するＧＦＰタグ付きminiShank3-v1の模式図を示す。ANK、アンキリンリピート；SH3、ｓｒｃ相同性３ドメイン；PDZ、ＰＤＺドメイン；Pro、プロリンリッチ領域；HBD、Homer結合ドメイン；CBD、コルタクチン結合ドメイン；SAM、滅菌アルファモチーフ。
図６Ａ～６Ｃは、miniShank3-v2の設計を示す。図６Ａは、全長Shank3のタンパク質ドメイン図を示す。図６Ｂは、本開示で提供されるminiShank3-v2の概略図を示す。図６Ｃは、ヒトシナプシン１プロモーター（ｈＳｙｎ－１）を有するＧＦＰタグ付きminiShank3-v2の模式図を示す。ANK、アンキリンリピート；SH3、ｓｒｃ相同性３ドメイン；PDZ、ＰＤＺドメイン；Pro、プロリンリッチ領域；HBD、Homer結合ドメイン；CBD、コルタクチン結合ドメイン；SAM、滅菌アルファモチーフ。
図７Ａ～７Ｈは、ＧＦＰ－miniShank3-v1がシナプスに局在したことを示す。ｈＳｙｎ１－ＧＦＰ－miniShank3-v1を、皮質線条体共培養中で線条体中型有棘ニューロン（ＭＳＮ）にトランスフェクトした。図７Ａは、ＧＦＰ－miniShank3-v1がＭＳＮで発現されたことを示す。図７Ｂ～７Ｃは、同じ培養物をＰＳＤ９５で染色してシナプスをマークしたもの（図７Ｂ）、およびＭＡＰ２で染色して樹状突起を示したもの（図７Ｃ）を示す。 図７Ａ～７Ｈは、ＧＦＰ－miniShank3-v1がシナプスに局在したことを示す。ｈＳｙｎ１－ＧＦＰ－miniShank3-v1を、皮質線条体共培養中で線条体中型有棘ニューロン（ＭＳＮ）にトランスフェクトした。図７Ｂ～７Ｃは、同じ培養物をＰＳＤ９５で染色してシナプスをマークしたもの（図７Ｂ）、およびＭＡＰ２で染色して樹状突起を示したもの（図７Ｃ）を示す。図７Ｄは、図７Ａ～７Ｃのマージ画像を示す。 図７Ａ～７Ｈは、ＧＦＰ－miniShank3-v1がシナプスに局在したことを示す。ｈＳｙｎ１－ＧＦＰ－miniShank3-v1を、皮質線条体共培養中で線条体中型有棘ニューロン（ＭＳＮ）にトランスフェクトした。図７Ｅ～７Ｈは、図７Ａ～７Ｄからの高倍率画像であって、ＰＳＤ９５（図７Ｆ）を有するＧＦＰ－miniShank3-v1（図７Ｅ）の、マージ画像（図７Ｈ）中の樹状突起（図７Ｇ）および樹状突起スパイン（図７Ｈ）への正確な局在化を示す。 図７Ａ～７Ｈは、ＧＦＰ－miniShank3-v1がシナプスに局在したことを示す。ｈＳｙｎ１－ＧＦＰ－miniShank3-v1を、皮質線条体共培養中で線条体中型有棘ニューロン（ＭＳＮ）にトランスフェクトした。図７Ｅ～７Ｈは、図７Ａ～７Ｄからの高倍率画像であって、ＰＳＤ９５（図７Ｆ）を有するＧＦＰ－miniShank3-v1（図７Ｅ）の、マージ画像（図７Ｈ）中の樹状突起（図７Ｇ）および樹状突起スパイン（図７Ｈ）への正確な局在化を示す。
図８は、生後０日目の顔面静脈注射後に、ＧＦＰ－miniShank3-v1の効率的な発現があったことを示す。Ｐ０マウスには、マウス当たり６．４２Ｅ＋１１のウイルスゲノム（ｖｇ）を注射した。マウスの脳を、ＡＡＶ注射の２か月後に採取し、脳を切片にしてＧＦＰ発現を観察した。
図９Ａ～９Ｆは、Ｐ０でのＡＡＶ－miniShank3-v1の単回静脈内注射が、Shank3欠損マウスにおけるＰＳＤタンパク質欠損を救済したことを示す。図９Ａは、ＡＡＶ媒介性miniShank3-v1遺伝子治療実験のタイムラインおよび実験群を示す。図９Ｂは、以下から調製した線条体シナプトソーム原形質膜（ＳＰＭ）画分における、miniShank3発現を示すウェスタンブロットを提供する：ＡＡＶ－ＧＦＰを注射した野生型マウス（WT）、ＡＡＶ－ＧＦＰを注射したInsG3680+/+マウス（変異体）、ＡＡＶ－ＧＦＰ－miniShank3-v1を注射したInsG3680+/+マウス（miniShank3）、ＧＦＰ－miniShank3-v1をコードするｃＤＮＡプラスミドを発現するＨＥＫ２９３細胞（HEK 293-a）およびＧＦＰ－ｐ２Ａ miniShank3-v1をコードするｃＤＮＡプラスミドを発現するＨＥＫ２９３細胞（HEK 293-b）からのライセート、これは抗Shank3抗体を使用して検出した。 図９Ａ～９Ｆは、Ｐ０でのＡＡＶ－miniShank3-v1の単回静脈内注射が、Shank3欠損マウスにおけるＰＳＤタンパク質欠損を救済したことを示す。図９Ｃおよび９Ｅは、以下のＡＡＶ注射マウスからの線条体（図９Ｃ）および皮質（図９Ｅ）ＳＰＭ画分における、特異的抗体によって検出されたタンパク質の代表的なブロットを示す：ＡＡＶ－ＧＦＰを注射したＷＴマウス（WT）、ＡＡＶ－ＧＦＰを注射したInsG3680+/+マウス（変異体）、およびＡＡＶ－ＧＦＰ－miniShank3-v1を注射したInsG3680+/+マウス（miniShank3）。 図９Ａ～９Ｆは、Ｐ０でのＡＡＶ－miniShank3-v1の単回静脈内注射が、Shank3欠損マウスにおけるＰＳＤタンパク質欠損を救済したことを示す。図９Ｄおよび９Ｆは、線条体（図９Ｄ）および皮質（図９Ｆ）ＳＰＭからのチューブリンタンパク質発現に対して正規化された、タンパク質の相対レベルの定量化を示す。（遺伝子型ごとにタンパク質当たりｎ＝４つの試料、各ｎは２匹のマウスからのプールされた組織）。Minishank3群では、変異体のＰＳＤタンパク質レベルが、ＷＴレベルに回復したことに注意されたい。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ボンフェローニ事後検定を用いる一元配置分散分析（図９Ｄおよび９Ｆ）。 図９Ａ～９Ｆは、Ｐ０でのＡＡＶ－miniShank3-v1の単回静脈内注射が、Shank3欠損マウスにおけるＰＳＤタンパク質欠損を救済したことを示す。図９Ｃおよび９Ｅは、以下のＡＡＶ注射マウスからの線条体（図９Ｃ）および皮質（図９Ｅ）ＳＰＭ画分における、特異的抗体によって検出されたタンパク質の代表的なブロットを示す：ＡＡＶ－ＧＦＰを注射したＷＴマウス（WT）、ＡＡＶ－ＧＦＰを注射したInsG3680+/+マウス（変異体）、およびＡＡＶ－ＧＦＰ－miniShank3-v1を注射したInsG3680+/+マウス（miniShank3）。 図９Ａ～９Ｆは、Ｐ０でのＡＡＶ－miniShank3-v1の単回静脈内注射が、Shank3欠損マウスにおけるＰＳＤタンパク質欠損を救済したことを示す。図９Ｄおよび９Ｆは、線条体（図９Ｄ）および皮質（図９Ｆ）ＳＰＭからのチューブリンタンパク質発現に対して正規化された、タンパク質の相対レベルの定量化を示す。（遺伝子型ごとにタンパク質当たりｎ＝４つの試料、各ｎは２匹のマウスからのプールされた組織）。Minishank3群では、変異体のＰＳＤタンパク質レベルが、ＷＴレベルに回復したことに注意されたい。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ボンフェローニ事後検定を用いる一元配置分散分析（図９Ｄおよび９Ｆ）。
図１０Ａ～１０Ｂは、Ｐ０でのＡＡＶ－miniShank3-v1の単回静脈内注射が、Shank3欠損マウスにおいて線条体シナプス欠陥を救済したことを示す。図１０Ａは、変異体マウスでの減少した線条体集合スパイク（pop spikes）の振幅が、miniShank3-v1を注射した動物で救済されたことを示す。図１０Ｂは、指示された処置を施したマウスからの代表的な皮質線条体の集合スパイクトレースを示す。
図１１Ａ～１１Ｅは、Ｐ０でのminiShank3-v1の全身送達が、Shank3欠損マウスにおける行動障害を救済したことを示す。図１１Ａは、社会的相互作用試験において、変異体マウスが対照と比較して、新規物体（Ｏ）よりよそものマウス（Ｓ）に対して何の選好も示さなかったことを示す。この行動は、miniShank3処置によって救済された。図１１Ｂは、miniShank3処置が、変異体マウスの低下した運動活動（オープンフィールド試験での移動距離の減少）を、野生型レベルまで救済したことを示す。))＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ボンフェローニ事後検定を用いる一元配置分散分析（図１１Ａ～１１Ｄ）、ボンフェローニ事後検定を用いる二元配置分散分析（図１１Ｅ）。データは平均±ＳＥＭとして表示する（ａ：ｎ＝１６のWT＋GFP、ｎ＝１２の変異体＋GFPおよびｎ＝１４の変異体＋miniShank3；ｂ～ｅ：ｎ＝２６のWT＋GFP、ｎ＝２９の変異体＋GFPおよびｎ＝１９の変異体＋miniShank3）。 図１１Ａ～１１Ｅは、Ｐ０でのminiShank3-v1の全身送達が、Shank3欠損マウスにおける行動障害を救済したことを示す。図１１Ｃは、Shank3変異体マウスでの減少した探索行動（立ち上がり（rearing）の時間）が、miniShank3処置群においてＷＴレベルに回復したことを示す。図１１Ｄは、Shank3変異体マウスでの不安様行動（高架式ゼロ迷路試験におけるオープンアーム時間の減少）もまた、miniShank3処置群において救済されたことを示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ボンフェローニ事後検定を用いる一元配置分散分析（図１１Ａ～１１Ｄ）、ボンフェローニ事後検定を用いる二元配置分散分析（図１１Ｅ）。データは平均±ＳＥＭとして表示する（ａ：ｎ＝１６のWT＋GFP、ｎ＝１２の変異体＋GFPおよびｎ＝１４の変異体＋miniShank3；ｂ～ｅ：ｎ＝２６のWT＋GFP、ｎ＝２９の変異体＋GFPおよびｎ＝１９の変異体＋miniShank3）。 図１１Ａ～１１Ｅは、Ｐ０でのminiShank3-v1の全身送達が、Shank3欠損マウスにおける行動障害を救済したことを示す。図１１Ｅは、miniShank3処置群ではShank3変異体群と比較して、運動技能（ロータロッド試験(rotarod test))の改善傾向が見られたことを示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ボンフェローニ事後検定を用いる一元配置分散分析（図１１Ａ～１１Ｄ）、ボンフェローニ事後検定を用いる二元配置分散分析（図１１Ｅ）。データは平均±ＳＥＭとして表示する（ａ：ｎ＝１６のWT＋GFP、ｎ＝１２の変異体＋GFPおよびｎ＝１４の変異体＋miniShank3；ｂ～ｅ：ｎ＝２６のWT＋GFP、ｎ＝２９の変異体＋GFPおよびｎ＝１９の変異体＋miniShank3）。
図１２Ａ～１２Ｆは、生後２８日目（Ｐ２８）でのminiShank3処置が、Shank3変異体マウスにおける社会的障害および運動障害を選択的に救済したことを示す。図１２Ａは、フェーズＩＩの社会的選好アッセイにおいて、物体（Ｏ）対よそものマウス（Ｓ）との緊密な社会的相互作用に費やされた時間を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ボンフェローニ事後検定を用いる一元配置分散分析（図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｅ、および１２Ｆ）、ボンフェローニ事後検定を用いる二元配置分散分析（図１２Ｃおよび１２Ｄ）。データは平均値±ＳＥＭとして表示する（図１２Ａ：ｎ＝２１のWT、ｎ＝２３のMut、およびｎ＝１８のMiniShank3；図１２Ｂ：ｎ＝１４のWT、ｎ＝２０のMut、およびｎ＝１３のMiniShank3；図１２Ｃ：ｎ＝１７のWT、ｎ＝１４のMut、およびｎ＝１０のMiniShank3；図１２Ｄ：ｎ＝１７のWT、ｎ＝１４のMut、およびｎ＝１０のMiniShank3；図１２Ｅ：ｎ＝１４のWT、ｎ＝２０のMut、およびｎ＝１４のMiniShank3；図１２Ｆ：ｎ＝１５のWT、ｎ＝１８のMut、およびｎ＝１７のMiniShank3）。WTは野生型を示す；mutはShank3変異体を示す；MiniShank3は、Shank3変異体＋miniShank3処置を示す。 図１２Ａ～１２Ｆは、生後２８日目（Ｐ２８）でのminiShank3処置が、Shank3変異体マウスにおける社会的障害および運動障害を選択的に救済したことを示す。図１２Ｂは、オープンフィールド試験で移動した総距離を示す。図１２Ｃは、ロータロッド試験での落ちるまでの時間を介して評価された、運動学習の評価を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ボンフェローニ事後検定を用いる一元配置分散分析（図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｅ、および１２Ｆ）、ボンフェローニ事後検定を用いる二元配置分散分析（図１２Ｃおよび１２Ｄ）。データは平均値±ＳＥＭとして表示する（図１２Ａ：ｎ＝２１のWT、ｎ＝２３のMut、およびｎ＝１８のMiniShank3；図１２Ｂ：ｎ＝１４のWT、ｎ＝２０のMut、およびｎ＝１３のMiniShank3；図１２Ｃ：ｎ＝１７のWT、ｎ＝１４のMut、およびｎ＝１０のMiniShank3；図１２Ｄ：ｎ＝１７のWT、ｎ＝１４のMut、およびｎ＝１０のMiniShank3；図１２Ｅ：ｎ＝１４のWT、ｎ＝２０のMut、およびｎ＝１４のMiniShank3；図１２Ｆ：ｎ＝１５のWT、ｎ＝１８のMut、およびｎ＝１７のMiniShank3）。WTは野生型を示す；mutはShank3変異体を示す；MiniShank3は、Shank3変異体＋miniShank3処置を示す。 図１２Ａ～１２Ｆは、生後２８日目（Ｐ２８）でのminiShank3処置が、Shank3変異体マウスにおける社会的障害および運動障害を選択的に救済したことを示す。図１２Ｄは、ロータロッド試験での落ちるまでの時間を介して評価された、運動協調の評価を示す。図１２Ｅは、不安様行動を評価するための、高架式ゼロ迷路のオープンアームで費やされた時間の定量化を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ボンフェローニ事後検定を用いる一元配置分散分析（図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｅ、および１２Ｆ）、ボンフェローニ事後検定を用いる二元配置分散分析（図１２Ｃおよび１２Ｄ）。データは平均値±ＳＥＭとして表示する（図１２Ａ：ｎ＝２１のWT、ｎ＝２３のMut、およびｎ＝１８のMiniShank3；図１２Ｂ：ｎ＝１４のWT、ｎ＝２０のMut、およびｎ＝１３のMiniShank3；図１２Ｃ：ｎ＝１７のWT、ｎ＝１４のMut、およびｎ＝１０のMiniShank3；図１２Ｄ：ｎ＝１７のWT、ｎ＝１４のMut、およびｎ＝１０のMiniShank3；図１２Ｅ：ｎ＝１４のWT、ｎ＝２０のMut、およびｎ＝１４のMiniShank3；図１２Ｆ：ｎ＝１５のWT、ｎ＝１８のMut、およびｎ＝１７のMiniShank3）。WTは野生型を示す；mutはShank3変異体を示す；MiniShank3は、Shank3変異体＋miniShank3処置を示す。 図１２Ａ～１２Ｆは、生後２８日目（Ｐ２８）でのminiShank3処置が、Shank3変異体マウスにおける社会的障害および運動障害を選択的に救済したことを示す。図１２Ｆは、２時間のビデオ撮影におけるグルーミング時間の評価を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ボンフェローニ事後検定を用いる一元配置分散分析（図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｅ、および１２Ｆ）、ボンフェローニ事後検定を用いる二元配置分散分析（図１２Ｃおよび１２Ｄ）。データは平均値±ＳＥＭとして表示する（図１２Ａ：ｎ＝２１のWT、ｎ＝２３のMut、およびｎ＝１８のMiniShank3；図１２Ｂ：ｎ＝１４のWT、ｎ＝２０のMut、およびｎ＝１３のMiniShank3；図１２Ｃ：ｎ＝１７のWT、ｎ＝１４のMut、およびｎ＝１０のMiniShank3；図１２Ｄ：ｎ＝１７のWT、ｎ＝１４のMut、およびｎ＝１０のMiniShank3；図１２Ｅ：ｎ＝１４のWT、ｎ＝２０のMut、およびｎ＝１４のMiniShank3；図１２Ｆ：ｎ＝１５のWT、ｎ＝１８のMut、およびｎ＝１７のMiniShank3）。WTは野生型を示す；mutはShank3変異体を示す；MiniShank3は、Shank3変異体＋miniShank3処置を示す。
図１３Ａ～１３Ｉは、出生後（Ｐ７）のminiShank3処置が、Shank3変異体マウスにおいてすべての行動障害および睡眠障害を完全に救済したことを示す。図１３Ａは、フェーズＩＩの社会的選好アッセイにおいて、物体（Ｏ）対よそものマウス（Ｓ）との緊密な社会的相互作用に費やされた時間を示す。図１３Ｂは、２時間のビデオ撮影におけるグルーミング時間の評価を示す。図１３Ｃは、不安様行動を評価するための、高架式ゼロ迷路のオープンアームで費やされた時間の定量化を示す。図１３Ｄおよび１３Ｅは、オープンフィールド試験で移動した総距離を示す。図１３Ｆは、ロータロッド試験での落ちるまでの時間を介して評価された、運動学習および協調の評価を示す。図１３Ｇは、Shank3変異体マウスにおける睡眠行動を評価するための、ＮＲＥＭ睡眠持続時間の定量化を示す。図１３Ｈは、Shank3変異体マウスにおける睡眠行動を評価するための、ＮＲＥＭ睡眠期間長（NREM sleep bout length）の定量化を示す。図１３Ｉは、Shank3変異体マウスにおける睡眠行動を評価するための、デルタパワー（delta power）の定量化を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ボンフェローニ事後検定を用いる一元配置分散分析（図１３Ａ、１３Ｂ、１３Ｃ、１３Ｄ、１３Ｇ、１３Ｈ、および１３Ｉ）、ボンフェローニ事後検定を用いる二元配置分散分析（図１３Ｅおよび１３Ｆ）。データは平均±ＳＥＭとして表示する（図１３Ａ：ｎ＝１６のWT、ｎ＝９のMutおよびｎ＝１４のMiniShank3；図１３Ｂ：ｎ＝１８のWT、ｎ＝１２のMutおよびｎ＝１４のMiniShank3；図１３Ｃ：ｎ＝１０のWT、ｎ＝１０のMutおよびｎ＝１０のMiniShank3；図１３Ｄ：ｎ＝１８のWT、ｎ＝１４のMutおよびｎ＝１８のMiniShank3；図１３Ｅ：ｎ＝１８のWT、ｎ＝１４のMutおよびｎ＝１８のMiniShank3；図１３Ｆ：ｎ＝１７のWT、ｎ＝１５のMutおよびｎ＝１７のMiniShank3；図１３Ｇ～１３Ｉ：ｎ＝９のWT、ｎ＝８のMutおよびｎ＝８のMiniShank3）。WTは野生型を示す。MutはShank3変異体を示す。MiniShank3は、Shank3変異体＋miniShank3処置を示す。 図１３Ａ～１３Ｉは、出生後（Ｐ７）のminiShank3処置が、Shank3変異体マウスにおいてすべての行動障害および睡眠障害を完全に救済したことを示す。図１３Ｂは、２時間のビデオ撮影におけるグルーミング時間の評価を示す。図１３Ｃは、不安様行動を評価するための、高架式ゼロ迷路のオープンアームで費やされた時間の定量化を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ボンフェローニ事後検定を用いる一元配置分散分析（図１３Ａ、１３Ｂ、１３Ｃ、１３Ｄ、１３Ｇ、１３Ｈ、および１３Ｉ）、ボンフェローニ事後検定を用いる二元配置分散分析（図１３Ｅおよび１３Ｆ）。データは平均±ＳＥＭとして表示する（図１３Ａ：ｎ＝１６のWT、ｎ＝９のMutおよびｎ＝１４のMiniShank3；図１３Ｂ：ｎ＝１８のWT、ｎ＝１２のMutおよびｎ＝１４のMiniShank3；図１３Ｃ：ｎ＝１０のWT、ｎ＝１０のMutおよびｎ＝１０のMiniShank3；図１３Ｄ：ｎ＝１８のWT、ｎ＝１４のMutおよびｎ＝１８のMiniShank3；図１３Ｅ：ｎ＝１８のWT、ｎ＝１４のMutおよびｎ＝１８のMiniShank3；図１３Ｆ：ｎ＝１７のWT、ｎ＝１５のMutおよびｎ＝１７のMiniShank3；図１３Ｇ～１３Ｉ：ｎ＝９のWT、ｎ＝８のMutおよびｎ＝８のMiniShank3）。WTは野生型を示す。MutはShank3変異体を示す。MiniShank3は、Shank3変異体＋miniShank3処置を示す。 図１３Ａ～１３Ｉは、出生後（Ｐ７）のminiShank3処置が、Shank3変異体マウスにおいてすべての行動障害および睡眠障害を完全に救済したことを示す。図１３Ｄおよび１３Ｅは、オープンフィールド試験で移動した総距離を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ボンフェローニ事後検定を用いる一元配置分散分析（図１３Ａ、１３Ｂ、１３Ｃ、１３Ｄ、１３Ｇ、１３Ｈ、および１３Ｉ）、ボンフェローニ事後検定を用いる二元配置分散分析（図１３Ｅおよび１３Ｆ）。データは平均±ＳＥＭとして表示する（図１３Ａ：ｎ＝１６のWT、ｎ＝９のMutおよびｎ＝１４のMiniShank3；図１３Ｂ：ｎ＝１８のWT、ｎ＝１２のMutおよびｎ＝１４のMiniShank3；図１３Ｃ：ｎ＝１０のWT、ｎ＝１０のMutおよびｎ＝１０のMiniShank3；図１３Ｄ：ｎ＝１８のWT、ｎ＝１４のMutおよびｎ＝１８のMiniShank3；図１３Ｅ：ｎ＝１８のWT、ｎ＝１４のMutおよびｎ＝１８のMiniShank3；図１３Ｆ：ｎ＝１７のWT、ｎ＝１５のMutおよびｎ＝１７のMiniShank3；図１３Ｇ～１３Ｉ：ｎ＝９のWT、ｎ＝８のMutおよびｎ＝８のMiniShank3）。WTは野生型を示す。MutはShank3変異体を示す。MiniShank3は、Shank3変異体＋miniShank3処置を示す。 図１３Ａ～１３Ｉは、出生後（Ｐ７）のminiShank3処置が、Shank3変異体マウスにおいてすべての行動障害および睡眠障害を完全に救済したことを示す。図１３Ｆは、ロータロッド試験での落ちるまでの時間を介して評価された、運動学習および協調の評価を示す。図１３Ｇは、Shank3変異体マウスにおける睡眠行動を評価するための、ＮＲＥＭ睡眠持続時間の定量化を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ボンフェローニ事後検定を用いる一元配置分散分析（図１３Ａ、１３Ｂ、１３Ｃ、１３Ｄ、１３Ｇ、１３Ｈ、および１３Ｉ）、ボンフェローニ事後検定を用いる二元配置分散分析（図１３Ｅおよび１３Ｆ）。データは平均±ＳＥＭとして表示する（図１３Ａ：ｎ＝１６のWT、ｎ＝９のMutおよびｎ＝１４のMiniShank3；図１３Ｂ：ｎ＝１８のWT、ｎ＝１２のMutおよびｎ＝１４のMiniShank3；図１３Ｃ：ｎ＝１０のWT、ｎ＝１０のMutおよびｎ＝１０のMiniShank3；図１３Ｄ：ｎ＝１８のWT、ｎ＝１４のMutおよびｎ＝１８のMiniShank3；図１３Ｅ：ｎ＝１８のWT、ｎ＝１４のMutおよびｎ＝１８のMiniShank3；図１３Ｆ：ｎ＝１７のWT、ｎ＝１５のMutおよびｎ＝１７のMiniShank3；図１３Ｇ～１３Ｉ：ｎ＝９のWT、ｎ＝８のMutおよびｎ＝８のMiniShank3）。WTは野生型を示す。MutはShank3変異体を示す。MiniShank3は、Shank3変異体＋miniShank3処置を示す。 図１３Ａ～１３Ｉは、出生後（Ｐ７）のminiShank3処置が、Shank3変異体マウスにおいてすべての行動障害および睡眠障害を完全に救済したことを示す。図１３Ｈは、Shank3変異体マウスにおける睡眠行動を評価するための、ＮＲＥＭ睡眠期間長（NREM sleep bout length）の定量化を示す。図１３Ｉは、Shank3変異体マウスにおける睡眠行動を評価するための、デルタパワー（delta power）の定量化を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ボンフェローニ事後検定を用いる一元配置分散分析（図１３Ａ、１３Ｂ、１３Ｃ、１３Ｄ、１３Ｇ、１３Ｈ、および１３Ｉ）、ボンフェローニ事後検定を用いる二元配置分散分析（図１３Ｅおよび１３Ｆ）。データは平均±ＳＥＭとして表示する（図１３Ａ：ｎ＝１６のWT、ｎ＝９のMutおよびｎ＝１４のMiniShank3；図１３Ｂ：ｎ＝１８のWT、ｎ＝１２のMutおよびｎ＝１４のMiniShank3；図１３Ｃ：ｎ＝１０のWT、ｎ＝１０のMutおよびｎ＝１０のMiniShank3；図１３Ｄ：ｎ＝１８のWT、ｎ＝１４のMutおよびｎ＝１８のMiniShank3；図１３Ｅ：ｎ＝１８のWT、ｎ＝１４のMutおよびｎ＝１８のMiniShank3；図１３Ｆ：ｎ＝１７のWT、ｎ＝１５のMutおよびｎ＝１７のMiniShank3；図１３Ｇ～１３Ｉ：ｎ＝９のWT、ｎ＝８のMutおよびｎ＝８のMiniShank3）。WTは野生型を示す。MutはShank3変異体を示す。MiniShank3は、Shank3変異体＋miniShank3処置を示す。
図１４Ａ～１４Ｂは、出生後（Ｐ７）のminiShank3処置が、Shank3変異体において発作活性を引き起こさなかったことを示す。図１４Ａは、野生型動物、対照ウイルスを注射した変異体、miniShank3を注射した変異体、またはＳｃｎ２ａ変異体の、代表的なＥＥＧトレースを示す。図１４Ｂは、パネルａに示した４つの実験群で観察された棘徐波発射（ＳＷＤ）の定量化を示す（データは平均±ＳＥＭとして表示）。＊＊＊ｐ＜０．００１、ボンフェローニ事後検定を用いる一元配置分散分析。
図１５は、ｈＳｙｎ１プロモーターを有するヒトminiShank3遺伝子のプラスミド構築を示す概略図を図示する。
詳細な説明
本開示の側面は、神経発達障害を処置するための遺伝子治療アプローチに関する。実施例は、遺伝子送達ベクターで発現させて対象に投与することができるShank3タンパク質をコードする非天然ポリヌクレオチドを実証する。本明細書に開示の遺伝子治療戦略は、ＡＡＶ系を使用してShank3遺伝子の機能的コピーを脳細胞に送達し、細胞機能を回復させる。
SHANK3は、興奮性グルタミン酸作動性シナプスでシナプス足場タンパク質をコードし、シグナル伝達分子の動員を調整し、高分子シナプス後（postsynaptic）タンパク質複合体の集合を調整する；これは、適切なシナプスの発達および機能にとって重要である。SHANK3の欠失は、フェラン・マクダーミド症候群における中心的神経発達障害および神経行動障害の主な原因である。ヒトの遺伝子研究では、SHANK3変異が自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）の約１％の主要因であることも特定された。フェラン・マクダーミド症候群の患者およびSHANK3変異を有するその他の個人はしばしば、発育遅延、睡眠障害、筋緊張低下、発話の欠如または重度の言語遅延、およびＡＳＤの特徴的な特色を含む、様々な共存する形質を示す。現在、ＡＳＤに対する有効な処置法は存在しない。
ＡＳＤとShank3との関連は、ＡＳＤのシナプス機能障害と病態生理学の間の直接のつながりを提供した。動物モデルは、ＡＳＤのヒト遺伝学を臨床症状の根底にある脳病理学に橋渡しし、最終的には、効果的な治療法の発見および評価に役立つ。ハエ、魚、およびげっ歯類を対象としたこれまでの研究は、SHANK3の喪失によるシナプス機能障害および行動異常を明らかにした。例えば、マウスモデルにおけるShank3の破壊は、シナプス欠陥、社会的相互作用の障害、運動障害、グルーミングの反復、および不安レベルの増加をもたらした。Shank3欠損はげっ歯類、サル、およびヒト患者に重度の睡眠障害を引き起こすため、睡眠効率は、ＡＳＤのユニークなバイオマーカーを提供する。さらに、Shank3欠損マウスモデルは予測的妥当性を示すが、これは、シナプス欠陥および行動異常が、Shank3が回復された場合に可逆的であるためである。したがって、遺伝子置換は、この単一遺伝子疾患の治療戦略として適している。
新規の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、それらの広範囲の組織親和性、低い免疫原性、非常に効率的で持続的な遺伝子導入、および臨床的に証明された安全性の実績のために、有望な遺伝子送達プラットフォームを代表する。しかしながらShank3は、約５．７ｋｂのコード配列を有する大きなタンパク質であることが当技術分野で知られており、これは、ＡＡＶベクターのパッケージング能力を超える。本出願の発明者らは、Shank3タンパク質の特定の領域がタンパク質の機能にとって重要ではないことを発見し、したがって、有意に小さいコード配列（約２．１ｋｂ～約３．１ｋｂ）を有する異種Shank3発現構築物を設計した；これらは、特定の非必須領域が削除されたShank3タンパク質のバージョンをコードする。本明細書に記載の得られた小型化Shank3タンパク質は、ＡＡＶなどのベクターによって送達することができる。驚くべきことに、本出願の発明者らは、小型化Shank3タンパク質が、マウスモデルにおいてShank3タンパク質をコードする遺伝子の欠失または変異によって引き起こされた欠陥機能を回復することができ、したがって、Shank3変異または欠失に関連する疾患によって引き起こされる異常を、救済する可能性があることを発見した。これは、Shank3タンパク質の部分的フラグメントの修復または改善に焦点を当てているが、しかしShankタンパク質の機能を回復することはできない、当技術分野で知られている方法とは対照的である。したがって本開示は、小型化Shank3タンパク質（「MiniShank3」）を使用してShank3の活性を回復することにより神経発達障害を処置するための、方法および組成物に関する。
Shankタンパク質
タンパク質のShankファミリー（例えば、Shank1、Shank2、およびShank3）は、足場タンパク質を興奮性ニューロンのシナプスにおいてつないで組織化する、主要な足場タンパク質である。このファミリーのメンバーは、少なくとも５つの主要なドメイン領域を共有する：Ｎ末端アンキリンリピート、ＳＨ３ドメイン、ＰＤＺドメイン、プロリンリッチ領域、およびＣ末端ＳＡＭドメイン。これらの機能ドメインを通じて、Shankタンパク質は多くのシナプス後肥厚（ＰＳＤ）タンパク質と相互作用する。いかなる理論にも束縛されることを望むものではないが、Shankタンパク質はＳＡＰＡＰに結合することができ、ＳＡＰＡＰは次にＰＳＤ９５に結合してＰＳＤ９５／ＳＡＰＡＰ／Shankシナプス後複合体を形成する。総合して、これらのマルチドメインタンパク質は、重要な足場を形成し、グルタミン酸作動性シナプスにおいて高分子シナプス後シグナル伝達複合体の集合を調整することが提案されている。この複合体は、神経伝達物質受容体およびシグナル伝達分子のシナプス局在化の標的化、固定、および動的調節において、重要な役割を果たすことが示されている。別の例では、タンパク質のShankファミリーは、Homerへのその結合を介してｍＧｌｕＲ経路に接続されている。
アクチン結合タンパク質との関連により、Shankは脊椎の発達においても主要な役割を果たす。Shank3のトランスフェクションは、培養したわずかな突起部の（aspiny）小脳顆粒細胞に機能的な樹状突起スパインシナプスを誘導するのに十分であることが見出されており、これはスパイン誘導における役割を示す。Shank3は、Shank3α（最長のShank3アイソフォーム）、Shank3β、およびShank3γを含む３つの主要なアイソフォームを有する。Shank3のｓｉＲＮＡノックダウンにより、ＤＩＶ１８培養海馬ニューロンの樹状突起スパインの数が減少し、長さが増加したことが報告されており、これはスパインの成熟における役割を示唆する。この提案された機能は、Shank1の過剰発現が培養海馬ニューロンに既に存在する樹状突起スパインを拡大するという知見によって支持された。さらに、Shank1変異体マウスは樹状突起スパインが小さく、シナプス伝達が弱いことが報告されている。
いくつかの態様において、本開示は、Shankタンパク質活性が破壊された対象においてシナプス活性を回復することができる、Shankタンパク質に関する。いくつかの態様において、Shankタンパク質活性の破壊は、神経発達障害、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）、および／またはフェラン・マクダーミド症候群を有する対象に存在する。いくつかの態様において、本開示に関連するShankタンパク質は、Shank1タンパク質である。いくつかの態様において、本開示は、Shank1またはShank1のバリアントをコードするポリヌクレオチドの、それを必要とする対象における発現に関する。いくつかの態様において、本開示のShankタンパク質は、Shank2タンパク質である。いくつかの態様において、本開示は、Shank2またはShank2のバリアントをコードするポリヌクレオチドの、それを必要とする対象における発現に関する。いくつかの態様において、本開示のShankタンパク質は、Shank3タンパク質である。いくつかの態様において、本開示は、Shank3またはShank3のバリアントをコードするポリヌクレオチドの、それを必要とする対象における発現に関する。本開示に関連するShankタンパク質は、興奮性ニューロンのシナプスにおいて足場タンパク質として機能する、そのバリアントまたはフラグメントを含む任意のShankタンパク質を含み得ることを理解されたい。
本明細書にさらに開示されるのは、遺伝子治療で使用するためのShankタンパク質（Shank1、Shank2、およびShank3）をコードする、ポリヌクレオチドである。
GenBankアクセッション番号BAE16756.1に対応するShank3全長マウスタンパク質配列は、配列番号５によって提供される：
MDGPGASAVVVRVGIPDLQQTKCLRLDPTAPVWAAKQRVLCALNHSLQDALNYGLFQPPSRGRAGKFLDEERLLQDYPPNLDTPLPYLEFRYKRRVYAQNLIDDKQFAKLHTKANLKKFMDYVQLHSTDKVARLLDKGLDPNFHDPDSGECPLSLAAQLDNATDLLKVLRNGGAHLDFRTRDGLTAVHCATRQRNAGALTTLLDLGASPDYKDSRGLTPLYHSALGGGDALCCELLLHDHAQLGTTDENGWQEIHQACRFGHVQHLEHLLFYGANMGAQNASGNTALHICALYNQESCARVLLFRGANKDVRNYNSQTAFQVAIIAGNFELAEVIKTHKDSDVVPFRETPSYAKRRRLAGPSGLASPRPLQRSASDINLKGDQPAASPGPTLRSLPHQLLLQRLQEEKDRDRDGELENDISGPSAGRGGHNKISPSGPGGSGPAPGPGPASPAPPAPPPRGPKRKLYSAVPGRKFIAVKAHSPQGEGEIPLHRGEAVKVLSIGEGGFWEGTVKGRTGWFPADCVEEVQMRQYDTRHETREDRTKRLFRHYTVGSYDSLTSHSDYVIDDKVAILQKRDHEGFGFVLRGAKAETPIEEFTPTPAFPALQYLESVDVEGVAWRAGLRTGDFLIEVNGVNVVKVGHKQVVGLIRQGGNRLVMKVVSVTRKPEEDGARRRAPPPPKRAPSTTLTLRSKSMTAELEELASIRRRKGEKLDEILAVAAEPTLRPDIADADSRAATVKQRPTSRRITPAEISSLFERQGLPGPEKLPGSLRKGIPRTKSVGEDEKLASLLEGRFPRSTSMQDTVREGRGIPPPPQTAPPPPPAPYYFDSGPPPTFSPPPPPGRAYDTVRSSFKPGLEARLGAGAAGLYDPSTPLGPLPYPERQKRARSMIILQDSAPEVGDVPRPAPAATPPERPKRRPRPSGPDSPYANLGAFSASLFAPSKPQRRKSPLVKQLQVEDAQERAALAVGSPGPVGGSFAREPSPTHRGPRPGSLDYSSGEGLGLTFGGPSPGPVKERRLEERRRSTVFLSVGAIEGSPPSADLPSLQPSRSIDERLLGTGATTGRDLLLPSPVSALKPLVGGPSLGPSGSTFIHPLTGKPLDPSSPLALALAARERALASQTPSRSPTPVHSPDADRPGPLFVDVQTRDSERGPLASPAFSPRSPAWIPVPARREAEKPPREERKSPEDKKSMILSVLDTSLQRPAGLIVVHATSNGQEPSRLGAEEERPGTPELAPAPMQAAAVAEPMPSPRAQPPGSIPADPGPGQGSSEEEPELVFAVNLPPAQLSSSDEETREELARIGLVPPPEEFANGILLTTPPPGPGPLPTTVPSPASGKPSSELPPAPESAADSGVEEADTRSSSDPHLETTSTISTVSSMSTLSSESGELTDTHTSFADGHTFLLEKPPVPPKPKLKSPLGKGPVTFRDPLLKQSSDSELMAQQHHAASTGLASAAGPARPRYLFQRRSKLWGDPVESRGLPGPEDDKPTVISELSSRLQQLNKDTRSLGEEPVGGLGSLLDPAKKSPIAAARLFSSLGELSTISAQRSPGGPGGGASYSVRPSGRYPVARRAPSPVKPASLERVEGLGAGVGGAGRPFGLTPPTILKSSSLSIPHEPKEVRFVVRSVSARSRSPSPSPLPSPSPGSGPSAGPRRPFQQKPLQLWSKFDVGDWLESIHLGEHRDRFEDHEIEGAHLPALTKEDFVELGVTRVGHRMNIERALRQLDGS
いくつかの態様において、配列番号５に対応するShank3全長マウスタンパク質配列は、配列番号１５によって提供される、GenBankアクセッション番号NM_021423に対応する核酸配列によってコードされる：
atggacggccccggggccagcgccgtggtcgtgcgcgtcggcatcccggacctgcaacaaacgaagtgcctgcgtctggacccaaccgcgcccgtgtgggccgccaagcagcgtgtgctctgcgccctcaatcatagccttcaagacgcgctcaactacgggctattccagcctccctcccggggtcgcgccggcaagttcctggatgaagagcggctcttacaggactacccgcctaacctggacacgcccctgccctatctggagttccgatacaagcggagagtttatgcccagaacctcatagatgacaagcagtttgcaaagctacacacaaaggcaaacctgaagaagttcatggactatgtccagctacacagcacagataaggtggcccgcctgctggacaaggggctggaccccaatttccatgaccctgactcaggagagtgccctctgagccttgcggcacagttggacaacgccactgacctcctgaaggttctccgcaacggcggtgctcatctggacttccggacccgagatgggctgacagccgtccactgtgctacccgccagcggaacgcaggggcattgacgaccctgctggacctgggggcttcgcctgactacaaggacagccgcggcctgacgcccctgtaccatagtgccctagggggcggggatgccctctgttgcgagctgcttctccatgatcatgcacagctggggaccactgatgagaatggttggcaagagatccatcaggcctgtcgctttggacacgtgcagcacctggagcaccttttgttctatggggccaacatgggtgctcagaatgcctcgggaaacacagccctgcacatctgtgccctctacaaccaggagagttgcgcgcgcgtcctgcttttccgtggtgccaacaaggacgtccgcaattacaacagccagacagccttccaggtggccattattgcagggaactttgagcttgccgaggtaatcaagacccacaaagactccgatgtcgtaccattcagggaaacccccagctatgcaaagcgacggcgtctggctggcccgagtggcctggcatccccacggcccttacagcgctcagccagtgatatcaacctgaaaggtgatcagcccgcagcttctccagggcccactctccgaagcctccctcatcaactcttgctccagaggcttcaggaggagaaagaccgtgacagggatggtgaactggagaatgacatcagcggcccctcagcaggcaggggtggccacaacaagatcagccccagtgggcccggcggatccggccccgcgcccggccccggcccggcgtctcccgcgccccccgcgccgccgccccggggcccgaagcggaaactttacagtgccgtccccggccgcaagttcatcgctgtgaaggcgcacagcccgcagggcgagggcgagatcccgctgcaccgcggcgaggccgtgaaggtgctcagcattggggagggcggtttctgggagggaaccgtgaagggccgaacaggctggttcccagctgactgtgtggaagaagtgcagatgcgacagtatgacacccggcatgaaaccagagaggaccggacgaagcgtctcttccgccactacactgtgggttcctatgacagcctcacttcacacagcgattatgtcatcgatgataaggtggctatcctgcagaaaagggaccatgaggggtttggctttgttctccggggagccaaagcagagacccccattgaggagtttacacccacacctgccttccctgcactccaataccttgagtctgtagatgtggaaggtgtggcctggagggctggacttcgaactggggacttcctcattgaggtgaacggagtgaatgtcgtgaaggttggacacaagcaagtggtgggtctcatccgtcagggtggcaaccgcctggtcatgaaggttgtgtctgtgaccaggaaacccgaggaggatggtgctcggcgcagagccccaccacccccaaagagggctcccagcaccacgctgaccctgcggtccaagtccatgacggctgagctcgaggaacttgcttccattcggagaagaaaaggggagaagttggatgagatcctggcagttgccgcggagccgacactgaggccggacattgcagatgctgactcgagggcggccactgtcaagcagcggcccaccagccggaggatcacccctgctgagatcagctcattgtttgagcgccagggcctcccaggcccagagaagctgccgggctctctgcggaaggggattccacggaccaaatctgtaggggaggatgagaagctggcatccctactggaagggcgcttcccacgcagcacgtcaatgcaggacacagtgcgtgaaggtcgaggcattccacccccgccgcagaccgccccgccacccccacccgcgccctactacttcgactccgggccaccccccaccttctcaccgccgccaccaccgggccgggcctatgacactgtgcgctccagcttcaaaccaggcctggaggctcgtctgggtgcgggggccgccggcctgtatgatccgagcacgcctctgggcccgctgccctaccctgagcgtcagaagcgtgcgcgctccatgatcatactgcaggactctgcgccagaagtgggtgatgtcccccggcctgcgcctgccgccacaccgcctgagcgccccaagcgccggcctcggccgtcaggccctgatagtccctatgccaacctgggcgccttcagtgccagcctcttcgctccgtcgaaaccacagcgccgcaagagcccgctggtgaagcagcttcaggtggaggacgctcaggagcgcgcggccctggccgtgggtagcccgggaccagtgggcggaagctttgcacgagaaccctctccgacgcaccgcgggccccggccaggcagccttgactacagctctggagaaggcctaggccttaccttcggcggccctagccctggcccagtcaaggagcggcgcctggaggagcgacgccgttccactgtgttcctctctgtgggtgccatcgagggcagccctcccagcgcggatctgccatccctacaaccctcccgctccattgatgagcgcctcctggggacaggcgccaccactggccgcgatttgctactcccctcccctgtctctgctctgaagccattggtcggtggtcccagccttgggccctcaggctccaccttcatccaccctctcactggcaaacccttggatcctagctcacccttagctcttgctctggctgcccgggagcgggctctggcctcgcaaacaccttcccggtcccccacacctgtgcacagccccgatgctgaccgccctggacccctctttgtggatgtgcaaacccgagactctgagagaggaccgttggcttccccagccttctcccctcggagtccagcgtggattccagtgcctgctcggagagaggcagagaagccccctcgggaagagcggaagtcaccagaggacaagaagtccatgatcctcagcgtcttggacacgtccttgcaacggccagctggcctcattgttgtgcatgccaccagcaatgggcaggagcccagcaggctgggggctgaagaggagcgccccggtactccggagctggccccagcccccatgcaggcagcagctgtggcagagcccatgccaagcccccgggcccagccccctggcagcatcccagcagatcccgggccaggtcaaggcagctcagaggaggagccagagctggtattcgctgtgaacctgccacctgctcagctgtcctccagcgatgaggagaccagagaggagctggcccgcatagggctagtgccaccccctgaagagtttgccaatgggatcctgctgaccaccccgcccccagggccgggccccttgcccaccacggtacccagcccggcctcagggaagcccagcagcgagctgccccctgcccctgagtctgcagctgactctggagtagaggaggctgacactcgaagctccagtgacccccacctggagaccacaagcaccatttccacagtgtccagcatgtccaccctgagctcggagagtggggaactcacggacacccacacctcctttgccgatggacacacttttctactcgagaagccaccagtgcctcccaagcccaagctcaagtccccgctggggaaggggccggtgaccttcagggacccgctgctgaagcaatcctcggacagtgagctcatggcccagcagcaccatgctgcctctactgggttggcttctgctgctgggcccgcccgccctcgctacctcttccagagaaggtccaagctgtggggggaccccgtggagagtcgggggctccctgggcctgaagatgacaaaccaactgtgatcagtgagctcagctcccgtctgcagcagctgaataaagacacacgctccttgggggaggaaccagttggtggcctgggcagcctgctggaccctgctaagaagtcacccattgcagcagctcggctcttcagcagcctcggtgagctgagcaccatctcagcgcagcgcagcccggggggcccgggcggaggggcctcctactcggtgcggcccagcggccggtaccccgtggcgagacgagccccgagcccagtgaaacccgcatcgctggagcgggtggaggggctgggggcgggcgtgggaggcgcggggcggcccttcggcctcacgcctcccaccatcctcaagtcgtccagcctctccatcccgcacgaacccaaggaagtgcgcttcgtggtgcgaagtgtgagtgcgcgcagccgctccccctcaccatctccgctgccctcgccttctcccggctctggccccagtgccggcccgcgtcggccatttcaacagaagcccctgcagctctggagcaagttcgatgtgggcgactggctggagagcatccacttaggcgagcaccgagaccgcttcgaggaccatgagatcgaaggcgcacacctgcctgcgctcaccaaggaagacttcgtggagctgggcgtcacacgcgttggccaccgcatgaacatcgagcgtgcgctcaggcagctggatggcagctga
GenBankアクセッション番号Q9BYB0.3に対応するShank3全長ヒトタンパク質配列は、配列番号６によって提供される：
MDGPGASAVVVRVGIPDLQQTKCLRLDPAAPVWAAKQRVLCALNHSLQDALNYGLFQPPSRGRAGKFLDEERLLQEYPPNLDTPLPYLEFRYKRRVYAQNLIDDKQFAKLHTKANLKKFMDYVQLHSTDKVARLLDKGLDPNFHDPDSGECPLSLAAQLDNATDLLKVLKNGGAHLDFRTRDGLTAVHCATRQRNAAALTTLLDLGASPDYKDSRGLTPLYHSALGGGDALCCELLLHDHAQLGITDENGWQEIHQACRFGHVQHLEHLLFYGADMGAQNASGNTALHICALYNQESCARVLLFRGANRDVRNYNSQTAFQVAIIAGNFELAEVIKTHKDSDVVPFRETPSYAKRRRLAGPSGLASPRPLQRSASDINLKGEAQPAASPGPSLRSLPHQLLLQRLQEEKDRDRDADQESNISGPLAGRAGQSKISPSGPGGPGPAPGPGPAPPAPPAPPPRGPKRKLYSAVPGRKFIAVKAHSPQGEGEIPLHRGEAVKVLSIGEGGFWEGTVKGRTGWFPADCVEEVQMRQHDTRPETREDRTKRLFRHYTVGSYDSLTSHSDYVIDDKVAVLQKRDHEGFGFVLRGAKAETPIEEFTPTPAFPALQYLESVDVEGVAWRAGLRTGDFLIEVNGVNVVKVGHKQVVALIRQGGNRLVMKVVSVTRKPEEDGARRRAPPPPKRAPSTTLTLRSKSMTAELEELASIRRRKGEKLDEMLAAAAEPTLRPDIADADSRAATVKQRPTSRRITPAEISSLFERQGLPGPEKLPGSLRKGIPRTKSVGEDEKLASLLEGRFPRSTSMQDPVREGRGIPPPPQTAPPPPPAPYYFDSGPPPAFSPPPPPGRAYDTVRSSFKPGLEARLGAGAAGLYEPGAALGPLPYPERQKRARSMIILQDSAPESGDAPRPPPAATPPERPKRRPRPPGPDSPYANLGAFSASLFAPSKPQRRKSPLVKQLQVEDAQERAALAVGSPGPGGGSFAREPSPTHRGPRPGGLDYGAGDGPGLAFGGPGPAKDRRLEERRRSTVFLSVGAIEGSAPGADLPSLQPSRSIDERLLGTGPTAGRDLLLPSPVSALKPLVSGPSLGPSGSTFIHPLTGKPLDPSSPLALALAARERALASQAPSRSPTPVHSPDADRPGPLFVDVQARDPERGSLASPAFSPRSPAWIPVPARREAEKVPREERKSPEDKKSMILSVLDTSLQRPAGLIVVHATSNGQEPSRLGGAEEERPGTPELAPAPMQSAAVAEPLPSPRAQPPGGTPADAGPGQGSSEEEPELVFAVNLPPAQLSSSDEETREELARIGLVPPPEEFANGVLLATPLAGPGPSPTTVPSPASGKPSSEPPPAPESAADSGVEEADTRSSSDPHLETTSTISTVSSMSTLSSESGELTDTHTSFADGHTFLLEKPPVPPKPKLKSPLGKGPVTFRDPLLKQSSDSELMAQQHHAASAGLASAAGPARPRYLFQRRSKLWGDPVESRGLPGPEDDKPTVISELSSRLQQLNKDTRSLGEEPVGGLGSLLDPAKKSPIAAARLFSSLGELSSISAQRSPGGPGGGASYSVRPSGRYPVARRAPSPVKPASLERVEGLGAGAGGAGRPFGLTPPTILKSSSLSIPHEPKEVRFVVRSVSARSRSPSPSPLPSPASGPGPGAPGPRRPFQQKPLQLWSKFDVGDWLESIHLGEHRDRFEDHEIEGAHLPALTKDDFVELGVTRVGHRMNIERALRQLDGS
いくつかの態様において、配列番号６に対応するShank3全長ヒトタンパク質配列は、配列番号１６によって提供される、GenBankアクセッション番号NM_001372044に対応する核酸配列によってコードされる：
atgcagctgagccgcgccgccgccgccgccgccgccgcccctgcggagcccccggagccgctgtcccccgcgccggccccggccccggccccccccggccccctcccgcgcagcgcggccgacggggctccggcgggggggaagggggggccggggcgccgcgcggagtccccgggcgctccgttccccggcgcgagcggccccggcccgggccccggcgcggggatggacggccccggggccagcgccgtggtcgtgcgcgtcggcatcccggacctgcagcagacgaagtgcctgcgcctggacccggccgcgcccgtgtgggccgccaagcagcgcgtgctctgcgccctcaaccacagcctccaggacgcgctcaactatgggcttttccagccgccctcccggggccgcgccggcaagttcctggatgaggagcggctcctgcaggagtacccgcccaacctggacacgcccctgccctacctggagtttcgatacaagcggcgagtttatgcccagaacctcatcgatgataagcagtttgcaaagcttcacacaaaggcgaacctgaagaagttcatggactacgtccagctgcatagcacggacaaggtggcacgcctgttggacaaggggctggaccccaacttccatgaccctgactcaggagagtgccccctgagcctcgcagcccagctggacaacgccacggacctgctaaaggtgctgaagaatggtggtgcccacctggacttccgcactcgcgatgggctcactgccgtgcactgtgccacacgccagcggaatgcggcagcactgacgaccctgctggacctgggggcttcacctgactacaaggacagccgcggcttgacacccctctaccacagcgccctggggggtggggatgccctctgctgtgagctgcttctccacgaccacgctcagctggggatcaccgacgagaatggctggcaggagatccaccaggcctgccgctttgggcacgtgcagcatctggagcacctgctgttctatggggcagacatgggggcccagaacgcctcggggaacacagccctgcacatctgtgccctctacaaccaggagagctgtgctcgtgtcctgctcttccgtggagctaacagggatgtccgcaactacaacagccagacagccttccaggtggccatcatcgcagggaactttgagcttgcagaggttatcaagacccacaaagactcggatgttgtaccattcagggaaacccccagctatgcgaagcggcggcgactggctggccccagtggcttggcatcccctcggcctctgcagcgctcagccagcgatatcaacctgaagggggaggcacagccagcagcttctcctggaccctcgctgagaagcctcccccaccagctgctgctccagcggctgcaagaggagaaagatcgtgaccgggatgccgaccaggagagcaacatcagtggccctttagcaggcagggccggccaaagcaagatcagcccgagcgggcccggcggccccggccccgcgcccggccccggccccgcgccccctgcgccccccgcaccgccgccccggggcccgaagcggaaactttacagcgccgtccccggccgcaagttcatcgccgtgaaggcgcacagcccgcagggtgaaggcgagatcccgctgcaccgcggcgaggccgtgaaggtgctcagcattggggagggcggtttctgggagggaaccgtgaaaggccgcacgggctggttcccggccgactgcgtggaggaagtgcagatgaggcagcatgacacacggcctgaaacgcgggaggaccggacgaagcggctctttcggcactacacagtgggctcctacgacagcctcacctcacacagcgattatgtcattgatgacaaagtggctgtcctgcagaaacgggaccacgagggctttggttttgtgctccggggagccaaagcagagacccccatcgaggagttcacgcccacgccagccttcccggcgctgcagtatctcgagtcggtggacgtggagggtgtggcctggagggccgggctgcgcacgggagacttcctcatcgaggtgaacggggtgaacgtggtgaaggtcggacacaagcaggtggtggctctgattcgccagggtggcaaccgcctcgtcatgaaggttgtgtctgtgacaaggaagccagaagaggacggggctcggcgcagagccccaccgccccccaagagggcccccagcaccacactgaccctgcgctccaagtccatgacagctgagctcgaggaacttgcctccattcggagaagaaaaggggagaagctggacgagatgctggcagccgccgcagagccaacgctgcggccagacatcgcagacgcagactccagagccgccaccgtcaaacagaggcccaccagtcggaggatcacacccgccgagattagctcattgtttgaacgccagggcctcccaggcccagagaagctgccgggctccttgcggaaggggattccacggaccaagtctgtaggggaggacgagaagctggcgtccctgctggaagggcgcttcccgcggagcacctcgatgcaagacccggtgcgcgagggtcgcggcatcccgcccccgccgcagaccgcgccgcctcccccgcccgcgccctactacttcgactcggggccgcccccggccttctcgccgccgcccccgccgggccgcgcctacgacacggtgcgctccagcttcaagcccggcctggaggcgcgcctgggcgcgggcgctgccggcctgtacgagccgggcgcggccctcggcccgctgccgtatcccgagcggcagaagcgcgcgcgctccatgatcatcctgcaggactcggcgcccgagtcgggcgacgcccctcgacccccgcccgcggccaccccgcccgagcgacccaagcgccggccgcggccgcccggccccgacagcccctacgccaacctgggcgccttcagcgccagcctcttcgctccgtccaagccgcagcgccgcaagagccccctggtgaagcagctgcaggtggaggacgcgcaggagcgcgcggccctggccgtgggcagccccggtcccggcggcggcagcttcgcccgcgagccctccccgacccaccgcggtccgcgcccgggtggcctcgactacggcgcgggcgatggcccggggctcgcgttcggcggcccgggcccggccaaggaccggcggctggaggagcggcgccgctccactgtgttcctgtccgtgggggccatcgagggcagcgcccccggcgcggatctgccatccctacagccctcccgctccatcgacgagcgcctcctggggaccggccccaccgccggccgcgacctgctgctgccctccccggtgtctgccctgaagccgttggtcagcggcccgagcctggggccctcgggttccaccttcatccacccactcaccggcaaacccctggaccccagctcacccctggcccttgccctggctgcccgagagcgagctctggcctcccaggcgccctcccggtcccccacacccgtgcacagtcccgacgccgaccgccccggacccctgtttgtggatgtacaggcccgggacccagagcgagggtccctggcttccccggctttctccccacggagcccagcctggattcctgtgcctgctcgcagggaggcagagaaggtcccccgggaggagcggaagtcacccgaggacaagaagtccatgatcctcagcgtcctggacacatccctgcagcggccagctggcctcatcgttgtgcacgccaccagcaacgggcaggagcccagcaggctggggggggccgaagaggagcgcccgggcaccccggagttggccccggcccccatgcagtcagcggctgtggcagagcccctgcccagcccccgggcccagccccctggtggcaccccggcagacgccgggccaggccagggcagctcagaggaagagccagagctggtgtttgctgtgaacctgccacctgcccagctgtcgtccagcgatgaggagaccagggaggagctggcccgaattgggttggtgccaccccctgaagagtttgccaacggggtcctgctggccaccccactcgctggcccgggcccctcgcccaccacggtgcccagcccggcctcagggaagcccagcagtgagccaccccctgcccctgagtctgcagccgactctggggtggaggaggctgacacacgcagctccagcgacccccacctggagaccacaagcaccatctccacggtgtccagcatgtccaccttgagctcggagagcggggaactcactgacacccacacctccttcgctgacggacacacttttctactcgagaagccaccagtgcctcccaagcccaagctcaagtccccgctggggaaggggccggtgaccttcagggacccgctgctgaagcagtcctcggacagcgagctcatggcccagcagcaccacgccgcctctgccgggctggcctctgccgccgggcctgcccgccctcgctacctcttccagagaaggtccaagctatggggggaccccgtggagagccgggggctccctgggcctgaagacgacaaaccaactgtgatcagtgagctcagctcccgcctgcagcagctgaacaaggacacgcgttccctgggggaggaaccagttggtggcctgggcagcctgctggaccctgccaagaagtcgcccatcgcagcagctcggctcttcagcagcctcggtgagctgagctccatttcagcgcagcgcagccccgggggcccgggcggcggggcctcgtactcggtgaggcccagtggccgctaccccgtggcgagacgcgccccgagcccggtgaagcccgcgtcgctggagcgggtggaggggctgggggcgggcgcggggggcgcagggcggcccttcggcctcacgccccccaccatcctcaagtcgtccagcctctccatcccgcacgagcccaaggaggtgcgcttcgtggtgcgcagcgtgagcgcgcgcagtcgctccccctcgccgtcgccgctgccctcgcccgcgtccggccccggccccggcgcccccggcccacgccgacccttccagcagaagccgctgcagctctggagcaagttcgacgtgggcgactggctggagagcatccacctaggcgagcaccgcgaccgcttcgaggaccatgagatagaaggcgcgcacctacccgcgcttaccaaggacgacttcgtggagctgggcgtcacgcgcgtgggccaccgcatgaacatcgagcgcgcgctcaggcagctggacggcagctga
全長Shank3タンパク質は複数のドメインを含み、サイズが約５．２ｋｂの遺伝子によってコードされる。そのサイズのため、全長Shank3を目的の組織または細胞にＡＡＶベクターを介して送達することは困難である。本出願の発明者らは、全長Shank3タンパク質から特定のドメインを除去または切断して、興奮性ニューロンにおけるShank3活性の回復に有効なMiniShank3を生成できることを発見した（図５Ｂおよび６Ｂ）。本明細書に記載のポリヌクレオチドによってコードされるShankタンパク質（例えば、Shank3タンパク質）を小型化して、天然の全長Shank3タンパク質の短縮バリアントを形成することができる。本明細書に開示されるように、小型化Shank3タンパク質、または小型化Shank3タンパク質をコードするＤＮＡ構築物は、交換可能に「miniShank3」または「MiniShank3」と呼ばれる。
いくつかの態様において、本明細書に開示のShank3タンパク質は、小型化Shank3 ＤＮＡ構築物として発現される。いくつかの態様において、本明細書に開示のバリアントShank3 ＤＮＡ構築物およびShank3タンパク質（MiniShank3）は、全長Shank3遺伝子およびタンパク質よりも少ないドメインを含む。いくつかの態様において、本明細書に開示のShank3タンパク質は、非天然ポリヌクレオチドによってコードされる。
本明細書に記載のポリヌクレオチドによってコードされるShank3タンパク質は、１つ以上のタンパク質ドメインを含み得る。例えば、Shank3タンパク質は、ＳＨ３ドメイン、ＰＤＺドメイン、Homer結合ドメイン、コルタクチンドメイン、ＳＡＭドメイン、および／またはアンキリンリピートドメインのうちの１つ以上を含むことができる。
いくつかの態様において、ＳＨ３ドメインは、配列番号６の残基４７４～５２５または配列番号５の残基４７３～５２４に対して、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を含むか、またはその間のすべての値を含めて１００％同一である。いくつかの態様において、ＳＨ３ドメインは、配列番号６の残基４７４～５２５と少なくとも９０％の同一性を含む。いくつかの態様において、ＳＨ３ドメインは、配列番号５の残基４７３～５２４と少なくとも９０％の同一性を含む。いくつかの態様において、ＳＨ３ドメインは、配列番号６の残基４７４～５２５を含む。いくつかの態様において、ＳＨ３ドメインは、配列番号５の残基４７３～５２４を含む。いくつかの態様において、ＳＨ３ドメインは、MiniShank3の構築に適した配列番号６の残基４７４～５２５に対する、任意のパーセント同一性を含むことができる。いくつかの態様において、ＳＨ３ドメインは、MiniShank3の構築に適した配列番号５の残基４７３～５２４に対する、任意のパーセント同一性を含むことができる。
いくつかの態様において、ＰＤＺドメインは、配列番号６の残基５７３～６６２または配列番号５の残基５７２～６６１に対して、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を含むか、またはその間のすべての値を含めて１００％同一である。いくつかの態様において、ＰＤＺドメインは、配列番号６の残基５７３～６６２と少なくとも９０％の同一性を含む。いくつかの態様において、ＰＤＺドメインは、配列番号５の残基５７２～６６１と少なくとも９０％の同一性を含む。いくつかの態様において、ＰＤＺドメインは、配列番号６の残基５７３～６６２を含む。いくつかの態様において、ＰＤＺドメインは、配列番号５の残基５７２～６６１を含む。いくつかの態様において、ＰＤＺドメインは、MiniShank3の構築に適した配列番号６の残基５７３～６６２に対する、任意のパーセント同一性を含むことができる。いくつかの態様において、ＰＤＺドメインは、MiniShank3の構築に適した配列番号５の残基５７２～６６１に対する、任意のパーセント同一性を含むことができる。
いくつかの態様において、Homer結合ドメインは、配列番号５または６の残基１２９４～１３２３に対して、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を含むか、またはその間のすべての値を含めて１００％同一である。いくつかの態様において、Homerドメインは、配列番号５の残基１２９４～１３２３と少なくとも９０％の同一性を含む。いくつかの態様において、Homerドメインは、配列番号６の残基１２９４～１３２３と少なくとも９０％の同一性を含む。いくつかの態様において、Homerドメインは、配列番号５または６の残基１２９４～１３２３を含む。いくつかの態様において、Homerドメインは、MiniShank3の構築に適した配列番号５または６の残基１２９４～１３２３に対する、任意のパーセント同一性を含むことができる。
いくつかの態様において、コルタクチン結合ドメインは、配列番号５または６の残基１４００～１４２６に対して、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を含むか、またはその間のすべての値を含めて１００％同一である。いくつかの態様において、コルタクチン結合ドメインは、配列番号５の残基１４００～１４２６と少なくとも９０％の同一性を含む。いくつかの態様において、コルタクチン結合ドメインは、配列番号６の残基１４００～１４２６と少なくとも９０％の同一性を含む。いくつかの態様において、コルタクチン結合ドメインは、配列番号５または６の残基１４００～１４２６を含む。いくつかの態様において、コルタクチン結合ドメインは、MiniShank3の構築に適した配列番号５または６の残基１４００～１４２６に対する、任意のパーセント同一性を含むことができる。
いくつかの態様において、ＳＡＭドメインは、配列番号６の残基１６６４～１７２９または配列番号５の残基１６６３～１７２８に対して、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を含むか、またはその間のすべての値を含めて１００％同一である。いくつかの態様において、ＳＡＭ結合ドメインは、配列番号６の残基１６６４～１７２９と少なくとも９０％の同一性を含む。いくつかの態様において、ＳＡＭ結合ドメインは、配列番号５の残基１６６３～１７２８と少なくとも９０％の同一性を含む。いくつかの態様において、ＳＡＭドメインは、配列番号６の残基１６６４～１７２９を含む。いくつかの態様において、ＳＡＭドメインは、配列番号５の残基１６６３～１７２８を含む。いくつかの態様において、ＳＡＭ結合ドメインは、MiniShank3の構築に適した配列番号６の残基１６６４～１７２９に対する、任意のパーセント同一性を含むことができる。いくつかの態様において、ＳＡＭ結合ドメインは、MiniShank3の構築に適した配列番号５の残基１６６３～１７２８に対する、任意のパーセント同一性を含むことができる。
いくつかの態様において、アンキリンリピートドメインは、配列番号６の残基１４８～３４５または配列番号５の残基１４７～３１３に対して、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を含むか、またはその間のすべての値を含めて１００％同一である。いくつかの態様において、アンキリンリピートドメインは、配列番号６の残基１４８～３４５と少なくとも９０％の同一性を含む。いくつかの態様において、アンキリンリピートドメインは、配列番号５の残基１４７～３１３と少なくとも９０％の同一性を含む。いくつかの態様において、アンキリンリピートドメインは、MiniShank3の構築に適した配列番号６の残基１４８～３４５に対する、任意のパーセント同一性を含むことができる。いくつかの態様において、アンキリンリピートドメインは、MiniShank3の構築に適した配列番号５の残基１４７～３１３に対する、任意のパーセント同一性を含むことができる。
いくつかの態様において、MiniShank3タンパク質は、配列番号５の全長にわたり、配列番号５と６５％未満の同一性である。いくつかの態様において、MiniShank3タンパク質は、配列番号６の全長にわたり、配列番号６と６５％未満の同一性である。本明細書で使用される場合、「６５％未満」には、MiniShank3の構築に適した６５％未満の任意のパーセント同一性が含まれる。いくつかの態様において、MiniShank3タンパク質は、配列番号５の全長にわたり、配列番号５と、６４％未満、６３％未満、６２％未満、６１％未満、６０％未満、５９％未満、５８％未満、５７％未満、５６％未満、５５％未満、５４％未満、５３％未満、５２％未満、５１％未満、５０％未満、４９％未満、４８％未満、４７％未満、４６％未満、４５％未満、４４％未満、４３％未満、４２％未満、４１％未満、４０％未満、３９％未満、３８％未満、３７％未満、３６％未満、３５％未満、３４％未満、３３％未満、３２％未満、３１％未満、３０％未満、２９％未満、２８％未満、２７％未満、２６％未満、２５％未満、２４％未満、２３％未満、２２％未満、２１％未満、２０％未満、１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満または１０％未満、同一である。
いくつかの態様において、MiniShank3タンパク質は、表１に提供される配列番号１７～２０のいずれか１つと、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるか、またはその間のすべての値を含めて１００％同一である、アミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、MiniShank3タンパク質は、配列番号１７～２０のいずれか１つを含む。いくつかの態様において、配列番号１７は、配列番号１によってコードされる。いくつかの態様において、配列番号１８は、配列番号２によってコードされる。いくつかの態様において、配列番号１９は、配列番号３によってコードされる。いくつかの態様において、配列番号２０は、配列番号４によってコードされる。
いくつかの態様において、MiniShank3タンパク質は、アンキリンリピートドメインを含む。MiniShank3タンパク質がアンキリンリピートドメインを含むある態様において、MiniShank3タンパク質は、配列番号１９および／または２０を含む。
他の態様において、MiniShank3タンパク質は、アンキリンリピートドメインを含まない。MiniShank3タンパク質がアンキリンリピートドメインを含まないある態様において、MiniShank3タンパク質は、配列番号１７および／または１８を含む。
いくつかの態様において、本開示に関連するMiniShank3タンパク質をコードするポリヌクレオチドの配列は、配列番号１～４のいずれかに対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を含むか、またはその間のすべての値を含めて１００％同一であり、およびShank3活性を有する１つ以上のタンパク質をコードする。いくつかの態様において、本開示に関連するMiniShank3タンパク質をコードするポリヌクレオチドの配列は、配列番号１～４のいずれか１つに対して少なくとも９０％の同一性を含み、およびShank3活性を有する１つ以上のタンパク質をコードする。いくつかの態様において、本開示に関連するMiniShank3タンパク質をコードするポリヌクレオチドの配列は、配列番号１～４のいずれか１つを含む。いくつかの態様において、配列番号１～４のいずれか１つは、部分的Shank3活性を有する１つ以上のタンパク質をコードする。いくつかの態様において、配列番号１～４のいずれか１つは、完全なShank3活性を有する１つ以上のタンパク質をコードする。
いくつかの態様において、MiniShank3は、表１に提供される配列番号１～４のいずれか１つによってコードされる。配列番号１および配列番号３は、マウスMiniShank3核酸配列に対応するが、配列番号２および配列番号４は、ヒトMiniShank3核酸配列に対応する。配列番号１および配列番号２は、アンキリンリピートドメインまたはＮ末端ドメインを含まないMiniShank3タンパク質をコードする。配列番号３および配列番号４は、アンキリンリピートドメインおよびＮ末端ドメインを含むMiniShank3タンパク質をコードする。
MiniShank3タンパク質をコードする本明細書に記載のポリヌクレオチドは、少なくとも部分的Shank3活性を有するタンパク質をコードする。
本明細書で開示されるように、配列の「同一性」とは、当業者に知られている数学モデル、アルゴリズム、またはコンピュータープログラムによって対処されるギャップアラインメントを有する２つ以上の配列間の同一一致のパーセントの測定または計算を指す。２つの配列（例えば、核酸またはアミノ酸配列）のパーセント同一性は、例えば、NBLAST（登録商標）およびXBLAST（登録商標）プログラム（バージョン２．０）などのBasic Local Alignment Search Tool（BLAST（登録商標））を使用して決定され得る。Clustal Omegaなどのアラインメント技法を、複数の配列アラインメントに使用することができる。他のアルゴリズムまたはアライメント法には、Smith-Watermanアルゴリズム、Needleman-Wunschアルゴリズム、またはFast Optimal Global Sequence Alignment Algorithm（FOGSAA）が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの態様において、本明細書に開示のShankタンパク質（Shank1、Shank2、Shank3）をコードするポリヌクレオチドは、約４．６ｋｂ未満、約４．５ｋｂ未満、約４．４ｋｂ未満、約４．３ｋｂ未満、約４．２ｋｂ未満、約４．１ｋｂ未満、約４．０ｋｂ未満、約３．９ｋｂ未満、約３．８ｋｂ未満、約３．７ｋｂ未満、約３．６ｋｂ未満、約３．５ｋｂ未満、約３．４ｋｂ未満、約３．３ｋｂ未満、約３．２ｋｂ未満、約３．１ｋｂ未満、約３．０ｋｂ未満、約２．９ｋｂ未満、約２．８ｋｂ未満、約２．７ｋｂ未満、約２．６ｋｂ未満、約２．５ｋｂ未満、約２．４ｋｂ未満、約２．３ｋｂ未満、約２．２ｋｂ未満、または約２．１ｋｂ未満のサイズである。いくつかの態様において、本明細書に開示のShankタンパク質（Shank1、Shank2、Shank3）をコードするポリヌクレオチドは、本開示に開示される方法およびベクターに適した、任意のサイズであることができる。
疾患および障害
本開示は、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）またはフェラン・マクダーミド症候群などの神経発達障害を処置するのに適した、組成物および方法を提供する。
本明細書で使用される「神経発達障害」とは、脳および／または中枢神経系の成長および／または発達を損なう、任意の障害を指す。いくつかの態様において、神経発達障害は、感情、学習能力、自己制御および記憶などの１つ以上の脳機能に影響を与える。本開示の側面は、任意の神経発達障害の処置に適用し得ることを理解されたい。
いくつかの態様において、神経発達障害は自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）である。ＡＳＤの診断は主に、コミュニケーションの障害、社会的相互作用の障害、および興味や行動の反復または制限などの基準に基づいて行われる。ＡＳＤは遺伝性の高い疾患であり、一卵性双生児での一致率は９０％にもなる。しかし、ＡＳＤは臨床的に不均一（heterogeneous）であり、症状の重症度が異なる様々な個別の障害をカバーする。ＡＳＤは病因的に不均一であると考えられており、おそらく多遺伝子性、単一遺伝子性、および環境要因が含まれる。
シナプスの接続および機能の変化は、ＡＳＤの根底にある重要なメカニズムとして提案されてきた。最近の遺伝子研究では多数のＡＳＤの候補遺伝子が特定されており、その多くはShank3、Neuroligin-3、Neuroligin-4、およびNeurexin-1などのシナプスタンパク質をコードする。これらの知見は、シナプス機能障害がＡＳＤのサブセットの共通メカニズムの根底にあり得ることを示唆する。様々なShank3変異が、知的障害（ＩＤ）を伴うＡＳＤの単一遺伝子的原因として特定されている。ＡＳＤ患者においては、特定されたすべてのShank3欠失および／または変異が、Shank3遺伝子の２つの正常なコピーのうちの１つの機能喪失（ＬｏＦ）につながる（すなわち、ハプロ不全）。最近の遺伝子スクリーニングでは、フェラン・マクダーミド症候群（ＰＭＳ）と診断されていないＡＳＤ患者の微小欠失、ナンセンス変異、再発性ブレークポイントを含む、Shank3遺伝子の多数の変異も特定された。これらは、Shank3遺伝子の破壊および／または変異を、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）の単一遺伝子的原因として示唆する。現在の推定では、Shank3が関与する欠失および／または変異は、ＩＤを有するすべてのＡＳＤ患者の約２％の主要因とされている。したがって、Shank3の機能を理解することは、ＡＳＤの病理学的メカニズムへの洞察を提供する可能性がある。
本明細書で使用する「知的障害」とは、対象に知的機能および／または適応機能の欠損をもたらす能力障害を指す。知的機能には、例えば、推論、問題解決、計画、抽象的思考、判断、学術的学習、および／または経験的学習が含まれる。知的機能は、ＩＱテストなどの当技術分野で知られている任意の方法を使用して測定することができる。適応機能には、例えば、コミュニケーションおよび社会的スキルなど、自立した責任ある様式で生活するために必要なスキルが含まれる。場合によっては、知的障害は小児期または思春期に明らかになり得る。
いくつかの態様において、神経発達障害はフェラン・マクダーミド症候群（ＰＭＳ、22q13.3欠失症候群）であり、これは、自閉症様行動、筋緊張低下、重度の知的障害、ならびに発話および言語の発達障害を示す自閉症スペクトラム障害である。Shank3は、フェラン・マクダーミド症候群で欠失が報告されている遺伝子の１つである。Shank3の破壊は、フェラン・マクダーミド症候群における中心的神経発達障害および神経行動障害の原因であると考えられているが、これは、無傷のShank3遺伝子を持つ２２番環状染色体を保有する個体では、表現型が正常だからである。
他の神経発達障害には、限定はされないが以下が含まれ得る：注意欠如／多動症（ＡＤＨＤ）、失読症または算数障害などの学習障害、知的障害（精神遅滞）、行為障害または運動障害、脳性麻痺、視覚および聴覚障害、発達言語障害、神経遺伝学的障害であって例えば脆弱Ｘ症候群、ダウン症候群、レット症候群、低ゴナドトロピン性性腺機能低下症候群、および外傷性脳損傷など。
対象
本明細書に記載の方法によって処置される対象は、ヒト対象または非ヒト対象であり得る。非ヒト対象には、例えば以下が含まれる：非ヒト霊長類；ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、およびブタなどの家畜；イヌおよびネコなどのペット；およびげっ歯類。
本明細書に記載の方法によって処置される対象は、神経発達障害を有するか、有する疑いがあるか、または発症するリスクがある対象であり得る。いくつかの態様において、対象は神経発達障害を有すると診断されているが、他の態様において、対象は神経発達障害を有すると診断されていない。いくつかの態様において、対象は、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）を有するか、有する疑いがあるか、または発症するリスクがあるヒト対象である。いくつかの態様において、対象は、フェラン・マクダーミド症候群を有するか、有する疑いがあるか、または発症するリスクがあるヒト対象である。いくつかの態様において、対象は、対照対象と比較してShank3遺伝子の発現が低下している対象である。いくつかの態様において、対象におけるShank3遺伝子の発現は、対照対象と比較して、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、または少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、または少なくとも１０００倍、低減されている。いくつかの態様において、対照対象は、神経発達障害を有しないか、有する疑いがないか、または有するリスクがない対象である。いくつかの態様において、対象におけるShank3遺伝子の発現低下は、Shank3遺伝子の少なくとも１つのコピーの破壊によって引き起こされる。いくつかの態様において、Shank3遺伝子の破壊は、Shank3遺伝子の少なくとも１つのコピーにおける欠失を含む。いくつかの態様において、Shank3遺伝子の破壊は、Shank3遺伝子の少なくとも１つのコピー内に１つ以上の変異を含む。
いくつかの態様において、対象は、ＡＳＤの１つ以上の症状を示すヒト対象である。いくつかの態様において、対象は、発育遅延を示すヒト対象である。いくつかの態様において、対象は、知的障害（ＩＤ）を示すヒト対象である。いくつかの態様において、対象は、睡眠障害を示すヒト対象である。いくつかの態様において、対象は、筋緊張低下を示すヒト対象である。いくつかの態様において、対象は、発話の欠如を示すヒト対象である。いくつかの態様において、対象は、言語遅延を示すヒト対象である。いくつかの態様において、対象は、ＡＳＤの任意の症状または徴候を示すヒト対象である。
いくつかの態様において、対象は、成人のヒト対象である。いくつかの態様において、成人は２５歳より年上である。いくつかの態様において、成人は２５歳以下である。いくつかの態様において、成人は２１歳以下である。いくつかの態様において、成人は１８歳以下である。いくつかの態様において、成人は１６歳である。いくつかの態様において、対象は高齢者（例えば、６５歳以上）である。いくつかの態様において、成人は、本明細書に開示の処置に適した、成人期の任意の年齢であることができる。
いくつかの態様において、対象は、成人ではないヒト対象である。いくつかの態様において、ヒト対象は１６歳以下である。いくつかの態様において、ヒト対象は１０歳を超えていない。いくつかの態様において、ヒト対象は、１０歳以下である。いくつかの態様において、ヒト対象は、小児または乳幼児である。いくつかの態様において、ヒト対象は幼児である。いくつかの態様において、ヒト対象は、発達の胎児段階にある。いくつかの態様において、ヒト対象は、発達の出生前段階にある。
ウイルスベクター
本明細書に開示されるように、MiniShank3タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、目的の組織または細胞にウイルスベクターで送達することができる。本明細書に記載のベクターは、目的のタンパク質をコードする核酸を対象に送達するために使用することができ、これには例えば、対象の特定の臓器または中枢神経系（ＣＮＳ）への送達を含む。いくつかの態様において、目的のタンパク質はShankタンパク質である。いくつかの態様において、目的のタンパク質はShank3タンパク質である。いくつかの態様において、目的のタンパク質はMiniShank3タンパク質である。
いくつかの態様において、本開示は、本明細書に開示のShankタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。いくつかの態様において、本開示は、Shank3タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。いくつかの態様において、ベクターはウイルスベクターである。いくつかの態様において、ベクターはＡＡＶベクターである。
ＡＡＶとは、ウイルスのパルボウイルス科内の複製欠損ディペンドパルボウイルスを指す。ＡＡＶは、天然のウイルスに由来するか、または組換え体であり得る。ＡＡＶは、天然のカプシドタンパク質または組換えカプシドタンパク質に由来し得るカプシドに、パッケージ化することができる。ＡＡＶの一本鎖ＤＮＡゲノムは、逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む。ＩＴＲは、ＡＡＶゲノムの複製とカプシド化、および宿主ゲノムへの組み込みおよびその切除に関与する。いかなる理論にも束縛されることを望むものではないが、ＡＡＶベクターは、５’ＩＴＲおよび／または３’ＩＴＲを含む１つ以上のＩＴＲ、１つ以上のプロモーター、１つ以上の目的のタンパク質をコードする１つ以上の核酸配列、および／または追加の転写後調節要素を含むことができる。本明細書に開示されるＡＡＶベクターは、当業者に知られている、例えばSambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (2012))に記載のような標準の分子生物学の技法を用いて、調製することができる；これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様において、ＡＡＶは宿主細胞ゲノムに組み込まれる。いくつかの態様において、ＡＡＶは宿主ゲノムに組み込まれない。いくつかの態様において、本明細書に開示のＡＡＶベクターは、任意の既知の生物からの配列を含み得る。いくつかの態様において、本明細書に開示のＡＡＶベクターは、合成配列を含み得る。ＡＡＶベクター配列は、当業者に知られている任意の方法で修飾することができ、これは例えば、挿入、欠失または置換を組み込むことによる、および／または、プロモーター、エンハンサー、ならびに例えばポリアデニル化シグナルなどの転写および翻訳ターミネーター等の、転写後調節要素の使用による。いくつかの態様において、ＡＡＶベクターは、複製および組み込みに関連する配列を含むことができる。
いくつかの態様において、本明細書に開示のMiniShank3は、目的の組織または細胞にＡＡＶベクターを介して送達される。いくつかの態様において、本明細書に開示のMiniShank3を送達するＡＡＶベクターは、対象の中枢神経系（ＣＮＳ）に送達される。本明細書で使用される場合、ＡＡＶベクターをＣＮＳに送達することは、ＡＡＶベクターをＣＮＳ内の任意の目的組織または細胞に送達することを含み得る。いくつかの態様において、ＡＡＶベクターをＣＮＳに送達することは、ＡＡＶベクターを神経組織または細胞に送達することを含む。いくつかの態様において、ＡＡＶベクターをＣＮＳに送達することは、ＡＡＶベクターを脳に送達することを含む。いくつかの態様において、ＡＡＶベクターをＣＮＳに送達することは、ＡＡＶベクターを脊髄に送達することを含む。いくつかの態様において、ＡＡＶベクターをＣＮＳに送達することは、ＡＡＶベクターを白質および灰白質に送達することを含む。いくつかの態様において、本明細書に開示のMiniShank3を送達するＡＡＶベクターは、本明細書に開示される処置に適した対象の任意の目的組織または細胞に送達される。
本開示において使用される場合、ＡＡＶベクターを「送達すること」または「投与すること」は、ＡＡＶベクターまたはＡＡＶベクターを含む組成物を、対象に送達するまたは投与するための、当技術分野で知られている任意の方法を含むことができる。投与には、ＡＡＶベクターまたはＡＡＶベクターを含む組成物の直接投与、または当技術分野で知られている血液脳関門を迂回するための受動拡散または対流強化送達（ＣＥＤ（convection-enhanced delivery））による末梢投与が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に記載のＡＡＶベクターは、本開示の側面に適合する任意の組成物で投与することができる。
ＡＡＶベクターは任意の既知のＡＡＶ血清型を含むことができ、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、およびＡＡＶ１１である。いくつかの態様において、ＡＡＶ血清型はＡＡＶ９である。ＡＡＶウイルスの分岐群（clade）はGao et al. (2004) J. Virol. 78(12):6381-6388に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの態様において、ＣＮＳへの送達に適した任意のＡＡＶ血清型が選択され得る。
本開示のＡＡＶベクターは、任意の天然または組換えＡＡＶ血清型を含み得るか、またはそれに由来し得る。いくつかの態様において、ＡＡＶベクターは、WO 2017/201258A1に記載のＡＡＶ血清型を利用するか、またはそれらに基づくことができ、この内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる；前記記載のＡＡＶ血清型は例えば、限定はされないが以下である：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ３－３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ４－４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ６．１．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ７．２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．１１、ＡＡＶ９．１３、ＡＡＶ９．１６、ＡＡＶ９．２４、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９．６１、ＡＡＶ９．６８、ＡＡＶ９．８４、ＡＡＶ９．９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１６．３、ＡＡＶ２４．１、ＡＡＶ２７．３、ＡＡＶ４２．１２、ＡＡＶ４２－１ｂ、ＡＡＶ４２－２、ＡＡＶ４２－３ａ、ＡＡＶ４２－３ｂ、ＡＡＶ４２－４、ＡＡＶ４２－５ａ、ＡＡＶ４２－５ｂ、ＡＡＶ４２－６ｂ、ＡＡＶ４２－８、ＡＡＶ４２－１０、ＡＡＶ４２－１１、ＡＡＶ４２－１２、ＡＡＶ４２－１３、ＡＡＶ４２－１５、ＡＡＶ４２－ａａ、ＡＡＶ４３－１、ＡＡＶ４３－１２、ＡＡＶ４３－２０、ＡＡＶ４３－２１、ＡＡＶ４３－２３、ＡＡＶ４３－２５、ＡＡＶ４３－５、ＡＡＶ４４．１、ＡＡＶ４４．２、ＡＡＶ４４．５、ＡＡＶ２２３．１、ＡＡＶ２２３．２、ＡＡＶ２２３．４、ＡＡＶ２２３．５、ＡＡＶ２２３．６、ＡＡＶ２２３．７、ＡＡＶ１－７／ｒｈ．４８、ＡＡＶ１－８／ｒｈ．４９、ＡＡＶ２－１５／ｒｈ．６２、ＡＡＶ２－３／ｒｈ．６１、ＡＡＶ２－４／ｒｈ．５０、ＡＡＶ２－５／ｒｈ．５１、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．６、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．９、ＡＡＶ３－９／ｒｈ．５２、ＡＡＶ３－１１／ｒｈ．５３、ＡＡＶ４－８／ｒ１１．６４、ＡＡＶ４－９／ｒｈ．５４、ＡＡＶ４－１９／ｒｈ．５５、ＡＡＶ５－３／ｒｈ．５７、ＡＡＶ５－２２／ｒｈ．５８、ＡＡＶ７．３／ｈｕ．７、ＡＡＶ１６．８／ｈｕ．１０、ＡＡＶ１６．１２／ｈｕ．１１、ＡＡＶ２９．３／ｂｂ．１、ＡＡＶ２９．５／ｂｂ．２、ＡＡＶ１０６．１／ｈｕ．３７、ＡＡＶ１１４．３／ｈｕ．４０、ＡＡＶ１２７．２／ｈｕ．４１、ＡＡＶ１２７．５／ｈｕ．４２、ＡＡＶ１２８．３／ｈｕ．４４、ＡＡＶ１３０．４／ｈｕ．４８、ＡＡＶ１４５．１／ｈｕ．５３、ＡＡＶ１４５．５／ｈｕ．５４、ＡＡＶ１４５．６／ｈｕ．５５、ＡＡＶ１６１．１０／ｈｕ．６０、ＡＡＶ１６１．６／ｈｕ．６１、ＡＡＶ３３．１２／ｈｕ．１７、ＡＡＶ３３．４／ｈｕ．１５、ＡＡＶ３３．８／ｈｕ．１６、ＡＡＶ５２／ｈｕ．１９、ＡＡＶ５２．１／ｈｕ．２０、ＡＡＶ５８．２／ｈｕ．２５、ＡＡＶＡ３．３、ＡＡＶＡ３．４、ＡＡＶＡ３．５、ＡＡＶＡ３．７、ＡＡＶＣ１、ＡＡＶＣ２、ＡＡＶＣ５、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＤＪ８、ＡＡＶＦ３、ＡＡＶＦ５、ＡＡＶＨ２、ＡＡＶｒｈ．７２、ＡＡＶｈｕ．８、ＡＡＶｒｈ．６８、ＡＡＶｒｈ．７０、ＡＡＶｐｉ．１、ＡＡＶｐｉ．３、ＡＡＶｐｉ．２、ＡＡＶｒｈ．６０、ＡＡＶｒｈ．４４、ＡＡＶｒｈ．６５、ＡＡＶｒｈ．５５、ＡＡＶｒｈ．４７、ＡＡＶｒｈ．６９、ＡＡＶｒｈ．４５、ＡＡＶｒｈ．５９、ＡＡＶｈｕ．１２、ＡＡＶＨ６、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＡＶＨ－１／ｈｕ．１、ＡＡＶＨ－５／ｈｕ．３、ＡＡＶＬＧ－１０／ｒｈ．４０、ＡＡＶＬＧ－４／ｒｈ．３８、ＡＡＶＬＧ－９／ｈｕ．３９、ＡＡＶＮ７２１－８／ｒｈ．４３、ＡＡＶＣｈ．５、ＡＡＶＣｈ．５Ｒ１、ＡＡＶｃｙ．２、ＡＡＶｃｙ．３、ＡＡＶｃｙ．４、ＡＡＶｃｙ．５、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ１、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ２、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ３、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ４、ＡＡＶｃｙ．６、ＡＡＶｈｕ．１、ＡＡＶｈｕ．２、ＡＡＶｈｕ．３、ＡＡＶｈｕ．４、ＡＡＶｈｕ．５、ＡＡＶｈｕ．６、ＡＡＶｈｕ．７、ＡＡＶｈｕ．９、ＡＡＶｈｕ．１０、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．１３、ＡＡＶｈｕ．１５、ＡＡＶｈｕ．１６、ＡＡＶｈｕ．１７、ＡＡＶｈｕ．１８、ＡＡＶｈｕ．２０、ＡＡＶｈｕ．２１、ＡＡＶｈｕ．２２、ＡＡＶｈｕ．２３．２、ＡＡＶｈｕ．２４、ＡＡＶｈｕ．２５、ＡＡＶｈｕ．２７、ＡＡＶｈｕ．２８、ＡＡＶｈｕ．２９、ＡＡＶｈｕ．２９Ｒ、ＡＡＶｈｕ．３１、ＡＡＶｈｕ．３２、ＡＡＶｈｕ．３４、ＡＡＶｈｕ．３５、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｈｕ．３９、ＡＡＶｈｕ．４０、ＡＡＶｈｕ．４１、ＡＡＶｈｕ．４２、ＡＡＶｈｕ．４３、ＡＡＶｈｕ．４４、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４５、ＡＡＶｈｕ．４６、ＡＡＶｈｕ．４７、ＡＡＶｈｕ．４８、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４９、ＡＡＶｈｕ．５１、ＡＡＶｈｕ．５２、ＡＡＶｈｕ．５４、ＡＡＶｈｕ．５５、ＡＡＶｈｕ．５６、ＡＡＶｈｕ．５７、ＡＡＶｈｕ．５８、ＡＡＶｈｕ．６０、ＡＡＶｈｕ．６１、ＡＡＶｈｕ．６３、ＡＡＶｈｕ．６４、ＡＡＶｈｕ．６６、ＡＡＶｈｕ．６７、ＡＡＶｈｕ．１４／９、ＡＡＶｈｕ．ｔ１９、ＡＡＶｒｈ．２、ＡＡＶｒｈ．２Ｒ、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．８Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．１２、ＡＡＶｒｈ．１３、ＡＡＶｒｈ．１３Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１４、ＡＡＶｒｈ．１７、ＡＡＶｒｈ．１８、ＡＡＶｒｈ．１９、ＡＡＶｒｈ．２０、ＡＡＶｒｈ．２１、ＡＡＶｒｈ．２２、ＡＡＶｒｈ．２３、ＡＡＶｒｈ．２４、ＡＡＶｒｈ．２５、ＡＡＶｒｈ．３１、ＡＡＶｒｈ．３２、ＡＡＶｒｈ．３３、ＡＡＶｒｈ．３４、ＡＡＶｒｈ．３５、ＡＡＶｒｈ．３６、ＡＡＶｒｈ．３７、ＡＡＶｒｈ．３７Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．３８、ＡＡＶｒｈ．３９、ＡＡＶｒｈ．４０、ＡＡＶｒｈ．４６、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｒｈ．４８．１、ＡＡＶｒｈ．４８．１．２、ＡＡＶｒｈ．４８．２、ＡＡＶｒｈ．４９、ＡＡＶｒｈ．５１、ＡＡＶｒｈ．５２、ＡＡＶｒｈ．５３、ＡＡＶｒｈ．５４、ＡＡＶｒｈ．５６、ＡＡＶｒｈ．５７、ＡＡＶｒｈ．５８、ＡＡＶｒｈ．６１、ＡＡＶｒｈ．６４、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ１、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．６７、ＡＡＶｒｈ．７３、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ａ５８６Ｒ変異体、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ｒ５３３Ａ変異体、ＡＡＡＶ、ＢＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、ＡＡＶｈＥ１．１、ＡＡＶｈＥｒ１．５、ＡＡＶｈＥＲ１．１４、ＡＡＶｈＥｒ１．８、ＡＡＶｈＥｒ１．１６、ＡＡＶｈＥｒ１．１８、ＡＡＶｈＥｒ１．３５、ＡＡＶｈＥｒ１．７、ＡＡＶｈＥｒ１．３６、ＡＡＶｈＥｒ２．２９、ＡＡＶｈＥｒ２．４、ＡＡＶｈＥｒ２．１６、ＡＡＶｈＥｒ２．３０、ＡＡＶｈＥｒ２．３１、ＡＡＶｈＥｒ２．３６、ＡＡＶｈＥＲ１．２３、ＡＡＶｈＥｒ３．１、ＡＡＶ２．５Ｔ、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ、ＡＡＶ－ＬＫ０１、ＡＡＶ－ＬＫ０２、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ－ＬＫ０４、ＡＡＶ－ＬＫ０５、ＡＡＶ－ＬＫ０６、ＡＡＶ－ＬＫ０７、ＡＡＶ－ＬＫ０８、ＡＡＶ－ＬＫ０９、ＡＡＶ－ＬＫ１０、ＡＡＶ－ＬＫ１１、ＡＡＶ－ＬＫ１２、ＡＡＶ－ＬＫ１３、ＡＡＶ－ＬＫ１４、ＡＡＶ－ＬＫ１５、ＡＡＶ－ＬＫ１６、ＡＡＶ－ＬＫ１７、ＡＡＶ－ＬＫ１８、ＡＡＶ－ＬＫ１９、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ２、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ４、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ６、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ７、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ８、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ１１、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ１２、ＡＡＶ－２－ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ－１０１、ＡＡＶ－８ｈ、ＡＡＶ－８ｂ、ＡＡＶ－ｈ、ＡＡＶ－ｂ、ＡＡＶ ＳＭ１０－２、ＡＡＶシャッフル１００－１、ＡＡＶシャッフル１００－３、ＡＡＶシャッフル１００－７、ＡＡＶシャッフル１０－２、ＡＡＶシャッフル１０－６、ＡＡＶシャッフル１０－８、ＡＡＶシャッフル１００－２、ＡＡＶ ＳＭ１０－１、ＡＡＶ ＳＭ１０－８、ＡＡＶ ＳＭ１００－３、ＡＡＶ ＳＭ１００－１０、ＢＮＰ６１ ＡＡＶ、ＢＮＰ６２ ＡＡＶ、ＢＮＰ６３ ＡＡＶ、ＡＡＶｒｈ．５０、ＡＡＶｒｈ．４３、ＡＡＶｒｈ．６２、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｈｕ．１９、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．５３、ＡＡＶ４－８／ｒｈ．６４、ＡＡＶＬＧ－９／ｈｕ．３９、ＡＡＶ５４．５／ｈｕ．２３、ＡＡＶ５４．２／ｈｕ．２２、ＡＡＶ５４．７／ｈｕ．２４、ＡＡＶ５４．１／ｈｕ．２１、ＡＡＶ５４．４Ｒ／ｈｕ．２７、ＡＡＶ４６．２／ｈｕ．２８、ＡＡＶ４６．６／ｈｕ．２９、ＡＡＶ１２８．１／ｈｕ．４３、true typeＡＡＶ（ｔｔＡＡＶ）、ＵＰＥＮＮ ＡＡＶ１０、日本のＡＡＶ１０血清型、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．１、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．１０、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．２、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．３、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．４、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．５、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．７、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．８、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｂ７．３、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｂ７．４、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ１、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ２、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ３、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ４、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ５、ＡＡＶ ＣＢｒ－ｅ５、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ６、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ７、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ８、ＡＡＶ ＣＨｔ－１、ＡＡＶ ＣＨｔ－２、ＡＡＶ ＣＨｔ－３、ＡＡＶ ＣＨｔ－６．１、ＡＡＶ ＣＨｔ－６．１０、ＡＡＶ ＣＨｔ－６．５、ＡＡＶ ＣＨｔ－６．６、ＡＡＶ ＣＨｔ－６．７、ＡＡＶ ＣＨｔ－６．８、ＡＡＶ ＣＨｔ－Ｐ１、ＡＡＶ ＣＨｔ－Ｐ２、ＡＡＶ ＣＨｔ－Ｐ５、ＡＡＶ ＣＨｔ－Ｐ６、ＡＡＶ ＣＨｔ－Ｐ８、ＡＡＶ ＣＨｔ－Ｐ９、ＡＡＶ ＣＫｄ－１、ＡＡＶ ＣＫｄ－１０、ＡＡＶ ＣＫｄ－２、ＡＡＶ ＣＫｄ－３、ＡＡＶ ＣＫｄ－４、ＡＡＶ ＣＫｄ－６、ＡＡＶ ＣＫｄ－７、ＡＡＶ ＣＫｄ－８、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ１、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ２、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ３、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ４、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ５、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ６、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ７、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ８、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｈ１、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｈ２、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｈ３、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｈ４、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｈ５、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｈ６、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｎ３、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｎ４、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｎ９、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ１、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ２、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ３、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ４、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ５、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ６、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ７、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ８、ＡＡＶ ＣＬｖ－１、ＡＡＶ ＣＬｖ１－１、ＡＡＶ Ｃｌｖ１－１０、ＡＡＶ ＣＬｖ１－２、ＡＡＶ ＣＬｖ－１２、ＡＡＶ ＣＬｖ１－３、ＡＡＶ ＣＬｖ－１３、ＡＡＶ ＣＬｖ１－４、ＡＡＶ Ｃｌｖ１－７、ＡＡＶ Ｃｌｖ１－８、ＡＡＶ Ｃｌｖ１－９、ＡＡＶ ＣＬｖ－２、ＡＡＶ ＣＬｖ－３、ＡＡＶ ＣＬｖ－４、ＡＡＶ ＣＬｖ－６、ＡＡＶ ＣＬｖ－８、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ１、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ２、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ３、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ４、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ５、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ６、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ７、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ８、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｅ１、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｋ１、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｋ３、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｋ６、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｌ４、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｌ５、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｌ６、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ１、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ１１、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ２、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ５、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ６、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ７、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ８、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ９、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ１、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ２、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ３、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ４、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ５、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ６、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ７、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ８、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ９、ＡＡＶ ＣＳｐ－１、ＡＡＶ ＣＳｐ－１０、ＡＡＶ ＣＳｐ－１１、ＡＡＶ ＣＳｐ－２、ＡＡＶ ＣＳｐ－３、ＡＡＶ ＣＳｐ－４、ＡＡＶ ＣＳｐ－６、ＡＡＶ ＣＳｐ－７、ＡＡＶ ＣＳｐ－８、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．１０、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．２、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．４、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．５、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．６、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．７、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．８、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．９、ＡＡＶ ＣＳｐ－９、ＡＡＶ．ｈｕ．４８Ｒ３、ＡＡＶ．ＶＲ－３５５、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶＦ１／ＨＳＣ１、ＡＡＶＦ１１／ＨＳＣ１１、ＡＡＶＦ１２／ＨＳＣ１２、ＡＡＶＦ１３／ＨＳＣ１３、ＡＡＶＦ１４／ＨＳＣ１４、ＡＡＶＦ１５／ＨＳＣ１５
、ＡＡＶＦ１６／ＨＳＣ１６、ＡＡＶＦ１７／ＨＳＣ１７、ＡＡＶＦ２／ＨＳＣ２、ＡＡＶＦ３／ＨＳＣ３、ＡＡＶＦ４／ＨＳＣ４、ＡＡＶＦ５／ＨＳＣ５、ＡＡＶＦ６／ＨＳＣ６、ＡＡＶＦ７／ＨＳＣ７、ＡＡＶＦ８／ＨＳＣ８、ＡＡＶＦ９／ＨＳＣ９、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ（ＰＨＰ．Ｂ）、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ａ（ＰＨＰ．Ａ）、Ｇ２Ｂ－２６、Ｇ２Ｂ－１３、ＴＨ１．１－３２および／またはＴＨ１．１－３５、ならびにそれらのバリアント。ＡＡＶベクターは、US 9,585,971、US 2017/0166926、およびWO2020/160337にさらに記載されており、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様において、本明細書に開示のMiniShank3は、ＡＡＶベクターによって送達される。いくつかの態様において、ＡＡＶベクターは、導入遺伝子およびその調節配列、および任意に５’および３’ＩＴＲを含む。いくつかの態様において、導入遺伝子およびその調節配列は、５’および３’ＩＴＲ配列に隣接する。導入遺伝子は、本明細書に開示されるように、MiniShank3をコードする１つ以上の領域を含み得る。導入遺伝子はまた、別のタンパク質をコードする領域を含んでもよい。導入遺伝子はまた、１つ以上の発現制御配列（例えば、ポリＡテール）を含んでもよい。いくつかの態様において、ＡＡＶベクターは、少なくともＡＡＶ ＩＴＲおよびMiniShank3導入遺伝子を含む。
いくつかの態様において、ＡＡＶはＡＡＶ粒子にパッケージ化され、対象に投与され、および／または選択された標的細胞に送達され得る。いくつかの態様において、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶカプシドタンパク質を含む。いくつかの態様において、ＡＡＶ粒子は、本明細書に開示のＡＡＶ血清型から選択される少なくとも１つのカプシドタンパク質を含み、これには以下が含まれる：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＰＨＢ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．４３、ＡＡＶ２／２－６６、ＡＡＶ２／２－８４、およびＡＡＶ２／２－１２５、または前述のいずれかのバリアント。
いくつかの態様において、ＡＡＶベクター中のminiShank3導入遺伝子コード配列は、組織特異的遺伝子発現のために調節配列に作動可能に連結される。いくつかの場合において、組織特異的調節配列は、組織特異的に転写を誘導する組織特異的転写因子に結合する。かかる組織特異的調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）は、当技術分野で周知である。いくつかの態様において、組織特異的調節配列は、Ｓｙｎプロモーター（例えば、ｈＳｙｎ１）であり得る。いくつかの態様において、組織特異的調節配列は、ニューロン特異的でありかつ本明細書に記載の処置に適した、任意のプロモーターまたはエンハンサーであり得る。
いくつかの態様において、ＡＡＶベクター中の配列番号２または４を含むminiShank3導入遺伝子コード配列は、プロモーターに作動可能に連結され、ＡＡＶ ＩＴＲに隣接する。いくつかの態様において、ＡＡＶベクター中の配列番号１または３を含むminiShank3導入遺伝子コード配列は、プロモーターに作動可能に連結され、ＡＡＶ ＩＴＲに隣接する。
本開示の側面は、miniShank3導入遺伝子を発現するＡＡＶベクターに関する。いくつかの態様において、miniShank3導入遺伝子は、ＡＡＶ ＩＴＲに隣接する。いくつかの態様において、ＡＡＶ ＩＴＲはＡＡＶ２ ＩＴＲを含む。いくつかの態様において、ＡＡＶ ＩＴＲはＡＡＶ１ ＩＴＲを含む。いくつかの態様において、ＡＡＶ ＩＴＲはＡＡＶ５ ＩＴＲを含む。いくつかの態様において、ＡＡＶ ＩＴＲはＡＡＶ６ ＩＴＲを含む。いくつかの態様において、ＡＡＶ ＩＴＲはＡＡＶ８ ＩＴＲを含む。いくつかの態様において、ＡＡＶ ＩＴＲはＡＡＶ９ ＩＴＲを含む。いくつかの態様において、ＡＡＶ ＩＴＲはｒｈ１０ ＩＴＲを含む。いくつかの態様において、ＡＡＶ ＩＴＲは、自己相補的ＩＴＲを含み得る。
本明細書に記載のＡＡＶベクターは、MiniShank3などの導入遺伝子、５’および／または３’ＩＴＲ、プロモーター、イントロン、および／または当技術分野で知られている他の関連する調節要素を含むＤＮＡ構築物を、含むことができることを理解されたい。
いくつかの態様において、ＡＡＶベクターは、miniShank3導入遺伝子発現を増強し得る、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）を含む。いくつかの態様において、ＡＡＶベクターは、イントロンまたは５’または３’非翻訳領域などの非翻訳部分を含む。いくつかの態様において、イントロンは、プロモーター／エンハンサー配列とminiShank3導入遺伝子との間に位置し得る。
いくつかの態様において、本明細書で使用されるＡＡＶベクターは、自己相補的ベクターであり得る。
図１５は、ヒトシナプシン１（ｈＳｙｎ１）プロモーターの制御下で発現されるヒトminiShank3導入遺伝子を含む、ＡＡＶベクター（図１５では「AAV-hSyn1-ヒトMiniShank3-V1」と呼ばれる）の例を示す。図１５に示されるＡＡＶベクターは、表１に配列番号２１として提供される配列を含む。
図１５に示すように、配列番号２１は、ヒトMini-Shank3遺伝子、５’－ＩＴＲ、３’－ＩＴＲ、ＷＰＲＥ、ｈＧＨポリＡ、Ｆ１起点（origin）、ＮｅｏＲ／ＫａｎＲマーカー、ｈＳｙｎ１プロモーター、およびＰＵＣ起点を含む。いくつかの態様において、逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列は、それぞれ約１４５ヌクレオチドを含む。これらの要素は、シスでの効果的な複製およびカプシド化のために役立ち得る。当業者は、当技術分野で知られているＡＡＶベクターの任意の要素が、本開示の側面と適合し得ることを理解するであろう。当業者はまた、機能的MiniShank3タンパク質をコードする本明細書に記載のポリヌクレオチド配列のいずれかが、図１５に示されるものと同様のＤＮＡ構築物において、ＡＡＶ送達のために発現され得ることを理解するであろう。これらのＤＮＡ構築物は、図１５に示される要素の１つ以上を含み得る。例えば、いくつかの態様において、配列番号１～４のいずれか１つに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を含むコード配列は、図１５に示されるようなＤＮＡ構築物で発現される。いくつかの態様において、配列番号１～４のいずれか１つの配列を含むコード配列は、図１５に示されるようなＤＮＡ構築物で発現される。いくつかの態様において、ＤＮＡ構築物は、図１５に示される要素の１つ以上を含み、例えばプロモーター、５’－ＩＴＲ、３’－ＩＴＲ、ＷＰＲＥ、ｈＧＨポリＡ、Ｆ１起点、ＮｅｏＲ／ＫａｎＲマーカー、および／またはＰＵＣ起点などである。
いくつかの態様において、本開示に関連するＡＡＶベクターは、配列番号２１の配列に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を含むか、またはその間のすべての値を含めて１００％同一である、MiniShank3タンパク質をコードする核酸配列を含む。いくつかの態様において、ＡＡＶベクターは配列番号２１に対応する配列を含み、これは、配列番号１８の配列を含むMiniShank3タンパク質をコードする。
いくつかの態様において、配列番号２１の配列に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を含むか、またはその間のすべての値を含めて１００％同一である配列を含み、かつ配列番号１８の配列を含むMiniShank3タンパク質をコードするＡＡＶベクターは、それを必要とするヒト対象に送達され得、および神経発達障害を有するヒト対象を処置するのに適し得る。
当業者が理解するように、臨床使用のためのＡＡＶベクターの設計のため、およびＡＡＶベクターの送達のための、当技術分野で知られている任意の方法は、本開示の側面と適合し得る。例えば、ＡＡＶベクターおよび送達に関連する開示の非限定的な例は、「アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）分岐群、配列、それを含むベクター、およびそれらの使用」と題する米国特許第7,906,111号、および「脈絡膜血症の遺伝子治療に使用するためのＡＡＶベクター」と題する米国特許第9,834,788号に提供され、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様において、本開示に関連するＡＡＶベクターは、表１に提供される配列番号７または２１の配列に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を含むか、またはその間のすべての値を含めて１００％同一である、ＡＡＶ送達のためのMiniShank3タンパク質をコードする配列を含む。配列番号７は、配列番号１１のタンパク質配列をコードする。配列番号８は、配列番号１２のタンパク質配列をコードする。配列番号９は、配列番号１３のタンパク質配列をコードする。配列番号１０は、配列番号１４のタンパク質配列をコードする。配列番号２１は、配列番号１８のタンパク質配列をコードする。
いくつかの態様において、ＡＡＶ送達のためのMiniShank3タンパク質をコードするＡＡＶベクターは、表１に提供される配列番号１１または１７～２０のいずれか１つに対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を含むか、またはその間のすべての値を含めて１００％同一である配列を有するタンパク質をコードする。
いくつかの態様において、本明細書に開示のminiShank3を送達するために使用されるベクターは、レンチウイルスベクターであることができる。いくつかの態様において、本明細書に開示のminiShank3を送達するために使用されるベクターは、アデノウイルスベクターであることができる。
いくつかの態様において、本明細書に開示のベクター構築物は、表１に示される配列番号２１を含むことができる。
いくつかの態様において、Shank3タンパク質のポリヌクレオチド（すなわち、miniShank3 ＤＮＡ構築物）を含むベクターは、目的の特定の組織または細胞で発現させることができる。いくつかの態様において、本明細書に開示のベクターはプロモーターを含む。いくつかの態様において、ベクターは、細胞型特異的プロモーターを含む。いくつかの態様において、プロモーターはヒトプロモーターである。いくつかの態様において、ヒトプロモーターは、ヒトシナプシン１（ｈＳｙｎ１）である。いくつかの態様において、ｈＳｙｎ１プロモーターは、配列番号２２に対応するポリヌクレオチド配列を有する。いくつかの態様において、ヒトプロモーターは、当技術分野で知られておりかつminiShank3の構築に適した、任意のプロモーターであり得る。いくつかの態様において、ヒトプロモーターは、神経組織および細胞に対して高い特異性を有する、任意のプロモーターであり得る。いくつかの態様において、プロモーターは構成的プロモーターであり得る。例えば、構成的プロモーターは、ＣＡＧプロモーターであり得る。当業者が理解するように、選択されたプロモーターが本開示の側面と適合する限り、任意のプロモーターを使用してよい。
組成物および投与
本開示は、本明細書に開示のＡＡＶベクターで送達されるポリヌクレオチド（例えば、miniShank3）および薬学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物を含む組成物を提供する。
本開示の組成物は、ＡＡＶを単独で、または１つ以上の他のウイルスと組み合わせて含み得る。いくつかの態様において、組成物は、それぞれが１つ以上の異なるShankタンパク質を有する、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の異なるＡＡＶを含む。
適切な担体は、当業者により、ＡＡＶが向けられる適応症を考慮して容易に選択され得る。例えば、適切な１つの担体には生理食塩水が含まれ、これは様々な緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）と配合され得る。他の例示的な担体には、滅菌生理食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油、および水が含まれる。担体の選択は本開示の限定ではない。ＡＡＶベクターを含む医薬組成物は、US 9,585,971およびUS 2017/0166926にさらに記載されており、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「担体」には、あらゆる溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイドなどが含まれる。医薬活性物質のためのかかる媒体および薬剤の使用は、当技術分野で周知である。補助活性成分も組成物に組み込むことができる。「薬学的に許容し得る」という語句は、宿主に投与された場合にアレルギー反応または同様の有害な反応を引き起こさない、分子実体および組成物を指す。
送達ビヒクル、例えばリポソーム、ナノカプセル、マイクロ粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、ベシクルなどを、本開示の組成物を適切な宿主細胞に導入するために使用することができる。特に、ＡＡＶベクターが送達する導入遺伝子は、脂質粒子、リポソーム、ベシクル、ナノスフェア、またはナノ粒子などのいずれかに封入された送達用に製剤化され得る。
かかる製剤は、本明細書に開示の核酸またはＡＡＶ構築物の薬学的に許容し得る製剤を導入するために好ましい場合がある。リポソームの形成および使用は、一般に当業者に知られている。最近、改善された血清安定性および循環半減期を有するリポソームが開発された（米国特許第5,741,516号）。さらに、潜在的な薬物担体としてのリポソームおよびリポソーム様調製物の様々な方法が記載されている（米国特許第5,567,434号；5,552,157号；5,565,213号；5,738,868号および5,795,587号）。
リポソームは、水性媒体中に分散して自発的に多層同心二重層ベシクル（多層ベシクル（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を形成するリン脂質から形成される。ＭＬＶは一般に、２５ｎｍから４μｍの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理は、コアに水溶液を含有する、直径が２００～５００Åの範囲の小型単層ベシクル（ＳＵＶ）の形成をもたらす。
代替的に、ＡＡＶベクターのナノカプセル製剤を使用することができる。ナノカプセルは一般に、物質を安定した再現可能な方法で閉じ込めることができる。細胞内ポリマーの過負荷による副作用を避けるために、かかる超微粒子（約０．１μｍのサイズ）は、in vivoで分解できるポリマーを使用して設計する必要がある。これらの要件を満たす生分解性ポリアルキルシアノアクリラートナノ粒子の使用が企図される。
いくつかの態様において、ＡＡＶベクターで送達される核酸を含む医薬組成物は、保存剤または化学安定剤などの、他の医薬成分を含む。適切な保存剤の例としては、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、チメロサール、およびパラクロロフェノールが挙げられる。適切な化学安定剤には、ゼラチンおよびアルブミンが挙げられる。多くの場合、等張剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。医薬組成物の持続的な吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に使用することによって、もたらすことができる。
ＡＡＶベクターを送達するのに適した医薬形態には、滅菌水溶液または分散液、および滅菌注射用溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末が含まれる。分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中、および油中で調製することもできる。通常の保管および使用条件下では、これらの調製物は微生物の増殖を防ぐ保存剤を含有する。多くの場合、形態は滅菌であり、容易に注射できる程度に流動的である。製造および保管の条件下で安定していなければならず、細菌および真菌などの微生物による汚染作用から保護されていなければならない。
本明細書に記載の方法は、所望の組織（例えば、脳）の細胞をトランスフェクトし、過度の悪影響なしで十分なレベルの遺伝子導入および発現を提供するのに十分な量で、ＡＡＶベクターを投与することを含む。従来の薬学的に許容し得る投与経路は、限定はされないが以下を含む：選択された器官への直接送達、経口、吸入、眼内、顔面静脈注射および眼窩後注射を含む静脈内、脳室内（ＩＣＶ）、筋肉内、髄腔内、頭蓋内、皮下、皮内、腫瘍内、およびその他の非経口投与経路。必要に応じて、投与経路を組み合わせることができる。いくつかの態様において、本明細書に開示のベクターは静脈内投与される。
いくつかの態様において、本開示は、神経発達障害を有する対象を処置する方法を提供する。いくつかの態様において、本開示は、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）を有する対象を処置する方法を提供する。いくつかの態様において、本開示は、フェラン・マクダーミド症候群を有する対象を処置する方法を提供する。本明細書で提供される方法は、いくつか態様において、Shank3タンパク質（例えば、miniShank3）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む組成物の有効量を、対象の標的環境または組織に投与および送達することを含む。いくつかの態様において、標的組織は皮質である。いくつかの態様において、標的組織は線条体である。いくつかの態様において、標的組織は視床小脳（thalamus cerebellum）である。いくつかの態様において、標的組織は海馬である。いくつかの態様において、標的組織は任意の脳構造である。いくつかの態様において、Shank3タンパク質（例えば、miniShank3）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む組成物の有効量を、標的環境または組織に投与および送達する方法は、組成物をニューロンまたは他の脳細胞型に送達することを含む。いくつかの態様において、ベクターはＡＡＶベクターである。いくつかの態様において、核酸を、それを必要とする対象の標的環境または組織に送達するための方法は、対象の標的環境または組織に送達される少なくとも核酸（例えば、miniShank3）を含むＡＡＶベクターを含む組成物を提供すること、および組成物を対象に投与することを含む。ＡＡＶベクターの使用方法は、US 9,585,971、US 2017/0166926、およびWO2020/160337にさらに記載されており、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの態様において、組成物は、カプシドタンパク質を含み得る。
いくつかの態様において、Shank3タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む組成物は、静脈内投与、全身投与、脳室内投与、子宮内投与、髄腔内投与、眼窩後注射、または顔面静脈注射を介して対象に送達される。いくつかの態様において、子宮内投与は、発達の出生前段階にある対象に使用される。いくつかの態様において、組成物は対象に、ナノ粒子を介して送達される。いくつかの態様において、組成物は対象に、ウイルスベクターを介して送達される。いくつかの態様において、組成物は対象に、核酸材料を送達するのに適した任意の担体を介して送達される。
対象にとって何らかの有用性または利益をもたらすタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む任意の組成物は、対象の標的環境または組織に、本明細書に開示される方法に従って送達され得る。
上記の送達方法に加えて、ＡＡＶ組成物を宿主に送達する代替方法として、以下の技法も企図される。ソノフォレーシス（すなわち、超音波）が使用されており、米国特許第5,656,016号において循環系へのおよび循環系を通る薬物透過の速度および有効性を高めるためのデバイスとして記載されている。企図される他の薬物送達代替物は、骨内注射（米国特許第5,779,708号）、マイクロチップデバイス（米国特許第5,797,898号）、眼科製剤（Bourlais et al., 1998）、経皮マトリックス（米国特許第5,770,219号および第5,783,208号）、およびフィードバック制御送達（米国特許第5,697,899号）である。
特定の「治療効果」を達成するために必要な、Shank3タンパク質（例えば、miniShank3）をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶの用量、例えば、絶対ベクターゲノム（ｖｇ）または医薬溶液１ミリリットル当たりのベクターゲノム（ｖｇ／ｍＬ）での用量単位は、限定することなく、ＡＡＶの投与経路、治療効果を達成するために必要な遺伝子発現レベル、処置される特定の疾患または障害、および遺伝子産物の安定性を含むいくつかの要因に基づいて、変化するだろう。神経発達に影響を与えることなく感染率を最大にする用量も適している。当業者は、前述の要因および他の要因に基づいて、特定の疾患または障害を有する患者を処置するためのＡＡＶ用量範囲を容易に決定することができる。
ＡＡＶベクターの有効量は、動物またはヒト対象に感染するか、または所望の組織を標的とするのに十分な量である。有効量は主に、対象の種、年齢、性別、体重、健康状態、および標的とする組織などの要因に依存するため、対象および組織によって異なり得る。対象への投与のための組成物または用量の文脈における「有効量」または「有効な量」という用語は、対象において１つ以上の所望の応答を生じる、組成物または用量の量を指す。いくつかの態様において、本明細書に開示される組成物の有効量は、変異Shank3遺伝子の影響を部分的または完全に救済し、および／またはShank3タンパク質の機能喪失を部分的または完全に回復し得る。有効量は、望ましくない応答のレベルを低下させることを含み得るが、しかしいくつかの態様においては、望ましくない応答を完全に防止することを含む。有効量には、望ましくない応答の発生を遅らせることも含まれる。有効量はまた、所望の治療エンドポイントまたは所望の治療結果をもたらす量であり得る。他の態様において、有効な量は、治療のエンドポイントまたは結果などの所望の応答のレベルを高めることを含み得る。前述のいずれかの達成は、通常の方法および本出願で開示される方法によって監視することができる。当然ながら、有効量は、処置される特定の対象；状態の重症度；年齢、体調、サイズ、体重などの個々の患者パラメータ；処置期間；同時治療の性質（もしあれば）；特定の投与経路および同様の要因に依存するであろう。
例えば、いくつかの態様において、対象に投与されるベクターゲノムの数は、約６．０×１０１１ｖｇ～約９．０×１０１３ｖｇの間の任意の値である。いくつかの態様において、対象に投与されるベクターゲノムの数は、約６．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ～約９．０×１０１３ｖｇの間の任意の値である。いくつかの態様において、対象に投与されるベクターゲノムの数は、約１×１０１０～約１×１０１２ｖｇの間の任意の値である。ある態様において、ＡＡＶの有効量は、１ｋｇあたりのゲノムコピー数が１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、または１０１４である。ある態様において、ＡＡＶの有効量は、対象当たりのゲノムコピー数が１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、または１０１５である。いくつかの場合において、約１０１１～１０１３のＡＡＶゲノムコピーの投薬量が適切である。いくつかの態様において、対象に投与されるベクターゲノムの数は、本明細書に開示される処置および方法に適した、任意の用量であることができる。
いくつかの態様において、ＡＡＶの用量は、暦日（例えば、２４時間）当たり１回以下で対象に投与される。いくつかの態様において、ＡＡＶの用量は、２、３、４、５、６、または７暦日に１回以下で対象に投与される。いくつかの態様において、ＡＡＶの用量は、暦週（例えば、７暦日）当たり１回以下で対象に投与される。いくつかの態様において、ＡＡＶの用量は、２週間に１回以下（例えば、２暦週間に１回）で対象に投与される。いくつかの態様において、ＡＡＶの用量は、１暦月に１回以下（例えば、３０暦日に１回）で対象に投与される。いくつかの態様において、ＡＡＶの用量は、６暦月に１回以下で対象に投与される。いくつかの態様において、ＡＡＶの用量は、暦年（例えば、３６５日または閏年では３６６日）当たり１回以下で対象に投与される。いくつかの態様において、ｒＡＡＶの用量は、２暦年（例えば、７３０日または閏年では７３１日）に１回以下で対象に投与される。いくつかの態様において、ＡＡＶの用量は、３暦年（例えば、１０９５日または閏年では１０９６日）に１回以下で対象に投与される。
本明細書に開示される薬学的に許容し得る賦形剤および担体溶液の製剤は、当業者に周知であり、本明細書に記載される特定の組成物を様々な処置レジメンで使用するための、適切な投薬および処置レジメンの開発も同様である。典型的には、これらの製剤は、少なくとも約０．１％以上の活性化合物を含有することができるが、活性成分（単数または複数）のパーセンテージは、当然ながら変動することができ、製剤全体の重量または体積の約１または２％～約７０％または約８０％の間、またはそれ以上であることが好都合であり得る。当然のことながら、各治療上有用な組成物中の活性化合物の量は、化合物の任意の所与の単位用量で適切な投薬量が得られるように、調製することができる。溶解度、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与経路、製品の貯蔵寿命などの要因、および他の薬理学的考慮事項は、かかる医薬製剤を調製する当業者によって企図され、したがって様々な投薬量および処置レジメンが望まれ得る。
Shankタンパク質ネットワークに関連するタンパク質の発現
本明細書で提供される方法および組成物は、いくつかの態様において、例えば、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）またはフェラン・マクダーミド症候群などの神経発達障害を処置するのに有用である。本開示の発明者らは、マウスモデルにおけるＡＡＶベクターなどのウイルスベクターを介したminiShank3の送達が、シナプス後肥厚（ＰＳＤ）タンパク質の機能の回復に有効であることを発見した。いくつかの態様において、ＰＳＤタンパク質の発現レベルを使用して、miniShank3の投与の有効性を評価する。いくつかの態様において、ＰＳＤタンパク質はHomerである。いくつかの態様において、ＰＳＤタンパク質はシナプス後肥厚タンパク質９５（ＰＳＤ９５）である。いくつかの態様において、ＰＳＤタンパク質はＳｙｎＧａｐ１である。いくつかの態様において、ＰＳＤタンパク質はＳＡＰＡＰ３である。いくつかの態様において、ＰＳＤタンパク質はＮＲ１である。いくつかの態様において、ＰＳＤタンパク質はＮＲ２Ｂである。いくつかの態様において、ＰＳＤタンパク質はＧｌｕＲ２である。いくつかの態様において、ＰＳＤタンパク質は、miniShank3処置で改善または回復可能な任意のタンパク質である。
いくつかの態様において、ＰＳＤタンパク質のいずれかの増加は、未処置の対照対象と比較して、miniShank3の有効性を示し得る。遺伝子発現およびタンパク質レベルを検出する方法は、当技術分野で周知である。
いくつかの態様において、miniShank3で処置した後の対象におけるHomerの発現は、対照と比較して、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、または少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、または少なくとも１０００倍、増加する。いくつかの態様において、miniShank3で処置した後の対象におけるシナプス後タンパク質（ＰＳＤ９５）の発現は、対照と比較して、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、または少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、または少なくとも１０００倍、増加する。いくつかの態様において、miniShank3で処置した後の対象におけるＳｙｎＧａｐ１の発現は、対照と比較して、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、または少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、または少なくとも１０００倍、増加する。いくつかの態様において、miniShank3で処置した後の対象におけるＳＡＰＡＰ３の発現は、対照と比較して、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、または少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、または少なくとも１０００倍、増加する。いくつかの態様において、miniShank3で処置した後の対象におけるＮＲ１の発現は、対照と比較して、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、または少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、または少なくとも１０００倍、増加する。いくつかの態様において、miniShank3で処置した後の対象におけるＮＲ２Ｂの発現は、対照と比較して、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、または少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、または少なくとも１０００倍、増加する。いくつかの態様において、miniShank3で処置した後の対象におけるＧｌｕＲ２の発現は、対照と比較して、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、または少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、または少なくとも１０００倍、増加する。
いくつかの態様において、MiniShank3またはMiniShank3を含む組成物の投与は、睡眠効率の改善につながり得る。いくつかの態様において、対象は、MiniShank3タンパク質などのShankタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現構築物を含む組成物の有効量を投与された後、改善された睡眠効率を有する。いくつかの態様において、組成物の有効量を投与された後の対象の睡眠効率は、対照対象と比較して、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、または少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、または少なくとも１０００倍、増加する。改善された睡眠効率には睡眠障害の減少が含まれ、これには、入眠および睡眠維持の困難が含まれるが、これらに限定はされない。睡眠効率の測定は、当技術分野で知られている任意の方法を用いて行うことができる。
いくつかの態様において、MiniShank3またはMiniShank3を含む組成物の投与は、社会的障害の改善につながり得る。いくつかの態様において、対象の社会的障害は、MiniShank3タンパク質などのShankタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現構築物を含む組成物の有効量を投与された後に、改善される。いくつかの態様において、組成物の有効量を投与された後の対象の社会的障害は、対照対象と比較して、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、または少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、または少なくとも１０００倍、低減する。社会的障害の測定は、当技術分野で知られている任意の方法を用いて行うことができる。
本明細書で使用される場合、「社会的障害」とは、対象が自発的な社会的相互作用を示すことを妨げる、行動異常または欠陥を指す。
いくつかの態様において、MiniShank3またはMiniShank3を含む組成物の投与は、移動運動および／または運動協調障害の改善につながり得る。いくつかの態様において、対象の移動運動および／または運動協調障害は、MiniShank3タンパク質などのShankタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現構築物を含む組成物の有効量を投与した後に、改善される。いくつかの態様において、有効量の組成物が投与された後の対象の移動運動および／または運動協調障害は、対照対象と比較して、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、または少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、または少なくとも１０００倍、低減する。移動運動および／または運動協調障害の測定は、当技術分野で知られている任意の方法を用いて行うことができる。
本明細書で使用される場合、「移動運動および／または運動協調障害」は、例えば、協調の欠如、バランスの喪失、および／または引きずり歩行（shuffling gait）を含み得る。
いくつかの態様において、MiniShank3またはMiniShank3を含む組成物の投与は、皮質線条体シナプス機能障害の改善につながり得る。いくつかの態様において、対象の皮質線条体シナプス機能障害は、MiniShank3タンパク質などのShankタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現構築物を含む組成物の有効量を投与された後に、改善される。いくつかの態様において、有効量の組成物が投与された後の対象における皮質線条体シナプス機能障害は、対照対象と比較して、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、または少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、または少なくとも１０００倍、低減する。皮質線条体シナプス機能障害の測定は、当技術分野で知られている任意の方法を用いて行うことができる。
本明細書で使用される場合、「皮質線条体シナプス機能障害」とは、自閉症、強迫性障害、およびトゥレット症候群等の神経精神障害および神経発達疾患などにおいて、反復行動および強迫行動を引き起こす可能性がある脳内の欠陥性の皮質線条体回路を指す。
本明細書に記載される技術のいくつかの側面は、以下の実施例セクションに記載される非限定的な例示的態様に基づいてさらに理解され得る。以下の実施例セクションに記載される態様の限定は、以下の実施例セクションに記載される態様のみの限定であり、本明細書に記載される任意の他の態様の限定ではない。
本明細書に記載の発明をさらに完全に理解できるようにするために、以下の例を記載する。本出願に記載される例は、本明細書で提供されるシステムおよび方法を説明するために提供され、決してそれらの範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
例１：Shank3変異を有するマウスモデルはシナプス欠陥および行動異常を示した
Shank3 ＬｏＦ変異を有する複数のマウスおよびサルモデルが以前に開発され、Shank3遺伝子の変異が、脳の発達、神経構造、シナプスおよび回路機能、ならびに行動にどのように影響するかを研究した。これらのモデルは、潜在的な治療法を試験するための基礎として機能する。
Shank3変異体マウスの２つの異なるアレル：Shank3AおよびShank3Bを生成した。Shank3A変異体マウスでは、アンキリンリピートをコードする遺伝子の一部が標的とされ、その結果、最長のShank3アイソフォームであるShank3αが完全に排除された。しかし、他の２つのアイソフォームは影響を受けなかった（ここではShank3βおよびShank3γと名付けた）。Shank3B変異体ではＰＤＺドメインが標的となり、Shank3αとShank3βの両方のアイソフォームが完全に排除され、推定Shank3γアイソフォームが大幅に減少した。さらなる分析は、主にShank3B変異体マウスに焦点を当てた。
Shank3B-/-マウスは、組織学的分析によって全体的な脳の異常を示さなかった。しかし生後３～６か月までに、Shank3B-/-マウスは顕著な皮膚病変を発症した。病変は離乳期に分離された動物に存在し、過度の同種グルーミングによるものではないため、自傷行為であった；なぜならば、Shank3B-/-マウスで出生時から収容された野生型（ＷＴ）マウスには病変が見つからなかったからである。２４時間のビデオ撮影により、損傷前のShank3B-/-マウスは、ＷＴ対照と比較してグルーミングに費やされる時間が増加したことが明らかになり（図１Ａ～１Ｂ）、これは、Shank3B-/-マウスが過度のグルーミングおよび自傷行為を行ったことを示している。結論として、Shank3B変異体マウスは、皮膚病変につながる反復的かつ強迫的なグルーミングを示した。
Shank3変異体の、社会的行動に対する効果を研究するために、３チャンバーソーシャルアリーナを使用し、動物を、その社会的相互作用の自発的開始および社会的新規性（social novelty）を識別するその能力について調査した。最初に試験動物は放置されて、有線ケージ内に保持されたパートナー（「よそもの１」）との社会的接触を探索および開始するか、または同一の空の有線ケージ（「空のケージ」）内にあった。Shank3B-/-マウスは、社会的パートナーとの相互作用よりも、空のケージとの相互作用に対して明らかな選好を示した（図２Ａ～２Ｂ）。その後の試行で、新しい社会的パートナー（「よそもの２」）を、以前は空だった有線のケージに入れた。ＷＴマウスが新規動物に対する選好を示したのに対し、Shank3B-/-変異体は、中央チャンバーでより多くの時間を過ごした（図２Ａおよび２Ｃ）。結論として、Shank3B変異体マウスは、社会的相互作用障害を示した。
Shank3変異体マウスを使用して、Shank3変異体の線条体シナプスに対する効果を研究した。大脳基底核は、ＡＳＤに関与する脳領域の１つである。Shank3B-/-マウスの反復グルーミング行動は、皮質線条体機能の欠陥を示唆した。さらに、Shank3は、線条体で高度に発現される唯一のShankファミリーメンバーであった（図３Ａ）。したがって、分析は線条体ニューロンおよび皮質線条体シナプスに焦点を当てた。
Shank3の破壊がＰＳＤタンパク質ネットワークにどのように影響し得るかを決定するために、線条体からの精製ＰＳＤを、足場タンパク質およびグルタミン酸受容体サブユニットについて調べた（図３Ｂ～３Ｃ）。Shank3B-/-マウスにおける、ＳＡＰＡＰ３、Homer－１ｂ／ｃおよびＰＳＤ９３、ならびにグルタミン酸受容体サブユニットＧｌｕＲ２、ＮＲ２Ａ、およびＮＲ２Ｂのレベルの低下が観察された。これは、線条体のＰＳＤの分子組成の変化およびグルタミン酸作動性シグナル伝達の破壊を示唆しており、Shankタンパク質が主要な足場であるという仮説を支持する。
ゴルジトレーシングを使用して、Shank3B-/- ＭＳＮにおけるデンドリティック アーバー（dendritic arbor）の複雑さ、樹状突起の全長および表面積の増加によって示されるように、ニューロンの肥大が見出された。さらに、ＭＳＮの色素ファイリングにより、Shank3B-/-マウスの脊椎密度の減少が明らかになった。ＥＭ分析は、ＷＴと比較してShank3B-/-マウスからのＰＳＤの、平均の厚さおよび長さの減少を示した。まとめると、これらの結果は、線条体におけるＭＳＮおよびグルタミン酸作動性シナプスの発達における、Shank3の重要な役割を強調する。
Shank3における破壊の、シナプスへの機能的結果を解明するために、皮質線条体シナプス回路の記録を、６～７週齢のShank3B-/-マウスの急性脳スライスにおいて実施し、同年齢の行動試験を行った。対照と比較した場合、Shank3B-/-マウスにおいてはフィールド集合スパイクが有意に減少したことが見出された（図４Ａ）。刺激強度と負のピーク１（ＮＰ１）と呼ばれる応答の活動電位成分の振幅との関係およびペアパルス比（ＰＰＲ）によって示されるように、シナプス前機能は明らかに変化しなかった。これらの結果は、総フィールド応答（total field response）の減少が、シナプス機能のシナプス後障害および／または機能的シナプス数の減少による可能性が最も高いことを示した。
背外側線条体ＭＳＮにおける、ＡＭＰＡＲ－ｍＥＰＳＣの全細胞電圧クランプ記録も実施した。ｍＥＰＳＣの頻度は、Shank3B-/- ＭＳＮで有意に減少し（図４Ｂ～４Ｃ）、ＰＰＲの欠陥が観察されなかったため（図４Ｅ）、Shank3B-/- ＭＳＮで機能的シナプスの数が減少したことを示唆している。Shank3B-/- ＭＳＮにおけるｍＥＰＳＣ振幅のピークも減少し（図４Ｂおよび４Ｄ）、利用可能なシナプスからのシナプス後応答の減少を示している。これらのデータは、皮質線条体回路のシナプス後機能における、Shank3の重要な役割を実証した。
同様の試験はサルモデルで試験され、次いで臨床試験においてShank3変異を有するヒトＡＳＤ患者で試験されるであろう。
例２：miniShank3遺伝子の設計および構築
本明細書に開示されるShank3変異についての遺伝子治療戦略は、ＡＡＶを使用してShank3 ｃＤＮＡの機能的コピーを脳細胞に送達し、患者におけるShank3発現レベルを回復させることであった。しかし、Shank3は大きなタンパク質で、コード配列は約５．７ｋｂであり、ＡＡＶベクターのパッケージング容量を超えている。この問題を解決するために、小型化されたShank3（miniShank3）の設計を、その機能を損なうことなくサイズを縮小することを目的として実施した。
miniShank3の最初のバージョン（miniShank3-v1、図５Ｂ）では、Ｎ末端ドメインおよびアンキリンリピートなどの他の領域、ならびに、ＰＤＺドメインと、重要ではないと判断されたプロリンリッチドメインの主要部分を含むプロリンリッチドメインとの間のリンク配列は、削除された。これにより、Shank3タンパク質の機能に重要であると予測されるドメインのみを維持することによって、Shank3コード配列を２．１ｋｂに効果的に減少させた。
いかなる理論にも束縛されることを望むものではないが、Shank3タンパク質のＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）は、シナプス可塑性において特殊な役割を果たし得る。シナプス可塑性とは、様々な刺激に応答してシナプス強度を調節するニューロンの能力を指し、これは人間の学習能力および環境変化への適応能力の基礎であると考えられている。Shank3は、主要なシナプス可塑性調節因子であるＣａＭＫＩＩαと特異的な相互作用をすることが見出されている。重度のＩＤを有するヒトＡＳＤ患者で特定されたミスセンス変異は、この相互作用を損なう。同じ変異を保有するノックインマウスが生成され、これらのマウスはシナプス可塑性欠陥を有していた。これらの知見に基づいて、ＮＴＤをminiShank3-v1に加えると、miniShank3の機能がさらに向上する可能性があることが推測された。
ＮＴＤを含むminiShank3の第２のバージョンを設計した（miniShank3-v2、図６Ｂ）。miniShank3-v2（３．１ｋｂ）は、miniShank3-v1（２．１ｋｂ）より大幅に大きいが、それでもＡＡＶのパッケージング容量の範囲内である。miniShank3-v1データに基づき、両方のバージョンがShank3機能の回復に効果的であると予想された。miniShank3-v2には、シナプス可塑性機能の回復に一定の利点があり得て、これは、遺伝子治療処置の枠を複数の発達段階にまで広げる可能性のある効果である。
皮質線条体共培養を実施した。簡潔に言えば、一次皮質線条体共培養物は、当技術分野で以前に記載されたように調製した。線条体組織は、Ｐ０ Shank3 InsG3680/InsG3680変異体から切開した。皮質組織は、Ｐ０野生型仔から切開した。組織をパパイン（Worthington Biochemical Corporation）で消化し、小さなガラス製パスツールピペットで分離した。約５００万個の線条体中型有棘ニューロン（ＭＳＮ）を、Mouse Neuron Nucleofector（商標）Kit（Lonza）で、１μｇのＡＡＶ－ｈＳｙｎ－ＧＦＰプラスミドのみ、または１μｇのＡＡＶ－ｈＳｙｎ１－ＧＦＰプラスミド１と２μｇのＡＡＶ－ｈＳｙｎ１－minishank3プラスミドを混合したもののいずれかと、エレクトロポレーションした。次に、線条体ＭＳＮと皮質ニューロンを３：１の比率で混合し、０．５ｍＭグルタミン（Invitrogen）、１×Ｂ２７（Invitrogen）、５０μｇ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン（Invitrogen）、５０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ（R&D Systems）、および３０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ（R&D Systems）を補充したNeurobasal A培地（Invitrogen）を有する２４ウェルプレートの内側の、ポリＤ－リジン／ラミニン（Neuvitro、ＧＧ－１２－１．５－ラミニン）を１×１０５細胞／ｃｍ２の密度でプレコートした１２ｍｍカバーガラスに、プレーティングした。最初のプレーティング後、培地の半分を、ＢＤＮＦおよびＧＤＮＦを含まない新鮮な培地と３～４日ごとに交換した。
miniShank3がShank3の重要な機能を維持しているかどうかを調べるために、Shank3変異体マウスからの培養ニューロンにおけるその発現および局在化を、最初に試験した。Shank3はシナプスタンパク質であるため、miniShank3が、内在性のShank3タンパク質と同様に、シナプスに局在することが重要であった。ＧＦＰタグ付きminiShank3v1が皮質線条体共培養物のニューロンで発現されると、シナプス後マーカーＰＳＤ９５との共局在化によって示されるように、ＧＦＰ－miniShank3がシナプスに正確に局在化されることが見出された（図７Ａ～７Ｈ）。したがって、miniShank3は、シナプスタンパク質のこの重要な特徴を保持していた。
例３：マウスモデルにおけるminiShank3の機能発現
miniShank3が内在性Shank3の全機能を捕捉するかどうかを調べるために、Shank3変異体マウスでの神経機能の回復におけるminiShank3-v1の能力を試験した。Shank3変異体マウスは、シナプスの電気生理学的特性および行動の異常を含む、シナプス後肥厚（ＰＳＤ）の分子組成の欠陥を示すことが、以前に実証された。Shank3 InsG3680変異体マウスにおけるこれらの欠陥のそれぞれを回復するminiShank3-v1の能力を試験した。このマウスは、ヒトＡＳＤ患者に見られるInsG3680変異を模倣する。以前の研究では、これらのマウスが、ＡＳＤに関連する分子的、電気生理学的および行動上の欠陥を示したことが示されている。したがって、このモデルを使用して、miniShank3-v1がこれらの変異体マウスで観察された欠陥を回復できるかどうかを試験した。
ＧＦＰ－miniShank3-v1を、ｐＨＰ．ｅＢ ＡＡＶベクターにクローニングした。ＡＡＶ－ＧＦＰ－miniShank3-v1ウイルスを調製し、生後０～２日（Ｐ０－Ｐ２）のマウスに顔面静脈注射により投与した。マウス１匹あたり６．４２Ｅ＋１１のウイルスゲノム（ｖｇ）の用量で、ＧＦＰ－miniShank3-v1が脳内の大多数のニューロンで高度に発現されることが見出された（図８）。ＡＡＶ－ｈＳｙｎ１－ＧＦＰを対照として注射した。
標準的な生化学的アプローチを使用して、ＰＳＤを、ＡＡＶ－ｈＳｙｎ１－ＧＦＰを注射した野生型マウス、ＡＡＶ－ｈＳｙｎ１－ＧＦＰを注射したShank3変異体マウス、およびＡＡＶ－ＧＦＰ－miniShank3-v1を注射したShank3変異体マウスの脳から単離した（図９Ａ）。ウェスタンブロットアッセイを使用して、ＰＳＤにおける様々なシナプスタンパク質のレベルを検出した（図９Ｂ）。以前に報告されたように、野生型マウスと比較して、Homer、ＰＳＤ９５、ＳｙｎＧａｐ１、ＳＡＰＡＰ３、ＮＲ１、ＮＲ２Ｂ、およびＧｌｕＲ２を含むいくつかのシナプスタンパク質のレベルが、Shank3変異体マウスのＰＳＤにおいて減少した（図９Ｃ～９Ｆ）。miniShank3-v1の発現は、これらのシナプスタンパク質の発現レベルを野生型レベルに回復させ、miniShank3-v1がＰＳＤの分子組成の回復において完全に機能的であることを示した（図９Ｃ～９Ｆ）。結論として、miniShank3は、Shank3変異体マウスにおけるシナプス後肥厚（ＰＳＤ）の分子欠陥を回復する。
Shank3は線条体で高度に発現される。皮質線条体シナプス伝達（synaptic communication）は、Shank3変異体マウスにおいて欠陥している。miniShank3-v1がシナプス欠陥を修復できるかどうかを試験するために、Shank3変異体マウスの急性脳スライスにおける皮質線条体シナプス回路の電気生理学的記録を実施した。以前に報告されたように、フィールド集合スパイクは、対照と比較した場合、Shank3変異体マウスにおいて有意に減少した（図１０Ａ）。Shank3変異体マウスにおけるこの欠陥は、miniShank3-v1発現によって救済された（図１０Ａ）。刺激強度の、負のピーク１と呼ばれる応答の活動電位成分の振幅に対する関係によって示されるように、シナプス前機能は変化しなかった（ＮＰ１；図１０Ｂ）。これらの結果は、総フィールド応答の減少が、シナプス機能のシナプス後障害および／または機能的シナプス数の減少による可能性が最も高いことを示しており、これらの欠陥は、Ｐ０でのＡＡＶを介したminiShank3-v1発現によって効果的に修正することができた。結論として、miniShank3は、Shank3変異体マウスの皮質線条体シナプス欠陥を修復する。
以前の研究は、Shank3変異体マウスが、フェラン・マクダーミド症候群またはShank3変異を有する患者に見られる症状に関連する、いくつかの行動表現型を示すことを示した。Ｐ０でのminiShank3-v1処置は、改善の傾向のみを示した運動学習の単一アッセイでのパフォーマンスを除いて、Shank3変異体マウスにおいて試験したすべての行動障害を完全に救済したことが見出された。miniShank3-v1での処置は、３チャンバー社会的相互作用アッセイによって測定された社会的相互作用障害（図１１Ａ）、オープンフィールド試験での移動距離によって測定された運動活動障害（図１１Ｂ）、オープンフィールド試験での立ち上がりの時間によって測定された探索行動障害（図１１Ｃ）、および高架式ゼロ迷路で示す不安様行動（図１１Ｄ）を、完全に救済した。しかしながら、変異体Shank3における運動学習障害は、ロータロッド試験においてわずかに改善されたのみであった（図１１Ｅ）。これは、マウスの小脳の発達が生後に始まり、これがＰ０でのＡＡＶ感染を制限するために、Ｐ０で注射した場合の小脳でのminiShank3の発現レベルが非常に低いことに関連する可能性があった。結論として、miniShank3は、Shank3変異体マウスの行動障害を回復する。
例４：miniShank3遺伝子治療の治療タイミングの決定
以前の研究は、Shank3変異体における特定の行動を救済するための、重要な発達時間枠があることを実証した。ＡＡＶを介したminiShank3送達の効果的な治療枠を決定するために、様々な発達段階で静脈内ウイルス注射を実施し、成体期の行動への効果を分析した。すべての行動実験は、マウスへのＡＡＶ注射の少なくとも８週間後に実施した。簡潔に言えば、野生型マウス、Shank3変異体マウス、および異なる日齢（Ｐ０、Ｐ２、Ｐ７、およびＰ２８）でShank3処置を受けたShank3変異体マウスを、実験群に割り当てた。Ｐ０およびＰ２のマウスに、滅菌生理食塩水で希釈したＡＡＶ－ｐＨＰ．ｅＢ－ｈＳｙｎ－ＧＦＰまたはＡＡＶ－ｐＨＰ．ｅＢ－ｈＳｙｎ－ＧＦＰ－MiniShank3の６．０×１０１１総ウイルスゲノム（ｖｇ）からなる２０μｌの注射混合物を、静脈内注射した。Ｐ０～Ｐ２の日齢のマウスには顔面静脈注射を使用した。Ｐ７およびＰ２８のマウスには、ＡＡＶ－ｐＨＰ．ｅＢ－ｈＳｙｎ－ＧＦＰまたはＡＡＶ－ｐＨＰ．ｅＢ－ｈＳｙｎ－ＧＦＰ－MiniShank3の７．０×１０１１総ウイルスゲノム（ｖｇ）を静脈内注射した。Ｐ７とＰ２８の日齢のマウスの場合、眼窩後注射または脳室内（ＩＣＶ）注射を使用した。
生後（Ｐ２８）でのMiniShank3処置は、Shank3 InsG3680変異体における社会的行動障害を完全に救済し、処置マウスは、選好を示さなかった未処置変異体とは異なり、よそものマウスに対する強い選好を示した（図１２Ａ）。Ｐ２８処置miniShank3マウスはまた、変異体マウスと比較して自発運動活性（locomotor activity）の有意な増加を示した（図１２Ｂ）。Ｐ２８でのminiShank3による処置は、運動学習（図１２Ｃ）および運動協調（図１２Ｄ）を有意に改善することが見出された。社会的行動および運動行動とは対照的に、Ｐ２８でのminiShank3処置は、不安様行動および反復グルーミングに対して最小の効果を示した（図１２Ｄ）。高架式ゼロ迷路では、miniShank3処置マウスはオープンアームでの探索時間において変異体マウスと有意差を示さず（図１２Ｆ）、グルーミングアッセイでは、miniShank3処置マウスはグルーミング行動のわずかな減少のみを示した（図１２Ｆ）。
成体マウスにおけるShank3発現の遺伝子救済を記載する以前の研究は、グルーミング表現型が成体において可逆的であり、皮質－線条体－視床－皮質回路の機能障害が反復的／強迫様行動に強く関係していることを示した。Ｐ２８でminiShank3により処置された変異体における、これらの行動表現型の救済の欠如が、グルーミング関連の脳領域でのminiShank3発現の低下によるものかどうかを検討するために、miniShank3の生体内分布を、Ｐ２８処置動物においてＧＦＰ発現を評価することにより調査した；ＧＦＰ発現が視床で非常に低く、線条体で限られていることを発見した。したがって、Ｐ２８でのminiShank3処置は、社会的行動、移動運動、および運動協調の障害を選択的に救済したが、この日齢での視床および線条体の、ＡＡＶに基づく標的化のための改善された戦略は、不安および反復行動に対する治療上の追加の利点を可能にし得る。
生後７日目（Ｐ７）にminiShank3を投与された変異体マウスは、Ｐ０－Ｐ２注射で観察されたものと同様に、それらの変異同腹子と比較してよそものマウスに対する強い選好を示した（図１３Ａ）。電気生理学的研究は、Ｐ７でのminiShank3送達が、Shank3変異体マウスで観察された皮質線条体シナプス欠陥を回復するのに十分であることを示した。皮質線条体回路の機能障害は、自閉症および強迫性障害に関連する反復的および強迫的な行動に強く関与しており、Shank3変異体は過度のグルーミング表現型を示した。この理論を検証するために、個々のＷＴマウス、Shank3変異体マウス、およびＰ７でminiShank3により処置したShank3変異体マウスを２時間監視し、セッション中グルーミングに費やされた時間の割合を定量化した。Shank3変異体マウスは、ＷＴマウスと比較して、グルーミングに費やす時間の割合が大幅に増加することが見出された。しかし、miniShank3処置マウスは、グルーミングに費やす時間が有意に短縮され、ＷＴ動物と同様であった（図１３Ｂ）。
Ｐ７でのMiniShank3処置は、オープンフィールド試験での総移動距離（図１３Ｃ）、高架式ゼロ迷路での不安様行動（図１３Ｄ～１３Ｅ）によって測定されたように、Shank3変異体で観察された自発運動表現型を完全に救済した。Ｐ０～Ｐ２（生後０日目～生後２日目）でのminiShank3の送達とは対照的に、Ｐ７でminiShank3を処置したShank3変異体マウスは、変異体同腹子よりも運動学習および運動協調の両方において有意に良好に機能し（図１３Ｆ）、Shank3変異体で観察された運動障害は、適切な発達段階で与えられた場合、ＡＡＶを介したminiShank3遺伝子治療によって可逆的であることを示唆している。まとめると、これらの行動結果は、Ｐ７でのminiShank3遺伝子治療が、Shank3 InsG3680変異体動物においてすべての報告された行動表現型を効果的に救済可能であったことを示す。
例５：Ｐ７でのminiShank3の全身送達はShank3 InsG3680変異体における睡眠障害の改善をもたらす
フェラン・マクダーミド症候群の患者およびSHANK3変異を有する他の個体は、しばしば、入眠および睡眠維持の困難を含む重度の睡眠障害を示すことが示されている。例えば、マカクのSHANK3変異は、顕著な睡眠障害を示す。Shank3 InsG3680変異体マウスの睡眠障害を評価するために、ＥＥＧ／ＥＭＧ関連の手術を行い、３つの実験群すべてからの信号を調べて、睡眠がShank3の変異によって影響を受けるかどうかを判断した。InsG3680ホモ接合体は、ＷＴ対照よりも短い期間長（bout length）（図１３Ｈ）を有するＮＲＥＭ睡眠持続時間の減少（図１３Ｇ）、およびＮＲＥＭ睡眠中の前頭ＥＥＧにおいてデルタリズム（１～４Ｈｚ）の減衰デルタパワー（図１３Ｉ）を示した。これらの結果は、Shank3変異体マウスに重度の睡眠障害を示した。Ｐ７で注射されたMiniShank3は、未処置の変異体で観察されたＮＲＥＭ睡眠の減少（図１３Ｇ）および睡眠期間長（sleep bout lengths）の減少（図１３Ｈ）の両方を、有意に緩和した。さらに、Ｐ７で注射されたminiShank3は、減衰デルタパワーを部分的に救済した（図１３Ｉ）。まとめると、これらの結果は、miniShank3がホモ接合体Shank3 InsG3680マウスの睡眠障害を軽減できることを示しており、これは、ＡＳＤ関連の行動表現型を救済するminiShank3の幅広い能力と一致する。
例６：Ｐ７でのMiniShank3処置はShank3 InsG3680変異体の発作活性を引き起こさない
miniShank3処置の発作活性に対する潜在的効果を試験するために、ＷＴマウス、対照ウイルスを注射したShank3変異体、miniShank3を注射したShank3変異体、およびＳｃｎ２ａ変異体を研究に含めた。ＥＥＧ分析では、睡眠モニタリング、自発発作、聴原性発作などの指標を実施した。２４時間の記録中の安定したＥＥＧベースラインによって証明されるように、Shank3 InsG3680変異体マウスにおいて、自発的てんかん性ＥＥＧ異常は観察されなかった（代表的トレース、図１４Ａ）。聴原性発作（１２４ｄＢ音響刺激）を誘発するShank3変異体の感受性を調べたところ、変異体マウスに聴原性発作の行動徴候が存在しないことが見出された。miniShank3の安全性を評価するために、Ｐ７でminiShank3を注射した変異体マウスにおいて自発的てんかん性ＥＥＧ異常を調査したが、ＥＥＧ上で検出可能な過興奮活性は観察されなかった（図１４Ａ）。さらに、Shank3 InsG3680変異体マウスおよびminiShank3を注射した変異体マウスは、欠神発作のＥＥＧの特徴である棘徐波発射（ＳＷＤ）を示さなかった。しかしながら、Ｓｃｎ２ａにヘテロ接合変異を有する動物の分析は、頻繁な欠神発作をもたらし、１時間当たり約６０回のＳＷＤエピソードを見出し、分析パイプラインの有効性を立証した（図１４Ｂ）。まとめると、これらの結果は、Shank3 InsG3680変異体がてんかん様活性を示さず、miniShank3発現が検出可能な発作を引き起こさなかったことを示す。
例７：miniShank3による成人ヒト対象の処置
自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）またはフェラン・マクダーミド症候群などの神経発達障害を有するか、有する疑いがあるか、または有するリスクがある成人ヒト対象は、miniShank3により、本明細書に記載の方法、ベクター、および非天然ポリヌクレオチドを使用して処置することができる。成人ヒト対象には、１６歳以上の男性または女性の成人が含まれ得る。２５歳未満の成人が、本明細書に開示のminiShank3処置に好ましい可能性がある。投与および送達方法は、本明細書に開示されるように、顔面静脈注射および脳室内注射を含み得る。当業者に知られている他の方法も使用することができる。成人ヒト対象は、ＡＡＶなどのウイルスベクターによって送達されるminiShank3で処置される。例えば、成人ヒト対象は、miniShank3導入遺伝子を発現する配列番号２１の配列を含むＡＡＶベクターで処置することができる。いかなる理論にも束縛されることを望むものではないが、処置のための用量は、１×１０１０～１×１０１２ウイルスゲノム（ｖｇ）の間であり得る。当業者は、特定の成人のための用量を決定する際に、性別、体重、年齢、疾患の状態、および疾患の種類などの様々な要因を考慮できることを理解するであろう。用量は１×１０１０～１×１０１２ｖｇの範囲外であることができる。投与経路は、例えば、静脈内、顔面静脈内、頭蓋内、脳室内、眼内、または髄腔内であり得る。
例８：miniShank3による非成人のヒト対象の処置
自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）またはフェラン・マクダーミド症候群などの神経発達障害を有するか、有する疑いがあるか、または有するリスクがある非成人のヒト対象は、miniShank3により、本明細書に記載の方法、ベクター、および非天然ポリヌクレオチドを使用して処置することができる。非成人のヒト対象には、１６歳以下の任意の男性または女性が含まれ得る。いかなる理論にも束縛されることを望むものではないが、本明細書に開示のminiShank3処置には、乳幼児または幼児などの１０歳以下のヒト対象が好ましい可能性がある。投与および送達方法は、本明細書に開示されるように、顔面静脈注射および脳室内注射を含み得る。当業者に知られている他の方法も使用することができる。非成人のヒト対象は、ＡＡＶなどのウイルスベクターによって送達されるminiShank3で処置される。例えば、非成人のヒト対象は、miniShank3導入遺伝子を発現する配列番号２１の配列を含むＡＡＶベクターで処置することができる。いかなる理論にも束縛されることを望むものではないが、処置のための用量は、１×１０１０～１×１０１２ウイルスゲノム（ｖｇ）の間であり得る。当業者は、特定の成人のための用量を決定する際に、性別、体重、年齢、疾患の状態、および疾患の種類などの様々な要因を考慮できることを理解するであろう。用量は１×１０１０～１×１０１２ｖｇの範囲外であることができる。投与経路は、例えば、静脈内、顔面静脈内、頭蓋内、脳室内、眼内、または髄腔内であり得る。非成人のヒト対象が胎児または出生前の発達段階にある場合、投与経路は子宮内であり得る。
例９：miniShank1またはminiShank2によるヒト対象の処置
神経発達障害、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）、またはフェラン・マクダーミド症候群を有するか、有する疑いがあるか、または有するリスクがあるヒト対象は、miniShank1またはminiShank2により、本明細書に記載の方法、ベクター、および非天然ポリヌクレオチドを使用して処置することができる。成人のヒト対象には、任意の男性または女性のヒト対象が含まれ得る。処置方法は、miniShank3構築物（配列番号１～４および２１）がShank1（miniShank1）またはShank2（miniShank2）を含むように改変されることを除いて、本明細書に記載の方法と同様である。成人または非成人のヒト対象は、ＡＡＶなどのウイルスベクターによって送達されるminiShank1またはminiShank2で処置される。例えば、成人のヒト対象または非成人のヒト対象は、miniShank3導入遺伝子を発現する配列番号２１の配列を含むＡＡＶベクターで処置することができる。いかなる理論にも束縛されることを望むものではないが、処置のための用量は、１×１０１０～１×１０１２ウイルスゲノム（ｖｇ）の間であり得る。当業者は、特定の成人のための用量を決定する際に、性別、体重、年齢、疾患の状態、および疾患の種類などの様々な要因を考慮できることを理解するであろう。用量は１×１０１０～１×１０１２ｖｇの範囲外であることができる。投与経路は、例えば、静脈内、顔面静脈内、頭蓋内、脳室内、眼内、または髄腔内であり得る。非成人のヒト対象が胎児または出生前の発達段階にある場合、投与経路は子宮内であり得る。
例１０：レンチウイルスウイルスベクターを使用したminiShank3の送達
自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）またはフェラン・マクダーミド症候群などの神経発達障害を有するか、有する疑いがあるか、または有するリスクがあるヒト対象は、miniShank1またはminiShank2により、本明細書に記載の方法、ベクター、および非天然ポリヌクレオチドを使用して処置することができる。成人または非成人のヒト対象は、レンチウイルスなどのウイルスベクターによって送達されるminiShank3で処置される。いかなる理論にも束縛されることを望むものではないが、処置のための用量は、１×１０１０～１×１０１２ウイルスゲノム（ｖｇ）の間であり得る。当業者は、特定の成人のための用量を決定する際に、性別、体重、年齢、疾患の状態、および疾患の種類などの様々な要因を考慮できることを理解するであろう。用量は１×１０１０～１×１０１２ｖｇの範囲外であることができる。投与経路は、例えば、静脈内、顔面静脈内、頭蓋内、脳室内、眼内、または髄腔内であり得る。非成人のヒト対象が胎児または出生前の発達段階にある場合、投与経路は子宮内であり得る。
表１．マウスおよびヒトのminiShank3配列およびベクター配列
参考文献
特許請求の範囲において、「a」、「an」、および「the」などの冠詞は、逆の指示がない限り、または文脈から明らかでない限り、１つまたは複数を意味し得る。グループの１つ以上のメンバー間に「または」を含む請求項または説明は、逆の指示がない限り、または文脈から明らかでない限り、グループメンバーの１つ、２つ以上、またはすべてが所与の製品またはプロセスに存在するか、用いられるか、またはその他で関連する場合に、満たされていると見なされる。本開示は、グループの正確に１つのメンバーが、所与の製品またはプロセスに存在するか、用いられるか、またはその他で関連する態様を含む。本開示は、グループメンバーの２つ以上、またはすべてが、所与の製品またはプロセスに存在するか、用いられるか、またはその他で関連する態様を含む。
さらに本開示は、列挙された請求項の１つ以上からの１つ以上の制限、要素、条項、および記述用語が別の請求項に導入されるところの、すべてのバリエーション、組み合わせ、および順列を包含する。例えば、別の請求項に依存する任意の請求項は、同じ基本請求項に依存する任意の他の請求項に見出される１つ以上の限定を含むように修正することができる。要素がリストとして（例えば、マーカッシュグループ形式で）表示される場合、要素の各サブグループも開示され、任意の要素（単数または複数）をグループから削除することができる。一般に、本開示または本開示の側面が特定の要素および／または特徴を含むと言及される場合、本開示または本開示の側面のある態様は、かかる要素および／または特徴からなるか、または本質的にこれらからなることが、理解されるべきである。簡単にするために、これらの態様は、本明細書では逐語的に具体的に述べられてはいない。用語「含む」および「含有する」は、オープンであることを意図しており、追加の要素またはステップを含めることが許容されることにも留意されたい。範囲が与えられている場合、別段の指定がない限り、エンドポイントはかかる範囲に含まれる。さらに、別段の指示がない限り、または文脈および当業者の理解から明らかでない限り、範囲として表される値は、本開示の異なる態様において記載された範囲内の任意の特定の値または下位範囲を、範囲の下限の単位の１０分の１まで、文脈が明確に逆を指示しない限りにおいて想定することができる。
本出願は、発行された様々な特許、公開された特許出願、ジャーナル記事、および他の刊行物に言及しており、これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる。組み込まれた参考文献と本明細書との間に矛盾がある場合、本明細書が優先するものとする。さらに、先行技術に含まれる本開示の任意の特定の態様は、任意の１つ以上の請求項から明示的に除外することができる。かかる態様は当業者に知られているとみなされるため、本明細書に除外が明示的に記載されていなくても、それらは除外され得る。本開示の任意の特定の態様は、理由の如何を問わず、先行技術の存在に関係するか否かにかかわらず、任意の請求項から除外することができる。
当業者は、日常的な実験のみを使用して、本明細書に記載の特定の態様に対する多くの均等物を認識するであろうし、または確認することができる。本明細書に記載される本態様の範囲は、上記の説明に限定されることを意図するものではなく、添付の特許請求の範囲に記載されるとおりである。当業者は、以下の特許請求の範囲で定義されるように、本開示の精神または範囲から逸脱することなく、この記載に対する様々な変更および修正を行い得ることを、理解するであろう。

Claims (79)

  1. Shank3タンパク質をコードする非天然ポリヌクレオチドであって、
    ここでShank3タンパク質は、ＳＨ３ドメイン、ＰＤＺドメイン、Homer結合ドメイン、コルタクチン結合ドメイン、およびＳＡＭドメインを含み；
    ここでＳＨ３ドメインは、配列番号６の残基４７４～５２５に対して少なくとも９０％の同一性、または配列番号５の残基４７３～５２４に対して少なくとも９０％の同一性を含み；
    ここでＰＤＺドメインは、配列番号６の残基５７３～６６２に対して少なくとも９０％の同一性、または配列番号５の残基５７２～６６１に対して少なくとも９０％の同一性を含み；
    ここでHomer結合ドメインは、配列番号５または６の残基１２９４～１３２３に対して少なくとも９０％の同一性を含み；
    ここで、コルタクチン結合ドメインは、配列番号５または６の残基１４００～１４２６に対して少なくとも９０％の同一性を含み、および／または
    ここでＳＡＭドメインは、配列番号６の残基１６６４～１７２９に対して少なくとも９０％の同一性、または配列番号５の残基１６６３～１７２８に対して少なくとも９０％の同一性を含み；および
    ここでポリヌクレオチドは４．７ｋｂ未満である、前記ポリヌクレオチド。
  2. ポリヌクレオチドがさらに、プロリンリッチ領域を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  3. ＳＨ３ドメインが、配列番号６の残基４７４～５２５または配列番号５の残基４７３～５２４を含み、ＰＤＺドメインが、配列番号６の残基５７３～６６２または配列番号５の残基５７２～６６１を含み、Homer結合ドメインが、配列番号５または６の残基１２９４～１３２３を含み；コルタクチン結合ドメインが、配列番号５または６の残基１４００～１４２６を含み、および／またはＳＡＭドメインが、配列番号６の残基１６６４～１７２９または配列番号５の残基１６６３～１７２８を含む、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
  4. ポリヌクレオチドが、配列番号１または２に対して少なくとも９０％の同一性を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  5. ポリヌクレオチドが、配列番号１または２を含む、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
  6. ポリヌクレオチドによってコードされるShank3タンパク質がさらに、アンキリンリピートドメインを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  7. アンキリンリピートドメインが、配列番号６の残基１４８～３４５に対して少なくとも９０％の同一性、または配列番号５の残基１４７～３１３に対して少なくとも９０％の同一性を含む、請求項６に記載のポリヌクレオチド。
  8. アンキリンリピートドメインが、配列番号６の残基１４８～３４５または配列番号５の残基１４７～３１３を含む、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
  9. ポリヌクレオチドが、配列番号３または４に対して少なくとも９０％の同一性を含む、請求項６～８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  10. ポリヌクレオチドが、配列番号３または４を含む、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
  11. ポリヌクレオチドが、約４．６ｋｂ未満、４．５ｋｂ未満、４．４ｋｂ未満、４．３ｋｂ未満、４．２ｋｂ未満、４．１ｋｂ未満、４．０ｋｂ未満、３．９ｋｂ未満、３．８ｋｂ未満、３．７ｋｂ未満、３．６ｋｂ未満、３．５ｋｂ未満、３．４ｋｂ未満、３．３ｋｂ未満、３．２ｋｂ未満、３．１ｋｂ未満、３．０ｋｂ未満、２．９ｋｂ未満、２．８ｋｂ未満、２．７ｋｂ未満、２．６ｋｂ未満、２．５ｋｂ未満、２．４ｋｂ未満、２．３ｋｂ未満、２．２ｋｂ未満、または２．１ｋｂ未満である、請求項１～１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  12. Shank3タンパク質が、配列番号５または６の全長にわたり、配列番号５または６と６５％未満の同一性である、請求項１～１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  13. Shank3タンパク質が、配列番号１７～２０のいずれか１つと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  14. Shank3タンパク質が、配列番号１７～２０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
  15. 請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリペプチドによってコードされる、Shank3タンパク質。
  16. 請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  17. ベクターがウイルスベクターである、請求項１６に記載のベクター。
  18. ベクターがＡＡＶベクターである、請求項１７に記載のベクター。
  19. ベクターが、請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む、請求項１８に記載のＡＡＶベクター。
  20. ポリヌクレオチドが、ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）に隣接している、請求項１９に記載のＡＡＶベクター。
  21. ＡＡＶベクターが、配列番号７または２１と少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項１８～２０のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
  22. ＡＡＶベクターが、配列番号７または２１の配列を含む、請求項２１に記載のＡＡＶベクター。
  23. 請求項１９～２１のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター、およびカプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子であって、ここでカプシドが、ＡＡＶ１、２、５、６、８、９、ｒｈ１０、およびＰＨＰ．ｅＢから選択される血清型のものである、前記ＡＡＶ粒子。
  24. 血清型がＡＡＶ９である、請求項２３に記載のＡＡＶ粒子。
  25. 血清型がＡＡＶ１０である、請求項２３に記載のＡＡＶ粒子。
  26. 血清型がＡＡＶ９－ＰＨＰ．ｅＢ血清型である、請求項２３に記載のＡＡＶ粒子。
  27. プロモーターがヒトプロモーターである、請求項１９に記載のＡＡＶベクター。
  28. プロモーターがｈＳｙｎ１である、請求項２７に記載のＡＡＶベクター。
  29. 請求項１８～２１のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターまたは請求項２３～２６に記載のＡＡＶ粒子を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
  30. ＡＡＶベクターまたは粒子が、静脈内投与される、請求項２９に記載の方法。
  31. ＡＡＶベクターまたは粒子が、対象の脳に送達される、請求項２９に記載の方法。
  32. ＡＡＶベクターまたは粒子が、対象の皮質、線条体および／または視床に送達される、請求項２９に記載の方法。
  33. 対象がヒト対象である、請求項２９に記載の方法。
  34. ヒト対象が成人である、請求項３３に記載の方法。
  35. ヒト対象が成人ではない、請求項３３に記載の方法。
  36. ヒト対象が２５歳以下である、請求項３３４に記載の方法。
  37. ヒト対象が１０歳以下である、請求項３５に記載の方法。
  38. 対象が、神経発達障害を有するか、有する疑いがあるか、または有するリスクがある、請求項２８～３６のいずれか一項に記載の方法。
  39. 対象が、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）を有するか、有する疑いがあるか、または有するリスクがある、請求項２９～３７のいずれか一項に記載の方法。
  40. 対象が、ＡＳＤの１つ以上の症状を示す、請求項２９～３７のいずれか一項に記載の方法。
  41. 対象が、フェラン・マクダーミド症候群を有するか、有する疑いがあるか、または有するリスクがある、請求項２９～３７のいずれか一項に記載の方法。
  42. 対象が、発育遅延、知的障害（ＩＤ）、睡眠障害、筋緊張低下、発話の欠如、または言語遅延のうちの１つ以上を示す、請求項２９～４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 対象が、対照対象と比較して、Shank3遺伝子の発現の低下を有するか、有する疑いがあるか、または有するリスクがある、請求項２９～４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 対照対象が、神経発達障害、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）、および／またはフェラン・マクダーミド症候群を有しないか、有する疑いがないか、または有するリスクがない対象である、請求項４３に記載の方法。
  45. Shank3遺伝子の発現低下が、Shank3遺伝子の少なくとも１つのコピーの破壊によって引き起こされる、請求項４３または４４に記載の方法。
  46. Shank3遺伝子の破壊が、Shank3遺伝子の少なくとも１つのコピーにおける欠失を含む、請求項４５に記載の方法。
  47. Shank3遺伝子の破壊が、Shank3遺伝子の少なくとも１つのコピー内の１つ以上の変異を含む、請求項４５に記載の方法。
  48. 神経発達障害を有する対象を処置する方法であって、該方法が、ＡＡＶベクターを含む組成物の有効量を対象に投与することを含み、ここでＡＡＶベクターが、Shank3タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、前記方法。
  49. 自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）を有する対象を処置する方法であって、該方法が、ＡＡＶベクターを含む組成物の有効量を対象に投与することを含み、ここでＡＡＶベクターが、Shank3タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、前記方法。
  50. フェラン・マクダーミド症候群を有する対象を処置する方法であって、該方法が、ＡＡＶベクターを含む組成物の有効量を対象に投与することを含み、ここでＡＡＶベクターが、Shank3タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、前記方法。
  51. Shank3タンパク質が、ＳＨ３ドメイン、ＰＤＺドメイン、Homer結合ドメイン、コルタクチン結合ドメイン、およびＳＡＭドメインを含む、請求項４８～５０のいずれか一項に記載の方法。
  52. Shank3タンパク質がさらに、アンキリンリピートドメインを含む、請求項４８～５０のいずれか一項に記載の方法。
  53. アンキリンリピートドメインが、配列番号６の残基１４８～３４５に対して少なくとも９０％の同一性、または配列番号５の残基１４７～３１３に対して少なくとも９０％の同一性を含む、請求項５２に記載の方法。
  54. 請求項５１～５３のいずれか一項に記載の方法であって、ここでＳＨ３ドメインは、配列番号６の残基４７４～５２５に対して少なくとも９０％の同一性、または配列番号５の残基４７３～５２４に対して少なくとも９０％の同一性を含み；
    ここでＰＤＺドメインは、配列番号６の残基５７３～６６２に対して少なくとも９０％の同一性、または配列番号５の残基５７２～６６１に対して少なくとも９０％の同一性を含み；
    ここでHomer結合ドメインは、配列番号５または６の残基１２９４～１３２３に対して少なくとも９０％の同一性を含み；
    ここでコルタクチン結合ドメインは、配列番号５または６の残基１４００～１４２６に対して少なくとも９０％の同一性を含み；および／または
    ここで、ＳＡＭドメインは、配列番号６の残基１６６４～１７２９に対して少なくとも９０の同一性、または配列番号５の残基１６６３～１７２８に対して少なくとも９０％の同一性を含む、前記方法。
  55. 請求項４８～５０のいずれか一項に記載の方法であって、ここでＳＨ３ドメインは、配列番号６の残基４７４～５２５または配列番号５の残基４７３～５２４を含み、
    ここでＰＤＺドメインは、配列番号６の残基５７３～６６２または配列番号５の残基５７２～６６１を含み、
    ここでHomer結合ドメインは、配列番号５または６の残基１２９４～１３２３を含み；
    ここでコルタクチン結合ドメインは、配列番号５または６の残基１４００～１４２６を含み；および／または
    ここでＳＡＭドメインは、配列番号６の残基１６６４～１７２９または配列番号５の残基１６６３～１７２８を含む、前記方法。
  56. ポリヌクレオチドが４．７ｋｂ未満である、請求項４７～４９のいずれか一項に記載の方法。
  57. ポリヌクレオチドが、約４．６ｋｂ未満、４．５ｋｂ未満、４．４ｋｂ未満、４．３ｋｂ未満、４．２ｋｂ未満、４．１ｋｂ未満、４．０ｋｂ未満、３．９ｋｂ未満、３．８ｋｂ未満、３．７ｋｂ未満、３．６ｋｂ未満、３．５ｋｂ未満、３．４ｋｂ未満、３．３ｋｂ未満、３．２ｋｂ未満、３．１ｋｂ未満、３．０ｋｂ未満、２．９ｋｂ未満、２．８ｋｂ未満、２．７ｋｂ未満、２．６ｋｂ未満、２．５ｋｂ未満、２．４ｋｂ未満、２．３ｋｂ未満、２．２ｋｂ未満、または２．１ｋｂ未満である、請求項４８～５０のいずれか一項に記載の方法。
  58. ポリヌクレオチドがさらに、プロリンリッチ領域を含む、請求項４８～５０のいずれか一項に記載の方法。
  59. ポリヌクレオチドが、配列番号１～４のいずれか１つに対して少なくとも９０％の同一性を含む、請求項４８～５０のいずれか一項に記載の方法。
  60. ポリヌクレオチドが、配列番号１～４のいずれか１つを含む、請求項４８～５０のいずれか一項に記載の方法。
  61. 対象がヒト対象である、請求項４７８～５０のいずれか一項に記載の方法。
  62. ヒト対象が成人である、請求項６１に記載の方法。
  63. ヒト対象が成人ではない、請求項６１に記載の方法。
  64. ヒト対象が２５歳以下である、請求項６２に記載の方法。
  65. ヒト対象が１０歳以下である、請求項６３に記載の方法。
  66. 組成物が、静脈内投与される、請求項４８～６５のいずれか一項に記載の方法。
  67. 組成物が、対象の脳に送達される、請求項４８～６５のいずれか一項に記載の方法。
  68. 組成物が、対象の線条体および／または視床に送達される、請求項４８～６５のいずれか一項に記載の方法。
  69. 対象が、発育遅延、知的障害（ＩＤ）、睡眠障害、筋緊張低下、発話の欠如、または言語遅延のうちの１つ以上を示す、請求項４８～６８のいずれか一項に記載の方法。
  70. 自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）が、自閉症を含む、請求項４８に記載の方法。
  71. 対象が、対照対象と比較して、Shank3遺伝子の発現の低下を有するか、有する疑いがあるか、または有するリスクがある、請求項４８～７０のいずれか一項に記載の方法。
  72. 対照対象が、神経発達障害、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）、および／またはフェラン・マクダーミド症候群を有しないか、有する疑いがないか、または有するリスクがない対象である、請求項７１に記載の方法。
  73. Shank3遺伝子の発現低下が、Shank3遺伝子の少なくとも１つのコピーの破壊によって引き起こされる、請求項７１または７２に記載の方法。
  74. Shank3遺伝子の破壊が、Shank3遺伝子の少なくとも１つのコピーにおける欠失を含む、請求項７３に記載の方法。
  75. Shank3遺伝子の破壊が、Shank3遺伝子の少なくとも１つのコピー内の１つ以上の変異を含む、請求項７３に記載の方法。
  76. 対象が、有効量の組成物を投与された後に改善された睡眠効率を有する、請求項４８～５０のいずれか一項に記載の方法。
  77. 組成物が、薬学的に許容し得る担体中にある、請求項４８～７６のいずれか一項に記載の方法。
  78. 配列番号１７～２０のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一である配列を含む、MiniShank3タンパク質。
  79. MiniShank3タンパク質が、配列番号１７～２０のいずれか１つの配列を含む、請求項７８に記載のMiniShank3タンパク質。
JP2023512119A 2020-08-17 2021-08-17 Ｓｈａｎｋ３遺伝子治療アプローチ Pending JP2023539574A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063066570P 2020-08-17 2020-08-17
US63/066,570 2020-08-17
PCT/US2021/046382 WO2022040239A1 (en) 2020-08-17 2021-08-17 Shank3 gene therapy approaches

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2023539574A true JP2023539574A (ja) 2023-09-15

Family

ID=77951796

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023512119A Pending JP2023539574A (ja) 2020-08-17 2021-08-17 Ｓｈａｎｋ３遺伝子治療アプローチ

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20230340041A1 (ja)
EP (1) EP4196494A1 (ja)
JP (1) JP2023539574A (ja)
KR (1) KR20230051578A (ja)
CN (1) CN116406305A (ja)
AU (1) AU2021328570A1 (ja)
BR (1) BR112023003023A2 (ja)
CA (1) CA3192052A1 (ja)
IL (1) IL300526A (ja)
MX (1) MX2023001998A (ja)
WO (1) WO2022040239A1 (ja)

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5549910A (en) 1989-03-31 1996-08-27 The Regents Of The University Of California Preparation of liposome and lipid complex compositions
US5252334A (en) 1989-09-08 1993-10-12 Cygnus Therapeutic Systems Solid matrix system for transdermal drug delivery
JP3218637B2 (ja) 1990-07-26 2001-10-15 大正製薬株式会社 安定なリポソーム水懸濁液
JP2958076B2 (ja) 1990-08-27 1999-10-06 株式会社ビタミン研究所 遺伝子導入用多重膜リポソーム及び遺伝子捕捉多重膜リポソーム製剤並びにその製法
US5741516A (en) 1994-06-20 1998-04-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Sphingosomes for enhanced drug delivery
US5795587A (en) 1995-01-23 1998-08-18 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
US5697899A (en) 1995-02-07 1997-12-16 Gensia Feedback controlled drug delivery system
US5738868A (en) 1995-07-18 1998-04-14 Lipogenics Ltd. Liposome compositions and kits therefor
US5656016A (en) 1996-03-18 1997-08-12 Abbott Laboratories Sonophoretic drug delivery system
US5797898A (en) 1996-07-02 1998-08-25 Massachusetts Institute Of Technology Microchip drug delivery devices
US5783208A (en) 1996-07-19 1998-07-21 Theratech, Inc. Transdermal drug delivery matrix for coadministering estradiol and another steroid
US5779708A (en) 1996-08-15 1998-07-14 Cyberdent, Inc. Intraosseous drug delivery device and method
DK2292779T3 (en) 2003-09-30 2017-02-27 Univ Pennsylvania ADENOASS-ASSOCIATED VIRUS (AAV) CLADES, SEQUENCES, VECTORS CONTAINING SAME AND APPLICATIONS THEREOF
GB201103062D0 (en) 2011-02-22 2011-04-06 Isis Innovation Method
EP3561062A1 (en) 2013-09-13 2019-10-30 California Institute of Technology Selective recovery
MX2018006840A (es) 2015-12-11 2019-03-28 California Inst Of Techn Focalizacion de peptidos para dirigir virus adenoasociados.
KR102427379B1 (ko) 2016-05-18 2022-08-02 보이저 테라퓨틱스, 인크. 헌팅톤 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법
EP3917945A4 (en) 2019-01-30 2023-02-08 The Broad Institute Inc. ADVANCED ADENO-ASSOCIATED VIRUS (AAVS) TARGETED DELIVERY SYSTEMS
IT201900008877A1 (it) * 2019-06-13 2020-12-13 Univ Bologna Alma Mater Studiorum Nuovi costrutti per terapia genica

Also Published As

Publication number Publication date
US20230340041A1 (en) 2023-10-26
WO2022040239A8 (en) 2022-06-23
CN116406305A (zh) 2023-07-07
IL300526A (en) 2023-04-01
WO2022040239A1 (en) 2022-02-24
AU2021328570A1 (en) 2023-03-09
KR20230051578A (ko) 2023-04-18
CA3192052A1 (en) 2022-02-24
BR112023003023A2 (pt) 2023-04-11
EP4196494A1 (en) 2023-06-21
MX2023001998A (es) 2023-05-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6397391B2 (ja) 神経変性障害のための遺伝子治療
JP5766389B2 (ja) 脊髄疾患の遺伝子療法
JP2022123145A (ja) 認知保護を提供しつつ疾患の発症及び進行を遅らせるための遺伝子治療を用いた神経変性疾患の治療方法
JP7389744B2 (ja) ムコ多糖症ｉｉｉａ型のための遺伝子療法
JP2021507687A (ja) ムコ多糖症ｉｉｉｂ型のための遺伝子療法
BRPI0612761A2 (pt) vetores aav codificando superóxido dismutase
JP2019517274A (ja) 最適化されたｃｌｎ１遺伝子および発現カセットおよびそれらの使用
JP2022523766A (ja) Ｇｒｎ関連成人発症性神経変性の治療のための組換えアデノ随伴ウイルス
EP2212348B1 (en) Materials and methods for gene mediated therapy of psychiatric disorders
US20220185862A1 (en) Dna-binding domain transactivators and uses thereof
JP2021052796A (ja) コドン最適化された小型ＡＴＰ７Ａ ｃＤＮＡおよび銅輸送障害を処置するための使用
JP2023539574A (ja) Ｓｈａｎｋ３遺伝子治療アプローチ
US20230285596A1 (en) Compositions and methods for the treatment of niemann-pick type c1 disease
US20230295654A1 (en) Methods and compositions for treatment of fragile x syndrome
Vaillend et al. Gene therapy for central nervous system in Duchenne muscular dystrophy
US20240033375A1 (en) Compositions useful for treating spinal and bulbar muscular atrophy (sbma)
US20230183741A1 (en) Disease correction by delivery of aav8 vectors expressing codon optimized naglu
KR20230023637A (ko) 크라베병의 치료에 유용한 조성물
JP2023526049A (ja) Ｇｍ１ガングリオシド－シスおよび他の障害を処置するための組成物および方法
WO2023201373A2 (en) Methods and compositions for treating neuropathies caused by a cntnap1 mutation
JP2023534037A (ja) シャルコー・マリー・トゥース病の治療に有用な組成物

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230905