CN112041451B - 基于aav的基因和蛋白质递送模块化系统 - Google Patents

基于aav的基因和蛋白质递送模块化系统 Download PDF

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Abstract

在一个实施方式中，本发明提供了包含外表面的腺相关病毒(AAV)，所述表面包含一个或多个肽标签，所述肽标签能与结合伴侣形成键，其中所述AAV是活病毒。在另一个实施方式中，本发明提供了一种偶联物，其包含至少一个该AAV和至少一个多肽，所述多肽包含第一结构域和第二结构域，所述第一结构域为针对标签的结合伴侣，所述第二结构域为生物活性多肽。在另一个实施方式中，本发明提供了一种偶联物，其包含至少一个该AAV(第一AAV)和至少一个第二AAV，其中该第二AAV包含第二外表面，该第二外表面包含至少一个针对所述标签的结合伴侣或针对第三接头分子的结合伴侣，其中所述至少一个第一AAV和所述至少一个第二AAV结合。

Description

基于AAV的基因和蛋白质递送模块化系统
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年2月28日提交的共同待批美国专利申请号62/636,638的权益，其全部内容通过引用全文纳入本文。
电子化提交材料的参考纳入
与本申请同时提交且如下认定的计算机可读核苷酸/氨基酸序列表以其全文作为参考纳入本文：36,315字节ASCII(文本)文件，名为“741805_ST25.TXT”，提交日期为2019年2月28日。
背景技术
目前，诸如腺相关病毒(AAV)的病毒是体内基因转移最有效的模式，但是它们却并不总是能够实现对蛋白质表达的瞬时控制。相反，通过病毒载体递送的基因通常是永久性表达的，这在持续表达会导致脱靶效应的情况(例如Cas9)中是一个明显的缺点。诱导型启动子能够提供一定水平的瞬态，但常有漏洞或效率低下。
AAV是用于体内基因递送的高效非致病性载体，其对神经细胞有强趋向性，且易于在实验室环境中生产和工作。然而，AAV载体的大小被严格限制在4.7kB，禁止了大基因或多基因的递送。因此，需要基于AAV的改良载体系统，其能够实现比可容纳于单个AAV病毒体的转基因更大的转基因的递送。同时，还需要能够递送瞬时表达对其具有重要性的蛋白质(如Cas9)的基于AAV的载体。
发明概述
本发明基于AAV的安全性和效率提供了一种创新的基因和蛋白质递送系统，该系统克服了体内基因递送的这些主要障碍。为了克服包装尺寸的限制和永久性蛋白表达，本发明提供了一种基于AAV的基因和蛋白质模块化递送系统，该系统采用了能自发形成键(其非限制性的例子可为共价键)的肽标签，所述键在生理学相关条件下不会被小球状蛋白破坏。通过在AAV病毒体表面上表达该肽标签并在其他AAV或其他蛋白质上表达结合伴侣，本发明的AAV载体能够将衣壳彼此连接(例如共价连接)和/或将衣壳与蛋白质连接(例如共价连接)，产生更大的感染单位。这种用于将基因和蛋白质递送入细胞的高度灵活可扩展性模块化系统大大扩展了AAV的基因和蛋白质递送能力。
本发明通过将AAV衣壳连接在一起形成偶联物，能够使AAV载体的运载能力翻倍(或多于翻倍)，使得大基因和多基因能够通过专性AAV共感染递送。而且，本发明通过将蛋白质拘于AAV衣壳外部，在递送必须瞬时表达的生物学活性蛋白质(如Cas9)的同时利用了病毒的趋向性和感染性。
本发明还能扩展到这两种方式的结合，从而实现基因和蛋白质的成组的共递送。同时，该方式克服了体内基因和蛋白质递送的最重大的障碍，扩大了AAV介导的基因递送和基因编辑在生物学研究和基因治疗中的应用。重要的是，本发明的该系统是模块化、高度灵活的且能够针对各种各样试验目的进行改良。本发明该系统的开发对于生物学的所有领域均具有广泛的意义，通过提供用于精确有效地控制体内基因表达、基因编辑和蛋白质递送的可定制工具，为跨学科的科学家开辟了新的研究途径，并开辟了涉及大基因或需要瞬时表达的疾病治疗新途径。并且，本文的概念和方法是可扩展的，能够转用到其他类型的病毒。
在一个实施方式中，本发明提供了包含外表面的腺相关病毒(AAV)，所述表面包含一个或多个肽标签，所述肽标签能与结合伴侣形成键(非限制性的例子为共价键)，其中所述AAV是活病毒。在另一个实施方式中，本发明提供了一种偶联物，其包含至少一个所述AAV和至少一个多肽，所述多肽包含第一结构域(其为所述标签的结合伴侣)和第二结构域(其为生物活性多肽)，其中所述AAV与所述多肽结合(例如共价结合)。在另一个实施方式中，本发明提供了一种偶联物，其包含至少一个此类AAV(第一AAV)和至少一个第二AAV，其中第二AAV包含第二外表面，该第二外表面包含至少一个针对所述标签的结合伴侣或针对第三接头分子的结合伴侣，其中所述至少一个第一AAV和所述至少一个第二AAV结合(例如，共价结合)，且其中所述至少一个第二AAV是活病毒。
本发明还提供了用本发明的AAV和偶联物感染细胞的方法，以及包含本发明AAV和偶联物以及细胞的组合物，其中所述细胞被本发明的AAV或偶联物感染。本发明还提供了药物组合物，其包含本发明的AAV或偶联物以及药学上可接受的载剂。
关于附图若干视图的简要说明
依据关于涉及彩色附图的37 C.F.R.§1.84的声明
本专利或申请文件包含至少一幅有色附图。具有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将在请求并支付所需费用之后由专利局提供。
图1展示了本发明方式的示意图。A行涉及连接的病毒(AAV)。肽标签表达在AAV衣壳的表面上，而蛋白质结合伴侣则表达在另一病毒上(第二AAV)。将这两种病毒混合在一起，接头对能自动形成键(其非限制性例子可为共价键)，该键在生理学条件下是永久稳定的，从而形成偶联物(在A行中描绘为病毒二聚体)，提高载体的运载能力，并实现了对所递送基因比例的精确控制。偶联物能够将多个基因递送到同一细胞，或通过专性共感染传递大基因，然后再进行重组。B行涉及通过第三接头分子连接2个病毒衣壳，其中所述接头包含结合至两个病毒上的接头从而将两个载体桥接在一起的分子。C行涉及连接至病毒以形成偶联物的蛋白质。通过将蛋白质拘于衣壳外部，可利用AAV的趋向性和感染性来非永久性地递送治疗性蛋白，例如Cas9。Cas9的瞬时表达对于减少脱靶效应是很关键的。将连接的功能性蛋白递送入核，发挥它们的作用，然后降解。D行表示本发明的方式是如何扩展的。结合这些方法，任何含DNA病毒颗粒和蛋白质串可作为多聚偶联物单元被一起递送。
图2展示了连接的载体(AAV偶联物)的电子显微镜照片。分图A显示作为对照的AAV2载体。分图B展示了证明AAV2-SpyTag载体与AAV2-SnoopTag载体连接形成多病毒偶联物的数据。偶联物表现为AAV病毒体的二聚体或三聚体。分图C显示了SpyTag/SnoopTag接头的过表达导致形成AAV衣壳簇，其中许多AAV载体系连在一起。
图3描绘了显示AAV衣壳连接的Western印迹图像。最后两个泳道中的上方条带指示了连接的VP3亚单位。在该具体实施方式中，AAV衣壳通过第三连接分子连接((VP3SpyTag-接头-VP3SnoopTag)(图1，B行)。
图4图示了包含连接于功能性蛋白的AAV的偶联物。分图A描绘了增量的GFP-SpyCatcher与AAV-SpyTag连接。分图B描绘了tdTomato(由包装入AAV2的转基因编码)的表达，证明了AAV-SpyTag-GFP-SpyCatcher是感染性的。分图C展示的数据证明AAV-SpyTag-GFP-SpyCatcher颗粒能够通过超分辨率共聚焦显微技术追踪，证明了功能性蛋白的成功掺入。
图5展示了涉及AAV-多肽偶联物的数据，在该偶联物中Cas9-SpyCatcher共价结合于AAV2-SpyTag。分图A涉及用Cas9-Spycatcher和靶向视紫红质的向导RNA转染的HEK293T细胞。CRISPR/Cas9诱导的突变用T7分析来测试。前两个泳道显示1)未处理和2)用T7核酸内切酶处理的未转染样品。最后两个泳道显示3)未处理和4)用T7核酸内切酶处理的转染样品。Cas9-Spycatcher切割产物可见于第四泳道。分图B展示Western印迹图，显示AAV2-SpyTag与Cas9-SpyCatcher的结合。
发明具体实施方式
在一个实施方式中，本发明提供了包含外表面的腺相关病毒(AAV)，所述表面包含一个或多个肽标签，所述肽标签能与结合伴侣形成键(非限制性的例子为共价键)。在本申请的上下文中，AAV优选为活病毒，这与病毒样颗粒(VLP)相反。
肽标签是能够与结合伴侣形成键的多肽。这确保了一旦本发明的AAV形成了此键，则该键在生理学相关条件下稳定且通常不会断裂，从而该AAV在感染时递送通过标签-结合伴侣键所拘的任何物质至细胞。
本发明上下文中的“标签”可为在表达于AAV外表面时能够与特定结合伴侣形成键(其非限制性例子可为共价键)的任何合适的多肽。合适标签的例子包括但不限于：称为SpyTag的细菌源性分子系连物及其结合伴侣SpyCatcher，或SnoopTag及其结合伴侣SnoopCatcher，或SpyTag002及其结合伴侣SpyCatcher002(参见例如Zakeri,B.等，“Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein,through engineering abacterial adhesin.(通过工程化改造细菌粘附素使得肽标签形成与蛋白质的快速共价键)”Proceedings of the National Academy of Sciences 109,E690–7(2012)(通过引用以其全文纳入本文)以及Veggiani,G.等，“Programmable polyproteins built usingtwin peptide superglues(使用双肽超强胶构建的可编程多聚蛋白质组)”.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 113,1202–1207(2016)(通过引用以其全文纳入本文)以及Keeble等，“Evolving Accelerated Amidation by SpyTag/SpyCatcher to AnalyzeMembrane Dynamics(发展通过SpyTag/SpyCatcher的加速酰胺化来分析膜动力学)”.AngewChem Int Ed Engl.(2017)(通过引用以其全文纳入本文)))。通常，键(系连物)是共价键；但也可使用其他系连物。可用的其他分子系连物包括例如：分裂内含肽(split inteins，参见例如Wu等.“Protein trans-splicing by a split intein encoded in a split DnaEgene of Synechocystis sp.PCC6803(通过在胞藻物种PCC6803分裂DnaE基因中编码的分裂内含肽的蛋白质顺式剪接)”.PNAS(1998)(通过引用其全文方式纳入本文))、分选酶(参见例如Kobashigawa等,Attachment of an NMR-invisible solubility enhancement tagusing a sortase-mediated protein ligation method(使用分选酶介导的蛋白质连接方法连接NMR不可见的溶解度增强标签).J Biomol NMR.(2009)(通过引用其全文方式纳入本文)),分裂GFP(参见例如Feinberg,E.H.等,GFP reconstitution across synapticpartners(GRASP)defines cell contacts and synapses in living nervous systems(跨突触伴侣的GFP重组(GRASP)定义了活神经系统中的细胞接触和突触).Neuron 57,353–363(2008)(通过引用其全文方式纳入本文))，或其它类似接头分子。
标签可经工程化改造以表达在本发明AAV的表面上，该改造通过使具有胞外结构域的编码AAV多肽的遗传序列发生突变以包含此类标签来实现。例如，AAV VP2和VP3多肽是可经突变包含该标签结构域的合适多肽。纳入标签的合适位点包括：AAV2 VP3的第453、588位(以及在其他AAV血清型上的类似位点)以及AAV2和其他血清型中AAV VP2的N-和C-末端。此外，可构建嵌合病毒来组合带标签和未带标签的衣壳蛋白(例如其中50％的VP3蛋白带有标签结构域，并且50％衣壳蛋白不带标签结构域的AAV衣壳)。
AAV多肽偶联物
在一个实施方式中，本发明提供了一种偶联物，其包含具有外表面的本发明AAV，所述表面包含一个或多个肽标签，所述肽标签能与结合伴侣形成键(其非限制性例子可为共价键)，包含第一结构域和第二结构域的至少一个多肽，所述第一结构域为所述标签的结合伴侣，所述第二结构域为生物活性多肽，其中所述AAV和所述多肽结合(例如但非必须，共价结合)。本实施方式图示于图1的C行中。在该实施方式中，可以重组构建所述至少一个多肽，所述构建采用的编码序列中生物活性多肽编码结构域与针对所述标签的特定结合伴侣(例如SpyCatcher、SnoopCatcher、SpyCatcher002等，如前所述)的编码序列在框内融合。
通过将编码带标签和不带标签衣壳蛋白的质粒混合物转染入包装细胞系(例如293细胞)来改变本发明AAV表面上表达的标签数量，本发明的AAV-多肽偶联物可掺入任意所需数量的结合生物活性多肽。因此，编码带标签衣壳蛋白的质粒相对于编码不带标签衣壳蛋白的质粒的比例可用于使衣壳表面上的标签数量在每个衣壳1个到60个之间变化(形成AAV衣壳的多肽有60个)。对于带最多标签(60个标签)的AAV的产生，不需要使用编码不带标签衣壳蛋白的质粒。例如，在一个实施方案中，本发明的AAV-多肽偶联物可以仅具有一个连接的(其非限制性实例可以是共价连接的)生物活性多肽。在其他实施方案中，本发明的AAV-多肽偶联物可以具有多个这样的连接的生物活性多肽，如3个或更多个，5个或更多个，10个或更多个，20个或更多个(或“约”如此数量的共价结合的生物活性分子)。在本发明的AAV-多肽偶联物中，此类连接的生物活性多肽的数量可以高达30，或高达50，或高达60，这取决于所需的应用(或“约”如此数量的结合的生物活性分子)。
产生后，可以纯化所得的AAV，并与多肽混合(通常但并非必须在PBS中)，所述多肽包含第一结构域(其为标签的结合伴侣)和第二结构域，其为生物活性多肽，其中AAV和多肽结合(其非限制性实例包括共价结合)。从此类包装细胞系纯化AAV对于本领域普通技术人员而言是常规且是已知的。
本发明的AAV-多肽偶联物可以用于在偶联物感染细胞后，将结合的生物活性多肽递送至细胞。该方法特别适合于将生物活性多肽递送至期望该多肽在细胞内瞬时存在的细胞。这与使用AAV将多肽递送至细胞的典型递送相反，在典型递送中，通过将编码所需多肽的基因(编码序列)作为转基因包含在AAV载体基因组内来将多肽递送至细胞。感染后，AAV载体基因组保留在非分裂细胞内，从而使AAV基因组内的转基因在细胞内永久表达，尤其是在组成型启动子控制下的情况下。然而，对于某些多肽，组成性地永久性生产此类多肽是不希望的。与CRISPR/Cas9系统相关的Cas9就是一个这样的例子，该系统迅速成为可用的最强大的研究工具之一。体内递送仍然是阻碍基于CRISPR/Cas9的方法成功的最大障碍。Cas9的长期过表达会大大增加在非计划中基因组位点处的脱靶切割风险。因此，基因编辑方法的重要目标是提供Cas9的瞬时高效递送。通过提供AAV-多肽偶联物，本发明可以将Cas9多肽递送至细胞，而不是将永久性表达的转基因递送至细胞，从而满足这两个挑战。以与AAV表面连接的蛋白质形式递送Cas9提供瞬时活性，并释放AAV基因组中用于转基因的空间(例如基于CRISPR/Cas9方法的供体DNA、编码荧光标志物的基因或其他所需的转基因)。由于Cas9不是遗传编码的，所以通过本发明偶联物递送的该蛋白质将随着时间的推移被细胞降解，从而降低潜在的有害长期脱靶效应。
生物活性多肽结构域也可以是荧光多肽，例如绿色荧光肽(GFP)，从而使得偶联物向细胞的递送能够便于对感染的追踪。这例如在图4的分图C中示出。
生物活性多肽结构域也可以是多肽，如霍乱毒素的β亚基(CTB)或狂犬病毒G蛋白(RVGP)，其表达将改变病毒的趋向性。例如，不希望受到理论约束，将CTB和RVGP连接到衣壳表面可以使它更高效地感染周围神经和/或可以改善逆行运输。
第一AAV-第二AAV偶联物
在一个实施方式中，本发明提供了一种偶联物，其包含：本发明的含外表面的AAV，该表面包括能与结合伴侣形成键(非限制性的例子是共价键)的一个或多个肽标签(“第一AAV”)，和至少一个第二AAV，其中，第二AAV包括第二外表面，该第二外表面包括针对该标签或针对单独接头分子的至少一个结合伴侣。在偶联物内，所述至少一个第一AAV和至少一个第二AAV结合。同样，与第一AAV一样(如上所述)，偶联物内的至少一个第二AAV优选是活病毒。
在该实施方式中(第一AAV-第二AAV偶联物)，第二AAV可以以与第一AAV表达标签相同的方式(例如，掺入突变体VP2多肽或其他表面多肽)在第二表面上表达结合伴侣。
在该实施方式中(第一AAV-第二AAV偶联物)，第一和第二AAV都可以表达结合伴侣标签(例如SpyTag和SnoopTag)，其随后经由单独的接头分子(例如SpyCatcher-SnoopCatcher融合蛋白)结合在一起形成一个三段式聚结物(three-piececonglomerate)。可以在SpyTag/SpyCatcher插入位点使用其他的接头序列，例如用于SpyTag/SnoopTag/SpyTag002的LA…A接头，以及VP2刚性接头，长柔性接头和较短的接头。图1的A行描绘了一个实施方式，其中偶联物内的AAV通过偶联物内分开的AAV之间的肽标签/蛋白质结合伴侣相互作用直接结合。图1的B行描绘了其中AAV经由第三接头分子结合的实施方式，其中第三接头分子将AAV载体桥接在一起。
本发明的第一AAV-第二AAV偶联物可通过改变在第一和第二AAV表面上表达的标签和结合伴侣的数目，通过改变包装细胞系中表达标签的衣壳蛋白的比例，来掺入任何期望数量的AAV(如上所述)。此后，可例如基于尺寸排阻亲和力，离子交换FPLC色谱法或其他可以纯化具有所需AAV数量的偶联物(例如，与单体或三聚体相反的二聚体)的方法来纯化第一AAV-第二AAV偶联物。例如，在一个实施方式中，偶联物可包含AAV的二聚体(参见例如图1的A行)。在其他实施方式中，第一AAV-第二AAV偶联物可以是三聚体，四聚体，五聚体，十聚体等。因此，第一AAV-第二AAV偶联物可以包含多于一个的第一AAV(包含标签)，多于一个的第二个AAV(包含标签的特异性结合伴侣)或两者兼有。第一AAV-第二AAV偶联物中AAV的数量实际受限于物理尺寸，因为偶联物内的AAV需能够感染细胞并进入此类细胞的核。
本发明第一AAV-第二AAV偶联物的一种用途是有效递送比单一AAV载体的4.7kB限度更大的转基因。因此，该实施方式的优选设置涉及包含基因组的偶联物中的AAV，所述基因组包含转基因的分开的相应片段，从而在用第一AAV-第二AAV偶联物感染细胞时可组装成完整的转基因。
例如，在能够有效采用AAV进行基因治疗的许多疾病的治疗中，均需要递送大基因，超出了单个AAV载体递送4.7kB的限度。提高AAV载体的容量同时保持其表达稳定性和高效性是基因治疗领域中的首要目标。递送大基因的一个有前景的方法是将开放阅读框分入多个载体，它们通过在用两个(或更多个)载体对细胞进行病毒感染之后通过同源重组重新合并。然而，采用分开的病毒等同比例地将等比例的大基因分开部分递送到同一细胞中可能性极低。这就造成了蛋白质表达效率降低，以及形成截短的蛋白质产物。本发明的该方面(第一AAV-第二AAV偶联物)中AAV载体在偶联物中连接在一起，这确保了高效(接近100％)的共递送，使得感染性单位的运载容量有效翻倍(或增长三倍、四倍等，取决于偶联物中的AAV数量)。
第一AAV-第二AAV偶联物可用于递送被分解到多个AAV衣壳中的大基因以治疗疾病，例如斯特格病变黄斑营养不良(Stargardt’s，转基因为ABCA4)，神经纤维瘤病(转基因为NF1)，血友病，莱伯氏病先天性黑内障(转基因为CEP290)，杜氏肌营养不良，囊性纤维化，I型、II型和III型Usher综合征等。该方法也可用于将多个基因递送到细胞，其产物可在细胞内彼此相互作用或互补。例如，该方法可用于同时递送：RdCVF和RdCVF L，以同时受益于RdCVF的视锥存活特性和RdCVFL的抗氧化特性(例如，如Byrne等人所述，“Viral-mediatedRdCVF and RdCVFL expression protects cone and rod photoreceptors in retinaldegeneration”(“病毒介导的RdCVF和RdCVFL表达保护视网膜变性中的视锥和视杆光受体”)，J Clin Invest(2015)(通过引用将其全文纳入本文))；营养因子和替代基因，如PDE6B和XIAP(Yae等人，“Caspase Inhibition with XIAP as an Adjunct to AAV VectorGene-Replacement Therapy:Improving Efficacy and Prolonging the TreatmentWindow”(“以XIAP抑制胱冬酶作为AAV载体基因替代疗法的辅助手段：提高疗效并延长治疗窗口”)，PLOS ONE(2012)(通过引用将其全文纳入本文)；或者，治疗基因和报告基因，可以更好地分析治疗方法的感染性模式；递送基于Cas9的两个互补切口酶以提高基因组编辑的特异性和效率等。例如，该方法可用于通过共递送营养因子和替代基因高效地功能性拯救视力。该方法也可用于连接两种血清型的AAV以扩展载体的趋向性。
应当指出，本发明AAV的表面可以具有以下之一或两者：标签(包括多个类型的标签)，或针对标签(包括多个标签)的特异性结合伴侣，或同时具有一个或多个标签以及一个或多个特异性的结合伴侣。因此，在包含第一和第二AAV的偶联物中，一个或多个第一AAV还可包括针对肽标签的至少一个结合伴侣，所述肽标签能与结合伴侣形成键。类似地，在此类偶联物中，至少一个第二AAV的第二外表面可包括一个或多个肽标签，其能与结合伴侣形成键。将注意到，这可以促进此类偶联物内AAV的多聚化。参见图1，D行。
此外，本发明第一AAV-第二AAV偶联物(图1中，A行和B行)和本发明的AAV-生物活性多肽偶联物(图1，C行)的方式可一起使用。从该意义而言，本发明允许将任何串的含DNA的病毒颗粒和蛋白质作为多聚化偶联物单元一起递送至细胞或细胞群。
将注意到，本发明的AAV和偶联物用于感染细胞，从而将转基因和/或连接的(例如但不限于，共价连接的)生物活性多肽递送至此细胞。因此，本发明提供了一种将转基因递送至细胞的方法，所述方法通过使一个或多个本发明的AAV或偶联物至细胞来感染细胞，其中所述AAV或偶联物包含一个或多个转基因。如所指出的，对于大的(大于4.7kB)转基因，可以采用第一AAV-第二AAV偶联物来感染细胞，由此将转基因分配到组成第一AAV-第二AAV偶联物的至少两个AAV之间。然后，转基因的这些分开部分可以在细胞内重新组装以产生转基因的完整编码序列。
类似地，本发明提供了一种将生物活性多肽递送至细胞的方法，所述方法用本文所述的一个或多个本发明的AAV-生物活性多肽偶联物感染细胞。感染后，与偶联物中AAV外表面上的标签连接(例如但不限于共价连接)的生物活性多肽会瞬时递送至细胞，而不是作为永久表达的转基因的产物。如上所述，这对于防止诸如Cas9的生物活性蛋白质在细胞内的脱靶效应是优选的。
本发明的方法可用于感染AAV表现出趋向性的任何细胞，这是本领域普通技术人员已知的。例如，细胞可以是诸如外分泌分泌细胞(例如，腺细胞，如唾液腺细胞，乳腺细胞，汗腺细胞，消化腺细胞等)，激素分泌腺细胞(例如垂体细胞，甲状腺细胞，甲状旁腺细胞，肾上腺细胞等)，外胚层来源的细胞(例如，角质化上皮细胞(例如，构成皮肤和头发)，湿的分层屏障上皮细胞(例如，角膜，舌头，口腔，胃肠道，尿道，阴道等)，神经系统细胞(例如外周和中枢神经元，神经胶质等)，中胚层来源的细胞，许多内部器官的细胞(例如肾脏，肝脏，胰腺，心脏，肺)，骨髓细胞，以及肿瘤内或其他部位的癌细胞。适合于被本发明的AAV和偶联物感染的细胞的优选但非限制性的例子包括但不限于：外周和中枢神经系统中的神经元，感光细胞，视网膜神经节细胞，视网膜色素上皮细胞，耳蜗细胞，Müller神经胶质细胞，视网膜双极细胞，无长突细胞和水平细胞。该细胞可以是体外或体内的，并且可以来自任何所需的哺乳动物宿主，例如实验动物(大鼠，小鼠等)，具有农业或兽医学价值的动物(例如牛，犬，山羊，马，猫，绵羊，猪等)或灵长类动物，例如猴子，类人猿，或优选人类，包括人患者体内的细胞。
本发明还相伴提供了一种组合物，其包含细胞和如上所述的一种或多种AAV、AAV生物活性偶联物或AAV-AAV偶联物，其中细胞被所述AAV或偶联物感染。细胞可以是体内或体外的，且为AAV或偶联物表现出趋向性和感染性的任何所需类型(以上所描述)。当然，在细胞是体外的情况下，组合物还包括合适的培养基以维持和增殖组合物中被感染的细胞。这样的培养基是本领域普通技术人员已知的，并且可以根据组合物中细胞的类型来选择合适的培养基。
为了便于体内使用，特别是人类患者的体内使用，本发明还提供了药物组合物，其包含一种或多种如上所述的AAV、AAV-多肽偶联物或AAV-AAV偶联物，以及运载体(carrier)，优选为生理学上的-可接受的载剂。组合物的载剂可以是针对载体的任何合适的载剂。载剂通常是液体，但也可以是固体，或液体和固体组分的组合。理想地，载剂是药学上可接受的(例如生理上或药理学上可接受的)载剂(例如赋形剂或稀释剂)。药学上可接受的载剂是众所周知的并且容易获得。载剂的选择将至少部分由用于施用组合物的特定载体和特定方法确定。组合物可以进一步包含任何其他合适的组分，特别是用于增强组合物的稳定性和/或其最终用途。因此，本发明的组合物有广泛的适宜制剂。以下制剂和方法仅是示例性的，绝不是限制性的。
适用于胃肠外给药的制剂包括：水性和非水性等渗无菌注射溶液，其可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂以及使得制剂与预期接受者的血液或其他组织等渗的溶质；水性和非水性无菌悬浮液，其可包含助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。通常，此类载剂是生理盐水溶液，其有助于通过皮肤点刺或通过皮下，肌内，瘤内或胃肠外注射或直接注射入所需的任何组织或器官中的给药。然而，也可使用其他载剂(例如，油膏剂，乳膏剂，贴剂等，对于例如用于经皮给药)。
制剂可存在于单位剂量或多剂量封装容器(例如，安瓿和药瓶)中，并可以在冷冻干燥(冻干)条件下保存，临用前只需要加入无菌液体赋形剂(例如，注射用水)即可。
另外，该组合物可以包含另外的治疗或生物活性剂。例如，可以存在可用于治疗特定适应症的治疗因子。控制炎症的因子，例如布洛芬或类固醇，可以是组合物的一部分，以减少与载体的体内给药和生理困扰有关的肿胀和炎症。免疫系统抑制剂可以通过组合物方法给药，以减少对载体本身或与疾病相关的任何免疫反应。或者，组合物中可包含免疫增强剂以上调机体抵抗疾病的天然防御能力。可以存在抗生素，例如杀微生物剂和杀真菌剂，以减少与基因转移过程和其他疾病相关的感染风险
以下实施例进一步说明了本发明，但是，当然不应解释为以任何方式限制本发明的范围。在实施例1-4的如下实验中采用了以下方法。
克隆和制备包装质粒
为了产生掺入SpyTag/SnoopTag，SpyCatcher，SnoopCatcher，SpyTag002或SnoopTag002的AAV载体，通过PCR扩增插入区并用Gibson Assembly(新英格兰生物实验公司，New England Biolabs)进行退火，将接头肽工程化改造到AAV衣壳的表面暴露区域。将接头肽插入AAV的VP3亚基的第453或588位和VP2亚基的N或C端。(有关序列，请参见附录)。
病毒载体的产生
通过质粒共转染方法(Grieger等人，“Production and characterization ofadeno-associated viral vectors.”(“腺相关病毒载体的生产和表征”)，NatProtoc.2006；1(3)：1412-28(通过引用以其全文纳入本文))，采用3或4个质粒产生了在衣壳蛋白上携带SpyTag或SnoopTag以及携带编码GFP或mCherry的基因组的AAV载体。通过碘克沙醇梯度超速离心，然后用Amicon Ultra-15离心过滤器单元在PBS+0.001％普朗尼克F-68中进行缓冲液交换和浓缩，来纯化重组AAV。效价通过定量PCR相对于标准曲线来确定(Aurnhammer等人，Hum.Gene Ther.Methods.23(1):18-28(2012)(通过引用以其全文纳入本文))。
Western印迹
如下使得SpyCatcher蛋白与绿色荧光蛋白(GFP)，Cas9蛋白，或霍乱毒素的β亚基融合在一起：突变该蛋白质的编码序列的起始密码子或终止密码子，并通过Gibson克隆，将SpyCatcher的编码序列在该蛋白质的N-或C-末端插入框内。蛋白质在细菌细胞中表达并纯化。将AAV-SpyTag载体与10μg GFP-SpyCatcher或10μg Cas9-SpyCatcher蛋白混合。将AAV-SnoopTag载体与43.5μg SpyCatcher/SnoopCatcher融合蛋白接头分子混合。为了将AAV载体连接在一起，将AAV-SnoopTag和AAV-SpyTag载体与Spycatcher/SnoopCatcher融合蛋白接头分子混合。将它们在室温下孵育1小时，然后在4℃过夜。
第二天，将混合物在6-8％的Tris-甘氨酸凝胶上电泳。将蛋白质转移到PVDF膜上，并在5％的牛奶中封闭1小时。然后将膜在TBST中洗涤3x5分钟，并在4℃的一抗中孵育过夜：来自Progen的针对VP1、2和3的小鼠单克隆抗体(1:100)。将膜在TBST中洗涤15分钟，然后4×5分钟。在室温下应用抗小鼠二抗(Li-Cor，1:2000)1小时，然后使用Odyssey CLx成像系统(Li-cor)进行清洗和可视化。
CRISPR/Cas9转染
测试了Cas9-SpyCatcher融合蛋白的编辑能力。设计了针对人视紫红质基因的四种不同gRNA，并使用GeneArt Precision gRNA合成试剂盒(赛默飞世尔科学公司，ThermoFisher Scientific)进行了合成。使用Lipofectamine CRISPRMAX转染试剂(赛默飞世尔科学公司，Thermo Fisher Scientific)，将Cas9-SpyCatcher与gRNA一起转染入HEK293细胞。根据Lipofectamine CRISPRMAX转染方案确定Cas9-SpyCatcher和gRNA的浓度。在测试编辑效率之前，将细胞孵育72小时。
AAV-SpyTag-Cas9-SpyCatcher-RNP组装物
为了制备Cas9 RNP复合物，将Cas9-SpyCatcher蛋白与sgRNA以2:1或4:1摩尔比温育。在一种方法中，在感染细胞前一天将Cas9-SpyCatcher蛋白与AAV-SpyTag载体混合。在即将进行实验之前，将sgRNA添加到混合物中，并在室温下孵育10或20分钟。在另一种方法中，将AAV-SpyTag载体，Cas9-SpyCatcher蛋白和sgRNA混合在一起，并在室温下孵育30分钟。用该组装物感染HEK293细胞并温育72小时，然后测试编辑效率。
测试CRISPR/Cas9编辑效率
为了量化在期望的基因组位点的编辑能力，在HEK293T细胞上进行T7核酸内切酶I测试，使用向导RNA UAGAGCGUGAGGAAGUUGAU(SEQ ID NO:12)，其将基因组编辑引导到视紫红质基因。对于T7核酸内切酶I分析，使用Qiagen DNeasy血液和组织试剂盒在转染后约72小时提取基因组DNA。设计引物(hRHO 1Fw:AGGCCTTCGCAGCATTCTT(SEQ ID NO:13)和hRHO1Rv:GCAGCACCCCATCTGTTTTC(SEQ ID NO:14))来扩增包含靶位点的约1kb区域，扩增采用Q5高保真DNA聚合酶。用Zymo DNA清洁与浓集器(Zymo DNA Clean and Concentrator)纯化PCR反应，然后进行T7核酸内切酶1消化。。用T7核酸内切酶处理的样品与未消化的样品一起在琼脂糖凝胶上电泳。
实施例1
该实施例证实了包含外表面的AAV的产生，稳定性和感染性，该表面包含能与结合伴侣形成共价键的一个或多个肽标签，其中AAV是活病毒。
将接头肽(标签)SpyTag和SnoopTag以及特异性结合伴侣SnoopCatcher工程化到AAV衣壳的表面暴露区域中，该衣壳包括VP3的第453、588位和VP2亚基的C或N末端。
病毒滴定，使用QPCR进行(如在Aurnhammer等，“Universal real-time PCR forthe detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derivedinverted terminal repeat sequences.”(“通用实时PCR对腺相关病毒血清型2衍生的反向末端重复序列的检测和定量”)Hum.Gene.Ther.Methods.23(1):18-28(2012)(通过引用以其全文纳入本文))，其携带接头分子，证明本发明的AAV可以携带这些接头(标签和特异性结合伴侣)而不影响病毒稳定性和感染性。这示于表1。
表1
表1.来自碘克沙醇纯化病毒的高病毒滴度证明了VP2和VP3的表面暴露区域插入接头分子后的AAV衣壳稳定性。“TG_GLS”指示包括TG和GLS序列以侧接SpyTag插入物的N-和C-末端(例如TG-SpyTag-GLS)，从而提供灵活性并允许有效的病毒包装。
实施例2
该实施例证明了如本文所述的第一AAV-第二AAV偶联物的产生。
将实施例1中提及的AAV物质混合在一起并通过电子显微镜观察。如图2所示，成对的AAV病毒偶联物是可见的。图2的分图A：作为对照的AAV2载体。图2的分图B：与AAV2-SnoopTag载体连接的AAV2-SpyTag载体，通过SpyCatcher/SnoopCatcher接头蛋白连接。病毒显示为二聚体或三聚体。图2的分图C：SpyTag/SnoopTag接头的过表达导致形成AAV衣壳簇，其中许多AAV载体系连在一起。
还通过Western印迹评估确认了表达标签(第一AAV)和表达结合伴侣(第二AAV)以形成连接的偶联物的能力。图3描绘了这些数据证明表达SpyTag和表达SnoopTag的AAV衣壳的连接，所述衣壳通过由SpyCatcher-SnoopCatcher融合蛋白制成的接头分子结合。
实施例3
该实施例证明了如本文所述的AAV-多肽偶联物的产生。
AAV2-SpyTag与其中绿色荧光蛋白(GFP或mClover)连接至SpyCatcher(GFP-SpyCatcher)的多肽结合(图4的分图A)。通过超分辨率显微镜在293细胞中跟踪GFP结合的病毒颗粒。结果显示病毒颗粒是感染性的，并且连接的蛋白质具有功能(图4的分图C)。
实施例4
该实施例证明了如本文所述的AAV-多肽偶联物的产生。
将Cas9融合至SpyCatcher以使其能够结合至AAV-SpyTag载体。首先，在HEK293T细胞中研究了Cas9-SpyCatcher融合蛋白与靶向人视紫红质的向导RNA的切割效率。结果示于图5的分图A中，并且它们表明，通过AAV-Cas9-SpyCatcher偶联物的感染递送的Cas9-SpyCatcher多肽成功切割靶标(视紫红质(Rhodopsin))。
还通过western印迹分析评估了Cas9-SpyCatcher与AAV2-SpyTag的结合能力。结果示于图5的分图B中。结果证明AAV2-SpyTag与Cas9-SpyCatcher结合。
]本文所引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，均通过引用并入本文，其程度与每个参考文献被单独且具体地指示为通过引用并入本文的全文相同。
描述本发明时(特别是在所附权利要求的上下文中)使用的术语“一个”和“一种”和“该”等类似表达应解释为涵盖单数和复数，除非另有说明或者上下文明确另有所指。术语“包含”、“具有”、“包括”以及“含有”应解释为开放式术语(即，表示“包括，但不限于”)，除非另有说明。除非本文中另有说明，本文中对数值范围的引用仅仅是一种速记方法，单独表示落在该范围内的各个独立的值，且各个独立的值包括在说明书范围内，如同它们被单独引用。本文所述的所有方法可以任何合适的顺序进行，除非另有说明或者与上下文明显矛盾。本文涉及的任何和所有实施例/实例，或者示例性的语言(例如，“例如/如/诸如”)的使用仅仅是为了更好地阐述本发明，而不是对本发明所要求保护范围的限制，除非另外指出。说明书中的所有语言都不应解释为指示对本发明实践所必需的非权利要求的要素。
本文描述了本发明的优选实施方式，包括发明人已知的用于实施本发明的最佳方式。通过阅读前述说明，那些优选实施例的变化形式对于本领域普通技术人员而言将变得明显。发明人期望熟练的技术人员适当地采用此类变化形式，并且发明人希望以不同于本文具体描述的方式来实践本发明。因此，本发明包括的许多实施方式包括适用法律所允许的所附权利要求中所述主题的所有修改和等同物。而且，除非本文另外指出或与上下文明显矛盾，否则本发明涵盖上述元素在其所有可能的变化中的任何组合。
附录——序列
SEQ ID NO:1：包含AAV2-588-SPYTAG插入物(带下划线)的部分序列(含TG_GLS接头)：
SEQ ID NO:2：包含AAV2-588-SNOOPTAG插入物(带下划线)的部分序列(含TG_GLS接头)：
SEQ ID NO:3:包含AAV2-453-SPYTAG插入物(带下划线)的部分序列(无接头)：
SEQ ID NO:4:包含AAV2-453-SPYTAG插入物(带下划线)的部分序列(具有TG_GLS接头)：
SEQ ID NO:5:包含VP2-SPYTAG的C末端中的插入物(带下划线)的部分序列(具有GSGGSGGSG接头)：
SEQ ID NO:6:包含VP2-SNOOPTAG的C末端中的插入物(带下划线)的部分序列(具有GSGGSGGSG接头)：
SEQ ID NO:7:包含AAV2-588-SPYTAG002的插入物(带下划线)的部分序列(具有TG_GLS接头)：
SEQ ID NO:8:包含AAV2-453-SPYTAG002的插入物(带下划线)的部分序列(具有TG_GLS接头)：
SEQ ID NO:9：SpyCatcher-VP2(SpyCatcher和长柔性接头带下划线):
/>
SEQ ID NO:10:Cas9-SpyCatcher002序列(SpyCatcher002带下划线):
/>
/>
SEQ ID NO:11:mClover(GFP变体)-SpyCatcher002序列(SpyCatcher002带下划线):
SEQ ID NO：12：UAGAGCGUGAGGAAGUUGAU
SEQ ID NO：13：AGGCCTTCGCAGCATTCTT
SEQ ID NO：14：GCAGCACCCCATCTGTTTTC
序列表
<110> 匹兹堡大学联邦系统高等教育
加利福尼亚大学董事会
<120> 基于AAV的基因和蛋白质递送模块化系统
<130> 741805
<150> US 62/636,638
<151> 2018-02-28
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2261
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 1
atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60
cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120
gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180
aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240
cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300
caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360
gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aacctgttaa gacggctccg 420
ggaaaaaaga ggccggtaga gcactctcct gtggagccag actcctcctc gggaaccgga 480
aaggcgggcc agcagcctgc aagaaaaaga ttgaattttg gtcagactgg agacgcagac 540
tcagtacctg acccccagcc tctcggacag ccaccagcag ccccctctgg tctgggaact 600
aatacgatgg ctacaggcag tggcgcacca atggcagaca ataacgaggg cgccgacgga 660
gtgggtaatt cctcgggaaa ttggcattgc gattccacat ggatgggcga cagagtcatc 720
accaccagca cccgaacctg ggccctgccc acctacaaca accacctcta caaacaaatt 780
tccagccaat caggagcctc gaacgacaat cactactttg gctacagcac cccttggggg 840
tattttgact tcaacagatt ccactgccac ttttcaccac gtgactggca aagactcatc 900
aacaacaact ggggattccg acccaagaga ctcaacttca agctctttaa cattcaagtc 960
aaagaggtca cgcagaatga cggtacgacg acgattgcca ataaccttac cagcacggtt 1020
caggtgttta ctgactcgga gtaccagctc ccgtacgtcc tcggctcggc gcatcaagga 1080
tgcctcccgc cgttcccagc agacgtcttc atggtgccac agtatggata cctcaccctg 1140
aacaacggga gtcaggcagt aggacgctct tcattttact gcctggagta ctttccttct 1200
cagatgctgc gtaccggaaa caactttacc ttcagctaca cttttgagga cgttcctttc 1260
cacagcagct acgctcacag ccagagtctg gaccgtctca tgaatcctct catcgaccag 1320
tacctgtatt acttgagcag aacaaacact ccaagtggaa ccaccacgca gtcaaggctt 1380
cagttttctc aggccggagc gagtgacatt cgggaccagt ctaggaactg gcttcctgga 1440
ccctgttacc gccagcagcg agtatcaaag acatctgcgg ataacaacaa cagtgaatac 1500
tcgtggactg gagctaccaa gtaccacctc aatggcagag actctctggt gaatccgggc 1560
ccggccatgg caagccacaa ggacgatgaa gaaaagtttt ttcctcagag cggggttctc 1620
atctttggga agcaaggctc agagaaaaca aatgtggaca ttgaaaaggt catgattaca 1680
gacgaagagg aaatcaggac aaccaatccc gtggctacgg agcagtatgg ttctgtatct 1740
accaacctcc agagaggcaa caccggtgcc cacatcgtga tggtggacgc ctacaagccg 1800
acgaagggct taagtagaca agcagctacc gcagatgtca acacacaagg cgttcttcca 1860
ggcatggtct ggcaggacag agatgtgtac cttcaggggc ccatctgggc aaagattcca 1920
cacacggacg gacattttca cccctctccc ctcatgggtg gattcggact taaacaccct 1980
cctccacaga ttctcatcaa gaacaccccg gtacctgcga atccttcgac caccttcagt 2040
gcggcaaagt ttgcttcctt catcacacag tactccacgg gacaggtcag cgtggagatc 2100
gagtgggagc tgcagaagga aaacagcaaa cgctggaatc ccgaaattca gtacacttcc 2160
aactacaaca agtctgttaa tgtggacttt actgtggaca ctaatggcgt gtattcagag 2220
cctcgcccca ttggcaccag atacctgact cgtaatctgt a 2261
<210> 2
<211> 2258
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 2
atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60
cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120
gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180
aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240
cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300
caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360
gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aacctgttaa gacggctccg 420
ggaaaaaaga ggccggtaga gcactctcct gtggagccag actcctcctc gggaaccgga 480
aaggcgggcc agcagcctgc aagaaaaaga ttgaattttg gtcagactgg agacgcagac 540
tcagtacctg acccccagcc tctcggacag ccaccagcag ccccctctgg tctgggaact 600
aatacgatgg ctacaggcag tggcgcacca atggcagaca ataacgaggg cgccgacgga 660
gtgggtaatt cctcgggaaa ttggcattgc gattccacat ggatgggcga cagagtcatc 720
accaccagca cccgaacctg ggccctgccc acctacaaca accacctcta caaacaaatt 780
tccagccaat caggagcctc gaacgacaat cactactttg gctacagcac cccttggggg 840
tattttgact tcaacagatt ccactgccac ttttcaccac gtgactggca aagactcatc 900
aacaacaact ggggattccg acccaagaga ctcaacttca agctctttaa cattcaagtc 960
aaagaggtca cgcagaatga cggtacgacg acgattgcca ataaccttac cagcacggtt 1020
caggtgttta ctgactcgga gtaccagctc ccgtacgtcc tcggctcggc gcatcaagga 1080
tgcctcccgc cgttcccagc agacgtcttc atggtgccac agtatggata cctcaccctg 1140
aacaacggga gtcaggcagt aggacgctct tcattttact gcctggagta ctttccttct 1200
cagatgctgc gtaccggaaa caactttacc ttcagctaca cttttgagga cgttcctttc 1260
cacagcagct acgctcacag ccagagtctg gaccgtctca tgaatcctct catcgaccag 1320
tacctgtatt acttgagcag aacaaacact ccaagtggaa ccaccacgca gtcaaggctt 1380
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ccggccatgg caagccacaa ggacgatgaa gaaaagtttt ttcctcagag cggggttctc 1620
atctttggga agcaaggctc agagaaaaca aatgtggaca ttgaaaaggt catgattaca 1680
gacgaagagg aaatcaggac aaccaatccc gtggctacgg agcagtatgg ttctgtatct 1740
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atggtctggc aggacagaga tgtgtacctt caggggccca tctgggcaaa gattccacac 1920
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ccacagattc tcatcaagaa caccccggta cctgcgaatc cttcgaccac cttcagtgcg 2040
gcaaagtttg cttccttcat cacacagtac tccacgggac aggtcagcgt ggagatcgag 2100
tgggagctgc agaaggaaaa cagcaaacgc tggaatcccg aaattcagta cacttccaac 2160
tacaacaagt ctgttaatgt ggactttact gtggacacta atggcgtgta ttcagagcct 2220
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<210> 3
<211> 2246
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 3
atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60
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tcagtacctg acccccagcc tctcggacag ccaccagcag ccccctctgg tctgggaact 600
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accaccagca cccgaacctg ggccctgccc acctacaaca accacctcta caaacaaatt 780
tccagccaat caggagcctc gaacgacaat cactactttg gctacagcac cccttggggg 840
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<210> 4
<211> 2261
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 4
atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60
cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120
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<210> 5
<211> 1842
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 5
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<210> 6
<211> 1839
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 6
aggccggtag agcactctcc tgtggagcca gactcctcct cgggaaccgg aaaggcgggc 60
cagcagcctg caagaaaaag attgaatttt ggtcagactg gagacgcaga ctcagtacct 120
gacccccagc ctctcggaca gccaccagca gccccctctg gtctgggaac taatacgatg 180
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<210> 7
<211> 2264
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 7
atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60
cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120
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gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aacctgttaa gacggctccg 420
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<210> 8
<211> 2264
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<220>
<223> 合成
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tcagtacctg acccccagcc tctcggacag ccaccagcag ccccctctgg tctgggaact 600
aatacgatgg ctacaggcag tggcgcacca atggcagaca ataacgaggg cgccgacgga 660
gtgggtaatt cctcgggaaa ttggcattgc gattccacat ggatgggcga cagagtcatc 720
accaccagca cccgaacctg ggccctgccc acctacaaca accacctcta caaacaaatt 780
tccagccaat caggagcctc gaacgacaat cactactttg gctacagcac cccttggggg 840
tattttgact tcaacagatt ccactgccac ttttcaccac gtgactggca aagactcatc 900
aacaacaact ggggattccg acccaagaga ctcaacttca agctctttaa cattcaagtc 960
aaagaggtca cgcagaatga cggtacgacg acgattgcca ataaccttac cagcacggtt 1020
caggtgttta ctgactcgga gtaccagctc ccgtacgtcc tcggctcggc gcatcaagga 1080
tgcctcccgc cgttcccagc agacgtcttc atggtgccac agtatggata cctcaccctg 1140
aacaacggga gtcaggcagt aggacgctct tcattttact gcctggagta ctttccttct 1200
cagatgctgc gtaccggaaa caactttacc ttcagctaca cttttgagga cgttcctttc 1260
cacagcagct acgctcacag ccagagtctg gaccgtctca tgaatcctct catcgaccag 1320
tacctgtatt acttgagcag aacaaacact ccaagtggaa ccggtgtgcc tactatcgtg 1380
atggtggacg cctacaagcg ttacaagggc ttaagtacca ccacgcagtc aaggcttcag 1440
ttttctcagg ccggagcgag tgacattcgg gaccagtcta ggaactggct tcctggaccc 1500
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gccatggcaa gccacaagga cgatgaagaa aagttttttc ctcagagcgg ggttctcatc 1680
tttgggaagc aaggctcaga gaaaacaaat gtggacattg aaaaggtcat gattacagac 1740
gaagaggaaa tcaggacaac caatcccgtg gctacggagc agtatggttc tgtatctacc 1800
aacctccaga gaggcaacag acaagcagct accgcagatg tcaacacaca aggcgttctt 1860
ccaggcatgg tctggcagga cagagatgtg taccttcagg ggcccatctg ggcaaagatt 1920
ccacacacgg acggacattt tcacccctct cccctcatgg gtggattcgg acttaaacac 1980
cctcctccac agattctcat caagaacacc ccggtacctg cgaatccttc gaccaccttc 2040
agtgcggcaa agtttgcttc cttcatcaca cagtactcca cgggacaggt cagcgtggag 2100
atcgagtggg agctgcagaa ggaaaacagc aaacgctgga atcccgaaat tcagtacact 2160
tccaactaca acaagtctgt taatgtggac tttactgtgg acactaatgg cgtgtattca 2220
gagcctcgcc ccattggcac cagatacctg actcgtaatc tgta 2264
<210> 9
<211> 2136
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 9
gccaccatgg gctcaggtga tagtgctacc catattaaat tctcaaaacg tgatgaggac 60
ggcaaagagt tagctggtgc aactatggag ttgcgtgatt catctggtaa aactattagt 120
acatggattt cagatggaca agtgaaagat ttctacctgt atccaggaaa atatacattt 180
gtcgaaaccg cagcaccaga cggttatgag gtagcaactg ctattacctt tacagttaat 240
gagcaaggtc aggttactgt aaatggcaaa gcaactaaag gtgacgctca tatttcaggt 300
ggtggcggtt caggcggagg tggctctggc ggtggcggat cggctccggg aaaaaagagg 360
ccggtagagc actctcctgt ggagccagac tcctcctcgg gaaccggaaa ggcgggccag 420
cagcctgcaa gaaaaagatt gaattttggt cagactggag acgcagactc agtacctgac 480
ccccagcctc tcggacagcc accagcagcc ccctctggtc tgggaactaa tacgatggct 540
acaggcagtg gcgcaccaat ggcagacaat aacgagggcg ccgacggagt gggtaattcc 600
tcgggaaatt ggcattgcga ttccacatgg atgggcgaca gagtcatcac caccagcacc 660
cgaacctggg ccctgcccac ctacaacaac cacctctaca aacaaatttc cagccaatca 720
ggagcctcga acgacaatca ctactttggc tacagcaccc cttgggggta ttttgacttc 780
aacagattcc actgccactt ttcaccacgt gactggcaaa gactcatcaa caacaactgg 840
ggattccgac ccaagagact caacttcaag ctctttaaca ttcaagtcaa agaggtcacg 900
cagaatgacg gtacgacgac gattgccaat aaccttacca gcacggttca ggtgtttact 960
gactcggagt accagctccc gtacgtcctc ggctcggcgc atcaaggatg cctcccgccg 1020
ttcccagcag acgtcttcat ggtgccacag tatggatacc tcaccctgaa caacgggagt 1080
caggcagtag gacgctcttc attttactgc ctggagtact ttccttctca gatgctgcgt 1140
accggaaaca actttacctt cagctacact tttgaggacg ttcctttcca cagcagctac 1200
gctcacagcc agagtctgga ccgtctcatg aatcctctca tcgaccagta cctgtattac 1260
ttgagcagaa caaacactcc aagtggaacc accacgcagt caaggcttca gttttctcag 1320
gccggagcga gtgacattcg ggaccagtct aggaactggc ttcctggacc ctgttaccgc 1380
cagcagcgag tatcaaagac atctgcggat aacaacaaca gtgaatactc gtggactgga 1440
gctaccaagt accacctcaa tggcagagac tctctggtga atccgggccc ggccatggca 1500
agccacaagg acgatgaaga aaagtttttt cctcagagcg gggttctcat ctttgggaag 1560
caaggctcag agaaaacaaa tgtggacatt gaaaaggtca tgattacaga cgaagaggaa 1620
atcaggacaa ccaatcccgt ggctacggag cagtatggtt ctgtatctac caacctccag 1680
agaggcaaca gacaagcagc taccgcagat gtcaacacac aaggcgttct tccaggcatg 1740
gtctggcagg acagagatgt gtaccttcag gggcccatct gggcaaagat tccacacacg 1800
gacggacatt ttcacccctc tcccctcatg ggtggattcg gacttaaaca ccctcctcca 1860
cagattctca tcaagaacac cccggtacct gcgaatcctt cgaccacctt cagtgcggca 1920
aagtttgctt ccttcatcac acagtactcc acgggacagg tcagcgtgga gatcgagtgg 1980
gagctgcaga aggaaaacag caaacgctgg aatcccgaaa ttcagtacac ttccaactac 2040
aacaagtctg ttaatgtgga ctttactgtg gacactaatg gcgtgtattc agagcctcgc 2100
cccattggca ccagatacct gactcgtaat ctgtaa 2136
<210> 10
<211> 5784
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 10
catcaccatc accatcacga gaacctctat ttccagggat cttctatgaa aatcgaagaa 60
ggtaaactgg taatctggat taacggcgat aaaggctata acggtctcgc tgaagtcggt 120
aagaaattcg agaaagatac cggaattaaa gtcaccgttg agcatccgga taaactggaa 180
gagaaattcc cacaggttgc ggcaactggc gatggccctg acattatctt ctgggcacac 240
gaccgctttg gtggctacgc tcaatctggc ctgttggctg aaatcacccc ggacaaagcg 300
ttccaggaca agctgtatcc gtttacctgg gatgccgtac gttacaacgg caagctgatt 360
gcttacccga tcgctgttga agcgttatcg ctgatttata acaaagatct gctgccgaac 420
ccgccaaaaa cctgggaaga gatcccggcg ctggataaag aactgaaagc gaaaggtaag 480
agcgcgctga tgttcaacct gcaagaaccg tacttcacct ggccgctgat tgctgctgac 540
gggggttatg cgttcaagta tgaaaacggc aagtacgaca ttaaagacgt gggcgtggat 600
aacgctggcg cgaaagcggg tctgaccttc ctggttgacc tgattaaaaa caaacacatg 660
aatgcagaca ccgattactc catcgcagaa gctgccttta ataaaggcga aacagcgatg 720
accatcaacg gcccgtgggc atggtccaac atcgacacca gcaaagtgaa ttatggtgta 780
acggtactgc cgaccttcaa gggtcaacca tccaaaccgt tcgttggcgt gctgagcgca 840
ggtattaacg ccgccagtcc gaacaaagag ctggcaaaag agttcctcga aaactatctg 900
ctgactgatg aaggtctgga agcggttaat aaagacaaac cgctgggtgc cgtagcgctg 960
aagtcttacg aggaagagtt ggcgaaagat ccacgtattg ccgccactat ggaaaacgcc 1020
cagaaaggtg aaatcatgcc gaacatcccg cagatgtccg ctttctggta tgccgtgcgt 1080
actgcggtga tcaacgccgc cagcggtcgt cagactgtcg atgaagccct gaaagacgcg 1140
cagactaatt cgagctcgaa caacaacaac aataacaata acaacaacct cgggatcgag 1200
gaaaacctgt acttccaatc caatgccacc atggataaga aatactcaat aggcttagat 1260
atcggcacaa atagcgtcgg atgggcggtg atcactgatg aatataaggt tccgtctaaa 1320
aagttcaagg ttctgggaaa tacagaccgc cacagtatca aaaaaaatct tataggggct 1380
cttttatttg acagtggaga gacagcggaa gcgactcgtc tcaaacggac agctcgtaga 1440
aggtatacac gtcggaagaa tcgtatttgt tatctacagg agattttttc aaatgagatg 1500
gcgaaagtag atgatagttt ctttcatcga cttgaagagt cttttttggt ggaagaagac 1560
aagaagcatg aacgtcatcc tatttttgga aatatagtag atgaagttgc ttatcatgag 1620
aaatatccaa ctatctatca tctgcgaaaa aaattggtag attctactga taaagcggat 1680
ttgcgcttaa tctatttggc cttagcgcat atgattaagt ttcgtggtca ttttttgatt 1740
gagggagatt taaatcctga taatagtgat gtggacaaac tatttatcca gttggtacaa 1800
acctacaatc aattatttga agaaaaccct attaacgcaa gtggagtaga tgctaaagcg 1860
attctttctg cacgattgag taaatcaaga cgattagaaa atctcattgc tcagctcccc 1920
ggtgagaaga aaaatggctt atttgggaat ctcattgctt tgtcattggg tttgacccct 1980
aattttaaat caaattttga tttggcagaa gatgctaaat tacagctttc aaaagatact 2040
tacgatgatg atttagataa tttattggcg caaattggag atcaatatgc tgatttgttt 2100
ttggcagcta agaatttatc agatgctatt ttactttcag atatcctaag agtaaatact 2160
gaaataacta aggctcccct atcagcttca atgattaaac gctacgatga acatcatcaa 2220
gacttgactc ttttaaaagc tttagttcga caacaacttc cagaaaagta taaagaaatc 2280
ttttttgatc aatcaaaaaa cggatatgca ggttatattg atgggggagc tagccaagaa 2340
gaattttata aatttatcaa accaatttta gaaaaaatgg atggtactga ggaattattg 2400
gtgaaactaa atcgtgaaga tttgctgcgc aagcaacgga cctttgacaa cggctctatt 2460
ccccatcaaa ttcacttggg tgagctgcat gctattttga gaagacaaga agacttttat 2520
ccatttttaa aagacaatcg tgagaagatt gaaaaaatct tgacttttcg aattccttat 2580
tatgttggtc cattggcgcg tggcaatagt cgttttgcat ggatgactcg gaagtctgaa 2640
gaaacaatta ccccatggaa ttttgaagaa gttgtcgata aaggtgcttc agctcaatca 2700
tttattgaac gcatgacaaa ctttgataaa aatcttccaa atgaaaaagt actaccaaaa 2760
catagtttgc tttatgagta ttttacggtt tataacgaat tgacaaaggt caaatatgtt 2820
actgaaggaa tgcgaaaacc agcatttctt tcaggtgaac agaagaaagc cattgttgat 2880
ttactcttca aaacaaatcg aaaagtaacc gttaagcaat taaaagaaga ttatttcaaa 2940
aaaatagaat gttttgatag tgttgaaatt tcaggagttg aagatagatt taatgcttca 3000
ttaggtacct accatgattt gctaaaaatt attaaagata aagatttttt ggataatgaa 3060
gaaaatgaag atatcttaga ggatattgtt ttaacattga ccttatttga agatagggag 3120
atgattgagg aaagacttaa aacatatgct cacctctttg atgataaggt gatgaaacag 3180
cttaaacgtc gccgttatac tggttgggga cgtttgtctc gaaaattgat taatggtatt 3240
agggataagc aatctggcaa aacaatatta gattttttga aatcagatgg ttttgccaat 3300
cgcaatttta tgcagctgat ccatgatgat agtttgacat ttaaagaaga cattcaaaaa 3360
gcacaagtgt ctggacaagg cgatagttta catgaacata ttgcaaattt agctggtagc 3420
cctgctatta aaaaaggtat tttacagact gtaaaagttg ttgatgaatt ggtcaaagta 3480
atggggcggc ataagccaga aaatatcgtt attgaaatgg cacgtgaaaa tcagacaact 3540
caaaagggcc agaaaaattc gcgagagcgt atgaaacgaa tcgaagaagg tatcaaagaa 3600
ttaggaagtc agattcttaa agagcatcct gttgaaaata ctcaattgca aaatgaaaag 3660
ctctatctct attatctcca aaatggaaga gacatgtatg tggaccaaga attagatatt 3720
aatcgtttaa gtgattatga tgtcgatcac attgttccac aaagtttcct taaagacgat 3780
tcaatagaca ataaggtctt aacgcgttct gataaaaatc gtggtaaatc ggataacgtt 3840
ccaagtgaag aagtagtcaa aaagatgaaa aactattgga gacaacttct aaacgccaag 3900
ttaatcactc aacgtaagtt tgataattta acgaaagctg aacgtggagg tttgagtgaa 3960
cttgataaag ctggttttat caaacgccaa ttggttgaaa ctcgccaaat cactaagcat 4020
gtggcacaaa ttttggatag tcgcatgaat actaaatacg atgaaaatga taaacttatt 4080
cgagaggtta aagtgattac cttaaaatct aaattagttt ctgacttccg aaaagatttc 4140
caattctata aagtacgtga gattaacaat taccatcatg cccatgatgc gtatctaaat 4200
gccgtcgttg gaactgcttt gattaagaaa tatccaaaac ttgaatcgga gtttgtctat 4260
ggtgattata aagtttatga tgttcgtaaa atgattgcta agtctgagca agaaataggc 4320
aaagcaaccg caaaatattt cttttactct aatatcatga acttcttcaa aacagaaatt 4380
acacttgcaa atggagagat tcgcaaacgc cctctaatcg aaactaatgg ggaaactgga 4440
gaaattgtct gggataaagg gcgagatttt gccacagtgc gcaaagtatt gtccatgccc 4500
caagtcaata ttgtcaagaa aacagaagta cagacaggcg gattctccaa ggagtcaatt 4560
ttaccaaaaa gaaattcgga caagcttatt gctcgtaaaa aagactggga tccaaaaaaa 4620
tatggtggtt ttgatagtcc aacggtagct tattcagtcc tagtggttgc taaggtggaa 4680
aaagggaaat cgaagaagtt aaaatccgtt aaagagttac tagggatcac aattatggaa 4740
agaagttcct ttgaaaaaaa tccgattgac tttttagaag ctaaaggata taaggaagtt 4800
aaaaaagact taatcattaa actacctaaa tatagtcttt ttgagttaga aaacggtcgt 4860
aaacggatgc tggctagtgc cggagaatta caaaaaggaa atgagctggc tctgccaagc 4920
aaatatgtga attttttata tttagctagt cattatgaaa agttgaaggg tagtccagaa 4980
gataacgaac aaaaacaatt gtttgtggag cagcataagc attatttaga tgagattatt 5040
gagcaaatca gtgaattttc taagcgtgtt attttagcag atgccaattt agataaagtt 5100
cttagtgcat ataacaaaca tagagacaaa ccaatacgtg aacaagcaga aaatattatt 5160
catttattta cgttgacgaa tcttggagct cccgctgctt ttaaatattt tgatacaaca 5220
attgatcgta aacgatatac gtctacaaaa gaagttttag atgccactct tatccatcaa 5280
tccatcactg gtctttatga aacacgcatt gatttgagtc agctaggagg tgacgggtca 5340
cctaagaaaa aacgaaaagt tgaggatcct aaaaagaaac gaaaagttga tggcagcggc 5400
ggcagcggcg gcagcggcgg cgccatggta accaccttat caggtttatc aggtgagcaa 5460
ggtccgtccg gtgatatgac aactgaagaa gatagtgcta cccatattaa attctcaaaa 5520
cgtgatgagg acggccgtga gttagctggt gcaactatgg agttgcgtga ttcatctggt 5580
aaaactatta gtacatggat ttcagatgga catgtgaagg atttctacct gtatccagga 5640
aaatatacat ttgtcgaaac cgcagcacca gacggttatg aggtagcaac tgctattacc 5700
tttacagtta atgagcaagg tcaggttact gtaaatggcg aagcaactaa aggtgacgct 5760
catactggat ccagtggtag ctaa 5784
<210> 11
<211> 1146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 11
catcaccatc accatcacga gaacctctat ttccagggag tgagcaaggg cgaggagctg 60
ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc 120
agcgtccgcg gcgagggcga gggcgatgcc accaacggca agctgaccct gaagttcatc 180
tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg cccaccctcg tgaccacctt cggctacggc 240
gtggcctgct tcagccgcta ccccgaccac atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc 300
atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc atctctttca aggacgacgg tacctacaag 360
acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac accctggtga accgcatcga gctgaagggc 420
atcgacttca aggaggacgg caacatcctg gggcacaagc tggagtacaa cttcaacagc 480
cactacgtct atatcacggc cgacaagcag aagaactgca tcaaggctaa cttcaagatc 540
cgccacaacg ttgaggacgg cagcgtgcag ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc 600
atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac aaccactacc tgagccatca gtccaagctg 660
agcaaagacc ccaacgagaa gcgcgatcac atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc 720
gggattacac atggcatgga cgagctgtac aagggcagcg gcggcagcgg cggcagcggc 780
ggcgccatgg taaccacctt atcaggttta tcaggtgagc aaggtccgtc cggtgatatg 840
acaactgaag aagatagtgc tacccatatt aaattctcaa aacgtgatga ggacggccgt 900
gagttagctg gtgcaactat ggagttgcgt gattcatctg gtaaaactat tagtacatgg 960
atttcagatg gacatgtgaa ggatttctac ctgtatccag gaaaatatac atttgtcgaa 1020
accgcagcac cagacggtta tgaggtagca actgctatta cctttacagt taatgagcaa 1080
ggtcaggtta ctgtaaatgg cgaagcaact aaaggtgacg ctcatactgg atccagtggt 1140
agctaa 1146
<210> 12
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 12
uagagcguga ggaaguugau 20
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 13
aggccttcgc agcattctt 19
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 14
gcagcacccc atctgttttc 20

Claims (10)

1.一种偶联物，其包含：
(a)第一腺相关病毒(AAV)，所述第一AAV是活病毒且包含外表面，所述外表面包含一个或多个肽标签，所述一个或多个肽标签能与结合伴侣形成键；
(b)至少一个多肽，所述多肽包含第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包含针对所述一个或多个肽标签的结合伴侣，所述第二结构域包含生物活性多肽，其中所述第一AAV和所述至少一个多肽结合，其中所述第二结构域包含Cas9蛋白；和，
(c)至少一个第二AAV，其中所述至少一个第二AAV是活病毒且包含第二外表面，所述第二外表面包含针对所述一个或多个肽标签或针对第三接头分子的至少一个结合伴侣，其中所述第一AAV和所述至少一个第二AAV通过所述一个或多个肽标签与所述第二外表面上的所述结合伴侣结合或通过所述第三接头分子结合，且其中所述第三接头分子将所述第一AAV和所述至少一个第二AAV桥接在一起，并且
其中，Cas9蛋白以与AAV表面连接的蛋白质形式而非遗传编码的形式通过所述偶联物递送。
2.如权利要求1所述的偶联物，其中，所述偶联物中的所述第一AAV和所述至少一个第二AAV包含基因组，所述基因组包含转基因的分开的相应片段，从而在用所述偶联物感染细胞时能够组装成完整的转基因。
3.如权利要求1所述的偶联物，其包含多于一个所述第一AAV。
4.如权利要求1所述的偶联物，其包含多于一个所述至少一个第二AAV。
5.如权利要求1所述的偶联物，其包含所述第三接头分子，其中所述第三接头分子将所述第一AAV和所述至少一个第二AAV桥接在一起。
6.一种组合物，其包含被权利要求1-5中任一项所述的偶联物感染的细胞。
7.如权利要求6所述的组合物，其中所述细胞是体内的。
8.如权利要求6或7所述的组合物，其中，所述细胞是人细胞。
9.如权利要求6或7所述的组合物，其中，所述细胞是牛、犬、山羊、马、猫、绵羊、猪或灵长类动物细胞。
10.一种药物组合物，其包含：如权利要求1-5中任一项所述的偶联物，以及药学上可接受的运载体。
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Bacterial superglue enables easydevelopment of efficient virus‑like particle based vaccines;Susan Thrane 等;《Journal of Nanobiotechnology》;20161231;第1-16页 *
Development of an intein-mediated split–Cas9 system for gene therapy;Dong-Jiunn Jeffery Truong等;《Nucleic Acids Research》;20151231;第43卷(第13期);摘要，第6451页左栏倒数第2段 *
Expanding AAV Packaging Capacity with Trans-splicing or Overlapping Vectors: A Quantitative Comparison;Dongsheng Duan 等;《MOLECULAR THERAPY》;20011031;第4卷(第4期);第1-9页 *
Plug-and-Display: decoration of Virus-Like Particles via isopeptide bonds for modular immunization;Karl D. Brune 等;《Scientific Reports》;20161209;第16卷;第1-13页 *
Production and characterization of adeno-associated viral vectors;Joshua C Grieger等;《NATURE PROTOCOLS》;20061231;第1卷(第3期);第1-17页 *
Triple Vectors Expand AAV Transfer Capacity in the Retina;Andrea Maddalena 等;《Molecular Therapy》;20180228;第26卷(第2期);第1-18页 *

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