CN103608455B

CN103608455B - 用于治疗色盲和其它疾病的启动子、表达盒、载体、药盒和方法

Info

Publication number: CN103608455B
Application number: CN201280012016.3A
Authority: CN
Inventors: 叶国杰; J.D.丘莱
Original assignee: Applied Genetic Technologies Corp
Current assignee: Applied Genetic Technologies Corp
Priority date: 2011-01-07
Filing date: 2012-01-06
Publication date: 2019-01-15
Anticipated expiration: 2032-01-06
Also published as: AU2022201451A1; JP6509182B2; US20130317091A1; DK2661494T3; US9982275B2; EP2661494B1; AU2017202320B2; JP2014504871A; WO2012094560A2; AU2012204266C1; CA2823890A1; EP2661494A4; AU2019250249A1; US20190002913A1; NZ612375A; AU2012204266A1; JP2017060487A; WO2012094560A3; CN108410872A; JP6345423B2

Abstract

本发明提供用于治疗影响视网膜视锥细胞的遗传病的分离的启动子、转基因表达盒、载体、药盒和方法。

Description

用于治疗色盲和其它疾病的启动子、表达盒、载体、药盒和方法

相关申请

本发明要求于2011年1月7日提交的美国临时申请号61/430,710的申请日的权益，其全部内容在此通过引用结合到本文中。

发明背景

色盲为色觉病症，其通常为先天性常染色体隐性病症。其可为部分的或完全的。参见Pang, J.-J.等 (2010). Achromatopsia as a Potential Candidate for GeneTherapy (色盲作为基因疗法的潜在候选). 载于Advances in Experimental Medicine and Biology, 第664卷，第6部分，639-646 (2010) (下文中Pang等)。色盲的症状包括视敏度降低、色盲(缺乏颜色感知)、昼盲症(在强光中视觉能力减退，伴随厌光(photoaversion)，意味着厌恶或避免强光)、眼球震颤(不受控的眼睛振荡运动)、虹膜运行异常和立体视觉损伤(不能感知景物的三维方面)。

视网膜电流图显示在色盲中，视网膜视杆光感受器功能保持完整，而视网膜视锥光感受器无功能。视杆和视锥光感受器在视觉中发挥功能上不同的作用，Pang等。在弱至非常强的光中运行时，视锥光感受器主要负责中央、高分辨率和色觉。其集中在视网膜的中央黄斑，并且包含几乎100%的窝(fovea)。视杆光感受器负责周边、弱光和夜间视觉，其主要存在于黄斑外的周边视网膜中。

每30,000个人中约1个患有全色盲。在全色盲中，色觉完全丧失、中央视觉丧失、视敏度20/200或更差。因此，大部分色盲个体为法定盲人。当前的护理标准包括用有色隐形眼镜限制视网膜曝光和提供放大以提高中央视觉。然而，尚无可用的矫正色盲中的视锥功能的治疗，Pang等。

先天性色盲有多种遗传原因。环核苷酸-门控离子通道β3 (CNGB3，也称为ACHM3)基因的突变为色盲的一个遗传原因。最新在狗中的研究提示了在治疗CNGB3基因突变导致的色盲中使用基于重组腺伴随病毒(rAAV)的基因疗法的一些前景。Komaromy等,Genetherapy rescues cone function in congenital achromatopsia (基因疗法在先天性色盲中拯救视锥功能). Human Molecular Genetics, 19(13): 2581-2593 (2010) (下文中Komaromy等)。在犬的研究中，使用的rAAV载体包装了人CNGB3 (hCNGB3)表达盒，所述表达盒包含包括2.1 kb的视锥红视蛋白启动子(PR2.1)和人CNGB3 (hCNGB3) cDNA的元件。该研究的一个限制为由PR2.1启动子驱动的hCNGB3仅在红和绿视锥中表达，而内源性hCNGB3在所有三个类型的视锥(红、绿和蓝视锥)中均表达。另一个限制为使用的表达盒的总体大小(5,230 bp)远超出AAV颗粒的正常包装能力(<4.9 kb)；过度填充的rAAV颗粒显著地损伤rAAV包装效率，导致低产率、较高的空-满颗粒比率，以及可能较低的载体侵染性。包含较短形式的视锥红视蛋白启动子或视锥抑制蛋白启动子的表达盒在恢复视觉功能上不太有效。本发明解决了这些限制。

本发明具有如下优点：其提供能够促进hCNGB3在所有三个类型的视锥中表达的启动子。此外，本发明启动子具有这样的优点，其足够短，使得hCNGB3表达盒很好地适应rAAV的正常包装能力。适应rAAV正常包装能力的启动子提供益处，例如改善的产率、较低的空-满颗粒比率和较高的载体侵染性。本发明还提供表达盒、载体和使用这些改善的启动子的药盒(kit)，以及用于通过给予载体而治疗色盲的方法。

本发明解决了对有效的色盲治疗的需求。

发明概述

在一个方面，本发明提供分离的启动子，其包含约1.8 kb的CNGB3基因的5’-NTR。在示例性实施方案中，所述启动子包含SEQ ID NO: 1所示的序列。

在另一个方面，本发明提供分离的启动子，其包含约1.6 kb的CNGB3基因的5’-NTR。在示例性实施方案中，所述启动子包含SEQ ID NO: 2所示的序列。

在另一个方面，本发明提供分离的启动子，其包含约400 bp的巨细胞病毒(CMV)增强子和约1.4 kb的CNGB3基因的5’-NTR。在示例性实施方案中，所述启动子包含SEQ ID NO:3所示的巨细胞病毒(CMV)增强子和SEQ ID NO: 4所示的CNGB3基因的5’-NTR。

在本发明的具体实施方案中，所述CNGB3基因为人CNGB3基因。

在具体实施方案中，本发明启动子能够促进S-视锥细胞、M-视锥细胞和L-视锥细胞中的CNGB3表达。

在其它具体实施方案中，所述启动子能够促进S-视锥细胞、M-视锥细胞和L-视锥细胞中的CNGA3表达。

在其它具体实施方案中，所述启动子能够促进S-视锥细胞、M-视锥细胞和L-视锥细胞中的GNAT2表达。

在另一个方面，本发明提供转基因表达盒，其包含本文所述启动子；选自CNGB3核酸、CNGA3核酸和GNAT2核酸的核酸和最小调控元件。

在另一个方面，本发明提供转基因表达盒，其包含本文所述启动子、CNGB3核酸和最小调控元件。

在具体实施方案中，所述核酸为人核酸。

在另一个方面，本发明提供核酸载体，其包含本文所述表达盒。在一个实施方案中，所述载体为腺伴随病毒(AAV)载体。在示例性实施方案中，载体包含所述AAV载体的衣壳序列血清型和ITR血清型，其独立地选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12的。在另一个实施方案中，衣壳序列为突变型衣壳序列。

在另一个方面，本发明提供用于治疗影响视网膜视锥细胞的基因突变、置换或缺失相关疾病的方法，其中所述方法包括给予需要此种治疗的受试者包含本文所述启动子的载体，从而治疗受试者。在一个所述方案中，所述疾病为色盲。

在另一个方面，本发明提供用于治疗色盲的方法，包括给予需要此种治疗的受试者本文所述载体，从而治疗受试者。在一个实施方案中，所述载体经视网膜下给予。

在另一个方面，本发明提供包括含有本文所述启动子的载体及其使用说明书的药盒。

在另一个实施方案中，本发明提供包括本文所述核酸载体及其使用说明书的药盒。

在另一个方面，本发明提供制备重组腺伴随病毒(rAAV)载体的方法，包括将选自CNGB3核酸、CNGA3核酸和GNAT2核酸的核酸插入本文所述腺伴随病毒载体。在一个实施方案中，所述核酸为人核酸。

在其它实施方案中，所述AAV载体的衣壳序列血清型和ITR血清型独立地选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。在具体实施方案中，衣壳序列为突变型衣壳序列。

附图简述

图1：截短的人红/绿视蛋白启动子示意图。

图2：rAAV5-PR2.1-hCNGB3载体的示意图。

图3：4个包含PR2.1启动子变体的前病毒质粒的示意图。PR2.1启动子(截短的人红/绿视蛋白启动子)在其5’-末端截短300 bp、500 bp和1,100 bp，产生较短的启动子，分别命名为PR1.7、PR1.5和PR1.1。将CMV增强子添加至PR1.1的5’末端，产生杂合启动子。在这些构建体的每个中，PR2.1的500 bp核心启动子(以灰色显示)和基因座控制区(以红色显示)保持完整。末端重复用箭头指出，并且示出SV40剪接信号序列的位置。

图4：不同长度的5’-NTR序列从hCNGB3基因PCR扩增。

图5列出SEQ ID NO: 1-4。

图6列出典型视网膜切片的图像。RPE：视网膜色素上皮；PR: 光感受器；绿色：GFP蛋白表达染色；红色：视锥染色；蓝色：核染色。

发明详述

I. 概述和定义

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域技术人员通常理解的含义。下列参考文献为技术人员提供本文所使用的许多术语的一般定义：Singleton等, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (微生物学和分子生物学词典) (第2版. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology(剑桥科技词典) (Walker主编, 1988); The Glossary of Genetics (遗传词汇表), 第5版，R. Rieger等 (主编), Springer Verlag (1991)和Hale & Marham, The HarperCollins Dictionary of Biology (生物学哈珀柯林斯词典) (1991)。如本文所使用的，下列术语具有下文归于其的含义，除非另外指明。

本文使用的冠词“一个”和“一种”指一个或多于一个(即至少一个)该冠词的语法对象。举例来说，“一个元件”意指一个元件或多于一个元件。

本文使用的术语“包括”意指短语“包括但不限于”，并且与之可互换地使用。

本文使用的术语“或”意指术语“和/或”，并与之可交换地使用，除非上下文另外清楚地指明。

本文使用的术语“例如”意指短语“例如但不限于”，并与之可互换地使用。

待通过本发明方法治疗的“受试者”或“患者”可意指人或非-人动物。“非人动物”包括任何脊椎或无脊椎生物。

“色盲”为色觉病症。色盲的症状包括色盲(缺乏颜色感知)、弱视(视敏度降低)、昼盲症(在强光中视觉能力减退，伴随厌光，意味着厌恶或避免强光)、眼球震颤(不受控的眼睛振荡运动)、虹膜运行异常和立体视觉损伤(不能感知景物的三维方面)。如本文所使用的，术语“色盲”是指基因突变、置换或缺失导致的色盲形式。

“治疗”疾病(例如，色盲)意指减轻、预防或延迟该疾病至少一个病征或症状的发生。

DNA和RNA链的不对称末端称为5′ (五撇)和3′ (三撇)末端，5'末端具有末端磷酸基团，3'末端具有末端羟基。五撇(5’)末端在其末端脱氧核糖或核糖的糖-环中具有第五个碳原子。核酸在体内按5'-至3'-方向合成，这是因为用于组装新链的聚合酶经由磷酸二酯键将每个新核苷酸连接到3'-羟基(-OH)。

术语“5’-NTR”是指不转录为RNA的基因区域。该区域有时还称为5'-侧翼区，其通常在转录起始位点前或上游(即，朝向DNA的5’末端)。5’-NTR包含基因启动子，并且可还包含增强子或其它蛋白结合位点。

“启动子”为促进特定基因转录的DNA区域。作为转录过程的一部分，合成RNA的酶，称为RNA聚合酶，附着在基因附近的DNA上。启动子包含提供RNA聚合酶和转录因子(其招募RNA聚合酶)起始结合位点的特定DNA序列和反应元件。

视网膜包含三种光感受器：视杆细胞、视锥细胞和光感神经节细胞。视锥细胞有三种类型：S-视锥细胞、M-视锥细胞和L-视锥细胞。S-视锥细胞对短波长光(峰值接近420-440nm)反应最强，也称为蓝视锥。M-视锥细胞对中波长光(峰值接近534-545 nm)反应最强，也被称为绿视锥。L-视锥细胞对长波长光(峰值接近564–580 nm)反应最强，也被称为红视锥。自三个视锥类型信号接收的信号差异允许脑感知所有可能的颜色。

“转基因表达盒”或“表达盒”包含被核酸载体递送至靶细胞的基因序列。这些序列包括目的基因(例如，CNGB3核酸)、一个或多个启动子和最小调控元件。

“最小调控元件”为基因在靶细胞中有效表达所必需的调控元件，因此应包含在转基因表达盒中。这样的序列可包括，例如启动子或增强子序列、便于DNA片段插入质粒载体中的多聚接头序列以及负责内含子剪接和mRNA转录物多腺苷酸化的序列。在最近的用于色盲的基因疗法治疗的实例中，表达盒包括多腺苷酸化位点的最小调控元件、剪接信号序列和AAV末端反向重复。参见，例如，Komaromy等。

“核酸”或“核酸分子”为由单体核苷酸链组成的分子，例如DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)。核酸可编码，例如，启动子、CNGB3基因或其部分或调控元件。核酸分子可为单链或双链。“CNGB3核酸”指包含CNGB3基因或其部分或CNGB3基因的功能变体或其部分的核酸。相似地，“CNGA3核酸”指包含CNGA3基因或其部分或CNGA3基因的功能变体或其部分的核酸，“GNAT2核酸”指包含GNAT2基因或其部分或GNAT2基因的功能变体或其部分的核酸。基因的功能变体包括具有微小变化，例如，沉默突变、单核苷酸多态性、错义突变和其它不显著改变基因功能的突变或缺失的基因变体。

“分离的”核酸分子(例如，分离的启动子)是指从核酸天然来源中存在的其它核酸分子中分离的核酸分子。例如，关于基因组DNA，术语“分离的”包括从与基因组DNA天然结合的染色体中分离的核酸分子。优选“分离的”核酸分子不含在衍生该核酸分子的生物基因组DNA中天然地位于核酸分子两侧的序列。

II. 发明方法

本发明提供可用于治疗影响视网膜视锥细胞的遗传病的启动子、表达盒、载体、药盒和方法。影响视网膜视锥细胞的遗传病包括色盲、Leber先天性黑蒙、视锥-视杆营养不良、色素性视网膜炎(包括X-连锁色素性视网膜炎)、黄斑病变和年龄相关性黄斑变性。在优选的实施方案中，所述疾病为色盲。

色盲为色觉病症。常染色体隐性突变或三个基因中其它类型的序列改变是先天性色盲的主要原因。参见Pang, J.-J.等 (2010). Achromatopsia as a PotentialCandidate for Gene Therapy (色盲作为基因疗法的潜在候选). 载于Advances in Experimental Medicine and Biology, 第664卷, 第6部分, 639-646 (2010)。色盲已经与环核苷酸门控通道(CNG) α或β亚基(分别被称为CNGA3和CNGB3)的突变相关联。与色盲相关的CNGA3基因突变在以下文献中报道：Patel KA,等 Transmembrane S1 mutations inCNGA3 from achromatopsia 2 patients cause loss of function and impairedcellular trafficking of the cone CNG channel (色盲2患者中CNGA3跨膜S1突变导致视锥CNG通道功能丧失和细胞运输损伤). Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46 (7):2282–90. (2005)., Johnson S,等 Achromatopsia caused by novel mutations inboth CNGA3 and CNGB3 (CNGA3和CNGB3二者中新型突变引起的色盲). J. Med.Genet. 41(2): e20. (2004)., Wissinger B,等 CNGA3 mutations in hereditary conephotoreceptor disorders (遗传性视锥光感受器病症中的CNGA3突变). Am. J. Hum.Genet. 69 (4): 722–37.(2001)., 和Kohl S,等 Total colourblindness iscaused by mutations in the gene encoding the alpha-subunit of the conephotoreceptor cGMP-gated cation channel (全色盲由编码视锥光感受器cGMP-门控阳离子通道α亚基的基因突变引起). Nat.Genet. 19 (3): 257–9. (1998)。与色盲相关的CNGB3基因突变在以下文献中报道：Johnson S,等Achromatopsia caused by novelmutations in both CNGA3 and CNGB3 (CNGA3和CNGB3二者中新型突变引起的色盲). J. Med.Genet. 41 (2): e20. (2004)., Peng C,等 Achoromatopsia-associated mutationin the human cone photoreceptor cyclic nucleotide-gated channel CNGB3 subunitalters the ligand sensitivity and pore properties of heteromeric channels (人视锥光感受器环核苷酸-门控通道CNGB3亚基中的色盲相关突变改变异测通道的配体敏感性和孔性质). J. Biol. Chem. 278 (36): 34533–40 (2003)., Bright SR,等 Disease-associated mutations in CNGB3 produce gain of function alterations in conecyclic nucleotide-gated channels (CNGB3的疾病相关突变引起视锥环核苷酸-门控通道的功能获得性改变). Mol. Vis. 11: 1141–50 (2005)., Kohl S,等 CNGB3 mutationsaccount for 50% of all cases with autosomal recessive achromatopsia (常染色体隐性色盲所有病例的50%起因于CNGB3突变). Eur. J. Hum.Genet. 13 (3): 302–8(2005)., Rojas CV,等A frameshift insertion in the cone cyclic nucleotidegated cation channel causes complete achromatopsia in a consanguineous familyfrom a rural isolate (在农村隔离群的一个血缘家庭中视锥环核苷酸门控阳离子通道的移码插入导致全色盲). Eur. J. Hum.Genet. 10 (10): 638–42 (2002)., Kohl S,等Mutations in the CNGB3 gene encoding the beta-subunit of the conephotoreceptor cGMP-gated channel are responsible for achromatopsia (ACHM3)linked to chromosome 8q21 (编码视锥光感受器cGMP-门控通道的CNGB3基因突变导致染色体8q21连锁的色盲(ACHM3)). Hum. Mol.Genet. 9 (14): 2107–16 (2000)., SundinOH,等.Genetic basis of total colourblindness among the Pingelapese islanders(Pingelapese岛民中全色盲的遗传基础). Nat.Genet. 25 (3): 289–93 (2000)。视锥细胞转导蛋白基因(被称为GNAT2)的序列改变也可导致色盲。参见Kohl S,等, Mutations inthe cone photoreceptor G-protein alpha-subunit gene GNAT2 in patients withachromatopsia (色盲患者中视锥光感受器G-蛋白α亚基基因GNAT2的突变). Am J Hum Genet 71 (2): 422-425 (2002) (下文中Kohl等)。这些蛋白突变的严重度与色盲表型的严重度相关。http://en.wikipedia.org/wiki/Achromatopsia。约50%的色盲病例起因于CNGB3突变。Kohl等，约23%的病例起因于CNGA3突变，约2%的病例起因于GNAT2突变。

“CNGB3基因”为编码环核苷酸-门控通道β3 (CNGB3)的基因。“CNGA3基因”为编码环核苷酸-门控通道α3 (CNGA3)的基因。CNGB3和CNGA3基因在视网膜的视锥细胞中表达。天然的视网膜环核苷酸门控通道(CNG)关键性地参与光转导。CNG为由两个α和两个β亚基组成的阳离子通道。在黑暗中，视锥具有相对高浓度的环鸟嘌呤核苷3'-5'一磷酸(cGMP)，其导致CNG打开，造成去极化和连续的谷氨酸释放。曝光激活降解cGMP的信号转导通路。cGMP浓度的降低导致CNG关闭，阻止正离子流入、使细胞超极化并终止谷氨酸的释放。CNGB3或CNGA3基因的突变可导致视锥光感受器功能缺陷，引起色盲。CNGB3基因突变已经与除色盲外的其它疾病相关联，这些疾病包括进行性视锥营养不良和青少年性黄斑变性。

GNAT2基因编码鸟嘌呤核苷酸结合蛋白的α-2亚基，也称为视锥-特异性α转导蛋白。鸟嘌呤核苷酸-结合蛋白(G蛋白)由α、β和γ亚基组成。在光感受器中，G蛋白在视觉信号的扩增和转导中是关键的。多种类型的GNAT2序列变化可导致人色盲：无义突变、小缺失和/或插入突变、移码突变和大的基因内缺失。Pang等。

当前，没有有效的色盲治疗。动物研究提示使用基因疗法来治疗色盲和其它视网膜疾病是可能的。对于隐性基因缺陷，目标为将缺陷基因的野生型拷贝递送至受影响的视网膜细胞类型。将基因递送至一些视锥细胞亚群的能力在例如Mauck, M. C.等,Longitudinal evaluation of expression of virally delivered transgenes ingerbil cone photoreceptors (病毒递送的转基因在沙鼠视锥光感受器中的表达的纵向评估). Visual Neuroscience 25(3): 273-282 (2008)中证明。作者表明重组AAV载体可用于实现编码绿色荧光蛋白的报道基因在特定类型的沙鼠视锥细胞中的长期表达。作者进一步证明可将人长-波长视蛋白基因递送至特定的沙鼠视锥，引起视锥对长-波长光的反应。

其它研究证明用重组AAV载体的基因疗法可用于通过将人L-视蛋白基因引入松鼠猴视网膜而将二色视猴转化为三色视者。Mancuso, K.,等 Gene therapy for red-greencolour blindness in adult primates (用于成年灵长类红-绿色盲的基因疗法).Nature 461: 784-787 (2009)。视网膜电流图证实引入的感光色素是有功能的，并且在行为测试中猴子显示色觉改善。

存在几种色盲动物模型，对其的基因疗法已经证明了恢复视锥功能的能力。参见Pang等。首先，Gnat2^cpfl3小鼠具有视锥特异性α转导蛋白基因的隐性突变，导致弱视敏度和很少或无视锥-特异性ERT反应。通过单次视网膜下注射携带野生型小鼠GNAT2 cDNA和人红视锥视蛋白启动子的AAV血清型5载体来治疗纯合Gnat2^cpfl3小鼠恢复了视锥-特异性ERG反应和视敏度。Alexander等Restoration of cone vision in a mouse model ofachromatopsia (色盲小鼠模型中视锥视觉的恢复). Nat Med 13:685-687 (2007) (下文中Alexander等)。其次，cpfl5 (视锥光感受器功能丧失5)小鼠具有CNGA3基因常染色体隐性错义突变，无视锥-特异性ERG反应。通过视网膜下注射携带野生型小鼠CNGA3基因和人蓝视锥启动子(HB570)的AAV载体来治疗cpfl5小鼠引起视锥-特异性ERG反应的恢复，Pang等。第三，有一种Alaskan Malmute狗，其具有天然存在的CNGB3突变，导致日间视觉丧失和视网膜视锥功能缺乏。在该类型的狗中，视网膜下注射包含人CNGB3 cDNA和人红视锥视蛋白启动子的AAV5载体恢复视锥-特异性ERG反应。参见例如，Komaromy等。

先前使用基因疗法治疗色盲的方法受这一事实限制：使用的启动子导致转基因仅在某些类型的视锥细胞光感受器中表达。本发明启动子可驱动基因在存在于人类中的所有三种类型视锥细胞(S-视锥细胞、M-视锥细胞和L-视锥细胞)中表达。

Komaromy等进行的研究的另一个限制在于所使用表达盒的总大小(5,230 bp)远超出AAV颗粒的正常包装能力(<4.9 kb)；过度填充的rAAV颗粒显著地损伤rAAV包装效率，导致低产率、较高的空-满颗粒比率，以及可能较低的载体侵染性。包含较短形式视锥红视蛋白启动子或视锥抑制蛋白启动子的表达盒在恢复视觉功能上不太有效。本发明启动子具有这样的优点，由于其缩短的长度，使得hCNGB3表达盒有效包装在AAV颗粒中。适应rAAV正常包装能力的启动子提供益处，例如改善的产率、较低的空-满颗粒比率、较高的载体侵染性以及最后，治疗所需病况的较高功效。

III. 本发明的启动子、表达盒、核酸和载体

本发明的启动子、CNGB3核酸、调控元件、表达盒和载体可使用本领域已知方法生产。下文所描述方法作为这样的方法的非限制性实例提供。

启动子

本发明提供分离的启动子。在一些方面，这些启动子包含CNGB3基因的5’-NTR区段。在相关方面，这些启动子包含CNGB3基因的5’-NTR区段以及衍生自其它基因的一个或多个增强子序列。

在一个实施方案中，启动子为包含约1.8 kb的CNGB3基因5’-NTR的分离启动子。在具体实施方案中，启动子具有序列SEQ ID NO: 1。

在另一个实施方案中，启动子为包含约1.6 kb的CNGB3基因5’-NTR的分离启动子。在具体实施方案中，启动子具有序列SEQ ID NO: 2。

在另一实施方案中，本发明提供分离的启动子，包含(a) 衍生自除CNGB3外的基因的增强子序列和(b) 约1.4 kb的CNGB3基因5’-NTR。

在一个实施方案中，启动子为分离的启动子，包含(a) 约400 bp的巨细胞病毒(CMV)增强子和(b) 约 1.4 kb的CNGB3基因5’-NTR。巨细胞病毒(CMV)增强子为衍生自巨细胞病毒的立即早期启动子。其用于增加转基因表达。在一个这样的实施方案中，启动子包含下列序列：(a) [SEQ ID NO: 3]和(b) [SEQ ID NO: 4]。

在另一实施方案中，启动子为分离的启动子，包含(a) 选自CBA启动子、劳斯肉瘤病毒-RSV启动子、近侧小鼠视蛋白启动子(mOP)、人G-蛋白-偶联受体蛋白激酶1启动子(hGRK1)的启动子序列；和(b) 约1.4 kb的CNGB3基因5’-NTR。CBA启动子为鸡-肌动蛋白启动子和CMV立即-早期增强子的融合物，其允许在视网膜下注射后GFP报道基因在光感受器细胞中稳定表达。Dinculescu, A等, Adeno-associated virus-vector gene therapyfor retinal disease (用于视网膜疾病的腺伴随病毒-载体基因疗法). Human Gene Therapy 2005; 16:649-663。RSV启动子已经被成功用于促进视网膜中的体内转基因表达。Lei B等 Molecular Vision 15:1374-1382 (2009)。

在其它实施方案中，本发明启动子包含CNGB3基因区段，所述CNGB3基因为人CNGB3(hCNGB3)基因。在其它实施方案中，CNGB3基因为来自非-人类动物的CNGB3基因。

在本发明启动子的一些实施方案中，启动子能够促进转基因在S-视锥、M-视锥和L-视锥细胞中表达。“转基因”是指包含已经从一种生物分离并且引入不同生物的基因序列的DNA区段。例如，为了治疗患有人CNGB3基因突变所导致的色盲的个体，可使用适当的载体给予野生型(即，非-突变的，或功能变体)人CNGB3基因。野生型基因被称为“转基因”。在优选的实施方案中，转基因为编码通常在视网膜视锥细胞中表达的蛋白的基因的野生型形式。在一个这样的实施方案中，转基因衍生自人基因。在第一个具体实施方案中，启动子能够促进CNGB3核酸在S-视锥、M-视锥和L-视锥细胞中表达。在第二个具体实施方案中，启动子能够促进CNGA3核酸在S-视锥、M-视锥和L-视锥细胞中表达。在第三个具体实施方案中，启动子能够促进GNAT2核酸在S-视锥、M-视锥和L-视锥细胞中表达。在这三个具体实施方案中，CNGB3、CNGA3或GNAT2优选人CNGB3、CNGA3或GNAT2.

在另一个方面，本发明提供这样的启动子，其为PR2.1启动子的缩短形式(参见例如，实施例1)，其可任选包含额外的增强子序列。这样的启动子具有更好地适应AAV载体包装能力的优点，因此提供优势，例如，改善的产率、较低的空-满颗粒比率和较高的载体侵染性。在一些实施方案中，这些启动子通过截短PR2.1的5’-末端同时保留500 bp核心启动子和600 bp基因座控制区(LCR)完整而产生。在一些这样的实施方案中，截短的长度选自约300 bp、500 bp和1,100 bp (分别参见，例如，PR1.7、PR1.5和PR1.1，如在实施例1中所描述)。在一个具体实施方案中，本发明提供缩短的启动子，其包含添加至PR1.1 5’-末端的CMV增强子。在本发明其它实施方案中，本发明提供包含上文所述其它类型的增强子序列(其被加入到缩短形式PR2.1 启动子)的启动子。

表达盒

在另一个方面，本发明提供转基因表达盒，其包括(a) 本发明的启动子；(b) 选自CNGB3核酸、CNGA3核酸和GNAT2核酸的核酸；和(c) 最小调控元件。本发明启动子包括上文讨论的启动子。

“CNGB3核酸”指包含CNGB3基因或其部分或CNGB3基因的功能变体或其部分的核酸。相似地，“CNGA3核酸”指包含CNGA3基因或其部分或CNGA3基因的功能变体或其部分的核酸，“GNAT2核酸”指包含GNAT2基因或其部分或GNAT2基因的功能变体或其部分的核酸。基因的功能变体包括具有微小变化，例如，沉默突变、单核苷酸多态性、错义突变和其它不显著改变基因功能的突变或缺失的基因变体。

在某些实施方案中，核酸为人核酸(即衍生自人CNGB3、CNGA3或GNAT2基因的核酸)。在其它实施方案中，核酸为非-人核酸(即衍生自非-人CNGB3、CNGA3或GNAT2基因的核酸)。

“最小调控元件”为基因在靶细胞中有效表达所必需的调控元件。这样的调控元件可包括，例如，启动子或增强子序列、便于DNA片段插入质粒载体中的多聚接头序列以及负责内含子剪接和mRNA转录物多腺苷酸化的序列。在最近的用于色盲的基因疗法治疗的实例中，表达盒包括多腺苷酸化位点的最小调控元件、剪接信号序列和AAV末端反向重复。参见，例如，Komaromy等。本发明表达盒还可任选包括基因有效并入靶细胞非必需的额外调控元件。

载体

本发明还提供包含前述部分所讨论的任一表达盒的载体。在一些实施方案中，载体为包含表达盒序列的寡核苷酸。在具体实施方案中，寡核苷酸的递送可通过以下实现：体内电穿孔(参见，例如，Chalberg, TW,等 phiC31 integrase confers genomicintegration and long-term transgene expression in rat retina (在大鼠视网膜中phiC31整合酶赋予基因组整合和长期转基因表达). Investigative Ophthalmology &Visual Science, 46, 2140–2146 (2005) (下文中Chalberg等, 2005))或电子雪崩转染(参见，例如，Chalberg, TW,等 Gene transfer to rabbit retina with electronavalanche transfection (用电子雪崩转染将基因转移至兔视网膜). InvestigativeOphthalmology &Visual Science, 47, 4083–4090 (2006) (下文中Chalberg等,2006))。在进一步的实施方案中，载体为DNA-致密化(compacting)肽(参见，例如，Farjo,R,等 Efficient non-viral ocular gene transfer with compacted DNAnanoparticles (使用致密DNA毫微粒的有效非-病毒眼部基因转移). PLoS ONE, 1, e38(2006) (后文中Farjo等, 2006)，其中使用CK30，一种包含偶联至聚乙二醇的半胱氨酸残基并且随后为30个赖氨酸的肽，将基因转移至光感受器)、具有细胞穿透性质的肽(参见Johnson, LN,等，Cell-penetrating peptide for enhanced delivery of nucleicacids and drugs to ocular tissues including retina and cornea (用于提高核酸和药物递送至眼部组织包括视网膜和角膜的细胞-穿透肽). Molecular Therapy, 16(1),107–114 (2007) (下文中Johnson等, 2007), Barnett, EM,等 Selective cell uptakeof modified Tat peptide-fluorophore conjugates in rat retina in ex vivo andin vivo models (修饰的Tat肽-荧光缀合物在大鼠视网膜体外和体内模型中的选择性细胞摄取). Investigative Ophthalmology & Visual Science, 47, 2589–2595 (2006)(下文中Barnett等, 2006), Cashman, SM,等 Evidence of protein transduction butnot intercellular transport by proteins fused to HIV tat in retina cellculture and in vivo (与HIV tat融合的蛋白在视网膜细胞培养物中和体内蛋白转导而非细胞间转运的证据). Molecular Therapy, 8, 130–142 (2003) (下文中Cashman等,2003), Schorderet, DF,等 D-TAT transporter as an ocular peptide deliverysystem (作为眼部肽递送系统的D-TAT运载体). Clinical and ExperimentalOphthalmology, 33, 628–635 (2005)(下文中Schorderet等, 2005), Kretz, A,等.HSV-1 VP22 augments adenoviral gene transfer to CNS neurons in the retina andstriatum in vivo (HSV-1 VP22体内增加腺病毒基因转移至视网膜和纹状体中的CNS神经元). Molecular Therapy, 7, 659–669 (2003)(下文中Kretz等 2003)，例如至眼部细胞的肽递送)，或DNA-包封脂复合物(lipoplex)、polyplex、脂质体或免疫脂质体(参见例如，Zhang, Y,等 Organ-specific gene expression in the rhesus monkey eye followingintravenous nonviral gene transfer (静脉内非病毒基因转移后猕猴眼中的器官-特异性基因表达). Molecular Vision, 9, 465–472 (2003) (下文中Zhang等 2003), Zhu,C,等 Widespread expression of an exogenous gene in the eye after intravenousadministration. (静脉内给予后外源基因在眼中的广泛表达) InvestigativeOphthalmology & Visual Science, 43, 3075–3080 (2002) (下文中Zhu等 2002), Zhu,C.,等 Organ-specific expression of the lacZ gene controlled by the opsinpromoter after intravenous gene administration in adult mice (成年小鼠中静脉内基因给予后视蛋白启动子控制的lacZ基因的器官-特异性表达). Journal of GeneMedicine, 6, 906–912. (2004) (下文中Zhu等 2004))。

在优选的实施方案中，载体为病毒载体，例如衍生自腺伴随病毒、腺病毒、反转录病毒、慢病毒、牛痘/痘病毒或疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒(HSV))的载体。参见例如，Howarth。在最优选的实施方案中，载体为腺伴随病毒(AAV)载体。

目前已经鉴定了多种腺伴随病毒(AAV)血清型，包括12种人血清型(AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12)和多于100种的非人灵长类血清型。Howarth JL等, Using viral vectors as gene transfer tools (使用病毒载体作为基因转移工具). Cell Biol Toxicol 26:1-10 (2010) (下文中Howarth等)。在其中载体为AAV载体的本发明实施方案中，AAV载体的末端反向重复(ITR)的血清型可选自任何已知的人或非人AAV血清型。在优选的实施方案中，AAV载体的AAV ITR血清型选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。此外，在其中载体为AAV载体的本发明实施方案中，AAV载体的衣壳序列血清型可选自任何已知的人或动物AAV血清型。在一些实施方案中，AAV载体的衣壳序列血清型选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。在优选的实施方案中，衣壳序列的血清型为AAV5。在一些其中载体为AAV载体的实施方案中，使用假分型(pseudotyping)方法，其中一种ITR血清型的基因组被包装入不同血清型衣壳中。参见例如，Zolutuhkin S.等Production and purification of serotype 1,2, and 5 recombinant adeno-assiciated viral vectors (血清型1、2和5重组腺伴随病毒载体的生产和纯化).Methods 28(2): 158-67 (2002)。在优选的实施方案中，AAV载体的AAV ITR血清型和AAV载体的衣壳序列血清型独立地选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。

在一些其中载体为rAAV载体的本发明实施方案中，使用突变型衣壳序列。在本发明中可使用突变型衣壳序列，以及其它技术例如合理诱变(rational mutagenesis)、靶向肽工程、嵌合颗粒的产生、文库和定向进化方法和免疫逃避修饰，以优化AAV载体，用于例如达到免疫逃避和增强治疗输出的目的。参见例如，Mitchell A.M.等 AAV’s anatomy:Roadmap for optimizing vectors for translational success (AAV剖析：为翻译成功优化载体的路线图). Curr Gene Ther. 10(5): 319-340。

制备本发明的核酸

本发明的核酸分子(包括，例如，启动子、CNGB3核酸、CNGA3核酸、GNAT2核酸或调控元件)可使用标准分子生物学技术分离。使用目的核酸序列的全部或部分作为杂交探针，核酸分子可使用标准杂交和克隆技术(例如，如Sambrook, J., Fritsh, E. F.,和Maniatis,T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual (分子克隆：实验室手册). 第2版, ColdSpring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, N.Y., 1989中所述)分离。

用于本发明方法的核酸分子也可使用合成的寡核苷酸引物(基于目的核酸分子序列设计)通过聚合酶链反应(PCR)分离。本发明方法使用的核酸分子可使用cDNA、mRNA或备选地基因组DNA (作为模板)和适当的寡核苷酸引物根据标准PCR扩增技术扩增。

此外，目的核苷酸序列相应的寡核苷酸也可使用标准技术化学合成。已经知道多种化学合成多聚脱氧核苷酸的方法，包括固相合成，其已经在可市售获得的DNA合成仪上自动化(参见例如，Itakura等，美国专利号4,598,049; Caruthers等，美国专利号4,458,066;和Itakura，美国专利号4,401,796和4,373,071，通过引用结合到本文中)。用于设计合成寡核苷酸的自动化方法是可得到的。参见例如，Hoover, D.M. & Lubowski, J. Nucleics Research, 30(10): e43 (2002)。

本发明许多实施方案涉及CNGB3核酸、CNGA3核酸或GNAT2核酸。本发明一些方面和实施方案涉及其它核酸，例如分离的启动子或调控元件。核酸可为，例如，cDNA或化学合成的核酸。cDNA可例如，通过使用聚合酶链反应(PCR)扩增或通过筛选合适的cDNA文库获得。备选地，核酸可化学合成。

IV. 本发明的方法和药盒

治疗方法

本发明提供用于治疗影响视网膜视锥细胞的基因突变、置换或缺失相关疾病的方法，其中所述方法包括给予需要此种治疗的受试者包含一种本发明启动子的载体，从而治疗受试者。在一个实施方案中，所述疾病影响视网膜色素上皮(PRE)。在一个具体实施方案中，所述疾病为色盲。影响视网膜视锥细胞的基因突变、置换或缺失相关的其它疾病包括色盲、Leber先天性黑蒙、视锥-视杆营养不良、黄斑病变、年龄相关性黄斑变性和色素性视网膜炎(包括X-连锁色素性视网膜炎)。

本发明进一步提供用于治疗色盲的方法，包括给予需要此种治疗的受试者任一本发明载体，从而治疗受试者。

待通过本发明方法治疗的“受试者”可意指人或非-人动物。“非人动物”包括任何脊椎或无脊椎生物。在一些实施方案中，非人动物为视网膜疾病或特别是色盲的动物模型。参见例如，Pang等、Alexander等、Komaromy等。多种大型动物模型可用于视网膜中AAV-介导的基于基因的疗法研究。Stieger K.等 AAV-mediated gene therapy for retinaldisorders in large animal models (大型动物模型中用于视网膜病症的AAV-介导的基因疗法).ILAR J. 50(2): 206-224 (2009)。本发明启动子在上文中描述。“治疗”疾病(例如，色盲)意指减轻、预防或延迟至少一种疾病病征或症状的发生。疾病的“病征”是可被其他人观察到的或通过客观方法例如视网膜电描记法或行为测试测量的疾病表现。疾病的“症状”为受试者主观感知的疾病特征。

在这两种治疗方法的任一种中，载体可为本领域已知的任何类型的载体。在一些实施方案中，载体为非-病毒载体，例如裸露的DNA质粒、寡核苷酸(例如反义寡核苷酸、小分子RNA (siRNA)、双链寡聚脱氧核苷酸或单链DNA寡核苷酸)。在涉及寡核苷酸载体的具体实施方案中，递送可通过体内电穿孔(参见例如，Chalberg等, 2005)或电子雪崩转染(参见例如，Chalberg等 2006)实现。在进一步的实施方案中，载体为可任选包封在水溶性聚合物中的树枝状大分子(dendrimer)/DNA复合体、DNA-致密化肽(参见例如，Farjo等 2006，其中使用CK30，一种包含偶联至聚乙二醇的半胱氨酸残基并且随后为30个赖氨酸的肽，将基因转移至光感受器)、具有细胞穿透性质的肽(参见Johnson等 2007; Barnett等, 2006;Cashman等, 2003; Schorderet等, 2005; Kretz等 2003，例如至眼部细胞的肽递送)或DNA-包封脂复合物(lipoplex)、polyplex、脂质体或免疫脂质体(参见例如，Zhang等 2003；Zhu等 2002；Zhu等 2004)。在许多额外的实施方案中，载体为病毒载体，例如衍生自腺伴随病毒、腺病毒、反转录病毒、慢病毒、牛痘/痘病毒或疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒 (HSV))的载体。参见例如，Howarth。在优选的实施方案中，载体为腺伴随病毒(AAV)载体。

在本发明的治疗方法中，载体的给予可通过本领域已知的任何方法实现。在优选的实施方案中，通过视网膜下注射给予。在某些实施方案中，视网膜下注射优先递送至一个或多个其中视锥密度特别高的区域(例如，视盘上面的毯区(tapetal zone))。在其它实施方案中，通过眼内注射、玻璃体内注射或静脉内注射给予。将载体给予视网膜可为单边的或双边的，并且可使用或不使用全身麻醉完成。

在本发明的治疗方法中，所递送载体的体积可基于接受治疗的受试者的特征(例如受试者的年龄和载体递送区域的体积)确定。已经知道个体间眼睛大小和视网膜下空间的体积不同，并且可随着受试者的年龄改变。在其中经视网膜下给予载体的实施方案中，可选择载体体积，目的是覆盖视网膜下空间的全部或一定比例，或使得递送特定数量的载体基因组。

在本发明的治疗方法中，给予载体的浓度可根据生产方法而不同，并且可基于确定为对特定给药途径治疗有效的浓度进行选择或优化。在一些实施方案中，每毫升的载体基因组中的浓度(vg/ml)选自约10⁸ vg/ml、约10⁹ vg/ml、约10¹⁰ vg/ml、约10¹¹ vg/ml、约10¹² vg/ml、约10¹³ vg/ml和约10¹⁴ vg/ml。在优选的实施方案中，所述浓度在10¹⁰ vg/ml -10¹³ vg/ml的范围内，以约0.1 mL、约0.2 mL、约0.4 mL、约0.6 mL、约0.8 mL和约1.0 mL的体积通过视网膜下注射或玻璃体内注射递送。

药盒

本发明还提供药盒。在一方面，本发明药盒包括(a) 包含任一本发明启动子的载体和(b)其使用说明书。在另一方面，本发明药盒包括(a) 任一本发明的载体和(b)其使用说明书。本发明启动子和载体如上文所述。在一些实施方案中，本发明载体可为本领域已知的任何类型的载体，包括非-病毒或病毒载体，如上文所述。在优选的实施方案中，载体为病毒载体，例如衍生自腺伴随病毒、腺病毒、反转录病毒、慢病毒、牛痘/痘病毒或疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒(HSV))的载体。在最优选的实施方案中，载体为腺伴随病毒(AAV)载体。

随药盒提供的说明书可描述启动子可如何并入载体内或载体可如何给予用于治疗目的，例如，用于治疗影响视网膜视锥细胞的基因突变、置换或缺失相关的疾病。在其中使用药盒用于治疗目的的一些实施方案中，说明书包括关于推荐剂量和给药途径的细节。

制备重组腺伴随病毒载体(AAV载体)的方法

本发明还提供制备重组腺伴随病毒(rAAV)载体的方法，包括将任一本发明启动子(上文中描述)和选自CNGB3核酸、CNGA3核酸和GNAT2核酸的核酸(也在上文中描述)插入腺伴随病毒载体中。在一些实施方案中，核酸为人核酸，即，衍生自人CNGB3、CNGA或GNAT基因的核酸，或其功能变体。在备选的实施方案中，核酸为衍生自非-人基因的核酸。

在制备本发明提供的rAAV载体的方法中，所述AAV载体的衣壳序列血清型和ITR血清型独立地选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。因此，本发明包括使用假分型方法的载体，其中将一种ITR血清型的基因组包装入不同血清型衣壳中。参见例如，Daya S.和Berns, K.I., Gene therapy using adeno-associated virus vectors (使用腺伴随病毒载体的基因疗法). Clinical Microbiology Reviews, 21(4): 583-593 (2008) (下文中Daya等)。此外，在一些实施方案中，衣壳序列为突变型衣壳序列。

AAV载体

AAV载体衍生自腺伴随病毒，其具有这样的名字是由于最初被描述为腺病毒制备物的污染物。AAV载体提供多种众所周知的超过其它类型载体的优点：野生型毒株感染人和非人灵长类而无疾病或有害作用迹象；AAV衣壳显示非常低的免疫原性以及允许严格的病毒纯化和浓缩方法的高化学和物理稳定性；AAV载体转导导致有丝分裂期后、不分裂细胞中持续的转基因表达，并且提供长期的功能获得；以及AAV亚型和变体的多样性提供靶向选择组织和细胞类型的可能性。Heilbronn R & Weger S, Viral Vectors for GeneTransfer: Current Status of Gene Therapeutics (用于基因转移的病毒载体：基因疗法现状), 载于M. Schäfer-Korting (主编), Drug delivery, Handbook ofExperimental Pharmacology (药理学实验手册), 197: 143-170 (2010) (下文中Heilbronn)。AAV载体的主要限制为，对于包含单链DNA的常规载体AAV仅提供有限的转基因能力(<4.9 kb)。

AAV为无包膜的、小的、包含单链DNA的病毒，被直径20 nm的二十面体衣壳壳体化。人血清型AAV2用于大多数的早期AAV研究。Heilbronn。其包含4.7 kb线性的单链DNA基因组，所述基因组具有两个开放阅读框rep和cap (“rep”用于复制，“cap”用于衣壳)。Rep编码四个重叠的非结构蛋白：Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。AAV生命周期的大多数步骤，包括AAVDNA复制在发夹-结构的末端反向重复(ITR)处的起始(生产AAV载体的必需步骤)，需要Rep78和Rep69。cap基因编码三种衣壳蛋白，VP1、VP2和VP3。Rep和cap两侧为145 bp ITR。ITR包含DNA复制起点和包装信号，并且其用于介导染色体整合。ITR通常为AAV载体构建中唯一保持的AAV元件。

为了完成复制，AAV必须与辅助病毒共同感染进入靶细胞。Grieger JC &Samulski RJ, Adeno-associated virus as a gene therapy vector: Vectordevelopment, production, and clinical applications (腺伴随病毒作为基因疗法载体：载体开发、生产和临床应用). Adv Biochem Engin/Biotechnol 99:119-145 (2005)。典型地，辅助病毒为腺病毒(Ad)或单纯疱疹病毒(HSV)。在不存在辅助病毒的情况下，AAV可通过整合到人染色体19上的位点建立潜伏性感染。Ad或HSV感染潜伏性感染AAV的细胞将拯救整合的基因组并开始生产性感染。辅助功能(helper function)所需的四个Ad蛋白为E1A、E1B、E4和E2A。此外，还需要Ad病毒-相关(VA)RNA的合成。疱疹病毒也可用作生产性AAV复制的辅助病毒。已经发现编码解旋酶-引发酶复合物(UL5、UL8和UL52)和DNA-结合蛋白(UL29)的基因足以介导HSV辅助作用。在一些使用rAAV载体的本发明实施方案中，辅助病毒为腺病毒。在其它使用rAAV载体的实施方案中，辅助病毒为HSV。

制备重组AAV (rAAV)载体

本发明rAAV载体的生产、纯化和表征可使用许多本领域已知方法中的任一种进行。对于实验室-规模生产方法的综述，参见，例如，Clark RK, Recent advances inrecombinant adeno-associated virus vector production (重组腺伴随病毒载体生产的最新进展).Kidney Int. 61s:9-15 (2002); Choi VW等, Production of recombinantadeno-associated viral vectors for in vitro and in vivo use (用于体外和体内用途的重组腺伴随病毒载体的生产). Current Protocols in Molecular Biology16.25.1-16.25.24 (2007) (下文中Choi等)；Grieger JC & Samulski RJ, Adeno-associated virus as a gene therapy vector: Vector development, production,and clinical applications (腺伴随病毒作为基因疗法载体：载体开发、生产和临床应用). Adv Biochem Engin/Biotechnol 99:119-145 (2005) (下文中Grieger &Samulski)；Heilbronn R & Weger S, Viral Vectors for Gene Transfer: CurrentStatus of Gene Therapeutics (用于基因转移的病毒载体：基因疗法现状), 载于M. Schäfer-Korting (主编), Drug Delivery, Handbook of Experimental Pharmacology (实验药理学手册), 197: 143-170 (2010) (下文中Heilbronn)；Howarth JL等, Usingviral vectors as gene transfer tools (使用病毒载体作为基因转移工具). Cell Biol Toxicol 26:1-10 (2010) (下文中Howarth)。下文所述生产方法意在作为非限制性实例。

AAV载体生产可通过包装质粒的共转染完成。Heilbronn。细胞系提供缺失的AAV基因rep和cap以及所需的辅助病毒功能。腺病毒辅助基因，VA-RNA、E2A和E4与AAV rep和cap基因在两个分开的质粒上或在单个辅助构建体上一起转染。还转染重组AAV载体质粒，其中AAV衣壳基因置换为被ITR框入的转基因表达盒(包含目的基因例如CNGB3核酸、启动子和最小调控元件)。这些包装质粒通常转染进293细胞，一种组成型表达其余所需Ad辅助基因E1A和E1B的人细胞系。这导致携带目的基因的AAV载体的扩增和包装。

现已鉴定了AAV的多种血清型，包括12种人血清型和超过100种非人灵长类血清型。Howarth等。本发明AAV载体可包含衍生自AAV任何已知血清型的衣壳序列。如本文所使用的，“已知的血清型”包括可使用本领域已知方法生产的衣壳突变型。这样的方法，包括，例如，病毒衣壳序列的遗传操作、不同血清型衣壳区所暴露表面的结构域交换和使用技术例如标记获救产生AAV嵌合体。参见Bowles等 Marker rescue of adeno-associatedvirus (AAV) capsid mutants: A novel approach for chimeric AAV production (腺伴随病毒(AAV)衣壳突变型的标记获救：用于嵌合AAV生产的新方法). Journal ofVirology, 77(1): 423-432 (2003)，以及其中引用的参考文献。此外，本发明AAV载体可包含衍生自AAV任何已知血清型的ITR。ITR优先衍生自人血清型AAV1-AAV12中的一种。在本发明一些实施方案中，使用假分型方法，其中将一种ITR血清型的基因组包装到不同血清型衣壳中。

本发明中使用的衣壳序列优先衍生自人血清型AAV1-AAV12中的一种。已经证明包含AAV5血清型衣壳序列的重组AAV载体在体内靶向视网膜细胞。参见，例如，Komaromy等。因此，在本发明优选实施方案中，AAV载体衣壳序列的血清型为AAV5。在其它实施方案中，AAV载体衣壳序列的血清型为AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或AAV12。即使当衣壳序列的血清型不天然靶向视网膜细胞时，可使用其它特异性组织靶向的方法。参见，Howarth等。例如，通过病毒衣壳序列(特别是在AAV三维结构的环出(loopedout)区域)的遗传操作，或通过不同血清型衣壳区域所暴露表面的结构域交换，或通过使用技术例如标记获救产生AAV嵌合体，可直接靶向重组AAV载体。参见Bowles等 Markerrescue of adeno-associated virus (AAV) capsid mutants: A novel approach forchimeric AAV production (腺伴随病毒(AAV)衣壳突变型的标记获救：用于嵌合AAV生产的新方法). Journal of Virology, 77(1): 423-432 (2003)，以及其中引用的参考文献。

Choi等提供了一种用于生产、纯化和表征重组AAV (rAAV)载体的可能方案。一般包括下列步骤：设计转基因表达盒、设计用于靶向特异性受体的衣壳序列、产生无腺病毒rAAV载体、纯化和滴度(titer)。这些步骤在下文概述，在Choi等中详述。

转基因表达盒可为作为假-双链转基因包装的单链AAV (ssAAV)载体或“二聚”或自身互补AAV (scAAV)载体。Choi等、Heilbronn、Howarth。由于需要将单链AAV DNA转化为双链DNA，使用传统的ssAAV载体通常导致基因表达起始缓慢(数日至数周直至达到转基因表达稳定期)。相比之下，scAAV载体显示在转导休眠细胞后数小时内基因表达起始，数日内达到稳定期。Heilbronn。然而，scAAV载体的包装能力约为传统ssAAV载体的一半。Choi等。备选地，转基因表达盒可在两个AAV载体之间分开，这允许递送较长的构建体。参见例如，Daya等。ssAAV载体可如下构建：用限制性内切核酸酶消化适当的质粒(例如，包含hCNGB3基因的质粒)以除去rep和cap片段，以及凝胶纯化包含AAVwt-ITR的质粒骨架。Choi等。随后，可将所需转基因表达盒插入适当的限制性位点之间，以构建单链rAAV载体质粒。scAAV载体可如Choi等中所描述构建。

然后，可通过双重CsCl梯度分级，纯化pTR前病毒质粒和适当的AAV辅助质粒以及pXX6 Ad辅助质粒的大规模质粒制备物(至少1 mg)。Choi等。适当的AAV辅助质粒可选自pXR系列，pXR1-pXR5，其分别允许将AAV2 ITR基因组交叉-包装(cross-packaging)到AAV血清型1-5的衣壳中。适当的衣壳可基于衣壳靶向目的细胞的效率选择。例如，在本发明优选的实施方案中，rAAV载体的衣壳序列血清型为AAV5，这是因为已知该衣壳类型有效靶向视网膜细胞。可使用已知的改变基因组(即，转基因表达盒)长度和AAV衣壳的方法改善表达和/或基因至特定细胞类型(例如，视网膜视锥细胞)的转移。参见，例如，Yang GS, Virus-mediated transduction of murine retina with adeno-associated virus: Effectsof viral capsid and genome size (使用腺伴随病毒的病毒-介导性鼠视网膜转导：病毒衣壳和基因组大小的影响). Journal of Virology, 76(15): 7651-7660。

接着，用pXX6辅助质粒、rAAV载体质粒和AAV辅助质粒转染293细胞。Choi等。随后分级的细胞裂解物经受rAAV纯化的多步过程，然后CsCl梯度纯化或肝素琼脂糖柱纯化。rAAV病毒体的生产和定量可使用斑点-印迹测定确定。rAAV在细胞培养物中的体外转导可用于验证病毒的侵染性和表达盒的功能性。

除了Choi等描述的方法外，在本发明上下文中，可使用多种其它用于生产AAV的转染方法。例如，瞬时转染方法，包括依赖磷酸钙沉淀方案的方法，为可用的。

除了用于生产rAAV载体的实验室-规模方法外，本发明可使用本领域已知用于AAV载体的生物反应器-规模制造的技术，包括，例如，Heilbronn; Clement, N.等Large-scaleadeno-associated viral vector production using a herpesvirus-based systemenables manufacturing for clinical studies (使用基于疱疹病毒的系统的大规模腺伴随病毒载体生产使得能够进行用于临床研究的制造). Human Gene Therapy, 20: 796-606。

本发明通过下列实施例进一步说明，所述实施例不应认为是进一步限制。所有图以及本申请各处引用的所有参考文献、专利和出版专利申请的内容以及附图通过引用以其整体明确地结合到本文中。

实施例

实施例1：较短形式PR2.1启动子的产生和测试

先前的研究者基于蓝视锥单色视者中存在的6个不同缺失的定位(0.6-55 kb)产生了截短的人红/绿视锥视蛋白启动子。Wang, Y.,等A locus control region adjacentto the human red and green pigment genes (临近人红和绿色素基因的基因座控制区). Neuron 9: 429-440 (1992); Nathans, J., 等Molecular genetics of humanblue cone monochromacy (人蓝视锥单色视的分子遗传学). Science 245: 831-838(1989); Shaaban, S.等Functional analysis of the promoters of the human redand green visual pigment genes (人红和绿视觉色素基因启动子的功能分析);Integrative Opthalmology & Visual Science: 39(6): 885-896 (1998). 该截短的红/绿视蛋白启动子在图1中示出。

Komaromy等中使用了重组腺伴随病毒(rAAV)载体，如图2所示。该载体衍生自人血清型5腺伴随病毒，因此包含AAV5的衣壳序列。其包装了包含2064 bp的PR2.1视锥红视蛋白启动子(PR2.1)和2430 bp的人CNGB3 (hCNGB3)序列的表达盒。此外，表达盒包含SV40多聚(A)和剪接信号序列，两侧为AAV2末端反向重复(ITR)。表达盒的总大小为5231bp，这远远超出AAV载体的正常包装能力。在两个生产运行中，发现与包装3843 bp hAAT表达盒(远远小于hCNGB3表达盒的长度(5231 bp))的rAAV1-hAAT的生产运行相比，rAAV5-PR2.1-hCNGB3的产率约为1/5-1/3。使用银染和电子显微术(EM)还观察到比使用相同的HSV互补系统制造的rAAV1-hAAT高的空-满颗粒比率。PR2.1启动子的另一个限制为其促进hCNGB3转基因在红/绿视锥中的表达，而在蓝视锥中很少表达。

在本实施中，创建并测试了缩短形式的PR2.1启动子。

材料和方法

通过从PR2.1的5’-末端开始进行截短，缩短PR2.1启动子。PR2.1的500 bp核心启动子和600 bp基因座控制区(LCR)保持完整。产生了3个缩短形式的PR2.1启动子：PR1.7、PR1.5和PR1.1。其分别通过在5’末端截短PR2.1约300 bp、500 bp和1,100 bp而产生。将CMV增强子加入PR1.1的5’末端，产生杂合启动子。产生包含这些启动子的每个的前病毒质粒，如图3所示。这些前病毒质粒(p)包含AAV末端重复(TR)、合成的启动子(PR2.1-syn)或其截短(有或无CMV增强子(CMVenh))和绿色荧光蛋白(GFP)转基因。构建下列4个前病毒质粒并测序：

(1) pTR-PR2.1syn-GFP

(2) pTR-PR1.8-GFP

(3) pTR-PR1.6-GFP

(4) pTR-CMVenh-PR1.1-GFP。

为了构建pTR-PR2.1syn-GFP，首先通过用enh-hGFP序列置换CBA和hRS1序列从pTR-CBA-hRS1构建亲本质粒pTR-CMVenh-hGFP。人GFP (hGFP) DNA序列从pTR-CBA-hGFP(一种包含hGFP开放阅读框的质粒)用两末端均具有内切核酸酶限制位点(Not I和BspHI)的寡核苷酸引物PCR扩增，用NotI/BspHI消化，连接到已经用NotI/NcoI消化以除去所有不必要DNA序列(包括鸡β肌动蛋白启动子和hRS1 (但非CMV增强子))的pTR-CBA-hRS1质粒中。所得质粒pTR-CMVenh-hGFP包含CMV增强子、hGFP开放阅读框(ORF)，和AAV2 ITR两侧的SV40多聚(A)序列。PR2.1 DNA序列根据人红视锥视蛋白5’DNA序列合成(Wang Y.等, A locuscontrol region adjacent to the human red and green visual pigment genes (临近人红和绿色视觉色素基因的基因座控制区), Neuron, 第9卷, 第429-440页, 1992)。合成的PR2.1由跨越-4564至-3009的碱基连接到碱基-496至0组成，并且包含L和N视蛋白基因两者在人中表达所必需的LCR (Komaromy AM等, Targeting gene expression to coneswith human cone opsin promoters in recombinant AAV (使用重组AAV中的人视锥视蛋白启动子将基因表达靶向至视锥), Gene Therapy, 第15卷, 第1049-1055页, 2008)。此外，将97个碱基对的SV40剪接供体/剪接受体(SD/SA)连接到PR2.1启动子的末端。将合成的包含SD/SA序列的PR2.1插入pJ206克隆载体中，产生pJ206-PR2.1syn。PR2.1syn DNA序列，包括SV40 SD/SA序列，通过HindIII/Acc65I消化从pJ206-PR2.1syn释放，并插入已经用HindIII/Acc65I消化以除去不必要CMV增强子序列的pTR-CMVenh-hGFP，产生质粒pTR-PR2.1syn-hGFP。

为了构建具有较短形式PR2.1启动子的质粒，从pJ206-PR2.1syn PCR扩增从PR2.1的5’末端截短300 bp、500 bp或1,100 bp的PR2.1序列。设计了4个寡核苷酸引物：

1) PR右-Hind:

；

2) PR1.1左-Hind：

；

3) PR1.5左-Acc65I：

；和

4) PR1.7左-Acc65I：。引物PR右-Hind分别与其它3个引物配对以PCR扩增PR1.1、PR1.5和PR1.7。使用Pfu Ultra HS聚合酶混合物和下列热循环：95℃ 5分钟，然后94℃ 1分钟，58℃ 45秒，72℃ 2分钟，35个循环。

使用PR右-Hind和PR1.1-左-Hind引物对，从pTR-CMVenh-PR1.1-hGFP: PR1.1扩增DNA。扩增的DNA用HindIII消化，并插入已经用HindIII消化的pTR-CMVenh-hGFP，产生质粒pTR-CMVenh-PR1.1-hGFP。

使用PR右-Hind和PR1.5-左-Acc65I引物对，从pTR-PR1.5-hGFP: PR1.5扩增DNA。扩增的DNA用HindIII/Acc65I消化，并插入已经用HindIII/Acc65I消化的pTR-CMVenh-hGFP，产生质粒pTR-PR1.5-hGFP。

使用PR右-Hind和PR1.7-左-Acc65I引物对，从pTR-PR1.7-hGFP: PR1.7扩增DNA。扩增的DNA用HindIII/Acc65I消化，并插入已经用HindIII/Acc65I消化的pTR-CMVenh-hGFP，产生质粒pTR-PR1.7-hGFP。

表达盒的DNA序列，包括启动子和hGFP，通过DNA测序确认，TR的定位通过SmaI限制性作图确认。

为了检查PR2.1启动子对RNA转录和随后的蛋白表达是否是功能性的，将人视网膜色素上皮(RPE)细胞系，APRE-19，和人胚肾HEK293细胞接种在6孔板中(5 x10⁵细胞/孔)，然后用6种质粒每一种的1 µg DNA转染：pTR-CMVenh-PR1.1-GFP、pTR-PR1.5-GFP、pTR-PR1.7-GFP、pTR-PR2.1syn-GFP、pTR-PR2.1-GFP (对照)或pTR-smCBA-GFP (阳性对照)。转染细胞在37℃、5% CO₂的培养箱中孵育4天。孵育期间，通过荧光显微术检查转染细胞的GFP表达。

结果

所有4种质粒的DNA测序和限制性作图证实这些前病毒质粒的序列和TR是正确的。

使用ARPE-19和HEK293细胞的体外分析发现这些细胞系均不支持PR2.1启动子的功能性。在转染后24小时，在转染来自pTR-smCBA-GFP的DNA的细胞(阳性对照)中观察到强GFP-表达。在转染后48小时，在转染来自pTR-CMVenh-PR1.1-GFP的DNA的细胞中观察到弱GFP表达。在所有其它孔，即用来自pTR-PR1.5-GFP、pTR-PR1.7-GFP、pTR-PR2.1syn-GFP或pTR-PR2.1-GFP的DNA转染的孔中，未观察到GFP-表达。质粒pTR-PR2.1-GFP包含全长PR2.1启动子，已知其对于体内RNA转录和随后的GFP表达是功能性的(Komaromy AM等,Targeting gene expression to cones with human cone opsin promoters inrecombinant AAV (用重组AAV中的人视锥视蛋白启动子靶向基因表达至视锥), GeneTherapy, 第15卷, 第1049-1055页, 2008)。因此这些结果表明ARPE-19细胞系不支持PR2.1启动子，也不支持任何其它较短形式的PR2.1 启动子。pTR-CMVenh-PR1.1-GFP转染细胞的GFP弱表达很可能是由于CMV增强子，其大大提高PR1.1启动子的强度。

在随后的实验中，新的构建体将包装在rAAV衣壳中，并在小鼠模型中体内测试。将通过标准质粒转染方法生产5种rAAV载体，即rAAV5-CMVenh-PR1.1-GFP、rAAV5-PR1.5-GFP、rAAV5-PR1.7-GFP、rAAV5-PR2.1syn-GFP和rAAV5-PR2.1-GFP。已经在转染细胞中包装的rAAV载体将通过细胞裂解收集，然后通过碘克沙醇(IDX)梯度接着通过Q Sepharose HP柱色谱纯化，并在Alcon BSS溶液中配制。然后通过视网膜下注射(1 µL)，注射正常小鼠的双眼(每种载体5只小鼠)。在注射后6周，小鼠将被处死，摘出眼睛并制备视网膜切片。玻片用DAPI染色以鉴别细胞核，并免疫染色GFP和PNA (视锥光感受器的标志)。针对定量GFP表达和视锥中的GFP表达的定位，对玻片进行评估。

实施例2：天然和杂合hCNGB3启动子的产生

在这些实验中，以hCNGB3能够在所有三种类型的视锥光感受器中表达为目标，产生了新的天然和杂合hCNGB3启动子。设计寡核苷酸引物对用于基于参考hCNGB3基因序列(GenBank acc# NG_016980) PCR扩增紧接hCNGB3开放阅读框(ORF)起始密码子(ATG) 5’的1913 bp DNA片段。CNGB3基因的5’非翻译区(NTR)包含天然CNGB3启动子。使用的引物序列为：pCNGB3-NTR F: 5’-CAGACTAGCCAGAATCACAGATC-3’和pCNGB3-NTR R: 5’-TCTCCTATAGGCTTCACCTTGTTG-3’。使用0.25 µg或0.5 µg的人基因组DNA (Promega, 目录号G1471, 批号305017)作为DNA模板，使用2X Pfu Ultra HS Mix (Agilent Technologies,目录号600850)进行PCR扩增。扩增参数为95℃ 5分钟，接着为94℃ 1分钟，55℃ 45秒和72℃ 2分钟，35个循环。扩增的1913 bp的DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳纯化，并用作模板DNA用于PCR扩增，产生缩短的hCNGB3基因5’-NTR序列。设计了两组寡核苷酸引物分别扩增1800bp和1600 bp的5’-NTR序列。用于扩增1,800 bp 5’-NTR的引物组序列为pCNGB3-NTF F238Acc65I：5’-GTTGGGTACCAGCCGCCATCAGGAATAAAC-3’和pCNGB-NTR R SacII：5’-TCTCCGCGGTGGTTCTGAAAACCCTC-3’。用于扩增1,600 bp 5’-NTR的引物组序列为pCNGB3-NTRF431 Acc65I：5’-CATCTTGGTACCACATTCTCTTACAGAGC-3’和pCNGB3-NTR R XhoI：5’-ATCTTCTCGAGGGTGGTTCTGAAAACCCTC-3’。缩短的5’-NTR序列使用2X Pfu Ultra HS Mix(Agilent Technologies, 目录号600850)通过PCR扩增，PCR扩增参数为95℃ 5分钟，接着为94℃ 1分钟，55℃ 45秒和72℃ 2分钟，35个循环。

使用引物组pCNGB3-NTF F238 Acc65I和pCNGB-NTR R SacII从1913 bp 5’-NTR片段扩增DNA。扩增的DNA用Acc65I和SacII内切核酸酶消化，并插入已经用Acc65I和SacII消化的pTR-PR1.7-hGFP，产生质粒pTR-NTR1800-hGFP。

使用引物组pCNGB3-NTR F431 Acc65I和pCNGB3-NTR R XhoI从1913 bp 5’-NTR片段扩增DNA。扩增的DNA用Acc65I/XhoI消化，并插入已经用Acc65I/XhoI消化的pTR-CMVenh-PR1.1-hGFP，产生质粒pTR-NTR1600-hGFP。

使用引物组pCNGB3-NTR F431 Acc65I和pCNGB3-NTR R XhoI从1913 bp 5’-NTR片段扩增DNA。扩增的DNA用HpaI/XhoI消化，并插入已经用SnaBI/XhoI消化的pTR-CMVenh-PR1.1-hGFP，产生质粒pTR-CMVenh-NTR1350-hGFP。

表达盒的DNA序列，包括启动子、hGFP，通过DNA测序确认，末端重复(TR)通过SmaI限制性作图确认。

实施例3：来自天然CNGB3非-翻译区的视锥特异性启动子在视网膜细胞中驱动GFP表达的体内功效

下列实验证明了来自天然CNGB3非-翻译区的视锥特异性启动子在小鼠视网膜细胞中驱动GFP表达的体内功效。

通过常规传染方法构建并制造了4种包含驱动GFP的独特启动子的AAV5载体。此4种载体包括：1) AAV5-NTR1.8-hGFP，其包含含有本文所述约1.8 kb的CNGB3基因5’-NTR的分离的启动子；2) AAV5-NTR1.6-hGFP，其包含含有本文所述约1.6 kb的CNGB3基因5’-NTR的分离的启动子；3) AAV5-CMVenh-NTR1.4-hGFP，其包含含有本文所述约400 bp巨细胞病毒(CMV)增强子和本文所述约1.4 kb的CNGB3基因5’-NTR的分离的启动子；和4) AAV5-PR2.1-hGFP，其包含2.1 kb形式的人红/绿视蛋白启动子(PR2.1)，用作阳性对照。

使用标准技术将1微升(1µl)载体(2 x 1012 vg/mL)注射到约6-8周龄C57bl6小鼠的视网膜下空间(Timmers等 2001)。每种载体共计注射10只眼睛。在注射后约6周处死小鼠。摘出眼睛，制备后用低温恒温器以10微米连续切片。视网膜切片用针对hGFP的兔多克隆抗体和缀合到Alexa Fluor 594的凝集素PNA染色。视网膜切片通过共聚焦显微镜分析并获取影像。

所有测试的载体导致视网膜切片中的可见GFP表达。阳性对照AAV5-PR2.1-hGFP导致相对强的视锥转导，而在视网膜色素上皮细胞(RPE)中无转导。在另一方面，AAV5-NTR1.8-hGFP特异性地在RPE中导致强转导。AAV5-CMVenh-NTR1.4-hGFP也导致在RPE中强转导和在光感受器(PR) (即，视杆和视锥)中的最小转导。对于AAV5-NTR1.6-hGFP，仅观察到最小的RPE转导。结果在图6中示出，并在表1中概述。

表1 启动子构建体的相对转导效率的总结

启动子构建体	视杆转导	视锥转导	RPE转导
				AAV5-CMVenh-NTR1.4-hGFP	+	+	+++
AAV5-NTR1.6-hGFP	+/-	+/-	+
				AAV5-NTR1.8-hGFP	-	+/-	+++
AAV5-PR2.1-hGFP	++	+++	-

NTR1.8对于RPE细胞为强启动子，因此可用于RPE相关基因疗法。

等价实施方案

本领域技术人员将认识到，或仅仅使用常规实验能够确定本文所述本发明具体实施方案的许多等价实施方案。这样的等价实施方案旨在由所附权利要求书包括。

Claims

1.一种分离的启动子，其包含CNGB3基因的5’-NTR，其由序列SEQ ID NO: 1表征。

2.一种分离的启动子，其包含CNGB3基因的5’-NTR，其由序列SEQ ID NO: 2表征。

3.一种分离的启动子，其包含

由SEQ ID NO: 3表征的巨细胞病毒(CMV)增强子和

由SEQ ID NO: 4表征的CNGB3基因的5’-NTR。

4.权利要求1、2或3中任一项的启动子，其中所述CNGB3基因为人CNGB3基因。

5.一种转基因表达盒，其包含

(a) 权利要求1、2或3中任一项的启动子；

(b) 选自CNGB3核酸、CNGA3核酸和GNAT2核酸的核酸；和

(c) 最小调控元件，

其中所述最小调控元件由以下的一种或多种组成：启动子序列、增强子序列、能够促进DNA片段插入质粒载体中的多聚接头序列、负责内含子剪接的序列、负责mRNA转录物多腺苷酸化的序列、多腺苷酸化位点、剪接信号序列和AAV末端反向重复。

6.一种转基因表达盒，其包含

(a) 权利要求1或2的启动子；

(b) CNGB3核酸；和

(c) 最小调控元件，

7.权利要求5或6的表达盒，其中所述核酸为人核酸。

8.包含权利要求5-7中任一项的表达盒的核酸载体。

9.权利要求8的载体，其中所述载体为腺伴随病毒(AAV)载体。

10.权利要求9的载体，其中所述AAV载体的衣壳序列血清型和ITR血清型独立地选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。

11.权利要求9的载体，其中衣壳序列为突变型衣壳序列。

12.一种药盒，其包含

(a) 包含权利要求1、2或3中任一项的启动子的载体，和

(b) 其使用说明书。

13.一种药盒，其包含

(a) 权利要求8-11中任一项的核酸载体，和

(b) 其使用说明书。

14.制备重组腺伴随病毒(rAAV)载体的方法，其包括将权利要求1、2、3或4的启动子中的任一个和选自CNGB3核酸、CNGA3核酸和GNAT2核酸的核酸插入腺伴随病毒载体。

15.权利要求14的方法，其中所述核酸为人核酸。

16.权利要求14或权利要求15的方法，其中所述AAV载体的衣壳序列血清型和ITR血清型独立地选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。

17.权利要求14的方法，其中衣壳序列为突变型衣壳序列。