KR20200119782A - 발작 장애 치료 시 mir101 또는 mir128의 용도 - Google Patents

발작 장애 치료 시 mir101 또는 mir128의 용도 Download PDF

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Abstract

발작 장애의 치료를 요하는 환자에게서 이를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 환자의 뇌 세포에서 마이크로RNA-101 분자의 수준을 증가시키는 조성물의 유효량을 환자에게 전달하는 단계를 포함한다. 발작 장애의 치료를 요하는 환자에게서 이를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 환자의 뇌 세포에서 마이크로RNA-128 분자의 수준을 증가시키는 조성물의 유효량을 환자에게 전달하는 단계를 포함한다. 발작 장애의 치료를 요하는 환자에게서 이를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 마이크로RNA-101, pri-miR101 또는 pre-miR101을 암호화하는 벡터를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 발작 장애의 치료를 요하는 환자에게서 이를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 마이크로RNA-128, pri-miR128 또는 pre-miR128을 암호화하는 벡터를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 구현예에서, 마이크로RNA-101 및/또는 마이크로RNA-128의 수준 증가는 발작 장애의 하나 이상의 증상을 개선시킨다.

Description

발작 장애 치료 시 MIR101 또는 MIR128의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2017년 12월 6일에 출원된 미국 특허 가출원 제62/595,255호의 이익과 이에 대한 우선권을 주장하며, 그 전체는 참조로서 본원에 통합된다.
기술분야
마이크로 RNA MIR101 또는 MIR128을 사용하는 발작 장애 치료.
발작 장애(seizure disorder)는 일반적으로 뇌에서의 비정상적인 신경 세포 활성과 관련이 있으며, 비정상적인 거동과 감각, 경련, 의식 저하 때로는 의식 상실의 기간으로 나타날 수 있는 발작을 유발한다. 발작은 뇌에 영향을 미칠 수 있는 많은 다른 장애의 증상일 수 있다. 간질(epilepsy)은 재발성 발작을 특징으로 하는 발작 장애이다. (예를 들어, Blume 등의 문헌[Epilepsia. 2001; 42:1212-1218] 참조) 간질성 발작은 대개 뇌에서의 비정상적인 뇌파로 표시되고 일반적으로 갑작스런 의식 변화 또는 저하, 불수의적 움직임 또는 경련의 단기 에피소드(brief episode)로 나타난다.
발작은 국소 발작(부분 발작으로도 지칭됨)과 전신성 발작으로 분류될 수 있다. 국소 발작(focal seizures)은 뇌의 일측에만 영향을 미치지만, 전신성 발작은 뇌의 양측 모두에 영향을 미친다. 국소 발작의 구체적인 유형에는 단순 국소 발작, 복합 국소 발작, 및 이차적 전신성 발작이 있다. 단순 국소 발작은 특정 엽(lobe)(예를 들어, 측두엽, 전두엽, 두정엽, 또는 후두엽)에 한정되거나 집중될 수 있다. 복합 국소 발작은 일반적으로 단순 국소 발작보다 한쪽 반구의 더 넓은 부분에 영향을 미치지만, 흔히 측두엽이나 전두엽에서 기원한다. 국소 발작이 뇌의 일측(반구)에서 양측으로 확산될 때, 발작은 이차적 전신성 발작으로 지칭된다. 전신성 발작의 구체적인 유형에는 압상스(absence)(소발작(petit mal seizures)으로도 지칭됨), 긴장성 발작(tonic seizures), 무긴장성 발작(atonic seizures), 근간대성 발작(myoclonic seizures), 긴장성 간대성 발작(tonic clonic seizures)(대발작(grand mal seizures)으로도 지칭됨), 및 간대성 발작(clonic seizures)이 있다.
발작 장애의 예에는 간질(epilepsy), 전신성 긴장성-간대성 발작을 수반하는 간질(epilepsy with generalized tonic-clonic seizures), 근간대성 압상스를 수반하는 간질(epilepsy with myoclonic absences), 전두엽 간질(frontal lobe epilepsy), 측두엽 간질(temporal lobe epilepsy), 란다우-클레프너 증후군(Landau-Kleffner Syndrome), 라스무센 증후군(Rasmussen's syndrome), 드라베 증후군(Dravet syndrome), 두즈 증후군(Doose syndrome), CDKL5 장애, 영아 연축(infantile spasms, 웨스트 증후군), 소아 근간대성 간질(juvenile myoclonic epilepsy, JME), 백신 관련 뇌병증(vaccine-related encephalopathy), 난치성 유아기 간질(intractable childhood epilepsy, ICE), 레녹스-가스토 증후군(Lennox-Gastaut syndrome, LGS), 레트 증후군(Rett syndrome), 오타하라 증후군(Ohtahara syndrome), CDKL5 장애, 유아기 압상스 간질, 본태성 진전(essential tremor), 급성 반복 발작(acute repetitive seizures), 양성 롤란드 간질(benign rolandic epilepsy), 간질 지속증(status epilepticus), 불응성 간질 지속증, 초불응성 간질 지속증(SRSE), PCDH19 소아과 간질, 국소성 대뇌피질 형성이상(focal cortical dysplasia), 및 발작 활성의 증가 또는 돌발성 발작(breakthrough seizures)(연속 발작 또는 군집 발작으로도 지칭됨)이 포함된다. 발작 장애는 1형 나트륨 채널 단백질 서브유닛 알파(Scn1a) 관련 질환과 관련이 있을 수 있다.
모든 유형의 뇌 종양이 발작 질환과 관련이 있을 수 있다. 특정 종양은 잦은 빈도의 발작과 관련이 있다. 예를 들어, 신경절교종(gangliogliomas)은 천천히 성장하는 양성 종양으로서 척수 및/또는 측두엽에서 발생할 수 있다. 신경절교종은 종양성 신경교세포와 신경절세포 둘 다로 이루어지며, 이들은 무질서하고, 다양한 세포로 이루어지며, 비 침투성이다. 신경절교종은 일반적으로 발작과 관련이 있다. 신경교종(glioma)은 뇌의 신경교세포에서 발생하는 뇌종양이다. 신경교종은 4개의 등급(1, 2, 3 및 4)으로 분류되고, 치료 및 예후는 종양 등급에 따라 달라진다. 저등급 신경교종은 상이한 두 가지 유형의 뇌 세포, 즉 성상세포(astrocytes)와 희돌기교세포(oligodendrocytes)에서 비롯된다. 저등급 신경교종은 가장 늦게 성장하는 종류의 신경교종인 2등급 종양으로 분류된다. 저등급 신경교종 환자 중 60% 내지 85%가 발작을 경험할 수 있다. 고등급 신경교종(3등급 또는 4등급)은 빠르게 성장하는 신경교종으로서, 일반적으로 예후가 좋지 않다. 3등급 신경교종은 악성 성상세포종(anaplastic astrocytoma), 악성 희돌기교세포(anaplastic oligodendroglioma), 악성 희돌기성상세포종(anaplastic oligoastrocytoma), 및 악성 뇌실막종(anaplastic ependymoma)을 포함한다. 교모세포종(glioblastoma)은 4등급 신경교종(glioma)이다. 발작은 3등급 신경교종 환자 중 절반 이상에서 발생하고 4등급 신경교종 환자 중 약 1/4에서 발생한다. 수막종(meningioma)은 뇌와 척수를 둘러싸는 막인 수막에서 발생하는 종양이다. 기술적으로는 뇌 안에 위치하지는 않지만 수막종은 인접한 뇌, 신경 및 혈관을 압축하거나 압박할 수 있다. 수막종은 두부 내에 형성되는 가장 흔한 유형의 종양이다. 대부분의 수막종은 느리게 성장한다. 발작은 수막종과 관련이 있다.
국소성 대뇌피질 형성이상은 대뇌피질의 발달 기형으로서, 소아 집단에서 의학적 불응성 간질의 흔한 원인이고 성인에서 의학적 난치성 발작의 흔한 원인이다. 국소성 대뇌피질 형성이상(FCD)은 3가지 유형과 추가 하위 유형으로 분류되어 왔다. I형은 전형적으로 측두엽과 관련이 있으며, 뉴런의 비정상적인 방사상 이주(FCD Ia형) 또는 미성숙 뉴런에 의한 대뇌피질의 전형적인 6층 연접 구조(tangential composition)의 파괴(FCD Ib형)로 인한 비정상적인 대뇌피질의 층화를 수반하거나, 구조적 비정상성, 대뇌피질의 방사상 및 접선 방향 층화 둘 다(FCD Ic형)를 수반하는 것으로 나타나는 기형이다. II형은 전두엽에서 흔히 발견되며, 대뇌피질 층화의 파괴 및 특이적 세포학적 이상(abnormality)에 기인하고, IIa형은 뉴런 이형성(풍선 세포 없음)이고 IIb형은 풍선 세포를 동반하는 뉴런 이형성이다. III형은 상이한 대뇌피질 탈층화(dislamination) 및 동일한 영역/엽 내의 주요 병변으로 인한 세포학적 이상과 관련된 기형이다. IIIa형은 해마 위축에 의한 측두엽에서의 대뇌피질 층 파괴이고, IIIb형은 신경절 종양이나 신경절신경의 종양(DNET, 신경절교종)에 근접하고, IIIc는 혈관 기형(예컨대, 혈관종, 뇌동정맥 기형, 모세혈관확장증 등)에 근접하고, IIId는 어린 나이에 발생한다(예: 트라우마, 허혈 또는 주산기 출혈, 감염성 또는 염증성 질환). Kabat 및 Krol의 Pol J Radiol, 2012, 77(2) 35-43을 참조한다. FCD는 뇌의 모든 부분에 관여할 수 있고, 크기와 위치가 다를 수 있으며, 다병소성(multifocal)일 수 있다. 발작은 FCD의 주요 증상이며, 가끔씩 정신 지체와 관련이 있고, 발작의 조기 발병과 특히 관련이 있다. 증상은 모든 연령에서 나타날 수 있는데, 대부분 아동기에 나타나지만 성인에게서 나타날 수도 있다. FCD와 관련된 발작은 내약성을 가질 수 있다.
신생혈관종은 대부분 양성의 국소성 기형이며, 기형이 발생한 조직의 신생물과 유사하다. 이들은 해당 부위에서 정상적으로 발견되는 조직 요소로 구성되지만, 무질서한 방식으로 성장한다. 신생혈관종은 뇌에서 발생할 수 있다. 결절성 경화증(TSC)은 다양한 장기에서 신생혈관종의 성장을 특징으로 하는 유전적 발작 장애이다. 이러한 장애를 가진 환자들은 뇌에서의 다수 병변으로 인해 높은 간질 발생률과 인지 문제를 나타낼 수 있다. TSC 병변(피질 결절)은 일반적으로 이형성 뉴런, 명백한 호산구 거대 세포 및 백질 변이를 함유한다. TSC와 연관된 발작은 난치성일 수 있다. 회백결절 과오종(tuber cinereum hamartoma)(시상하부 과오종(hypothalamic hamartoma)으로도 알려짐)은 무질서하게 뭉친 뉴런과 신경절이 시상하부의 회백결절에 축적되는 양성 종양이다. 증상으로는 비자발적으로 터지는 웃음과 이어지는 갑작스런 성마름(irritability)과 우울함을 특징으로 하는 장애인 웃음 발작(gelastic seizures)이 있다.
발작 장애를 치료하기 위해 사용되는 약물은 항간질제("AED")로서 지칭될 수 있다. 재발성 발작의 치료는 대개 적어도 하나의 AED를 주로 사용하는 데, 단일 요법이 듣지 않는 경우 제2 또는 제3 제제까지도 보조적으로 사용할 수 있다. Tolman 및 Faulkner의 문헌[Ther Clin Risk Manag. 2011; 7: 367-375]를 참조한다. 그러나, 간질 환자의 약 30% 내지 40%는 하나의 AED만을 사용함으로 인해 발작을 충분히 제어하지 못하고 있으며, 보조제의 사용을 필요로 한다. 전술한 바와 같이, 이러한 그룹의 하위 집합은 다수의 AED를 적당히 투여함에도 불구하고 규칙적이고 지속적인 발작 활성을 가질 것이다. 이러한 발작은 치료에 불응성인 것으로 간주된다. 전술한 바와 같이, 이에 따라, 발작 장애를 치료하기 위한 개선된 및/또는 추가적인 치료법에 대한 필요성이 남아있다.
마이크로RNA(miRNA)는 mRNA의 안정성 및 번역 모두에 영향을 미침으로써 다세포 기관에서 유전자 발현의 번역 후 조절에 관여하는 짧은(20~24 nt) 비-코딩 RNA이다. miRNA는 캡핑되고 폴리아데닐화된 일차 전사체(pri-miRNAs)의 일부로서 RNA 중합효소 II에 의해 전사되며, 단백질-코딩 또는 비-코딩일 수 있다. pri-miRNA는 전구체로 알려진 약 70 nt의 헤어핀 구조로 가공된다. Pre-miRNAs는 핵으로부터 세포질까지 운반되며, 여기서 이들은 RISC 로딩 복합체에 의해 약 22 bp의 이중 가닥 RNA로 가공된다. 성숙한 miRNA는 RNA-유발성 침묵화 복합체(RISC)로 통합되는데, 이는 miRNA와의 불완전한 염기 짝짓기를 통해 표적 mRNA를 인식하고 가장 흔하게는 표적 mRNA의 번역을 억제하거나 불안정하게 만든다.
마이크로RNA 101(MIR101, miR101, miRNA-101 또는 miRNA-101로도 지칭됨)은 암 세포주에서 EZH2의 발현 및 기능의 억제와 관련이 있는 것으로 확인되었다. Varambally 등의 문헌[Science 2008, 322: 1695-1699]을 참조한다. 2가지 miR-101 이소형이 있는데, 인간에게는 miR-101-1 및 miR-101-2가 있고, 마우스에게는 miR-101a와 miR-101b가 있다. Huang 등의 문헌[Journal of Biological Chemistry, 2017, 292, 16420-16439]을 참조한다. miR-101 이소형 모두는 하나의 염기 차이를 갖는 miR-101b를 제외하고는 동일한 성숙 서열을 갖는다. 전술한 바와 같이, 인간 miR101의 성숙 서열은 UACAGUACUGUGAUAACUGAA[서열 번호 1]이다. Lippi 등은 문헌[Neuron 2016, 92(6), 1337-1351]은 miR-101이 성체 설치류에서 자극적 활성을 제한하기 위해 다수의 출생 후 발달 프로그램을 동시에 조절한다는 것을 나타낸다. Lippi 등은 마우스 해마의 RNA 시퀀싱을 통해 miR-101a 및 miR-101b가 출생 후 12일 차에 고도로 발현된다는 것을 확인하였다. Lippi 등은 생애 초기의 일시적인 miR-101 억제로 인해 성체에서 과다 흥분성 신경망이 생성되는 것으로 상정한다. 비록 miR-101 억제가 자발적 발작성 이벤트를 닮은 자발적 고빈도의 돌발파(burst discharge)를 야기하였지만, Lippi 등은 신경망이 완전한 간질성 표현형을 나타내지 않는 것으로 결론을 내렸다.
마이크로RNA 128(MIR128, miR-128 또는 miRNA-128로도 지칭됨)은 각각 마우스 염색체 1과 9 또는 인간 염색체 2와 3에서 2개의 별개 유전자인 miR-128-1 및 miR-128-2에 의해 암호화된다. Tan 등의 문헌[Science 2013, 342(6163):1254-1258] 참조. 마이크로RNA 128-2(MIR128-2 또는 miR128-2로도 지칭됨)는 성체 마우스와 성인의 뇌에서 존재량이 가장 많고 가장 풍부한 miRNA 중 하나이다. 전술한 바와 같이, miR128의 성숙한 서열은 GGGGGCCGAUACACUGUACGAGA[서열 번호 2]이다. 마우스에서, 생식선 miR-128-2 결핍은 전뇌에서 miR-128 발현의 80%를 감소시키는 반면, miR-128-1 유전자를 절제해도 miR-128의 20%만이 제거된다. 전술한 바와 같이, Tan 등은, 마우스에서, 출생 후 뉴런에서 miR-128 발현의 감소는 운동 활성과 치명적인 간질을 증가시킨다는 것을 밝혀냈다. miR-128의 과발현은 마우스에서 뉴런의 반응성을 약화시키고, 운동 활성을 억제하며, 파키슨 유사 질환 및 발작과 관련된 운동 이상을 경감시킨다. 전술한 바와 같이,
혈액 뇌 장벽(BBB)은 혈류 중의 많은 화합물이 뇌의 조직 및 뇌액에 들어가는 것을 방지한다. BBB는 뇌-특이적 내피 세포에 의해 형성되며, 극성 분자 또는 단백질 및 펩티드와 같은 큰 분자가 뇌 간질(brain interstitium) 내로 통과하거나 이로부터 밖으로 통과하는 것을 제한하도록 신경혈관 유닛의 세포에 의해 지지된다. 그러나, BBB는 많은 치료 화합물이 뇌로 들어가는 것도 막는데, 이는 뇌의 병태 및 뇌질환의 효과적인 치료를 방해할 수 있다.
BBB를 통한 치료 약물의 운반을 보조하는 하나의 방법은 BBB에 초음파 에너지를 전달하는 것을 포함하는데, 초음파 에너지는 BBB를 "개방하여" 치료제가 뇌로 이동하는 것을 막는 BBB의 능력을 방해한다. 예를 들어, BBB를 통한 화합물의 이미지 유도된 초음파 전달에 관한 미국 특허 제5,752,515호를 참조한다. 일 양태에서, 초음파에 의해 유도된 중추 신경계(CNS) 조직 및/또는 유체에서의 변화는 가열 또는 공동현상(cavitation)에 의한 것이다. 가열 또는 공동화는 티슈에 손상을 줄 수 있고 치료적 이점을 위해 전달되는 화합물을 잠재적으로 분해시킬 수 있으므로, 이러한 가열 또는 공동화는 단점을 야기할 수 있다. 초음파는 또한 유기 화합물의 분해를 야기한다. 예를 들어, Bremner 등의 문헌[Current Organic Chemistry, 15(2): 168-177 (2011) ("Bremner 등")]을 참조한다. Bremner 등에 따르면, 수용액에 초음파로 조사하면, 물 속의 H-O 결합이 균형 분해되어 히드록실 라디칼과 수소 원자를 형성한다. 이 과정은 공동화의 결과로서, 이에 의해 내폭성 기포(imploding bubble) 내에서 매우 높은 온도와 압력이 생성된다. 전술한 바와 같이, 따라서, 치료용 화합물을 뇌까지 전달하거나 전달을 증가시키기 위해 BBB를 개방하려는 시도에 사용되는 초음파는 이들 화합물을 분해하고 치료적 치료와 방해하거나 차단할 수 있다.
발작 장애의 치료를 요하는 환자에게서 이를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 환자의 뇌 세포에서 마이크로RNA-101 분자의 수준을 증가시키는 조성물의 유효량을 환자에게 전달하는 단계를 포함한다. 발작 장애의 치료를 요하는 환자에게서 이를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 환자의 뇌 세포에서 마이크로RNA-128 분자의 수준을 증가시키는 조성물의 유효량을 환자에게 전달하는 단계를 포함한다. 발작 장애의 치료를 요하는 환자에게서 이를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 마이크로RNA-101, pri-miR101 또는 pre-miR101을 암호화하는 벡터를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 발작 장애의 치료를 요하는 환자에게서 이를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 마이크로RNA-128, pri-miR128 또는 pre-miR128을 암호화하는 벡터를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 구현예에서, 마이크로RNA-101 또는 마이크로RNA-128의 수준 증가는 발작 장애의 하나 이상의 증상을 개선시킨다.
구현예에서, 마이크로RNA-101, pri-miR101 또는 pre-miR101을 암호화하는 벡터는 발작 장애 환자에게서 마이크로RNA-101의 수준을 증가시키며, 발작 장애의 증상 감소와 관련이 있다. 구현예에서, 마이크로RNA-128, pri-miR128 또는 pre-miR128을 암호화하는 벡터는 발작 장애 환자에게서 마이크로RNA-128의 수준을 증가시키며, 발작 장애의 증상 감소와 관련이 있다.　
구현예에서, 마이크로RNA-101, pri-miR101 또는 pre-miR101을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터는 마이크로RNA-101, pri-miR101 또는 pre-miR101을 암호화하는 핵산에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 구현예에서, 벡터는 마멋 전사후 조절 요소(woodchuck post-transcriptional regulatory element, WPRE)를 포함한다. 구현예에서, 벡터는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열(BGHpA)을 포함한다. 구현예에서, 벡터는 형광 리포터 카세트를 포함한다. 구현예에서, 벡터는 아데노-관련 바이러스이다. 구현예에서, 벡터는 렌티바이러스이다. 구현예에서, 마이크로RNA-128, pri-miR128 또는 pre-miR128을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터는 마이크로RNA-128, pri-miR128 또는 pre-miR128을 암호화하는 핵산에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 구현예에서, 마이크로RNA-128을 암호화하는 핵산은 마이크로RNA-128-2이다. 구현예에서, 벡터는 마멋 전사후 조절 요소(woodchuck post-transcriptional regulatory element, WPRE)를 포함한다. 구현예에서, 벡터는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열(BGHpA)을 포함한다. 구현예에서, 벡터는 형광 리포터 카세트를 포함한다. 구현예에서, 벡터는 아데노-관련 바이러스이다. 구현예에서, 벡터는 렌티바이러스이다. 구현예에서, 벡터는 pAM/CBA-miR101-1-WPRE-BGHpA이다. 구현예에서, 벡터는 pAM/CBA-miR128-2-WPRE-BGHpA이다.
구현예에서, 벡터는 환자의 뇌 안의 표적 위치까지 전달된다. 구현예에서, 표적 위치는 전두엽, 측두엽, 후두엽 또는 두정엽이다. 구현예에서, 벡터의 투여 경로는 경구, 구강, 설하, 직장, 국소, 비강 내, 질 또는 비경구이다. 구현예에서, 벡터는 표적 위치까지 직접 투여된다.
구현예에서, 발작 장애는 국소성 발작을 특징으로 한다. 구현예에서, 발작 장애는 국소성 대뇌피질 형성이상이다. 구현예에서, 발작 장애는 간질, 전신성 긴장성-간대성 발작을 수반하는 간질, 근간대성 압상스를 수반하는 간질, 전두엽 간질, 측두엽 간질, 란다우-클레프너 증후군, 라스무센 증후군, 드라베 증후군, 두즈 증후군, CDKL5 장애, 영아 연축(웨스트 증후군), 소아 근간대성 간질(JME), 백신 관련 뇌병증, 난치성 유아기 간질(ICE), 레녹스-가스토 증후군(LGS), 레트 증후군, 오타하라 증후군, CDKL5 장애, 유아기 압상스 간질, 본태성 진전, 급성 반복 발작, 양성 롤란드 간질, 간질 지속증, 불응성 간질 지속증, 초불응성 간질 지속증(SRSE), PCDH19 소아과 간질, 뇌종양 유발성 발작, 과오종 유발성 발작, 약물 금단에 의한 발작, 알코올 금단에 의한 발작, 및 발작 활성의 증가 또는 돌발성 발작이다.
구현예에서, 초음파는 환자의 뇌 안의 표적 위치에 인가되어 표적 위치에서 환자의 뇌 혈액 장벽의 투과성을 향상시키며, 여기서 마이크로RNA-101 또는 마이크로RNA-128이 표적 위치까지 전달된다.
도 1은 pAM/CBA-miR101-1-WPRE-BGHpA의 플라스미드 맵이다.
도 2a, 2b, 2c 및 2d는 pAM/CBA-miR101-1-WPRE-BGHpA[서열번호 3]의 뉴클레오티드 서열을 도시한다.
도 3은 pCMV-MIR101-1의 플라스미드 맵이다.
도 4는 pAM_CBA-pl-WPRE-BGHpA의 플라스미드 맵이다.
도 5는 pAM/CBA-miR128-2-WPRE-BGHpA의 플라스미드 맵이다.
도 6a, 6b, 6c 및 6d는 pAM/CBA-miR128-2-WPRE-BGHpA[서열번호 4]의 뉴클레오티드 서열을 도시한다.
도 7은 pCMV-MIR128-2의 플라스미드 맵이다.
도 8은 AAVRec3[서열 번호 5]의 아미노산 서열을 도시한다.
발작 장애를 치료하기 위한 방법 및 조성물이 본원에서 제공되며, 상기 방법은 발작 장애 환자에게 마이크로RNA-101, pri-miR101 또는 pre-miR101을 투여하는 단계를 포함한다. 또한, 발작 장애를 치료하기 위한 방법 및 조성물이 본원에서 제공되며, 상기 방법은 발작 장애 환자에게 마이크로RNA-128, pri-miR128 또는 pre-miR128을 투여하는 단계를 포함한다. 구현예에서, 마이크로RNA-101, pri-miR101 또는 pre-miR101을 암호화하는 벡터가 제공된다. 구현예에서, 마이크로RNA-101, pri-miR101 또는 pre-miR101을 암호화하는 벡터가 발작 장애 환자에게 투여되며, 상기 환자는 발작 장애의 하나 이상의 증상에 있어서 개선을 나타낸다. 구현예에서, 마이크로RNA-128, pri-miR128 또는 pre-miR128을 암호화하는 벡터가 제공된다. 구현예에서, 마이크로RNA-128, pri-miR128 또는 pre-miR128을 암호화하는 벡터가 발작 장애 환자에게 투여되며, 상기 환자는 발작 장애의 하나 이상의 증상에 있어서 개선을 나타낸다. 구현예에서, 초음파는 환자의 뇌 안의 표적 위치에 인가되어 표적 위치에서 환자의 뇌 혈액 장벽의 투과성을 향상시키며, 여기서 마이크로RNA-101 또는 마이크로RNA-128이 표적 위치까지 전달된다.
마이크로RNA-101, pri-miR101, pre-miR101, 마이크로RNA-128, pri-miR128, 및/또는 pre-miR128은 본원에서 마이크로RNA(들)로서 통칭된다. 환자에게 마이크로RNA-101, pri-miR101, pre-miR101, 마이크로RNA-128, pri-miR128, 및/또는 pre-miR128을 투여하는 것은 본원에서 마이크로RNA 치료로서 통칭된다. 마이크로RNA 치료는 세포에서 활성 마이크로RNA 분자 각각의 수준을 증가시킨다. 이러한 증가는, 마이크로RNA를 세포에 직접적으로 제공함으로써 발생하거나, 마이크로RNA를 세포에 간접적으로, 예컨대 벡터를 통해 제공함으로써 발생할 수 있다. 마이크로RNA는 추가 서열을 또한 포함하는 RNA 또는 DNA 분자를 포함할 수 있다. 환자의 뇌 세포 안의 활성 마이크로RNA 분자 각각의 수준의 증가는 발작 장애의 하나 이상의 증상의 개선과 관련이 있다.
하나 이상의 pri-miRNA(들)가 본원에 기술된 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. 임의의 적합한 형태의 pri-mRNA가 사용될 수 있다. pri-mRNA(들)는 세포 내에서 가공될 수 있고, miRNA에 대한 기능을 얻도록, 예컨대 pre-mRNA(들)로 변환되고 이어서 성숙한 형태로 변환되도록 작용할 수 있다. 대안적으로, miRNA는 초기에 miRNA 전구체일 수 있다. 구현예에서, 조성물 및 방법은 pre-miRNA를 포함하는데, 이는 Dicer로 불리는 RN아제(RNAse) III형 이중 가닥 엔도뉴클레아제에에 의한 절단을 거쳐, 약 20~25 뉴클레오티드 크기의 불완전한 miRNA:miRNA* 이중구조(duplex)를 생성한다. 이러한 이중구조는 성숙한 miRNA 가닥 및 이와 반대되는 상보성 miRNA* 가닥을 함유한다. 하나 이상의 pre-miRNA(들)가 본원에 기술된 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. pre-miRNA는 miRNA에 대한 기능을 얻도록 작용할 수 있다. 임의의 적합한 형태의 pre-miRNA가 사용될 수 있다. 또한, 본원에서 기재된 조성물 및 방법의 miRNA는 성숙한 miRNA일 수 있는 것으로 여긴다.
마이크로RNA는 비-발현 벡터 또는 발현 벡터의 방식(modality)으로 세포에 전달될 수 있다. 발현 벡터 및 벡터는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 구현예에서, 마이크로RNA는 후속 단계에서 사용되기 전에 단리되거나 정제될 수 있다. 마아크로RNA는 세포 내로 도입되기 전에 단리되거나 정제될 수 있다. 세포 내로의 "도입(introduction)"은 발현 벡터 또는 이종 핵산을 세포 내로 도입하기 위한 공지된 형질감염 방법, 변환 방법, 감염 방법 및 기타 방법을 포함한다. 주형 핵산 또는 증폭 프라이머는 전사되거나 증폭되기 전에 단리되거나 정제될 수 있다. 단리 또는 정제는 핵산에 대해 당업자에게 공지된 다수의 방법에 의해 수행될 수 있다. 마이크로RNA의 전달은 여러 형태를 통해, 예컨대 바이러스 또는 비-바이러스 전달 용기 내에서 화학적으로 변형되었거나 변형되지 않는 RNA 모이어티의 캡슐화를 통해 일어날 수 있다. 비-발현 벡터 전달 방식은 뇌 세포에 대해 표적화될 수 있는 나노입자, 미세입자, 리포솜, 중합체, 미소구체 등을 포함한다. 마이크로RNA는 플라스미드 또는 미니벡터 기반의 발현 시스템으로서 전달될 수도 있고, 이어서 RNAi 기계에 의해 세포 내에서 발현되고 가공되어 성숙한 마이크로RNA를 형성한다.
miRNA 발현을 위한 핵산 작제물은 재조합적으로 생산될 수 있다. 이러한 발현 벡터가 본원에서 제공된다. 발현 벡터는 핵산 서열이 복제될 수 있는 세포 내로의 도입을 위해 핵산 서열이 삽입될 수 있는 담체 핵산이다. 발현 벡터는 플라스미드, 코스미드, 재조합 바이러스, 예컨대 아데노-연관 바이러스(AAV), 아데노바이러스, 레트로바이러스, 수두바이러스 및 당업계에 알려진 기타 바이러스(박테리오파지, 동물 바이러스, 및 식물 바이러스), 및 인공 염색체(예를 들어, YAC)를 포함한다. 당업자는 표준 재조합 기술을 통해 발현 벡터를 작제할 수 있는 장비를 잘 구비하고 있다. 구현예에서, 마이크로RNA를 갖는 발현 벡터가 환자의 세포에 전달된다. 핵산 분자는 치료적으로 유효한 수준이 달성될 수 있도록 이들이 흡수되고 유리하게 발현될 수 있는 형태로 환자의 세포에 전달된다.
본원에서의 마이크로RNA(들)를 뇌 안의 표적 위치에 전달하기 위해, 당업자에게 공지된 임의의 적절한 발현 벡터가 이용될 수 있다. 이렇게 전달될 때, 표적 위치에서의 뉴런이 마이크로RNA(들)로 형질감염되어, 환자의 뇌에서 이들 마이크로RNA(들)의 수준이 증가한다. 바이러스(예를 들어, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 렌티바이러스 및 아데노-연관 바이러스) 벡터의 형질도입이 체세포 유전자 요법에 사용될 수 있는데, 이는 특히 이들의 감염 효율이 높고 통합과 발현이 안정적이기 때문이다.
구현예에서, 발현 벡터는 안정한 통합 벡터 또는 안정한 비통합 벡터일 수 있다. 적절한 벡터의 예는 렌티바이러스 및 아데노-관련 바이러스(AAV)이다. 렌티바이러스는 레트로바이러스의 하위 부류이다. 렌티바이러스는 뉴런과 같은 비분열 세포의 게놈 내에 통합될 수 있다. 렌티바이러스는 고효율 감염, 이식유전자의 장기적인 안정적 발현 및 낮은 면역원성을 특징으로 한다. 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 마이크로RNA(들)를 뇌에 전달하는 데 사용될 수 있다.
AAV는 많은 세포 유형을 감염시키는 것으로 알려진 결함있는 파보바이러스이며, 인체에 대해서는 비병원성이다. AAV는 분열 세포와 비분열 세포 둘 다를 감염시킬 수 있다. 구현예에서, AAV 벡터는 본원에서 마이크로RNA(들)를 뇌에 전달하는 데 사용될 수 있다. 공지된 아데노-관련 바이러스(AAV) 중 어느 하나가 본원에서 이용될 수 있는데, 예를 들어, AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV8, AAV9 및 AAVRec3이 뉴런과 관련하여 이용될 수 있다. 추가의 적합한 AAV 혈청형(serotype)을 위형화(pseudotyping)를 통해, 즉 상이한 바이러스 혈청형 유래의 게놈과 캡시드를 혼합함으로써 개발하였다. 따라서, 예를 들어, AAV2/7은 혈청형 7에서 유래된 캡시드에 포장된 혈청형 2의 게놈을 함유하는 바이러스를 나타낸다. 다른 예는 AAV2/5, AAV2/8, AAV2/9 등이다. 3가지 비인간 영장류 AAV 혈청형 cy5, rh20 및 rh39 모두가 AAV8과 일치하는 캡시드 서열의 단편을 셔플링(shuffling)함으로써 혼성화 AAV 캡시드 혈청형 rec1, rec2, rec3 및 rec4를 생성하였다. Charbel 등의 문헌[PloS One. 2013 Apr 9;8(4):e60361]을 참조한다. 용어 rec3AAV 및 AAVRec3은 본원에서 상호 교환적으로 사용될 수 있다. AAVRec3의 아미노산 서열은 도 8에 도시되어 있다. 　 자기 상보성 아데노-연관 바이러스(scAAV) 또한 벡터로서 사용될 수 있다. AAV는 DNA의 단일 가닥을 포장하고 2번째 가닥 합성의 과정을 필요로 하는 반면, scAAV는 양 가닥 모두를 포장하는데, 포장된 가닥들은 함께 어닐링되어 이중 가닥 DNA를 형성한다. 2번째 가닥 합성을 생략함으로써, scAAV는 세포에서 신속한 발현을 가능하게 한다.
적절한 벡터는 당업자가 공지된 기술을 사용하여 작제할 수 있다. 마이크로RNA(들) 이외에, 프로모터 서열, 종결자 단편, 폴리아데닐화 서열, 마커 유전자 및 경우에 따라 다른 서열을 포함하는 적절한 조절 서열을 함유하는 적절한 벡터가 선택되거나 작제될 수 있다. 당업자는 프로모터 서열, 종결자 단편, 폴리아데닐화 서열, 마커 유전자 및 다른 적합한 서열을 포함하는 적절한 조절 서열에 익숙하다.
본원의 발현 벡터는, 코딩 서열 또는 ORF에 작동 가능하게 연결되어 표적화된 숙주 세포에서 코딩 서열 또는 ORF의 발현을 촉진하는 적절한 서열을 포함한다. "작동 가능하게 연결된(operably linked)" 서열은: 코딩 서열과 인접하는 프로모터와 같은 발현 조절 서열; 및 원하는 생성물의 발현을 조절하기 위해 트랜스에서 작용하거나 원위에서 작용하는 발현 조절 서열 둘 다를 포함한다.　
통상적으로, 벡터는 표적 세포 내에서 마이크로RNA(들)의 발현을 용이하게 하기 위한 프로모터를 포함한다. 프로모터는, 뇌에서 선택된 이식유전자의 발현을 유도할 수 있는 다수의 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터로부터 선택될 수 있다. 구성적 프로모터의 예는 CMV 급초기 인핸서/닭 베타-액틴(CBA) 프로모터-엑손 1-인트론 1 요소, RSV LTR 프로모터/인핸서, SV40 프로모터, CMV 프로모터, 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 프로모터, 및 포스포글리세롤 키나아제(PGK) 프로모터를 포함한다.　
특이성은, 예를 들어 조직 또는 영역 특이적 프로모터를 사용하여, 전적으로 수용체의 국소적 및 세포 유형 특이적 발현에 달성될 수 있다. 바이러스 유전자 프로모터 요소는 마이크로RNA(들)를 발현하는 세포의 유형을 결정하는 데 도움을 줄 수 있다. 일부 프로모터는 비특이적이지만(예: CAG, 합성 프로모터), 다른 프로모터는 뉴런 특이적이다. CAG 프로모터는 강한 합성 프로모터로서, 높은 수준의 발현을 유도하는데 사용될 수 있다. CAG 프로모터는: 1) 세포메갈로바이러스(CMV) 초기 인핸서 요소; 2) 닭 베타-액틴 유전자의 프로모터, 제1 엑손 및 제1 인트론; 및 3) 토끼 베타-글로빈 유전자의 스플라이스 수용체로 구성된다. 구현예에서 프로모터는 CAG 프로모터이다. 뉴런 특이적 프로모터는 특이적 뉴런 유형, 예를 들어, 다이노르핀(dynorphin), 엔케팔린(encephalin), 성상세포에 우선하는 GFAP(신경교 섬유질 산성 단백질), 또는 대뇌피질 글루타민성 세포에 우선하지만 피질하 GABAergic 세포를 표적으로 할 수도 있는 CamKIIa를 포함하거나(예: 시냅신; hSyn) 이들에 우선한다. 구현예에서, 프로모터는 CamkIIa(알파 CaM 키나아제 II 유전자) 프로모터이며, 이는 전뇌에서 발현을 유도할 수 있다. 다른 뉴런 세포 유형 특이적 프로모터는 NSE 프로모터, 티로신 히드록실라제 프로모터, 골수염기성 단백질 프로모터, 신경교 섬유질 산성 단백질 프로모터, 및 신경필라멘트 유전자(중, 중간, 경) 프로모터를 포함한다.
발현 조절 서열은 또한 적절한 전사 개시, 종결 및 인핸서 서열; 스플라이싱 신호 및 폴리아데닐화 신호와 같은 효율적인 RNA 가공 신호; 세포질 mRNA를 안정화하는 서열; 번역 효율을 향상시키는 서열(예를 들어, 코작 공통 서열); 핵산 또는 단백질 안정성을 향상시키는 서열; 및 원하는 경우, 생상물 가공 및/또는 분비를 증향상시키는 서열을 포함할 수 있다. 천연 및 비-천연, 구성적, 유도성 및/또는 조직-특이적 서열을 포함하여, 많은 다양한 발현 조절 서열이 당업계에 공지되어 있고, 원하는 발현의 유형에 따라 본원에서 사용될 수 있다.　
프로모터 이외에, 진핵 세포에 대한 발현 조절 서열은 전형적으로 면역글로불린 유전자, SV40, CMV 등으로부터 유래된 것과 같은 인핸서, 및 스플라이스 공여자 및 수용자 부위를 포함할 수 있는 폴리아데닐화 서열을 포함한다. 폴리아데닐화 서열은 일반적으로 코딩 서열에 대해서는 3'에, 3' ITR 서열에 대해서는 5'에 삽입된다. 본원의 벡터에 사용될 수 있는 polyA 신호의 예시적인 예는 polyA 서열(예를 들어, AATAAA, ATTAAA, 또는 AGTAAA), 소 성장 호르몬 polyA 서열(BGHpA), 토끼 베타-글로빈 polyA 서열(rßgpA), 또는 당업계에 공지된 또 다른 적합한 이종 또는 내인성 polyA 서열을 포함한다.　
본원에서 유용한 조절 서열은 프로모터/인핸서 서열과 코딩 서열 사이에 위치된 것과 같은 인트론을 또한 포함할 수 있다. 하나의 유용한 인트론 서열은 SV40으로부터 유래되며, SV40 T 인트론 서열로서 지칭된다. 또 다른 하나는 마멋 간염 바이러스 전사후 요소(WPRE)를 포함한다. WPRE는 전사될 때 발현을 향상시키는 삼차 구조를 생성하는 DNA 서열이다.
본원의 벡터는 리포터 유전자, 예를 들어 형광단을 암호화하는 것들을 포함할 수 있다. 형광단(fluorphore)은 여기될 때, 일반적으로 특정 주파수의 광을 재방출할 수 있는 형광 화합물이다. 이들은, 예를 들어, 단백질에 부착되어 단백질의 위치를 확인할 수 있게 하는 태그 또는 마커로서 사용될 수 있다. 많은 적합한 형광단이 당업계에 공지되어 있다. 이들은 이들이 방출하는 색상, 예를 들어 청색, 청녹색(cyan), 녹색, 황색, 오렌지색, 적색 등에 의해 분류될 수 있다. 예를 들어, mCherry, mRasberry, mTomato 및 mRuby는 적색 형광단 단백질이고; citrine, venus 및 EYFP는 황색 형광단 단백질이다. 녹색 형광 단백질(GFP)이 흔히 사용되는 형광단이다.
구현예에서, 발현 벡터는 pAM/CBA-miR101-1-WPRE-BGHpA이다. pAM/CBA-miR101-1-WPRE-BGHpA의 플라스미드 맵은 도 1에 도시되어 있다. 　 핵산 서열[서열번호 3]은 도 2a 내지 도 2d에 도시되어 있다. 　 표 1은 pAM/CBA-miR101-1-WPRE-BGHpA의 주석을 제공한다.
Figure pct00001
pAM/CBA-miR101-1-WPRE-BGHpA를 작제하기 위해, OriGene Technologies, Inc.,(9620 Medical Center Dr., Suite 200, Rockville, MD 20850 소재)에서 시판 중인 pCMV-MIR101-1 플라스미드(772 bp)(SC400013)에서 유래된 EcoRI - EcoRV 단편을 EcoRI+EcoRV로 절단된 pAM_CBA-pl-WPRE-BGHpA 벡터에 삽입한다. pCMV-MIR101-1의 플라스미드 맵은 도 3에 도시되어 있다. 　 pAM_CBA-pl-WPRE-BGHpA의 플라스미드 맵은 도 4에 도시되어 있다. 　
구현예에서, 발현 벡터는 pAM/CBA-miR128-2-WPRE-BGHpA이다. pAM/CBA-miR128-2-WPRE-BGHpA의 플라스미드 맵은 도 5에 도시되어 있다. 　 핵산 서열[서열번호 4]은 도 6a 내지 6d에 도시되어 있다. 　 표 2는 pAM/CBA-miR128-2-WPRE-BGHpA의 주석을 제공한다.
Figure pct00002
pAM/CBA-miR128-2-WPRE-BGHpA를 작제하기 위해, OriGene Technologies, Inc.,(9620 Medical Center Dr., Suite 200, Rockville, MD 20850 소재)에서 시판 중인 pCMV-MIR128-2 플라스미드(755 bp)(SC400112)에서 유래된 EcoRI - EcoRV 단편을 EcoRI+EcoRV로 절단된 pAM_CBA-pl-WPRE-BGHpA 벡터에 삽입한다. pCMV-MIR128-2의 플라스미드 맵은 도 7에 도시되어 있다. 　 pAM_CBA-pl-WPRE-BGHpA의 플라스미드 맵은 도 4에 도시되어 있다. 　
본원에 기술된 마이크로RNA는, 발현 벡터에 의해 전달되거나 비-발현 벡터 방식에 의해 전달되는지 여부에 상관없이 발작 장애를 치료하는 데 사용된다. 측두엽 간질(TLE)와 같은 복합적 부분 발작을 수반하는 것들을 포함하여, 발작 장애는 간질의 가장 불응성 형태 중 하나일 수 있다. 특정 경우에, 하나의 측두엽이 발작 기원 부위(간질원성 영역)로서 정의될 수 있고, 전방 해마를 포함하는 내측 측부엽이 본원의 방법에 따라 표적화될 수 있다. 발작 장애는 흥분성과 억제성(excitation to inhibition)의 불균형으로 인해 발생할 수 있다. 흥분성을 길항시키고 억제성을 강화하면 발작 장애의 적어도 하나의 증상을 개선할 수 있다.
발작 장애의 예에는 간질, 전신성 긴장성-간대성 발작을 수반하는 간질, 근간대성 압상스를 수반하는 간질, 전두엽 간질, 측두엽 간질, 란다우-클레프너 증후군, 라스무센 증후군, 드라베 증후군, 두즈 증후군, CDKL5 장애, 영아 연축(웨스트 증후군), 소아 근간대성 간질(JME), 백신 관련 뇌병증, 난치성 유아기 간질(ICE), 레녹스-가스토 증후군(LGS), 레트 증후군, 오타하라 증후군, CDKL5 장애, 유아기 압상스 간질, 본태성 진전, 급성 반복 발작, 양성 롤란드 간질, 간질 지속증, 불응성 간질 지속증, 초불응성 간질 지속증(SRSE), PCDH19 소아과 간질, 약물 금단 유도성 발작, 알코올 금단 유도성 발작, 발작 활성의 증가 또는 돌발성 발작(연속 발작 또는 군집 발작으로도 지칭됨)이 포함된다. 구현예에서, 발작 장애는 1형 나트륨 채널 단백질 서브유닛 알파(Scn1a) 관련 질환과 관련이 있다. 구현예에서, 발작 장애는 국소성 발작을 특징으로 한다. 구현예에서, 발작 장애는 국소성 대뇌피질 형성이상이다. 구현예에서, FCD는 I형 FCD이다. 구현예에서, FCD는 Ia형 FCD이다. 구현예에서, FCD는 Ib형 FCD이다. 구현예에서, FCD는 Ic형 FCD이다. 구현예에서, FCD는 II형 FCD이다. 구현예에서, FCD는 IIa형 FCD이다. 구현예에서, FCD는 IIb형 FCD이다. 구현예에서, FCD는 III형 FCD이다. 구현예에서, FCD는 IIIa형 FCD이다. 구현예에서, FCD는 IIIb형 FCD이다. 구현예에서, FCD는 IIIc형 FCD이다. 구현예에서, 발작 장애는 악성 성상세포종, 악성 희돌기 교세포종, 악성 희돌기 성상세포종, 및 악성 뇌실막종, 교모세포종, 또는 수막종을 포함하는 악성 저등급 및 고등급 교종인 신경절교종과 같은 뇌종양과 관련된 뇌종양 유도성 발작이다. 구현예에서, 발작 장애는 복합 결절성 경화증(TSC) 또는 회백결절 과오종과 같은 뇌 과오종과 관련된 과오종 유도성 발작이다.
구현예에서, 발작 장애는 간질 지속증(SE)이다. SE는 간질 발작이 5분 이상 지속되는 것, 또는 5분 이내에 2회 이상의 발작이 발생하고 발작과 발작 사이에 사람이 정상으로 돌아오지 않는 것을 특징으로 한다. SE는 치료가 지연되는 경우 사망으로 이어질 수 있는 위험한 병태일 수 있다. SE는 팔과 다리의 규칙적인 패턴의 신축을 동반하는 경련성이거나, 비교적 긴 지속시간 동안 사람의 의식 수준의 변화를 동반하지만 발작 활성으로 인한 사지의 큰 신축을 동반하지 않는 비경련성일 수 있다. 경련성 SE(CSE)는 (a) 긴장성-간대성 SE, (b) 긴장성 SE, (c) 간대성 SE 및 (d) 근간대성 SE로 추가로 분류될 수 있다. 비경련성 SE(NCSE)는 비정상적인 정신 상태, 불응증(unresponsiveness), 안구 운동 이상, 지속적인 뇌파상 발작(persistent electrographic seizure), 및 가능하게는 항경련제에 대한 반응을 특징으로 한다.
발작 장애의 증상은 운동 실조(ataxia), 보행 장애(gait impairment), 언어 장애(speech impairment), 발성(vocalization), 인지 손상(impaired cognition), 비정상적인 운동 활성(abnormal motor activity), 임상적 발작, 무임상 발작(subclinical seizure), 긴장 저하(hypotonia), 긴장 항진(hypertonia), 침흘림(drooling), 입 모양으로만 말하기(mouthing behavior), 전조(aura), 반복적인 움직임(repetitive movement), 웃음(laughing), 및 비정상적인 감각(unusual sensation)과 관련된 에피소드를 포함하되 이들로 한정되지는 않는다. 구현예에서, 제공된 방법 및 조성물은 하나 이상의 상이한 유형의 발작을 감소시키거나 방지할 수 있다. 일반적으로, 발작은 반복적인 움직임, 비정상적인 감각, 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 발작은 국소 발작(부분 발작으로도 지칭됨)과 전신성 발작으로 분류될 수 있다. 국소 발작(focal seizures)은 뇌의 일측에만 영향을 미치지만, 전신성 발작은 뇌의 양측 모두에 영향을 미친다. 국소 발작의 구체적인 유형에는 단순 국소 발작, 복합 국소 발작, 및 이차적 전신성 발작이 있다. 단순 국소 발작은 특정 엽(예를 들어, 측두엽, 전두엽, 두정엽, 또는 후두엽)에 한정되거나 집중될 수 있다. 복합 국소 발작은 일반적으로 단순 국소 발작보다 한쪽 반구의 더 넓은 부분에 영향을 미치지만, 흔히 측두엽이나 전두엽에서 기원한다. 국소 발작이 뇌의 일측(반구)에서 양측으로 확산될 때, 발작은 이차적 전신성 발작으로 지칭된다. 전신성 발작의 구체적인 유형에는 압상스(absence)(소발작(petit mal seizures)으로도 지칭됨), 긴장성 발작(tonic seizures), 무긴장성 발작(atonic seizures), 근간대성 발작(myoclonic seizures), 긴장성 간대성 발작(tonic clonic seizures)(대발작(grand mal seizures)으로도 지칭됨), 및 간대성 발작(clonic seizures)이 있다. 본원에서의 치료 방법은 전술한 증상 중 하나 이상을 개선하는 단계를 포함할 수 있다.
일단 환자에서 발작 장애와 관련된 비정상적인 전기 임펄스의 위치 또는 의심되는 위치가 결정되면, 본 개시에 따른 표적화 처리가 구현될 수 있다. 뇌에서 비정상적인 전기적 활성의 위치를 결정하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 본원에서, 뇌에서 비정상적인 전기적 활성를 나타내는 임의의 영역이 치료를 위해 표적화될 수 있지만, 발작 장애와 관련이 있는 것으로 알려져 있고 표적 치료를 받을 수 있는 뇌의 영역은 측두엽, 전두엽, 후두엽 및 두정엽을 포함하되 이들로 한정되지는 않는다. 예를 들어, 측두엽은 국소 간질 발작의 흔한 부위일 수 있다. 특정한 경우에, 측두엽에서 시작하는 발작은 뇌의 다른 부분까지 연장될 수 있다. 구현예에서, 치료를 위해 표적화될 수 있는 측두엽의 특정 영역은 해마, 청각 전정 피질(auditory-vestibular cortex), 내 측두엽, 및 편도체(amygdala)와 같은 변연계(limbic system)의 구조를 포함한다. 구현예에서, 후두엽의 특정 영역, 예를 들어, 일차 시각 피질이 또한 표적화될 수 있다. 구현예에 있어서, 두정엽의 특정 영역, 예를 들어 측방향 중심뒤 이랑(lateral postcentral gyrus)이 표적화될 수 있다. 구현예에서, 일차 체감각 피질(primary somatosensory cortex)의 위치가 표적화될 수 있다. 구현예에서, 전두엽의 특정 영역, 예를 들어, 운동 피질, 후각-미각 피질이 표적화될 수 있다. 구현예에서, 비정상적인 전기적 활성을 나타내는 것으로 확인된, 뇌의 큰 영역이 표적화될 수 있다. 특정한 경우에, 발작 장애의 징후는 뇌의 뇌의 특정 영역 내에서 시작하여 다른 영역으로 확산될 수 있다. 예를 들어, 발작 장애의 징후는 해마 또는 그 주변 구조 내에서 시작될 수 있다. 구현예에서, 비정상적인 전기적 활동의 기원 부위인 것으로 결정된 영역이 표적화될 수 있다.
뇌 안의 표적 위치에 물질을 직접적으로 투여하는 방법은 잘 알려져 있다. 예를 들어, 천두공과 같은 구멍을 두개골 내로 천공하고, 적절한 크기의 바늘을 사용해 벡터 또는 비-벡터 비히클을 표적 위치에 전달할 수 있다. 구현예에서, 표적 위치 근처에 있는 경막(dura matter)을 노출시키기 위해 두개골의 일부를 제거하고(개두술), 벡터 또는 비-벡터 비히클을 표적 위치에 직접 투여할 수 있다. 구현예에서, 벡터 또는 비-벡터 비히클은 주변 조직에 대한 손상을 최소화하면서 원하는 영역에 벡터 또는 비-벡터 비히클을 정확히 전달하기 위한 정위 좌표, 마이크로 피펫, 및 자동화 펌프를 사용해 두개 내 주입된다. 구현예에서, 뇌 안의 표적 영역에 마이크로RNA(들)를 함유하는 벡터 또는 비-벡터 비히클이 포함된 약학적 조성물을 전달하기 위해 마이크로펌프가 사용될 수 있다. 조성물은, 즉시 전달되거나 연장된 기간에 걸쳐, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10분 또는 그 이상에 걸쳐 전달될 수 있다. 뇌 안의 표적 위치에 벡터를 전달한 후 표적 위치에서 마이크로RNA(들)의 발현을 허용하기에 충분한 시간이 경과될 수 있다.
구현예에서, 본원의 벡터 또는 비벡터 전달 비히클은 전신에 투여될 수 있다. 전신 전달은 경구, 구강 내, 설하, 직장, 국소, 비강, 질 및 비경구 투여 방식을 포함한다. 비경구 투여 방식의 예는 정맥 내, 복강 내, 근육 내 및 피하 투여 모드를 포함한다. 구현예에서, 벡터 또는 비벡터 전달 비히클은 뇌 안의 표적 위치(들)와 접촉할 때까지 순환하게 되고, 표적 위치에서 예를 들어 망 형성을 돕도록 작용하고/하거나 뉴런 신호전달 망을 조절한다.
마이크로RNA(들)는 환자에서 발작 장애에 대해 효과적인 양으로 사용된다. 활성 성분의 투여량은 환자의 연령, 체중, 개별적인 상태, 개별적인 약동학 데이터, 및 투여 방식에 따라 달라진다. 체중이 약 70 kg인 인간 개체의 경우, 투여된 마이크로 RNA의 일일 투여량은 한 번 투여량 또는 여러 번 투여량으로서 체중 1 kg당 0.01 mg 내지 100 mg, 예를 들어 체중 1 kg당 0.1 mg 내지 50 mg, 체중 1 kg당 1 mg 내지 20 mg일 수 있다. 마이크로RNA(들)는 단독으로 사용되거나 다른 AED 약물과 조합하여 사용될 수 있다.
구현예에서, 혈액 뇌 장벽을 파괴하여 뇌 안의 표적 위치에 마이크로 RNA(들)의 전달을 향상시키기 위해 초음파에 의한 치료가 사용된다. 본원에서의 집속된 초음파 에너지를 사용하면 벡터, 비-벡터 전달 비히클, 마이크로RNA 및/또는 뇌 조직 자체에 악영향을 미치지 않으면서 BBB가 파괴된다. 이는 초음파 에너지에 의한 유기 화합물 및 조직에 대한 잠재적 손상을 고려하면 놀라운 것으로 간주될 수 있다. 본원에서의 초음파 에너지를 사용하면, 뇌 안의 표적 위치에 벡터, 비-벡터 전달 비히클 및/또는 마이크로RNA를 전달하는 속도를 증가시킬 수 있고, 뇌 안의 표적 위치에 벡터, 비-벡터 전달 비히클 및/또는 마이크로RNA(들)을 전달하는 것과 연관될 수 있는 부작용을 감소시킬 수 있고, 표적 위치에서 벡터, 비-벡터 전달 비히클 및/또는 마이크로RNA(들)를 집중시키면서 투여량을 감소시킬 수 있으며, 표적 위치에서 벡터, 비-벡터 전달 비히클 및/또는 마이크로RNA(들)의 양을 서방출시킬 수 있다.
본 개시에 따르면, 구현예에서, 초음파 에너지는 마이크로 RNA(들)를 운반하는 벡터가 뇌 안의 표적 위치까지 침투하는 것을 돕고/돕거나 촉진한다. 구현예에서, 본원에서의 벡터, 비-벡터 전달 비히클 및/또는 마이크로RNA(들)에 대해 혈액 뇌 장벽을 투과성으로 만들기 위해 초음파 에너지가 사용된다. 따라서, 구현예에서, 초음파 에너지는 벡터, 비-벡터 전달 비히클 및/또는 마이크로 RNA(들)의 투여 전에 표적 위치에 인가될 수 있다. 구현예에서, 본원에서의 벡터, 비-벡터 전달 비히클 및/또는 마이크로RNA(들)는 초음파 에너지의 투여와 동시에 뇌 안의 표적 영역에 투여될 수 있다. 구현예에서, 본원에서의 벡터, 비-벡터 전달 비히클 및/또는 마이크로RNA(들)는 초음파 에너지의 투여 이전에 뇌 안의 표적 영역에 투여될 수 있다.
전술한 바와 같이, 본원에서의 벡터, 비-벡터 전달 비히클, 및/또는 마이크로RNA(들)는 전신 투여될 수 있다. 이러한 방식으로, 혈류에서 순환하는 벡터, 비-벡터 전달 비히클 및/또는 마이크로RNA(들)는 초음파 에너지에 의해 파괴된 BBB의 일부분을 통해 뇌 안의 표적 위치에 전달된다. 구현예에서, 본원에서의 벡터, 비-벡터 전달 비히클 및/또는 마이크로RNA(들)는 표적 위치의 초음파 에너지 치료 후에 전신 투여될 수 있고, 벡터, 비-벡터 전달 비히클, 및/또는 마이크로RNA(들)는 파괴된 BBB를 투과하여 표적 위치에 놓일 수 있다. 구현예에서, 본원에서의 벡터, 비-벡터 전달 비히클 및/또는 마이크로RNA(들)는 뇌 안의 표적 위치에 직접적으로 투여될 수 있다. 구현예에서, 본원에서의 벡터, 비-벡터 전달 비히클 및/또는 마이크로RNA(들)는 표적 위치에 대한 초음파 에너지 치료 후에 뇌 안의 표적 위치에 직접적으로 투여되어 표적 위치에 놓일 수 있다. 구현예에서, 본원에서의 벡터, 비-벡터 전달 비히클 및/또는 마이크로RNA(들)는 초음파 치료 없이 뇌 안의 표적 위치에 직접적으로 투여될 수 있다.
구현예에서, 표적 위치 또는 그 근처에 있는 경막을 노출시키기 위해 두개골의 일부를 제거하고(개두술), 노출된 경막에 또는 그 아래에 초음파 에너지를 전달함으로써 초음파 에너지가 표적 영역에 투여될 수 있다. 구현예에서, 초음파 에너지는 두개골을 통해 표적 위치에 투여될 수 있어서, 표적 위치에 초음파 에너지를 전달하는 것과 관련된 외과적 수술이 필요하지 않을 수 있다. 두개골을 통해 초음파 에너지를 전달하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,752,515호 및 미국 공개 번호 제2009/0005711호를 참조하고, 이들 모두는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 또한, Hynynen 등의 문헌[NeuroImage 24 (2005) 12-120]을 참조한다.
구현예에서, 초음파 에너지는 약 20 kHz 내지 약 5 MHz 범위의 주파수로, 100나노초 내지 1분의 범위의 초음파 처리 지속 시간 동안 뇌 안의 표적 위치에 인가될 수 있다. 구현예에서, 초음파 에너지는, 약 20 kHz 내지 약 10 MHz 범위의 주파수로, 약 100나노초 내지 약 30분 범위의 초음파 처리 지속 시간 동안, 연속파 방식 또는 버스트 방식 작동으로 뇌 안의 표적 위치에 인가될 수 있고, 버스트 방식은 약 0.01 Hz에서 약 1 MHz까지 다양하게 반복된다. 구현예에서, 초음파 에너지는 약 200 kHz 내지 약 10 MHz 범위의 주파수로, 100밀리초 내지 약 30분 범위의 초음파 처리 지속 시간 동안 뇌 안의 표적 위치에 인가될 수 있다. 구현예에서, 초음파 에너지는 약 250 kHz 내지 약 10 MHz 범위의 주파수로, 0.10마이크로초 내지 약 30분 범위의 초음파 처리 지속 시간 동안 뇌 안의 표적 위치에 인가될 수 있다. 구현예에서, 초음파 에너지는 약 1.525 MHz의 주파수로 뇌 안의 표적 위치에 인가될 수 있다. 구현예에서, 초음파 에너지는 약 0.69 MHz의 주파수로 뇌 안의 표적 위치에 인가될 수 있다. 구현예에서, 초음파 에너지에 의해 발생된 압력 진폭은 약 0.5 내지 약 2.7 MPa일 수 있다. 구현예에서, 초음파 에너지에 의해 발생된 압력 진폭은 약 0.8 내지 약 1 MPa일 수 있다. 구현예에서, 초음파 에너지는 본원에서의 벡터, 비-벡터 전달 비히클 및/또는 마이크로RNA(들)가 전달될 조직 및/또는 유체의 부피에 부합하는, 예를 들어 약 0.1 mm3 내지 약 5 cm3의 크기를 갖는 국소 영역에서 뇌 안의 표적 위치에 인가된다.　
구현예에서, 표적 위치 및 이에 대한 접근은, 초음파 에너지를 표적 위치에 인가하기 전, 도중 또는 후에 환자에게 대비제(contrast agent)를 도입하고, 대비제가 BBB를 투과할 수 있는 충분한 시간을 허용하고, 대비제가 표적 위치에 존재하는지 여부를 결정함으로써 확인된다. 대조제는 잘 알려져 있고, 예를 들어 요오드계 화합물, 바륨계 화합물 및 란타나이드계 화합물을 포함한다. 요오드계 제제는, 예를 들어, 아이오헥솔(iohexol), 아이오프로미드(iopromide), 아이오딕사놀(iodixanol), 아이오시메놀(iosimenol), 아이옥사글레이트(ioxaglate), 아이오탈메이트(iothalamate) 및 아이오파미돌(iopamidol)을 포함한다. 바륨계 화합물은 황산바륨을 포함한다. 란타나이드계 화합물은, 예를 들어, 가돌리늄계 킬레이트제, 예컨대 가도베르세트아미드(gadoversetamide), 가도펜테테이트 디메글루민(gadopentetate dimeglumine), 가도부트롤(gadobutrol), 가도베네이트 디메글루민(gadobenate dimeglumine), 가도테레이트 메글루민(gadoterate meglumine) 및 가독세테이트 디소듐(gadoxetate disodium)을 포함한다. 검출 방식에는 2차원 X-선 방사선 촬영, X-선 컴퓨터 단층촬영 및 자기 공명 촬영이 포함되는데, 이들은 표적 위치에서 대조제의 존재 여부를 확인하는 데 활용될 수 있는 잘 알려진 기술이다.
본 개시에 따르면, 마이크로RNA 치료는 환자에게 투여 후 1시간을 초과하는 동안 발작 장애의 하나 이상의 증상을 개선한다. 구현예에서, 마이크로RNA 치료는 환자에게 투여 후 2시간을 초과하는 동안 장애의 하나 이상의 증상을 개선한다. 구현예에서, 마이크로RNA 치료는 환자에게 투여 후 3시간을 초과하는 동안 장애의 하나 이상의 증상을 개선한다. 구현예에서, 마이크로RNA 치료는 환자에게 투여 후 4시간을 초과하는 동안 장애의 하나 이상의 증상을 개선한다. 구현예에서, 마이크로RNA 치료는 환자에게 투여 후 6시간을 초과하는 동안 장애의 하나 이상의 증상을 개선한다. 구현예에서, 마이크로RNA 치료는 환자에게 투여 후 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 또는 24시간을 초과하는 동안 장애의 하나 이상의 증상을 개선한다. 구현예에서, 환자에게 투여 후 12시간 동안 적어도 하나의 증상의 개선이 본 개시에 따라 제공된다. 구현예에서, 마이크로RNA 치료는 환자의 다음 날의 기능을 개선시킨다. 예를 들어, 마이크로RNA는, 투여 후 야간 수면에서 깨어난 후, 예를 들어, 약 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 10시간, 12시간, 14시간, 16시간, 18시간, 20시간, 22시간, 또는 24시간 동안 장애의 하나 이상의 증상을 개선할 수 있다.
구현예에서, 발작 장애를 치료하는 방법이 본원에서 제공되며, 상기 방법은 임박한 발작의 경고 신호가 검출된 후 발작 장애의 치료를 필요로 하는 환자에게 마이크로RNA를 투여하여 발작 활성을 감소시키거나 예방하는 단계를 포함한다.
구현예에서, 본원에 기술된 방법은 발작 장애의 하나 이상의 다른 임상적 증상을 감소, 지연 또는 예방하는데 효과적이다. 예를 들어, 특정 증상, 약리학적 또는 생리학적 지표에 대해 뇌의 표적 위치에서 마이크로RNA(이의 전달은 초음파 에너지에 의해 선택적으로 개선됨)로 치료 중인 환자에서의 효과를 미치료 환자 또는 환자의 치료 전 상태와 비교할 수 있다. 구현예에서, 증상, 약리학적 및/또는 생리학적 지표는 환자에게서 치료 전에 측정되고, 치료 개시 후 1회 이상 다시 측정된다. 구현예에서, 대조군은 치료 대상 질병이나 병태가 없는 하나 이상의 환자(예: 건강한 환자)에서 증상, 약리학적 또는 생리학적 지표를 측정한 것을 기준으로 결정한 기준 수준, 또는 평균이다. 구현예에서, 치료 전 뇌 조직에서의 miR-101 및/또는 miR-128의 양을 치료 후 뇌 조직에서의 miR-101 및/또는 miR-128의 양과 비교한다. 구현예에서, 치료의 효과를 당업자의 범위 내에 있는 종래의 치료법과 비교한다.
본원에서의 발작 장애(예: 난치성 국소성 발작, 국소성 대뇌피질 형성이상, 간질 지속증 등)의 효과적인 치료는 일정 기간 후 베이스라인 대비 증상의 빈도 또는 중증도에 있어서 (예: 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 초과의) 감소를 보임으로써 달성된다. 예를 들어, 1개월의 베이스라인 기간 후, 2개월의 이중 맹검 기간 동안 마이크로RNA 치료를 받는 환자를 표준 요법에 대한 부가 요법으로서 위약을 무작위로 배정할 수 있다. 일차 측정 결과는 마이크로RNA 및 위약에 대한 반응자의 백분율을 포함할 수 있으며, 상기 반응자는 이중 맹검의 2차 월에 베이스라인과 비교했을 때 증상의 적어도 10% 내지 50%의 감소를 경험한 환자로서 정의된다.
구현예에서, 벡터, 비-벡터 전달 비히클, 및/또는 마이크로RNA(들)를 함유하는 약학적 조성물로서, 종래의 방출 프로파일 또는 변형된 방출 프로파일을 가진 조성물이 제공된다. 약학적 조성물은 안전하고 효과적인 것으로 간주되는 물질로 구성된 약학적으로 허용 가능한 "담체"를 사용해 제조될 수 있다. "담체"는 활성 물질 또는 성분 이외의 약학적 제형에 존재하는 모든 성분을 포함한다. 활성 물질의 예는 마이크로RNA(들), 마이크로 RNA(들)를 함유하는 발현 벡터 및 AED를 포함한다. 용어 "담체"는 희석제, 결합제, 윤활제, 붕해제, 충전제 및 코팅 조성물을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다. 당업자는 이러한 약학적 담체 및 이러한 담체를 사용해 약학적 조성물을 화합하는 방법에 익숙하다.
구현예에서, 벡터, 비-벡터 전달 비히클 및/또는 마이크로RNA를 함유하는 약학적 조성물은, 예를 들어, 근육 내(i.m.), 정맥 내(i.v.), 피하(s.c.), 복강 내(i.p.) 또는 경막 내(i.t.) 투여를 포함하는 비경구 투여에 적합하다. 비경구 조성물은 주사, 주입 또는 이식에 의해 체내에 투여하기 위해 멸균되어야 하며, 단일 투여량 또는 다중 투여량 용기에 포장될 수 있다. 구현예에서, 환자에 대한 비경구 투여용 액체 약학적 조성물은 활성 물질, 예를 들어, 벡터, 비-벡터 전달 비히클 및/또는 마이크로RNA(들)을 전술한 각각의 양 중 어느 하나로 포함한다. 구현예에서, 비경구 투여용 약학적 조성물은 예를 들어, 약 0.1 ml, 0.25 ml, 0.5 ml, 0.75 ml, 1 ml, 1.25 ml, 1.5 ml, 1.75 ml, 2 ml, 2.25 ml, 2.5 ml, 2.75 ml, 3 ml, 3.25 ml, 3.5 ml, 3.75 ml, 4 ml,4.25 ml, 4.5 ml, 4.75 ml, 5 ml, 10 ml, 20 ml, 25 ml, 50 ml, 100 ml, 200 ml, 250 ml, 또는 500 ml의 총 부피로서 제형화된다. 구현예에서, 발현 벡터를 함유하는 약학적 조성물의 부피는 마이크로리터 양이다. 예를 들어, 0.1 μL 내지 10 μL 이상이 주입할 수 있다. 예를 들어, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.25, 1.5, 1.75, 2.0, 2.25, 2.5, 2.75, 3.0, 3.25, 3.5, 3.75, 4.0, 4.25, 4.5, 4.75, 5.0, 5.25, 5.5, 5.75, 6.0, 6.25, 6.5, 6.75, 7.0, 8.25, 8.5, 8.75, 9.0, 9.25, 9.5, 9.75, 또는 10마이크로리터가 주입될 수 있다. 구현예에서, 조성물은 마이크로피펫, 백, 유리 바이알, 플라스틱 바이알 또는 병에 담긴다.
구현예에서, 비경구 투여용 약학적 조성물은 전술한 각각의 양을 포함한다. 구현예에서, 비경구 투여용 약학적 조성물은 약 0.0001 mg 내지 약 500 mg의 활성 물질, 예를 들어, 벡터, 비-벡터 전달 비히클, 및/또는 마이크로RNA(들)를 포함한다. 구현예에서, 환자에 대한 비경구 투여용 약학적 조성물은 활성 물질, 예를 들어, 벡터, 비-벡터 전달 비히클, 및/또는 마이크로RNA(들)를 약 0.001 mg/ml 내지 약 500 mg/ml의 농도로 각각 포함한다. 구현예에서, 비경구 투여용 약학적 조성물은 활성 물질을, 예를 들어, 약 0.005 mg/ml 내지 약 50 mg/ml, 약 0.01 mg/ml 내지 약 50 mg/ml, 약 0.1 mg/ml 내지 약 10 mg/ml, 약 0.05 mg/ml 내지 약 25 mg/ml, 약 0.05 mg/ml 내지 약 10 mg/ml, 약 0.05 mg/ml 내지 약 5 mg/ml, 또는 약 0.05 mg/ml 내지 약 1 mg/ml의 농도로 각각 포함한다. 구현예에서, 비경구 투여용 약학적 조성물은 활성 물질을, 예를 들어, 약 0.05 mg/ml 내지 약 15 mg/ml, 약 0.5 mg/ml 내지 약 10 mg/ml, 약 0.25 mg/ml 내지 약 5 mg/ml, 약 0.5 mg/ml 내지 약 7 mg/ml, 약 1 mg/ml 내지 약 10 mg/ml, 약 5 mg/ml 내지 약 10 mg/ml, 또는 약 5 mg/ml 내지 약 15 mg/ml의 농도로 각각 포함한다.
구현예에서, 비경구 투여용 약학적 조성물이 제공되며, 여기서 약학적 조성물은 적어도 6개월 동안 안정적이다. 구현예에서, 비경구 투여용 약학적 조성물은 적어도 예를 들어, 적어도 3 내지 6개월 동안 약 5% 이하로 활성 물질의 감소를 나타낸다. 구현예에서, 벡터 또는 비-벡터 비히클의 양은, 예를 들어, 약 2.5%, 1%, 0.5% 또는 0.1% 이하로 분해된다. 구현예에서, 분해는 적어도 6개월 동안 예를 들어, 약 5%, 2.5%, 1%, 0.5%, 0.25%, 0.1% 미만이다.
구현예에서, 비경구 투여용 약학적 조성물이 제공되며, 여기서 약제학적 조성물은 가용성이다. 구현예에서, 비경구 투여용 약학적 조성물이 제공되며, 이들은 안정하고, 가용성이고, 국소 부위에 사용할 수 있고/있거나 즉시 사용 가능하다. 구현예에서, 본원의 약학적 조성물은 이를 필요로 하는 환자에게 직접 투여하기 위해 즉시 사용 가능하다.
본원에서 제공되는 비경구 투여용 약학적 조성물은 하나 이상의 부형제, 예를 들어, 용매, 용해도 증강제, 현탁제, 완충제, 등장화제, 안정화제 또는 항균 보존제를 포함할 수 있다. 비경구 조성물의 부형제가 사용될 때, 이들은 조성물에 사용된 벡터, 비-벡터 전달 비히클, 및/또는 마이크로RNA(들)의 안정성, 생체이용률, 안전성, 및/또는 효능에 악영향을 미치지 않을 것이다. 따라서, 투여량 형태의 임의의 성분들 간에 부적합성이 없는 비경구 조성물이 제공된다.
구현예에서, 벡터, 비-벡터 전달 비히클 및/또는 마이크로RNA를 포함하는 비경구 조성물은 적어도 하나의 부형제의 안정화량을 포함한다. 예를 들어, 부형제는 완충제, 가용화제, 등장화제, 항산화제, 킬레이트제, 항균제 및 보존제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 당업자는 부형제가 두 가지 이상의 기능을 가질 수 있고 하나 이상의 정의된 그룹으로 분류될 수 있음을 이해할 것이다.
구현예에서, 비경구 조성물은 벡터, 비-벡터 전달 비히클 및/또는 마이크로RNA(들) 및 부형제를 포함하며, 부형제는 예를 들어, 약 10%, 5%, 2.5%, 1%, 또는 0.5% 미만의 중량%(w/v)로 존재한다. 구현예에서, 부형제는 예를 들어, 약 1.0% 내지 10%, 10% 내지 25%, 15% 내지 35%, 0.5% 내지 5%, 0.001% 내지 1%, 0.01% 내지 1%, 0.1% 내지 1%, 또는 0.5% 내지 1%의 중량%로 존재한다. 구현예에서, 부형제는 예를 들어, 약 0.001% 내지 1%, 0.01% 내지 1%, 1.0% 내지 5%, 10% 내지 15%, 또는 1% 내지 15%의 중량%로 존재한다.
구현예에서, 비경구 조성물은 필요 시, 예를 들어 1일 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회 또는 그 이상 투여되거나, 환자의 필요에 따라 연속 투여될 수 있다.
구현예에서, 활성 물질의 비경구 조성물이 제공되며, 여기서 조성물의 pH는 약 4.0 내지 약 8.0이다. 구현예에서, 조성물의 pH는, 예를 들어, 약 5.0 내지 약 8.0, 약 6.0 내지 약 8.0, 약 6.5 내지 약 8.0이다. 구현예에서, 조성물의 pH는, 예를 들어, 약 6.5 내지 약 7.5, 약 7.0 내지 약 7.8, 약 7.2 내지 약 7.8, 또는 약 7.3 내지 약 7.6이다. 구현예에서, 수용액의 pH는, 예를 들어, 약 6.8, 약 7.0, 약 7.2, 약 7.4, 약 7.6, 약 7.7, 약 7.8, 약 8.0, 약 8.2, 약 8.4, 또는 약 8.6이다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본원의 개시가 속하는 기술분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약(about)" 또는 "대략(about)"은 당업자에 의해 결정되었을 때 특정 값에 대한 허용 가능한 오류 범위 내에 있음을 의미하며, 이는 값이 측정 또는 결정되는 방법, 즉 측정 시스템의 한계에 따라 부분적으로 달라지게 된다. 예를 들어, "약"은 당 업계의 관행에 따라 3개 이상의 표준 편차 이내에 있음을 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 최대 20%, 최대 10%, 최대 5%, 및/또는 최대 1%까지의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 공정과 관련하여, 상기 용어는 값의 10배 이내, 바람직하게는 5배 이내, 더 바람직하게는 2배 이내에 있음을 의미할 수 있다.
"개선(improvement)"은 전술한 장애의 적어도 하나의 증상과 관련해 측정했을 때, 국소성 간질, 난치성 국소성 간질, 국소성 대뇌피질 형성이상, 간질, 전신성 긴장성-간대성 발작을 수반하는 간질, 근간대성 압상스를 수반하는 간질, 전두엽 간질, 측두엽 간질, 란다우-클레프너 증후군, 라스무센 증후군, 드라베 증후군, 두즈 증후군, CDKL5 장애, 영아 연축(웨스트 증후군), 소아 근간대성 간질(JME), 백신 관련 뇌병증, 난치성 유아기 간질(ICE), 레녹스-가스토 증후군(LGS), 레트 증후군, 오타하라 증후군, CDKL5 장애, 유아기 압상스 간질, 본태성 진전, 급성 반복 발작, 양성 롤란드 간질, 간질 지속증, 불응성 간질 지속증, 초불응성 간질 지속증(SRSE), PCDH19 소아과 간질, 뇌종양 유발성 발작, 과오종 유발성 발작, 약물 금단에 의한 발작, 알코올 금단에 의한 발작, 및 발작 활성의 증가 또는 돌발성 발작과 같은 발작 장애의 치료를 지칭한다.
"다음 날의 기능 개선(improvement in next day functioning)" 또는 "다음 날의 기능에 개선이 있는(wherein there is improvement in next day functioning)"은 야간 수면 기간으로부터 깨어난 후의 개선을 지칭하며, 여기서 환자에 대한 마이크로RNA 요법 튜여의 유익한 효과는 본원에서의 증후군 또는 장애의 적어도 하나의 증상에 적용되고, 예를 들어, 깨어난 후 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 12시간, 또는 24시간 등의 기간 동안 환자에 의해 주관적으로 또는 관찰자에 의해 객관적으로 식별 가능하다.
"치료(treating, treatment 또는 treat)"는, 질환이나 병태에 걸렸거나 이에 취약할 수 있지만 아직 질환이나 병태의 임상 증상 또는 무임상 증상을 경험하지 않았거나 드러내지 않는 환자에서 질환이나 병태의 임상 증상이 출현하는 것을 경감 또는 지연시키는 것을 지칭할 수 있다. 특정 구현예에서, "치료(treating, treatment 또는 treat)"는, 질환이나 병태에 걸렸거나 이에 취약할 수 있지만 아직 질환이나 병태의 임상 증상 또는 무임상 증상을 경험하지 않았거나 드러내지 않는 환자에서 질환이나 병태의 임상 증상이 출현하는 것을 예방하는 것을 지칭할 수 있다. "치료(treating, treat 또는 treatment)"는 질환이나 병태를 억제하는 것, 예를 들어, 질환이나 병태, 또는 이의 적어도 한 가지 임상 증상 또는 무임상 증상이 발생하는 것을 저지하거나 감소시키는 것을 또한 지칭한다. 추가로, "치료(treating, treat 또는 treatment)"는 질환이나 병태를 완화시키는 것, 예를 들어, 질병이나 병태, 또는 이의 적어도 한 가지 임상 증상 또는 무임상 증상의 퇴행을 유도하는 것을 지칭한다. 치료 대상 환자에 대한 이점은 통계학적으로 유의미하거나, 수학적으로 유의미하거나, 환자 및/또는 의사에게 적어도 인지될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 예방적(예방) 치료 및 치료(치유) 치료는 본원 개시의 2개의 개별적인 구현예이다.
"약학적으로 허용 가능한(pharmaceutically acceptable)"은 "일반적으로 안전한 것으로 간주되는" 분자 엔티티 및 조성물, 예를 들어, 인간에게 투여되었을 때, 생리학적으로 견딜 수 있고 알레르기 반응 또는 이와 유사한 바람직하지 않은 반응, 예컨대 배탈 등을 생성하지 않는 분자 엔티티 및 조성물을 지칭한다. 구현예에서, 본 용어는 연방 식품, 의약 및 화장품법 제204조 및 제409조에 따른 GRAS 목록으로서 연방 규제 기관 또는 주정부에 의해 승인된 분자 엔티티 및 조성물을 지칭하며, 동물 및 보다 구체적으로는 인간에서 사용하기 위해 FDA 또는 유사 목록, 미국 약전, 또는 일반적으로 인정되는 또 다른 약전에 의해 시판 전 검토 및 승인의 대상이 되는 분자 엔티티 및 조성물을 지칭한다.
"유효량" 또는 "치료적 유효량"은 치료 중인 증후군, 장애, 질환 또는 병태의 하나 이상의 증상을 완화시키거나, 달리 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 제공하기에 충분한 투여량을 의미할 수 있다. "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 본원에서 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
"공동 투여(co-administered with)", "조합으로 투여(administered in combination with)", "조합" 또는 "함께 투여"는 상호 교환적으로 사용될 수 있며, 치료 과정에서 둘 이상의 제제가 투여됨을 의미한다. 제제는 동시에 투여되거나 이격된 간격으로 별도로 투여될 수 있다. 제제는 단일 투여 형태로 또는 별도의 투여량 형태로 투여될 수 있다.
"이를 필요로 하는 환자(patient in need thereof)"는 간질, 전신성 긴장성-간대성 발작을 수반하는 간질, 근간대성 압상스를 수반하는 간질, 국소성 간질, 난치성 국소성 간질, 국소성 대뇌피질 형성이상, 전두엽 간질, 측두엽 간질, 란다우-클레프너 증후군, 라스무센 증후군, 드라베 증후군, 두즈 증후군, CDKL5 장애, 영아 연축(웨스트 증후군), 소아 근간대성 간질(JME), 백신 관련 뇌병증, 난치성 유아기 간질(ICE), 레녹스-가스토 증후군(LGS), 레트 증후군, 오타하라 증후군, CDKL5 장애, 유아기 압상스 간질, 본태성 진전, 급성 반복 발작, 양성 롤란드 간질, 간질 지속증, 불응성 간질 지속증, 초불응성 간질 지속증(SRSE), PCDH19 소아과 간질, 뇌종양 유발성 발작, 과오종 유발성 발작, 약물 금단에 의한 발작, 알코올 금단에 의한 발작, 및 발작 활성의 증가 또는 돌발성 발작(연속 발작 또는 군집 발작으로 지칭됨)과 같은 발작 장애로 진단된 개체, 예를 들어, 인간, 갯과, 고양잇과, 돼지, 설치류 등과 같은 포유동물을 포함한다. 발작 장애는 1형 나트륨 채널 단백질 서브유닛 알파(Scn1a) 관련 질환과 관련이 있을 수 있다. 상기 방법은, 예를 들어, 환자가 신생아, 영아, 소아 환자(6개월 내지 12세), 청소년 환자(12~18세) 또는 성인(18세 이상)인 경우를 포함하여, 임의의 개체에게 제공될 수 있다. 환자는 포유동물을 포함한다.
"프로드러그(prodrug)"는 비활성인 (또는 상당히 덜 활성인) 형태로 환자에게 투여되는 약리학적 물질(약물)을 지칭한다. 일단 투여되면, 프로드러그는 체내에서(생체 내에서) 원하는 약리학적 활성을 갖는 화합물로 대사된다.
"유사체" 및 "유도체"는 상호 교환적으로 사용될 수 있으며, 부모 화합물과 동일한 코어를 보유하지만, 결합 순서, 하나 이상의 원자 및/또는 원자 그룹의 존재 여부, 및 이들의 조합에 있어서 부모 화합물과 상이할 수 있는 화합물을 지칭한다. 거울상 이성질체는 유도체의 예이다. 유도체는, 예를 들어, 코어 상에 존재하는 하나 이상의 치환기에 있어서 부모 화합물과 다를 수 있으며, 이에는 하나 이상의 원자, 작용기, 또는 하위 구조가 포함될 수 있다. 일반적으로, 유도체는 화학적 및/또는 물리적 과정을 거쳐 부모 화합물로부터 형성되는 것으로 적어도 이론적으로 상상할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용 가능한 염"은 본원에서 정의된 화합물의 유도체를 지칭하며, 여기서 부모 화합물은 이들의 산염 또는 염기염을 만드는 것에 의해 변형된다. 약학적으로 허용 가능한 염의 예로는 무기 염기를 갖는 비독성 염기 부가염을 들 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 알칼리 및 알칼라인 토금속 염기와 같은 적합한 무기 염기는 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등과 같은 금속 양이온을 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 염은 종래의 화학적 방법에 의해 부모 화합물로부터 합성될 수 있다.
실시예
본원에서 제공된 실시예는 본원 개시를 보강하기 위한 목적으로만 포함되며, 어떠한 경우에도 한정하는 것으로 간주되어서는 안된다.
실시예 1
후술하는 바와 같은 Hu-pri-miR 서열은 AAV pAM-플라스미드 백본으로 클로닝된다. 각각의 플라스미드는 시퀀싱 및 제한 분해에 의해 검증될 것이다.
1. pAM-CBA-hu-pri-miR128-2-WPRE-bGH
2. pAM-CBA-hu-pri-miR101-WPRE-bGH
3. pAM-CBA-sc-hu-pri-miR128-2-GFP-WPRE-bGH
GFP 리포터를 발현하는 플라스미드는, 마우스 뇌에 주입 후 miR 발현의 생체 내 확산 분석을 용이하게 한다.
위의 플라스미드 1~3 및 pAM-공(empty) 플라스미드는 AAVRec3 벡터(약 300 μl AAV 벡터; >1 x 1012 vg/mL)에 포장되고, 표준 아이오딕사놀 정제법을 사용해 정제된다. AAV 벡터 모액의 순도는 표준 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색 방법에 의해 확인될 것이다. AAV 벡터 역가는 정량적 RT-PCR에 의해 결정될 것이다.
연구 1: AAV 벡터 투여량의 최적화
AAV miR-128-2-GFP 및 AAV miR128-2 벡터를 2벡터의 투여량으로 마우스 뇌에 주입한다(벡터 당 n=4마리, 2 투여량) (GFP와 상승적 독성 효과가 있는 경우, miR128-2 만이 포함됨). 표준화된 실험실 방법을 사용하여 이식 유전자 발현 분석(GFP의 경우)과 확산, 및 독성에 대한 임의의 증거(GFAP, Cd11b, NeuN IHC, 플루오로제이드)를 분석하기 위해, 벡터 주입 후 4주차에 뇌를 채취한다.
연구 2: AAV 벡터 투여량의 최적화
AAV miR-101-1-GFP 및 AAV miR101-1 벡터를 2벡터의 투여량으로 마우스 뇌에 주입한다(벡터 당 n=4마리, 2 투여량) (GFP와 상승적 독성 효과가 있는 경우, miR101-1 만이 포함됨). 표준화된 실험실 방법을 사용하여 이식 유전자 발현 분석(GFP의 경우)과 확산, 및 독성에 대한 임의의 증거(GFAP, Cd11b, NeuN IHC, 플루오로제이드)를 분석하기 위해, 벡터 주입 후 4주차에 뇌를 채취한다.
연구 3:
다음의 치료군을 생성한다. 분석을 위해 벡터 주입 후 3~4주차에 뇌를 채취한다.
치료군:
AAV-miR128-2
AAV-miR101
AAV-miR128-2/miR101
동물군 크기: 벡터 당 n=8마리.
분석:
- 독성 - NeuN IHC, 플루오로제이드 염색.
- RT-qPCR/디지털 적가 PCR에 의해 결정된 표적 유전자의 발현에 대한 효과. 이들 표적에 대한 항체를 이용할 수 있는 경우, 가능하면 웨스턴 블롯 및/또는 IHC 방법을 수행한다.
- miR-128-2 표적
o slc6a1 (EAAT3), TARPP, Pea15a, ERK1/2 활성화 - 선조 샘플(striatal samples).
- miR-101 표적
o NKCC1, Ank2, Kif1a (시냅틱 전), Abca1, Ndrg2 (신경교), xCT, PMCA2
실시예 2
마우스 발작 모델에서 마이크로RNA 치료의 전향적 효능 평가
1일차에, 이소플루란 마취 하에 마우스 50마리의 해마 내에 카인산(KA, 200 ng/nl)을 주입한다. 21일차에, AAVRec3- pAM/CBA-miR101-1-WPRE-BGHpA(4.66 E+13 게놈 사본/ml)를 경화성 해마에 주입한다(500 nl). 25마리의 IHKA 대조군 마우스에게는 AAVRec3- pAM_CBA-pl-WPRE-BGHpA 대조군 벡터를 주입한다. 동시에, 양극성 기록 전극을 해마 내에 이식한다. 25, 27, 30, 32 및 35일차에, 평가를 위해 마우스를 선택한다. 동물 중 약 20% 내지 25%(마우스 5 내지 6마리/군)를 검사한다. EEG를 연속적으로 기록하고, 기록된 신호를 추가로 처리하여 발작의 수를 정량화한다. 부작용 없이 장시간 발작을 억제할 수 있는 투여량을 결정하기 위해 마우스를 평가한다. 엔드포인트(endpoint)는 적어도 8시간의 발작 억제이다.
실시예 3
마우스 발작 모델에서 마이크로RNA 치료의 전향적 효능 평가
1일차에, 이소플루란 마취 하에 마우스 50마리의 해마 내에 카인산(KA, 200 ng/nl)을 주입한다. 21일차에, AAVRec3- pAM/CBA-miR128-2-WPRE-BGHpA (4.66 E+13 게놈 사본/ml)를 경화성 해마에 주입한다(500 nl). 25마리의 IHKA 대조군 마우스에게는 AAVRec3- pAM_CBA-pl-WPRE-BGHpA 대조군 벡터를 주입한다. 동시에, 양극성 기록 전극을 해마 내에 이식한다. 25, 27, 30, 32 및 35일차에, 평가를 위해 마우스를 선택한다. 동물 중 약 20% 내지 25%(마우스 5 내지 6마리/군)를 검사한다. EEG를 연속적으로 기록하고, 기록된 신호를 추가로 처리하여 발작의 수를 정량화한다. 부작용 없이 장시간 발작을 억제할 수 있는 투여량을 결정하기 위해 마우스를 평가한다. 엔드포인트는 적어도 8시간의 발작 억제이다.
실시예 4
마우스 발작 모델에서 초음파로 향상된 마이크로RNA 치료 효능의 전향적 평가
1일차에, 2% 이소플루란 마취 하에 마우스 50마리의 해마 내에 카인산(KA, 200 ng/nl)을 주입한다. 21일차에, AAVRec3- pAM/CBA-miR101-1-WPRE-BGHpA(4.66 E+13 게놈 사본/ml)를 경화성 해마에 주입한다(500 nl). 25마리의 IHKA 대조군 마우스에게는 AAVRec3- pAM_CBA-pl-WPRE-BGHpA 대조군 벡터를 주입한다.
AAVRec3-pAM/CBA-miR101-1-WPRE-BGHpA 투여 전에, 변형된 수용체의 해마 유전자좌에 인접한 BBB에 초음파 에너지를 인가한다. 2% 이소플루란을 사용하여 각각의 마우스를 마취시켜 배가 바닥을 향하도록 두고, 마우스 머리 고정기, 귀 고정막대, 및 가스 마취 마스크가 포함된 정위 장치로 머리를 고정시킨다. 전기 트리머와 제모 크림을 사용해 마우스의 털을 제거한다. 음향적으로 및 광학적으로 투명한 얇은 플라스틱 랩으로 밀봉되고, 탈기된 물로 채워진 용기를 마우스 머리 상단에 위치시킨다. 임의의 잔여 임피던스 불일치를 제거하기 위해 초음파 결합 겔도 사용한다.
단일 소자의 구형 세그먼트 집속형 초음파 변환기(중심 주파수: 1.525 MHz, 초점 심도: 90 mm, 반경 30 mm, 예컨대 미국 뉴욕주 뉴욕 소재의 Riverside Research Institute로부터 입수 가능함)에 의해 초음파(ultrasonic waves)를 생성한다. 지속형 초음파 변환기의 중심 원형 구멍(반경: 11.2 mm)을 통해 진단용 펄스-반향 변환기(중심 주파수: 7.5 MHz, 초점 길이: 60mm)를 정렬하여, 두 변환기의 초점을 완전히 중첩시킨다. 탈기된 증류수로 채워진 원뿔체를 변환기 시스템 상에 장착하는데, 탈기된 증류수는 음향적으로 투명한 폴리우레탄 멤브레인 캡에 의해 원뿔체에 담긴 상태를 유지한다. 변환기 시스템을 컴퓨터 제어식 3차원 위치설정 시스템(예를 들어, 캐나다 QC, Lachine 소재의 Velmex Inc로부터 입수 가능함)에 부착한다. 집속식 초음파 변환기를 매칭 회로에 연결하고 컴퓨터 제어식 기능 발생기 및 50-dB 전력 증폭기에 의해 구동시킨다. 개인용 컴퓨터 내의 디지타이저에 연결된 펄서-수신기(pulser-receiver) 시스템으로 펄스-반향 변환기를 구동시킨다.　
집속식 초음파 변환기를 탈기된 물로 채워진 용기에 잠기게 하되, 변환기의 빔축(beam axis)을 두개골 표면과 수직으로 유지시킨다. 변환기의 초점을, 예를 들어, 그리드-위치 설정법(grid-positioning method)을 사용해 마우스의 뇌 내부에 위치시킨다. 초점이 두개골의 두정골 상단 아래 3 mm에 놓이도록 변환기의 빔축을 정렬시킨다. 이러한 배치에서, 집속된 초음파 빔의 초점은 좌측 해마 및 좌측 후대뇌 동맥(PCA)과 중첩된다. 우측 해마는 타겟화하지 않으며, 대조군으로서 사용할 수 있다.　
초음파 처리의 1~4분 전에 마이크로버블(평균 직경: 3.0~4.5 μm, 농도: ml당 5.0~8.0 x 108개의 버블)을 구성하는 25 μl의 초음파 대조제 볼루스를 꼬리 정맥 내에 주입한다. 그런 다음, 펄스화된 집속 초음파(펄스 속도: 10 Hz, 펄스 지속기간: 20 ms, 듀티 사이클: 20%)를 0.64 MPa 피크-대-피크로 단일 위치(즉, 해마)에 2회의 버스트(burst)로 연속 인가하며, 각각의 버스트는 30초의 초음파 처리로 이루어진다. 각 버스트 간에는 30초의 간격을 두어 펄스 간의 임의의 잔류 열이 방열될 수 있게 한다. 집속식 초음파 처리 절차는 각 마우스 뇌에서 1회 이상 수행될 수 있다.　
BBB가 개방되면, 양극성 기록 전극을 해마 내에 이식한다. 부작용 없이 장시간 발작을 억제할 수 있는 투여량을 결정하기 위해 마우스를 평가한다. 엔드포인트는 적어도 8시간의 발작 억제이다.
실시예 5
마우스 발작 모델에서 초음파로 향상된 마이크로RNA 치료 효능의 전향적 평가
1일차에, 2% 이소플루란 마취 하에 마우스 50마리의 해마 내에 카인산(KA, 200 ng/nl)을 주입한다. 21일차에, AAVRec3-pAM/CBA-miR128-2-WPRE-BGHpA (4.66 E+13 게놈 사본/ml)를 경화성 해마에 주입한다(500 nl). 25마리의 IHKA 대조군 마우스에게는 AAVRec3- pAM_CBA-pl-WPRE-BGHpA 대조군 벡터를 주입한다.
AAVRec3-pAM/CBA-miR128-2-WPRE-BGHpA 투여 전에, 변형된 수용체의 해마 유전자좌에 인접한 BBB에 초음파 에너지를 인가한다. 2% 이소플루란을 사용하여 각각의 마우스를 마취시켜 배가 바닥을 향하도록 두고, 마우스 머리 고정기, 귀 고정막대, 및 가스 마취 마스크가 포함된 정위 장치로 머리를 고정시킨다. 전기 트리머와 제모 크림을 사용해 마우스의 털을 제거한다. 음향적으로 및 광학적으로 투명한 얇은 플라스틱 랩으로 밀봉되고, 탈기된 물로 채워진 용기를 마우스 머리 상단에 위치시킨다. 임의의 잔여 임피던스 불일치를 제거하기 위해 초음파 결합 겔도 사용한다.
단일 소자의 구형 세그먼트 집속형 초음파 변환기(중심 주파수: 1.525 MHz, 초점 심도: 90 mm, 반경 30 mm, 예컨대 미국 뉴욕주 뉴욕 소재의 Riverside Research Institute로부터 입수 가능함)에 의해 초음파(ultrasonic waves)를 생성한다. 지속형 초음파 변환기의 중심 원형 구멍(반경: 11.2 mm)을 통해 진단용 펄스-반향 변환기(중심 주파수: 7.5 MHz, 초점 길이: 60mm)를 정렬하여, 두 변환기의 초점을 완전히 중첩시킨다. 탈기된 증류수로 채워진 원뿔체를 변환기 시스템 상에 장착하는데, 탈기된 증류수는 음향적으로 투명한 폴리우레탄 멤브레인 캡에 의해 원뿔체에 담긴 상태를 유지한다. 변환기 시스템을 컴퓨터 제어식 3차원 위치설정 시스템(예를 들어, 캐나다 QC, Lachine 소재의 Velmex Inc로부터 입수 가능함)에 부착한다. 집속식 초음파 변환기를 매칭 회로에 연결하고 컴퓨터 제어식 기능 발생기 및 50-dB 전력 증폭기에 의해 구동시킨다. 개인용 컴퓨터 내의 디지타이저에 연결된 펄서-수신기(pulser-receiver) 시스템으로 펄스-반향 변환기를 구동시킨다.　
집속식 초음파 변환기를 탈기된 물로 채워진 용기에 잠기게 하되, 변환기의 빔축(beam axis)을 두개골 표면과 수직으로 유지시킨다. 변환기의 초점을, 예를 들어, 그리드-위치 설정법(grid-positioning method)을 사용해 마우스의 뇌 내부에 위치시킨다. 초점이 두개골의 두정골 상단 아래 3 mm에 놓이도록 변환기의 빔축을 정렬시킨다. 이러한 배치에서, 집속된 초음파 빔의 초점은 좌측 해마 및 좌측 후대뇌 동맥(PCA)과 중첩된다. 우측 해마는 타겟화하지 않으며, 대조군으로서 사용할 수 있다.　
초음파 처리의 1~4분 전에 마이크로버블(평균 직경: 3.0~4.5 μm, 농도: ml당 5.0~8.0 x 108개의 버블)을 구성하는 25 μl의 초음파 대조제 볼루스를 꼬리 정맥 내에 주입한다. 그런 다음, 펄스화된 집속 초음파(펄스 속도: 10 Hz, 펄스 지속기간: 20 ms, 듀티 사이클: 20%)를 0.64 MPa 피크-대-피크로 단일 위치(즉, 해마)에 2회의 버스트(burst)로 연속 인가하며, 각각의 버스트는 30초의 초음파 처리로 이루어진다. 각 버스트 간에는 30초의 간격을 두어 펄스 간의 임의의 잔류 열이 방열될 수 있게 한다. 집속식 초음파 처리 절차는 각 마우스 뇌에서 1회 이상 수행될 수 있다.　
BBB가 개방되면, 양극성 기록 전극을 해마 내에 이식한다. 부작용 없이 장시간 발작을 억제할 수 있는 투여량을 결정하기 위해 마우스를 평가한다. 엔드포인트는 적어도 8시간의 발작 억제이다.
실시예 6
마우스 발작 모델에서 초음파로 향상된 마이크로RNA 치료 효능의 전향적 평가
1일차에, 2% 이소플루란 마취 하에 마우스 50마리의 해마 내에 카인산(KA, 200 ng/nl)을 주입한다. 21일차에, AAV 9 - pAM/CBA-miR101-1-WPRE-BGHpA (4.66 E+13 게놈 사본/ml)를 경화성 해마에 주입한다(500 nl). 25마리의 IHKA 대조군 마우스에게는 AAV 9 - pAM_CBA-pl-WPRE-BGHpA 대조군 벡터를 주입한다. EEG를 연속적으로 기록하고, 기록된 신호를 추가로 처리하여 발작의 수를 정량화한다.
AAV 9 - pAM/CBA-miR101-1-WPRE-BGHpA 투여 전에, 변형된 수용체의 해마 유전자좌에 인접한 BBB에 초음파 에너지를 인가한다. 2% 이소플루란을 사용하여 각각의 마우스를 마취시켜 배가 바닥을 향하도록 두고, 마우스 머리 고정기, 귀 고정막대, 및 가스 마취 마스크가 포함된 정위 장치로 머리를 고정시킨다. 전기 트리머와 제모 크림을 사용해 마우스의 털을 제거한다. 음향적으로 및 광학적으로 투명한 얇은 플라스틱 랩으로 밀봉되고, 탈기된 물로 채워진 용기를 마우스 머리 상단에 위치시킨다. 임의의 잔여 임피던스 불일치를 제거하기 위해 초음파 결합 겔도 사용한다.
단일 소자의 구형 세그먼트 집속형 초음파 변환기(중심 주파수: 1.525 MHz, 초점 심도: 90 mm, 반경 30 mm, 예컨대 미국 뉴욕주 뉴욕 소재의 Riverside Research Institute로부터 입수 가능함)에 의해 초음파(ultrasonic waves)를 생성한다. 지속형 초음파 변환기의 중심 원형 구멍(반경: 11.2 mm)을 통해 진단용 펄스-반향 변환기(중심 주파수: 7.5 MHz, 초점 길이: 60mm)를 정렬하여, 두 변환기의 초점을 완전히 중첩시킨다. 탈기된 증류수로 채워진 원뿔체를 변환기 시스템 상에 장착하는데, 탈기된 증류수는 음향적으로 투명한 폴리우레탄 멤브레인 캡에 의해 원뿔체에 담긴 상태를 유지한다. 변환기 시스템을 컴퓨터 제어식 3차원 위치설정 시스템(예를 들어, 캐나다 QC, Lachine 소재의 Velmex Inc로부터 입수 가능함)에 부착한다. 집속식 초음파 변환기를 매칭 회로에 연결하고 컴퓨터 제어식 기능 발생기 및 50-dB 전력 증폭기에 의해 구동시킨다. 개인용 컴퓨터 내의 디지타이저에 연결된 펄서-수신기(pulser-receiver) 시스템으로 펄스-반향 변환기를 구동시킨다.　
집속식 초음파 변환기를 탈기된 물로 채워진 용기에 잠기게 하되, 변환기의 빔축(beam axis)을 두개골 표면과 수직으로 유지시킨다. 변환기의 초점을, 예를 들어, 그리드-위치 설정법(grid-positioning method)을 사용해 마우스의 뇌 내부에 위치시킨다. 초점이 두개골의 두정골 상단 아래 3 mm에 놓이도록 변환기의 빔축을 정렬시킨다. 이러한 배치에서, 집속된 초음파 빔의 초점은 좌측 해마 및 좌측 후대뇌 동맥(PCA)과 중첩된다. 우측 해마는 타겟화하지 않으며, 대조군으로서 사용할 수 있다.　
초음파 처리의 1~4분 전에 마이크로버블(평균 직경: 3.0~4.5 μm, 농도: ml당 5.0~8.0 x 108개의 버블)을 구성하는 25 μl의 초음파 대조제 볼루스를 꼬리 정맥 내에 주입한다. 그런 다음, 펄스화된 집속 초음파(펄스 속도: 10 Hz, 펄스 지속기간: 20 ms, 듀티 사이클: 20%)를 0.64 MPa 피크-대-피크로 단일 위치(즉, 해마)에 2회의 버스트(burst)로 연속 인가하며, 각각의 버스트는 30초의 초음파 처리로 이루어진다. 각 버스트 간에는 30초의 간격을 두어 펄스 간의 임의의 잔류 열이 방열될 수 있게 한다. 집속식 초음파 처리 절차는 각 마우스 뇌에서 1회 이상 수행될 수 있다.　
BBB가 개방되면, 양극성 기록 전극을 해마 내에 이식한다. MRI 대조제, 예를 들어, 가돌리늄을 투여한다. 대조제는 집속된 초음파 치료에 의해 BBB가 개방되었는지 여부를 결정하는데 사용된다. 제제는 9.4 T 시스템을 사용하는 T1- 및 T2-가중 MRI 스캔을 사용하여 관찰한다. 마우스를 3.8 cm 직경의 새장형 코일이 부착된 플라스틱 튜브에 넣고 자석에 수직으로 삽입하였다. 초음파 처리 후 약 15분 후 및 MRI 대조제 주입 전에, TI-가중 스핀-반향 MRI 스캔을 얻는다(TR/TE: 246.1 ms/10 ms; BW: 50,505.1 Hz; 매트릭스 크기: 256 x 256; FOV: 1.92 x 1.92(cm); 슬라이스 두께: 0.6 mm: NEX: 10, 15 및 45). 일단 제1 스캔이 완료되면, 0.5 mL의 MRI 대조제인 가돌리늄을 카테터를 통해 복강 내 투여하여 BBB 개방을 도시한다. 복강 내 주사는 MRI 대조제가 혈류에 느리게 흡수될 수 있게 한다. MRI 대조제를 주입한 후, 각각의 마우스를 대상으로 연속 6회의 교번 T1-가중 및 T2-가중 급속 스핀-에코 이미지 스캔(TR/TE: 4000 ms/9.2 ms; 이완 증강 급속 획득: 16; FOV: 1.92 x 1.92(cm); 매트릭스 크기: 256 x 256; 슬라이스 수: 10; 슬라이스 두께: 0.6 mm; 슬라이스 갭: 0.1 mm; NEX: 10, 15와 45)를 수행한다.
부작용 없이 장시간 발작을 억제할 수 있는 투여량을 결정하기 위해 마우스를 평가한다. 엔드포인트는 적어도 8시간의 발작 억제이다.
본원에서 제공되는 실시예 및 구현예는 예시적인 실시예와 구현예라는 것을 이해해야 한다. 당업자는 본원의 개시의 범위와 일치하는 실시예 및 구현예의 다양한 변형을 고려할 것이다. 이러한 변형은 청구범위에 의해 포함되도록 의도된다.
<110> OVID THERAPEUTICS, INC. DURING, Matthew <120> USE OF MIR101 OR MIR128 IN THE TREATMENT OF SEIZURE DISORDERS <130> 2262-51 <150> US 62/595,255 <151> 2017-12-06 <160> 5 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> mature sequence of human miR101 <400> 1 uacaguacug ugauaacuga a 21 <210> 2 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(23) <223> mature sequence of miR128 <400> 2 gggggccgau acacuguacg aga 23 <210> 3 <211> 6141 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct: pAM/CBA-miR101-1-WPRE-BGHpA <400> 3 tagctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gcccgggcaa agcccgggcg tcgggcgacc 60 tttggtcgcc cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc caactccatc 120 actaggggtt ccttgtagtt aatgattaac ccgccatgct acttatctac gtagccatgc 180 tctaggtacc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt 240 tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag 300 tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg 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ccggaagggc cgagcgcaga 4560 agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga 4620 gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg 4680 gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga 4740 gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt 4800 gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct 4860 cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca 4920 ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat 4980 accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga 5040 aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc 5100 aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg 5160 caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc 5220 ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt 5280 gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca 5340 cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg 5400 aggccctttc gtctcgcgcg tttcggtgat gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc 5460 ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc 5520 gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc tggcttaact atgcggcatc agagcagatt 5580 gtactgagag tgcaccattc gacgctctcc cttatgcgac tcctgcatta ggaagcagcc 5640 cagtagtagg ttgaggccgt tgagcaccgc cgccgcaagg aatggtgcat gcaaggagat 5700 ggcgcccaac agtcccccgg ccacggggcc tgccaccata cccacgccga aacaagcgct 5760 catgagcccg aagtggcgag cccgatcttc cccatcggtg atgtcggcga tataggcgcc 5820 agcaaccgca cctgtggcgc cggtgatgcc ggccacgatg cgtccggcgt agaggatctg 5880 gctagcgatg accctgctga ttggttcgct gaccatttcc gggtgcggga cggcgttacc 5940 agaaactcag aaggttcgtc caaccaaacc gactctgacg gcagtttacg agagagatga 6000 tagggtctgc ttcagtaagc cagatgctac acaattaggc ttgtacatat tgtcgttaga 6060 acgcggctac aattaataca taaccttatg tatcatacac atacgattta ggtgacacta 6120 tagaatacac ggaattaatt c 6141 <210> 4 <211> 6124 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct: pAM/CBA-miR128-2-WPRE-BGHpA <400> 4 tagctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gcccgggcaa agcccgggcg tcgggcgacc 60 tttggtcgcc cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc caactccatc 120 actaggggtt ccttgtagtt aatgattaac ccgccatgct acttatctac gtagccatgc 180 tctaggtacc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt 240 tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag 300 tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc 360 attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag 420 tcatcgctat taccatggtc gaggtgagcc ccacgttctg cttcactctc cccatctccc 480 ccccctcccc acccccaatt ttgtatttat ttatttttta attattttgt gcagcgatgg 540 gggcgggggg gggggggggg cgcgcgccag gcggggcggg gcggggcgag gggcggggcg 600 gggcgaggcg gagaggtgcg gcggcagcca atcagagcgg cgcgctccga aagtttcctt 660 ttatggcgag gcggcggcgg cggcggccct ataaaaagcg aagcgcgcgg cgggcgggag 720 tcgctgcgcg ctgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc 780 ggctctgact gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg 840 gctgtaatta gcgcttggtt taatgacggc ttgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc 900 ttgaggggct ccgggagggc cctttgtgcg gggggagcgg ctcggggctg tccgcggggg 960 gacggctgcc ttcggggggg acggggcagg gcggggttcg gcttctggcg tgtgaccggc 1020 ggctctagag cctctgctaa ccatgttcat gccttcttct ttttcctaca gctcctgggc 1080 aacgtgctgg ttattgtgct gtctcatcat tttggcaaag aattggatcc actcgagtgg 1140 agctcgcgac tagtcgattc gaattcgtcg actggatcca gtaccgagga gatctgcgcc 1200 gcgatcgcgt ctccataaat tattttttga tccttcttct gttaaagcag aaagtcaacc 1260 atgtccgtac ctttctagtt cataccttct tttaattttt tttttctttt caatttgaag 1320 agagtgcttc ctctgttctt aaggctaggg aaccaaatta ggttgtttca atatcgtgct 1380 aaaagatact gcctttagaa gaaggctatt gacaatccag cgtgtctcgg tggaactctg 1440 actccatggt tcactttcat gatggccaca tgcctcctgc ccagagcccg gcagccactg 1500 tgcagtggga aggggggccg atacactgta cgagagtgag tagcaggtct cacagtgaac 1560 cggtctcttt ccctactgtg tcacactcct aatggaatgc cgttatccaa agagcagcac 1620 gaacccgaca gggctgagtg gcttgtgcta gggagaggtt tgtgtcattc ctgctgacca 1680 aactgcagga aaaactgcta attgtcatgc tgaagactgc ctgacgggga gactctgcct 1740 tctgtaagta ggtcatgtaa agagcacgtg ctccttgctg ctactcatag atgcctgctc 1800 cgtgatctga tttctgcact gaatctatgt tatgcatatg gaatgtatac agatacatgt 1860 acgcgtacgc ggccgctcga gcagaaactc atctcagaag aggatctggc agcaaatgat 1920 atcaagctta tcgataatca acctctggat tacaaaattt gtgaaagatt gactggtatt 1980 cttaactatg ttgctccttt tacgctatgt ggatacgctg ctttaatgcc tttgtatcat 2040 gctattgctt cccgtatggc tttcattttc tcctccttgt ataaatcctg gttgctgtct 2100 ctttatgagg agttgtggcc cgttgtcagg caacgtggcg tggtgtgcac tgtgtttgct 2160 gacgcaaccc ccactggttg gggcattgcc accacctgtc agctcctttc cgggactttc 2220 gctttccccc tccctattgc cacggcggaa ctcatcgccg cctgccttgc ccgctgctgg 2280 acaggggctc ggctgttggg cactgacaat tccgtggtgt tgtcggggaa atcatcgtcc 2340 tttccttggc tgctcgcctg tgttgccacc tggattctgc gcgggacgtc cttctgctac 2400 gtcccttcgg ccctcaatcc agcggacctt ccttcccgcg gcctgctgcc ggctctgcgg 2460 cctcttccgc gtcttcgcct tcgccctcag acgagtcgga tctccctttg ggccgcctcc 2520 ccgcatcgat accgtcgact cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat 2580 ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc 2640 tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg 2700 ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg 2760 gggatgcggt gggctctatg gcttctgagg cggaaagaac cagctggggc tcgactagag 2820 catggctacg tagataagta gcatggcggg ttaatcatta actacaagga acccctagtg 2880 atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag 2940 gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagct 3000 ttttgcaaaa gcctaggcct ccaaaaaagc ctcctcacta cttctggaat agctcagagg 3060 ccgaggcggc ctcggcctct gcataaataa aaaaaattag tcagccatgg ggcggagaat 3120 gggcggaact gggcggagtt aggggcggga tgggcggagt taggggcggg actatggttg 3180 ctgactaatt gagatgcatg ctttgcatac ttctgcctgc tggggagcct ggggactttc 3240 cacacctggt tgctgactaa ttgagatgca tgctttgcat acttctgcct gctggggagc 3300 ctggggactt tccacaccct aactgacaca cattccacag ctgcattaat gaatcggcca 3360 acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc 3420 gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg 3480 gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa 3540 ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga 3600 cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag 3660 ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct 3720 taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg 3780 ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc 3840 ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt 3900 aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta 3960 tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac 4020 agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc 4080 ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat 4140 tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc 4200 tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt 4260 cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta 4320 aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct 4380 atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg 4440 cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga 4500 tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt 4560 atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt 4620 taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt 4680 tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat 4740 gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc 4800 cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc 4860 cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat 4920 gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag 4980 aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt 5040 accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc 5100 ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa 5160 gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg 5220 aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa 5280 taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac 5340 cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtctcgc 5400 gcgtttcggt gatgacggtg aaaacctctg acacatgcag ctcccggaga cggtcacagc 5460 ttgtctgtaa gcggatgccg ggagcagaca agcccgtcag ggcgcgtcag cgggtgttgg 5520 cgggtgtcgg ggctggctta actatgcggc atcagagcag attgtactga gagtgcacca 5580 ttcgacgctc tcccttatgc gactcctgca ttaggaagca gcccagtagt aggttgaggc 5640 cgttgagcac cgccgccgca aggaatggtg catgcaagga gatggcgccc aacagtcccc 5700 cggccacggg gcctgccacc atacccacgc cgaaacaagc gctcatgagc ccgaagtggc 5760 gagcccgatc ttccccatcg gtgatgtcgg cgatataggc gccagcaacc gcacctgtgg 5820 cgccggtgat gccggccacg atgcgtccgg cgtagaggat ctggctagcg atgaccctgc 5880 tgattggttc gctgaccatt tccgggtgcg ggacggcgtt accagaaact cagaaggttc 5940 gtccaaccaa accgactctg acggcagttt acgagagaga tgatagggtc tgcttcagta 6000 agccagatgc tacacaatta ggcttgtaca tattgtcgtt agaacgcggc tacaattaat 6060 acataacctt atgtatcata cacatacgat ttaggtgaca ctatagaata cacggaatta 6120 attc 6124 <210> 5 <211> 738 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AAVRec3 Amino Acid Sequence <400> 5 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Gly Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Arg Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile 145 150 155 160 Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln 165 170 175 Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro 180 185 190 Pro Ala Gly Pro Ser Gly Leu Gly Ser Gly Thr Met Ala Ala Gly Gly 195 200 205 Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser 210 215 220 Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val 225 230 235 240 Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His 245 250 255 Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Asp 260 265 270 Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn 275 280 285 Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn 290 295 300 Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn 305 310 315 320 Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala 325 330 335 Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln 340 345 350 Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe 355 360 365 Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn 370 375 380 Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr 385 390 395 400 Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Glu Phe Ser Tyr 405 410 415 Thr Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser 420 425 430 Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu 435 440 445 Ser Arg Thr Gln Ser Thr Gly Gly Thr Gln Gly Thr Gln Gln Leu Leu 450 455 460 Phe Ser Gln Ala Gly Pro Ala Asn Met Ser Ala Gln Ala Lys Asn Trp 465 470 475 480 Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Leu Ser 485 490 495 Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His 500 505 510 Leu Asn Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Val Ala Met Ala Thr 515 520 525 His Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser Ser Gly Val Leu Met 530 535 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Claims (107)

  1. 발작 장애의 치료를 필요로 하는 환자에서 이를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 마이크로RNA-101, pri-miR101 또는 pre-miR101을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 핵산은 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 발작 장애의 하나 이상의 증상이 개선되는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 투여 단계 후, 환자에서 마이크로RNA-101, pri-miR101 또는 pre-miR101의 발현은 발작 장애의 증상 감소와 관련이 있는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 프로모터는 CAG 프로모터, CMV 프로모터, 인간 시냅신 1 유전자 프로모터(hSyn), 다이노르핀 프로모터, 엔케팔린 프로모터 및 CaMKII 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 프로모터는 CAG 프로모터인, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 벡터는 마멋 전사후 조절 요소(WPRE)를 포함하는, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 벡터는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열(BGHpA)을 포함하는, 방법.
  7. 제1항에 있어서, 벡터는 형광 리포터 카세트를 포함하는, 방법.
  8. 제1항에 있어서, 벡터는 아데노-관련 바이러스(AAV)인, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 아데노-관련 바이러스는 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9 또는 AAVRec3인, 방법.
  10. 제1항에 있어서, 벡터는 렌티바이러스인, 방법.
  11. 제1항에 있어서, 벡터는 환자의 뇌 안의 표적 위치에 전달되는, 방법.
  12. 제1항에 있어서, 표적 위치는 전두엽, 측두엽, 후두엽 또는 두정엽인, 방법.
  13. 제11항에 있어서, 벡터는 경구, 구강, 설하, 직장, 국소, 비강, 질 및 비경구로 이루어진 군으로부터 선택된 경로를 통해 투여되는, 방법.
  14. 제11항에 있어서, 벡터는 표적 위치에 직접 투여되는, 방법.
  15. 제1항에 있어서, 벡터는 pAM /CBA-miR101-1-WPRE-BGHpA인, 방법.
  16. 제1항에 있어서, 발작 장애는 간질, 전신성 긴장성-간대성 발작을 수반하는 간질, 근간대성 압상스를 수반하는 간질, 전두엽 간질, 측두엽 간질, 란다우-클레프너 증후군, 드라베 증후군, 두즈 증후군, CDKL5 장애, 영아 연축(웨스트 증후군), 소아 근간대성 간질(JME), 백신 관련 뇌병증, 난치성 유아기 간질(ICE), 레녹스-가스토 증후군(LGS), 레트 증후군, 오타하라 증후군, CDKL5 장애, 유아기 압상스 간질, 본태성 진전, 급성 반복 발작, 양성 롤란드 간질, 간질 지속증, 불응성 간질 지속증, 초불응성 간질 지속증(SRSE), PCDH19 소아과 간질, 뇌종양 유발성 발작, 과오종 유발성 발작, 약물 금단에 의한 발작, 알코올 금단에 의한 발작, 및 발작 활성의 증가 및 돌발성 발작으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 발작 장애의 치료 방법.
  17. 제1항에 있어서, 발작 장애는 국소성 발작을 특징으로 하는, 발작 장애의 치료 방법.
  18. 제1항에 있어서, 발작 장애는 국소성 대뇌피질 형성이상인, 발작 장애의 치료 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 방법은 실조증, 보행 장애, 음성 장애, 발성, 인지 손상, 비정상적인 운동 활성, 임상적 발작, 무임상 발작, 긴장 저하, 긴장 항진, 침흘림, 입 모양으로만 말하기, 전조, 경련, 반복적인 움직임, 비정상적인 감각, 발작 빈도 및 발작 중증도로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 증상을 개선하는, 방법.
  20. 제1항에 있어서, 환자의 뇌 안의 표적 위치에 초음파를 인가되어 표적 위치에서 환자의 뇌 혈액 장벽의 투과성을 향상시키는 단계를 추가로 포함하되, 벡터는 표적 위치까지 전달되는, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 초음파는 두개골을 통해 투여되는, 방법.
  22. 제20항에 있어서, 뇌의 경막을 노출시키고, 노출된 경막 또는 그 아래에 초음파를 전달하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  23. 제20항에 있어서, 초음파는 벡터의 투여 전에 환자의 뇌 안의 표적 위치에 투여되는, 방법.
  24. 제20항에 있어서, 벡터는 초음파의 인가 전에 투여되는, 방법.
  25. 발작 장애의 치료를 요하는 환자에게서 이를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 환자의 뇌에서 마이크로RNA-101 분자의 수준을 증가시키는 약학적 조성물의 유효량을 환자에게 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 조성물은 마이크로RNA-101, pri-miR101 또는 pre-miR101을 포함하는, 방법.
  27. 제25항에 있어서, 조성물은 마이크로RNA-101, pri-miR101 또는 pre-miR101을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 투여 단계 후, 환자에서 마이크로RNA-101, pri-miR101 또는 pre-miR101의 발현은 발작 장애의 증상 감소와 관련이 있는, 방법.
  29. 제27항에 있어서, 마이크로RNA-101, pri-miR101 또는 pre-miR101을 암호화하는 핵산은 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 방법.
  30. 제29항에 있어서, 프로모터는 CAG 프로모터, CMV 프로모터, 인간 시냅신 1 유전자 프로모터(hSyn), 다이노르핀 프로모터, 엔케팔린 프로모터 및 CaMKII 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  31. 제27항에 있어서, 벡터는 마멋 전사후 조절 요소(WPRE)를 포함하는, 방법.
  32. 제27항에 있어서, 벡터는 형광 리포터 카세트를 포함하는, 방법.
  33. 제27항에 있어서, 벡터는 아데노-관련 바이러스(AAV)인, 방법.
  34. 제31항에 있어서, 아데노-관련 바이러스는 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9 또는 AAVRec3인, 방법.
  35. 제27항에 있어서, 벡터는 렌티바이러스인, 방법.
  36. 제27항에 있어서, 벡터는 pAM /CBA-miR101-1-WPRE-BGHpA인, 방법.
  37. 제27항에 있어서, 벡터는 환자의 뇌 안의 표적 위치에 전달되는, 방법.
  38. 제38항에 있어서, 표적 위치는 전두엽, 측두엽, 후두엽 또는 두정엽인, 방법.
  39. 제27항에 있어서, 벡터는 경구, 구강, 설하, 직장, 국소, 비강, 질 및 비경구로 이루어진 군으로부터 선택된 경로를 통해 투여되는, 방법.
  40. 제37항에 있어서, 벡터는 표적 위치에 직접 투여되는, 방법.
  41. 제25항에 있어서, 발작 장애는 간질, 전신성 긴장성-간대성 발작을 수반하는 간질, 근간대성 압상스를 수반하는 간질, 전두엽 간질, 측두엽 간질, 란다우-클레프너 증후군, 드라베 증후군, 두즈 증후군, CDKL5 장애, 영아 연축(웨스트 증후군), 소아 근간대성 간질(JME), 백신 관련 뇌병증, 난치성 유아기 간질(ICE), 레녹스-가스토 증후군(LGS), 레트 증후군, 오타하라 증후군, CDKL5 장애, 유아기 압상스 간질, 본태성 진전, 급성 반복 발작, 양성 롤란드 간질, 간질 지속증, 불응성 간질 지속증, 초불응성 간질 지속증(SRSE), PCDH19 소아과 간질, 뇌종양 유발성 발작, 과오종 유발성 발작, 약물 금단에 의한 발작, 알코올 금단에 의한 발작, 및 발작 활성의 증가 및 돌발성 발작으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  42. 제25항에 있어서, 발작 장애는 국소성 발작을 특징으로 하는, 방법.
  43. 제25항에 있어서, 발작 장애는 국소성 대뇌피질 형성이상인, 방법.
  44. 제25항에 있어서, 상기 방법은 실조증, 보행 장애, 음성 장애, 발성, 비자발적으로 터지는 웃음, 인지 손상, 비정상적인 운동 활성, 임상적 발작, 무임상 발작, 긴장 저하, 긴장 항진, 침흘림, 입 모양으로만 말하기, 전조, 경련, 반복적인 움직임, 비정상적인 감각, 발작 빈도 및 발작 중증도로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 증상을 개선하는, 방법.
  45. 제25항에 있어서, 환자의 뇌 안의 표적 위치에 초음파를 인가되어 표적 위치에서 환자의 뇌 혈액 장벽의 투과성을 향상시키는 단계를 추가로 포함하되, 벡터는 표적 위치까지 전달되는, 방법.
  46. 제45항에 있어서, 초음파는 두개골을 통해 투여되는, 방법.
  47. 제45항에 있어서, 뇌의 경막을 노출시키고, 노출된 경막 또는 그 아래에 초음파를 전달하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  48. 제45항에 있어서, 초음파는 벡터의 투여 전에 환자의 뇌 안의 표적 위치에 투여되는, 방법.
  49. 제45항에 있어서, 벡터는 초음파의 인가 전에 투여되는, 방법.
  50. 제25항에 있어서, 조성물은 비-바이러스 벡터인 벡터를 포함하는, 방법.
  51. 제50항에 있어서, 비-바이러스 벡터는 리포좀 매개 전달 벡터인, 방법.
  52. CAG 프로모터, 마멋 전사후 조절 요소(WPRE) 및 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열(BGHpA)의 조절 제어 하에, 마이크로RNA-101, pri-miR101 또는 pre-miR101을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터.
  53. 발작 장애의 치료를 필요로 하는 환자에서 이를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 마이크로RNA-128, pri-miR128 또는 pre-miR128을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 핵산은 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 발작 장애의 하나 이상의 증상이 개선되는, 방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 투여 단계 후, 환자에서 마이크로RNA-128의 발현은 발작 장애의 증상 감소와 관련이 있는, 방법.
  55. 제53항에 있어서, 프로모터는 CAG 프로모터, CMV 프로모터, 인간 시냅신 1 유전자 프로모터(hSyn), 다이노르핀 프로모터, 엔케팔린 프로모터 및 CaMKII 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  56. 제53항에 있어서, 프로모터는 CAG 프로모터인, 방법.
  57. 제53항에 있어서, 벡터는 마멋 전사후 조절 요소(WPRE)를 포함하는, 방법.
  58. 제53항에 있어서, 벡터는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열(BGHpA)을 포함하는, 방법.
  59. 제53항에 있어서, 벡터는 형광 리포터 카세트를 포함하는, 방법.
  60. 제53항에 있어서, 벡터는 아데노-관련 바이러스(AAV)인, 방법.
  61. 제60항에 있어서, 아데노-관련 바이러스는 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9 또는 AAVRec3인, 방법.
  62. 제53항에 있어서, 벡터는 렌티바이러스인, 방법.
  63. 제53항에 있어서, 벡터는 환자의 뇌 안의 표적 위치에 전달되는, 방법.
  64. 제53항에 있어서, 표적 위치는 전두엽, 측두엽, 후두엽 또는 두정엽인, 방법.
  65. 제63항에 있어서, 벡터는 경구, 구강, 설하, 직장, 국소, 비강, 질 및 비경구로 이루어진 군으로부터 선택된 경로를 통해 투여되는, 방법.
  66. 제63항에 있어서, 벡터는 표적 위치에 직접 투여되는, 방법.
  67. 제 53 항에 있어서, miR128은 miRNA128-2에 의해 암호화되는, 방법.
  68. 제67항에 있어서, 벡터는 pAM /CBA-miR128-2-WPRE-BGHpA인, 방법.
  69. 제53항에 있어서, 발작 장애는 간질, 전신성 긴장성-간대성 발작을 수반하는 간질, 근간대성 압상스를 수반하는 간질, 전두엽 간질, 측두엽 간질, 란다우-클레프너 증후군, 드라베 증후군, 두즈 증후군, CDKL5 장애, 영아 연축(웨스트 증후군), 소아 근간대성 간질(JME), 백신 관련 뇌병증, 난치성 유아기 간질(ICE), 레녹스-가스토 증후군(LGS), 레트 증후군, 오타하라 증후군, CDKL5 장애, 유아기 압상스 간질, 본태성 진전, 급성 반복 발작, 양성 롤란드 간질, 간질 지속증, 불응성 간질 지속증, 초불응성 간질 지속증(SRSE), PCDH19 소아과 간질, 뇌종양 유발성 발작, 과오종 유발성 발작, 약물 금단에 의한 발작, 알코올 금단에 의한 발작, 발작 활성의 증가 및 돌발성 발작으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 발작 장애의 치료 방법.
  70. 제53항에 있어서, 발작 장애는 국소성 발작을 특징으로 하는, 발작 장애의 치료 방법.
  71. 제53항에 있어서, 발작 장애는 국소성 대뇌피질 형성이상인, 발작 장애의 치료 방법.
  72. 제53항에 있어서, 상기 방법은 실조증, 보행 장애, 음성 장애, 발성, 비자발적으로 터지는 웃음, 인지 손상, 비정상적인 운동 활성, 임상적 발작, 무임상 발작, 긴장 저하, 긴장 항진, 침흘림, 입 모양으로만 말하기, 전조, 경련, 반복적인 움직임, 비정상적인 감각, 발작 빈도 및 발작 중증도로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 증상을 개선하는, 발작 장애의 치료 방법.
  73. 제53항에 있어서, 환자의 뇌 안의 표적 위치에 초음파를 인가되어 표적 위치에서 환자의 뇌 혈액 장벽의 투과성을 향상시키는 단계를 추가로 포함하되, 벡터는 표적 위치까지 전달되는, 방법.
  74. 제73항에 있어서, 초음파는 두개골을 통해 투여되는, 방법.
  75. 제73항에 있어서, 뇌의 경막을 노출시키고, 노출된 경막 또는 그 아래에 초음파를 전달하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  76. 제73항에 있어서, 초음파는 벡터의 투여 전에 환자의 뇌 안의 표적 위치에 투여되는, 방법.
  77. 제73항에 있어서, 벡터는 초음파의 인가 전에 투여되는, 방법.
  78. 발작 장애의 치료를 요하는 환자에게서 이를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 환자의 뇌 세포에서 마이크로RNA-128 분자의 수준을 증가시키는 약학적 조성물의 유효량을 환자에게 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
  79. 제78항에 있어서, 조성물은 마이크로RNA-128, pri-miR128 또는 pre-miR128을 포함하는, 방법.
  80. 제78항에 있어서, 조성물은 마이크로RNA-128, pri-miR128 또는 pre-miR128을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는, 방법.
  81. 제80항에 있어서, 상기 투여 단계 후, 환자에서 마이크로RNA-128, pri-miR128 또는 pre-miR128의 발현은 발작 장애의 증상 감소와 관련이 있는, 방법.
  82. 제80항에 있어서, 마이크로RNA-128을 암호화하는 핵산은 miR-128-2인, 방법.
  83. 제80항에 있어서, 마이크로RNA-128을 암호화하는 핵산은 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 방법.
  84. 제80항에 있어서, 프로모터는 CAG 프로모터, CMV 프로모터, 인간 시냅신 1 유전자 프로모터(hSyn), 다이노르핀 프로모터, 엔케팔린 프로모터 및 CaMKII 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  85. 제80항에 있어서, 벡터는 마멋 전사후 조절 요소(WPRE)를 포함하는, 방법.
  86. 제80항에 있어서, 벡터는 형광 리포터 카세트를 포함하는, 방법.
  87. 제80항에 있어서, 벡터는 아데노-관련 바이러스(AAV)인, 방법.
  88. 제87항에 있어서, 아데노-관련 바이러스는 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9 또는 AAVRec3인, 방법.
  89. 제80항에 있어서, 벡터는 렌티바이러스인, 방법.
  90. 제80항에 있어서, 벡터는 pAM /CBA-miR101-1-WPRE-BGHpA인, 방법.
  91. 제80항에 있어서, 벡터는 환자의 뇌 안의 표적 위치에 전달되는, 방법.
  92. 제91항에 있어서, 표적 위치는 전두엽, 측두엽, 후두엽 또는 두정엽인, 방법.
  93. 제91항에 있어서, 벡터는 경구, 구강, 설하, 직장, 국소, 비강, 질 및 비경구로 이루어진 군으로부터 선택된 경로를 통해 투여되는, 방법.
  94. 제91항에 있어서, 벡터는 표적 위치에 직접 투여되는, 방법.
  95. 제78항에 있어서, 발작 장애는 간질, 전신성 긴장성-간대성 발작을 수반하는 간질, 근간대성 압상스를 수반하는 간질, 전두엽 간질, 측두엽 간질, 란다우-클레프너 증후군, 드라베 증후군, 두즈 증후군, CDKL5 장애, 영아 연축(웨스트 증후군), 소아 근간대성 간질(JME), 백신 관련 뇌병증, 난치성 유아기 간질(ICE), 레녹스-가스토 증후군(LGS), 레트 증후군, 오타하라 증후군, CDKL5 장애, 유아기 압상스 간질, 본태성 진전, 급성 반복 발작, 양성 롤란드 간질, 간질 지속증, 불응성 간질 지속증, 초불응성 간질 지속증(SRSE), PCDH19 소아과 간질, 뇌종양 유발성 발작, 과오종 유발성 발작, 약물 금단에 의한 발작, 알코올 금단에 의한 발작, 발작 활성의 증가 및 돌발성 발작으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  96. 제78항에 있어서, 발작 장애는 국소성 발작을 특징으로 하는, 방법.
  97. 제78항에 있어서, 발작 장애는 국소성 대뇌피질 형성이상인, 방법.
  98. 제78항에 있어서, 상기 방법은 실조증, 보행 장애, 음성 장애, 발성, 비자발적으로 터지는 웃음, 인지 손상, 비정상적인 운동 활성, 임상적 발작, 무임상 발작, 긴장 저하, 긴장 항진, 침흘림, 입 모양으로만 말하기, 전조, 경련, 반복적인 움직임, 비정상적인 감각, 발작 빈도 및 발작 중증도로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 증상을 개선하는, 방법.
  99. 제78항에 있어서, 환자의 뇌 안의 표적 위치에 초음파를 인가되어 표적 위치에서 환자의 뇌 혈액 장벽의 투과성을 향상시키는 단계를 추가로 포함하되, 벡터는 표적 위치까지 전달되는, 방법.
  100. 제99항에 있어서, 초음파는 두개골을 통해 투여되는, 방법.
  101. 제99항에 있어서, 뇌의 경막을 노출시키고, 노출된 경막 또는 그 아래에 초음파를 전달하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  102. 제99항에 있어서, 초음파는 벡터의 투여 전에 환자의 뇌 안의 표적 위치에 투여되는, 방법.
  103. 제99항에 있어서, 벡터는 초음파의 인가 전에 투여되는, 방법.
  104. 제78항에 있어서, 조성물은 비-바이러스 벡터인 벡터를 포함하는, 방법.
  105. 제104항에 있어서, 비-바이러스 벡터는 리포좀 매개 전달 벡터인, 방법.
  106. CAG 프로모터, 마멋 전사후 조절 요소(WPRE) 및 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열(BGHpA)의 조절 제어 하에, 마이크로RNA-128, pri-miR128 또는 pre-miR128을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터.
  107. 제102항에 있어서, 마이크로RNA-128은 마이크로 RNA-128-2에 의해 암호화되는, 벡터.
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