BRPI0612761A2 - vetores aav codificando superóxido dismutase - Google Patents

Abstract

VETORES AAV CODIFICANDO SUPEROXIDO DISMUTASE. A presente invenção refere-se a vetores de vírus adeno-associado (AAV) codificando superóxido dismutase (SOD), onde o vetor AAV codificando SOD (AAV-SOD) pode ser usado para aplicar o gene SOD a células alvo. As células alvo podem estar dentro de um indivíduo tendo uma doença ou condição para a qual a aplicação de SOD às células alvo provê um benefício terapêutico e/ou um efeito terapêutico no indivíduo. Em um outro aspecto, a invenção refere-se a um sistema modelo para avaliação de compostos quanto à eficácia em tratamento de esclerose amiotrófica lateral (ALS). O sistema modelo pode compreender uma pluralidade de células transduzidas com um vetor AAV codificando um gene SOD; as células transduzidas podem exibir uma mudança fenotípica associada com ALS. O sistema modelo da invenção pode ser usado para avaliar compostos quanto à eficácia no tratamento de ALS.

Description

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Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VETORESAAV CODIFICANDO SUPERÓXIDO DISMUTASE".

O presente pedido de patente reivindica prioridade sob o 35U.S.C. § 119(e) ao Pedido Provisório U.S. No. 60/697.450 depositado em 7 dejulho de 2005, cujos conteúdos são aqui incorporados a título de referência.

Campo da Técnica

A presente invenção refere-se a modelos in vitro para a triagemde compostos quanto à eficácia em tratamento de esclerose lateral amiotró-fica (ALS). A presente invenção refere-se também a vetores e métodos deterapia de gene.

Antecedentes

Doenças neurodegenerativas- apresentam questões de saúdepúblicas importantes. Por exemplo, esclerose lateral amiotrófica (ALS) é umadoença letal progressiva cruel que envolve destruição seletiva de neurôniosmotores. Informação adicional com relação à ALS pode ser encontrada noOnline Mendelian Inheritance in Man (OMIM) número de acesso 105400 eem Rowland e Shneider (2001) Amyotrophic lateral sclerosis, New Eng. J.Med. 344:1688-1700, cujas revelações são aqui incorporadas a título de re-ferência em suas totalidades.

Mutações em genes codificando superóxido dismutase (SOD)estão associadas com ALS. Três variantes de SOD são conhecidas estarpresentes em mamíferos. O SOD citoplásmico é uma enzima de cobre zinco(Cu/Zn SOD) codificada por SOD1 (Weisiger e Fridovich (1973) J. Biol.Chem. 248, 4793-4796). Conforme discutido infra, defeitos genéticos emSOD1 foram associados com esclerose lateral amiotrófica familiar (fALS).SOD mitocondrial (MnSOD) está associado com manganês e é codificadapor SOD2. Li e outros ((1995) Nature Genetics 11, 376-381) descreve umcamundongo mutante onde o gene codificando SOD2 foi inativado. Uma ter-ceira SOD de mamífero, codificada por SOD3 (Carlsson e outros (1995)Proc. Natl. Acad. Sci., USA 92, 6264-6268), também contendo cobre e zinco,está localizada abundantemente extracelularmente. Inativação deste genenão resulta em nenhum fenótipo observável.Aproximadamente 20% de fALS estão ligados a mutações nogene SOD1 (Julien, J.P., Cell (2001) 104:581-591). Camundongos transgê-nicos superexpressando o gene SOD1 mutante onde glicina 93 foi mutadapara alanina (G93A) desenvolvem um distúrbio paralítico de início adultodominantemente herdado que tem muitas das características clínicas e pato-lógicas de fALS (Gurney e outros, Science (1994) 264:1772-1775). No en-tanto, até agora, os mecanismos moleculares que levam à degeneração deneurônio motor em ALS e maioria das doenças de neurônio motor permane-cem pobremente compreendidos, e atualmente não há nenhuma terapia dis-ponível para prevenir ou curar ALS.

Métodos de triagem de compostos eficazes no tratamento deALS são ineficierites è dê trabalho intensivo, impedindo-o desenvolvimentode fármaco. Embora õs camundongos transgênicos ALS discutidos acimarepresentem um método in vivo útil para triagem da eficácia de compostoscandidatos, experimentos com camundongos são relativamente caros, con-somem tempo e não são bem adequados para triagem de resultado emgrande quantidade. Outros experimentos se apoiam no estudo de expressãode gene em amostras de humano post-mortem, que não são abundantes, enão-submetidas à manipulação experimental controlada.

Um modelo eficiente in vitro para ALS facilitaria a triagem rápidade compostos terapêuticos potenciais. Compostos demonstrando efeitosbenéficos in vitro poderiam então ser validados mais com teste adicional, porexemplo, usando os camundongos transgênicos discutidos acima. Métodosin vitro existentes, no entanto, são inadequados para triagem de resultadoem grande quantidade. Por exemplo, em um método, células individuais emcultura primária são microinjetadas com um plasmídeo codificando um geneSOD1 mutante (por exemplo, G93A) para imitar os efeitos de superexpres-são do mesmo gene mutante em ALS. Tais células podem então ser trata-das com um composto de interesse para determinar se o composto é capazde reverter o(s) efeito(s) fenotípico(s) associado(s) com a superexpressão deSOD1, tal como formação de agregados ou inclusões. Microinjeção, no en-tanto, é de trabalho intensivo e pode ser realizada em apenas um númerolimitado de células, tornando difícil se obter resultados estatisticamente ro-bustos.

Existe a necessidade de um sistema modelo para triagem decompostos quanto à eficácia em reverter ou melhorar os efeitos de ALS,modelo que deve ser condescendente à triagem de resultado em grandequantidade e permitir a avaliação de um número estatisticamente significantede células para determinar a eficácia de compostos de interesse.

SOD do tipo selvagem (não o mutante) pode ser útil como umagente terapêutico. Vários distúrbios são o resultado de estresse oxidativo,isto é, a presença de espécies oxigênio reativas prejudiciais (ROS) em célu-las, tal como superóxido. Vide, por exemplo, Cash e outros, (2004) Med.Chem. f?evr1:19-23. Superóxido dismutase catalisa a conversão de superó-xido em peróxido de hidrogênio e oxigênio molecular. O peróxido de hidro-gênio produzido por SOD é subseqüentemente convertido em oxigênio mo-Iecular e água por catalase, completando a conversão de superóxido paraformas menos reativas, e então, menos prejudiciais, de oxigênio.

Antioxidantes, tal como vitamina A, vitamina C, glutationa, vita-mina E, carotenos, ácido lipóico e coenzima Qi0, podem ser administradospara reduzir a produção e acúmulo de tais espécies, mas tais agentes po-dem não acumular para níveis eficazes dentro de células quando adminis-trados sistemicamente. Como uma alternativa, aplicação sustentada da en-zima SOD a tais células poderia ajudar a diminuir os efeitos prejudiciais deformação de superóxido.

Existe a necessidade de vetores e métodos de terapia que se-jam capazes de aplicar um gene de SOD a células em um indivíduo quepossa se beneficiar da atividade de SOD. Tais indivíduos incluem aquelesque sofrem de distúrbios causando produção ou acúmulo em excesso desuperóxido, aqueles expostos a condições ambientais causando produçãode superóxido ou acúmulo em excesso, e até mesmo aqueles sujeitos aodano oxidativo cumulativo associado com envelhecimento normal.

Sumario da Invenção

Em um aspecto, a invenção refere-se a vetores de vírus adeno-associados (AAV) codificando superóxido dismutase (SOD). Em uma moda-lidade o SOD é SOD 1. Em outra modalidade, o gene de S0D1 contém umamutação associada com ALS1 tal como Gly93Ala.

Em uma modalidade, o vetor AAV codificando SOD (AAV-SOD)é usado para aplicar o gene de SOD a células-alvo. Em uma modalidade ascélulas-alvo estão dentro de um indivíduo tendo uma doença ou condiçãopara a qual aplicação de SOD às células-alvo provê um benefício terapêuti-co. Em algumas modalidades, aplicação de SOD resulta em um efeito tera-pêutico no indivíduo. Em outras modalidades, a doença ou condição é sele-cionada do grupo consistindo em doença de Parkinson,doença de Hunting-ton, doença do olho degenerativa (por exemplo, degeneração macular, retini-te pigmentosa), doença de Alzheimerl artrite reumatóide, doença de Chron,doença de Peyronie, colite ulcerativa, isquemia cerebral (derrame), infarto domiocárdio (ataque cardíaco), trauma cerebral e/ou do cordão espinhal, danopor reperfusão, ALS, síndrome de Down, cataratas, esquizofrenia, epilepsia,leucemia humana e outros cânceres e diabetes.

Em um outro aspecto a invenção refere-se a um sistema modelopara triagem de compostos quanto à eficácia em tratamento de escleroselateral amiotrófica (ALS) compreendendo uma pluralidade de células trans-duzidas com um vetor AAV codificando um gene de SOD1 contendo umamutação associada com ALS, tal como Gly93Ala. Em várias modalidades, ovetor AAV da invenção é derivado de AAV-2, AAV-5 ou AAV-6.

Em uma modalidade, a^ pluralidade de células transduzidas como vetor AAV compreende pelo menos 80% das células na população ondeelas são encontradas, por exemplo, uma cultura primária de células de cor-dão espinhal de roedor.

Em algumas modalidades as células transduzidas exibem umamudança fenotípica associada com ALS. Em outras modalidades, um oumais compostos avaliados reduzem ou melhoram esta mudança fenotípica.

Em ainda outro aspecto, a invenção refere-se a métodos de tria-gem de compostos quanto à eficácia em tratamento de ALS usando um sis-tema modelo da invenção.Breve Descrição dos Desenhos

A Figura 1 é um diagrama esquemático de um vetor rAAV paraaplicação de hSOD1--Gly93Ala, referido como pVm-G93ASOD. Expressãode hSOD1-Gly93Ala é direcionada pelo promotor de beta-actina de galinha.

O cassete de expressão está localizado entre duas seqüências ITR de AAV-2. SOD1-Gly91Ala é também referido aqui como SOD "mutante".

A Figura 2 é um diagrama esquemático de um vetor rAAV paraaplicação de S0D1 humano do tipo selvagem, referido como pVm-WTSOD.Expressão de wtSODI é direcionada pelo promotor de beta-actina de gali-nha. O cassete de expressão está localizado entre duas seqüências ITR deAAV-2.

Descrição Detalhada

A prática da presente invenção vai empregar, a menos que deoutro modo indicado, métodos convencionais de virologia, microbiologia, bio-Iogia de célula e molecular e técnicas de DNA recombinante dentro da habi-lidade na técnica. Tais técnicas são explicadas integralmente na literatura.Vide, por exemplo, Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Ma-nual (Edução Atual); DNA Cloning: A Practical Approach, Vol. I & Il (D. Glo-ver, Ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, Ed., Edição Atual); NucIeicAcidHybridization (B. Hanes & S. Higgins, Eds., Edição Atual); Transeription andTranslation (B. Hames & S. Higgins, eds., Edição Atual); CRC Handbook ofParvoviruses, Vol. I & Il (P. Tijssen, ed.); Fundamental Virology, 2a Edição,Vol. I & Il (B.N. Fields e D.M. Knipe, Eds.); Fresehney, Culture of Animal Cel-ls, A Manual of Basic Technique (Wiley-Liss, Terceira Edição); e Ausubel eoutros (1991) Current Protocols in Molecular Biology (Wiley Interscience, NY).

Todas as publicações, patentes, pedidos de patente e acessos abancos de dados (incluindo acessos OMIM) citados aqui são aqui incorpora-dos a título de referência em sua totalidade.

A presente invenção refere-se a vetores AAV codificando SODque podem ser usados para criar um sistema modelo in vitro para ALS oucomo agentes terapêuticos.Mutações de SOD1 associadas com ALS

No aspecto da invenção com relação a um sistema modelo deALS1 o gene SOD codificado pelo vetor AAV compreende uma mutação as-sociada com ALS. "Uma mutação associada com ALS", conforme aqui usa-do, refere-se a uma mutação em um gene de SOD que acontece com maiorfreqüência em indivíduos tendo ALS do que em indivíduos que não têm ALS.A seqüência de amino ácido de wtSODI é apresentada na Tabela 1. Muta-ções conhecidas em S0D1 incluem Ala4Ser, Ala4Thr, Ala4Val (A4V;147450.0012), Cys6Gly, Cys6Phe, Val7Glu, Leu8Val, Leu8Gln, GIyIOVaI,Gly12Arg, Val14Met, Val14Gly, Glyl6Ala, Glyl6Ser, Asnl9Ser, Phe20Cys,Glu21Gly, Glu21Lys, Gln22Leu, Gly37Arg (G37R; 147450.0001), Leu38Arg,Leü38Val (L38V; 147450.0002), Gly41Asp (G41 Drt47450T0004), Gly41Ser,His43Arg, Phe45Cys, His46Arg (H46R; 147450.0013), Val47Phe, His48Arg,His48Gln, Glu49Lys, Thr54Arg, Cys57Arg, Ser59lle, Asn65Ser, Leu67Arg,Gly72Cys, Gly72Ser, Asp76Tyr, Asp76Val, His80Ala, His80Arg, Leu84Val,Gly85Arg, Asn86Asp, Asn86Ser, Val87Met, Val87Ala, Ala89Thr, Ala89Val,Asp90Ala, Asp90Val, Gly93Ala (G93A; 147450.0008), Gly93Arg, Gly93Asp,Gly93Cys (G93C; 147450.0007), Gly93Ser, Gly93Val, Ala95Thr, Asp96Asn,Val97Met, GIuIOOGIy, GIuIOOLys, Asp101Asn, Asp101Gly, Asp101His, I-le104Phe, Leu106Val, lle113Thr (I113T; 147450.0011), Leul26Ter,Ser134Asn, Leul44Ser e Alal45Thr. Números seguindo mutações, quandopresentes, representam números de referência OMIM para essas mutações.Mutações de SOD1 são também reveladas em Rosen e outros (1993). Mu-tações em gene de superóxido dismutase de Cu/Zn estão associadas comesclerose lateral amiotrófica familiar, Nature 362:59-62; Cudkowic e outros,(1997) "Epidemiology of mutations in superoxide dismutase in amyotrophiclateral sclerosis", Annr Neuroi 41:210-221; Belleroche e outros (1995). "Fa-milial amyotrophic lateral sclerosis/motor neuron disease (FALS): a review ofcurrent developments", J. Med. Genet. 32:841-847. Embora várias mutaçõesem SOD1 sejam reveladas aqui, nenhum desses mutantes será útil na cria-ção de modelos de doença para ALS.Tabela 1: Seqüência de Amino Ácido de wtSODI

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Vetores de Vírus Adeno-Associado

Vírus adeno-associado (AAV) tem sido usado com sucesso paraaplicar genes para terapia de gene e testes clínicos em seres humanos têmdemonstrado grande promessa (vide, por exemplo, Kay e outros, Nat Genet.(2000) 24:257-261). Como o único sistema de vetor viral baseado em umvírus não-patogênico e de replicação defeituosa, vírions de AAV recombi-nantes têm sido usados com sucesso para estabelecer transferência de ge-ne eficiente e sustentada de ambas células em proliferação e terminalmentediferenciadas em uma variedade de tecidos sem respostas imunes detectá-veis ou toxidez (Bueler, H., Biol. Chem. (1999) 380:613-622).

O genoma de AAV é uma molécula de DNA de filamento sim-ples, linear, contendo cerca de 4681 nucleotídeos. O genoma de AAV ge-ralmente compreende um genoma de não-repetição interno flanqueado emcada extremidade por repetições terminais invertidas (ITRs). As ITRs sãoaproximadamente de 145 pares de base (pb) de comprimento. As ITRs têmfunções múltiplas, incluindo como origens de replicação de DNA e como si-nais de empacotamento para o genoma viral. A porção não-repetida internado genoma inclui duas estruturas de leitura aberta grandes, conhecidas co-mo os genes de replicação (rep) e capsídeo {cap) de AAV. Os genes rep ecap codificam proteínas virais que permitem que o vírus replique e empacoteem um vírion. Em particular, uma família de pelo menos quatro proteínasvirais é expressa da região rep de AAV, Rep 78, Rep 68, Rep 52 e Rep 40,nomeadas de acordo com seu peso molecular aparente. A região cap deAAV codifica pelo menos três proteínas, VP1, VP2 e VP3.AAV foi construído para aplicar genes de interesse através dedeleção da porção de não-repetição interna do genoma de AAV (isto é, osgenes rep e cap) e inserção de um gene heterólogo entre as ITRs. O geneheterólogo é tipicamente funcionalmente ligado a um promotor heterólogo(constitutivo, específico de célula ou induzível) capaz de direcionar expressãode gene nas células-alvo do paciente sob condições apropriadas. Sinais determinação, tal como sítios de poliadenilação, podem ser também incluídos.

AAV é um vírus dependente de auxiliar; isto é, ele requer co-infecção com um vírus auxiliar (por exemplo, adenovírus, herpesvírus ouvaccínia), a fim de formar vírions de AAV no selvagem. Na ausência de co-infecção com um vírus auxiliar, AAV estabelece um estado latente onde ogenoma viral se insere em um cromossomo da célula-hospedeiro, mas ví-rions infecciosos não são produzidos. Infecção subseqüente por um vírusauxiliar "resgata" o genoma integrado, permitindo que ele replique e empa-cote seu genoma em um vírion de AAV infeccioso. Embora AAV possa infec-tar células de espécies diferentes, o vírus auxiliar deve ser da mesma espé-cie que a célula-hospedeiro. Então, por exemplo, AAV humano vai replicarem células caninas co-infectadas com um adenovírus canino.

Em uma modalidade preferida da presente invenção, um métodode transfecção triplo (descrito em detalhe na Patente U.S. No. 6.001.650,incorporada aqui a título de referência em sua totalidade) é usado para pro-duzir vírions de rAAV porque este método não requer o uso de um vírus au-xiliar infeccioso, permitindo que os vírions de rAAV sejam produzidos semqualquer vírus auxiliar detectável presente. Isto é conseguido através do usode três vetores para produção de vírion de rAAV: um vetor de função auxiliarde AAV, um vetor de função acessório e um vetor de expressão de rAAV.Uma pessoa versada na técnica vai compreender que as seqüências de áci-do nucléico codificadas por esses vetores podem ser providas em dois oumais vetores em várias combinações.

O vetor de função auxiliar de AAV codifica as seqüências defunção auxiliar de AAV (isto é, rep e cap), que funcionam in trans para repli-cação e encápsidação de AAV produtivas. De preferência, o vetor de funçãoauxiliar de AAV apóia produção de vetor AAV eficiente sem gerar quaisquervírions de AAV detectáveis contendo genes rep e cap funcionais. Um exem-plo de tal vetor, pHLP19 é descrito na Patente U.S. No. 6.001.650, incorpo-rada aqui a título de referência em sua totalidade. Os genes rep e cap dovetor de função auxiliar AAV podem ser derivados de qualquer um dos soro-tipos de AAV conhecidos, conforme acima explicado, por exemplo, o vetorde função auxiliar AAV pode ter um gene rep derivado de AAV-2 e um genecap derivado de AAV-6. Uma pessoa versada na técnica vai reconhecer queoutras combinações de genes rep e cap são possíveis, a característica dedefinição sendo a habilidade em apoiar produção de vírion de rAAV.

O vetor de função acessório codifica seqüências de nucleotídeopara funções virais e/ou celulares derivadas de não-AAV das quais AAV édependente para replicação, referidas aqui como funções acessório. As fun-ções acessório incluem aquelas funções requeridas para replicação de AAV1incluindo, sem limitação, aquelas porções envolvidas em ativação de trans-crição de gene de AAV, união de mRNA de AAV específico de estágio, repli-cação de DNA de AAV, síntese de produtos de expressão de cap e monta-gem de capsídeo de AAV. Funções acessório baseadas em virais podem serderivadas de qualquer um dos vírus auxiliares bem conhecidos tal como a-denovírus, herpesvírus (outros que não o vírus herpes simplex tipo-1) e vírusvaccínia. Em uma modalidade preferida, o plasmídeo de função acessóriopLadeno5 é usado. Detalhes com relação a pLadeno5 são descritos na Pa-tente U.S. No. 6.004.797, incorporada aqui a título de referência em sua tota-lidade. Este plasmídeo provê um conjunto completo de funções acessório deadenovírus para produção de vetor AAV, mas não tem os componentes ne-cessários para formar adenovírus competentes em replicação.

Vetores de Expressão AAV Recombinantes

Vetores de expressão AAV recombinantes (rAAV) são construí-dos usando técnicas conhecidas para prover componentes operativamenteligados incluindo elementos de controle (incluindo uma região de iniciaçãotranscripcional), o polinucleotídeo de codificação de SOD de interesse e umaregião de terminação transcripcional. O construto resultante contém os com-ponentes operativamente ligados (51 e 3') ligados com seqüências de ITR deAVV funcionais.

Em modalidades direcionadas a um sistema modelo para o es-tudo de ALS1 os elementos de controle são selecionados para serem funcio-nais em uma célula neuronal de mamífero. Em modalidades direcionadas avetores AAV-SOD para usos terapêuticos, os elementos de controle são se-lecionados para serem funcionais na célula-alvo ou tecido de interesse. Em-bora elementos de controle específicos de tecido e reguláveis sejam deseja-dos em algumas modalidades da presente invenção, outras modalidadesenvolvem o uso de promotores constitutivos.

As seqüências de nucleotídeo de regiões de ITR de AAV sãoconhecidas: Vide; por exemplo, Kotin, R.M. (\9d4)—Haman Gene Therapy5:793-801: Berns, K.l. "Parvoviridãe and their Replication" em FundamentalVirology, 2a Edição, (B.N. Fields e D.M. Knipe, eds) para a seqüência deAAV-2. ITRs de AVV usadas nos vetores da invenção não precisam ter umaseqüência de nucleotídeo do tipo selvagem, e podem ser alteradas, por e-xemplo, através da inserção, deleção ou substituição de nucleotídeos. Adi-cionalmente, ITRs de AAV podem ser derivadas de qualquer um de váriossorotipos de AAV, incluindo, sem limitação, AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4,AAV-5, AAV-6, AAV-7 e AAV-8, etc. ITRs de AAV podem ser também deri-vadas, por exemplo, de variantes de AAV isoladas de fontes de murino, ca-prino ou bovino. Ainda, as ITRs 5' e 3' que flanqueiam uma seqüência denucleotídeo selecionada em um vetor de expressão AAV não precisam sernecessariamente idênticas ou derivadas do mesmo sorotipo ou isolato deAAV, contanto que elas funcionem conforme pretendido, isto é, para permitirexcisão e resgate da seqüência de interesse a partir do genoma ou vetor dacélula-hospedeiro, e permitir integração da molécula de DNA no genoma dacélula recipiente quando produtos de gene rep de AAV estão presentes nacélula.

Sorotipos de AAV diferentes podem ser usados para especifica-mente direcionar tipos de célula diferentes. Por exemplo, em várias modali-dades, os vetores da presente invenção são derivados de AAV-2, AAV-5 eAAV-6. Por exemplo, em culturas rieurais motoras de rato primárias, vetoresderivados de AAV-6 direcionam a expressão de SOD principalmente emneurônios; vetores derivados de AAV-2 direcionam a expressão de SOD emambos neurônios e glia; e vetores derivados de AAV-5 direcionam expressãode SOD principalmente em glia. hSOD1-Gly93Ala causa mudanças morfoló-gicas em neurônios motores que estão associadas com patologia quandoaplicado usando um vetor derivado de AAV-2 mas não causa patologia emneurônios motores quando aplicado usando um vetor derivado de AAV-5.

Usos Terapêuticos de AAV-SOD

Em várias modalidades da invenção com relação a usos tera-pêuticos de rAAV-SOD, vetores rAAV são usados para aplicar os genesS0D1, S0D2 ou S0D3, ou qualquer combinação deles. Em uma modalida-de particular, SOD1 é aplicado.

Os vetores descritos aqui podem ser usados para tratar ou pre-venir doenças ou condições associadas com níveis indesejados de ROS eradicais livres, ou estresse oxidativo em geral. ROS são também geradascomo efeitos colaterais prejudiciais de alguns fármacos terapêuticos. Vide,por exemplo, Chan e outros (1996) Adv. Neuroi 71:271-279; DiGiuseppi eFridovich (1984) Crit Rev. Toxicol. 12:315-342. Condições que podem sertratadas usando os vetores AAV-SOD da presente invenção incluem doençade Parkinson, doença de Huntington, doenças degenerativas do olho (porexemplo, degeneração macular, retinite pigmentosa), doença de Alzheimer,artrite reumatóide, doença de Crohn, doença de Peyronie, colite ulcerativa,isquemia cerebral (derrame), infarto do miocárdio (ataque cardíaco), traumacerebral e/ou ao cordão espinhal, dano por reperfusão, ALS, síndrome deDown, cataratas, esquizofrenia, epilepsia, leucemia humana e outros cânce-res e diabetes.

Até mesmo indivíduos sofrendo de nada mais do que dano oxi-dativo normal associado com envelhecimento podem se beneficiar dos veto-res e métodos da presente invenção. Um aumento progressivo de estresseoxidativo devido à formação de ROS e radicais livres acontece durante oenvelhecimento (vide, por exemplo, Mecocci, P. e outros (2000) Free Radio.Biol. Med., 28:1243-1248), conforme evidenciado por um aumento na forma-ção de peroxidatos de lipídeo em tecidos de rato (Erdincler, D. S. e outros(1997) Clin. Chim. Acta, 265:77-84) e células sangüíneas em pacientes hu-manos mais velhos (Congi, F. e outros (1995) Presse. Med., 24:1115-1118).

Uma revisão recente (Niki, E., Intern. Med. (2000) 39:324-326) relatou quedano a tecido aumentado por ROS e radicais livres poderia ser atribuído aosníveis menores das enzimas antioxidativas SOD e CAT que acontecem du-rante envelhecimento. Por exemplo, animais transgênicos gerados atravésde inserção de genes de SOD extra no genoma de camundongos foram veri-ficados ter níveis menores de dano por ROS e radical livre. Tais animaistambém tinham um tempo de vida prolongado. Evidência mais recente indi-cou que "administração de-um pequeno composto manganês porfirina queimita atividade de SOD levou a uma extensão de 44% de tempo de vida doverme nematóide Caenorhabditis elegans (S. Melow e outros (2000) Scien-ce, 289:1567-1569). Deste modo, os vetores e métodos da presente inven-ção podem prevenir e/ou agir contra o dano a tecido aumentado e expectati-va de vida menor causados pelos níveis elevados de ROS e radicais livresque acompanham o processo de envelhecimento.

Conforme aqui usado, "tratamento" de ALS inclui reversão dedano preexistente, prevenção de dano adicional e diminuição da progressãode dano, cada um dos quais é um resultado terapeuticamente desejável. Umvetor rAAV-SOD terapêutico, ou um composto encontrado usando um siste-ma modelo de ALS in vitro da presente invenção, não precisa reverter danopreexistente para ser considerado terapeuticamente eficaz. Qualquer trata-mento que pelo menos diminua a progressão de ALS em um indivíduo podeser considerado terapeuticamente eficaz.

Sistemas Modelo In Vitro de ALS para Avaliar Compostos Terapêuticos

Conforme descrito em mais detalhe nos Exemplos, os vetoresAAV-SOD da presente invenção podem ser usados para criar um sistemamodelo in vitro para ALS, sistema modelo que pode ser usado para avaliarcompostos quanto à eficácia no tratamento ou prevenção de ALS. Em umamodalidade, um SOD1 mutante conhecido associado com ALS (SOD1-Gly93Ala) é clonado em um vetor AAV e um vírion recombinante (rAAV-SOD1-Gly93Ala) é produzido. rAAV-SOD1-Gly93Ala é então usado paratransduzir uma cultura primária a partir de um tecido representativo, tal comocordão espinhal de rato ou cérebro de rato. A cultura é então experimentada3-5 dias pós-transfecção para confirmar que alguns dos neurônios dentro dacultura exibem mudanças morfológicas associadas com ALS1 tal como aformação de agregados de SOD ou vacuolização. Tais células são referidasaqui como "células do tipo ALS". Tais agregados podem ser visualizadosatravés de imunoistoquímica. Em modalidades preferidas, a porcentagem decélulas tipo ALS na cultura é alta, tal como 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou95% ou mais. Quanto maior a porcentagem de células do tipo ALS em umacultura maior o número de compostos que-podem-ser avaliados, ou maior onúmero de réplicas para cada composto individual, usando as células dacultura.

Triagem é realizada expondo células do tipo ALS a um ou maiscompostos de interesse e subseqüentemente determinando se o fenótipo dacélula do tipo ALS é alterado em um modo refletindo melhora das caracterís-ticas de ALS, tal como uma diminuição em agregados de SOD. Em algumasmodalidades, compostos são adicionados individualmente para isolar cultu-ras de células do tipo ALS, tal como culturas em garrafas, pratos, placas in-dividuais ou cavidades em uma placa multicavidade. Em outras modalidadescompostos são adicionados como misturas de vários compostos. Em algu-mas modalidades, compostos são adicionados como bibliotecas combinato-riais ou sub-bibliotecas de compostos. Em algumas modalidades as identi-dades dos compostos ativos dentro de uma mistura de compostos é deter-minada através de desconvolução de dados obtidos com sobreposição desub-bibliotecas de compostos. Em outras modalidades a identidade de com-postos ativos é determinada através da triagem dos compostos individuaisem uma mistura ativa separadamente ou em grupos pequenos. O método dedetecção dos compostos ativos em uma mistura de compostos ou em umabiblioteca não é um aspecto crítico da invenção.

Conforme demonstrado no Exemplo 1, o uso de SOD1-Gly93Alacomo o gene SOD mutante causa a formação de agregados de SOD dentrode neurônios motores espinhais de rato transduzidos e células gliais, e va-cuolização de neurônios estriais e células gliais de cérebro de rato. As carac-terísticas morfológicas podem ser observadas visualmente através de imu-nocitoquímica, como pode qualquer reversão de tais características morfoló-gicas quando células transduzidas são tratadas com um agente ou tratamen-to terapêutico potencial. Em outras modalidades, a observação de fenótipodo tipo ALS é automatizada, por exemplo, através de análise de imagemauxiliada por computador que é capaz de detectar agregação ou vacuoliza-ção sem intervenção humana. Tal análise de imagem auxiliada por compu-tador é particularmente preferida na triagem de grandes números de agentes"ou tratarnentos terapêuticos potenciais. Em ainda outras modalidades, mu-tantes de S0D1 outros que não Gly93Ala são usados, e o fenótipo de célu-las transduzidas com esses outros genes de S0D1 mutantes pode diferir dofenótipo associado com transdução de SODGIy93Ala. Qualquer mudançafenotípica detectável associada com transdução de SOD mutante pode serusada para avaliar ambos se células foram transduzidas para um fenótipo dotipo ALS e também se um agente ou tratamento terapêutico potencial é efi-caz em reverter o fenótipo do tipo ALS.

Compostos que podem ser triados incluem quaisquer compostosque podem ser providos nas culturas de células do tipo ALS. Esses compos-tos incluem, mas não estão limitados a, produtos naturais (ou misturas bru-tas ou componentes altamente purificados), compostos sintéticos, bibliotecascombinatoriais e bibliotecas de compostos farmaceuticamente ativos conhe-cidos. Compostos sintéticos podem ser aleatoriamente selecionados ou sin-tetizados especificamente para uso em tratamento de ALS usando design defármaco sensato. Bibliotecas combinatoriais podem ser derivadas de síntesecombinatorial de moléculas pequenas ou através de síntese combinatorial demoléculas poliméricas, tal como oligonucleotídeos, oligossacarídeos ou pep-tídeos. Bibliotecas a serem avaliadas usando o sistema modelo in vitro deALS da presente invenção podem compreender qualquer número de com-postos individuais, incluindo 10, 50, 100, 500, 1000, 10.000, 100.000 a1.000.000 ou mais. "Triagem com resultado em grande quantidade", confor-me aqui usado, refere-se à triagem de mais compostos por tempo unitário(por exemplo, por dia) do que é possível com o mesmo gasto de tempo eesforço usando ensaios tal como o modelo SOD1-Gly93Ala de camundongotransgênico. Em várias modalidades, triagem com resultado em grandequantidade refere-se à triagem de 10, 20, 50, 100, 500, 1000, 2000, 5000 oumais compostos por dia. Os sistemas modelo da presente invenção podemser também usados para avaliar tratamentos que não envolvem adição deum agente para a habilidade do tratamento em reverter ou prevenir fenótipodo tipo ALS.

Compostos mostrando eficácia em um ensaio in vitro da presen-te invenção podem senentão estudados maisrpor exemplo, em outros en-saios in vitro, ensaios in vivo (tal como camundongos de ALS, conformedescrito supra) ou em testes clínicos. Tais testes subseqüentes são de tra-balho relativamente mais intensivo, consumidores de tempo e caros do queo sistema modelo in vitro da presente invenção, e então não seria práticoavaliar um número grande de compostos usando tais testes de trabalho in-tensivo. É possível, usando o modelo de ALS in vitro da presente invenção,reduzir o número de compostos candidatos suficientemente para tornar talteste de trabalho intensivo prático. Deste modo o ensaio in vivo da presenteinvenção torna possível a triagem de mais compostos do que seria pratica-mente possível usando métodos de triagem da técnica anterior, deste modoaumentando as chances de encontro de um primeiro composto eficaz paratratamento ou prevenção de ALS.

Usos de Pesquisa Básica de Sistemas Modelo In Vitro de ALS

Os sistemas modelo de ALS da invenção não apenas provêemum método eficiente para triagem de resultado em grande quantidade, elestambém provêem um modelo experimental valioso para estudo de patogê-nese de doença, e definição das bases para vulnerabilidade seletiva de neu-rônios motores em ALS. Por exemplo, células em cultura primária podem sertransduzidas com um vírion de AAV codificando uma SOD1 mutante associ-ado com ALS, e RNA pode ser coletado das células transduzidas em mo-mentos de quatro horas a quatro dias pós-transdução. RNA é também obtidode células de controle que são ou transduzidas com vírions de AAV codifi-cando wtSODI ou células que não são tranduzidas com quaisquer vírions.As amostras de RNA são então submetidas à análise de expressão de geneem um Affymetrix Gene Chip® para determinar quais genes são superex-pressos, e quais são subexpressos, nas células modelo de ALS comparadocom os controles. Genes mostrando expressão diferencial podem represen-tar caminhos atraentes para intervenção terapêutica.

Sistemas Modelo In Vivo (Animal) de ALS para Avaliar Compostos Terapêuticos

Vetores AAV recombinantes codificando formas mutantes deSOD podem ser também usados para criar novos modelos animais paraALS. Animais podem ser administrados com vetores rAAV (por exemplo,vírions de rAAV) codificando um gene S0D1 mutante para produzir fenótipodo tipo ALS. Animais exibindo um fenótipo alterado, incluindo fenótipos imi-tando os sintomas de ALS, são então usados em experimentos para testar aeficácia de compostos ou tratamentos terapêuticos potenciais. Compostosque causam uma reversão em fenótipo do tipo ALS podem ser então estu-dados mais para desenvolvimento como agentes terapêuticos. Animais quepodem ser usados em tais modelos ALS incluem, mas não estão limitado a,camundongos, ratos e primatas não-humanos.

Exemplos de modalidades específicas da presente invenção sãoprovidos abaixo. Os exemplos são oferecidos para propósitos ilustrativosapenas, e não pretendem limitar o escopo da presente invenção de modoalgum.

Exemplo 1:

Modelo In Vitro de ALS em Culturas Neurais Motoras de Rato Primárias

Um sistema modelo in vitro para ALS é construído como segue.Dois vetores AAV são criados através de clonagem ou do gene do tipo sel-vagem de S0D1 humana (hSODIwt) ou um gene de S0D1 mutante(hSOD1-Gly93Ala) em um vetor derivado de AAV-2 compreendendo duasrepetições terminais invertidas de AAV (ITRs) de modo que a expressão dogene de SOD é direcionada pelo promotor de beta-actina de galinha.

O vetor rAAV2-SOD1-Gly93Ala resultante é então empacotadoem vírions AAV-2 (vide Patentes U.S. Nos. 6.001.650 e 6.004.797) e usadopara transduzir culturas neurais motoras de rato primárias. Microscopia defluorescência 3-5 dias pós-transdução descreve que células transduzidasexibem mudanças patológicas características de ALS, tal como distribuiçãoanormal de proteína SOD mutante em agregados pontuados na maioria dosneurônios motores expressando SOD mutante, extensões de citoplasma pe-ricarial e inchaço de processos neurais motores, morte apoptótica de neurô-nios motores e ativação de astrócitos. rAAV2-SOD1wt é usado como umcontrole no modelo de ALS da invenção uma vez que transdução com estevetor não causa quaisquer "mudanças fenotípicas associadas com ALS nascélulas-alvo.

A presença de SOD foi visualizada com imunoistoquímica emneurônios motores em uma cultura primária de um cordão espinhal de ratode aproximadamente 3-5 dias após transdução com vetores AAV-2 codifi-cando pVm-WTSOD ou pVm-G93ASOD, respectivamente. Imunoistoquímicafoi realizada com um anticorpo primário IgG anti-SOD1 de camundongo eum anticorpo secundário IgG anti-camundongo de cabra marcado com Ale-xa-594. Neurônios transduzidos com pVm-G93ASOD mostram SOD1 agre-gado que não é observado em neurônios transduzidos com pVm-WTSOD.

A presença de SOD foi visualizada através de imunoistoquímicaem células gliais em uma cultura primária de cordão espinhal de rato apro-ximadamente 3-5 dias após transdução com vetores AAV2 codificando pVm-WTSOD ou pVm-G93ASOD, respectivamente. Células gliais transduzidascom pVm-G93ASOD mostram S0D1 agregado que não é observado emcélulas gliais transduzidas com pVm-WTSOD.

Experimentos separados são realizados, analogamente àquelesdescritos acima, mas usando vetores AAV derivados de AAV-5 e AAV-6, istoé, vetores AAV onde as ITRs são derivadas de AAV-5 e AAV-6, respectiva-mente. Virions de rAAV-5 e rAAV-6 são então produzidos usando sistemasde empacotamento que usam genes de proteína capsídeo de AAV-5 ouAAV-6, respectivamente.

A presença de SOD foi visualizada através de imunoistoquímicaem neurônios motores em uma cultura primária de cordão de rato espinhalde aproximadamente 3-5 dias após transdução com vetores AAV-6 codifi-cando pVm-WTSOD ou pVmG93ASOD. Neurônios transduzidos com pVm-G93ASOD mostram S0D1 agregado que não é observado em neurôniostransduzidos com wtSODI.

Resultados mostram que genes aplicados usando vírions de rA-AV-6 são predominantemente expressos em neurônios enquanto genes apli-cados usando vírions de rAAV-2 são expressos ambos em neurônios e emglia (conforme discutido supra). Genes aplicados usando vírions de rAAV-5são expressos apenas em glia, e transdução de vírion de rAAV-5 não cau-sou patologia em neurônios motores.

Os efeitos fenotípicos de transdução de rAAV-SOD em neurô-nios motores são medidos novamente 6-7 dias e 12 dias pós-transdução. Osresultados mostram progressão de agregação com o tempo levando à mortecelular em 12 dias pós-transdução. A presença de SOD foi visualizada atra-vés de imunoistoquímica em neurônios motores em uma cultura primária deum cordão espinhal de rato aproximadamente 6-7 dias após transdução comvetores AAV2 codificando pVm-G93ASOD. Agregação de SOD1 em neurô-nios transduzidos com pVm-G93ASOD é mais extensiva do que ela era em3-5 dias após transdução, ilustrando a progressão de dano com o tempo. Apresença de SOD foi visualizada através de imunoistoquímica em neurôniosmotores em uma cultura primária de cordão espinhal de rato aproximada-mente 12 dias após transdução com vetores AAV2 codificando pVm-G93ASOD. Os resultados mostram que SOD-Gly93Ala é tóxico para as célu-las, e que ele eventualmente as mata.

A morfologia de neurônios motores 6-7 dias após transduçãocom rAAV-SOD1-G93A foi avaliada e comparada com a morfologia de neu-rônios motores de um paciente com ALS. A presença de SOD foi visualizadaatravés de imunoistoquímica em uma cultura primária de cordão espinhal derato aproximadamente 6-7 dias após transdução com vetores AAV2 codifi-cando pVm-G93ASOD. Células transduzidas com rAAV-SOD1-G93A emcultura exibem o mesmo inchaço axonal focai característico de neurôniosmotores de ALS, sugerindo que o sistema modelo de ALS in vitro da presen-te invenção imita o estado de doença. Neurônios transduzidos com pVm-G93ASOD mostram extensões de citoplasma pericarial e inchaço de proces-sos neurais motores nos dias 6-7 que são similares àqueles vistos em neu-rônios motores de pacientes com ALS.

Os mesmos vírions usados para transduzir culturas de cordãoespinhal de rato (supra) são também usados para transduzir neurônios estri-atais de culturas de cérebro de rato primárias. Imunocitoquímica das célulastransduzidas 3-5 dias pós-transdução mostra que neurônios estriatais exi-bem vacuolização quando transduzidõs^cõmrvetores expressando S0D1-G93A. Um fenótipo similar é observado quando células gliais de uma culturaprimária de cérebro de rato são transduzidas com vetores AAV expressandoS0D1-G93A. As células gliais do cérebro exibem vacuolização quandotransduzidas com pVm-G93ASOD, conforme contrastado com o agregamen-to observado com tratamento similar de células gliais espinhais (discutidosupra). Este fenótipo observado nas células de cérebro contrasta com a for-mação de agregado de SOD1 observada em neurônios motores espinhais eglia transduzidos.

Experimentos confirmam que as células expressando S0D1-G93A são de fato neurônios motores. Imunocitoquímica foi realizada em cé-lulas em uma cultura primária de cordão espinhal de rato aproximadamente5-6 dias pós-transdução com rAAV-SODIwt ou rAAV-SOD1-G93A. Um pri-meiro experimento envolveu detecção imunocitoquímica de ambos SOD eneurofilamento leve (NF-L). Ambos SOD e neurofilamento leve (NF-L) foramdetectados em neurônios motores em uma cultura primária de cordão espi-nhal de rato aproximadamente 3-5 dias após transdução com vetores AAV2codificando pVm-WTSOD ou pVm-G93ASOD, respectivamente. NF-L é ummarcador neural específico. Tingimento de ambos SOD e NF-L na mesmacélula confirma que a célula é um neurônio. Um segundo experimento envol-ve detecção imunocitoquímica de ambos SOD e colina acetiltransferase(ChAT). Ambos SOD e colina acetiltransferase (ChaT) foram detectados emneuronios motores em uma cultura primaria de cordao espinhal de rato apro-ximadamente 3-5 dias apos transducao com vetores AAV-2 codificandopVm-WTSOD ou pVm-G93ASOD, respectivamente. ChAT e um marcadorespecifico para neuronios motores. Tingimento de ambos SOD e ChAT namesma celula confirma que a celula e um neuronio motor. Esses experimen-tos demonstram expressao de SOD dentro das celulas expressando protei-nas que sao caracteristicas de neuronios motores.

Microscopia por flourescencia indica que aproximadamente 90%de todas as celulas na cultura neural motora de rato primaria sao transduzi-dos. A alta eficeincia de transducao usando rAAV-SOD1-Gly93Ala prove umgrande trabalho, simplesmente atraves da adicao do numero apropriado departiculas virais e incubacao. Neste exempo celulas sao transduzidas com100.00 particulas de rAAV-SOD1-Gly93Ala por celula, isto e, a multiplicidadede infeccao (MOI) e 105. Outros experimentos (nao mostraos0 mostram queuma MOI tao baixa quanto 1000 e igualmente eficaz na provisao de transdu-cao maxima (90%). O numero alto de celulas transduzidas torna possivelobservar os efeitos de qualqer dado composto de interesse em um numero estatisticamente robustas. Isto deve ser constrastado com metodos an-teriores envolvendo microinjecao de plasmideos codificando SOD mutanteem celulas individuais, que como uma materia pratica nao e capaz de proverum numero estatisticamente significante de celulas para triagem de resulta-do em grande quantidade.

Este modelo epigenetico, que emprega um vetor viral transdu-zndo um grande numero de neuronios motores e outras celulas simultane-amente, ode facilitae estudis d patologia molecular de ALS.

Materiais e metodos para Exemplo 1 sao sengue.

Construção de plasmídeos de SOD ofpVm-wtSOD e pVm-G93A

Genes de SOD humanos de tipo selvagem e mutante G93A sãoamplificados através de PCR com o iniciador adiantando contendo um sítioHindlll incorporado e o iniciador reverso com um sítio Notl incorporado.

5'-AGCTAAGCTTCCACCATGGCGACGAAGGCCGTGTG-3'_ ( No. HC146)(SEQIDNO. 2)

5'-ATATGCGGCCGCTTATTGGGCGATCCCAATIACACCA-3' (No. HC 147)(SEQIDNO. 3).

Os produtos de PCR são digeridos com enzimas de restriçãoHindlll e Notl e clonados nos sítios Hindlll e Notl de plasmídeo F101, e osgenes são postos sob o controle de promotor de beta-actina de galinha eflanqueados por ambas ITRs de AAV para criar os plasmídeos FIOI-wtSODe F101-G93A. wtSOD e G93A, junto com o promotor beta-actina de galinha,são cortados de F101-wtSOD e F101-G93A com Bglll e Notl e clonados nossítios Sphl e Ncol de pVm-LacZ usando Iigantes Sphl-Bglll e Notl-wtSOD.

Os construtos são verificados através de análise de sequenciamento e cha-mados pVm-wtSOD (Figura 2) e pVm-G93ASOD (Figura 1). Os plasmídeossão então amplificados e usados para transfectar células 293 para produzirvetores AAV.

Culturas neurais primárias

Culturas primárias de cordão espinhal ou cérebro dissociado sãopreparadas a partir de embriões de rato Sprague-Dawley de 15 dias. Tecidode estriato ou cordão espinhal dissecado é moído em pequenos pedaços eincubado com tripsina por 30 minutos. Seguindo dissociação, o tecido é en-tão triturado através de uma pipeta Pasteur e células são postas em placaem uma densidade de 350.000 (neurônios estriatais) ou 700.000 células(neurônios do cordão espinhal) por cavidade em placas de cultura de 12 ca-vidades (Fisher Scientific, Chicago, IL), contendo coberturas de vidro de 18mm, redondas (Fisher Scientific, Chicago, IL) revestidas com poli-D-lisina(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Para culturas estriatais o meio é meioneurobasal (Invitrogen, Chicago, IL) suplementado com 2% de B-27, L-glutamina a 0,5 mM e ácido L-glutâmino a 25 mM. Culturas são alimentadasuma vez por semana a fim de manter as células. Para culturas de cordãoespinhal o meio é meio essencial mínimo eagle (EMEM)1 (ATCC, Manassas,Virgínia) enriquecido com 2,5 g de D-glicose e suplementado com 2% desoro de cavalo, 5% de soro bovino fetal, 1% de Penstrep e fatores de cres-cimento. As culturas são alimentadas duas vezes por semana para se obtercrescimento e estabilidade celular ótimos. Células não-neurais são minimi-zadas através de tratamento das culturas nos dias 4-6 com 1,4 pg/ml de ci-tosina-B-D-arabinose (Calbiochem). As culturas são mantidas a 37° C emCO2 a 5%. As células são usadas nos experimentos 2-3 semanas após dis-sociação, a fim de permitir crescimento neuronal motor e diferenciação deoutros neurônios.

Tratamento de culturas

Culturas estriatais e culturas de cordão espinhal são incubadas"com AAV-hSODwt ou AAV-hG93A (105 genomas- de vetor (vg) por célula)para atingir expressão dê vetores máxima.

Imunocitoquímica

Células estriatais e de cordão espinhal cultivadas em coberturasde vidro são fixadas com 4% de paraformaldeído e permeabilizadas por0,05% de NP-40. Solução de bloqueio contendo IX PBS, 3% de BSA e 2%de soro de cabra é usada. Imunocitoquímica é realizada com os seguintesanticorpos: Neurofilamento-L (NF-L; AB1983; 1:100, Chemicon Inc.), ColinaActiltransferase (ChAT; AB143 e MAB305 1:10, Chemicon, Inc.), SuperóxidoDismutase (SOD; 52 1:300, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) ProteínaÁcida Fibrilar Glial (GFAP:AB5804, 1:500, Chemicon Inc.). Todos os anticor-pos são diluídos em solução de bloqueio. Distribuição de anticorpo é visuali-zada através de microscopia de epifluorescência após incubação com anti-corpos secundários: conjugado IgG de anticamundongo/anticoelho/anti-ratopara Alexa Fluor 488 (verde) ou Alexa Fluor 594 (vermelho), diluído 1:200(Molecular Probes).

Exemplo 2:

Avaliação de um Peptídeo de IL-10 como um Candidato paraTratamento de ALS

O valor do sistema modelo de ALS in vitro do Exemplo 1 da in-venção é ilustrado através de um ensaio para avaliar o efeito de um peptídeoderivado de IL-10 sobre ALS.

Fabricação de oligopeptídeo é conseguida através de métodosde síntese de fase sólida conhecidos daqueles versados na técnica. Análisedos oligopeptídeos sintetizados inclui espectrometria de massa por eletro-pulverização, cromatografia líquida de alto desempenho e aparência visualdo produto purificado. O(s) oligopeptídeo(s) é/são preparado(s) em águapara injeção a 1 mg/ml. Um exemplo de um peptídeo derivado de IL-10 a-propriado (Patente U.S. No. 6.159.937) e um peptídeo de controle 'embara-lhado' são providos na Tabela 2. Seqüências de peptídeo são providas nadireção terminal N—>C convencional. Aminoácidos são nomeados usando anomenclatura de três letras.

Tabela 2:

<table>table see original document page 24</column></row><table>

Embora uma seqüência de peptídeo exemplar seja provida naTabela 2, seria claro a um versado na técnica que várias modificações ousubstituições poderiam ser feitas à seqüência listada que reteriam, e talvezmelhorassem, a eficácia do peptídeo em tratamento de dor neuropática oudoença neurodegenerativa, ou melhorariam suas propriedades farmacológi-cas. Tais variantes de seqüência poderiam ser testadas em um ou mais dosmodelos descritos nos exemplos que seguem para avaliar sua eficácia tera-pêutica.

Por exemplo, seqüências de IL-10 de espécies não-humanaspoderiam ser usadas para se obter seqüências de peptídeo derivadas de IL-10 diferindo do peptídeo derivado de IL-10 humano, peptídeos derivados deIL-10 humanos que podem exibir propriedades aperfeiçoadas comparadocom a seqüência derivada de ser humano. Alternativamente, variantes po-dem ser feitas através de inspeção usando parâmetros empíricos conheci-dos familiares àqueles versados na técnica de peptídeos terapêuticos. Adi-cionalmente, projeto de fármaco racional pode ser usado para construir umavariante de seqüência que seria esperada exibir eficácia aumentada, designde fármaco racional que pode ser baseado em análise da estrutura tridimen-sional de uma IL-10, um receptor de IL-10, ou um complexo de IL-10 comum receptor.

Culturas primárias de cordão espinhal de rato são incubadascom vírions de rAAV2-SOD1-G93A para produzir uma cultura de célulascompreendendo uma ou mais células de neurônio motor transduzidas ex-pressando SOD1-G93A. Os peptídeos de IL-10 e embaralhados descritosacima são adicionados (em triplicata) a placas de cultura de tecido contendoculturas de células transduzidas com rAAV-SOD1-G93A em vários momen-tos após transdução. Placas de controle de células transduzidas não sãotratadas com nenhum peptídeo. Imunocitoquímica de SOD é realizada comouma função de tempo após adição de peptídeo para determinar se o peptí-deo de IL-10, o peptídeo embaralhado ou ambos melhoram os efeitos feno-típicos de expressão de S0D1-G93A (isto é, formação de agregado de SODintracelular ou morte celular).

Se agregação menor ou morte celular for observada em culturastratadas com um ou ambos peptídeos, o peptídeo dando resultados positivosno ensaio in vitro da presente invenção é então submetido a estudo maisextensivo (por exemplo, estudos in vivo em camundongos com ALS). Resul-tados positivos nos ensaios in vitro da presente invenção incluem reduçãoem formação de agregado de SOD ou morte celular em 10, 20, 30, 40, 50,60, 70, 80, 90, 95, 98% ou mais. Eficácia em tratamento ou prevenção deALS é por fim confirmada através de testes clínicos em indivíduos humanos.

Em outros experimentos, 500 variantes de seqüência do peptí-deo de IL-10 mostrado acima são sintetizadas e ensaiadas quanto à ativida-de em redução do fenótipo tipo ALS em neurônios motores transduzidoscom rAAV-SOD1-G93A. Os peptídeos mostrando a maior atividade são es-tudados mais quanto à eficácia em tratamento ou prevenção de ALS.

Exemplos representativos, não-limitantes, de outras seqüênciasde IL-10 para uso com a presente invenção incluem as seqüências descritasnos números de acesso NCBI NM000572, U63015, AF418271, AF247603,AF247604, AF247606, AF247605, AY029171, UL16720 (toda seqüênciashumanas), NM012854, L02926, X60675 (rato); NM010548, AF307012,M37897, M84340 (todas seqüencias e camundongo), U38200 (eqüina);U39569, AF060520 (seqüências felinas); U00799 (bovina); U11421, Z29362(seqüências ovinas); L26031, L26029 (seqüências de macaque); AF294758(macaco); U33843 (canina); AF088887, AF068058 (seqüências de coelho);AF012909, AF120030 (seqüências de marmota); AF026277 (gambá);AF097510 (porquinho-da-índia); U1767 (cervo); L37781 (gerbil); AB 107649(lhama e camelo).

Exemplo 3:

Triagem de Peptídeos de GDNF como um Candidato para Tratamento deALS

O valor do sistema modelo de ALS in vitro do Exemplo 1 da in-venção é ilustrado mais através de um ensaio para avaliar o efeito de umpeptídeo de fator neutrófico derivado de célula glial (GDNF) sobre ALS. Ex-perimentos são realizados essencialmente conforme descrito no Exemplo 2exceto que um peptídeo derivado de GDNF e uma versão embaralhada delesão providos ao invés do peptídeo de IL-10. Se um peptídeo de GDNF mos-trar um resultado positivo no ensaio (isto é, se houver uma redução em ca-racterísticas fenotípicas tipo ALS de neurônios motores transduzidos apóstratamento com o peptídeo), este peptídeo pode ser estudado mais paraconfirmar sua eficácia no tratamento ou prevenção de ALS.

Em outros experimentos, 500 peptídeos derivados de GNDF di-ferentes são sintetizados e ensaiados quanto à atividade na redução de fe-nótipo tipo ALS em neurônios motores transduzidos com rAAV-SOD1-G93A.Os peptídeos mostrando a maior atividade são estudados mais quanto à efi-ciência em tratamento ou prevenção de ALS.

Peptídeos de GDNF para uso na presente invenção podem serderivados de várias seqüências de GDNF conhecidas, incluindo aquelasdescritas nas Patentes U.S. Nos. 6.221.376 e 6.363.319, incorporadas aquia título de referência em suas totalidades, e Lin e outros, Science (1993)260:1130-1132 para seqüências de rato e humanas, bem como números deacesso NCBI AY052831, AJ001896, AF053748, AF063586 e L19063 paraseqüências humanas; números de acesso NCBI AF184922, AF497634,X922495, NM019139 para seqüências de rato; número de acesso NCBIAF516767 para uma seqüência de panda gigante; números de acesso NCBIXM122804, NM10275, D88351S1, D49921, U36449, U37459, U661955 paraseqüências de camundongo; número de acesso NCBI AF469665 para umaseqüência nippon Nipponia; número de acesso NCBI AF106678 para umaseqüência de Macaca mulatta] e número de acesso NCBI NM131732 eAF329853 para seqüências de peixe zebra. Seqüências de GDNF são tam-bém reveladas no Pedido de Patente U.S. No. 2003/0161814.

Essas e outras modalidades da presente invenção ocorrerãoprontamente àqueles versados na técnica em vista da presente descrição.

Embora modalidades preferidas da presente invenção tenham sido descritasem alguns detalhes, é compreendido que variações podem ser feitas sem seafastar do espírito e escopo da invenção conforme definido aqui. Todas aspublicações, patentes e pedidos de patente citados aqui são incorporadosaqui a título de referência em suas totalidades.Seqüência -de Listagem

<T10> Genzymei ,eo-rporatiori Oorbudc

<120> Vetores AAV GodiiEicandb -Superoxido Dismutase

<130> 1054

<140> 60/697,450<141> 2005-07-07

<160> 5

<170> PatentIn versão 3.3

<210> 1

<211> 153

<212> PRT

<2Í3> -Horoo sapiens;;

<400>- 1

Ala Thr Lys Ala Val Cys Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val Gln Gly

Si: ' -Si' . - ■ 10 15

Ile lie Asn Phe Glu Gln Lys Glu Ser Asn Gly Pro Val Lys Val Trp20 25 ■ ■ 30

Gly Ser lie Lys Gly Leu Thr Glu Gly Leu Kis Gly Phe Eis Val His35 40 4 5'

JgWAesGlyi-Asp^iAsn:Thr Ala Gly Cys Thr Ser Ala Gly Pro His Phe50 SS 60

Asi Pro Leu Ser Arg Lys His Gly Gly Pro Lys Asp Glo Glu Arc His65 70 75 80

^M- -GSiy Leu Gly Asn Val Thr Ala Asp Lys Asp Gly Val Ala Asp85 90 95

Val' Ser Ile Glu AeD Ser Val Ile Ser Leu Ser Gly Asp His Cys Ile

íoo 105

Ile Gly Arg Thr Leu Val Val His Glu Lys Ala Asp Asp Leu Gly Lys

-■■■■■'•■ 115 120 '

GlyGlyAsnGlu^ Glu- Ser Thr lys Thr' ' 130 135

Asrv Ala wGly -Ser; Arg; Leu140

Ala Gys? Gly -Val--Ala Gln

145 -Mo;

<210> 2-<211> 35<212> DNA<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador.Avançado

-<400> 2 agctaagctt ccaccatggc; gacgaaggcc gtgtg.

Artificial'<22 O >

<223> Iniciador Avançado<400> 3

atatgcggcc gcttattggg cgatcccaat tacacca

<210><211><2I2><213>

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> Hcano sapiens

,<400> 4

Ala Tyr Met Ttir Met IsysIleAzgAsn1 5 '

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> Artifi-cial

<220>

<223> Peptideo IL-IO Humano Disperso<400> 5

Arg Ile Lys Asn Met Ala Thr Tyr Met

1 ' ,.Si

Claims (15)

1. Vetor de vírus adeno-associado recombinante (AAV) compre-endendo: pelo menos uma seqüência de repetição terminal invertida (ITR)de AAV; e um gene codificando superóxido dismutase (SOD).

2. Vetor de acordo com a reivindicação 1, onde o SOD é SOD1.

3. Vetor de acordo com a reivindicação 2, onde o S0D1 contémuma mutação associada com ALS.

4. Vetor de acordo com a reivindicação 3, onde o S0D1 contémuma mutação de Gly93Ala.

5. Vetor de acordo com a reivindicação 1, onde o vetor AAV éum plasmídeo.

6. Vetor de acordo com a reivindicação 1, onde o vetor AAV éum vírion.

7. Vetor de acordo com a reivindicação 6, onde o vírion de AAVé derivado de AAV-2.

8. Vetor de acordo com a reivindicação 6, onde o vírion de AAVé derivado de AAV-5.

9. Vetor de acordo com a reivindicação 6, onde o vírion de AAVé derivado de AAV-6.

10. Método de tratamento de um indivíduo compreendendo: ad-ministrar ao dito indivíduo um vetor AAV codificando SOD.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, onde o indivíduotem um distúrbio selecionado do grupo consistindo em ALS, doença de Par-kinson, doença de Huntington, doença de Alzheimer, síndrome de Down,artrite reumatóide, doença de Crohn, doença de Peyronie, colite ulcerativa,degeneração macular, retinite pigmentosa, cataratas, isquemia cerebral, in-farto do miocárdio, trauma cerebral, trauma ao cordão espinhal, dano porreperfusão, esquizofrenia, epilepsia, leucemia humana e diabetes.

12. Método de avaliação de compostos quanto à eficácia no tra-tamento ou prevenção de esclerose amiotrófica lateral (ALS) compreendendo:transdução de uma célula com um vetor AAV codificando SOD1contendo uma mutação associada com ALS para produzir uma célula trans-duzida, onde a dita célula transduzida exibe característica fenotípica associ-ada com ALS;exposição da dita célula transduzida a um composto de interesse;determinação de se ou não a célula transduzida exposta aocomposto de interesse exibe uma redução nas características fenotípicasassociadas com ALS.

13. Modelo in vitro para avaliação de compostos quanto à eficá-cia no tratamento de ALS compreendendo:uma pluralidade de células transduzidas com um vetor AAV codi-ficando um SOD contendo uma mutação associada com ALS.

14. Modelo de acordo com a reivindicação 12 ou reivindicação-13, onde a mutação é Gly93Ala.

15. Modelo de acordo com a reivindicação 13, onde a pluralida-de de células transduzidas com o vetor AAV compreende pelo menos 80%de todas as células em uma população de células em cultura.