KR20230006823A - Her2를 표적화하는 항원 결합 구조체 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
HER2를 표적화하는 항원 결합 구조체 및 이의 용도가 개시된다. 항원 결합 구조체, 이를 인코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 세포, 및 상기를 포함하는 약학적 조성물이 구체적으로 개시된다. HER2-발현 종양으로부터 고통받는 대상체를 치료하거나, HER2-발현 종양 세포를 사멸시키거나, 또는 HER2-발현 종양 세포의 성장을 억제하는 것과 같은 양태에서의 이의 용도가 추가로 제공된다.
Description
본 개시내용은 항원-결합 구조체, 및 특히 HER2-표적화 항원-결합 구조체 및 이의 용도에 관한 것이다.
ErbB-2(수용체 티로신-단백질 키나제 erbB-2)라고도 알려진 Her2(인간 표피 성장 인자 수용체 2)는 EGFR (ErbB-1), Her2/c-neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3) 및 Her4 (ErbB-4)를 포함하는 인간 표피 성장 인자 수용체(HER/EGFR/ERBB)패밀리의 구성원이다. Her2 단백질은 세포외 리간드 결합 도메인(도메인 I-IV), 막횡단 도메인, 및 세포내 도메인을 포함한다. Her2의 리간드는 알려져 있지 않다. Her2와 다른 3개의 수용체(ErbB-1, ErbB-3 및 ErbB-4)중 임의의 것은 이종이량체를 형성한다. 이량체화는 상기 수용체의 세포질 도메인에 있는 티로신 잔기의 자가인산화 및 MAPK (미토겐-활성화 단백질 키나제), PI3K/Akt (포스포이노시티드 3-키나제), PKC (단백질 키나제 C), 및 STAT (신호 변환 및 전사 활성화제)를 포함하는 다양한 신호 전달 경로의 활성화로 이어진다. 상기 Her2 유전자의 확장 또는 과발현은 일부 유형의 침습성 유방암의 발병 및 진행에 중요한 역할을 한다. 유방암 환자의 15%-30%는 Her2 양성이다. Her2는 유방암 환자의 중요한 바이오마커이고 치료의 표적이다. 또한, 위암 환자의 7%-34%와 침샘관암종 환자의 30%에서 과발현 되는 것으로 밝혀졌다.
Her2 세포외 도메인 IV(ECD4)를 표적으로 하는 로슈의 단일클론 항체 약물 허셉틴(Herceptin®), Her2 세포외 도메인 II(ECD2)를 표적으로 하는 로슈의 퍼제타(Perjeta®) 및 로슈의 ADC T-DM1®(아도-트라스투주맙 멤탄신(ado-trastuzumab memtansine)을 포함하는 Her2 양성 종양을 치료하기 위한 여러 Her2 표적 항체 약물. 이러한 단일클론 항체 약물의 작용 기전은 다음을 포함한다: 1) Her2 신호전달 하향 조절; 2) Her2에 결합하여 신호전달 이종이량체의 에피토프를 형성함; 3) Her2의 세포내이입; 및 4) 단일클론 항체의 ADCC(항체 의존성 세포 독성). 단일특이성 표적은 신호전달 및 병인에 관여할 수 있는 다른 표적 에피토프에 대해 지시되지 않아 약물 내성 및 회피 기전을 허용한다.
항체 응집은 발현 및/또는 정제, 면역원성, 독성, 분해, 결합력 손상, 또는 보관 후 활성 손실과 같은 측면에서 어려움을 나타낼 수 있다. 따라서, 산업적 응용에서는, 항체 응집을 줄이는 것이 바람직하다. scFv는 단일 사슬 분자이기 때문에 더 쉽게 응집되어, 이량체(디아바디), 삼량체(트리바디) 및 사량체(테트라바디)를 형성할 수 있다.
요약
본 개시내용은 감소된 응집을 갖는 항원-결합 구조체를 제공한다. 본 개시내용은 상기 항원-결합 구조체의 용도를 추가로 제공한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 1가이고 HER2-발현 세포 상의 HER2의 ECD4 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 단편을 포함하는 항원-결합 구조체를 제공하고, 여기서 상기 제1 항원-결합 단편은 scFv이고; 상기 제1 항원-결합 단편의 중쇄 가변 영역은 카바트 넘버링 체계에 따른 위치 30에서 아미노산 돌연변이를 포함하고, 바람직하게 상기 아미노산은 E로 돌연변이되고; 또는/및 상기 제1 항원-결합 단편의 경쇄 가변 영역은 카바트 넘버링 체계에 따른 위치 53에서 아미노산 돌여변이를 포함하고, 바람직하게 상기 아미노산은 Y로 돌연변이된다.
대안적으로, 상기 개시내용은 1가이고 HER2-발현 세포 상의 HER2의 ECD4 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 단편을 포함하는 항원-결합 구조체를 제공하고, 여기서 상기 제1 항원-결합 단편은 scFv이고; 상기 제1 항원-결합 단편의 중쇄 가변 영역은 카바트 넘버링 체계에 따른 위치 30에 아미노산 K 또는 E를 포함하고, 또는/및 상기 제1 항원-결합 단편의 경쇄 가변 영역은 카바트 넘버링 체계에 따른 위치 53에 아미노산 F 또는 Y를 포함하고; 그러나 상기 제1 항원-결합 단편의 상기 중쇄 가변 영역이 카바트 넘버링 체계에 따른 위치 30에 아미노산 K를 포함하는 경우, 상기 제1 항원-결합 단편의 상기 경쇄 가변 영역은 카바트 넘버링 체계에 따른 위치 53에 아미노산 F를 포함하지 않는다.
일부 실시양태에서, 상기 제1 항원-결한 단편의 상기 중쇄 가변 영역은 카바트 넘버링 체계에 따른 K30E 돌연변이를 포함하고, 또는/및 상기 제1 항원-결합 단편의 상기 경쇄 가변 영역에 카바트 넘버링 체계에 따른 F53Y 돌연변이를 포함한다. 일부 특정 실시 양태에서, 상기 제1 항원-결합 단편의 상기 중쇄 가변 영역은 카바트 넘버링 체계에 따른 K30E 돌연변이를 포함한다. 일부 다른 특정 실시 양태에서, 상기 제1 항원-결합 단편의 상기 경쇄 가변 영역은 카바트 넘버링 체계에 따른 F53Y 돌연변이를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 상기 제1 항원-결합 단편의 상기 중쇄 가변 영역은 카바트 넘버링 체계에 따른 K30E 돌연변이를 포함하고, 상기 제1 항원-결합 단편의 상기 경쇄 가변 영역은 카바트 넘버링 체계에 따른 F53Y 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 상기 제1 항원-결한 단편은 하기로부터 선택되는 CDR 그룹을 포함한다:
i. 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 중쇄 CDR1, 상기 중쇄 CDR2 및 상기 중쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 27, 28 및 29에 따른 아미노산 서열을 포함함;
ii. 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 중쇄 CDR1, 상기 중쇄 CDR2 및 상기 중쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 27, 28 및 29에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함함;
iii. 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 경쇄 CDR1, 상기 경쇄 CDR2 및 상기 경쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 30, 34 및 32에 따른 아미노산 서열을 포함함;
iv. 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 경쇄 CDR1, 상기 경쇄 CDR2 및 상기 경쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 30, 34 및 32 에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함함;
v. 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 중쇄 CDR1, 상기 중쇄 CDR2 및 상기 중쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 27, 28 및 29에 따른 아미노산 서열을 포함하고; 상기 경쇄 CDR1, 상기 경쇄 CDR2 및 상기 경쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 30, 34 및 32에 따른 아미노산 서열을 포함함;
vi. 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 중쇄 CDR1, 상기 중쇄 CDR2 및 상기 중쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 27, 28 및 29에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노를 포함하고; 상기 경쇄 CDR1, 상기 경쇄 CDR2 및 상기 경쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 30, 34 및 32에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함함;
vii. 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 중쇄 CDR1, 상기 중쇄 CDR2 및 상기 중쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 43, 28 및 29에 따른 아미노산 서열을 포함하고; 상기 경쇄 CDR1, 상기 경쇄 CDR2 및 상기 경쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 30, 31 및 32에 따른 아미노산 서열을 포함함;
viii. 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 중쇄 CDR1, 상기 중쇄 CDR2 및 상기 중쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 43, 28 및 29에 따른 아미노산 서열을 포함하고; 상기 경쇄 CDR1, 상기 경쇄 CDR2 및 상기 경쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 30, 33 및 32에 따른 아미노산 서열을 포함함; 및
ix. 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 중쇄 CDR1, 상기 중쇄 CDR2 및 상기 중쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 44, 28 및 29에 따른 아미노산 서열을 포함하고; 상기 경쇄 CDR1, 상기 경쇄 CDR2 및 상기 경쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 30, 31 및 32에 따른 아미노산 서열을 포함함.
여기서 서열 번호: 27에 제시된 상기 서열은 GFNIX2DTYIH이고, 여기서 X2는 K 또는 E이고; 서열 번호: 34에 제시된 상기 서열은 SASX1LYS이고, 여기서 X1은 F 또는 Y이다.
일부 실시양태에서, 상기 항원-결합 단편은 트라스트주맙의 중쇄 가변 영역 또는 이의 돌연변이체, 및 트라스트주맙의 경쇄 가변영역 또는 이의 돌연변이체를 포함하고, 여기서 상기 중쇄 가변 영역의 돌연변이체는 카바트 넘버링 체계에 따른 K30E 돌연변이를 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역의 돌연변이체는 카바트 넘버링 체계에 따른 F53Y 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 상기 제1 항원-결합 단편은 하기로부터 선택된다:
i. 각각 서열 번호: 41 및 42에 따른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는 제1 항원-결합 단편;
ii. 각각 서열 번호: 41 및 42에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 제1 항원-결합 단편;
iii. 각각 서열 번호: 35 및 36에 따른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 제1 항원-결합 단편;
iv. 각각 서열 번호: 35 및 39에 따른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 제1 항원-결합 단편; 및
v. 각각 서열 번호: 40 및 36에 따른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 제1 항원-결합 단편;
여기서 서열 번호: 41에 제시된 상기 서열은:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIX2DTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS이고, 여기서 X2는 K 또는 E이고;
서열 번호: 42에 제시된 상기 서열은:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASX1LYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK이고, 여기서 X1은 F 또는 Y임.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 상기 항원-결합 구조체는 1가이고 HER2-발현 세포 상의 HER2의 ECD2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 단편을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 제2 항원-결합 단편은 Fab이다. 일부 실시양태에서, 상기 제2 항원-결합 단편은 페르투주맙의 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 제2 항원-결합 단편은 페르투주맙의 중쇄 가변 영역 및 페르투주맙의 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 상기 항원-결합 구조체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 상기 항원-결합 구조체의 적어도 하나의 항원-결합 단편을 인코딩하는 적어도 하나의 핵산을 포함하는 단리된 핵산 또는 단리된 핵산의 집합을 제공한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 핵산 및 핵산의 집합 중 하나 이상을 포함하는 벡터 또는 벡터의 집합을 제공한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 핵산 또는 핵산의 집합, 또는 본원에 기재된 벡터 또는 벡터의 집합을 포함하는 단리된 세포를 제공한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 상기 항원-결합 구조체 제조 방법을 제공하고, 이는 하기를 포함한다: 상기 항원-결합 구조체의 발현에 적합한 조건에서 숙주 세포를 배양하는 단계, 여기서 상기 숙주 세포는 본원에 기재된 상기 항원-결합 구조체를 인코딩하는 핵산, 또는 본원에 기재된 벡터 또는 벡터의 집합을 포함함; 및 상기 구조체를 정제하는 단계.
또 다른 양태에서, 본 기재내용은 HER2-발현 종양을 갖는 대상체를 치료하는 방법을 제공하고, 이는 본원에 기재된 상기 항원-결합 구조체 또는 본원에 기재된 약학적 조성물의 치료학적 유효량을 상기 대상체에 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 기재내용은 HER2-발현 종양 세포를 사멸시키거나 HER2-발현 종양 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공하고, 이는 본원에 기재된 상기 항원-결합 구조체를 상기 종양 세포와 접촉시키는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 세포에서 HER2 신호전달을 억제, 감소 또는 차단하는 방법을 제공하고, 이는 본원에 기재된 상기 항원-결합 구조체 또는 본원에 기재된 약학적 조성물의 유효량을 세포에 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 샘플에서 HER2를 검출 또는 측정하는 방법을 제공하고, 이는 상기 시료를 본원에 기재된 상기 항원-결합 구조체와 접촉시키고 결합 복합체를 검출 및 또는 측정하는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 항원-결합 구조체의 응집에 대한 내성을 향상시키는 방법을 제공하고, 여기서 상기 항원-결합 구조체는 1가이고 HER-발현 세포 상의 HER2의 ECD4 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 단편을 포함하고, 상기 제1 항원-결합 단편은 scFv이고; 상기 방법은 상기 제1 항원-결합 단편의 중쇄 가변 영역이 카바트 넘버링 체계에 따른 위치 30에 아미노산 돌연변이를 포함하고 상기 아미노산이 E로 돌연변이되도록, 또는/및 상기 제1 항원-결합 단편의 경쇄 가변 영역이 카바트 넘버링 체계에 따른 위치 53에 아미노산 돌연변이를 포함하고 상기 아미노산은 Y로 돌연변이되도록 상기 항원-결합 구조체를 변형시키는 것을 포함한다.
도 1은 항-HER2 이중특이성 항체 Expi Her2-2의 글리칸 맵핑 분석을 나타낸다;
도 2는 항-HER2 이중특이성 항체 23C2 Her2-2의 글리칸 맵핑 분석을 나타낸다;
도 3은 BT474 종양 세포에 대한 트라스투주맙과 페르투주맙의 조합 및 항-HER2 이중특이성 항체의 사멸률을 나타낸다;
도 4는 NCI-N87 종양 세포에 대한 트라스투주맙, 트라스투주맙과 페르투주맙의 조합, T-DM1 및 항-HER2 이중특이성 항체의 사멸률을 나타낸다;
도 5는 JIMT-1 종양 세포에 대한 트라스투주맙, 트라스투주맙과 페르투주맙의 조합, T-DM1 및 항-HER2 이중특이성 항체의 사멸률을 나타낸다;
도 6은 트라스투주맙, 트라스투주맙과 페르투주맙의 조합, 항-HER2 이중특이성 항체에 의한 BT474 종양 세포 증식의 억제를 나타낸다;
도 7은 위암 N87 마우스 이종이식 종양 모델에서 마우스 종양 부피의 변화에 대한 트라스투주맙과 페르투주맙의 조합 및 항-HER2 이중특이성 항체의 효과를 나타낸다;
도 8은 위암 N87 마우스 이종이식 종양 효능에서 마우스 체중의 변화에 대한 트라스투주맙과 페르투주맙의 조합 및 항-HER2 이중특이성 항체의 효과를 나타낸다; 및
도 9는 일부 예시적인 항-HER2 이중특이성 항체의 구조를 나타내고, 여기서 이량체 Fc는 흑색으로 표시된 하나의 사슬(제1 Fc 폴리펩티드) 및 회색으로 나타낸 다른 사슬(제2 Fc 폴리펩티드)로 도시되고; 제1 항원-결합 단편은 상기 제1 Fc 폴리펩티드와 융합된 scFv이고, 제2 항원-결합 단편은 상기 제2 Fc 폴리펩티드와 융합된 Fab이다.
도 2는 항-HER2 이중특이성 항체 23C2 Her2-2의 글리칸 맵핑 분석을 나타낸다;
도 3은 BT474 종양 세포에 대한 트라스투주맙과 페르투주맙의 조합 및 항-HER2 이중특이성 항체의 사멸률을 나타낸다;
도 4는 NCI-N87 종양 세포에 대한 트라스투주맙, 트라스투주맙과 페르투주맙의 조합, T-DM1 및 항-HER2 이중특이성 항체의 사멸률을 나타낸다;
도 5는 JIMT-1 종양 세포에 대한 트라스투주맙, 트라스투주맙과 페르투주맙의 조합, T-DM1 및 항-HER2 이중특이성 항체의 사멸률을 나타낸다;
도 6은 트라스투주맙, 트라스투주맙과 페르투주맙의 조합, 항-HER2 이중특이성 항체에 의한 BT474 종양 세포 증식의 억제를 나타낸다;
도 7은 위암 N87 마우스 이종이식 종양 모델에서 마우스 종양 부피의 변화에 대한 트라스투주맙과 페르투주맙의 조합 및 항-HER2 이중특이성 항체의 효과를 나타낸다;
도 8은 위암 N87 마우스 이종이식 종양 효능에서 마우스 체중의 변화에 대한 트라스투주맙과 페르투주맙의 조합 및 항-HER2 이중특이성 항체의 효과를 나타낸다; 및
도 9는 일부 예시적인 항-HER2 이중특이성 항체의 구조를 나타내고, 여기서 이량체 Fc는 흑색으로 표시된 하나의 사슬(제1 Fc 폴리펩티드) 및 회색으로 나타낸 다른 사슬(제2 Fc 폴리펩티드)로 도시되고; 제1 항원-결합 단편은 상기 제1 Fc 폴리펩티드와 융합된 scFv이고, 제2 항원-결합 단편은 상기 제2 Fc 폴리펩티드와 융합된 Fab이다.
상세설명
용어
"항원-결합 구조체" 용어는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체와 같이 항원에 결합할 수 있는 임의의 제제를 의미한다. 일부 양태에서, 상기 항원-결합 구조체는 관심 항원에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드다. 상기 항원-결합 구조체는 단량체, 이량체, 중합체, 단백질, 펩티드, 또는 단백질 또는 펩티드 복합체; 항체 또는 이의 항원-결합 부분; scFv 등일 수 있다. 상기 항원-결합 구조체는 단일특이성, 이중특이성 또는 다중특이성 폴리펩티드 구조체일 수 있다. 일부 양태에서, 상기 항원-결합 구조체는 예를 들어, 하나 이상의 Fc에 연결된 하나 이상의 항원-결합 구성(예를 들어, Fab 또는 scFv)을 포함할 수 있다. 상기 항원-결합 구조체의 다른 예시는 하기에 기재되고 실시예에 제공된다.
용어 "이중특이성"은 항원-결합 구조체와 같은 임의의 제제가 각각 고유한 결합 특이성을 갖는 2개의 항원-결합 부분(예를 들어, 항원-결합 단편)을 포함함을 나타내도록 의도된다. 예를 들어, 제1 항원-결합 단편은 제1 항원 상의 에피토프에 결합하는 반면, 제2 항원-결합 단편은 제2 항원 상의 에피토프에 결합한다. 다른 예로서, 제1 항원-결합 단편 및 제2 항원-결합 단편은 각각 동일한 항원의 상이한 에피토프에 결합한다.
"항체"는 가장 넒은 의미로 사용되며 원하는 생물학적 활성을 보유하는 한 온전한 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이성 항체(예를 들어, 이중특이성 항체), 다기능 항체 및 항체 단편을 구체적으로 포함한다.
용어 "가변 영역"은 항원 인식을 주로 담당하는 항체의 경쇄 또는 중쇄의 N-말단 도메인에 의해 정의되는 약 100 내지 110 또는 그 이상의 아미노산의 도메인을 나타낸다. 용어 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)은 각각 이들 경쇄 및 중쇄 도메인을 나타낸다.
"초가변영역"으로도 알려진 용어 "CDR"(상보성-결정 영역)은 서열이 매우 가변적이고/또는 구조적으로 정의된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 각 영역을 나타낸다. 자연의 4-쇄 항체는 전형적으로 6개의 CDR, 상기 중쇄 가변 영역에 3개 및 상기 경쇄 가변 영역에 3개를 포함한다.
용어 "Fab"는 각각 상기 경쇄 및 중쇄에 있는 상기 가변 도메인 VL(경쇄 가변영역) 및 VH(중쇄 가변 영역)와 함께 상기 경쇄의 불변 도메인(CL) 및 상기 중쇄의 상기 제1 불변 도메인(CH1)을 포함하는 것을 의미한다. 상기 가변 도메인은 항원-결합에 관여하는 상보성-결정 영역(CDRs)을 포함한다.
용어 "scFv"는 항체의 상기 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 여기서 이러한 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬에 존재한다. 일부 실시 양태에서, scFv는 항원-결합을 위해 필요한 구조를 형성할 수 있게 하는 상기 VH 및 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다.
용어 "ECD"는 세포외 도메인을 나타낸다. HER2의 상기 세포외 도메인은 4개의 도메인을 포함하고, 이는 ECD1, ECD2, ECD3 및 ECD4이다.
일반 용어 "트라스투주맙(trastuzumab)"은 인간 표피 성장 인자 수용체-2(HER2)의 ECD4에 선택적으로 작용하고 HER2-양성 암을 치료하기 위해 사용될 수 있는 재조합 인간화 모노클로날 항체를 나타내며, 이의 예시는 HERCEPTIN® 상표명으로 시판되는 치료용 모노클로날 항체 제품이다.
일반 용어 "페르투주맙(pertuzumab)"은 인간 표피 성장 인자 수용체-2(HER2)의 ECD2에 선택적으로 작용하고 HER2-양성 암을 치료하는데 사용될 수 있는 재조합 인간화 모노클로날 항체를 나타낸다.
용어 "HER2"는 EGFR 패밀리의 제2 구성원을 나타내고, 이는 티로신 키나제 활성을 가진다.
용어 "작동가능하게 연결된"은 둘 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드 도메인 또는 핵산(예를 들어, DNA) 단편 사이의 기능적인 연결을 나타낸다. 단백질, 항체 또는 다른 폴리펩티드의 맥락에서, 상기 용어 "작동가능하게 연결된"은 둘 이상의 아미노산 단편이 결합되어 기능적 폴리펩티드를 형성하는 것을 의미한다.
용어 "EC50"은 항원-결합 구조체의 최대 반응의 50%를 유도하는 유효 농도를 나타낸다. 본원에 사용된 용어 "IC50"은 항원-결합 구조체의 최대 반응의 50%를 유도하는 억제 농도를 나타낸다. EC50 및 IC50 둘 모두는 ELISA 또는 FACS 분석 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 방법에 의해 측정될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "KD"는 몰농도(M)으로 표현되는 평행 해리 상수를 나타낸다. 항원-결합 구조체의 상기 KD 값은 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 항원-결합 구조체의 상기 KD 값을 결정하는 한가지 바람직한 방법은 표면 플라즈몬 공명을 사용하는 것이고, 보다 바람직하게는 Biacore 시스템과 같은 바이오센서 시스템을 사용하는 것이다.
용어 "치료"는 병(illness)(예를 들어, 질병(disease)) 및 질병의 증상을 통계적으로 유의하게 치료, 치유, 경감, 완화, 변경, 구제, 개선, 향상 또는 영향을 미치거나 증상의 발병을 예방 또는 지연시키거나, 합병증 및 생화학적 지표, 또는 그렇지 않으면 질병(disease), 병(illness) 또는 장애의 추가 진행을 예방하거나 억제하기 위해 취한 조치를 의미한다.
용어 "치료학적 유효량"은 대상체에게 치료적 및/또는 예방적 이점을 제공하는데 필요한 항원-결합 구조체 또는 조성물의 양을 의미한다.
용어 "대상체"는 인간 또는 인간이 아닌 동물을 포함한다. 용어 "비인간동물"은 모든 척추동물, 예를 들어, 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 및 파충류와 같은 포유동물 및 비포유동물을 포함한다. 바람직하게는, 본 개시내용에 따른 대상체는 인간이다. 용어 "환자" 및 "대상체"는 달리 명시되지 않는 한 상호교환적으로 사용된다.
본원에 사용된, "약"은 특정 값에 대해 당업자에 의해 결정된 허용가능한 오차 범위 내에 있음을 의미하며, 이는 값이 어떻게 측정 또는 결정되는지, 즉, 측정 시스템에 의한 제한에 부분적으로 의존할 것이다. 예를 들어, "약"은 당업계에서 실시되는 바와 같이, 1 또는 1 이상의 표준 편차 이내임을 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 예를 들어, ± 2%, ± 1% 또는 ± 0.5%로 주어진 특정 수치 범위 내에서 변동하는 최대 5% (즉, ±5%)의 범위를 의미할 수 있다. 특정 값이 본 개시내용 또는 청구범위에서 제공되는 경우, 달리 언급되지 않는 한, "약"은 그 특정 값에 대해 허용 가능한 오차 범위 내에 있음을 의미하는 것으로 간주되어야 한다.
용어 "동일성"은 일관성이라고도 한다. 두 서열 사이의 퍼센트 동일성은 상기 서열이 공유하는 동일한 위치의 함수이며(즉, %동일성=동일한 위치의 수/위치의 총 수 Х 100), 여기서 두 서열의 최적의 정렬을 생성하기 위해 도입해야 하는 갭의 수 및 각 갭의 길이를 고려해야 한다. 하기 비제한적 실시예에 나타난 바와 같이, 서열의 비교 및 퍼센트 동일성의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 두 아미노산 사이의 퍼센트 동일성은 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 통합되고 갭 길이 패널티가 12 및 갭 패널티가 4인 PAM120 잔기 중량 테이블을 사용하는 E. Meyers 및 W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988))의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 또한, GCG 소프트웨어 패키지(www.gcg.com에서 사용가능)의 GAP 프로그램에 통합되고, 갭 가중치가 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4이고, 길이 가중치가 1, 2, 3, 4, 5 또는 6인 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스를 사용하는 Needleman 및 Wunsch (J. Mol. Biol., 484-453 (1970))의 알고리즘을 사용하여 두 아미노산 서열의 퍼센트 동일성을 결정할 수 있다.
용어 "Xn" 및 "Xaa"는 동등하며 관련 설명의 후속 정의에 의해 범위가 특정되는 비특정 아미노산을 나타낸다.
본 명세서에서 달리 나타내지 않는 한, 용어 "포함하다" 또는 이의 등가물(예를 들어, 포함하다(comprise) 및 함유하다(contain))은 개방형 용어이다. 이는 명시된 요소, 단계 또는 구성 요소를 포함하지만 이에 제한되지 않는 것을 의미하고 명시적으로 언급되지 않은 요소, 단계 또는 구성요소에 대해 열려있다.
본 명세서에서 달리 언급되지 않는 한, 단수 용어는 복수 형태를 포함하고, 그 반대의 경우도 마찬가지이다.
모든 특허, 특허 출원 및 기타 확인된 간행물은 설명 및 공개를 위해 여기에 참조로 명시적으로 포함된다. 이러한 간행물은 본 출원의 출원일 이전에 공개되었기 때문에 제공된다. 이러한 문서의 날짜에 대한 모든 진술 또는 이 문서의 내용에 대한 설명은 출원인이 사용할 수 있는 정보를 기반으로 하며 날짜 또는 이러한 문서의 내용이 정확하다는 것을 인정하지 않는다. 또한, 임의의 국가 또는 지역에서 이 간행물에 대한 언급은 해당 간행물이 해당 기술 분야에서 일반적으로 인정되는 지식의 일부를 구성한다는 인정으로 해석되어서는 안 된다. 본 개시내용의 다양한 양태는 다음 섹션에서 더 상세히 설명될 것이다.
항원-결합 구조체
본 개시내용은 1가이고 HER2-발현 세포 상의 HER2의 ECD4 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 단편을 포함하는 항원-결합 구조체를 제공하고, 여기서 상기 제1 항원-결합 단편은 scFv이고; 상기 제1 항원-결합 단편의 중쇄 가변 영역은 카바트 넘버링 체계에 따른 위치 30에서 아미노산 돌연변이를 포함하고(일부 예에서, 위치 30의 아미노산은 E로 돌연변이된다); 또는/및 상기 제1 항원-결합 단편의 경쇄 가변 영역은 카바트 넘버링 체계에 따른 위치 53에서의 아미노산 돌연변이를 포함한다(일부 예에서, 위치 53에서의 아미노산은 Y로 돌연변이된다).
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 상기 항원-결합 구조체는 1가이고 HER2-발현 세포 상의 HER2의 ECD2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 단편을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 상기 항원-결합 구조체는 제1 항원-결합 단편 또는/및 제2 항원-결합 단편, 예를 들어 항체의 CL 영역, CH1 영역, CH2 영역, 및/또는 CH3 영역의 하나 이상에 작동가능하게 연결된 면역글로불린 기능적 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 상기 항원-결합 구조체는 제1 항원-결합 단편 또는/및 제2 항원 결합 단편에 작동가능하게 연결된 불변 영역을 포함한다. 상기 불변 영역은 면역글로불린의 자연의 서열 불변 영역 또는 돌연변이된 불변 영역, 예를 들어, 자연의 또는 돌연변이된 CL, CH1, CH2, 및/또는 CH3 기능적 도메인 중 하나 이상일 수 있고; 일부 예에서, 이러한 기능적 도메인은 당업계의 통상적인 방식으로 작동가능하게 연결된다. 상기 불변 영역은 인간 면역글로불린의 불변 영역, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터 유래될 수 있다. 일부 예에서, 상기 불변 영역은 효과기 기능을 매개하는 능력이 개선되도록 변형을 가질 수 있다.
일부 실시 양태에서, 본원에서 제공되는 상기 항원-결합 구조체는 제1 항원-결합 단편 또는/및 제2 항원-결합 단편에 작동가능하게 연결된 면역글로불린 기능적 도메인 또는 골격, 예를 들어, Fc를 포함한다. 용어 Fc는 자연의 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. Fc는 인간 Fc일 수 있고; 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4에서 유래된다. Fc는 효과기 기능을 매개하는 능력이 개선되도록 변형을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 실시 양태에서, 상기 골격은 놉-인투-홀(knob into hole), H435R, Y436F 및 탈푸코실화와 같은 변형을 갖는다.
본원에서 제공되는 항원-결합 구조체는 1가, 2가 또는 다가일 수 있고, 단일특이성, 이중특이성 또는 다중특이성일 수 있다.
상기 항원-결합 구조체의 상기 제1 항원-결합 단편의 scFV 형태의 가변 영역으로의 돌연변이 도입이 상기 항원-결합 구조체의 응집을 감소시킬 수 있다는 것이 예기치 않게 발견되었다. 이들 돌연변이는, 예를 들어, 상기 제1 항원-결합 단변의 중쇄 가변 영역의 30번 위치(카바트 넘버)의 아미노산이 음으로 하전된 글루타민산(E)으로 돌연변이, 또는 상기 제1 항원-결합 단편의 경쇄 가변 영역의 위치 53(카바트 넘버)의 아미노산이 전기적으로 중성인 티로신(Y)으로 돌연변이, 또는 둘 모두의 돌연변이가 도입되는 것일 수 있다. 또한, 본 발명자들은 원래의 돌연변이되지 않은(위치 30의 아미노산이 E가 아님 또는/및 위치 53의 아미노산이 Y가 아님) 상기 제1 항원-결합 단편의 scFV 형태로부터 직접 이중특이성 항원-결합 구조체를 구성하는 것이 상기 이중 특이성 항원-결합 구조체에 바람직하지 않은 응집 특성을 부여할 것이라는 것을 발견하였다; 그러나, 본원에 기재된 상기 돌연변이를 상기 scFV에 도입한 후, 상기 구성된 이중특이성 항체가 응집에 대한 우수한 내성을 나타내었다. 일부 실시 양태에서, 상기 돌연변이의 도입은 상기 HER2 항원에 대한 항원-결합 구조체(예를 들어, 단일특이성 또는 이중특이성 항원-결합 구조체)의 친화도를 유의하게 감소시키지 않는다. 일부 실시 양태에서, 상기 항원-결합 구조체는 상기 HER2 항원에 대해 우수한 친화도를 갖는다. 일부 실시 양태에서, 상기 이중특이성 항원-결합 구조체(23C2 Her2-2, 등.)는 항원 Her2에 대해 트라스투주맙 및 페르투주맙보다 더 높은 결합 친화도를 나타낸다. 일부 실시 양태에서, 상기 항원-결합 구조체는 상기 Her2 항원에 대해 약 1E-8 M 이하, 약 1E-9 M 이하, 약 6.11E-10 M 이하, 약 1E-11 M 이하, 또는 약 1E-11 M 이하의 KD를 가진다. 일부 실시 양태에서, 상기 Her2 항원은 인간 Her2 항원이다. 일부 실시 양태에서, 본원에 제공된 상기 항원-결합 구조체의 결합 친화도 KD는 Biacore에 의해 측정된다.
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 상기 항원-결합 구조체는 종양 세포 사멸 또는/및 종양 성장 억제와 같은 우수한 항-종양 특성을 나타낸다. 일부 실시 양태에서, 본원에서 구성된 상기 항원-결합 구조체는 다양한 종양 세포 또는/및 HER2를 상이한 수준에서 발현하는 다양한 세포에 대해 우수한 사멸 효과를 가진다. 예를 들어, 상기 항원-결합 구조체 중 일부는 BT474 (Her2+++) 종양 세포에 대한 우수한 사멸 효과를 가지고; 상기 항원-결합 구조체 중 일부는 NCI-N87 (Her2++) 종양 세포에 대한 우수한 사멸 효과를 가지고; 상기 항원-결합 구조체 중 일부는 트라스투주맙-내성 종양 세포(예를 들어, JIMT-1)에 대한 우수한 사멸 효과를 가지고; 상기 항원-결합 구조체 중 일부는 낮은 수준으로 Her2를 발현하는 종양 세포(예를 들어, MCF-7 Her2 0/+)에 대한 우수한 사멸 효과를 가진다.
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 상기 항원-결합 구조체가 유의한 독성 효과를 갖지 않는다는 것이 마우스 모델을 이용한 실험에 의해 발견된다.
이중특이성 항원-결합 구조체
Her2에 결합하는 이중특이성 항원-결합 구조체가 본원에 제공된다. 상기 이중특이성 항원-결합 구조체는 각각 HER2의 특정 도메인 또는 에피토프에 결합하는 2개의 항원-결합 단편을 포함한다.
본원에서 제공되는 상기 항원-결합 구조체는 1가이고 HER2-발현 세포 상의 HER2의 ECD4 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 단편, 1가이고 HER2-발현 세포 상의 HER2의 ECD2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 단편을 포함하는 이중특이성 항원-결합 구조체이고;
여기서 상기 제1 항원-결합 단편은 scFv이고; 상기 제1 항원-결합 단편의 중쇄 가변 영역은 카바트 넘버링 체계에 따른 위치 30에 아미노산 돌여변이를 포함하고 상기 아미노산은 E로 돌연변이되고; 또는/및 상기 제1 항원-결합 단편의 경쇄 가변 영역은 카바트 넘버링 체계에 따른 위치 53에 아미노산 돌연변이를 포함하고 상기 아미노산은 Y로 돌연변이 된다.
일부 실시 양태에서, 본원에 제공된 상기 항원-결합 구조체는 이중특이성 항원-결합 구조체이고, 여기서 상기 제1 항원-결합 단편의 중쇄 가변영역은 카바트 넘버링 체계에 따른 위치 30에 아미노산 돌연변이를 포함하고, 상기 아미노산은 E로 돌연변이 된다.
일부 실시 양태에서, 본원에 제공된 상기 항원-결합 구조체는 이중특이성 항원-결합 구조체이고, 여기서 상기 제1 항원-결합 단편의 경쇄 가변 영역은 카바트 넘버링 체계에 따른 위치 53에 아미노산 돌연변이를 포함하고, 상기 아미노산은 Y로 돌연변이 된다.
일부 실시 양태에서, 본원에 제공되는 상기 항원-결합 구조체는 이중특이성 항원-결합 구조체이고, 여기서 상기 제1 항원-결합 단편의 중쇄 가변 영역은 카바트 넘버링 체계에 따른 위치 30에 아미노산 돌연변이를 포함하고 상기 아미노산은 E로 돌연변이되고; 상기 제1 항원-결합 단편의 경쇄 가변 영역은 카바트 넘버링 체계에 따른 위치 53에 아미노산 돌연변이를 포함하고 상기 아미노산은 Y로 돌연변이 된다.
일부 실시 양태에서, 상기 제1 항원-결합 단편의 중쇄 가변 영역은 카바트 넘버링 체계에 따른 위치 30에 아미노산 돌연변이를 포함하고, 돌연변이 되기 전의 상기 아미노산은 E가 아니고; 일부 실시 양태에서, 돌연변이되기 전의 상기 아미노산은 K이고, 일부 실시양태에서, 상기 제1 항원-결합 단편의 상기 중쇄 가변 영역은 카바트 넘버링 체계에 따른 K30E 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 상기 제1 항원-결합 단편의 경쇄 가변 영역은 카바트 넘버링 체계에 따른 위치 53에서 아미노산 돌연변이를 포함하고, 돌연변이되기 전의 상기 아미노산은 Y가 아니고; 일부 실시 양태에서, 돌연변이되기 전의 상기 아미노산은 F이고, 즉, 일부 실시 양태에서, 상기 제1 항원-결합 단편의 상기 경쇄 가변 영역은 카바트 넘버링 체계에 따른 F53Y 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 상기 항원-결합 구조체는 이중특이성 항원-결합 구조체이고, 여기서 상기 제1 항원-결합 단편은 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3를 포함하고, 여기서 상기 중쇄 CDR1, 상기 중쇄 CDR2 및 상기 중쇄 CDR3는 각각 서열 번호: 27, 28 및 29에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 동일성, 적어도 81% 동일성, 적어도 82% 동일성, 적어도 83% 동일성, 적어도 84% 동일성, 적어도 85% 동일성, 적어도 86% 동일성, 적어도 87% 동일성, 적어도 88% 동일성, 적어도 89% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 91% 동일성, 적어도 92% 동일성, 적어도 93% 동일성, 적어도 94% 동일성, 적어도 95% 동일성, 적어도 96% 동일성, 적어도 97% 동일성, 적어도 98% 동일성 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 특정 실시 양태에서, 본원에 기재된 상기 항원-결합 구조체는 이중특이성 항원-결합 구조체이고, 여기서 상기 제1 항원-결합 단편은 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3를 포함하고, 여기서 상기 중쇄 CDR1, 상기 중쇄 CDR2, 상기 중쇄 CDR3는 각각 서열 번호: 27, 28 및 29에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 상기 항원-결합 구조체는 이중특이성 항원-결합 구조체이고, 여기서 상기 제1 항원-결합 단편은 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3를 포함하고, 여기서 상기 경쇄 CDR1, 상기 경쇄 CDR2, 상기 경쇄 CDR3는 각각 서열 번호: 30, 34 및 32에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 동일성, 적어도 81% 동일성, 적어도 82% 동일성, 적어도 83% 동일성, 적어도 84% 동일성, 적어도 85% 동일성, 적어도 86% 동일성, 적어도 87% 동일성, 적어도 88% 동일성, 적어도 89% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 91% 동일성, 적어도 92% 동일성, 적어도 93% 동일성, 적어도 94% 동일성, 적어도 95% 동일성, 적어도 96% 동일성, 적어도 97% 동일성, 적어도 98% 동일성 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 특정 실시 양태에서, 본원에 기재된 상기 항원-결합 구조체는 이중특이성 항원-결합 구조체이고, 여기서 상기 제1항원-결합 단편은 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3를 포함하고, 여기서 상기 경쇄 CDR1, 상기 경쇄 CDR2 및 상기 경쇄 CDR3는 각각 서열 번호 30, 34 및 32에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 상기 항원-결합 구조체는 이중특이성 항원-결합 구조체이고, 여기서 상기 제1 항원-결합 단편은 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3를 포함하고, 여기서 상기 중쇄 CDR1, 상기 중쇄 CDR2 및 상기 중쇄 CDR3는 각각 서열 번호: 27, 28 및 29에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 동일성, 적어도 81% 동일성, 적어도 82% 동일성, 적어도 83% 동일성, 적어도 84% 동일성, 적어도 85% 동일성, 적어도 86% 동일성, 적어도 87% 동일성, 적어도 88% 동일성, 적어도 89% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 91% 동일성, 적어도 92% 동일성, 적어도 93% 동일성, 적어도 94% 동일성, 적어도 95% 동일성, 적어도 96% 동일성, 적어도 97% 동일성, 적어도 98% 동일성 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 상기 경쇄 CDR1, 상기 경쇄 CDR2 및 상기 경쇄 CDR3는 각각 서열 번호: 30, 34 및 32에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 동일성, 적어도 81% 동일성, 적어도 82% 동일성, 적어도 83% 동일성, 적어도 84% 동일성, 적어도 85% 동일성, 적어도 86% 동일성, 적어도 87% 동일성, 적어도 88% 동일성, 적어도 89% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 91% 동일성, 적어도 92% 동일성, 적어도 93% 동일성, 적어도 94% 동일성, 적어도 95% 동일성, 적어도 96% 동일성, 적어도 97% 동일성, 적어도 98% 동일성 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 상기 항원-결합 구조체는 이중특이성 항원-결합 구조체이고, 여기서 상기 제1 항원-결합 단편은 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3를 포함하고, 여기서 상기 중쇄 CDR1, 상기 중쇄 CDR2 및 상기 중쇄 CDR3는 각각 서열 번호: 27, 28 및 29에 따른 아미노산 서열을 포함하고; 상기 경쇄 CDR1, 상기 경쇄 CDR2 및 상기 경쇄 CDR3는 서열 번호: 30, 34 및 32에 따른 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 제1 항원-결합 단편은 각각 서열 번호: 43, 28, 29, 30, 31 및 32에 따른 상기 중쇄 CDR1, 상기 중쇄 CDR2, 상기 중쇄 CDR3, 상기 경쇄 CDR1, 상기 경쇄 CDR2 및 상기 경쇄 CDR3를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 제1 항원-결합 단편은 각각 서열 번호: 43, 28, 29, 30, 33 및 32에 따른 상기 중쇄 CDR1, 상기 중쇄 CDR2, 상기 중쇄 CDR3, 상기 경쇄 CDR1, 상기 경쇄 CDR2 및 상기 경쇄 CDR3를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 제1 항원-결합 단편은 각각 서열 번호: 44, 28, 29, 30, 31 및 32에 따른 상기 중쇄 CDR1, 상기 중쇄 CDR2, 상기 중쇄 CDR3, 상기 경쇄 CDR1, 상기 경쇄 CDR2 및 상기 경쇄 CDR3를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 상기 항원-결합 구조체는 이중특이성 항원-결합 구조체이고, 여기서 상기 제1 항원-결합 단편은 트라스투주맙의 중쇄 가변 영역의 돌연변이체 및 트라스투주맙의 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 상기 중쇄 가변 영역의 상기 돌연변이체는 카바트 넘버링 체계에 따른 K30E 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 상기 항원-결합 구조체는 이중특이성 항원-결합 구조체이고, 여기서 상기 제1 항원-결합 단편은 트라스투주맙의 중쇄 가변 영역 및 트라스투주맙의 경쇄 가변 영역의 돌연변이체를 포함하고, 여기서 상기 경쇄 가변 영역의 상기 돌연변이체는 카바트 넘버링 체계에 따른 F53Y 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 상기 항원-결합 구조체는 이중특이성 항원-결합 구조체이고, 여기서 상기 제1 항원-결합 단편은 트라스투주맙의 중쇄 가변 영역의 돌연변이체 및 트라스투주맙의 경쇄 가변 영역의 돌연변이체를 포함하고, 여기서 상기 중쇄 가변영역의 상기 돌연변이체는 K30E 돌연변이를 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역의 상기 돌연변이체는 F53Y 돌연변이를 포함한다.
상기 제1 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 scFV이다. 일부 실시 양태에서, 상기 중쇄 가변 영역은 트라스투주맙의 상기 중쇄 가변 영역 또는 이의 돌연변이체이고, 상기 경쇄 가변 영역은 트라스투주맙의 상기 경쇄 가변 영역 또는 이의 돌연변이체이다.
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 상기 항원-결합 구조체는 이중특이성 항원-결합 구조체이고, 여기서 상기 제1 항원-결합 단편의 상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역은 각각 서열 번호: 41 및 42에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 동일성, 적어도 85% 동일성, 적어도 86% 동일성, 적어도 87% 동일성, 적어도 88% 동일성, 적어도 89% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 91% 동일성, 적어도 92% 동일성, 적어도 93% 동일성, 적어도 94% 동일성, 적어도 95% 동일성, 적어도 96% 동일성, 적어도 97% 동일성, 적어도 98% 동일성 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 상기 제1 항원-결합 단편은 전술된 임의의 상기 CDR 영역 서열 특징을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 상기 제1 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역은 각각 서열 번호: 41 및 42에 따른 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 상기 제1 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역은 각각 서열 번호 35 및 36에 따른 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 상기 제1 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역은 각각 서열 번호: 35 및 39에 따른 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 상기 제1 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역은 각각 서열 번호: 40 및 36에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 상기 제1 항원-결합 단편의 상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역은 링커에 의해 연결되어 scFV를 형성한다. 상기 링커는 임의의 적합한 것, 예를 들어, 전기적으로 대전되고 및/또는 가요성 링커일 수 있다. 특정 실시 양태에서, 상기 링커는 펩티드 결합에 의해 연결된 1 내지 50개의 아미노산으로 이루어지고, 여기서 상기 아미노산은 20개의 자연 발생 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고; 보다 바람직한 실시 양태에서, 상기 1 내지 50개의 아미노산은 글리신, 알라닌, 프롤린, 아스파라긴, 글루타민 및 리신으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 보다 더 바람직하게는, 상기 링커는 대부분 입체적으로 방해받지 않는 아미노산(예를 들어 글리신 및 알라닌)으로 구성된다. 특히 유용한 가요성 링커는 (GGGGS)n ((G4S)n으로도 알려짐)이다. 일부 실시 양태에서, n은 1과 10 사이의 임의의 수, 즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 및 10, 또는 전술한 수 중 임의의 2개에 의해 정의된 임의의 범위, 예를 들어, 1-5, 2-5, 3-6, 2-4 및 1-4이다. 일부 특정 실시 양태에서, 상기 링커는 GGSGGSGGSGGSGG (서열 번호: 52)의 서열을 갖는 가요성 링커 펩티드를 포함한다. 일부 특정 실시 양태에서, 상기 링커는 GGGGSGGGGSGGGGS (서열 번호: 53)의 서열을 갖는 가요성 링커 펩티드를 포함한다. 일부 특정 실시 양태에서, 상기 링커는 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열 번호: 54)의 서열을 갖는 가요성 링커 펩티드를 포함한다. 일부 특정 실시 양태에서, 상기 링커는 GGGPGKR (서열 번호: 55)의 서열을 갖는 가요성 링커 펩티드를 포함한다. 다른 적합한 링커의 예는 또한 특허 출원 번호 WO2019195535의 표 4에 개시된 것들을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 상기 항원-결합 구조체는 이중특이성 항원-결합 구조체이고, 여기서 상기 제1 항원-결합 단편의 VH 및 VL는 VH-링커-VL의 순서로 N-말단에서 C-말단으로 배열된다. 일부 실시 양태에서, 상기 제1 항원-결합 단편의 VH 및 VL은 VL-링커-VH의 순서로 N-말단에서 C-말단으로 배열된다.
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 상기 항원-결합 구조체는 이중특이성 항원-결합 구조체이고, 여기서 상기 제2 항원-결합 단편은 Fab이다. 상기 제2 항원-결합 단편은 HER2-발현 세포 상의 HER2의 ECD2 항원에 특이적으로 결합한다.
일부 실시 양태에서, 상기 제2 항원-결합 단편은 페르투주맙의 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 상기 제2 항원-결합 단편은 페르투주맙의 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 상기 제2 항원-결합 단편은 페르투주맙의 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3를 포함한다. 페르트주맙의 상기 중쇄 CDR1, 상기 중쇄 CDR2, 상기 중쇄 CDR3, 상기 경쇄 CDR1, 상기 경쇄 CDR2 및 상기 경쇄 CDR3의 아미노산 서열은: 각각 GFTFTDYTMD (서열 번호: 45), DVNPNSGGSIYNQRFKG (서열 번호: 46), NLGPSFYFDY (서열 번호: 47), KASQDVSIGVA (서열 번호: 48), SASYRYT (서열 번호: 49), 및 QQYYIYPYT (서열 번호: 50)이다.
일부 실시 양태에서, 상기 제2 항원-결합 단편은 페르투주맙의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 상기 제2 항원-결합 단편은 페르투주맙의 Fab 단편이다. 페르투주맙의 상기 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호: 37에 제시되고, 페르투주맙의 상기 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호: 38에 제시된다.
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 상기 항원-결합 구조체는 불변 영역을 포함하는 이중특이성 항원-결합 구조체이다. 일부 실시 양태에서, 상기 불변 영역은 링커에 의해 상기 제1 항원-결합 단편 및 상기 제2 항원-결합 단편에 연결된다. 일부 실시 양태에서, 상기 불변 영역은 상기 제1 항원-결합 단편 및 상기 제2 항원-결합 단편에 직접 연결된다.
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 상기 항원-결합 구조체는 골격을 포함하는 이중특이성 항원-결합 구조체이다. 일부 실시 양태에서, 상기 골격은 링커 폴리펩티드(예를 들어, IgG1, IgG2 및 IgG4 힌지 영역으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드)에 의해 상기 제1 항원-결합 단편 및 상기 제2 항원-결합 단편에 연결된다. 일부 실시 양태에서, 상기 골격은 상기 제1 항원-결합 단편 및 상기 제2 항원-결합 단편에 직접 연결된다.
일부 실시 양태에서, 상기 골격은 제1 Fc 폴리펩티드 및 제2 Fc 폴리펩티드를 포함하는 이량체 Fc이다. 본원에 기재된 상기 Fc는 불변 영역의 적어도 하나의 부분을 포함하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. 이량체 Fc의 Fc 폴리펩티드는 이량체 Fc 도메인이 형성되는 2개의 폴리펩티드 중 하나, 즉, 면역 글로불린 중쇄의 C-말단 불변 영역을 포함하고 안정한 자가-회합이 가능한 폴리펩티드를 의미한다. 본원에서 달리 언급되지 않는 한, 상기 Fc 영역 또는 불변 영역의 상기 아미노산 잔기는 EU 넘버링 체계에 따라 넘버링된다. 예를 들어, 이량체 IgG Fc의 상기 Fc 폴리펩티드는 IgG CH2 및 IgG CH3 불변 도메인 서열을 포함한다. 상기 CH3 도메인은 각각 제1 Fc 폴리펩티드 및 제2 Fc 폴리펩티드로부터 유래된 두 개의 CH3 서열을 포함하고, 상기 CH2 도메인은 각각 제1 Fc 폴리펩티드 및 제2 Fc 폴리펩티드로부터 유래된 두 개의 CH2 서열을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 상기 제1 항원-결합 단편은 상기 제1 Fc 폴리펩티드에 작동가능하게 연결되고, 상기 제2 항원-결합 단편은 상기 제2 Fc 폴리펩티드에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시 양태에서, 상기 제1 항원-결합 단편은 제1 폴리펩티드 링커에 의해 상기 제1 Fc 폴리펩티드에 작동가능하게 연결되고, 상기 제2 항원-결합 단편은 제2 폴리펩티드 링커에 의해 상기 제2 Fc 폴리펩티드에 작동가능하게 연결된다. 상기 제1 링커 폴리펩티드 및 상기 제2 링커 폴리펩티드는 이황화 결합과 같은 공유 결합을 형성할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 상기 제1 링커 폴리펩티드 또는/및 상기 제2 링커 폴리펩티드는 IgG1의 상기 힌지 영역을 포함하고; 일부 실시 양태에서, 상기 제1 링커 폴리펩티드 또는/및 상기 제2 링커 폴리펩티드는 IgG2의 상기 힌지 영역을 포함하고; 일부 실시 양태에서, 상기 제1 링커 폴리펩티드 또는/및 상기 제2 링커 폴리펩티드는 IgG3의 상기 힌지 영역을 포함하고; 일부 실시 양태에서, 상기 제1 링커 폴리펩티드 또는/및 상기 제2 링커 폴리펩티드는 IgG4의 상기 힌지 영역을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 상기 이량체 Fc는 인간 IgG1의 Fc이다. 일부 실시 양태에서, 상기 이량체 Fc는 인간 IgG4의 Fc이다.
일부 실시 양태에서, 상기 이량체 Fc는 변형을 가진다. 일부 실시 양태에서, 상기 이량체 Fc는 H435R 변형 또는/및 Y436F 변형을 가지고, 이는 상기 제1 Fc 폴리펩티드 및 상기 제2 Fc 폴리펩티드의 폴리펩티드 사슬에서 발생할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 상기 이량체 Fc는 H435R 변형 또는/및 Y436F 변형을 가지고, 이는 다른 Fc 폴리펩티드가 아닌 하나의 Fc 폴리펩티드에서만 발생한다. 일부 실시 양태에서, 상기 이량체 Fc는 놉-인투-홀의 돌연변이 부위, 예컨대 Y349C, T366S, L368A, Y407V, S354C 및 T366W를 갖는다. 일부 실시 양태에서, 상기 이량체 Fc의 한 사슬은 T366Y/W 또는/및 S354C를 갖고, 다른 사슬은 Y407T/V, Y349C, T366S 또는/및 L368A를 갖는다.
일부 실시 양태에서, 상기 이량체 Fc는 푸코스를 포함하지 않는다.
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 상기 항원-결합 구조체는 글리코실화된다.
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 상기 항원-결합 구조체는 푸코실화된다. IgG1과 FcgRIIIa의 상호작용은 탈푸코실화에 의해 향상될 수 있고, 이에 의해 상기 항체의 ADCC가 향상된다. 아미노산 서열을 변경하지 않고 Fc 글리코실화 부위에서 푸코스가 거의 또는 전혀 없는 항원-결합 구조체를 생산하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 발현 세포가 있는 배지의 조성을 조정하거나, 발현 세포에서 FUT8과 같은 푸코스 발현-관련 유전자를 녹아웃시킨다.
일부 실시 양태에서, 본원에서 제공되는 이중특이성 항원-결합 구조체는 2가이다.
이중특이성 항원-결합 구조체는 표 S1에 예시적으로 제공된다. 일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 상기 이중특이성 항원-결합 구조체는 이중특이성 항체이다. 이중특이성 항체, 예컨대 Expi Her2-2, Expi Her2-3, Expi Her2-4, 23C-HER2-2, 23C-HER2-3 및 23C-HER2-4기 표 S2에 예시적으로 제공되며, CDR 및 가변 영역의 서열은 표 S2에 제공된다. 예시적인 이중특이성 항체는 2개의 중쇄 및 1개의 경쇄를 포함한다. Expi Her2-2 및 23C-HER2-2의 중쇄의 아미노산 서열은 서열 번호: 11 및 서열 번호: 13에 제시되어 있고, Expi Her2-2의 경쇄의 아미노산 서열은 서열 번호: 15에 제시되어 있고; Expi Her2-3 및 23C-HER2-3의 중쇄의 아미노산 서열은 서열 번호: 21 및 서열 번호: 13에 제시되어 있고, Expi Her2-3 및 23C-HER2-3의 경쇄의 아미노산 서열은 서열 번호: 15에 제시되어 있고; Expi Her2-4 및 23C-HER2-4의 중쇄의 아미노산 서열은 서열 번호: 23 및 서열 번호: 13에 제시되어 있고, 및 Expi Her2-4 및 23C-HER2-4의 경쇄의 아미노산 서열은 서열 번호: 15에 제시되어 있다.
추가로 일부 ADCC-향상된 이중특이성 항원-결합 구조체가 본원에 제공된다. 23C-HER2-2, 23C-HER2-3 및 23C-HER2-4와 같은 예시적인 ADCC-향상된 이중특이성 항체가 본원에 제공된다.
표 S1: 예시적인 이중특이성 항원-결합 구조체
표 S2: 예시적인 이중특이성 항체의 CDR 및 가변 영역 서열
단일특이성 항원-결합 구조체
단일특이성 항원-결합 구조체는 한 유형의 결합 특이성을 갖는 항원-결합 구조체를 의미한다.
일부 실시 양태에서, 본원에서 제공되는 상기 항원-결합 구조체는 단일특이성 항원-결합 구조체이고, 이는 1가이고 HER2-발현 세포 상의 HER2의 ECD4 항원에 특이적으로 결합하고, 여기서 제1 항원-결합 단편은 scFv이고; 상기 제1 항원-결합 단편의 중쇄 가변 영역은 카바트 넘버링 체계에 따른 위치 30에 아미노산 돌연변이를 포함하고 상기 아미노산은 E로 돌연변이되고; 또는/및 상기 제1 항원-결합 단편의 경쇄 가변 영역은 카바트 넘버링 체계에 따른 위치 53에 아미노산 돌연변이를 포함하고 상기 아미노산은 Y로 돌연변이된다.
일부 실시 양태에서, 본원에서 제공되는 상기 항원-결합 구조체는 단일특이성 항원-결합 구조체이고, 이는 2가이고 HER-발현 세포 상의 HER2의 ECD4 항원에 특이적으로 결합하는 2개의 제1 항원-결합 단편을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 본원에 제공되는 상기 제1 항원-결합 구조체는 단일특이성 항원-결합 구조체이고, 이의 상기 제1 항원-결합 단편은 전술한 상기 이중특이성 항원-결합 구조체의 상기 제1 항원-결합 단편의 서열 특징을 가질 수 있다.
일부 실시 양태에서, 본원에 제공되는 상기 항원-결합 구조체는 단일특이성 항원-결합 구조체이고, 이는 2가이고 상기 제1 항원-결합 단편에 작동가능하게 연결된 Fc를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 상기 Fc는 인간 IgG1의 Fc이다.
일부 실시 양태에서, 상기 항원-결합 구조체는 2가 단일특이성 항체이고, 이는 서열 번호:3의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 상기 항원-결합 구조체는 2가 단일특이성 항체이고, 이는 서열 번호:9의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 상기 항원-결합 구조체는 2가 단일특이성 항체이고, 이는 서열 번호:51의 아미노산 서열을 포함한다.
조성물
항원-결합 구조체, 또는 상기 항원-결합 구조체를 인코딩하는 핵산, 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 약학적 조성물이 본원에서 제공된다. 일부 실시 양태에서, 상기 조성물은 Expi Her2-2, Expi Her2-3, Expi Her2-4, 23C-HER2-2, 23C-HER2-3 및 23C-HER2-4와 같은 이중특이성 항체 하나 이상, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 예를 들어, 부형제, 희석제, 캡슐화 물질, 충전제, 완충제 또는 기타 제제를 포함한다.
조성물에서, 상기 항원-결합 구조체는 완전히 탈푸코실화 되거나(검출가능한 푸코스를 포함하지 않음) 또는 부분적으로 푸코실화 될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 약 20% 이하, 약 18% 이하, 약 16% 이하, 약 14% 이하, 약 12% 이하, 약 10% 이하, 약 8% 이하, 약 6% 이하, 약 5% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하, 약 1.5% 이하, 약 1% 이하, 약 0.9% 이하, 약 0.8% 이하, 약 0.7% 이하, 약 0.6% 이하, 약 0.5% 이하, 약 0.4% 이하, 약 0.3% 이하, 약 0.2% 이하, 약 0.1% 이하 또는 약 0%의 상기 항원-결합 구조체가 푸코스를 포함하지 않는다. 일부 실시 양태에서, 약 0 내지 약 20%, 약 0 내지 약 18%, 약 0 내지 약 16%, 약 0 내지 약 14%, 약 0 내지 약 12%, 약 0 내지 약 10%, 약 0 내지 약 8%, 약 0 내지 약 6%, 약 0 내지 약 5%, 약 0 내지 약 3%, 약 0 내지 약 2%, 약 0 내지 약 1.5%, 약 0 내지 약 1%, 약 0 내지 약 0.9%, 약 0 내지 약 0.8%, 약 0 내지 약 0.7%, 약 0 내지 약 0.6%, 약 0 내지 약 0.5%, 약 0 내지 약 0.4%, 약 0 내지 약 0.3%, 약 0 내지 약 0.2%, 약 0 내지 약 0.1%, 또는 약 0.5% 내지 약 0.6%의 상기 항원-결합 구조체는 푸코스를 포함하지 않는다.
단리된 핵산
본원에 기재된 상기 항원-결합 구조체의 적어도 하나의 폴리펩티드를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 또는 단리된 핵산의 집합이 본원에서 제공된다. 일부 실시 양태에서, 상기 핵산은 본원에 기재된 상기 항원-결합 구조체의 서열을 인코딩한다. 일부 실시 양태에서, 상기 핵산은 본원에 기재된 상기 항원-결합 구조체의 상기 제1 항원-결합 단편 또는/및 상기 제2 항원-결합 단편을 포함하는 아미노산 서열을 인코딩할 수 있다. 일부 다른 실시 양태에서, 상기 핵산은 본원에 기재된 상기 항원-결합 구조체 중쇄 또는/및 상기 항원-결합 구조체 경쇄를 포함하는 아미노산을 인코딩할 수 있다. 이중특이성 항체의 항원-결합 단편과 같은 일부 항원-결합 구조체, 및 항원-결합 구조체의 중쇄 및 경쇄의 핵산 서열이 서열 목록에 예시적으로 나열되어 있다.
벡터
본 개시내용은 상기 단리된 핵산 및 핵산의 집합 중 하나 이상을 포함하는 벡터 또는 벡터의 집합을 제공한다. 일부 실시 양태에서, 상기 벡터는 클로닝 벡터; 일부 다른 실시예에서, 상기 벡터는 발현 벡터이다.
상기 발현 벡터는 선택적으로 본원에 기재된 상기 항원-결합 구조체를 발현할 수 있는 임의의 발현 벡터이다.
숙주 세포
일부 실시 양태에서, 본 개시내용은 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공하며, 상기 숙주 세포는 항원-결합 구조체를 클로닝 하거나 인코딩하기에 적합한 숙주 세포이다. 일부 실시 양태에서, 상기 숙주 세포는 원핵 세포이다. 다른 실시 양태에서, 상기 숙주 세포는 진핵 세포이다. 일부 실시 양태에서, 상기 숙주 세포는 효모 세포, 포유동물 세포 또는 항원-결합 구조체를 제조하기에 적합한 다른 세포로부터 이루어진 군으로부터 선택된다. 포유동물 세포는 예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 CHO-S 세포이다.
항원-결합 구조체의 제조 방법
일부 실시 양태에서, 항원-결합 구조체의 제조 방법이 본원에 제공되며, 이는 하기를 포함한다: 상기 항원-결합 구조체의 발현에 적합한 조건 하에 상기 항원-결합 구조체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 상기 숙주 세포 또는 숙주 세포 배양 배지로부터 상기 항원-결합 구조체를 회수하는 단계. 상기 항원-결합 구조체를 생산하기 위해, 상기 항원-결합 구조체를 인코딩하는 핵산이 단리되고 숙주 세포에서 추가 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 삽입된다. 상기 핵산은 유전자 스플라이싱, 화학적 합성 및 클로닝과 같은 당업계에 공지된 다양한 방법을 사용하여 얻을 수 있다.
용도
상기 항원-결합 구조체의 용도가 본원에 제공된다. 특정 실시 양태에서, 사용된 상기 항원-결합 구조체는 Expi Her2-2, Expi Her2-3, Expi Her2-4, 23C-HER2-2, 23C-HER2-3 및 23C-HER2-4일 수 있다.
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 상기 항원-결합 구조체의 치료학적 유효량을 대상체에게 투여하는 것은 HER2-발현 종양 세포를 사멸시키거나 HER2-발현 종양 세포의 성장을 억제할 수 있다. 일부 실시 양태에서, HER2-발현 종양 세포를 사멸시키거나 HER2-발현 종양 세포의 성장을 억제하기 위한 약제를 제조하기 위한 상기 항원-결합 구조체의 용도가 본원에 제공된다. 일부 실시 양태에서, HER2-발현 종양 세포를 사멸시키거나 또는 HER2-발현 종양 세포의 성장을 억제하는데 사용하기 위한 항원-결합 구조체가 본원에 제공된다. 일부 실시 양태에서, 본 개시내용은 활성 성분으로서 본원에 기재된 상기 항원-결합 구조체를 포함하는, HER2-발현 종양세포를 사멸시키거나 HER2-발현 종양세포의 성장을 억제하는데 사용하기 위한 치료제를 제공한다.
일부 실시 양태에서, HER2-발현 종양은 본원에 기재된 상기 항원-결합 구조체의 치료학적 유효량을 대상체에게 투여함으로써 치료될 수 있다. 치료를 필요로 하는 대상체에는 질병 또는 증상이 있는 사람, 질병 또는 증상이 발병할 위험이 있는 사람, 질병 또는 증상을 가질 수 있어 질병 또는 증상을 예방, 지연 또는 완화하는 것이 목적인 사람이 포함된다. 일부 실시 양태에서, HER2-발현 종양을 갖는 대상체를 치료하기 위한 약제를 제조하기 위한 상기 항원-결합 구조체의 용도가 본원에 제공된다. 일부 실시 양태에서, HER2-발현 종양을 치료하는데 사용하기 위한 항원-결합 구조체가 본원에 제공된다. 일부 실시 양태에서, 활성 성분으로 본원에 기재된 항원-결합 구조체를 포함하는, HER2-발현 종양을 치료하는데 사용하기 위한 치료제가 본원에 제공된다. 상기 종양의 예는 담도암, 암육종, 식도암, 위식도 접합부 암, 유방암, 위암, 췌장암, 두경부암, 결장직장암, 신장암, 자궁경부암, 난소암, 자궁내막암, 자궁암, 악성 흑색종, 임두암, 구강암, 및 피부암을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
특정 실시 양태에서, 상기 종양은 IHC에 의해 결정된 바와 같이 HER2 0-1+, 1+, HER2 2+ 또는 HER2 3+이다. 일부 실시 양태에서, 상기 종양은 HER2 2+ 이하, 또는 HER2 1+ 이하이다.
일부 실시 양태에서, 유효량의 항원-결합 구조체를 세포에 투여하는 것은 상기 세포에서 HER2 신호전달을 억제, 감소 또는 차단할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 세포에서 HER2 신호전달을 억제, 감소 또는 차단하기 위한 약제를 제조하기 위한 상기 항원-결합 구조체의 용도가 본원에 제공된다. 일부 실시 양태에서, 세포에서 HER2 신호전달을 억제, 감소 또는 차단하는데 사용하기 위한 항원-결합 구조체가 본원에 제공된다. 일부 실시 양태에서, 활성 성분으로서 본원에 기재된 상기 항원-결합 구조체를 포함하는, 세포에서 HER2 신호전달을 억제, 감소 또는 차단하는데 사용하기 위한 치료제가 본원에 제공된다. 일부 실시 양태에서, 상기 세포는 종양 세포이다.
일부 실시 양태에서, 샘플에서 HER를 검출 또는 측정하는 방법이 제공되고, 이는 상기 샘플을 본원에 기재된 상기 항원-결합 구조체와 접촉시키고 결합 복합체를 검출 또는 측정하는 것을 포함한다.
응집에 대한 항원-결합 구조체의 내성을 향상시키는 방법
본원에서는 응집에 대한 항원-결합 구조체의 내성을 향상시키는 방법을 제공하고, 여기서 상기 항원-결합 구조체는 1가이고 HER2-발현 세포 상의 HER2의 ECD4 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 단편을 포함하고, 상기 제1 항원-결합 단편은 scFv이고; 상기 방법은 상기 제1 항원-결합 단편의 중쇄 가변 영역이 카바트 넘버링 체계에 따른 위치 30에 아미노산 돌연변이를 포함하고 상기 아미노산은 E로 돌연변이되도록, 또는/및 상기 제1 항원-결합 단편의 경쇄 가변 영역이 카바트 넘버링 체계에 따른 위치 53에 아미노산 돌연변이를 포함하고 상기 아미노산은 Y로 돌연변이 되도록 상기 항원-결합 구조체를 변형시키는 단계를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 상기 항원-결합 구조체는 1가이고 HER2-발현 세포 상의 HER2의 ECD2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 단편을 추가로 포함하고, 여기서 상기 제2 항원-결합 단편은 Fab이다. 일부 실시 양태에서, 상기 제1 항원-결합 단편은 하기로부터 선택되는 CDR 그룹을 포함한다:
i. 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 중쇄 CDR1, 상기 중쇄 CDR2 및 상기 중쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 27, 28 및 29에 따른 아미노산 서열을 포함함;
ii. 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 중쇄 CDR1, 상기 중쇄 CDR2 및 상기 중쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 27, 28 및 29에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함함;
iii. 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 경쇄 CDR1, 상기 경쇄 CDR2 및 상기 경쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 30, 34 및 32에 따른 아미노산 서열을 포함함;
iv. 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 경쇄 CDR1, 상기 경쇄 CDR2 및 상기 경쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 30, 34 및 32에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함함;
v. 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 중쇄 CDR1, 상기 중쇄 CDR2 및 상기 중쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 27, 28 및 29에 따른 아미노산 서열을 포함하고; 상기 경쇄 CDR1, 상기 경쇄 CDR2 및 상기 경쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 30, 34 및 32에 따른 아미노산 서열을 포함함;
vi. 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 중쇄 CDR1, 상기 중쇄 CDR2 및 상기 중쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 27, 28 및 29에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 상기 경쇄 CDR1, 상기 경쇄 CDR2 및 상기 경쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 30, 34 및 32에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함함;
vii. 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 중쇄 CDR1, 상기 중쇄 CDR2 및 상기 중쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 43, 28 및 29에 따른 아미노산 서열을 포함하고; 상기 경쇄 CDR1, 상기 경쇄 CDR2 및 상기 경쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 30, 31 및 32에 따른 아미노산 서열을 포함함;
viii. 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3를 포함하는 그룹, 여기서 상기 중쇄 CDR1, 상기 중쇄 CDR2 및 상기 중쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 43, 28 및 29에 따른 아미노산 서열을 포함하고; 상기 경쇄 CDR1, 상기 경쇄 CDR2 및 상기 경쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 30, 33 및 32에 따른 아미노산 서열을 포함함; 및 ix. 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 중쇄 CDR1, 상기 중쇄 CDR2 및 상기 중쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 44, 28 및 29에 따른 아미노산 서열을 포함하고; 상기 경쇄 CDR1, 상기 경쇄 CDR2 및 상기 경쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 30, 31 및 32에 따른 아미노산 서열을 포함함.
일부 실시 양태에서, 상기 제1 항원-결합 단편의 중쇄 가변 영역은 카바트 넘버링 체계에 따른 위치 30에 아미노산 돌연변이를 포함하고, 돌연변이되기 전의 상기 아미노산은 E가 아니고; 일부 실시 양태에서, 돌연변이되기 전의 아미노산은 K이고, 즉, 일부 실시 양태에서 상기 제1 항원-결합 단편의 상기 중쇄 가변 영역은 카바트 넘버링 체계에 따른 K30E 돌연변이를 포함하도록 만들어진다.
일부 실시 양태에서, 상기 제1 항원-결합 단편의 경쇄 가변 영역은 카바트 넘버링 체계에 따른 위치 53에 아미노산 돌연변이를 포함하고, 돌연변이되기 전의 상기 아미노산은 Y가 아니고; 일부 실시 양태에서, 돌연변이되기 전의 상기 아미노산은 F이고, 즉, 일부 실시 양태에서, 상기 제1 항원-결합 단편의 상기 경쇄 경쇄 가변 영역은 카바트 넘버링 체계에 따른 F53Y 돌연변이를 포함하도록 만들어진다.
일부 실시 양태에서, 상기 항원-결합 구조체는 변형되어, 상기 제1 항원-결합 단편의 상기 중쇄 가변 영역이 카바트 넘버링 체계에 따른 K30E 돌연변이를 포함하고, 상기 제1 항원-결합 단편의 상기 경쇄 가변 영역이 카바트 넘버링 체계에 따른 F53Y 돌연변이를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 상기 제1 항원-결합 단편은 scFv이고 트라스투주맙의 중쇄 가변 영역 또는 이의 돌연변이체 및 트라스투주맙의 경쇄 가변 영역 또는 이의 돌연변이체를 포함하고; 상기 중쇄 가변 영역의 돌연변이체는 K30E 돌연변이를 포함하도록 만들어지고, 상기 경쇄 가변 영역의 돌연변이체는 F53Y 돌연변이를 포함하도록 만들어진다.
일부 실시 양태에서, 상기 방법은 her2 항원에 결합하는 상기 변형된 항원-결합 구조체의 능력을 확인하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 양태에서, 상기 방법은 her2 항원에 결합하는 변형된 항원-결합 구조체를 선택하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 양태에서, 상기 항원-결합 구조체의 친화도(예를 들어, KD)는 비변형 항원-결합 구조체의 친화도 보다 높거나 이와 유사하다.
일부 실시 양태에서, 상기 방법은 비변형된 항원-결합 구조체와 비교하여 응집 경향이 감소된 항원-결합 구조체를 선택하는 단계를 추가로 포함한다.
전술한 개시 내용은 본 목적의 명확한 이해를 위해 예시 및 실시예를 제공함으로써 다소 상세하게 설명되었지만, 첨부된 특허 청구 범위의 사상 또는 범위를 벗어나지 않고 본 개시 내용에 특정 변경 및 수정이 가능하다는 것은 본 개시의 교시에 비추어 당업자에게 명백할 것이다. 다음 예는 설명의 목적으로 제공되며 제한하려는 것이 아니다. 당업자는 실질적으로 유사한 결과를 생성하기 위해 변경 또는 수정될 수 있는 다양한 비임계 파라미터를 쉽게 식별할 것이다.
달리 명시되지 않는 한, 본 개시내용의 실시는 당업계의 단백질 화학, 생화학, 재조합 DNA의 기술, 및 약리학에서 통상적인 방법을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 완전히 설명되어 있다. 참조, 예를 들어, T. E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W. H. Freeman and company, 1993); A. L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., currently added); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989, 2nd Edition); Methods In Enzymology (Ed. S. Colowick and N. Kaplan, Academic Press, Inc.); Remington's PharmaceuticalSciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); 및 Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry, 3rd Edition (Plenum Press) Volumes A and B (1992).
본 발명은 다음과 같은 구체적인 실시예를 더 제공하지만, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다:
실시 양태 1. 1가이고 HER2-발현 세포 상의 HER2의 ECD4 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 단편을 포함하는, 항원-결합 구조체, 여기서 상기 제1 항원-결합 단편은 scFv이고; 상기 제1 항원-결합 단편의 중쇄 가변 영역은 카바트 넘버링 체계에 따른 위치 30에 아미노산 돌연변이를 포함하고, 바람직하게는, 상기 아미노산은 E로 돌연변이되고; 또는/및 상기 제1 항원-결합 단편의 경쇄 가변 영역은 카바트 넘버링 체계에 따른 위치 53에 아미노산 돌연변이를 포함하고, 바람직하게는 상기 아미노산은 Y로 돌연변이된다.
실시 양태 2. 실시 양태 1에 따른 상기 항원-결합 구조체로, 여기서 상기 제1 항원-결합 단편의 상기 중쇄 가변 영역은 카바트 넘버링 체계에 따른 K30E 돌연변이를 포함하고, 또는/및 상기 제1 항원-결합 단편의 상기 경쇄 가변 영역은 카바트 넘버링 체계에 따른 F53Y 돌연변이를 포함한다.
실시 양태 3. 실시 양태 1 또는 2에 따른 상기 항원-결합 구조체로, 여기서 상기 항원-결합 구조체는 항체이다.
실시 양태 4. 실시 양태 1-3 중 어느 하나에 따른 상기 항원-결합 구조체로, 여기서 상기 제1 항원-결합 단편은 하기로부터 선택되는 CDR 그룹을 포함하고:
i. 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 중쇄 CDR1, 상기 중쇄 CDR2 및 상기 중쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 27, 28 및 29에 따른 아미노산 서열을 포함함;
ii. 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 중쇄 CDR1, 상기 중쇄 CDR2 및 상기 중쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 27, 28 및 29에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함함;
iii. 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 경쇄 CDR1, 상기 경쇄 CDR2 및 상기 경쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 30, 34 및 32에 따른 아미노산 서열을 포함함;
iv. 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 경쇄 CDR1, 상기 경쇄 CDR2 및 상기 경쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 30, 34 및 32에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함함;
v. 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 중쇄 CDR1, 상기 중쇄 CDR2 및 상기 중쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 27, 28 및 29에 따른 아미노산 서열을 포함함; 및 상기 경쇄 CDR1, 상기 경쇄 CDR2 및 상기 경쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 30, 34 및 32에 따른 아미노산 서열을 포함함;
vi. 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 중쇄 CDR1, 상기 중쇄 CDR2 및 상기 중쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 27, 28 및 29에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 상기 경쇄 CDR1, 상기 경쇄 CDR2 및 상기 경쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 30, 34 및 32에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함함;
vii. 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 중쇄 CDR1, 상기 중쇄 CDR2 및 상기 중쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 43, 28 및 29에 따른 아미노산 서열을 포함하고; 상기 경쇄 CDR1, 상기 경쇄 CDR2 및 상기 경쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 30, 31 및 32에 따른 아미노산 서열을 포함함;
viii. 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 중쇄 CDR1, 상기 중쇄 CDR2 및 상기 중쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 43, 28 및 29에 따른 아미노산 서열을 포함하고; 상기 경쇄 CDR1, 상기 경쇄 CDR2 및 상기 경쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 30, 33 및 32에 따른 아미노산 서열을 포함함; 및
ix. 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 중쇄 CDR1, 상기 중쇄 CDR2 및 상기 중쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 44, 28 및 29에 따른 아미노산 서열을 포함하고; 상기 경쇄 CDR1, 상기 경쇄 CDR2 및 상기 경쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 30, 31 및 32에 따른 아미노산 서열을 포함함.
실시 양태 5. 실시 양태 1-4 중 어느 하나에 따른 상기 항원-결합 구조체로, 여기서 상기 제1 항원-결합 단편은 트라스투주맙의 중쇄 가변 영역 또는 이의 돌연변이체, 및 트라스투주맙의 경쇄 가변영역 또는 이의 돌연변이체를 포함하고; 상기 중쇄 가변 영역의 상기 돌연변이체는 카바트 넘버링 체계에 따른 K30E 돌연변이를 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역의 상기 돌연변이체는 카바트 넘버링 체계에 따른 F53Y 돌연변이를 포함함.
실시 양태 6. 실시 양태 4-5 중 어느 하나에 따른 상기 항원-결합 구조체로, 여기서 상기 제1 항원-결합 단편은 하기로부터 선택되고:
i. 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 상기 제1 항원-결합 단편, 이는 각각 서열 번호: 41 및 42에 따른 아미노산 서열을 포함함;
ii. 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 상기 제1 항원-결합 단편, 이는 각각 서열 번호: 41 및 42에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함함;
iii. 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 상기 제1 항원-결합 단편, 이는 각각 서열 번호: 35 및 36에 따른 아미노산 서열을 포함함;
iv. 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 상기 제1 항원-결합 단편, 이는 각각 서열 번호: 35 및 39에 따른 아미노산 서열을 포함함; 및
v. 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 상기 제1 항원-결합 단편, 이는 각각 서열 번호: 40 및 36에 따른 아미노산 서열을 포함함.
실시 양태 7. 실시 양태 1-6 중 어느 하나에 따른 상기 항원-결합 구조체로, 여기서 상기 제1 항원 결합 단편의 VH 및 VL은 VH-링커-VL의 순서로 N-말단에서 C-말단으로 배열됨.
실시 양태 8. 실시 양태 1-7 중 어느 하나에 따른 상기 항원-결합 구조체로, 여기서 상기 항원-결합 구조체는 1가이고 HER2-발현 세포 상에 HER2의 ECD2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 단편을 추가로 포함함.
실시 양태 9. 실시 양태 8에 따른 상기 항원-결합 구조체로, 여기서 상기 제2 항원-결합 단편은 Fab임.
실시 양태 10. 실시 양태 8 또는 9에 따른 상기 항원-결합 구조체로, 여기서 상기 제2 항원-결합 단편은 페르투주맙의 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함함.
실시 양태 11. 실시 양태 8 또는 9에 따른 상기 항원-결합 구조체로, 여기서 상기 제2 항원-결합 단편은 페르투주맙의 중쇄 가변 영역 및 페르투주맙의 경쇄 가변 영역을 포함함.
실시 양태 12. 실시 양태 8-11 중 어느 하나에 따른 상기 항원-결합 구조체로, 여기서 상기 항원-결합 구조체는 상기 제1 항원-결합 단편 또는/및 상기 제2 항원-결합 단편에 작동가능하게 연결된 면역글로불린 기능적 도메인을 포함하고, 상기 면역글로불린 기능적 도메인은 하기를 포함함: i. 하나 이상의 CL, CH1, CH2 및 CH3; 또는 ii. Fc.
실시 양태 13. 실시 양태 12에 따른 상기 항원-결합 구조체로, 여기서 상기 CL, CH1, CH2, CH3 및 Fc은 각각 인간 IgG의 CL, CH1, CH2, CH3 및 Fc로부터 유래함.
실시 양태 14. 실시 양태 12에 따른 상기 항원-결합 구조체로, 여기서 상기 CL, CH1, CH2, CH3 또는 Fc는 변형을 가지거나 가지지 않고; 바람직하게는, 상기 CH3 또는 Fc가 갖는 상기 변형은, 예를 들어, 카바트 넘버링 체계에 따른 위치 435 또는/및 436에서 아미노산의 치환임.
실시 양태 15. 실시 양태 12에 따른 상기 항원-결합 구조체로, 여기서 상기 Fc는 제1 Fc 폴리펩티드 및 제2 Fc 폴리펩티드를 포함하는 이량체 Fc이고; 상기 제1 항원-결합 단편은 상기 제1 Fc 폴리펩티드에 작동가능하게 연결되고, 상기 제2 항원-결합 단편은 상기 제2 Fc 폴리펩티드에 작동가능하게 연결됨.
실시 양태 16. 실시 양태 1-15 중 어느 하나에 따른 상기 항원-결합 구조체로, 여기서 상기 항원-결합 구조체는 이중특이성 항체 또는 다중특이성 항체임.
실시 양태 17. 실시 양태 1-15 중 어느 하나에 따른 상기 항원-결합 구조체로, 여기서 상기 항원 결합 구조체는 2가 또는 다가임.
실시 양태 18. 실시 양태 1-7 중 어느 하나에 따른 항원-결합 구조체로, 여기서 상기 항원-결합 구조체는 단일특이성 항체이고; 여기서 상기 항원-결합 구조체는 1가, 2가 또는 다가임.
실시 양태 19. 실시 양태 1에 따른 상기 항원-결합 구조체로, 여기서 상기 항원-결합 구조체는 하기 그룹으로부터 선택됨:
i. 상기 항원-결합 구조체는 2가 이중특이성 항체이고, 하기를 포함함: 서열 번호: 11을 포함하는 중쇄, 서열 번호: 13을 포함하는 중쇄, 및 서열 번호: 15를 포함하는 경쇄;
ii. 상기 항원-결합 구조체는 2가 이중특이성 항체이고, 하기를 포함함: 서열 번호: 21을 포함하는 중쇄, 서열 번호: 13을 포함하는 중쇄, 및 서열 번호: 15를 포함하는 경쇄;
iii. 상기 항원-결합 구조체는 2가 이중특이성 항체이고, 하기를 포함함: 서열 번호: 23을 포함하는 중쇄, 서열 번호: 13을 포함하는 중쇄, 및 서열 번호: 15를 포함하는 경쇄;
iv. 상기 항원-결합 구조체는 2가 단일특이성 항체이고, 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함함;
v. 상기 항원-결합 구조체는 2가 단일특이성 항체이고, 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함함; 및
vi. 상기 항원-결합 구조체는 2가 단일특이성 항체이고, 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 포함함.
실시 양태 20. 실시 양태 1-19 중 어느 하나에 따른 상기 항원-결합 구조체로, 여기서 상기 항원-결합 구조체는 위치 30의 아미노산이 E가 아니고 또는/및 위치 53의 아미노산이 Y가 아닌 항원-결합 구조체와 비교하여 감소된 응집을 갖고; 또는/및
상기 항원-결합 구조체는 위치 30의 아미노산이 E가 아니고 또는/및 위치 53의 아미노산이 Y가 아닌 항원-결합 구조체와 비교하여 HER2의 ECD4 항원 또는/및 ECD2 항원에 대한 결합 친화도가 현저하게 감소하지 않음.
실시 양태 21. 실시 양태 1-20 중 어느 하나에 따른 상기 항원-결합 구조체로, 여기서 상기 항원-결합 구조체는 푸코실화됨.
실시 양태 22. A 실시 양태 1-21 중 어느 하나에 따른 상기 항원-결합 구조체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
실시 양태 23. 실시 양태 1-21 중 어느 하나에 따른 상기 항원-결합 구조체의 적어도 하나의 항원-결합 단편을 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는, 단리된 핵산 또는 단리된 핵산의 집합.
실시 양태 24. 실시 양태 23에 따른 상기 핵산 및 상기 핵산의 집합 중 하나 이상을 포함하는 벡터 또는 벡터의 집합.
실시 양태 25. 실시 양태 23에 따른 상기 핵산 또는 상기 핵산의 집합, 또는 청구항 24에 따른 상기 벡터 또는 상기 벡터의 집합을 포함하는 단리된 세포.
실시 양태 26. 실시 양태 1-21 중 어느 하나에 따른 상기 항원-결합 구조체를 제조 방법으로, 하기를 포함함: 상기 항원-결합 구조체의 발현에 적합한 조건하에 숙주 세포를 배양하는 단계, 여기서 상기 숙주 세포는 상기 항원-결합 구조체, 또는 실시 양태 24에 따른 상기 벡터 또는 벡터의 집합을 포함하고; 상기 구조체를 정제하는 단계.
실시 양태 27. HER2-발현 종양을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로, 상기 방법은 실시 양태 1-21 중 어느 하나에 따른 상기 항원-결합 구조체 또는 실시 양태 22에 따른 상기 약학적 조성물의 치료학적 유효량을 상기 대상체에 투여하는 것을 포함함.
실시 양태 28. 실시 양태 27에 따른 상기 방법으로, 상기 방법은 종양 세포를 상기 항원-결합 구조체와 접촉시켜 HER2-발현 종양 세포가 사멸되거나 HER2-발현 종양 세포의 성장이 억제되도록 함.
실시 양태 29. 실시 양태 27 또는 28에 따른 상기 방법으로, 여기서 상기 종양은 담도암, 암육종, 식도암, 위식도 접합부 암, 유방암, 위암, 췌장암, 두경부암, 결장직장암, 신장암, 자궁경부암, 난소암, 자궁내막암, 자궁암, 악성 흑색종, 인두암, 구강암, 또는 피부암임.
실시 양태 30. 실시 양태 27-29 중 어느 하나에 따른 상기 방법에서, 상기 방법은 세포에 상기 항원-결합 구조체 또는 상기 약학적 조성물의 유효량을 투여하여 상기 세포에서 HER2 신호전달이 억제, 감소 또는 차단되게 하는 것을 포함함.
실시 양태 31. 항원-결합 구조체의 응집에 대한 내성을 향상시키는 방법으로, 여기서 상기 항원-결합 구조체는 1가이고 HER2-발현 세포 상의 HER2의 ECD4 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 단편을 포함하고, 상기 제1 항원-결합 단편은 scFv이고; 상기 방법은 상기 제1 항원-결합 단편의 중쇄 가변 영역이 카바트 넘버링 체계에 따른 위치 30에 아미노산 돌연변이를 포함하고 상기 아미노산은 E로 돌연변이되도록, 또는/및 상기 제1 항원-결합 단편의 경쇄 가변 영역이 카바트 넘버링 체계에 따른 위치 53에 아미노산 돌연변이를 포함하고 상기 아미노산은 Y로 돌연변이되도록 상기 항원-결합 구조체를 변형시키는 것을 포함함.
실시 양태 32. 실시 양태 31에 따른 항원-결합 구조체의 응집에 대한 내성을 향상시키는 방법으로, 여기서 상기 항원-결합 구조체는 1가이고 HER2-발현 세포 상의 HER2의 ECD2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 단편을 추가로 포함하고, 상기 제2 항원-결합 단편은 Fab임.
실시 양태 33. 실시 양태 31 또는 32에 따른 항원-결합 구조체의 응집에 대한 내성을 향상시키는 방법으로, 여기서 상기 제1 항원-결합 단편은 하기로부터 선택되는 CDR 그룹을 포함함:
i. 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 중쇄 CDR1, 상기 중쇄 CDR2 및 상기 중쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 27, 28 및 29에 따른 아미노산 서열을 포함함;
ii. 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 중쇄 CDR1, 상기 중쇄 CDR2 및 상기 중쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 27, 28 및 29에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함함;
iii. 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 경쇄 CDR1, 상기 경쇄 CDR2 및 상기 경쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 30, 34 및 32에 따른 아미노산 서열을 포함함;
iv. 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 경쇄 CDR1, 상기 경쇄 CDR2 및 상기 경쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 30, 34 및 32에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함함;
v. 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 중쇄 CDR1, 상기 중쇄 CDR2 및 상기 중쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 27, 28 및 29에 따른 아미노산 서열을 포함하고; 상기 경쇄 CDR1, 상기 경쇄 CDR2 및 상기 경쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 30, 34 및 32에 따른 아미노산 서열을 포함함;
vi. 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 중쇄 CDR1, 상기 중쇄 CDR2 및 상기 중쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 27, 28 및 29에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 상기 경쇄 CDR1, 상기 경쇄 CDR2 및 상기 경쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 30, 34 및 32에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함함;
vii. 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 중쇄 CDR1, 상기 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 43, 28 및 29에 따른 아미노산 서열을 포함하고; 상기 경쇄 CDR1, 상기 경쇄 CDR2 및 상기 경쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 30, 31 및 32에 따른 아미노산 서열을 포함함;
viii. 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 중쇄 CDR1, 상기 중쇄 CDR2 및 상기 중쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 43, 28 및 29에 따른 아미노산 서열을 포함하고; 상기 경쇄 CDR1, 상기 경쇄 CDR2 및 상기 경쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 30, 33 및 32에 따른 아미노산 서열을 포함함;
ix. 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 중쇄 CDR1, 상기 중쇄 CDR2 및 상기 중쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 44, 28 및 29에 따른 아미노산 서열을 포함하고; 상기 경쇄 CDR1, 상기 경쇄 CDR2 및 상기 경쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 30, 31 및 32에 따른 아미노산 서열을 포함함; 및
ix. 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 중쇄 CDR1, 상기 중쇄 CDR2 및 상기 중쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 44, 28 및 29에 따른 아미노산 서열을 포함하고; 상기 경쇄 CDR1, 상기 경쇄 CDR2 및 상기 경쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 30, 31 및 32에 따른 아미노산 서열을 포함함.
실시 양태 34. 실시 양태 31 또는 32에 따른 항원-결합 구조체의 응집에 대한 내성을 향상시키는 방법으로, 여기서 상기 제1 항원-결합 단편은 scFv이고 트라스투주맙 또는 이의 돌연변이체의 중쇄 가변 영역을 포함하여 상기 중쇄 영역의 상기 돌연변이체가 K30E 돌연변이를 포함하고 상기 경쇄 가변 영역의 상기 돌연변이체가 F53Y 돌연변이를 포함하도록 함.
실시예 1. 항-Her2-scFv-Fc 및 이의 변이체의 제작, 발현 및 정제
항-Her2-scFv-Fc 제작 시, 인간 IgG1이 Fc 부분으로 사용되었고, 항-Her2 암(arm)의 가변 영역 서열은 단일클론 항체 허셉틴® 기반의 서열이었다. 상기 단일클론 항체 허셉틴®의 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 설계된 링커 1((GGGGS)3, 서열 번호: 53)에 의해 직렬로 연결되어 항-Her2-scFv-Fc (서열 번호: 1)를 형성하였다, 상기 아미노산 서열은 다음과 같다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
또한, 항--Her2-scFv-Fc 서열에 점 돌연변이를 제작하여 하기 변이체를 제작하였다:
항-Her2-scFv-VL-F53Y-Fc (서열 번호: 3): VL 영역에 F53Y가 있는 야생형 항-Her2-scFv-Fc에서 유래됨; 상기 아미노산 서열은 다음과 같다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
항-Her2-scFv-VL-F53A-Fc (서열 번호: 5): VL 영역에 F53A를 가지고, 야생형 항-Her2-scFv-Fc에서 유래됨; 상기 아미노산 서열은 다음과 같다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASALYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
항-Her2-scFv-VL-F53R-Fc (서열 번호: 7): VL 영역에 F53R를 가지고, 야생형 항-Her2-scFv-Fc에서 유래됨; 상기 아미노산 서열은 다음과 같다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASRLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
항-Her2-scFv-VH-K30E-Fc (서열 번호: 9): VH 영역에 K30E를 가지고, 야생형 항-Her2-scFv-Fc에서 유래됨; 상기 아미노산 서열은 다음과 같다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIEDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
항-Her2-scFv-Fc 및 이의 변이체의 DNA 서열(서열 번호: 2, 4, 6, 8 및 10)을 합성하고 각각 pcDNA3.1 발현 벡터에 클로닝하였다. 항-Her2-scFv-Fc 또는 이의 변이체의 발현 벡터를 ExpiCHOTM 발현 키트(Thermo Fisher, Cat. No. A29133)를 사용하여 ExpiCHO 세포에(CHO-S, Thermo) 형질감염시켰다. 상기 세포를 130 rpm으로 회전하는 오비탈 쉐이커 상에서 8% CO2와 함께 37℃의 인큐베이터에서 가습 환경의 ExpiCHO 발현 배지에서 배양하였다. 배양 상등액을 채취하고, 단백질 A 자성 비드(Genscript, Cat. No. L00273)를 이용하여 단백질 정제를 수행하였다. UV-Vis 분광광도계(NanoDrop lite, Thermo Scientific)를 사용하여 단백질 농도를 측정하였다.
| 명칭 | 아미노산 서열 (서열 번호) |
인코딩 DNA 서열 (서열 번호) |
가변 영역의 돌연변이 위치 |
| 항-Her2-scFv-Fc | 1 | 2 | 없음 |
| 항-Her2-scFv-VL-F53Y-Fc | 3 | 4 | F53Y |
| 항-Her2-scFv-VL-F53A-Fc | 5 | 6 | F53A |
| 항-Her2-scFv-VL-F53R-Fc | 7 | 8 | F53R |
| 항-Her2-scFv-VH-K30E-Fc | 9 | 10 | K30E |
실시예 2. 항-Her2-scFv-Fc 및 이의 변이체의 응집체 확인 및 인간 Her2 항원-결합 분석
발현 및 정제된 항-Her2-scFv-Fc 및 이의 변이체에 대해, 인간 Her2 단백질에 대한 시험 분자의 친화도를 Biacore T200 (GE)에 의해 다음과 같이 결정하였다:
항-Her2-scFv-Fc 또는 이의 변이체를 항-hIgG에 결합된 칩으로 포획한 후, 이어서 항원 인간 HER2 단백질(Sino Biological, Cat. No. 10004-H08H)을 칩 표면에 흘려보냈다. 반응 신호는 Biacore T200을 사용하여 실시간으로 검출하였고, 결합 및 해리 곡선을 얻었다. 실험에 사용된 완충액은 Biacore 범용 완충액(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4·12H2O, 1.8 mM KH2PO4, 0.05% 계면활성제 P20 (GE, Cat. No. BR-1000-54), pH 7.4) 이었다. 항-hIgG (인간 항체 포획 키트, GE, Cat. No. 29-2346-00)는 최대 약 9000 RU의 반응값으로 CM5 칩 표면에 결합되었고, 항-Her2-scFv-Fc 또는 이의 변이체는 약 200 RU에서 포획되었다. 이어서, 상이한 농도의 인간 HER2 단백질(100 nM, 50 nM, 25 nM, 12.5 nM, 6.25 nM 및 3.125 nM)과 항-Her2-scFv-Fc 또는 이의 변이체의 상호작용의 신호 값을 측정하였다. 플로우 셀의 유속은 50 μL/min이었고, 결합은 240 s동안 수행되었고, 해리는 1400 s 동안 수행되었고, 재생은 3 M MgCl2 (GE)를 사용하여 60 s 동안 수행되었고, 기준선은 안정적이었다. biacore 평가 소프트웨어에서 친화도 및 역학 1:1 결합 모드에 따라 계산하여 결과를 얻었다. 항원 인간 Her2에 대한 항-Her2-scFv-Fc 또는 이의 변이체의 친화도는 표 2에 나타냈다. 항-Her2-scFv-Fc (KD = 0.77 nM)와 비교하여, 변이체 항-Her2-scFv-VL-F53A-Fc (KD = 1.26 nM)는 항원 인간 Her2 단백질에 대한 결합 친화도에 더 큰 영향을 미쳤다. 변이체 항-Her2-scFv-VL-F53Y-Fc (KD = 0.8 nM) 및 항-Her2-scFv-Fc (KD = 0.77 nM)는 항원 인간 Her2 단백질에 대해 유사한 결합 친화도를 나타냈다. 변이체 항 -Her2-scFv-VH-K30E-Fc는 항원 인간 Her2 단백질에 대해 0.54 nM의 결합 KD를 가진다. 돌연변이 F53Y 및 K30E의 도입은 항원 인간 Her2 단백질에 대한 결합 친화도를 감소시키지 않는 것으로 알려져 있다.
항-Her2-scFv-Fc 또는 이의 변이체의 성분은 겔 컬럼 크로마토그래피로 분리하였다. 용출은 이동상으로 중성 버퍼를 이용하여 수행되었고, 분자량이 다른 성분은 분자량에 따라 내림차순으로 용출되었다. 사용된 겔 크로마토그래피 컬럼은 ACQUITY UPLC 단백질 BEH SEC 컬럼 200 Å, 1.7 μm, 4.6 Х 300 mm이었고, 컬럼 온도는 25℃이었다. 이동상은 pH 7.0에서 50 mmol/L 인산염-완충 식염수-200 mmol/L 염화나트륨(2.33 g의 인산이수소나트륨 이수화물, 12.53 g의 인산이수소나트륨 십이수화물 및 11.69 g의 염화나트륨을 약 800 mL의 초순수에 칭량하고 교반하여 완전히 용해시키고; 부피가 1000mL에 도달할 때까지 초순수를 첨가하고; 혼합물을 잘 혼합한 다음 0.22 μm 필터 멤브레인을 통해 여과함)이었다. 샘플을 이동상으로 희석하여 10 mg/mL의 시험 용액을 얻고, 이 중 2 μL를 정밀하게 측정하여 액체크로마토그래프에 주입하여 (샘플 농도가 10 mg/mL 미만인 경우 단백질 20 μg을 주입하도록 주입량을 조정함) 280 nm에서 검출하였다. 유속은 0.30 mL/min이었고, 등용매 용출은 15분 동안 수행되었다. 데이터를 가공하고, 그 결과를 면적 정규화 방법을 이용하여 정량적으로 분석하였다. 응집체, 면역글로불린 단량체 및 저분자량 불순물에 대한 피크 면적 백분율을 각각 계산하였다. 면역글로불린 단량체를 나타내는 메인 피크 앞에 응집 피크가 나타났고, 메인 피크 뒤에 저분자 불순물 피크가 나타났다. 항-Her2-scFv-Fc 또는 이의 변이체에서 주요 피크 및 응집체 함량 백분율은 표 2에 나타나있다. 변이체 항-Her2-scFv-VL-F53Y-Fc 및 항-Her2-scFv-VH-K30E-Fc는 응집체를 상당히 감소시켰다: 응집체 함량은 6.31% (항-Her2-scFv-Fc)에서 각각 4.94% 및 3.39%로 감소하였다.
| 명칭 | 항-Her2-scFv-Fc | 항-Her2-scFv-VL-F53Y-Fc | 항-Her2-scFv-VL-F53A-Fc | 항-Her2-scFv-VL-F53R-Fc | 항-Her2-scFv-VH-K30E-Fc |
| 응집체 | 6.31% | 4.94% | 6.96% | 7.83% | 3.39% |
| 단량체 | 93.43% | 94.83% | 92.80% | 91.90% | 96.32% |
| 저분자량 단편 | 0.25% | 0.24% | 0.23% | 0.26% | 0.28% |
| Her2 항원(KD) | 0.77 nM | 0.8 nM | 1.26 nM | 측정안됨 | 0.54 nM |
실시예 3. 항-Her2 이중특이성 항체의 제작, 발현 및 정제
항-Her2 이중특이성 항체는 놉-인투-홀(Ridgway, et al., 1996) Fc 엔지니어링에 의해 인간 IgG1으로 생산되었다. H435R 및 Y436F 돌연변이(Jendeberg et al.,1997)는 단백질 A에 대한 Fc의 친화도를 감소시키기 위해 하나의 중쇄의 Fc 영역 서열에 설계되었으며, 이는 단백질 A 친화도 정제(특허 US5945311A)에서 이중특이성 항체의 조립 동안 형성된 동종이량체를 제거하는데 유리했다. 실시예 2로부터 항-Her2-scFv-VL-F53Y-Fc 돌연변이 및 항-Her2-scFv-VH-K30E-Fc 돌연변이가 Her2 항원에 대한 친화도를 감소시키지 않으면서 항-Her2-scFv 응집체를 상당히 감소시킬 수 있음을 알 수 있다. 이 실시예에서 항-Her2 이중특이성 항체의 하나의 항-Her2 암(arm)의 항원-결합 도메인은 scFv (VH-링커-VL 구조) 형태였고, 가변 영역 서열은 돌연변이 K30E (b-항-Her2-scFv-VH-K30E-Fc, 서열 번호: 21), 돌연변이 F53Y (b-항-Her2-scFv-VL-F53Y-Fc, 서열 번호: 23), 또는 이들 점 돌연변이 모두(항-Her2-scFv-VH-K30E-VL-F53Y-Fc, 서열 번호: 11)를 포함하였다. 이 실시예에서 항-Her2 이중특이성 항체의 또 다른 항-Her2 암의 항원-결합 도메인은 항-Her2-도메인2-HC-Fc (서열 번호: 13) 및 항-Her2-도메인2-LC (서열 번호: 15)를 포함하는 Fab 형태였다. 또한, 대조군으로 돌연변이가 없는 scFv(VH-링커-VL 구조 또는 VL-링커-VH 구조)를 사용하여 항-Her2 이중특이성 항체가 제작되었다.
| 명칭 | 구성 | 아미노산 서열 (서열 번호) |
뉴클레오티드 서열 (서열 번호) |
| Expi Her2-1 | 항-Her2-scFv-VL-VH-Fc | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSAAEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLICLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENRYMTWPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열 번호: 17) |
18 |
| 항-Her2-도메인2-HC-Fc-2 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVYPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFALVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPG (서열 번호: 19) |
20 | |
| 항-Her2-도메인2-LC | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열 번호: 15) |
16 | |
| Expi Her2-2 | 항-Her2-scFv-VH-K30E-VL-F53Y-Fc | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIEDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열 번호: 11) |
12 |
| 항-Her2-도메인2-HC-Fc | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK (서열 번호: 13) |
14 | |
| 항-Her2-도메인2-LC | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열 번호: 15) |
16 | |
| Expi Her2-3 | b-항-Her2-scFv-VH-K30E-Fc | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIEDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열 번호: 21) |
22 |
| 항-Her2-도메인2-HC-Fc | 서열 번호: 13 | 14 | |
| 항-Her2-도메인2-LC | 서열 번호: 15 | 16 | |
| Expi Her2-4 | b-항-Her2-scFv-VL-F53Y-Fc | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열 번호: 23) |
24 |
| 항-Her2-도메인2-HC-Fc | 서열 번호: 13 | 14 | |
| 항-Her2-도메인2-LC | 서열 번호: 15 | 16 | |
| Expi Her2-5 | 항-Her2-scFv-VH-VL-Fc | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열 번호: 25) |
26 |
| 항-Her2-도메인2-HC-Fc | 서열 번호: 13 | 14 | |
| 항-Her2-도메인2-LC | 서열 번호: 15 | 16 |
항-Her2 이중특이성 항체의 DNA 서열 (SEQ ID NOs: 12, 14 and 16)을 합성하고 각각 pcDNA3.1 발현 벡터에 클로닝하였다. 항-Her2-scFv-VH-K30E-VL-F53Y-Fc (서열 번호: 11), 항-Her2-도메인2-HC-Fc (서열 번호: 13) 및 항-Her2-도메인2-LC (서열 번호: 15)의 발현 벡터를 ExpiCHOTM 발현 키트(Thermo Fisher, Cat. No. A29133)를 사용하여 1:1:1.5의 형질 감염 비율로 ExpiCHO 세포에 동시 형질감염 시켰다. 형질 감염 밀도는 6 Х 106 cells/mL였다. 배지는 ExpiCHO 발현 배지였다. 형질감염 후 10일까지 배양을 계속하고, 세포 배양 상층액을 원심분리에 의해 수집하였다. 단백질 A 자성 비드(Genscript, Cat. No. L00273)를 사용하여 단백질 정제를 수행하였다. UV-Vis 분광 광도계(NanoDrop lite, Thermo Scientific)를 사용하여 단백질 농도를 측정하였다. 이 샘플은 Expi Her2-2로 지정되었다. 이 방법을 참조하여, 다른 이중특이성 항체, Expi Her2-1, Expi Her2-3, Expi Her2-4 및 Expi Her2-5를 상기 표에 기재된 DNA 서열에 따라 발현 및 정제하여 얻었다.
실시예 4. 탈푸코실화된 이중특이성 항체의 제조 및 확인
FcgRIIIa와 IgG1의 상호작용은 푸코스 발현 관련 유전자 FUT8을 녹아웃함으로써 향상될 수 있으며, 이에 의해 항체의 ADCC가 향상된다(Shields et al., 2002; Yamane-Ohnuki et al., 2004). 이 실시예에서, 푸코스 녹아웃 항-Her2 이중특이성 항체는 FUT8-녹아웃 CHO-S 세포(CHO FUT8-/- 세포로 지정)를 사용하여 제조하였다. 항-Her2 이중특이성 항체의 DNA 서열(서열 번호: 12, 14 및 16)을 합성하고 pcDNA3.1 발현 벡터에 각각 클로닝하였다. 항-Her2-scFv-VH-K30E-VL-F53Y-Fc, 항-Her2-도메인2-HC-Fc 및 항-Her2-도메인2-LC의 발현 벡터를 CHOgro® 고수율 발현 시스템(Cat. No. MIR 6270)을 사용하여 1:1:1.5의 형질감염 비율로 FUT8- 녹아웃 CHO-S 세포에 동시 형질감염시켰다. 형질감염 밀도는 6 Х 106 세포/mL이었다. 배지는 CHOgro® 발현 배지(Cat. No. MIR 6200, 제조사: Mirus)였다. 형질감염 후 10일까지 배양을 계속하고, 세포 배양 상층액을 원심분리에 의해 수집하였다. 단백질 A 자성 비드를 사용하여 단백질 정제를 수행하였다(Genscript, Cat. No. L00273). 단백질 농도는 UV-Vis 분광광도계(NanoDrop lite, Thermo Scientific)를 사용하여 측정하였다. 이 샘플은 23C2 Her2-2로 지정되었다. 이 방법을 참조하여, 표 3에 나열된 Expi Her2-1, Expi Her2-3, Expi Her2-4 및 Expi Her2-5의 서열을 CHO FUT8-/- 세포에서 발현시켜 상응하는 푸코스 녹아웃 항-Her2 이중특이성 항체 23C2 Her2-1, 23C2 Her2-3, 23C2 Her2-4 및 23C2 Her2-5를 얻었다.
CHO FUT8-/- 세포 및 CHO-S 세포에 의해 발현되는 항-Her2 이중특이성 항체 샘플을 GlycoWorks RapiFluor-MS N-Glycan 키트 (Waters, Milford, Mass., USA)를 사용하여 처리하였다. N-글리칸은 단백질에서 방출되고 표지되었다. 컬럼크로마토그래피 분리 후, FLR 검출기 (Waters, Milford, Mass., USA)를 이용하여 분석하고, N-글리칸의 구조 및 함량을 알 수 있었다. 항-Her2 이중특이성 항체 Expi HER2-2의 글리칸 맵핑 분석을 도 1에 나타내었다. FUT8 녹아웃 CHO-S 세포에 의해 발현되는 항-Her2 이중특이성 항체 23C2 HER2-2의 글리칸 맵핑 분석을 도 2에 나타내었다. 글리칸 함량 백분율은 표 4에 나타나있다. 정상 항-Her2 이중특이성 항체 Expi HER2-2에서 탈푸코실화된 형태의 백분율은 21.85%였고, FUT8- 녹아웃 CHO-S 세포에 의해 발현된 항-Her2 이중특이성 항체 23C2 HER2-2에서 탈푸코실화된 형태의 백분율은 99.40%였다.
| 구성성분 명칭 |
함량 (%) | |
| Expi HER2-2 | 23C2 HER2-2 | |
| A1(M3B) | 1.81 | 9.84 |
| A1G(4)1 | 0.16 | 0.17 |
| A2 | 1.14 | 70.33 |
| A2[3]G(4)1 | / | 2.34 |
| A2[6]G(4)1 | / | 4.19 |
| A2[3]BG(4)1 | / | 0.11 |
| A2G(4)2 | / | 0.55 |
| A2G(4)2S(3)1 | / | 0.21 |
| A2G(4)2S(3,3)2 | / | 0.46 |
| F(6)A1G(4)1 | / | / |
| F(6)A1[3]G(4)1S(3)1 | / | / |
| F(6)A1 | 12.77 | / |
| F(6)A2 | 60.69 | 0.60 |
| F(6)A2[3]G(4)1 | 1.20 | / |
| F(6)A2[6]G(4)1 | 0.70 | / |
| F(6)A2G(4)2 | / | / |
| F(6)A2G(4)2S(3)1 | / | / |
| M3 | / | 0.26 |
| M4 | / | 0.07 |
| M4A1G(4)1 | / | 0.36 |
| M4 D1 | / | 0.08 |
| M5 | 12.31 | 5.67 |
| M5A1G(4)1 | / | 0.05 |
| M6 D1 | 2.11 | 0.75 |
| M6 D3 | 0.73 | 0.18 |
| M7 D1 | 0.80 | 0.44 |
| M8 | 0.20 | 0.15 |
| 탈푸코실화된 글리칸 | 21.85 | 99.40 |
| 디-시알화 글리칸 | / | 0.46 |
| 고 만노스 글리칸 | 20.07 | 7.24 |
| 모노-시알화 글리칸 | 0.18 | 0.21 |
| 시알화되지 않은 글리칸 | 99.82 | 99.33 |
실시예 5. 이중특이성 항체의 응집체 확인
이 실시예는 항-Her2 이중특이성 항체 23C2 Her2-1, 23C2 Her2-2, 23C2 Her2-3, 23C2 Her2-4 및 23C2 Her2-5의 응집체 확인에 관한 것이다.
항-Her2 이중특이성 항체를 겔 컬럼 크로마토그래피로 분리하고, 응집체 함량을 확인하였다. 용출은 중성 버퍼를 이동상으로 사용하여 수행되었고, 분자량이 다른 성분이 분자량에 따라 내림차순으로 용출되었다. 사용된 겔 크로마토그래피 컬럼은 ACQUITY UPLC 단백질 BEH SEC 컬럼 200 Å, 1.7 μm, 4.6 Х 300 mm이었고, 컬럼 온도는 25℃이었다. 이동상은 pH 7.0에서 50 mmol/L 인산염-완충 식염수-200 mmol/L 염화나트륨(2.33 g의 인산이수소나트륨 이수화물, 12.53 g의 인산이수소나트륨 십이수화물 및 11.69 g의 염화나트륨을 약 800 mL의 초순수에 칭량하고 교반하여 완전히 용해시키고; 부피가 1000mL이 될때까지 초순수를 첨가하고; 혼합물을 잘 혼합한 다음 0.22 μm 필터 멤브레인을 통해 여과함)이었다. 샘플을 이동상으로 희석하여 10 mg/mL의 시험 용액을 얻고, 이 중 2 μL를 정밀하게 측정하여 액체 크로마토그래프에 주입하고(샘플 농도가 10 mg/mL 미만인 경우 단백질 20 μg을 주입하도록 주입량을 조정함) 280 nm에서 검출하였다. 유속은 0.30 mL/min이었고, 등용매 용출은 15분 동안 수행하였다. 데이터를 가공하고, 결과를 면적 정규화 방법을 이용하여 정량적으로 분석하였다. 응집체, 면역글로불린 단량체 및 저분자량 불순물에 대한 피크 면적 백분율을 각각 계산하였다. 면역글로불린 단량체를 나타내는 메인 피크 앞에 응집체 피크가 나타났고, 메인 피크 뒤에 저분자량 불순물 피크가 나타났다.
| 샘플 명칭 | 응집체 | 단량체 | 저분자량 단편 |
| 23C2 Her2-2 | 8.51% | 91.02% | 0.47% |
| 23C2 Her2-1 | 19.55% | 80.05% | 0.40% |
결과는 scFVs (돌연변이 없음)가 이중특이성 항체로 조립된 후에도, 이중특이성 항체가 여전히 많은 양의 응집체를 생성했음을 보여준다; 그러나, 이중특이성 항체의 응집체 함량은 돌연변이를 도입하여 감소될 수 있다. 23C2 Her2-2의 응집체 함량은 돌연변이를 포함하지 않는 23C2 Her2-1의 응집체 함량과 비교하여 8.51%로 감소될 수 있다(표 5).
실시예 6. 항-Her2 이중특이성 항체의 항원-결합 분석
발현 및 정제된 항-Her2 이중특이성 항체의 경우, HER2 단백질에 대한 시험 분자의 친화도를 Biacore T200 (GE)에 의해 다음과 같이 결정하였다:
항-Her2 이중특이성 항체의 양이 항-hIgG에 결합된 칩에 의해 포획된 후, 인간 Her2 (Sino Biological, Cat. No. 10004-H08H)를 칩 표면에 흘려보냈다. 반응 신호는 Biacore T200을 사용하여 실시간으로 검출하였고, 결합 및 해리 곡선을 얻었다. 실험에 사용된 버퍼는 Biacore 범용 버퍼였다(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4·12H2O, 1.8 mM KH2PO4, 0.05% 계면활성제 P20, pH 7.4). 항-hIgG (인간 항체 포획 키트, GE, Cat. No. 29-2346-00)는 최대 약 9000 RU의 반응 값에서 CM5 칩 표면에 결합되었고, 항-Her2 이중특이성 항체는 약 200 RU에서 포획되었다. 이어서 상이한 농도의 Her2 단백질(100 nM, 50 nM, 25 nM, 12.5 nM, 6.25 nM and 3.125 nM)과 항-Her2 이중특이성 항체의 상호작용 신호 값을 측정하였다. 플로우 셀의 유속은 50 μL/min였고, 결합은 240 s 동안 수행되었고, 해리는 1400 s 동안 수행되었고, 재생은 3 M MgCl2(GE)를 사용하여 60 s 동안 수행되었고, 기준선은 안정적이었다.
biacore 평가 소프트웨어를 사용하여 계산하여 결과를 얻었다. 항원 Her2에 대한 항-Her2 이중특이성 항체 23C2 Her2-2의 결합 친화도, 뿐만 아니라 대조군 트라스투주맙 및 페르투주맙의 결합 친화도가 표 6에 제시되어 있다. 항원 Her2에 대한 항-Her2 이중특이성 항체 23C2 Her2-2의 결합 KD는 6.11E-10 M이고, 항원 Her2에 대한 트라스투주맙의 결합 KD는 1.22E-09 M이고, 항원 Her2에 대한 페르투주맙의 결합 KD는 2.35E-09 M이다. 항-Her2 이중특이성 항체 23C2 Her2-2는 항원 Her2에 대해 트라스투주맙 및 페르투주맙 보다 더 높은 친화도를 나타냈다.
| Ka (1/Ms) | Kd (1/s) | KD (M) | |
| 23C2 Her2-2 | 1.79E+05 | 1.09E-04 | 6.11E-10 |
| 트라스투주맙 대조군 | 1.73E+05 | 2.12E-04 | 1.22E-09 |
| 페르투주맙 대조군 | 1.15E+05 | 2.69E-04 | 2.35E-09 |
실시예 7. 항-Her2 이중특이성 항체의 항원-결합 분석
실시예 6의 절차를 참조하여, 발현 및 정제된 항-Her2 이중특이성 항체 23C2 Her2-1, 23C2 Her2-2, 23C2 Her2-3, 23C2 Her2-4 and 23C2 Her2-5의 HER2 단백질에 대한 친화도를 Biacore T200 (GE)로 측정하였다.
항원 인간 Her2 단백질에 대한 항-Her2 이중특이성 항체의 친화도를 표 7에 나타냈다. 표 6 및 7의 결과로부터 항원 인간 Her2 단백질에 대한 항-Her2 이중특이성 항체의 결합 친화도가 F53Y 및 K30E 돌연변이를 도입함으로써 개선될 수 있음을 알 수 있다.
| 샘플 명칭 | 23C2 Her2-1 |
| 항원 Her2 KD | 4.02 nM |
실시예 8. 항-Her2 이중특이성 항체에 의한 Her2-양성 표적 세포 BT474의 사멸
표적 세포(BT474 Her2+++, 출처: 중국과학원의 Cell Bank of Type Culture Collection Committee)에 대한 항-Her2 이중특이성 항체의 사멸 효과는 인간 PBMC(말초 혈액 단핵 세포; 이펙터 세포)에 의해 제공되는 NK 세포를 이용하여 연구되었다. EC50을 계산하고, 항-Her2 이중특이성 항체의 시험관 내 활성을 평가하였다
구체적인 절차는 다음과 같다:
BT474 세포를 2% FBS (fetal bovine serum)를 포함하는 1640 배지를 사용하여 세포 밀도를 3 Х 105 세포/mL로 조정하고 96-웰 세포 배양 플레이트(eppendorf, Cat. No. 0030730199)에 웰 당 50 μL로 시딩하였다. 상이한 농도의 항-Her2 이중특이성 항체(1000 ng/mL, 333 ng/mL, 111 ng/mL, 37 ng/mL, 12.3 ng/mL, 4.11 ng/mL, 1.37 ng/mL, 0.46 ng/mL, 0.15 ng/mL 및 0.05 ng/mL)를 1640 배지를 사용하여 제조하고 상기 96-웰 세포 배양 플레이트에 웰 당 50 μL 첨가하였다. 인간 PBMCs를 1640 배지를 사용하여 1.5 Х 106 세포/mL 밀도로 조정하고 웰당 100 μL 첨가하였다. 투여군(표적 세포 + 이펙터 세포 + 항체), 표적 세포군 (BT474 세포), 이펙터 세포군 (인간 PBMC), 표적세포 + 이펙터 세포군, 블랭크 대조군(배지) 및 용해액 대조군, 및 표적 세포 최대 방출군 (표적세포 + 용해액)을 설정하였으며, 이펙터-대-표적 세포 비율은 10:1 이었다. 분석 45분 전에, 20 μL/웰의 용해 용액(Promega, Cat. No. G182A)을 표적 세포 최대 방출군 및 용해액 대조군에 첨가하였다. 45분 후, 세포 용해 속도(사멸 속도)는 CytoTox96® 비방사성 세포독성 분석 키트(Promega, G1780)를 사용하여 측정되었다.
용해율(%) = (OD투여군 - OD타겟 세포 + 이펙터 세포군)/(OD타겟 세포 최대 방출군 - OD타겟 세포군) Х 100%
도 3은 BT474 Her2+++ 종양 세포에 대한 항-Her2 이중특이성 항체의 사멸률을 나타낸다. ADCC-향상된 항-Her2 이중특이성 항체 23C2 HER2-1 및 23C2 HER2-2는 트라스투주맙과 페르투주맙의 조합 및 CHO-S 세포에 의해 발현되는 항-Her2 이중특이성 항체 Expi Her2-1 및 Expi HER2-2 보다 BT474 종양 세포에 대한 더 나은 사멸 효과를 가졌고, 여기서 트라스투주맙 및 페르투주맙(1:1)의 조합의 EC50은 8.627 ng/mL이고; Expi HER2-1의 EC50은 38.05 ng/mL이고; EC50이 35.17 ng/mL인 Expi HER2-2는 Expi HER2-1 보다 우수하고; ADCC-강화된 23C2 HER2-1의 EC50은 4.728 ng/mL이고; EC50이 3.658 ng/mL인 ADCC-강화된 23C2 HER2-2인 23C2 HER2-1 보다 우수하다.
실시예 9. 항-Her2 이중특이성 항체에 의한 Her2-양성 표적 세포 NCI-N87의 사멸
표적 세포(NCI-N87 Her2+++, 출처: 중국과학원의 Cell Bank of Type Culture Collection Committee)에 대한 항-Her2 이중특이성 항체의 사멸 효과는 인간 PBMC(말초 혈액 단핵 세포; 이펙터 세포)에 의해 제공되는 NK 세포를 이용하여 연구되었다. EC50을 계산하고, 항-Her2 이중특이성 항체의 시험관 내 활성을 평가하였다
구체적인 절차는 다음과 같다:
NCI-N87 세포를 2% FBS (fetal bovine serum)가 포함된 1640 배지를 사용하여 3 Х 105 세포/mL의 세포 밀도로 조정하고 96-웰 세포 배양 플레이트(eppendorf, Cat. No. 0030730199)에 웰 당 50 μL 시딩하였다. 상이한 농도의 항-Her2 이중특이성 항체 또는 대조군 약물(8.1 nM, 2.7 nM, 0.9 nM, 0.3 nM, 0.1 nM, 0.03 nM, 0.01 nM, 0.003 nM, 0.001 nM 및 0.0004 nM)을 1640 배지를 사용하여 제조하고 상기 96-웰 세포 배양 플레이트에 웰당 50 μL 첨가하였다. 인간 PBMCs를 1640 배지를 사용하여 1.5 Х 106 세포/mL 밀도로 조정하고 웰당 100 μL 첨가하였다. 투여군(표적 세포 + 이펙터 세포 + 항체), 표적 세포군 (NCI-N87 세포), 이펙터 세포군 (인간 PBMC), 표적세포 + 이펙터 세포군, 블랭크 대조군(배지) 및 용해액 대조군, 및 표적 세포 최대 방출군 (표적세포 + 용해액)을 설정하였으며, 이펙터-대-표적 세포 비율은 10:1 이었다. 분석 45분 전에, 20 μL/웰의 용해 용액(Promega, Cat. No. G182A)을 표적 세포 최대 방출군 및 용해액 대조군에 첨가하였다. 45분 후, 세포 용해 속도(사멸 속도)는 CytoTox96® 비방사성 세포독성 분석 키트(Promega, G1780)를 사용하여 측정되었다.
대조군 약물로는 트라스투주맙, T-DM1 (트라스투주맙-엠탄신 결합체, 상품명 Kadcyla®), 트라스투주맙 및 페르투주맙의 조합(1:1), 및 Expi HER2-1이 사용되었다.
용해율(%) = (OD투여군 - OD표적 세포 + 이펙터 세포군)/(OD표적 세포 최대 방출군 - OD표적 세포군) Х 100%
도 4는 NCI-N87 종양 세포에 대한 트라스투주맙과 페르투주맙의 조합, 트라스투주맙, T-DM1 및 항-Her2 이중특이성 항체의 사멸률을 나타낸다. ADCC-향상된 항-Her2 이중특이성 항체 23C2 HER2-2는 트라스투주맙과 페르투주맙의 조합, 트라스투주맙, T-DM1 및 Expi HER2-1 보다 NCI-N87 종양 세포에 대한 더 나은 사멸 효과를 가졌고, 여기서 ADCC-향상된 항-Her2 이중특이성 항체 23C2 HER2-2의 EC50은 0.02447 nM이고, 트라스투주맙과 페르투주맙의 조합의 EC50은 0.08267 nM이고, Expi HER2-1의 EC50은 0.1048 nM이고, T-DM1의 EC50은 0.07392 nM이고, 트라스투주맙의 EC50은 0.07468 nM이다.
실시예 10. 항-Her2 이중특이성 항체에 의한 트라스투주맙-내성 세포 JIMT-1의 사멸
표적 세포(JIMT-1, 출처: AddexBio, Cat. No. C0006005)에 대한 항-Her2 이중특이성 항체의 사멸 효과는 인간 PBMCs (말초 혈액 단핵 세포; 이펙터 세포)에 의해 제공되는 NK 세포를 이용하여 연구되었다. EC50을 계산하고, 항-Her2 이중특이성 항체의 시험관 내 활성을 평가하였다.
구체적인 절차는 다음과 같다:
JIMT-1 세포를 2% FBS (fetal bovine serum)가 포함된 1640 배지를 사용하여 3 Х 105 세포/mL의 세포 밀도로 조정하고 96-웰 세포 배양 플레이트(eppendorf, Cat. No. 0030730199)에 웰 당 50 μL 시딩하였다. 상이한 농도의 항-Her2 이중특이성 항체 또는 대조군 약물(8.1 nM, 2.7 nM, 0.9 nM, 0.3 nM, 0.1 nM, 0.03 nM, 0.01 nM, 0.003 nM, 0.001 nM 및 0.0004 nM)을 1640 배지를 사용하여 제조하고 상기 96-웰 세포 배양 플레이트에 웰당 50 μL 첨가하였다. 인간 PBMCs를 1640 배지를 사용하여 1.5 Х 106 세포/mL 밀도로 조정하고 웰당 100 μL 첨가하였다. 투여군(표적 세포 + 이펙터 세포 + 항체 또는 대조군 약물), 표적 세포군 (BT474 세포), 이펙터 세포군 (인간 PBMC), 표적세포 + 이펙터 세포군, 블랭크 대조군(배지) 및 용해액 대조군, 및 표적 세포 최대 방출군 (표적세포 + 용해액)을 설정하였으며, 이펙터-대-표적 세포 비율은 20:1 이었다. 분석 45분 전에, 20 μL/웰의 용해 용액(Promega, Cat. No. G182A)을 표적 세포 최대 방출군 및 용해액 대조군에 첨가하였다. 45분 후, 세포 용해 속도(사멸 속도)는 CytoTox96® 비방사성 세포독성 분석 키트(Promega, G1780)를 사용하여 측정되었다. 트라스투주맙, T-DM1, 트라스투주맙과 페르투주맙의 조합(1:1), 및 Expi HER2-1이 대조군 약물로 사용되었다.
용해율(%) = (OD투여군 - OD표적 세포 + 이펙터 세포군)/(OD표적 세포 최대 방출군 - OD표적 세포군) Х 100%
도 5는 트라스투주맙 및 페르투주맙의 조합, 트라스투주맙, T-DM1 및 항-Her2 이중특이성 항체의 JIMT-1 종양 세포에 대한 사멸률을 나타낸다. ADCC-향상된 항-Her2 이중특이성 항체 23C2 HER2-2는 트라스투주맙과 페르투주맙의 조합, 트라스투주맙, T-DM1 및 Expi HER2-1 보다 JIMT-1 종양 세포에 대한 더 나은 사멸 효과를 가졌고, 여기서 ADCC-향상된 항-Her2 이중특이성 항체 23C2 HER2-2의 EC50은 0.01006 nM이고, 트라스투주맙과 페르투주맙의 조합의 EC50은 0.06727 nM이고, Expi HER2-1의 EC50은 0.08066 nM이고, T-DM1의 EC50은 0.08357 nM이고, 트라스투주맙의 EC50은 0.07443 nM이고; 또한, 항-Her2 이중특이성 항체 23C2 HER2-2가 더 높은 세포 용해율을 나타내었다.
실시예 11. 항-Her2 이중특이성 항체에 의한 BT474 Her2+++ 종양 세포의 증식 억제
23C2 Her2-2, 트라스투주맙 및 페르투주맙을 2% FBS(fetal bovine serum, 제조사: GIBCO, 카탈로그 번호 10099-141)를 포함하는 DMEM/F12 배지(GIBCO, 카탈로그 번호 11330-032)로 최종 3.2μg/mL의 농도로 희석하고, 이어서 9가지 농도(1.6μg/mL, 0.8μg/mL, 0.4μg/mL, 0.2μg/mL, 0.1μg/mL, 0.05μg/ mL, 0.025μg/mL, 0.0125μg/mL 및 0.00625μg/mL)가 얻어질 때까지 1:1의 비율로 연속 희석했다. 대수기에서 성장한 BT474 Her2+++ 세포를 채취하여, 1 Х 105 세포/mL의 밀도로 조정하고 웰당 100μL씩 플레이팅하고, 세포가 없는 블랭크 웰을 대조군으로 설정하였다. 상기 연속 희석된 항체를 웰당 50 μL로 첨가하였다. 플레이트를 5% CO2가 포함된 37℃의 인큐베이터에서 5일 동안 인큐베이션하였다. 배양 배지를 버리고, CCK-8(Dojindo, Japan, Cat. No. CK04) 표준 용액(working solution)을 웰당 100μL로 첨가하였다. 플레이트를 발색을 위해 4-5 시간 동안 배양하고 마이크로플레이트 판독기(제조업체: Thermo, 모델: VarioskanFlash)에 넣었습니다. 450 nm의 파장에서 흡광도 값은 630 nm의 기준 파장을 사용하여 읽고 기록되었다.
종양 세포에 대한 증식 억제율을 계산하였다.
그 결과를 도 6에 나타내었다. BT474 종양세포에 대한 ADCC-향상 항-Her2 이중특이성 항체 23C2 Her2-2의 증식억제율은 78.38%이고, 이는 트라스투주맙(54.12%), 트라스투주맙과 페르투주맙 조합(53.7%)보다 우수하다.
실시예 12. 항-Her2 이중특이성 항체에 의한 NCI-N87 Her2++ 위암 누드 마우스 이종이식 종양의 억제
항-Her2 이중특이성 항체의 생체내 효능은 NCI-N87 Her2++ 위암 세포(중국과학원의 Cell Bank of Type Culture Collection Committee)를 사용하는 마우스 이종이식 모델에서 평가되었다. NCI-N87 Her2++ 위암 세포를 5 Х 107 세포/mL의 농도로 준비하고 누드 마우스(Changzhou Cavens Laboratory Animal Ltd., 14-17 g, 수컷, SPF 환경에서 수용) 오른쪽 겨드랑이에 0.1mL/마우스로 접종했다. 누드 마우스 이종이식 종양의 직경은 버니어 캘리퍼(vernier caliper)를 사용하여 측정되었고, 종양이 100-250 mm3로 성장할 때 동물을 5개 그룹으로 무작위화했다:
그룹 1: 대조군
그룹 2: Expi Her2-1, 10 mg/kg
그룹 3: 23C2 Her2-2, 5 mg/kg
그룹 4: 23C2 Her2-2, 10 mg/kg
그룹 5: 페르 + 트라 (트라스투주맙 및 페르투주맙의 조합), 5 + 5 mg/kg
각 투여군에는 해당 용량의 약물을 약 연속 3주 동안 주 2회 정맥주사하였다(6회 주사). 그룹 5(조합 그룹)의 두 약물을 각각 5mL/kg 마우스 체중으로 투여한 것을 제외하고 각 그룹은 10mL/kg 마우스 체중으로 투여하였다. 그룹 1은 PBS(Hyclone; Cat. No. sh30256.01)를 10mL/kg으로 정맥주사하였다. 조합 그룹에서 트라스투주맙은 페르투주맙 투여 후 최소 30분 후에 투여하였다.
종양 부피를 측정함으로써 시험 약물의 항종양 효과를 동적으로 모니터링하였다. 종양 부피는 일주일에 2-3회 측정되었으며(특정 측정 시점은 표 8에 나와 있음), 그 동안에 마우스의 무게를 측정하였고; 데이터가 기록되었다. 마우스의 일반적인 행동을 매일 관찰했다.
검출 색인:
종양 부피 (TV), 다음과 같이 계산됨: TV = 1/2 Х a Х b2, 여기서 a 및 b는 각각 길이와 너비를 나타낸다.
본 실험에서는 d0에 투여를 시작하여 6회(d0, d3, d7, d10, d14, 및 d17)에 수행되었다. 실험 d21까지 동물은 죽지 않았다. 각 그룹에서 마우스의 평균 체중은 상승하는 경향을 보였다(도 8). 약물은 심각한 독성 효과가 없었다.
d21까지, NCI-N87 위암 누드 마우스 이종이식편 종양 부피에 대한 그룹 2(10 mg/kg), 그룹 3(5 mg/kg), 그룹 4(10 mg/kg) 및 그룹 5(5 + 5 mg/kg)의 효과를 표 7 및 도 7에 나타내었다. 23C2 Her2-2는 10 mg/kg의 용량에서 Expi Her2-1(10 mg/kg) 및 페르 + 트라 조합 그룹(5 + 5 mg/kg) 보다 NCI-N87 위암 누드 마우스 이종이식편 종양에 대한 더 나은 억제 효과를 가졌다.
| 그룹 | 용량(mg/kg) | 투여 경로 | 동물 수(마우스) | TV (mm3) | ||||||||
| d0 | d21 | d0 | d3 | d6 | d9 | d12 | d15 | d18 | d21 | |||
| 대조군 | - | i.v. | 6 | 6 | 204±40 | 284±58 | 363±78 | 481±109 | 586±161 | 724±261 | 808±241 | 863±251 |
| Expi Her2-1 | 10 | i.v. | 6 | 6 | 204±23 | 235±46 | 207±35 | 179±30 | 195±24 | 204±44 | 195±50 | 178±35 |
| 23C2 Her2-2 | 5 | i.v. | 6 | 6 | 204±31 | 246±37 | 250±47 | 277±67 | 318±79 | 348±86 | 353±84 | 358±101 |
| 23C2 Her2-2 | 10 | i.v. | 6 | 6 | 204±44 | 201±39 | 154±39 | 136±33 | 151±35 | 173±46 | 165±35 | 144±29 |
| Per+Tra | 5+5 | i.v. | 6 | 6 | 204±34 | 224±48 | 199±59 | 202±65 | 205±45 | 231±93 | 218±94 | 218±91 |
참고: 투여는 d0, d3, d7, d10, d14 및 d17에 수행되어 총 6회 투여되었음.
Claims (31)
1가이고 HER2-발현 세포 상의 HER2의 ECD4 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 단편을 포함하는 항원-결합 구조체로, 여기서 상기 제1 항원-결합 단편은 scFV이고; 상기 제1 항원-결합 단편의 중쇄 가변 영역은 카바트 넘버링 체계에 따른 위치 30에서 아미노산 돌연변이를 포함하고, 바람직하게 상기 아미노산은 E로 돌연변이되고; 또는/및 상기 제1 항원-결합 단편의 경쇄 가변 영역은 카바트 넘버링 체계에 따른 위치 53에서 아미노산 돌연변이를 포함하고, 바람직하게 상기 아미노산은 Y로 돌연변이되는 것인, 항원-결합 구조체.
제1항에 있어서, 상기 제1 항원-결합 단편의 상기 중쇄 가변 영역은 카바트 넘버링 체계에 따른 K30E 돌연변이를 포함하고, 또는/및 상기 제1 항원-결합 단편의 상기 경쇄 가변 영역은 카바트 넘버링 체계에 따른 F53Y 돌연변이를 포함하는 것인, 항원-결합 구조체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항원-결합 구조체는 항체인 것인, 항원-결합 구조체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항원-결합 단편은 하기로부터 선택되는 CDR 그룹을 포함하는 것인, 항원-결합 구조체:
i. 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 중쇄 CDR1, 상기 중쇄 CDR2 및 상기 중쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 27, 28 및 29에 따른 아미노산 서열을 포함함;
ii. 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 중쇄 CDR1, 상기 중쇄 CDR2 및 상기 중쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 27, 28 및 29에 따른 아미노산 서열과 적어도 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함함;
iii. 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 경쇄 CDR1, 상기 경쇄 CDR2 및 상기 경쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 30, 34 및 32에 따른 아미노산 서열을 포함함;
iv. 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 경쇄 CDR1, 상기 경쇄 CDR2 및 상기 경쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 30, 34 및 32에 따른 아미노산 서열과 적어도 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함함;
v. 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 중쇄 CDR1, 상기 중쇄 CDR2 및 상기 중쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 27, 28 및 29에 따른 아미노산 서열을 포함하고; 상기 경쇄 CDR1, 상기 경쇄 CDR2 및 상기 경쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 30, 34 및 32에 따른 아미노산 서열을 포함함;
vi. 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 중쇄 CDR1, 상기 중쇄 CDR2 및 상기 중쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 27, 28 및 29에 따른 아미노산 서열과 적어도 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 상기 경쇄 CDR1, 상기 경쇄 CDR2 및 상기 경쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 30, 34 및 32에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함함;
vii. 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 중쇄 CDR1, 상기 중쇄 CDR2 및 상기 중쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 43, 28 및 29에 따른 아미노산 서열을 포함하고; 상기 경쇄 CDR1, 상기 경쇄 CDR2 및 상기 경쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 30, 31 및 32에 따른 아미노산 서열을 포함함;
viii. 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 중쇄 CDR1, 상기 중쇄 CDR2 및 상기 중쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 43, 28 및 29에 따른 아미노산 서열을 포함하고; 상기 경쇄 CDR1, 상기 경쇄 CDR2 및 상기 경쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 30, 33 및 32에 따른 아미노산 서열을 포함함; 및
ix. 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 중쇄 CDR1, 상기 중쇄 CDR2 및 상기 중쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 44, 28 및 29에 따른 아미노산 서열을 포함하고; 상기 경쇄 CDR1, 상기 경쇄 CDR2 및 상기 경쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 30, 31 및 32에 따른 아미노산 서열을 포함함.
i. 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 중쇄 CDR1, 상기 중쇄 CDR2 및 상기 중쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 27, 28 및 29에 따른 아미노산 서열을 포함함;
ii. 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 중쇄 CDR1, 상기 중쇄 CDR2 및 상기 중쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 27, 28 및 29에 따른 아미노산 서열과 적어도 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함함;
iii. 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 경쇄 CDR1, 상기 경쇄 CDR2 및 상기 경쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 30, 34 및 32에 따른 아미노산 서열을 포함함;
iv. 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 경쇄 CDR1, 상기 경쇄 CDR2 및 상기 경쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 30, 34 및 32에 따른 아미노산 서열과 적어도 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함함;
v. 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 중쇄 CDR1, 상기 중쇄 CDR2 및 상기 중쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 27, 28 및 29에 따른 아미노산 서열을 포함하고; 상기 경쇄 CDR1, 상기 경쇄 CDR2 및 상기 경쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 30, 34 및 32에 따른 아미노산 서열을 포함함;
vi. 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 중쇄 CDR1, 상기 중쇄 CDR2 및 상기 중쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 27, 28 및 29에 따른 아미노산 서열과 적어도 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 상기 경쇄 CDR1, 상기 경쇄 CDR2 및 상기 경쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 30, 34 및 32에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함함;
vii. 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 중쇄 CDR1, 상기 중쇄 CDR2 및 상기 중쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 43, 28 및 29에 따른 아미노산 서열을 포함하고; 상기 경쇄 CDR1, 상기 경쇄 CDR2 및 상기 경쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 30, 31 및 32에 따른 아미노산 서열을 포함함;
viii. 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 중쇄 CDR1, 상기 중쇄 CDR2 및 상기 중쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 43, 28 및 29에 따른 아미노산 서열을 포함하고; 상기 경쇄 CDR1, 상기 경쇄 CDR2 및 상기 경쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 30, 33 및 32에 따른 아미노산 서열을 포함함; 및
ix. 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하는 그룹, 여기서 상기 중쇄 CDR1, 상기 중쇄 CDR2 및 상기 중쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 44, 28 및 29에 따른 아미노산 서열을 포함하고; 상기 경쇄 CDR1, 상기 경쇄 CDR2 및 상기 경쇄 CDR3은 각각 서열 번호: 30, 31 및 32에 따른 아미노산 서열을 포함함.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항원-결합 단편은 트라스투주맙 또는 이의 돌연변이체의 중쇄 가변영역, 및 트라스투주맙 또는 이의 돌연변이체의 경쇄 가변영역을 포함하고; 상기 중쇄 가변 영역의 상기 돌연변이는 카바트 넘버링 체계에 따른 K30E 돌연변이를 포함하고, 또는/및 상기 경쇄 가변 영역의 상기 돌연변이는 카바트 넘버링 체계에 따른 F53Y 돌연변이를 포함하는 것인, 항원-결합 구조체.
제4항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항원-결합 단편은 하기로부터 선택되는 것인, 항원-결합 구조체:
i. 각각 서열 번호: 41 및 42에 따른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 제1 항원-결합 단편;
ii. 각각 서열 번호: 41 및 42에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 제1 항원 결합 단편;
iii. 각각 서열 번호: 35 및 36에 따른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 제1 항원-결합 단편;
iv. 각각 서열 번호: 35 및 39에 따른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 제1 항원-결합 단편; 및
v. 각각 서열 번호: 40 및 36에 따른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 제1 항원-결합 단편.
i. 각각 서열 번호: 41 및 42에 따른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 제1 항원-결합 단편;
ii. 각각 서열 번호: 41 및 42에 따른 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 제1 항원 결합 단편;
iii. 각각 서열 번호: 35 및 36에 따른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 제1 항원-결합 단편;
iv. 각각 서열 번호: 35 및 39에 따른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 제1 항원-결합 단편; 및
v. 각각 서열 번호: 40 및 36에 따른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 제1 항원-결합 단편.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항원-결합 단편의 VH 및 VL은 VH-링커-VL의 순서로 N-말단에서 C-말단으로 배열되는 것인, 항원-결합 구조체.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원-결합 구조체는 1가이고 HER2-발현 세포 상의 HER2의 ECD2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 단편을 추가로 포함하는 것인, 항원-결합 구조체.
제8항에 있어서, 상기 제2 항원-결합 단편은 Fab인 것인, 항원-결합 구조체.
제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 제2 항원-결합 단편은 페르트주맙의 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하는 것인, 항원-결합 구조체.
제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 제2 항원-결합 단편은 페르투주맙의 중쇄 가변 영역 및 페르투주맙의 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인, 항원-결합 구조체.
제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원-결합 구조체는 상기 제1 항원-결합 단편 또는/및 상기 제2 항원-결합 단편에 작동 가능하게 연결되는 면역글로불린 기능적 도메인을 포함하고, 상기 면역글로불린 기능적 도메인은 i. CL, CH1, CH2 및 CH3 중 하나 이상; 또는 ii. Fc를 포함하는 것인, 항원-결합 구조체.
제12항에 있어서, 상기 CL, CH1, CH2, CH3 및 Fc는 각각 인간 IgG의 CL, CH1, CH2, CH3 및 Fc 유래하는 것인, 항원-결합 구조체.
제12항에 있어서, 상기 CL, CH1, CH2, CH3 또는 Fc는 변형을 가지거나 가지지 않고; 바람직하게는 CH3 또는 Fc가 갖는 상기 변형은 예를 들어, 카바트 넘버링 체계에 따른 위치 435 또는/및 위치 436에서의 아미노산 치환을 가지는 것인, 항원-결합 구조체.
제12항에 있어서, 상기 Fc는 제1 Fc 폴리펩티드 및 제2 Fc 폴리펩티드를 포함하는 이량체 Fc이고; 상기 제1 항원-결합 단편은 상기 제1 Fc 폴리펩티드에 작동가능하게 연결되고, 상기 제2 항원-결합 단편은 제2 Fc 폴리펩티드에 작동가능하게 연결되는 것인, 항원-결합 구조체.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원-결합 구조체는 이중특이성 항체 또는 다중특이성 항체인 것인, 항원-결합 구조체.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원-결합 구조체는 2가 또는 다가인 것인, 항원-결합 구조체.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원-결합 구조체는 단일특이성 항체이고; 상기 항원-결합 구조체는 1가, 2가 또는 다가인 것인, 항원-결합 구조체.
제1항에 있어서, 상기 항원-결합 구조체는 하기의 그룹으로부터 선택되는 것인, 항원 결합 구조체:
i. 상기 항원-결합 구조체는 서열 번호: 11을 포함하는 중쇄, 서열 번호: 13을 포함하는 중쇄, 및 서열 번호: 15를 포함하는 경쇄를 포함하는 2가 이중특이성 항체임;
ii. 상기 항원-결합 구조체는 서열 번호: 21을 포함하는 중쇄, 서열 번호: 13을 포함하는 중쇄, 및 서열 번호: 15를 포함하는 경쇄를 포함하는 2가 이중특이성 항체임;
iii. 상기 항원-결합 구조체는 서열 번호: 23을 포함하는 중쇄, 서열 번호: 13을 포함하는 중쇄, 서열 번호: 15를 포함하는 경쇄를 포함하는 2가 이중특이성 항체임;
iv. 상기 항원-결합 구조체는 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 2가 단일특이성 항체임;
v. 상기 항원-결합 구조체는 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 2가 단일특이성 항체임; 및
vi. 상기 항원-결합 구조체는 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 2가 단일특이성 항체임.
i. 상기 항원-결합 구조체는 서열 번호: 11을 포함하는 중쇄, 서열 번호: 13을 포함하는 중쇄, 및 서열 번호: 15를 포함하는 경쇄를 포함하는 2가 이중특이성 항체임;
ii. 상기 항원-결합 구조체는 서열 번호: 21을 포함하는 중쇄, 서열 번호: 13을 포함하는 중쇄, 및 서열 번호: 15를 포함하는 경쇄를 포함하는 2가 이중특이성 항체임;
iii. 상기 항원-결합 구조체는 서열 번호: 23을 포함하는 중쇄, 서열 번호: 13을 포함하는 중쇄, 서열 번호: 15를 포함하는 경쇄를 포함하는 2가 이중특이성 항체임;
iv. 상기 항원-결합 구조체는 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 2가 단일특이성 항체임;
v. 상기 항원-결합 구조체는 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 2가 단일특이성 항체임; 및
vi. 상기 항원-결합 구조체는 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 2가 단일특이성 항체임.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원-결합 구조체는 위치 30의 아미노산이 E가 아니고 또는/및 위치 53의 아미노산이 Y가 아닌 항원-결합 구조체와 비교하여 감소된 응집을 가지고; 또는/및 상기 항원-결합 구조체는 위치 30의 아미노산이 E가 아니고 또는/및 위치 53의 아미노산이 Y가 아닌 항원-결합 구조체와 비교하여 HER2의 ECD4 항원 또는/및 ECD2 항원에 대한 결합 친화도가 현저히 감소하지 않는 것인, 항원-결합 구조체.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원-결합 구조체는 푸코실화되는 것인, 항원 결합 구조체.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 항원-결합 구조체 및 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약학적 조성물.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 항원-결합 구조체의 적어도 하나의 항원-결합 단편을 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는, 단리된 핵산 또는 단리된 핵산의 집합.
제23항에 따른 핵산 및 핵산의 집합 중 하나 이상을 포함하는 벡터 또는 벡터의 집합.
제23항에 따른 핵산 또는 핵산의 집합, 또는 제24항에 따른 벡터 또는 벡터의 집합을 포함하는 단리된 세포.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 항원-결합 구조체의 발현에 적합한 조건에서 숙주 세포를 배양하는 단계, 여기서 상기 숙주 세포는 상기 항원-결합 구조체를 인코딩하는 핵산, 또는 제24항에 따른 벡터 또는 벡터의 집합을 포함하고; 및 상기 구조체를 정제하는 단계;를 포함하는, 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 항원-결합 구조체를 제조하기 위한 방법.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 항원-결합 구조체 또는 제22항에 따른 약학적 조성물의 치료학적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, HER2-발현 종양을 갖는 대상체를 치료하는 방법.
HER2-발현 종양 세포가 사멸되거나 HER2-발현 종양 세포의 성장이 억제되도록 종양 세포를 상기 항원-결합 구조체와 접촉시키는 것을 포함하는, 제27항에 따른 방법.
제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 종양이 담도암, 암육종, 식도암, 위식도 접합부 암, 유방암, 위암, 췌장암, 두경부암, 결장직장암, 신장암, 자궁경부암, 난소암, 자궁내막암, 자궁암, 악성 흑색종, 인두암, 구강암, 또는 피부암인 것인, 방법.
세포에서 HER2 신호전달이 억제, 감소 또는 차단되도록 유효량의 상기 항원-결합 구조체 또는 상기 약학적 조성물을 상기 세포에 투여하는 것으로 포함하는, 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 방법.
항원-결합 구조체의 응집 내성을 향상시키는 방법으로, 상기 항원-결합 구조체는 1가이고 HER2-발현 세포 상의 HER2의 ECD4 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 단편을 포함하고, 상기 제1 항원-결합 단편은 scFv이고; 상기 방법은 상기 제1 항원-결합 단편의 중쇄 가변 영역이 카바트 넘버링 체계에 따른 위치 30에서 아미노산 돌연변이를 포함하고, 상기 아미노산은 E로 돌연변이되도록, 또는/및 상기 제1 항원-결합 단편의 경쇄 가변 영역은 카바트 넘버링 체계에 따른 위치 53에서 아미노산 돌연변이를 포함하고, 상기 아미노산은 Y로 돌연변이되도록 상기 항원-결합 구조체를 변형시키는 것을 포함하는, 방법.
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