TW202417484A - 異多聚體蛋白質及其製備方法 - Google Patents
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Abstract
本發明涉及一種異多聚體蛋白質及其製備方法。具體地，其包含第一抗體重鏈相對於Knob-into-Hole的Knob單鏈的S354C、T366W突變引入T394K的突變，和第二抗體重鏈相對於Knob-into-Hole的Hole單鏈的Y349C、T366S、L368A、Y407V突變增加V397D突變。還提供了利用該產生異多聚體蛋白質的方法製備同時標靶腫瘤細胞表面分子HER-2和CD47雙特異性抗體或標靶腫瘤細胞和免疫細胞表面分子TROP-2和CD3雙特異性抗體的方法，包括可變片段scFv和免疫球蛋白抗體IgG透過胜肽連接子連接，或具有抗原活性的Fab片段和免疫球蛋白抗體IgG透過胜肽連接子連接產生的雙特異抗體。
Description
本發明屬於生物抗體領域。具體地，涉及異多聚體蛋白質及其製備方法。
異多聚體蛋白質(Heteromultimeric protein)是至少包括2個異源多肽鏈二聚化或多聚化後得到的蛋白產物，非對稱結構的雙特異性抗體(Bispecific antibody，BsAb)就屬於異多聚體蛋白質其中的一類。為了促進抗體Fc段的異源二聚化，可透過基因工程技術使不同的抗體組合在一起，如透過對野生型抗體恆定區CH3或鉸鏈區的胺基酸位點進行突變，使CH3-CH3界面上的空間位阻或非共價作用力(靜電或疏水作用)發生改變，從而使得異源重鏈比同源重鏈更容易發生二聚化。
目前成熟的Fc段異源二聚化的技術為杵臼結構(Knobs-into-holes，KIH)。將一個抗體重鏈CH3區366位較小的蘇胺酸(T)替換為較大的色胺酸(W)形成Knobs結構(T366W)，將另一個抗體重鏈CH3區407位較大的酪胺酸(Y)突變成較小的蘇胺酸(T)形成holes結構(Y407T)，依靠突變後空間位阻效應的下降以及鉸鏈區形成的共價二硫鍵，促進異源重鏈二聚化，即為KIH結構。後續研究發現重鏈hole的CH3區的T366和L368位也對重鏈Knob的T366W位突變存在位阻效應，利用噬菌體展示技術，最終將重鏈hole的Y407T單點突變改進為3點突變(T366S、L368A和Y407V)，獲得了更穩定的“1+3”杵臼結構。後續又在重鏈Knob上加入S354C位點突變，重鏈hole上加入S349C位點突變，形成了目前Fc段特異性結合較為常用的杵臼結構。然而異多聚體蛋白質的杵臼結構中，會產生部分Hole-Hole同二聚體，增加了後續純化工藝的難度。
因此，本領域亟待開發一種新型的異多聚體蛋白質及其製備方法。
本發明的目的在於提供一種異多聚體蛋白質及其製備方法。具體地，提供一種含有抗體Fc段的異多聚體蛋白質，以抗HER-2和CD47的雙特異性抗體為研究基礎，開發異多聚體蛋白質的製備方法和應用。
在本發明的第一方面，提供了一種異多聚體蛋白質，包括含有第一重鏈恆定結構域3(CH3)結構域的第一多肽和含有第二重鏈恆定結構域3(CH3)結構域的第二多肽，其中所述第一CH3結構域包括相對於野生型CH3結構域在胺基酸位置394處利用帶正電荷的胺基酸進行的取代，和/或所述第二CH3結構域包括相對於野生型CH3結構域在胺基酸位置397處利用帶負電荷的胺基酸進行的取代，所述胺基酸的位置根據KABAT編號的EU索引確定。
在另一優選例中，所述第一CH3結構域中，胺基酸位置394處所述帶正電荷的胺基酸與所述第二CH3結構域中的胺基酸殘基形成離子和/或電荷相互作用。
在另一優選例中，所述第二CH3結構域中，胺基酸位置397處所述帶負電荷的胺基酸與所述第一CH3結構域中的胺基酸殘基形成離子和/或電荷相互作用。
在另一優選例中，所述第一CH3結構域和所述第二CH3結構域中包括杵臼結構的殘基。
在另一優選例中，所述第一多肽和第二多肽形成杵臼結構配對。
在另一優選例中，所述第一CH3結構域在胺基酸位置394處包含離胺酸(K)取代。
在另一優選例中，所述第二CH3結構域在胺基酸位置397處包含天冬胺酸(D)取代。
在另一優選例中，所述第一CH3結構域和所述第二CH3結構域中，還包括一個或多個胺基酸取代，所述取代促進所述第一多肽和所述第二多肽之間形成杵-臼結構配對。
在另一優選例中，所述第一CH3結構域還包括選自下組的胺基酸取代：S354C、 T366W；並且所述第二CH3結構域還包括選自下組的胺基酸取代：Y349C、T366S、L368A、Y407V、或其組合。
在另一優選例中，在第一CH3結構域中，所述杵臼結構的殘基包括選自下組的胺基酸取代：S354C、T366W；在第二CH3結構域中，所述杵臼結構的殘基包括選自下組的胺基酸取代：Y349C、T366S、L368A、Y407V、或其組合。
在另一優選例中，所述第一CH3結構域包含選自下組的取代：T394K、S354C和T366W、或其組合。
在另一優選例中，所述第二CH3結構域包含選自下組的取代：V397D、Y349C、T366S，L368A、Y407V、或其組合。
在另一優選例中，所述第一CH3結構域和所述第二CH3結構域是人CH3結構域。
在另一優選例中，其中所述異多聚體蛋白質包含IgG Fc區。
在另一優選例中，所述IgG Fc區選自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
在另一優選例中，所述IgG是IgG1。
在另一優選例中，所述IgG Fc是源自人IgG1的Fc。
在另一優選例中，所述第一多肽和/或所述第二多肽源自IgG分子。
在另一優選例中，所述第一多肽和/或所述第二多肽包含重鏈恆定結構域2(CH2結構域)。
在另一優選例中，所述第一多肽是抗體重鏈，和/或所述第二多肽是抗體重鏈。
在另一優選例中，所述異多聚體蛋白質包含一個或多個抗體輕鏈。
在另一優選例中，所述異多聚體蛋白質包含
(a) 異二聚化的Fc片段；和
(b) 抗原結合片段。
在另一優選例中，所述異二聚化的Fc元件包括含有第一重鏈恆定結構域3(CH3)結構域的第一多肽和含有第二重鏈恆定結構域3(CH3)結構域的第二多肽，其中相對於野生型CH3結構域，所述第一CH3結構域包括選自下組的胺基酸取代：T394K、S354C和T366W、或其組合；和所述第二CH3結構域包括選自下組的胺基酸取代：V397D、Y349C，T366S，L368A、Y407V、或其組合，所述胺基酸的位置根據KABAT編號的EU索引確定。
在另一優選例中，所述異二聚化的Fc元件還包括重鏈恆定結構域2(CH2結構域)。
在另一優選例中，所述異多聚體蛋白質為多特異性抗體。
在另一優選例中，所述多特異性抗體包括雙特異性抗體、三特異性抗體或四特異性抗體。
在另一優選例中，所述多特異性抗體包括一個或多個抗原結合片段。
在另一優選例中，所述抗原結合片段標靶相同或不同的抗原。
在另一優選例中，所述抗原結合片段分別標靶相同抗原的不同表位。
在另一優選例中，所述抗原結合片段選自下組：(i)Fab 片段；(ii)F(ab')
2片段；(iii)Fd 片段；(iv)Fv 片段；(v)單鏈Fv (scFv)分子；或(vi)單域抗體dAb 片段。
在另一優選例中，所述抗原選自下組：EGFR、HER-2、EpCAM、CD20、CD30、CD33、CD47、TROP-2、CD52、CD133、CD3、CEA、TAG-72、CIX、PSMA、GD2、GD3、GM2、VEGF、VEGFR、ERBB2、ERBB3、MET、IGF1R、EPHA3、TRAILR1、TRAILR2、RANKL和FAP。
在另一優選例中，所述抗原結合片段標靶不同的抗原，所述不同的抗原選自以下的抗原對：CD3和Trop-2、CD20和CD3、CD3和CD19、CD3和Fc-γ-RIIIA、CD3和TPBG、CD3和Epha10、CD3和IL-5Rα、CD3和TASCTD-2、CD3和CLEC12A、CD3和Prominin-1、CD3和IL-23R、CD3和ROR1、CD3和IL-3Rα、CD3和PSA、CD3和CD8、CD3和Glypican3、CD3和FAP、CD3和EphA2、CD3和ENPP3、CD3和CD33、CD3和CD133、CD3和EpCAM、CD3和CD19、CD3和Her2、CD3和CEA、CD3和GD2、CD3和PSMA、CD3和BCMA、CD3和A33、CD3和B7-H3、CD3和EGFR、CD3和P-鈣粘蛋白、CD3和HMW-MAA、CD3和TIM-3、CD3和CD38、CD3和TAG-72、CD3和SSTR、CD3和FRA、CD16和CD30、CD64和Her2、CD137和CD20、CD138和CD20、CD19和CD20、CD38和CD20、CD20和CD22、CD40和CD20、CD47和CD20、CD47和Her-2、CD137和EGFR、CD137和Her-2、CD137和PD-1、CD137和PDL-1、PD-1和PD-L1、VEGF和PD-L1、Lag-3和TIM-3、OX40和PD-1、TIM-3和PD-1、TIM-3和PDL-1、EGFR和DLL-4、VEGF和EGFR、HGF和VEGF、VEGF的第一表位和VEGF的不同第二表位、VEGF和Ang2、EGFR和cMet、PDGF和VEGF、VEGF和DLL-4、OX40和PDL1、ICOS和PD-1、ICOS和PD-L1、Lag-3和PD-1、Lag-3和PD-L1、Lag-3和CTLA-4、ICOS和CTLA-4、CD138和CD40、CD38和CD138、CD38和CD40、CD-8和IL-6、CSPGs和RGM A、CTLA-4和BTN02、CTLA-4和PD-1、IGFl和IGF2、IGFl/2和Erb2B、IGF-IR和EGFR、EGFR和CD13、IGF-IR和ErbB3、EGFR-2和IGFR、Her2的第一表位和Her2的第二不同表位、因子IXa和Met、因子X和Met、VEGFR-2和Met、VEGF-A和促血管生成素-2(Ang-2)、IL-12和TWEAK、IL-13和IL-lβ、MAG和RGMA、NgR和RGM A、NogoA和RGM A、OMGp和RGM A、PDL-1和CTLA-4、PD-1和TIM-3、RGM A和RGM B、Te38和TNFα、TNFα和Blys、TNFα和CD22、TNFα和a CTLA-4、TNFα和GP130、TNFα和IL-12p40、以及TNFα和RANK配體。
在另一優選例中，所述異多聚體蛋白質包含第一重鏈、第二重鏈、第一輕鏈、第二輕鏈和第三輕鏈；其中，
所述第一重鏈從N端到C端包含：針對第一標的的抗體重鏈可變結構域Z1、抗體重鏈恆定區Z4、針對第二標的的抗體重鏈可變結構域Z2、第一CH1、第一CH2和第一CH3結構域；所述的第一輕鏈和第二輕鏈分別與所述第一重鏈配合，使得所述的異多聚體蛋白質特異性結合於第一標的和第二標的；
所述第二重鏈從N端到C端包含：針對第三標的的抗原結合片段Z3，針對第二標的的抗體重鏈可變結構域Z2、第二CH1、第二CH2和第二CH3結構域，所述的第三輕鏈分別與所述第二重鏈配合，使得所述的異多聚體蛋白質特異性結合於第二標的；和針對第三標的的抗原結合片段Z3特異性結合於第三標的。在另一優選例中，所述第一輕鏈從N端到C端包括串聯的針對第一標的的抗體輕鏈可變結構域Y1和第一CL。
在另一優選例中，所述第二輕鏈從N端到C端包括串聯的針對第二標的的抗體輕鏈可變結構域Y2和抗體第二CL。
在另一優選例中，所述第三輕鏈從N端到C端包括串聯的針對第二標的的抗體輕鏈可變結構域Y2和第三CL。
在另一優選例中，所述針對第三標的的抗原結合片段Z3選自下組：針對第三標的的scFv分子、VHH或Fab分子。
在另一優選例中，所述第一標的與第二標的為相同或不同的表位。
在另一優選例中，所述第一標的和第二標的是不同的抗原。
在另一優選例中，所述第一標的和第二標的是相同抗原的不同表位。
在另一優選例中，所述第三標的是不同於第一標的、第二標的的表位。
在另一優選例中，所述第一標的和所述第二標的為HER-2，和所述第三標的為CD47。在另一優選例中，所述針對第三標的的抗原結合片段為針對CD47的scFv分子。
在另一優選例中，所述針對第一標的的抗體重鏈可變結構域Z1和針對第二標的的抗體重鏈可變結構域Z2的序列相同或不同。
在另一優選例中，所述抗體重鏈恆定區Z4、第一CH1和第二CH1的序列相同或不同。
在另一優選例中，所述第一CL、第二CL和第三CL相同或者不同。
在另一優選例中，所述的第一輕鏈、第二輕鏈和第三輕鏈的序列相同或不同。
在另一優選例中，所述第一重鏈中，所述針對第一標的的抗體重鏈可變結構域Z1、抗體重鏈恆定區Z4、針對第二標的的抗體重鏈可變結構域Z2、第一CH1中相鄰的兩個元件直接相連或透過連接子連接。
在另一優選例中，所述第二重鏈中，所述針對第三標的的抗原結合片段與針對第二標的的抗體重鏈可變結構域Z2直接相連或透過連接子連接。
在另一優選例中，所述的連接子包括柔性連接子和剛性連接子。
在另一優選例中，所述的連接子為長度為1-35個胺基酸的胜肽連接子，較佳地6-30個胺基酸的胜肽連接子。
在另一優選例中，所述第一CH3結構域包含選自下組的取代：T394K、S354C和T366W、或其組合。
在另一優選例中，所述第二CH3結構域包含選自下組的取代：V397D、Y349C，T366S，L368A、Y407V、或其組合。
在另一優選例中，所述多特異性抗體為雙特異性抗體。
在另一優選例中，所述異多聚體蛋白質具有兩條重鏈和三條輕鏈，其中
第一重鏈自N端到C端包含：Fab-VH-CH1-鉸鏈區-Fc1；
第二重鏈自N端到C端包含：scFv-VH-CH1-鉸鏈區-Fc2；
所述輕鏈自N端到C端包含：VL-CL，其中所述第一重鏈的Fab的抗原結合結構域結合第一標的；所述第一重鏈和第二重鏈的VH-CH1與所述輕鏈的VL-CL各自獨立地形成結合於第二標的的第二抗原結合域，所述第二重鏈的scFv的抗原結合結構域結合第三標的。
在另一優選例中，所述第一標的與第二標的相同或不同。
在另一優選例中，所述Fc1中的CH3結構域包括選自由以下組成的組的取代：T394K、S354C和T366W；所述Fc2中的CH3結構域包括選自由以下組成的組的取代：V397D、Y349C，T366S、L368A和Y407V。
在另一優選例中，所述第一標的和所述第二標的為HER-2，所述第三標的為CD47。
在另一優選例中，所述第一標的和所述第二標的為TROP-2，所述第三標的為CD3。
在另一優選例中，所述第一重鏈的Fab為抗HER-2的IgG抗體的Fab片段。
在另一優選例中，所述第二重鏈的scFv為抗CD47抗體的scFv。
在另一優選例中，所述抗CD47抗體的scFv片段包含可變區VH和可變區VL，VH與VL透過胜肽連接子L1連接。
在另一優選例中，所述第一重鏈和第二重鏈中抗HER-2的重鏈可變區VH的胺基酸序列如SEQ ID NO. 13所示，所述輕鏈中抗HER-2的輕鏈可變區的VL的序列如SEQ ID NO. 14所示。
在另一優選例中，所述第二重鏈中抗CD47抗體的scFv片段的胺基酸序列如SEQ ID NO. 17所示。
在另一優選例中，所述抗HER-2的IgG抗體的重鏈可變區如SEQ ID NO. 13所示；所述抗HER-2的IgG抗體的輕鏈可變區如SEQ ID NO. 14所示；和/或所述抗CD47抗體的重鏈可變區如SEQ ID NO. 15所示；所述抗CD47抗體的輕鏈可變區如SEQ ID NO. 16所示。
在另一優選例中，所述異多聚體蛋白質包含第一重鏈、第二重鏈、第二輕鏈和第三輕鏈；其中，
所述第一重鏈從N端到C端包含：針對第三標的的抗原結合片段Z3，針對第二標的的抗體重鏈可變結構域Z2、第一CH1、第一CH2和第一CH3結構域；所述的第二輕鏈與所述第一重鏈配合，使得所述的異多聚體蛋白質特異性結合於第二標的；針對第三標的的抗原結合片段Z3特異性結合於第三標的；
所述第二重鏈從N端到C端包含：針對第二標的的抗體重鏈可變結構域Z2、第二CH1、第二CH2和第二CH3結構域，所述的第三輕鏈分別與所述第二重鏈配合，使得所述的異多聚體蛋白質特異性結合於第二標的。
在另一優選例中，所述第二標的為TROP-2，所述第三標的為CD3。
在另一優選例中，所述針對第三標的的抗原結合片段Z3為抗CD3抗體的scFv。
在另一優選例中，所述異多聚體蛋白質具有兩條重鏈和兩條輕鏈，其中
第一重鏈自N端到C端包含：scFv-VH-CH1-鉸鏈區-Fc1；
第二重鏈自N端到C端包含：VH-CH1-鉸鏈區-Fc2；
所述輕鏈自N端到C端包含：VL-CL，其中所述第一重鏈和第二重鏈的VH-CH1與所述輕鏈的VL-CL各自獨立地形成結合於第二標的的第二抗原結合域，所述第一重鏈的scFv的抗原結合結構域結合第三標的。
在另一優選例中，所述第二標的為TROP-2，所述第三標的為CD3。
在另一優選例中，所述第一重鏈的scFv為抗CD3抗體的scFv。
在另一優選例中，所述異多聚體蛋白質，包含含有抗體重鏈恆定區CH3結構域的第一多肽和含有抗體重鏈恆定區CH3結構域的第二多肽，第一多肽恆定區CH3結構域包含選自由以下組成的組的取代：S354C、T366W和T394K，第二多肽恆定區CH3結構域包含選自由以下組成的組的取代：Y349C、T366S、L368A、Y407V和V397D。在另一優選例中，第一多肽恆定區CH3結構域包含選自由以下組成的組的取代：S354C、和T366W，第二多肽恆定區CH3結構域包含選自由以下組成的組的取代：Y349C、T366S、L368A、和Y407V。
在另一優選例中，所述異多聚體蛋白質是雙特異性抗體或Fc融合蛋白。
在另一優選例中，所述雙特異性抗體包含：
第一抗原結合結構域D1；和第二抗原結合結構域D2。
其中，D1特異性結合靶分子HER-2蛋白；D2特異性結合靶分子CD47蛋白；
所述D1為特異性結合HER-2蛋白的抗體或其抗原結合片段；和/或
所述D2為特異性結合CD47蛋白的抗體或其抗原結合片段；
其中，所述的抗原結合片段的結構選自下組：(i)Fab 片段；(ii)F(ab')
2片段；(iii)Fd 片段；(iv)Fv 片段；(v)單鏈Fv (scFv)分子；或(vi)單域抗體dAb 片段。
在另一優選例中，所述的特異性結合HER-2蛋白的抗體包括：單鏈抗體、雙鏈抗體、奈米抗體、單株抗體、嵌合抗體、鼠源抗體、人源化抗體和雙特異性抗體。
在另一優選例中，所述的特異性結合CD47蛋白的抗體包括：單鏈抗體、雙鏈抗體、奈米抗體、單株抗體、嵌合抗體、鼠源抗體、人源化抗體和雙特異性抗體。
在另一優選例中，所述的D1和/或D2為IgG抗體。
在另一優選例中，所述IgG抗體為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體。
在另一優選例中，所述的D1和/或D2為scFv。
在另一優選例中，所述的D1和/或D2為Fab片段。
在另一優選例中，所述D1為抗HER-2的IgG抗體。
在另一優選例中，所述D1為抗HER-2的Fab片段。
在另一優選例中，所述D1包含一個、兩個、三個或多個抗HER-2的IgG抗體。
在另一優選例中，所述D1包含一個、兩個、三個或多個抗HER-2的Fab片段。
在另一優選例中，所述D1為抗HER-2的Fab片段；和所述D1為抗HER-2的IgG抗體，其中D1的抗HER-2的Fab片段連接在D1的抗HER-2的IgG抗體重鏈的可變區N末端。
在另一優選例中，所述D1的Fab和所述D1的IgG透過連接子或直接相連。
在另一優選例中，所述連接子的序列為(G4S)n，較佳地，n為1-4。
在另一優選例中，所述D1為抗HER-2的IgG抗體。
在另一優選例中，所述D2為抗CD47的scFv。
在另一優選例中，所述D1包含一個、兩個、三個或多個抗HER-2的IgG抗體。
在另一優選例中，所述D2包含一個、兩個、三個或多個抗CD47的scFv。
在另一優選例中，所述D2連接到所述的抗HER-2抗體的選自下組的區域：重鏈可變區、重鏈恆定區、輕鏈可變區、輕鏈恆定區或其組合。
在另一優選例中，所述D2為抗CD47的scFv；和所述D1為抗HER-2的IgG抗體，其中D2連接在D1的重鏈可變區N末端。
在另一優選例中，所述D1和所述D2透過連接子或直接相連。
在另一優選例中，所述連接子的序列為(G4S)n，較佳地，n為1-4。
在另一優選例中，所述雙特異性抗體為同源或異源二聚體，優選為異源二聚體。
在另一優選例中，所述雙特異性抗體包含抗HER-2的IgG抗體，一個抗HER-2的Fab片段和一個抗CD47的scFv，其中每個Fab片段與透過L2與抗HER-2的免疫球蛋白抗體IgG串聯；其中每個scFv包含可變區VH和可變區VL，VH與VL透過連接子L1連接，每個抗CD47的scFv透過連接子L2與抗HER-2的免疫球蛋白抗體IgG串聯。
在另一優選例中，所述雙特異性抗體包含：
第一抗原結合結構域D1；和第二抗原結合結構域D2；
其中，D1特異性結合靶分子TROP-2蛋白；D2特異性結合靶分子CD3蛋白；
所述D1為特異性結合TROP-2蛋白的抗體或其抗原結合片段；和/或
所述D2為特異性結合CD3蛋白的抗體或其抗原結合片段；
其中，所述的抗原結合片段的結構選自下組：(i)Fab 片段；(ii)F(ab')
2片段；(iii)Fd 片段；(iv)Fv 片段；(v)單鏈Fv (scFv)分子；或(vi)單域抗體dAb 片段。
在另一優選例中，所述雙特異性抗體包含抗TROP-2的IgG抗體和一個抗CD3的scFv，抗CD3的scFv透過連接子與抗TROP-2的免疫球蛋白抗體IgG串聯。
在另一優選例中，所述抗TROP-2的IgG抗體的重鏈可變區包含互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO. 32所示，HCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO. 33所示，HCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO. 34所示；和
所述抗TROP-2的IgG抗體的輕鏈可變區包含互補決定區LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO.35所示，LCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO. 36所示，LCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO. 37所示。
在另一優選例中，所述抗CD3的scFv的重鏈可變區包含互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO. 38所示，HCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO. 39所示，HCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO.40所示；和
所述抗CD3的scFv輕鏈可變區包含互補決定區LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO.41所示，LCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO. 42所示，LCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO. 43所示。
在另一優選例中，所述的雙特異性抗體選自下組：
(1)所述雙特異性抗體的重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO.48和SEQ ID NO. 49所示，和所述雙特異性抗體的輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO. 50所示；
(2)將(1)中的胺基酸序列經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有同時抗TROP-2活性和抗CD3活性的由(1)衍生的多肽。
在另一優選例中，所述雙特異性抗體為異源二聚體，其包含第一多肽和第二多肽，從N端到C端分別具有如式Ia和Ib所示的結構：
(Ia) (Ib)；
其中，
VL
A代表抗HER-2抗體的輕鏈可變區；
VH
A代表抗HER-2抗體的重鏈可變區；
VL
B代表抗CD47抗體的輕鏈可變區；
VH
B代表抗CD47抗體的重鏈可變區；
CH代表重鏈恆定區；
CL代表輕鏈恆定區；
L1、L2各自獨立地為鍵或連接子；
“～”代表二硫鍵或共價鍵；
“-”代表肽鍵；
其中，所述雙特異性抗體具有同時結合HER-2以及結合CD47的活性。
在另一優選例中，所述重鏈恆定區選自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重鏈恆定區。
在另一優選例中，所述連接子L1的序列如SEQ ID NO. 24所示。
在另一優選例中，所述連接子L2的序列如SEQ ID NO. 25所示。
在另一優選例中，所述抗HER-2的IgG抗體的重鏈可變區包含互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO. 7所示，HCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO. 8所示，HCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO. 9所示；和
所述抗HER-2的IgG抗體的輕鏈可變區包含互補決定區LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO. 10所示，LCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO. 11所示，LCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO. 12所示。
在另一優選例中，所述抗HER-2抗體包含SEQ ID NO. 13所示的重鏈可變區。
在另一優選例中，所述抗HER-2抗體包含SEQ ID NO. 14所示的輕鏈可變區。
在另一優選例中，所述抗HER-2的Fab片段重鏈區域的序列如SEQ ID NO. 22所示。
在另一優選例中，所述抗CD47抗體的重鏈可變區包含互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO.1所示，HCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，HCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO. 3所示；和
所述抗CD47抗體的輕鏈可變區包含互補決定區LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO. 4所示，LCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO. 5所示，LCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO. 6所示。
在另一優選例中，所述抗CD47抗體包含SEQ ID NO. 15所示的重鏈可變區。
在另一優選例中，所述抗CD47抗體包含SEQ ID NO. 16所示的輕鏈可變區。
在另一優選例中，所述抗CD47的scFv的序列如SEQ ID NO. 17所示。
在另一優選例中，所述的雙特異性抗體選自下組：
(1)所述雙特異性抗體的重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO. 30和SEQ ID NO. 31所示，和所述雙特異性抗體的輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO. 27所示；
(2)將(1)中的胺基酸序列經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有同時抗HER-2活性和抗CD47活性的由(1)衍生的多肽。
在另一優選例中，所述雙特異性抗體包括所述雙特異性抗體的活性片段和/或衍生物，其中，所述活性片段和/或所述衍生物保留了所述雙特異性抗體的70-100%的抗HER-2活性和70-100%的抗CD47活性。
在另一優選例中，所述抗體的衍生物具有與本發明抗體至少85%的序列相同性。
在另一優選例中，所述抗體的衍生物是本發明抗體經過一個或幾個胺基酸缺失、插入和/或取代後並保持至少85%的相同性的序列。
在另一優選例中，所述抗體的衍生物具有與本發明抗體至少86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的序列相同性。
在另一優選例中，所述的取代為守恆性取代。
在另一優選例中，所述雙特異性抗體包含抗HER-2的IgG，其包含SEQ ID NO. 26所示的重鏈恆定區或其衍生序列，所述衍生序列包含一個或多個位點的胺基酸取代：SEQ ID NO. 26所示胺基酸序列的第354、366和394位。
在另一優選例中，所述衍生序列包含一個或多個位點的胺基酸取代：S354C、T366W和T394K。
在另一優選例中，所述雙特異性抗體包含抗HER-2的IgG，其包含SEQ ID NO. 26所示的重鏈恆定區或其衍生序列，所述衍生序列包含一個或多個位點的胺基酸取代：SEQ ID NO. 26所示胺基酸序列的第349、366、368、407和397位。
在另一優選例中，所述衍生序列包含一個或多個位點的胺基酸取代：Y349C、T366S、L368A、Y407V和V397D。
在另一優選例中，所述雙特異性抗體包含抗HER-2的IgG，其包含SEQ ID NO. 26所示的重鏈恆定區或其衍生序列，所述衍生序列包含一個或多個位點的胺基酸取代：SEQ ID NO. 26所示胺基酸序列的第354和366位。
在另一優選例中，所述衍生序列包含一個或多個位點的胺基酸取代： S354C和T366W。
在另一優選例中，所述雙特異性抗體包含抗HER-2的IgG，其包含SEQ ID NO. 26所示的重鏈恆定區或其衍生序列，所述衍生序列包含一個或多個位點的胺基酸取代：SEQ ID NO. 26所示胺基酸序列的第349、366、368和407位。
在另一優選例中，所述衍生序列包含一個或多個位點的胺基酸取代：Y349C、T366S、L368A和Y407V。
在本發明的第二方面，提供了一種多核苷酸分子，所述多核苷酸分子編碼根據本發明的第一方面所述的異多聚體蛋白質。
在本發明的第三方面，提供了一種表現載體，所述表現載體含有根據本發明的第二方面所述的多核苷酸分子。
在另一優選例中，所述表現載體為病毒或質體，較佳地為噬菌體或者噬菌粒。
在另一優選例中，所述表現載體選自下組：pcDNA3.4，pDR1，pcDNA3.1(+)，pcDNA3.1/ZEO(+)，pDH FR，pTT5，pDHFF，pGM-CSF或pCHO 1.0，較佳地為pcDNA3.4。
在本發明的第四方面，提供了一種宿主細胞，所述宿主細胞含有根據本發明的第三方面所述的表現載體。
在另一優選例中，所述宿主細胞選自下組：COS、CHO、NS0、sf9、sf21、DH5α、BL21(DE3)或TG1，更佳地為E.coli TG1、BL21(DE3)細胞(表現單鏈抗體或Fab抗體)或者CHO-K1細胞(表現全長IgG抗體)。
在另一優選例中，所述宿主細胞為真核細胞，優選CHO細胞或293F細胞。
在本發明的第五方面，提供了一種製備如本發明的第一方面所述的異多聚體蛋白質的方法，所述製備方法包括以下步驟：
a) 在表現條件下，培養根據本發明的第四方面所述的宿主細胞，從而表現異多聚體蛋白質；
b) 分離並純化步驟a)所述的異多聚體蛋白質。
在本發明的第六方面，提供了一種藥物組成物，所述藥物組成物包含有效量的根據本發明的第一方面所述的異多聚體蛋白質和一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
在本發明的第七方面，提供了根據本發明的第一方面所述的異多聚體蛋白質、或根據本發明的第六方面所述的藥物組成物在製備癌症或腫瘤的藥物中的用途。
在另一優選例中，所述癌症或腫瘤選自：肺癌、骨癌、胃癌、胰腺癌、皮膚癌、頭頸癌、子宮癌、卵巢癌、睪丸癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、直腸癌、結腸癌、肛門區癌、乳腺癌、食管癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、胰腺癌、腦癌、睪丸癌、淋巴癌、移行細胞癌、膀胱癌、腎癌或輸尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、軟組織肉瘤、兒童固態腫瘤、淋巴細胞性淋巴瘤、中樞神經系統(CNS)腫瘤、原發性中樞神經系統淋巴瘤、腫瘤血管生成、脊柱腫瘤、腦幹神經膠質瘤、垂體腺瘤、黑素瘤、卡波西肉瘤、表皮樣癌、鱗狀細胞癌、T細胞淋巴瘤、慢性、急性白血病或其組合。
在本發明的第八方面，提供了一種免疫偶聯物，所述免疫偶聯物包括：
(a) 如本發明的第一方面所述的異多聚體蛋白質；和
(b) 選自下組的偶聯部分：可檢測標記物、藥物、毒素、細胞激素、放射性核素、或酶。
在另一優選例中，所述偶聯物部分選自：螢光或發光標記物、放射性標記物、MRI(磁共振成像)或CT(電子計算機X射線斷層掃描技術)造影劑、或能夠產生可檢測產物的酶、放射性核素、生物毒素、細胞激素(如IL-2等)。
在另一優選例中，所述的免疫偶聯物包括抗體－藥物偶聯物(ADC)。
在另一優選例中，所述的免疫偶聯物用於製備治療癌症或腫瘤的藥物組成物。
在本發明的第九方面，提供了一種產生特異性結合第一標的、第二標的和第三標的的異多聚體蛋白質的方法，所述方法包括：
(a) 提供包含特異性結合至第一標的的第一結合結構域、特異性結合至第二標的的第二結合結構域、第一CH2結構域和第一CH3結構域的第一多肽；以及
(b) 提供第二多肽，其包含特異性結合至第三標的的第三結合結構域、第二標的的第二結合結構域、第二CH2結構域和第二CH3結構域；
其中：所述第一CH3結構域、第二CH3結構域相對於野生型CH3結構域具有以下取代：第一CH3結構域：T394K、S354C、T366W；第二CH3結構域：V397D、Y349C、T366S、L368A、Y407V。
其中，所述胺基酸的位置根據KABAT編號的EU索引確定。
在另一優選例中，所述第一標的與第二標的相同或不同。
在另一優選例中，所述方法還包括：
(c) 提供第一輕鏈、第二輕鏈和第三輕鏈；其中，所述的第一輕鏈和第二輕鏈分別與所述第一多肽配合，使得所述的異多聚體蛋白質特異性結合於第一標的和第二標的；所述的第三輕鏈與所述第二多肽配合，使得所述的異多聚體蛋白質特異性結合於第二標的。
在另一優選例中，提供了一種產生特異性結合不同標的的異多聚體蛋白質的方法，所述方法包括：
(a1) 提供包含特異性結合至第一標的的第一結合結構域、特異性結合至第二標的的第二結合結構域、第一CH2結構域和第一CH3結構域的第一多肽；以及
(b1) 提供第二多肽，其包含特異性結合至第三標的的第三結合結構域、第二標的的第二結合結構域、第二CH2結構域和第二CH3結構域；或
(a2) 提供包含特異性結合至第三標的的第三結合結構域、特異性結合至第二標的的第二結合結構域、第一CH2結構域和第一CH3結構域的第一多肽；以及
(b2) 提供第二多肽，其包含特異性結合至第二標的的第二結合結構域、第二CH2結構域和第二CH3結構域；
其中：所述第一CH3結構域、第二CH3結構域相對於野生型CH3結構域具有以下取代：第一CH3結構域：T394K、S354C、T366W；第二CH3結構域：V397D、Y349C、T366S、L368A、Y407V。
在本發明的第十方面，提供了一種治療癌症或腫瘤的方法，所述方法包括向有需要的受試者施用根據在本發明的第一方面所述的異多聚體蛋白質、根據在本發明的第六方面所述的藥物組成物、根據本發明的第九方面所述的免疫偶聯物。
在另一優選例中，所述方法還包括和其他的抗腫瘤藥聯合給藥。
在本發明的第十一方面，提供了一種異二聚化的Fc元件，包括含有第一重鏈恆定結構域3(CH3)結構域的第一多肽和含有第二重鏈恆定結構域3(CH3)結構域的第二多肽，其中相對於野生型CH3結構域，所述第一CH3結構域包括選自下組的胺基酸取代：T394K、S354C和T366W、或其組合；和/或所述第二CH3結構域包括選自下組的胺基酸取代：V397D、Y349C，T366S，L368A、Y407V、或其組合，所述胺基酸的位置根據KABAT編號的EU索引確定。
在另一優選例中，所述異二聚化的Fc元件還包括重鏈恆定結構域2(CH2)。
本發明的積極進步效果在於：提供了一種可以運用到含Fc段的異多聚體蛋白質的杵臼結構模式，可促進抗體Fc段的異源二聚化，並提供了一種可以穩定表現的非對稱結構的抗HER-2和CD47雙特異性抗體，並衍生得到其他的可以穩定表現的雙特異性抗體，如抗TROP-2和CD3雙特異性抗體(詳情見實施例)，進一步證明了該模式的應用廣度。
應理解，在本發明範圍內中，本發明的上述各技術特徵和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特徵之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限於篇幅，在此不再一一累述。
具體實施方式
本發明人經過廣泛而深入地研究，首次意外發現了一種異多聚體蛋白質，其包含具有一個或多個胺基酸取代的抗體重鏈恆定結構域3(CH3)結構域，所述胺基酸取代使所述異多聚體蛋白質的CH3結構域具有新型工程化離子鍵和/或離子和/或電荷相互作用，進一步與杵臼結構(KIH)殘基取代組合，促進異二聚體的形成。進一步地，還提供了製備所述異多聚體蛋白質的方法。本發明的異多聚體蛋白質製備方法可用於增強異二聚體的形成和減少同二聚體的形成。所述方法適用於所有含Fc段的異多聚體蛋白質，諸如雙特異性抗體和Fc融合蛋白等。在此基礎上完成了本發明。
本申請是在上述杵臼結構的基礎上，對重鏈恆定區CH3的胺基酸進行進一步的突變與篩選，獲得更加穩定的異多聚體蛋白質，並將此結構運用到更多透過Fc段結合的異多聚體蛋白質中，如非對稱結構的雙特異性抗體和Fc融合蛋白等。
具體地，本發明同時提供了一種異多聚體蛋白質，所述異多聚體蛋白質中的Fc段的CH3結構域中包含相對於野生型CH3結構域在在胺基酸位置394處利用帶正電荷的胺基酸(例如T394K)進行的取代；和/或所述第二CH3結構域包括相對於野生型CH3結構域在胺基酸位置397處利用帶負電荷的胺基酸(例如V397D)進行的取代。
進一步地還包括杵臼結構(KIH)殘基，例如所述第一CH3結構域還包括選自下組的胺基酸取代：S354C和/或T366W；並且所述第二CH3結構域還包括選自下組的胺基酸取代：Y349C、T366S、L368A、Y407V。所述胺基酸的位置根據KABAT編號的EU索引確定。
在一個具體實施方式中，所述異多聚體蛋白質為具有不對稱的抗HER-2和CD47雙特異性抗體，或具有不對稱結構的抗TROP-2和CD3雙特異性抗體。
術語
為了可以更容易地理解本揭示，首先定義某些術語。如本申請中所使用的，除非本文另有明確規定，否則以下術語中的每一個應具有下面給出的含義。在整個申請中闡述了其它定義。
術語“約”可以是指在本領域普通技術人員確定的特定值或組成的可接受誤差範圍內的值或組成，其將部分地取決於如何測量或測定值或組成。
如本文所用，術語“含有”或“包括(包含)”可以是開放式、半封閉式和封閉式的。換言之，所述術語也包括“基本上由…構成”、或“由…構成”。
如本文所用，術語“異多聚體”或“異多聚體蛋白質”是包含至少第一多肽和第二多肽的分子，其中第二多肽在胺基酸序列上與第一多肽相異於至少一個胺基酸殘基。在一些發明中，異多聚體對至少兩種不同的配體或結合位點具有結合特異性。異多聚體可包含由第一多肽和第二多肽形成的“異二聚體”，或可形成其中存在除了第一多肽和第二多肽之外的多肽的更高階的三級結構。
如本文所用，術語“異二聚化(heterodimerization)”通常是指在兩個不同成員之間形成或不形成共價鍵的情況下，諸如透過複合、締合或聚集在兩個不同成員(例如兩個不同多肽)之間形成異二聚體的過程。
如本文所用，術語“杵臼結構”或“Knobs-into-Holes”是指CH3結構域中的一對工程化胺基酸殘基，工程化胺基酸殘基使得CH3結構域的接觸表面的獲得空間修飾，所述第一CH3結構域透過互補的空間修飾優先附著至第二CH3結構域的相應接觸表面。此類空間修飾主要源自不同的胺基酸殘基和側鏈，例如，以產生“Knobs”或“Holes”結構，它們互補形成“Knobs-into-Holes”二聚體。
如本文所用，“CH3結構域”(也稱為“C2”或“H3”結構域)包含Fc區中殘基C末端至CH2結構域的延伸(即從抗體序列的大約胺基酸殘基341至C末端(通常在IgG的胺基酸殘基446或447處))。如本文所用，“第一CH3結構域”、“第一多肽恆定區CH3”、“第一CH3”、“第一CH3域”、“第一重鏈恆定結構域3”可以互換使用；“第二CH3結構域”、“第二多肽恆定區CH3”、“第二CH3”、第二CH3域”、“第二重鏈恆定結構域3”可以互換使用。
如本文所用，術語“抗體(Antibody，縮寫Ab)”和“免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，縮寫IgG)”是有相同結構特徵的異四聚醣蛋白，其由兩條相同的輕鏈(L)和兩條相同的重鏈(H)組成。每條輕鏈透過一個共價二硫鍵與重鏈相連，而不同免疫球蛋白同種型(isotype)的重鏈間的二硫鍵數目不同。每條重鏈和輕鏈也有規則間隔的鏈內二硫鍵。每條重鏈的一端有可變區(VH)，其後是恆定區，重鏈恆定區由三個結構域CH1、CH2、以及CH3構成。每條輕鏈的一端有可變區(VL)，另一端有恆定區，輕鏈恆定區包括一個結構域CL；輕鏈的恆定區與重鏈恆定區的CH1結構域配對，輕鏈的可變區與重鏈的可變區配對。恆定區不直接參與抗體與抗原的結合，但是它們表現出不同的效應功能，例如參與抗體依賴的細胞媒介的細胞毒殺作用(ADCC，antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)等。重鏈恆定區包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4亞型；輕鏈恆定區包括κ(Kappa)或λ(Lambda)。抗體的重鏈和輕鏈透過重鏈的CH1結構域和輕鏈的CL結構域之間的二硫鍵共價連接在一起，抗體的兩條重鏈透過鉸鏈區之間形成的多肽間二硫鍵共價連接在一起。
如本文所用，術語“結合結構域”包括多肽中的任意區域，其特異性結合目標分子(例如抗原、配體、受體等)。示例性結合結構域包括抗體可變結構域、受體結合結構域、配體結合結構域和酶促結構域。
本發明所述的“免疫球蛋白抗體IgG”是約150kDa的分子，它由四條肽鏈構成，含有兩條相同的約50kDa的γ重鏈，和兩條相同的約25kDa的輕鏈，從而具有四聚體四級結構。兩條重鏈透過二硫鍵相互連接，並各自與一條輕鏈連接。所成的四聚體具有相同的兩半，二者形成叉型或者類似Y的形狀，叉的每一端含有一個相同的抗原結合位點。IgG抗體可以基於重鏈的恆定區中胺基酸序列的微小差異而分為多個亞型(例如IgG1、2、3、4)。
本發明中，術語“雙特異性抗體(或雙抗)”是指能同時特異性結合兩種抗原(標的)或兩種表位的抗體分子。根據對稱性，雙特異性抗體可以分為結構對稱的和不對稱的分子。根據結合位點的多少，雙特異性抗體可以分為二價、三價、四價和多價分子。
本發明中，術語“單株抗體(單抗)”指從一類基本均一的群體獲得的抗體，即該群體中包含的單個抗體是相同的，除少數可能存在的天然發生的突變外。單株抗體高特異性地針對單個抗原位點。而且，與常規多株抗體製劑(通常是具有針對不同抗原決定簇的不同抗體的混合物)不同，各單株抗體是針對抗原上的單個決定簇。除了它們的特異性外，單株抗體的好處還在於它們可以透過融合瘤培養來合成，不會被其它免疫球蛋白污染。修飾語“單株”表示了抗體的特性，是從基本均一的抗體群中獲得的，這不應被解釋成需要用任何特殊方法來生產抗體。
如本文所用，術語“抗原結合片段”，指具有抗原結合活性的Fab片段，Fab’片段，F(ab’)
2片段，或單一Fv片段。抗原結合片段的非限制性例子包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')
2片段；(iii) Fv片段； (iv) 單鏈Fv(scFv) ；或(vi) 單域抗體(dAb)片段。如本文所用，表述“抗原結合片段”內部也涵蓋其他工程化分子，如結構域特異性抗體、單結構域抗體、結構域缺失抗體、嵌合抗體、CDR移植抗體、雙體抗體、三體抗體、四體抗體、微型抗體、奈米抗體(例如單價奈米體、雙價奈米體等)、小模塊免疫藥物(SMIP)和鯊魚可變IgNAR域。
本發明中，術語“Fab”和“Fc”是指木瓜蛋白酶可將抗體裂解為兩個完全相同的Fab段和一個Fc段。Fab段由抗體的重鏈的VH和CH1以及輕鏈的VL和CL結構域組成。Fc段即可結晶片段(fragment crystallizable，Fc)，由抗體的CH2和CH3結構域組成。Fc段無抗原結合活性，是抗體與效應分子或細胞相互作用的部位。術語“F(ab’)
2片段” F(ab’)
2片段抗體是由胃蛋白酶消化整個 IgG 抗體，去除大部分 Fc 區同時完整保留一些鉸鏈區後得到的，具有透過二硫鍵連接在一起的兩個抗原結合 F(ab) 部分。
本發明中，術語“scFv”或“單鏈可變區片段scFv”為單鏈抗體(single chain antibody fragment，scFv)，是指包含免疫球蛋白重鏈VH和輕鏈VL可變區的融合蛋白，VH與VL透過15～25個胺基酸的連接子(linker)相連，其中所述融合蛋白保留了完整免疫球蛋白相同的抗原特異性。
本發明中，術語“Fv片段”或“Fv抗體”含有抗體重鏈可變區、輕鏈可變區，但沒有恆定區，並具有全部抗原結合位點的最小抗體片段。一般的，Fv片段還包含VH和VL結構域之間的多肽連接子，且能夠形成抗原結合所需的結構。
本發明中，術語“可變”表示抗體中可變區的某些部分在序列上有所不同，它形成各種特定抗體對其特定抗原的結合和特異性。然而，可變性並不均勻地分佈在整個抗體可變區中。它集中於重鏈可變區和輕鏈可變區中稱為互補決定區(complementarity-determining region，CDR)或超變區中的三個片段中。可變區中較保守的部分稱為框架區(frame region，FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區中各自包含四個FR區，它們大致上呈β-折疊構型，由形成連接環的三個CDR相連，在某些情況下可形成部分β折疊結構。每條鏈中的CDR透過FR區緊密地靠在一起並與另一鏈的CDR一起形成了抗體的抗原結合部位(即形成了抗原結合結構域)(參見Kabat等，NIH Publ.No.91-3242，卷I，647-669頁(1991))。
如本文所用，術語“KABAT編號的EU索引”通常是指根據KABAT等人(1971)Ann.NYAcad,Sci.(《紐約科學院年報》)190:382-391和Kabat,E.A.等人(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest(具有免疫學意義的蛋白質序列)，第五版，美國衛生及公共服務部,NIH第91-3242號出版物的對應於胺基酸序列的EU編號的索引。
如本文所用，術語“框架區”(FR)指插入CDR間的胺基酸序列，即指在單一物種中不同的免疫球蛋白間相對保守的免疫球蛋白的輕鏈和重鏈可變區的那些部分。免疫球蛋白的輕鏈和重鏈各具有四個FR，分別稱為FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。相應地，輕鏈可變結構域可因此稱作(FR1-L)-(CDR1-L)-(FR2-L)-(CDR2-L)-(FR3-L)-(CDR3-L)-(FR4-L)且重鏈可變結構域可因此表示為(FR1-H)-(CDR1-H)-(FR2-H)-(CDR2-H)-(FR3-H)- (CDR3-H)-(FR4-H)。優選地，本發明的FR是人抗體FR或其衍生物，所述人抗體FR的衍生物與天然存在的人抗體FR基本相同，即序列相同性達到85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%。
獲知CDR的胺基酸序列，本領域的技術人員可輕易確定框架區FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和/或FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。
如本文所用，術語“人框架區”是與天然存在的人抗體的框架區基本相同的(約85%或更多，具體地90%、95%、97%、99%或100%)框架區。
如本文所用，術語“連接子”是指插入免疫球蛋白結構域中為輕鏈和重鏈的結構域提供足夠的可動性以折疊成交換雙重可變區免疫球蛋白的一個或多個胺基酸殘基。在本發明中，優選的連接子是指連接子L1和L2，其中L1連接單鏈抗體(scFv)的VH和VL，而L2用於將scFv或Fab片段與另一抗體的重鏈進行連接。
合適的連接子實例包括單甘胺酸(Gly)、或絲胺酸(Ser)殘基，連接子中胺基酸殘基的標識和序列可隨著連接子中需要實現的次級結構要素的類型而變化。
如本文所用，術語“抗”、“結合”、“特異性結合”是指兩分子間的非隨機的結合反應，如抗體和其所針對的抗原之間的反應。通常，抗體以小於大約10
-7M，例如小於大約10
-8M、10
-9M、10
-10M、10
-11M或更小的平衡解離常數(KD)結合該抗原。本發明中，術語“KD”是指特定抗體-抗原相互作用的平衡解離常數，其用於描述抗體與抗原之間的結合親和力。平衡解離常數越小，抗體-抗原結合越緊密，抗體與抗原之間的親和力越高。例如，使用表面等離子體共振術(Surface Plasmon Resonance，縮寫SPR)在BIACORE儀中測定抗體與抗原的結合親和力或使用ELISA測定抗體與抗原結合的相對親和力。
如本文所用，術語“表位”是指與抗體特異性結合的多肽決定簇。本發明的表位是抗原中被抗體結合的區域。
HER-2
人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)基因定位於染色體17q21，屬於原癌基因，其編碼的HER-2蛋白為185KD的跨膜精蛋白，具有酪胺酸蛋白激酶活性，是表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)的家族成員之一。HER-2蛋白在正常機體組織內不表現或低表現，在乳腺癌、卵巢癌和胃癌等多種腫瘤細胞中過表現，是典型的腫瘤治療標的和監測標誌物。HER-2蛋白與其家族的其他成員組成同源或異源二聚體，啟動下游訊息途徑，目前尚未發現能與HER-2蛋白直接結合的配體。世界上第一個用於臨床治療的人源化單株抗體曲妥珠單抗(Herceptin)，就是專門針對HER-2陽性乳腺癌的抗體治療藥物，該抗體可與HER-2的胞外結構域結合，阻斷HER-2與非受體酪胺酸激酶的相互作用，從而引起HER-2下調，在臨床治療中效果顯著。
CD47
分化簇47(cluster of differentiation 47，CD47)又稱為整合素相關蛋白(integrin-associated protein，IAP)，屬於免疫球蛋白超家族，目前已知的天然配體有整合素、血小板反應蛋白1(thrombospondin-1，TSP-1)和訊息調節蛋白α(signal-regulatory proteinα，Sirpα)。在免疫反應中，CD47透過與巨噬細胞表面的Sirpα結合，釋放“別吃我”訊息，從而保證正常細胞不被巨噬細胞“吃掉”，然而一些腫瘤細胞也會利用CD47/Sirpα訊息途徑，高表現CD47以實現免疫逃脫。抗CD47抗體可針對多種適應症，主要包括非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin lymphoma，NHL)和急性骨髓性白血病(acute myeloid leukemia，AML)等血液系統惡性腫瘤，但是由於正常細胞包括紅血球和T淋巴細胞等也表現CD47，所以標靶CD47藥物的毒副作用是此類藥物開發的難點，目前暫無成功上市的抗CD47抗體藥物。
TROP-2
人滋養層細胞表面抗原2 (human trophoblast cell surface antigen 2, TROP-2)是由TACSTD2基因編碼表現的細胞表面醣蛋白。TROP-2為單次跨膜的I型膜蛋白，由323個胺基酸構成，其中訊息胜肽26個胺基酸，胞外區248個胺基酸，跨膜區23個胺基酸，胞內區26個胺基酸。截至目前，TROP-2的配體蛋白還沒有鑒定到，因此對其生理生化功能還不是十分明確。但是大量的臨床研究和文獻報導，TROP-2蛋白在各種人類上皮癌中高表現並且與患者的預後不良和癌細胞轉移密切相關，包括乳腺癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌和子宮頸癌等。美國FDA已經批准TROP-2抗體偶聯藥物賽妥珠單抗-格衛替康(sacituzumab govitecan)用於轉移性三陰性乳腺癌的治療。
CD3
分化簇3(cluster of differentiation 3，CD3)是T細胞表面重要的分化抗原，CD3分子與T細胞受體(T cell recptor，TCR)形成TCR-CD3複合體，TCRαβ亞基辨識胞外訊息並將胞外訊息傳遞給CD3，CD3分子依靠自身免疫酪胺酸訊息模體(immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)將訊息向胞內傳遞。抗CD3抗體可激發或阻斷T細胞活化訊息，清除效應T細胞或誘導調節T細胞產生。
異多聚體蛋白質
本發明提供的異多聚體蛋白質，諸如異二聚體蛋白質，其包含含有抗體重鏈恆定區CH3的第一多肽和含有抗體重鏈恆定區CH3的第二多肽，其中第一多肽恆定區CH3和第二多肽恆定區CH3包含工程化離子和/或電荷相互作用和靜電相互作用。應理解，所述異多聚體蛋白質包含改造的Fc區段，所述改造的Fc區段包含第一多肽恆定區CH3和第二多肽恆定區CH3。
在一些優選例中，第一多肽恆定區CH3和第二多肽恆定區CH3包含“Knobs-into-Holes”殘基。異多聚體蛋白質的示例性結構包括異二聚體(例如Fc融合蛋白)、異三聚體(例如抗體‑免疫粘附素嵌合體)、異四聚體(例如雙特異性抗體)和其它寡聚體結構。在一些優選例中，異多聚體蛋白質是雙特異性抗體，例如具有非對稱結構(包含兩條不同的重鏈)的雙特異性抗體。
本發明提供的異多聚體蛋白質，其包含改造的Fc區段，其中第一多肽恆定區CH3包含相對於野生型恆定區CH3在胺基酸位置394處利用帶正電的胺基酸進行的取代，並/或第二多肽恆定區CH3包含相對於野生型恆定區CH3在胺基酸位置397處利用帶負電荷的胺基酸進行的取代。
第一多肽恆定區CH3的394處的帶正電荷的胺基酸與第二多肽恆定區CH3中的胺基酸殘基形成離子和/或電荷相互作用，第二多肽恆定區CH3的397處的帶負電荷的胺基酸與第一多肽恆定區CH3中的胺基酸殘基形成離子和/或電荷相互作用。
雙特異性抗體
在本發明的一個優選實施例中，所述異多聚體蛋白質為雙特異性抗體。較佳地，所述雙特異性抗體為抗HER-2和CD47的雙特異性抗體，其包含改造的Fc區段，所述改造的Fc區段包含促進工程化離子和/或電荷相互作用的胺基酸替換和“Knobs-into-Holes”殘基。進一步地，所述改造的Fc區段包含第一多肽恆定區CH3和第二多肽恆定區CH3，其包含選自下組的胺基酸取代：
第一多肽恆定區CH3：T394K、S354C、T366W；第二多肽恆定區CH3：V397D、Y349C、T366S、L368A、Y407V。
本發明的雙特異性抗體為一種能與HER-2和CD47特異結合的不對稱的雙特異性抗體，其包含抗HER-2抗體部分和抗CD47抗體部分。具體地，其包含免疫球蛋白抗體IgG，一個Fab片段和一個可變區片段scFv，Fab片段包含可變區VH和恆定區CH1，以及可變區VL和恆定區CL，Fab片段透過連接子胜肽L2與免疫球蛋白抗體IgG串聯；單鏈可變片段scFv包含可變區VH和可變區VL，VH與VL透過胜肽連接子L1連接，單鏈可變片段scFv透過連接子胜肽L2與免疫球蛋白抗體IgG串聯。
本發明所述的“雙特異性抗體”是指擁有兩個不同的抗原結合位點，能同時結合HER-2和CD47的雙特異性抗體，其包含一個Fab片段和一個可變區片段scFv，和與之綴合的免疫球蛋白抗體IgG，Fab片段和scFv經由胜肽連接子L2分別連接至不同的IgG抗體重鏈上，形成雙特異性抗體的的兩條不同的重鏈並獲得融合蛋白，其中scFv包含可變區VH和可變區VL，VH與VL透過胜肽連接子L1連接。
如上所述，本發明的雙特異性抗體中的抗HER-2抗體部分為特異性結合HER-2蛋白的抗體或其抗原結合片段，抗CD47抗體部分為特異性結合CD47蛋白的抗體或其抗原結合片段；所述的抗原結合片段的結構可以選自下組：(i)Fab 片段；(ii)F(ab')
2片段；(iii)Fd 片段；(iv)Fv 片段；(v)單鏈Fv (scFv)分子；或(vi)單域抗體dAb 片段。
本發明的雙特異性抗體可以為二聚體、三聚體或多聚體，優選為同源或異源二聚體。本發明的雙特異性抗體中抗HER-2或抗CD47的抗體部分可以包括一個或多個抗體或其抗原結合片段，較佳地，1、2、3、4、5、6個。
作為優選的方案，本發明的雙特異性抗體包含抗CD47抗體的scFv和HER-2的IgG抗體，其中所述抗CD47抗體的VH包含互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，HCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，HCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO. 3所示；
所述抗CD47抗體的VL包含互補決定區LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO. 4所示，LCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO. 5所示，LCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO. 6所示；
所述抗HER-2的IgG抗體的VH包含互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO. 7所示，HCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO. 8所示，HCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO. 9所示；
所述抗HER-2的IgG抗體的VL包含互補決定區LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO. 10所示，LCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO. 11所示，LCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO. 12所示。
本領域中，抗體的結合區通常均含有一條輕鏈可變區和一條重鏈可變區，每一個可變區均含有3個CDR結構域。抗體的重鏈和輕鏈的CDR結構域分別稱為HCDR和LCDR。因此，常規抗體抗原結合位點包含六個CDR，包括分別來自重鏈和輕鏈V區的CDR集合。
在本發明中，本發明雙特異性抗體的還包括其守恆性變異體，指與本發明雙特異性抗體的胺基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成多肽。這些守恆性變異多肽最好根據表A進行胺基酸替換而產生。
表 A
| 最初的殘基 | 代表性的取代 | 優選的取代 |
| Leu (L) | Ala； Lys； Asp； Phe | Ala |
| Ser (S) | Cys； Thr | Cys |
| Thr (T) | Ser； Trp； Lys； Gly | Ser |
| Tyr (Y) | Cys； Val ； Ser | Cys |
| Val (V) | Asp； Leu； Met； Phe | Asp |
作為優選的方案，第一重鏈恆定區的胺基酸序列如SEQ ID NO. 18所示，或在SEQ ID NO. 18序列的基礎上還具有選自第354、366和394位的胺基酸突變的序列，優選具有選自S354C、T366W和T394K中一個或多個位點胺基酸突變的序列；第二重鏈恆定區的胺基酸序列如SEQ ID NO. 18所示，或在SEQ ID NO. 18序列的基礎上還具有選自第349、366、368、407和397位的胺基酸突變的序列，優選具有選自Y349C、T366S、L368A、Y407V和V397D中一個或多個位點胺基酸突變的序列。
作為優選的方案，第一重鏈恆定區的胺基酸序列如SEQ ID NO. 18所示，或在SEQ ID NO. 18序列的基礎上還具有選自第354和366位的胺基酸突變的序列，優選具有選自和S354C和T366W中一個或多個位點胺基酸突變的序列；第二重鏈恆定區的胺基酸序列如SEQ ID NO. 18所示，或在SEQ ID NO. 18序列的基礎上還具有選自第349、366、368和407位的胺基酸突變的序列，優選具有選自Y349C、T366S、L368A和Y407V中一個或多個位點胺基酸突變的序列。
作為優選的方案，所述胜肽連接子L1的胺基酸序列如SEQ ID NO. 24所示。
作為優選的方案，所述胜肽連接子L2的胺基酸序列如SEQ ID NO. 25所示。
作為優選的方案，所述單鏈可變片段scFv的分子結構形式為VH-L1-VL，每個scFv的C末端經由胜肽連接子L2連接至免疫球蛋白抗體IgG重鏈的N末端。
作為優選的方案，所述單鏈可變片段scFv的胺基酸序列如SEQ ID NO. 17所示。
作為優選的方案，所述雙特異性抗體的重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO. 30和SEQ ID NO. 31所示，其輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO. 27所示。
在建構本發明的雙特異性抗體時，與該雙特異性抗體的化學和物理穩定性相關的問題也得到了解決，諸如表現物理穩定的分子、增加熱和鹽依賴的穩定性、降低聚集、增加在高濃度下的溶解度以及維持分別針對兩種抗原HER-2和CD47的親和力等。
編碼核酸和表現載體
本發明另一方面提供了一種多核苷酸分子，所述核苷酸分子編碼上述所述的異多聚體蛋白質。本發明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。
本發明所述核苷酸分子的製備方法為本領域常規的製備方法，較佳地包括以下製備方法：透過基因選殖技術例如PCR方法等，獲得編碼上述單株抗體的核苷酸分子，或者透過人工全序列合成的方法得到編碼上述單株抗體的核苷酸分子。
本領域技術人員知曉，編碼上述雙特異性抗體的胺基酸序列的核苷酸序列可以適當引入替換、缺失、改變、插入或增加來提供一個多聚核苷酸的同系物。本發明中多聚核苷酸的同系物可以透過對編碼該雙特異性抗體基因的一個或多個鹼基在保持抗體活性範圍內進行替換、缺失或增加來製得。
本發明另一方面提供了一種表現載體，所述表現載體含有上述的核苷酸分子。
其中所述表現載體為本領域常規的表現載體，是指包含適當的調控序列，例如啟動子序列、終止子序列、多腺苷醯化序列、增強子序列、標記基因和/或序列以及其他適當的序列的表現載體。所述表現載體可以是病毒或質體，如適當的噬菌體或者噬菌粒，更多技術細節請參見例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989。許多用於核酸操作的已知技術和方案請參見Current Protocols in Molecular Biology，第二版，Ausubel等編著。本發明所述表現載體較佳地為pDR1，pcDNA3.1(+)，pcDNA3.4，pcDNA3.1/ZEO(+)，pDHFR，pTT5，pDHFF，pGM-CSF或pCHO 1.0，更佳地為pcDNA3.4。
本發明另外提供了一種宿主細胞，所述宿主細胞含有上述的表現載體。
本發明所述的宿主細胞為本領域常規的各種宿主細胞，只要能滿足使上述重組表現載體穩定地自行複製，且所攜帶所述的核苷酸可被有效表現即可。其中所述宿主細胞包括原核表現細胞和真核表現細胞，所述宿主細胞較佳地包括：COS、CHO(中國倉鼠卵巢，Chinese H amster Ovary)、NS0、sf9、sf21、DH5α、BL21(DE3)或TG1，更佳地為E.coli TG1、BL21(DE3)細胞(表現單鏈抗體或Fab抗體)或者CHO-K1細胞(表現全長IgG抗體)。將前述表現載體轉形至宿主細胞中，即可得本發明優選的重組表現轉形體。其中所述轉形方法為本領域常規轉形方法，較佳地為化學轉形法，熱休克法或電穿孔法。
作為優選的方案，所述宿主細胞是真核細胞。優選CHO細胞或293F細胞。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其選殖入載體，再轉入細胞，然後透過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。
本發明還涉及包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體。這些載體可以用於轉形適當的宿主細胞，以使其能夠表現蛋白質。
本發明另一方面提供了上述能與HER-2和CD47特異結合的雙特異性抗體以及的製備方法，所述製備方法包括以下步驟：
a)在表現條件下，培養上述的宿主細胞，從而表現能與HER-2和CD47特異結合的雙特異性抗體；
b)分離並純化步驟a)所述的雙特異性抗體。
本發明所述的宿主細胞的培養方法、所述抗體的分離和純化方法為本領域常規方法，具體操作方法請參考相應的細胞培養技術手冊以及抗體分離純化技術手冊。本發明中揭示的抗HER-2和CD47雙特異性抗體的製備方法包括：在表現條件下，培養上述的宿主細胞，從而表現能與HER-2和CD47特異結合的雙特異性抗體；分離和純化所述的抗HER-2和CD47雙特異性抗體。利用上述方法，可以將重組蛋白純化為基本均一的物質。
可以利用親和層析的方法對本發明揭示的抗HER-2和CD47雙特異性抗體進行分離純化，根據所利用的親和管柱的特性，可以使用常規的方法例如高鹽緩衝液、改變PH等方法洗提結合在親和管柱上的抗HER-2和CD47雙特異性抗體。本發明的發明人對所得抗HER-2和CD47雙特異性抗體進行了檢測實驗，實驗結果表明該抗HER-2和CD47雙特異性抗體能很好地與標的細胞和抗原結合，具有較高的親和力。
藥物組成物
本發明的另一方面提供了一種組成物，所述組成物包含上述所述的能與HER-2和CD47特異結合的雙特異性抗體和一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。優選地，所述的組成物是藥物組成物。
本發明提供的雙特異性抗體，可以和藥學上可接受的載體一起組成藥物製劑組成物從而更穩定地發揮療效，這些製劑可以保證本發明的雙特異性抗體的胺基酸核心序列的構像完整性，同時還保護蛋白質的多官能團防止其降解(包括但不限於凝聚、脫氨或氧化)。通常，可將這些物質配製於無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，儘管pH值可隨被配製物質的性質以及待治療的病症而有所變化。配製好的藥物組成物可以透過常規途徑進行給藥，其中包括(但並不限於)：靜脈注射、靜脈滴注、皮下注射、局部注射、肌肉注射、瘤內注射、腹腔內注射(如腹膜內)、顱內注射、或腔內注射。通常情況下，對於液體製劑，通常可以在2℃-8℃條件下保存至少穩定一年，對於凍乾製劑，在30℃至少六個月保持穩定。所述雙特異性抗體製劑可為製藥領域常用的懸浮液、水針、凍乾等製劑。
本發明中，術語“藥物組成物”是指本發明的雙特異性抗體可以和藥學上可以接受的載體一起組成藥物製劑組成物從而更穩定地發揮療效，這些製劑可以保證本發明揭示的雙特異性抗體的胺基酸核心序列的構象完整性，同時還保護蛋白質的多官能團防止其降解(包括但不限於凝聚、脫氨或氧化)。
本發明的藥物組成物含有安全有效量(如0.001-99wt%，較佳地0.01-90wt%，更佳地0.1-80wt%)的本發明上述的雙特異性抗體(或其偶聯物)以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但並不限於)：鹽水、緩衝液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物製劑應與給藥方式相匹配。本發明的藥物組成物可以被製成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他佐劑的水溶液透過常規方法進行製備。藥物組成物如針劑、溶液宜在無菌條件下製造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約10微克/千克體重-約50毫克/千克體重。此外，本發明的雙特異性抗體還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組成物時，是將安全有效量的雙特異性抗體或其免疫偶聯物施用於哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數情況下不超過約50毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約10毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能範圍之內的。
應用
本發明提供了與HER-2和CD47特異結合的雙特異性抗體、或上述藥物組成物在製備藥物中的應用，所述藥物用於治療癌症或腫瘤。
本發明所稱的用於治療癌症或腫瘤的藥物，指具有抑制和/或治療腫瘤的藥物，可以包括伴隨腫瘤相關症狀發展的延遲和/或這些症狀嚴重程度的降低，進一步還包括已存在的腫瘤伴隨症狀的減輕並防止其他症狀的出現，還包括減少或防止腫瘤的轉移等。
本發明所述的藥物所針對的腫瘤較佳地包括但不限於：肺癌、骨癌、胃癌、胰腺癌、皮膚癌、頭頸癌、子宮癌、卵巢癌、睪丸癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、直腸癌、結腸癌、肛門區癌、乳腺癌、食管癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、胰腺癌、腦癌、睪丸癌、淋巴癌、移行細胞癌、膀胱癌、腎癌或輸尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、軟組織肉瘤、兒童固態腫瘤、淋巴細胞性淋巴瘤、中樞神經系統(CNS)腫瘤、原發性中樞神經系統淋巴瘤、腫瘤血管生成、脊柱腫瘤、腦幹神經膠質瘤、垂體腺瘤、黑素瘤、卡波西肉瘤、表皮樣癌、鱗狀細胞癌、T細胞淋巴瘤、慢性或急性白血病和所述癌的組合。
本發明的雙特異性抗體及其組成物在對包括人在內的動物給藥時，給藥劑量因病人的年齡和體重，疾病特性和嚴重性，以及給藥途徑而異，可以參考動物實驗的結果和種種情況，總給藥量不能超過一定範圍。具體講靜脈注射的劑量是1-1800mg/天。
本發明的雙特異性抗體及其組成物還可以和其他的抗腫瘤藥聯合給藥以達到更加有效治療腫瘤的目的，這些抗腫瘤藥包括但不限於：1、細胞毒類藥物：1)作用於核酸化學結構的藥物：烷化劑如氮芥類、亞硝脲類、甲基磺酸酯類；鉑類化合物如順鉑(Cisplatin)、卡鉑 (Carboplatin)和草酸鉑(Oxaliplatin)等；抗生素類如阿黴素(Adriamycin/Doxorubicin)、放線菌素D(DactinomycinD)、柔紅黴素(Daunorubicin)、表阿黴素(Epirubicin)、光輝黴素(Mithramycin)等；2)影響核酸代謝的藥物：二氫葉酸還原酶抑制劑如甲氨喋呤(MTX)和培美曲塞(Pemetrexed)等；胸腺核苷合成酶抑制劑如氟尿嘧啶類(5-氟尿嘧啶、卡培他濱)等；嘌呤核苷合成酶抑制劑如6-巰基嘌呤等；核苷酸還原酶抑制劑如羥基脲(Hydroxycarbamide)等；DNA多聚酶抑制劑如阿糖胞苷(Cytosinearabinoside)和吉西他濱(Gemcitabine)等；3)作用於微管蛋白的藥物：多西他賽(Docetaxel)、長春花鹼(Vincristine)、長春瑞濱(Vinorelbine)、鬼臼鹼類、高三尖杉酯鹼等；2、激素類藥物：抗雌激素如他莫昔芬(Tamoxifen)、屈洛昔芬(Droloxifene)、依西美坦(Exemestane)等；芳香化酶抑制劑如氨魯米特(Aminoglutethimide)、福美司坦(Formestane)、來曲唑(Letrozle)、阿那曲唑(Anastrozole)等；抗雄激素：氟它氨RH-LH激動劑/拮抗劑：諾雷德、依那通等；3、生物反應調節劑類藥物：此類藥物主要透過調節機體免疫功能以到抗腫瘤的效果，如干擾素類(Interferon)；白細胞介素-2(Interleukin-2)；胸腺胜肽類(Thymosins)等；4、單株抗體類藥物：曲妥昔單抗(Trastuzumab)、利妥昔單抗(Rituximab)、西妥昔單抗(Cetuximab)、貝伐單抗(Bevacizumab)等；5、其他類抗腫瘤藥物：包括一些目前機制尚不明確、有待進一步研究的藥物等。本發明揭示的雙特異性抗體及其組成物可以和上述的抗腫瘤藥物之一或其組合聯合用藥。
本發明的主要優點包括
(1)本發明的異多聚體蛋白質包含具有促進離子和/或電荷相互作用的特定胺基酸取代的Fc段，透過與杵臼結構(KIH)突變相組合，有效促進異二聚體的形成和減少同二聚體的形成。
(2)本發明提供了在Fc區中具有工程化離子和/或電荷相互作用的胺基酸替換和“Knobs-into-Holes”杵臼結構的抗HER-2和CD47及抗TROP-2和CD3的雙特異性抗體，其能夠以高純度穩定表現。
下面結合具體實施例，進一步陳述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明詳細條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子選殖：實驗室手冊(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。
以下實施例中使用的實驗材料和來源以及實驗試劑的配製方法具體說明如下。
實驗材料：
感受態細胞：品牌生工，貨號B528412。
293F細胞：品牌GIBCO，貨號R79007。
0.45µm的過濾器：品牌密理博，貨號SLHV013SL。
Hitrap Mabselect Sure層析管柱：購自Cytiva公司。
HiLoad 26/600 Superdex 200 pg管柱：購自Cytiva公司。
AdvancedBio SEC 300A層析管柱：購自安捷倫公司。
GXⅡ HT protein express labchip：購自PerkinElmer公司。
MassPREP Micro Desalting column：購自Waters公司。
實驗試劑：
無內毒素質體大提試劑盒：品牌天根，貨號DP117。
DNA 純化回收試劑盒：品牌天根，貨號DP214。
ClonExpressTM II One Step Cloning Kit：品牌諾唯贊，貨號C112。
PrimeSTAR® HS DNA Polymerase：品牌takara，貨號R010B 。
protein express reagent kit：品牌PerkinElmer，貨號CLS960008。
PNGase F酶：品牌NEB，貨號P0704S。
實驗儀器：
Mastercycler nexus PCR儀：購自Eppendorf公司。
LabChip® GX II儀：購自PerkinElmer公司。
Heraeus Fresco17離心機：購自Thermo公司。
UPLC-XEVO G2 Q-TOF液質聯用系統：購自Waters公司。
iCE3毛細管等點聚焦分析儀：購自ProteinSimple公司。
本發明的序列如下表所示：
表
1.
實施例
1. KIH
修飾的抗
HER-2
和
CD47
雙抗分子建構
| SEQ ID NO. | 名稱 | 序列 |
| 1 | 抗CD47單抗重鏈可變區VH中互補決定區HCDR1胺基酸序列 | NHVIH |
| 2 | 抗CD47單抗重鏈可變區VH中互補決定區HCDR2胺基酸序列 | YIYPYNDGTKYNEKFKD |
| 3 | 抗CD47單抗重鏈可變區VH中互補決定區HCDR3胺基酸序列 | GGYYTYDD |
| 4 | 抗CD47單抗輕鏈可變區VL中互補決定區LCDR1胺基酸序列 | RSSQSLVHSNGKTYLH |
| 5 | 抗CD47單抗輕鏈可變區VL中互補決定區LCDR2胺基酸序列 | KVSNRFS |
| 6 | 抗CD47單抗輕鏈可變區VL中互補決定區LCDR3胺基酸序列 | SQSTHVPYT |
| 7 | 抗HER-2單抗重鏈可變區VH中互補決定區HCDR1胺基酸序列 | DTYIH |
| 8 | 抗HER-2單抗重鏈可變區VH中互補決定區HCDR2胺基酸序列 | RIYPTNGYTRYADSVKG |
| 9 | 抗HER-2單抗重鏈可變區VH中互補決定區HCDR3胺基酸序列 | WGGDGFYAMDY |
| 10 | 抗HER-2單抗輕鏈可變區VL中互補決定區LCDR1胺基酸序列 | RASQDVNTAVA |
| 11 | 抗HER-2單抗輕鏈可變區VL中互補決定區LCDR2胺基酸序列 | SASFLYS |
| 12 | 抗HER-2單抗輕鏈可變區VL中互補決定區LCDR3胺基酸序列 | QQHYTTPPT |
| 13 | 抗HER-2單抗重鏈可變區VH胺基酸序列 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS |
| 14 | 抗HER-2單抗輕鏈可變區VL胺基酸序列 | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKR |
| 15 | 抗CD47單抗重鏈可變區VH胺基酸序列 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFANHVIHWVRQAPGQGLEWMGYIYPYNDGTKYNEKFKDRVTLTSDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYYTYDDWGQGTLVTVSS |
| 16 | 抗CD47單抗輕鏈可變區VL胺基酸序列 | DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHSNGKTYLHWYQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPYTFGQGTKVEIKR |
| 17 | 抗CD47單抗的可變片段scFv的胺基酸序列 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFANHVIHWVRQAPGQGLEWMGYIYPYNDGTKYNEKFKDRVTLTSDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYYTYDDWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHSNGKTYLHWYQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPYTFGQGTKVEIKR |
| 18 | 人IgG1重鏈恆定區胺基酸序列 | ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
| 19 | 人IgG1重鏈恆定區CH1胺基酸序列 | ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDK |
| 20 | 人IgG1重鏈恆定區CH2胺基酸序列 | THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK |
| 21 | 人IgG1重鏈恆定區CH3胺基酸序列 | TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
| 22 | 抗HER-2單抗Fab片段重鏈區域胺基酸序列 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDK |
| 23 | 人kappa鏈恆定區胺基酸序列 | TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
| 24 | 胜肽連接子L1的胺基酸序列 | GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS |
| 25 | 胜肽連接子L2的胺基酸序列 | GGGGSGGGGSGGGGS |
| 26 | 抗HER-2單抗重鏈胺基酸序列 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
| 27 | 抗HER-2單抗輕鏈胺基酸序列 | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
| 28 | 抗HER-2單抗重鏈HC-Knob胺基酸序列 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTKPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
| 29 | 抗HER-2單抗重鏈HC-Hole胺基酸序列 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPDLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
| 30 | 抗HER-2/CD47雙抗a的重鏈I胺基酸序列 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTKPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
| 31 | 抗HER-2/CD47雙抗a的重鏈II胺基酸序列 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFANHVIHWVRQAPGQGLEWMGYIYPYNDGTKYNEKFKDRVTLTSDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYYTYDDWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHSNGKTYLHWYQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPYTFGQGTKVEIKRGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPDLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
本發明採用了HER-2單抗IgG和CD47單抗scFv串聯的方式，以及HER-2單抗IgG和HER-2單抗Fab片段重鏈區域串聯的方式，透過knob-into-hole模式，建構了具有不對稱結構的抗HER-2和CD47雙特異性抗體a和b，結構如圖1C所示，雙特異性抗體a、b的CH3-CH3界面晶體結構局部視圖分別如圖1A、1B所示。
其中，HER-2的單抗來源於：三生國健藥業按照Herceptin的可變區胺基酸序列、用CHO細胞表現系統進行表現、自主研發的細胞培養生產工藝得到的人鼠嵌合單株抗體。
CD47的單抗來源於：WO2021218684A1中的人源化抗CD47抗體，其重鏈可變區和輕鏈可變區分別為Anti-CD47B-Hu-VH和Anti-CD47B-Hu-VL。
實施例中的抗HER-2單抗和抗CD47單抗對照分別為：按照上述相應的專利中揭示的單抗胺基酸序列，參照實施例2中相同的表現純化方法得到的單株抗體。
抗HER-2和CD47雙特異性抗體a和b都是異源二聚體，需對重鏈的恆定區CH3(SEQ ID NO. 21)進行胺基酸突變，對恆定區CH3的S354C、T366W和T394K位點進行突變，獲得抗HER-2單抗重鏈HC-Knob(SEQ ID NO. 28)；對恆定區CH3的Y349C、T366S、L368A、Y407V和V397D位點進行突變，獲得抗HER-2單抗重鏈HC-Hole(SEQ ID NO. 29)。
其中的抗HER-2單抗Fab片段重鏈區域(SEQ ID NO. 22)是由抗HER-2單抗重鏈可變區VH(SEQ ID NO. 13)與重鏈恆定區CH1(SEQ ID NO. 19)直接連接；其中抗CD47單抗可變片段scFv是透過胜肽連接子L1(SEQ ID NO. 24)連接CD47重鏈可變區VH(SEQ ID NO. 15)和CD47輕鏈可變區VL(SEQ ID NO. 16)，得到VH-L1-VL(SEQ ID NO. 17)。
抗HER-2單抗Fab片段重鏈區域的C末端與抗HER-2單抗重鏈HC-Knob的N末端透過胜肽連接子L2(SEQ ID NO:25)連接，獲得抗HER-2和CD47雙抗a的重鏈I(SEQ ID NO:30)；抗CD47單抗的可變片段scFv的C末端與抗HER-2單抗重鏈HC-Hole透過胜肽連接子L2連接，獲得抗HER-2和CD47雙抗a的重鏈II(SEQ ID NO. 31)，抗HER-2單抗輕鏈(SEQ ID NO:27)保持不變。
在抗HER-2和CD47雙特異性抗體a的基礎上對其重鏈恆定區CH3的胺基酸進行突變，獲得抗HER-2和CD47雙特異性抗體a’、b、c和c’，如表2所示。
為了提高抗體分子在CHO細胞中的表現效率，委託生工生物工程有限公司對抗HER-2和CD47雙特異性抗體分子的核酸序列進行密碼子優化，主要考慮密碼子的偏好性、GC含量、mRNA的二級結構、重複序列等因素，並委託該公司對序列進行合成。
表2 雙抗分子重鏈恆定區CH3的胺基酸突變位點
實施例 2. 雙抗的表現與純化
| 雙抗分子 | 突變位置 | 突變位點 |
| a | 重鏈I-CH3 | S354C T366W T394K |
| 重鏈II-CH3 | Y349C T366S L368A Y407V V397D | |
| a’ | 重鏈I-CH3 | S354C T366W V397D |
| 重鏈II-CH3 | Y349C T366S L368A Y407V T394K | |
| b | 重鏈I-CH3 | S354C T366W L351K |
| 重鏈II-CH3 | Y349C T366S L368A Y407V L351D | |
| c | 重鏈I-CH3 | S354C T366W |
| 重鏈II-CH3 | Y349C T366S L368A Y407V | |
| c’ | 重鏈I-CH3 | T394K |
| 重鏈II-CH3 | V397D |
將抗HER-2和CD47雙特異性抗體的重鏈和輕鏈的DNA片段分別次選殖到載體pcDNA3.4中，提取重組質體並共轉染293F細胞和/或CHO細胞。細胞培養5-7天後，將培養液透過高速離心，0.22μm濾膜過濾後進樣至Hitrap Mabselect Sure親和層析管柱中，用100mM檸檬酸，pH3.5的洗提液一步洗提蛋白，回收目的樣品並透析換液至pH7.4的PBS中，並進一步透過HiLoad 26/600 Superdex 200 pg分子篩純化，最後將純化後的蛋白用UPLC-SEC檢測，待測抗體用pH7.4的PBS調節濃度至1mg/mL，用Agilent 1290型UPLC檢測SEC純度，層析管柱為AdvancedBio SEC 300A(4.6*150mm，2.7μm)，流動相為磷酸-磷酸鈉緩衝液(200mM，pH=6.8±0.1)，運行時間為10分鐘，得到抗HER-2和CD47雙抗a和b分子的檢測結果如圖2A、圖2B、表3所示。
實驗結果表明，與單獨具有KIH突變或者電荷突變的抗HER-2和CD47雙抗c和c’分子的主峰純度相比，抗HER-2和CD47雙抗a分子的狀態均一，單體純度竟然能夠出乎意料地達到90%以上，並且雜質1和雜質2的含量均顯著下降(均小於6%或更低)；而抗HER-2和CD47雙抗b分子中雜質2的含量超過10%，主峰純度只有86.9%，低於雙抗分子a的純度；抗HER-2和CD47雙抗a’分子的主峰純度只有67.4%，都低於雙抗a分子。
為了進一步證明雙抗分子a的重鏈突變也可應用於其他標的的非對稱結構雙抗製備，我們建構抗TROP-2和CD3的雙特異性抗體分子d(其包括抗TROP-2的IgG抗體、抗CD3抗體的scFv片段)，其重鏈I包含S354C、T366W和T394K位突變，重鏈II包含Y349C、T366S、L368A、Y407V和V397D，分子d的Fc段中的替換完全與抗HER-2和CD47雙抗a分子相同，如表3所示，單體純度仍然達到90%以上。
表3 不同雙抗分子的純化結果
| 雙抗分子 | Fc段中的替換 | 產物百分比 | 雜質1 | 雜質2 |
| c | Knob into hole結構 | 77.4% | 12.7% | 9.9% |
| c’ | T394K和V397D | 88.3% | 8.3% | 3.3% |
| a | knob+T394K和Hole+V397D | 91.9% | 2.4% | 5.7% |
| a’ | knob+V397D和Hole+T394K | 67.4% | 14.1% | 18.4% |
| b | knob +L351K和Hole+L351D | 86.9% | 2.6% | 10.6% |
| d | knob+T394K和Hole+V397D | 92.3% | 5.0% | 2.6% |
TROP-2/CD3雙抗d序列如下(結構見圖1D)。其中，抗TROP-2/CD3雙特異性抗體中的TROP-2單抗序列來源於US20120237518A1專利中揭示的KM4097HV3aLV0人源化單株抗體，抗TROP-2/CD3雙特異性抗體中的CD3單抗的CDR序列來源於US8236308B2中的SEQ ID NO 2和4。
表4
實施例 3. 抗 HER-2 和 CD47 雙抗 a 和 b 的 CE-SDS 檢測
| SEQ ID NO. | 名稱 | 序列 |
| 32 | 抗TROP-2單抗HCDR1胺基酸序列 | DYWLG |
| 33 | 抗TROP-2單抗HCDR2胺基酸序列 | NIFPGSAYINYNEKFKG |
| 34 | 抗TROP-2單抗HCDR3胺基酸序列 | EGSNSGY |
| 35 | 抗TROP-2單抗LCDR1胺基酸序列 | KSSQSLLNSGNQQNYLA |
| 36 | 抗TROP-2單抗LCDR2胺基酸序列 | GASTRES |
| 37 | 抗TROP-2單抗LCDR3胺基酸序列 | QSDHIYPYT |
| 38 | 抗CD3單抗HCDR1胺基酸序列 | TYAMN |
| 39 | 抗CD3單抗HCDR2胺基酸序列 | RIRSKYNNYATYYADSVKD |
| 40 | 抗CD3單抗HCDR3胺基酸序列 | HGNFGNSYVSWFAY |
| 41 | 抗CD3單抗LCDR1胺基酸序列 | RSSTGAVTTSNYAN |
| 42 | 抗CD3單抗LCDR2胺基酸序列 | GTNKRAP |
| 43 | 抗CD3單抗LCDR3胺基酸序列 | ALWYSNLWV |
| 44 | 抗TROP-2單抗重鏈可變區VH胺基酸序列 | QVQLVQSGPEVKKPGASVKVSCKASGYTFT DYWLGWVRQAPGQGLEWMGNIFPGSAYINYNEKFKGKVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCAREGSNSGYWGQGTLVTVSS |
| 45 | 抗TROP-2單抗輕鏈可變區VL胺基酸序列 | DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGNQQNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQSDHIYPYT FGQGTKLEIKR |
| 46 | 抗CD3單抗重鏈可變區VH胺基酸序列 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS |
| 47 | 抗CD3單抗輕鏈可變區VL胺基酸序列 | QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGQGTKVEIKR |
| 48 | 抗TROP-2/CD3雙抗d的重鏈I胺基酸序列 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGQGTKVEIKR GGGGSGGGGSGGGGS QVQLVQSGPEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYWLGWVRQAPGQGLEWMGNIFPGSAYINYNEKFKGKVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCAREGSNSGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTKPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
| 49 | 抗TROP-2/CD3雙抗d的重鏈II胺基酸序列 | QVQLVQSGPEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYWLGWVRQAPGQGLEWMGNIFPGSAYINYNEKFKGKVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCAREGSNSGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPDLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
| 50 | 抗TROP-2/CD3雙抗d的輕鏈胺基酸序列 | DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGNQQNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQSDHIYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
將抗HER-2和CD47雙特異性抗體a和b用超純水調節濃度至1mg/mL，製備還原及非還原樣品，參照protein express reagent kit說明，採用GXⅡ HT protein express labchip晶片，用LabChip® GX II毛細管電泳系統檢測樣品的CE值，獲得抗HER-2和CD47雙特異性抗體a和b的CE-SDS檢測圖譜如圖3A和圖3B所示。
實驗結果表明，抗HER-2和CD47雙抗a分子主峰占比為93.2%，與UPLC-SEC結果一致；抗HER-2和CD47雙抗b分子主峰占比為94.2%，但是在該抗體大小約一半處存在5.8%的雜峰，說明該分子中存在一定量的半抗體結構。
實施例 4. 抗 HER-2 和 CD47 雙抗 a 和 b 的分子量檢測
將抗HER-2和CD47雙特異性抗體a和b用醣切酶PNGase F進行脫醣處理，用50mM的NH
4HCO
3稀釋蛋白濃度至1mg/mL，轉速12000rpm離心10min。取上清，經MassPREPTM Micro Desalting Column(20μm，2.1×5mm)脫鹽管柱後進行質譜分析，獲得抗HER-2和CD47雙特異性抗體a和b的分子量檢測圖譜如圖4A和圖4B所示。
實驗結果表明，抗HER-2和CD47雙抗a分子狀態均一，理論分子量與測試分子量一致，占比為100%；抗HER-2和CD47雙抗b分子，理論分子量為與測試分子量基本一致，占比為61.9%，其中還含有38.1%大小為100KD的蛋白分子，說明該分子中存在一定量的未知結構雜質。
實施例 5. 抗 HER-2 和 CD47 雙抗 a 和 b 的等電點檢測
取抗HER-2和CD47雙特異性抗體a和b蛋白各100μg，加入182μl進樣緩衝液，用超純水定容至200μl，混勻並12000rpm離心5min除去氣泡，取200μl上清，再12000rpm離心5min除氣泡，將樣品加入進樣瓶後放入到iCE3毛細管等點聚焦分析儀中，設置儀器電泳參數，電泳10分鐘後，獲得抗HER-2和CD47雙特異性抗體a和b的毛細管等電聚焦電泳圖譜如圖5A和圖5B所示。
實驗結果表明，抗HER-2和CD47雙抗a的等電點主要集中在9.14-9.22之間，該範圍占比97.07%，其中等電點9.22占比50.29%；抗HER-2和CD47雙抗b的等電點在9.14-9.22之間，該範圍占比87.07%，其中等電點9.18占比45.78%。說明抗HER-2和CD47雙抗a的等電點範圍相對更窄，單一等電點的蛋白含量相對更高。
討論
透過上述實驗可知，引入S354C、T366W和T394K位突變和Y349C、T366S、L368A、Y407V和V397D突變的抗HER-2和CD47雙特異性抗體a的體積篩析層析、毛細管電泳、分子量質譜和等電點檢測的結果均優於引入L351K和L351D抗HER-2和CD47雙特異性抗體b。抗HER-2和CD47雙特異性抗體a的目的蛋白含量更高且等電點範圍更窄，相對更穩定，並且該突變適用於製備其他標的的非對稱雙抗。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附申請專利範圍所限定的範圍。
無
圖1顯示了雙抗結構示意圖；其中圖1A顯示了抗HER-2/CD47雙抗a中兩條重鏈CH3-CH3界面晶體結構局部視圖；圖1B顯示了抗HER-2/CD47雙抗b中兩條重鏈CH3-CH3界面晶體結構局部視圖；圖1C顯示了抗HER-2/CD47雙抗結構示意圖；圖1D顯示了抗TROP-2/CD3雙抗d結構示意圖。
圖2A顯示了抗HER-2/CD47雙抗a的HPLC檢測圖譜。
圖2B顯示了抗HER-2/CD47雙抗b的HPLC檢測圖譜。
圖3A顯示了抗HER-2/CD47雙抗a的CE-SDS檢測圖譜。
圖3B顯示了抗HER-2/CD47雙抗b的CE-SDS檢測圖譜。
圖4A顯示了抗HER-2/CD47雙抗a的分子量檢測圖譜。
圖4B顯示了抗HER-2/CD47雙抗b的分子量檢測圖譜。
圖5A顯示了抗HER-2/CD47雙抗a的等電點檢測圖譜。
圖5B顯示了抗HER-2/CD47雙抗b的等電點檢測圖譜。
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Claims (23)
- 一種異多聚體蛋白質，其特徵在於，包括含有第一重鏈恆定結構域3(CH3)結構域的第一多肽和含有第二重鏈恆定結構域3(CH3)結構域的第二多肽，其中所述第一CH3結構域包括相對於野生型CH3結構域在胺基酸位置394處利用帶正電荷的胺基酸進行的取代，和/或所述第二CH3結構域包括相對於野生型CH3結構域在胺基酸位置397處利用帶負電荷的胺基酸進行的取代，所述胺基酸的位置根據KABAT編號的EU索引確定。
- 如請求項1所述的異多聚體蛋白質，其特徵在於，所述第一CH3結構域在胺基酸位置394處包含離胺酸(K)取代。
- 如請求項1所述的異多聚體蛋白質，其特徵在於，所述第二CH3結構域在胺基酸位置397處包含天冬胺酸(D)取代。
- 如請求項1所述的異多聚體蛋白質，其特徵在於，所述第一CH3結構域和所述第二CH3結構域中，還包括一個或多個胺基酸取代，所述取代促進所述第一多肽和所述第二多肽之間形成杵-臼結構配對。
- 如請求項1所述的異多聚體蛋白質，其特徵在於，所述第一CH3結構域還包括選自下組的胺基酸取代：S354C、T366W；並且所述第二CH3結構域還包括選自下組的胺基酸取代：Y349C、T366S、L368A、Y407V、或其組合。
- 如請求項1所述的異多聚體蛋白質，其特徵在於，所述異多聚體蛋白質包含 (a)異二聚化的Fc片段；和 (b)抗原結合片段。
- 如請求項6所述的異多聚體蛋白質，其特徵在於，所述異二聚化的Fc元件包括含有第一重鏈恆定結構域3(CH3)結構域的第一多肽和含有第二重鏈恆定結構域3(CH3)結構域的第二多肽，其中相對於野生型CH3結構域，所述第一CH3結構域包括選自下組的胺基酸取代：T394K、S354C和T366W、或其組合；和所述第二CH3結構域包括選自下組的胺基酸取代：V397D、Y349C，T366S，L368A、Y407V、或其組合，所述胺基酸的位置根據KABAT編號的EU索引確定。
- 如請求項6所述的異多聚體蛋白質，其特徵在於，所述抗原結合片段標靶相同或不同的抗原；較佳地，所述抗原選自下組：EGFR、HER-2、EpCAM、CD20、CD30、CD33、CD47、TROP-2、CD52、CD133、CD3、CEA、TAG-72、CIX、PSMA、GD2、GD3、GM2、VEGF、VEGFR、ERBB2、ERBB3、MET、IGF1R、EPHA3、TRAILR1、TRAILR2、RANKL和FAP。
- 如請求項1所述的異多聚體蛋白質，其特徵在於，所述異多聚體蛋白質包含第一重鏈、第二重鏈、第一輕鏈、第二輕鏈和第三輕鏈；其中， 所述第一重鏈從N端到C端包含：針對第一標的的抗體重鏈可變結構域Z1、抗體重鏈恆定區Z4、針對第二標的的抗體重鏈可變結構域Z2、第一CH1、第一CH2和第一CH3結構域；所述的第一輕鏈和第二輕鏈分別與所述第一重鏈配合，使得所述的異多聚體蛋白質特異性結合於第一標的和第二標的； 所述第二重鏈從N端到C端包含：針對第三標的的抗原結合片段Z3，針對第二標的的抗體重鏈可變結構域Z2、第二CH1、第二CH2和第二CH3結構域，所述的第三輕鏈分別與所述第二重鏈配合，使得所述的異多聚體蛋白質特異性結合於第二標的；和針對第三標的的抗原結合片段Z3特異性結合於第三標的；或 所述異多聚體蛋白質包含第一重鏈、第二重鏈、第二輕鏈和第三輕鏈；其中， 所述第一重鏈從N端到C端包含：針對第三標的的抗原結合片段Z3，針對第二標的的抗體重鏈可變結構域Z2、第一CH1、第一CH2和第一CH3結構域；所述的第二輕鏈與所述第一重鏈配合，使得所述的異多聚體蛋白質特異性結合於第二標的；針對第三標的的抗原結合片段Z3特異性結合於第三標的； 所述第二重鏈從N端到C端包含：針對第二標的的抗體重鏈可變結構域Z2、第二CH1、第二CH2和第二CH3結構域，所述的第三輕鏈分別與所述第二重鏈配合，使得所述的異多聚體蛋白質特異性結合於第二標的。
- 如請求項9所述的異多聚體蛋白質，其特徵在於，所述異多聚體蛋白質具有兩條重鏈和三條輕鏈，其中 第一重鏈自N端到C端包含：Fab-VH-CH1-鉸鏈區-Fc1； 第二重鏈自N端到C端包含：scFv-VH-CH1-鉸鏈區-Fc2； 所述輕鏈自N端到C端包含：VL-CL，其中所述第一重鏈的Fab的抗原結合結構域結合第一標的；所述第一重鏈和第二重鏈的VH-CH1與所述輕鏈的VL-CL各自獨立地形成結合於第二標的的第二抗原結合域，所述第二重鏈的scFv的抗原結合結構域結合第三標的；或 所述異多聚體蛋白質具有兩條重鏈和兩條輕鏈，其中 第一重鏈自N端到C端包含：scFv-VH-CH1-鉸鏈區-Fc1； 第二重鏈自N端到C端包含：VH-CH1-鉸鏈區-Fc2； 所述輕鏈自N端到C端包含：VL-CL，其中所述第一重鏈和第二重鏈的VH-CH1與所述輕鏈的VL-CL各自獨立地形成結合於第二標的的第二抗原結合域，所述第一重鏈的scFv的抗原結合結構域結合第三標的。
- 如請求項6所述的異多聚體蛋白質，其特徵在於，所述異多聚體蛋白質是雙特異性抗體、多特異性或Fc融合蛋白；其中， 所述雙特異性抗體包含： 第一抗原結合結構域D1；和第二抗原結合結構域D2； 其中，D1特異性結合標的分子HER-2蛋白；D2特異性結合標的分子CD47蛋白； 或D1特異性結合標的分子TROP-2蛋白；D2特異性結合標的分子CD3蛋白； 所述D1為特異性結合HER-2蛋白或TROP-2蛋白的抗體或其抗原結合片段；和/或所述D2為特異性結合CD47蛋白或CD3蛋白的抗體或其抗原結合片段； 其中，所述的抗原結合片段的結構選自下組：(i)Fab 片段；(ii)F(ab') 2片段；(iii)Fd 片段；(iv)Fv 片段；(v)單鏈Fv (scFv)分子；或(vi)單域抗體dAb 片段。
- 如請求項11所述的異多聚體蛋白質，其特徵在於，所述特異性結合CD47蛋白的抗體的重鏈可變區包含互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO .1所示，HCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，HCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO. 3所示；和 所述特異性結合CD47蛋白的抗體的輕鏈可變區包含互補決定區LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO. 4所示，LCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO. 5所示，LCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO. 6所示；和/或 所述特異性結合HER-2蛋白的抗體的重鏈可變區包含互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO. 7所示，HCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO. 8所示，HCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO. 9所示；和 所述特異性結合HER-2蛋白的抗體的輕鏈可變區包含互補決定區LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO. 10所示，LCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO. 11所示，LCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO. 12所示；或 所述特異性結合TROP-2蛋白的抗體的重鏈可變區包含互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO .32所示，HCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO. 33所示，HCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO. 34所示；和 所述特異性結合TROP-2蛋白的抗體的輕鏈可變區包含互補決定區LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO. 35所示，LCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO. 36所示，LCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO. 37所示；和/或 所述特異性結合CD3蛋白的抗體的重鏈可變區包含互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO. 38所示，HCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO. 39所示，HCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO. 40所示；和 所述特異性結合CD3蛋白的抗體的輕鏈可變區包含互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO. 41所示，HCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO. 42所示，HCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO. 43所示。
- 如請求項11所述的異多聚體蛋白質，其特徵在於，所述特異性結合CD47蛋白的抗體的重鏈可變區如SEQ ID NO. 15所示，特異性結合CD47蛋白的抗體的輕鏈可變區如SEQ ID NO. 16所示，和/或，所述特異性結合HER-2蛋白的抗體的重鏈可變區如SEQ ID NO. 13所示，特異性結合HER-2蛋白的抗體的輕鏈可變區如SEQ ID NO. 14所示；或 所述特異性結合TROP-2蛋白的抗體的重鏈可變區如SEQ ID NO. 44所示，特異性結合TROP-2蛋白的抗體的輕鏈可變區如SEQ ID NO. 45所示，和/或，所述特異性結合CD3蛋白的抗體的重鏈可變區如SEQ ID NO. 46所示，特異性結合CD3蛋白的抗體的輕鏈可變區如SEQ ID NO. 47所示。
- 如請求項11所述的異多聚體蛋白質，其特徵在於，所述的雙特異性抗體選自下組： (1)所述雙特異性抗體的重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO. 30和SEQ ID NO. 31所示，和所述雙特異性抗體的輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO. 27所示； (2)將(1)中的胺基酸序列經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有同時抗HER-2活性和抗CD47活性的由(1)衍生的多肽；或 (3)所述雙特異性抗體的重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO. 48和SEQ ID NO. 49所示，和所述雙特異性抗體的輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO. 50所示； (4)將(3)中的胺基酸序列經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有同時抗TROP-2活性和抗CD3活性的由(1)衍生的多肽。
- 一種多核苷酸分子，其特徵在於，所述多核苷酸分子編碼根據請求項1-14中任一項所述的異多聚體蛋白質。
- 一種表現載體，其特徵在於，所述表現載體含有請求項15所述的多核苷酸分子。
- 一種宿主細胞，其特徵在於，所述宿主細胞含有請求項16所述的表現載體。
- 一種製備如本發明的第一方面所述的異多聚體蛋白質的方法，其特徵在於，所述製備方法包括以下步驟： a) 在表現條件下，培養請求項17所述的宿主細胞，從而表現異多聚體蛋白質； b) 分離並純化步驟a)所述的異多聚體蛋白質。
- 一種藥物組成物，其特徵在於，所述藥物組成物包含有效量的根據請求項1-14中任一項所述的異多聚體蛋白質和一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
- 根據請求項1-14中任一項所述的異多聚體蛋白質、或根據請求項19所述的藥物組成物在製備癌症或腫瘤的藥物中的用途。
- 一種免疫偶聯物，其特徵在於，所述免疫偶聯物包括： (a) 如請求項1-14中任一項所述的異多聚體蛋白質；和 (b) 選自下組的偶聯部分：可檢測標記物、藥物、毒素、細胞激素、放射性核素、或酶。
- 一種產生特異性結合不同標的的異多聚體蛋白質的方法，其特徵在於，所述方法包括： (a1) 提供包含特異性結合至第一標的的第一結合結構域、特異性結合至第二標的的第二結合結構域、第一CH2結構域和第一CH3結構域的第一多肽；以及 (b1) 提供第二多肽，其包含特異性結合至第三標的的第三結合結構域、第二標的的第二結合結構域、第二CH2結構域和第二CH3結構域；或 (a2) 提供包含特異性結合至第三標的的第三結合結構域、特異性結合至第二標的的第二結合結構域、第一CH2結構域和第一CH3結構域的第一多肽；以及 (b2) 提供第二多肽，其包含特異性結合至第二標的的第二結合結構域、第二CH2結構域和第二CH3結構域； 其中：所述第一CH3結構域、第二CH3結構域相對於野生型CH3結構域具有以下取代：第一CH3結構域：T394K、S354C、T366W；第二CH3結構域：V397D、Y349C、T366S、L368A、Y407V。
- 一種異二聚化的Fc元件，其特徵在於，包括含有第一重鏈恆定結構域3(CH3)結構域的第一多肽和含有第二重鏈恆定結構域3(CH3)結構域的第二多肽，其中相對於野生型CH3結構域，所述第一CH3結構域包括選自下組的胺基酸取代：T394K、S354C和T366W、或其組合；和/或所述第二CH3結構域包括選自下組的胺基酸取代：V397D、Y349C，T366S，L368A、Y407V、或其組合，所述胺基酸的位置根據KABAT編號的EU索引確定。
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| CN2022109506634 | 2022-08-09 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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| TW202417484A true TW202417484A (zh) | 2024-05-01 |
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