BR112019016595A2 - Anticorpos isolados, métodos de produção do anticorpo e de tratamento de um distúrbio, ácido nucleico isolado, vetor ou conjunto de vetores, célula hospedeira, composições farmacêuticas e uso - Google Patents

Anticorpos isolados, métodos de produção do anticorpo e de tratamento de um distúrbio, ácido nucleico isolado, vetor ou conjunto de vetores, célula hospedeira, composições farmacêuticas e uso Download PDF

Info

Publication number
BR112019016595A2
BR112019016595A2 BR112019016595-9A BR112019016595A BR112019016595A2 BR 112019016595 A2 BR112019016595 A2 BR 112019016595A2 BR 112019016595 A BR112019016595 A BR 112019016595A BR 112019016595 A2 BR112019016595 A2 BR 112019016595A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
antibody
seq
fact
amino acid
acid sequence
Prior art date
Application number
BR112019016595-9A
Other languages
English (en)
Inventor
Chen Xiaocheng
Dennis Mark
Jackman Janet
T. Koerber James
Lu Mason
R. Maun Henry
Rajapaksa Kathila
Ramanujan Saroja
Staton Tracy
Wu Lawren
Yi Tangsheng
Original Assignee
Genentech, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genentech, Inc. filed Critical Genentech, Inc.
Publication of BR112019016595A2 publication Critical patent/BR112019016595A2/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39591—Stabilisation, fragmentation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/14—Antitussive agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04—Antipruritics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21059—Tryptase (3.4.21.59)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/22—Heterocyclic compounds, e.g. ascorbic acid, tocopherol or pyrrolidones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Abstract

a invenção fornece composições que incluem anticorpos anti-triptase e suas composições farmacêuticas, bem como métodos de uso dos mesmos.

Description

“ANTICORPOS ISOLADOS, MÉTODOS DE PRODUÇÃO DO ANTICORPO E DE TRATAMENTO DE UM DISTÚRBIO, ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO, VETOR OU CONJUNTO DE VETORES, CÉLULA HOSPEDEIRA, COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E USO” Referência Cruzada a Pedidos Relacionados [001] Este pedido reivindica benefício para o Pedido Provisório US n°s 62/457.722, depositado em 10 de fevereiro de 2017, o qual é incorporado por referência neste documento em sua totalidade.
Listagem de Sequências [002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequência, que foi submetida eletronicamente no formato ASCII e está incorporada por meio deste documento a título de referência em sua totalidade. A cópia ASCII, criada em 9 de fevereiro de 2018, é denominada 50474112WO2_Sequence_Listing_2.9.18_ST25 e tem 108.967 bytes de tamanho.
Campo da invenção [003] A invenção refere-se a anticorpos anti-triptase, composições farmacêuticas e seus métodos de utilização.
Fundamentos da Invenção [004] A beta triptase humana é uma serina protease semelhante à tripsina que é abundante nos mastócitos e, em menor grau, nos basófilos. A beta triptase humana (da qual existem três subtipos, beta triptase 1, beta triptase 2 e beta triptase 3) produzida pelos loci TPSAB1 e TPSB2 é a triptase ativa predominante produzida pelos mastócitos humanos. Estes dois loci produzem quatro isoformas de triptase; TPSAB1 produz triptase alfa e beta triptase 1, enquanto o TPSB2 produz beta triptase 2 e beta triptase 3. A triptase alfa, assim como outras isoformas, como a triptase gama, a triptase delta e a triptase épsilon são, em grande parte, inativas.
[005] A beta triptase ativa proteoliticamente ativa é armazenada
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 8/418
2/324 nos grânulos de secreção dos mastócitos como um tetrâmero no complexo com heparina. A degranulação de mastócitos, que pode ser causada por estímulos dependentes de IgE (por exemplo, alérgenos) ou estímulos não dependentes de IgE (por exemplo, substância P ou triptase ativa), leva à liberação de beta triptase juntamente com outras enzimas granulares e histamina. Estudos anteriores observaram aumento do número de mastócitos no músculo liso brônquico e no epitélio de pacientes com asma, bem como aumento dos níveis de beta triptase no lavado broncoalveolar. Além disso, a triptase contribui para a broncoconstrição e hiperresponsividade das vias aéreas, e também tem sido sugerido que ela desempenhe um papel na fibrose e no turnover da matriz extracelular, que são marcas do processo de remodelação das vias aéreas.
[006] Foi sugerido que a triptase estivesse envolvida em várias doenças e distúrbios, incluindo asma e outros distúrbios pulmonares, inflamatórios, autoimunes e fibróticos, para os quais permanece a necessidade de terapias melhoradas, incluindo antagonistas terapêuticos anti-triptase e métodos de tratamento. Tem havido tentativas para desenvolver inibidores de triptase de moléculas pequenas (ver, por exemplo, Cairns, JA, 2005, Pulmonary Pharmacology & Therapeutics 18:55-66); no entanto, até onde sabemos, não foram relatados agentes terapêuticos antagonistas da triptase biológica, especialmente anticorpos antagonistas anti-triptase.
Descrição Resumida da Invenção [007] A presente invenção refere-se a anticorpos anti-triptase e a suas composições farmacêuticas, assim como a seus métodos de utilização.
[008] Em um aspecto, a invenção apresenta um anticorpo isolado que se liga à beta triptase 1 humana, ou um fragmento de ligação ao antígeno dele, em que o anticorpo compreende as seguintes seis regiões hipervariáveis (HVRs): (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de DYGMV (SEQ ID NO: 7); (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 9/418
3/324 de FISSGSSTVYYADTMKG (SEQ ID NO: 2); (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de RNYDDWYFDV (SEQ ID NO: 8); (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SASSSVTYMY (SEQ ID NO: 4); (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de RTSDLAS (SEQ ID NO: 5); e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de QHYHSYPLT (SEQ ID NO: 6). Em algumas modalidades, o anticorpo é definido pelas seis HVRs compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7, 2, 8, 4, 5 e 6. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende ainda S43, P46 e W47 na região de framework L2 (FR-L2) do domínio variável de cadeia leve (VL) (numeração de Kabat). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende (a) um domínio variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma sequência amino possuindo pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9; (b) um domínio variável da cadeia leve (VL) compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10; ou (c) um domínio VH como em (a) e um domínio VL como em (b). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende ainda as seguintes regiões framework do domínio VH (FRs): (a) uma FR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS (SEQ ID NO: 11); (b) uma FRH2 compreendendo a sequência de aminoácidos de WVRQAPGKGLEWVA (SEQ ID NO: 12); (c) uma FR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTR (SEQ ID NO: 13); e (d) uma FRH4 compreendendo a sequência de aminoácidos de WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 14). Em algumas modalidades, o domínio VH compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende ainda as seguintes FR do domínio VL: (a) uma FR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 10/418
4/324
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 15); (b) uma FR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de WYQQKPGKSPKPWIY (SEQ ID NO: 16); (c) uma FR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 17); e (d) uma FRL4 compreendendo a sequência de aminoácidos de FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 18). Em algumas modalidades, o domínio VL compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende (a) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 76 e (b) uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 77. Em outras modalidades o anticorpo compreende (a) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 78 e (b) uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 79.
[009] Noutro aspecto, a invenção apresenta um anticorpo isolado que se liga à beta triptase 1 humana ou um fragmento de ligação ao antígeno deste, em que o anticorpo compreende (a) um domínio VH compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9 e (b) um domínio VL compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 99% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9 e um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende (a) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 76 e (b) uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 77. Em outras modalidades o anticorpo compreende (a) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 11/418
5/324 aminoácidos da SEQ ID NO: 78 e (b) uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 79.
[010] Noutro aspecto, a invenção apresenta um anticorpo isolado compreendendo (a) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 76 e (b) uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 77.
[011] Noutro aspecto, a invenção apresenta um anticorpo isolado compreendendo (a) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 78 e (b) uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 79.
[012] Noutro aspecto, a invenção apresenta um anticorpo isolado que se liga à beta triptase 1 humana ou um fragmento de ligação ao antígeno deste, em que o anticorpo compreende as seguintes seis HVRs: (a) uma HVRH1 compreendendo a sequência de aminoácidos de DYGMV (SEQ ID NO: 7); (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de FISSGSSTVYYADTMKG (SEQ ID NO: 2); (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de RDNYDWYFDV (SEQ ID NO: 29); (d) uma HVRL1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SASSSVTYMY (SEQ ID NO: 4); (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de RTSDLAS (SEQ ID NO: 5); e [013] (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos QHYHSYPLT (SEQ ID NO: 6). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende ainda as seguintes FR do domínio VH: (a) uma FR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de EVKLVESGGGSVQPGGSRKLSCAASGFTFS (SEQ ID NO: 21); (b) uma FRH2 compreendendo a sequência de aminoácidos de WVRQAPGKGLEWVA (SEQ ID NO: 22); (c) uma FR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de RFTISRDNPKNTLFLQMSSLRSEDTAMYYCAR (SEQ ID NO: 23); e (d) uma
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 12/418
6/324
FR-H4 compreendendo a sequência de aminoácidos de WGTGTTVTVSS (SEQ ID NO: 24). Em algumas modalidades, o domínio VH compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende ainda as seguintes FRs do domínio VL: (a) uma FR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de QIVLTQSPAIMSASPGEKVTISC (SEQ ID NO: 25); (b) uma FR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de WYQQKPGSSPKPWIY (SEQ ID NO: 26); (c) uma FR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de GVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYC (SEQ ID NO: 27); e (d) uma FR-L4 compreendendo a sequência de aminoácidos de FGAGTKLELK (SEQ ID NO: 28). Em algumas modalidades, o domínio VL compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20.
[014] Noutro aspecto, a invenção apresenta um anticorpo isolado que se liga à beta triptase 1 humana ou um seu fragmento de ligação ao antígeno, em que o anticorpo compreende (a) um domínio VH compreendendo uma sequência amino possuindo pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19; (b) um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20; ou (c) um domínio VH como em (a) e um domínio VL como em (b). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende ainda as seguintes FR do domínio VH: (a) uma FR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de EVKLVESGGGSVQPGGSRKLSCAASGFTFS (SEQ ID NO: 21); (b) uma FR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de WVRQAPGKGLEWVA (SEQ ID NO: 22); (c) uma FR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de RFTISRDNPKNTLFLQMSSLRSEDTAMYYCAR (SEQ ID NO: 23); e (d) uma FR-H4 compreendendo a sequência de aminoácidos de WGTGTTVTVSS (SEQ ID NO: 24). Em algumas modalidades, o domínio VH compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19. Em
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 13/418
7/324 algumas modalidades, o anticorpo compreende ainda as seguintes FRs do domínio VL: (a) uma FR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de QIVLTQSPAIMSASPGEKVTISC (SEQ ID NO: 25); (b) uma FR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de WYQQKPGSSPKPWIY (SEQ ID NO: 26); (c) uma FR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de GVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYC (SEQ ID NO: 27); e (d) uma FR-L4 compreendendo a sequência de aminoácidos de FGAGTKLELK (SEQ ID NO: 28). Em algumas modalidades, o domínio VL compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20.
[015] Noutro aspecto, a invenção apresenta um anticorpo isolado que se liga à beta triptase 1 humana ou um seu fragmento de ligação ao antígeno, compreendendo (a) um domínio VH compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19 e (b) um domínio VL compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20.
[016] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos anteriores, o anticorpo se liga a um epítopo na beta triptase 1 humana compreendendo pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, ou todos os quatro resíduos selecionados do grupo consistindo em His51, Val80, Lys81 e Asp82 da SEQ ID NO: 71. Em algumas modalidades, o anticorpo se liga a um epítopo na beta triptase 1 humana compreendendo pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, ou todos os quatro resíduos selecionados do grupo consistindo em His51, Val80, Lys81 e Asp82 da SEQ ID NO: 71. Em algumas modalidades, o anticorpo se liga a um epítopo na beta triptase 1 humana compreendendo His51 e pelo menos um, pelo menos dois ou todos os três resíduos selecionados do grupo consistindo em Val80, Lys81 e Asp82 da
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 14/418
8/324
SEQ ID NO: 71. Em algumas modalidades, o epítopo na beta triptase 1 humana compreende ainda um ou mais resíduos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em Gln67, Leu83, Ala84, Ala85, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu128, Glu129 e Pro130 da SEQ ID NO: 71. Em algumas modalidades, o epítopo na beta triptase 1 humana compreende pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez, pelo menos onze, ou todos os doze resíduos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em Gln67, Leu83, Ala84, Ala85, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu128, Glu129 e Pro130 da SEQ ID NO: 71. Em algumas modalidades, o epítopo na beta triptase 1 humana compreende His51, Gln67, Val80, Lys81, Asp82, Leu83, Ala84, Ala85, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu128, Glu129 e Pro130 da SEQ ID NO: 71. Em algumas modalidades, o epítopo é relativo a um monômero ou tetrâmero de beta triptase 1 humano. Em algumas modalidades, o epítopo é determinado por um modelo de cristalografia de raios X. Em algumas modalidades, o anticorpo é capaz de dissociar tanto a pequena interface da beta triptase 1 humana tetramérica como a grande interface da beta triptase 1 humana tetramérica.
[017] Noutro aspecto, a invenção apresenta um anticorpo isolado que se liga a beta triptase 1 humana ou um seu fragmento de ligação ao antígeno, em que o anticorpo compreende as seguintes seis HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de GYAIT (SEQ ID NO: 30); (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de GISSAATTFYSSWAKS (SEQ ID NO: 31); (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de DPRGYGAALDRLDL (SEQ ID NO: 32); (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de QSIKSVYNNRLG (SEQ ID NO: 33); (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de ETSILTS (SEQ ID NO: 34); e (f) uma HVR-L3 compreendendo
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 15/418
9/324 a sequência de aminoácidos de AGGFDRSGDTT (SEQ ID NO: 35). Em algumas modalidades, o anticorpo definido pelas seis HVRs compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 30, 31, 32, 33, 34 e 35. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende adicionalmente Arg71 e Val78 na FR-H3 do domínio VH (numeração de Kabat). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende ainda as seguintes FR do domínio VH: (a) uma FR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de EVQLVESGPGLVKPSETLSLTCTVSRFSLI (SEQ ID NO: 38); (b) uma FR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de WIRQPPGKGLEWIG (SEQ ID NO: 42); (c) uma FR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de RVTISRDTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAR (SEQ ID NO: 43); e (d) uma FR-H4 compreendendo a sequência de aminoácidos de WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 41). Em algumas modalidades, o domínio VH compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende as seguintes FRs do domínio VL: (a) uma FR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 64); (b) uma FR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 65); (c) uma FR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 66); e (d) uma FR-L4 compreendendo a sequência de aminoácidos de FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 63). Em algumas modalidades, o domínio VL compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende (a) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 80 e (b) uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 81. Noutras modalidades, o anticorpo compreende (a) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 82 e (b) uma cadeia leve compreendendo a
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 16/418
10/324 sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 83.
[018] Em outro aspecto, a invenção apresenta um anticorpo isolado que se liga à beta triptase 1 humana, ou seu fragmento de ligação a antígeno, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende (a) um domínio VH compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 36, 47, 48, 49, 50, 51 e 52; (b) um domínio VL compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% de identidade com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 37, 53, 58, ou 59; ou (c) um domínio VH como em (a) e um domínio VL como em (b). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende ainda as seguintes FR do domínio VH: (a) uma FR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de EVQLVESGPGLVKPSETLSLTCTVSRFSLI (SEQ ID NO: 38); (b) uma FR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de WIRQPPGKGLEWIG (SEQ ID NO: 42); (c) uma FR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de RVTISRDTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAR (SEQ ID NO: 43); e (d) uma FR-H4 compreendendo a sequência de aminoácidos de WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 41). Em algumas modalidades, o domínio VH compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende as seguintes FRs do domínio VL: (a) uma FR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 64); (b) uma FR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 65); (c) uma FR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 66); e (d) uma FR-L4 compreendendo a sequência de aminoácidos de FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 63). Em algumas modalidades, o domínio VL compreende a sequência de
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 17/418
11/324 aminoácidos da SEQ ID NO: 37. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende (a) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 80 e (b) uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 81. Noutras modalidades, o anticorpo compreende (a) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 82 e (b) uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 83.
[019] Noutro aspecto, a invenção apresenta um anticorpo isolado que se liga à triptase humana ou um fragmento de ligação ao antígeno deste, em que o anticorpo compreende (a) um domínio VH compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 e (b) um domínio VL compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 e um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende (a) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 80 e (b) uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 81. Noutras modalidades, o anticorpo compreende (a) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 82 e (b) uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 83.
[020] Noutro aspecto, a invenção apresenta um anticorpo isolado compreendendo (a) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 80 e (b) uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 81.
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 18/418
12/324 [021] Noutro aspecto, a invenção apresenta um anticorpo isolado compreendendo (a) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 82 e (b) uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 83.
[022] Noutro aspecto, a invenção apresenta um anticorpo isolado que se liga à triptase humana ou um seu fragmento de ligação ao antígeno, em que o anticorpo compreende (a) um domínio VH compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 52 e (b) um domínio VL compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 53.
[023] Em alguns casos, qualquer um dos anticorpos anteriores se liga a um epítopo na beta triptase 1 humana compreendendo pelo menos um, pelo menos dois ou todos os três resíduos selecionados do grupo que consiste em Gln100, Leu101 e Leu102 da SEQ ID NO: 71. Em algumas modalidades, o epítopo na beta triptase 1 humana compreende ainda um ou mais resíduos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em Trp55, Gln67, Asp82, Leu83, Ala84, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu126, Leu127, Glu128, e Glu129 da SEQ ID NO: 71. Em algumas modalidades, o epítopo na beta triptase 1 humana compreende pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez, pelo menos onze, pelo menos doze, pelo menos treze, ou todos os catorze resíduos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em Trp55, Gln67, Asp82, Leu83, Ala84, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu126, Leu127, Glu128 e Glu129 da SEQ ID NO: 71. Em algumas modalidades, o epítopo compreende Gln35, Trp55, Gln67, Asp82, Leu83, Ala84, Arg87, Gln100, Leu101, Leu102, Pro103,
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 19/418
13/324
Val104, Ser105, Arg106, Glu126, Leu127, Glu128, Glu129 e Arg216 da SEQ ID NO:71. Em algumas modalidades, o epítopo é relativo a um monômero ou tetrâmero de beta triptase 1 humano. Em algumas modalidades, o epítopo é relativo a um tetrâmero da beta triptase 1 humana, e o epítopo na beta triptase 1 humana compreende ainda um ou ambos os Gln35 e Arg216 da SEQ ID NO: 71. Em algumas modalidades, o epítopo é determinado por um modelo de cristalografia de raios X. Em algumas modalidades, o anticorpo é capaz de dissociar a pequena interface e/ou a grande interface da beta triptase 1 humana.
[024] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos anteriores, o anticorpo liga-se adicionalmente à triptase de macaco cynomolgus (cyno). Em algumas modalidades, o anticorpo liga-se ainda à triptase alfa humana. Em algumas modalidades, o anticorpo liga-se ainda à beta triptase 2 humana ou beta triptase 3 humana. Em algumas modalidades, o anticorpo liga beta triptase 2 humana e beta triptase 3 humana.
[025] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos anteriores, o anticorpo liga a triptase com um Kd de cerca de 1 nM ou menos. Em algumas modalidades, o Kd é medido por um ensaio de ressonância plasmônica de superfície (SPR). Em algumas modalidades, o anticorpo liga a triptase com um Kd entre cerca de 120 pM e cerca de 0,5 nM. Em algumas modalidades, o anticorpo liga a triptase com um Kd entre cerca de 120 pM e cerca de 300 pM. Em algumas modalidades, o anticorpo liga a triptase com um Kd entre cerca de 120 pM e cerca de 200 pM. Em algumas modalidades, o anticorpo liga a triptase com um Kd de cerca de 180 pM. Em algumas modalidades, o anticorpo liga triptase com um Kd de cerca de 400 pM. Em algumas modalidades, o ensaio SPR é realizado a 25°C. Em algumas modalidades, o Kd é medido utilizando um ensaio BIACORE® SPR, por exemplo, como descrito no Exemplo 1, Seção(A)(vii). Em algumas
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 20/418
14/324 modalidades, o ensaio SPR pode usar um BIAcore® T200 ou um dispositivo equivalente. Em algumas modalidades, chips sensor BIAcore® Série S CM5 (ou chips sensor equivalentes) são imobilizados com anticorpo monoclonal de camundongo anti-lgG humana (Fc) e anticorpos anti-triptase são subsequentemente capturados na célula de fluxo. Diluições de 3 vezes em série do monômero de beta triptase 1 humana marcada com His (SEQ ID NO: 128) são injetadas a uma taxa de fluxo de 30 μΙ/min. Cada amostra é analisada com 3 min de associação e 10 min de dissociação. O ensaio é realizado a 25° C. Após cada injeção, o chip é regenerado usando 3 M de MgCl2. A resposta de ligação é corrigida subtraindo as unidades de resposta (Rll) de uma célula de fluxo capturando uma IgG irrelevante com densidade semelhante. Um modelo Languir 1:1 de ajuste simultâneo de kon e kott é usado para análise cinética.
[026] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos anteriores, o anticorpo é capaz de inibir a atividade enzimática da beta triptase 1 humana. Em algumas modalidades, o anticorpo inibe a atividade da triptase com uma IC50 de cerca de 2,5 nM ou menor conforme determinado por um ensaio enzimático com a beta triptase humana usando um peptídeo sintético S2288 como substrato. Em algumas modalidades, o anticorpo inibe a atividade da triptase com um IC50 entre cerca de 550 pM e cerca de 2,5 nM. Em algumas modalidades, o anticorpo inibe a atividade da triptase com um IC50 entre cerca de 500 pM e cerca de 2 nM. Em algumas modalidades, o anticorpo inibe a atividade da triptase com um IC50 entre cerca de 550 nM e 1,5 nM. Em algumas modalidades, o anticorpo inibe a atividade da triptase com um IC50 entre cerca de 500 pM e cerca de 700 pM. Em algumas modalidades, a atividade inibidora do anticorpo determinada como descrito no Exemplo 1 (A) (viii) (a)). Em algumas modalidades, a concentração final de heparina no ensaio enzimático da beta triptase humana utilizando o peptídeo sintético S-2288 é de
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 21/418
15/324 pg/ml. Em algumas modalidades, a enzima ativa de tetrâmero da beta triptase 1 humana recombinante é diluída até 0,75 nM em Tampão TNH (Tris a 200 mM, NaCI a 150 mM, 0,1 mg/mL de heparina, TRITON™ X-100 a 0,01%, pH 8,0) e combinada 1:1 com anticorpos anti-triptase (diluídos em PBS) em placas de 384 poços. As placas são incubadas durante 1 h à temperatura ambiente com agitação suave. O substrato colorimétrico S-2288 (Chromogenix, Part N°s 82-0852-39), ou um substrato equivalente, é diluído até 1200 μΜ em Tampão TNH e adicionado à placa. Em algumas modalidades, as concentrações finais em poço são de 400 μΜ de S-2288, 0,25 nM de tetrâmero de beta triptase 1 humana recombinante, 66 pg/mL de heparina e 0,10 a 222 nM de anticorpo anti-triptase. As placas são incubadas durante 40 min à temperatura ambiente com agitação suave e depois lidas em A405. O IC50 dos anticorpos anti-triptase é determinado a partir de um ajuste de quatro parâmetros das respectivas curvas.
[027] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos anteriores, o anticorpo é capaz de inibir a atividade enzimática da beta triptase 1 humana a pH 6. Em particular, a atividade inibidora do anticorpo pode ser determinada a pH 6.
[028] Em algumas modalidades, o anticorpo é capaz de inibir a estimulação mediada por triptase da proliferação de células do músculo liso brônquico e/ou contração baseada em colágeno. Em algumas modalidades, o anticorpo é capaz de inibir a liberação de histamina em mastócitos. Em algumas modalidades, o anticorpo é capaz de inibir a liberação de histamina desencadeada por IgE e/ou a liberação de histamina desencadeada por triptase. Em algumas modalidades, o anticorpo é capaz de inibir a cito triptase D1, conforme avaliado por um ensaio ELISA com triptase ativa. Em algumas modalidades, 0 anticorpo é capaz de inibir a atividade da triptase em amostras de lavado broncoalveoar de macaco cynomolgus (BAL) ou de absorção nasal
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 22/418
16/324 (nasossorção) Em algumas modalidades, o anticorpo é capaz de dissociar a beta triptase 1 humana tetramérica. Em algumas modalidades, o anticorpo é capaz de dissociar a beta triptase 1 humana tetramérica, quando num formato monovalente. Em algumas modalidades, o formato monovalente é um formato Fab. Em algumas modalidades, o anticorpo é capaz de dissociar a beta triptase 1 tetramérica humana na presença de heparina. Em algumas modalidades, o anticorpo é capaz de dissociar a beta-triptase tetramérica na presença de heparina 66 pg/ml.
[029] Noutro aspecto, a invenção apresenta um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo que qualquer um dos anticorpos anteriores. Em algumas modalidades, se o anticorpo se liga ao mesmo epítopo ou compete pela ligação à beta triptase 1 humana é determinado por um ensaio de compartimentação de epítopo. Em algumas modalidades, o ensaio de binning de epítopo é um ensaio de binning de epítopo OCTET® tal como descrito no Exemplo 3, Seção C. Em algumas modalidades, a proteína de monômero de beta triptasel humana é biotinilada no resíduo Lys por reação com NHS-PEG4biotina. O monômero biotinilado diluído para 5 pg/ml em tampão clínico (ForteBio, Inc.) e imobilizado em pontas de sensor de estreptavidina (ForteBio, Inc.). Após a etapa de imobilização, os sensores de beta triptase 1 humana imobilizados são saturados com o primeiro anticorpo, diluídos a 10-20 pg/ml, seguido de ligação com o segundo anticorpo diluído a 2,5 pg/ml. Em algumas modalidades, o ensaio de binning de epítopo é realizado a 30 °C.
[030] Noutro aspecto, a invenção apresenta um anticorpo que compete pela ligação à beta triptase 1 humana com qualquer um dos anticorpos anteriores ou é por eles bloqueada de forma cruzada ou os bloqueia de forma cruzada.
[031] Em algumas modalidades de qualquer dos aspectos anteriores, o anticorpo é monoclonal, humano, humanizado ou quimérico. Em
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 23/418
17/324 algumas modalidades, o anticorpo é humanizado.
[032] Em algumas modalidades de qualquer dos aspectos anteriores, o anticorpo é um fragmento de anticorpo que se liga à triptase. Em algumas modalidades, o fragmento de anticorpo é selecionado do grupo que consiste nos fragmentos Fab, Fab’-SH, Fv, scFv e (Fab’)2.
[033] Em algumas modalidades de qualquer dos aspectos anteriores, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo IgG. Em algumas modalidades, o anticorpo IgG é um anticorpo lgG1. Em algumas modalidades, o anticorpo IgG é um anticorpo lgG4. Em algumas modalidades, o anticorpo lgG4 compreende uma mutação na região de dobradiça. Em algumas modalidades, a mutação é uma mutação de substituição. Em algumas modalidades, a mutação de substituição está no resíduo de aminoácido S228 (numeração UE). Em algumas modalidades, o anticorpo lgG4 compreende uma mutação S228P (numeração UE).
[034] Em algumas modalidades de qualquer dos aspectos anteriores, o anticorpo é um anticorpo monoespecífico.
[035] Em algumas modalidades de qualquer dos aspectos anteriores, o anticorpo é um anticorpo multiespecífico. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo biespecífico. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação que se liga à triptase e um segundo domínio de ligação que se liga a uma segunda molécula biológica, em que a segunda molécula biológica é selecionada do grupo consistindo em interleucina-13 (IL-13), interleucina-4 (IL-4), interleucina-5 (IL-5), interleucina-17 (IL-17), IgE e interleucina-33 (IL-33). Em algumas modalidades, a segunda molécula biológica é IL-13. Em algumas modalidades, a segunda molécula biológica é IL-33. Em algumas modalidades, a segunda molécula biológica é IgE.
[036] Noutro aspecto, a invenção apresenta um ácido nucleico
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 24/418
18/324 isolado que codifica qualquer dos anticorpos descritos neste documento ou um conjunto de ácidos nucleicos isolados codificando em conjunto o anticorpo.
[037] Noutro aspecto, a invenção apresenta um ácido nucleico isolado codificando um anticorpo compreendendo um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9 e/ou um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10, ou um conjunto de ácidos nucleicos isolados que codificam o anticorpo, em que o ácido nucleico compreende uma sequência que é pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% idêntica à sequência da SEQ ID NO: 104 e/ou SEQ ID NO: 105. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende (a) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 76 e/ou (b) uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 77 e em que o ácido nucleico ou conjunto compreende uma sequência que pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% idêntica à sequência da SEQ ID NO: 106 e/ou SEQ ID NO: 107. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende (a) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 78 e/ou (b) uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 79 e em que o ácido nucleico ou conjunto compreende uma sequência que pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% idêntica à sequência da SEQ ID NO: 108 e/ou SEQ ID NO: 107. Em algumas modalidades, o ácido nucleico ou conjunto compreende a sequência da SEQ ID NO: 108 e/ou SEQ ID NO: 107.
[038] Noutro aspecto, a invenção apresenta um ácido nucleico isolado codificando o anticorpo compreendendo um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 e/ou um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37, ou um conjunto de ácidos nucleicos isolados que codificam o anticorpo, em que
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 25/418
19/324 o ácido nucleico compreende uma sequência que é pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% idêntica à sequência da SEQ ID NO: 109 e/ou SEQ ID NO: 110. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende (a) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 80 e/ou (b) uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 81 e em que o ácido nucleico ou conjunto compreende uma sequência que pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% idêntica à sequência da SEQ ID NO: 111 e/ou SEQ ID NO: 112. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende (a) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 82 e/ou (b) uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 83 e em que o ácido nucleico ou conjunto compreende uma sequência que pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% idêntica à sequência da SEQ ID NO: 113 e/ou SEQ ID NO: 112. Em algumas modalidades, o ácido nucleico ou conjunto compreende a sequência da SEQ ID NO: 113 e/ou SEQ ID NO: 112.
[039] Noutro aspecto, a invenção apresenta um vetor (por exemplo, um vetor de expressão) ou conjunto de vetores compreendendo qualquer um dos ácidos nucleicos isolados ou conjunto de ácidos nucleicos isolados descritos neste documento. Noutro aspecto, a invenção apresenta células hospedeiras compreendendo os ácidos nucleicos anteriores e/ou vetores e/ou conjuntos de ácidos nucleicos e/ou conjuntos de vetores. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula de mamífero. Em outras modalidades, a célula de mamífero é uma célula do ovário de hamster chinês (CHO). Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula procariótica. Em algumas modalidades, a célula procariótica é E. coli.
[040] Noutro aspecto, a invenção apresenta um método de produção de qualquer dos anticorpos descritos neste documento,
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 26/418
20/324 compreendendo o método a cultura de uma célula hospedeira que compreende qualquer um dos vetores anteriores (por exemplo, vetores de expressão) ou conjunto de vetores em um meio de cultura sob condições adequadas que permitir a produção do anticorpo. Em algumas modalidades, o método compreende ainda a recuperação do anticorpo a partir da célula hospedeira ou do meio de cultura.
[041] Noutro aspecto, a invenção apresenta uma composição (por exemplo, uma composição farmacêutica) compreendendo qualquer um dos anticorpos anteriores. Em algumas modalidades, a composição compreende ainda um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável.
[042] Em outro aspecto, uma invenção apresenta uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo monoclonal isolado que se liga à beta triptase 1 humana, ou a seu fragmento de ligação a antígeno, e um carreador, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável, em que o anticorpo se liga à beta triptase 1 monomérica com um Kd de cerca de 0,1 nM a cerca de 1 nM, e/ou em que o anticorpo é capaz de inibir a atividade enzimática da triptase com uma metade da concentração inibitória máxima (IC50) de cerca de 0,1 nM a cerca de 5 nM conforme determinado por um ensaio enzimático com triptase in vitro usando S-2288 como substrato.
[043] Em algumas modalidades do aspecto anterior, o anticorpo liga a triptase com um Kd entre cerca de 0,5 nM e cerca de 1 nM. Em algumas modalidades, o anticorpo liga a triptase com um Kd entre cerca de 0,1 nM e cerca de 0,5 nM. Em algumas modalidades, o anticorpo liga a triptase com um Kd de cerca de 0,4 nM. Em algumas modalidades, o anticorpo liga a triptase com um Kode cerca de 0,2 nM. Em algumas modalidades, o Kd é medido por um ensaio de ressonância plasmônica de superfície (SPR). Em algumas modalidades, o ensaio SPR é realizado a 25 °C. Em algumas modalidades, o Kd é medido utilizando um ensaio BIACORE® SPR, por exemplo, como
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 27/418
21/324 descrito no Exemplo 1, Seção(A)(vii). Em algumas modalidades, o ensaio SPR pode usar um BIAcore® T200 ou um dispositivo equivalente. Em algumas modalidades, chips sensor BIAcore® Série S CM5 (ou chips sensor equivalentes) são imobilizados com anticorpo monoclonal de camundongo antiIgG humana (Fc) e anticorpos anti-triptase são subsequentemente capturados na célula de fluxo. Diluições de 3 vezes em série do monômero de beta triptase 1 humana marcada com His (SEQ ID NO: 128) são injetadas a uma taxa de fluxo de 30 μΙ/min. Cada amostra é analisada com 3 min de associação e 10 min de dissociação. O ensaio é realizado a 25° C. Após cada injeção, o chip é regenerado usando 3 M de MgCL. A resposta de ligação é corrigida subtraindo as unidades de resposta (RU) de uma célula de fluxo capturando uma IgG irrelevante com densidade semelhante. Um modelo Languir 1:1 de ajuste simultâneo de kon e kofté usado para análise cinética.
[044] Em algumas modalidades do aspecto anterior, o anticorpo é capaz de inibir a atividade da triptase com um IC50 de cerca de 0,5 nM a cerca de 5 nM. Em algumas modalidades, o anticorpo é capaz de inibir a atividade da triptase com um IC50 de cerca de 0,1 nM a cerca de 2 nM. Em algumas modalidades, o anticorpo é capaz de inibir a atividade da triptase humana com um IC50 de cerca de 4 nM. Em algumas modalidades, o anticorpo é capaz de inibir a atividade da triptase com um IC50 de cerca de 0,6 nM. Em algumas modalidades, o anticorpo é capaz de inibir a atividade da triptase a pH 6 num ensaio enzimático de triptase in vitro utilizando S-2288 como substrato. Em algumas modalidades, a atividade inibidora do anticorpo é determinada como descrito nos Exemplos (por exemplo, Exemplo 1, Seção (A) (viii) (a)). Em algumas modalidades, a enzima ativa de tetrâmero da beta triptase 1 humana recombinante é diluída até 0,75 nM em Tampão TNH (Tris 200 mM, NaCI 150 mM, 0,1 mg/mL de heparina, TRITON ™ X-100 a 0,01%, pH 8,0) e combinada 1:1 com anticorpos anti-triptase (diluídos em PBS) em placas de 384 poços. As
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 28/418
22/324 placas são incubadas durante 1 h à temperatura ambiente com agitação suave. O substrato colorimétrico S-2288 (Chromogenix, Part n°s 82-0852-39), ou um substrato equivalente, é diluído até 1200 μΜ em Tampão TNH e adicionado à placa. Em algumas modalidades, as concentrações finais em poço são de 400 μΜ de S-2288, 0,25 nM de tetrâmero de beta triptase 1 humana recombinante, 66 pg/mL de heparina e 0,10 a 222 nM de anticorpo anti-triptase. As placas são incubadas durante 40 min à temperatura ambiente com agitação suave e depois lidas em A405. O IC50 dos anticorpos anti-triptase é determinado a partir de um ajuste de quatro parâmetros das respectivas curvas. Em algumas modalidades, a concentração final de heparina no ensaio enzimático da beta triptase humana utilizando o peptídeo sintético S-2288 é de 66 pg/ml.
[045] Em algumas modalidades do aspecto anterior, o anticorpo é capaz de inibir a estimulação mediada por triptase da proliferação de células do músculo liso brônquico e/ou contração baseada em colágeno. Em algumas modalidades, o anticorpo é capaz de inibir a liberação de histamina em mastócitos. Em algumas modalidades, o anticorpo é capaz de inibir a liberação de histamina desencadeada por IgE e/ou a liberação de histamina desencadeada por triptase. Em algumas modalidades, o anticorpo é capaz de inibir a atividade da triptase em amostras de lavado broncoalveolar de macaco cynomolgus (BAL) ou de absorção nasal (nasossorção) Em algumas modalidades, o anticorpo é capaz de dissociar a beta triptase 1 humana tetramérica. Em algumas modalidades, o anticorpo é capaz de dissociar a beta triptase 1 humana tetramérica, quando num formato monovalente. Em algumas modalidades, o formato monovalente é um formato Fab. Em algumas modalidades, o anticorpo é capaz de dissociar a beta triptase 1 tetramérica humana na presença de heparina. Em algumas modalidades, o anticorpo é capaz de dissociar a beta-triptase tetramérica na presença de heparina 66 pg/ml.
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 29/418
23/324 [046] Em algumas modalidades do aspecto anterior, o anticorpo compreende as seguintes seis regiões hipervariáveis (HVR): (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de DYGMV (SEQ ID NO: 7); (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de FISSGSSTVYYADTMKG (SEQ ID NO: 2); (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de RNYDDWYFDV (SEQ ID NO: 8); (d) uma HVRL1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SASSSVTYMY (SEQ ID NO: 4); (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de RTSDLAS (SEQ ID NO: 5); e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de QHYHSYPLT (SEQ ID NO: 6). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende (a) um domínio variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma sequência amino possuindo pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9; (b) um domínio variável da cadeia leve (VL) compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10; ou (c) um domínio VH como em (a) e um domínio VL como em (b). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende ainda as seguintes FR do domínio VH: (a) uma FR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS (SEQ ID NO: 11); (b) uma FR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de WVRQAPGKGLEWVA (SEQ ID NO: 12); (c) uma FR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTR (SEQ ID NO: 13); e (d) uma FR-H4 compreendendo a sequência de aminoácidos de WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 14). Em algumas modalidades, o domínio VH do anticorpo compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende ainda as seguintes FR do domínio VL: (a) uma FR-L1 compreendendo a sequência de
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 30/418
24/324 aminoácidos de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 15); (b) uma FR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de WYQQKPGKSPKPWIY (SEQ ID NO: 16); (c) uma FR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 17); e (d) uma FR-L4 compreendendo a sequência de aminoácidos de FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 18). Em algumas modalidades, o domínio VL do anticorpo compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende (a) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 76 e (b) uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 77. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende (a) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 78 e (b) uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 79. Em algumas modalidades, o anticorpo se liga a um epítopo na beta triptase 1 humana compreendendo pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, ou todos os quatro resíduos selecionados do grupo consistindo em His51, Val80, Lys81 e Asp82 da SEQ ID NO: 71. Em algumas modalidades, o anticorpo se liga a um epítopo na beta triptase 1 humana compreendendo His51 e pelo menos um, pelo menos dois ou todos os três resíduos selecionados do grupo consistindo em Vai 80, Lys81 e Asp82 da SEQ ID NO: 71. Em algumas modalidades, o epítopo na beta triptase 1 humana compreende ainda um ou mais resíduos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em Gln67, Leu83, Ala84, Ala85, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu128, Glu129 e Pro130 da SEQ ID NO: 71. Em algumas modalidades, o epítopo na beta triptase 1 humana compreende pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez, pelo menos onze, ou todos os doze resíduos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em Gln67, Leu83, Ala84, Ala85, Arg87,
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 31/418
25/324
Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu128, Glu129 e Pro130 da SEQ ID NO: 71. Em algumas modalidades, o epítopo na beta triptase 1 humana compreende His51, Gln67, Val80, Lys81, Asp82, Leu83, Ala84, Ala85, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu128, Glu129 e Pro130 da SEQ ID NO: 71.Em algumas modalidades, o epítopo é relativo a um monômero ou tetrâmero de beta triptase 1 humano. Em algumas modalidades, o epítopo é determinado por um modelo de cristalografia de raios X. Em algumas modalidades, o anticorpo é capaz de dissociar tanto a pequena interface da beta triptase 1 humana tetramérica como a grande interface da beta triptase 1 humana tetramérica.
[047] Noutras modalidades do aspecto anterior, o anticorpo compreende as seguintes seis HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de GYAIT (SEQ ID NO: 30); (b)uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de GISSAATTFYSSWAKS (SEQ ID NO: 31); (c)uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de DPRGYGAALDRLDL (SEQ ID NO: 32); (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de QSIKSVYNNRLG (SEQ ID NO: 33); (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de ETSILTS (SEQ ID NO: 34); e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de AGGFDRSGDTT (SEQ ID NO: 35). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende (a) um domínio VH compreendendo uma sequência amino possuindo pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 36, 47, 48, 49, 50, 51 e 52; (b) um domínio VL compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% de identidade com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 37, 53, 58 ou 59; ou (c) um domínio VH como em (a) e um domínio VL como em (b). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende ainda as seguintes FR do domínio VH:
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 32/418
26/324 (a) uma FR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de EVQLVESGPGLVKPSETLSLTCTVSRFSLI (SEQ ID NO: 38); (b) uma FR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de WIRQPPGKGLEWIG (SEQ ID NO: 42); (c) uma FR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de RVTISRDTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAR (SEQ ID NO: 43); e (d) uma FR-H4 compreendendo a sequência de aminoácidos de WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 41). Em algumas modalidades, o domínio VH do anticorpo compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende ainda as seguintes FRs do domínio VL: (a) uma FR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 64); (b) uma FR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 65); (c) uma FR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 66); e (d) uma FR-L4 compreendendo a sequência de aminoácidos de FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 63). Em algumas modalidades, o domínio VL do anticorpo compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende (a) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 80 e (b) uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 81. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende (a) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 82 e (b) uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 83. Em algumas modalidades, o anticorpo liga-se a um epítopo na beta triptase 1 humana compreendendo pelo menos um, pelo menos dois ou todos os três resíduos selecionados do grupo que consiste em Gln100, Leu101 e Leu102 da SEQ ID NO: 71. Em algumas modalidades, o epítopo na beta triptase 1 humana compreende ainda um ou mais resíduos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em Trp55,
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 33/418
27/324
Gln67, Asp82, Leu83, Ala84, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu126, Leu127, Glu128, e Glu129 da SEQ ID NO: 71. Em algumas modalidades, ο epítopo na beta triptase 1 humana compreende pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez, pelo menos onze, pelo menos doze, pelo menos treze, ou todos os catorze resíduos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em Trp55, Gln67, Asp82, Leu83, Ala84, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu126, Leu127, Glu128 e Glu129 da SEQ ID NO: 71. Em algumas modalidades, o epítopo compreende Gln35, Trp55, Gln67, Asp82, Leu83, Ala84, Arg87, GlnlOO, Leu101, Leu102, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu126, Leu127, Glu128, Glu129 e Arg216 da SEQ ID NO:71. Em algumas modalidades, o epítopo é relativo a um monômero ou tetrâmero de beta triptase 1 humano. Em algumas modalidades, o epítopo é relativo a um tetrâmero da beta triptase 1 humana, e o epítopo na beta triptase 1 humana compreende ainda um ou ambos os Gln35 e Arg216 da SEQ ID NO: 71. Em algumas modalidades, o epítopo é determinado por um modelo de cristalografia de raios X. Em algumas modalidades, o anticorpo é capaz de dissociar a pequena interface e/ou a grande interface da beta triptase 1 humana.
[048] Noutro aspecto, a invenção apresenta uma composição (por exemplo, uma composição farmacêutica) compreendendo um anticorpo monoclonal isolado que se liga a beta triptase 1 humana, ou um seu fragmento de ligação ao antígeno, e um carreador, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável, em que anticorpo liga-se a um epítopo na beta triptase 1 humana compreendendo pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três ou todos os quatro resíduos selecionados do grupo que consiste em His51, Val80, Lys81 e Asp82 da SEQ ID NO: 71. Em algumas modalidades, o anticorpo se liga a um epítopo na beta triptase 1 humana compreendendo
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 34/418
28/324
His51 e pelo menos um, pelo menos dois ou todos os três resíduos selecionados do grupo consistindo em Val80, Lys81 e Asp82 da SEQ ID NO: 71. Em algumas modalidades, o epítopo na beta triptase 1 humana compreende ainda um ou mais resíduos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em Gln67, Leu83, Ala84, Ala85, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu128, Glu129 e Pro130 da SEQ ID NO: 71. Em algumas modalidades, o epítopo na beta triptase 1 humana compreende pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez, pelo menos onze, ou todos os doze resíduos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em Gln67, Leu83, Ala84, Ala85, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu128, Glu129 e Pro130 da SEQ ID NO: 71. Em algumas modalidades, o epítopo na beta triptase 1 humana compreende His51, Gln67, Val80, Lys81, Asp82, Leu83, Ala84, Ala85, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu128, Glu129 e Pro130 da SEQ ID NO: 71.Em algumas modalidades, o epítopo é relativo a um monômero ou tetrâmero de beta triptase 1 humano. Em algumas modalidades, o epítopo é determinado por um modelo de cristalografia de raios X. Em algumas modalidades, o anticorpo é capaz de dissociar tanto a pequena interface da beta triptase 1 humana tetramérica como a grande interface da beta triptase 1 humana tetramérica. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende as seguintes seis regiões hipervaháveis (HVRs): (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de DYGMV (SEQ ID NO: 7); (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de FISSGSSTVYYADTMKG (SEQ ID NO: 2); (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de RNYDDWYFDV (SEQ ID NO: 8); (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SASSSVTYMY (SEQ ID NO: 4); (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de RTSDLAS (SEQ ID NO: 5); e (f) uma HVR-L3
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 35/418
29/324 compreendendo a sequência de aminoácidos de QHYHSYPLT (SEQ ID NO: 6). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende (a) um domínio variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma sequência amino possuindo pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9; (b) um domínio variável da cadeia leve (VL) compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10; ou (c) um domínio VH como em (a) e um domínio VL como em (b). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende ainda as seguintes FR do domínio VH: (a) uma FR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS (SEQ ID NO: 11); (b) uma FR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de WVRQAPGKGLEWVA (SEQ ID NO: 12); (c) uma FR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTR (SEQ ID NO: 13); e (d) uma FR-H4 compreendendo a sequência de aminoácidos de WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 14). Em algumas modalidades, o domínio VH do anticorpo compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende ainda as seguintes FR do domínio VL: (a) uma FR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 15); (b) uma FR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de WYQQKPGKSPKPWIY (SEQ ID NO: 16); (c) uma FR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 17); e (d) uma FR-L4 compreendendo a sequência de aminoácidos de FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 18). Em algumas modalidades, o domínio VL do anticorpo compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende (a) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 36/418
30/324 aminoácidos da SEQ ID NO: 76 e (b) uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 77. Em algumas modalidades, ο anticorpo compreende (a) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 78 e (b) uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 79.
[049] Noutro aspecto, a invenção apresenta uma composição (por exemplo, uma composição farmacêutica) compreendendo um anticorpo monoclonal isolado que se liga à beta triptase 1 humana, ou um seu fragmento de ligação ao antígeno, e um carreador, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável, em que anticorpo liga-se a um epítopo na beta triptase 1 humana compreendendo pelo menos um, pelo menos dois ou todos os três resíduos selecionados do grupo consistindo em Gln100, Leu101 e Leu102 da SEQ ID NO: 71. Em algumas modalidades, o epítopo na beta triptase 1 humana compreende ainda um ou mais resíduos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em Trp55, Gln67, Asp82, Leu83, Ala84, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu126, Leu127, Glu128, e Glu129 da SEQ ID NO: 71. Em algumas modalidades, o epítopo na beta triptase 1 humana compreende pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez, pelo menos onze, pelo menos doze, pelo menos treze, ou todos os catorze resíduos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em Trp55, Gln67, Asp82, Leu83, Ala84, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu126, Leu127, Glu128 e Glu129 da SEQ ID NO: 71. Em algumas modalidades, o epítopo compreende Gln35, Trp55, Gln67, Asp82, Leu83, Ala84, Arg87, Gln100, Leu101, Leu102, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu126, Leu127, Glu128, Glu129 e Arg216 da SEQ ID NO:71. Em algumas modalidades, o epítopo é relativo a um monômero ou tetrâmero de beta triptase 1 humano. Em algumas modalidades, o epítopo é relativo a um
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 37/418
31/324 tetrâmero da beta triptase 1 humana, e o epítopo na beta triptase 1 humana compreende ainda um ou ambos os Gln35 e Arg216 da SEQ ID NO: 71. Em algumas modalidades, o epítopo é determinado por um modelo de cristalografia de raios X. Em algumas modalidades, o anticorpo é capaz de dissociar a pequena interface e/ou a grande interface da beta triptase 1 humana. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende as seguintes seis HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de GYAIT (SEQ ID NO: 30); (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de GISSAATTFYSSWAKS (SEQ ID NO: 31); (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de DPRGYGAALDRLDL (SEQ ID NO: 32); (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de QSIKSVYNNRLG (SEQ ID NO: 33); (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de ETSILTS (SEQ ID NO: 34); e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de AGGFDRSGDTT (SEQ ID NO: 35). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende (a) um domínio VH compreendendo uma sequência amino possuindo pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 36, 47, 48, 49, 50, 51 e 52; (b) um domínio VL compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% de identidade com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 37, 53, 58 ou 59; ou (c) um domínio VH como em (a) e um domínio VL como em (b). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende ainda as seguintes FR do domínio VH: (a) uma FR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de EVQLVESGPGLVKPSETLSLTCTVSRFSLI (SEQ ID NO: 38); (b) uma FR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de WIRQPPGKGLEWIG (SEQ ID NO: 42); (c) uma FR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de RVTISRDTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAR (SEQ ID NO: 43); e (d) uma
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 38/418
32/324
FR-H4 compreendendo a sequência de aminoácidos de WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 41). Em algumas modalidades, o domínio VH do anticorpo compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende ainda as seguintes FRs do domínio VL: (a) uma FR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 64); (b) uma FR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 65); (c) uma FR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 66); e (d) uma FR-L4 compreendendo a sequência de aminoácidos de FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 63). Em algumas modalidades, o domínio VL do anticorpo compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende (a) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 80 e (b) uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 81. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende (a) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 82 e (b) uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 83.
[050] Em algumas modalidades, o anticorpo é capaz de se ligar adicionalmente à alfa triptase humana, beta triptase 2, beta triptase 3 humanas e/ou triptase D1 de cyno.
[051] Em qualquer uma das composições anteriores (por exemplo, composições farmacêuticas), o anticorpo pode ser monoclonal, humano, humanizado ou quimérico. Em algumas modalidades, o anticorpo é humanizado.
[052] Em qualquer uma das composições anteriores (por exemplo, composições farmacêuticas), a composição pode ser para uso humano.
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 39/418
33/324 [053] Qualquer uma das composições anteriores (por exemplo, composições farmacêuticas) pode ser liofilizada. Em outras modalidades, qualquer uma das composições anteriores (por exemplo, composições farmacêuticas) pode ser um líquido.
[054] Em qualquer uma das composições anteriores (por exemplo, composições farmacêuticas), o excipiente pode ser um antioxidante. Em algumas modalidades, a composição compreende um ou mais antioxidantes selecionados do grupo que consiste em N-acetiltriptofano, triptofano, metionina, cisteína, glutationa, tiosorbitol, ácido ascórbico, monotioglicerol, ciclodextrinas, Trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8tetrametilcromano-2-carboxílico), piridoxina, manitol e um quelante de metal. Em algumas modalidades, a composição compreende N-acetiltriptofano ou metionina. Em algumas modalidades, a composição compreende Nacetiltriptofano e metionina.
[055] Em outro aspecto, a invenção apresenta uma composição (por exemplo, uma composição farmacêutica) compreendendo: (i) um anticorpo isolado que se liga à beta triptase 1 humana, ou um fragmento de ligação ao antígeno respectivo, em que o anticorpo compreende as seguintes seis regiões hipervariáveis (HVRs): (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de DYGMV (SEQ ID NO: 7); (b) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de FISSGSSTVYYADTMKG (SEQ ID NO: 2); (c) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de RNYDDWYFDV (SEQ ID NO: 8); d) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SASSSVTYMY (SEQ ID NO: 4); e) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de RTSDLAS (SEQ ID NO: 5); e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de QHYHSYPLT (SEQ ID NO: 6), em que a oxidação do triptofano na posição 6 de HVR-H3 (SEQ ID NO: 8) não é mais do que 30%. Em algumas modalidades, a oxidação
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 40/418
34/324 de triptofano na posição 6 de HVR-H3 (SEQ ID NO: 8) não é mais do que 28%, 25%, 20%, 15%, 10% ou 6%. Em algumas modalidades, a oxidação de triptofano na posição 6 de HVR-H3 (SEQ ID NO: 8) é determinada após um teste de estresse AAPH. Em algumas modalidades, a oxidação de triptofano na posição 6 de HVR-H3 (SEQ ID NO: 8) é determinada no prazo de um ano a partir da produção inicial da composição.
[056] Qualquer uma das composições anteriores (por exemplo, composições farmacêuticas) pode compreender N-acetiltriptofano a uma concentração de cerca de 0,1 mM a cerca de 5 mM. Em algumas modalidades, a concentração de N-acetiltriptofano é de cerca de 0,1 mM a cerca de 1 mM. Em algumas modalidades, a concentração de N-acetiltriptofano é de cerca de 0,3 mM. Em algumas modalidades, a composição compreende metionina a uma concentração de cerca de 1 mM a cerca de 20 mM. Em algumas modalidades, a concentração de metionina é de cerca de 1 mM a cerca de 10 mM. Em algumas modalidades, a concentração de metionina é de cerca de 5 mM.
[057] Noutro aspecto, a invenção apresenta uma composição (por exemplo, uma composição farmacêutica) compreendendo: (i) um anticorpo isolado que se liga à triptase humana ou um seu fragmento de ligação ao antígeno, em que o anticorpo compreende as seguintes seis regiões hipervariáveis (HVRs): (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de DYGMV (SEQ ID NO: 7); (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de FISSGSSTVYYADTMKG (SEQ ID NO: 2); (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de RNYDDWYFDV (SEQ ID NO: 8); (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SASSSVTYMY (SEQ ID NO: 4); (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de RTSDLAS (SEQ ID NO: 5); e [058] (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 41/418
35/324 aminoácidos de QHYHSYPLT (SEQ ID NO: 6); (ii) N-acetiltriptofano a uma concentração de cerca de 0,1 mm a cerca de 1 mM; e (iii) metionina a uma concentração de cerca de 1 mM a cerca de 10 mM.
[059] Em qualquer uma das composições anteriores (por exemplo, composições farmacêuticas), a concentração de anticorpo pode ser de cerca de 1 mg/ml a cerca de 250 mg/ml. Em algumas modalidades, a concentração de anticorpo é de cerca de 150 mg/ml.
[060] Qualquer uma das composições anteriores (por exemplo, composições farmacêuticas) pode ainda incluir um ou mais excipientes adicionais selecionados do grupo que consiste em um estabilizador, um tampão, um surfactante, e um agente de tonicidade. Em algumas modalidades, a composição compreende ainda um tampão. Em algumas modalidades, o tampão é succinato de arginina e/ou succinato de histidina. Em algumas modalidades, o tampão compreende succinato de arginina e succinato de histidina. Em algumas modalidades, a concentração de succinato de arginina é de cerca de 50 mM a cerca de 500 mM. Em algumas modalidades, a concentração de succinato de arginina é de cerca de 100 mM a cerca de 300 mM. Em algumas modalidades, a concentração de succinato de arginina é de cerca de 200 mM. Em algumas modalidades, a concentração de succinato de histidina é de cerca de 1 mM a cerca de 50 mM. Em algumas modalidades, a concentração de succinato de histidina é de cerca de 15 mM a cerca de 25 mM. Em algumas modalidades, a concentração de succinato de histidina é de cerca de 20 mM. Em algumas modalidades, a composição compreende ainda um surfactante. Em algumas modalidades, o surfactante é poloxâmero 188 ou polissorbato 20. Em algumas modalidades, o surfactante é poloxâmero 188. Em algumas modalidades, a concentração de poloxâmero 188 é de cerca de 0,005% a cerca de 0,1%. Em algumas modalidades, a concentração de poloxâmero 188 é de cerca de 0,005% a cerca de 0,05%. Em algumas
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 42/418
36/324 modalidades, a concentração de poloxâmero 188 é de cerca de 0,02%. Em algumas modalidades, o pH da composição é de cerca de 4,5 a cerca de 7,0. Em algumas modalidades, o pH da composição é de cerca de 4,5 a cerca de 6,5. Em algumas modalidades, o pH da composição é de cerca de 5,5. Em algumas modalidades, a composição está em um recipiente à prova de luz. Em algumas modalidades, a composição está numa seringa pré-cheia.
[061] Qualquer uma das composições anteriores (por exemplo, composições farmacêuticas) pode ainda incluir um antagonista de ligação ao eixo de IL-13, um antagonista de ligação ao eixo de IL-5, um antagonista de ligação ao eixo de IL-33, um antagonista de M1 prime, um antagonista de IgE, um antagonista TRPA1, um antagonista de CRTH2, um broncodilatador ou medicação de controle de sintomas de asma, um imunomodulador, um corticosteroide, um inibidor da via de Th2, um inibidor da tirosina quinase ou um inibidor da fosfodiesterase. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao eixo da IL-13 é um anticorpo anti-IL-13. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-IL-13 é lebrikizumabe. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao eixo da IL-5 é um antagonista de ligação a IL-5 ou um antagonista de ligação ao receptor de IL-5. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao eixo de IL-33 é um antagonista de ligação a IL-33 ou um antagonista de ligação a ST2. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação a IL-33 é um anticorpo anti-IL-33. Em algumas modalidades, o antagonista de M1 prime é quilizumabe. Em alguns casos, o antagonista da IgE é omalizumabe (XOLAIR®).
[062] Qualquer uma das composições anteriores (por exemplo, composições farmacêuticas) pode ser formulada para administração a um humano. Em certas modalidades, as composições farmacêuticas compreendem anticorpos que não compreendem sequências de regiões constantes não humanas. Em certas modalidades, as composições
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 43/418
37/324 farmacêuticas compreendem anticorpos que não compreendem sequências de região constante não humana e de estrutura não humana. Em certas modalidades, as composições farmacêuticas compreendem anticorpos que são anticorpos humanos, anticorpos humanizados ou anticorpos quiméricos.
[063] Em alguns aspectos, qualquer um dos anticorpos anteriores pode ser usado como um medicamento.
[064] Em alguns aspectos, qualquer um dos anticorpos anteriores pode ser usado no tratamento de um distúrbio. Em algumas modalidades, o distúrbio é selecionado de um grupo consistindo em um distúrbio autoimune, um distúrbio inflamatório, um distúrbio fibrótico, um distúrbio granulocítico (neutrofílico ou eosinofílico), um distúrbio monocítico, um distúrbio linfocítico ou um distúrbio associado ao aumento do número ou distribuição de células residentes normais ou aberrantes (tais como mastócitos, macrófagos ou linfócitos) ou células estromais (tais como fibroblastos, miofibroblastos, células musculares lisas, epitélio ou endotélio). Em algumas modalidades, o distúrbio é um distúrbio pulmonar. Em algumas modalidades, o distúrbio pulmonar selecionado do grupo consistindo em asma, hiperresponsividade das vias respiratórias e doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC). Em algumas modalidades, o distúrbio pulmonar é asma. Em algumas modalidades, a asma é asma Th2-alta ou asma Th2-baixa. Em algumas modalidades, o distúrbio autoimune é selecionado do grupo consistindo em artrite reumatoide, psoríase, esofagite eosinofílica, doença inflamatória intestinal (Dll) e doença de Crohn. Em algumas modalidades, o distúrbio inflamatório é a urticária idiopática crônica (CIU, também conhecida como urticária espontânea crônica, CSU), anafilaxia, choque anafilático, dermatite atópica ou rinite alérgica. Em algumas modalidades, o distúrbio fibrótico é a fibrose pulmonar idiopática (FPI). Em algumas modalidades, o distúrbio é um distúrbio associado a números aumentados ou distribuição de
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 44/418
38/324 células residentes normais ou aberrantes (tais como mastócitos, macrófagos ou linfócitos) ou células estromais (tais como fibroblastos, miofibroblastos, células musculares lisas, epitélio ou endotélio). Em algumas modalidades, o distúrbio é mastocitose. Em algumas modalidades, o anticorpo é para uso em combinação com um agente terapêutico adicional. Em algumas modalidades, e o agente terapêutico adicional é um antagonista de ligação ao eixo de IL-13, um antagonista de ligação ao eixo de IL-5, um antagonista de ligação ao eixo de IL-33, um antagonista de M1 prime, um antagonista de IgE, um antagonista de TRPA1, um antagonista de CRTH2, um medicamento broncodilatador ou controlador de sintomas da asma, um imunomodulador, um corticosteroide, um inibidor da via de Th2, um inibidor de tirosina quinase, ou um inibidor da fosfodiesterase. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao eixo da IL-13 é um anticorpo anti-IL-13. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-IL13 é lebrikizumabe. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao eixo da IL-5 é um antagonista de ligação a IL-5 ou um antagonista de ligação ao receptor de IL-5. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao eixo de IL-33 é um antagonista de ligação a IL-33 ou um antagonista de ligação a ST2. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação a IL-33 é um anticorpo antiIL-33. Em algumas modalidades, o antagonista de M1 prime é quilizumabe. Em algumas modalidades, o anticorpo é para administração por via subcutânea, intravenosa, intramuscular, tópica, oral, transdérmica, intraperitoneal e intraorbitária, por implantação, por inalação, por via intratecal, intraventricular ou intranasal. Em algumas modalidades, o anticorpo é para administração subcutânea. Em algumas modalidades, o anticorpo é para uso em um sujeito humano.
[065] Em alguns aspectos, qualquer uma das composições anteriores (por exemplo, composições farmacêuticas) pode ser usada como um medicamento.
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 45/418
39/324 [066] Em alguns aspectos, qualquer uma das composições anteriores (por exemplo, composições farmacêuticas) pode ser usada no tratamento de um distúrbio. Em algumas modalidades, o distúrbio é selecionado de um grupo consistindo em um distúrbio autoimune, um distúrbio inflamatório, um distúrbio fibrótico, um distúrbio granulocítico (neutrofílico ou eosinofílico), um distúrbio monocítico, um distúrbio linfocítico ou um distúrbio associado ao aumento do número ou distribuição de células residentes normais ou aberrantes (tais como mastócitos, macrófagos ou linfócitos) ou células estromais (tais como fibroblastos, miofibroblastos, células musculares lisas, epitélio ou endotélio). Em algumas modalidades, o distúrbio é um distúrbio pulmonar. Em algumas modalidades, o distúrbio pulmonar selecionado do grupo consistindo em asma, hiperresponsividade das vias respiratórias e doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC). Em algumas modalidades, o distúrbio pulmonar é asma. Em algumas modalidades, a asma é asma Th2-alta ou asma Th2-baixa. Em algumas modalidades, o distúrbio autoimune é selecionado do grupo consistindo em artrite reumatoide, psoríase, esofagite eosinofílica, doença inflamatória intestinal (Dll) e doença de Crohn. Em algumas modalidades, o distúrbio inflamatório é urticária idiopática crônica (CIU ou CSU), anafilaxia, choque anafilático, dermatite atópica ou rinite alérgica. Em algumas modalidades, o distúrbio fibrótico é a fibrose pulmonar idiopática (FPI). Em algumas modalidades, o distúrbio é um distúrbio associado a números aumentados ou distribuição de células residentes normais ou aberrantes (tais como mastócitos, macrófagos ou linfócitos) ou células estromais (tais como fibroblastos, miofibroblastos, células musculares lisas, epitélio ou endotélio). Em algumas modalidades, o distúrbio é mastocitose. Em algumas modalidades, a composição (por exemplo, composição farmacêutica) é para uso em combinação com um agente terapêutico adicional. Em algumas modalidades, e o agente terapêutico adicional é um antagonista de ligação ao
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 46/418
40/324 eixo de IL-13, um antagonista de ligação ao eixo de IL-5, um antagonista de ligação ao eixo de IL-33, um antagonista de M1 prime, um antagonista de IgE, um antagonista de TRPA1, um antagonista de CRTH2, um medicamento broncodilatador ou controlador de sintomas da asma, um imunomodulador, um corticosteroide, um inibidor da via de Th2, um inibidor de tirosina quinase, ou um inibidor da fosfodiesterase. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao eixo da IL-13 é um anticorpo anti-IL-13. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-IL-13 é lebrikizumabe. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao eixo da IL-5 é um antagonista de ligação a IL-5 ou um antagonista de ligação ao receptor de IL-5. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao eixo de IL-33 é um antagonista de ligação a IL-33 ou um antagonista de ligação a ST2. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação a IL-33 é um anticorpo anti-IL-33. Em algumas modalidades, o antagonista de M1 prime é quilizumabe. Em algumas modalidades, a composição (por exemplo, composição farmacêutica) é para administração subcutânea, intravenosa, intramuscular, tópica, oral, transdérmica, intraperitoneal, intraorbitária, por implantação, por inalação, intratecalmente, intraventricularmente ou intranasalmente. Em algumas modalidades, a composição (por exemplo, composição farmacêutica) é para administração subcutânea. Em algumas modalidades, a composição (por exemplo, composição farmacêutica) é para uso em um sujeito humano.
[067] Em alguns aspectos, qualquer um dos anticorpos anteriores pode ser utilizado na fabricação de um medicamento para tratar um distúrbio. Em algumas modalidades, o distúrbio é selecionado de um grupo consistindo em um distúrbio autoimune, um distúrbio inflamatório, um distúrbio fibrótico, um distúrbio granulocítico (neutrofílico ou eosinofílico), um distúrbio monocítico, um distúrbio linfocítico ou um distúrbio associado ao aumento do número ou distribuição de células residentes normais ou aberrantes (tais como
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 47/418
41/324 mastócitos, macrófagos ou linfócitos) ou células estromais (tais como fibroblastos, miofibroblastos, células musculares lisas, epitélio ou endotélio). Em algumas modalidades, o distúrbio é um distúrbio pulmonar. Em algumas modalidades, o distúrbio pulmonar selecionado do grupo consistindo em asma, hiperresponsividade das vias respiratórias e doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC). Em algumas modalidades, o distúrbio pulmonar é asma. Em algumas modalidades, a asma é asma Th2-alta ou asma Th2-baixa. Em algumas modalidades, o distúrbio autoimune é selecionado do grupo consistindo em artrite reumatoide, psoríase, esofagite eosinofílica, doença inflamatória intestinal (Dll) e doença de Crohn. Em algumas modalidades, o distúrbio inflamatório é urticária idiopática crônica (CIU ou CSU), anafilaxia, choque anafilático, dermatite atópica ou rinite alérgica. Em algumas modalidades, o distúrbio fibrótico é a fibrose pulmonar idiopática (FPI). Em algumas modalidades, o distúrbio é um distúrbio associado a números aumentados ou distribuição de células residentes normais ou aberrantes (tais como mastócitos, macrófagos ou linfócitos) ou células estromais (tais como fibroblastos, miofibroblastos, células musculares lisas, epitélio ou endotélio). Em algumas modalidades, o distúrbio é mastocitose. Em algumas modalidades, o medicamento é formulado para utilização em combinação com um agente terapêutico adicional. Em algumas modalidades, e o agente terapêutico adicional é um antagonista de ligação ao eixo de IL-13, um antagonista de ligação ao eixo de IL-5, um antagonista de ligação ao eixo de IL-33, um antagonista de M1 prime, um antagonista de IgE, um antagonista de TRPA1, um antagonista de CRTH2, um medicamento broncodilatador ou controlador de sintomas da asma, um imunomodulador, um corticosteroide, um inibidor da via de Th2, um inibidor de tirosina quinase, ou um inibidor da fosfodiesterase. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao eixo da IL-13 é um anticorpo anti-IL-13. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-IL
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 48/418
42/324 é lebrikizumabe. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao eixo da IL-5 é um antagonista de ligação a IL-5 ou um antagonista de ligação ao receptor de IL-5. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao eixo de IL-33 é um antagonista de ligação a IL-33 ou um antagonista de ligação a ST2. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação a IL-33 é um anticorpo antiIL-33. Em algumas modalidades, o antagonista de M1 prime é quilizumabe. Em algumas modalidades, o medicamento é formulado para administração por via subcutânea, intravenosa, intramuscular, tópica, oral, transdérmica, intraperitoneal e intraorbitária, por implantação, por inalação, por via intratecal, intraventricular ou intranasal. Em algumas modalidades, o medicamento é formulado para administração subcutânea. Em algumas modalidades, o medicamento é formulado para utilização num sujeito humano.
[068] Em alguns aspectos, qualquer uma das composições anteriores (por exemplo, composições farmacêuticas) pode ser utilizada na fabricação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio. Em algumas modalidades, o distúrbio é selecionado de um grupo consistindo em um distúrbio autoimune, um distúrbio inflamatóho, um distúrbio fibrótico, um distúrbio granulocítico (neutrofílico ou eosinofílico), um distúrbio monocítico, um distúrbio linfocítico ou um distúrbio associado ao aumento do número ou distribuição de células residentes normais ou aberrantes (tais como mastócitos, macrófagos ou linfócitos) ou células estremais (tais como fibroblastos, miofibroblastos, células musculares lisas, epitélio ou endotélio). Em algumas modalidades, o distúrbio é um distúrbio pulmonar. Em algumas modalidades, o distúrbio pulmonar selecionado do grupo consistindo em asma, hiperresponsividade das vias respiratórias e doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC). Em algumas modalidades, o distúrbio pulmonar é asma. Em algumas modalidades, a asma é asma Th2-alta ou asma Th2-baixa. Em algumas modalidades, o distúrbio autoimune é selecionado do grupo
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 49/418
43/324 consistindo em artrite reumatoide, psoríase, esofagite eosinofílica, doença inflamatória intestinal (Dll) e doença de Crohn. Em algumas modalidades, o distúrbio inflamatório é urticária idiopática crônica (CIU ou CSU), anafilaxia, choque anafilático, dermatite atópica ou rinite alérgica. Em algumas modalidades, o distúrbio fibrótico é a fibrose pulmonar idiopática (FPI). Em algumas modalidades, o distúrbio é um distúrbio associado a números aumentados ou distribuição de células residentes normais ou aberrantes (tais como mastócitos, macrófagos ou linfócitos) ou células estromais (tais como fibroblastos, miofibroblastos, células musculares lisas, epitélio ou endotélio). Em algumas modalidades, o distúrbio é mastocitose. Em algumas modalidades, o medicamento é formulado para utilização em combinação com um agente terapêutico adicional. Em algumas modalidades, e o agente terapêutico adicional é um antagonista de ligação ao eixo de IL-13, um antagonista de ligação ao eixo de IL-5, um antagonista de ligação ao eixo de IL-33, um antagonista de M1 prime, um antagonista de IgE, um antagonista de TRPA1, um antagonista de CRTH2, um medicamento broncodilatador ou controlador de sintomas da asma, um imunomodulador, um corticosteroide, um inibidor da via de Th2, um inibidor de tirosina quinase, ou um inibidor da fosfodiesterase. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao eixo da IL-13 é um anticorpo anti-IL-13. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-IL13 é lebrikizumabe. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao eixo da IL-5 é um antagonista de ligação a IL-5 ou um antagonista de ligação ao receptor de IL-5. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao eixo de IL-33 é um antagonista de ligação a IL-33 ou um antagonista de ligação a ST2. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação a IL-33 é um anticorpo antiIL-33. Em algumas modalidades, o antagonista de M1 prime é quilizumabe. Em algumas modalidades, o medicamento é formulado para administração por via subcutânea, intravenosa, intramuscular, tópica, oral, transdérmica,
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 50/418
44/324 intraperitoneal e intraorbitária, por implantação, por inalação, por via intratecal, intraventricular ou intranasal. Em algumas modalidades, o medicamento é formulado para administração subcutânea. Em algumas modalidades, o medicamento é formulado para utilização num sujeito humano.
[069] Noutro aspecto, a invenção apresenta um método de tratamento de um distúrbio num sujeito com necessidade dele, o método compreendendo a administração ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer um dos anticorpos anteriores. Em algumas modalidades, o distúrbio é selecionado de um grupo consistindo em um distúrbio autoimune, um distúrbio inflamatório, um distúrbio fibrótico, um distúrbio granulocítico (neutrofílico ou eosinofílico), um distúrbio monocítico, um distúrbio linfocítico ou um distúrbio associado ao aumento do número ou distribuição de células residentes normais ou aberrantes (tais como mastócitos, macrófagos ou linfócitos) ou células estremais (tais como fibroblastos, miofibroblastos, células musculares lisas, epitélio ou endotélio). Em algumas modalidades, o distúrbio é um distúrbio pulmonar. Em algumas modalidades, o distúrbio pulmonar selecionado do grupo consistindo em asma, hiperresponsividade das vias respiratórias e doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC). Em algumas modalidades, o distúrbio pulmonar é asma. Em algumas modalidades, a asma é asma Th2-alta ou asma Th2-baixa. Em algumas modalidades, o distúrbio autoimune é selecionado do grupo consistindo em artrite reumatoide, psoríase, esofagite eosinofílica, doença inflamatória intestinal (Dll) e doença de Crohn. Em algumas modalidades, o distúrbio inflamatório é urticária idiopática crônica (CIU ou CSU), anafilaxia, choque anafilático, dermatite atópica ou rinite alérgica. Em algumas modalidades, o distúrbio fibrótico é a fibrose pulmonar idiopática (FPI). Em algumas modalidades, o distúrbio é um distúrbio associado a números aumentados ou distribuição de células residentes normais ou aberrantes (tais
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 51/418
45/324 como mastócitos, macrófagos ou linfócitos) ou células estromais (tais como fibroblastos, miofibroblastos, células musculares lisas, epitélio ou endotélio). Em algumas modalidades, o distúrbio é mastocitose. Em algumas modalidades, o método ainda compreende administrar um agente terapêutico adicional para o sujeito. Em algumas modalidades, e o agente terapêutico adicional é um antagonista de ligação ao eixo de IL-13, um antagonista de ligação ao eixo de IL-5, um antagonista de ligação ao eixo de IL-33, um antagonista de M1 prime, um antagonista de IgE, um antagonista de TRPA1, um antagonista de CRTH2, um medicamento broncodilatador ou controlador de sintomas da asma, um imunomodulador, um corticosteroide, um inibidor da via de Th2, um inibidor de tirosina quinase, ou um inibidor da fosfodiesterase. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao eixo da IL-13 é um anticorpo anti-IL-13. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-IL-13 é lebrikizumabe. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao eixo da IL-5 é um antagonista de ligação a IL-5 ou um antagonista de ligação ao receptor de IL-5. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao eixo de IL-33 é um antagonista de ligação a IL-33 ou um antagonista de ligação a ST2. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação a IL-33 é um anticorpo antiIL-33. Em algumas modalidades, o antagonista de M1 prime é quilizumabe. Em alguns casos, o antagonista de IgE é omalizumabe (Xolair®). Em algumas modalidades, o anticorpo é administrado por via subcutânea, intravenosa, intramuscular, tópica, oral, transdérmica, intraperitoneal, intraorbital, por implantação, por inalação, por via intratecal, intraventricular ou intranasal. Em algumas modalidades, o sujeito é um humano.
[070] Noutro aspecto, a invenção apresenta um método de tratamento de um distúrbio num sujeito com necessidade dele, o método compreendendo a administração ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer uma das composições anteriores (por
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 52/418
46/324 exemplo, composições farmacêuticas). Em algumas modalidades, o distúrbio é selecionado de um grupo consistindo em um distúrbio autoimune, um distúrbio inflamatório, um distúrbio fibrótico, um distúrbio granulocítico (neutrofílico ou eosinofílico), um distúrbio monocítico, um distúrbio linfocítico ou um distúrbio associado ao aumento do número ou distribuição de células residentes normais ou aberrantes (tais como mastócitos, macrófagos ou linfócitos) ou células estromais (tais como fibroblastos, miofibroblastos, células musculares lisas, epitélio ou endotélio). Em algumas modalidades, o distúrbio é um distúrbio pulmonar. Em algumas modalidades, o distúrbio pulmonar selecionado do grupo consistindo em asma, hiperresponsividade das vias respiratórias e doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC). Em algumas modalidades, o distúrbio pulmonar é asma. Em algumas modalidades, a asma é asma Th2-alta ou asma Th2-baixa. Em algumas modalidades, o distúrbio autoimune é selecionado do grupo consistindo em artrite reumatoide, psoríase, esofagite eosinofílica, doença inflamatória intestinal (Dll) e doença de Crohn. Em algumas modalidades, o distúrbio inflamatório é urticáha idiopática crônica (CIU ou CSU), anafilaxia, choque anafilático, dermatite atópica ou rinite alérgica. Em algumas modalidades, o distúrbio fibrótico é a fibrose pulmonar idiopática (FPI). Em algumas modalidades, o distúrbio é um distúrbio associado a números aumentados ou distribuição de células residentes normais ou aberrantes (tais como mastócitos, macrófagos ou linfócitos) ou células estromais (tais como fibroblastos, miofibroblastos, células musculares lisas, epitélio ou endotélio). Em algumas modalidades, o distúrbio é mastocitose. Em algumas modalidades, o método ainda compreende administrar um agente terapêutico adicional para o sujeito. Em algumas modalidades, e o agente terapêutico adicional é um antagonista de ligação ao eixo de IL-13, um antagonista de ligação ao eixo de IL-5, um antagonista de ligação ao eixo de IL-33, um antagonista de M1 prime, um antagonista de IgE, um antagonista de TRPA1,
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 53/418
47/324 um antagonista de CRTH2, um medicamento broncodilatador ou controlador de sintomas da asma, um imunomodulador, um corticosteroide, um inibidor da via de Th2, um inibidor de tirosina quinase, ou um inibidor da fosfodiesterase. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao eixo da IL-13 é um anticorpo anti-IL-13. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-IL-13 é lebrikizumabe. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao eixo da IL-5 é um antagonista de ligação a IL-5 ou um antagonista de ligação ao receptor de IL-5. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao eixo de IL-33 é um antagonista de ligação a IL-33 ou um antagonista de ligação a ST2. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação a IL-33 é um anticorpo antiIL-33. Em algumas modalidades, o antagonista de M1 prime é omalizumabe (Xolair®). Em algumas modalidades, a composição é administrada por via subcutânea, intravenosa, intramuscular, tópica, oral, transdérmica, intraperitoneal, intraorbital, por implantação, por inalação, por via intratecal, intraventricular ou intranasal. Em algumas modalidades, o sujeito é um humano.
Breve Descrição das Figuras [071] A FIG. 1 é um alinhamento de sequência dos domínios VH e VL de hu31A.v11 e huE104.v2 mostrando as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de acordo com as designações de Kabat, Chothia e Contact. As regiões hipervariáveis (HVRs) estão sublinhadas.
[072] A FIG. 2A é uma série de gráficos que mostram os resultados de uma análise de inibição de hu31A.v11 e huE104.v2 IgG, conforme determinado por um ensaio enzimático de triptase humana. Ambos os anticorpos inibiram completamente a atividade enzimática da triptase.
[073] As FIGS. 2B e 2C são gráficos que mostram os resultados dos ensaios de proliferação de células do músculo liso das vias aéreas primárias humanas (SMC) (Fig. 2B) e de contração (Fig. 2C). A adição de beta
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 54/418
48/324 triptase estimulou a proliferação de SMC nas vias aéreas primárias humanas, que foi inibida de uma maneira dependente da dose pela adição do anticorpo anti-triptase hu31A.v11 lgG4 ou huE104.v2 lgG4 (Fig. 2B). A adição de triptase também estimulou a contração de SMC das vias aéreas primárias humanas, que também foi inibida pela adição de hu31A.v11 lgG4 e huE104.v2 lgG4 (Fig. 2C).
[074] As FIGS. 2D e 2E são gráficos que mostram os resultados dos ensaios de degranulação de mastócitos nos quais os mastócitos foram estimulados in vitro pela adição de beta triptase ouanti-4-hidroxi-3nitrofenilacetil (NP) IgE e NP. A adição de triptase resultou na liberação de histamina, que foi bloqueada pela adição de hu31A.v11 (Fig. 2D). Uma triptase mutante cataliticamente inativa (S195A) serviu como controle. A adição de IgE e NP também resultou na liberação de histamina, que foi inibida (30-50%) pela adição de um inibidor de pequenas moléculas de triptase (SMI) ou hu31A.v11 (Fig. 2E).
[075] A FIG. 3A é um gráfico que mostra os resultados da dissociação do tetrâmero de beta triptase 1 humana pelo Fab hu31A.v11 analisado por cromatografia por exclusão de tamanho (SEC). Três ensaios foram analisados por SEC: a execução 1 continha triptase tetramérica WT sozinha, que resultou no pico 1 com um tempo de retenção Tr = 26 min, um volume de retenção Vr = 13 ml; o ensaio 2 continha triptase tetramérica WT + Fab hu31A.v11 + heparina, que resultou no pico 2 (Tr = 27,6 min, Vr = 13,8 mL) e pico 4 (Tr = 31 min, Vr = 15,5 mL); o ensaio 3 continha triptase tetramérica WT + Fab hu31A.v11 sem heparina, que resultou no pico 3 (Tr = 28,1 min, Vr = 14 ml) e pico 4 (Tr = 31 min, Vr = 15,5 ml).
[076] A FIG. 3B é um gráfico que mostra os resultados da dissociação do tetrâmero de beta triptase 1 humana por huE104.v2 Fab. Três ensaios foram analisados pela SEC: a execução 1 continha triptase
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 55/418
49/324 monomérica com tag de His + Fab huE104. v2, que resultou no pico 2 (TR = 25,8 min) e pico 6 (31,6 min); a execução 2 continha triptase WT tetramérica + Fab huE104. v2, que resultou no pico 3 (TR = 26 min) e pico 7 (TR = 31,8 min); e a execução 3 continha triptase tetramérica WT + Fab huE104. v2 + hepahna, que resultou no pico 1 (TR = 21 min), pico 4 (TR = 27,2 min) e pico 5 (TR = 31,2 min).
[077] As FIGS. 4A e 4B são uma série de gráficos mostrando os resultados de uma simulação farmacocinética (PK) que compara a atividade farmacocinética (PK) e neutralizante de um anticorpo anti-triptase dissociador com um anticorpo estabilizador específico de tetrâmero da triptase em um nível de triptase de linha de base (4 ng/ml de soro, 10 ng/ml de tecido pulmonar, Fig. 4A) ou um nível elevado de triptase (10 ng/ml de soro, 40 ng/ml de tecido pulmonar, Fig. 4B).
[078] A FIG. 4C é uma série de gráficos que mostram os resultados da simulação de atividade neutralizante comparando um anticorpo anti-triptase dissociador e um anticorpo estabilizador específico para tetrâmero de triptase no nível basal de triptase ou um elevado nível de triptase.
[079] As FIGS. 5A e 5B mostram imagens de géis de eletroforese em gel de dodecil sulfato-poliacrilamida de sódio (SDS-PAGE) corados com azul de Coomassie, mostrando que o fibrinogênio clivado com beta triptase 1 em fragmentos peptídicos a pH 6 (Fig. 5A) e 7,5 (Fig. 5B). O anticorpo hu31A.v11 Fab anti-triptase bloqueou a divagem do fibrinogênio tanto no pH 6 como no pH 7,5, enquanto o huE102.v2 Fab não o fez, nas condições experimentais de alta concentração de heparina. Faixa 1, apenas fibrinogênio, mostrando as cadeias alfa, beta e gama do fibrinogênio não clivado; faixa 2, fibrinogênio e beta triptase; faixa 3, fibrinogênio, beta triptase e hu31A.v11 Fab; faixa 4, fibrinogênio, beta triptase e B12 IgG; faixa 5, fibrinogênio, beta triptase 1 e huE104.v2 Fab; e a faixa 6 mostra apenas B12
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 56/418
50/324 mlgG1. A diminuição da intensidade da cadeia alfa indica atividade proteolítica da triptase, que foi analisada e quantificada nos painéis inferiores.
[080] A FIG. 6A é um gráfico que mostra os resultados da dissociação de tetrâmero WT ou mutante por hu31A.v11 Fab. Quatro ensaios foram analisados por SEC: a execução 1 continha o tetrâmero WT + huE104.v1 Fab, o que resultou no pico de referência (Tr = 21,6 min); a execução 2 continha o tetrâmero variante Y75C + hu31 A.v11 Fab, o que resultou no pico 1 (Tr = 25,6 minutos) e no pico 4 (Tr = 31,6 minutos); a execução 3 continha o tetrâmero variante I99C + hu31A.v11 Fab, o que resultou no pico 2 (Tr = 23,9 min) e pico 4 (Tr = 31,6 min); e a execução 4 continha tetrâmero WT + hu31A.v11 Fab, que resultou no pico 3 (Tr = 28,1 min) e no pico 4 (Tr = 31,6 min).
[081] A FIG. 6B mostra os resultados de uma análise em gel de SDS-PAGE corado com azul de Coomassie de picos de cromatografia por exclusão de tamanho da Fig. 6A. hu31A.v11 Fab formou complexos com mutantes de triptase Y75C e I99C e dissociou o tetrâmero em dímeros ligados covalentemente.
[082] A FIG. 6C é um gráfico que mostra os resultados da dissociação de tetrâmero WT ou mutante por huE104.v2 Fab. Três ensaios foram analisados por SEC: a execução 1 continha o tetrâmero Y75C variante + huE104.v2 Fab, que resultou no pico 1 (Tr = 21,6 min) e no pico 4 (Tr = 31 min); a execução2 continha o tetrâmero variante I99C + huE104.v2 Fab, que resultou no pico 2 e no pico 5 (Tr = 31 min); e a execução 3 continha tetrâmero WT + huE104.v2 Fab, que resultou no pico 3 (Tr = 26 min) e no pico 6 (Tr = 31,8 min). Os resultados mostram que huE104.v2 Fab formou complexos com os mutantes de triptase Y75C e I99C e apenas dissociou o tetrâmero bloqueado por interface grande de I99C em dímeros ligados covalentemente. Os picos 4, 5 e 6 contêm, todos, Fab em excesso conforme determinado por
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 57/418
51/324
SDS-PAGD (dados não mostrados).
[083] A FIG. 7 mostra a sequência de aminoácidos da beta triptase humana madura 1 juntamente com a numeração sequencial do gene e o sistema de numeração quimotripsinogênico (“chymo-numb”) tipicamente usado para tripsina de serina de mamíferos.
[084] A FIG. 8 mostra o epítopo de ligação de hu31 A.v11 Fab em beta triptase 1 humana (resíduos de triptase, toda a numeração de quimotripsinogênio).
[085] A FIG. 9 é uma representação mostrando a modelagem de hu31A.v11 Fab no tetrâmero de triptase. Os monômeros de triptase em complexo com hu31A.v11 Fab foram alinhados aos protômeros A e C no tetrâmero de triptase. Cadeias pesadas e cadeias leves são indicadas. Os choques entre as cadeias leves de hu31A.v11 Fab em protômeros de triptase adjacentes neste modelo são realçados por um oval tracejado.
[086] A FIG. 10 mostra mudanças conformacionais na alça de 60s da triptase detectado na estrutura complexa. Val60c e Val90 (mostrados em varas) criam uma bolsa hidrofóbica para ligação de Tyr173d do protômero vizinho como parte da interação proteína-proteína na grande interface da triptase tetramérica. Os protômeros de triptase na conformação do tetrâmero são indicados. A triptase ligada a hu31 A.v11 Fab é sobreposta a um protômero do complexo de tetrâmero. A conformação de Val60c muda quando hu31A.v11 Fab é ligado, o que cria impedimento esférico, que é esperado que impeça que Tyr173d se ligue a essa bolsa (resíduos de triptase, toda a numeração de quimotripsinogênio).
[087] A FIG. 11 mostra alterações conformacionais na alça de 30s da triptase localizada na pequena interface detectada na estrutura complexa após ligação a hu31 A.v11.
[088] A FIG. 12A é uma representação da estrutura cristalina do
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 58/418
52/324 tetrâmero de triptase WT em complexo com quatro huE104.v1 Fabs. Os protômeros da triptase são indicados de acordo com a rotulagem das letras ou com os protômeros (ver Pereira et al. Nature 392:306-311, 1998).
[089] A FIG. 12B é uma representação do efeito da ligação de huE104.v1 na pequena interface do tetrâmero de triptase conforme avaliado por troca de hidrogênio-deutério (HDX).
[090] A FIG. 13 é um gráfico que mostra os resultados de uma análise farmacocinética (PK) de anticorpos anti-triptase humanizados huE104.v2 e hu31A.v11, cada um deles administrado por injeção intravenosa (IV) a 1 ou 10 mg/kg a camundongos C57BL/6. O gráfico mostra a concentração de anticorpo anti-triptase (pg/mL) em função do tempo (dias). Os resultados são de três animais.
[091] A FIG. 14 é um gráfico que mostra os resultados de uma análise PK de anticorpos humanizados anti-triptase huE104.v2 e hu31A.v11 em comparação com um anticorpo anti-gD lgG4 de controle. Cada anticorpo foi administrado por injeção IV a 30 mg/kg a macacos cynomolgus (cyno). O gráfico mostra a concentração de anticorpo anti-triptase (pg/mL) em função do tempo (dias).
[092] A FIG. 15 é um diagrama esquemático de ensaios para medir a quantidade de triptase ativa (painel esquerdo) e triptase total (painel direito) numa amostra. Monômeros e tetrâmeros de triptase são indicados. No painel esquerdo, o inibidor de tripsina de soja (SBTI) é adicionado. Em seguida, adicionou-se uma sonda baseada em atividade biotinilada exemplificativa (ABP) a uma amostra contendo triptase (por exemplo, fluido de lavagem bronco-alveolar (BAL)) para marcar a triptase ativa. A marcação foi interrompida pela adição de um inibidor de molécula pequena exemplar G02849855 (por exemplo, BMS-262084, Sutton et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 12:3229-33, 2002, Qian et al., J. Org. Chem. 2002, 67:3595-3600). O anticorpo
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 59/418
53/324 hu31A.v11 foi adicionado para dissociar os tetrâmeros de triptase. A triptase marcada foi então detectada num ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA) utilizando peroxidase de rábano conjugada com estreptavidina. No ensaio total de triptase, adicionou-se hu31A.v11 a uma amostra para dissociar os tetrâmeros de triptase na amostra. A quantidade de triptase foi então determinada usando ELISA.
[093] A FIG. 16 mostra os resultados de um ensaio de triptase ativo realizado em amostras de BAL obtidas a partir de macacos cyno aos quais foi administrado o anticorpo anti-triptase hu31A.v11 por administração intravenosa (IV) a 30 mg/kg. O painel superior mostra um diagrama esquemático do protocolo experimental.
[094] A FIG. 17 é um diagrama esquemático mostrando o protocolo experimental do modelo de desafio cyno Ascaris descrito no Exemplo 6.
[095] As FIGS. 18A e 18B são gráficos que mostram os resultados de um ensaio de triptase ativo (Fig. 18A) e um ensaio total de triptase (Fig. 18B) realizado em BAL obtido de animais individuais na experiência de desafio cyno Ascaris descrita no Exemplo 6.
[096] A FIG. 18C é um gráfico que mostra os resultados de um ensaio total de triptase para determinar a quantidade de triptase total em fluido de revestimento da mucosa nasal (MLF) obtida por nasossorção utilizando uma matriz absorvente sintética (SAM) de animais individuais na experiência de desafio Cyno Ascaris descrita no Exemplo 6.
[097] A FIG. 19 é um gráfico que mostra que a administração do anticorpo anti-triptase hu31A.v11 inibiu a anafilaxia sistêmica passiva mediada por IgE em camundongos humano-enxertados. Após o desafio com IgE, os camundongos tratados com o anticorpo anti-triptase hu31 A.v11 mostraram uma manutenção da temperatura corporal melhorada em comparação com
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 60/418
54/324 camundongos tratados com um anticorpo anti-gD de controle. *** P < 0.0001 (teste T emparelhado).
Descrição Detalhada de Modalidades da Invenção
I. Definições [098] O termo cerca de, como utilizado neste documento, refere-se à faixa de erro usual para o respectivo valor prontamente conhecido pela pessoa versada neste campo técnico. Referência a cerca de um valor ou parâmetro neste documento inclui (e descreve) modalidades que são dirigidas a esse valor ou parâmetro perse.
[099] Uma estrutura de aceptor humano para as finalidades deste documento é uma estrutura compreendendo a sequência de aminoácidos de uma estrutura do domínio variável de cadeia leve (VL) ou uma estrutura do domínio variável de cadeia pesada (VH) derivada de uma estrutura de imunoglobulina humana ou uma estrutura de consenso humana, conforme definido abaixo. Uma estrutura de aceptor humano derivada de uma estrutura da imunoglobulina humana ou uma estrutura de consenso humano pode compreender a mesma sequência de aminoácidos desta ou pode conter mudanças na sequência de aminoácidos. Em algumas modalidades, o número de alterações de aminoácidos são 10 ou menos, 9 ou menos, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos ou 2 ou menos. Em algumas modalidades, a estrutura de aceptor humano de VL é idêntica no quesito sequência à sequência da estrutura da imunoglobulina humana de VL ou à sequência da estrutura de consenso humano.
[100] Afinidade se refere à força da soma total de interações não covalentes entre um sítio de ligação simples de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). A menos que indicado de outra forma, como usado neste documento, afinidade de ligação se refere à afinidade de ligação intrínseca que reflete
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 61/418
55/324 uma interação de 1:1 entre membros de um par de ligação (por exemplo, anticorpo e antígeno). A afinidade de uma molécula X pelo seu parceiro Y geralmente pode ser representada pela constante de dissociação (Kd). A afinidade pode ser medida por métodos comuns conhecidos na técnica, incluindo aqueles descritos neste documento. As modalidades exemplares e ilustrativas específicas para medir a afinidade de ligação são descritas a seguir.
[101] O termo Kd é medido por um ensaio de ressonância plasmônica de superfície, quando utilizado no contexto das reivindicações, significa que o Kd é medido de acordo com o método descrito no Exemplo 1 (A) (vii), que mede parâmetros cinéticos para ligação de anticorpos anti-triptase para o monômero de beta triptase 1 humana, por exemplo, monômero de triptase com tag de His6 como mostrado na SEQ ID NO: 128, que não forma espontaneamente um tetrâmero de triptase. O ensaio pode usar um BIAcore® T200 ou um dispositivo equivalente. Em resumo, chips sensor BIAcore® Série S CM5 (ou chips sensor equivalentes) são imobilizados com anticorpo monoclonal de camundongo anti-lgG humana (Fc) e anticorpos anti-triptase são subsequentemente capturados na célula de fluxo. Diluições em série de 3 vezes do monômero de beta triptase 1 humana são injetadas a uma taxa de fluxo de 30 μΙ/min. Cada amostra é analisada com 3 min de associação e 10 min de dissociação. O ensaio é realizado a 25° C. Após cada injeção, o chip é regenerado usando 3 M de MgCE. A resposta de ligação é corrigida subtraindo as unidades de resposta (Rll) de uma célula de fluxo capturando uma IgG irrelevante com densidade semelhante. Um modelo Languir 1:1 de ajuste simultâneo de kon e kofté usado para análise cinética.
[102] Um anticorpo de afinidade maturada é um com uma ou mais alterações numa ou mais HVRs e/ou regiões framework que resultam em uma melhoria na afinidade do anticorpo com o antígeno, em comparação com um anticorpo progenitor que não possua alteração(ões). Os anticorpos
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 62/418
56/324 maturados por afinidade preferidos terão afinidades nanomolares ou mesmo picomolares para o antígeno alvo. Os anticorpos de afinidade maturada são produzidos através de procedimentos conhecidos na técnica. Por exemplo, Marks et al. Bio/Technology 10: 779-783, 1992 descreve a maturação por afinidade por embaralhamento de domínios VH e VL. A mutagênese aleatória de HVR e/ou resíduos de estrutura é descrita por Barbas et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:3809-3813, 1994; Schier et al. Gene 169:147-155, 1995; Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004, 1995; Jackson et al. J. Immunol. 154 (7): 3310-3319, 1995; e Hawkins etal. J. Mol. Biol. 226:889-896, 1992.
[103] O termo anticorpo é usado neste documento no sentido mais amplo e abrange várias estruturas de anticorpo, incluindo mas não limitado a anticorpos monoclonais, Anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpos, contanto que eles exibam a atividade desejada da ligação do antígeno.
[104] O termo triptase, como usado neste documento, refere-se a qualquer triptase nativa de qualquer fonte de vertebrados, incluindo mamíferos, como primatas (por exemplo, humanos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), salvo indicação em contrário. A triptase é também conhecida na técnica como triptase de mastócitos, protease de mastócitos II, triptase da pele, triptase do pulmão, triptase da pituitária, proteinase neutra de mastócitos e serina proteinase II de mastócitos. O termo triptase engloba alfa triptase (codificada em humanos por TPSAB1), beta triptase (codificada em humanos por TPSAB1 e TPSB2; veja abaixo), delta triptase (codificada em humanos por TPSD1), gama triptase (codificada em humanos por TPSG1) e épsilon triptase (codificada em humanos por PRSS22). As proteínas alfa, beta e gama da triptase são solúveis, enquanto as proteínas épsilon da triptase são ancoradas à membrana. A beta triptase e gama são proteases de serina ativas,
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 63/418
57/324 embora tenham diferentes especificidades. As proteínas alfa e delta de triptase são, em grande parte, proteases inativas, pois possuem resíduos em posição crítica que diferem das serinas proteases ativas típicas. Uma sequência proteica de comprimento total de triptase exemplificativa alfa pode ser encontrada no número de acesso NCBI GenBank ACZ98910.1 (SEQ ID NO: 118). Exemplos de sequências proteicas completas de triptase gama podem ser encontradas em Uniprot N° de acesso Q9NRR2 ou n°s de acesso GenBank Q9NRR2.3, AAF03695.1, NP_036599.3 ou AAF76457.1. Exemplos de sequências proteicas completas de delta triptase podem ser encontradas em Uniprot N° de acesso Q9BZJ3 ou N° de acesso GenBank NP_036349.1. Vários genes da triptase estão agrupados no cromossomo humano 16p13.3. O termo abrange triptase não processada de comprimento total não processado, bem como qualquer forma de triptase que resulte do processamento na célula. A beta triptase é a principal triptase expressa nos mastócitos, enquanto a alfa triptase é a principal triptase expressa nos basófilos. A alfa triptase e a beta triptase incluem tipicamente uma sequência líder de aproximadamente 30 aminoácidos e uma sequência catalítica de aproximadamente 245 aminoácidos (ver, por exemplo, Schwartz, Immunol. Allergy Clin. N. Am. 26: 451-463, 2006).
[105] O termo beta triptase, como usado neste documento, refere-se a qualquer beta triptase nativa de qualquer fonte de vertebrados, incluindo mamíferos, como primatas (por exemplo, humanos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), salvo indicação em contrário. Beta triptase é uma protease senna que é um dos principais constituintes dos grânulos secretores de mastócitos. Como utilizado neste documento, o termo abrange beta triptase 1 (codificada pelo gene TPSAB1, que também codifica alfa triptase 1), beta triptase 2 (codificada pelo gene TPSB2) e beta triptase 3 (também codificada pelo gene TPSB2). Uma sequência exemplar da beta triptase 1 humana é mostrada na SEQ ID NO: 71 (vide também o N° de Acesso
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 64/418
58/324
GenBank NP_003285.2). Uma sequência exemplar da beta triptase 2 humana é mostrada na SEQ ID NO: 72 (vide também o N° de Acesso GenBank AAD13876.1). Uma sequência exemplar da beta triptase 3 humana é mostrada na SEQ ID NO: 73 (vide também o N° de Acesso GenBank NP_077078.5). O termo beta triptase engloba a beta triptase “completa”, não processada, assim como a beta triptase que resulta de modificações pós-traducionais, incluindo o processamento proteolítico. Acredita-se que a beta pro-triptase completa seja processada em duas etapas proteolíticas. Primeiro, a divagem intermolecular autocatalítica em R’3 ocorre, particularmente a pH ácido e na presença de um poliânion (por exemplo, heparina ou sulfato de dextrano). Em seguida, o dipeptídeo pro' restante é removido (provavelmente pela dipeptidil peptidase I). Para a beta triptase 1 humana completa, com referência à SEQ ID NO: 71 abaixo, os resíduos de aminoácido sublinhados correspondem à sequência líder nativa, e os resíduos de aminoácidos em negrito e cinza correspondem ao pró-domínio, que são clivados para formar a proteína madura (ver, por exemplo, Sakai et al. J. Clin. Invest. 97: 988-995, 1996)
MLNLLLLALPVLASRAYAAP APGQALQRVGIVGGQ EAP RS KWP WQVSLRVHGPYWMHFCG
GSLIHPQWVLTAAHCVGPDVKDLAALRVQLREQHLYYQDQLLP VSRIIVHPQFYTAQIGA
DIALLELEEPVNVSSHVHTVTLPPASETFPPGMPCWVTGWGDV DNDERLPPPFPLKQVKV
PIMENHICDAKYHLGAYTGDDVRIVRDDMLCAGNTRRDSCQGD SGGPLVCKVNGTWLQAG
VVSWGEGCAQPNRPGIYTRVTYYLDWIHHYVPKKP (SEQ ID NO: 71).
[106] A beta triptase madura e enzimaticamente ativa é tipicamente um homotetrâmero ou heterotetrâmero, embora o monômero ativo
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 65/418
59/324 tenha sido relatado (ver, por exemplo, Fukuoka et al. J. Immunol. 176:3165, 2006). As subunidades do tetrâmero de beta triptase são mantidas juntas por interações hidrofóbicas e polares entre subunidades e estabilizadas por poliânions (particularmente heparina e sulfato de dextrano). O termo triptase pode referir-se a tetrâmero de triptase ou monômero de triptase. Sequências exemplificativas para triptase humana madura beta 1, beta 2 e beta 3 são mostradas em SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 116 e SEQ ID NO: 117, respectivamente. O sítio ativo de cada subunidade está voltado para um poro central do tetrâmero, que mede aproximadamente 50 x 30 angstroms (ver, por exemplo, Pereira et al. Nature 392:306-311, 1998). O tamanho do poro central tipicamente restringe o acesso dos sítios ativos pelos inibidores. Substratos exemplares de beta triptase incluem, mas não estão limitados a PAR2, C3, fibrinogênio, fibronectina e quininogênio.
[107] Os termos “anticorpo anti-triptase”, “anticorpo que se liga à triptase” e “anticorpo que especificamente se liga à triptase” referem-se a um anticorpo que é capaz de se ligar à triptase com afinidade suficiente para que o anticorpo seja útil como diagnóstico e/ou agente terapêutico no direcionamento à triptase. Em uma modalidade, o grau de ligação de um anticorpo anti-triptase a uma proteína não-triptase, não relacionada, é menor do que cerca de 10% da ligação do anticorpo à triptase, conforme medido, por exemplo, por um radioimunoensaio (RIA). Em certas modalidades, um anticorpo que se liga à triptase possui uma constante de dissociação (Kd) de < 1μΜ, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM, ou < 0,001 nM (por exemplo, 10’8 M ou menos, por exemplo, de 10’8 M a 10’13 M, por exemplo, de 10’9 M a 10’13 M). Em certas modalidades, um anticorpo anti-triptase liga-se a um epítopo da triptase que é conservado entre a triptase de espécies diferentes.
[108] Um “anticorpo que se liga ao mesmo epítopo” como um anticorpo de referência refere-se a um anticorpo que entra em contato com um
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 66/418
60/324 conjunto sobreposto de resíduos de aminoácido do antígeno em comparação ao anticorpo de referência ou bloqueia a ligação do anticorpo de referência ao seu antígeno em um teste de competição por 50% ou mais, 60% ou mais, 70% ou mais, 80% ou mais, ou 90% ou mais. Em algumas modalidades, o conjunto de resíduos de aminoácidos contatado pelo anticorpo pode ser completamente sobreposto ou parcialmente sobreposto com o conjunto de resíduos de aminoácidos contatados pelo anticorpo de referência. Em algumas modalidades, um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo como anticorpo de referência bloqueia a ligação do anticorpo de referência ao seu antígeno num ensaio de competição em 50% ou mais, 60% ou mais, 70% ou mais, 80% ou mais, ou 90% ou mais, e inversamente, o anticorpo de referência bloqueia a ligação do anticorpo ao seu antígeno em um teste de competição em 50% ou mais, 60% ou mais, 70% ou mais, 80% ou mais, ou 90% ou mais. Um ensaio de competição exemplar é apresentado neste documento.
[109] O termo “é determinado por um ensaio de binning de epítopo”, no contexto das reivindicações, significa que um anticorpo é determinado para se ligar ao mesmo epítopo e/ou competir pela ligação com um anticorpo anti-triptase de referência (por exemplo, hu31A.v11 ou huE104.v2) utilizando o ensaio OCTET® de binning de epítopos, tal como descrito no Exemplo 3, Seção C. Resumidamente, a proteína monomérica de beta triptasel humana é biotinilada no resíduo Lys por reação com NHS-PEG4biotina. O monômero biotinilado diluído para 5 pg/ml em tampão clínico (ForteBio, Inc.) e imobilizado em pontas de sensor de estreptavidina (ForteBio, Inc.). Após a etapa de imobilização, os sensores de beta triptase 1 humana imobilizados são saturados com o primeiro anticorpo, diluídos a 10-20 pg/ml, seguido de ligação com o segundo anticorpo diluído a 2,5 pg/ml. A temperatura de corrida para tais ensaios de ligação ao epítopo é de 30°C. Um sinal de ligação por segundo anticorpo implica que os dois anticorpos podem ligar o
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 67/418
61/324 antígeno simultaneamente a epítopos não sobrepostos distintos, considerando que nenhum sinal de ligação implica que compartilham um epítopo comum. Em alguns casos, observa-se um sinal parcial pelo segundo anticorpo (isto é, o sinal é menor do que o sinal observado se o primeiro anticorpo não foi adicionado, mas maior que o de fundo), o que implica que os epítopos são parcialmente sobrepostos.
[110] Fragmentos de anticorpo compreendem uma porção de um anticorpo intacto, de preferência de ligação ao antígeno ou região variável do anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem Fab, Fab', F(ab')2 e fragmentos de Fv; diabodies; anticorpos lineares (ver a Patente U.S. N°s 5,641,870, Exemplo 2; Zapata et al., Protein Eng. Protein Eng. 8(10):10571062, 1995); moléculas de anticorpos de cadeia única; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos.
[111] A digestão por papaína de anticorpos produz dois fragmentos de ligação ao antígeno idênticos, chamados fragmentos Fab e um fragmento Fc residual, uma designação refletindo a habilidade de cristalizar rapidamente. O fragmento Fab consiste em uma cadeia L inteira juntamente com o domínio da região variável da cadeia H (VH), e o primeiro domínio constante de uma cadeia pesada (Ch1). O tratamento com pepsina de um anticorpo origina um único grande fragmento F(ab’)2 que corresponde aproximadamente a dois fragmentos Fab ligados por dissulfureto que possui atividade de ligação ao antígeno bivalente e é ainda capaz de ligação cruzada ao antígeno. Os fragmentos Fab' diferem dos fragmentos Fab por terem alguns resíduos adicionais no terminal carboxi do domínio Ch1 incluindo uma ou mais cisteínas da região de dobradiça do anticorpo. Fab'-SH é a designação neste documento para a Fab' na qual os resíduos de cisteína dos domínios constantes carregam um grupo de tiol livre. Fragmentos de anticorpo F(ab’)2 originalmente foram produzidos como pares de fragmentos Fab', os quais têm
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 68/418
62/324 cisteínas de articulação entre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpos também são conhecidos.
[112] O termo região Fc neste documento é utilizado para definir uma região de C-terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina que contém pelo menos uma parte da região constante. O termo inclui regiões Fc de sequência nativa e regiões Fc variantes. Em uma modalidade, uma região Fc da cadeia pesada da IgG humana se estende de Cys226, ou de Pro230, ao terminal carboxil da cadeia pesada. No entanto, a lisina C-terminal (Lys447) da região Fc pode ou não estar presente. A menos que especificado de outra forma neste documento, a numeração dos resíduos de aminoácidos na região de Fc ou região constante está de acordo com o sistema de numeração UE, também denominado o índice UE, como descrito em Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a. Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
[113] Fv consiste em um dímero de um domínio de região variável de cadeia leve e cadeia pesada em associação estreita, não covalente. A partir do dobramento destes dois domínios emanam seis alças hipervariáveis (3 alças cada das cadeias H e L) que contribuem com os resíduos de aminoácido para ligação de antígeno e conferem especificidade de ligação de antígeno para o anticorpo. Entretanto, até mesmo um domínio variável único (ou metade de um Fv que compreende somente três Hs específicos para um antígeno) tem a habilidade de reconhecer e se ligar ao antígeno, embora comumente com uma afinidade inferior ao sítio de ligação inteiro.
[114] Fv de cadeia única, também abreviado como sFv ou scFv são fragmentos de anticorpo que compreendem os domínios VH e VL de anticorpos ligados numa única cadeia de polipeptídeo. De preferência, o polipeptídeo sFv adicionalmente compreende um ligante polipeptídico entre os domínios VH e VL o qual permite que o sFv forme a estrutura desejada para a
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 69/418
63/324 ligação ao antígeno. Para uma revisão de scFv, vide Pluckthun em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., Springer-Verlag, Nova Iorque, pp. 269-315, 1994.
[115] O termo diabodies refere-se a pequenos fragmentos de anticorpo preparados através da construção de fragmentos sFv (ver o parágrafo anterior) com ligantes curtos (cerca de 5-10 resíduos) entre os domínios VH e VL de tal modo que emparelhamentos intracadeias, mas não emparelhamento intracadeia dos domínios V, é alcançado, resultando num fragmento bivalente, isto é, um fragmento possuindo dois sítios de ligação ao antígeno. Diabodies biespecíficos são heterodímeros de dois fragmentos crossover sFv, em que os domínios VH e VL dos dois anticorpos estão presentes em diferentes cadeias polipeptídicas. Diabodies são descritos mais plenamente em, por exemplo, EP 404.097; WO 93/11161; e Hollinger et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:6444-6448, 1993.
[116] Entende-se por domínio de ligação uma parte de um composto ou de uma molécula que se liga especificamente a um epítopo, antígeno, ligante ou receptor alvo. Os domínios de ligação incluem, entre outros, anticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais, policlonais, recombinantes, humanizados e quiméricos), fragmentos de anticorpos ou suas partes (por exemplo, fragmentos de Fab, Fab'2, anticorpos scFv, SMIP, anticorpos de domínio, diabodies, minibodies, scFv-Fc, afibodies, nanobodies e domínios de anticorpos VH e/ou VL , receptores, ligantes, aptâmeros e outras moléculas com um parceiro de ligação identificado.
[117] Um anticorpo de bloqueio ou um anticorpo antagonista é um que inibe ou reduz a atividade biológica do antígeno ao qual se liga. Certos anticorpos de bloqueio ou anticorpos antagonistas preferenciais inibem substancial ou completamente a atividade biológica do antígeno. Em algumas modalidades, a atividade pode ser uma atividade enzimática da triptase, por
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 70/418
64/324 exemplo, atividade de protease. Noutros casos, a atividade pode ser estimulação mediada por triptase da proliferação de células dos músculos lisos brônquicos e/ou contração baseada em colágeno. Em outros casos, a atividade pode ser a liberação de histamina de mastócitos (por exemplo, liberação de histamina desencadeada por IgE e/ou liberação de histamina desencadeada por triptase). Um anticorpo da invenção pode inibir uma atividade biológica da triptase pelo menos cerca de 1%, cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% ou cerca de 100%.
[118] O termo “como determinado por um ensaio enzimático de beta de triptase humana utilizando um peptídeo sintético S-2288 como substrato”, no contexto das reivindicações, significa que a atividade inibidora é medida de acordo com o ensaio descrito no Exemplo 1 (A)(viii)(a). Em resumo, a enzima ativa de tetrâmero da beta triptase 1 humana recombinante é diluída até 0,75 nM em Tampão TNH (Tris 200 mM, NaCI 150 mM, 0,1 mg/mL de heparina, TRITON ™ X-100 a 0,01%, pH 8,0) e combinada 1:1 com anticorpos anti-triptase (diluídos em PBS) em placas de 384 poços. As placas são incubadas durante 1 h à temperatura ambiente com agitação suave. O substrato colohméthco S-2288 (Chromogenix, Part n°s 82-0852-39), ou um substrato equivalente, é diluído até 1200 μΜ em Tampão TNH e adicionado à placa. As concentrações finais em poço são de 400 pM de S-2288, 0,25 nM de tetrâmero de beta triptase 1 humana recombinante, 66 pg/mL de heparina e 0,10 a 222 nM de anticorpo anti-triptase. As placas são incubadas durante 40 min à temperatura ambiente com agitação suave e depois lidas em A405. O IC50 dos anticorpos anti-triptase é determinado a partir de um ajuste de quatro parâmetros das respectivas curvas.
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 71/418
65/324 [119] A classe de um anticorpo se refere ao tipo de domínio constante ou região constante possuída por sua cadeia pesada. Existem cinco classes principais de anticorpos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, e várias destas podem ser ainda divididas em subclasses (isótipos), por exemplo, IgG-ι, IgGz, IgGs, lgG4, IgA-ι, e lgA2. Os domínios constantes da cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são denominados α,δ,ε,γ e μ, respectivamente.
[120] “Funções efetoras” de anticorpo referem-se às atividades biológicas atribuíveis à região Fe (uma região Fc de sequência nativa ou região Fc de sequência de aminoácidos variante) de um anticorpo e variam com o isotipo de anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpo incluem: ligação C1q e citotoxicidade dependente de complemento; ligação ao receptor de Fc; citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC); fagocitose; regulação negativa de receptores da superfície celular (por exemplo, receptor de células B); e ativação de células B.
[121] Citotoxicidade dependente do anticorpo mediado por células ou ADCC refere-se a uma forma de citotoxicidade em que Ig secretada ligada a receptores Fc (FcR) presentes em certas células citotóxicas (por exemplo, células Natural Killer (NK), neutrófilos e macrófagos) ativam estas células efetoras citotóxicas que se ligam especificamente a uma célulaalvo do antígeno e subsequentemente mata a célula-alvo com citotoxinas. Os anticorpos armam as células citotóxicas e são absolutamente necessários para tal ato de matar. As células primárias para mediar ADCC, células NK, expressam somente FcyRIII, enquanto monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. A expressão de FcR em células hematopoiéticas está resumida na Tabela 3 na página 464 de Ravetch et al. Annu. Rev. Immunol. 9:457-492, 1991. Para avaliar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse, pode ser realizado um ensaio ADCC in vitro, tal como o descrito na Patente US N°
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 72/418
66/324
5.500.362 ou 5.821.337. As células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e células exterminadoras naturais (NK). Alternativamente, ou adicionalmente, a atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal, tal como aquele divulgado em Clynes et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95:652-656, 1998.
[122] Receptor de Fc ou FcR descreve um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. O FcR preferido é um FcR humano de sequência nativa. Além disso, um FcR preferido é um que se liga a um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui receptores de FcyRI, FcyRII, e FcyRIII, incluindo subclasses variantes alélicas e formas de splicing alternativas destes receptores. Os receptores FcyRII incluem FcyRIIA (um receptor de ativação) e FcyRIIB (um receptor de inibição), que possuem sequências de aminoácidos similares que diferem principalmente nos seus domínios citoplasmáticos. Receptor de ativação de FcRIlA contém um motivo de ativação de imunorreceptor baseado em tirosina (ITAM) no seu domínio citoplasmático. O receptor de inibição de FcRHB contém um motivo de inibição de imunorreceptor baseado em tirosina (ITIM) no seu domínio citoplasmático, (ver resenha M. em Daêron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234, 1997). Os FcRs são revisados, por exemplo, em Ravetch et al. Annu. Rev. Immunol. 9:457-492, 1991; Capel et al. Immunomethods 4:25-34, 1994; e de Haas et al. J. Lab. Clin. Med. 126:330-41, 1995. Outros FcRs, incluindo aqueles a serem identificados no futuro, são englobados pelo termo FcR no presente documento. O termo também inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgG maternas para o feto (ver, por exemplo, Guyer et al. J. Immunol. 117:587, 1976 e Kim et al. J. Immunol. 24:249, 1994).
[123] Células efetoras humanas são leucócitos que expressam um ou mais FcR e desempenham funções efetoras. Preferivelmente, as células
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 73/418
67/324 expressam pelo menos FcyRIII e executam a função efetora de ADCC. Exemplos de leucócitos humanos que medeiam ADCC incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC), células assassinas naturais (NK), monócitos, células T citotóxicas e neutrófilos; com PBMC e as células NK sendo preferidos. As células efetoras podem ser isoladas a partir de uma fonte nativa, por exemplo, a partir de sangue.
[124] Citotoxicidade dependente do complemento ou CDC refere-se a lise de uma célula alvo na presença de complemento. A ativação da via clássica do complemento é iniciada pela ligação do primeiro componente do sistema do complemento (C1q) a anticorpos (da subclasse apropriada) que estão ligados ao seu antígeno cognato. Para avaliar a ativação do complemento, um ensaio de CDC, por exemplo, como descrito em GazzanoSantoro et al. J. Immunol. Methods 202:163, 1996, pode ser realizado.
[125] Um epítopo é a porção do antígeno ao qual o anticorpo se liga seletivamente. Para um antígeno polipeptídico, um epítopo linear pode ser uma porção peptídica de cerca de 4-15 (por exemplo, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 resíduos de aminoácidos.) Um epítopo conformacional não linear pode compreender resíduos de uma sequência polipeptídica levada para perto da estrutura tridimensional (3D) da proteína. Em algumas modalidades, o epítopo compreende aminoácidos que estão dentro de 4 angstroms (A) de qualquer átomo de um anticorpo. Em algumas modalidades, o epítopo compreende aminoácidos de um protômero de triptase que estão dentro de 4 A de qualquer átomo de um Fab parceiro. Em certas modalidades, o epítopo compreende aminoácidos que estão dentro de 3,5 A, 3 A, 2,5 A ou 2 A de qualquer átomo de um anticorpo. Os resíduos de aminoácidos de um anticorpo que contacte um antígeno (por exemplo, parátopo) podem ser determinados, por exemplo, ao determinar a estrutura cristalina do anticorpo em complexo com o antígeno ou através da realização de uma troca de hidrogênio/deutério.
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 74/418
68/324 [126] 0 termo “ο epítopo é determinado por um modelo de cristalografia de raios-X”, quando usado no contexto das reivindicações, significa que um átomo de um resíduo de aminoácido triptase (por exemplo, resíduo de beta triptase 1 humana) é determinado dentro de 4 A de qualquer átomo de um anticorpo anti-thptase (por exemplo, qualquer anticorpo antithptase descrito aqui, por exemplo, hu31A.v11 ou huE104.v2) em um modelo de cristalografia de raios X, por exemplo, como descrito no Exemplo 3. Em algumas modalidades, o modelo de cristalografia de raios-X tem uma resolução de cerca de 3,5 A ou menos, cerca de 3 A ou menos, cerca de 2,5 A ou menos, cerca de 2,15 A ou menos, ou cerca de 2 A ou menos.
[127] Os termos anticorpo de comprimento total, anticorpo intacto, e anticorpo inteiro são usados neste documento permutavelmente para se referir a um anticorpo possuindo uma estrutura substancialmente similar a uma estrutura de anticorpo nativo ou possuindo cadeias pesadas que contêm uma região Fc, conforme definido neste documento.
[128] Um anticorpo humano é um que possui uma sequência de aminoácidos que corresponde àquela de um anticorpo produzido por um humano e/ou que foi produzido utilizando qualquer uma das técnicas para produção de anticorpos humanos. Esta definição de um anticorpo humano exclui especificamente um anticorpo humanizado que compreende resíduos de ligação ao antígeno não humanos.
[129] Uma estrutura de consenso humano é uma estrutura que representa o resíduo de aminoácidos de ocorrência mais comum em uma seleção de sequências de estrutura de VL ou VH da imunoglobulina humana. Geralmente, a seleção das sequências VL ou VH da imunoglobulina humana é de um subgrupo de sequências de domínio variável. Em geral, o subgrupo de sequências é um subgrupo como em Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD,
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 75/418
69/324 vols. 1-3, 1991. Em uma modalidade, para a VL, o subgrupo é subgrupo kappa III ou kappa IV como em Kabat et al., supra. Em uma modalidade, para a VH, o subgrupo é subgrupo III como em Kabat et al., supra.
[130] Formas humanizadas de anticorpos não humanos (por exemplo, roedor) são anticorpos quiméricos que contêm uma sequência mínima derivada de anticorpo não humano. No geral, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) em que resíduos de uma região hipervariável do receptor são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humanas (anticorpo doador), tais como camundongo, rato, coelho ou primata não humano, possuindo a especificidade do anticorpo, afinidade e capacidade. Em alguns casos, resíduos da região de framework (FR) da imunoglobulina humana são substituídos pelos correspondentes resíduos não humanos. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Estas modificações são feitas para adicionalmente refinar o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente a totalidade de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todos, ou substancialmente todos, os laços hipervariáveis correspondem àqueles de uma imunoglobulina não humana e todas, ou substancialmente todas, as FRs são aquelas de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado opcionalmente compreenderá também pelo menos uma parte de uma região constante de imunoglobulina (Fc), normalmente o de uma imunoglobulina humana. Para mais detalhes, ver Jones et al. Nature 321:522525, 1986; Riechmann et al. Nature 332:323-329, 1988; e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, 1992.
[131] Um imunoconjugado é um anticorpo conjugado a uma ou mais moléculas heterólogas, incluindo, mas não se limitando a um agente
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 76/418
70/324 citotóxico.
[132] O termo isolado, quando utilizado para descrever os vários anticorpos aqui revelados, significa um anticorpo que foi identificado e separado e/ou recuperado a partir de uma cultura de células ou célula a partir da qual ele foi expresso. Componentes contaminante de seu ambiente natural são materiais que normalmente iriam interferir com usos dos diagnósticos ou terapêuticos para o polipeptídeo e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteicos ou não proteicos na sequência. Em algumas modalidades, um anticorpo é purificado para mais do que 95% ou 99% de pureza, conforme determinado, por exemplo, por eletroforese (por exemplo, eletroforese em gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE), focagem isoelétrica (IEF), eletroforese capilar) ou métodos de cromatografia (por exemplo, troca iônica ou HPLC de fase reversa). Para revisão de métodos para a avaliação da pureza do anticorpo, vide, por exemplo, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87, 2007. Nas modalidades preferidas, o anticorpo será purificado (1) até um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos da sequência do terminal N do amino ácido ou interna por utilização de um sequenciador de copo rotativo, ou (2) até à homogeneidade por SDS-PAGE sob não redutoras ou redutoras utilizando azul de Coomassie ou, preferivelmente, coloração de prata. O anticorpo isolado inclui anticorpos in situ dentro das células recombinantes, pois pelo menos um componente do ambiente natural polipeptídeo não estará presente. Normalmente, contudo, o polipeptídeo isolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação.
[133] O termo anticorpo monoclonal, conforme usado neste documento, refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos e/ou se ligam ao mesmo epítopo ou um antígeno, exceto por possíveis anticorpos variantes, por exemplo, contendo
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 77/418
71/324 mutações de ocorrência natural ou originados durante a produção de uma preparação de anticorpo monoclonal, essas variantes geralmente estando presentes em quantidades menores. Em contraste com as preparações de anticorpos policlonais, as quais tipicamente incluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo monoclonal é direcionado a um único determinante em um antígeno. Assim, o modificador monoclonal indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos e não deve ser interpretado como exigente de produção do anticorpo por qualquer método específico. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser feitos por uma variedade de técnicas, incluindo, mas não se limitando ao método de hibhdoma, métodos de DNA recombinante, métodos de exibição de fago e métodos que utilizam animais transgênicos contendo todos ou parte dos loci de imunoglobulina humana. Esses métodos e outros exemplares para produzir anticorpos monoclonais são descritos neste documento. Em certas modalidades, o termo “anticorpo monoclonal” engloba anticorpos biespecíficos.
[134] O termo “anticorpo bivalente” refere-se a um anticorpo que possui dois sítios de ligação ao antígeno. Um anticorpo bivalente pode ser, sem limitação, no formato IgG ou no formato F(ab')2.
[135] O termo anticorpo multiespecífico é usado no sentido mais amplo e abrange um anticorpo que se liga a dois ou mais determinantes ou epítopos em um antígeno ou dois ou mais determinantes ou epítopos em mais de um antígeno. Tais anticorpos multiespecíficos incluem, mas não estão limitados a anticorpos de comprimento completo, anticorpos possuindo duas ou mais domínios VL e VH, fragmentos de anticorpo, tais como Fab, Fv, dsFv, scFv, diabodies, triacorpos e diabodies, fragmentos de anticorpos biespecíficos
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 78/418
72/324 que foram ligados de forma covalente ou não covalente. Especificidade poliepitópica refere-se à capacidade de se ligar especificamente a dois ou mais epítopos diferentes no mesmo ou diferente(s) alvo(s). Em certas modalidades, o anticorpo multiespecífico é um anticorpo biespecífico. Especificidade dupla ou biespecificidade refere-se à capacidade de se ligar especificamente a dois epítopos diferentes no mesmo ou diferente(s) alvo(s). No entanto, em contraste com os anticorpos biespecíficos, os anticorpos duplos específicos têm dois braços que se ligam ao antígeno que são idênticos na sequência de aminoácidos e cada braço Fab é capaz de reconhecer dois antígenos. Dupla especificidade permite que os anticorpos para interagir com elevada afinidade com dois antígenos diferentes como uma única molécula de Fab ou de IgG. De acordo com uma modalidade, o anticorpo multiespecífico liga-se a cada epítopo com uma afinidade de 5 μM a 0,001 pM, 3 μΜ a 0,001 pM, 1 μΜ a 0,001 pM, 0,5 μΜ a 0,001 pM ou 0,1 μΜ a 0,001 pM. Monoespecífico refere-se à capacidade para se ligar apenas um epítopo.
[136] Um anticorpo nu se refere a um anticorpo que não está conjugado com uma fração heteróloga (por exemplo, uma fração citotóxica) ou radiomarcação. O anticorpo puro pode estar presente em uma composição farmacêutica.
[137] No que diz respeito à ligação de um anticorpo para uma molécula alvo, o termo liga-se ou ligação ou ligação específica ou liga-se especificamente a ou é específico para um polipeptídeo particular ou um epítopo num alvo polipeptídeo particular, meios de ligação que é mensuravelmente diferente de uma interação não específica. A ligação específica pode ser medida, por exemplo, por determinação da ligação de molécula em comparação com a ligação uma molécula de controle. Por exemplo, a ligação específica pode ser determinada por competição com uma molécula de controle que é semelhante ao alvo, por exemplo, um excesso de
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 79/418
73/324 alvo não marcado. Nesse caso, a ligação específica é indicada se a ligação do alvo marcado a uma sonda é inibida competitivamente pelo excesso de alvo não marcado. O termo ligação específica ou especificamente liga-se a ou é específico a um polipeptídeo particular ou um epítopo num alvo polipeptídico particular como utilizado neste documento pode ser exibido, por exemplo, por uma molécula possuindo um Kd para o alvo de 10’4 M ou inferior, alternativamente 10’5 M ou inferior, alternativamente 10’7 M ou inferior, alternativamente 10’9 M ou inferior, alternativamente 10’6 M ou inferior, alternativamente 10’8 M ou inferior, alternativamente 10’10 M ou inferior.
alternativamente 10’11 M ou inferior, alternativamente 10’12 M ou inferior ou um
Kd no intervalo de 10’4 M a 10’6 M ou 10’6 M a 10’10 M ou 10’7 M a 10’9 M. Como será apreciado pelos versados na técnica, os valores de afinidade e Kd são inversamente relacionados. Uma alta afinidade para um antígeno é medida por um baixo valor Kd . Numa modalidade, o termo ligação específica refere-se a uma molécula de ligação que se liga a um polipeptídeo particular ou epítopo num polipeptídeo particular, sem substancialmente se ligar a qualquer outro polipeptídeo ou epítopo de polipeptídeo.
[138] Por parátopo entende-se a parte de um anticorpo que se liga ao epítopo de um antígeno. O parátopo é tipicamente uma região de cerca de 15-22 resíduos de aminoácidos da região Fv do anticorpo e pode conter aminoácidos das cadeias Vh e Vl do anticorpo.
[139] O termo variável se refere ao fato de que determinados segmentos dos domínios variáveis diferem extensivamente na sequência entre os anticorpos. A variável ou um domínio V medeia a ligação ao antígeno e define a especificidade de um anticorpo particular para o seu antígeno particular. No entanto, a variabilidade não é distribuída uniformemente em toda a extensão do aminoácido 110 dos domínios variáveis. Em vez disso, as regiões V consistem em trechos relativamente invariáveis chamados regiões de
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 80/418
74/324 estrutura (FRs) de 15-30 aminoácidos separados por regiões mais curtas de extrema variabilidade chamadas de regiões hipervariáveis que têm, cada uma, 9-12 aminoácidos longos. O termo região hipervariável ou HVR quando usado neste documento refere-se aos resíduos de aminoácido de um anticorpo que são responsáveis pela ligação ao antígeno. A região hipervariável geralmente compreende resíduos de aminoácidos de, por exemplo, em tomo dos resíduos 24-34 (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) na VL, e em tomo dos resíduos 26-35 (H1), 49 -65 (H2) e 95-102 (H3) na VH (numa modalidadeHI está em tomo aproximadamente dos resíduos 31-35); Kabat et al. supra) e/ou aqueles resíduos de um “alça hipervariável” (por exemplo, resíduos 26-32 (L1), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) na VL, e 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no VH; Chothia et al. J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987. Os domínios variáveis de cadeias leves e pesadas nativas, cada um, compreendem quatro FRs, amplamente adotando uma configuração folha beta, conectada por três regiões hipervariáveis, que formam conexão em alças, e em alguns casos, formando parte da, estrutura de As regiões hipervariáveis em cada cadeia são mantidas juntas em proximidade estreita por FRs e, com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação de antígeno de anticorpos (vide Kabat et al. supra). Nesse sentido, as sequências de HVR e FR geralmente aparecem na seguinte sequência em VH (ou VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4. Os domínios constantes não estão envolvidos diretamente na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibem várias funções efetoras, tais como participação do anticorpo na citoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC).
[140] O termo numeração de resíduo de domínio variável como em Kabat ou numeração de posição de aminoácido como em Kabat e variações dos mesmos, refere-se ao sistema de numeração usado para os domínios variáveis de cadeia pesada ou domínios variáveis da cadeia leve da
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 81/418
75/324 compilação de anticorpos em Kabat et al., supra. Usando esse sistema de numeração, a sequência de aminoácidos linear real pode conter mais ou menos aminoácidos adicionais correspondentes a um encurtamento, ou inserção, em uma FR ou HVR de domínio variável. Por exemplo, um domínio variável de cadeia pesada pode incluir uma única inserção de aminoácido (resíduo 52a de acordo com Kabat) após o resíduo 52 de H2 e resíduos inseridos (por exemplo, resíduos 82a, 82b e 82c, etc. de acordo com Kabat) após o resíduo 82 da FR de cadeia pesada. A numeração de Kabat de resíduos pode ser determinada para um dado anticorpo pelo alinhamento em regiões de homologia da sequência do anticorpo com uma sequência de Kabat numerada padrão.
[141] O sistema de numeração de Kabat é geralmente usado ao se referir a um resíduo no domínio variável (aproximadamente resíduos 1-107 da cadeia leve e resíduos 1-113 da cadeia pesada) (por exemplo, Kabat et al. supra). O sistema de numeração UE ou índice UE é geralmente utilizado ao se referir a um resíduo em uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina (por exemplo, o índice UE relatado em Kabat et al., supra). O índice UE como em Kabat refere-se à numeração dos resíduos do anticorpo UE lgG1 humano. Salvo indicação em contrário, as referências aos números de resíduos no domínio variável de anticorpos significam numeração de resíduos pelo sistema de numeração de Kabat. Salvo indicação em contrário no presente documento, as referências aos números de resíduos no domínio constante de anticorpos significam numeração de resíduos pelo sistema de numeração da UE (por exemplo, ver o Pedido Provisório dos Estados Unidos N° 60/640,323, números para a numeração da UE).
[142] Um distúrbio ou doença é qualquer condição que se beneficiaria do tratamento com o anticorpo (por exemplo, qualquer anticorpo anti-triptase descrito aqui). Isto inclui distúrbios ou doenças crônicas e agudas
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 82/418
76/324 incluindo as condições patológicas que predispõem o mamífero ao distúrbio em questão. Em algumas modalidades, o distúrbio é um distúrbio autoimune, um distúrbio pulmonar, um distúrbio inflamatório, um distúrbio fibrótico, um distúrbio granulocítico (neutrofílico ou eosinofílico), um distúrbio monocítico, um distúrbio linfocítico ou um distúrbio associado ao aumento do número ou distribuição de células residentes normais ou aberrantes (tais como mastócitos, macrófagos ou linfócitos) ou células estromais (tais como fibroblastos, miofibroblastos, células musculares lisas, epitélio ou endotélio). Em algumas modalidades, o distúrbio é um distúrbio pulmonar. Em alguns exemplos, um distúrbio pode ser um distúrbio associado à triptase ou um distúrbio mediado pela triptase.
[143] Os termos “distúrbio associado à triptase” e “distúrbio mediado pela triptase”, como utilizado neste documento, referem-se a qualquer distúrbio ou condição mediado por, ou associado a, triptase. Em algumas modalidades, os distúrbios associados à triptase estão associados a níveis ou atividade em excesso de triptase, nos quais os sintomas atípicos podem manifestar-se devido aos níveis ou atividade da triptase local e/ou sistemicamente no organismo.
[144] Em algumas modalidades, o distúrbio pulmonar é asma. Em algumas modalidades, a asma é uma asma persistente crônica grave com eventos agudos de agravamento dos sintomas (exacerbações ou exacerbações) que podem ser fatais. Em algumas modalidades, a asma é asma atópica (também conhecida como alérgica), asma não alérgica (por exemplo, frequentemente desencadeada por infecção por um vírus respiratório (por exemplo, gripe, parainfluenza, rinovírus, metapneumovírus humano e vírus sincicial respiratório) ou inalada irritante (poluentes atmosféricos, poluição atmosférica, partículas de diesel, produtos químicos voláteis e gases em ambientes fechados ou externos, ou mesmo por ar seco e frio).
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 83/418
77/324 [145] Em algumas modalidades, a asma é intermitente ou induzida por exercício, asma devido à exposição primária ou secundária aguda ou crônica à “fumaça” (tipicamente cigarros, charutos, cachimbos), inalação ou “vaping” (tabaco, maconha ou outras substâncias) ou asma desencadeada pela ingestão recente de aspirina ou NSAIDS relacionados. Em algumas modalidades, a asma é asma ligeira, corticosteroide, asma recémdiagnosticada e não tratada, ou não requer anteriormente o uso crônico de esteroides tópicos ou sistêmicos inalados para controlar os sintomas (tosse, pieira, falta de ar/falta de ar ou dor torácica). Em algumas modalidades, a asma é asma crônica resistente a corticosteroides, asma refratária a corticosteroides, asma não controlada com corticosteroides ou outros medicamentos controlados por asma crônica.
[146] Em algumas modalidades, a asma é asma de moderada a grave. Em certas modalidades, a asma é de asma Th2-alta. Em algumas modalidades, a asma é asma grave. Em algumas modalidades, a asma é asma atópica, asma alérgica, asma não alérgica (por exemplo, devido à infecção e/ou vírus sincicial respiratório (RSV)), asma induzida por exercício, asma sensível à aspirina/exacerbada, asma leve, moderada a asma grave, asma corticosteroide, asma crônica, asma resistente a corticosteroides, asma refratária a corticosteroides, asma recém-diagnosticada e não tratada, asma devido ao tabagismo, asma não controlada com corticosteroides. Em algumas modalidades, a asma é a asma do linfócito T auxiliar do tipo 2 (Th2) ou do tipo 2 (Th2) elevada ou do tipo 2 (T2). Em algumas modalidades, a asma é asma eosinofílica. Em algumas modalidades, a asma alérgica é asma. Em algumas modalidades, o indivíduo foi determinado como Inflamação Eosinofílica Positiva (EIP). Vide WO 2015/061441. Em algumas modalidades, a asma é asma com periostina elevada (por exemplo, com um nível de periostina de pelo menos cerca de 20 ng/ml, 25 ng/ml ou 50 ng/ml de soro). Em algumas modalidades, a
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 84/418
78/324 asma é uma asma eosinófila alta (por exemplo, pelo menos cerca de 150, 200, 250, 300, 350, 400 contagens de eosinófilos/ml de sangue). Em certas modalidades, a asma é asma Th2-baixa ou asma não-acionada-Th2. Em algumas modalidades, o indivíduo foi determinado como Inflamação Eosinofílica Negativa (EIP). Vide WO 2015/061441. Em algumas modalidades, a asma é asma com periostina baixa (por exemplo, com nível de periostina inferior a cerca de 20 ng/mL de soro). Em algumas modalidades, a asma é asma com eosinófilos baixos (por exemplo, menos de cerca de 150 contagens de eosinófilos/μΙ de sangue ou menos de cerca de 100 contagens de eosinófilos/μΙ de sangue).
[147] O termo “asma Th2-alta”, como usado neste documento, refere-se à asma que exibe altos níveis de uma ou mais citocinas relacionadas a células Th2, por exemplo, IL13, IL4, IL9, IL5, ou que exibe inflamação associada à citocina Th2. Em certas modalidades, o termo asma Th2-alta pode ser usado de forma intercambiável com a asma eosinofílica alta. Em certas modalidades, a asma Th2-alta é a asma induzida por Th2. Em algumas modalidades, o paciente asmático foi determinado como possuindo Inflamação Eosinofílica Positiva (EIP). Vide por exemplo, Publicação do pedido de patente internacional N°s WO 2015/061441, que é incorporado neste documento por referência na sua totalidade. Em certas modalidades, determinou-se que o indivíduo possui níveis elevados de pelo menos um dos genes de assinatura eosinofílicos em comparação com um nível de referência ou de controle. Vide WO2015/061441. Em certas modalidades, a asma Th2-alta é a asma com periostina elevada. Em algumas modalidades, o indivíduo tem alta periostina no soro. Em certas modalidades, o indivíduo tem dezoito anos ou mais. Em certas modalidades, foi determinado que o indivíduo tem um nível elevado de periostina no soro em comparação com um nível de referência ou de controle. Em certas modalidades, o nível de referência ou de controle é o nível mediano
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 85/418
79/324 de periostina numa população. Em certas modalidades, o indivíduo foi determinado como possuindo periostina sérica de 20 ng/ml ou mais. Em certas modalidades, foi determinado que o indivíduo tem 25 ng/ml ou mais de periostina no soro. Em certas modalidades, o indivíduo foi determinado como possuindo periostina sérica de 50 ng/ml ou mais. Em certas modalidades, o nível de referência ou de controle da periostina no soro é de 20 ng/ml, 25 ng/ml ou 50 ng/ml. Em certas modalidades, a asma é de asma alta em eosinofilia. Em certas modalidades, foi determinado que o indivíduo tem uma contagem elevada de eosinófilos em comparação com um nível de referência ou de controle. Em certas modalidades, o nível de referência ou de controle é o nível mediano numa população. Em certas modalidades, foi determinado que o indivíduo tem 150 ou mais de contagem de eosinófilos /pl de sangue. Em certas modalidades, foi determinado que o indivíduo tem 200 ou mais de contagem de eosinófilos/μΙ de sangue. Em certas modalidades, foi determinado que o indivíduo tem 250 ou mais de contagem de eosinófilos/μΙ de sangue. Em certas modalidades, foi determinado que o indivíduo tem 300 ou mais de contagem de eosinófilos /μΙ de sangue. Em certas modalidades, foi determinado que o indivíduo tem 350 ou mais de contagem de eosinófilos/μΙ de sangue. Em certas modalidades, foi determinado que o indivíduo tem 400 ou mais de contagem de eosinófilos/μΙ de sangue. Em certas modalidades, foi determinado que o indivíduo tem 450 ou mais de contagem de eosinófilos/μΙ de sangue. Em certas modalidades, foi determinado que o indivíduo tem 500 ou mais de contagem de eosinófilos/μΙ de sangue. Em certas modalidades preferenciais, foi determinado que o indivíduo tem 300 ou mais de contagem de eosinófilos/μΙ de sangue. Em certas modalidades, os eosinófilos são eosinófilos do sangue periférico. Em certas modalidades, os eosinófilos são eosinófilos de expectoração. Em certas modalidades, o indivíduo exibe níveis elevados de FeNO (ácido nítrico exalado fracionado) e/ou nível elevado de IgE. Por
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 86/418
80/324 exemplo, em alguns casos, o indivíduo exibe um nível de FeNO acima de 250 partes por bilhão (ppb), acima de cerca de 275 ppb, acima de cerca de 300 ppb, acima de 325 ppb, acima de 325 ppb, ou acima de 350 ppb. Em alguns casos, o indivíduo tem um nível de IgE acima de 50 Ul/rnl.
[148] O termo asma Th2-baixa ou asma não-Th2-alta, como neste documento utilizado, refere-se à asma que exibe níveis baixos de uma ou mais citocinas relacionadas com células Th2, por exemplo, IL13, IL4, IL9, IL5 ou exibe inflamação associada a citocinas não-Th2. Em certas modalidades, o termo asma Th2-baixa pode ser usado de forma intercambiável com a asma eosinofílica baixa. Em algumas modalidades, o paciente asmático foi determinado como possuindo Inflamação Eosinofílica Negativa (EIN). Vide, por exemplo, o documento WO 2015/061441. Em certas modalidades, a asma Th2baixa é a asma acionada por Th17. Em certas modalidades, a asma Th2-baixa é a asma com periostina baixa. Em certas modalidades, o indivíduo tem dezoito anos ou mais. Em certas modalidades, foi determinado que o indivíduo tem um nível reduzido de periostina no soro em comparação com um nível de referência ou de controle. Em certas modalidades, o nível de referência ou de controle é o nível mediano de periostina numa população. Em certas modalidades, o indivíduo foi determinado como possuindo menos de 20 ng/ml de periostina no soro. Em certas modalidades, a asma é de asma baixa em eosinofilia. Em certas modalidades, foi determinado que o indivíduo tem uma contagem reduzida de eosinófilos em comparação com um nível de referência ou de controle. Em certas modalidades, o nível de referência ou de controle é o nível médio numa população. Em certas modalidades, foi determinado que o indivíduo tem menos de 150 de contagem de eosinófilos/μΙ de sangue. Em certas modalidades, foi determinado que o indivíduo tem menos de 100 de contagem de eosinófilos/μΙ de sangue. Em certas modalidades preferenciais, foi determinado que o indivíduo tem menos de 300 de contagem de eosinófilos/μΙ
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 87/418
81/324 de sangue.
[149] Em algumas modalidades, o distúrbio autoimune, distúrbio inflamatório, distúrbio fibrótico, distúrbio granulocítico (neutrofílico ou eosinofílico), distúrbio monocítico ou distúrbio linfocítico é esofagite (por exemplo, esofagite eosinofílica), rinite alérgica, rinite não alérgica, rinossinusite com pólipos, polipose nasal, bronquite, pneumonia crônica, aspergilose broncopulmonar alérgica, inflamação das vias aéreas, rinite alérgica, bronquietasia e/ou bronquite crônica.
[150] Em algumas modalidades, o distúrbio autoimune, distúrbio inflamatório, distúrbio fibrótico, distúrbio granulocítico (neutrofílico ou eosinofílico), distúrbio monocítico ou distúrbio linfocítico, é artrite. Em algumas modalidades, a artrite é artrite reumatoide. Em algumas modalidades, a artrite é osteoartrite, artrite reumatoide, artrite juvenil, artrite reumatoide juvenil, artrite precoce, artrite reumatoide poliarticular, artrite reumatoide de início sistêmico, artrite enteropática, artrite reativa, artrite psoriática e/ou artrite como resultado de lesão.
[151] Em algumas modalidades, o distúrbio autoimune, distúrbio inflamatório, distúrbio fibrótico, distúrbio granulocítico (neutrofílico ou eosinofílico), distúrbio monocítico ou distúrbio linfocítico, é uma condição inflamatória gastrointestinal. Em algumas modalidades, a condição inflamatória gastrointestinal é IBD (doença inflamatória do intestino), oolite ulcerativa (UC), doença de Crohn (CD), oolite (por exemplo, oolite causada por insultos ambientais (por exemplo, causada ou associada a um regime terapêutico, como quimioterapia, radioterapia, etc.)), oolite infecciosa, oolite isquêmica, oolite colagenosa ou linfocítica, enterocolite necrosante, oolite em condições como doença granulomatosa crônica ou doença celíaca, alergias alimentares, gastrite, gastroentehte, gasthte infecciosa ou enterocolite (por exemplo, gastrite ativa crônica infectada por Helicobacter pylori), esofagite e outras formas de
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 88/418
82/324 inflamação gastrintestinal causadas por um agente infeccioso ou colite indeterminada.
[152] Em algumas modalidades, o distúrbio autoimune, distúrbio inflamatório, distúrbio fibrótico, distúrbio granulocítico (neutrofílico ou eosinofílico), distúrbio monocítico ou distúrbio linfocítico, é uma condição inflamatória gastrointestinal. Em algumas modalidades, a condição inflamatória gastrointestinal é IBD (doença inflamatória do intestino). Em algumas modalidades, a doença inflamatória do intestino é colite ulcerativa (UC) ou doença de Crohn (CD). Em algumas modalidades, a condição inflamatória gastrointestinal é colite (por exemplo, colite causada por insultos ambientais (por exemplo, causada ou associada a um regime terapêutico, como quimioterapia, radioterapia, etc.)), colite infecciosa, colite isquêmica, colite colagenosa ou linfocítica, enterocolite necrosante, colite em condições como doença granulomatosa crônica ou doença celíaca, alergias alimentares, gastrite, gastroentehte, gasthte infecciosa ou enterocolite (por exemplo, gastrite ativa crônica infectada por Helicobacter pylori), e outras formas de inflamação gastrintestinal causadas por um agente infeccioso ou colite indeterminada. Em algumas modalidades, o estado inflamatório gastrointestinal é colite ulcerativa (UC) ou doença de Crohn (CD). Em algumas modalidades, a condição inflamatória gastrointestinal é colite ulcerativa (UC). Em algumas modalidades, a colite ulcerativa é colite distai ligeira a moderada. Em algumas modalidades, a colite ulcerativa é uma colite extensa ligeira a moderada. Em algumas modalidades, a colite ulcerativa é colite grave. Em algumas modalidades, a condição inflamatória gastrointestinal é a doença de Crohn (CD). Em algumas modalidades, a doença de Crohn está no estágio de doença aguda. Em algumas modalidades, a doença de Crohn está em fase de remissão clínica induzida. Em algumas modalidades, a doença de Crohn está em manter o estado de resposta/remissão. Em algumas modalidades, a doença de Crohn é
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 89/418
83/324 doença leve a moderada. Em algumas modalidades, a doença de Crohn é doença moderada a grave. Em algumas modalidades, a doença de Crohn é doença grave/fulminante. Em algumas modalidades, a doença de Crohn é doença ileal, ileocolônica ou colônica.
[153] Em algumas modalidades, o distúrbio autoimune, distúrbio inflamatório, distúrbio fibrótico, distúrbio granulocítico (neutrofílico ou eosinofílico), distúrbio monocítico ou distúrbio linfocítico, ou distúrbio associado a números aumentados ou distribuição de células residentes normais ou aberrantes de tecido (como mastócitos, macrófagos ou linfócitos) ou células estromais (como fibroblastos, miofibroblastos, células musculares lisas, epitélio ou endotélio) é o lúpus ou o Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES), ou uma ou mais manifestações específicas do órgão do lúpus (por exemplo, nefrite lúpica (LN) que afeta o rim, ou lúpus extrarrenal (ERL) que afeta o sangue e/ou órgãos linfoides (linfonodos, baço, timo e vasos linfáticos associados) e/ou articulações e/ou outros órgãos, mas não necessariamente o rim).
[154] Em algumas modalidades, o distúrbio autoimune, o distúrbio inflamatório, ou o distúrbio fibrótico são relacionados à sepse e/ou ao traumatismo, à infecção por o HIV, ou idiopáticos (de etiologia desconhecida) tais como vaculitides associados por ANCA (AAV), granulomatose com poliangiite (anteriormente conhecida como granulomatose de Wegener), doença de Behcet, doença cardiovascular, bronquite eosinofílica, síndrome de Reiter, síndrome de SEA (Soronegatividade, Entesopatia, Síndrome artropatia), espondilite anquilosante, dermatom iosite, esclerodermia, por exemplo, esclerodermia sistemático igualmente chamado esclerose sistemática, vasculite (por exemplo, Arterite de Células Gigantes (GCA), chamado também arterite temporal, arterite craniano ou doença de Horton), miosite, polimiosite, dermatom iosite, nodosa do poliarterite, arterite, polimialgia reumática, sarcoidose, esclerose biliar preliminar, colangite esclerosante, síndrome de
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 90/418
84/324
Sjogren, psoríase, psoríase em placas, psoríase gutata, psoríase inversa, psoríase pustulosa, psoríase eritrodérmica, dermatite, dermatite atópica, pênfigo, por exemplo, pênfigo vulgar, aterosclerose, lúpus, doença de Still, miastenia gravis, doença celíaca, esclerose múltipla (EM) da doença reincidente-remitente (EMRR) ou subtipos progressivo primário (PPMS) ou secundário progressivo (SPMS), doença de Guillain-Barré, diabetes mellitus do tipo I (DMT1) ou insulinodependente (IDDM) ou tipo DM de início juvenil, tireoidite (por exemplo, doença de Graves), doença celíaca, síndrome de Churg-Strauss, síndrome de mialgia, síndrome hipereosinofílica, reações edematosas incluindo angioedema episódico, infecções helmínticas, dermatite oncocercal, esofagite eosinofílica, enterite eosinofílica, oolite eosinofílica, apneia obstrutiva do sono, endomiocardiofibrose, doença de Addison, doença de Raynaud ou fenômeno, hepatite autoimune, doença do enxerto versus hospedeiro (GVHD), ou rejeição de transplante de órgãos.
[155] Em algumas modalidades, o distúrbio é um distúrbio inflamatório da pele. Em algumas modalidades, o distúrbio é dermatite atópica ou dermatite oncocercal. Em algumas modalidades, o distúrbio é a urticária idiopática crônica (CIU ou CSU).
[156] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, o distúrbio autoimune, distúrbio inflamatório, distúrbio fibrótico, distúrbio neutrofílico ou distúrbio eosinofílico é um distúrbio fibrótico. Em algumas modalidades, os distúrbios fibróticos incluem a fibrose do pulmão, fibrose do fígado (por exemplo, fibrose associada com a cirrose (por exemplo, cirrose induzida por álcool, cirrose induzida por vírus, cirrose pós-hepatite C, e Cirrose biliar preliminar), esquistossomose, colangite (por exemplo, colangite esclerosante), e hepatite autoimune induzida), fibrose do rim (por exemplo, fibrose tubulointersticial, escleroderma, nefrite do diabético, e nefrite glomerular), fibrose cutânea (por exemplo, escleroderma, cicatrizes
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 91/418
85/324 hipertróficas e queloides, dermatopatia fibrosa nefrogênica, e queimaduras), mielofibrose, neurofibromatose, fibroma, fibrose intestinal e aderências fibróticas resultantes de procedimentos cirúrgicos), fibrose cardíaca (por exemplo, fibrose associada com infarto do miocárdio), fibrose vascular (por exemplo, fibrose associada à reestenose arterial pós-angioplastia e aterosclerose), fibrose ocular (por exemplo, fibrose associada à cirurgia póscatarata, vitreoretinopatia proliferativa e fibrose orbital) e fibrose da medula óssea (por exemplo, mielofibrose idiopática e mielofibrose induzida por fármacos). A fibrose pode ser órgão específico ou sistêmico (por exemplo, esclerose sistêmica e fibrose associada à GVHD). Em algumas modalidades, o distúrbio fibrótico é a fibrose pulmonar. Em algumas modalidades, a fibrose pulmonar é pneumonia intersticial fibrosante. Em algumas modalidades, a fibrose pulmonar é a fibrose pulmonar idiopática (FPI), também conhecida como alveolite fibrosante criptogênica. Em algumas modalidades, o FPI é sexo, idade e fisiologia (GAP), estágio I. Em algumas modalidades, o FPI é o estágio GAP II. Em algumas modalidades, o FPI é o estágio GAP III. Em algumas modalidades, a fibrose pulmonar é FPI esporádica. Em algumas modalidades, a fibrose pulmonar é fibrose pulmonar familiar. Em algumas modalidades, a fibrose pulmonar é combinada com fibrose pulmonar e enfisema. Em algumas modalidades, a fibrose pulmonar está associada a um ou mais dos seguintes: pneumonia intersticial usual; pneumonia intersticial idiopática; pneumonia intersticial descamativa; bronquiolite respiratória por doença pulmonar intersticial; pneumonia intersticial aguda; pneumonia intersticial não específica; sarcoidose; pneumonia em organização criptogênica; pneumonia eosinofílica; infecção; exposição a agentes ocupacionais ou ambientais; fumar cigarros; doença pulmonar intersticial induzida por drogas ou radiação; doença pulmonar intersticial associada à doença reumática; pneumonia intersticial linfoide; fibroelastose pleuropulmonar; histiocitose pulmonar de células de Langerhans;
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 92/418
86/324 esclerose sistêmica por doença pulmonar intersticial; Síndrome de HermanskyPudlak; e telomeropatia.
[157] Em algumas modalidades, o distúrbio pulmonar, distúrbio autoimune, distúrbio inflamatório, distúrbio fibrótico, distúrbio neutrofílico ou distúrbio eosinofílico é a doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC). Em algumas modalidades, a DPOC é a Iniciativa Global para Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (GOLD) categoria A. Em algumas modalidades, a DPOC é da categoria GOLD B. Em algumas modalidades, a DPOC é da categoria GOLD C. Em algumas modalidades, a DPOC é da categoria GOLD D. Em algumas modalidades, a DPOC é bronquite crônica. Em algumas modalidades, a DPOC é enfisema. Em algumas modalidades, o enfisema é enfisema acinar proximal, panacinar ou acinar distal. Em algumas modalidades, o enfisema é enfisema induzido por cigarro. Em algumas modalidades, a DPOC está associada à exposição a poeiras particuladas, fumos químicos e/ou poluição do ar. Em algumas modalidades, a DPOC está associada a um desenvolvimento pulmonar prejudicado. Em algumas modalidades, a DPOC é asma obstrutiva crônica. Em algumas modalidades, a DPOC está associada à deficiência de alfa-1 antitripsina. Em algumas modalidades, a DPOC está associada a ruptura do ciado E da protease de serina, membro 2 (SERPINE2). Em algumas modalidades, a DPOC é DPOC com inflamação sistêmica persistente. Em algumas modalidades, a DPOC é DPOC alta de T-helper tipo 2 (Th2) ou eosinofílica. Em algumas modalidades, a DPOC é DPOC com colonização bacteriana persistente. Em algumas modalidades, a DPOC é DPOC com exacerbações frequentes. Em algumas modalidades, o distúrbio autoimune, distúrbio inflamatório, distúrbio fibrótico, distúrbio neutrofílico ou distúrbio eosinofílico é a síndrome de sobreposição da síndrome de sobreposição de asma-DPOC (ACOS). Em algumas modalidades, o ACOS é ACOS predominante em eosinófilos, predominante de neutrófilos, padrão misto, ou
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 93/418
87/324 nenhuma inflamação (paucigranulocítica). Em algumas modalidades, o distúrbio autoimune, distúrbio inflamatório, distúrbio fibrótico, um distúrbio neutrofílico ou um distúrbio eosinofílico é a síndrome de sobreposição da apneia obstrutiva do sono (AOS) com DPOC.
[158] As listas acima não são exaustivas, e será entendido pelo versado na técnica que uma doença ou distúrbio pode estar dentro de várias categorias.
[159] O termo bula é usado para se referir às instruções normalmente incluídas em embalagens comerciais dos produtos terapêuticos, que contêm as informações sobre as indicações, uso, dosagem, administração, terapia de combinação, contraindicações e/ou avisos em relação ao uso desses produtos terapêuticos.
[160] Os termos formulação farmacêutica e composição farmacêutica são usados intercambiavelmente neste documento e dizem respeito a uma preparação cuja forma permite que a atividade biológica de um ingrediente ativo contido nela seja eficaz, e que não contenha componentes adicionais que sejam inaceitavelmente tóxicos a um sujeito ao qual a formulação será administrada. Essas formulações são estéreis. Numa modalidade preferida, a composição farmacêutica ou formulação farmacêutica é administrada a um sujeito humano.
[161] Uma formulação farmacêutica estéril é asséptica ou livre, ou essencialmente livre, de todos os microrganismos que vivem e os seus esporos.
[162] Uma formulação farmacêutica estável é aquela em que a proteína (por exemplo, um anticorpo, tal como um anticorpo anti-triptase) retém essencialmente a sua estabilidade física e/ou estabilidade química e/ou atividade biológica após o armazenamento. De preferência, a formulação retém essencialmente a sua estabilidade física e química, bem como a sua atividade
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 94/418
88/324 biológica durante o armazenamento. O período de armazenamento é geralmente selecionado com base no prazo de validade pretendido da formulação. Várias técnicas analíticas para medir a estabilidade da proteína estão disponíveis na técnica e são analisadas em Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.Y., Pubs. (1991) e Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993), por exemplo. A estabilidade pode ser medida em uma quantidade selecionada de exposição à luz e/ou à temperatura durante um período de tempo selecionado. A estabilidade pode ser avaliada qualitativa e/ou quantitativamente de várias maneiras diferentes, incluindo avaliação da formação de agregados (por exemplo, utilizando cromatografia por exclusão de tamanho, medição da turbidez e/ou inspeção visual); avaliação da formação de ROS (por exemplo, usando um ensaio de tensão leve ou um ensaio de tensão AAPH); oxidação de resíduos de aminoácidos específicos da proteína (por exemplo, um resíduo de Met e/ou Trp de um anticorpo monoclonal); avaliação da heterogeneidade de carga usando cromatografia de permuta catiônica, focagem isoelétrica capilar de imagem (iclEF) ou eletroforese de zona capilar; análise da sequência amino-terminal ou carboxi-terminal; análise espectrométrica de massa; análise SDS-PAGE para comparar anticorpos reduzidos e intactos; análise do mapa peptídico (por exemplo, tríptico ou LYS-C); avaliação da atividade biológica ou da função de ligação ao alvo da proteína (por exemplo, função de ligação ao antígeno de um anticorpo); e similares. A instabilidade pode envolver qualquer um ou mais de: agregação, desamidação (por exemplo, desamidação de Asn), oxidação (por exemplo oxidação de Met e/ou oxidação de Trp), isomerização (por exemplo, isomeriação de Asp), corte/hidrólise/fragmentação (por exemplo fragmentação da região de dobradiça), formação de succinimida, cisteína não pareada, extensão de N-terminal, processamento de C-terminal, diferenças de glicosilação e similares.
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 95/418
89/324 [163] Um anticorpo (por exemplo, um anticorpo anti-triptase) “mantém sua estabilidade física” em uma formulação farmacêutica se não mostrar sinais ou muito pouco de agregação, precipitação, fragmentação e/ou desnaturação após exame visual de cor e/ou claridade, ou como medido por dispersão de luz UV ou por cromatografia por exclusão de tamanho.
[164] Um anticorpo (por exemplo, um anticorpo anti-triptase) “retém sua estabilidade química” em uma formulação farmacêutica, se a estabilidade química em um determinado momento é tal que o anticorpo é considerado como ainda retendo sua atividade biológica como definida abaixo. A estabilidade química pode ser avaliada, detectando e quantificando formas quimicamente alteradas do anticorpo. A alteração química pode envolver a oxidação de proteínas, que pode ser avaliada utilizando mapeamento de peptídeos trípticos, cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa (HPLC) e espectrometria de massa por cromatografia líquida (LC/MS), por exemplo. Outros tipos de alterações químicas incluem a alteração de carga da proteína do anticorpo, que pode ser avaliada por cromatografia de troca iônica ou iclEF, por exemplo.
[165] Um anticorpo (por exemplo, um anticorpo anti-triptase) “retém sua atividade biológica” em uma formulação farmacêutica, se a atividade biológica do anticorpo em um dado momento estiver dentro de cerca de 20% (como em cerca de 10%) da atividade biológica exibida no momento em que a formulação farmacêutica foi preparada (dentro dos erros do ensaio), como determinado, por exemplo, num ensaio de ligação ao antígeno ou um ensaio inibidor in vitro para um anticorpo monoclonal (por exemplo, um anticorpo monoclonal anti-triptase). Em algumas modalidades, a atividade biológica de um anticorpo num dado momento está entre cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50% da atividade biológica apresentada no momento em que a formulação
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 96/418
90/324 farmacêutica foi preparada.
[166] Como utilizado neste documento, “atividade biológica” de um anticorpo (por exemplo, um anticorpo anti-triptase) refere-se à capacidade do anticorpo para se ligar ao seu alvo, por exemplo, a capacidade de um anticorpo monoclonal se ligar a um antígeno. Pode incluir ainda uma resposta biológica que pode ser medida in vitro ou in vivo. Tal atividade pode ser antagônica ou agonística.
[167] Uma proteína (por exemplo, um anticorpo, tal como um anticorpo anti-triptase) que é suscetível à oxidação é aquela que compreende um ou mais resíduos que foram considerados propensos à oxidação, tais como, mas sem limitação, metionina (Met), cisteína (Cys), histidina (His), triptofano (Trp) e tirosina (Tyr). Por exemplo, um aminoácido de triptofano na porção Fab de um anticorpo monoclonal ou um aminoácido de metionina na porção Fc de um anticorpo monoclonal pode ser suscetível à oxidação.
[168] O termo “porcentagem de oxidação” refere-se à porcentagem de anticorpos em uma formulação (por exemplo, uma composição farmacêutica) que são oxidados em um resíduo de aminoácido específico, por exemplo, um resíduo Trp (por exemplo, TrplOO em HVR-H3 de hu31A.v11) ou um resíduo Met. A porcentagem de oxidação pode ser determinada por, por exemplo, análise por espectrometria de massa (MS) de um ou mais peptídeos trípticos, em que residem um ou mais resíduos de aminoácidos propensos à oxidação. Em certas modalidades, a porcentagem de oxidação de TrplOO em HVR-H3 de hu31A.v11 é determinada pela massa de peptídeo tríptico oxidado em que Trp 100 reside, sobre a massa do peptídeo tríptico total (oxidado e não oxidado), como determinado pela análise MS. A porcentagem de oxidação pode ser determinada, por exemplo, dentro de 9 meses, 12 meses, 18 meses ou dois anos a partir da produção inicial de um anticorpo ou da sua composição farmacêutica.
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 97/418
91/324 [169] 0 termo é determinado após um teste de tensão de AAPH, como usado neste documento, significa que a porcentagem de oxidação em um resíduo de aminoácido específico (por exemplo, em TrplOO em HVR-H3 de hu31A.v11) é determinada por análise de espectrometria de massa de peptídeos trípticos após formulação do anticorpo a 150 mg/mL em AAPH a 5 mM durante 25 h a 40 °C, por exemplo, como descrito no Exemplo 5. O anticorpo tensionado é digerido com tripsina e os peptídeos digeridos foram submetidos a cromatografia líquida de ultra alto desempenho-espectrometria de massa de alta resolução (UHPLC-HRMS) para determinar a porcentagem de oxidação.
[170] Como utilizado neste documento, tampão refere-se a uma solução tamponada que resiste a mudanças no pH pela ação de seus componentes conjugados de ácido-base. O tampão desta invenção preferencialmente tem um pH no intervalo de cerca de 4,5 a cerca de 8,0 (por exemplo, cerca de 4,5, cerca de 5, cerca de 5,5, cerca de 6, cerca de 6,5, cerca de 7, cerca de 7,5 ou cerca de 8), por exemplo, pH 5,5. Por exemplo, o acetato de histidina é um exemplo de tampão que controla o pH neste intervalo. Outro tampão adequado é o succinato de arginina e/ou o succinato de histidina.
[171] Um conservante é um composto que pode ser opcionalmente incluído na formulação para reduzir essencialmente a ação bacteriana, facilitando assim a produção de uma formulação multiuso, por exemplo. Exemplos de conservantes potenciais incluem cloreto de octadecildimetilbenzilamônio, cloreto de hexametônio, cloreto de benzalcônio (uma mistura de cloretos de alquilbenzildimetilamônio nos quais os grupos alquil são compostos de cadeia longa) e cloreto de benzetônio. Outros tipos de conservantes incluem álcoois aromáticos tais como álcool fenólico, butílico e benzílico, alquilparabenos tais como metil ou propilparabeno, catecol, resorcinol, ciclo-hexanol, 3-pentanol e m-cresol. Em uma modalidade, o
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 98/418
92/324 conservante em questão é o álcool benzílico.
[172] Como utilizado neste documento, surfactante refere-se a um agente surfactante, preferencialmente um agente surfactante não iônico. Exemplos de agentes surfactantes na presente invenção incluem polissorbato (por exemplo, polissorbato 20 e polissorbato 80); poloxâmero (por exemplo poloxâmero 188); TRITON®; dodecilsulfato de sódio (SDS); laurilsulfato de sódio; sódio octil glicosídeo; lauril-, miristil-, linoleil- ou estearil-sulfobetaína; lauril-, miristil-, linoleil- ou estearil-sarcosina; linoleil-, miristil- ou cetil-betaína; lauroamidopropil-, cocam idopropil-, linoleamidopropil-, miristamidopropilpalmidopropil- ou isostearamidopropil-betaína (por exemplo lauroamidopropil); miristamidopropil-, palmidopropil- ou isostearamidopropil-dimetilamina; cocoilmetil sódico ou metil oleil-taurato dissódico; e a série MONAQUAT™ (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.); polietilglicol, polipropilglicol, e copolímeros de etileno e propilenoglicol (por exemplo, copolímeros em bloco tipo PLURONIC®, por exemplo, PLURONIC® F-68); e similares. Em outra modalidade, o surfactante em questão é o polissorbato 20. Em outra modalidade, ainda, o surfactante em questão é o poloxâmero 188.
[173] Um carreador farmaceuticamente aceitável se refere a um ingrediente em uma formulação farmacêutica, diferente do ingrediente ativo, que é não tóxico a um sujeito. Um carreador farmaceuticamente aceitável inclui, mas não está limitado a, um tampão, excipiente, estabilizante ou conservante.
[174] O termo pró-droga, tal como utilizado neste pedido de patente refere-se a uma forma precursora ou derivada de uma substância farmaceuticamente ativa que é menos citotóxica para células tumorais em comparação com o fármaco progenitor e é capaz de ser enzimaticamente ativada ou convertida na forma parental mais ativa. Ver, por exemplo, Wilman, “Prodrugs in Cancer Chemotherapy”, Biochemical Society Transactions, 14, pp.
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 99/418
93/324
375-382, 615th Meeting, Belfast (1986) e Stella et al. “Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery,” Directed Drug Delivery, Borchardt et al. (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985). As pró-drogas da presente invenção incluem, mas não se limitam a, pró-drogas que contém fosfato, pró-drogas que contém tiofosfato, pró-drogas que contém sulfato, pró-drogas que contém peptídeos, pró-drogas modificadas com D-aminoácidos, pró-drogas glicosiladas, pró-drogas que contém β-lactâmicos, pró-drogas que contém fenoxiacetamida opcionalmente substituída ou pró-drogas que contém fenilacetamida opcionalmente substituída, 5-fluorocitosina e outras pró-drogas de 5-fluorouridina que podem ser convertidas em droga livre de citotóxico e mais ativo. Exemplos de drogas citotóxicas que podem ser derivadas em uma forma de pró-droga para utilização na presente invenção incluem, mas não estão limitados àqueles agentes quimioterapêuticos descritos acima.
[175] Um sujeito é um vertebrado, preferencialmente um mamífero, mais preferencialmente um ser humano. Mamíferos incluem, mas não estão limitados a, animais de fazenda (como vacas e ovelhas), animais esportivos, animais de estimação (como gatos, cães e cavalos), primatas (por exemplo, humanos e primatas não humanos, como macacos cynomolgus) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos).
[176] Como utilizado neste documento, “administrar” significa um método para dar uma dosagem de um composto (por exemplo, um anticorpo anti-triptase da invenção ou um agente terapêutico adicional) ou uma composição (por exemplo, uma composição farmacêutica, por exemplo, uma composição farmacêutica incluindo um anticorpo anti-triptase da invenção, opcionalmente incluindo também um agente terapêutico adicional, que pode incluir um excipiente tal como um antioxidante (por exemplo, N-acetiltriptofano e/ou metionina) a um sujeito. As composições utilizadas nos métodos descritos neste documento podem ser administradas, por exemplo, por via intravítrea,
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 100/418
94/324 intramuscular, intravenosa, intradérmica, percutânea, intra-arterial, intraperitoneal, intralesional, intracraniana, intra-articular, intraprostaticamente, intrapleural, intratraqueal, intratecal, intranasal, intravaginal, intratópica, tópica, intratumoral, peritoneal, subcutânea, subconjuntival, intravesicular e mucosal, intrapericárdica, intrailuminal, intraocular, intraorbital, oral, tópica, transdérmica, periocular, conjuntival, subtenoniana, intracameral, subretiniana, retrobulbariana, intracanalicular, por inalação, por injeção, por implantação, através de células-alvo de banho de perfusão localizadas diretamente, por cateter, por lavagem, em cremes ou em composições lipídicas. As composições utilizadas nos métodos descritos neste documento também podem ser administradas sistematicamente ou localmente. O método de administração pode variar dependendo de vários fatores (por exemplo, o composto ou composição a ser administrada e a gravidade da condição, doença ou distúrbio a ser tratado).
[177] Uma “quantidade eficaz” ou “quantidade terapeuticamente eficaz” de um agente, por exemplo, um anticorpo anti-thptase ou uma formulação farmacêutica (por exemplo, uma formulação farmacêutica que inclua um anticorpo anti-thptase, que pode incluir um excipiente como um antioxidante (por exemplo, N-acetiltriptofano e/ou metionina), refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado terapêutico ou profilático desejado. A quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, um anticorpo anti-triptase), ou sua composição, pode melhorar ou tratar o distúrbio ou doença, ou prevenir, reduzir, melhorar ou tratar sintomas associados com o distúrbio ou doença.
[178] Como utilizado neste documento, tratamento (e variações gramaticais deste tal como tratar ou tratando) se refere à intervenção clínica na tentativa de alterar o curso natural do indivíduo sendo tratado e pode ser
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 101/418
95/324 realizado para fins de profilaxia ou durante o curso da patologia clínica. Os efeitos desejáveis do tratamento incluem, mas não estão limitados a, prevenção da ocorrência ou recorrência da doença, alívio dos sintomas, diminuição de quaisquer consequências patológicas diretas ou indiretas da doença, prevenção de metástase, diminuição da taxa de progressão da doença, melhora ou paliação do estado da doença e remissão ou prognóstico aprimorado. Em algumas modalidades, os anticorpos da invenção são usados para retardar o desenvolvimento de uma doença ou reduzir a progressão de uma doença. Um paciente pode ser “tratado” com sucesso quanto à asma se, por exemplo, após receber uma terapia para asma, o paciente apresentar redução observável e/ou mensurável ou ausência de um ou mais dos seguintes sintomas: sibilância recorrente, tosse, dificuldade para respirar, tórax apertado, sintomas que ocorrem ou pioram à noite, sintomas que são desencadeados por ar frio, exercício ou exposição a alérgenos.
[179] O termo interleucina-5 (IL-5), como usado neste documento, refere-se a qualquer IL-5 nativa de qualquer fonte de vertebrados, incluindo mamíferos, como primatas (por exemplo, os seres humanos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), salvo indicação em contrário. O termo engloba IL-5 completa, não processada, IL-5 madura, assim como qualquer forma de IL-5 que resulte de modificações pós-traducionais. O termo também abrange variantes de ocorrência natural de IL-5, tais como variantes de união ou variantes alélicas. A sequência de aminoácidos de uma IL-5 exemplificativa pode ser encontrada, por exemplo, sob o número de acesso UniProtKB P05113.
[180] O termo antagonista de ligação ao eixo de IL-5 refere-se a uma molécula que diminui, bloqueia, inibe, anula ou interfere com a transdução de sinal resultante da interação de IL-5 com um ou mais dos seus parceiros de ligação, como o receptor de IL-5 alfa (IL5RA). Antagonistas de
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 102/418
96/324 ligação ao eixo da IL-5 exemplares que podem ser utilizados nos métodos da invenção incluem, por exemplo, antagonistas de ligação a IL-5 (por exemplo, anticorpos anti-IL-5 (por exemplo, mepolizumabe, benralizumabe e reslizumabe) e antagonistas de ligação ao receptor de IL-5 (por exemplo, anticorpos anti-IL-5R)).
[181] Como utilizado neste documento, “interleucina-13 (IL-13)” refere-se a qualquer IL-13 nativa de qualquer fonte de vertebrado, incluindo mamíferos tais como primatas (por exemplo, humanos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), salvo indicação em contrário. A IL-13 é uma citocina secretada por muitos tipos de células, incluindo células T helper tipo 2 (Th2). O termo abrange IL-13 “completa”, não processada, IL-13 madura, assim como qualquer forma de IL-13 que resulte de modificações pós-traducionais. A sequência de aminoácidos de uma IL-13 humana exemplificativa pode ser encontrada, por exemplo, sob o número de acesso UniProtKB P35225.
[182] O termo antagonista de ligação ao eixo de IL-13 refere-se a uma molécula que diminui, bloqueia, inibe, anula ou interfere com a transdução de sinal resultante da interação da IL-13 com um ou mais dos seus parceiros de ligação, tal como o receptor da IL-4 alfa (IL4Ra), receptor de IL-13 alfal (IL13RA1) e receptor de IL-13 alfa2 (IL13RA2). Os antagonistas da ligação ao eixo da IL-13 incluem antagonistas da ligação à IL-13 (por exemplo, anticorpos anti-IL-13, por exemplo, lebhkizumabe, 228B/C-1, 228A-4, 227-26 e 227-43 (ver, por exemplo Pat. n°s 7.674.459; 8.067.199; 8.088.618; 8.318.160; e 8.734.797) e antagonistas da ligação ao receptor de IL-13 (por exemplo, um anticorpo anti-IL4Ra, um anticorpo anti-IL13RA1 ou um anticorpo antiIL13RA2).
[183] Como utilizado neste documento, “interleucina-17 (IL-17)” refere-se a qualquer IL-17 nativa de qualquer fonte de vertebrado, incluindo mamíferos tais como primatas (por exemplo, humanos) e roedores (por
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 103/418
97/324 exemplo, camundongos e ratos), salvo indicação em contrário, e inclui membros da família IL-17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E e IL-17F. O termo abrange IL-17 “completa”, não processada, IL-17 madura, assim como qualquer forma de IL-17 que resulte de modificações pós-traducionais. A sequência de aminoácidos de uma IL-17A humana exemplificativa pode ser encontrada, por exemplo, sob o número de acesso UniProtKB Q16552. A sequência de aminoácidos de uma IL-17B humana exemplificativa pode ser encontrada, por exemplo, sob o número de acesso UniProtKB Q9UHF5. A sequência de aminoácidos de uma IL-17C humana exemplificativa pode ser encontrada, por exemplo, sob o número de acesso UniProtKB Q9P0M4. A sequência de aminoácidos de uma IL-17D humana exemplificativa pode ser encontrada, por exemplo, sob o número de acesso UniProtKB Q8TAD2. A sequência de aminoácidos de uma IL-17E humana exemplificativa pode ser encontrada, por exemplo, sob o número de acesso UniProtKB Q9H293. A sequência de aminoácidos de uma IL-17F humana exemplificativa pode ser encontrada, por exemplo, sob o número de acesso UniProtKB Q96PD4.
[184] O termo “antagonista de ligação ao eixo de IL-17” refere-se a uma molécula que diminui, bloqueia, inibe, anula ou interfere na transdução de sinal resultante da interação da IL-17 com um ou mais de seus parceiros de ligação, como proteínas membro da família receptor de interleucina-17 (IL17R), receptor A de interleucina 17 (IL17RA), receptor B de interleucina 17 (IL17RB), receptor C de interleucina 17 (IL17RC), receptor D de interleucina 17 (IL17RD), receptor E de interleucina 17 (IL17RE) e receptor semelhante a E de interleucina 17 (IL17REL). Antagonistas de ligação ao eixo de IL-17 exemplificativos incluem, por exemplo, antagonistas de ligação a IL-17 (por exemplo, anticorpos anti-IL-17 (por exemplo, secucinumabe (AIN417), ixekizumabe (LY2439821), bimekizumabe e NI-1401) e antagonistas da ligação ao receptor de IL-17 (por exemplo, anticorpos anti-IL-17R (por exemplo,
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 104/418
98/324 brodalumabe (AMG-827))). Ver, por exemplo, os documentos WO 2006/013107, WO 2007/070750, WO 2012/156219 e Patente US N°s 8.715.669.
[185] O termo interleucina-33 (IL-33), como usado neste documento, refere-se a qualquer IL-33 nativa de qualquer fonte de vertebrados, incluindo mamíferos, como primatas (por exemplo, os seres humanos e macacos cynomolgus) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), salvo indicação em contrário. A IL-33 é também referida na técnica como fator nuclear de vênulas endoteliais elevadas (NF-HEV; ver, por exemplo, Baekkevold et al. Am. J. Pathol. 163 (1): 69-79, 2003), DVS27, C9orf26 e membro da família da interleucina-1 11 (IL-1F11). O termo engloba IL-33 completa, não processada, IL-33 madura, assim como qualquer forma de IL-33 que resulte de modificações pós-traducionais. A IL-33 humana completa, não processada, contém 270 aminoácidos (aa) e também pode ser referida como IL-33i -270. Formas processadas de IL-33 humana incluem, por exemplo, IL—3395270, IL-3399 -270, IL-33i 09-270, IL-33i 12-270, IL-33i-i78 e IL-33i79-27o (Lefrançais et al. Proc. Natl. Acad. Sei. 109(5):1673-1678, 2012 e Martin, Semin. Immunol. 25: 449-457, 2013). Em algumas modalidades, as formas processadas de IL-33 humana, por exemplo, IL-3395-270, IL-3399-270, IL-33w9-27o ou outras formas processadas por proteases, como calpaína, proteinase 3, elastase de neutrófilos e catepsina G, podem ter atividade biológica aumentada em comparação com a IL-33 completa. O termo também abrange variantes de ocorrência natural de IL-33, por exemplo, variantes de splicing (por exemplo, a variante de splice constitutivamente ativa splL-33 que não possui o éxon 3, Hong et al. J. Biol. Chem. 286 22):20078-20086, 2011) ou variantes alélicas. A IL-33 pode estar presente dentro de uma célula (por exemplo, dentro do núcleo) ou como uma forma de citocina secretada. A proteína IL-33 completa contém um motivo de ligação de DNA hélice-volta-hélice incluindo a sequência
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 105/418
99/324 de localização nuclear (aa1-75 da IL-33 humana), que inclui um motivo de ligação à cromatina (aa 40-58 da IL-33 humana). Formas de IL-33 que são processadas e secretadas não possuem estes motivos N-terminais. A sequência de aminoácidos de uma IL-33 humana exemplificativa pode ser encontrada, por exemplo, sob o número de acesso UniProtKB 095760.
[186] Os termos “interleucina 1 tipo receptora 1 (IL1RL1)” e “ST2”, aqui usados indistintamente, referem-se a qualquer ST2 nativa de qualquer fonte de vertebrados, incluindo mamíferos como primatas (por exemplo, humanos) e roedores (por exemplo, ratos e camundongos), exceto quando indicado. ST2 é também referida na técnica como DER4, T1 e FIT-1. O termo abrange ST2 “completa”, não processada, ST2 madura, assim como qualquer forma de ST2 que resulte de modificações pós-traducionais. Pelo menos quatro isoformas de ST2 são conhecidas na técnica, incluindo solúvel (sST2, também conhecido como IL1RL1-a) e transmembrana (ST2L, também conhecido como IL1RL1 -b), que surgem da expressão diferencial de mRNA de um sistema promotor duplo, e ST2V e ST2LV, que surgem de splicing alternativo, como descrito abaixo. A estrutura do domínio de ST2L inclui três domínios C2 extracelulares do tipo imunoglobulina, um domínio transmembrana e um domínio citoplasmático de receptor Toll/lnterleucina-1 (TIR). sST2 não possui os domínios transmembrana e citoplasmático contidos em ST2L e inclui um único 9 aminoácido (aa) Sequência de C-terminal (ver, por exemplo, Kakkar et al. Nat. Rev. Drug Disc. 7: 827-840, 2008). sST2 pode funcionar como um receptor chamariz para inibir a IL-33 solúvel. O termo também abrange variantes de ocorrência natural de ST2, por exemplo, variantes de splicing (por exemplo, ST2V que não possui o terceiro motivo de imunoglobulina e tem uma única cauda hidrofóbica e ST2LV, que não possui o domínio transmembrana de ST2L) ou variantes alélicas (por exemplo, variantes que são protetores contra o risco de asma ou que conferem risco de asma
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 106/418
100/324 como descrito aqui). A sequência de aminoácidos de uma ST2 humana exemplificativa pode ser encontrada, por exemplo, sob o número de acesso UniProtKB Q01638. ST2 é uma parte do receptor de IL-33 juntamente com a proteína correceptora IL-1RAcP. A ligação de IL-33 a ST2 e da proteína acessória do receptor de interleucina-1 do correceptor (IL-1RAcP) forma um complexo de sinalização ternário 1:1:1 para promover a transdução de sinal a jusante (ver, por exemplo, Lingel et al. Structure 17(10): 1398-1410, 2009 e Liu etal. Proc. Natl. Acad. Sei. 110(37): 14918-14924, 2013).
[187] Por eixo de IL-33 entende-se um ácido nucleico (por exemplo, um gene ou mRNA transcrito a partir do gene) ou polipeptídeo que está envolvido na transdução de sinal de IL-33. Por exemplo, o eixo de IL-33 pode incluir o ligante de IL-33, um receptor (por exemplo, ST2 e/ou IL-1RAcP), moléculas adaptadores (por exemplo, MyD88) ou proteínas que se associam a moléculas receptores e/ou moléculas adaptadores (por exemplo, quinases, tais como quinase 1 associada a receptor de interleucina 1 (IRAKI) e quinase 4 associada a receptor de interleucina 1 (IRAK4), ou ligase de ubiquitina E3, tal como fator 6 associado ao receptor de TNF (TRAF6)).
[188] Um “antagonista de ligação ao eixo de IL-33” refere-se a uma molécula que inibe a interação de um parceiro de ligação ao eixo de IL-33 com um ou mais dos seus parceiros de ligação. Como utilizado neste documento, um antagonista de ligação ao eixo da IL-33 inclui antagonistas de ligação a IL-33, antagonistas de ligação a ST2 e antagonistas de ligação a ILIRAcP. Antagonistas de ligação ao eixo de exemplares incluem anticorpos anti-IL-33 e seus fragmentos de ligação ao antígeno (por exemplo, anticorpos anti-IL-33 tais como ANB-020 (AnaptysBio, Inc.) ou qualquer um dos anticorpos descritos em EP1725261, US8187596, WO2011031600, WO2014164959, WO2015099175 ou WO2015106080, que são incorporados este documento por referência na sua totalidade); polipeptídeos que se ligam a IL-33 e/ou o seu
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 107/418
101/324 receptor (ST2 e/ou IL-1RAcP) e bloqueiam a interação ligante-receptor (por exemplo, proteínas ST2-Fc, tais como as descritas no documento WO 2014/152195, que é incorporado neste documento por referência na sua totalidade: imunoadesinas, pepticorpos e ST2 solúvel, ou seus derivados); anticorpos antirreceptor de IL-33 (por exemplo, anticorpos anti-ST2, por exemplo, AMG-282 (Amgen) ou STLM15 (Janssen) ou qualquer um dos anticorpos anti-ST2 descritos em WO 2013/173761 e WO 2013/165894, que são incorporados neste documento por referência na sua totalidade ou proteínas ST2-Fc, tais como as descritas no documento WO 2013/173761; documento WO 2013/165894; documento WO 2014/152195, que são incorporadas este documento por referência na sua totalidade); e antagonistas do receptor de IL-33, tais como inibidores de molécula pequena, aptâmeros que se ligam a IL-33 e ácidos nucleicos que hibridizam sob condições severas com sequências de ácido nucleico de eixo de IL-33 (por exemplo, pequenos RNA interferentes (siRNA) ou RNAs de repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente espaçadas (CRISPR-RNA ou crRNA), incluindo RNA de guia única (sgRNAs) possuindo uma sequência de crRNA e tracRNA como descrita em Mali et al. (Science. 339: 823-26, 2013), que é incorporado neste documento por referência na sua totalidade).
[189] Os termos anticorpo anti-IL-33, um anticorpo que se liga a IL-33 e anticorpo que se liga especificamente a IL-33 referem-se a um anticorpo que é capaz de se ligar a IL-33 com suficiente afinidade, de tal modo que o anticorpo seja útil como diagnóstico e/ou agente terapêutico no direcionamento a IL-33. Em uma modalidade, o grau de ligação de um anticorpo anti-IL-33 a uma proteína não-IL-33, não relacionada, é menor do que cerca de 10% da ligação do anticorpo a IL-33, conforme medido, por exemplo, por um radioimunoensaio (RIA). Em certas modalidades, um anticorpo que se liga a IL-33 tem uma constante de dissociação Kd) de < 1μΜ, < 100 nM, < 10
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 108/418
102/324 nM, < 1 ηΜ, < 0,1 ηΜ, < 0,01 ηΜ, ou < 0,001 ηΜ (por exemplo, 10’8 Μ ou menos, por exemplo, de 10’8 M a 10’13 M, por exemplo, de 10’9 M a 10’13 M). Em determinadas modalidades, um anticorpo anti-IL-33 se liga a um epítopo de IL33 que é conservado entre IL-33 de diferentes espécies.
[190] O termo antagonista de ligação a ST2 refere-se a uma molécula que inibe a interação de um ST2 com IL-33, ILIRAcP e/ou uma segunda molécula de ST2. O antagonista de ligação a ST2 pode ser uma proteína, tal como uma “proteína ST2-Fc” que inclui um domínio de ligação a IL-33 (por exemplo, toda ou uma porção de uma proteína ST2 ou ILIRAcP) e um domínio de multimerização (por exemplo, uma porção Fc de uma imunoglobulina, por exemplo, um domínio Fc de uma IgG selecionada dos isotipos lgG1, lgG2, lgG3 e lgG4, bem como qualquer alótipo dentro de cada grupo de isotipos), que estão ligados a uma outro, direta ou indiretamente, por meio de um ligante (por exemplo, um ligante serina-glicina (SG), um ligante glicina-glicina (GG) ou uma variante do mesmo (por exemplo, um ligante SGG, um GGS, um SGS ou um GSG) e inclui, mas não é limitado a proteínas ST2-Fc e suas variantes descritas nos documentos WO 2013/173761, WO 2013/165894 e WO 2014/152195, que são incorporadas neste documento por referência na sua totalidade. Em algumas modalidades, um antagonista de ligação a ST2 pode ser um anticorpo anti-ST2, por exemplo, AMG-282 (Amgen) ou STLM15 (Janssen) ou qualquer um dos anticorpos anti-ST2 descritos em WO 2013/173761 e WO 2013/165894.
[191] Um ácido nucleico isolado se refere a uma molécula de ácido nucleico que foi separada de um componente de seu ambiente natural. Um ácido nucleico isolado inclui uma molécula de ácido nucleico contida em células que geralmente compreendem a molécula de ácido nucleico, porém a molécula de ácido nucleico está presente extracromossomicamente ou em um local cromossômico diferente de seu local cromossômico natural.
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 109/418
103/324 [192] O termo sequências de controle refere-se a sequências de DNA necessárias para a expressão de uma sequência de codificação operacionalmente ligada num organismo hospedeiro particular. Sequências de controle que são adequadas para procariotos, por exemplo, incluem um promotor, opcionalmente uma sequência operadora, e um sítio de ligação a ribossomo. Células eucarióticas são conhecidas por utilizar promotores, sinais de poliadenilação e potencializadores.
[193] Os termos célula hospedeira, linhagem celular hospedeira, e cultura celular hospedeira são usados intercambiavelmente e se referem às células nas quais um ácido nucleico exógeno foi introduzido, incluindo a progênie dessas células. Células hospedeiras incluem transformantes e células transformadas, que incluem a célula primária transformada e a progênie derivada desta sem referência ao número de passagens. A progênie pode não ser completamente idêntica em teor de ácido nucleico para uma célula precursora, mas pode conter mutações. A progênie mutante que tem a mesma função ou atividade biológica, conforme tríada ou selecionada na célula originalmente transformada está incluída neste documento.
[194] O ácido nucleico está ligado de forma operacional quando é colocado em uma relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, o DNA para uma pré-sequência ou líder de secreção está ligado operacionalmente ao DNA para um polipeptídeo se ele for expresso como uma pré-proteína que participa na secreção do polipeptídeo; um promotor ou potencializador está operacionalmente ligado a uma sequência de codificação se ele afetar a transcrição da sequência; ou um sítio de ligação ao ribossomo está operacionalmente ligado a uma sequência de codificação se ele estiver posicionado de forma a facilitar a tradução. Geralmente, operacionalmente ligado significa que as sequências de DNA a serem ligadas são contíguas, e,
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 110/418
104/324 no caso de um líder secretor, contíguas e em fase de leitura. Todavia, os potencializadores não precisam ser contíguos. A ligação é obtida por meio da ligação em sítios de restrição convenientes. Se esses sítios não existirem, os adaptadores ou ligantes de oligonucleotídeos sintéticos são usados de acordo com a prática convencional.
[195] Identidade de sequência de aminoácidos percentual (%) em relação a uma sequência polipeptídica identificada neste documento é definida como a porcentagem de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata que é idêntica aos resíduos de aminoácidos polipeptídicos sendo comparados, após o alinhamento das sequências e introdução de lacunas, se necessário, para alcançar a identidade de sequência percentual máxima, e não levando em consideração quaisquer substituições conservatives como parte da identidade de sequência. O alinhamento para fins de determinação do percentual de identidade da sequência de aminoácidos pode ser atingido de muitas formas no estado da técnica, por exemplo, usando software de computador livre, tal como BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Aqueles versados na técnica podem determinar parâmetros apropriados para medir o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para alcançar o alinhamento máximo em relação ao comprimento total das sequências sendo comparadas. Para a finalidade deste documento, no entanto, os valores de porcentagem de identidade de sequência de aminoácidos são gerados usando o programa de computador de comparação de sequência ALIGN-2. O programa de computador de comparação de sequência ALIGN-2 é da Genentech, Inc., e o código fonte foi depositado com a documentação do usuário no U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, onde está registrado sob número de registro U.S. Copyright Registration TXU510087. O programa ALIGN-2 está disponível publicamente através da Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia. O programa ALIGN-2 deve ser compilado para
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 111/418
105/324 utilização num sistema operativo UNIX, preferencialmente UNIX V4.0D digital. Todos os parâmetros de comparação das sequências são estabelecidos pelo programa ALIGN-2 e não variam.
[196] Em situações em que o ALIGN-2 é empregado para a comparações de sequências de aminoácidos, a porcentagem de identidade de sequência de aminoácidos de uma determinada sequência de aminoácidos A em relação a uma determinada sequência de aminoácidos B (que pode, por outro lado, ser expressa como uma determinada sequência de aminoácidos A que tem ou compreende uma determina porcentagem de identidade de sequência de aminoácido em relação a uma determinada sequência de aminoácidos B) é calculada da seguinte forma:
[197] 100 vezes a fração X/Y [198] onde X é o número de resíduos de aminoácidos marcados como correspondências idênticas pelo programa de sequência de alinhamento ALIGN-2 no alinhamento do programa de A e B, e onde Y é o número total de resíduos de aminoácidos em B. Será apreciado que onde o comprimento da sequência de aminoácidos A não for igual ao comprimento da sequência de aminoácidos B, o % de identidade de sequência de aminoácidos de A para B não será igual ao % de sequência de aminoácidos de B para A. A menos que especificamente indicado de outra forma, todos os valores % de identidade sequência de aminoácidos usados neste documento serão obtidos como descrito no parágrafo imediatamente anterior usando o programa de computador ALIGN-2.
[199] As sequências de aminoácidos descritas neste documento são sequências de aminoácidos contíguas, a menos que especificado de outra forma.
[200] O termo vetor, como utilizado neste documento, pretende referir-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 112/418
106/324 nucleico ao qual foi ligada. Um tipo de vetor é um plasmídeo, que remete a uma alça de DNA de fita dupla circular na qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Um outro tipo de vetor é um vetor de fago. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados no genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira em que eles são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos, possuindo uma origem bacteriana da replicação e vetores de mamíferos epissômicos). Outros vetores (por exemplo, vetores de mamíferos não epissômicos) são integrados ao genoma de uma célula hospedeira, mediante a introdução na célula hospedeira e, assim, são replicados junto com o genoma hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais estão ligados operacionalmente. Tais vetores são aqui referidos como vetores de expressão recombinantes (ou simplesmente vetores recombinantes ou vetores de expressão). Em geral, os vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinante estão frequentemente sob a forma de plasmídeos. Na presente descrição, “plasmídeo” e “vetor” podem ser usados de forma intercambiável.
II. Composições e Métodos [201] Em um aspecto, a invenção é baseada, em parte, em novos anticorpos que se ligam à triptase. Noutro aspecto, a invenção baseiase, em parte, na descoberta de que resíduos particulares (por exemplo, resíduos de HVR, tais como HVR-H3 W100, que se refere a W100 do domínio VH do anticorpo anti-triptase hu31A.v11) de anticorpos anti-triptase podem ser susceptíveis à oxidação. A invenção fornece composições farmacêuticas que incluem antioxidantes (por exemplo, N-acetiltriptofano e/ou metionina) para reduzir ou prevenir a oxidação de anticorpos descritos neste documento (por exemplo, anticorpos anti-triptase). Outros excipientes antioxidantes adequados incluem, sem limitação, triptofano livre, ciclodextrinas, Trolox (ácido 6-hidroxi
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 113/418
107/324
2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico), piridoxina, polióis (por exemplo, manitol) e quelantes de metais (por exemplo EDTA). Ver, por exemplo, Ji et al., Biotechnology 98: 4485-4500, 2009. Anticorpos e composições farmacêuticas da invenção são úteis, por exemplo, para o diagnóstico e/ou tratamento de distúrbios (por exemplo, um distúrbio pulmonar, um distúrbio autoimune, um distúrbio inflamatório, um distúrbio fibrótico, um distúrbio granulocítico (neutrofílico ou eosinofílico), um distúrbio monocítico, um distúrbio linfocítico, um distúrbio associado com números aumentados ou distribuição de células residentes normais ou aberrantes de tecido (tais como mastócitos, macrófagos ou linfócitos) ou células estromais (tais como fibroblastos, miofibroblastos, células musculares lisas, epitélio ou endotélio ou um distúrbio associado à triptase ou um distúrbio mediado pela triptase. Noutro aspecto, a invenção fornece composições farmacêuticas liofilizadas para reduzir ou eliminar a oxidação de anticorpos descritos neste documento (por exemplo, anticorpos anti-triptase).
A. Anticorpos Anti-triptase Exemplares [202] A invenção fornece anticorpos isolados que se ligam à triptase. Em certas modalidades, um anticorpo anti-triptase da invenção liga-se à triptase com um Kode cerca de 100 nM ou inferior (por exemplo, 100 nM ou inferior, 10 nM ou inferior, 1 nM ou inferior, 100 pM ou inferior, 10 pM ou inferior, 1 pM ou inferior, ou 0,1 pM ou inferior). Em algumas modalidades, o anticorpo liga-se à triptase com um Kd de 10 nM ou inferior (por exemplo, 10 nM ou inferior, 1 nm ou inferior, 100 pM ou inferior, 10 pM ou inferior, 1 pM ou inferior, ou 0,1 pM ou inferior). Em algumas modalidades, o anticorpo liga-se à triptase com um Kd de 1 nM ou inferior (por exemplo, 1 nm ou inferior, 100 pM ou inferior, 10 pM ou inferior, 1 pM ou inferior, ou 0,1 pM ou inferior). Em algumas modalidades, o anticorpo liga-se à triptase com um Kd de 0,5 nM ou inferior (por exemplo, 0,5 nm ou inferior, 400 pM ou inferior, 300 pM ou inferior,
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 114/418
108/324
200 pM ou inferior, 100 pM ou inferior, 50 pM ou inferior, 25 pM ou inferior, 10 pM ou inferior, 1 pM ou inferior, ou 0,1 pM ou inferior). Em algumas modalidades, o anticorpo liga-se à triptase com um Kd entre cerca de 0,1 nM a cerca de 0,5 nM (por exemplo, cerca de 0,1 nM, cerca de 0,2 nM, cerca de 0,3 nM, cerca de 0,4 nM ou cerca de 0,5 nM). Em algumas modalidades, o anticorpo liga-se à triptase com um Kd entre aproximadamente 1 pM a cerca de 500 pM, cerca de 1 pM a cerca de 400 pM, cerca de 1 pM a cerca de 300 pM, cerca de 1 pM a cerca de 200 pM, cerca de 1 pM a cerca de 100 pM, cerca de 1 pM a cerca de 50 pM, cerca de 25 pM a cerca de 500 pM, cerca de 25 pM a cerca de 400 pM, cerca de 25 pM a cerca de 300 pM, cerca de 25 pM a cerca de 100 pM, cerca de 50 pM a cerca de 500 pM, cerca de 50 pM a cerca de 450 pM, cerca de 50 pM a cerca de 425 pM, cerca de 50 pM a cerca de 400 pM, cerca de 50 pM a cerca de 375 pM, cerca de 50 pM a cerca de 350 pM, cerca de 50 pM a cerca de 325 pM, cerca de 50 pM a cerca de 300 pM, cerca de 50 pM a cerca de 275 pM, cerca de 50 pM a cerca de 250 pM, cerca de 50 pM a cerca de 200 pM, cerca de 50 pM a cerca de 180 pM, cerca de 50 pM a cerca de 175 pM, cerca de 50 pM a cerca de 150 pM, cerca de 50 pM a cerca de 125 pM, cerca de 50 pM a cerca de 100 pM, cerca de 50 pM a cerca de 75 pM,
cerca de 100 pM a cerca de 500 pM, cerca de 100 pM a cerca de 475 pM,
cerca de 100 pM a cerca de 450 pM, cerca de 100 pM a cerca de 425 pM,
cerca de 100 pM a cerca de 400 pM, cerca de 100 pM a cerca de 375 pM,
cerca de 100 pM a cerca de 350 pM, cerca de 100 pM a cerca de 325 pM,
cerca de 100 pM a cerca de 300 pM, cerca de 100 pM a cerca de 275 pM,
cerca de 100 pM a cerca de 250 pM, cerca de 100 pM a cerca de 225 pM,
cerca de 100 pM a cerca de 200 pM, cerca de 100 pM a cerca de 180 pM,
cerca de 100 pM a cerca de 175 pM, cerca de 100 pM a cerca de 150 pM,
cerca de 100 pM a cerca de 125 pM, cerca de 150 pM a cerca de 500 pM,
cerca de 150 pM a cerca de 475 pM, cerca de 150 pM a cerca de 450 pM,
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 115/418
109/324
cerca de 150 pM a cerca de 425 pM, cerca de 150 pM a cerca de 400 pM,
cerca de 150 pM a cerca de 375 pM, cerca de 150 pM a cerca de 350 pM,
cerca de 150 pM a cerca de 325 pM, cerca de 150 pM a cerca de 300 pM,
cerca de 150 pM a cerca de 375 pM, cerca de 150 pM a cerca de 350 pM,
cerca de 150 pM a cerca de 325 pM, cerca de 150 pM a cerca de 300 pM,
cerca de 150 pM a cerca de 275 pM, cerca de 150 pM a cerca de 225 pM,
cerca de 150 pM a cerca de 200 pM, cerca de 175 pM a cerca de 500 pM,
cerca de 175 pM a cerca de 475 pM, cerca de 175 pM a cerca de 450 pM,
cerca de 175 pM a cerca de 425 pM, cerca de 175 pM a cerca de 400 pM,
cerca de 175 pM a cerca de 375 pM, cerca de 175 pM a cerca de 350 pM,
cerca de 175 pM a cerca de 325 pM, cerca de 175 pM a cerca de 300 pM ou cerca de 180 pM a cerca de 400 pM. Em algumas modalidades, o anticorpo liga a triptase com um Kd de cerca de 0,4 nM. Em algumas modalidades, o anticorpo liga a triptase com um Kd de cerca de 0,2 nM. Em algumas modalidades, o anticorpo liga a triptase com um Kd de cerca de 0,18 nM. Em algumas modalidades, a triptase é triptase humana, por exemplo, beta triptase humana (por exemplo, beta triptase 1 humana, beta triptase 2 humana e/ou beta triptase 3 humanas). Em algumas modalidades, o Kd é determinado num ensaio BIACORE® SPR. Em certas modalidades, a triptase é triptase alfa humana. Em certas modalidades, o anticorpo é um anticorpo humano ou humanizado.
[203] Noutro exemplo, em algumas modalidades, um anticorpo anti-triptase da invenção (incluindo qualquer um dos anticorpos anti-triptase anteriores) é capaz de inibir uma atividade da triptase. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-triptase da invenção é capaz de inibir uma atividade proteolítica da triptase, por exemplo, como determinado num ensaio enzimático de triptase in vitro. Em algumas modalidades, um substrato artificial, por exemplo, o peptídeo sintético S-2288 pode ser utilizado como substrato
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 116/418
110/324 num ensaio enzimático de triptase in vitro. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-triptase da invenção é capaz de inibir a atividade da triptase humana com uma concentração inibidora meio-máxima (IC50) de cerca de 100 nM ou inferior (por exemplo, 100 nM ou inferior, 10 nM ou inferior, 5 nM ou inferior, 2,5 nM ou inferior, 1 nM ou inferior, 100 pM ou inferior, 10 pM ou inferior, 1 pM ou inferior, ou 0,1 pM ou inferior) conforme determinado por um ensaio enzimático de triptase in vitro, por exemplo, utilizando S-2288 como substrato. Em algumas modalidades, o anticorpo é capaz de inibir a atividade da triptase humana com uma IC50 de cerca de 10 nM ou inferior (por exemplo, 10 nM ou inferior, 5 nM ou inferior, 2,5 nM ou inferior, 1 nM ou inferior, 100 pM ou inferior, 10 pM ou inferior, 1 pM ou inferior, ou 0,1 pM ou inferior) conforme determinado por um ensaio enzimático de triptase in vitro, por exemplo, utilizando S-2288 como substrato. Em algumas modalidades, o anticorpo capaz de inibir a atividade da triptase humana com uma IC50 de cerca de 2,5 nM ou inferior (p.ex., 2,5 nM ou inferior, 1 nM ou inferior, 100 pM ou inferior, 10 pM ou inferior, 1 pM ou inferior, ou 0,1 pM ou inferior), conforme determinado por um ensaio enzimático de triptase in vitro, por exemplo, utilizando S-2288 como substrato. Em algumas modalidades, o anticorpo é capaz de inibir a atividade da triptase humana com uma IC50 de cerca de 0,1 nM a cerca de 2 nM (por exemplo, cerca de 0,1 nM, cerca de 0,2 nM, cerca de 0,3 nM, cerca de 0,4 nM, cerca de 0,5 nM, cerca de 0,6 nM, cerca de 0,7 nM, cerca de 0,8 nM, cerca de 0,9 nM, cerca de 1,0 nM, cerca de 1,1 nM, cerca de 1,2 nM, cerca de 1,3 nM, cerca de 1,4 nM, cerca de 1,5 nM, cerca de 1,6 nM, cerca de 1,7 nM, cerca de 1,8 nM, cerca de 1,9 nM, ou cerca de 2,0 nM). Em algumas modalidades, o anticorpo é capaz de inibir a atividade da triptase humana com uma IC50 de cerca de 0,5 nM a cerca de 2,5 nM (p.ex., cerca de 0,5 nM, cerca de 0,6 nM, cerca de 0,7 nM, cerca de 0,8 nM, cerca de 0,9 nM, cerca de 1,0 nM, cerca de 1,1 nM, cerca de 1,2 nM, cerca de 1,3 nM, cerca de 1,4 nM, cerca de 1,5 nM,
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 117/418
111/324 cerca de 1,6 nM, cerca de 1,7 nM, cerca de 1,8 nM, cerca de 1,9 nM, cerca de 2,0 nM, cerca de 2,1 nM, cerca de 2,2 nM, cerca de 2,3 nM, cerca de 2,4 nM, ou cerca de 2,5 nM). Em algumas modalidades, o anticorpo é capaz de inibir a atividade do triptase humano com uma IC50 de aproximadamente 1 pM a cerca de 2,5 nM, cerca de 25 pM a cerca de 2,5 nM, cerca de 50 pM a cerca de 2,5 nM, cerca de 75 pM a cerca de 2,5 nM, cerca de 100 pM a cerca de 2,5 nM, cerca de 125 pM a cerca de 2,5 nM, cerca de 150 pM a cerca de 2,5 nM, cerca de 175 pM a cerca de 2,5 nM, cerca de 200 pM a cerca de 2,5 nM, cerca de 225 pM a cerca de 2,5 nM, cerca de 250 pM a cerca de 2,5 nM, cerca de 300 pM a cerca de 2,5 nM, cerca de 325 pM a cerca de 2,5 nM, cerca de 325 pM a cerca de 2,5 nM, cerca de 350 pM a cerca de 2,5 nM, cerca de 375 pM a cerca de 2,5 nM, cerca de 400 pM a cerca de 2,5 nM, cerca de 425 pM a cerca de 2,5 nM, cerca de 450 pM a cerca de 2,5 nM, cerca de 500 pM a cerca de 2,5 nM, cerca de 450 pM a cerca de 2,5 nM, cerca de 500 pM a cerca de 2,5 nM, cerca de 550 pM a cerca de 2,5 nM, cerca de 600 pM a cerca de 2,5 nM, cerca de 650 pM a cerca de 2,5 nM, cerca de 700 pM a cerca de 2,5 nM, cerca de 750 pM a cerca de 2,5 nM, cerca de 800 pM a cerca de 2,5 nM, cerca de 850 pM a cerca de 2,5 nM, cerca de 900 pM a cerca de 2,5 nM, cerca de 950 pM a cerca de 2,5 nM, cerca de 1 nM a cerca de 2,5 nM, cerca de 1,1 nM a cerca de 2,5 nM, cerca de 1,2 nM a cerca de 2,5 nM, cerca de 1,3 nM a cerca de 2,5 nM, cerca de 1,4 nM a cerca de 2,5 nM, cerca de 1,5 nM a cerca de 2,5 nM, cerca de 1,6 nM a cerca de 2,5 nM, cerca de 1,7 nM a cerca de 2,5 nM, cerca de 1,8 nM a cerca de 2,5 nM, cerca de 1,9 nM a cerca de 2,5 nM, cerca de 2,0 nM a cerca de 2,5 nM, cerca de 2,1 nM a cerca de 2,5 nM, cerca de 2,2 nM a cerca de 2,5 nM, cerca de 2,3 nM a cerca de 2,5 nM, cerca de 500 pM a cerca de 1,9 pM, cerca de 750 pM a cerca de 1,9 pM, cerca de 1 nM a cerca de 1,9 pM, cerca de 1,25 nM a cerca de 1,9 pM, cerca de 1,5 nM a cerca de 1,9 pM, cerca de 1 nM a cerca de 1,85 nM, cerca de 1,25 nM a cerca de 1,85 nM, cerca de
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 118/418
112/324
1,25 nM a cerca de 1,85 nM, cerca de 1,5 nM a cerca de 1,85 nM, cerca de 1 nM a cerca de 1,8 nM, cerca de 1,25 nM a cerca de 1,8 nM, cerca de 1,5 nM a cerca de 1,8 nM ou cerca de 1,6 nM a cerca de 1,8 nM. Em algumas modalidades, o anticorpo é capaz de inibir a atividade da triptase humana com um IC50 de cerca de 1,8 nM. Em outras modalidades, o anticorpo é capaz de inibir a atividade da triptase humana com uma IC50 de cerca de 0,5 nM a cerca de 1 nM (p. Ex., cerca de 0,5 nM, cerca de 0,6 nM, cerca de 0,7 nM, cerca de
0,8 nM ou cerca de 0,9 nM cerca de 1,0 nM). Em algumas modalidades, o anticorpo é capaz de inibir a atividade da triptase humana com uma IC50 de cerca de 1 pM a cerca de 1 nM, cerca de 25 pM a cerca de 1 nM, cerca de 50 pM a cerca de 1 nM, cerca de 75 pM a cerca de 1 nM, cerca de 100 pM a cerca de 1 nM, cerca de 125 pM a cerca de 1 nM, cerca de 150 pM a cerca de 1 nM, cerca de 175 pM a cerca de 1 nM, cerca de 200 pM a cerca de 1 nM, cerca de
225 pM a cerca de 1 nM, cerca de 250 pM a cerca de 1 nM, cerca de 300 pM a cerca de 1 nM, cerca de 325 pM a cerca de 1 nM, cerca de 350 pM a cerca de nM, cerca de 375 pM a cerca de 1 nM, cerca de 400 pM a cerca de 1 nM, cerca de 425 pM a cerca de 1 nM, cerca de 450 pM a cerca de 1 nM, cerca de
500 pM a cerca de 1 nM, cerca de 450 pM a cerca de 1 nM, cerca de 500 pM a cerca de 1 nM, cerca de 550 pM a cerca de 1 nM, cerca de 600 pM a cerca de nM, cerca de 650 pM a cerca de 1 nM, cerca de 700 pM a cerca de 1 nM,
cerca de 750 pM, cerca de 250 pM a cerca de 800 pM, cerca de 300 pM
cerca de 800 pM, cerca de 325 pM a cerca de 800 pM, cerca de 325 pM
cerca de 800 pM, cerca de 350 pM a cerca de 800 pM, cerca de 375 pM
cerca de 800 pM, cerca de 400 pM a cerca de 800 pM, cerca de 425 pM
cerca de 800 pM, cerca de 450 pM a cerca de 800 pM, cerca de 500 pM
cerca de 800 pM, cerca de 450 pM a cerca de 800 pM, cerca de 500 pM
cerca de 800 pM, cerca de 550 pM a cerca de 800 pM, cerca de 600 pM
cerca de 800 pM, cerca de 650 pM a cerca de 800 pM, cerca de 700 pM
a a
a a
a a
a a
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 119/418
113/324 cerca de 800 pM, cerca de 750 pM a cerca de 800 pM, cerca de 1 pM a cerca de 600 pM, cerca de 25 pM a cerca de 600 pM, cerca de 50 pM a cerca de 600 pM, cerca de 75 pM a cerca de 600 pM, cerca de 100 pM a cerca de 600 pM, cerca de 125 pM a cerca de 600 pM, cerca de 150 pM a cerca de 600pM, cerca de 175 pM a cerca de 600 pM, cerca de 200 pM a cerca de 600pM, cerca de 225 pM a cerca de 600 pM, cerca de 250 pM a cerca de 600pM, cerca de 300 pM a cerca de 600 pM, cerca de 325 pM a cerca de 600pM, cerca de 325 pM a cerca de 600 pM, cerca de 350 pM a cerca de 600pM, cerca de 375 pM a cerca de 600 pM, cerca de 400 pM a cerca de 600pM, cerca de 425 pM a cerca de 600 pM, cerca de 450 pM a cerca de 600pM, cerca de 500 pM a cerca de 600 pM, cerca de 450 pM a cerca de 600pM, cerca de 500 pM a cerca de 600 pM ou cerca de 550 pM a cerca de 600 pM.
Em algumas modalidades, o anticorpo é capaz de inibir a atividade da triptase humana com um IC50 de cerca de 0,6 nM. Em algumas modalidades, a triptase é triptase humana, por exemplo, beta triptase humana (por exemplo, beta triptase 1 humana, beta triptase 2 humana e/ou beta triptase 3 humanas). Em alguns casos, a atividade inibidora do anticorpo é determinada aqui descrita, por exemplo, nos Exemplos (por exemplo, Exemplo 1, particularmente Seção(A)(viii)(a)), ou por outras abordagens conhecidas na técnica. Em certas modalidades, o anticorpo é um anticorpo humano ou humanizado. Em algumas modalidades, o anticorpo capaz de inibir a atividade da triptase humana como um anticorpo monovalente ou um seu fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, um Fab). Em outras modalidades, o anticorpo é capaz de inibir a atividade da triptase humana como um anticorpo bivalente (por exemplo, um anticorpo IgG (por exemplo, um anticorpo lgG1 ou lgG4) ou um F(ab')2).
[204] Em alguns casos, qualquer um dos anticorpos anti-triptase descritos neste documento pode inibir a contração estimulada por triptase de células do músculo liso das vias aéreas primárias humanas. Noutros casos,
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 120/418
114/324 qualquer um dos anticorpos anti-triptase descritos neste documento pode inibir a contração estimulada por triptase de células do músculo liso das vias aéreas primárias humanas. Ainda noutros casos, qualquer um dos anticorpos antitriptase descritos neste documento pode inibir a desgranulação de mastócitos estimulada por triptase ou IgE e/ou liberação de histamina. Noutros casos, qualquer dos anticorpos anti-triptase aqui descritos pode reduzir a quantidade de triptase ativa (por exemplo, numa amostra tal como fluido de lavagem broncoalveolar ou uma amostra de nasossorção), por exemplo, após administração a um sujeito. Por exemplo, qualquer um dos anticorpos antitriptase aqui descritos pode reduzir a quantidade de triptase ativa em cerca de 1%, cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou mais. A redução pode ser relativa a uma quantidade de referência de triptase ativa, por exemplo, a quantidade de triptase ativa numa amostra antes da administração do anticorpo anti-triptase.
[205] Em alguns casos, o anticorpo (por exemplo, o anticorpo anti-triptase) pode incluir pelo menos um, dois, três, quatro, cinco ou seis regiões hipervariáveis (HVRs), selecionadas a partir de:(a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da X1X2GMX3 (SEQ ID NO: 1), em que X1 é Asp ou Ser, X2 é Tyr ou Phe, e X3 é Vai ou His; (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da FISSGSSTVYYADTMKG (SEQ ID NO: 2);(c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da RX1X2X3DWYFDV (SEQ ID NO: 3), em que X1 é Asn ou Asp, X2 é Tyr ou Asn, e X3 é Asp ou Tyr; (d) um HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SASSSVTYMY (SEQ ID NO: 4); (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da RTSDLAS (SEQ ID NO: 5); e
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 121/418
115/324 (f) uma HVR-L3 compreendendo o aminoácido sequência de QHYHSYPLT (SEQ ID NO: 6), ou uma combinação de um ou mais dos HVRs acima e uma ou mais variantes respectivos, possuindo pelo menos cerca de 80% de sequências identidade (por exemplo, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86% 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade) para qualquer uma das SEQ IS NOs: 1-6.
[206] Por exemplo, em algumas modalidades, o anticorpo (por exemplo, o anticorpo anti-triptase) pode incluir pelo menos um, dois, três, quatro, cinco ou seis regiões hipervariáveis (HVRs), selecionadas a partir de: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da DYGMV (SEQ ID NO: 7); (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da FISSGSSTVYYADTMKG (SEQ ID NO: 2); (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da RNYDDWYFDV (SEQ ID NO: 8);(d) uma HVRL1 que compreende a sequência de aminoácidos da SASSSVTYMY (SEQ ID NO: 4); (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da RTSDLAS (SEQ ID NO: 5); e (f) uma HVR-L3 compreendendo o aminoácido sequência de QHYHSYPLT (SEQ ID NO: 6), ou uma combinação de um ou mais dos HVRs acima e uma ou mais variantes respectivos, possuindo pelo menos cerca de 80% de sequências identidade (por exemplo, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86% 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade) para qualquer uma das SEQ ID NOS: 2 ou 4-8.
[207] Num exemplo particular, em algumas modalidades, o anticorpo (por exemplo, o anticorpo anti-triptase) pode incluir (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de DYGMV (SEQ ID NO: 7); (b) um HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de FISSGSSTVYYADTMKG (SEQ ID NO:2); (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de RNYDDWYFDV (SEQ ID NO: 8);(d) uma HVRL1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SASSSVTYMY (SEQ ID
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 122/418
116/324
NO: 4); (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de RTSDLAS (SEQ ID NO: 5); e(f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de QHYHSYPLT (SEQ ID NO: 6). Em algumas formas de realização, o anticorpo (por exemplo, o anticorpo anti-triptase) inclui (a) um domínio variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma sequência amino possuindo pelo menos 90% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência), ou a sequência da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9; (b) um domínio variável da cadeia leve (VL) compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade (por exemplo, pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência), ou a sequência da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10; ou (c) um domínio VH como em (a) e um domínio VL como em (b). Em algumas modalidades, o anticorpo (por exemplo, o anticorpo anti-triptase) inclui uma, duas, três ou quatro das seguintes regiões de framework de cadeia pesada (FRs): (a) uma FR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS (SEQ ID NO: 11); (b) um FR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de WVRQAPGKGLEWVA (SEQ ID NO: 12); (c) um FR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTR (SEQ ID NO: 13); e (d) uma FR-H4 compreendendo a sequência de aminoácidos de WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 14). Em algumas modalidades, o anticorpo (por exemplo, o anticorpo anti-triptase) inclui uma, duas, três ou quatro das seguintes FRs de cadeia leve: (a) uma FR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 15); (b) uma FR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de WYQQKPGKSPKPWIY (SEQ ID NO: 16); (c) um FR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 17); e (d) um FR
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 123/418
117/324
L4 compreendendo a sequência de aminoácidos de FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 18). Em algumas modalidades, o anticorpo (por exemplo, o anticorpo antitriptase) inclui um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9 e um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10, tal como o anticorpo hu31A.v11.
[208] Noutro exemplo particular, em algumas modalidades, o anticorpo (por exemplo, o anticorpo anti-triptase) pode incluir (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de DYGMV (SEQ ID NO: 7); (b) um HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de FISSGSSTVYYADTMKG (SEQ ID NO: 2); (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de RDNYDWYFDV (SEQ ID NO: 29);(d)uma HVRL1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SASSSVTYMY (SEQ ID NO: 4); (e)uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de RTSDLAS (SEQ ID NO: 5); e(f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de QHYHSYPLT (SEQ ID NO: 6). Em algumas modalidades, o anticorpo (por exemplo, o anticorpo anti-triptase) inclui (a) um domínio variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma sequência amino possuindo pelo menos 90% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência), ou a sequência da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19; (b) um domínio variável da cadeia leve (VL) compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade (por exemplo, pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência), ou a sequência da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20; ou (c) um domínio VH como em (a) e um domínio VL como em (b). Em algumas modalidades, o anticorpo (por exemplo, o anticorpo anti-triptase) inclui uma, duas, três ou quatro das seguintes regiões de framework de cadeia pesada (FRs): (a) uma FR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 124/418
118/324
EVKLVESGGGSVQPGGSRKLSCAASGFTFS (SEQ ID NO: 21); (b) uma FRH2 compreendendo a sequência de aminoácidos de WVRQAPGKGLEWVA (SEQ ID NO: 22); (c) um FR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de RFTISRDNPKNTLFLQMSSLRSEDTAMYYCAR (SEQ ID NO: 23); e (d) uma FR-H4 compreendendo a sequência de aminoácidos de WGTGTTVTVSS (SEQ ID NO: 24). Em algumas modalidades, o anticorpo (por exemplo, o anticorpo anti-triptase) inclui uma, duas, três ou quatro das seguintes FRs de cadeia leve: (a) uma FR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de QIVLTQSPAIMSASPGEKVTISC (SEQ ID NO: 25); (b) uma FR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de WYQQKPGSSPKPWIY (SEQ ID NO: 26); (c) uma FR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de GVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYC (SEQ ID NO: 27); e (d) uma FR-L4 compreendendo a sequência de aminoácidos de FGAGTKLELK (SEQ ID NO: 28). Em algumas modalidades, o anticorpo (por exemplo, o anticorpo anti-triptase) inclui um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19 e um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20, tal como o anticorpo 31a.
[209] Em alguns casos, o anticorpo (por exemplo, o anticorpo anti-triptase) inclui (a) um domínio variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma sequência amino possuindo pelo menos 90% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência), ou a sequência da sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 9, 101, 102, 103, e 104; (b) um domínio variável da cadeia leve (VL) compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade (por exemplo, pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência), ou a sequência da sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 10, 105 e 106; ou (c) um domínio VH como em
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 125/418
119/324 (a) e um domínio VL como em (b). Por exemplo, em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 98 e um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 102. Noutros casos, o anticorpo compreende um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 98 e um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10. Noutros casos, o anticorpo compreende um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 98 e um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 103. Noutros casos, o anticorpo compreende um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 99 e um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 102. Noutros casos, o anticorpo compreende um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 99 e um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10. Noutros casos, o anticorpo compreende um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 99 e um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 103. Noutros casos, o anticorpo compreende um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 100 e um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 102. Noutros casos, o anticorpo compreende um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 100 e um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10. Noutros casos, o anticorpo compreende um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 100 e um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 103. Noutros casos, o anticorpo compreende um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9 e um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 102. Noutros casos, o anticorpo
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 126/418
120/324 compreende um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9 e um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10. Noutros casos, o anticorpo compreende um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9 e um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 103. Noutros casos, o anticorpo compreende um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 101 e um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 102. Noutros casos, o anticorpo compreende um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 101 e um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10. Noutros casos, o anticorpo compreende um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 101 e um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 103.
[210] Em alguns casos, qualquer um dos anticorpos anteriores se liga a um epítopo da triptase beta 1 humana compreendendo pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, ou todos os quatro resíduos selecionados do grupo que consiste em His51, Val80, Lys81 e Asp82 de SEQ ID NO: 71. Em algumas modalidades, o anticorpo se liga a um epítopo na beta triptase 1 humana compreendendo pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, ou todos os quatro resíduos selecionados do grupo consistindo em His51, Val80, Lys81 e Asp82 da SEQ ID NO: 71. Em algumas modalidades, o anticorpo se liga a um epítopo na beta triptase 1 humana compreendendo His51 e pelo menos um, pelo menos dois ou todos os três resíduos selecionados do grupo consistindo em Vai 80, Lys81 e Asp82 da SEQ ID NO: 71. Em algumas modalidades, o epítopo na beta triptase 1 humana compreende ainda um ou mais resíduos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em Gln67, Leu83, Ala84, Ala85, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu128, Glu129
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 127/418
121/324 e Pro130 da SEQ ID NO: 71. Em algumas modalidades, o epítopo na beta triptase 1 humana compreende pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez, pelo menos onze, ou todos os doze resíduos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em Gln67, Leu83, Ala84, Ala85, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu128, Glu129 e Pro130 da SEQ ID NO: 71. Em algumas modalidades, o epítopo na triptase beta 1 humana compreende His51, Gln67, Val80, Lys81, Asp82, Leu83, Ala84, Ala85, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu128, Glu129 e Pro130 da SEQ ID NO: 71.Em algumas modalidades, o epítopo é relativo a um monômero ou tetrâmero de triptase beta 1 humano. Em algumas modalidades, o epítopo é determinado por um modelo de cristalografia de raios X. Em algumas modalidades, o anticorpo é capaz de dissociar tanto a pequena interface da triptase beta tetramérica humana 1 como a grande interface da triptase beta tetramérica humana 1.
[211] Em alguns casos, qualquer um dos anticorpos antitriptase anteriores inclui um parátopo que se liga a triptase (por exemplo, triptase beta 1 humana) que inclui um ou mais resíduos de aminoácidos (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 19 resíduos de aminoácidos) selecionados do grupo consistindo nos resíduos de aminoácidos da região variável de cadeia leve Val30; Thr31; Tyr32; Tyr34; Arg50; Tyr90; His92; Ser93; e Tyr94 e os resíduos de aminoácidos da região variável da cadeia pesada Phe50; Ser52; Gly53; Ser54; Ser55; Thr56; Tyr58; Arg95; Tyr97; e Asp98.
[212] Por exemplo, em alguns casos, o anticorpo anti-triptase inclui um parátopo que se liga a triptase (por exemplo, triptase beta 1 humana) que inclui os resíduos de aminoácidos da região variável de cadeia leve Val30, Thr31, Tyr32, Tyr34, Arg50, Tyr90, His92, Ser93. e Tyr94 ou os resíduos de aminoácidos de região variável de cadeia pesada Phe50, Ser52, Gly53, Ser54,
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 128/418
122/324
Ser55, Thr56, Tyr58, Arg95, Tyr97 e Asp98. Em alguns casos, o anticorpo antitriptase inclui um parátopo que se liga a triptase (por exemplo, triptase beta 1 humana) que inclui os resíduos de aminoácidos da região variável de cadeia leve Val30, Thr31, Tyr32, Tyr34, Arg50, Tyr90, His92, Ser93 e Tyr94 e os resíduos de aminoácidos de região variável de cadeia pesada Phe50, Ser52, Gly53, Ser54, Ser55, Thr56, Tyr58, Arg95, Tyr97 e Asp98.
[213] Em alguns casos, o anticorpo (por exemplo, o anticorpo anti-triptase) pode incluir pelo menos um, dois, três, quatro, cinco ou seis regiões hipervariáveis (HVRs), selecionadas a partir de: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da GYAIT (SEQ ID NO: 30);(b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da GISSAATTFYSSWAKS (SEQ ID NO: 31);(c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da DPRGYGAALDRLDL (SEQ ID NO: 32);(d)uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da QSIKSVYNNRLG (SEQ ID NO: 33); (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de ETSILTS (SEQ ID NO: 34); e(f) uma HVR-L3 compreendendo o aminoácido sequência AGGFDRSGDTT (SEQ ID NO: 35), ou uma combinação de um ou mais dos HVRs acima e uma ou mais variantes respectivos, possuindo pelo menos cerca de 80% de sequências identidade (por exemplo, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86% 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade) para qualquer uma das SEQ ID NOs: 30-35.
[214] Em alguns casos, o anticorpo (por exemplo, o anticorpo anti-triptase) inclui (a) um domínio variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma sequência amino possuindo pelo menos 90% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência), ou a sequência da sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs:36, 47, 48, 49,
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 129/418
123/324
50, 51, e 52; (b) um domínio variável da cadeia leve (VL) compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade (por exemplo, pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência), ou a sequência da sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 37, 53, 58 ou 59; ou (c) um domínio VH como em (a) e um domínio VL como em (b).
[215] Em alguns casos, qualquer um dos anticorpos anteriores (por exemplo, os anticorpos anti-triptase) pode incluir um, dois, três ou quatro das seguintes regiões de framework de cadeia pesada (FRs): (a) uma FR-H1 compreendendo uma sequência amino possuindo pelo menos 90% de identidade de (por exemplo, pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência), ou a sequência de, a sequência de aminoácidos da EVQLVESGPGLVKPSETLSLTCTVSRFSLI (SEQ ID NO: 38); (b) uma FR-H2 compreendendo uma sequência amino possuindo pelo menos 90% de identidade de (por exemplo, pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência), ou a sequência de, a sequência de aminoácidos da WX-iRQPPGKGLEWIG (SEQ ID NO: 39), onde Xi é lie ou Vai; (c) um FR-H3, composto por uma sequência de aminoácidos ter pelo menos 90% de identidade de sequência para (por exemplo, pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência), ou a sequência de, a sequência de aminoácidos da RX1TISX2DTSKNQX3SLKLSSVTAADTAVYX4CAR (SEQ ID NO: 40), em que X1 é Vai ou Ser, X2 é Arg ou Vai, X3 é Vai ou Phe, e X4 é Tyr ou Phe; e (d) uma FR-H4 compreendendo uma sequência amino possuindo pelo menos 90% de identidade de sequência com (por exemplo, pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência), ou a sequência da sequência de aminoácidos de WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 41).
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 130/418
124/324 [216] Por exemplo, em alguns casos, qualquer um dos anticorpos anteriores (por exemplo, anticorpos anti-triptase) pode incluir uma, duas, três ou quatro das seguintes FRs de cadeia pesada: (a) uma FR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de EVQLVESGPGLVKPSETLSLTCTVSRFSLI (SEQ ID NO: 38); (b) uma FR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de WIRQPPGKGLEWIG (SEQ ID NO: 42); (c) uma FR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de RVTISRDTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAR (SEQ ID NO: 43); e (d) uma FR-H4 compreendendo a sequência de aminoácidos de WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 41).
[217] Noutro exemplo, em alguns casos, qualquer um dos anticorpos anteriores (por exemplo, anticorpos anti-triptase) pode incluir uma, duas, três ou quatro das seguintes FR da cadeia pesada: (a) uma FR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSRFSLI (SEQ ID NO: 44); (b) uma FR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de WVRQAPGKGLEWIG (SEQ ID NO: 45); (c) uma FR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de RSTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCAR (SEQ ID NO: 46); e (d) uma FR-H4 compreendendo a sequência de aminoácidos de WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 41).
[218] Noutro exemplo, em alguns casos, qualquer um dos anticorpos anteriores (por exemplo, anticorpos anti-triptase) pode incluir uma, duas, três ou quatro das seguintes FR da cadeia pesada: (a) uma FR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSRFSLI (SEQ ID NO: 44); (b) uma FR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de WVRQAPGKGLEWIG (SEQ ID NO: 45); (c) uma FR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de RSTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCAR (SEQ ID NO: 46); e (d) uma
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 131/418
125/324
FR-H4 compreendendo a sequência de aminoácidos de WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 41).
[219] Em alguns casos, qualquer um dos anticorpos anteriores (por exemplo, os anticorpos anti-tryptase) pode incluir um, dois, três, ou quatro da luz seguir cadeia FRs: (a) um composto por uma sequência de aminoácidos ter pelo menos 90% FR-L1 sequenciar identidade para (por exemplo, pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% identidade de sequência), ou a sequência da sequência de aminoácidos da DX1QX2TQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 60), em que X1 é lie ou Ala, e X2 é Met ou Leu; (b) uma FR-L2 compreendendo uma sequência amino possuindo pelo menos 90% de identidade de (por exemplo, pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência), ou a sequência da sequência de aminoácidos de WYQQKPGKX1PKLLIY (SEQ ID NO: 61), em que X1 é Ala ou Pro; (c) uma FR-L3 compreendendo uma sequência amino possuindo pelo menos 90% de identidade de sequência para (por exemplo, pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência), ou a sequência da sequência de aminoácidos de VPSRFSGSGSX1TDFTLTISSLQPEDFATYX2C (SEQ ID NO: 62), em que X1 é Gly ou Glu, e X2 é Tyr ou Phe; e (d) uma FR-L4 compreendendo uma sequência amino possuindo pelo menos 90% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência), ou a sequência da sequência de aminoácidos de FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 63).
[220] Por exemplo, em casos particulares , qualquer um dos anticorpos anteriores (por exemplo, anticorpos anti-triptase) pode incluir uma, duas, três ou quatro das seguintes FRs de cadeia leve: (a) uma FR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 64); (b) uma FR-L2
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 132/418
126/324 compreendendo a sequência de aminoácidos de WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 65); (c) uma FR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 66); e (d) uma FR-L4 compreendendo a sequência de aminoácidos de FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 63).
[221] Em algumas modalidades, qualquer um dos anticorpos anteriores (por exemplo, anticorpos anti-triptase) pode incluir uma, duas, três ou quatro das seguintes FRs de cadeia leve: (a) uma FR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de AAVLTQTPASVSAAVGGTVSISC (SEQ ID NO: 67); (b) uma FR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de WYQQKPGQPPKLLIY (SEQ ID NO: 68); (c) uma FR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de GVPSRFKGSGSETQFTLTISDVQXiDDAATYFC (SEQ ID NO: 69), em que X1 Cys ou Ala; e (d) uma FR-L4 compreendendo a sequência de aminoácidos de FGQGTKVEIK FGGGTEVWK (SEQ ID NO: 70).
[222] Em alguns casos, o anticorpo (por exemplo, o anticorpo anti-triptase) inclui (a) um domínio variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma sequência amino possuindo pelo menos 90% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência), ou a sequência da sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 36, 47, 48, 49, 50, 51 e 52; (b) um domínio variável da cadeia leve (VL) compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade (por exemplo, pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência), ou a sequência da sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 37, 53, 58 e 59; ou (c) um domínio VH como em (a) e um domínio VL como em (b). Por exemplo, em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 e um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 133/418
127/324 da SEQ ID NO: 37. Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 47 e um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37. Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48 e um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37. Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49 e um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37. Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 50 e um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37. Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 50 e um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37. Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 51 e um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37. Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 52 e um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37. Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 e um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 53. Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 47 e um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 53. Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48 e um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 53. Em alguns
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 134/418
128/324 casos, o anticorpo compreende um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49 e um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 53. Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 50 e um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 53. Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 51 e um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 53. Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 52 e um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 53. Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 e um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 58. Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 47 e um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 58. Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48 e um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 58. Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49 e um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 58. Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 50 e um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 58. Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 51 e um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 58. Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 135/418
129/324 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 e um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 59. Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 47 e um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 59. Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48 e um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 59. Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49 e um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 59. Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 50 e um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 59. Em alguns casos, o anticorpo compreende um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 51 e um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 59.
[223] Noutro exemplo particular, em algumas modalidades, o anticorpo anti-triptase pode incluir (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de GYAIT (SEQ ID NO: 30); (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de GISSAATTFYSSWAKS (SEQ ID NO: 31);(c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de DPRGYGAALDRLDL (SEQ ID NO: 32);(d)uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de QSIKSVYNNRLG (SEQ ID NO: 33); (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de ETSILTS (SEQ ID NO: 34); e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de AGGFDRSGDTT (SEQ ID NO: 35). Em algumas modalidades, o anticorpo antitriptase inclui (a) um domínio variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma sequência amino possuindo pelo menos 90% de identidade de sequência
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 136/418
130/324 a (por exemplo, pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência), ou a sequência da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36; (b) um domínio variável da cadeia leve (VL) compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade para (por exemplo, pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência), ou a sequência da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37; ou (c) um domínio VH como em (a) e um domínio VL como em (b). Em algumas modalidades, o anticorpo anti-triptase inclui uma, duas, três ou quatro das seguintes regiões de framework de cadeia pesada (FRs): (a) uma FR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de EVQLVESGPGLVKPSETLSLTCTVSRFSLI (SEQ ID NO: 38); (b) uma FR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de WIRQPPGKGLEWIG (SEQ ID NO: 42); (c) uma FR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de RVTISRDTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAR (SEQ ID NO: 43); e (d) uma FR-H4 compreendendo a sequência de aminoácidos de WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 41). Em algumas modalidades, o anticorpo anti-triptase inclui uma, duas, três ou quatro das seguintes FRs de cadeia leve: (a) uma FR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 64); (b) uma FR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 65); (c) uma FR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 66); e (d) uma FR-L4 compreendendo a sequência de aminoácidos de FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 63). Em algumas modalidades, o anticorpo anti-triptase inclui um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 e um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37, tal como o anticorpo anti-triptase huE104.v2.
[224] Noutro exemplo particular, em algumas modalidades, o
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 137/418
131/324 anticorpo (por exemplo, o anticorpo anti-triptase) pode incluir (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de GYAIT (SEQ ID NO: 30); (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de GISSAATTFYSSWAKS (SEQ ID NO: 31); (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de DPRGYGAALDRLDL (SEQ ID NO: 32);(d)uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de QSIKSVYNNRLG (SEQ ID NO: 33); (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de ETSILTS (SEQ ID NO: 34); e(f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de AGGFDRSGDTT (SEQ ID NO: 35). Em algumas modalidades, o anticorpo (por exemplo, o anticorpo anti-triptase) inclui (a) um domínio variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma sequência amino possuindo pelo menos 90% de identidade de sequência para (por exemplo, pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência), ou a sequência da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 52; (b) um domínio variável da cadeia leve (VL) compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade para (por exemplo, pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência), ou a sequência da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 53; ou (c) um domínio VH como em (a) e um domínio VL como em (b) . Em algumas modalidades, o anticorpo (por exemplo, o anticorpo antitriptase) inclui uma, duas, três ou quatro das seguintes regiões de framework de cadeia pesada (FRs): (a) uma FR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de QXSLEESGGGLFKPTDTLTLTCTVSRFSLI (SEQ ID NO: 54); (b) uma FR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de WVRQSPENGLEWIG (SEQ ID NO: 55); (c) uma FR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de RSTITRNTNENTVTLKMTSLTAADTATYFCAR (SEQ ID NO: 56); e (d) uma FR-H4 compreendendo a sequência de aminoácidos de WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 57). Em algumas modalidades,
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 138/418
132/324 o anticorpo (por exemplo, o anticorpo anti-triptase) inclui uma, duas, três ou quatro das seguintes FRs de cadeia leve: (a) uma FR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de AAVLTQTPASVSAAVGGTVSISC (SEQ ID NO: 67); (b) uma FR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de WYQQKPGQPPKLLIY (SEQ ID NO: 68); (c) uma FR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de GVPSRFKGSGSETQFTLTISDVQXiDDAATYFC (SEQ ID NO: 69), em que X1 é Cys ou Ala; e (d) uma FR-L4 compreendendo a sequência de aminoácidos de FGQGTKVEIKFGGGTEVWK (SEQ ID NO: 70). Em algumas modalidades, o anticorpo (por exemplo, o anticorpo anti-triptase) inclui um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 52 e um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 53, tal como o anticorpo E104. Em algumas modalidades, o anticorpo (por exemplo, o anticorpo anti-triptase) inclui um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 52 e um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 59.
[225] Em alguns casos, a invenção fornece um anticorpo compreendendo (a) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência amino possuindo pelo menos 90% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência), ou a sequência da sequência de aminoácidos da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 76 e/ou (b) uma cadeia leve compreendendo uma sequência amino possuindo pelo menos 90% de identidade de sequência para (por exemplo, pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência), ou a sequência da sequência de aminoácidos da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 77. Em alguns casos, o anticorpo compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 76 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 77. Em algumas modalidades, a cadeia pesada
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 139/418
133/324 compreende ainda um resíduo de lisina (K) no terminal C.
[226] Em alguns casos, a invenção fornece um anticorpo compreendendo (a) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência amino possuindo pelo menos 90% de identidade de sequência para (por exemplo, pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência), ou a sequência da sequência de aminoácidos da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 78 e/ou (b) uma cadeia leve compreendendo uma sequência amino possuindo pelo menos 90% de identidade de sequência para (por exemplo, pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência), ou a sequência da sequência de aminoácidos da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 79. Em alguns casos, o anticorpo compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 78 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 79. Em algumas modalidades, a cadeia pesada compreende ainda um resíduo de lisina (K) no terminal C.
[227] Em alguns casos, a invenção fornece um anticorpo compreendendo (a) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência amino possuindo pelo menos 90% de identidade de sequência para (por exemplo, pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência), ou a sequência da sequência de aminoácidos da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 80 e/ou (b) uma cadeia leve compreendendo uma sequência amino possuindo pelo menos 90% de identidade de sequência para (por exemplo, pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência), ou a sequência da sequência de aminoácidos da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 81. Em alguns casos, o anticorpo compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 80 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 81. Em algumas modalidades, a cadeia pesada
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 140/418
134/324 compreende ainda um resíduo de lisina (K) no terminal C.
[228] Em alguns casos, a invenção fornece um anticorpo compreendendo (a) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência amino possuindo pelo menos 90% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência), ou a sequência da sequência de aminoácidos da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 82 e/ou (b) uma cadeia leve compreendendo uma sequência amino possuindo pelo menos 90% de identidade de sequência com (por exemplo, pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência), ou a sequência da sequência de aminoácidos da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 83. Em alguns casos, o anticorpo compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 82 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 83. Em algumas modalidades, a cadeia pesada compreende ainda um resíduo de lisina (K) no terminal C.
[229] Em alguns casos, qualquer um dos anticorpos anteriores se liga a um epítopo na triptase beta 1 humana compreendendo pelo menos um, pelo menos dois ou todos os três resíduos selecionados do grupo consistindo em Gln100, Leu101 e Leu102 da SEQ ID NO: 71. Em algumas modalidades, o epítopo na beta triptase 1 humana compreende ainda um ou mais resíduos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em Trp55, Gln67, Asp82, Leu83, Ala84, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu126, Leu127, Glu128, e Glu129 da SEQ ID NO: 71. Em algumas modalidades, o epítopo na beta triptase 1 humana compreende pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez, pelo menos onze, pelo menos doze, pelo menos treze, ou todos os catorze resíduos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em Trp55, Gln67, Asp82, Leu83, Ala84,
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 141/418
135/324
Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu126, Leu127, Glu128 e Glu129 da SEQ ID NO: 71. Em algumas modalidades, o epítopo compreende Gln35, Trp55, Gln67, Asp82, Leu83, Ala84, Arg87, GlnlOO, Leu101, Leu102, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu126, Leu127, Glu128, Glu129 e Arg216 da SEQ ID NO:71. Em algumas modalidades, o epítopo é relativo a um monômero ou tetrâmero de triptase beta 1 humano. Em algumas modalidades, o epítopo é relativo a um tetrâmero da beta triptase 1 humana, e o epítopo na beta triptase 1 humana compreende ainda um ou ambos os Gln35 e Arg216 da SEQ ID NO: 71. Em algumas modalidades, o epítopo é determinado por um modelo de cristalografia de raios X. Em algumas modalidades, o anticorpo é capaz de dissociar a pequena interface e/ou a grande interface da triptase beta 1 humana.
[230] Em alguns casos, qualquer um dos anticorpos anti-thptase anteriores inclui um parátopo que liga triptase (por exemplo, triptase beta 1 humana) que inclui um ou mais resíduos de aminoácidos (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 19 resíduos de aminoácidos) selecionados do grupo consistindo nos resíduos de aminoácidos da região variável de cadeia leve Tyr29; Asn30; Arg32; e Arg94 e os resíduos de aminoácidos da região variável da cadeia pesada Gly31; Tyr32; Ser52; Ser53; Ala54; Thr56; Phe58; Pro96; Arg97; Gly98; Tyr99; e ArglOOe.
[231] Por exemplo, em alguns casos, o anticorpo anti-thptase inclui um parátopo que liga a triptase (por exemplo, triptase beta 1 humana) que inclui resíduos de aminoácidos da região variável de cadeia leve Tyr29; Asn30; Arg32; e Arg94 ou os resíduos de aminoácido da região variável da cadeia pesada Gly31; Tyr32; Ser52; Ser53; Ala54; Thr56; Phe58; Pro96; Arg97; Gly98; Tyr99; e ArglOOe. Em alguns casos, o anticorpo anti-triptase inclui um parátopo que se liga à triptase (por exemplo, triptase beta 1 humana) que inclui resíduos de aminoácidos da região variável de cadeia leve Tyr29; Asn30;
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 142/418
136/324
Arg32; e Arg94 e os resíduos de aminoácidos da região variável da cadeia pesada Gly31; Tyr32; Ser52; Ser53; Ala54; Thr56; Phe58; Pro96; Arg97; Gly98; Tyr99; e ArglOOe.
[232] Em alguns casos, qualquer um dos anticorpos anti-triptase anteriores se liga à triptase humana. Em alguns casos, qualquer um dos anticorpos anteriores se liga a triptase de macaco cynomolgus (cyno). Em alguns casos, o anticorpo liga triptase alfa humana ou triptase beta humana. Em alguns casos, o anticorpo liga triptase beta 1 humana, triptase beta 2 humana ou triptase beta 3 humana.
[233] Noutro aspecto, a invenção fornece anticorpos anti-triptase que se ligam a um epítopo na triptase (por exemplo, triptase beta 1 humana) que inclui um ou mais resíduos de aminoácidos (por exemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6 ou 7 resíduos de aminoácidos) selecionados do grupo consistindo em His51, Val80, Lys81, Asp82, Leu83, Ala84 e Ala85, que podem estar em referência à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 71 ou um aminoácido correspondente de qualquer proteína de triptase. Por exemplo, em algumas modalidades, o anticorpo liga-se a um epítopo na triptase (por exemplo, triptase beta 1 humana) compreendendo pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, ou todos os quatro resíduos selecionados do grupo consistindo em His51, Val80, Lys81 e Asp82 da SEQ ID NO: 71 ou um aminoácido correspondente de qualquer proteína triptase. Em algumas modalidades, o anticorpo liga-se a um epítopo na triptase (por exemplo, triptase beta 1 humana) compreendendo His51 e pelo menos um, pelo menos dois, ou todos os três resíduos selecionados do grupo consistindo em Val80, Lys81 e Asp82 de SEQ ID NO 71 ou um aminoácido correspondente de qualquer proteína triptase. Em algumas modalidades, o epítopo na triptase (por exemplo, triptase beta 1 humana) compreende ainda um ou mais resíduos de aminoácido selecionados do grupo consistindo em Gln67, Leu83, Ala84, Ala85, Arg87, Pro103, Val104, Ser105,
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 143/418
137/324
Arg106, Glu128, Glu129 e Pro130 da SEQ ID NO: 71 ou um aminoácido correspondente de qualquer proteína triptase. Em algumas modalidades, o epítopo na triptase (por exemplo, triptase beta 1 humana) compreende pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez, pelo menos onze, ou todos os doze resíduos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em Gln67, Leu83, Ala84, Ala85, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu128, Glu129 e Pro130 da SEQ ID NO: 71 ou um aminoácido correspondente de qualquer proteína triptase. Em algumas modalidades, o epítopo na triptase (por exemplo, triptase beta 1 humana) compreende His51, Gln67, Val80, Lys81, Asp82, Leu83, Ala84, Ala85, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu128, Glu129 e Pro130 de SEQ ID NO: 71 ou um aminoácido correspondente de qualquer proteína triptase. Em algumas modalidades, o epítopo é relativo a um monômero ou tetrâmero de triptase (por exemplo, tripatase beta 1 humana). Em algumas modalidades, o epítopo é determinado por um modelo de cristalografia de raios X. Em algumas modalidades, o anticorpo é capaz de dissociar tanto a pequena interface da triptase tetraméhca como a grande interface da triptase tetramérica (por exemplo, triptase beta 1 humana).
[234] Ainda noutro aspecto, a invenção fornece anticorpos antitriptase que se ligam a um epítopo na triptase (por exemplo, triptase beta 1 humana) que inclui um ou mais resíduos de aminoácidos (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, ou 7 resíduos de aminoácidos) eleitos do grupo consistindo em GlnlOO, Leu101, Leu102, Pro103, Val104, Ser105 e Arg106, que podem estar em referência à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 71 ou um aminoácido correspondente de qualquer proteína triptase. Em algumas modalidades, o epítopo da triptase (por exemplo, triptase beta 1 humana) compreende ainda um ou mais resíduos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 144/418
138/324
Trp55, Gln67, Asp82, Leu83, Ala84, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu126, Leu127, Glu128 e Glu129 da SEQ ID NO: 71 ou um aminoácido correspondente de qualquer proteína triptase. Em algumas modalidades, o epítopo da triptase (por exemplo, triptase beta 1 humana) compreende pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez, pelo menos onze, pelo menos doze, pelo menos treze, ou todos os quatorze resíduos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em Trp55, Gln67, Asp82, Leu83, Ala84, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu126, Leu127, Glu128 e Glu129 da SEQ ID NO: 71 ou um aminoácido correspondente de qualquer proteína triptase. Em algumas modalidades, o epítopo compreende Gln35, Trp55, Gln67, Asp82, Leu83, Ala84, Arg87, GlnWO, Leu101, Leu102, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu126, Leu127, Glu128, Glu129 e Arg216 da SEQ ID NO:71 ou um aminoácido correspondente de qualquer proteína triptase. Em algumas modalidades, o epítopo é relativo a um monômero ou tetrâmero de triptase (por exemplo, tripatase beta 1 humana). Em algumas modalidades, o epítopo é relativo a um tetrâmero, e o epítopo na triptase (por exemplo, triptase beta 1 humana) compreende ainda um ou ambos de Gln35 e Arg216 da SEQ ID NO: 71 ou um aminoácido correspondente de qualquer proteína triptase. Em algumas modalidades, o epítopo é determinado por um modelo de cristalografia de raios X. Em algumas modalidades, o anticorpo é capaz de dissociar a pequena interface e/ou a grande interface da triptase (por exemplo, triptase beta 1 humana).
[235] Em algumas modalidades, qualquer um dos anticorpos anteriores se liga a um epítopo da triptase (por exemplo, triptase beta 1 humana) que inclui um ou mais resíduos de aminoácidos (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou 11 resíduos de aminoácidos) selecionados do grupo consistindo em Gln67, Asp82, Leu83, Ala84, Arg87, Pro103, Val104, Ser105,
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 145/418
139/324
Arg106, Glu128 e Glu129, que podem estar em referência à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71 ou um aminoácido correspondente de qualquer proteína triptase.
[236] Por exemplo, em alguns casos, qualquer um dos anticorpos anteriores se liga a um epítopo na triptase (por exemplo, triptase beta 1 humana) que inclui Gln67 da SEQ ID NO: 71 ou um aminoácido correspondente de qualquer proteína triptase. Em alguns casos, o anticorpo liga-se a um epítopo na triptase (por exemplo, triptase beta 1 humana) que inclui Asp82 da SEQ ID NO: 71 ou um aminoácido correspondente de qualquer proteína triptase. Em alguns casos, o anticorpo liga-se a um epítopo na triptase (por exemplo, triptase beta 1 humana) que inclui Leu83 da SEQ ID NO: 71 ou um aminoácido correspondente de qualquer proteína triptase. Por exemplo, em alguns casos, qualquer um dos anticorpos anteriores se liga a um epítopo na triptase (por exemplo, triptase beta 1 humana) que inclui Ala84 da SEQ ID NO: 71 ou um aminoácido correspondente de qualquer proteína triptase. Em alguns casos, o anticorpo liga-se a um epítopo na triptase (por exemplo, triptase beta 1 humana) que inclui Arg87 da SEQ ID NO: 71 ou um aminoácido correspondente de qualquer proteína triptase. Em alguns casos, o anticorpo liga-se a um epítopo na triptase (por exemplo, triptase beta 1 humana) que inclui Pro103 da SEQ ID NO: 71 ou um aminoácido correspondente de qualquer proteína triptase. Em alguns casos, o anticorpo liga-se a um epítopo na triptase (por exemplo, triptase beta 1 humana) compreendendo Val104 da SEQ ID NO: 71 ou um aminoácido correspondente de qualquer proteína triptase. Por exemplo, em alguns casos, qualquer um dos anticorpos anteriores se liga a um epítopo na triptase (por exemplo, triptase beta 1 humana) que inclui Ser105 da SEQ ID NO: 71 ou um aminoácido correspondente de qualquer proteína triptase. Por exemplo, em alguns casos, qualquer um dos anticorpos anteriores se liga a um epítopo na triptase (por exemplo, triptase
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 146/418
140/324 beta 1 humana) que inclui Arg106 da SEQ ID NO: 71 ou um aminoácido correspondente de qualquer proteína triptase. Por exemplo, em alguns casos, qualquer um dos anticorpos anteriores se liga a um epítopo na triptase (por exemplo, triptase beta 1 humana) que inclui Glu128 da SEQ ID NO: 71 ou um aminoácido correspondente de qualquer proteína triptase. Por exemplo, em alguns casos, qualquer um dos anticorpos anteriores se liga a um epítopo na triptase (por exemplo, triptase beta 1 humana) que inclui Glu129 da SEQ ID NO: 71 ou um aminoácido correspondente de qualquer proteína triptase.
[237] Em algumas modalidades, qualquer um dos anticorpos anteriores se liga a um epítopo na triptase (por exemplo, triptase beta 1 humana) que inclui dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, dez ou mais, ou todos os onze resíduos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em Gln67, Asp82, Leu83, Ala84, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu128 e Glu129, que podem estar em referência à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 71 ou um aminoácido correspondente de qualquer proteína triptase.
[238] Em alguns casos, qualquer um dos anticorpos anteriores se liga a um epítopo da triptase (por exemplo, triptase beta 1 humana) que inclui ainda um ou mais resíduos de aminoácidos adicionais (por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5 resíduos adicionais de aminoácidos) selecionado do grupo que consiste em His51, Val80, Lys81, Ala85 e Pro130, o qual pode estar em referência à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 71 ou um aminoácido correspondente de qualquer proteína triptase. Por exemplo, em alguns casos, qualquer um dos anticorpos anteriores se liga a um epítopo na triptase (por exemplo, triptase beta 1 humana) que inclui ainda His51 da SEQ ID NO: 71 ou um aminoácido correspondente de qualquer proteína triptase. Por exemplo, em alguns casos, qualquer um dos anticorpos anteriores se liga a um epítopo na triptase (por exemplo, triptase beta 1 humana) que inclui ainda Val80 da SEQ
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 147/418
141/324
ID NO: 71 ou um aminoácido correspondente de qualquer proteína triptase. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-triptase se liga a um epítopo na triptase (por exemplo, triptase beta 1 humana) que inclui ainda Lys81 da SEQ ID NO: 71 ou um aminoácido correspondente de qualquer proteína triptase. Por exemplo, em alguns casos, qualquer um dos anticorpos anteriores se liga a um epítopo na triptase (por exemplo, triptase beta 1 humana) que inclui Ala85 da SEQ ID NO: 71 ou um aminoácido correspondente de qualquer proteína triptase. Por exemplo, em alguns casos, qualquer um dos anticorpos anteriores se liga a um epítopo na triptase (por exemplo, triptase beta 1 humana) que inclui ainda Pro130 da SEQ ID NO: 71 ou um aminoácido correspondente de qualquer proteína triptase.
[239] Em alguns casos, o anticorpo liga-se a um epítopo na triptase (por exemplo, triptase beta 1 humana) que inclui ainda dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, ou cinco ou mais resíduos de aminoácidos adicionais selecionados do grupo que consiste em His51, Val80, Lys81, Ala85 e Pro130, que podem estar em referência à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 71 ou a um aminoácido correspondente de qualquer proteína triptase.
[240] Em alguns casos, o anticorpo anti-triptase se liga a um epítopo na triptase (por exemplo, triptase beta 1 humana) que inclui His51, Gln67, Val80, Lys81, Asp82, Leu83, Ala84, Ala85, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu128, Glu129 e Pro130 da SEQ ID NO: 71, que podem estar em referência à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 71 ou um aminoácido correspondente de qualquer proteína triptase. Em alguns casos, o anticorpo anti-triptase se liga a um epítopo da triptase (por exemplo, triptase beta 1 humana) que consiste em His51, Gln67, Val80, Lys81, Asp82, Leu83, Ala84, Ala85, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu128, Glu129 e Pro130 da SEQ ID NO: 71.
[241] Noutros casos, qualquer um dos anticorpos anti-triptase
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 148/418
142/324 anteriores liga-se a um epítopo da triptase (por exemplo, triptase beta 1 humana) que inclui ainda um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8) resíduos de aminoácidos adicionais selecionados do grupo consistindo em Gln35, Trp55, GlnlOO, Leu101, Leu102, Glu126, Leu127 e Arg216, que podem estar em referência à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 71 ou um aminoácido correspondente de qualquer proteína triptase. Por exemplo, em alguns casos, qualquer um dos anticorpos anteriores se liga a um epítopo na triptase (por exemplo, triptase beta 1 humana) que inclui ainda Gln35 da SEQ ID NO: 71 ou um aminoácido correspondente de qualquer proteína triptase. Por exemplo, em alguns casos, qualquer um dos anticorpos anteriores se liga a um epítopo na triptase (por exemplo, triptase beta 1 humana) que inclui ainda Trp55 da SEQ ID NO: 71 ou um aminoácido correspondente de qualquer proteína triptase. Por exemplo, em alguns casos, qualquer um dos anticorpos anteriores se liga a um epítopo na triptase (por exemplo, triptase beta 1 humana) que inclui ainda GlnlOO da SEQ ID NO: 71 ou um aminoácido correspondente de qualquer proteína triptase. Por exemplo, em alguns casos, qualquer um dos anticorpos anteriores se liga a um epítopo na triptase (por exemplo, triptase beta 1 humana) que inclui ainda Leu101 da SEQ ID NO: 71 ou um aminoácido correspondente de qualquer proteína triptase. Por exemplo, em alguns casos, qualquer um dos anticorpos anteriores se liga a um epítopo na triptase (por exemplo, triptase beta 1 humana) que inclui ainda Leu102 da SEQ ID NO: 71 ou um aminoácido correspondente de qualquer proteína triptase. Por exemplo, em alguns casos, qualquer um dos anticorpos anteriores se liga a um epítopo na triptase (por exemplo, triptase beta 1 humana) que inclui ainda Glu126 da SEQ ID NO: 71 ou um aminoácido correspondente de qualquer proteína triptase. Por exemplo, em alguns casos, qualquer um dos anticorpos anteriores se liga a um epítopo na triptase (por exemplo, triptase beta 1 humana) que inclui ainda Leu127 da SEQ ID NO: 71 ou um aminoácido
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 149/418
143/324 correspondente de qualquer proteína triptase. Por exemplo, em alguns casos, qualquer um dos anticorpos anteriores se liga a um epítopo na triptase (por exemplo, triptase beta 1 humana) que inclui ainda Arg216 da SEQ ID NO: 71 ou um aminoácido correspondente de qualquer proteína triptase. Em alguns casos, o anticorpo se liga a um epítopo da triptase (por exemplo, triptase beta 1 humana) que inclui ainda dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, ou oito ou mais resíduos de aminoácidos adicionais selecionados do grupo que consiste em Gln35, Trp55, GlnlOO, Leu101, Leu102, Glu126, Leu127 e Arg216, que podem estar em referência à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 71 ou um aminoácido correspondente de qualquer proteína triptase.
[242] Em alguns casos, o anticorpo anti-triptase se liga a um epítopo da triptase (por exemplo, triptase beta 1 humana) que inclui Gln35, Trp55, Gln67, Asp82, Leu83, Ala84, Arg87, GlnlOO, Leu101, Leu102, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu126, Leu127, Glu128, Glu129 e Arg216, que podem estar em referência à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 71 ou um aminoácido correspondente de qualquer proteína triptase. Em alguns casos, o anticorpo anti-triptase se liga a um epítopo na triptase (por exemplo, triptase beta 1 humana) que consiste em Gln35, Trp55, Gln67, Asp82, Leu83, Ala84, Arg87, GlnlOO, Leu101, Leu102, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu126, Leu127, Glu128, Glu129 e Arg216 da SEQ ID NO: 71.
[243] Noutro aspecto, a invenção fornece um anticorpo que compete pela ligação à triptase (por exemplo, triptase beta 1 humana) com qualquer um dos anticorpos anteriores.
[244] Noutro aspecto, a invenção fornece um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo ou epítopo sobreposto como qualquer dos anticorpos anteriores.
[245] Em algumas modalidades, qualquer um dos anticorpos
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 150/418
144/324 anteriores pode ter a capacidade de interromper a triptase possuindo uma estrutura tetramérica (tal como triptase madura presente ou libertada de grânulos de excreção de mastócitos) para formar espécies de menor peso molecular, por exemplo, monômeros, dímeros, e/ou trímeros.
[246] Em outro aspecto, um anticorpo de acordo com qualquer uma das modalidades acima, pode incorporar qualquer uma das características isoladamente ou em combinação, como descrito nas Seções 1-7 abaixo:
1. Afinidade de Anticorpo [247] Em certas modalidades, um anticorpo fornecido neste documento tem uma constante dissociação (Kd) de < 1 μΜ, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM, < 1 pM, ou < 0,1 pM (por exemplo, 10’6 M ou inferior, por exemplo, de 10’6 M a 10’9 M ou inferior, por exemplo, de 10’9M a 10’13 M ou inferior). Em algumas modalidades, um anticorpo anti-triptase da invenção liga-se à triptase (por exemplo, triptase humana, por exemplo, triptase beta humana) com uma Kode cerca de 100 nM ou inferior (por exemplo, 100 nM ou inferior, 10 nM ou inferior, 1 nM ou inferior, 100 pM ou inferior, 10 pM ou inferior, 1 pM ou inferior, ou 0,1 pM ou inferior). Em algumas modalidades, o anticorpo liga triptase (por exemplo, triptase humana, por exemplo, triptase beta humana) com uma Kd de 10 nM ou inferior (por exemplo, 10 nM ou inferior, 1 nm ou inferior, 100 pM ou inferior, 10 pM ou inferior, 1 pM ou inferior, ou 0,1 pM ou inferior). Em algumas modalidades, o anticorpo liga triptase (por exemplo, triptase humana, por exemplo, triptase beta humana) com uma Kd de 1 nM ou inferior (por exemplo, 1 nm ou inferior, 100 pM ou inferior, 10 pM ou inferior, 1 pM ou inferior, ou 0,1 pM ou inferior). Em algumas modalidades, qualquer um dos anticorpos anti-triptase descritos acima ou aqui se liga à triptase (por exemplo, triptase humana, por exemplo, triptase beta humana) com uma Kd de cerca de 0,5 nM ou inferior (por exemplo, 0,5 nm ou inferior, 400 pM ou inferior, 300 pM ou inferior, 200 pM ou inferior, 100 pM ou inferior,
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 151/418
145/324 pM ou inferior, 25 pM ou inferior, 10 pM ou inferior, 1 pM ou inferior, ou 0,1 pM ou inferior). Em algumas modalidades, o anticorpo liga triptase (por exemplo, triptase humana, por exemplo, triptase beta humana) com uma Kd entre cerca de 0,1 nM e cerca de 0,5 nM (por exemplo, cerca de 0,1 nM, cerca de 0,2 nM, cerca de 0,3 nM, cerca de 0,4 nM ou cerca de 0,5 nM). Em algumas modalidades, o anticorpo liga a triptase (por exemplo, triptase humana, por exemplo, triptase beta humana) com um Kd de cerca de 0,4 nM. Em algumas modalidades, o anticorpo liga a triptase (por exemplo, triptase humana, por exemplo, triptase beta humana) com um Kd de cerca de 0,18 nM.
[248] Em uma modalidade, Kd é medido por um ensaio de ligação ao antígeno radiomarcado (RIA). Em uma modalidade, um RIA é realizado com a versão Fab de um anticorpo de interesse e seu antígeno. Por exemplo, a afinidade de ligação da solução de Fabs para antígeno é medida pelo equilíbrio do Fab com uma concentração mínima de antígeno marcado com (125l) na presença de uma série de titulação de antígeno não marcado, capturando, em seguida, o antígeno ligado a uma placa revestida por anticorpo anti-Fab (ver, por exemplo, Chen et al. J. Mol. Biol. 293:865-881, 1999). Para estabelecer condições para o ensaio, placas de poços múltiplos MICROTITER® (Thermo Scientific) são revestidas durante a noite com 5 pg/ml de um anticorpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) em carbonato de sódio a 50 mM (pH 9,6) e subsequentemente bloqueadas com albumina de soro bovino a 2% (p/v) em PBS por duas a cinco horas à temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C). Em uma placa não adsorvente (Nunc #269620), 100 pM ou 26 pM [125l] por antígeno são misturados com diluições em série de um Fab de interesse (por exemplo, consistente com a avaliação do anticorpo antiVEGF, Fab-12, em Presta et al. Cancer Res. 57:4593-4599, 1997). O Fab de interesse é então incubado durante a noite; no entanto, a incubação pode continuar por um período mais longo (por exemplo, cerca de 65 horas) para
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 152/418
146/324 garantir que o equilíbrio seja atingido. A partir daí as misturas são transferidas para a placa de captura para incubação à temperatura ambiente (por exemplo, por uma hora). A solução é então removida e a placa lavada oito vezes com polissorbato 20 a 0,1% (TWEEN®-20) em PBS. Quando as placas tiverem secado, 150 μΙ/poço de cintilante (MICRQSCINT-20 ™; Packard) são adicionados, e as placas são contadas em um contador gama TOPCOUNT™ (Packard) por dez minutos. As concentrações de cada Fab que geram menos de ou igual a 20% de ligação máxima são escolhidas para uso em ensaios de ligação competitiva.
[249] De acordo com outra modalidade, o Kd é medido por meio da utilização de um BIACORE® de ensaio de ressonância plasmônica de superfície. Por exemplo, um ensaio usando um BIACORE ®-2000 ou um BIACORE ®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) é realizado a 25°C, com fragmentos de CM5 de antígeno imobilizado nas ~ 10 unidades de resposta (Rll). Em uma modalidade, os fragmentos de biossensor de dextrano carboximetilado (CM5, BIACORE, Inc.) são ativados com cloridrato de /V-etil-A/'(3-dimetilaminopropil)-carbodi-imida (EDC) e /V-hidroxisuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. O antígeno é diluído com acetato de sódio 10 mM, pH 4,8, to 5 pg/ml (~0,2μΜ) antes da injeção a uma vazão de 5 μΙ/minuto para alcançar aproximadamente 10 unidades de resposta (Rll) da proteína acoplada. Após a injeção do antígeno, etanolamina a 1 M é injetada para bloquear os grupos não reagidos. Para medições cinéticas, duas diluições seriadas de Fab (0,78 nM a 500 nM) são injetadas em solução salina tamponada com fosfato (PBS) com 0,05% polissorbato 20 (TWEEN®-20) surfactante (PBST) a 25° C a uma taxa de fluxo de aproximadamente 25 μΙ/min. As taxas de associação (kon) e de dissociação (koff) são calculadas usando um modelo de ligação de Langmuir de um para um simples (BIACORE® Evatuation Software versão 3.2) através do ajuste simultâneo dos
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 153/418
147/324 sensorgramas de associação e dissociação. A constante de equilíbrio de dissociação (Kd) é calculada como a razão koff/kon. Ver, por exemplo, Chen et al. (J. Mol. Biol. 293:865-881, 1999). Se a taxa de associação exceder 106 M’1 s’1 pelo ensaio de ressonância plasmônica de superfície acima, então a taxa de associação poderá ser determinada através do uso de uma técnica de extinção fluorescente que mede o aumento ou a diminuição da intensidade da emissão da fluorescência (excitação = 295 nm; emissão = 340 nm, passa-faixa 16 nm) a 25°C de um anticorpo anti-antígeno a 20 nM (forma Fab) em PBS, pH 7,2, na presença de concentrações crescentes de antígeno conforme medidas em um espectrômetro, tal como um espectrofotômetro equipado com parada de fluxo (Aviv Instruments) ou um espetrofotômetro 8000-series SLM-AMINCO™ (ThermoSpectronic) com uma cubeta agitada.
[250] Em algumas modalidades, Kd é medido utilizando um ensaio BIACORE® SPR, por exemplo, como descrito no Exemplo 1, Seção (A) (vii). Em algumas modalidades, o ensaio SPR pode usar um BIAcore® T200 ou um dispositivo equivalente. Em algumas modalidades, chips sensor BIAcore®Série S CM5 (ou chips sensor equivalentes) são imobilizados com anticorpo monoclonal de camundongo anti-lgG humana (Fc) e anticorpos antitriptase são subsequentemente capturados na célula de fluxo. Diluições de 3 vezes em série do monômero de triptase beta 1 humana marcada com His (SEQ ID NO: 128) são injetadas a uma taxa de fuxo de 30 μΙ/min. Cada amostra é analisada com 3 min de associação e 10 min de dissociação. O ensaio é realizado a 25° C. Após cada injeção, o chip é regenerado usando 3 M de MgCh. A resposta de ligação é corrigida subtraindo as unidades de resposta (RU) de uma célula de fluxo capturando uma IgG irrelevante com densidade semelhante. Um modelo Languir 1:1 de ajuste simultâneo de kon e koffé usado para análise cinética.
2. Fragmentos de Anticorpo
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 154/418
148/324 [251] Em determinadas modalidades, um anticorpo fornecido neste documento é um fragmento de anticorpo. Fragmentos de anticorpo incluem, mas não estão limitados a, fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv e scFv, e outros fragmentos descritos abaixo. Para uma revisão de certos fragmentos de anticorpos, ver Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003). Para uma revisão dos fragmentos scFv, ver, por exemplo, Pluckthün, em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., (Springer-Verlag, Nova York), pp. 269-315 (1994); ver também WO 93/16185; e Patente U.S. n°s 5.571.894 e 5.587.458. Para uma discussão de fragmentos Fab e F(ab')2, compreendendo resíduos de epítopo de ligação do receptor de salvamento e possuindo maior meia-vida in vivo, ver Patente U.S. n° 5.869.046.
[252] Os diabodies são fragmentos de anticorpo com dois sítios de ligação a antígeno que podem ser bivalentes ou biespecíficos. Ver, por exemplo, EP 404.097; WO 1993/01161; Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134, 2003; e Hollinger et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 6444-6448, 1993. Ttriacorpos e tetracorpos também são descritos em Hudson et al., Nat. Nat. Med. 9:129-134, 2003.
[253] Os anticorpos de domínio único são fragmentos de anticorpo compreendendo todo ou uma porção do domínio variável da cadeia pesada ou todo ou uma porção do domínio variável da cadeia leve de um anticorpo. Em determinadas modalidades, um anticorpo de domínio único é um anticorpo de domínio único humano (ver, por exemplo, Patente U.S. n° 6.248.516 B1).
[254] Os fragmentos de anticorpo podem ser produzidos por várias técnicas, incluindo, mas não se limitando à digestão proteolítica de um anticorpo intacto, bem como a produção por células hospedeiras recombinantes (por exemplo, E. coli ou fago), como descrito neste documento.
3. Anticorpos Quiméricos e Humanizados
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 155/418
149/324 [255] Em certas modalidades, um anticorpo fornecido neste documento é um anticorpo quimérico. Determinados anticorpos quiméricos são descritos, por exemplo, na Patente U.S. n° 4.816.567; e Morrison et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855, 1984). Em um exemplo, um anticorpo quimérico compreende uma região variável não humana (por exemplo, uma região variável derivada de um camundongo, rato, hamster, coelho ou primata não humano, tal como um macaco) e uma região constante humana. Em outro exemplo, um anticorpo quimérico é um anticorpo de classe trocada, em que a classe ou subclasse foi alterada daquela do anticorpo de origem. Anticorpos quiméricos incluem fragmentos de ligação ao antígeno destes.
[256] Em certas modalidades, um anticorpo quimérico é um anticorpo humanizado. Tipicamente, um anticorpo não humano é humanizado para reduzir a imunogenicidade em seres humanos, embora mantenha a especificidade e afinidade do anticorpo não humano parental. De modo geral, um anticorpo humanizado compreende um ou mais domínios variáveis, nos quais as HVRs (ou partes destas), são derivadas de um anticorpo não humano e as FRs (ou partes destas) são derivadas das sequências de anticorpos humanos. Um anticorpo humanizado opcionalmente compreenderá adicionalmente pelo menos uma parte de uma região constante humana. Em algumas modalidades, alguns resíduos de FR em um anticorpo humanizado são substituídos por resíduos correspondentes de um anticorpo não humano (por exemplo, o anticorpo a partir do qual os resíduos de HVR são derivados), por exemplo, para restaurar ou melhorar a especificidade ou afinidade do anticorpo.
[257] Anticorpos humanizados e métodos de fazê-los são revistos, por exemplo, em Almagro et al. Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008), e são descritos, por exemplo, em Riechmann et al. Nature 332:323-329, 1988; Queen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033, 1989; Patente US n°s
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 156/418
150/324
5.821.337, 7.527.791, 6.982.321, e 7.087.409; Kashmiri et al. Methods 36: 2534 (2005) (descrevendo o enxerto da região determinante de especificidade (SDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498, 1991 (descrevendo reemersão); Dall’Acqua et al. Methods 36:43-60, 2005 (descrevendo embaralhamento de FR); e Osbourn et al. Methods 36:61-68, 2005; e Klimka et al. Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (que descreve a abordagem de “seleção orientada” para o embaralhamento de FR).
[258] As regiões de framework humanas que podem ser usadas para a humanização incluem, mas não estão limitadas a: regiões de framework selecionadas usando o método de melhor ajuste (ver, por exemplo, Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993); regiões de framework derivadas da sequência consenso de anticorpos humanos de um subgrupo específico de regiões variáveis de cadeia leve ou pesada (ver, por exemplo, Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89:4285, 1992; e Presta et al. J. Immunol., 151: 2623 (1993)); regiões de framework maduras humanas (somaticamente mutadas) ou regiões de framework de linhagem germinativa humana (ver, por exemplo, Almagro et al. Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); e regiões de framework derivadas da triagem de bibliotecas de FR (vide, por exemplo, Baca et al. J. Biol. Chem. 272:10678-10684, 1997 e Rosok et al. J. Biol. Chem. 271:22611-22618, 1996).
4. Anticorpos humanos [259] Em certas modalidades, um anticorpo fornecido neste documento é um anticorpo humano. Os anticorpos humanos podem ser produzidos por meio da utilização várias técnicas conhecidas na técnica. Os anticorpos humanos são descritos geralmente em van Dijk et al. Curr. Opin. Pharmacol. 5:368-74 (2001) e Lonberg, Cure Opin. Immunol. 20:450-459, 2008.
[260] Os anticorpos humanos podem ser preparados pela administração de um imunógeno a um animal transgênico que foi modificado
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 157/418
151/324 para produzir anticorpos humanos intactos ou anticorpos intactos com regiões variáveis humanas em resposta ao desafio antigênico. Tais animais normalmente contêm todas ou uma parte dos loci de imunoglobulina humana que substituem os loci de imunoglobulina endógena ou que estão presentes extracromossomicamente ou integrados de maneira aleatória aos cromossomos do animal. Em tais camundongos transgênicos, os loci de imunoglobulina endógena foram desativados de modo geral. Para uma revisão dos métodos de obtenção de anticorpos humanos de animais transgênicos, ver Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125, 2005. Ver também, por exemplo, as Patentes U.S. Nos 6.075.181 e 6.150.584 que descrevem a tecnologia XENOMOUSE™; a Patente U.S. No 5770429 descreve a tecnologia HUMAB®; a Patente U.S. n° 7041870 descreve a tecnologia K-M Mouse® e o Pedido de Publicação de Patente U.S. n° US 2007/0061900, que descreve a tecnologia VELOCIMOUSE®. As regiões variáveis humanas de anticorpos intactos gerados por esses animais podem ser modificadas ainda, por exemplo, combinando-as com uma região constante humana diferente.
[261] Os anticorpos humanos também podem ser produzidos por métodos baseados em hibridoma. As linhagens celulares de mieloma humano e de heteromieloma de camundongo-humano para a produção de anticorpos monoclonais humanos foram descritas. (Vide, por exemplo, Kozbor J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeuret al. Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nova York, 1987); e Boerner et al. J. Immunol. 147: 86, 1991). Os anticorpos humanos gerados através da tecnologia do hibridoma de células B humanas também são descritos em Li et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 103:3557-3562, 2006. Outros métodos incluem aqueles descritos, por exemplo, na Patente norteamericana n° 7.189.826 (que descreve a produção de anticorpos IgM humanos monoclonais a partir de linhagens de células de hibridoma) e Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268,
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 158/418
152/324
2006 (que descreve hibridomas humano-humano). A tecnologia de hibridomas humanos (tecnologia Trioma) também é descrita em Vollmers et al. Histology and Histopathology 20 (3): 927-937, 2005 e Vollmers et al. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27(3): 185-91,2005.
[262] Os anticorpos humanos também podem ser gerados por meio do isolamento das sequências de domínio variável de clone de Fv selecionadas a partir de bibliotecas de exibição de fago derivadas de humanos. Tais sequências de domínio variável podem então ser combinadas com um domínio constante humano desejado. As técnicas de seleção de anticorpos humanos a partir de bibliotecas de anticorpos são descritas abaixo.
5. Anticorpos Derivados da Biblioteca [263] Os anticorpos da invenção podem ser isolados através da triagem de bibliotecas combinatóhas para anticorpos com a atividade ou atividades desejadas. Por exemplo, uma variedade de métodos é conhecida na técnica para a geração de bibliotecas de phage display e triagem dessas bibliotecas em busca de anticorpos que possuam as características de ligação desejadas. Esses métodos são revistos, por exemplo, em Hoogenboom et al. em Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) e descritos ainda, por exemplo, em McCafferty et al. Nature 348:552-554, 1990; Clackson et al. Nature 352: 624-628, 1991; Marks et al. J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks et al., em Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al. J. Mol. Biol. 338(2): 299-310, 2004; Lee et al. J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093, 2004; Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 101(34):12467-12472, 2004; e Lee et al. J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132, 2004.
[264] Em certos métodos de exibição de fago, repertórios de genes de VH e VL são separadamente clonados pela reação em cadeia da polimerase (PCR) e aleatoriamente recombinados em bibliotecas de fagos, que
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 159/418
153/324 podem então ser tríadas por fagos de ligação ao antígeno, como descrito em Winter et al. Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455, 1994. O fago normalmente exibe fragmentos de anticorpos, tanto como fragmentos Fv de cadeia simples (scFv) quanto como fragmentos Fab. As bibliotecas de fontes imunizadas proveem anticorpos de alta afinidade ao imunógeno sem a necessidade de construir hibridomas. Alternativamente, o repertório naive pode ser clonado (por exemplo, a partir de humano) para prover uma única fonte de anticorpos para uma ampla variedade de antígenos não próprios e também próprios sem qualquer imunização como descrito por Griffiths et al. EMBO J, 12: 725-734, 1993. Por fim, as bibliotecas virgens também podem ser feitas de maneira sintética, ao se clonar segmentos de gene V não rearranjados de células-tronco e ao se usar iniciadores de PCR (primers) contendo a sequência aleatória para codificar as regiões HVR3 altamente variáveis e para realizar o rearranjo in vitro, como descrito por Hoogenboom et al. J. Mol. Biol., 227: 381-388, 1992. As publicações de patentes que descrevem bibliotecas de fagos de anticorpos humanos incluem, por exemplo: a Patente U.S. n° 5.750.373 e as Publicações de Patente U.S. Nos 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 e 2009/0002360.
[265] Os anticorpos ou fragmentos de anticorpos isolados a partir de bibliotecas de anticorpos humanos são considerados anticorpos humanos ou fragmentos de anticorpos humanos neste documento.
6. Anticorpos multiespecíficos [266] Em determinadas modalidades, um anticorpo fornecido neste documento é um anticorpo multiespecífico, por exemplo, um anticorpo biespecífico. Os anticorpos multiespecíficos são anticorpos monoclonais que tem especificidades de ligação para pelo menos dois sítios diferentes. Em determinadas modalidades, os anticorpos biespecíficos podem se ligar a dois epítopos diferentes de triptase. Em certas modalidades, uma das
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 160/418
154/324 especificidades de ligação é para triptase e a outra é para qualquer outro antígeno (por exemplo, uma segunda molécula biológica). Em algumas modalidades, os anticorpos biespecíficos podem ligar-se a dois epítopos diferentes da triptase. Em outras modalidades, uma das especificidades de ligação é para triptase (por exemplo, triptase humana, por exemplo, triptase beta humana) e a outra é para qualquer outro antígeno (por exemplo, uma segunda molécula biológica, por exemplo, IL-13, IL-4, IL-5, IL-17, IL-33, IgE, M1 prime, CRTH2 ou TRPA). Consequentemente, o anticorpo biespecífico pode ter especificidade de ligação para triptase e IL-13; triptase e IL-4; triptase e IL5; triptase e IL-17, ou triptase IL-33. Em particular, o anticorpo biespecífico pode ter especificidade de ligação para triptase e IL-13 ou triptase e IL-33. Os anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos de comprimento total ou fragmentos de anticorpo.
[267] Por exemplo, em alguns casos, um anticorpo biespecífico inclui um primeiro domínio de ligação que se liga a triptase e um segundo domínio de ligação que se liga a IL-13. Em alguns casos, o anticorpo (por exemplo, o anticorpo anti-triptase) pode incluir, por exemplo, pelo menos um, dois, três, quatro, cinco ou seis regiões hipervariáveis (HVRs), selecionadas a partir de:(a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da X1X2GMX3 (SEQ ID NO: 1), em que X1 é Asp ou Ser, X2 é Tyr ou Phe, e X3 é Vai ou His; (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da FISSGSSTVYYADTMKG (SEQ ID NO: 2);(c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da RX1X2X3DWYFDV (SEQ ID NO: 3), em que X1 é Asn ou Asp, X2 é Tyr ou Asn, e X3 é Asp ou Tyr; (d) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SASSSVTYMY (SEQ ID NO: 4); (e)uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da RTSDLAS (SEQ ID NO: 5); e (f)uma HVR-L3 compreendendo o aminoácido sequência de QHYHSYPLT (SEQ ID NO: 6), ou uma combinação de um ou mais dos HVRs
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 161/418
155/324 acima e uma ou mais variantes respectivos, possuindo pelo menos cerca de 80% de sequências identidade (por exemplo, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86% 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade) para qualquer uma das SEQ IS NOs: 1-6. Em alguns casos, o segundo domínio de ligação que vincula a IL-13 pode, por exemplo, incluir pelo menos um, dois, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionados a partir de (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de AYSVN (SEQ ID NO: 84); (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de MIWGDGKIVYNSALKS (SEQ ID NO: 85); (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de DGYYPYAMDN (SEQ ID NO: 86); (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de RASKSVDSYGNSFMH (SEQ ID NO: 87); (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de LASNLES (SEQ ID NO: 88); e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de QQNNEDPRT (SEQ ID NO: 89), ou uma combinação de uma ou mais das HVRs acima e uma ou mais suas variantes possuindo pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência (por exemplo, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade) a qualquer uma das SEQ ID NOs: 84-89. Em algumas modalidades, o segundo domínio de ligação compreende um, dois, três, quatro, cinco ou seis HVRs do anticorpo anti-IL-13 lebrikizumabe.
[268] Por exemplo, em alguns casos, o primeiro domínio de ligação que liga a triptase compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis regiões hipervariáveis (HVR) selecionadas a partir de: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de DYGMV (SEQ ID NO: 7); (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de FISSGSSTVYYADTMKG (SEQ ID NO: 2); (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de RNYDDWYFDV (SEQ ID NO: 8); (d) uma HVRL1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SASSSVTYMY (SEQ ID
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 162/418
156/324
NO: 4); (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de RTSDLAS (SEQ ID NO: 5); e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de QHYHSYPLT (SEQ ID NO: 6), tal como hu31a.v11. Em alguns casos, o segundo domínio de ligação que liga IL-13 pode, por exemplo, compreender pelo menos um, dois, três, cinco ou seis HVR selecionados a partir de: (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de AYSVN (SEQ ID NO: 84); (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de MIWGDGKIVYNSALKS (SEQ ID NO: 85); (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de DGYYPYAMDN (SEQ ID NO: 86); (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de RASKSVDSYGNSFMH (SEQ ID NO: 87); (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de LASNLES (SEQ ID NO: 88); e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de QQNNEDPRT (SEQ ID NO: 89). Em algumas modalidades, o segundo domínio de ligação compreende um, dois, três, quatro, cinco ou seis HVRs do anticorpo anti-IL-13 lebrikizumabe. Em algumas modalidades, o primeiro domínio de ligação compreende a sequência de aminoácidos da VH e/ou VL de hu31a.v11 e o segundo domínio de ligação compreende a sequência de aminoácidos da VH e/ou VL do anticorpo anti-IL-13 lebrikizumabe.
[269] Qualquer um dos anticorpos biespecíficos anteriores antitriptase/anti-IL-13 pode incluir um primeiro domínio de ligação que se liga a triptase compreendendo (a) um domínio VH compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 80% de identidade de sequência (por exemplo, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência), ou a sequência de, SEQ ID NO: 9; (b) um domínio VL compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade de sequência (por exemplo, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%,
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 163/418
157/324
91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência) para, ou a sequência de, SEQ ID NO: 10; ou (c) um domínio VH como em (a) e um domínio VL como em (b). Qualquer um dos anticorpos biespecíficos anti-triptase/anti-IL-13 anteriores pode incluir um segundo domínio de ligação que vincula a IL-13 que inclui (a) um domínio VH, composto por uma sequência de aminoácidos, possuindo pelo menos 80% de sequências identidade (por exemplo, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% identidade de sequência), ou a sequência de, SEQ ID NO: 90 ou SEQ ID NO: 114; (b) um domínio VL compreendendo uma sequência de aminoácidos, possuindo pelo menos 80% de sequências identidade (por exemplo, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% identidade de sequência) para, ou a sequência de, SEQ ID NO: 91 ou SEQ ID NO: 115; ou (c) um VH domínio como em (a) e um domínio VL como em (b). Em alguns casos, o segundo domínio de ligação compreende o domínio VH e/ou VL do lebrikizumabe.
[270] Em outro exemplo, um anticorpo biespecífico inclui um primeiro domínio de ligação que se liga a triptase e um segundo domínio de ligação que se liga a IL-33. O segundo domínio de ligação que se liga a IL-33 pode incluir qualquer um dos anticorpos anti-IL-33 descritos, por exemplo, na Publicação de Patente US 2016/0168242, que é incorporada neste documento por referência na sua totalidade. Em alguns casos, o anticorpo (por exemplo, o anticorpo anti-triptase) pode incluir, por exemplo, pelo menos um, dois, três, quatro, cinco ou seis regiões hipervariáveis (HVRs), selecionadas a partir de:(a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da X1X2GMX3 (SEQ ID NO: 1), em que X1 é Asp ou Ser, X2 é Tyr ou Phe, e X3 é Vai ou His; (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da FISSGSSTVYYADTMKG (SEQ ID NO: 2);(c) uma HVR-H3 compreendendo a
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 164/418
158/324 sequência de aminoácidos da RX1X2X3DWYFDV (SEQ ID NO: 3), em que Xi é Asn ou Asp, X2 é Tyr ou Asn, e X3 é Asp ou Tyr; (d) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SASSSVTYMY (SEQ ID NO: 4); (e)uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da RTSDLAS (SEQ ID NO: 5); e (f)uma HVR-L3 compreendendo o aminoácido sequência de QHYHSYPLT (SEQ ID NO: 6), ou uma combinação de um ou mais dos HVRs acima e uma ou mais variantes respectivos, possuindo pelo menos cerca de 80% de sequências identidade (por exemplo, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86% 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade) para qualquer uma das SEQ IS NOs: 1-6. Em alguns casos, o segundo domínio de ligação que se liga a IL-33 pode, por exemplo, incluir pelo menos um, dois, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionados a partir de (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SFSMS (SEQ ID NO: 120); (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos deTISGGKTFTDYVDSVKG (SEQ ID NO: 121); (c)HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos deANYGNWFFEV (SEQ ID NO: 122); (d)HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos deRASESVAKYGLSLLN (SEQ ID NO: 123); (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos deAASNRGS (SEQ ID NO: 124); e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos deQQSKEVPFT (SEQ ID NO: 125), ou uma combinação de uma ou mais das HVRs acima e uma ou mais suas variantes com pelo menos 80% de identidade de sequência (por exemplo, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade) para quaisquer umas das SEQ ID NOs: 120-125. Em algumas modalidades, 0 segundo domínio de ligação compreende um, dois, três, quatro, cinco ou seis HVRs do anticorpo anti-IL-33 10C12.38.H6.87Y.58I.
[271] Por exemplo, em alguns casos, o primeiro domínio de ligação que liga a triptase compreende pelo menos uma, duas, três, quatro,
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 165/418
159/324 cinco ou seis regiões hipervariáveis (HVR) selecionadas a partir de: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de DYGMV (SEQ ID NO: 7); (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de FISSGSSTVYYADTMKG (SEQ ID NO: 2); (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de RNYDDWYFDV (SEQ ID NO: 8); (d) uma HVRL1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SASSSVTYMY (SEQ ID NO: 4); (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de RTSDLAS (SEQ ID NO: 5); e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de QHYHSYPLT (SEQ ID NO: 6), tal como hu31a.v11. Em alguns casos, o segundo domínio de ligação que liga IL-33 pode, por exemplo, compreender pelo menos um, dois, três, cinco ou seis HVR selecionados a partir de (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SFSMS (SEQ ID NO: 120); (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de TISGGKTFTDYVDSVKG (SEQ ID NO: 121); (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de ANYGNWFFEV (SEQ ID NO: 122); (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de RASESVAKYGLSLLN (SEQ ID NO: 123); (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de AASNRGS (SEQ ID NO: 124); e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de QQSKEVPFT (SEQ ID NO: 125). Em algumas modalidades, o segundo domínio de ligação compreende um, dois, três, quatro, cinco ou seis HVRs do anticorpo anti-IL-33 10C12.38.H6.87Y.58I. Em algumas modalidades, o primeiro domínio de ligação compreende a sequência de aminoácidos da VH e/ou VL de hu31a.v11 e o segundo domínio de ligação compreende a sequência de aminoácidos da VH e/ou VL do anticorpo anti-IL-33 10C12.38.H6.87Y.58I.
[272] Qualquer um dos anticorpos biespecíficos anteriores antitriptase/anti-IL-33 pode incluir um primeiro domínio de ligação que se liga a triptase compreendendo (a) um domínio VH compreendendo uma sequência de
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 166/418
160/324 aminoácidos possuindo pelo menos 80% de identidade de sequência (por exemplo, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência), ou a sequência de, SEQ ID NO: 9; (b) um domínio VL compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade de sequência (por exemplo, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência) para, ou a sequência de, SEQ ID NO: 10; ou (c) um domínio VH como em (a) e um domínio VL como em (b). Qualquer um dos anticorpos biespecíficos anteriores anti-triptase/anti-IL-33 pode incluir um segundo domínio de ligação que se liga a IL-33 compreendendo (a) um domínio VH compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade de sequência (por exemplo, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência) com, ou a sequência de, SEQ ID NO: 126; (b) um domínio VL compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade de sequência (por exemplo, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência) para, ou a sequência de, SEQ ID NO: 127; ou (c) um domínio VH como em (a) e um domínio VL como em (b). Em alguns casos, o segundo domínio de ligação compreende o domínio VH e/ou VL do 10C12.38.H6.87Y.58I.
[273] Técnicas para fazer anticorpos multiespecíficos incluem, mas não estão limitados a coexpressão recombinante de dois pares de cadeia leve de cadeia pesada da imunoglobulina possuindo especificidades diferentes (ver Milstein et al. Nature 305: 537, 1983; WO 93/08829; e Traunecker et al. EMBO J. 10: 3655, 1991), e “knob-in-hole” engineering (ver, por exemplo, Patente U.S. n° 5.731.168). Os anticorpos multiespecíficos também podem ser
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 167/418
161/324 produzidos pela manipulação de efeitos de condução eletrostática para a fabricação de moléculas heterodiméricas de Fc do anticorpo (WO 2009/089004A1); reticulando dois ou mais anticorpos ou fragmentos (vide, por exemplo, Patente US N° 4.676.980, e Brennan et al. Science, 229: 81, 1985); usando zíperes de leucina para produzir anticorpos biespecíficos (ver, por exemplo, Kostelny et al. J. Immunol., 148 (5): 1547-1553, 1992); utilizando a tecnologia “diabody” para produzir fragmentos de anticorpo biespecíficos (ver, por exemplo, Hollinger et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 6444-6448, 1993); e usando dímeros de Fv de cadeia simples (scFv) (ver, por exemplo, Gruber et al. J. Immunol. 152: 5368, 1994); e preparar anticorpos triespecíficos como descrito, por exemplo, em Tutt et al. J. Immunol. 147: 60, 1991.
[274] Os anticorpos manipulados com três ou mais sítios de ligação ao antígeno funcionais, incluindo “anticorpos octopus”, são também incluídos neste documento (vide, por exemplo, US 2006/0025576A1).
[275] O anticorpo ou fragmento deste documento também inclui uma Dupla atuação Fab ou DAF, compreendendo um sítio de ligação do antígeno que se liga à triptase, bem como outro, diferente do antígeno (ver US, 2008/0069820, por exemplo).
Knobs-into-Holes [276] O uso de knobs-into-holes como método de produção de anticorpos multiespecíficos é descrito, por exemplo, na Pat. U.S. n° 5.731.168, W02009/089004, US2009/0182127, US2011/0287009, Marvin e Zhu, Acta Pharmacol. Sin. (2005) 26 (6): 649-658, e Kontermann (2005) Acta Pharmacol. Sin. 26:1-9. Uma breve discussão não limitativa é fornecida abaixo.
[277] Uma protuberância refere-se a, pelo menos, uma cadeia lateral de aminoácidos que se projeta a partir da interface de um primeiro polipeptideo e, portanto, é posicionada numa cavidade compensatória na interface adjacente (isto é, a interface de um segundo polipeptideo) de modo a
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 168/418
162/324 estabilizar o heteromultímero e favorecer, assim, a formação de heteromultímero em vez da formação de homomultímero, por exemplo. A protuberância pode estar na interface original ou pode ser introduzida sinteticamente (por exemplo, alterando o ácido nucleico que codifica a interface). Em algumas modalidades, um ácido nucleico que codifica a interface do primeiro polipepeptídeo é alterado para codificar a protuberância. Para conseguir isto, o ácido nucleico que codifica pelo menos um resíduo de aminoácido original na interface do primeiro polipeptídeo é substituído por ácido nucleico que codifica pelo menos um resíduo de aminoácido de importação que tem um volume de cadeia lateral maior do que o amino original resíduo ácido. Será apreciado que pode haver mais do que um resíduo de importação original e correspondente. Os volumes da cadeia lateral dos vários resíduos amino são mostrados, por exemplo, na Tabela 1 da US 2011/0287009 ou na Tabela 1 da Patente US n° 7.642.228.
[278] Em algumas modalidades, resíduos importados para a formação de uma protuberância são aminoácidos de ocorrência natural selecionados a partir de arginina (R), fenilalanina (F), tirosina (Y) e triptofano (W). Em algumas modalidades, um resíduo de importação é triptofano ou tirosina. Em algumas modalidades, o resíduo original para a formação da protuberância tem um volume de cadeia lateral pequeno, tal como alanina, asparagina, ácido aspártico, glicina, serina, treonina ou valina. Ver, por exemplo, a Patente US n° 7.642.228.
[279] Uma cavidade refere-se a, pelo menos, uma cadeia lateral de aminoácido, que é rebaixada a partir da interface do segundo polipeptídeo e, por conseguinte, acomoda uma protuberância correspondente na interface adjacente de um primeiro polipeptídeo. A cavidade pode estar na interface original ou pode ser introduzida sinteticamente (por exemplo, alterando o ácido nucleico que codifica a interface). Em algumas modalidades,
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 169/418
163/324 o ácido nucleico que codifica a interface do segundo polipeptídeo é alterado para codificar a cavidade. Para conseguir isto, o ácido nucleico que codifica pelo menos um resíduo de aminoácido original na interface do segundo polipeptídeo é substituído por DNA que codifica pelo menos um resíduo de aminoácido de importação que tem um volume de cadeia lateral menor do que o amino original resíduo ácido. Será apreciado que pode haver mais do que um resíduo de importação original e correspondente. Em algumas modalidades, resíduos importados para a formação de uma cavidade são normalmente resíduos de aminoácidos de ocorrência natural selecionados a partir de alanina (A), serina (S), treonina (T) e valina (V). Em algumas modalidades, um resíduo de importação é serina, alanina ou treonina. Em algumas modalidades, o resíduo original para a formação da cavidade tem um volume de cadeia lateral grande, tal como tirosina, arginina, fenilalanina ou triptofano.
[280] A protuberância é posicionável na cavidade, o que significa que a localização espacial da protuberância e da cavidade na interface do primeiro polipeptídeo e do segundo polipeptídeo, respectivamente, e os tamanhos da protuberância e cavidade são tais que a protuberância possa ser localizada no interior da cavidade sem perturbar significativamente a associação normal do primeiro e segundo polipeptídeos na interface. Uma vez que as saliências, tais como Tyr, Phe e Trp, tipicamente não se estendem perpendicularmente em relação ao eixo da interface e têm conformações preferenciais, o alinhamento de uma protuberância com uma cavidade correspondente, pode em algumas instâncias, basear-se na modelação do par de protuberância/cavidade com base numa estrutura tridimensional, tal como a obtida por cristalografia de raios X ou ressonância magnética nuclear (NMR). Isto pode ser conseguido utilizando técnicas amplamente aceitas na técnica.
[281] Em algumas modalidades, uma mutação de botão em uma
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 170/418
164/324 região constante de lgG1 é T366W. Em algumas modalidades, uma mutação de furo em uma região constante de lgG1 compreende uma ou mais mutações selecionadas de T366S, L368A e Y407V. Em algumas modalidades, uma mutação de furo em uma região constante de lgG1 compreende T366S, L368A e Y407V.
[282] Em algumas modalidades, uma mutação de botão em uma região constante de lgG4 é T366W. Em algumas modalidades, uma mutação de furo em uma região constante de lgG4 compreende uma ou mais mutações selecionadas de T366S, L368A e Y407V. Em algumas modalidades, uma mutação de furo em uma região constante de lgG4 compreende T366S, L368A e Y407V.
7. Variantes de Anticorpos [283] Em certas modalidades, as variantes da sequência de aminoácidos dos anticorpos fornecidos neste documento são consideradas. Por exemplo, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo, tal como uma atividade inibitória. As variantes da sequência de aminoácidos de um anticorpo podem ser preparadas pela introdução de modificações apropriadas na sequência nucleotídica codificando o anticorpo, ou pela síntese de peptídeos. Essas modificações incluem, por exemplo, deleções e/ou inserções e/ou substituições de resíduos dentro das sequências de aminoácidos do anticorpo. Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição pode ser feita para chegar ao construto final, desde que o construto final possua as características desejadas, por exemplo, ligação ao antígeno.
a) Variantes de substituição, inserção e deleção [284] Em certas modalidades, são fornecidas variantes de anticorpos com uma ou mais substituições de aminoácidos. Os locais de interesse para mutagênese substitucional incluem as HVRs e FRs. As
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 171/418
165/324 substituições conservativas são mostradas na Tabela 1, sob o título de substituições preferidas. As alterações mais substanciais são providas na Tabela 1, sob o título de substituições exemplares e, como adicionalmente descrito abaixo, em referência às classes de cadeia lateral dos aminoácidos. As substituições de aminoácidos podem ser introduzidas em um anticorpo de interesse e os produtos triados para uma atividade desejada, por exemplo, ligação ao antígeno mantida/aprimorada, imunogenicidade diminuída, ou ADCC ou CDC aprimorada.
Tabela 1
Re síduo Original Exemplos de Substituições ituições Preferenciais Subst
a (A) Al Vai; Leu; He Vai
g(R) Ar Lys; Gin; Asn Lys
n(N) As Gin; His; Asp, Lys; Arg Gin
P(D) As Glu; Asn Glu
s(C) Cy Ser; Ala Ser
n(Q) Gl Asn; Glu Asn
u(E) Gl Asp; Gin Asp
y(G) Gl Ala Ala
s(H) Hi Asn; Gin; Lys; Arg Arg
(1) He Leu; Vai; Met; Ala; Phe; Norleucina Leu
u(L) Le Norleucina; lie; Vai; Met; Ala; Phe lie
s(K) Ly Arg; Gin; Asn Arg
t(M) Me Leu; Phe; lie Leu
e(F) Ph Trp; Leu; Vai; lie; Ala; Tyr Tyr
o(P) Pr Ala Ala
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 172/418
166/324
Re síduo Original Exemplos de Substituições ituições Preferenciais Subst
r(S) Se Thr Thr
r(T) Th Vai; Ser Ser
p(W) Tr Tyr; Phe Tyr
r(Y) Ty Trp; Phe; Thr; Ser Phe
l(V) Va He; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucina Leu
[285] Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com as propriedades comuns de cadeia lateral:
(1) hidrofóbicos: Norleucina, Met, Ala, Vai, Leu, lie;
(2) hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin;
(3) ácidos: Asp, Glu;
(4) básicos: His, Lys, Arg;
(5) resíduos que influenciam na orientação de cadeia: Gly, Pro;
(6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
[286] As substituições não conservatives implicam a troca de um membro de uma dessas classes por outra classe.
[287] Um tipo de variante substitucional envolve a substituição de um ou mais resíduos da região hipervariável de um anticorpo precursor (por exemplo, um anticorpo humanizado ou humano). Geralmente, a(s) vahante(s) resultante(s) selecionada(s) para estudo adicional terão modificações (por exemplo, aprimoramentos) em determinadas propriedades biológicas (por exemplo, afinidade aumentada, imunogenicidade reduzida) em relação ao anticorpo de origem e/ou terão determinadas propriedades biológicas substancialmente mantidas do anticorpo de origem. Uma variante de substituição exemplar é um anticorpo de afinidade maturada, que pode ser convenientemente gerado, por exemplo, usando técnicas de maturação de
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 173/418
167/324 afinidade baseadas na exibição de fago, tais como aquelas descritas neste documento. Brevemente, um ou mais resíduos de HVR sofrem mutação e os anticorpos variantes exibidos no fago e triados para uma atividade biológica em particular (por exemplo, afinidade de ligação).
[288] As alterações (por exemplo, substituições) podem ser feitas em HVRs, por exemplo, para aprimorar a afinidade do anticorpo. Essas alterações podem ser feitas nos pontos principais da HVR, isto é, resíduos codificados por códons que sofrem mutação em uma frequência alta durante o processo de maturação somática (ver, por exemplo, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196, 2008) e/ou resíduos que entrem em contato com o antígeno, com a variante resultante de VH ou VL sendo testada para afinidade de ligação. A maturação da afinidade pela construção e nova seleção de bibliotecas secundárias foi descrita, por exemplo, em Hoogenboom et al. em Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al. ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001). Em algumas modalidades de maturação da afinidade, a diversidade é introduzida nos genes variáveis escolhidas para a maturação por qualquer um de uma variedade de métodos (por exemplo, PCR error-prone, shuffling de cadeia ou mutagênese direcionada ao oligonucleotídeo). Uma biblioteca secundária é então criada. A biblioteca é então tríada para identificar quaisquer variantes de anticorpos com a afinidade desejada. Outro método para introduzir diversidade envolve abordagens direcionadas a HVR, em que vários resíduos de HVR (por exemplo, 4-6 resíduos por vez) são randomizados. Os resíduos de HVR envolvidos na ligação ao antígeno podem ser especificamente identificados, por exemplo, usando mutagênese de escaneamento de alanina ou modelagem. HVR-H3 e HVR-L3 em particular são frequentemente visadas.
[289] Em certas modalidades, as substituições, inserções ou deleções podem ocorrer dentro de uma ou mais HVRs, desde que essas
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 174/418
168/324 alterações não reduzam substancialmente a capacidade do anticorpo se ligar ao antígeno. Por exemplo, alterações conservadoras (por exemplo, substituições conservadoras conforme fornecidas neste documento) que não reduzem substancialmente a afinidade de ligação podem ser feitas nas HVRs. Tais alterações podem, por exemplo, estar fora dos resíduos que entram em contato com o antígeno nas HVRs. Em determinadas modalidades das sequências VH e VL variantes fornecidas acima, cada HVR é inalterada ou contém não mais de uma, duas ou três substituições de aminoácidos.
[290] Um método útil para a identificação de resíduos ou regiões de um anticorpo que pode ser direcionado para mutagênese é designado por Mutagênese de varrimento de alanina como descrito por Cunningham et al. Science 244: 1081-1085, 1989. Neste método, um resíduo ou grupo de resíduos alvo (por exemplo, resíduos carregados, tais como Arg, Asp, His, Lys e Glu) é identificado e substituído por um aminoácido neutro ou carregado negativamente (por exemplo, Ala ou polialanina) para determinar se a interação do anticorpo com o antígeno é afetada. As outras substituições podem ser introduzidas nos locais dos aminoácidos que demonstram sensibilidade funcional às substituições iniciais. Alternativa ou adicionalmente, uma estrutura cristalina de um complexo antígeno-anticorpo é obtida, a fim de identificar pontos de contato entre o anticorpo e o antígeno. Tais resíduos de contato e resíduos vizinhos podem ser direcionados ou eliminados como candidatos para a substituição. As variantes podem ser tríadas para determinar se elas contêm as propriedades desejadas.
[291] As inserções de sequência de aminoácidos incluem fusões amino e/ou carboxi-terminais que variam em comprimento de um resíduo a polipeptídeos que contém cem ou mais resíduos, bem como inserções intrassequênciais de resíduos de aminoácidos únicos ou múltiplos. Os exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo de
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 175/418
169/324 metionil do terminal N. Outras variantes de inserção da molécula de anticorpo incluem a fusão à extremidade N ou C-terminal do anticorpo a uma enzima (por exemplo, para ADEPT) ou um polipeptídeo que aumenta a meia-vida sérica do anticorpo.
b) Variantes de glicosilação [292] Em certas modalidades, um anticorpo fornecido neste documento é alterado para aumentar ou diminuir a extensão na qual o anticorpo é glicosilado. A adição ou deleção de locais de glicosilação a um anticorpo pode ser convenientemente realizada por meio da alteração da sequência de aminoácidos de forma tal que um ou mais locais de glicosilação sejam criados ou removidos.
[293] Sempre que o anticorpo compreender uma região Fc, o carboidrato ligado ao mesmo poderá ser alterado. Os anticorpos nativos produzidos por células de mamíferos tipicamente compreendem um oligossacarídeo ramificado biantenário que está geralmente ligado por uma ligação N a Asn297 do domínio CH2 da região Fc. Ver, por exemplo, Wright et al. TIBTECH 15:26-32, 1997. O oligossacarídeo pode incluir vários carboidratos, por exemplo, manose, N-acetil glicosamina (GlcNAc), galactose e ácido siálico, bem como uma fucose ligada a um GlcNAc na haste da estrutura oligossacarídica biantenária. Em algumas modalidades, modificações do oligossacarídeo em um anticorpo da invenção podem ser feitas a fim de criar variantes do anticorpo com certas propriedades melhoradas.
[294] Em uma modalidade, as variantes de anticorpo são fornecidas com uma estrutura de carboidratos que carece de fucose ligada (direta ou indiretamente) a uma região Fc. Por exemplo, a quantidade de fucose nesse anticorpo pode ser de 1% a 80%, de 1% a 65%, de 5% a 65% ou de 20% a 40%. A quantidade de fucose é determinada por meio do cálculo da quantidade média de fucose dentro da cadeia de açúcar em Asn297, em
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 176/418
170/324 relação à soma de todas as glicoestruturas ligadas a Asn297 (por exemplo, estruturas complexas, híbridas e com alto teor de manose) conforme medido pela espectrometria de massa MALDI-TOF, como descrito em WO 2008/077546, por exemplo. Asn297 se refere ao resíduo de asparagina localizado ao redor da posição 297 na região Fc (numeração Eu dos resíduos da região Fc). No entanto, Asn297 também pode estar localizado em cerca de ± 3 aminoácidos a montante ou a jusante da posição 297, isto é, entra as posições 294 e 300, devido a menores variações de sequência nos anticorpos. Tais variantes de fucosilação podem ter função de ADCC melhorada. Ver, por exemplo, as Publicações de Patentes US Nos. 2003/0157108 e 2004/0093621. Exemplos de publicações relacionadas a variantes de anticorpo defucosilada ou deficiente de fucose incluem: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; W02005/053742; W02002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249, 2004; Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614, 2004. Os exemplos de linhagens celulares capazes de produzir anticorpos desfucosilados incluem células CHO Led3 deficientes na fucosilação de proteína (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249: 533-545, 1986; US 2003/0157108; e WO 2004/056312 A1, especialmente no Exemplo 11), e linhas celulares de eliminação, tais como o gene da alfa-1,6-fucosiltransferase, FUT8, células CHO knockout (ver, por exemplo, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87:614, 2004; Kanda et al. Biotechnol. Bioeng. 94 (4): 680-688, 2006; e WO 2003/085107).
[295] As variantes de anticorpos são ainda fornecidas com oligossacarídeos divididos, por exemplo, nos quais um oligossacarídeo biantenário ligado à região Fc do anticorpo é dividido por GlcNAc. Tais variantes de anticorpos podem ter fucosilação reduzida e/ou função de ADCC
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 177/418
171/324 melhorada. Exemplos de tais variantes de anticorpo são descritos, por exemplo, em WO 2003/011878; Patente US n° 6.602.684; eUS 2005/0123546. Também são providas variantes de anticorpos com pelo menos um resíduo de galactose no oligossacarídeo ligado à região Fc. Tais variantes de anticorpos podem ter função CDC melhorada. Tais variantes de anticorpos são descritas, por exemplo, em WO 1997/30087; WO 1998/58964; e WO 1999/22764.
c) Variantes de região Fc [296] Em certas modalidades, uma ou mais modificações de aminoácidos podem ser introduzidas na região Fc de um anticorpo fornecido neste documento, gerando, desse modo, uma variante da região Fc. A variante da região Fc pode compreender uma sequência da região Fc humana (por exemplo, uma região Fc de lgG1, lgG2, lgG3 ou lgG4 humana) compreendendo uma modificação de aminoácido (por exemplo, uma substituição) em uma ou mais posições de aminoácido.
[297] Em certas modalidades, a invenção contempla uma variante de anticorpo que possui algumas, mas não todas as funções efetoras que a tomam um candidato desejável para aplicações, nas quais a meia-vida do anticorpo in vivo é importante, no entanto, certas funções efetoras (tais como complemento e ADCC) são desnecessárias ou deletérias. Ensaios de citotoxicidade in vitro e/ou in vivo podem ser realizados para confirmar a redução/depleção das atividades de CDC e/ou ADCC. Por exemplo, os ensaios de ligação do receptor de Fc (FcR) podem ser realizados para garantir que o anticorpo careça de ligação de FcyR (consequentemente provável de carecer da atividade de ADCC), mas mantenha a capacidade de ligação ao FcRn. As células primárias para mediação de ADCC, as células NK, expressam FcyRIII apenas, enquanto os monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. A expressão de FcR em células hematopoiéticas está resumida na Tabela 3 na página 464 de Ravetch et al. Annu. Rev. Immunol. 9:457-492, 1991. Exemplos
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 178/418
172/324 não-limitantes de ensaios in vitro para avaliar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse são descritos na Patente U.S. N° 5.500.362 (vide, por exemplo, Hellstrom, I. et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:7059-7063, 1986 e Hellstrom et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82: 1499-1502, 1985; Patente US n° 5.821.337 (ver Bruggemann et al. J. Exp. Med. 166:1351-1361, 1987). Altemativamente, métodos de ensaios não radioativos podem ser empregados (ver, por exemplo, ensaio de citotoxicidade não radioativo para citometria de fluxo ACTI™ (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; e ensaio de citotoxicidade não radioativo CytoTox 96® (Promega, Madison, Wl). As células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e células exterminadoras naturais (NK). Alternativa ou adicionalmente, a atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal, tal como aquele divulgado em Clynes et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95:652-656, 1998. Ensaios de ligação a C1q também podem ser realizados para confirmar que o anticorpo é incapaz de se ligar a C1q e, consequentemente, carece da atividade de CDC. Ver, por exemplo, ELISA de ligação a C1q e C3c em WO 2006/029879 e WO 2005/100402. Para avaliar a ativação do complemento, um ensaio de CDC pode ser realizado (ver, por exemplo Gazzano-Santoro et al. J. Immunol. Methods 202:163, 1996; Cragg et al. Blood 101: 1045-1052, 2003; e Cragg et al. Blood 103: 2738-2743, 2004). As determinações de ligação a FcRn e da depuração/semivida in vivo também podem ser realizadas usando métodos conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Petkova et al. Inti. Immunol. 18(12):1759-1769, 2006).
[298] Anticorpos com função efetora reduzida incluem aqueles com substituição de um ou mais dos resíduos da região Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 e 329 (Patente U.S. n° 6.737.056). Tais mutantes de Fc incluem mutantes de Fc com substituições em duas ou mais das posições de
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 179/418
173/324 aminoácidos 265, 269, 270, 297 e 327, incluindo o assim denominado mutante de Fc DANA com substituição de resíduos 265 e 297 para alanina (Patente U.S. n° 7.332.581).
[299] Algumas variantes de anticorpos com ligação melhorada ou diminuída a FcRs são descritas. (Vide, por exemplo, Patente U.S. n° 6.737.056; WO 2004/056312, e Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).
[300] Em determinadas modalidades, uma variante do anticorpo compreende uma região Fc com uma ou mais substituições de aminoácidos que aprimoram ADCC, por exemplo, substituições nas posições 298, 333 e/ou 334 da região Fc (numeração EU dos resíduos).
[301] Em algumas modalidades, alterações são feitas na região Fc que resultam na ligação a C1q alterada (isto é, ou aprimorada ou diminuída) e/ou Citotoxicidade Dependente do Complemento (CDC), por exemplo, como descrito na Patente US n° 6.194.551, WO 99/51642, e Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184, 2000.
[302] Os anticorpos com maior meia-vida e melhor ligação ao receptor de Fc neonatal (FcRn), que é responsável pela transferência de IgGs matemos para o feto (Guyer et al. J. Immunol. 117:587, 1976 e Kim et al. J. Immunol. 24: 249, 1994), são descritos em US2005/0014934. Esses anticorpos compreendem uma região Fc com uma ou mais substituições que melhoram a ligação da região Fc ao FcRn. Essas variantes Fc incluem aquelas substituições em um ou mais resíduos da região Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ou 434, por exemplo, substituição do resíduo 434 da região Fc (Patente US n° 7.371.826).
[303] Ver também Duncan et al. Nature 322:738-40 (1988); Patente US n° 5.648.260; e 5.624.821; e WO 94/29351 sobre outros exemplos de variantes de região Fc.
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 180/418
174/324
d) Variantes de anticorpo projetadas com cisteína [304] Em determinadas modalidades, pode ser desejável criar anticorpos projetados com cisteína, por exemplo, tioMAbs, em que um ou mais resíduos de um anticorpo são substituídos por resíduos de cisteína. Em modalidades específicas, os resíduos substituídos ocorrem em locais acessíveis do anticorpo. Substituindo esses resíduos por cisteína, os grupos tiol reativos são posicionados, desse modo, em locais acessíveis do anticorpo e podem ser usados para conjugar o anticorpo com outras frações, tais como frações da droga ou frações da droga-ligante, a fim de criar um imunoconjugado, como também descrito neste documento. Em certas modalidades, qualquer um ou mais dos seguintes resíduos pode ser substituído por cisteína: V205 (numeração de Kabat) da cadeia leve; A118 (numeração EU) da cadeia pesada; e S400 (numeração EU) da região Fc da cadeia pesada. Anticorpos manipulados com cisteína podem ser gerados como descrito, por exemplo, na Patente US n° 7.521.541.
e) Anticorpos derivados [305] Em determinadas modalidades, um anticorpo fornecido neste documento pode ser ainda modificado para conter outras frações não proteicas conhecidas na técnica e prontamente disponíveis. As frações adequadas para a derivação do anticorpo incluem, mas não estão limitadas aos polímeros solúveis em água. Exemplos não-limitantes de polímeros solúveis em água incluem, mas não estão limitados a, polietilenoglicol (PEG), copolímeros de etilenoglicol/propilenoglicol, carboximetilcelulose, dextrana, álcool polivinílico, polivinil pirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anidrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros ou copolímeros aleatórios) e dextrana ou poli(n-vinil pirrolidona)polietilenoglicol, homopolímeros de propropilenoglicol, copolímeros de óxido de prolipropileno/óxido de etileno, polióis polioxietilados (por exemplo, glicerol),
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 181/418
175/324 álcool polivinílico e misturas dos mesmos. O propionaldeído de polietileno glicol pode ter vantagens na fabricação devido à sua estabilidade na água. O polímero pode ser de qualquer peso molecular e pode ser ramificado ou não ramificado. O número de polímeros ligados ao anticorpo pode variar, e se mais de um polímero for ligado, eles poderão ser moléculas iguais ou diferentes. Em geral, o número e/ou tipo de polímeros usados para derivação pode ser determinado com base em considerações, incluindo, mas não se limitando às propriedades ou funções específicas do anticorpo a ser aprimorado, se o derivado do anticorpo será usado em uma terapia sob condições definidas, e semelhantes.
[306] Em outra modalidade, são fornecidos os conjugados de um anticorpo e fração não proteica que podem ser seletivamente aquecidos pela exposição à radiação. Em uma modalidade, a fração não proteica é um nanotubo de carbono (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 102: 1160011605, 2005). A radiação pode ser de qualquer comprimento de onda e inclui, mas não está limitada aos comprimentos de onda que não prejudicam as células normais, porém aquecem a fração não proteica até uma temperatura na qual as células próximas à fração não proteica do anticorpo sejam mortas.
B. Métodos e composições recombinantes [307] Os anticorpos podem ser produzidos usando métodos recombinantes e composições, por exemplo, como descrito na Patente U.S. n° 4.816.567. Em uma modalidade, é fornecido o ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo anti-triptase descrito neste documento. Tal ácido nucleico pode codificar uma sequência de aminoácidos que compreende a VL e/ou uma sequência de aminoácidos compreendendo a VH do anticorpo (por exemplo, as cadeias leves e/ou pesadas do anticorpo). Em uma modalidade adicional, um ou mais vetores (por exemplo, vetores de expressão) compreendendo esses ácidos nucleicos são fornecidos. Em outra modalidade, é provida uma célula
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 182/418
176/324 hospedeira compreendendo esse ácido nucleico. Em uma modalidade dessas, uma célula hospedeira compreende (por exemplo, foi transformada com): (1) um vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo a VL do anticorpo e uma sequência de aminoácidos compreendendo a VH do anticorpo, ou (2) um primeiro vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo a VL do anticorpo e um segundo vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo a VH do anticorpo. Em uma modalidade, a célula hospedeira é eucariótica, por exemplo, uma célula de Ovário de Hamster Chinês (CHO), célula 293 ou células linfoides (por exemplo, células YO, NSO, Sp20). Em uma modalidade, um método de produção de um anticorpo antitriptase é fornecido, em que o método compreende cultivar uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico codificando o anticorpo, como fornecido acima, sob condições adequadas para a expressão do anticorpo, e opcionalmente recuperando o anticorpo a partir da célula hospedeira (ou meio de cultura de célula hospedeira).
[308] Para a produção recombinante de um anticorpo antitriptase, o ácido nucleico que codifica um anticorpo, por exemplo, como descrito acima, é isolado e inserido em um ou mais vetores para posterior clonagem e/ou expressão em uma célula hospedeira. Esse ácido nucleico pode ser facilmente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, usando sondas de oligonucleotídeos que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as cadeias pesadas e leves do anticorpo).
[309] As células hospedeiras adequadas para a clonagem ou expressão de vetores codificantes de anticorpos incluem as células procarióticas ou eucarióticas descritas neste documento. Por exemplo, os
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 183/418
177/324 anticorpos podem ser produzidos em bactérias, particularmente quando a glicosilação e função efetora de Fc não forem necessárias. Para a expressão dos fragmentos de anticorpo e polipeptídeos em bactérias, ver, por exemplo, Patentes U.S. n° 5.648.237, 5.789.199, e 5.840.523. Ver também Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254, que descreve a expressão de fragmentos de anticorpo em E. coli. Após a expressão, o anticorpo pode ser isolado da massa de células bacteriana sem uma fração solúvel e pode ainda ser purificada.
[310] Além de procariontes, micróbios eucariontes tais como fungos filamentosos ou leveduras são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para vetores codificantes de anticorpo, incluindo cepas de fungos e leveduras cujas vias de glicosilação foram humanizadas, resultando na produção de um anticorpo com um padrão de glicosilação parcial ou totalmente humano. Ver Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414, 2004, and Li et al. Nat. Biotech. 24:210-215, 2006.
[311] As células hospedeiras adequadas para a expressão do anticorpo glicosilado também são derivadas de organismos multicelulares (invertebrados e vertebrados). Os exemplos de células de invertebrados incluem células vegetais e de insetos. Foram identificadas inúmeras cepas de baculovírus que podem ser usadas em conjunto com células de insetos, particularmente para a transfecção de células de Spodoptera frugiperda .
[312] Culturas de células vegetais também podem ser utilizadas como hospedeiras. Ver, por exemplo, Patente US n° 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, e 6,417,429 (que descreve a tecnologia
PLANTIBODIES™ para a produção de anticorpos em plantas transgênicas).
[313] Células de vertebrados também podem ser usadas como hospedeiras. Por exemplo, linhas celulares de mamífero que estão adaptadas para crescer em suspensão podem ser úteis. Outros exemplos de linhagens de
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 184/418
178/324 células hospedeiras de mamíferos úteis são a linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7); linhagem de rim embrionário humano (células 293 ou 293 como descrito, por exemplo, em Graham et al., J. Gen Virol. 36:59, 1977); células de rim de hamster bebê (BHK); células de sertoli de camundongos (células TM4 como descrito, por exemplo, em MatherB/o/. Reprod. 23:243-251, 1980); células de rim de macaco (CV1); células de rim de macaco verde africano (VERO-76); células de carcinoma cervical humano (HELA); células de rim canino (MDCK; células de fígado de rato do tipo búfalo (BRL 3A); células de pulmão humano (W138); células de fígado humano (Hep G2); tumor de mamífero de camundongo (MMT 060562); células TRI, como descrito, por exemplo, em Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 1982; células MRC 5; e células FS4. Outras linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis incluem células de ovário de hamster chinês (CHO), incluindo células DHFRCHO (llrlaub et al. Proc. Natl. Acad. Sci. l/SA77:4216 1980); e linhagens celulares de mieloma tais como Y0, NSO e Sp2/0. Para uma revisão de algumas linhagens celulares hospedeiras de mamíferos adequadas para a produção de anticorpos, vide, por exemplo, Yazaki et al. Methods in Molecular Biology, vol. 248 (BKC Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255268, 2003.
C. Ensaios [314] Os anticorpos anti-thptase fornecidos neste documento podem ser identificados, triados ou caracterizados por suas propriedades físicas/químicas e/ou atividades biológicas por vários ensaios conhecidos na técnica.
1. Ensaios de ligação e outros ensaios [315] Num aspecto, um anticorpo anti-thptase da invenção testado quanto sua atividade de ligação ao antígeno, por exemplo, através de métodos conhecidos, tais como ELISA, Western blot, ressonância plasmônica
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 185/418
179/324 de superfície (SPR) e semelhantes.
[316] Noutro aspecto, os ensaios de competição podem ser usados para identificar um anticorpo que compete com um anticorpo antitriptase da invenção para ligação a triptase. Em determinadas modalidades, tal anticorpo competidor liga-se ao mesmo epítopo (por exemplo, um epítopo linear ou conformacional) que é ligado por um anticorpo anti-triptase da invenção. Em determinadas modalidades, tal anticorpo competidor liga-se a um epítopo sobreposto (por exemplo, um epítopo linear ou conformacional) que é ligado por um anticorpo anti-triptase da invenção. Os métodos exemplares detalhados para o mapeamento de um epítopo ao qual um anticorpo se liga são fornecidos em Morris Epitope Mapping Protocols, em Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ), 1996.
[317] Em um ensaio de competição exemplar, a triptase imobilizada é incubada em uma solução que compreende um primeiro anticorpo marcado que se liga à triptase e um segundo anticorpo marcado que está sendo testado quanto à sua capacidade de competir com o primeiro anticorpo pela ligação à triptase. O segundo anticorpo pode estar presente em um sobrenadante do hibridoma. Como um controle, triptase imobilizada é incubado em uma solução compreendendo o primeiro anticorpo marcado, mas não o segundo anticorpo não marcado. Após a incubação sob condições permissivas para a ligação do primeiro anticorpo à triptase, o excesso de anticorpo não ligado é removido e a quantidade de marcação associada à triptase imobilizada é medida. Se a quantidade de marcação associada à triptase imobilizada for substancialmente reduzida na amostra de teste em relação à amostra de controle, indica então que o segundo anticorpo está competindo com o primeiro anticorpo para a ligação à triptase. Ver Harlow et al. Antibodies: A Laboratory Manual Ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY), 1988.
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 186/418
180/324 [318] Noutra modalidade, a competição de dois anticorpos para ligação ao mesmo epítopo determinada por binning de epítopo. Por exemplo, o antígeno marcado é imobilizado numa superfície sólida e feito reagir com uma quantidade saturante de um primeiro anticorpo. Um segundo anticorpo competidor é então adicionado. Qualquer ligação adicional pelo segundo anticorpo, tal como detectada por, por exemplo, técnicas OCTET® (ForteBio) ou outras técnicas de interferometria de camada bioquímica (BLI), indica que os dois anticorpos se ligam a epítopos distintos, não sobreponíveis. Nenhuma ligação adicional indica que os dois anticorpos se ligam ao mesmo epítopo ou ao epítopo sobreposto. Vários outros métodos, incluindo ELISA, cromatografia por exclusão de tamanho, cristalografia, HDX-MS, mutagênese e outros métodos de SPR, também podem ser empregados para demonstrar que dois anticorpos se ligam aos mesmos epítopos ou sobrepondo-se a epítopos. Técnicas semelhantes podem ser utilizadas para determinar se um anticorpo bloqueia, ou é bloqueado de forma cruzada pelo anticorpo da invenção.
2. Ensaios de atividade [319] Em um aspecto, os ensaios são fornecidos para identificar anticorpos anti-triptase destes possuindo atividade biológica. A atividade biológica pode incluir, por exemplo, a ligação triptase (por exemplo, triptase na corrente sanguínea ou na via aérea), ou um seu fragmento peptídico, in vivo, in vitroou ex vivo. Noutras modalidades, a atividade biológica pode incluir bloquear ou neutralizar a triptase. Por exemplo, em algumas modalidades, a atividade biológica pode incluir bloquear ou neutralizar a atividade proteolítica da triptase. Possuindo tal atividade biológica in vivo e/ou in vitro de anticorpos também são fornecidos. Em determinadas modalidades, um anticorpo da invenção é testado para tal atividade biológica.
[320] Por exemplo, em algumas modalidades, um anticorpo da invenção é testado para inibição da atividade da triptase num ensaio
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 187/418
181/324 enzimático triptase, por exemplo, utilizando um substrato peptídico (por exemplo, peptídeo sintético S-2288), por exemplo, como descrito nos Exemplos (por exemplo, Exemplo 1, particularmente Seção (A) (viii) (a)), ou usando métodos conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Fukuoka et al. J. Immunol. 176: 3165-3172, 2006). Em algumas modalidades, a inibição da atividade da triptase num ensaio enzimático triptase é realizada a ou próximo do pH neutro (por exemplo, cerca de pH 7, por exemplo, cerca de pH 7, cerca de pH, 7,4, ou cerca de pH 8). Noutras modalidades, a inibição da atividade da triptase num ensaio enzimático triptase é realizada a um pH ácido (por exemplo, cerca de pH 6,0, por exemplo, cerca de pH 4,0, cerca de pH 5,0, cerca de pH 6,0, ou cerca de pH 6,5).
[321] Noutras modalidade, um anticorpo da invenção testado quanto à capacidade de romper a triptase possuindo uma estrutura tetramárica (tal como triptase madura presente ou libertada de grânulos de secreção de mastócitos) para formar monômeros, que podem ser determinados utilizando qualquer método adequado conhecido na técnica, incluindo cromatografia de filtração em gel (por exemplo, cromatografia de filtração em gel SUPEROSE® 12). Ver, por exemplo, em Fukuoka et al. J. Immunol. 176:3165-3172, 2006.
[322] Ainda noutras modalidades, um anticorpo da invenção é testado para a capacidade de inibir a proliferação e/ou contração estimuladas pela triptase de células do músculo liso das vias respiratórias primárias humanas, como descrito, por exemplo, no Exemplo 1.
[323] Ainda noutras modalidades, um anticorpo da invenção testado quanto à capacidade para inibir a desgranulação de mastócitos e/ou liberação de histamina, por exemplo, estimulada por triptase e/ou IgE. Tais ensaios são descritos, por exemplo, no Exemplo 1.
[324] Em algumas modalidades, um anticorpo da invenção é testado para a capacidade de inibir a triptase ativa, por exemplo, num ensaio
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 188/418
182/324 de triptase ativo (ver, por exemplo, a Fig. 15 e Exemplo 6), por exemplo, numa amostra (por exemplo, fluido de lavagem broncoalveolar) obtido de um sujeito após a administração do anticorpo ao sujeito (por exemplo, por injeção intravenosa ou subcutânea).
[325] Ainda noutras modalidades, um anticorpo da invenção testado quanto capacidade para modular (por exemplo, aumentar ou diminuir) os níveis totais de triptase, por exemplo, num ensaio total de triptase (ver, por exemplo, a Fig. 15 e Exemplo 6), para exemplo, numa amostra (por exemplo, fluido de lavagem broncoalveolar) obtida de um sujeito após a administração do anticorpo ao sujeito (por exemplo, por injeção intravenosa ou subcutânea).
D. Imunoconjugados [326] A invenção também fornece imunoconjugados compreendendo um anticorpo anti-triptase neste documento conjugado a um ou mais agentes citotóxicos, tais como agentes quimioterápicos ou drogas, agentes inibidores de crescimento, toxinas (por exemplo, toxinas de proteínas, toxinas ativas enzimaticamente de bactérias, fungos, plantas, ou origem animal ou respectivos fragmentos) ou isótopos radioativos.
[327] Em uma modalidade um imunoconjugado é um conjugado de anticorpo-droga (ADC) no qual um anticorpo é conjugado a uma ou mais drogas, incluindo, mas não se limitando a um maitansinoide (ver as Patentes U.S. n° 5.208.020, 5.416.064 e Patente Européia EP 0 425 235 B1); uma auristatina, tal como frações da droga monometilauristatina DE e DF (MMAE e MMAF) (ver Patente U.S. n° 5.635.483 e 5.780.588, e 7.498.298); uma dolastatina; uma caliqueamicina ou derivado dos mesmos (ver Patentes U.S. n° 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001, e 5.877.296; Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342, 1993; e Lode et al. Cancer Res. 58:2925-2928, 1998); uma antraciclina tal a daunomicina ou doxorrubicina (ver Kratz et al. Current Med. Chem. 13:477-523, 2006; Jeffrey et
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 189/418
183/324 al. Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362, 2006; Torgov et al. Bioconj. Chem. 16:717-721, 2005; Nagy et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834, 2000; Dubowchik et al. Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532, 2002; King et al. J. Med. Chem. 45:4336-4343, 2002; e Patente U.S. n° 6.630.579); metotrexato; vindesina; um taxano, tal como docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel e ortataxel; um tricoteceno; e CC1065.
[328] Em outra modalidade, um imunoconjugado compreende um anticorpo como descrito neste documento conjugado a uma toxina enzimaticamente ativa ou fragmento dos mesmos, incluindo mas não limitado a cadeia A de difteria, fragmentos ativos não ligantes da toxina da difteria, cadeia A da exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), Cadeia A de ricina, cadeia A abrina, cadeia A de modecina, alfa-sarcina, proteínas Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e o tricotecenos.
[329] Em outra modalidade, um imunoconjugado compreende um anticorpo como descrito neste documento conjugado a um átomo radioativo, a fim de formar um radioconjugado. Uma variedade de isótopos radioativos está disponível para a produção de radioconjugados. Exemplos incluem At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioativos de Lu. Quando o radioconjugado é utilizado para a detecção, isso pode compreender um átomo radioativo para estudos cintilográficos, por exemplo, tecnécio-99m (tc99m) ou I123, ou uma marca de rotação para imagens de ressonância magnética nuclear (NMR) (também conhecido como imagem por ressonância magnética, mri), tais como o iodo-123 novamente, iodo-131, índio-111, flúor-19, carbono-13, nitrogênio-15, oxigênio-17, gadolínio, manganês ou ferro.
[330] Os conjugados de um anticorpo e agente citotóxico podem ser feitos usando uma variedade de agentes de acoplamento de proteínas
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 190/418
184/324 bifuncionais, tais como propionato de N-sucinimidil-3-(2-piridilditio) (SPDP), ciclo-hexano-1-carboxilato de sucinimidil-4-(N-maleimidometil)(SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (como adipimidato de dimetil HCI), ésteres ativos (tais como, suberato de disucinimidil), aldeídos (tais como o glutaraldeído), compostos de bis-azido (como bis (p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (tais como bis-(p-diazoniumbenzoil)etilenediamina), di-isocianatos (tais como, di-isocianato de 2,6-tolueno) e compostos de flúor bis-ativo (tais como, 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina de ricina pode ser preparada como descrito em Vitetta et al., Science 238:1098, 1987. O ácido 1-isotiocianatobenzil-3metildietileno triaminopenta-acético marcado no carbono 14 (MX-DTPA) é um agente quelante exemplar para a conjugação do radionucleotídeo ao anticorpo. Ver WO 94/11026. O ligante pode ser um ligante clivável facilitando a liberação de uma droga citotóxica na célula. Por exemplo, um ligante de ácidolábil, ligante sensível a peptidases, ligante fotolábil, ligante dimetil ou ligante contendo dissulfeto (ver, por exemplo, Chari et al. Cancer Res. 52:127-131, 1992; U.S. Patent n° 5.208.020) podem ser usados.
[331] O imunoconjugado ou ADCs deste documento contemplam expressamente, mas não estão limitados a tais conjugados preparados com reagentes reticuladores incluindo, mas não limitados a, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC e sulfo-SMPB e SVSB (sucinimidil-(4-vinilsulfona)benzoato), que são comercialmente disponíveis (por exemplo, pela PierceBiotechnology, Inc., Rockford, IL., EUA).
E. Métodos e composições para diagnósticos e detecção [332] Em determinadas modalidades, qualquer um dos anticorpos anti-triptase fornecidos neste documento é útil para a detecção da
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 191/418
185/324 presença de triptase em uma amostra biológica. O termo detectar como usado neste documento abrange a detecção quantitativa ou qualitativa. Em certas modalidades, uma amostra biológica compreende uma célula ou tecido, incluindo, mas não limitado aos mastócitos, basófilos, células epiteliais ou tecido pulmonar (por exemplo, músculo liso brônquico). Em certas modalidades, uma amostra biológica compreende sangue (por exemplo, sangue total, soro ou plasma), expectoração, lavagem broncoalveolar ou uma amostra de nasossorção.
[333] Em uma modalidade, um anticorpo anti-triptase para uso em um método de diagnóstico ou detecção é fornecido. Em um aspecto adicional, é fornecido um método de detecção da presença de tripatse em uma amostra biológica. Em determinadas modalidades, o método compreende colocar em contato a amostra biológica com um anticorpo anti-triptase como descrito neste documento sob condições permissivas para a ligação do anticorpo anti-triptase a triptase e detectar se um complexo é formado entre o anticorpo anti-triptase e triptase. Esse método pode ser um método in vitro ou in vivo. Em uma modalidade, um anticorpo anti-triptase é usado para selecionar sujeitos elegíveis para a terapia com um anticorpo anti-triptase, por exemplo, onde triptase é um biomarcador para a seleção dos pacientes.
[334] Doenças exemplares que podem ser diagnosticadas usando um anticorpo da invenção incluem distúrbios pulmonares (por exemplo, asma (por exemplo, asma Th2-alta ou asma Th2-baixo), hiperresponsividade das vias respiratórias ou DPOC), doenças autoimunes (por exemplo, artrite reumatoide, psoríase, esofagite eosinofílica, IBD e doença de Crohn), distúrbios inflamatórias (por exemplo, urticária idiopática crônica (CIU ou CSU), dermatite atópica, ou rinite alérgica), doenças fibróticas (por exemplo, FPI), granulocíticos (neutrofílico ou eosinofílica) transtornos monocítica distúrbios, transtornos linfocítico, distúrbios associados com números aumentados ou
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 192/418
186/324 distribuição de células residentes normais ou aberrantes em tecidos e (por exemplo, mastócitos, macrófagos ou linfócitos) ou células do estroma (tais como fibroblastos, miofibroblastos, células musculares lisas, epitélios, ou endotélio e triptase associados ou distúrbios mediados por triptase.
[335] Por exemplo, em alguns casos, os anticorpos da invenção podem ser usados para diagnosticar ou detectar anafilaxia (por exemplo, anafilaxia sistêmica aguda) ou mastocitose (por exemplo, mastocitose sistêmica não aguda), por exemplo, como descrito em Schwartz et al. Immunol. Allergy Clin. N. Am. 26: 451-463, 2006). Os anticorpos da invenção podem ser utilizados, por exemplo, num ELISA para detectar os níveis de triptase total, pró-triptase e/ou triptase madura. Em algumas modalidades, um anticorpo da invenção pode ser utilizado como um anticorpo de captura num ELISA. Noutras modalidades, um anticorpo da invenção pode ser utilizado como um anticorpo de detecção num ELISA. Nas modalidades particulares, um nível de referência normal de triptase total no soro ou plasma pode ser cerca de 1-15 ng/mL (por exemplo, cerca de 1 ng/mL, cerca de 2 ng/mL, cerca de 3 ng/mL, cerca de 4 ng/mL cerca de 5 ng/mL, cerca de 6 ng/mL, cerca de 7 ng/mL, cerca de 8 ng/mL, cerca de 9 ng/mL, cerca de 10 ng/mL, cerca de 11 ng/mL, cerca de 12 ng/mL, cerca de 13 ng/mL, cerca de 14 ng/mL, ou cerca de 15 ng/mL). Em alguns casos, um aumento em relação a um nível de referência normal de triptase total é usado como um indicador de diagnóstico de um distúrbio associado à triptase. Em algumas modalidades, um nível de referência normal de triptase madura no soro ou plasma pode ser <1 ng/mL. Em algumas modalidades, um aumento relativo a um nível de referência normal de triptase madura pode ser utilizado como um indicador de diagnóstico de um distúrbio associado à triptase.
[336] Em determinadas modalidades, são fornecidos anticorpos anti-triptase marcados. As marcações incluem, mas não estão limitadas a
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 193/418
187/324 marcações ou frações que são detectadas diretamente (tais como marcações fluorescentes, cromóforas, eletrodensas, quimioluminescentes e radioativas), bem como frações, tais como enzimas ou ligantes, que são detectados indiretamente, por exemplo, através de uma reação enzimática ou interação molecular. Marcações exemplares incluem, mas não estão limitadas a, radioisótopos 32P, 14C, 125l, 3H e 1311, fluóforos, tais como quelatos de terra rara ou fluoresceína e seus derivados, rodamina e seus derivados, dansil, umbeliferona, luceferases, por exemplo, luciferase de vagalume e luciferase bacteriana (Patente U.S. n° 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalazinadionas, peroxidase de raiz forte (HRP), fosfatase alcalina, β-galactosidase, glicoamilase, lisozima, sacarídeo oxidases, por exemplo, glicose oxidase, galactose oxidase, e glicose-6-fosfato desidrogenase, oxidases heterocíclicas, tais como uricase e xantina oxidase, acopladas com uma enzima que emprega o peróxido de hidrogênio para oxidar um precursor de corante, tal como HRP, lactoperoxidase ou microperoxidase, biotina/avidina, marcadores de spin, marcadores de bacteriófago, radicais livres estáveis e similares.
F. Formulações Farmacêuticas [337] Preparam-se formulações farmacêuticas de um anticorpo anti-triptase da invenção misturando esse anticorpo possuindo o grau de pureza desejado com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis opcionais (ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Osol, A. Ed., 1980), sob a forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Transportadores farmaceuticamente aceitáveis são geralmente não tóxicos aos recebedores nas dosagens e concentrações empregadas, e incluem, mas não estão limitados a: tampões, tais como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio; cloreto de benzetônio; álcool fenólico,
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 194/418
188/324 butílico ou benzílico; alquilparabenos, tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofilicos, tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos, incluindo glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes, tais como EDTA; açúcares, tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contraíons formadores de sal, tais como sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexos de Zn-proteína); e/ou surfactantes não iônicos, tais como polietilenoglicol (PEG). Veículos farmaceuticamente aceitáveis exemplares neste documento incluem adicionalmente agentes de dispersão de drogas intersticiais, tais como glicoproteínas de hialuronidase ativas neutras solúveis (sHASEGP), por exemplo, glicoproteínas da hialuronidase PH-20 solúveis humanas, tais como rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Determinados sHASEGPs exemplares e métodos de uso, incluindo rHuPH20, são descritos na Publicação de Patente norteamericana n° 2005/0260186 e 2006/0104968. Em um aspecto, uma sHASEGP é combinada com uma ou mais glicosaminoglicanases adicionais, tais como condroitinases.
[338] As formulações de anticorpo liofilizadas exemplares são descritas na Patente US n° 6.267.958. Formulações de anticorpo aquosas incluem aquelas descritas na Patente US n° 6.171.586 e WO 2006/044908, as últimas formulações incluindo um tampão de histidina-acetato.
[339] A formulação neste documento também pode conter mais de um ingrediente ativo conforme necessário para a indicação específica sendo tratada, preferencialmente aquelas com atividades complementares que não prejudiquem umas às outras. Por exemplo, pode ser desejável proporcionar adicionalmente um antagonista de ligação à interleucina-13 (IL-13), um
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 195/418
189/324 antagonista de ligação ao eixo da interleucina-17 (IL-17), um antagonista de ligação ao eixo da interleucina-5 (IL-5), um antagonista de ligação ao eixo IL33, um antagonista do prime M1, um antagonista de IgE, um antagonista de TRPA1, um antagonista de CRTH2, um broncodilatador ou medicação de controle de sintomas de asma, um imunomodulador, um corticosteroide, um inibidor da via Th2, um inibidor de tirosina quinase ou um inibidor fosfodiesterase. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao eixo da IL-13 é um anticorpo anti-IL-13, por exemplo, lebrikizumabe. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao eixo da IL-5 é um antagonista de ligação a IL-5 ou um antagonista de ligação ao receptor de IL-5. Em algumas modalidades, um antagonista de ligação ao eixo IL-33 é um antagonista de ligação a IL-33 ou um antagonista de ligação a ST2. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação a IL-33 é um anticorpo anti-IL-33. Em alguns casos, o antagonista do prime M1 é o quilizumabe. Em alguns casos, o antagonista da IgE é omalizumabe (XOLAIR®). Tais ingredientes ativos estão adequadamente presentes juntamente com quantidades que são eficazes para a finalidade pretendida.
[340] Os ingredientes ativos podem ser aprisionados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli (metilmetacilato), respectivamente, em sistemas de distribuição de drogas coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Essas técnicas são divulgadas em Remington's Pharmaceutical Sciences 16a ed., Osol, A. Ed., 1980.
[341] Preparações de liberação prolongada podem ser preparadas. Exemplos adequados de preparações de liberação prolongada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 196/418
190/324 anticorpo, matrizes estas que estão na forma de artigos moldados, por exemplo, películas ou microcápsulas.
[342] As formulações a serem utilizadas para a administração in vivo são geralmente estéreis. A esterilidade pode ser facilmente realizada, por exemplo, pela filtração através de membranas de filtração estéreis.
[343] A invenção fornece composições farmacêuticas que incluem antioxidantes. Tais composições podem ser utilizadas para reduzir a oxidação de um anticorpo descrito neste documento (por exemplo, um anticorpo anti-triptase, tal como hu31A.v11). Em alguns casos, um antioxidante é incluído para reduzir a oxidação de um resíduo de triptofano, por exemplo, um resíduo de triptofano em uma região HVR ou uma região FR de uma região variável. Em casos particulares, um antioxidante é incluído para reduzir a oxidação de um resíduo HVR-H3 de um anticorpo anti-triptase, por exemplo, W100 em hu31A.v11. Em alguns casos, um antioxidante é incluído na composição para reduzir a oxidação de um resíduo de metionina, por exemplo, um resíduo de metionina na região Fc de um anticorpo (por exemplo, um anticorpo anti-triptase), como os resíduos Fc M251, M357 e/ou M427 (por exemplo, de hu31 A.v11).
[344] Em alguns casos, a composição farmacêutica inclui qualquer um dos anticorpos aqui descritos e um antioxidante. Em alguns casos, o anticorpo é suscetível à oxidação (por exemplo, em um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10) resíduos de triptofano ou metionina). Qualquer antioxidante adequado pode ser usado. Por exemplo, em alguns casos, a composição inclui um ou mais antioxidantes (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 antioxidantes) selecionados do grupo que consiste em Nacetiltriptofano (por exemplo, N -acetil DL-triptofano ou N-acetil-D-triptofano), triptofano, metionina (por exemplo, L-metionina), cisteína, glutationa, tiosorbitol, ácido ascórbico, monotioglicerol, ciclodextrinas, Trolox, piridoxina, poliois (por
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 197/418
191/324 exemplo, manitol), sacarose, um quelante de metal (por exemplo, EDTA) e suas combinações (por exemplo, uma combinação de N-acetiltriptofano e metionina). Em alguns casos, o antioxidante é N-acetiltriptofano (por exemplo, N-acetil-DL-triptofano ou N-acetil-D-triptofano). Em outros casos, o antioxidante é a metionina (por exemplo, L-metionina ou D-metionina). Em casos particulares, a composição inclui N-acetiltriptofano (por exemplo, N-acetil-DLtriptofano ou N-acetil-D-triptofano) e metionina (por exemplo, L-metionina ou Dmetionina). Em alguns casos, o N-acetiltriptofano reduz ou previne a oxidação do triptofano no anticorpo. Em alguns casos, a metionina reduz ou previne a oxidação da metionina no anticorpo.
[345] A composição farmacêutica pode incluir qualquer concentração adequada do antioxidante para reduzir ou eliminar a oxidação. Por exemplo, a concentração de poliois (por exemplo, manitol) ou sacarose pode ser de cerca de 1% (p/v) a cerca de 25% (p/v), por exemplo, cerca de 1%, cerca de 2%, cerca de 3%, cerca de 4%, cerca de 5%, cerca de 6%, cerca de 7%, cerca de 8%, cerca de 9%, cerca de 10%, cerca de 11%, cerca de 12%, cerca de 13%, cerca de 15%, cerca de 16%, cerca 17%, cerca de 18%, cerca de 19%, cerca de 20%, ou cerca de 25% (p/v). Em casos particulares, a concentração de poliois (por exemplo, manitol) ou sacarose pode ser de cerca de 15% (p/v). Noutro exemplo, a concentração de quelantes metálicos (por exemplo, EDTA) pode ser de cerca de 0,01% (p/v) a cerca de 1% (p/v), por exemplo, cerca de 0,01%, cerca de 0,02%, cerca de 0,03%, cerca de 0,04%, cerca de 0,05%, cerca de 0,06%, cerca de 0,07%, cerca de 0,08%, cerca de 0,09%, cerca de 0,1%, cerca de 0,15%, cerca de 0,2%, cerca de 0,25%, cerca de 0,3%, cerca de 0,4%, cerca de 0,45%, cerca de 0,5%, cerca de 0,6%, cerca de 0,7%, cerca de 0,8%, cerca de 0,9%, ou cerca de 1% (p/v). Em casos particulares, a concentração de um quelante de metal (por exemplo, EDTA) pode ser de cerca de 0,4% (p/v). Ainda num outro exemplo, a concentração de
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 198/418
192/324 metionina e/ou triptofano pode ser de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 10 mg/ml, por exemplo, cerca de 0,1 mg/ml, cerca de 0,5 mg/ml, cerca de 1 mg/ml, cerca de 2 mg/ml, cerca de 3 mg/ml, cerca de 4 mg/ml, cerca de 5 mg/ml, cerca de 6 mg/ml, cerca de 7 mg/ml, cerca de 8 mg/ml, cerca de 9 mg/ml ou cerca de 10 mg/ml. Em alguns casos, a concentração de metionina e/ou triptofano é de cerca de 2 mg/ml.
[346] Por exemplo, em alguns casos, a invenção fornece uma composição farmacêutica que inclui:
(i) um anticorpo isolado se liga à triptase humana, ou um fragmento de ligação ao antígeno, em que o anticorpo compreende as seguintes seis regiões hipervariáveis (HVRs): (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos deDYGMV (SEQ ID NO: 7); (b) um HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de FISSGSSTVYYADTMKG (SEQ ID NO: 2); (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de RNYDDWYFDV (SEQ ID NO: 8); (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SASSSVTYMY (SEQ ID NO: 4); (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de RTSDLAS (SEQ ID NO: 5); e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos deQHYHSYPLT (SEQ ID NO: 6); (ii) N-acetiltriptofano (por exemplo, N-acetil DL-triptofano ou Nacetil D-triptofano); e (iii) metionina (por exemplo, L-metionina ou D-metionina).
[347] Qualquer concentração adequada de N-acetiltriptofano (por exemplo, N-acetil-DL-triptofano ou N-acetil-D-triptofano) pode ser utilizada em qualquer das composições descritas neste documento. Em alguns casos, a concentração de N-acetiltriptofano (por exemplo, N-acetil-DL-triptofano ou Nacetil-D-triptofano) é cerca de 0,05 mM a cerca de 20 mM (por exemplo, cerca de 0,05 mM a cerca de 20 mM, cerca de 0,05 mM a cerca de 19 mM, cerca de 0,05 mM a cerca de 18 mM, cerca de 0,05 mM a cerca de 17 mM, cerca de 0,05 mM a cerca de 16 mM, cerca de 0,05 mM a cerca de 15 mM cerca de 0,05
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 199/418
193/324 mM a cerca de 14 mM, cerca de 0,05 mM a cerca de 13 mM, cerca de 0,05 mM a cerca de 13 mM, cerca de 0,05 mM a cerca de 12 mM, cerca de 0,05 mM a cerca de 11 mM, cerca de 0,05 mM a cerca de 10 mM , cerca de 0,05 mM a cerca de 9 mM, cerca de 0,05 mM a cerca de 8 mM, cerca de 0,05 mM a cerca de 7 mM, cerca de 0,05 mM a cerca de 6 mM, cerca de 0,05 mM a cerca de 5 mM, cerca de 0,05 mM a cerca de 4 mM, cerca de 0,05 mM para cerca de 3 mM, cerca de 0,05 mM a cerca de 2 mM, cerca de 0,05 mM a cerca de 1 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 20 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 19 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 18 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 17 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 16 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 15 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 14 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 13 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 13 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 12 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 11 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 10 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 9 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 8 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 7 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 6 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 5 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 4 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 3 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 2 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 1 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 0,9 mM, cerca de 0,1 a cerca de 0,8 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 0,7 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 0,6 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 0,5 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 0,4 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 0,3 mM, cerca de 0,2 mM a cerca de 20 mM, cerca de 0,2 mM a cerca de 19 mM, cerca de 0,2 mM a cerca de 18 mM, cerca de 0,2 mM a cerca de 17 mM, cerca de 0,2 mM a cerca de 16 mM, cerca de 0,2 mM a cerca de 15 mM, cerca de 0,2 mM a cerca de 14 mM, cerca de 0,2 mM a cerca de 13 mM, cerca de 0,2 mM a cerca de 13 mM, cerca de 0,2 mM a cerca de 12 mM, cerca de 0,2 mM a cerca de 11 mM, cerca de 0,2 mM a cerca de 10 mM, cerca de 0,2 mM a cerca de 9 mM, cerca de 0,2 mM a cerca de 8 mM, cerca de 0,2 mM a cerca de 7 mM, cerca de 0,2 mM a cerca de 6 mM, cerca de 0,2 mM a cerca de 5 mM, cerca de 0,2 mM
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 200/418
194/324 a cerca de 4 mM, cerca de 0,2 mM a cerca de 3 mM, cerca de 0,2 mM a cerca de 2 mM, cerca de 0,2 mM a cerca de 1 mM, cerca de 0,2 mM a cerca de 0,9 mM, cerca de 0,2 a cerca de 0,8 mM, cerca de 0,2 mM a cerca de 0,7mM, cerca de 0,2 mM a cerca de 0,6 mM, cerca de 0,2 mM a cerca de 0,5mM, cerca de 0,2 mM a cerca de 0,4 mM, cerca de 0,2 mM a cerca de 0,3mM, cerca de 0,3 mM a cerca de 20 mM, cerca de 0,3 mM a cerca de 19 mM, cerca de 0,3 mM a cerca de 18 mM, cerca de 0,3 mM a cerca de 17 mM, cerca de 0,3 mM a cerca de 16 mM, cerca de 0,3 mM a cerca de 15 mM, cerca de 0,3 mM a cerca de 14 mM, cerca de 0,3 mM a cerca de 13 mM, cerca de 0,3 mM a cerca de 13 mM, cerca de 0,3 mM a cerca de 12 mM, cerca de 0,3 mM a cerca de 11 mM, cerca de 0,3 mM a cerca de 10 mM, cerca de 0,3 mM a cerca de 9 mM, cerca de 0,3 mM a cerca de 8 mM, cerca de 0,3 mM a cerca de 7 mM, cerca de 0,3 mM a cerca de 6 mM, cerca de 0,3 mM a cerca de 5 mM, cerca de 0,3 mM a cerca de 4 mM, cerca de 0,3 mM a cerca de 3 mM, cerca de 0,3 mM a cerca de 2 mM, cerca de 0,3 mM a cerca de 1 mM, cerca de 0,3 mM a cerca de 0,9 mM, cerca de 0,3 a cerca de 0,8 mM, cerca de 0,3 mM a cerca de 0,7 mM, cerca de 0,3 mM a cerca de 0,6 mM, cerca de 0,3 mM a cerca de 0,5 mM, cerca de 0,3 mM a cerca de 0,4 mM). Em alguns casos, o N-acetiltriptofano está numa concentração de cerca de 0,1 mM a cerca de 1 mM (por exemplo, cerca de 0,1 mM, cerca de 0,2 mM, cerca de 0,3 mM, cerca de 0,4 mM, cerca de 0,5 mM, cerca de 0,6 mM, cerca de 0,7 mM cerca de 0,8 mM, cerca de 0,9 mM ou cerca de 1 mM). Em casos particulares, a concentração de Nacetiltriptofano (por exemplo, N-acetil-DL-triptofano ou N-acetil-D-triptofano) é de cerca de 0,3 mM. Em casos particulares, o N-acetiltriptofano é ou N-acetilDL-triptofano.
[348] Qualquer concentração adequada de metionina (por exemplo, L-metionina ou D-metionina) pode ser utilizada em qualquer das composições aqui descritas. Por exemplo, em alguns casos, a concentração de
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 201/418
195/324 metionina (por exemplo, L-metionina ou D-metionina) é cerca de 0,1 mM a cerca de 30 mM (por exemplo, cerca de 0,1 mM a cerca de 30 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 25 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 20 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 19 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 18 mM cerca de 0,1 mM a cerca de 17 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 16 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 15 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 14 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 13 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 13 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 12 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 11 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 10 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 9 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 8 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 7 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 6 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 5 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 4 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 3 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 2 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 1 mM, cerca de 1 mM cerca de 20 mM, cerca de 1 mM a cerca de 19 mM, cerca de 1 mM a cerca de 18 mM, cerca de 1 mM a cerca de 17 mM, cerca de 1 mM a cerca de 16 mM, cerca de 1 mM a cerca de 15 mM, cerca de 1 mM a cerca de 14 mM, cerca de 1 mM a cerca de 13 mM, cerca de 1 mM a cerca de 13 mM, cerca de 1 mM a cerca de 12 mM, cerca de 1 mM a cerca de 11 mM, cerca de mM a cerca de 10 mM, cerca de 1 mM a cerca de 9 mM, cerca de 1 mM a cerca de 8 mM, cerca de 1 mM a cerca de 7 mM, cerca de 1 mM a cerca de 6 mM, cerca de 1 mM a cerca de 5 mM, cerca de 1 mM a cerca de 4 mM, cerca de 1 mM a cerca de 3 mM, cerca de 1 mM a cerca de 2 mM, cerca de 2 mM a cerca de 20 mM, cerca de 2 mM a cerca de 19 mM, cerca de 2 mM a cerca de 18 mM, cerca de 2 mM a cerca de 17 mM, cerca de 2 mM cerca de 16 mM, cerca de 2 mM a cerca de 15 mM, cerca de 2 mM a cerca de 14 mM, cerca de mM a cerca de 13 mM, aproximadamente.2 mM a cerca de 13 mM, cerca de 2 mM a cerca de 12 mM, cerca de 2 mM a cerca de 11 mM, cerca de 2 mM a cerca de 10 mM, cerca de 2 mM a cerca de 9 mM, cerca de 2 mM a cerca de 8 mM, cerca de 2 mM a cerca de 7 mM, cerca de 2 mM a cerca de 6 mM, cerca
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 202/418
196/324 de 2 mM a cerca de 5 mM, cerca de 2 mM a cerca de 4 mM, cerca de 2 mM a cerca de 3 mM, cerca de 5 mM a cerca de 20 mM, cerca de 5 mM a cerca de 19 mM, cerca de 5 mM a cerca de 18 mM, cerca de 5 mM a cerca de 17 mM, cerca de 5 mM a cerca de 16 mM, cerca de 5 mM a cerca de 15 mM, cerca de 5 mM a cerca de 14 mM, cerca de 5 mM a cerca de 13 mM, cerca de 5 mM a cerca de 12 mM, cerca de 5 mM a cerca de 11 mM, cerca de 5 mM a cerca de 10 mM, cerca de 5 mM a cerca de 9 mM, cerca de 5 mM a cerca de 8 mM, cerca de 5 mM a cerca de 7 mM, ou cerca de 5 mM a cerca de 6 mM). Em alguns casos, a metionina (por exemplo, L-metionina ou D-metionina) está numa concentração de cerca de 1 mM a cerca de 10 mM (por exemplo, cerca de 1 mM, cerca de 2 mM, cerca de 3 mM, cerca de 4 mM, cerca de 5 mM cerca de 6 mM, cerca de 7 mM, cerca de 8 mM, cerca de 9 mM ou cerca de 10 mM). Em casos particulares, a concentração de metionina (por exemplo, L-metionina ou D-metionina) é de cerca de 5 mM. Em outros casos, a concentração de metionina é de cerca de 10 mM. Em casos particulares, a metionina é Lmetionina.
[349] Em alguns casos, a presença do antioxidante (por exemplo,
N-acetiltriptofano (por exemplo, N-acetil DL-triptofano) e/ou metionina (por exemplo, L-metionina ou D-metionina)) reduz a oxidação por cento do anticorpo anti-triptase em um resíduo específico (por exemplo, um resíduo de triptofano ou um resíduo de metionina, por exemplo, em um resíduo de HVR-H3 (por exemplo, W100 do domínio de hu31A.v11 VH) ou em um resíduo de Fc (por exemplo, o Fc resíduos M251, M357, e/ou M427 (por exemplo, de hu31A.v11)) por cerca de 1%, cerca de 2%, cerca de 5%, cerca de 6%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 28%, cerca de 30%, cerca de
35%, cerca de
60%, cerca de
85%, cerca de
40%, cerca de
65%, cerca de
90%, cerca de
45%, cerca de
70%, cerca de
95%, cerca de
50%, cerca de
75%, cerca de
96%, cerca de
55%, cerca de
80%, cerca de
97%, cerca de
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 203/418
197/324
98%, cerca de 99%, ou mais, por exemplo, em relação a oxidação por cento no resíduo na ausência do antioxidante.
[350] Nos casos em que o anticorpo inclui um resíduo W100 do domínio VH em HVR-H3 (por exemplo, hu31A.v11) que seja susceptível à oxidação, em alguns casos, o resíduo W100 do domínio VH em HVR-H3 tem uma porcentagem de oxidação inferior a cerca de 35% (por exemplo, menos de 35%, menos de 34%, menos de 33%, menos de 32%, menos de 31%, menos de 30%, menos de 29%, menos de 28%, menos de 27%, menos 26%, menos de 25%, menos de 24%, menos de 23%, menos de 22%, menos de 21%, menos de 20%, menos de 19%, menos de 18%, menos de 17%, menos de 16%, menos de 15%, menos de 14%, menos de 13%, menos de 12%, menos de 11%, menos de 10%, menos de 9%, menos de 8%, menos de 7%, menos de 6%, menos de 5%, menos de 4%, menos de 3%, menos de 2%, menos de 1%, ou menos). Por exemplo, em alguns casos, o resíduo W100 em HVR-H3 tem uma porcentagem de oxidação inferior a cerca de 35%. Noutros casos, o resíduo W100 em HVR-H3 tem uma porcentagem de oxidação inferior a cerca de 25%. Ainda noutros casos, o resíduo W100 em HVR-H3 tem uma porcentagem de oxidação inferior a cerca de 15%. Ainda noutros casos, o resíduo W100 em HVR-H3 tem uma porcentagem de oxidação inferior a cerca de 10%. Noutros casos, o resíduo W100 em HVR-H3 tem uma porcentagem de oxidação inferior a cerca de 5%. Noutros casos, o resíduo W100 em HVR-H3 tem uma porcentagem de oxidação inferior a cerca de 4%, cerca de 3%, cerca de 2% ou cerca de 1 %.
[351] Por exemplo, em alguns casos onde o anticorpo inclui um resíduo de W100 domínio VH no HVR-H3 que é suscetível à oxidação, em alguns casos, o resíduo de W100 domínio VH no HVR-H3 tem uma oxidação por cento de entre cerca de 1% para cerca de 50%, entre cerca de 1% para cerca de 45%, entre cerca de 1% para cerca de 40%, entre cerca de 1% para
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 204/418
198/324 cerca de 35%, entre cerca de 1% para cerca de 25%, entre cerca de 1% para cerca de 15%, entre cerca de 1% para cerca de 5%, entre cerca de 1% para cerca de 3%, entre cerca de 1% para cerca de 30%, entre cerca de 1% para cerca de 20%, entre cerca de 1% para cerca de 10%, entre cerca de 1% para cerca de 4%, entre cerca de 1% para cerca de 2%, entre cerca de 5% para cerca de 50%, entre cerca de 5% para cerca de 45%, entre cerca de 5% para cerca de 50%, entre cerca de 5% para cerca de 30%, entre cerca de 5% para cerca de 20%, entre cerca de 5% para cerca de 35%, entre cerca de 5% para cerca de 25%, entre cerca de 5% para cerca de 15%, entre cerca de 5% para cerca de 10%, entre cerca de 10% para cerca de 50%, entre cerca de 10% para cerca de 45%, entre cerca de 10% para cerca de 40%, entre cerca de 10% para cerca de 35%, entre cerca de 10% para cerca de 30%, entre cerca de 10% para cerca de 25%, entre cerca de 10% para 20%, entre cerca de 10% para cerca de 15%, entre cerca de 15% para cerca de 50%, entre cerca de 15% para cerca de 45%, entre cerca de 15% para cerca de 40%, entre cerca de 15% para cerca de 35%, entre cerca de 15% para cerca de 30%, entre cerca de 15% para cerca de 25%, entre cerca de 15% para cerca de 20%, entre cerca de 25% para cerca de 50% ou entre cerca de 30% para cerca de 50%.
[352] A oxidação percentual pode ser determinada, por exemplo, em cerca de 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses, 18 meses, dois anos ou mais, da produção inicial de um anticorpo ou uma sua composição farmacêutica. Em alguns casos, a porcentagem de oxidação é determinada cerca de 9 meses, cerca de 12 meses, cerca de 18 meses, ou dois anos a partir da produção inicial de um anticorpo ou de uma composição farmacêutica deste.
[353] A concentração de um anticorpo em uma composição da
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 205/418
199/324 invenção pode variar, por exemplo, de cerca de 1 mg/mL para cerca de 350 mg/mL (por exemplo, cerca de 1 mg/mL para cerca de 350 mg/mL, cerca de 1 mg/mL a cerca de 325 mg/mL, com 1 mg/mL a cerca de 300 mg/mL, cerca de 1 mg/mL a cerca de 275 mg/mL, cerca de 1 mg/mL para cerca de 250 mg/mL, cerca de 1 mg/mL a cerca de 225 mg/mL, cerca de 1 mg/mL para cerca de 200 mg/mL, cerca de 1 mg/mL para cerca de 175 mg/mL, cerca de 1 mg/mL a cerca de 150 mg/mL, cerca de 1 mg/mL para cerca de 125 mg/mL, cerca de 1 mg/mL para cerca de 100 mg/mL, cerca de 1 mg/mL para cerca de 75 mg/mL, cerca de 1 mg/mL para cerca de 50 mg/mL, cerca de 1 mg/mL para cerca de 25 mg/mL, cerca de 25 mg/mL para cerca de 350 mg/mL, cerca de 25 mg/mL para cerca de 325 mg/mL, cerca de 25 mg/mL para cerca de 300 mg/mL, cerca de 25 mg/mL para cerca de 275 mg/mL, cerca de 25 mg/mL para cerca de 250 mg/mL, cerca de 25 mg/mL para cerca de 225 mg/mL, cerca de 25 mg/mL para cerca de 200 mg/mL, cerca de 25 mg/mL para cerca de 175 mg/mL, cerca de 25 mg/mL para cerca de 150 mg/mL, cerca de 25 mg/mL para cerca de 125 mg/mL, cerca de 25 mg/mL para cerca de 100 mg/mL, cerca de 25 mg/mL para cerca de 75 mg/mL, cerca de 25 mg/mL para cerca de 50 mg/mL, cerca de 50 mg/mL para cerca de 350 mg/mL, cerca de 50 mg/mL para cerca de 325 mg/mL, cerca de 50 mg/mL para cerca de 300 mg/mL, cerca de 50 mg/mL para cerca de 275 mg/mL, cerca de 50 mg/mL para cerca de 250 mg/mL, cerca de 50 mg/mL para cerca de 225 mg/mL, cerca de 50 mg/mL para cerca de 200 mg/mL, cerca de 50 mg/mL para cerca de 175 mg/mL, cerca de 50 mg/mL para cerca de 150 mg/mL, cerca de 50 mg/mL para cerca de 125 mg/mL, cerca de 50 mg/mL para cerca de 100 mg/mL, cerca de 50 mg/mL para cerca de 75 mg/mL, cerca de 75 mg/mL para cerca de 350 mg/mL, cerca de 75 mg/mL para cerca de 325 mg/mL, cerca de 75 mg/mL para cerca de 300 mg/mL, cerca de 75 mg/mL para cerca de 275 mg/mL, cerca de 75 mg/mL para cerca de 250 mg/mL, cerca de 75 mg/mL para cerca de 225 mg/mL, cerca de 75 mg/mL para
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 206/418
200/324 cerca de 200 mg/mL, cerca de 75 mg/mL para cerca de 175 mg/mL, cerca de 75 mg/mL para cerca de 150 mg/mL, cerca de 75 mg/mL para cerca de 125 mg/mL, cerca de 75 mg/mL para cerca de 100 mg/mL, cerca de 100 mg/mL para cerca de 350 mg/mL, cerca de 100 mg/mL para cerca de 325 mg/mL, cerca de 100 mg/mL para cerca de 300 mg/mL, cerca de 100 mg/mL para cerca de 275 mg/mL, cerca de 100 mg/mL para cerca de 250 mg/mL, cerca de 100 mg/mL para cerca de 225 mg/mL, cerca de 100 mg/mL para cerca de 200 mg/mL, cerca de 100 mg/mL para cerca de 175 mg/mL, cerca de 100 mg/mL para cerca de 150 mg/mL, cerca de 100 mg/mL para cerca de 125 mg/mL ou cerca de 150 mg/mL para cerca de 175 mg/mL. Em alguns casos, o anticorpo encontra-se numa concentração de cerca de 50 mg/ml a cerca de 200 mg/ml (por exemplo, cerca de 50 mg/ml, cerca de 60 mg/ml, cerca de 70 mg/ml, cerca de 80 mg/ml, cerca de 90 mg/mL, cerca de 100 mg/mL, cerca de 110 mg/mL, cerca de 120 mg/mL, cerca de 130 mg/mL, cerca de 140 mg/mL, cerca de 150 mg/mL, cerca de 160 mg/mL, cerca de 170 mg/mL, cerca de 180 mg/mL, cerca de 190 mg/mL ou cerca de 200 mg/mL. Em casos particulares, a concentração de anticorpo é de cerca de 150 mg/mL.
[354] Qualquer uma das composições aqui descritas pode incluir um ou mais excipientes adicionais selecionados do grupo que consiste num estabilizador, um tampão, um surfactante e um agente de tonicidade. Em alguns casos, o tampão compreende succinato de arginina e/ou succinato de histidina. Em alguns casos, o tampão inclui succinato de arginina e succinato de histidina.
[355] Qualquer concentração adequada de succinato de arginina pode ser usada. Por exemplo, em alguns casos, a concentração de succinato de arginina é de cerca de 10 mM a cerca de 500 mM (por exemplo, cerca de 10 mM, cerca de 20 mM, cerca de 30 mM, cerca de 40 mM, cerca de 50 mM, cerca de 75 mM, cerca de 100 mM, cerca de 125 mM, cerca de 150 mM, cerca
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 207/418
201/324 de 175 mM, cerca de 200 mM, cerca de 225 mM, cerca de 250 mM, cerca de
275 mM, cerca de 300 mM, cerca de 325 mM, cerca de 350 mM, cerca de 375 mM, cerca de 400 mM, cerca de 425 mM, cerca de 450 mM, cerca de 475 mM ou cerca de 500 mM). Por exemplo, em alguns casos, a concentração de succinato de arginina é de cerca de 100 mM a cerca de 300 mM, cerca de 125 mM cerca de 300 mM, cerca de 150 mM cerca de 300 mM, cerca de 175 mM cerca de 300 mM, cerca de 200 mM cerca de 300 mM, cerca de 225 mM cerca de 300 mM, cerca de 250 mM cerca de 300 mM, cerca de 275 mM cerca de 300 mM, cerca de 100 mM cerca de 250 mM, cerca de
125 mM cerca de 250 mM, cerca de 150 mM cerca de 250 mM, cerca de
175 mM cerca de 250 mM, cerca de 200 mM cerca de 250 mM, cerca de
100 mM cerca de 225 mM, cerca de
125 mM cerca de 225 mM, cerca de
150 mM cerca de 225 mM, cerca de
175 mM cerca de 225 mM, cerca de 200 mM cerca de 225 mM, cerca de
100 mM cerca de 200 mM, cerca de 125 mM cerca de 200 mM, cerca de 150 mM a cerca de 200 mM ou cerca de 175 mM cerca de 200 mM. Em casos particulares, a concentração de succinato de arginina é de cerca de 200 mM.
[356] Qualquer concentração adequada de succinato de histidina pode ser usada. Por exemplo, em algumas modalidades, a concentração de succinato de histidina de cerca de 1 mM a cerca de 100 mM (por exemplo, cerca de 1 mM, cerca de 5 mM, cerca de 10 mM, cerca de 15 mM, cerca de 20 mM, cerca de 25 mM, cerca de 30 mM, cerca de 35 mM, cerca de 40 mM, cerca de 45 mM, cerca de 50 mM, cerca de 55 mM, cerca de 60 mM, cerca de mM, cerca de 70 mM, cerca de 75 mM, cerca de 80 mM, cerca de 85 mM, cerca de 90 mM, cerca de 95 mM ou cerca de 100 mM). Em casos particulares, a concentração de succinato de histidina é de cerca de 20 mM.
[357] Qualquer uma das composições descritas neste documento pode ter um pH de cerca de 4,0 a cerca de 7,0 (por exemplo, cerca de 4,0,
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 208/418
202/324 cerca de 4,5, cerca de 5,0, cerca de 5,5, cerca de 6,0, cerca de 6,5 ou cerca de 7,0). Em alguns casos, o pH é de cerca de 4,5 a cerca de 7,0 (por exemplo, cerca de 4,5, cerca de 5,0, cerca de 5,5, cerca de 6,0, cerca de 6,5 ou cerca de 7,0). Em alguns casos, o pH é de cerca de 4,5 a cerca de 6,5 (por exemplo, cerca de 4,5, cerca de 4,6, cerca de 4,7, cerca de 4,8, cerca de 4,9, cerca de 5, cerca de 5,1, cerca de 5,2, cerca de 5,3, cerca de 5,4, cerca de 5,5, cerca de 5,6, cerca de 5,7, cerca de 5,8, cerca de 5,9, cerca de 6, cerca de 6,1, cerca de
6.2, cerca de 6,3, cerca de 6,4, ou cerca de 6,5). Em alguns casos, o pH é de cerca de 5,0 a cerca de 6,0 (por exemplo, cerca de 5,0, cerca de 5,1, cerca de
5.2, cerca de 5,3, cerca de 5,4, cerca de 5,5, cerca de 5,6, cerca de 5,7, cerca de 5,8, cerca de 5,9, ou cerca de 6,0). Em alguns casos, o pH é de cerca de 5,5.
[358] Qualquer surfactante adequado pode ser utilizado nas composições aqui descritas. Em alguns casos, o surfactante é poloxâmero 188 ou polissorbato 20. Qualquer concentração adequada de poloxâmero 188 pode ser usada. Por exemplo, a concentração de poloxâmero 188 pode ser de cerca de 0,005% a cerca de 0,5%, cerca de 0,005% a cerca de 0,05%, ou cerca de 0,02%. Em alguns casos, a concentração de poloxâmero 188 é de cerca de 0,01%, cerca de 0,02%, cerca de 0,03%, cerca de 0,04%, cerca de 0,05%, cerca de 0,06%, cerca de 0,07%, cerca de 0,08%, cerca de 0,09% ou cerca de 0,1%. Nas modalidades particulares, a concentração de poloxâmero 188 é de cerca de 0,02%. Qualquer concentração adequada de polissorbato 20 pode ser usada. Por exemplo, a concentração de polissorbato 20 pode ser de cerca de 0,005% a cerca de 0,5%, cerca de 0,005% a cerca de 0,05%, ou cerca de 0,02%. Em alguns casos, a concentração de polissorbato 20 é de cerca de 0,01%, cerca de 0,02%, cerca de 0,03%, cerca de 0,04%, cerca de 0,05%, cerca de 0,06%, cerca de 0,07%, cerca de 0,08%, cerca de 0,09% ou cerca de 0,1%.
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 209/418
203/324 [359] Em casos particulares, a composição inclui cerca de 150 mg/mL de um anticorpo anti-thptase descrito neste documento (por exemplo, hu31A.v11), cerca de 200 mM de succinato de arginina, cerca de 20 mM de succinato de histidina, cerca de 0,3 mM de N-acetil DL-triptofano), cerca de 5 mM de L-metionina, cerca de 0,02% de poloxâmero 188 e tem um pH de cerca de 5,8.
[360] Qualquer uma das composições aqui descritas pode ser formulada para administração por qualquer via adequada. Em casos particulares, a composição é formulada para administração subcutânea ou administração intravenosa. Em alguns casos, a composição é formulada para administração subcutânea.
G. Métodos e composições terapêuticas [361] Qualquer um dos anticorpos anti-thptase ou composições farmacêuticas da invenção pode ser utilizado em métodos terapêuticos.
[362] Num aspecto, é proporcionado um anticorpo anti-thptase, ou uma sua composição farmacêutica, para utilização como medicamento. Em aspectos adicionais, é fornecido um anticorpo anti-thptase, ou uma sua composição farmacêutica, para utilização no tratamento de um distúrbio. Em certas modalidades, é fornecido um anticorpo anti-thptase, ou uma sua composição farmacêutica, para utilização num método de tratamento. Em certas modalidades, a invenção fornece um anticorpo anti-thptase, ou uma sua composição farmacêutica, para utilização num método de tratamento de um sujeito com um distúrbio que envolve a administração ao sujeito de uma quantidade eficaz do anticorpo anti-thptase. Em algumas modalidades, o método inclui ainda a administração ao sujeito de uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional, por exemplo, como descrito abaixo. Um “sujeito” de acordo com qualquer uma das modalidades acima é de preferência um humano.
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 210/418
204/324 [363] Num outro aspecto, a invenção fornece a utilização de um anticorpo anti-triptase, ou uma sua composição farmacêutica, na fabricação ou preparação de um medicamento. Numa modalidade, o medicamento é para tratamento de um distúrbio. Numa outra modalidade, o medicamento é para utilização num método de tratamento de um distúrbio compreendendo a administração a um sujeito com o distúrbio de uma quantidade eficaz do medicamento. Nessa modalidade, o método compreende ainda a administração ao sujeito de uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional, por exemplo, como descrito abaixo. Um sujeito de acordo com qualquer uma das modalidades acima pode ser um ser humano.
[364] Em um outro aspecto, a invenção fornece um método para o tratamento de um distúrbio, incluindo, por exemplo, uma doença pulmonar (por exemplo, asma (por exemplo, asma Th2-alta ou asma Th2-baixo), hiperresponsividade das vias respiratórias ou DPOC), um distúrbio autoimune (por exemplo, artrite reumatoide artrite, psoríase, esofagite eosinofílica, IBD ou doença de Crohn), um distúrbio inflamatório (por exemplo, anafilaxia (CIU ou CSU), de urticária idiopática crônica, dermatite atópica ou rinite alérgica), um distúrbio fibrótico (por exemplo, FPI), um (granulocítica transtorno neutrofílico ou eosinofílico), um distúrbio monocítico, um transtorno linfocítico, um associado com o aumento do número ou distribuição de células residentes do tecido normal ou aberrante (por exemplo, mastócitos, macrófagos ou linfócitos) ou células do estroma (como fibroblastos, miofibroblastos, células musculares lisas, epitélios, ou endotélio e uma triptase associada à doença ou distúrbio mediado por triptase. Numa modalidade, o método compreende administrar a um sujeito com um distúrbio uma quantidade eficaz de um anticorpo antitriptase, ou uma sua composição farmacêutica. Nessa modalidade, o método compreende ainda a administração ao sujeito de uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional, como descrito abaixo. Um
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 211/418
205/324 sujeito de acordo com qualquer uma das modalidades acima pode ser um ser humano.
[365] Em outro aspecto, a invenção fornece formulações farmacêuticas compreendendo qualquer um dos anticorpos anti-triptase fornecidos neste documento, por exemplo, para uso em qualquer um dos métodos terapêuticos acima. Em uma modalidade, uma formulação farmacêutica compreende qualquer um dos anticorpos anti-triptase fornecidos neste documento e um transportador farmaceuticamente aceitável. Em outra modalidade, uma formulação farmacêutica compreende qualquer um dos anticorpos anti-triptase fornecidos neste documento e pelo menos um agente terapêutico adicional, por exemplo, como descrito neste documento. Qualquer uma das formulações farmacêuticas descritas na Seção F (por exemplo, aquelas que incluem um antioxidante tal como N-acetiltriptofano e/ou metionina) acima pode ser utilizada em qualquer das utilizações ou métodos descritos neste documento.
[366] Em algumas modalidades, o distúrbio é um distúrbio autoimune, um distúrbio inflamatório, um distúrbio fibrótico, um distúrbio granulocítico (neutrofílico ou eosinofílico), um distúrbio monocítico, um distúrbio linfocítico ou um distúrbio associado ao aumento do número ou distribuição de células residentes normais ou aberrantes (tais como mastócitos, macrófagos ou linfócitos) ou células estromais (tais como fibroblastos, miofibroblastos, células musculares lisas, epitélio ou endotélio). Em algumas modalidades, o distúrbio é um distúrbio pulmonar.
[367] Em algumas modalidades, o distúrbio pulmonar está associado ainflamação pulmonar granulocítica (eosinofílica e/ou neutrofílica), condições pulmonares induzidas por infecção (incluindo aquelas associadas com vírus (por exemplo, influenza, parainfluenza, rinovírus, metapneumovírus humano e vírus sincicial respiratório), bacterianos, ou fungos (por exemplo,
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 212/418
206/324
Aspergillus). Em algumas modalidades, o distúrbio é uma condição pulmonar induzida por alérgeno, uma condição pulmonar induzida por poluente ambiental tóxico (por exemplo, asbestose, silicose ou beriliose), uma condição pulmonar induzida por aspiração gástrica ou associada a desregulação imunológica ou uma condição inflamatória com predisposição genética, como fibrose cística. Em algumas modalidades, o distúrbio é uma condição pulmonar induzida por trauma físico (por exemplo, lesão do ventilador), enfisema , enfisema induzido por cigarro, bronquite, sarcoidose, histiocitose, linfangiomiomatose, lesão pulmonar aguda, síndrome do desconforto respiratório agudo, doença pulmonar crônica, broncopulmonar displasia, pneumonia (por exemplo, pneumonia adquirida na comunidade, pneumonia nosocomial, pneumonia associada à ventilação mecânica, pneumonia viral, pneumonia bacteriana e pneumonia grave), exacerbações das vias aéreas e síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA)). Em algumas modalidades, o distúrbio pulmonar é DPOC.
[368] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, o distúrbio pulmonar é asma. Em algumas modalidades, a asma é uma asma persistente crônica grave com eventos agudos de agravamento dos sintomas (exacerbações ou exacerbações) que podem ser fatais. Em algumas modalidades, a asma é asma atópica (também conhecida como alérgica), asma não alérgica (por exemplo, frequentemente desencadeada por infecção por um vírus respiratório (por exemplo, gripe, parainfluenza, rinovírus, metapneumovírus humano e vírus sincicial respiratório) ou inalada irritante (poluentes atmosféricos, poluição atmosférica, partículas de diesel, produtos químicos voláteis e gases em ambientes fechados ou externos, ou mesmo por ar seco e frio).
[369] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, a asma é intermitente ou induzida por exercício, asma devido à exposição
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 213/418
207/324 primária ou secundária aguda ou crônica à “fumaça” (tipicamente cigarros, charutos, cachimbos), inalação ou “vaping” (tabaco, maconha ou outras substâncias) ou asma desencadeada pela ingestão recente de aspirina ou NSAIDS relacionados. Em algumas modalidades, a asma é asma ligeira, corticosteroide, asma recém-diagnosticada e não tratada, ou não requer anteriormente o uso crônico de esteroides tópicos ou sistêmicos inalados para controlar os sintomas (tosse, pieira, falta de ar/falta de ar ou dor torácica). Em algumas modalidades, a asma é asma crônica resistente a corticosteroides, asma refratária a corticosteroides, asma não controlada com corticosteroides ou outros medicamentos controlados por asma crônica.
[370] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, a asma é asma moderada a grave. Em certas modalidades, a asma é de asma Th2-alta. Em algumas modalidades, a asma é asma grave. Em algumas modalidades, a asma é asma atópica, asma alérgica, asma não alérgica (por exemplo, devido à infecção e/ou vírus sincicial respiratório (RSV)), asma induzida por exercício, asma sensível à aspirina/exacerbada, asma leve, moderada a asma grave, asma corticosteroide, asma crônica, asma resistente a corticosteroides, asma refratária a corticosteroides, asma recémdiagnosticada e não tratada, asma devido ao tabagismo, asma não controlada com corticosteroides. Em algumas modalidades, a asma é a asma do linfócito T auxiliar do tipo 2 (Th2) ou do tipo 2 (Th2) elevada ou do tipo 2 (T2). Em algumas modalidades, a asma é asma eosinofílica. Em algumas modalidades, a asma alérgica é asma. Em algumas modalidades, o indivíduo foi determinado como Inflamação Eosinofílica Positiva (EIP). Ver WO2015/061441. Em algumas modalidades, a asma é asma com periostina elevada (por exemplo, com um nível de periostina de pelo menos cerca de 20 ng/ml, 25 ng/ml ou 50 ng/ml de soro). Os métodos de determinação dos níveis séricos de periostina são fornecidos, por exemplo, na US2012/0156194. Em algumas modalidades, a
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 214/418
208/324 asma é uma asma eosinófila alta (por exemplo, pelo menos cerca de 150, 200, 250, 300, 350, 400 contagens de eosinófilos/ml de sangue). Em certas modalidades, a asma é asma Th2-baixa ou asma não-acionada-Th2. Em algumas modalidades, o indivíduo foi determinado como Inflamação Eosinofílica Negativa (IEN). Ver WO2015/061441. Em algumas modalidades, a asma é asma com periostina baixa (por exemplo, com nível de periostina inferior a cerca de 20 ng/mL de soro). Em algumas modalidades, a asma é asma com eosinófilos baixos (por exemplo, menos de cerca de 150 contagens de eosinófilos/μΙ de sangue ou menos de cerca de 100 contagens de eosinófilos/μΙ de sangue). Em certas modalidades, o indivíduo exibe níveis elevados de FeNO (ácido nítrico exalado fracionado) e/ou nível elevado de IgE. Por exemplo, em alguns casos, o indivíduo exibe um nível de FeNO acima de 250 partes por bilhão (ppb), acima de cerca de 275 ppb, acima de cerca de 300 ppb, acima de 325 ppb, acima de 325 ppb, ou acima de 350 ppb. Em alguns casos, o indivíduo tem um nível de IgE acima de 50 Ul/ml. Em algumas modalidades, o indivíduo tem um volume expiratório forçado em 1 segundo (FEV1) de 40% a 80% do previsto.
[371] Em outras modalidades de qualquer um dos métodos, o distúrbio autoimune, distúrbio inflamatório, distúrbio fibrótico, distúrbio neutrofílico ou distúrbio eosinofílico é a fibrose pulmonar. Em algumas modalidades, a fibrose pulmonar é a fibrose pulmonar idiopática (FPI).
[372] Ainda noutras modalidades de qualquer um dos métodos, o distúrbio autoimune, distúrbio inflamatório, distúrbio fibrótico, distúrbio granulocítico (neutrofílico ou eosinofílico), distúrbio monocítico ou distúrbio linfocítico é esofagite (por exemplo, esofagite eosinofílica), rinite alérgica, rinite não alérgica, rinossinusite com pólipos, polipose nasal, bronquite, pneumonia crônica, aspergilose broncopulmonar alérgica, inflamação das vias aéreas, rinite alérgica, bronquiectasia e/ou bronquite crônica.
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 215/418
209/324 [373] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, o distúrbio autoimune, distúrbio inflamatório, distúrbio fibrótico, distúrbio granulocítico (neutrofílico ou eosinofílico), distúrbio monocítico ou distúrbio linfocítico, é artrite. Em algumas modalidades, a artrite é artrite reumatoide. Em algumas modalidades, a artrite é osteoartrite, artrite reumatoide, artrite juvenil, artrite reumatoide juvenil, artrite precoce, artrite reumatoide poliarticular, artrite reumatoide de início sistêmico, artrite enteropática, artrite reativa, artrite psoriática e/ou artrite como resultado de lesão.
[374] Ainda noutras modalidades de qualquer um dos métodos, o distúrbio autoimune, distúrbio inflamatório, distúrbio fibrótico, distúrbio granulocítico (neutrofílico ou eosinofílico), distúrbio monocítico ou distúrbio linfocítico é um estado inflamatório gastrointestinal. Em algumas modalidades, a condição inflamatória gastrointestinal é IBD (doença inflamatória do intestino), oolite ulcerativa (UC), doença de Crohn (CD), oolite (por exemplo, colite causada por insultos ambientais (por exemplo, causada ou associada a um regime terapêutico, como quimioterapia, radioterapia, etc.)), colite infecciosa, colite isquêmica, colite colagenosa ou linfocítica, enterocolite necrosante, colite em condições como doença granulomatosa crônica ou doença celíaca, alergias alimentares, gastrite, gastroenterite, gastrite infecciosa ou enterocolite (por exemplo, gastrite ativa crônica infectada por Helicobacter pylori), esofagite e outras formas de inflamação gastrintestinal causadas por um agente infeccioso ou colite indeterminada.
[375] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, o distúrbio autoimune, distúrbio inflamatório, distúrbio fibrótico, distúrbio granulocítico (neutrofílico ou eosinofílico), distúrbio monocítico ou distúrbio linfocítico, é uma condição inflamatória gastrointestinal. Em algumas modalidades, a condição inflamatória gastrointestinal é IBD (doença inflamatória do intestino). Em algumas modalidades, a doença inflamatória do
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 216/418
210/324 intestino é oolite ulcerativa (UC) ou doença de Crohn (CD). Em algumas modalidades, a condição inflamatória gastrointestinal é oolite (por exemplo, oolite causada por insultos ambientais (por exemplo, causada ou associada a um regime terapêutico, como quimioterapia, radioterapia, etc.)), colite infecciosa, colite isquêmica, colite colagenosa ou linfocítica, enterocolite necrosante, colite em condições como doença granulomatosa crônica ou doença celíaca, alergias alimentares, gastrite, gastroenterite, gastrite infecciosa ou enterocolite (por exemplo, gastrite ativa crônica infectada por Helicobacter pylori), e outras formas de inflamação gastrintestinal causadas por um agente infeccioso ou colite indeterminada.
[376] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, o estado inflamatório gastrointestinal é colite ulcerativa (UC) ou doença de Crohn (CD). Em algumas modalidades, a condição inflamatória gastrointestinal é colite ulcerativa (UC). Em algumas modalidades, a colite ulcerativa é colite distai ligeira a moderada. Em algumas modalidades, a colite ulcerativa é uma colite extensa ligeira a moderada. Em algumas modalidades, a colite ulcerativa é colite grave. Em algumas modalidades, a condição inflamatória gastrointestinal é a doença de Crohn (CD). Em algumas modalidades, a doença de Crohn está no estágio de doença aguda. Em algumas modalidades, a doença de Crohn está em fase de remissão clínica induzida. Em algumas modalidades, a doença de Crohn está em manter o estado de resposta/remissão. Em algumas modalidades, a doença de Crohn é doença leve a moderada. Em algumas modalidades, a doença de Crohn é doença moderada a grave. Em algumas modalidades, a doença de Crohn é doença grave/fulminante. Em algumas modalidades, a doença de Crohn é doença ileal, ileocolônica ou colônica.
[377] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, o distúrbio autoimune, distúrbio inflamatório, distúrbio fibrótico, distúrbio
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 217/418
211/324 granulocítico (neutrofílico ou eosinofílico), distúrbio monocítico ou distúrbio linfocítico, ou distúrbio associado a números aumentados ou distribuição de células residentes normais ou aberrantes de tecido (como mastócitos, macrófagos ou linfócitos) ou células estromais (como fibroblastos, miofibroblastos, células musculares lisas, epitélio ou endotélio) é o lúpus ou o Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES), ou uma ou mais manifestações específicas do órgão do lúpus (por exemplo, nefrite lúpica (LN) que afeta o rim, ou lúpus extrarrenal (ERL) que afeta o sangue e/ou órgãos linfoides (linfonodos, baço, timo e vasos linfáticos associados) e/ou articulações e/ou outros órgãos, mas não necessariamente o rim).
[378] Em algumas modalidades de alguns dos métodos, o distúrbio autoimune, o distúrbio inflamatório, ou o distúrbio fibrótico são relacionados ao sepsis e/ou ao traumatismo, à infecção por o HIV, ou idiopáticos (de etiologia desconhecida) tais como vaculitides associados por ANCA (AAV), granulomatose com poliangiite (anteriormente conhecida como granulomatose de Wegener), doença de Behcet, doença cardiovascular, bronquite eosinofílica, síndrome de Reiter, síndrome de SEA (Soronegatividade, Entesopatia, Síndrome artropatia), espondilite anquilosante, dermatomiosite, esclerodermia, por exemplo, esclerodermia sistemático igualmente chamado esclerose sistemática, Vasculitis (por exemplo, Arterite de Células Gigantes (GCA), chamado também Arterite temporal, arterite craniano ou doença de Horton), miosite, polimiosite, dermatomiosite, nodosa do poliarterite, arterite, polimialgia reumática, sarcoidose, esclerose biliar preliminar, colangite esclerosante, síndrome de Sjogren, psoríase, psoríase em placas, psoríase gutata, psoríase inversa, psoríase pustulosa, psoríase eritrodérmica, dermatite, dermatite atópica, pênfigo, por exemplo, pênfigo vulgar, aterosclerose, lúpus, doença de Still, miastenia gravis, doença celíaca, esclerose múltipla (EM) da doença reincidente-remitente (RRMS) ou subtipos
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 218/418
212/324 progressivo primário (PPMS) ou secundário progressivo (SPMS), doença de Guillain-Barré, diabetes mellitus do tipo I (DMT1) ou insulinodependente (IDDM) ou tipo DM de início juvenil, tireoidite (por exemplo, doença de Graves), doença celíaca, síndrome de Churg-Strauss, síndrome de mialgia, síndrome hipereosinofílica, reações edematosas incluindo angioedema episódico, infecções helmínticas, dermatite oncocercal, esofagite eosinofílica, entente eosinofílica, oolite eosinofílica, apneia obstrutiva do sono, endomiocardiofibrose, doença de Addison, doença de Raynaud ou fenômeno, hepatite autoimune, doença do enxerto versus hospedeiro (GVHD), ou rejeição de transplante de órgãos.
[379] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, o distúrbio é um distúrbio inflamatório da pele. Em algumas modalidades, o distúrbio é dermatite atópica ou dermatite oncocercal. Em algumas modalidades, o distúrbio é a urticária idiopática crônica (CIU ou CSU). Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, o método compreende ainda administrar um antagonista de IL-13, um antagonista de IL-33, um antagonista de IgE, um inibidor de cálcio, um inibidor de leucotrieina ou um anti-histamínico. Em algumas modalidades, o antagonista de IL-13 é lebrikizumabe. Em algumas modalidades, o antagonista de IgE é omalizumabe ou ligelizumabe.
[380] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, o distúrbio autoimune, distúrbio inflamatório, distúrbio fibrótico, distúrbio neutrofílico ou distúrbio eosinofílico é um distúrbio fibrótico. Em algumas modalidades, os distúrbios fibróticos incluem a fibrose do pulmão, fibrose do fígado (por exemplo, fibrose associada com a cirrose (por exemplo, cirrose induzida por álcool, cirrose induzida por vírus, cirrose pós-hepatite C, e Cirrose biliar preliminar), esquistossomose, colangite (por exemplo, colangite esclerosante), e hepatite autoimune induzida), fibrose do rim (por exemplo,
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 219/418
213/324 fibrose tubulointersticial, Scleroderma, nefrite do diabético, e nefrite glomerular), fibrose cutânea (por exemplo, Scleroderma, cicatrizes hipertróficas e queloides, dermatopatia fibrosa nefrogênica, e queimaduras), mielofibrose, neurofibromatose, fibroma, fibrose intestinal e aderências fibróticas resultantes de procedimentos cirúrgicos), fibrose cardíaca (por exemplo, fibrose associada com infarto do miocárdio), fibrose vascular (por exemplo, fibrose associada à reestenose arterial pós-angioplastia e aterosclerose), fibrose ocular (por exemplo, fibrose associada à cirurgia pós-catarata, vitreoretinopatia proliferativa e fibrose orbital) e fibrose da medula óssea (por exemplo, mielofibrose idiopática e mielofibrose induzida por fármacos). A fibrose pode ser órgão específico ou sistêmico (por exemplo, esclerose sistêmica e fibrose associada à GVHD). Em algumas modalidades, o distúrbio fibrótico é a fibrose pulmonar. Em algumas modalidades, a fibrose pulmonar é pneumonia intersticial fibrosante. Em algumas modalidades, a fibrose pulmonar é a fibrose pulmonar idiopática (FPI), também conhecida como alveolite fibrosante criptogênica. Em algumas modalidades, o FPI é sexo, idade e fisiologia (GAP), estágio I. Em algumas modalidades, o FPI é o estágio GAP II. Em algumas modalidades, o FPI é o estágio GAP III. Em algumas modalidades, a fibrose pulmonar é FPI esporádica. Em algumas modalidades, a fibrose pulmonar é fibrose pulmonar familiar. Em algumas modalidades, a fibrose pulmonar é combinada com fibrose pulmonar e enfisema. Em algumas modalidades, a fibrose pulmonar está associada a um ou mais dos seguintes: pneumonia intersticial usual; pneumonia intersticial idiopática; pneumonia intersticial descamativa; bronquiolite respiratória por doença pulmonar intersticial; pneumonia intersticial aguda; pneumonia intersticial não específica; sarcoidose; pneumonia em organização criptogênica; pneumonia eosinofílica; infecção; exposição a agentes ocupacionais ou ambientais; fumar cigarros; doença pulmonar intersticial induzida por drogas ou radiação; doença pulmonar
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 220/418
214/324 intersticial associada à doença reumática; pneumonia intersticial linfoide; fibroelastose pleuropulmonar; histiocitose pulmonar de células de Langerhans; esclerose sistêmica por doença pulmonar intersticial; Síndrome de HermanskyPudlak; e telomeropatia.
[381] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, o distúrbio autoimune, distúrbio inflamatório, distúrbio fibrótico, distúrbio neutrofílico ou distúrbio eosinofílico é a doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC). Em algumas modalidades, a DPOC é a Iniciativa Global para Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (GOLD) categoria A. Em algumas modalidades, a DPOC é da categoria GOLD B. Em algumas modalidades, a DPOC é da categoria GOLD C. Em algumas modalidades, a DPOC é da categoria GOLD D. Em algumas modalidades, a DPOC é bronquite crônica. Em algumas modalidades, a DPOC é enfisema. Em algumas modalidades, o enfisema é enfisema acinar proximal, panacinar ou acinar distal. Em algumas modalidades, o enfisema é enfisema induzido por cigarro. Em algumas modalidades, a DPOC está associada à exposição a poeiras particuladas, fumos químicos e/ou poluição do ar. Em algumas modalidades, a DPOC está associada a um desenvolvimento pulmonar prejudicado. Em algumas modalidades, a DPOC é asma obstrutiva crônica. Em algumas modalidades, a DPOC está associada à deficiência de alfa-1 antitripsina. Em algumas modalidades, a DPOC está associada a ruptura do clade E da protease de serina, membro 2 (SERPINE2). Em algumas modalidades, a DPOC é DPOC com inflamação sistêmica persistente. Em algumas modalidades, a DPOC é DPOC alta eosinofílica ou Thelper tipo 2 (Th2). Em algumas modalidades, a DPOC é DPOC com colonização bacteriana persistente. Em algumas modalidades, a DPOC é DPOC com exacerbações frequentes. Em algumas modalidades, o distúrbio autoimune, distúrbio inflamatório, distúrbio fibrótico, distúrbio neutrofílico ou distúrbio eosinofílico é a síndrome de sobreposição da síndrome de
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 221/418
215/324 sobreposição de asma-DPOC (ACOS). Em algumas modalidades, o ACOS é predominante de eosinófilos, predominante de neutrófilos, padrão misto, ou nenhuma inflamação (paucigranulocítica) ACOS. Em algumas modalidades, o distúrbio autoimune, distúrbio inflamatório, distúrbio fibrótico, um distúrbio neutrofílico ou um distúrbio eosinofílico é a síndrome de sobreposição da apneia obstrutiva do sono (AOS) com DPOC.
[382] Os anticorpos da invenção podem ser usados sozinhos ou em combinação com outros agentes em uma terapia. Por exemplo, um anticorpo da invenção, ou suas composições farmacêuticas, podem ser coadministrados com pelo menos um agente terapêutico adicional. Em certas modalidades, um agente terapêutico adicional é um antagonista de ligação à interleucina-13 (IL-13), um antagonista de ligação ao eixo da interleucina-17 (IL-17), um antagonista de ligação ao eixo da interleucina-5 (IL-5) ou um antagonista de ligação ao eixo IL-33. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao eixo da IL-13 é um anticorpo anti-IL-13, por exemplo, lebrikizumabe. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao eixo da IL-5 é um antagonista de ligação a IL-5 ou um antagonista de ligação ao receptor de IL-5. Em algumas modalidades, um antagonista de ligação ao eixo IL-33 é um antagonista de ligação a IL-33 ou um antagonista de ligação a ST2. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação a IL-33 é um anticorpo antiIL-33.
[383] Em algumas modalidades, um agente terapêutico adicional é uma terapia de asma, como descrito abaixo. Asma moderada é atualmente tratada com um anti-inflamatório-corticosteroide inalado diário ou de um inibidor de mastócitos, tais como cromoglicato de sódio ou nedocromil além de um beta2-agonista inalado, conforme necessário (3-4 vezes por dia) para aliviar os sintomas de ruptura ou alérgeno- ou asma induzida pelo exercício. Corticosteroides inalatórios exemplares incluem QVAR®, PULMICORT®,
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 222/418
216/324
SYMBICORT®, AEROBID®, FLOVENT®, FLONASE®, ADVAIR® e AZMACORT®. Terapias adicionais de asma incluem dilatadores brônquicos de ação prolongada (LABD). Em certas modalidades, o LABD um agonista beta-2 de longa duração (LABA), antagonista do receptor de leucotrieno (LTRA), antagonista muscarínico de longa duração (LAMA), teofilina ou corticosteroides orais (OCS). Exemplos de LABDs incluem SYMBICORT®, ADVAIR®, BROVANA®, FORADIL®, PERFOROMIST™ e SEREVENT®.
[384] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, o método compreende ainda administrar um broncodilatador ou medicação de controle de sintomas de asma. Em algumas modalidades, o broncodilatador ou medicação do controle da asma é um agonista 32-adrenérgico, como um β2agonista de curta duração (SABA) (como o albuterol) ou um agonista β2adrenérgico de longa ação (LABA). Em algumas modalidades, o LABA é salmeterol, abediterol, indacaterol, vilanterol e/ou formoterol (fumarato de formoterol desidratado). Em algumas modalidades, a medicação de controle de asma um antagonista de receptor de leucotrieno (LTRA). Em algumas modalidades, o LTRA é montelucaste, zafirlukast e/ou zileuton. Em algumas modalidades, o broncodilatador ou medicamento controlador da asma é um antagonista muscarínico, tal como um antagonista do receptor de acetilcolina muscarínico de longa duração (colinérgico) (LAMA). Em algumas modalidades, o LAMA é glicopirrônio. Em algumas modalidades, o broncodilatador ou medicamento controlador da asma é um agonista de um canal iônico, tal como um receptor do sabor amargo (tal como o TAS2R).
[385] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, o método compreende ainda a administração de um broncodilatador. Em algumas modalidades, o broncodilatador é um broncodilatador inalado. Em algumas modalidades, o broncodilatador inalado é um agonista βΣ^ΓβηέΓρίοο. Em algumas modalidades, o agonista β2^ΓβηέΓςίοο é um agonista β2
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 223/418
217/324 adrenérgico de curta duração (SABA). Em algumas modalidades, o SABA é bitolterol, fenoterol, isoproterenol, levalbuterol, metaproterenol, pirbuterol, procaterol, ritodrina, albuterol e/ou terbutalina. Em algumas modalidades, o agonista 32-adrenérgico é um agonista 32-adrenérgico de longa duração (LABA). Em algumas modalidades, o LABA é arformoterol, bambuterol, clenbuterol, formoterol, salmeterol, abediterol, carmoterol, indacaterol, olodaterol e/ou vilanterol. Em algumas modalidades, o broncodilatador inalado é um antagonista do receptor muscarínico. Em algumas modalidades, o antagonista do receptor muscarínico é um antagonista do receptor muscarínico de ação curta (SAMA). Em algumas modalidades, a SAMA é brometo de ipratrópio. Em algumas modalidades, o antagonista do receptor muscarínico é um antagonista do receptor muscarínico de ação prolongada (LAMA). Em algumas modalidades, o LAMA é brometo de tiotrópio, brometo de glicopirrônio, brometo de umeclidínio, brometo de aclidínio e/ou revefenacina. Em algumas modalidades, o broncodilatador inalado é uma combinação SABA/SAMA. Em algumas modalidades, a combinação SABA/SAMA é albuterol/ipratrópio. Em algumas modalidades, o broncodilatador inalado é uma combinação LABA/LAMA. Em algumas modalidades, a combinação LABA/LAMA é formoterol/aclidínio, formoterol/glicopirrônio, formoterol/tiotrópio, indacaterol/glicopirrônio, indacaterol/tiotrópio, olodaterol/tiotrópio, salmeterol/tiotrópio e/ou vilanterol/umeclidínio. Em algumas modalidades, o broncodilatador inalado é um broncodilatador bifuncional. Em algumas modalidades, o broncodilatador bifuncional é um antagonista muscarínico/32agonista (MABA). Em algumas modalidades, o MABA é o batefenterol, THRX 200495, AZD 2115, LAS 190792, TEI3252, PF-3429281 e/ou PF-4348235. Em algumas modalidades, o broncodilatador inalado é um agonista de TAS2R. Em algumas modalidades, o broncodilatador é um SABA nebulizado. Em algumas modalidades, o SABA nebulizado é albuterol e/ou levalbuterol. Em algumas
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 224/418
218/324 modalidades, o broncodilatador é um LABA nebulizado. Em algumas modalidades, o LABA nebulizado é arformoterol e/ou formoterol. Em algumas modalidades, o broncodilatador é um SAMA nebulizado. Em algumas modalidades, o SAMA nebulizado é ipratrópio. Em algumas modalidades, o broncodilatador é um LAMA nebulizado. Em algumas modalidades, o LAMA nebulizado é glicopirrônio e/ou revefenacina. Em algumas modalidades, o broncodilatador é uma combinação SABA/SAMA nebulizado. Em algumas modalidades, a combinação SABA/SAMA é albuterol/ipratrópio nebulizado. Em algumas modalidades, o broncodilatador é um antagonista do receptor de leucotrieno (LTRA). Em algumas modalidades, o LTRA é montelucaste, zafirlukast e/ou zileuton. Em algumas modalidades, o broncodilatador é uma metilxantina. Em algumas modalidades, a metilxantina é teofilina.
[386] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, o método compreende ainda a administração de um imunomodulador. Em algumas modalidades, o imunomodulador é um anticorpo para imunoglobulina tipo E (IgE) ou anti-lgE (um inibidor de IgE). Em algumas modalidades, o antiIgE é omalizumabe e/ou ligelizumab. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, o método compreende ainda cromolina. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, o método compreende ainda metilxantina. Em algumas modalidades, a metilxantina é teofilina ou cafeína.
[387] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, o método compreende ainda a administração de um ou mais corticosteroides, tais como um corticosteroide inalado (ICS) ou um corticosteroide oral. Corticosteroides exemplares não limitantes incluem corticosteroides inalados, tais como dipropionato de beclometasona, budesonida, ciclesonida, flunisolida, propionato de fluticasona, furoato de fluticasona, mometasona e/ou acetonido de triancinolona e corticosteroides orais, tais como metilprednisolona, prednisolona e prednisona. Em algumas modalidades, o corticosteroide é um
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 225/418
219/324
ICS. Em algumas modalidades, o ICS é beclometasona, budesonida, flunisolida, furoato de fluticasona, propionato de fluticasona, mometasona, ciclesonida e/ou triancinolona. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, o método compreende ainda administrar uma combinação de ICS/LABA e/ou LAMA. Em algumas modalidades, a combinação ICS/LABA e/ou LAMA é propionato de fluticasona/salmeterol, budesonida/formoterol, mometasona/formoterol, furoato de fluticasona/vilanterol, propionato de fluticasona/formoterol, beclometasona/formoterol, furoato de fluticasona/umeclidínio, furoato de fluticasona/vilanterol/umeclidínio, fluticasona/salmeterol/tiotrópio, beclometasona/formoterol/glicopirrônio, budesonida/formoterol/glicopirrônio e/ou budesonida/formoterol/tiotrópio. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, o método compreende ainda administrar um corticosteroide nebulizado. Em algumas modalidades, o corticosteroide nebulizado é budesonida. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, o método compreende ainda a administração de um corticosteroide oral ou intravenoso. Em algumas modalidades, o corticosteroide oral ou intravenoso é prednisona, prednisolona, metilprednisolona e/ou hidrocortisona [388] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, o método compreende ainda a administração de um inibidor da via TH2 ou T2 que inibe um ou mais alvos selecionados de ITK, BTK, JAK (JAK1, JAK2 e/ou JAK3), IL-9, IL-6, IL-5, IL-13, IL-4, IL-17 (por exemplo, IL-17A e IL-17F), OX40L, TSLP, IL-25, IL-33, IgE, receptor de IL-9, receptor de IL-5, receptor de IL-4 de a, receptor de IL-13 (por exemplo, receptor de IL-13 de a1 e/ou a2), 0X40, TSLP-R, receptor de IL-7 (por exemplo, IL7Ra), receptor de IL-17 (por exemplo, IL -17Ρβ), ST2 (receptor IL-33), CCR3, CCR4, CRTH2, FcsRI, FcsRII/CD23, Flap, quinase Syk; CCR4, TLR9, CCR3, antagonista do receptor de quimiocina e GM-CSF. Em algumas modalidades, o método compreende ainda a
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 226/418
220/324 administração de um antagonista de IL-5. Em algumas modalidades, o antagonista de IL-5 é benralizumabe, mepolizumabe e/ou reslizumabe. Em algumas modalidades, o método compreende ainda a administração de um antagonista de IL-13. Em algumas modalidades, o antagonista de IL-13 é lebrikizumabe, dectrekumab ou tralokinumab. Em algumas modalidades, o método compreende ainda a administração de um antagonista de IL-4 (incluindo um antagonista de IL-4/IL-13). Em algumas modalidades, o antagonista de IL-4 é dupilumab ou QBX-258 (Novartis). Em algumas modalidades, o método compreende ainda a administração de um antagonista de TSLP. Em algumas modalidades, o antagonista de TSLP é AMG-157 (MEDI-9929). Em algumas modalidades, o método compreende ainda a administração de um antagonista de ST2. Em algumas modalidades, o método compreende ainda a administração de um antagonista de IL-17. Em algumas modalidades, o antagonista de IL-17 é secucinumab, ixekizumabe ou bimekizumabe. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, o método compreende ainda a administração de um fevipiprant. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, o método compreende ainda a administração de um masitinib. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, o método compreende ainda administrar um inibidor ou antagonista de fosfodiesterase (PDE), tal como um antagonista de PDE3 e/ou PDE4. Em algumas modalidades, o antagonista de PDE é Theo-24, daliresp ou roflumilaste.
[389] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, o método compreende ainda a administração de um ou mais ingredientes ativos selecionados a partir de um aminosalicilato; um esteroide; um biológico; uma tiopurina; metotrexato; um inibidor de calcineurina, por exemplo, ciclosporina ou tacrolimus; e um antibiótico. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, o método compreende a administração do ingrediente ativo adicional
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 227/418
221/324 numa formulação oral ou tópica. Exemplos de aminossalicilatos incluem ácido 4-aminossalicílico, sulfassalazina, balsalazida, olsalazina e mesalazina, em formas como revestidas com Eudragit-S, mesalamina dependente de pH, mesalamina revestida com etilcelulose e mesalamina de libertação em multimatriz. Exemplos de um esteroide incluem corticosteroides ou glucocorticosteroides. Exemplos de um corticosteroide incluem prednisona e hidrocortisona ou metilprednisolona, ou um corticosteroide de segunda geração, por exemplo, budesonida ou azatioprina; por exemplo, em formas como um enema de hidrocortisona ou uma espuma de hidrocortisona. Exemplos de produtos biológicos incluem etanercept; um anticorpo para o fator alfa de necrose tumoral, por exemplo, infliximab, adalimumab ou certolizumabe; um anticorpo para IL-12 e IL-23, por exemplo, ustekinumab; vedolizumabe; etrolizumabe e natalizumabe. Exemplos de tiopurinas incluem azatioprina, 6mercaptopurina e tioguanina. Exemplos de antibióticos incluem vancomicina, rifaximina, metronidazol, trimetoprim, sulfametoxazol, diaminodifenilsulfona e ciprofloxacina; e agentes antivirais como o ganciclovir [390] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, o método compreende ainda a administração de um agente antifibrótico. Em algumas modalidades, o agente antifibrótico inibe a síntese de colágeno estimulada por transformação do fator de crescimento beta (TGF-β), diminui a matriz extracelular e/ou bloqueia a proliferação de fibroblastos. Em algumas modalidades, o agente antifibrótico é pirfenidona. Em algumas modalidades, o agente antifibrótico é PBI-4050. Em algumas modalidades, o agente antifibrótico é o tipelukast.
[391] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, o método compreende ainda a administração de um inibidor da tirosina quinase. Em algumas modalidades, o inibidor de tirosina quinase inibe uma tirosina quinase que medeia a elaboração de um ou mais fatores de crescimento
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 228/418
222/324 fibrogênicos. Em algumas modalidades, o fator de crescimento fibrogênico é fator de crescimento derivado de plaquetas, fator de crescimento endotelial vascular e/ou fator de crescimento de fibroblastos. Em algumas modalidades, o inibidor de tirosina quinase é imatinib e/ou nintedanib. Em algumas modalidades, o inibidor de tirosina quinase é nintedanib. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, o método compreende ainda a administração de um agente antidiarreico. Em algumas modalidades, o agente antidiarreico é loperamida.
[392] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, o método compreende ainda a administração de um anticorpo. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo anti-interleucina (IL) -13. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-IL-13 é tralokinumab. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo anti-IL-4/anti-IL-13. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-IL-4/anti-IL-13 é SAR 156597. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo anti-fator de crescimento de tecido conjuntivo (CTGF). Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CTGF é FG-3019. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo anti-lisil oxidase 2 (LOXL2). Em algumas modalidades, o anticorpo anti-LOXL2 é simtuzumab. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo anti-receptor da integrina ανβ6. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-receptor da integrina ανβ6 é STX-100. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo monoclonal.
[393] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, o método compreende ainda a administração de um antagonista do receptor do ácido lisofosfatídico 1 (LPA1). Em algumas modalidades, o antagonista do receptor LPA1 é BMS-986020. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, o método compreende ainda a administração de um inibidor de galectina 3. Em algumas modalidades, o inibidor de galectina 3 é TD-139.
[394] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, o
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 229/418
223/324 método compreende ainda a administração de uma terapia paliativa. Em algumas modalidades, a terapia paliativa compreende um ou mais de um antibiótico, um ansiolítico, um corticosteroide e um opioide. Em algumas modalidades, o antibiótico é um antibiótico de largo espectro. Em algumas modalidades, o antibiótico é penicilina, um inibidor de β-lactamase e/ou uma cefalosporina. Em algumas modalidades, o antibiótico é piperacilina/tazobactam, cefixima, ceftriaxona e/ou cefdinir. Em algumas modalidades, o ansiolítico é alprazolam, buspirona, clorpromazina, diazepam, midazolam, lorazepam e/ou prometazina. Em algumas modalidades, o corticosteroide é um glucocorticosteroide. Em algumas modalidades, o glucocorticosteroide é prednisona, prednisolona, metilprednisolona e/ou hidrocortisona. Em algumas modalidades, o opioide é morfina, codeína, dihidrocodeína e/ou diamorfina.
[395] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, o método compreende ainda a administração de um antibiótico. Em algumas modalidades, o antibiótico é um macrolídeo. Em algumas modalidades, o macrolídeo é azitromicina e/ou claritromicina. Em algumas modalidades, o antibiótico é doxiciclina. Em algumas modalidades, o antibiótico é trimetoprim/sulfametoxazol. Em algumas modalidades, o antibiótico é uma cefalosporina. Em algumas modalidades, a cefalosporina é cefepima, cefixima, cefpodoxima, cefprozil, ceftazidima e/ou cefuroxima. Em algumas modalidades, o antibiótico é penicilina. Em algumas modalidades, o antibiótico é amoxicilina, ampicilina e/ou pivampicilina. Em algumas modalidades, o antibiótico é uma combinação de inibidor de penicilina^-lactamase. Em algumas modalidades, a combinação de inibidor de penicilina Ζβ-lactamase amoxicilina/clavulanato e/ou piperacilina/tazobactam. Em algumas modalidades, o antibiótico é uma fluoroquinolona. Em algumas modalidades, a fluoroquinolona é ciprofloxacina, gemifloxacina, levofloxacina, moxifloxacina e/ou ofloxacina.
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 230/418
224/324 [396] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, o método compreende ainda a administração de um inibidor de fosfodiesterase. Em algumas modalidades, o inibidor da fosfodiesterase é um inibidor da fosfodiesterase tipo 5. Em algumas modalidades, o inibidor da fosfodiesterase é avanafil, benzamidenafil, dasantafil, icariin, lodenafil, mirodenafil, sildenafil, tadalafil, udenafil e/ou vardenafil. Em algumas modalidades, o inibidor de PDE é um inibidor de PDE-4. Em algumas modalidades, o inibidor de PDE-4 é roflumilast, cilomilast, tetomilast e/ou CHF6001. Em algumas modalidades, o inibidor de PDE é um inibidor de PDE-3/PDE-4. Em algumas modalidades, o inibidor PDE-3/PDE-4 é RPL-554.
[397] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, o método compreende ainda a administração de um agente citotóxico e/ou imunossupressor. Em algumas modalidades, o agente citotóxico e/ou imunossupressor é azatioprina, colchicina, ciclofosfamida, ciclosporina, metotrexato, penicilamina e/ou talidomida. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, o método compreende ainda a administração de um agente que restaura os níveis de glutationa esgotados no pulmão. Em algumas modalidades, o agente que restaura os níveis de glutationa esgotados no pulmão é /V-acetilcisteína. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, o método compreende ainda a administração de um anticoagulante. Em algumas modalidades, o anticoagulante é varfarina, heparina, proteína C ativada e/ou inibidor da via do fator tecidular.
[398] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, o método compreende ainda a administração de um antagonista do receptor da endotelina. Em algumas modalidades, o método antagonista do receptor de endotelina é bosentano, macitentano e/ou ambrisentano. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, o método compreende ainda a administração de um antagonista TNF-α. Em algumas modalidades, o
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 231/418
225/324 antagonista de TNF-α compreende um ou mais de etanercept, adalimumab, infliximab, certolizumabe e golimumab. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, o método compreende ainda a administração de interferon gama-1b.
[399] Em algumas modalidades qualquer um dos métodos, o método compreende ainda administrar um inibidor de interleucina (IL). Em algumas modalidades, o inibidor de IL é um inibidor de IL-5. Em algumas modalidades, o inibidor de IL-5 é mepolizumabe e/ou benralizumabe. Em algumas modalidades, o inibidor de IL é um inibidor de IL-17A. Em algumas modalidades, o inibidor de IL-17A é CNTO-6785.
[400] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, o método compreende ainda a administração de um inibidor da proteína quinase ativada por mitógeno p38 (MAPK). Em algumas modalidades, o inibidor de MAPK p38 é losmapimod e/ou AZD-7624. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, o método compreende ainda a administração de um antagonista CXCR2. Em algumas modalidades, o antagonista de CXCR2 é danirixina.
[401] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, o método compreende ainda vacinação. Em algumas modalidades, a vacinação é a vacinação contra pneumococos e/ou gripe. Em algumas modalidades, a vacinação é a vacinação contra Streptococcus pneumoniae e/ou gripe. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, o método compreende ainda a administração de uma terapia antiviral. Em algumas modalidades, a terapia antiviral é oseltamivir, peramivir e/ou zanamivir.
[402] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, o método compreende ainda a prevenção de refluxo gastroesofágico e/ou microaspiração recorrente.
[403] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, o
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 232/418
226/324 método compreende ainda suporte ventilatório. Em algumas modalidades, o suporte ventilatório é ventilação mecânica. Em algumas modalidades, o suporte ventilatório é ventilação não invasiva. Em algumas modalidades, o suporte ventilatório é oxigênio suplementar. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, o método compreende ainda reabilitação pulmonar.
[404] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, o método compreende ainda transplante de pulmão. Em algumas modalidades, o transplante de pulmão é um transplante de pulmão único. Em algumas modalidades, o transplante de pulmão é um transplante de pulmão bilateral.
[405] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, o método compreende ainda uma intervenção não farmacológica. Em algumas modalidades, a intervenção não farmacológica é a cessação do tabagismo, uma dieta saudável e/ou exercício regular. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, o método compreende ainda a administração de uma ajuda farmacológica para a cessação do tabagismo. Em algumas modalidades, a ajuda farmacológica para a cessação do tabagismo é a terapia de reposição de nicotina, bupropiona e/ou vareniclina. Em algumas modalidades, a intervenção não farmacológica é a terapia pulmonar. Em algumas modalidades, a terapia pulmonar é reabilitação pulmonar e/ou oxigênio suplementar. Em algumas modalidades, a intervenção não farmacológica é a cirurgia pulmonar. Em algumas modalidades, a cirurgia pulmonar é cirurgia de redução do volume pulmonar, transplante pulmonar único, transplante pulmonar bilateral ou bullectomia. Em algumas modalidades, a intervenção não farmacológica é o uso de um dispositivo. Em algumas modalidades, o dispositivo é uma bobina de redução de volume pulmonar, um stent de expiração das vias aéreas e/ou um sistema de suporte ventilatório nasal.
[406] Tais terapias de combinação referidas acima abrangem
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 233/418
227/324 administração combinada (em que dois ou mais agentes terapêuticos estão inclusos nas mesmas formulações ou separadamente) e administração separada, caso em que, a administração de um anticorpo anti-triptase, ou uma sua composição farmacêutica, pode ocorrer antes para, simultaneamente, e/ou após a administração do(s) agente(s) terapêutico(s) adicional(ais). Numa modalidade, a administração de um anticorpo anti-triptase, ou uma sua composição farmacêutica, e a administração de um agente terapêutico adicional ocorrem dentro de cerca de um mês; ou dentro de uma, duas ou três semanas; ou dentro de um, dois, três, quatro, cinco ou seis dias; ou dentro de cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 horas; ou dentro de cerca de 1, 5, 10, 20, 30, 40 ou 50 minutos um do outro. Para modalidades envolvendo administração sequencial, o anticorpo anti-triptase pode ser administrado antes ou após a administração do(s) agente(s) terapêutico(s) adicional(ais).
[407] Um anticorpo anti-triptase da invenção, ou suas composições farmacêuticas (e qualquer agente terapêutico adicional) pode ser administrado por qualquer meio adequado, incluindo administração parentérica, intrapulmonar e intranasal. As infusões parentéricas incluem a administração intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea. Em alguns casos, um anticorpo antitriptase da invenção pode ser administrado por via intravítrea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, percutânea, intraarterial, intraperitoneal, intralesional, intracraniana, intra-articular, intraprostaticamente, intrapleural, intratraqueal, intratecal, intranasal, intravaginal, intra-tópica, tópica, intratumoral, peritoneal, subcutânea, subconjuntival, intravesicular e mucosal, intrapericárdica, intra-iluminal, intraocular, intraorbital, oral, tópica, transdérmica, periocular, conjuntival, subtenoniana, intracameral, sub-retiniana, retrobulbariana, intracanalicular, por inalação, por injeção, por implantação, através de células-alvo de banho de perfusão localizadas diretamente, por cateter, por lavagem, em cremes ou em
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 234/418
228/324 composições lipídicas. Em casos particulares, o anticorpo, ou uma sua composição farmacêutica, pode ser administrado por administração subcutânea. As composições utilizadas nos métodos aqui descritos também podem ser administradas sistematicamente ou localmente. A dosagem pode ser por qualquer via apropriada, por exemplo, por injeções, como injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte se a administração for breve ou crônica. São fornecidos neste documento muitos esquemas de dosagem incluindo, mas não se limitando a administrações únicas ou múltiplas durante vários momentos, a administração em bolus e a infusão em pulso.
[408] Os anticorpos da invenção ou composições farmacêuticas deste iriam ser formulados, dosados e administrados de forma consistente com boas práticas médicas. Os fatores para consideração neste contexto incluem o distúrbio específico sendo tratado, o mamífero específico sendo tratado, a condição clínica do paciente indivíduo, a causa do distúrbio, o local de distribuição do agente, o método de administração, o esquema da administração e outros fatores conhecidos aos profissionais médicos. O anticorpo ou composição farmacêutica deste não precisa ser, mas opcionalmente é formulado com um ou mais agentes, atualmente utilizados para prevenir ou tratar o distúrbio em questão. A quantidade eficaz de tais outros agentes dependem da quantidade de anticorpo presente na formulação, do tipo de distúrbio ou tratamento e de outros fatores discutidos acima. Estes geralmente são usados nas mesmas dosagens e nas vias de administração como descritas neste documento, ou cerca de 1 a 99% das dosagens descritas neste documento ou em qualquer dosagem e por qualquer via que seja empiricamente/clinicamente determinada como apropriada.
[409] Para a prevenção ou tratamento da doença, a dosagem apropriada de um anticorpo ou imunoconjugado da invenção (quando utilizado sozinho ou em combinação com um ou mais outros agentes terapêuticos
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 235/418
229/324 adicionais) dependerá do tipo de doença a ser tratada, o tipo de anticorpo, a gravidade e o curso da doença, se o anticorpo é administrado para fins preventivos ou terapêuticos, terapia anterior, a história clínica do paciente e resposta do anticorpo, e a critério do médico atendente. O anticorpo é devidamente administrado ao paciente em um momento ou ao longo de uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e da gravidade da doença, cerca de 1 pg/kg a 15 mg/kg (por exemplo, 0,1 mg/kg a 10 mg/kg) do anticorpo pode ser uma dosagem candidata inicial para a administração ao paciente, por exemplo, tanto por uma ou mais administrações separadas, quanto por infusão contínua. Uma dosagem diária típica pode variar de cerca de 1 pg/kg a 200 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento geralmente seria sustentado até que ocorresse uma supressão desejada dos sintomas de doença. Uma dosagem exemplar do anticorpo estaria no intervalo de cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 10 mg/kg. Assim, uma ou mais doses de cerca de 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ou 10 mg/kg (ou qualquer combinação destas) podem ser administradas ao paciente. Essas doses podem ser administradas intermitentemente, por exemplo, a cada semana, ou a cada duas semanas, ou a cada três semanas ou a cada quatro semanas (por exemplo, tal que o paciente receba de cerca de duas a cerca de vinte, ou por exemplo, cerca de seis doses do anticorpo). Por exemplo, uma dose pode ser administrada uma vez por mês (por exemplo, por injeção subcutânea). Uma dose de carga inicial maior, seguida por uma ou mais doses menores, pode ser administrada. No entanto, outros regimes de dosagem podem ser úteis. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por técnicas e ensaios convencionais. Em alguns casos, a dose de cerca de 50 mg/ml a cerca de 200 mg/ml (por exemplo, cerca de 50 mg/ml, cerca de 60 mg/ml, cerca de 70 mg/ml, cerca de 80 mg/ml, cerca de 90 mg/mL, cerca de
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 236/418
230/324
100 mg/mL, cerca de 110 mg/mL, cerca de 120 mg/mL, cerca de 130 mg/mL, cerca de 140 mg/mL, cerca de 150 mg/mL, cerca de 160 mg/mL, cerca de 170 mg/mL, cerca de 180 mg/mL, cerca de 190 mg/mL ou cerca de 200 mg/mL de um anticorpo pode ser administrado, por exemplo, por injeção subcutânea. Em alguns casos, cerca de 150 mg/mL de um anticorpo podem ser administrados por injeção subcutânea.
[410] Entende-se que qualquer uma das formulações acima ou métodos terapêuticos podem ser efetuados utilizando um imunoconjugado da invenção em vez de ou além de um anticorpo anti-tritase.
H. Artigos de Fabricação [411] Noutro aspecto da invenção, é fornecido um artigo de fabricação contendo materiais úteis para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico dos distúrbios descritos acima (por exemplo, distúrbios associados a triptase). O artigo de fabricação compreende um recipiente e um rótulo ou bula dentro ou associado ao recipiente. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, sacos de solução IV, etc. Os recipientes podem ser formados de uma variedade de materiais como o vidro ou plástico. O recipiente contém uma composição que é por si só ou combinado com outra composição eficaz para tratar, prevenir e/ou diagnosticar a condição e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou um frasco com uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é um anticorpo da invenção, ou uma composição farmacêutica deste. O rótulo ou bula indica que a composição é utilizada para o tratamento da condição de escolha. Além disso, o artigo de fabricação pode compreender (a) um primeiro recipiente com uma composição que contém nesse lugar, em que a composição é composta por um anticorpo da invenção; e (b) um segundo recipiente com uma composição que contém nesse lugar, em que a
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 237/418
231/324 composição compreende um agente terapêutico adicional. O artigo de fabricação nesta modalidade da invenção pode compreender adicionalmente uma bula indicando as composições que podem ser usadas para tratar uma condição específica. Alternativa ou adicionalmente, o artigo de fabricação pode compreender ainda um segundo (ou terceiro) recipiente compreendendo um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Pode incluir ainda outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.
[412] Entende-se que qualquer um dos artigos acima de fabrico pode incluir um imunoconjugado da invenção em vez de ou além de um anticorpo anti-triptase.
III. Exemplos [413] A seguir encontram-se exemplos de métodos e composições da invenção. Entende-se que várias outras modalidades podem ser praticadas, dada a descrição geral fornecida acima. A menos que especificamente indicado, a triptase beta 1 humana foi usada nos estudos.
Exemplo 1: Geração e humanização de anticorpos anti-triptase
A. Materiais e Métodos [414] Os números de resíduos são de acordo com Kabat et al. Sequences of proteins of immunological interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
(i) Expressão recombinante e purificação da triptase em células de insetos e células de mamíferos [415] A sequência que codifica a triptase beta 1 humana do tipo selvagem madura (Ile16 - Pro246 numeração de quimotripsinogênio, SEQ ID NO: 97) foi clonada num vetor pAcGP67A modificado através do promotor de
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 238/418
232/324 poliedro e a sequência de sinal de secreção gp67. Salvo indicação em contrário, nesta seção, a triptase refere-se à triptase beta 1 humana (também referida como triptase b1 humana). O construto contém um marcador His6 do N-terminal, um local de divagem de enteroquinase e, para alguns construtos, um marcador FLAG do C-terminal. A mutagênese direcionada ao local foi realizada utilizando protocolos padrão QuikChange™ (Stratagene) para gerar mutantes de triptase. Ambos os construtos foram confirmados por sequenciamento de DNA. Os baculovírus recombinantes foram gerados utilizando o sistema BaculoGold™ (BD Biosciences) em células Sf9 seguindo protocolos padrão. As células deTrichoplusia ni foram infectadas para produção de proteína em larga escala e colhidas 48 h após a infecção. O meio colhido foi suplementado com 1 mM de NiCL, 5 mM de CaCLe 20 mM Ths pH 8, agitado durante 30 min, e depois centrifugado durante 20 min a 8500 x g para remover as células e precipitar do meio. Filtrou-se o meio sobrenadante através de um filtro de polietersulfona (PES) de 0,22 pm antes de carregar numa coluna de afinidade de ácido níquel-nitrilotriacético (Ni-NTA). A triptase beta 1 humana também foi expressa por transfecção transiente na linha celular de mamífero CHO DP12. O meio de cultura celular foi submetido à mesma purificação começando com purificação por afinidade com Ni-NTA como descrito abaixo.
[416] Meio de células de insetos ou meios de células CHO contendo triptase recombinante marcada com His6 segregada (do tipo selvagem ou mutante) foi carregado numa coluna de 10 mL Ni-NTA Superflow (Qiagen) a uma taxa de fluxo volumérica de 170 cm/h. A coluna foi lavada com 10 CV (volumes de coluna) de tampão de lavagem (Tris 20 mM, pH 8, imidazol 10 mM, NaCI 300 mM) e eluída com tampão de eluição de 8 CV (Tris 20 mM pH 8, imidazole 300 mM, 300 mM NaCI). As frações analisadas por electroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio (SDSPAGE) contendo triptase foram reunidas, concentradas e carregadas numa
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 239/418
233/324 coluna de exclusão de tamanho S200 (GE Healthcare) para posterior purificação utilizando tampão de execução ácido de (10 mM 3- (/V-morfolino) propanossulfônico (MOPS) pH 6,8, NaCl 2 M) em taxas de fluxo recomendadas pelo fabricante. As frações contendo a triptase recombinante marcada com His (monomérica) foram reunidas e concentradas. A triptase recombinante foi então clivada durante à noite temperatura ambiente a uma concentração de 2 mg/mL em tampão (10 mM MOPS pH 6,8, 0,2 M NaCl) contendo 0,5 mg/mL de heparina (Sigma Aldrich) e 0,1 mg/mL de enteroquinase (New England Biolabs , Inc). Esta etapa remove o marcador His6 do N-terminal e resulta em tetramerização e triptase proteoliticamente ativa, que tem IVGG como a sequência do N-terminal recentemente formada, começando no resíduo 16 (numeração de quimotripsinogênio). A triptase tetramérica foi então submetida a cromatografia de exclusão por tamanho utilizando uma coluna S200 (GE Healthcare) em tampão (10 mM MOPS pH 6,8 e 2 M NaCl) para purificar a triptase tetramérica removendo enterocinase e qualquer triptase recombinante não clivada.
[417] Os mutantes de triptase Y75C e I99C, bem como o mutante cataliticamente inativo S195A (numeração de quimotripsinogênio, correspondente à substituição de Ser224 a Ala da sequência de triptase de comprimento total SEQ ID NO: 71) foram purificados por cromatografia de afinidade com Ni como descrito acima. Os mutantes de dímero de triptase ligados por dissulfureto foram então separados dos mutantes de monômero de triptase não ligados por dissulfureto por cromatografia por exclusão de tamanho S200. Mutantes de dímeros ligados por dissulfureto foram ainda processados em tetrâmeros como descrito acima para a triptase do tipo selvagem.
(ii) Geração de anticorpos monoclonais de coelho e camundongos triptase anti-humanos [418] Dois coelhos foram imunizados com triptase beta 1
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 240/418
234/324 (tetrâmero) humana derivada de CHO com Adjuvante Completo de Freund (CFA). Os coelhos foram reforçados com a mesma proteína, com Adjuvante Incompleto de Freund (IFA), uma vez a cada 2 semanas. Após 4 injeções, amostras de soro purificadas foram avaliadas quanto à ligação por ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA) e inibição da atividade da triptase humana utilizando um ensaio de atividade enzimática. As células B do baço colhidas de um dos coelhos, que demonstraram inibição da atividade da triptase humana, foram então fundidas com um parceiro de fusão de coelho. Após 10-14 dias, os sobrenadantes foram coletados e rastreados quanto à ligação às proteínas por ELISA.
[419] O protocolo ELISA foi o seguinte. Placas NUNC MAXISORB® ELISA de 96 poços foram revestidas durante a noite com NeutrAvidin® Proteína de Ligação a Biotina (Thermo Scientific n°. de Catálogo . 31000, stock 10 mg/ml) a 5 pg/ml, 100 μΙ/poço. Os poços foram lavados três vezes com tampão de lavagem (PBS com TWEEN®-20 a 0,05%) e secos por secagem. Os poços foram então bloqueados com 200 μΙ/poço de Tampão de Bloqueio (PBS com albumina de soro bovino a 0,5% (BSA) e TWEEN®-20 a 0,05%) e incubados durante um período superior ou igual a 30 min à temperatura ambiente. Proteína triptase beta 1 humana biotinilada (diluída em tampão de ensaio; PBS com BSA a 0,5%, TWEEN®-20 a 0,05% e heparina 0,1 mg/ml) foi adicionada aos poços a 1 pg/ml e incubada à temperatura ambiente por 1 h ± 10 min. A heparina foi incluída para garantir que a triptase permanecesse como um tetrâmero. Os poços foram lavados três vezes com tampão de lavagem (200 μΙ/poço) e secos. Os sobrenadantes de hibridoma (amostras) ou controles (por exemplo, os controles positivos de anticorpo policlonal purificado de coelho YZ4209 (0,25 mg/mL) foram adicionados aos poços (diluídos em tampão de ensaio, 100 μΙ/poço) e incubados à temperatura ambiente durante 1 h. Em seguida, os poços foram lavados três vezes com
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 241/418
235/324 tampão de lavagem (200 μΙ/poço) e secos. Foi adicionado conjugado de peroxidase de rábano (HRP) (IgG de cabra anticoelho (H + L) HRP; Thermo Scientific n° de Catálogo . 31460) (diluído 1:10.000 em tampão de ensaio, 100 μΙ/poço) e incubado à temperatura ambiente durante 30 min . Os poços foram novamente lavados três vezes com tampão de lavagem (200 μΙ/poço) e secos. Adicionou-se o substrato (substrato BioFX TMB, n° de produto: TMBW-100001) (100 μΙ/poço) e incubou-se durante 5 min à temperatura ambiente. A reação foi interrompida por adição de 100 μΙ/poço da solução de paragem BioFX (Produto n°: BSTP-0100-01), e as placas foram lidas a Aeso.
[420] Todos os clones positivos para ELISA foram purificados por cromatografia de afinidade utilizando métodos padrão (MabSelect SuRe ™; GE Healthcare) e depois pesquisados quanto à inibição da atividade da triptase humana num ensaio de atividade de triptase recombinante. Resumidamente, os anticorpos foram diluídos de 0,007 a 100.000 ng/mL (0,046 pM a 667 nM) em PBS, pH 7,4. A triptase beta 1 humana recombinante foi diluída para 3 nM em Tampão TNH (Tris 200 mM, NaCI 150 mM, 0,1 mg/mL de heparina, TRITON ™ X-100 a 0,01%, pH 8,0) e combinada 1: 1 com anticorpos antitriptase em placas pretas de 384 poços (ViewPlate-384 F, Preto, Fundo Transparente, Perkin Elmer, n° de Catálogo . 6007470). As placas foram incubadas durante 1 h à temperatura ambiente com agitação suave. O substrato colorimétnco S-2288 (Chromogenix, Part n° 82-0852-39) foi diluído para 900 μΜ em Tampão TNH e foi adicionado à placa. As concentrações finais em poço foram 300 μΜ de S-2288, 1 nM de triptase beta 1 humana recombinante e 0,015 pM a 222 nM de anticorpos anti-triptase. As placas foram incubadas durante 40 min à temperatura ambiente com agitação suave e depois foram lidas em A405. A metade da concentração inibitória máxima (IC50) dos anticorpos anti-triptase foi determinada a partir de um ajuste de quatro parâmetros de suas respectivas curvas. Os clones que demonstram a inibição
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 242/418
236/324 desejada foram então subclonados por diluição limitante (célula única/poço), testados novamente como descrito acima e ainda caracterizados.
[421] Os hibridomas de camundongos foram gerados e pesquisados e os clones positivos foram analisados de um modo semelhante. Três camundongos A/J (Harlan, Indianapolis, Ind.) foram imunizados com proteína triptase purificada como o antígeno (EPC, Inc. # TR913). Triptase enzimática ativa administrada a 20 pg/camundongo por imunização subcutânea e intraperitoneal após mistura e emulsificação 1: 1 com Adjuvante Completo de Freund (primeira imunização) ou Adjuvante Incompleto de Freund (segunda, terceira e quarta imunização). O reforço (quinta imunização) não teve adjuvante. Após a quarta imunização, soros de camundongos imunizados foram testados por ELISA e o camundongo com título de soro superior a OD450 >2,16 na diluição de 1: 1,28 x 104 foi selecionado para a fusão do hibridoma.> 107 x 106células de baço isoladas foram misturadas com 100 x 106 de mieloma Sp2 /0 (ATCC) para fusão na presença de polietilenoglicol (Sigma-Aldrich, Cat. n° P7777-5G). Vinte e quatro clones foram rastreados quanto à ligação à triptase e ensaiados quanto à inibição das atividades enzimáticas da triptase. Clone T31a (também referido aqui como “31 A” e “mu.31A ”) foi selecionado para humanização.
(iii) Clonagem molecular e reformatação de clones de hibridoma anti-triptase de coelho [422] O RNA total foi extraído de células de hibridoma que produzem os anticorpos monoclonais anti-thptase de coelho (RNeasy® Mini Kit, Qiagen). Utilizando o Kit de Amplificação de cDNA SMARTer® RACE (Clontech), o RNA foi primeiro transcrito inversamente, depois sujeito a síntese de cDNA de primeira cadeia e 5' RACE de amplificação por PCR dos domínios leve variável (VL) e pesado variável (VH) com os seguintes iniciadores:
Primer para a frente da cadeia leve (LC):
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 243/418
237/324
Universal Primer Mix (kit de amplificação de cDNA SMARTer® RACE, Clontech, catálogo #634858)
Primer para a frente da cadeia pesada (HC):
Universal Primer Mix (kit de amplificação de cDNA SMARTer® RACE, Clontech, catálogo #634858)
Primer inverso LC:
5’-GATGGTGACTGTTCCAGTTGC-3’ (SEQ ID NO: 74)
Primer inverso HC:
5’-CATTGGTGAGGGTGCCCGAGTTC-3’ (SEQ ID NO: 75) [423] Os primers inversos LC e HC foram concebidos para se ligarem a uma região no domínio de constante leve (CL) e no constante pesado 1(CH1).
[424] Os produtos de PCR amplificados foram sequenciados diretamente. A sequência de DNA de VL identificada foi então subclonada no vetor de expressão de células de mamífero pRK contendo o domínio constante kappa humano. A sequência de DNA de VH foi inserida em vetores pRK codificando o domínio constante γ1 humano completo.
(iv) Humanização do anticorpo monoclonal anti-triptase de coelho E104 [425] Os domínios VL (SEQ ID NO: 53) e VH (SEQ ID NO: 52) do anticorpo monoclonal de coelho anti-triptase E104 foram alinhados com as sequências de consenso VL kappa I (VLki) e VH humano do subgrupo IV (VHiv) (SEQ ID NOs: 92 e 93, respectivamente). Ver, por exemplo, Dennis, Ch. 2 CDR Repair: A Novel Approach to Antibody Humanization in Current Trends in Monoclonal Antibody Development and Manufacturing, Eds. Shire et al. Springer, New York, NY. As regiões hipervariáveis (HVR) foram manipuladas nos frameworks aceitadores VLki e VHiv humanos de consenso para gerar variantes de enxerto CDR. A partir do domínio E104 VL, as posições 24-34
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 244/418
238/324 (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) foram enxertadas em VLki. Do domínio VH, as posições 26-35b (H1), 50-65 (H2) e 93-102 (H3) foram enxertadas em VHiv. Para avaliar as posições vernier de framework que podem ser importantes, as posições vernier selecionadas sofreram mutação de volta para as sequências de coelho. As posições vernier que sofreram mutação de volta para as sequências de coelho incluíram as posições 2, 4, 43, 68 e 87 em VL e 37, 67, 71, 78 e 91 em VH.
[426] Os domínios VL e VH do anticorpo monoclonal de coelho anti-triptase E104 foram também alinhados com as sequências de consenso VL kappa I (VLki) e VH humano do subgrupo III (VHin) (SEQ ID NOs: 92 e 94, respectivamente). Ver Dennis, supra. As regiões hipervariáveis (HVR) foram manipuladas nos frameworks aceitadores VLki e VHm humanos de consenso para gerar variantes de enxerto CDR. A partir do domínio rab.E104 VL, as posições 24-34 (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) foram enxertadas em VLki. Do domínio VH, as posições 26-35 (H1), 50-65 (H2) e 93-102 (H3) foram enxertadas em VHm.
[427] No total, duas versões diferentes de sequências VL humanizadas e seis versões diferentes de sequências VH humanizadas foram sintetizadas e subsequentemente subclonadas em vetores de expressão de mamífero pRK. Combinando as diferentes versões do LC e HC, um total de doze variantes E104 humanizadas diferentes (v1 a v12) foram geradas (Tabela 3). Todas as variantes anti-triptase humanizadas foram expressas como anticorpos lgG1 ou lgG4 em células de mamífero. Os anticorpos foram purificados por cromatografia de afinidade usando métodos padrão (MabSelect SuRe ™; GE Healthcare). Todos os anticorpos lgG4 utilizados na seção de Exemplos incluíram uma mutação S228P (numeração EU) na região constante da cadeia pesada; no entanto, a invenção descrita neste documento não está limitada à variante de lgG4 com a mutação S228P.
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 245/418
239/324 [428] Uma sequência de DNA que codifica o domínio VH de huE104.v2 mostrada na SEQ ID NO: 109. Uma sequência de DNA que codifica o domínio VL de huE104.v2 mostrada na SEQ ID NO: 110. Uma sequência de DNA que codifica a cadeia pesada (lgG1) mostrada na SEQ ID NO: 111. Uma sequência de DNA que codifica a cadeia pesada (lgG4.S228P) é apresentada na SEQ ID NO: 113. Uma sequência de DNA que codifica a cadeia leve (lgG1 e lgG4) é mostrada na SEQ ID NO: 112. A sequência de aminoácidos da cadeia pesada (HC) de lgG1 huE104.v2 mostrada na SEQ ID NO: 80. A sequência de aminoácidos da cadeia leve (LC) de huE104.v2 (lgG1 ou lgG4) é mostrada na SEQ ID NO: 81. A sequência de aminoácidos do HC de huE104.v2 lgG4 S228P é mostrada na SEQ ID NO: 82.
(v) Humanização do anticorpo monoclonal anti-triptase de camundongo 31A [429] Os domínios VL (SEQ ID NO: 20) e VH (SEQ ID NO: 19) do anticorpo monoclonal anti-triptase de camundongo 31A (mu.31A ”) foram alinhadas com as sequências de consenso de VL kappa I humana (VLki) e VH humana do subgrupo III (VHm) (SEQ ID NOs: 92 e 93, respectivamente). As regiões hipervariáveis (HVR) foram manipuladas nos frameworks aceitadores VLki e VHm humanos de consenso para gerar variantes de enxerto CDR. A partir do domínio mu.E31A VL, as posições 24-34 (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) foram enxertadas em VLki. A partir do domínio mu.31A VH, as posições 26-35 (H1), 50-65 (H2) e 93-102 (H3) foram enxertadas em VHm. Para avaliar a importância das posições vernier do framework, as posições vernier selecionadas sofreram mutação de volta para as sequências do camundongo. As posições vernier que sofreram mutação de volta para que as sequências de camundongo incluam as posições 4, 43, 46, 47 e 71 em VL e a posição 49 em VH.
[430] Em resumo, três LC humanizados e cinco HC humanizados
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 246/418
240/324 foram sintetizados e subsequentemente subclonados em vetores de expressão de mamífero pRK. Combinando as diferentes versões do LC e HC, um total de quinze diferentes variantes humanizados (v1 a v15) de 31A (hu31A) foram gerados (Tabela 4).
[431] Todas as variantes anti-triptase humanizadas foram expressas como anticorpos lgG1 ou lgG4 em células de mamífero. Os anticorpos foram purificados por cromatografia de afinidade usando métodos padrão (MabSelect SuReTM; GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA).
[432] Uma sequência de DNA que codifica o domínio VH de hu31A.v11 mostrada na SEQ ID NO: 104. Uma sequência de DNA que codifica o domínio VL de hu31A.v11 mostrada na SEQ ID NO: 105. Uma sequência de DNA que codifica a cadeia pesada (lgG1) mostrada na SEQ ID NO: 106. Uma sequência de DNA que codifica a cadeia pesada (lgG4.S228P) é apresentada na SEQ ID NO: 108. Uma sequência de DNA que codifica a cadeia leve (lgG1 e lgG4) é mostrada na SEQ ID NO: 107. A sequência de aminoácidos do HC de lgG1 hu31A.v11 é apresentada na SEQ ID NO: 76. A sequência de aminoácidos do LC de lgG1 hu31A.v11 mostrada na SEQ ID NO: 77. A sequência de aminoácidos do HC de hu31A.v11 lgG4 S228P é mostrada na SEQ ID NO: 78. A sequência de aminoácidos do LC de hu31 A.v11 lgG4 S228P mostrada na SEQ ID NO: 79.
(vi) Clonagem, expressão e purificação de fragmentos Fab [433] Os Fabs foram clonados e expressos em E. coli como previamente descrito (ver Simmons et al. J. Immunol. Methods 263: 133-147, 2002; Lombana et al. Sci. Rep. 5: 17488, 2015). A pasta celular de E. coli contendo o Fab expresso foi coletada de fermentações expressando Fabs e dissolvida em tampão PBS contendo EDTA 25 mM e fluoreto de fenilmetilsulfonil de 1 mM (PMSF). A mistura foi homogeneizada e depois passada duas vezes através de um microfluidificador. A suspensão foi então
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 247/418
241/324 centrifugada a 21,500 x g durante 60 min. O sobrenadante foi então carregado numa coluna de Proteína G equilibrada com PBS a 5 ml/min. A coluna foi lavada com tampão PBS até à linha de base e as proteínas foram então eluídas com ácido acético a 0,6%. As frações contendo Fabs, como ensaiadas por SDS-PAGE, foram reunidas e depois carregadas numa coluna de 50 mL de SP SEPHAROSE® equilibrada em MES 20 mM (pH 5,5). A coluna foi lavada com tampão MES 20 mM (pH 5,5) para 2 volumes de coluna e depois eluída com um gradiente linear para NaCl 0,5 M em tampão MES de 20 mM (pH 5,5). Para purificação final, as frações contendo Fab da cromatografia de troca iônica foram concentradas e corridas numa coluna de exclusão de tamanho S75 em tampão PBS. O mesmo protocolo foi usado para todos os Fabs utilizados nos experimentos.
(vii) Análise de ressonância plasmônica de superfície (SPR) BIAcore® de variantes anti-triptase humanizadas [434] Nesta experiência, todas as variantes humanizadas foram expressas como IgG por transfecção transiente de células 293. A IgG foi purificada com cromatografia de afinidade com proteína G. A afinidade de cada variante para monômero de triptase beta 1 humana marcada com His recombinante (SEQ ID NO: 128) foi determinada por análise de SPR utilizando um BIAcore® T200. Os chips do sensor BIAcore® Série S CM5 foram imobilizados com anticorpo IgG (Fc) anti-humano de camundongo monoclonal (kit de captura de anticorpo humano da GE Healthcare) e as variantes antitriptase foram subsequentemente capturadas em cada célula de fluxo. Diluições em série de 3 vezes do monômero humano triptase beta 1 foram injetadas a uma taxa de fluxo de 30 μΙ/min. Cada amostra foi analisada com 3 min de associação e 10 min de dissociação. Após cada injeção, o chip foi regenerado usando 3 M de MgCE A resposta de ligação foi corrigida subtraindo as unidades de resposta (RU) de uma célula de fluxo capturando
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 248/418
242/324 uma IgG irrelevante com densidade semelhante. Um modelo Languir 1:1 de ajuste simultâneo de kon e kofffoi usado para análise cinética.
(viii) Análise da atividade inibitória de variantes anti-triptase humanizadas
a. Ensaio enzimático da triptase [435] A inibição da atividade da triptase humana por anticorpos anti-triptase humanizados foi medida utilizando um ensaio de atividade de triptase recombinante. As lgG4 e lgG1 hu31a.v11 foram diluídas de 0,05 a 100 pg/ml (0,30 a 667 nM) em PBS, pH 7,4, e huE104.v2 lgG4 e huE104.v2 lgG1 foram diluídos de 0,02 a 50 pg/ml ( 0,15 a 333 nM) em PBS pH 7,4. Enzima ativa beta-tetrâmero triptase humana recombinante foi diluída para 0,75 nM em Tampão TNH (Tris 200 mM, NaCI 150 mM, 0,1 mg/mL de heparina, TRITON™ X-100 a 0,01%, pH 8,0) e combinada 1: 1 com Anticorpos antiestreptase em placas pretas de 384 cavidades (Visualizar placa-384 F, Preto, Claro-lnfehor, Perkin Elmer, n° de Catálogo . 6007470). As placas foram incubadas durante 1 h à temperatura ambiente com agitação suave. O substrato colohmétrico S2288 (Chromogenix, Part n° 82-0852-39) foi diluído para 1200 μΜ em Tampão TNH e foi adicionado à placa. As concentrações finais em poço foram de 400 μΜ S-2288, 0,25 nM de tetrâmero de triptase beta 1 humana recombinante, 66 pg/mL de heparina e 0,10 a 222 nM de anticorpos anti-triptase para hu31A.v11 e 0,05 a 111 nM para huE104.v2. As placas foram incubadas durante 40 min à temperatura ambiente com agitação suave e depois foram lidas em A405. O IC50 dos anticorpos anti-triptase foi determinado a partir de um ajuste de quatro parâmetros das respectivas curvas.
b. Ensaio de proliferação celular brônquica de músculo liso e ensaio de contração baseado em colágeno [436] Células do músculo liso brônquico humano (BSMCs; n° de Catálogo . CC-2576, Lonza Minneapolis, MN) foram cultivadas em incubadora
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 249/418
243/324 umidificada a 37°C com 5% de CChem meio de cultura completo SmGM-2 (n° de Catálogo. CC-3182, Lonza). O meio de ensaio foi meio de cultura SmGm-2 sem soro humano ou suplementos adicionados (n° de catálogo CC-3181, Lonza). Utilizou-se a tetrâmero de triptase humana do tipo selvagem ou a enzima triptase cataliticamente inativa S195A (numeração de quimotripsinogênio) nas concentrações especificadas. Os anticorpos de antitriptase humana hu31A.v11 lgG4 e E104.v2 lgG4 foram utilizados nas concentrações especificadas.
[437] Para o ensaio de proliferação, 1 dia antes da realização do ensaio, as BSMC foram plaqueadas a 2x105 células/ml numa placa de cultura de tecidos de 96 poços (n° de Catálogo 353072, Falcon BD) em meio de cultura completo. Após 24 h, o meio de cultura foi substituído por meio de ensaio e as células foram incubadas por mais 24 h. Os anticorpos de antitriptase humana foram diluídos em série 3,3 vezes em meio de ensaio numa placa de cultura de tecidos de 96 poços (n° de Catálogo 353072, Falcon BD). 100 pL de hu31A.v11 lgG4 diluído foram transferidos para uma placa de 96 poços contendo 100 pl de triptase humana a 200 nM. Os anticorpos triptase ativa e triptase humana foram incubados durante 30 min à temperatura ambiente. Neste momento, o meio de ensaio foi removido das células plaqueadas e substituído por 100 pL dos anticorpos diluídos mais triptase. A concentração final de anticorpos variou de 2,0 μΜ a 4 pM. A concentração final de triptase foi de 100 nM (sem heparina). A concentração final de sal foi de cerca de 130 mM. Os poços com apenas triptase foram incluídos como controles de estimulação. Os poços apenas com meio de ensaio foram incluídos como controles não estimulados. As placas foram incubadas por 24 horas a 37°C antes da adição de 1 pCi de HMimidina por poço. Após mais 6 h de incubação, a proliferação foi medida pela incorporação de HMimidina. A radioatividade associada às células foi quantificada por contagem de cintilação.
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 250/418
244/324
Os resultados foram expressos como a média de amostras em triplicado. Os gráficos foram gerados e a análise estatística foi realizada usando o KaleidaGraph (Synergy Software).
[438] Para o ensaio de contração baseada em colágeno, 1 dia antes da realização do ensaio, as BSMC foram plaqueadas em colágeno a 9x106células/mL numa placa de 24 poços (n° de Catálogo 353047, Falcon BD) seguindo as orientações do fabricante (n° de Catálogo CBA-201, Cell BioLabs Inc.). Após uma incubação de 1 h a 37°C, as células foram sobrepostas com 1 mL de meio de ensaio. Após 24 h de incubação a 37°C, o meio foi substituído por 250 pL de meio de ensaio novo. A triptase foi diluída em 250 pL de meio de ensaio para 660 nM na presença ou ausência de anticorpos anti-triptase humana 4 μΜ e incubada por 30 min a 37°C antes da adição nos poços específicos contendo a matriz de célula:colágeno. As concentrações finais foram de 330 nM triptase e 2 μΜ de anticorpo (sem heparina). A concentração final de sal foi de cerca de 130 mM. A contração celular foi iniciada pela liberação da matriz de colágeno: colágeno da parede da placa usando uma ponta de pipeta estéril. O meio de ensaio sozinho foi usado como um controle não estimulado. No início da contração celular (t = 0), as matrizes célula: colágeno foram visualizadas, visualizadas por imagem e registradas usando um Alphalmager® ProteinSimple. As células foram incubadas a 37° durante mais 3 h e as matrizes de células: colágeno foram recristalizadas e registadas (t = 3). Os dados foram analisados usando o software NIH Image J. Os dados foram representados como a variação percentual na célula: diâmetro da matriz de colágeno desde o início da contração (t = 0) até o ponto temporal de 3 h (t = 3). Os resultados foram expressos como a média de amostras em triplicado.
c. Ensaio de liberação de histamina de mastócitos [439] Utilizou-se a linha de mastócitos humanos LAD2. As células LAD2 foram cultivadas numa incubadora umidificada a 37° C com 5%
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 251/418
245/324 de CO2 em meio de crescimento isento de soro, StemPro®-34, contendo suplemento de nutrientes StemPro®-34 (n° de Catálogo 10640-019, Gibco/Life Technologies), 1x penicilina-estreptomicina-glutamina (n° de Catálogo 10378016, Gibco/Life Technologies) e 100 ng/mL de fator de células-tronco humanas recombinantes (SCF) (n° de Catálogo 573908, BioLegend). Ver Kirshenbaum et al. Leukemia Research 27: 677-682, 2003. Utilizou-se triptase humana do tipo selvagem ou triptase humana S195A mutante nas concentrações especificadas. IgE humana anti-NP (JW8.5.13; ver Jackman et al. J. Biol Chem. 285 (27): 20850-20859, 2010) foi obtido da Serotec Inc. NP-BSA (n° de Catálogo N5050H-10, Biosearch Technologies, Petaluma, CA) foi utilizado na concentração especificada para desencadear a libertação de histamina. Os anticorpos de anti-triptase humana hu31A.v11 lgG4 e E104.v2 lgG4 foram utilizados nas concentrações especificadas. O inibidor de molécula pequena G02849855 foi utilizado na concentração especificada. Estimulações celulares foram realizadas usando o Tyrode's Salt (n° de catálogo T-2397, Sigma). A histamina foi medida usando um kit de histamina ELISA (GenWay. n° de Catálogo 40-371-25010).
[440] Para o ensaio de libertação de histamina desencadeada por IgE humana, plaquearam-se as células LAD2 a 4x106 células/4 ml em 2 poços de uma placa de 6 poços. Adicionou-se IgE de anti-NP (100 ng/mL) a um poço e as células foram incubadas durante a noite a 37°C para iniciar as células. No outro poço, as células foram cultivadas em meio apenas sem a adição de IgE de anti-NP para servir como controle negativo. Após a incubação durante a noite, as células foram lavadas 3 vezes com meio de cultura celular para remover a IgE não ligada. As células foram ressuspensas em 4 mL de sais de Tyrode (densidade celular 1x106células/mL) e aliquotadas em tubos Eppendorf® (300.000 células/tubo). As amostras foram incubadas com 100 pg/mL de hu31A.v11 lgG4 ou 10 μΜ de G02849855, bem misturadas e
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 252/418
246/324 incubadas à temperatura ambiente por 1 h. Após esta incubação, a NP-BSA foi adicionada às amostras a uma concentração final de 0,1 pg/mL para desencadear a degranulação celular. As amostras foram bem misturadas e incubadas a 37°C numa incubadora de CO2 durante 1 h. As células foram então centrifugadas a 3000 rpm durante 5 min à temperatura ambiente, e o sobrenadante foi coletado para medição de histamina. A histamina no sobrenadante da desgranulação foi quantificada utilizando um kit de histamina ELISA. Os dados foram representados como a média de amostras duplicadas.
[441] Para o ensaio de libertação de histamina desencadeada por triptase humana, as células LAD2 foram ressuspensas em sais de Tyrode a uma concentração de 106células/mL e aliquotadas para tubos Eppendorf® (300.000 células/tubo). Para promover a degranulação celular, as células foram tratadas com 3 pg/mL de triptase (tipo selvagem ou mutante S195A) ou 3 pg/mL de triptase que foram pré-incubadas com 100 pg/mL hu31A.v11 por 45 min em temperatura ambiente. PBS foi usado como um controle sem estimulação. As amostras foram bem misturadas e incubadas a 37° C numa incubadora de CO2 durante 1 h. A concentração final de sal foi de cerca de 140 mM. As células foram então centrifugadas a 3000 rpm durante 5 min à temperatura ambiente, e o sobrenadante foi coletado para medição de histamina. A histamina no sobrenadante da desgranulação foi quantificada utilizando um kit de histamina ELISA. Os dados foram representados como a média de amostras duplicadas.
(ix) Purificação de monômeros e tetrâmeros de triptase recombinante [442] A triptase humana sem o peptídeo de sinal endógeno (resíduos de aminoácidos 1-15 da SEQ ID NO: 71) e pró-peptídeo (resíduos de aminoácidos 16-30 da SEQ ID NO: 71) foi expressa nas células CHO de mamífero como uma proteína recombinante marcada com His com um local de
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 253/418
247/324 divagem para enteroquinase manipulada e foram submetidos a ultrafiltração 5x seguido por uma diluição 5x em PBS. 0 meio foi então carregado sobre uma coluna Ni-NTA e eluído com imidazol de 250 mM. O eluato foi dialisado em tampão MOPS 10 mM, NaCI 0,2 M, pH 6,8, originando triptase monomérica. Os monômeros de triptase marcados com His6 não clivados permanecem monoméricos e não formam tetrâmeros.
[443] Para gerar triptase tetramérica, a triptase monomérica contendo o marcador His foi digerida utilizando 0,1 mg/mL de enzima enteroquinase e estabilizada com sal de sódio de sulfato de dextrano-10 a 0,5 mg/mL durante 16-20 h à temperatura ambiente. A proteína foi passada através de uma coluna SUPERDEX™ 200 para o tampão final de MOPS 10 mM, NaCI 2M, pH 6,8 para separar os tetrâmeros dos monômeros e de qualquer protease contaminante residual. Tetrâmero purificado exemplar é mostrado na Fig. 3A, pico 1. A triptase tetramétrica combinada foi usada para ensaios de imunização e atividade.
B. Resultados (i) Clonagem de hibridoma [444] A clonagem molecular de cinco anticorpos anti-triptase de coelho de clones de hibridoma positivos para ELISA revelou quatro clones anti-triptase únicos. Destes, o clone E104 mostrou a atividade de inibição mais robusta no ensaio enzimático, e foi selecionado para manipulação adicional. Em paralelo, um clone de anticorpo monoclonal antitriptase murino 31A que apresentou atividade de inibição no ensaio enzimático foi também selecionado para manipulação adicional.
(ii) Geração de variantes E104 quiméricas (chE104) [445] A cadeia leve do anticorpo monoclonal de coelho antitriptase E104 é uma cadeia leve kapa de coelho, que contém uma ponte dissulfureto entre Cys80 em FR3 do domínio variável (VL) e Cys170 no
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 254/418
248/324 domínio constante (CL). Para avaliar a importância de Cys80 no VL, foi gerada uma variante E104 quimérica com a cisteína na posição 80 que sofreu mutação para alanina (Cys80Ala). Como mostrado na Tabela 2, não houve diferença entre as duas variantes em termos de rendimento ou agregação, como evidenciado pela % elevada de monômero em ambas as variantes quiméricas Cys80 e Cys80Ala determinadas por cromatografia por exclusão de tamanho. Assim, determinou-se que o resíduo Cys80 não era crítico e na versão humanizada, Cys80 foi mudado para um resíduo de prolina como no enxerto VH4. Adicionalmente, os anticorpos E104 quiméricos com a mutação Cys80Ala no domínio variável FR3, quer fundidos com os domínios constantes lgG1 ou lgG4 humanos, mostraram atividades inibitórias semelhantes como o anticorpo monoclonal de coelho com cisteína na posição 80 (dados não mostrados).
Tabela 2: Efeito do Resíduo Cys80 do Anticorpo AntiTriptase E104 no Rendimento e Agregação
Clone anti-triptase Variantes da cadeia leve (posição 80 resíduos) Rendimento (mg) % de Monômero
E104 chE104.C 3,01 95,45
chE104.A 3,14 95,2
(iii) Humanização do clone de anticorpo monoclonal anti-triptase de coelho E104 e do clone de anticorpo monoclonal anti-triptase de camundongo 31A [446] Todas as variantes humanizadas foram expressas como IgG e as suas afinidades de ligação foram avaliadas num ensaio BIAcore® SPR. Em geral, todas as variantes E104 humanizadas (huE104) mostraram afinidades de ligação semelhantes em relação ao monômero de triptase beta
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 255/418
249/324 humano (Tabela 3). A Tabela 3 lista as variantes de huE104 bem como a afinidade de ligação (em termos de Kd) conforme determinado pela análise BIAcore® SPR. A Tabela 3 também fornece as SEQ ID NOs dos domínios VH e VL para cada variante. Cada clone da Tabela 3 foi testado no formato lgG1. Consistentemente, foram observados valores IC50 muito semelhantes para estes anticorpos no ensaio de atividade enzimática descrito acima, exceto que os clones huE104.v1 e huE104.v5 e, em menor grau, huE104.v11 e huE104.v12, apresentaram algum efeito de gancho” (no qual um aumento da atividade enzimática, isto é, uma diminuição na atividade inibitória do anticorpo, foi observado em altas concentrações de anticorpos) no ensaio enzimático. Modificações na região FR3 da cadeia pesada de V71 do anticorpo humanizado para o resíduo Arg original do anticorpo monoclonal de coelho (V71R) e F78 do anticorpo humanizado para o resíduo Vai original do anticorpo monoclonal de coelho (F78V) eliminaram o efeito gancho em E104.v1, v5, v11 e v12. O clone quimérico E104.v9 contém R71 e V78 como no monoclonal Ab E104 de coelho progenitor. Vide Tabela 3. Como mostrado na Fig. 12B, o resíduo de arginina (R) na posição 71 e o resíduo de valina (V) na posição 78 (ambos numeração de Kabat) podem desempenhar um papel importante na conformação de HVR-H2, e assim a ligação do anticorpo a triptase. Como resultado, as modificações V71R e F78V em huE104.v2 podem ter afetado a conformação do loop da triptase 80, que é importante na associação de dois protômeros que formam a pequena interface. Ver o Exemplo 3 abaixo. Assim, o hu104.v2, que possui as reversões de V71R e F78V, melhorou a atividade de ligação e inibição em comparação com v1, que possui V na posição 71 e F na posição 78. Todas as variantes, exceto v1, v5, v11 e v12, mostraram inibição completa da atividade da triptase, conforme medido pelo ensaio enzimático descrito acima. O clone humanizado huE104.v2 foi selecionado para avaliação
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 256/418
250/324 adicional. As sequências de aminoácidos dos domínios variáveis da cadeia pesada e leve de huE104.v2 s mostradas na Fig. 1.
Tabela 3: Afinidades de ligação de variantes de E104 humanizado (huE104) (afinidade de ligação ao monômero da triptase b1 humana entre parênteses)
Cadeia leve
Enxerto K1 (SEQ ID NO: 37) Enxerto K1 + A2 + L4 + P43 + E68 + F87 (SEQ ID NO: 58) Quimérico LC (SEQ ID NO: 59)
Cadeia Pesada Enxerto VH4 (SEQ ID NO: 47) v1 (0,43 nM) v5 (0,18 nM) -
Enxerto de VH4 + R71 + V78 (SEQ ID NO: 36) v2 (0,18 nM) v6 (0,14 nM) v10 (0,26 nM)
Enxerto VH4 + V37 + S67 + R71 + V78 + F91 (SEQ ID NO: 48) v3 (0,21 nM) v7 (0,25 nM) -
Enxerto VH3 + I48 + S67 + T73 + V78 (SEQ ID NO: 51) v4 (0,44 nM) v8 (0,24 nM) -
Quimérico HC (SEQ ID NO: 52) v9 (0,24 nM) — -
Enxerto VH4 +V78 (SEQ ID NO: 49) v11 (0,32 nM) — -
Enxerto de VH4 + R71 (SEQ ID NO: 50) v12 (0,12 nM) — -
[447] A Tabela 4 lista as variantes de hu31A bem como a afinidade de ligação (em termos de Kd, nanomolar) medida pela análise BIAcore® SPR. A Tabela 4 também mostra as SEQ ID NOs de VH e VL para cada anticorpo. Todas as variantes mostraram inibição completa da atividade da triptase, conforme medido pelo ensaio enzimático (dados não mostrados). Cada clone da Tabela 4 foi testado no formato lgG1. O clone hu31A.v11 apresentou a melhor afinidade e melhor atividade inibitória em um ensaio
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 257/418
251/324 enzimático e, portanto, foi selecionado para posterior avaliação. As sequências de aminoácidos dos domínios variáveis da cadeia pesada e leve de hu31 A.v11 s mostradas na Fig. 1.
Tabela 4: Afinidades de ligação de variantes de 31A humanizado (hu31A) (afinidade de ligação ao monômero da triptase b1
humana entre parênteses
Cadeia leve
Enxerto K1 (SEQ ID NO: 102) Enxerto K1 + S43 + P46 + W47 (SEQ ID NO: 10) Enxerto K1 + L4 + S43 + P46 + W47 + Y71 (SEQ ID NO: 103)
Cadeia Pesada Enxerto VH3 (SEQ ID NO: 98) v1 (4,04 nM) v2 (0,74 nM) v3 (0,79 nM)
Enxerto de VH3 + A49 (SEQ ID NO: 99) v4 (11,8 nM) v5 (1,68 nM) v6 (1,65 nM)
Enxerto VH3 + S31 + F32 + H35 + A49 (SEQ ID NO: 100) v7 (2,06 nM) v8 (0,94 nM) v9 (0,94 nM)
Enxerto de VH3 + A49 + T93 + N96 + Y97 + D98 (SEQ ID NO: 9) v10 (1,19 nM) v11 (0,40 nM) v12 (0,43 nM)
Enxerto de VH3 + A49 + T93 (SEQ ID NO: 101) v13 (9,65 nM) v14 (1,34 nM) v15 (1,32 nM)
[448] A atividade inibidora de anticorpos anti-triptase humanizados foi também determinada utilizando o ensaio de atividade enzimática de triptase recombinante descrito acima. Ambos h31A.v11 e huE104.v2, lgG1 e lgG4, inibiram completamente a atividade da triptase no ensaio enzimático (ver Fig. 2A). Os valores de IC50 são mostrados abaixo (Tabela 5).
Tabela 5: Atividade inibidora (IC50) de anticorpos anti-triptase humanizados
Anticorpo lgG1 lgG4
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 258/418
252/324
Anticorpo Igd lgG4
hu31A.v11 1,82 nM ± 0,09 3,9 nM ± 0,65
huE104.v2 0,91 nM ± 0,35 0,59 nM± 0,11
[449] Tanto o hu31A.v11 como o huE104.v2 se ligam e inibem a triptase beta 2 e beta 3 humana, além da triptase beta 1. Os dados representativos são mostrados abaixo na Tabela 6 com base nos protocolos descritos acima para análise de afinidade e ensaio enzimático utilizando triptase beta 1 humana como alvo. Tanto o hu31A.v11 como o huE104.v2 também se ligam e inibem a cyno triptase D1.
Tabela 6: Afinidade e IC50 de anticorpos anti-triptase humanizados
Anticorpo Triptase Humano Kd (nM) IC50 (nM)
hu31A.v11 igG4 Triptase beta 1 0,27 3,16
Triptase beta 2 0,12 1,46
Triptase beta 3 0,10 2,47
huE104.v2 igG4 Triptase beta 1 0,3 0,42
Triptase beta 2 0,18 0,95
Triptase beta 3 0,13 2,80
[450] A atividade inibidora de hu31A.v11 lgG4 ou huE104.v2 lgG4 foi ainda avaliada em vários modelos ex vivo de função de células do músculo liso das vias aéreas primárias humanas (SMC). A adição de triptase beta 1 ao meio de cultura resulta em um aumento na proliferação de SMCs das
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 259/418
253/324 vias aéreas primárias humanas (Fig. 2B), bem como na contração das células (Fig. 2C). A adição de hu31A.v11 ou huE104.v2 resultou numa redução da proliferação dependente da dose e a 300 pg/ml inibiu a proliferação aos níveis da linha de base (Fig. 2B). Similarmente, a adição de hu31A.v11 ou huE104.v2 reduziu a contração aos níveis basais (Fig. 2C). Estes dados demonstram que os anticorpos anti-triptase hu31A.v11 e huE104.v2 inibiram a função da triptase.
[451] A adição de triptase ou IgE aos mastócitos resulta em degranulação e liberação de histamina (Figs. 2D-2E). A capacidade de hu31 A.v11 de inibir a liberação de histamina foi avaliada. A triptase beta 1 com a substituição S195A é cataliticamente inativa. A adição de hu31A.v11 bloqueou a capacidade da triptase de promover a liberação de histamina (Figs. 2D-2E). A extensão da inibição (30-50%) foi semelhante ao inibidor de molécula pequena da atividade da triptase beta 1, G02849855 (Fig. 2E). Estes resultados mostram ainda que o anticorpo anti-triptase hu31A.v11 inibe a função da triptase.
Exemplo 2: hu31A.v11 e huE104.v2 IgG dissociam o tetrâmero beta da triptase humana [452] A estrutura cristalina da triptase tetramérica ativa mostra que o sítio catalítico de cada protômero (representado por S195, H57 e D102 de cada protômero, numeração de quimotripsinogênio) está localizado dentro do poro do tetrâmero, e que o acesso aos sítios ativos é limitado de forma que apenas substratos peptídicos e moléculas menores podem ter acesso (Pereira et al. Nature 392: 306-11, 1999). Até esta data, nenhum inibidor de protease de serina de mamífero é conhecido por inibir a atividade proteolítica da triptase. Os inibidores de serina protease humana da arquitetura do tipo de domínio Kunitz são muito grandes para acessar os sítios ativos. Não existem inibidores naturais conhecidos da triptase em humanos. Os únicos inibidores
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 260/418
254/324 macromoleculares naturais conhecidos da triptase até esta data são inibidores da triptase derivados de sanguessugas (LDTI) (Sommerhoff et al. Biol. Chem. 373:685-94, 1997) e inibidor de protease derivado de carrapato (TdPI) (Paesen et al. J. Mol. Biol. 368:1172-86, 2007). LDTI (4,7 kDa) e TdPI (11,1 kDa) têm a capacidade de bloquear dois ou três dos quatro sítios ativos do tetrâmero de triptase, respectivamente. LDTI e TdPI não dissociam o tetrâmero de triptase. Tanto o IgG como o Fab de hu31A.v11 são muito maiores que o LDTI ou o TdPI, e ainda assim inibem completamente a triptase.
[453] Determinamos a estequiometria da ligação do Fab hu31 A.v11 à triptase tetramérica em solução. A triptase tetramérica ativa beta 1 foi misturada com um excesso molar de 2 vezes de Fab hu31A.v11 para cada protômero e a formação do complexo foi deixada atingir o equilíbrio. Porque o tetrâmero é montado não covalentemente, o efeito de dissociação de cada anticorpo na estrutura tetramérica foi analisado por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) e os tempos/volumes de retenção e os pesos moleculares dos picos de proteína individuais foram determinados. As frações contendo proteína foram caracterizadas por SDS-PAGE para determinar os componentes proteicos (Fig. 3A). O tempo de retenção da triptase tetramérica sozinha foi significativamente menor (tr= 26 min, execução 1, pico 1) do que quando em complexo com Fab hu31A.v11 (tr= 28,1 min, execução 3, pico 3). Uma análise SEC adicional em combinação com espalhamento de luz multiângulo (MALS) foi realizada para determinar o peso molecular dos complexos de proteína eluídos. A triptase tetramérica tinha um peso molecular de 120 kDa ± 0,2% de acordo com MALS, o que é consistente com o peso molecular teórico de 109,537 kDa com base na sequência de aminoácidos (excluindo glicosilação). O pico proteico contendo triptase no complexo com Fab hu31A.v11 foi medido como sendo de 67,7 kDa ± 3% por MALS (pico 3), o que reflete um complexo compreendendo 1 monômero de triptase ligado a 1 Fab. Isto indica que o
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 261/418
255/324 tetrâmero de triptase se dissocia em monômeros por ligação a Fab hu31A.v11, o qual é ainda corroborado pela estrutura cristalina (ver Exemplo 3) e pela atividade inibidora do Fab hu31 A.v11.
[454] Quando o mesmo complexo triptase tetramérico/Fab hu31A.v11 foi analisado por SEC em tampão de ensaio enzimático que continha uma concentração elevada de heparina, por exemplo, 100 pg/ml de heparina (ensaio 2), o tempo de retenção do complexo triptase-Fab foi diminuído apenas ligeiramente de 28,1 min (execução 3, pico 3) para 27,6 min (execução 2, pico 2), provavelmente devido à ligação da heparina ao complexo proteico do monômero de triptase e Fab. A heparina da mucosa intestinal suína é uma mistura de cadeias de poli-ânion com pesos moleculares variando de 6 a 30 kDa, com a maioria das cadeias na faixa de 17 a 19 kDa. Este resultado indica que o efeito estabilizador da heparina na triptase tetramérica é também neutralizado ou rompido por Fab hu31A.v11; mesmo uma concentração elevada de 100 pg/ml de heparina não pode impedir que Fab hu31A.v11 dissocie completamente o tetrâmero. Ver FIG. 3A.
[455] A estequiometria de ligação dos Fabs huE104.v1 e huE104.v2 à triptase tetramérica em solução também foi determinada. A triptase tetramérica ativa beta foi misturada com um excesso molar de 2 vezes de Fab para cada protômero e a formação do complexo foi deixada alcançar o equilíbrio. A mistura complexa resultante foi separada por SEC com tampão de triptase SEC sem heparina e os tempos de retenção/volumes e os pesos moleculares dos picos de proteína individuais foram determinados). As frações contendo proteína foram caracterizadas por SDS-PAGE para determinar os componentes proteicos (dados não mostrados). A triptase tetrramérica WT teve um tempo de retenção de tr = 26 min (ver, por exemplo, pico 1 da Fig. 3A) e um peso molecular de 120 kDa ± 0,2% de acordo com MALS, o que é consistente com o peso molecular teórico de 109,537 kDa na sequência de aminoácidos
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 262/418
256/324 (excluindo glicosilação).
[456] Os Fabs huE104.v1 formaram um complexo homogêneo com triptase tetramérica WT com um tempo de retenção de tr= 21,6 mL e um peso molecular de 276,1 kDa, conforme determinado por SEC-MALS (dados não mostrados). Isto representaria um complexo de tetrâmero de triptase com 4 Fabs ligados a ele. A análise por SDS-PAGE das frações deste pico confirmou a presença de Fab e protômeros de triptase. Assim, os Fabs huE104.v1 formaram um complexo estável com triptase tetramérica e não afetaram a estabilidade do tetrâmero (dados não mostrados).
[457] A triptase marcada com His6 monomérica (Fig. 3B, ensaio 1) ou a triptase tetramérica WT (Fig. 3B, ensaio 2) foram misturadas com um excesso molar de 2 vezes de Fab huE104.v2 e cada mistura complexa analisada individualmente por SEC. O primeiro pico proteico de cada cromatograma teve um tempo de retenção tr= 25,8 min (Fig. 2B, execução 1, pico 2) e tr= 26 min (Fig. 2B, execução 2, pico 3), respectivamente. A análise por SDS-PAGE das frações destes dois primeiros picos mostrou que ambos, triptase e Fab E104.v2, estavam presentes neste pico. Ambos os picos de proteína foram também analisados por MALS e foi determinado um peso molecular de 68 kDa ± 3%, o que reflete um complexo compreendendo 1 monômero de triptase ligado a 1 Fab. O segundo pico de cada execução teve um tempo de retenção de tr= 31,6 min (execução 1, pico 6) e tr= 31,8 (execução 2, pico 7), respectivamente, e continha apenas Fab huE104.v2, conforme determinado por SDS- PAGE. Os cromatogramas de ambos os SEC correm praticamente sobrepostos, indicando que a ligação Fab de huE104.v2 dissocia a triptase tetramérica WT em monômeros, uma vez que os tempos de retenção eram praticamente idênticos, independentemente de se utilizar triptase tetramérica ou triptase monomérica marcada com His para formação de complexo.
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 263/418
257/324 [458] Quando a triptase tetramérica foi novamente misturada com excesso de huE104.v2 Fab na presença de 100 pg/mL de heparina e analisada por SEC em tampão TNH como tampão de execução (execução 3), foram observados 3 picos de proteína: o primeiro pico tem um tempo de retenção muito menor (tr= 21 min, Fig. 3B, execução 3, pico 1) do que triptase tetramérica de WT apenas (tr= 26 min, por exemplo, Fig. 3A, pico 1). O segundo pico tem um tempo de retenção de tr= 27,2 min (Fig. 3B, execução 3, pico 4) e o último tem um tempo de retenção de tr= 31,2 min (Fig. 3B, execução 3, pico 5), que é indicativo de Fab apenas. A análise SDS-PAGE mostrou que tanto a triptase como o Fab estavam presentes nos picos 1 e 4, em que o pico 1 contém o tetrâmero ativo ligado pelos Fab huE104.v2 e o pico 4 continha monômero de triptase ligado pelo Fab huE104.v2 (dados não mostrados). Isso nos levou a concluir que, na presença de 100 pg/mL de alta concentração de heparina, apenas uma fração da triptase tetramérica foi dissociada pelo Fab huE104.v2, como no pico 4, enquanto a maioria da triptase permaneceu ligada à hu104.v2 da triptase tetramérica a Fabs no pico 1. Em resumo, o Fab huE104.v1 não apresentou atividade inibidora detectável, enquanto o Fab huE104.v2 dissociou completamente o tetrâmero da triptase. Ao contrário do Fab hu31A.v11 ou IgG huE104.v2, no entanto, a capacidade do Fab huE104.v2 para dissociar o tetrâmero foi parcialmente neutralizada por concentração elevada de heparina. Assim, com base nestes dados, concluímos que o Fab hu31A.v11 é capaz de dissociar o tetrâmero de triptase com ou sem alta concentração de heparina, e o Fab huE104.v2 é capaz de dissociar o tetrâmero de triptase na ausência de alta concentração de heparina.
[459] Cada monômero de triptase possui um conjunto idêntico de tríade catalítica, e os quatro monômeros se reúnem para formar um tetrâmero com os quatro sítios catalíticos voltados para o poro médio no qual o substrato entra. Ver Pereira et al., supra. Pereira et al. discute o projeto de inibidores de
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 264/418
258/324 triptase de molécula pequena, bloqueando os sítios ativos. Vários inibidores de triptase de molécula pequena em desenvolvimento foram descontinuados devido a fraca seletividade ou fraca biodisponibilidade. Ver, por exemplo, Cairns, JA, 2005, Pulmonary Pharmacology & Therapeutics 18:55-66.
[460] A triptase tetramérica do tipo selvagem é covalentemente mantida unida e pode dissociar-se em monômeros sob condições fisiológicas (Schwartz et al. J. Biol. Chem. 261:7372-7370, 1986; Alter et al. Biochem. J. 248:821-827, 1987; Schwartz et al. J. Immunol. 144:2304-2311, 1990). Foi descrito que a triptase madura demonstra uma elevada atividade enzimática como um tetrâmero e inativa como um monômero sob condições fisiologicamente relevantes (Schwartz et al., J. Biol. Chem. 261:7372-7379, 1986). Os dados mostrados neste documento demonstram que tanto hu31.v11 como huE104.v2 se ligam a monômeros de triptase, dissociam o tetrâmero em monômeros, pelo menos a baixa concentração de heparina, e após dissociação, permanecem ligados aos monômeros. Também foi relatado que a triptase monomérica pode ser enzimaticamente ativa sob certas condições (Fukuoka et al. J. Immunol. 176:3165, 2006; Fajardo et al., 2003, Biochem. J. 369:603-610). As observações levantam a questão de se um anticorpo antitriptase de dissociação será inferior a um inibidor de bloqueio do sítio ativo, como um anticorpo de bloqueio de sítio ativo de estabilização de tetrâmero, porque o monômero inativo do soro pode atuar como um grande sumidouro para os anticorpos de dissociação que se ligam aos monômeros. E um anticorpo de bloqueio de sítio ativo de estabilização de tetrâmero pode ser mais vantajoso como terapêutico se os monômeros puderem ser ativos enzimaticamente sob certas condições.
[461] Primeiro investigamos a eficácia de um anticorpo de dissociação de tetrâmero em comparação com um anticorpo de neutralização de estabilização de tetrâmero em experimentos in silico usando um modelo
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 265/418
259/324 farmacocinético-farmacodinâmico (PKPD). O modelo foi desenvolvido no software Simbiology ® (Mathworks Inc, Cambridge MA) para simular a geração, dissociação e depuração tetramérica da triptase, no tecido circulante e no pulmão, bem como a PK e os efeitos de ligação dos anticorpos antitriptase. Dois tipos de anticorpos são considerados: (1) um anticorpo de dissociação que dissocia o tetrâmero rapidamente após a ligação, mas também se liga ao monômero; e (2) um anticorpo de estabilização específico do tetrâmero, que se liga apenas ao tetrâmero ativo e neutraliza a sua atividade bloqueando o acesso aos substratos destes, mas também estende a semivida do tetrâmero. Um anticorpo de dissociação do tetrâmero com um Kd de 0,2 nM foi simulado sob um regime de dose hipotética de 300 mg administrado por via subcutânea a cada quatro semanas. Assumimos um coeficiente de partição pulmonar de 10% do anticorpo. Para o cenário de linha de base, assumimos 4 ng / ml de triptase total no soro e 10 ng / ml de triptase total no compartimento de tecido, e para o cenário de alta triptase, assumimos níveis de triptase de 10 ng / ml de triptase sérica e 40 ng / ml de tecido. As constantes de taxa relativa para a dissociação tetramérica fisiológica para o monômero e a depuração de cada espécie resultam em uma razão de 8:1 de monômero para tetrâmero dentro dos conjuntos totais de triptase.
[462] Para o regime de dose simulado de 300 mg sc q4w de anticorpos de dissociação ou de estabilização, os painéis da esquerda da Fig. 4A mostram a concentração de anticorpo total e livre/não ligado no pulmão sob o cenário da linha de base, e os painéis direitos mostram o pulmão correspondente (livre) níveis de triptase em relação aos níveis pré-tratamento tanto para o monômero quanto para o tetrâmero. Os resultados sugerem que para um anticorpo de dissociação com Kd= 0,2 nM (painéis superiores), a maior parte do anticorpo pulmonar permanece livre (painel superior esquerdo) indicando disponibilidade adequada da droga apesar da ligação ao monômero
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 266/418
260/324 e ao tetrâmero; os resultados indicam ainda que o anticorpo de dissociação alcançaria uma redução sustentada de mais de 90% na triptase tetramérica (ativa) (painel superior direito). Para o anticorpo de estabilização (painéis de fundo), quase todo o anticorpo é livre (painel inferior esquerdo); no entanto, a redução no tetrâmero é mantida apenas em ou acima de 80%.
[463] Como a especificidade do tetrâmero do anticorpo de estabilização podería ser considerada vantajosa sob condições de alta triptase total, essas simulações foram repetidas sob o cenário mais elevado de triptase (Fig. 4B). Sob essas condições, um anticorpo mais dissociado é ligado pela triptase monomérica inativa, resultando em menor anticorpo livre (compare o painel superior esquerdo da Fig. 4B com o da Fig. 4A) e levando a uma neutralização do tetrâmero menor, mas ainda boa (mínimo ~80%) pelo anticorpo de dissociação (Fig. 4B, painel superior direito). Por comparação, para o anticorpo de estabilização de tetrâmero, apesar de maior anticorpo livre devido à ausência de ligação ao monômero (Fig. 4B, painel esquerdo inferior), o anticorpo alcança menos neutralização (mínimo ~70%) quando comparado com o anticorpo de dissociação sob o anticorpo nas mesmas condições, apesar de uma afinidade 10 vezes maior assumida para o anticorpo de estabilização (Kd= 0,02nM) nas simulações (Fig. 4B, painel inferior direito). A menor neutralização é devida à maior estabilidade (meia-vida) do alvo ligado que serve como um “reservatório” para o tetrâmero. Assim, nossas simulações preveem que um anticorpo de dissociação é promissor e teria um desempenho melhor do que o anticorpo de estabilização específico do tetrâmero em diferentes cenários testados.
[464] Em seguida, testamos como o anticorpo de dissociação se compara com o anticorpo de estabilização específico do tetrâmero em diferentes doses de anticorpos. A Fig. 4C mostra a neutralização do tetrâmero para ambos os tipos de anticorpos, tanto no cenário basal como nos elevados
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 267/418
261/324 cenários de triptase, como uma função do nível de dose de anticorpo (30, 100, 300 mg sc q4w). No cenário da linha basal (Fig. 4C, painéis da esquerda), o anticorpo de dissociação reduz consistentemente a atividade do tetrâmero mais do que o anticorpo de estabilização, ao longo de todas as doses consideradas. No cenário elevado de triptase (FIG. 4C, painéis da direita), o anticorpo de dissociação supera o anticorpo de estabilização relativamente à neutralização do tetrâmero, mas a dose mais baixa (30 mg), altura em que os dois anticorpos atuam de forma comparável. A neutralização geralmente menor obtida usando o anticorpo de estabilização apesar de uma afinidade 10x maior (Kd= 0,02 nM) do que o anticorpo de dissociação (Kd= 0,2nM), indica um requisito de afinidade muito maior (> 10x) para neutralização comparável de tetrâmero usando o anticorpo de estabilização comparado ao anticorpo de dissociação. Para ambos os cenários, a dose ideal para a neutralização do tetrâmero (90%) é menor para o anticorpo de dissociação do que para o anticorpo de estabilização (resultados não mostrados), apesar da 10x maior afinidade assumida para o anticorpo de estabilização. Assim, sob o modelo, o anticorpo de dissociação superaria ou, pelo menos, correspondería ao anticorpo de estabilização que tem 10x maior afinidade, ao longo do intervalo de dose e concentrações testadas de soro e pulmão da triptase. Além disso, demonstramos neste documento que hu31A.v11 e huE104.v2 IgG inibiram completamente toda a atividade da triptase. Ver a Fig. 2A e a Tabela 5.
[465] Até onde sabemos, não houve nenhum exemplo de anticorpo de dissociação triptase-tetrâmero desenvolvido para utilizações terapêuticas. Sabe-se que os loci inflamatórios dos tecidos da doença, incluindo o pulmão asmático agudo, são ácidos em comparação com os sujeitos de controle; ver, por exemplo, Hunt et al. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 161:694-699, 2000; Steen et al. J. Neuroscience 15:3982, 1995; Bellocq et al. J. Biol. Chem. 273:5086, 1998; and Lardner J. Leukocyte Biol. 69:522, 2001).
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 268/418
262/324
Dados publicados mostraram que o anticorpo monoclonal murino anti-triptase B12 neutraliza a triptase beta humana a pH neutro, mas é incapaz de neutralizar a atividade da triptase beta humana num ensaio enzimático a pH 6 ácido (ver Fukuoka et al. J. Immunol. 176:3165, 2006). Portanto, testamos os anticorpos hu31a.v11 e huE104.v2 por sua capacidade de inibir a atividade da triptase beta humana na divagem do fibrinogênio tanto em pH neutro quanto em pH ácido.
[466] Resumidamente, beta-tetrâmero de triptase humana (1,0 pg / mL) foi pré-incubado com o anticorpo testado durante 30 min em tampão TNH a pH 6,0 ou 7,5 (Tris 50 mM, NaCI 150 mM, 0,1 mg/ml de heparina) à temperatura ambiente. A mistura foi então incubada com 5 pg de substrato de fibrinogênio humano (Haematologic Technologies, Inc., Cat. N° HIC-0150R) durante 2,5 h a 37°C. O Fab hu31A.v11, o Fab huE104.v2 e o B12mlgG1 foram, cada um, testados a 200 pg/mL. Os produtos de divagem foram analisados por SDS-PAGE e coloração Coomassie Blue.
[467] Como mostrado nas Figs. 5A e 5B, cadeias alfa e beta do fibrinogênio clivado com triptase beta 1 a pH 6 e 7,5 (comparar a faixa 1, apenas o fibrinogênio, com a faixa 2, fibrinogênio mais triptase beta 1). O anticorpo hu31 A.v11 Fab inibiu a triptase beta humana tanto a pH 6 como a pH 7,5 (faixa 3), enquanto o Fab huE104.v2, sob a condição de ensaio de 0,1 mg / mL de alta concentração de heparina, não (faixa 5). A faixa 6 foi B12 mlgG1 apenas. A diminuição da cadeia alfa do fibrinogênio é indicativa da atividade proteolítica da triptase. A cadeia beta do fibrinogênio também é clivada, mas a divagem da cadeia beta tende a ser obscurecida no gel. A intensidade da cadeia alfa foi assim quantificada e mostrada nos painéis inferiores das Figs. 5A e 5B. Assim, o Fab hu31A.v11 inibiu a atividade da triptase a pH 6 e 7,5, enquanto o Fab huE104.v2, sob a condição de ensaio de concentração elevada de heparina, não foi inibidor.
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 269/418
263/324 [468] A atividade inibidora de anticorpos no formato IgG (hu31A.v11 lgG4 e huE104.v2 lgG4) foi também avaliada utilizando o peptídeo S-2288 como substrato num ensaio de inibição na presença de 1 nM triptase e 400 μΜ de S-2288 cromogênico em tampão TNH em pH 6, 7 ou 8. A concentração final de heparina neste experimento foi de cerca de 95 pg/ml. Tanto o hu31A.v11 como o huE104.v2 no formato IgG inibiram completamente a atividade da triptase a pH 6, 7 e 8 (dados não mostrados).
[469] Portanto, hu31A.v11 IgG e huE104.v2 IgG ligam-se à triptase com alta afinidade e também inibem eficientemente a atividade da triptase em condições fisiologicamente relevantes para distúrbios associados à triptase, como a asma. Curiosamente, nas nossas condições experimentais, o anticorpo monoclonal murino anti-triptase humana B12 lgG1 também mostrou inibição da triptase beta humana a pH 6 (Fig. 5A, faixa 4), ao contrário dos resultados publicados. A discrepância pode ser atribuída a qualquer atividade protease residual não triptase presente no material usado para o ensaio nos dados publicados que foi ativado por pH ácido e resistente à inibição de B12.
Exemplo 3: Análise estrutural de anticorpos anti-triptase
A. Anticorpos da família 31A (i). Cristalografia de raios-x [470] A triptase tetramérica do tipo selvagem foi misturada com 1,5 mol de excesso de Fab hu31A.v11 e 2 vezes de excesso molar de inibidor de tripsina de soja (STI) (Roche) e incubada durante 10 min à temperatura ambiente. STI foi adicionado para facilitar a cristalização. A mistura foi então submetida a SEC utilizando uma coluna S200 (GE Healthcare) em 10 mM MOPS (pH 6,8), 0,5 M NaCI. As frações contendo o complexo ternário de triptase, STI e Fab hu31 A.v11 foram reunidas e concentradas a 40 mg/mL.
[471] Os cristais de triptase/Fab hu31A.v11/STI cresceram a 19°C utilizando o modo de difusão de vapor em gotas suspensas. Tampão de
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 270/418
264/324 cristalização contendo Tris 0,1 M (pH 7,5), sulfato de lítio 0,2 M, e polietilenoglicol (PEG) 4000 a 5% foi misturado em volume igual com a solução proteica. Os cristais foram imersos em licor mãe artificial contendo 25% de etilenoglicol e vitrificados em nitrogênio líquido.
[472] A Tabela 7 mostra a coleta de dados de raios-X e informação de refinamento para a estrutura de Fab hu31A.v11/triptase/STI. Os dados de difração que se estenderam a 2,15 A foram coletados em uma rede hexagonal no ALS Beamline 5.0.2. A redução de dados e escalonamento permitiram a atribuição da classe Laue a 6/mmm (Otwinowski, Methods in Enzymol. 276, 307-326, 1997; Winn et al. Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 67, 235-242, 2011). Com base no volume unitário de células e teor de proteína proposto, esperava-se um único complexo Fab hu31 A.v11/triptase/STI na unidade cristalográfica assimétrica. A estrutura foi resolvida usando substituição molecular (McCoy et al. J. Appl. Crystallogr. 40:658-674, 2007) no grupo espacial P6222. Utilizaram-se as seguintes sondas de pesquisa, cada uma como corpos separados: um protômero de triptase previamente determinado derivado de acesso de PDB 4A6L (Liang et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22:1049-1054, 2012), STI de PDB 1AVU (Song et al. J. Mol. Biol. 275:347-363, 1998), um fragmento Fv removido das alças CDR de PDB 1FVC (Eigenbrot et al. J. Mol. Biol. 229:969-995, 1993), e a região constante de PDB 1FVD. Depois de algum refinamento contido (Murshudov et al. Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 67:355-367, 2011), os mapas de densidade de elétron permitiram a correção da sequência da proteína Fab e o ajuste de resíduos perdidos e cadeias laterais a densidade clara (Emsley et al. Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66:486-501, 2010). Água foi adicionada automaticamente (Adams et al. Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66:213-221, 2010). Mais rodadas de ajustes e refinamentos do modelo (software BUSTER; Global Phasing Ltd., 2011) levaram ao modelo
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 271/418
265/324 final. 0 modelo é contínuo para resíduos de triptase Ile16 - Lys244 (numeração de quimotripsinogênio), resíduos STI Asp1 - Asp177, resíduos da cadeia leve do Fab Asp1 - Cys214 (numeração de Kabat) (Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest. Bethesda, MD, U.S. Dept, of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, 1991). A cadeia pesada de Fab é contínua, com exceção de um intervalo de cinco resíduos de aminoácido no domínio constante. O valor para a estatística de complementaridade de forma (Sc) (Lawrence et al. J. Mol. Biol. 234:946-950, 1993) é 0,73, consistente com outros complexos Fab/antígeno de ligação forte. A maior área de contato entre as proteínas é entre a triptase e a STI, pois cada uma delas perde 1260 A2 superfície acessível ao solvente (Broger C, xsae, F. Hoffman-La Roche, Basel, Suíça, 2000) em sua interface. Em contraste, o contato Fab / triptase é de apenas 760 A2 em cada lado, distribuído uniformemente entre as cadeias leve e pesada do Fab. Contatos de embalagem de cristal de 4 A ou menos são bem distribuídos em tomo de STI, triptase e todos os quatro domínios Fab e incluem numerosas ligações de hidrogênio, bem como contatos hidrofóbicos.
Tabela 7: Coleta e Refino de Dados de Raios-X Fab hu31A.v11 / Triptase / STI
Redução de dados
Fonte de raios X ALS 5.0.2
Comprimento de onda (A) 0,97395
Faixa de resolução (A) 31,48-2,15 (2,226-2,149)
Grupo espacial P6222
Bordas da célula 128,52 128,52 245,88
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 272/418
266/324
unitária (A)
Ângulos da célula unitária (°) 90 90 120
Reflexões totais 308799
Reflexões únicas 65702 (6404)
Multiplicidade 4,7 (4,8)
Integralidade (%) 99,8(100)
Média l/sigma (1) 14,2 (2,3)
Fator B de Wilson (A2) 37,02
R-symm 0,086 (0,681)
Refinamento
Refs para livre de R 1996
trabalho de R 0,190
Livre de R 0,233
Número de átomos não H 7057
macro moléculas 6608
etilenoglicol 8
água 441
Resíduos de proteína 850
RMS (ligações) 0,010
RMS (ângulos) 1,1
Favorecido por Rama (%) 97
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 273/418
267/324
Fator B Médio (A2) 45,7
macro moléculas 45,6
etilenoglicol 59,7
solvente 47,1
(ii) Mapeamento de epítopo de anticorpos anti-triptase analisados por troca de hidrogênio-deutério (HDX) e medido por MS [473] As taxas de absorção de deutério da triptase monomérica na presença e ausência de anticorpo foram medidas para determinar as regiões estruturais que são modificadas após ligação do anticorpo. As amostras ligadas continham uma mistura 1:1 de triptase e o respectivo anticorpo, preparadas e incubadas à temperatura ambiente durante 1 h. A concentração de triptase antes da rotulagem de deutério foi de 30 μΜ em amostras ligadas e não ligadas a anticorpos. As experiências de HDX envolveram diluir amostras 15 vezes em tampão de marcação de deutério contendo acetato de histidina 20 mM a pD 7,0. Seis tempos de rotulagem, logaritmicamente amostrados entre 30 seg e 1000 min, foram tomados em triplicado, temperados diminuindo o pH para pH 2,5 e adicionando cloreto de guanidina 2 M (GdmCI) e fr/s(2-carboxietil)fosfina a 0,25 M (TCEP), e injetado num sistema online frio, como previamente descrito (Mayne et al., J.Am. Soc. Mass. Spectrom. 22:1898-1905, 2011).
[474] Resumidamente, as amostras foram primeiro passadas através de uma coluna de pepsina imobilizada (2,1 x 30 mm, Applied Biosystems) e carregadas numa coluna de armadilha (Acquity Vanguard Cs) para dessalinização. Os fragmentos peptídicos foram então separados por cromatografia de fase reversa utilizando uma coluna Acquity UPLC ™ BEH Cis (tamanho de partícula de 1,7 pm, 1,0 x 50 mm) e introduzida no espectrômetro de massa (Thermo Orbitrap Elite ™, resolução de 120k Hz a m/z 400) para análise em massa. As fases móveis cromatográficas foram preparadas como
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 274/418
268/324 descrito anteriormente para minimizar a troca de volta de deutério (Walters et al., J. Am. Chem. Soc. Mass Spectrom. 23: 2132-2139, 2012). O programa ExMS (Kan et al. J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 22:1906-1915, 2011) foi usado para identificar peptídeos deuterados e preparar cromatogramas de íons extraídos, que foram então analisados por scripts de python internos (Walters et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 110:18898-18903, 2013). Esses scripts combinam estados de carga degenerados, ajustam distribuições isotópicas com binômios e extraem o número de deutério carreado, em média, por cada peptídeo.
(iii) Massa intacta por cromatografia líquida/espectrometria de massa (LC/MS) [475] As proteínas purificadas (incluindo triptase e mutantes dos mesmos) foram acidificadas com 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA) (Thermo, Rockford, IL) e diluídas até uma concentração final de 10 μΜ. As amostras foram analisadas em um tempo de voo de quadrupolo de precisão Accurate 6520 da Agilent (Q-TOF) acoplado a uma cromatografia líquida de alta performance Agilent 1260 Infinity (HPLC) - Interface Cube (Agilent, Santa Clara, CA). As proteínas foram separadas por HPLC de fase reversa numa coluna PLRP-S de 150 mm x 75 pm a 40 nL/min com um gradiente de 10 min, 5-80% de solvente aquoso A (97% H2O, 3% acetonitrila, 0,1% ácido fórmico) ao solvente orgânico B (acetonitrila a 98%, ácido fórmico a 0,1%). Os dados foram coletados com uma estação de trabalho MassHunter® (Agilent, Santa Clara, CA) e os espectros de massa bruta foram deconvoluídos para gerar dados de massa intactos. Os picos principais foram observados a 61764,4 Da e 63152,9 Da. A adição de múltiplas massas de GlcNAc (203 Da) também foi observada.
(iv) Resultados [476] A estrutura cristalina da triptase humana mostra que cada
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 275/418
269/324 monômero do tetrâmero entra em contato com vizinhos destes em duas interfaces diferentes através de seis segmentos de alça: a interface grande (entre os protômeros A/D e B/C) ou a interface pequena (entre o protômero A/B e C/D) de acordo com a nomenclatura protomérica descrita por Pereira et al. Nature 392: 306-11, 1998, que é incorporado neste documento por referência na sua totalidade. As seis alças de superfície de cada protômero circundam o sítio ativo e envolvem contatos intermonômeros (Pereira, supra). Entre os quais, a alça de 147, a alça de 70-80 e a alça de 37 se engajam na interação da interface pequena, e a aba 173, a alça de 97 e a alça de 60 são importantes na interação de interface grande. Enquanto a interface pequena envolve apenas interações hidrofóbicas, a interface grande compreende várias interações carregadas, além de interações hidrofóbicas. A heparina estabiliza ainda as pequenas interfaces, que se acredita serem os pontos de cisalhamento do tetrâmero, ligando-se não covalentemente a resíduos carregados positivamente, abrangendo os dois protômeros adjacentes A/B e C/D. Ver Pereira supra. Naturalmente, as interfaces pequenas são os pontos de cisalhamento do tetrâmero, seguidos pela dissociação do dímero mantido pelas grandes interfaces. A semivida da triptase é de cerca de 2-3 horas em circulação no sangue humano após o desenvolvimento de anafilaxia sistêmica (ver, por exemplo, Schwartz et al. J. Clin. Invest. 83:1551-1555, 1989). A meiavida normal do tetrâmero é de cerca de 30 minutos.
[477] Nós determinamos se as pequenas ou grandes interfaces de proteína que mantêm o tetrâmero de triptase juntos são desestabilizadas quando hu31A.v11 ou huE104.v2 se ligam à triptase. Foram gerados dois mutantes de triptase que resultaram em ligação covalente de dois protômeros vizinhos no tetrâmero através de uma ligação dissulfureto intermolecular na interface grande (entre os protômeros A/D e B/C) ou na interface pequena (entre os protômeros A/B e C/D) de acordo com a nomenclatura dos
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 276/418
270/324 protômeros descrita por Pereira et al. supra. Assim, quando a dissociação da interface pequena é impedida devido à formação covalente de dímeros ligados por dissulfureto, a dissociação da interface grande é ainda permitida. Por outro lado, quando a dissociação da interface grande é impedida devido à formação covalente de dímeros ligados por dissulfureto, a dissociação da interface pequena é ainda permitida.
[478] Tyr75 na interface pequena e Ile99 na interface grande (numeração de quimotripsinogênio, Fig. 7) foram mutados individualmente para cisteína. Esses sítios foram selecionados porque eles se enfrentam nessas interfaces devido à quase dupla simetria do tetrâmero (Sommerhoff et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96:10984-91, 1999). A substituição de Tyr75 ou Ile99 por cisteína in silico usando o software PyMOL mostrou as respectivas distâncias de 2,4 A e 3,2 A entre os tiois de cada cisteína oposta, que é um pouco maior do que um comprimento típico de ligação dissulfureto de 2,05 A. No entanto, os dois mutantes de tetrâmero resultantes foram expressos e purificados e continham uma ligação dissulfureto que se formou entre as respectivas interfaces, conforme determinado por análise MS de peptídeos trípticos. Além disso, ambos os mutantes foram também enzimaticamente ativos, mas com cerca de metade da eficiência catalítica (kcat/KM) quando comparada com a triptase tetramérica do tipo selvagem (Tabela 8).
Tabela 8: Atividade enzimática da triptase do tipo selvagem e mutante
Triptase Km (μΜ) Vmáx (nM/seg) kcat (1/s) kcat/KM (1/(M*s) Eficiência Catalítica (Mutante/WT)
WT 554 400 100 180505.42 1
Y75C 320 133 33.25 103906.25 0.57
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 277/418
271/324
Interface pequena bloqueada
I99C Interface grande bloqueada 798 235 58.75 73621.55 0.41
[479] 0 tamanho destes mutantes complexados com Fab hu31A.v11 ou Fab huE104.v1 foi analisado. Os mutantes de triptase Y75C e I99C foram, cada um, misturados com um excesso molar de 2 vezes de Fab hu31 A.v11 para formação de complexo, como descrito acima para a triptase do tipo selvagem, e analisados por cromatografia por exclusão de tamanho. Como referência para comparação, a triptase tetramérica do tipo selvagem foi complexada com um Fab do anticorpo huE104.v1, que se liga especificamente a triptase, mas não dissocia o tetrâmero e que perde a atividade inibidora a uma taxa elevada de anticorpo para tetrâmero. A triptase tetramérica do tipo selvagem complexada com o Fab huE104.v1 teve um tempo de retenção de 21,6 min (Fig. 6A, pico de referência). A análise SEC-MALS deste complexo determinou um peso molecular de 276,1 kDa, indicativo de um complexo compreendendo um tetrâmero de triptase com quatro Fab ligados.
[480] Fab hu31A.v11 formou complexos com mutantes de triptase tetramérica Y75C e I99C com tempos de retenção de 25,6 min (Fig. 6A, execução 2, pico 1) e 23,9 min (Fig. 6A, execução 3, pico 2), respectivamente (Fig. 6A). Ambos os tempos de retenção são mais longos do que o do complexo de referência, indicando que ambos os mutantes do tetrâmero se dissociam nos seus respectivos dímeros ligados covalentemente após formação do complexo com Fab hu31A.v11. Amostras de cada pico foram coletadas e analisadas por SDS-PAGE para confirmar as espécies em cada
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 278/418
272/324 pico (Fig. 6B). A análise de SDS-PAGE destes picos proteicos eluídos mostra que tanto Fab hu31A.v11 como respectivos dímeros de triptase estavam presentes na mesma fração (Fig. 6B). O pico 3 (Tr de 28,1 min) e o pico 4 (Tr de 31,6 min) da execução 4 representaram o monômero WT complexado com Fab hu31A.v11 e excesso Fab, respectivamente. Uma pequena quantidade de amostra de pico 3 foi carreada para o pico de 4 amostras em SDS PAGE. Ambos os mutantes de triptase no complexo com Fab hu31A.v11 são executados com tempos de retenção mais longos do que o pico de referência, indicando que tanto a interface grande como a pequena são desestabilizadas na ligação Fab hu31A.v11. Esta desestabilização resulta na dissociação do tetrâmero, como observado para o tetrâmero de triptase do tipo selvagem, que finalmente inativa a atividade proteolítica da triptase. O Fab B12 também desestabilizou ambos os tetrâmeros mutantes (dados não mostrados).
[481] A ligação do anticorpo anti-triptase humanizado hu31A.v11 à triptase beta 1 humana madura foi estudada usando cristalografia de raios X para determinar a estrutura do complexo molecular entre a triptase e o fragmento Fab de hu31A.v11 a uma resolução de 2,15 A. O resultado foi uma unidade assimétrica cristalográfica contendo um complexo triptase/STI (inibidor de tripsina de soja) interagindo com um Fab hu31A.v11. STI foi incluído para fins de cristalização.
[482] Uma definição de epítopo é o conjunto de aminoácidos de triptase que estão dentro de 4 A de qualquer átomo do Fab hu31A.v11. O programa PyMOL foi usado para encontrar epítopos. Os resíduos de aminoácidos nas cadeias polipeptídicas da triptase podem ser numerados de acordo com uma convenção (numeração de quimotripsinogênio) que se desvia da numeração sequencial para permitir comparações entre proteínas homólogas. Uma tabela traduzindo entre este esquema de numeração de resíduos de triptase e o esquema sequencial simples é fornecido (Fig. 7). Os
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 279/418
273/324 resíduos de triptase abaixo são nomeados de acordo com a convenção, com o esquema de numeração sequencial do gene entre parênteses.
[483] O epítopo de hu31A.v11 na triptase inclui os seguintes resíduos: H36, Q50, V60c, K60d, D60e, L61, A62, A63, R65, P84, V85, S86, R87, E109, E110, P111 (numeração de quimotripsinogênio, correspondente a H51, Q67, V80, K81, D82, L83, A84, A85, R87, P103, V104, S105, R106, E128, E129 e P130, respectivamente, da SEQ ID NO: 71). Ver Fig. 8. Os resíduos das alças de 60s, 80s e 100s da triptase estão em íntimo contato com Fab hu31A.v11, enquanto os resíduos His36 e Gln50 estão mais na periferia da interação com o Fab. Ver também Pereira et al. supra. O contato Fab-triptase exclui 760 A2 do solvente (cada lado), com contribuições iguais da cadeia leve do Fab (Val30, Thr31, Tyr32, Tyr34, Arg50, Tyr90, His92, Ser93, Tyr94) e cadeia pesada (Phe50, Ser52, Gly53, Ser54, Ser55, Thr56, Tyr58, Arg95, Tyr97, Asp98). Considera-se que os resíduos de epítopos descritos acima também se aplicam a outros anticorpos derivados de 31 A.
[484] Quando o dímero Fab/triptase do complexo ternário foi sobreposto aos protômeros triptase A e D do tetrâmero do tipo selvagem (Pereira et al. Supra), descobrimos que os dois Fabs se assentam no mesmo lado do tetrâmero, quase perpendicular ao plano do tetrâmero (Fig. 9). Repetindo esse processo para os protômeros B e C, coloque dois Fabs no lado oposto do tetrâmero. Notavelmente, estes resultados destacam os choques esféricos entre as cadeias leves de Fab, consistentes com o fato de que o Fab elui como um complexo 1:1 com triptase monomérica na SEC e não como um complexo com triptase tetramérica (Fig. 9).
[485] A triptase tetramérica não é mantida covalentemente em conjunto e pode dissociar-se em monômeros sob condições fisiológicas, conforme monitorado pelo decaimento da atividade enzimática ao longo do tempo e alterações no espectro do dicroismo circular (CD) em solução
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 280/418
274/324 (Schwartz et al. J. Biol. Chem. 261:7372-7379, 1986; Schwartz et al. J. Immunol. 144:2304-11, 1990). A ligação de hu31A.v11 (Fab ou IgG) a cada protômero do tetrâmero iria promover e acelerar a dissociação do tetrâmero e prevenir qualquer nova associação de tetrâmero devido aos choques esteréricos dos Fabs quando ligados a triptase. Assim, a triptase dissocia-se e torna-se monômero enzimaticamente inativo de uma forma mais rápida devido às alterações alostéricas em cada protômero provocadas pela ligação a hu31A.v11. Por causa da simetria pseudo dupla no tetrâmero, quase todas as interações que constituem as interfaces pequenas e grandes existem duas vezes. Isso também significa que cada mudança sutil na estrutura da triptase causada pela ligação hu31A.v11 ocorre duas vezes em cada interface, potencializando assim a desestabilização.
[486] A estrutura complexa do Fab hu31A.v11 com triptase mostra mudanças significativas na alça de 60s, que está na interface grande. Em particular, quando ligado pelo Fab hu31A.v11, o resíduo Val60c (correspondendo a Val80 da SEQ ID NO: 71) tem um desvio significativo na cadeia lateral quando comparado com a sua posição encontrada na estrutura de triptase não ligada. No tetrâmero de triptase não ligado, Tyr173d do protômero vizinho encontra-se numa bolsa hidrofóbica criada pelos resíduos Val60c e Val90 (Fig. 10, ambos são numerados por quimotripsinogênio, ver também Fig. 7). No complexo de anticorpo, a alteração conformacional de Val60c cria impedimento esférico que impede a ligação de Tyr173d a essa bolsa. Como a ligação do hu31A.v11 à triptase envolve interações com partes da alça de 60s e resíduos próximos, ele pode ser responsável por essa alteração conformacional no Val60c. Isso podería levar à desestabilização da interface grande e, assim, aumentar a dissociação do tetrâmero de triptase em monômeros inativos.
[487] O anel de imidazol de His36 (numeração de
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 281/418
275/324 quimotripsinogênio; correspondente a His51 de SEQ ID NO: 71) na triptase faz interações hidrofóbicas com Fab hu31A.v11, resultando em alterações do traço Ca na alça de 30s dos resíduos de triptase His36, Pro37a e Tyr37b quando em comparação com protômeros triptase na estrutura do tetrâmero não ligado. Isto afeta a conformação da cadeia lateral Tyr37b, de tal modo que uma interação hidrofóbica chave com um protômero vizinho compreendendo Pro152 e Pro152a na interface pequena pode ser enfraquecida (Fig. 11, todas são numeradas por quimotripsinogênio, ver também Fig. 7).
[488] Os estudos de formação de complexos das duas diferentes variantes da triptase bloqueada por dissulfureto Y75C e I99C com o Fab hu31A.v11 mostram que tanto a interface grande como a pequena da triptase tetramérica são desestabilizadas pelo anticorpo. Tanto os choques esféricos de Fabs ligados ao tetrâmero quanto as alterações conformacionais aos principais resíduos de interação da interface grande e da pequena são provavelmente importantes para contribuir para a dissociação do tetrâmero. Esses dois fatores não são mutuamente exclusivos. O impedimento esférico decorrente de Fabs hu31A.v11 quando ligados a cada protômero do tetrâmero demonstrado in silico indica que dois Fabs de uma única IgG poderíam tipicamente nunca se ligar simultaneamente a um tetrâmero (Fig. 9). Esta observação é consistente com a constatação de que tanto o Fab como o IgG de hu31 A.v11 são capazes de dissociar o tetrâmero, inibindo assim a atividade enzimática. Esta observação também indica que é improvável que os monômeros dissociados ligados pelo anticorpo se reagrupem para formar um tetrâmero.
[489] Em seguida, foram realizadas experiências de HDX de triptase monomérica ligada a Fab hu31A.v11 para estudar as interações de ligação em solução. O grau de HDX ao longo do tempo foi monitorizado por espectrometria de massa. Embora este método forneça informação indicativa do epítopo de ligação de hu31A.v11, também detecta alterações alostéricas na
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 282/418
276/324 estabilidade conformacional que podem ocorrer longe do epítopo de ligação ao anticorpo. As ligações amida que mostraram uma troca mais lenta na triptase quando o hu31A.v11 estava ligado estavam localizadas nas regiões dos resíduos 25-29, 40-41, 57-59, 60-61, 66-67, 83-88, 108-110, e 231-233 (numeração de quimotripsinogênio). Quando se comparam estas regiões com resíduos de triptase dentro de 4 A do Fab hu31A.v11 como observado na estrutura cristalina, foi observado um elevado grau de sobreposição entre os dois métodos que identificam resíduos de epítopo de ligação nas alças 60s, 80s e 100s (Fig. 8). Outras áreas identificadas pela HDX, como posições nas regiões de 20s, 40s, 50s e 230s da sequência primária da triptase, não estão em contato direto com o anticorpo de acordo com a estrutura cristalina, mas mostram uma redução na dinâmica conformacional na presença de hu31A.v11. Curiosamente, os resíduos 57-59 parecem ser alostericamente afetados pela ligação hu31A.v11. Esta curta hélice α contém o resíduo His57 (numeração de quimotripsinogênio) que faz parte da tríade catalítica em serina-proteases e essencial para a atividade catalítica. Embora os resíduos 40 e 41 identificados por HDX não estejam em contato direto com hu31A.v11, eles estão em uma localização estrutural intrigante como parte de uma folha beta anti-paralela exibindo Tyr37b (numeração de quimotripsina) em sua alça em hairpin, o que é um importante resíduo de contato para a interface pequena como discutido acima (Fig. 11). Alterações estruturais nessa área podem influenciar a estabilidade da interface pequena e levar potencialmente à dissociação do tetrâmero.
[490] Ligações peptídicas na alça 20s (todos os resíduos na alça não estruturada) e na região 230s (também referida como hélice 230s), que também sofrem alterações em sua dinâmica estrutural de acordo com a HDX, estão distantes do sítio de ligação a hu31A.v11. Os experimentos de HDX monitoram as mudanças na dinâmica estrutural e não distinguem entre
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 283/418
277/324 mudanças na conformação em massa versus mudanças na estabilidade energética de uma determinada conformação. No geral, encontramos um alto grau de consistência entre as informações estruturais obtidas por HDX e cristalografia de raios X e identificamos resíduos adicionais que são alostericamente afetados pela ligação hu31A.v11.
B. Análise estrutural de anticorpos anti-triptase derivados de E104 (i) Materiais e Métodos [491] Foi utilizado Fab huE104.v1 para gerar estrutura cristalina com tetrâmero de triptase porque a ligação de huE104.v1 não dissocia o tetrâmero. Os cristais de triptase/huE104.v1 foram cultivados a 19°C utilizando o modo de difusão de vapor misturando proteína em 1:1 (v/v) com uma solução de reservatório contendo Tris 0,1 M (pH 8,5), cloreto de cálcio 0,2 M, polietileno a 20% glicol (PEG) 4000 e 8% de etoxilato de pentaeritritol. Os cristais foram crioprotegidos em licor mole artificial contendo Tris 0,1 M (pH 8,5), cloreto de cálcio 0,2 M, PEG 3350 a 35% e congelado instantaneamente em nitrogênio líquido. Os dados de difração foram coletados na linha de luz SSRL 12-2 numa estrutura monoclínica que se estende até uma resolução de 3Â utilizando um detector de matriz de pixels Pilatus 6M e raios-X de comprimento de onda de 0,9795 A. Os dados foram reduzidos (Kabsch, Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 66:125-132, 2010; Vonrhein et al. Acta. Crystallogr. D67:293-302, 2011) e escalonados (Winn et al. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 67:235242, 2011) e a estrutura resolvida por substituição molecular (McCoy et al. J. Appl. Crystallogr. 40:658-674, 2007) no grupo espacial P21 revelando um tetrâmero de triptase ligado a quatro Fabs. As sondas de pesquisa de substituição molecular eram um protômero de triptase de acesso a PDB 4A6L e um fragmento Fab de anticorpo derivado de acesso a PDB 1FVD fazendo varredura de versões modificadas com uma faixa de elbow angles (ângulos de cotovelo) utilizando apenas a função de rotação. Após refinamento limitado,
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 284/418
278/324 uma região constante de Fab foi substituída em uma pesquisa de substituição molecular usando apenas a região constante de 1FVD. A numeração de resíduos de triptase foi alterada para um esquema de quimotripsinogênio e a numeração de resíduos de Fab-E104v1 para o esquema de Kabat. A inspeção e ajuste dos mapas de densidade de modelos e elétrons foram realizados usando Coot (Emsley et al. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 66:486-501, 2010) e a estrutura refinada usando REFMAC5 (Murshudov et al. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 67:355-367, 2011) e Phenix.refine (Adams et al. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 66, 213-221, 2010). As métricas de coleta e refinamento de dados aparecem na Tabela 9. Experiências HDX foram realizadas como descrito acima.
Tabela 9: Tabela de métricas de raios X para a triptase beta-huE104.Fab V1
Dados
Fonte de raios X SSRL 12-2
Comprimento de onda (A) 0,9795
Faixa de res. (A) 50-3,0(3,112- 3,005)
Grupo espacial P21
célula a, b, c (A) 89,573 168,811 114,652
célula α, β, γ (°) 90 109,97 90
Reflexões totais 214206
Reflexões únicas 62353
Multiplicidade 3,4 (3,5)
Integralidade (%) 97,8 (99,7)
Média l/o(l) 11,3(2,1)
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 285/418
279/324
Wilson B (A2) 72,2
R-symm 0,098 (0,577)
Refinamento
Reflexões para livre de R 1266
trabalho de R 0,187 (0,278)
Livre de R 0,232 (0,340)
Número de átomos não H 20794
macro moléculas 20689
ligantes 100
íons 3
água 2
Resíduos de proteína 2702
RMS(ligações) (A) 0,01
RMS(ângulos) (°) 1,2
Favorecido por Ramachandran (%) 94
Fator B Médio (A2) 71,5
macromolécula 71,6
ligantes 48,4
íons, água 71,6
(ii) Resultados [492] De modo a determinar se as interfaces pequenas ou grandes da proteína que mantinham o tetrâmero da triptase em conjunto estão desestabilizadas na ligação ao Fab huE104.v2, o mutante de triptase tetramérico Y75C ou I99C (ver acima) foi misturado com um excesso molar de 2 vezes de Fab huE104. v2 para formação complexa e analisada por SEC (Figura 6C). huE104.v2 complexos formados por Fab com mutante de triptase tetramérico Y75C e o cromatograma mostra dois picos com tempos de
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 286/418
280/324 retenção tr= 21,6 min (Fig. 6C, ensaio 1, pico 1) e tr= 31 min (pico 4) compreendendo Fab em excesso. huE104.v2 Fab formou complexos com triptase tetramérica mutante I99C e o cromatograma mostra dois picos com tempos de retenção de tr= 23,8 min (Fig. 6C, execução 2, pico 2) e tr= 31 min (execução 2, pico 5) compreendendo Fab em excesso. A análise SDS-PAGE mostrou que tanto o Fab huE104.v2 como o mutante dímero de triptase estavam presentes nos picos 1 e 2 e o Fab em excesso estava presente nos picos 4 e 5 (dados não mostrados). Para comparação, o complexo huE104.v2 Fab em complexo com tetrâmero de triptase WT teve um tempo de retenção de tr= 26 min (Fig. 6C, execução 3, pico 3), compreendendo monômero ligado por Fab huE104.v, que é menor que mutante tetrâmero de triptase I99C em complexo com huE104.v2 (tr = 23,8 min, execução 2, pico 2). O mutante de triptase Y75C (o tetrâmero mutante bloqueado por interface pequeno) em complexo com Fab huE104.v2 teve um tempo de retenção semelhante ao do complexo intacto e estável do tetrâmero de triptase WT ligado a quatro Fab de huE104.v1 (ver Fig. 6A, execução 1, ref de pico). Por outro lado, o mutante triptase I99C (o tetrâmero mutante bloqueado por interface grande) em complexo com huE104.v2 teve um tempo de retenção mais longo indicativo de um complexo menor que o primeiro pico na execução 1. Os resultados indicam que o Fab huE104.v2 só foi capaz de dissociar a interface pequena, mas não a interface grande do tetrâmero. Assim, quando se liga ao tetrâmero de triptase do tipo selvagem, a ligação do Fab huE104.v2 dissocia a interface pequena apenas. Sob as condições experimentais, a interface pequena dissociada pode ser rapidamente restaurada pela heparina presente em uma alta concentração local (por exemplo, 0,1 mg / ml), o que levaria à remontagem do tetrâmero. Esta concentração de heparina é substancialmente mais elevada do que a concentração de heparina fisiológica, que foi relatada como sendo cerca de 1,5 pg/ml de soro (ver, por exemplo, Engelberg et al., Circulation 23: 578-581, 1961
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 287/418
281/324 e Davids et al. S. Afr. Med. J. 100:307-307, 2010). A baixa concentração de heparina, o Fab huE104.v2 é capaz de dissociar completamente o tetrâmero de triptase de WT e neutralizar a atividade da triptase, embora menos potente do que o huE104.v2 no formato de IgG.
[493] Para obter mais conhecimento sobre o epítopo de ligação exato de huE104.v2 na triptase, tentamos cristalizar o complexo Fab huE104.v2 / triptase. Uma vez que não conseguimos obter quaisquer cristais adequados, foi utilizado o complexo de triptase WT tetramérico ligado a quatro Fabs E104.v1 isolado por cromatografia de exclusão por tamanho para cristalização. huE104.v1 e huE104.v2 diferem apenas em duas posições do framework vernier, enquanto os HVRs são idênticos. Assim, huE104.v1 foi um bom substituto para elucidar o epítopo de ligação de huE104.v2. A ligação do anticorpo anti-triptase humanizado huE104.v1 (ver Exemplo 1) para desenvolver a triptase beta 1 humana madura foi estudada utilizando cristalografia de raios X para determinar a estrutura do complexo molecular entre a triptase e o fragmento Fab de huE104.v1 em resolução de 3,0 angstrom (A). O resultado foi uma unidade assimétrica cristalográfica contendo um tetrâmero de triptase, estabilizado por complexação com EGR-clorometilcetona interagindo com quatro Fabs huE104.v1 de tal forma que cada Fab interage quase exclusivamente com apenas um dos protômeros da triptase (Fig. 12A). O ambiente de embalagem de cristal intermolecular não inclui grandes vazios e tem um número moderado de contatos de embalagem de cristal de menos de 4Â. Por exemplo, dois domínios Fab VL de huE104.v1 experimentam um contato não chstalográfico de 2 vezes na sua face de fitas β ABDE, envolvendo ligações de H das cadeias de cadeia Thr e Ser e outras. Outra região menor com vários contatos intermoleculares existe entre um domínio constante de cadeia pesada (próximo da ligação do peptídeo ao domínio variável da mesma cadeia) e o fundo de um domínio constante da cadeia leve adjacente. Existem
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 288/418
282/324 mais resíduos nos contatos de embalagem para os Fabs (média 12) do que para os protômeros de triptase (média 3,5), apesar dos protômeros de triptase terem mais resíduos (243 em relação a aproximadamente 215). Neste sentido, os cristais são formados, pelo menos em parte, através de contatos intermoleculares Fab-Fab.
[494] Três cópias de Fab huE104.v1 exibiram ângulos de cotovelo estreitamente similares (os ângulos entre os domínios variáveis (VH e VL) e os domínios constantes (CH e CL) de 140°, 138° e 141°. A quarta cópia do Fab huE104.v1 foi caracterizada por uma densidade de elétrons relativa fraca para sua região constante e exibiu um ângulo de cotovelo de 152°. Áreas de superfície de ligação ao antígeno de anticorpo (parátopos), calculadas como área de superfície de solvente acessível perdida (Adams et al. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 66:213-221, 2010) ao contato com um protômero triptase, com média de 682 A2 e são dominados pela cadeia pesada, 71% contra 29% para a cadeia leve. A estatística de complementaridade de forma (Lawrence et al. J. Mol. Biol. 234:946-950, 1993), Sc, com uma média de 0,76, que está na extremidade alta para anticorpos com antígenos proteicos. A resolução do nosso resultado foi baixa demais para discernir a estrutura da água, mas os valores do Sc sugerem que provavelmente há muito poucas águas na interface. O uso de restrições de simetria não cristalográfica (NCS) produziu refinamentos superiores de acordo com o valor de livre de R. Os desvios de raiz quadrada média (RMSDs) para superposição de átomos de carbono dos domínios Fab (VL, CL, VH ou CH1) foram da ordem de alguns décimos de angstrom.
[495] Os resíduos de anticorpo dentro de 4Á de sua triptase parceira eram muito semelhantes para as quatro cadeias e incluem: resíduos da cadeia leve Y29, N30, R32 (HVR-L1), R94 (HVR-L3) e resíduos da cadeia pesada G31, Y32 (HVR-H1), S52, S53, A54, T56, F58 (HVR-H2) e P96, R97,
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 289/418
283/324
G98, Y99, R100e (HVR-H3).
[496] Cada Fab huE104.v1 contata uma região análoga à de um protômero triptase parceiro. Este epítopo está aproximadamente a 90° de distância da fenda de ligação ao substrato do sítio ativo e coloca cada Fab que se projeta perpendicularmente a partir do plano do tetrâmero da triptase planar aproximadamente quadrada. Uma vez que os protômeros da triptase se associam de forma ascendente/descendente/ascendente/descendente ao redor do anel triptase, há dois Fabs projetando “para cima” do tetrâmero e dois Fabs projetando “para baixo” (Fig. 12A).
[497] A unidade assimétrica cristalográfica (asu) inclui 4 protômeros de triptase organizados em um tetrâmero aproximadamente simétrico. Os quatro protômeros triptase são cada um modificados de forma covalente no sítio ativo (do tratamento utilizando Glu-Gly-Arg-clorometilcetona) e sobrepostos com rmsd pareados com base em átomos de Ca de cerca de 0,1 A. Se cada protômero estivesse dentro de 4 A de apenas um dos quatro Fabs no asu, então seria possível definir quatro epítopos huE104.v1, um para cada protômero de triptase, e, sem simetria estrita, esses quatro epítopos podem diferir ligeiramente. Existem alguns resíduos de triptase que estão dentro de 4 A de um Fab que não fornece a maior parte das interações com ele, referido neste documento como um “não-parceiro Fab”. Como isso é verdade, também é possível definir o epítopo huE104.v1 para o tetrâmero de triptase.
[498] O programa PyMOL foi utilizado para identificar o epítopo, que neste Exemplo é o conjunto de aminoácidos triptase que estão dentro de 4 A de qualquer átomo do Fab huE104.v1. Os resíduos de aminoácidos nas cadeias polipeptídicas da triptase podem ser numerados de acordo com o esquema de numeração do quimotripsinogênio, como descrito acima (Fig. 7). Os resíduos de triptase abaixo são nomeados de acordo com o esquema de
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 290/418
284/324 numeração do quimiotripsinogênio, com a numeração sequencial do gene entre parênteses.
[499] Existem 4 epítopos definidos entre um protômero de triptase e o parceiro Fab deste. Todos os quatro contêm um conjunto quase idêntico de resíduos de aminoácidos triptase. Esses resíduos são: W38, Q50, D60e, L61, A62, R65, Q81, L82, L83, P84, V85, S86, R87, E107, L108, E109 e E110 (numeração de quimotripsinogênio, correspondendo aos resíduos W55, Q67, D82, L83, A84, R87, Q100, L101, L102, P103, V104, S105, R106, E126, L127, E128 e E129, respectivamente, utilizando o esquema de numeração sequencial do gene, com resíduos correspondentes a posições da SEQ ID NO: 71). O resíduo L61 (L83 da SEQ ID NO: 71) está ausente em dois dos quatro, mas excede apenas um pouco o critério de 4Â. O resíduo Q81 (Q100 da SEQ ID NO: 71) está ausente para um dos quatro. Se não fosse esse o caso, todos os quatro seriam idênticos pelo critério de definição.
[500] Além disso, os Fabs que não são parceiros fazem um pequeno número de contatos de 4 A no tetrâmero. São estes resíduos de triptase que distinguem um epítopo de tetrâmero de um epítopo de protômero. Os resíduos de triptase contatados são: Q20 e R187 (Q35 e R216, respectivamente, da SEQ ID NO: 71).
[501] Assim, o epítopo de huE104.v1 no tetrâmero da triptase a soma de: 4 casos de cada um dos seguintes: W38, Q50, D60e, L61, A62, R65, L82, L83, P84, V85, S86, R87, E107, L108, E109 e E110 (numeração de quimotripsinogênio, correspondente aos resíduos W55, Q67, D82, L83, A84, R87, L101, L102, P103, V104, S105, R106, E126, L127, E128 e E129, respectivamente, de SEQ ID NO: 71), mais três casos de Q81 (Q100 da SEQ ID NO: 71), mais 1 caso de Q20 (Q35 da SEQ ID NO: 71), mais três casos de R187 (R216 da SEQ ID NO: 71). Considera-se que os resíduos de epítopos descritos acima também se aplicam a outros anticorpos derivados de E104,
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 291/418
285/324 incluindo huE104.v2.
[502] Embora huE104.v1 e v2 tenham as mesmas sequências de CDR e se liguem ao mesmo epítopo, as duas variantes se comportam diferentemente em Fab, bem como em IgG: o huE104.v2 Fab dissocia o tetrâmero e, mais especificamente, na interface pequena, enquanto huE104 ,v1 Fab não; e em IgG, huE104.v2 dissocia e inativa o tetrâmero, enquanto que huE104.v1 perde a atividade inibitória na taxa elevada de anticorpo para triptase. Nós hipotetizamos que embora huE104.v1 e huE104.v2 se liguem aos mesmos resíduos de contato na triptase, existem diferenças sutis entre como eles interagem com a triptase. De modo a identificar diferenças na interação entre os Fabs de huE104.v1 e huE104.v2 com a triptase em solução, realizaram-se experiências de HDX com triptase monomérica isolada ou ligada a huE104.v1 ou huE104.v2 e ao grau de troca de hidrogênio-deutério ao longo do tempo foi monitorado por espectrometria de massa. Embora este método forneça informação indicativa dos epítopos de ligação de huE104.v1 e huE104.v2, este monitora globalmente as alterações na dinâmica estrutural que podem ocorrer longe do epítopo de ligação ao anticorpo. Essas medições não distinguem entre mudanças na conformação em massa versus mudanças na estabilidade energética de uma determinada conformação.
[503] Ligações am ida que mostraram uma troca mais lenta na triptase quando huE104.v1 ou huE104.v2 estavam ligadas às regiões dos resíduos 25-27, 60-61,66-68, 88 e 108-110 (numeração de quimotripsinogênio; Tabela 10), mas as ligações amidas que mostraram uma troca mais lenta que eram específicas apenas para huE104.v1 ou huE104.v2 também foram encontradas. Por exemplo, as ligações amida dos resíduos triptase 47-50, 5455, 85-87, 119-122, 179, 230-231 e 244-245 (numeração de quimotripsinogênio) mostraram troca mais lenta apenas quando huE104.v1 foi ligado. Por outro lado, as ligações amida dos resíduos triptase 25, 41-43, 81-81
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 292/418
286/324 e 160-162 mostraram troca mais lenta apenas quando huE104.v2 foi ligado (Tabela 10). As diferenças mais intrigantes na troca mais lenta de hidrogênio são as ligações amidas dos resíduos 81-83 (Q81, L82 e L83 na numeração de quimotripsinogênio, correspondente a Q100, L101 e L102 da SEQ ID NO: 71) na triptase, que só mostrou ser mais lenta troca quando huE104.v2 está ligado. Esta área é particularmente interessante, pois faz parte da alça em que residem dois resíduos críticos de contato (Y74 e Y75) da interface pequena. Os resíduos de triptase 81-83 também estão em contato direto com HVR-H2 de huE104.v1, como visto no complexo de estrutura cristalina com triptase tetramérica, mas de acordo com os resultados de HDX considera-se que esta área deve fazer uma interação mais forte e presumivelmente diferente com huE104.v2 do que para a interação de huE104.v1 com triptase. Mudanças conformacionais na alça de 80s da estrutura principal Ca e nas cadeias laterais podem afetar a conformação de Y74 e Y75, que são fundamentais para a interface pequena hidrofóbica entre dois protômeros triptase no complexo tetrâmero. Como a interface é simétrica, os resíduos Y74 e Y75 de ambos os protômeros que interagem são afetados quando huE104.v2 está ligado a cada protômero, o que amplificaria qualquer alteração e instabilidade dessa interface.
[504] Como mencionado acima, as diferenças entre huE104.v1 e huE104.v2 são os resíduos de framework vernier V71R e F78V. Foi anteriormente relatado que alterações de framework de resíduos na posição 71 na cadeia pesada de anticorpos afetam a conformação de HVR-H2. Os experimentos de modelagem de HVR-H2 em huE104.v1 e huE104.v2 confirmam que este é o caso (dados não mostrados). Sem estar limitado pela teoria, alterações em ambos os resíduos de vernier podem afetar a conformação de HVR-H2, de tal modo que a interação com os resíduos de triptase 81 a 83 difere e se traduz em alterações da interface pequena do
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 293/418
287/324 tetrâmero. Além disso, as ligações de triptase amida dos resíduos R69 e E70 (numeração de quimotripsinogênio), que estão em estreita proximidade estrutural, também mostram HDX mais lento somente quando huE104.v2 está ligado. Este achado faria mudanças na alça de 70s, o que constitui uma parte significativa da interface pequena, ainda mais provável.
[505] Ao comparar as regiões de HDX mais lento devido à ligação Fab com resíduos de triptase dentro de 4 A do Fab E104.v1, como observado na estrutura cristalina, foi observado um alto grau de sobreposição entre os dois métodos, identificando resíduos de epítopo de ligação na alça 20s, 40s, 60s, 80s e 100 (Tabela 10). Outras áreas identificadas pela HDX, como posições em 11 Os, 160s, 179, 230s e a região 245 da sequência primária de triptase, não estão em contato direto com o anticorpo de acordo com a estrutura cristalina, mas mostram uma redução na dinâmica conformacional na presença de huE104.v1 e huE104.v2.
Tabela 10: Ligações amida de resíduos de triptase que mostraram HDX mais lento quando ligado a huE104.v1 ou huE104.v2
Resíduos de triptase afetados (numeração de quimotripsinogênio)
huE104.v1 huE104.v2 Resíduos de contato na estrutura cristalina
26-27 25-27 25-29
- - 38
- 41-43 40-41
47-50 - 50
54-55 - -
- - -
60-61 60-61 60-62
66-68 66-70 65
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 294/418
288/324
- 81-83 81-87
85-88 88 -
108-110 108-110 107-110
119-122 - -
- 160-162 -
179 - -
230-231 - -
- - -
244-245 - -
[506] Para resumir estes dados, huE104.v1 e huE104.v2 possuem as mesmas sequências HVR e os mesmos resíduos de contato na triptase beta 1 humana. Com base nos estudos de HDX, contudo, foram detectadas diferenças sutis na maneira como os dois anticorpos se ligam ao alvo. A V71 e F78 na região FR3 da cadeia pesada de huE104.v1 são mostradas na Fig. 12B. Conforme indicado na figura, a V71R e F78V na região FR3 da cadeia pesada em huE104.v2 podem ter afetado a posição de HVR-H2 e a ligação de HVR-H2 à triptase, evidenciada pelo HDX mais lento na região de Q81, L82 e L83 (numeração de quimotripsinogênio) quando huE104.v2 está ligado. Os resíduos de Q81, L82 e L83 mostraram HDX mais lento quando huE104.v2 está ligado à triptase em comparação com a triptase não ligada. Como resultado, a interação hidrofóbica de Y75 com o protômero vizinho é enfraquecida. huE104.v1 tem V na posição 71 e F na posição 78 (como no enxerto de VHiv). Nesse contexto, o HVR-H2 é apresentado de forma ligeiramente diferente, e o efeito da ligação de E104.v1 à triptase, embora nos mesmos resíduos de contato, difere ligeiramente na dissociação da pequena interface, em comparação com E104.v2.
[507] Em resumo, tanto o Fab hu31 A.v11 quanto o IgG dissociam
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 295/418
289/324 o tetrâmero de triptase. Tanto o Fab huE104.v2 quanto o IgG também dissociam o tetrâmero de triptase. IgG huE104.v1, mas não Fab, é capaz de dissociar o tetrâmero de triptase. No entanto, IgG huE104.v1 em taxa alta de anticorpos para tetrâmero perde a atividade inibidora. Mais de um Fab hu31A.v11 ligando ao mesmo tetrâmero causaria choque estérico, enquanto Fabs huE104.v2 ligando ao mesmo tetrâmero não. Assim, a região da dobradiça de lgG1 ou lgG4 pode desempenhar um papel na orientação dos dois Fabs da IgG huE104.v1 e cria tensão suficiente que resulta na dissociação do tetrâmero (dados não mostrados). Em taxa alta de anticorpos para tetrâmero, contudo, IgG huE104.v1 liga-se mais provavelmente ao tetrâmero como um ligante monovalente, ou seja, um Fab, e perde a atividade inibidora.
C. hu31A.v11 e huE104.v2 competem pela ligação à triptase beta 1 humana [508] O epítopo de hu31A.v11 determinado por cristalografia de raios X sobrepõe-se substancialmente ao epítopo de huE104.v1 e huE104.v2. Determinou-se a seguir se hu31A.v11 e huE104.v2 competem pela ligação à triptase beta 1 humana pela categorização de epítopos. A categorização de epítopos foi feita usando o Sistema OCTET® RED384 (ForteBio, Inc., Menlo Park, CA, EUA). Resumidamente, a proteína monomérica de triptase 3beta 1 humana foi biotinilada no resíduo Lys por reação com NHS-PEG4-biotina. O monômero biotinilado foi diluído para 5 pg/ml em tampão cinético (ForteBio, Inc., Menlo Park, CA, EUA) e imobilizado em pontas de sensores de estreptavidina (ForteBio, Inc., Menlo Park, CA, EUA). Após a etapa de imobilização, os sensores de triptase beta 1 humana imobilizados foram saturados com o primeiro anticorpo, diluídos a 10-20 pg/ml, seguido de ligação com o segundo anticorpo diluído a 2,5 pg/ml. Um sinal de ligação por segundo anticorpo implica que os dois anticorpos podem ligar o antígeno simultaneamente a epítopos não sobrepostos distintos, considerando que
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 296/418
290/324 nenhum sinal de ligação implica que compartilham um epítopo comum. O software de análise de dados Forte Bio 8.1 foi usado para gerar a matriz de categorização de epítopos.
[509] Os resultados mostrados na Tabela 11 abaixo demonstram que nenhum sinal de ligação adicional foi detectado usando huE104.v2 como o primeiro anticorpo e hu31A.v11 como o segundo anticorpo ou vice-versa. Qualquer anticorpo adicionado após o tampão resultou em ligação adicional. Assim, os dois anticorpos competem pela ligação à triptase beta 1 humana.
Tabela 11: hu31A.v11 e huE104.v2 competem pela ligação à triptase beta 1 humana
10 Anticorpo 2° Anticorpo
hu31A.v11 lgG4 huE104.v2 lgG4
huE104.v2 lgG4 -0,0086 -0,0083
Hu31A.v11 lgG4 -0,0205 0,011
Tampão 0,423 0,514
Exemplo 4: Análise farmacocinética (PK) de anticorpos antitriptase humanizados [510] Para avaliar as características farmacodinâmicas (PK) dos anticorpos anti-triptase humanizados, os anticorpos huE104.v2 ou hu31A.v11 lgG4 foram administrados por injeção intravenosa (IV) a 1 ou 10 mg/kg a camundongos C57BL/6, n = 3. A concentração de anti-gD lgG4, anti-triptase hu31A.v11 lgG4 ou anti-triptase huE104.v2 lgG4 em soro de camundongo C57BL6 foi determinada com um ELISA farmacocinético de imunoglobulina genérico usando IgG anti-humano de ovino (The Binding Site San Diego, CA) para captura e IgG anti-humano de ovino conjugada com HRP (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX), para detecção. A sensibilidade do ensaio foi 15,6 ng/mL no soro. Os anticorpos huE104.v2 e hu31A.v11 lgG4 exibiram PK
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 297/418
291/324 semelhante, caracterizado por PK linear e proporcional à dose, ao longo da faixa de dose testada (Fig. 13 e Tabela 12). Ademais, ambos os anticorpos tiveram uma depuração relativamente baixa (~ 5 ml/dia/kg), sugerindo que ambos os anticorpos se comportam bem após a administração de dose única e estão bem dentro da faixa aceita. Em outros experimentos, o huE104.v2 lgG1 teve um desempenho semelhante aos anticorpos huE104.v2 lgG4 e hu31A.v11 lgG4 (dados não mostrados).
Tabela 12: Análise farmacocinética de anticorpos anti-triptase humanizados em camundongos
Anti-Triptase lgG4 Dose AUClast (dia · pg/ml) Depuração (ml/dia/kg) Cmax (pg/ml)
huE104.v2 1 mg/kg 127 5,00 21,6
huE104.v2 10 mg/kg 1400 5,12 242
hu31A.v11 1 mg/kg 155 4,74 25,8
hu31A.v11 10 mg/kg 1750 4,54 251
[511] As características PK dos anticorpos anti-triptase humanizados também foram avaliadas em macacos cinomolgos machos (cyno), n=3. Um anticorpo de controle (anti-gD), huE104.v2 lgG4 ou hu31A.v11 lgG4 foi administrado por injeção intravenosa (IV) a 30 mg/kg (Fig. 14 e Tabela 13). A concentração de anti-gD lgG4, anti-triptase hu31A.v11 lgG4 ou antitriptase huE104.v2 lgG4 em soro de macaco cinomolgo foi determinada com um imunoensaio Gyrolab XP consistindo em captura de IgG de cabra antihumana conjugada com biotina (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX) e
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 298/418
292/324 detecção de Fc (R10Z8E9) de camundongo anti-humano conjugado com Alexa® Fluor 647. A sensibilidade do ensaio foi 41 ng/mL no soro. A Tabela 13 mostra a área sob a curva (AUC), a depuração (CL), a Cmax, e a semivida (T1/2). hu31 A.v11 exibiu farmacocinética semelhante ao anticorpo anti-gD de controle. Uma depuração baixa (CL) de aproximadamente 3 mL/dia/kg e T1/2 de cerca de 15 dias estavam bem dentro da faixa aceitável.
Tabela 13: Análise farmacocinética de anticorpos anti-triptase humanizados em cyno (n=3)
Grupo AUC (dia · pg/mL) CL (mL/dia/kg) Cmax (pg/ml) T1/2 (dias)
Anti-gD 11100±1220 2,73 ±0,285 972 ± 68,8 14,1 ±1,37
hu31A.v11 10700 ±3530 2,99 ±0,855 805 ± 72,3 14,9 ±5,95
huE104.v2 7910 ±2270 3,98 ± 1,00 808 ± 48,9 11,5 ±4,43
Exemplo 5: Formulação do anticorpo anti-triptase hu31A.v11 para melhorar a oxidação de HVR-H3 TrplOO (W100) [512] Ao avaliar ambos os anticorpos hu31A.v11 e huE104.v2, constatou-se inesperadamente que o resíduo VH TrplOO presente na região HVR-H3 de hu31A.v11 (Fig. 1) é suscetível oxidação, por exemplo, após a exposição a dicloridrato de 2,2-azobis(2-amidinopropano) (AAPH) (também referido como “estresse de AAPH”) ou luz ambiente (“estresse por luz ambiente”). Essa oxidação pode ser considerada indesejável no contexto de um anticorpo terapêutico. No entanto, o resíduo TrplOO foi considerado importante para a ligação de hu31 A.v11 à triptase, assim como para a atividade inibidora. Por exemplo, conforme descrito abaixo, a mutação de TrplOO para mitigar a oxidação resultou em variantes com afinidade de ligação reduzida e atividade inibidora. Portanto, a oxidação de hu31A.v11, particularmente em
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 299/418
293/324
HVR-H3 W100, foi mitigada usando formulações contendo um excipiente antioxidante, por exemplo, N-acetiltriptofano e/ou metionina.
[513] O efeito do estresse de AAPH e oxidação de hu31A.v11 HVR-H3 W100 (ou seja, o resíduo de triptofano na posição 100 do domínio VH, ver Fig. 1) na ligação da triptase e na atividade inibidora foi avaliado. As amostras foram formuladas em AAPH 1 mM durante 16 h a 40°C. Sob essas condições, houve um aumento de 75% na oxidação de W100 (percentagem de oxidação). O anticorpo estressado foi digerido com tripsina e os peptídeos digeridos foram submetidos a UHPLC-HRMS (cromatografia líquida de ultra alto desempenho-espectrometria de massa de alta resolução) para determinar a percentagem de oxidação do triptofano. Resumidamente, uma amostra de 250 pg de hu31A.v11 foi reduzida com DTT 20 mM em cloridrato de guanidina 6 M, Tris 360 mM e EDTA 2 mM a pH 8,6 durante 1 h. A amostra reduzida foi arrefecida até à temperatura ambiente e alquilada usando ácido iodoacético 1 M (concentração final, 50 mM) durante 15 min no escuro. A amostra foi então trocada em tampão para tampão de digestão (Tris 25 mM, CaCh 2 mM, pH 8,2). A amostra trocada em tampão foi digerida com tripsina durante 4 horas a 37°C usando uma razão de 1:40 (p/p) de enzima para anticorpo. A digestão foi interrompida pela adição de ácido fórmico a 100% até uma concentração final de 3,0%.
[514] 10 pg dos peptídeos trípticos foram injetados em uma coluna Waters 2,1 x 150 mm da Acquity UPLC® CSH C18 com partículas de 1,7 pm, 130 A, operando a uma taxa de fluxo de 0,2 mL/min a 77°C acoplada a um sistema espectrômetro de massa Q Exactive com o seguinte gradiente: 1% de B (0,1% de ácido fórmico em acetonitrila) a 0-2 min; 13% de B a 7 min; 35% de B a 42 min; 85% de B a 44-46 min; 1% de B a 46,1 min. O Q Exactive foi operado no modo dependente de dados, coletando uma varredura completa de MS de 200-2000 m/z a uma resolução de 35.000 e um alvo de controle
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 300/418
294/324 automático de ganho (AGC) de 1x106. Os 8 íons mais abundantes por varredura foram selecionados para MS tandem com resolução de 17.500 e alvo de AGC de 1x105. A quantificação relativa da oxidação de W100 foi gerada da seguinte forma: (1) As áreas de pico foram calculadas integrando os cromatogramas de íons extraídos dos três isótopos mais abundantes dos estados de carga com uma abundância relativa de 10% e acima para o peptídeo tríptico nativo e suas contrapartes oxidadas. (2) A área total do pico oxidado foi dividida pela soma das áreas do pico oxidado e nativo e multiplicada por 100 para obter a percentagem de oxidação.
[515] Os resultados na Tabela 14 mostram que o estresse de AAPH reduziu a ligação de hu31A.v11 ao monômero de triptase, conforme medido pela análise de BIAcore® SPR (Tabela 14). A ligação reduzida também foi observada para a ligação ao tetrâmero da triptase. Em contraste, a ligação de huE104.v2 ao monômero e tetrâmero de triptase não foi afetada pelo estresse de AAPH (Tabela 14). Adicionalmente, o estresse de AAPH reduziu a atividade de hu31A.v11 num ensaio de atividade enzimática de triptase in vitro em cerca de 5 vezes, enquanto a atividade inibidora de huE104.v2 não foi afetada (dados não mostrados). Em resumo, após o estresse de AAPH, hu31A.v11 lgG4, que teve 75% de oxidação em HVR-H3 W100, mostrou uma Kd aproximadamente 6 vezes maior (ou seja, afinidade reduzida) (com 35% Rmax) e um aumento de 5 vezes em IC50 (ou seja, diminuição na potência). Rmax indica a resposta máxima em um experimento BIAcore® SPR, e uma diminuição na Rmax reflete o fato de que menos do anticorpo estressado pela AAPH se liga à triptase. Em contraste, o estresse de AAPH teve um efeito mínimo, se algum, na ligação e potência do huE104.v2 lgG4.
Tabela 14: O estresse de AAPH reduz a ligação de hu31A.v11 à triptase
Amostra Triptase Beta 1 Kon (1/Ms) KOff (1/s) KD (M)
Controle de hu31A.v11 Monômero 5.976E5 1,328E-4 2.222E-10
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 301/418
295/324
hu31A.v11 AAPH Monômero 6.076E5 7.978E-4 1.313E-9
Controle de huE104.v2 Monômero 5.846E5 1.861E-4 3.183E-10
huE104.v2 AAPH Monômero 6.795E5 1,535E-4 2.260E-10
[516] Numa abordagem para reduzir a oxidação de HVR-H3, anticorpos variantes possuindo substituições em HVR-H3 W100 foram produzidos, e a ligação dessas variantes aos monômeros de triptase beta 1 foi avaliada (Tabela 15). O resíduo W100 de hu31A.v11 sofreu mutação para fenilalanina (F), tirosina (Y), valina (V), leucina (L) ou arginina (R). Surpreendentemente, todas as variantes mostraram ligação reduzida ao monômero de triptase beta 1. A variante hu31A.v11 W100F teve a maior afinidade para o monômero de triptase beta 1 em comparação com as outras variantes, mas exibiu uma taxa de dissociação aproximadamente 100 vezes mais rápida (Koft) em comparação com o hu31A.v11 do tipo selvagem, com uma taxa de associação similar (Kon) (Tabela 15). Além disso, essas variantes eram inferiores ao hu31A.v11 WT em termos de atividade inibidora (Tabela 15). Para algumas das variantes, a atividade inibidora foi essencialmente perdida (por exemplo, para W100R, W100L e W100V). As variantes hu31A.v11 W100F e W100Y inibiram a triptase beta 1 humana, mas apresentaram valores de IC50 que foram aproximadamente 2 a 3 vezes aumentados (ou seja, atividade reduzida) em comparação com hu31A.v11 WT. Na Tabela 15, “nd” indica não detectável ou acima de 1 μΜ.
Tabela 15: Efeito de variantes hu31A.v11 W100 na afinidade de ligação ao monômero de triptase beta 1 e IC50 em comparação com o tipo selvagem hu31A.v11 (como aumento de vezes)
hu31A.v11 (W100) hu31A.v11 W100F hu31A.v11 W100Y hu31A.v11 W100V huE104.v2 W100L huE104.v2 W100R
KD 1 80 234 821 2411 54
IC50 1 2,5 3,46 nd nd nd
[517] Conforme descrito acima, os estudos estruturais revelaram
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 302/418
296/324 que HVR-H3 W100 fez múltiplas interações com a triptase, incluindo a interação com R65 da triptase (numeração do quimotripsinogênio), que foi determinada como sendo parte dos resíduos de contato de hu31 A.v11 (ver Fig. 8). Considera-se que o Trp na posição 100 interage com a triptase em maior extensão do que o Phe no mutante W100F, resultando em maior afinidade de ligação e atividade inibidora mais potente.
[518] Em vista da afinidade reduzida e atividade inibidora de hu31A.v11 com oxidação em HVR-H3 W100, bem como a importância de W100 na inibição da triptase, conforme mostrado acima, uma estratégia alternativa para mitigar a oxidação em W100 foi buscada. A capacidade de excipientes antioxidantes para reduzir a oxidação de W100 foi determinada. Num exemplo, as amostras foram submetidas a AAPH 5 mM durante 24 h a 40°C, com ou sem exemplos de excipientes antioxidantes, ou seja, Nacetiltriptofano (NAT) 0,3 mM e metionina (Met) 5 mM em formulação contendo 0,02% de polissorbato 20, 200 mM de succinato de arginina (pH 5,5) e 150 mg/mL de anticorpo hu31A.v11. O nível de oxidação de CDR H3 W100 e a potência do anticorpo foram medidas com base no ensaio enzimático cromogênico S-2288. Os dados na Tabela 16 abaixo mostram que, nesse experimento, o estresse de AAPH resultou em 38% de oxidação em W100 de hu31A.v11 lgG4, o que levou à perda de potência em 32% em comparação à amostra de anticorpo não estressado de controle (n=2). A composição de anticorpo na formulação contendo NAT a 0,3 mM e Met a 5 mM mostrou um nível de oxidação reduzido de 38% a 26% e perda de potência reduzida de 32% a 21% (n=2). Assim, a formulação contendo excipientes antioxidantes, tais como NAT e Met, reduziu a oxidação induzida por AAPH em W100 e restaurou a potência do anticorpo. Num exemplo separado, a amostra é submetida a condições de estresse por luz ambiente (60 h a 5000 Lux/h, que é uma condição de estresse mais branda do que AAPH) na mesma formulação com
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 303/418
297/324 ou sem os excipientes antioxidantes. A condição de estresse por luz ambiente branda resultou em 6% de oxidação em W100, e a presença dos excipientes reduziu ainda mais o nível de oxidação (Tabela 16). O nível de oxidação induzido pelo processo de estresse induzido por luz ambiente não afetou a potência do anticorpo.
Tabela 16: Efeito da formulação antioxidante na oxidação de hu31A.v11
Descrição da Amostra Potência relativa média, (perda de potência) (n=2) Oxidação de HVR-H3 W100
Amostra de AAPH 5 mM, sem NAT/MET 68% (32%) 38%
Amostra de AAPH 5mM, NAT 0,3 mM/ΜΕΤ 5mM 79% (21%) 26%
Amostra estressada por luz, sem NAT/MET 100% (0%) 6%
[519] Em resumo, esses resultados mostram que hu31A.v11 HVR-H3 W100 é inesperadamente susceptível à oxidação. Os dados de mutagênese mostraram que W100 é importante para a afinidade de ligação e atividade inibidora do anticorpo hu31A.v11, e nenhuma das variantes testadas nesse resíduo tinha afinidade ou atividade inibidora comparável ao hu31A.v11 do tipo selvagem. Antioxidantes tais como NAT e Met podem ser usados para mitigar a oxidação inesperada observada em hu31A.v11 HVR-H3 W100, por exemplo, em formulações de anticorpos farmacêuticos para o tratamento de distúrbios (por exemplo, asma).
Exemplo 6: Anticorpo anti-triptase hu31A.v11 inibe a atividade da triptase in vivo
A. Materiais e Métodos (i) Ensaio ELISA de Triptase Ativa de Cyno
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 304/418
298/324 [520] A concentração de triptase ativa (tetrâmero) de macaco cinomolgo (cyno) numa amostra biológica, por exemplo, fluido de lavagem broncoalveolar (BAL), foi determinada por um ensaio ELISA. Um anticorpo monoclonal que reconhece a triptase D1 de cyno foi utilizado como o anticorpo de captura. A triptase D1 ativa de cyno recombinante foi usada como o material de origem para a preparação de padrões de ensaio. Os padrões de ensaio, controles e amostras diluídas foram incubados com 500 pg/ml de inibidor de tripsina de soja (SBTI; Sigma Cat. N° 10109886001) durante 10 min e depois marcados com a sonda baseada em atividade (ABP; G0353816) durante 1 h. Ver Pan et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 16:2882-85, 2006. SBTI foi usado para se ligar ao sítio ativo no monômero, o que reduz qualquer fundo causado pelo monômero ativo, uma espécie que pode se formar em condições específicas in vitro. O SBTI é incapaz de se ligar ao sítio ativo quando a triptase está em conformação tetramérica. Um inibidor de triptase de molécula pequena (G02849855) foi adicionado durante 20 min para interromper a marcação de ABP. Um anticorpo de dissociação do tetrâmero (por exemplo, hu31A.v11 lgG4) foi adicionado durante 10 min para dissociar tanto o tetrâmero marcado com ABP quanto o não marcado. Essa mistura foi adicionada à placa de ELISA com um anticorpo de captura durante 1 h, lavada com 1x PBST e incubada com o reagente SA-HRP (peroxidase de rábano conjugado com estreptavidina, General Electric (GE) número de catálogo RPN4401V) durante 2 h. Um sinal colorimétrico foi gerado pela aplicação de substrato de HRP, tetrametilbenzidina (TMB), e a reação foi interrompida pela adição de ácido fosfórico. As placas foram lidas em um leitor de placas SpectraMax® M5 (Molecular Devices; Sunnyvale, CA) usando 450 nm para a absorção de detecção e 650 nm para a absorção de referência. O ensaio tinha uma faixa relatável de 20-0,04 ng/mL (em poço) e a concentração mínima quantificável do ensaio (MQC) foi determinada como sendo 0,08 ng/mL em diluição 1:2 de cyno
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 305/418
299/324
BAL. Cada amostra de cyno individual foi triada com uma única diluição em duplicado. As amostras analisadas com uma diluição mínima que caiu abaixo do MQC foram relatadas como menos do que relatáveis (LTR).
(ii) Ensaio ELISA de Triptase Total de Cyno [521] A concentração de triptase total de macaco cinomolgo (cyno) numa amostra biológica, por exemplo, BAL, foi determinada por um ensaio ELISA. Um anticorpo que reconhece a triptase D1 de cyno foi utilizado como o anticorpo de captura. Um anticorpo que reconhece a triptase D1 de cyno sem competir com um anticorpo de dissociação de tetrâmero para a ligação à triptase D1 de cyno foi utilizado como o anticorpo de detecção. A triptase D1 ativa de cyno recombinante foi usada como o material de origem para a preparação de padrões de ensaio. Um anticorpo de dissociação do tetrâmero (por exemplo, hu31A.v11 lgG4) foi adicionado durante 10 min para padrões de ensaio, controles e amostras diluídas a fim de dissociar qualquer tetrâmero presente. Essa mistura foi adicionada à placa de ELISA com anticorpo de captura durante 2 h e depois lavada com 1x PBST. O anticorpo de detecção biotinilado foi adicionado durante 1 h. Em seguida, o reagente SAHRP foi adicionado durante 1 h. Um sinal colonmétnco foi gerado por TMB, e a reação foi interrompida pela adição de ácido fosfórico. As placas foram lidas em um leitor de placas SpectraMax® M5 usando 450 nm para a absorção de detecção e 650 nm para a absorção de referência. O ensaio tinha uma faixa relatável de 20-0,02 ng/mL (em poço) e a MQC do ensaio foi determinada como sendo 0,08 ng/mL em diluição 1:2 de cyno BAL. Cada amostra de cyno individual foi triada com uma única diluição em duplicado. As amostras analisadas com uma diluição mínima que caiu abaixo do MQC foram relatadas como menos do que relatáveis (LTR).
(iii) Ensaio ELISA de Triptase Ativa Humana [522] A concentração de triptase ativa humana (tetrâmero) foi
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 306/418
300/324 determinada por um ensaio ELISA. O clone de anticorpo monoclonal de camundongo B12 que reconhece a triptase humana e que é capaz de dissociar o tetrâmero de triptase, foi utilizado como anticorpo de captura (Fukuoka et al. supra). Outros anticorpos que se ligam à triptase humana também podem ser usados. A triptase beta 1 ativa humana recombinante foi purificada e usada como o material de origem para a preparação de padrões de ensaio. Os padrões de ensaio, controles e amostras diluídas foram incubados com 500 pg/ml de SBTI durante 10 min e depois marcados com o ABP (G0353816) durante 1 h. Um inibidor de triptase de molécula pequena (G02849855) foi adicionado durante 20 min para interromper a marcação de ABP. Essa mistura foi adicionada à placa de ELISA com um anticorpo de captura durante 1 h, lavada com 1x PBST e incubada com o reagente SA-HRP durante 2 h. Um sinal colorimétnco foi gerado pela aplicação de TMB, e a reação foi interrompida pela adição de ácido fosfórico. As placas foram lidas em um leitor de placas SpectraMax® M5 usando 450 nm para a absorção de detecção e 650 nm para a absorção de referência.
(iv) Ensaio ELISA de Triptase Total Humana [523] A concentração de triptase total humana foi determinada por um ensaio ELISA. Um anticorpo (clone B12) que reconhece a triptase humana e que é capaz de dissociar o tetrâmero de triptase, foi utilizado como anticorpo de captura. Um anticorpo monoclonal que reconhece a triptase humana foi utilizado como o anticorpo de detecção. A triptase beta 1 ativa humana recombinante foi purificada e usada como o material de origem para a preparação de padrões de ensaio. As amostras foram adicionadas à placa de ELISA com anticorpo de captura durante 2 h e depois lavadas com 1x PBST. O anticorpo de detecção biotinilado foi adicionado durante 1 h. Em seguida, o reagente SA-HRP foi adicionado durante 1 h. Um sinal colonmétnco foi gerado com a aplicação de TMB, e a reação foi interrompida pela adição de ácido
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 307/418
301/324 fosfórico. As placas foram lidas em um leitor de placas SpectraMax® M5 usando 450 nm para a absorção de detecção e 650 nm para a absorção de referência.
B. Resultados [524] Para avaliar se os anticorpos anti-triptase tais como hu31A.v11 atingem a triptase in vivo e inibem a atividade ativa da triptase, um ensaio foi desenvolvido para medir a quantidade de triptase ativa presente em amostras tais como o líquido de lavagem broncoalveolar (BAL) (por exemplo, de cyno) ou tomado por um método menos invasivo, como a nasossorção. Uma sonda baseada em atividade, que inclui um marcador (por exemplo, biotina), um ligante e um grupo reativo que reage com a triptase ativa foi desenvolvida. Essa sonda se liga seletivamente e covalentemente à triptase ativa. Ver Pan et al. supra. Essa ferramenta pode ser usada para medir a quantidade de triptase ativa em uma amostra (Fig. 15). O procedimento de coleta de BAL envolve a instilação de tampão na via aérea e a recuperação subsequente desse fluido (que pode ser variável) e, portanto, um fator de normalização é necessário para comparar entre os pontos no tempo e animais. Como a uréia é uma pequena molécula com difusão passiva entre os compartimentos vasculares e das vias aéreas, a proporção de uréia em BAL/ureia no soro pode ser usada para normalizar entre os pontos de tempo e entre os animais. Ver Pinheiro de Oliveira et al. 2010, Critical Care 14:R39.
[525] Para determinar se a administração de hu31A.v11 atingia a triptase in vivo, uma dose de 30 mg/kg foi administrada por injeção intravenosa a macacos cyno saudáveis e sem exposição, e a quantidade de triptase ativa em BAL foi determinada. Na linha de base, os níveis de triptase ativa eram relativamente baixos e variáveis entre os animais. Uma tendência de diminuição dos níveis de triptase ativa foi observada em BAL após a administração de hu31A.v11 em animais com triptase ativa detectável na linha
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 308/418
302/324 de base (Fig. 16).
[526] O efeito da administração de hu31A.v11 foi também avaliado num modelo de exposição com alérgeno em que macacos cyno são sensibilizados ao verme nematoide parasita Ascaris por administração repetida por uma variedade de vias (Fig. 17). A fase de sensibilização incluiu a administração de Ascaris intraperitonealmente e intramuscularmente nos dias 0, 7, 15, 71, 78 e 85; por inalação nos dias 29, 50, 120, 184 e 198-205; e intramuscularmente no dia 34 (Fig. 17). O pico da pápula foi avaliado nos dias 7, 57 e 140 após a administração intradérmica naqueles dias. Cada animal recebeu uma dose ideal de Ascaris como determinado por ORD (Dose de Resposta Ideal), que foi realizada para caracterizar os níveis de dose apropriados de Ascaris para induzir uma resposta desejada em cada animal (realizada durante a fase de sensibilização). As doses incluíram 4, 400 e 4000 pg/ml. A fase experimental incluiu uma fase de veículo, na qual o veículo foi administrado no dia 1, seguido da administração de Ascaris por inalação no dia 2, seguido da amostragem de BAL e nasossorção 30 min depois para avaliar a quantidade de triptase total e ativa (Fig. 17). Quatro semanas depois, a fase do fármaco incluiu a administração de hu31A.v11 no dia 1, seguida da administração de Ascaris no dia 2 e amostragem de BAL e nasossorção 30 min depois para avaliar a quantidade de triptase total e ativa (Fig. 17).
[527] No modelo de sensibilização de Ascaris, a administração do anticorpo anti-triptase hu31A.v11 levou a uma diminuição significativa na triptase ativa na BAL em 5 animais que tinham níveis detectáveis de triptase ativa na linha de base (Fig. 18A), indicando que esse anticorpo inibe a atividade da triptase in vivo. Adicionalmente, a administração do anticorpo antitriptase também conduziu a um aumento na quantidade total de triptase na BAL em todos os animais (Fig. 18B). Outros experimentos mostraram que o nível de triptase total no fluido de revestimento da mucosa nasal (MLF) foi aumentado
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 309/418
303/324 após a dosagem do anticorpo anti-triptase hu31A.v11, conforme avaliado pelo nível de triptase total na amostra de nasossorção (Fig. 18C). Nesse experimento, o MLF foi coletado usando uma matriz de absorção sintética (SAM; Hunt Developments (UK), Ltd, West Sussex, Inglaterra). O aumento da triptase total após a dosagem é indicativo do envolvimento do alvo. A triptase ativa era indetectável na amostra de nasossorção antes e após a dosagem. O * nas Figs. 18A e 18C indicam níveis abaixo da detecção.
[528] Em seguida, a prova in vivo da atividade também foi testada em camundongos IL2Rgnull-3/GM/SF NOD-SCID enxertados em humanos. Um modelo de camundongo humanizado para o enxerto de mastócito humano e respostas alérgicas humanas dependentes de IgE foi previamente desenvolvido. Resumidamente, os camundongos NSG-SGM3 (Jackson Laboratory, stock # 013062) foram desenvolvidos a partir do fundo NOD.Cg-Prkcfcsc/d //2rgímí WSzJ (NSG) e, tal como os seus precursores NSG, os camundongos NSG-SGM3 não possuem células T maduras, células B e células NK funcionais, e são deficientes na sinalização de citocinas de camundongos. Esses camundongos contêm três transgenes coinjetados, cada um conduzido por uma sequência promotora/potencializadora de citomegalovírus humano. Os camundongos transgênicos NSG-SGM3 triplos produzem constitutivamente 2-4 ng/ml de níveis séricos de SCF humano, GMCSF e IL-3, fornecendo sinais de proliferação e sobrevivência celular (ver, por exemplo, Bryce et al. J. Allergy Clin Immunol. 138(3):769-779, 2016). Os camundongos NSG-SGM3 BLT desenvolvem mastócitos humanos que povoam os tecidos linfoides periféricos, os tecidos mucosos e a cavidade peritoneal. Os mastócitos humanos em camundongos NSG-SGM3 BLT expressam CD117, triptase e receptor de IgE, e podem sofrer um fluxo de cálcio e degranular de um modo específico para o antígeno dependente de IgE. Após a exposição, os camundongos NSG-SGM3-BLT desenvolvem uma resposta de anafilaxia
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 310/418
304/324 sistêmica passiva mediada por IgE, específico de antígenos, dependente de mastócito humano, que pode ser analisada medindo as mudanças na temperatura corporal.
[529] O experimento foi projetado para examinar a capacidade dos anticorpos anti-triptase na inibição da anafilaxia sistêmica passiva mediada por IgE nos camundongos enxertados. Os camundongos NSG-SGM3 com ΙΟΙ 2 semanas de idade (Jackson Laboratory stock # 013062) foram divididos em três grupos: Grupo 1: os camundongos NSG-SGM3 foram tratados intraperitonealmente (i.p.) com anticorpo de isotipo (500 pg/camundongos); Grupo 2: os camundongos NSG-SGM3 foram tratados com anticorpo antitriptase humano (hu31A.v11 lgG-4, 13,3 mg/mL) i.p. (500 pg/camundongos); e Grupo 3: os camundongos NSG-SGM3 foram tratados com o inibidor de pequenas moléculas de triptase G02849855 (30 mg/kg) i.p. No dia -1, todos os camundongos foram depilados de cabelo abdominal para facilitar a medição da temperatura corporal. No dia 0, os animais foram injetados com anticorpo de isótipo de controle ou anticorpo anti-triptase. O volume de dose foi formulado em 100 pL. O anticorpo anti-triptase foi dissolvido em 200 pL de solução salina para injeção. 15 min após o tratamento, os camundongos dos Grupos 1-3 foram sensibilizados intravenosamente com anti-NP (4-Hidroxi-3-nitrofenilacetil hapteno) IgE JW8.5.13 (Sigma Cat. N° 87080706-1 VL; ver também US20070253948 e Jackman et al. J. Biol. Chem. 285(27):20850-20859, 2010), 1,6 pg em 200 pL de solução salina. No dia 1 (24 h após o tratamento), a temperatura corporal foi medida restringindo manualmente os camundongos e colocando firmemente um Braun ThermoScan® Pro 4000 contra a pele abdominal raspada logo abaixo do esterno. Imediatamente após a medição da temperatura corporal de linha de base, os camundongos foram expostos i.v. com 500 pg do antígeno NP conjugado a uma proteína carreadora BSA (NPBSA) em 200 pL de solução salina. A cada 15 minutos após a exposição, a
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 311/418
305/324 temperatura corporal será medida durante pelo menos 60 minutos.
[530] Como mostrado na Fig. 19, os camundongos tratados com o anticorpo anti-triptase hu31A.v11 mostraram uma manutenção da temperatura corporal melhorada em comparação com camundongos tratados com um anticorpo anti-gD de controle, após a exposição com IgE.
[531] Esses dados mostram que o anticorpo anti-triptase hu31A.v11 é ativo e pode ligar e inibir a atividade da triptase in vivo. Esses dados fornecem evidência adicional de que anticorpos anti-triptase tais como hu31 A.v11 podem ser usados como agentes terapêuticos para o tratamento de distúrbios associados a triptase, tais como asma.
Outras Modalidades [532] Embora a invenção supracitada tenha sido descrita em alguns detalhes a título de ilustração e exemplo para fins de esclarecimento de entendimento, as descrições e exemplos não devem ser interpretados como limitantes do escopo da invenção. As divulgações de toda a literatura científica e de patente citadas neste documento estão expressamente incorporadas em sua totalidade por referência.
IV. Listagem de Sequência [533] A Tabela 17 mostra as sequências usadas em todo o pedido.
Tabela 17: Listagem de Sequência
SEQ ID NO : Sequência
1 X1X2GMX3, em que Xi é Asp ou Ser, X2 é Tyr ou Phe, e X3 é Vai ou His
2 FISSGSSTVYYADTM KG
3 RX1X2X3DWYFDV, em que X1 é Asn ou Asp, X2 é Tyr ou Asn, e X3 é Asp ou Tyr
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 312/418
306/324
4 SASSSVTYMY
5 RTSDLAS
6 QHYHSYPLT
7 DYGMV
8 RNYDDWYFDV
9 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMVWVRQ APGKGLEWVAFISSGSSTVYYADTMKGRFTISRDNSKNTLYL QMNSLRAEDTAVYYCTRRNYDDWYFDVWGQGTLVTVSS
10 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVTYMYWYQQKPGK SPKPWIYRTSDLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFA TYYCQHYHSYPLTFGQGTKVEIK
11 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS
12 WVRQAPGKGLEWVA
13 RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTR
14 WGQGTLVTVSS
15 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC
16 WYQQKPGKSPKPWIY
17 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC
18 FGQGTKVEIK
19 EVKLVESGGGSVQPGGSRKLSCAASGFTFSDYGMVWVRQ APGKGLEWVAFISSGSSTVYYADTMKGRFTISRDNPKNTLFL QMSSLRSEDTAMYYCARRDNYDWYFDVWGTGTTVTVSS
20 QIVLTQSPAIMSASPGEKVTISCSASSSVTYMYWYQQKPGS SPKPWIYRTSDLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDA ATYYCQHYHSYPLTFGAGTKLELK
21 EVKLVESGGGSVQPGGSRKLSCAASGFTFS
22 WVRQAPGKGLEWVA
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 313/418
307/324
23 RFTISRDNPKNTLFLQMSSLRSEDTAMYYCAR
24 WGTGTTVTVSS
25 QIVLTQSPAIMSASPGEKVTISC
26 WYQQKPGSSPKPWIY
27 GVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYC
28 FGAGTKLELK
29 RDNYDWYFDV
30 GYAIT
31 GISSAATTFYSSWAKS
32 DPRGYGAALDRLDL
33 QSIKSVYNNRLG
34 ETSILTS
35 AGGFDRSGDTT
36 EVQLVESGPGLVKPSETLSLTCTVSRFSLIGYAITWIRQPPGK GLEWIGGISSAATTFYSSWAKSRVTISRDTSKNQVSLKLSSV TAADTAVYYCARDPRGYGAALDRLDLWGQGTLVTVSS
37 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSIKSVYNNRLGWYQQKP GKAPKLLIYETSILTSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDF ATYYCAGGFDRSGDTTFGQGTKVEIK
38 EVQLVESGPGLVKPSETLSLTCTVSRFSLI
39 WX1RQPPGKGLEWIG, em queXí é I1eou Vai
40 RX1TISX2DTSKNQX3SLKLSSVTAADTAVYX4CAR, em que Xi é Vai ou Ser, X2 é Arg ou Vai, X3 é Vai ou Phe, e X4 é Tyr ou Phe
41 WGQGTLVTVSS
42 WIRQPPGKGLEWIG
43 RVTISRDTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAR
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 314/418
308/324
44 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSRFSLI
45 WVRQAPGKGLEWIG
46 RSTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCAR
47 EVQLVESGPGLVKPSETLSLTCTVSRFSLIGYAITWIRQPPGK GLEWIGGISSAATTFYSSWAKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSV TAADTAVYYCARDPRGYGAALDRLDLWGQGTLVTVSS
48 EVQLVESGPGLVKPSETLSLTCTVSRFSLIGYAITWVRQPPG KGLEWIGGISSAAI I HYSSWAKSRSTISRDTSKNQVSLKLSS VTAADTAVYFCARDPRGYGAALDRLDLWGQGTLVTVSS
49 EVQLVESGPGLVKPSETLSLTCTVSRFSLIGYAITWIRQPPGK GLEWIGGISSAATTFYSSWAKSRVTISVDTSKNQVSLKLSSV TAADTAVYYCARDPRGYGAALDRLDLWGQGTLVTVSS
50 EVQLVESGPGLVKPSETLSLTCTVSRFSLIGYAITWIRQPPGK GLEWIGGISSAATTFYSSWAKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSV TAADTAVYYCARDPRGYGAALDRLDLWGQGTLVTVSS
51 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSRFSLIGYAITWVRQAP GKGLEWIGGISSAATTFYSSWAKSRSTISRDTSKNTVYLQM NSLRAEDTAVYFCARDPRGYGAALDRLDLWGQGTLVTVSS
52 QSLEESGGGLFKPTDTLTLTCTVSRFSLIGYAITWVRQSPEN GLEWIGGISSAATTFYSSWAKSRSTITRNTNENTVTLKMTSL TAADTATYFCARDPRGYGAALDRLDLWGQGTLVTVSS
53 AAVLTQTPASVSAAVGGTVSISCQSIKSVYN N RLGWYQQKP GQPPKLLIYETSILTSGVPSRFKGSGSETQFTLTISDVQCDDA ATYFCAGGFDRSGDTTFGGGTEVWK
54 QSLEESGGGLFKPTDTLTLTCTVSRFSLI
55 WVRQSPENGLEWIG
56 RSTITRNTNENTVTLKMTSLTAADTATYFCAR
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 315/418
309/324
57 WGQGTLVTVSS
58 DAQLTQSPSSLSASVGDRVTITCQSIKSVYNNRLGWYQQKP GKPPKLLIYETSILTSGVPSRFSGSGSETDFTLTISSLQPEDF ATYFCAGGFDRSGDTTFGQGTKVEIK
59 AAVLTQTPASVSAAVGGTVSISCQSIKSVYN N RLGWYQQKP GQPPKLLIYETSILTSGVPSRFKGSGSETQFTLTISDVQADDA ATYFCAGGFDRSGDTTFGGGTEVWK
60 DX1QX2TQSPSSLSASVGDRVTITC, em que Xi é 11 e ou Ala, e X2 é Met ou Leu
61 WYQQKPGKX1PKLLIY, em que X1 é Ala ou Pro
62 GVPSRFSGSGSX1TDFTLTISSLQPEDFATYX2C, em que X1 é Gly ou Glu, e X2 é Tyr ou Phe
63 FGQGTKVEIK
64 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC
65 WYQQKPGKAPKLLIY
66 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC
67 AAVLTQTP AS VS AAVG GTVSIS C
68 WYQQKPGQPPKLLIY
69 GVPSRFKGSGSETQFTLTISDVQX1DDAATYFC, em que X1 é Cys ou Ala
70 FGGGTEVWK
71 MLNLLLLALPVLASRAYAAPAPGQALQRVGIVGGQEAPRSK WPWQVSLRVHGPYWMHFCGGSLIHPQWVLTAAHCVGPDV KDLAALRVQLREQHLYYQDQLLPVSRIIVHPQFYTAQIGADIA LLELEEPVNVSSHVHTVTLPPASETFPPGMPCWVTGWGDV DNDERLPPPFPLKQVKVPIMENHICDAKYHLGAYTGDDVRIV RDDMLCAGNTRRDSCQGDSGGPLVCKVNGTWLQAGVVS
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 316/418
310/324
WGEGCAQPNRPGIYTRVTYYLDWIHHYVPKKP
72 MLNLLLLALPVLASRAYAAPAPGQALQRVGIVGGQEAPRSK WPWQVSLRVHGPYWMHFCGGSLIHPQWVLTAAHCVGPDV KDLAALRVQLREQHLYYQDQLLPVSRIIVHPQFYTAQIGADIA LLELEEPVKVSSHVHTVTLPPASETFPPGMPCWVTGWGDV DNDERLPPPFPLKQVKVPIMENHICDAKYHLGAYTGDDVRIV RDDMLCAGNTRRDSCQGDSGGPLVCKVNGTWLQAGVVS WGEGCAQPNRPGIYTRVTYYLDWIHHYVPKKP
73 MLNLLLLALPVLASRAYAAPAPGQALQRVGIVGGQEAPRSK WPWQVSLRVRDRYWMHFCGGSLIHPQWVLTAAHCVGPDV KDLAALRVQLREQHLYYQDQLLPVSRIIVHPQFYTAQIGADIA LLELEEPVNVSSHVHTVTLPPASETFPPGMPCWVTGWGDV DNDERLPPPFPLKQVKVPIMENHICDAKYHLGAYTGDDVRIV RDDMLCAGNTRRDSCQVATAPHTFPAPS
74 GATGGTGACTGTTCCAGTTGC
75 CATTGGTGAGGGTGCCCGAGTTC
76 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMVWVRQ APGKGLEWVAFISSGSSTVYYADTMKGRFTISRDNSKNTLYL QMNSLRAEDTAVYYCTRRNYDDWYFDVWGQGTLVTVSSA STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICN VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL F P P KP KDTLM1S RTP E VTC WVD VS Η E D P E VKF N WYVDG VE VHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSL TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 317/418
311/324
77 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVTYMYWYQQKPGK SPKPWIYRTSDLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFA TYYCQHYHSYPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLK SGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ D S KD STYS LS STLTLS KAD YE KH KVYAC E VTH Q G LS S P VTK SFNRGEC
78 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMVWVRQ APGKGLEWVAFISSGSSTVYYADTMKGRFTISRDNSKNTLYL QMNSLRAEDTAVYYCTRRNYDDWYFDVWGQGTLVTVSSA STKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCN VDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPP KP KDTLM1S RTP EVTC WVDVS QE D P E VQ FN WYVDGVEVH NAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS RLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
79 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVTYMYWYQQKPGK SPKPWIYRTSDLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFA TYYCQHYHSYPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLK SGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ D S KD STYS LS STLTLS KAD YE KH KVYAC E VTH Q G LS S P VTK SFNRGEC
80 EVQLVESGPGLVKPSETLSLTCTVSRFSLIGYAITWIRQPPGK GLEWIGGISSAATTFYSSWAKSRVTISRDTSKNQVSLKLSSV TAADTAVYYCARDPRGYGAALDRLDLWGQGTLVTVSSAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVN
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 318/418
312/324
HKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFP P KP KDTLMIS RTP EVTC WVDVS Η E D P EVKF N WYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
81 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSIKSVYNNRLGWYQQKP GKAPKLLIYETSILTSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDF ATYYCAGGFDRSGDTTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESV TEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC
82 EVQLVESGPGLVKPSETLSLTCTVSRFSLIGYAITWIRQPPGK GLEWIGGISSAATTFYSSWAKSRVTISRDTSKNQVSLKLSSV TAADTAVYYCARDPRGYGAALDRLDLWGQGTLVTVSSAST KGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVD HKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCWVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKG LPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRL TVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
83 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSIKSVYNNRLGWYQQKP GKAPKLLIYETSILTSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDF ATYYCAGGFDRSGDTTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESV TEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 319/418
313/324
VTKSFNRGEC
84 AYSVN
85 MIWGDGKIVYNSALKS
86 DGYYPYAMDN
87 RASKSVDSYGNSFMH
88 LASNLES
89 QQNNEDPRT
90 QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTVSGFSLSAYSVNWIRQPP GKALEWLAMIWGDGKIVYNSALKSRLTISKDTSKNQVVLTMT N M D PVDTATYYCAG DGYYPYAM D N WGQGS LVTVS S
91 DIVMTQSPDSLSVSLGERATINCRASKSVDSYGNSFMHWYQ QKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQ AEDVAVYYCQQNNEDPRTFGGGTKVEIK
92 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPG KAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDF ATYYCQQYYSYPFTFGQGTKVEIK
93 EVQLVESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSGGYYWSWIRQ PPGKGLEWIGYIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLK LSSVTAADTAVYYCARFDYWGQFTLVTVSS
94 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQA PGKGLEWVGAISSSGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYL QMNSLRAEDTAVYYCARFDYWGQGTLVTVSS
95 TLTISSLQPEDFATYYCQQYYSYPFTFGQGTKVEIK
96 TLTISDVQCDDAATYFCAGGFDRSGDTTFGGGTEVWK
97 IVGGQEAPRSKWPWQVSLRVHGPYWMHFCGGSLIHPQWV LTAAHCVGPDVKDLAALRVQLREQHLYYQDQLLPVSRIIVHP QFYTAQIGADIALLELEEPVNVSSHVHTVTLPPASETFPPGM
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 320/418
314/324
PCWVTGWGDVDNDERLPPPFPLKQVKVPIMENHICDAKYHL GAYTGDDVRIVRDDMLCAGNTRRDSCQGDSGGPLVCKVN GTWLQAGWSWGEGCAQPNRPGIYTRVTYYLDWIHHYVPK KP
98 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMVWVRQ APGKGLEVWGFISSGSSTVYYADTMKGRFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAWYCARRDNYDWYFDVWGQGTLVTVSS
99 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMVWVRQ APGKGLEVWAFISSGSSTVYYADTMKGRFTISRDNSKNTLYL QMNSLRAEDTAWYCARRDNYDWYFDVWGQGTLVTVSS
100 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQA PGKGLEVWAFISSGSSTVYYADTMKGRFTISRDNSKNTLYL QMNSLRAEDTAWYCARRDNYDWYFDVWGQGTLVTVSS
101 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMVWVRQ APGKGLEVWAFISSGSSTVYYADTMKGRFTISRDNSKNTLYL QMNSLRAEDTAWYCTRRDNYDWYFDVWGQGTLVTVSS
102 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVTYMYWYQQKPGK APKLLIYRTSDLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAT YYCQHYHSYPLTFGQGTKVEIK
103 DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVTYMYWYQQKPGK SPKPWIYRTSDLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFA TYYCQHYHSYPLTFGQGTKVEIK
104 GAAGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCA GCCAGGCGGCAGCCTGCGCCTGAGCTGCGCCGCCAGCG GCTTCACCTTCAGCGATTATGGCATGGTGTGGGTGCGCC AGGCCCCAGGCAAAGGCCTGGAATGGGTGGCCTTCATCA GCAGCGGCAGCAGCACCGTGTATTATGCCGATACCATGA
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 321/418
315/324
AAGGCCGCTTCACCATCAGCCGCGATAACAGCAAAAACA CCCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGCGCGCCGAAGATA CCGCCGTGTATTATTGCACCCGCCGCAACTACGATGATT GGTAI I ICGATGTGTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCG TCTCGAGT
105 GATATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCC AGCGTGGGCGATCGCGTGACCATCACCTGCAGCGCCAG CAGCAGCGTGACCTATATGTATTGGTATCAGCAGAAACCA GGCAAAAGCCCAAAACCATGGATCTATCGCACCAGCGAT CTGGCCAGCGGCGTGCCAAGCCGCTTCAGCGGCAGCGG CAGCGGCACCGAI I ICACCCTGACCATCAGCAGCCTGCA GCCAGAAGAI I I CGCCACCTATTATTGCCAGCACTATCAC AGCTATCCACTGACCTTCGGCCAGGGTACCAAGGTGGAG ATCAAA
106 GAAGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCA GCCAGGCGGCAGCCTGCGCCTGAGCTGCGCCGCCAGCG GCTTCACCTTCAGCGATTATGGCATGGTGTGGGTGCGCC AGGCCCCAGGCAAAGGCCTGGAATGGGTGGCCTTCATCA GCAGCGGCAGCAGCACCGTGTATTATGCCGATACCATGA AAGGCCGCTTCACCATCAGCCGCGATAACAGCAAAAACA CCCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGCGCGCCGAAGATA CCGCCGTGTATTATTGCACCCGCCGCAACTACGATGATT GGTAI I ICGATGTGTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCG TCTCGAGTGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCC TGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCG GCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCG GTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGG CGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACT
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 322/418
316/324
CTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACTGTGCCCTCTAGCAG CTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAA GCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAA ATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCA CCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCC CCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCT GAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGA CCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGA GGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTA CAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCT GCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAA GGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAAC CATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGT GTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAA CCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCC CAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGC CGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACT CCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGG ACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCT CCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGA AGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
107 GATATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCC AGCGTGGGCGATCGCGTGACCATCACCTGCAGCGCCAG CAGCAGCGTGACCTATATGTATTGGTATCAGCAGAAACCA GGCAAAAGCCCAAAACCATGGATCTATCGCACCAGCGAT CTGGCCAGCGGCGTGCCAAGCCGCTTCAGCGGCAGCGG CAGCGGCACCGAI I ICACCCTGACCATCAGCAGCCTGCA GCCAGAAGAI I I CGCCACCTATTATTGCCAGCACTATCAC
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 323/418
317/324
AGCTATCCACTGACCTTCGGCCAGGGTACCAAGGTGGAG ATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCC CGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCTTCTGT TGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAA GTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAAC TCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAG CACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGC AGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCAC CCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAA CAGGGGAGAGTGT
108 GAAGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCA GCCAGGCGGCAGCCTGCGCCTGAGCTGCGCCGCCAGCG GCTTCACCTTCAGCGATTATGGCATGGTGTGGGTGCGCC AGGCCCCAGGCAAAGGCCTGGAATGGGTGGCCTTCATCA GCAGCGGCAGCAGCACCGTGTATTATGCCGATACCATGA AAGGCCGCTTCACCATCAGCCGCGATAACAGCAAAAACA CCCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGCGCGCCGAAGATA CCGCCGTGTATTATTGCACCCGCCGCAACTACGATGATT GGTAI I ICGATGTGTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCG TCTCGAGTGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCC TGGCACCCTGCTCCCGCAGTACTTCTGAGTCCACAGCGG CCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGG TGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGC GTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTC TACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACTGTGCCCTCTAGCAGC TTGGGCACCAAGACCTACACGTGCAACGTGGATCACAAG CCCAGCAACACCAAGGTGGACAAACGCGTTGAGTCCAAA TATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGTTC
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 324/418
318/324
CTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCC AAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACG TGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGT CCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAA TGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCAC GTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGA CTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAA CAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAA GCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCT GCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAG CCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACAT CGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACA ACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCT CCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCA GGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGC ATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCT CCCTGTCTCTGGGTAAA
109 GAAGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCCCAGGCCTGGTGAA ACCAAGCGAAACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTGAGCCG CTTCAGCCTGATCGGCTATGCCATCACCTGGATCCGCCA GCCACCAGGCAAAGGCCTGGAATGGATCGGCGGCATCA GCAGCGCCGCCACCACCTTCTATAGCAGCTGGGCCAAAA GCCGCGTGACCATCAGCCGCGATACCAGCAAAAACCAGG TGAGCCTGAAACTGAGCAGCGTGACCGCCGCCGATACCG CCGTGTATTATTGCGCCCGCGATCCACGCGGCTATGGCG CCGCCCTGGATCGCCTGGATCTGTGGGGCCAGGGCACC CTGGTGACCGTCTCGAGT
110 GATATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCC
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 325/418
319/324
AGCGTGGGCGATCGCGTGACCATCACCTGCCAGAGCATC AAAAGCGTGTATAACAACCGCCTGGGCTGGTATCAGCAG AAACCAGGCAAAGCCCCAAAACTGCTGATCTATGAAACCA GCATCCTGACCAGCGGCGTGCCAAGCCGCTTCAGCGGC AGCGGCAGCGGCACCGAI I I CACCCTGACCATCAGCAGC CTGCAGCCAGAAGAI I I CGCCACCTATTATTGCGCCGGC GGCTTCGATCGCAGCGGCGATACCACCTTCGGCCAGGGT ACCAAGGTGGAGATCAAA
111 GAAGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCCCAGGCCTGGTGAA ACCAAGCGAAACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTGAGCCG CTTCAGCCTGATCGGCTATGCCATCACCTGGATCCGCCA GCCACCAGGCAAAGGCCTGGAATGGATCGGCGGCATCA GCAGCGCCGCCACCACCTTCTATAGCAGCTGGGCCAAAA GCCGCGTGACCATCAGCCGCGATACCAGCAAAAACCAGG TGAGCCTGAAACTGAGCAGCGTGACCGCCGCCGATACCG CCGTGTATTATTGCGCCCGCGATCCACGCGGCTATGGCG CCGCCCTGGATCGCCTGGATCTGTGGGGCCAGGGCACC CTGGTGACCGTCTCGAGTGCCTCCACCAAGGGCCCATCG GTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGG GGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTC CCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCT GACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTC CTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACTGTGCC CTCTAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGT GAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGT TGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCG TGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTC CTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCC
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 326/418
320/324
GGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGC CACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGAC GGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGA GGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCT CACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTA CAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCAT CGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGA ACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAAGAGAT GACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGG CTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAA TGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGT GCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCT CACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCT TCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTA CACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
112 GATATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCC AGCGTGGGCGATCGCGTGACCATCACCTGCCAGAGCATC AAAAGCGTGTATAACAACCGCCTGGGCTGGTATCAGCAG AAACCAGGCAAAGCCCCAAAACTGCTGATCTATGAAACCA GCATCCTGACCAGCGGCGTGCCAAGCCGCTTCAGCGGC AGCGGCAGCGGCACCGAI I I CACCCTGACCATCAGCAGC CTGCAGCCAGAAGAI I I CGCCACCTATTATTGCGCCGGC GGCTTCGATCGCAGCGGCGATACCACCTTCGGCCAGGGT ACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCT GTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTG GAACTGCTTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCC CAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCT CCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGA
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 327/418
321/324
CAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGAC GCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGC CTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCAC AAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
113 GAAGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCCCAGGCCTGGTGAA ACCAAGCGAAACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTGAGCCG CTTCAGCCTGATCGGCTATGCCATCACCTGGATCCGCCA GCCACCAGGCAAAGGCCTGGAATGGATCGGCGGCATCA GCAGCGCCGCCACCACCTTCTATAGCAGCTGGGCCAAAA GCCGCGTGACCATCAGCCGCGATACCAGCAAAAACCAGG TGAGCCTGAAACTGAGCAGCGTGACCGCCGCCGATACCG CCGTGTATTATTGCGCCCGCGATCCACGCGGCTATGGCG CCGCCCTGGATCGCCTGGATCTGTGGGGCCAGGGCACC CTGGTGACCGTCTCGAGTGCCTCCACCAAGGGCCCATCG GTCTTCCCCCTGGCACCCTGCTCCCGCAGTACTTCTGAG TCCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTC CCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCT GACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTC CTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACTGTGCC CTCTAGCAGCTTGGGCACCAAGACCTACACGTGCAACGT GGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAACGCGT TGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGC ACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCC CCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCC TGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAG ACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGG AGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGT TCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCC
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 328/418
322/324
TGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCA AGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAA CCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAG GTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAG AACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTAC CCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCA GCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGA CTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGT GGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATG CTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACA GAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAA
114 EVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTVSGFSLSAYSVNWIRQPPG KALEWLAMIWGDGKIVYNSALKSRLTISKDTSKNQVVLTMTN M D PVDTATYYCAG DGYYPYAM D N WGQ GS LVTVSS
115 DIVLTQSPDSLSVSLGERATINCRASKSVDSYGNSFMHWYQ QKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQ AEDVAVYYCQQNNEDPRTFGGGTKVEIK
116 IVGGQEAPRSKWPWQVSLRVHGPYWMHFCGGSLIHPQWV LTAAHCVGPDVKDLAALRVQLREQHLYYQDQLLPVSRIIVHP QFYTAQIGADIALLELEEPVKVSSHVHTVTLPPASETFPPGM PCVWTGWGDVDNDERLPPPFPLKQVKVPIMENHICDAKYHL GAYTGDDVRIVRDDMLCAGNTRRDSCQGDSGGPLVCKVN GTWLQAGWSWGEGCAQPNRPGIYTRVTYYLDWIHHYVPK KPGNSDYKDDDDK
117 IVGGQEAPRSKWPWQVSLRVRDRYWMHFCGGSLIHPQWV LTAAHCVGPDVKDLAALRVQLREQHLYYQDQLLPVSRIIVHP QFYTAQIGADIALLELEEPVNVSSHVHTVTLPPASETFPPGM
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 329/418
323/324
PCWVTGWGDVDNDERLPPPFPLKQVKVPIMENHICDAKYHL GAYTGDDVRIVRDDMLCAGNTRRDSCQGDSGGPLVCKVN GTWLQAGWSWGEGCAQPNRPGIYTRVTYYLDWIHHYVPK KPGNSDYKDDDDK
118 IVGGQEAPRSKWPWQVSLRVRDRYWMHFCGGSLIHPQWV LTAAHCLGPDVKDLAALRVQLREQHLYYQDQLLPVSRIIVHP QFYIIQTGADIALLELEEPVNISSRVHTVMLPPASETFPPGMP CWVTGWGDVDNDEPLSPPFPLKQVKVPIMENHICDAKYHL GAYTGDDVRIIRDDMLCAGNSQRDSCKGDSGGPLVCKVNG TWLQ AG WS WD EGCAQPNRPGIYTRVTYYL D Wl Η H YVP KK PGNSDYKDDDDK
119 ALPVLVSPAHAAPAPGQALQRVGIVGGKEAPRSKWPWQVS LRLHGQYWMHFCGGSLIHPQWVLTAAHCVGPDVKDLADLR VQLREQHLYYQDQLLPVSRIIVHPQFYAVQIGADIALLELEEP VNVSSHVHTVTLPPALETFPPGTPCWVTGWGDVDNDVRLP PPYPLKEVEVPIVENQLCDAEYHTGLHTGDSFRIVRDDMLCA GSEKHDSCQGDSGGPLVCKVNGTWLQAGWSWGEGCALP NRPGIYTRVTYYLDWIHRYVPEKP
120 SFSMS
121 TISGGKTFTDYVDSVKG
122 ANYGNWFFEV
123 RASESVAKYGLSLLN
124 AASNRGS
125 QQSKEVPFT
126 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQA PGKGLEWVATISGGKTFTDYVDSVKGRFTISRDDSKNTLYL QMNSLRAEDTAVYYCTRANYGNWFFEVWGQGTLVTVSS
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 330/418
324/324
127 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVAKYGLSLLNWFQQ KPGQPPRLLIFAASNRGSGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPE DFAVYYCQQSKEVPFTFGQGTKVEIK
128 AGSTHHHHHHDDDDKIVGGQEAPRSKWPWQVSLRVHGPY WMHFCGGSLIHPQWVLTAAHCVGPDVKDLAALRVQLREQH LYYQDQLLPVSRIIVHPQFYTAQIGADIALLELEEPVNVSSHV HTVTLPPASETFPPGMPCWVTGWGDVDNDERLPPPFPLKQ VKVPIMENHICDAKYHLGAYTGDDVRIVRDDMLCAGNTRRD SCQGDSGGPLVCKVNGTWLQAGWSWGEGCAQPNRPGIY TRVTYYLDWIHHYVPKKP
Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 331/418

Claims (336)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. ANTICORPO ISOLADO que se liga à beta triptase 1 humana, ou seu fragmento de ligação a antígeno, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende as seguintes seis regiões hipervariáveis (HVRs):
    (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de DYGMV (SEQ ID NO: 7);
    (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de FISSGSSTVYYADTMKG (SEQ ID NO: 2);
    (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de RNYDDWYFDV (SEQ ID NO: 8);
    (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SASSSVTYMY (SEQ ID NO: 4);
    (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de RTSDLAS (SEQ ID NO: 5); e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de QHYHSYPLT (SEQ ID NO: 6).
  2. 2. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende (a) um domínio variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9; (b) um domínio variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10; ou (c) um domínio VH como em (a) e um domínio VL como em (b).
  3. 3. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende ainda as seguintes regiões de framework (FRs) do domínio VH:
    Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 332/418
    2/50 (a) uma FR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS (SEQ ID NO: 11);
    (b) uma FR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de WVRQAPGKGLEWVA (SEQ ID NO: 12);
    (c) uma FR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTR (SEQ ID NO: 13); e (d) uma FR-H4 compreendendo a sequência de aminoácidos de WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 14).
  4. 4. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizado pelo fato de que o domínio VH compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9.
  5. 5. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, caracterizado pelo fato de que compreende ainda as seguintes FRs do domínio VL:
    (a) uma FR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 15);
    (b) uma FR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de WYQQKPGKSPKPWIY (SEQ ID NO: 16);
    (c) uma FR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 17); e (d) uma FR-L4 compreendendo a sequência de aminoácidos de FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 18).
  6. 6. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, caracterizado pelo fato de que o domínio VL compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10.
  7. 7. ANTICORPO ISOLADO que se liga à beta triptase 1 humana, ou seu fragmento de ligação a antígeno, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende (a) um domínio VH compreendendo uma sequência de
    Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 333/418
    3/50 aminoácidos tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9 e (b) um domínio VL compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10.
  8. 8. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9 e um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10.
  9. 9. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende (a) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 76 e (b) uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 77.
  10. 10. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende (a) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 78 e (b) uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 79.
  11. 11. ANTICORPO ISOLADO caracterizado pelo fato de que compreende (a) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 76 e (b) uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 77.
  12. 12. ANTICORPO ISOLADO caracterizado pelo fato de que compreende (a) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 78 e (b) uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 79.
  13. 13. ANTICORPO ISOLADO que se liga à beta triptase 1 humana,
    Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 334/418
    4/50 ou seu fragmento de ligação a antígeno, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende as seguintes seis HVRs:
    (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de GYAIT (SEQ ID NO: 30);
    (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de GISSAATTFYSSWAKS (SEQ ID NO: 31);
    (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de DPRGYGAALDRLDL (SEQ ID NO: 32);
    (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de QSIKSVYNNRLG (SEQ ID NO: 33);
    (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de ETSILTS (SEQ ID NO: 34); e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de AGGFDRSGDTT (SEQ ID NO: 35).
  14. 14. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende ainda Arg71 e Val78 no FR-H3 do domínio VH (numeração de Kabat).
  15. 15. ANTICORPO ISOLADO que se liga à beta triptase 1 humana, ou seu fragmento de ligação a antígeno, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende (a) um domínio VH compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 36, 47, 48, 49, 50, 51 e 52; (b) um domínio VL compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% de identidade com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 37, 53, 58, ou 59; ou (c) um domínio VH como em (a) e um domínio VL como em (b).
  16. 16. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das
    Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 335/418
    5/50 reivindicações 13-15, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes FRs do domínio VH:
    (a) uma FR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de EVQLVESGPGLVKPSETLSLTCTVSRFSLI (SEQ ID NO: 38);
    (b) uma FR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de WIRQPPGKGLEWIG (SEQ ID NO: 42);
    (c) uma FR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de RVTISRDTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAR (SEQ ID NO: 43); e (d) uma FR-H4 compreendendo a sequência de aminoácidos de WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 41).
  17. 17. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13-16, caracterizado pelo fato de que o domínio VH compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36.
  18. 18. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13-17, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes FRs do domínio VL:
    (a) uma FR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 64);
    (b) uma FR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 65);
    (c) uma FR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 66); e (d) uma FR-L4 compreendendo a sequência de aminoácidos de FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 63).
  19. 19. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13-18, caracterizado pelo fato de que o domínio VL compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37.
  20. 20. ANTICORPO ISOLADO que se liga à triptase humana, ou seu
    Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 336/418
    6/50 fragmento de ligação a antígeno, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende (a) um domínio VH compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 e (b) um domínio VL compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37.
  21. 21. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37.
  22. 22. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13-21, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende (a) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 80 e (b) uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 81.
  23. 23. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13-21, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende (a) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 82 e (b) e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 83.
  24. 24. ANTICORPO ISOLADO caracterizado pelo fato de que compreende (a) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 80 e (b) uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 81.
  25. 25. ANTICORPO ISOLADO caracterizado pelo fato de que compreende (a) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 82 e (b) uma cadeia leve compreendendo a
    Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 337/418
    7/50 sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 83.
  26. 26. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-12, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga a um epítopo na beta triptase 1 humana compreendendo pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, ou todos os quatro resíduos selecionados do grupo consistindo em His51, Val80, Lys81 e Asp82 da SEQ ID NO: 71.
  27. 27. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga a um epítopo na beta triptase 1 humana compreendendo His51 e pelo menos um, pelo menos dois ou todos os três resíduos selecionados do grupo consistindo em Vai 80, Lys81 e Asp82 da SEQ ID NO: 71.
  28. 28. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 26 ou 27, caracterizado pelo fato de que o epítopo na beta triptase 1 humana compreende ainda um ou mais resíduos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em Gln67, Leu83, Ala84, Ala85, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu128, Glu129 e Pro130 da SEQ ID NO: 71.
  29. 29. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o epítopo na beta triptase 1 humana compreende pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez, pelo menos onze, ou todos os doze resíduos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em Gln67, Leu83, Ala84, Ala85, Arg87, Prol 03, Val104, Ser105, Arg106, Glu128, Glu129 e Prol 30 da SEQ ID NO: 71.
  30. 30. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 28 ou 29, caracterizado pelo fato de que o epítopo na beta triptase 1 humana compreende His51, Gln67, Val80, Lys81, Asp82, Leu83, Ala84, Ala85, Arg87, Prol 03, Val104, Ser105, Arg106, Glu128, Glu129 e Prol 30 da SEQ ID NO:71.
  31. 31. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das
    Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 338/418
    8/50 reivindicações 26-30, caracterizado pelo fato de que o epítopo é relativo a um monômero ou tetrâmero da beta triptase 1 humana.
  32. 32. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26-31, caracterizado pelo fato de que o epítopo é determinado por um modelo de cristalografia de raios X.
  33. 33. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-12 ou 26-32, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é capaz de dissociar a interface pequena da beta triptase 1 humana tetramérica e a interface grande da beta triptase 1 humana tetramérica.
  34. 34. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13-25, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga a um epítopo na beta triptase 1 humana compreendendo pelo menos um, pelo menos dois, ou todos os três resíduos selecionados do grupo consistindo em GlnWO, Leu101 e Leu102 da SEQ ID NO: 71.
  35. 35. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o epítopo na beta triptase 1 humana compreende ainda um ou mais resíduos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em Trp55, Gln67, Asp82, Leu83, Ala84, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu126, Leu127, Glu128 e Glu129 da SEQ ID NO: 71.
  36. 36. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o epítopo na beta triptase 1 humana compreende pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez, pelo menos onze, pelo menos doze, pelo menos treze, ou todos os catorze resíduos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em Trp55, Gln67, Asp82, Leu83, Ala84, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu126, Leu127, Glu128 e Glu129 da SEQ ID NO: 71.
  37. 37. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 35 ou 36,
    Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 339/418
    9/50 caracterizado pelo fato de que o epítopo compreende Gln35, Trp55, Gln67, Asp82, Leu83, Ala84, Arg87, Gln100, Leu101, Leu102, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu126, Leu127, Glu128, Glu129 e Arg216 da SEQ ID NO:71.
  38. 38. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34-37, caracterizado pelo fato de que o epítopo é relativo a um monômero ou tetrâmero da beta triptase 1 humana.
  39. 39. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34-38, caracterizado pelo fato de que o epítopo é relativo a um tetrâmero da beta triptase 1 humana, e o epítopo na beta triptase 1 humana compreende ainda um ou ambos os Gln35 e Arg216 da SEQ ID NO: 71.
  40. 40. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34-39, caracterizado pelo fato de que o epítopo é determinado por um modelo de cristalografia de raios X.
  41. 41. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13-25 ou 34-40, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é capaz de dissociar a interface pequena e/ou a interface grande da beta triptase 1 humana.
  42. 42. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-41, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga ainda à triptase de macaco cynomolgus (cyno).
  43. 43. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-42, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga ainda à alfa triptase humana.
  44. 44. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga ainda à beta triptase 2 humana ou à beta triptase 3 humana.
  45. 45. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga à beta triptase 2 humana e à
    Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 340/418
    10/50 beta triptase 3 humana.
  46. 46. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-45, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga à triptase com um Kd de cerca de 1 nM ou menos.
  47. 47. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que o Kd é medido por um ensaio de ressonância plasmônica de superfície.
  48. 48. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga à triptase com um Kd de entre cerca de 120 pM e cerca de 0,5 nM.
  49. 49. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga à triptase com um Kd de entre cerca de 120 pM e cerca de 300 pM.
  50. 50. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga à triptase com um Kd de entre cerca de 120 pM e cerca de 200 pM.
  51. 51. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga à triptase com um Kd de cerca de 180 pM.
  52. 52. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga à triptase com um Kd de cerca de 400 pM.
  53. 53. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-52, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é capaz de inibir a atividade enzimática da beta triptase 1 humana.
  54. 54. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que o anticorpo inibe a atividade da triptase com uma IC50 de cerca de 2,5 nM ou menor conforme determinado por um ensaio
    Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 341/418
    11/50 enzimático com a beta triptase humana usando um peptídeo sintético S-2288 como substrato.
  55. 55. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que o anticorpo inibe a atividade da triptase com uma IC50 de entre cerca de 550 pM e cerca de 2,5 nM.
  56. 56. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que o anticorpo inibe a atividade da triptase com uma IC50 de entre cerca de 500 pM e cerca de 2 nM.
  57. 57. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que o anticorpo inibe a atividade da triptase com uma IC50 de entre cerca de 550 nM e 1,5 nM.
  58. 58. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que o anticorpo inibe a atividade da triptase com uma IC50 de entre cerca de 500 pM e cerca de 700 pM.
  59. 59. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-58, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é capaz de inibir a atividade enzimática da beta triptase 1 humana em pH 6.
  60. 60. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-59, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é capaz de inibir a estimulação da proliferação de células musculares lisas brônquicas e/ou a contração à base de colágeno mediadas pela triptase.
  61. 61. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-60, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é capaz de inibir a liberação de histamina por células mastócitos.
  62. 62. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é capaz de inibir a liberação de histamina desencadeada por IgE e/ou a liberação de histamina desencadeada pela triptase.
    Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 342/418
    12/50
  63. 63. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-62, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é capaz de inibir a atividade da triptase em amostras de lavado broncoalveolar (BAL) ou absorção nasal (nasosorption) de macaco cynomolgus.
  64. 64. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-63, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é capaz de dissociar a beta triptase 1 humana tetramérica.
  65. 65. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é capaz de dissociar a beta triptase 1 humana tetramérica quando no formato monovalente.
  66. 66. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que o formato monovalente é um formato Fab.
  67. 67. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-66, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é capaz de dissociar a beta triptase 1 humana tetramérica na presença de heparina.
  68. 68. ANTICORPO caracterizado pelo fato de que se liga ao mesmo epítopo que o anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-67.
  69. 69. ANTICORPO caracterizado pelo fato de que compete pela ligação à beta triptase 1 humana com, ou bloqueia cruzadamente ou é bloqueada de forma cruzada pelo anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-68.
  70. 70. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 68 ou 69, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se ligar ao mesmo epítopo ou competir pela ligação à beta triptase 1 humana, ele será determinado por um ensaio de caracterização de epítopos (epitope binning assay).
  71. 71. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-70, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é monoclonal.
  72. 72. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das
    Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 343/418
    13/50 reivindicações 1-70, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é humanizado.
  73. 73. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-72, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um fragmento de anticorpo que se liga à beta triptase 1 humana.
  74. 74. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que o fragmento de anticorpo é selecionado do grupo consistindo nos fragmentos Fab, Fab’-SH, Fv, scFv e (Fab’)2.
  75. 75. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-72, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo de comprimento total.
  76. 76. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação75, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo IgG.
  77. 77. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação76, caracterizado pelo fato de que o anticorpo IgG é um anticorpo IgG 1.
  78. 78. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação76, caracterizado pelo fato de que o anticorpo IgG é um anticorpo lgG4.
  79. 79. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação78, caracterizado pelo fato de que o anticorpo lgG4 compreende uma mutação S228P (numeração EU).
  80. 80. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-79, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoespecífico.
  81. 81. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-79, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo multiespecífico.
  82. 82. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 81, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo biespecífico.
  83. 83. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 82,
    Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 344/418
    14/50 caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação que se liga à beta triptase 1 humana e um segundo domínio de ligação que se liga a uma segunda molécula biológica, em que a segunda molécula biológica é selecionada do grupo consistindo em interleucina-13 (IL-13), interleucina-4 (IL-4), interleucina-5 (IL-5), interleucina-17 (IL-17), IgE e interleucina-33 (IL-33).
  84. 84. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que a segunda molécula biológica é IL-13.
  85. 85. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que a segunda molécula biológica é IL-33.
  86. 86. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que a segunda molécula biológica é IgE.
  87. 87. ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO caracterizado pelo fato de que codifica o anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 -86, ou um conjunto de ácidos nucleicos isolados juntos que codificam o anticorpo.
  88. 88. ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO que codifica um anticorpo, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9 e/ou um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10, ou um conjunto de ácidos nucleicos isolados juntos que codificam o anticorpo, em que o ácido nucleico ou o conjunto compreende uma sequência que seja pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% idêntica à sequência da SEQ ID NO: 104 e/ou SEQ ID NO: 105.
  89. 89. ÁCIDO NUCLEICO, de acordo com a reivindicação 87 ou 88, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende (a) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 76 e/ou (b) uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 77, e em que o ácido nucleico ou o conjunto compreende uma sequência que seja
    Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 345/418
    15/50 pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% idêntica à sequência da SEQ ID NO: 106 e/ou SEQ ID NO: 107.
  90. 90. ÁCIDO NUCLEICO, de acordo com a reivindicação 87 ou 88, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende (a) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 78 e/ou (b) uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 79, e em que o ácido nucleico ou o conjunto compreende uma sequência que seja pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% idêntica à sequência da SEQ ID NO: 108 e/ou SEQ ID NO: 107.
  91. 91. ÁCIDO NUCLEICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 87, 88 e 90, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico compreende a sequência da SEQ ID NO: 108 e/ou SEQ ID NO: 107.
  92. 92. ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO que codifica o anticorpo caracterizado pelo fato de que compreende um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 e/ou um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37, ou um conjunto de ácidos nucleicos isolados juntos que codificam o anticorpo, em que o ácido nucleico ou o conjunto compreende uma sequência que seja pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% idêntica à sequência da SEQ ID NO: 109 e/ou SEQ ID NO: 110.
  93. 93. ÁCIDO NUCLEICO, de acordo com a reivindicação 87 ou 92, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende (a) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 80 e/ou (b) uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 81, e em que o ácido nucleico ou o conjunto compreende uma sequência que seja pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% idêntica à sequência da SEQ ID NO: 111 e/ou SEQ ID NO: 112.
  94. 94. ÁCIDO NUCLEICO, de acordo com a reivindicação 87 ou 92,
    Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 346/418
    16/50 caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende (a) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 82 e/ou (b) uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 83, e em que o ácido nucleico ou o conjunto compreende uma sequência que seja pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% idêntica à sequência da SEQ ID NO: 113 e/ou SEQ ID NO: 112.
  95. 95. ÁCIDO NUCLEICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 87, 92 e 94, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico ou o conjunto compreende a sequência da SEQ ID NO: 113 e/ou SEQ ID NO: 112.
  96. 96. VETOR OU CONJUNTO DE VETORES caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico isolado ou o conjunto de ácidos nucleicos isolados de acordo com qualquer uma das reivindicações 87-95.
  97. 97. CÉLULA HOSPEDEIRA caracterizada pelo fato de que compreende o vetor ou o conjunto de vetores de acordo com a reivindicação 96.
  98. 98. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com reivindicação 97, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula de mamífero.
  99. 99. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 98, caracterizada pelo fato de que a célula de mamífero é uma célula de ovário de hamster chinês (CHO).
  100. 100. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 97, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula procariótica.
  101. 101. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 100, caracterizada pelo fato de que a célula procariótica é E. coli.
  102. 102. MÉTODO DE PRODUÇÃO DO ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-86, sendo o método caracterizado pelo fato de que compreende a cultura da célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 97, em um meio de cultura em condições adequadas que
    Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 347/418
    17/50 permitam a produção do anticorpo.
  103. 103. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 102, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda a recuperação do anticorpo a partir da célula hospedeira ou do meio de cultura.
  104. 104. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-86, e um carreador, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável.
  105. 105. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo monoclonal isolado que se liga à beta triptase 1 humana, ou a seu fragmento de ligação a antígeno, e um carreador, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável, em que o anticorpo se liga à beta triptase 1 monomérica com um Kode cerca de 0,1 nM a cerca de 1 nM, e/ou em que o anticorpo é capaz de inibir a atividade enzimática da triptase com uma metade da concentração inibitória máxima (IC50) de cerca de 0,1 nM a cerca de 5 nM conforme determinado por um ensaio enzimático com triptase in vitro usando S-2288 como substrato.
  106. 106. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 105, caracterizada pelo fato de que o anticorpo se liga à triptase com um Kd entre cerca de 0,5 nM a cerca de 1 nM.
  107. 107. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 105, caracterizada pelo fato de que o anticorpo se liga à triptase com um Kd entre cerca de 0,1 nM a cerca de 0,5 nM.
  108. 108. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 105 ou 107, caracterizada pelo fato de que o anticorpo se liga à triptase com um Kd de cerca de 0,4 nM.
  109. 109. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 105 ou 107, caracterizada pelo fato de que o anticorpo se liga à triptase com um Kd de cerca de 0,2 nM.
    Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 348/418
    18/50
  110. 110. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 105-109, caracterizada pelo fato de que o Kd é medido por um ensaio de ressonância plasmônica de superfície.
  111. 111. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 105-110, caracterizada pelo fato de que o anticorpo é capaz de inibir a atividade da triptase com uma IC50 de cerca de 0,5 nM a cerca de 5 nM.
  112. 112. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 105-110, caracterizada pelo fato de que o anticorpo é capaz de inibir a atividade da triptase com uma IC50 de cerca de 0,1 nM a cerca de 2 nM.
  113. 113. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 105-112, caracterizada pelo fato de que o anticorpo é capaz de inibir a atividade da triptase humana com uma IC50 de cerca de 4 nM.
  114. 114. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 105-113, caracterizada pelo fato de que o anticorpo é capaz de inibir a atividade da triptase com uma IC50 de cerca de 0,6 nM.
  115. 115. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 105-114, caracterizada pelo fato de que o anticorpo é capaz de inibir a atividade da triptase em pH 6.
  116. 116. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 105-115, caracterizada pelo fato de que o anticorpo é capaz de inibir a estimulação da proliferação de células musculares lisas brônquicas e/ou a contração à base de colágeno mediadas pela triptase.
  117. 117. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 105-116, caracterizada pelo fato de que o anticorpo é capaz de inibir a liberação de histamina por células mastócitos.
  118. 118. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 117,
    Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 349/418
    19/50 caracterizada pelo fato de que o anticorpo é capaz de inibir a liberação de histamina desencadeada por IgE e/ou a liberação de histamina desencadeada pela triptase.
  119. 119. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 105-118, caracterizada pelo fato de que o anticorpo é capaz de inibir a triptase D1 de cyno conforme avaliado por um ensaio de ELISA com triptase ativa.
  120. 120. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 105-119, caracterizada pelo fato de que o anticorpo é capaz de dissociar a beta triptase 1 humana tetramérica.
  121. 121. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 120, caracterizada pelo fato de que o anticorpo é capaz de dissociar a beta triptase 1 humana tetramérica quando em um formato monovalente.
  122. 122. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 121, caracterizada pelo fato de que o formato monovalente é um formato de Fab.
  123. 123. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 105-122, caracterizada pelo fato de que o anticorpo é capaz de dissociar a beta triptase 1 humana tetramérica na presença de heparina.
  124. 124. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 105, 107, 108, 110-113, ou 115-123, caracterizada pelo fato de que o anticorpo compreende as seis seguintes regiões hipervariáveis (HVRs):
    (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de DYGMV (SEQ ID NO: 7);
    (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de FISSGSSTVYYADTMKG (SEQ ID NO: 2);
    (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de RNYDDWYFDV (SEQ ID NO: 8);
    (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos
    Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 350/418
    20/50 de SASSSVTYMY (SEQ ID NO: 4);
    (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de RTSDLAS (SEQ ID NO: 5); e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de QHYHSYPLT (SEQ ID NO: 6).
  125. 125. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 105, 107, 108, 110-113, ou 115-124, caracterizada pelo fato de que o anticorpo compreende (a) um domínio variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9; (b) um domínio variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10; ou (c) um domínio VH como em (a) e um domínio VL como em (b).
  126. 126. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 105, 107, 108, 110-113, ou 115-125, caracterizada pelo fato de que o anticorpo compreende ainda as seguintes regiões de framework (FRs) do domínio VH:
    (a) uma FR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS (SEQ ID NO: 11);
    (b) uma FR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de WVRQAPGKGLEWVA (SEQ ID NO: 12);
    (c) uma FR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTR (SEQ ID NO: 13); e (d) uma FR-H4 compreendendo a sequência de aminoácidos de WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 14).
  127. 127. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das
    Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 351/418
    21/50 reivindicações 105, 107, 108, 110-113, ou 115-126, caracterizada pelo fato de que o domínio VH do anticorpo compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9.
  128. 128. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 105, 107, 108, 110-113, ou 115-127, caracterizada pelo fato de que o anticorpo compreende ainda as seguintes FRs do domínio VL:
    (a) uma FR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 15);
    (b) uma FR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de WYQQKPGKSPKPWIY (SEQ ID NO: 16);
    (c) uma FR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 17); e (d) uma FR-L4 compreendendo a sequência de aminoácidos de FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 18).
  129. 129. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 105, 107, 108, 110-113, ou 115-128, caracterizada pelo fato de que o domínio VL do anticorpo compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10.
  130. 130. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 124-129, caracterizada pelo fato de que o anticorpo compreende (a) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 76 e (b) uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 77.
  131. 131. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 124-129, caracterizada pelo fato de que o anticorpo compreende (a) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 78 e (b) uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 79.
    Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 352/418
    22/50
  132. 132. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 105, 107, 109-112, ou 114-123, caracterizada pelo fato de que o anticorpo compreende as seguintes seis HVRs:
    (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de GYAIT (SEQ ID NO: 30);
    (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de GISSAATTFYSSWAKS (SEQ ID NO: 31);
    (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de DPRGYGAALDRLDL (SEQ ID NO: 32);
    (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de QSIKSVYNNRLG (SEQ ID NO: 33);
    (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de ETSILTS (SEQ ID NO: 34); e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de AGGFDRSGDTT (SEQ ID NO: 35).
  133. 133. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 105, 107, 109-112, 114-123, ou 132, caracterizada pelo fato de que o anticorpo compreende (a) um domínio VH compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 36, 47, 48, 49, 50, 51 e 52, e (b) um domínio VL compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% de identidade com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 37, 53, 58, ou 59.
  134. 134. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 105, 107, 109-112, 114-123, 132, ou 133, caracterizada pelo fato de que o anticorpo compreende ainda as seguintes FRs do domínio VH:
    (a) uma FR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos
    Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 353/418
    23/50 de EVQLVESGPGLVKPSETLSLTCTVSRFSLI (SEQ ID NO: 38);
    (b) uma FR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de WIRQPPGKGLEWIG (SEQ ID NO: 42);
    (c) uma FR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de RVTISRDTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAR (SEQ ID NO: 43); e (d) uma FR-H4 compreendendo a sequência de aminoácidos de WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 41).
  135. 135. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 105, 107, 109-112, 114-123, ou 132-134, caracterizada pelo fato de que o domínio VH do anticorpo compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36.
  136. 136. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 105, 107, 109-112, 114-123, ou 132-135, caracterizada pelo fato de que o anticorpo compreende ainda as seguintes FRs do domínio VL:
    (a) uma FR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 64);
    (b) uma FR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 65);
    (c) uma FR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 66); e (d) uma FR-L4 compreendendo a sequência de aminoácidos de FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 63).
  137. 137. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 105, 107, 109-112, 114-123, ou 132-136, caracterizada pelo fato de que o domínio VL do anticorpo compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37.
  138. 138. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 132-137, caracterizada pelo fato de que o anticorpo compreende
    Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 354/418
    24/50 (a) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 80 e (b) uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 81.
  139. 139. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 132-137, caracterizada pelo fato de que o anticorpo compreende (a) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 82 e (b) uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 83.
  140. 140. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 105, 107, 108, 110-113, ou 115-131, caracterizada pelo fato de que o anticorpo se liga a um epítopo na beta triptase 1 humana compreendendo pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, ou todos os quatro resíduos selecionados do grupo consistindo em His51, Val80, Lys81 eAsp82 da SEQ ID NO: 71.
  141. 141. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 140, caracterizada pelo fato de que o anticorpo se liga a um epítopo na beta triptase 1 humana compreendendo His51 e pelo menos um, pelo menos dois ou todos os três resíduos selecionados do grupo consistindo em Vai 80, Lys81 e Asp82 da SEQ ID NO: 71.
  142. 142. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 140 ou 141, caracterizada pelo fato de que o epítopo na beta triptase 1 humana compreende ainda um ou mais resíduos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em Gln67, Leu83, Ala84, Ala85, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu128, Glu129 e Pro130 da SEQ ID NO: 71.
  143. 143. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 142, caracterizada pelo fato de que o epítopo na beta triptase 1 humana compreende pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove,
    Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 355/418
    25/50 pelo menos dez, pelo menos onze, ou todos os doze resíduos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em Gln67, Leu83, Ala84, Ala85, Arg87, Prol 03, Val104, Ser105, Arg106, Glu128, Glu129 e Prol 30 da SEQ ID NO: 71.
  144. 144. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 142 ou 143, caracterizada pelo fato de que o epítopo na beta triptase 1 humana compreende His51, Gln67, Val80, Lys81, Asp82, Leu83, Ala84, Ala85, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu128, Glu129 e Pro130 da SEQ ID NO:71.
  145. 145. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 140-144, caracterizada pelo fato de que o epítopo é relativo a um monômero ou tetrâmero da beta triptase 1 humana.
  146. 146. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 140-145, caracterizada pelo fato de que o epítopo é determinado por um modelo de cristalografia de raios X.
  147. 147. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 105, 107, 108, 110-113, 115-131, ou 140-146, caracterizada pelo fato de que o anticorpo é capaz de dissociar a interface pequena da beta triptase 1 humana tetramérica e a interface grande da beta triptase 1 humana tetramérica.
  148. 148. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 105, 107, 109-112, 114-123, ou 132-139, caracterizada pelo fato de que o anticorpo se liga a um epítopo na beta triptase 1 humana compreendendo pelo menos um, pelo menos dois, ou todos os três resíduos selecionados do grupo consistindo em Gln100, Leu101 e Leu102 da SEQ ID NO: 71.
  149. 149. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 148, caracterizada pelo fato de que o epítopo na beta triptase 1 humana compreende ainda um ou mais resíduos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em Trp55, Gln67, Asp82, Leu83, Ala84, Arg87, Pro103,
    Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 356/418
    26/50
    Val104, Ser105, Arg106, Glu126, Leu127, Glu128 e Glu129 da SEQ ID NO: 71.
  150. 150. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 149, caracterizada pelo fato de que o epítopo na beta triptase 1 humana compreende pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez, pelo menos onze, pelo menos doze, pelo menos treze, ou todos os catorze resíduos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em Trp55, Gln67, Asp82, Leu83, Ala84, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu126, Leu127, Glu128 e Glu129 da SEQ ID NO: 71.
  151. 151. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 149 ou 150, caracterizada pelo fato de que o epítopo compreende Gln35, Trp55, Gln67, Asp82, Leu83, Ala84, Arg87, Gln100, Leu101, Leu102, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu126, Leu127, Glu128, Glu129 e Arg216 da SEQ ID NO:71.
  152. 152. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 148-151, caracterizada pelo fato de que o epítopo é relativo a um monômero ou tetrâmero da beta triptase 1 humana.
  153. 153. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 152, caracterizada pelo fato de que o epítopo é relativo a um tetrâmero da beta triptase 1 humana, e o epítopo na beta triptase 1 humana compreende ainda um ou ambos os Gln35 e Arg216 da SEQ ID NO: 71.
  154. 154. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 148-153, caracterizada pelo fato de que o epítopo é determinado por um modelo de cristalografia de raios X.
  155. 155. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 105, 107, 109-112, 114-123, 132-139, ou 148-154, caracterizada pelo fato de que o anticorpo é capaz de dissociar a interface pequena e/ou a interface grande da beta triptase 1 humana.
  156. 156. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA caracterizada pelo fato de
    Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 357/418
    27/50 que compreende um anticorpo monoclonal isolado que se liga à beta triptase 1 humana, ou a seu fragmento de ligação a antígeno, e um carreador, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável, em que o anticorpo se liga a um epítopo na beta triptase 1 humana compreendendo pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, ou todos os quatro resíduos selecionados do grupo consistindo em His51, Val80, Lys81 e Asp82 da SEQ ID NO: 71.
  157. 157. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 156, caracterizada pelo fato de que o anticorpo se liga a um epítopo na beta triptase 1 humana compreendendo His51 e pelo menos um, pelo menos dois ou todos os três resíduos selecionados do grupo consistindo em Val80, Lys81 e Asp82 da SEQ ID NO: 71.
  158. 158. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 156 ou 157, caracterizada pelo fato de que o epítopo na beta triptase 1 humana compreende ainda um ou mais resíduos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em Gln67, Leu83, Ala84, Ala85, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu128, Glu129 e Pro130 da SEQ ID NO: 71.
  159. 159. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 158, caracterizada pelo fato de que o epítopo na beta triptase 1 humana compreende pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez, pelo menos onze, ou todos os doze resíduos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em Gln67, Leu83, Ala84, Ala85, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu128, Glu129 e Pro130 da SEQ ID NO: 71.
  160. 160. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 158 ou 159, caracterizada pelo fato de que o epítopo na beta triptase 1 humana compreende His51, Gln67, Val80, Lys81, Asp82, Leu83, Ala84, Ala85, Arg87, Prol03, Val104, Ser105, Arg106, Glu128, Glu129 e Prol 30 da SEQ ID NO:71.
  161. 161. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das
    Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 358/418
    28/50 reivindicações 156-160, caracterizada pelo fato de que o epítopo é relativo a um monômero ou tetrâmero da beta triptase 1 humana.
  162. 162. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 156-161, caracterizada pelo fato de que o epítopo é determinado por um modelo de cristalografia de raios X.
  163. 163. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 156-162, caracterizada pelo fato de que o anticorpo é capaz de dissociar a interface pequena da beta triptase 1 humana tetramérica e a interface grande da beta triptase 1 humana tetramérica.
  164. 164. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo monoclonal isolado que se liga à beta triptase 1 humana, ou a seu fragmento de ligação a antígeno, e um carreador, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável, em que o anticorpo se liga a um epítopo na beta triptase 1 humana compreendendo pelo menos um, pelo menos dois, ou todos os três resíduos selecionados do grupo consistindo em GlnWO, Leu101 e Leu102 da SEQ ID NO: 71.
  165. 165. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 164, caracterizada pelo fato de que o epítopo na beta triptase 1 humana compreende ainda um ou mais resíduos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em Trp55, Gln67, Asp82, Leu83, Ala84, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu126, Leu127, Glu128 e Glu129 da SEQ ID NO: 71.
  166. 166. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 165, caracterizada pelo fato de que o epítopo na beta triptase 1 humana compreende pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez, pelo menos onze, pelo menos doze, pelo menos treze, ou todos os catorze resíduos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em Trp55, Gln67, Asp82, Leu83, Ala84, Arg87, Pro103, Val104, Ser105,
    Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 359/418
    29/50
    Arg106, Glu126, Leu127, Glu128 e Glu129 da SEQ ID NO: 71.
  167. 167. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 165 ou 166, caracterizada pelo fato de que o epítopo compreende Gln35, Trp55, Gln67, Asp82, Leu83, Ala84, Arg87, GlnlOO, Leu101, Leu102, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu126, Leu127, Glu128, Glu129 e Arg216 da SEQ ID NO:71.
  168. 168. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 164-167, caracterizada pelo fato de que o epítopo é relativo a um monômero ou tetrâmero da beta triptase 1 humana.
  169. 169. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 168, caracterizada pelo fato de que o epítopo é relativo a um tetrâmero da beta triptase 1 humana, e o epítopo na beta triptase 1 humana compreende ainda um ou ambos os Gln35 e Arg216 da SEQ ID NO: 71.
  170. 170. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 164-169, caracterizada pelo fato de que o epítopo é determinado por um modelo de cristalografia de raios X.
  171. 171. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 164-170, caracterizada pelo fato de que o anticorpo é capaz de dissociar a interface pequena e/ou a interface grande da beta triptase 1 humana.
  172. 172. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 105-171, caracterizada pelo fato de que o anticorpo é capaz de se ligar ainda à alfa triptase, beta triptase 2, beta triptase 3 humanas e/ou triptase D1 de cyno.
  173. 173. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 105-172, caracterizada pelo fato de que o anticorpo é monoclonal.
  174. 174. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 105-172, caracterizada pelo fato de que o anticorpo é
    Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 360/418
    30/50 humanizado.
  175. 175. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 104-174, caracterizada pelo fato de que a composição é para uso em um ser humano.
  176. 176. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 104-175, caracterizada pelo fato de que a composição é liofilizada.
  177. 177. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 104-175, caracterizada pelo fato de que a composição é um líquido.
  178. 178. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 104-177, caracterizada pelo fato de que o excipiente é um antioxidante.
  179. 179. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 178, caracterizada pelo fato de que a composição compreende um ou mais antioxidantes selecionados do grupo consistindo em N-acetiltriptofano, triptofano, metionina, cisteína, glutationa, tiossorbitol, ácido ascórbico, monotioglicerol, ciclodextrinas, Trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8tetrametilcroman-2-carboxílico), piridoxina, manitol, e um quelante de metal.
  180. 180. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 179, caracterizada pelo fato de que a composição compreende N-acetiltriptofano e/ou metionina.
  181. 181. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 180, caracterizada pelo fato de que a composição compreende N-acetiltriptofano e metionina.
  182. 182. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA caracterizada pelo fato de que compreende:
    (i) um anticorpo isolado que se liga à beta triptase 1 humana, ou
    Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 361/418
    31/50 seu fragmento de ligação a antígeno, em que o anticorpo compreende as seguintes seis regiões hipervariáveis (HVRs):
    (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de DYGMV (SEQ ID NO: 7);
    (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de FISSGSSTVYYADTMKG (SEQ ID NO: 2);
    (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de RNYDDWYFDV (SEQ ID NO: 8);
    (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SASSSVTYMY (SEQ ID NO: 4);
    (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de RTSDLAS (SEQ ID NO: 5); e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de QHYHSYPLT (SEQ ID NO: 6), em que a oxidação do triptofano na posição 6 da HVR-H3 (SEQ ID NO: 8) não é maior que 30%.
  183. 183. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 182, caracterizada pelo fato de que a oxidação do triptofano na posição 6 da HVRH3 (SEQ ID NO: 8) é determinada seguindo um teste de estresse de AAPH.
  184. 184. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 182, caracterizada pelo fato de que a oxidação do triptofano na posição 6 da HVRH3 (SEQ ID NO: 8) é determinada dentro de um ano a partir da produção inicial da composição.
  185. 185. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 182-184, caracterizada pelo fato de que a oxidação do triptofano na posição 6 da HVR-H3 (SEQ ID NO: 8) não é maior que 28%, 25%, 20%, 15%, 10%, ou 6%.
  186. 186. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 180-185, caracterizada pelo fato de que a composição
    Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 362/418
    32/50 compreende N-acetiltriptofano numa concentração de cerca de 0,1 mM a cerca de 5 mM.
  187. 187. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 186, caracterizada pelo fato de que a concentração de N-acetiltriptofano é de cerca de 0,1 mM a cerca de 1 mM.
  188. 188. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 187, caracterizada pelo fato de que a concentração de N-acetiltriptofano é de cerca de 0,3 mM.
  189. 189. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 180-188, caracterizada pelo fato de que a composição compreende metionina numa concentração de cerca de 1 mM a cerca de 20 mM.
  190. 190. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 189, caracterizada pelo fato de que a concentração de metionina é de cerca de 1 mM a cerca de 10 mM.
  191. 191. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 190, caracterizada pelo fato de que a concentração de metionina é de cerca de 5 mM.
  192. 192. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA caracterizada pelo fato de que compreende:
    (i) um anticorpo isolado que se liga à triptase humana, ou seu fragmento de ligação a antígeno, em que o anticorpo compreende as seguintes seis regiões hipervariáveis (HVRs):
    (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de DYGMV (SEQ ID NO: 7);
    (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de FISSGSSTVYYADTMKG (SEQ ID NO: 2);
    (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos
    Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 363/418
    33/50 de RNYDDWYFDV (SEQ ID NO: 8);
    (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SASSSVTYMY (SEQ ID NO: 4);
    (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de RTSDLAS (SEQ ID NO: 5); e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de QHYHSYPLT (SEQ ID NO: 6);
    (ii) N-acetiltriptofano numa concentração de cerca de 0,1 mm a cerca de 1 mM; e (iii) metionina numa concentração de cerca de 1 mM a cerca de 10 mM.
  193. 193. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 104-192, caracterizada pelo fato de que a concentração de anticorpo é de cerca de 1 mg/ml a cerca de 250 mg/ml.
  194. 194. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 193, caracterizada pelo fato de que a concentração de anticorpo é de cerca de 150 mg/ml.
  195. 195. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 104-194, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um ou mais excipientes adicionais selecionados do grupo consistindo em um estabilizante, um tampão, um surfactante e um agente de tonicidade.
  196. 196. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 195, caracterizada pelo fato de que a composição compreende ainda um tampão.
  197. 197. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 196, caracterizada pelo fato de que o tampão compreende succinato de arginina e/ou succinato de histidina.
  198. 198. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 197, caracterizada pelo fato de que o tampão compreende succinato e arginina e
    Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 364/418
    34/50 succinato de histidina.
  199. 199. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 197 ou 198, caracterizada pelo fato de que a concentração de succinato de arginina é de cerca de 50 mM a cerca de 500 mM.
  200. 200. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 199, caracterizada pelo fato de que a concentração de succinato de arginina é de cerca de 100 mM a cerca de 300 mM.
  201. 201. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 200, caracterizada pelo fato de que a concentração de succinato de arginina é de cerca de 200 mM.
  202. 202. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 197-201, caracterizada pelo fato de que a concentração de succinato de histidina é de cerca de 1 mM a cerca de 50 mM.
  203. 203. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 202, caracterizada pelo fato de que a concentração de succinato de histidina é de cerca de 15 mM a cerca de 25 mM.
  204. 204. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 203, caracterizada pelo fato de que a concentração de succinato de histidina é de cerca de 20 mM.
  205. 205. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 195-204, caracterizada pelo fato de que a composição compreende ainda um surfactante.
  206. 206. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 205, caracterizada pelo fato de que o surfactante é poloxâmero 188 ou polissorbato 20.
  207. 207. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 206, caracterizada pelo fato de que o surfactante é o poloxâmero 188.
  208. 208. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 207,
    Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 365/418
    35/50 caracterizada pelo fato de que a concentração do poloxâmero 188 é de cerca de 0,005% a cerca de 0,1 %.
  209. 209. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 208, caracterizada pelo fato de que a concentração do poloxâmero 188 é de cerca de 0,005% a cerca de 0,05%.
  210. 210. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 209, caracterizada pelo fato de que a concentração do poloxâmero 188 é de cerca de 0,02%.
  211. 211. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 104-210, caracterizada pelo fato de que o pH da composição é de cerca de 4,5 a cerca de 7,0.
  212. 212. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 211, caracterizada pelo fato de que o pH da composição é de cerca de 4,5 a cerca de 6,5.
  213. 213. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 212, caracterizada pelo fato de que o pH da composição é de cerca de 5,8.
  214. 214. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 104-213, caracterizada pelo fato de que a composição está em um recipiente à prova de luz.
  215. 215. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 104-214, caracterizada pelo fato de que a composição está em uma seringa preenchida.
  216. 216. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 104-215, caracterizada pelo fato de que a composição compreende ainda um antagonista de ligação ao eixo da IL-13, um antagonista de ligação ao eixo da IL-5, um antagonista de ligação ao eixo da IL-33, um antagonista de M1 prime, um antagonista de IgE, um antagonista de TRPA1, um antagonista de CRTH2, um medicamento broncodilatador ou controlador de
    Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 366/418
    36/50 sintomas da asma, um imunomodulador, um corticosteroide, um inibidor da via de Th2, um inibidor de tirosina quinase, ou um inibidor da fosfodiesterase.
  217. 217. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 216, caracterizada pelo fato de que o antagonista de ligação ao eixo da IL-13 é um anticorpo anti-IL-13.
  218. 218. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 217, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti-IL-13 é lebrikizumab.
  219. 219. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 216, caracterizada pelo fato de que o antagonista de ligação ao eixo da IL-5 é um antagonista de ligação à IL-5 ou um antagonista de ligação ao receptor da IL-5.
  220. 220. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 216, caracterizada pelo fato de que o antagonista de ligação ao eixo da IL-33 é um antagonista de ligação à IL-33 ou um antagonista de ligação a ST2.
  221. 221. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 217, caracterizada pelo fato de que o antagonista de ligação à IL-33 é um anticorpo anti-IL-33.
  222. 222. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 216, caracterizada pelo fato de que o antagonista de M1 prime é quilizumab.
  223. 223. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 104-222, caracterizada pelo fato de que a composição é formulada para administração a um ser humano.
  224. 224. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-86, caracterizado pelo fato de que é para uso como um medicamento.
  225. 225. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-86, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de um distúrbio.
  226. 226. ANTICORPO para uso, de acordo com a reivindicação 225,
    Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 367/418
    37/50 caracterizado pelo fato de que o distúrbio é selecionado do grupo consistindo em um distúrbio pulmonar, um distúrbio autoimune, um distúrbio inflamatório, um distúrbio fibrótico, um distúrbio granulocítico (neutrofílico ou eosinofílico), um distúrbio monocítico, um distúrbio linfocítico, um distúrbio associado a números aumentados ou distribuição de células residentes teciduais aberrantes ou normais ou células estromais, ou mastocitose.
  227. 227. ANTICORPO para uso, de acordo com a reivindicação 226, caracterizado pelo fato de que o distúrbio é um distúrbio pulmonar.
  228. 228. ANTICORPO para uso, de acordo com a reivindicação 227, caracterizado pelo fato de que o distúrbio pulmonar é selecionado do grupo consistindo em asma, hiper-responsividade das vias aéreas e doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC).
  229. 229. ANTICORPO para uso, de acordo com a reivindicação 228, caracterizado pelo fato de que o distúrbio pulmonar é asma.
  230. 230. ANTICORPO para uso, de acordo com a reivindicação 229, caracterizado pelo fato de que a asma é asma com alto nível de Th2 ou asma com baixo nível de Th2.
  231. 231. ANTICORPO para uso, de acordo com a reivindicação 226, caracterizado pelo fato de que o distúrbio autoimune é selecionado do grupo consistindo em artrite reumatoide, psoríase, esofagite eosinofílica, doença inflamatória intestinal (DlI) e doença de Crohn.
  232. 232. ANTICORPO para uso, de acordo com a reivindicação 226, caracterizado pelo fato de que o distúrbio inflamatório é urticária crônica espontânea (UCE), anafilaxia, choque anafilático, dermatite atópica ou rinite alérgica.
  233. 233. ANTICORPO para uso, de acordo com a reivindicação 226, caracterizado pelo fato de que o distúrbio fibrótico é a fibrose pulmonar idiopática (FPI).
    Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 368/418
    38/50
  234. 234. ANTICORPO para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 225-233, caracterizado pelo fato de que é para uso em combinação com um agente terapêutico adicional.
  235. 235. ANTICORPO para uso, de acordo com a reivindicação 234, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico adicional é um antagonista de ligação ao eixo da IL-13, um antagonista de ligação ao eixo da IL-5, um antagonista de ligação ao eixo da IL-33, um antagonista de M1 prime, um antagonista de IgE, um antagonista de TRPA1, um antagonista de CRTH2, um medicamento broncodilatador ou controlador de sintomas da asma, um imunomodulador, um corticosteroide, um inibidor da via de Th2, um inibidor de tirosina quinase, ou um inibidor da fosfodiesterase.
  236. 236. ANTICORPO para uso, de acordo com a reivindicação 235, caracterizado pelo fato de que o antagonista de ligação ao eixo da IL-13 é um anticorpo anti-IL-13.
  237. 237. ANTICORPO para uso, de acordo com a reivindicação 236, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-IL-13 é lebrikizumab.
  238. 238. ANTICORPO para uso, de acordo com a reivindicação 234, caracterizado pelo fato de que o antagonista de ligação ao eixo da IL-5 é um antagonista de ligação à IL-5 ou um antagonista de ligação ao receptor da IL-5.
  239. 239. ANTICORPO para uso, de acordo com a reivindicação 235, caracterizado pelo fato de que o antagonista de ligação ao eixo da IL-33 é um antagonista de ligação à IL-33 ou um antagonista de ligação a ST2.
  240. 240. ANTICORPO para uso, de acordo com a reivindicação 239, caracterizado pelo fato de que o antagonista de ligação à IL-33 é um anticorpo anti-IL-33.
  241. 241. ANTICORPO para uso, de acordo com a reivindicação 235, caracterizado pelo fato de que o antagonista de M1 prime é quilizumab.
  242. 242. ANTICORPO para uso, de acordo com qualquer uma das
    Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 369/418
    39/50 reivindicações 225-241, caracterizado pelo fato de que é para administração por via subcutânea, intravenosa, intramuscular, tópica, oral, transdérmica, intraperitoneal, infraorbital, por implante, por inalação, intratecal, intraventricular ou intranasal.
  243. 243. ANTICORPO para uso, de acordo com a reivindicação 242, caracterizado pelo fato de que é para administração por via subcutânea.
  244. 244. ANTICORPO para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 225-243, caracterizado pelo fato de que é para uso em um sujeito humano.
  245. 245. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 104-223, caracterizada pelo fato de que é para uso como um medicamento.
  246. 246. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 104-223, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento de um distúrbio.
  247. 247. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA para uso, de acordo com a reivindicação 246, caracterizada pelo fato de que o distúrbio é selecionado do grupo consistindo em um distúrbio pulmonar, um distúrbio autoimune, um distúrbio inflamatório, um distúrbio fibrótico, um distúrbio granulocítico (neutrofílico ou eosinofílico), um distúrbio monocítico, um distúrbio linfocítico, um distúrbio associado a números aumentados ou distribuição de células residentes teciduais aberrantes ou normais ou células estromais, ou mastocitose.
  248. 248. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA para uso, de acordo com a reivindicação 247, caracterizada pelo fato de que o distúrbio é um distúrbio pulmonar.
  249. 249. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA para uso, de acordo com a reivindicação 248, caracterizada pelo fato de que o distúrbio pulmonar é
    Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 370/418
    40/50 selecionado do grupo consistindo em asma, hiper-responsividade das vias aéreas e doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC).
  250. 250. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA para uso, de acordo com a reivindicação 249, caracterizada pelo fato de que o distúrbio pulmonar é asma.
  251. 251. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA para uso, de acordo com a reivindicação 250, caracterizada pelo fato de que a asma é asma com alto níveis de Th2 ou asma com baixo nível de Th2.
  252. 252. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA para uso, de acordo com a reivindicação 247, caracterizada pelo fato de que o distúrbio autoimune é selecionado do grupo consistindo em artrite reumatoide, psoríase, esofagite eosinofílica, doença inflamatória intestinal (Dll) e doença de Crohn.
  253. 253. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA para uso, de acordo com a reivindicação 247, caracterizada pelo fato de que o distúrbio inflamatório é urticária crônica espontânea (UCE), anafilaxia, choque anafilático, dermatite atópica ou rinite alérgica.
  254. 254. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA para uso, de acordo com a reivindicação 247, caracterizada pelo fato de que o distúrbio fibrótico é fibrose pulmonar idiopática (FPI).
  255. 255. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 246-254, caracterizada pelo fato de que é para uso em combinação com um agente terapêutico adicional.
  256. 256. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA para uso, de acordo com a reivindicação 255, caracterizada pelo fato de que o agente terapêutico adicional é um antagonista de ligação ao eixo da IL-13, um antagonista de ligação ao eixo da IL-5, um antagonista de ligação ao eixo da IL-33, um antagonista de M1 prime, um antagonista de IgE, um antagonista de TRPA1, um antagonista de CRTH2, um medicamento broncodilatador ou controlador de sintomas da asma, um imunomodulador, um corticosteroide, um inibidor da via de Th2, um
    Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 371/418
    41/50 inibidor de tirosina quinase, ou um inibidor da fosfodiesterase.
  257. 257. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA para uso, de acordo com a reivindicação 256, caracterizada pelo fato de que o antagonista de ligação ao eixo da IL-13 é um anticorpo anti-IL-13.
  258. 258. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA para uso, de acordo com a reivindicação 257, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti-IL-13 é lebrikizumab.
  259. 259. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA para uso, de acordo com a reivindicação 256, caracterizada pelo fato de que o antagonista de ligação ao eixo da IL-5 é um antagonista de ligação à IL-5 ou um antagonista de ligação ao receptor da IL-5.
  260. 260. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA para uso, de acordo com a reivindicação 256, caracterizada pelo fato de que o antagonista de ligação ao eixo da IL-33 é um antagonista de ligação à IL-33 ou um antagonista de ligação a ST2.
  261. 261. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA para uso, de acordo com a reivindicação 260, caracterizada pelo fato de que o antagonista de ligação à IL33 é um anticorpo anti-IL-33.
  262. 262. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA para uso, de acordo com a reivindicação 256, caracterizada pelo fato de que o antagonista de M1 prime é quilizumab.
  263. 263. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 246-262, caracterizada pelo fato de que é para administração por via subcutânea, intravenosa, intramuscular, tópica, oral, transdérmica, intraperitoneal, infraorbital, por implante, por inalação, intratecal, intraventricular ou intranasal.
  264. 264. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA para uso, de acordo com a reivindicação 263, caracterizada pelo fato de que é para administração por via
    Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 372/418
    42/50 subcutânea.
  265. 265. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 246-264, caracterizada pelo fato de que é para uso em um sujeito humano.
  266. 266. USO de um anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-86, caracterizado pelo fato de que se aplica na fabricação de um medicamento para tratamento de um distúrbio.
  267. 267. USO, de acordo com a reivindicação 266, caracterizado pelo fato de que o distúrbio é selecionado do grupo consistindo em um distúrbio pulmonar, um distúrbio autoimune, um distúrbio inflamatório, um distúrbio fibrótico, um distúrbio granulocítico (neutrofílico ou eosinofílico), um distúrbio monocítico, um distúrbio linfocítico, um distúrbio associado a números aumentados ou distribuição de células residentes teciduais aberrantes ou normais ou células estromais, ou mastocitose.
  268. 268. USO, de acordo com a reivindicação 267, caracterizado pelo fato de que o distúrbio é um distúrbio pulmonar.
  269. 269. USO, de acordo com a reivindicação 268, caracterizado pelo fato de que o distúrbio pulmonar é selecionado do grupo consistindo em asma, hiper-responsividade das vias aéreas e doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC).
  270. 270. USO, de acordo com a reivindicação 269, caracterizado pelo fato de que o distúrbio pulmonar é asma.
  271. 271. USO, de acordo com a reivindicação 270, caracterizado pelo fato de que a asma é asma com alto nível de Th2 ou asma com baixo nível de Th2.
  272. 272. USO, de acordo com a reivindicação 267, caracterizado pelo fato de que o distúrbio autoimune é selecionado do grupo consistindo em artrite reumatoide, psoríase, esofagite eosinofílica, doença inflamatória intestinal (Dll)
    Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 373/418
    43/50 e doença de Crohn.
  273. 273. USO, de acordo com a reivindicação 267, caracterizado pelo fato de que o distúrbio inflamatório é urticária crônica espontânea (UCE), anafilaxia, choque anafilático, dermatite atópica ou rinite alérgica.
  274. 274. USO, de acordo com a reivindicação 267, caracterizado pelo fato de que o distúrbio fibrótico é a fibrose pulmonar idiopática (FPI).
  275. 275. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 265274, caracterizado pelo fato de que o medicamento é formulado para uso em combinação com um antagonista de ligação ao eixo da IL-13, um antagonista de ligação ao eixo da IL-5, um antagonista de ligação ao eixo da IL-33, um antagonista de M1 prime, um antagonista de IgE, um antagonista de TRPA1, um antagonista de CRTH2, um medicamento broncodilatador ou controlador de sintomas da asma, um imunomodulador, um corticosteroide, um inibidor da via de Th2, um inibidor de tirosina quinase, ou um inibidor da fosfodiesterase.
  276. 276. USO, de acordo com a reivindicação 275, caracterizado pelo fato de que o antagonista de ligação ao eixo da IL-13 é um anticorpo anti-IL-13.
  277. 277. USO, de acordo com a reivindicação 276, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-IL-13 é lebrikizumab.
  278. 278. USO, de acordo com a reivindicação 275, caracterizado pelo fato de que o antagonista de ligação ao eixo da IL-5 é um antagonista de ligação à IL-5 ou um antagonista de ligação ao receptor da IL-5.
  279. 279. USO, de acordo com a reivindicação 275, caracterizado pelo fato de que o antagonista de ligação ao eixo da IL-33 é um antagonista de ligação à IL-33 ou um antagonista de ligação a ST2.
  280. 280. USO, de acordo com a reivindicação 279, caracterizado pelo fato de que o antagonista de ligação à IL-33 é um anticorpo anti-IL-33.
  281. 281. USO, de acordo com a reivindicação 275, caracterizado pelo fato de que o antagonista de M1 prime é quilizumab.
    Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 374/418
    44/50
  282. 282. USO de uma composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 104-223, caracterizado pelo fato de que se aplica na fabricação de um medicamento para tratamento de um distúrbio.
  283. 283. USO, de acordo com a reivindicação 282, caracterizado pelo fato de que o distúrbio é selecionado do grupo consistindo em um distúrbio pulmonar, um distúrbio autoimune, um distúrbio inflamatório, um distúrbio fibrótico, um distúrbio granulocítico (neutrofílico ou eosinofílico), um distúrbio monocítico, um distúrbio linfocítico, um distúrbio associado a números aumentados ou distribuição de células residentes teciduais aberrantes ou normais ou células estremais, ou mastocitose.
  284. 284. USO, de acordo com a reivindicação 283, caracterizado pelo fato de que o distúrbio é um distúrbio pulmonar.
  285. 285. USO, de acordo com a reivindicação 284, caracterizado pelo fato de que o distúrbio pulmonar é selecionado do grupo consistindo em asma, hiper-responsividade das vias aéreas e doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC).
  286. 286. USO, de acordo com a reivindicação 285, caracterizado pelo fato de que o distúrbio pulmonar é asma.
  287. 287. USO, de acordo com a reivindicação 286, caracterizado pelo fato de que a asma é asma com alto nível de Th2 ou asma com baixo nível de Th2.
  288. 288. USO, de acordo com a reivindicação 283, caracterizado pelo fato de que o distúrbio autoimune é selecionado do grupo consistindo em artrite reumatoide, psoríase, esofagite eosinofílica, doença inflamatória intestinal (Dll) e doença de Crohn.
  289. 289. USO, de acordo com a reivindicação 283, caracterizado pelo fato de que o distúrbio inflamatório é urticária crônica espontânea (UCE), anafilaxia, choque anafilático, dermatite atópica ou rinite alérgica.
    Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 375/418
    45/50
  290. 290. USO, de acordo com a reivindicação 283, caracterizado pelo fato de que o distúrbio fibrótico é a fibrose pulmonar idiopática (FPI).
  291. 291. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 282290, caracterizado pelo fato de que o medicamento é formulado para uso em combinação com um antagonista de ligação ao eixo da IL-13, um antagonista de ligação ao eixo da IL-5, um antagonista de ligação ao eixo da IL-33, um antagonista de M1 prime, um antagonista de IgE, um antagonista de TRPA1, um antagonista de CRTH2, um medicamento broncodilatador ou controlador de sintomas da asma, um imunomodulador, um corticosteroide, um inibidor da via de Th2, um inibidor de tirosina quinase, ou um inibidor da fosfodiesterase.
  292. 292. USO, de acordo com a reivindicação 291, caracterizado pelo fato de que o antagonista de ligação ao eixo da IL-13 é um anticorpo anti-IL-13.
  293. 293. USO, de acordo com a reivindicação 292, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-IL-13 é lebrikizumab.
  294. 294. USO, de acordo com a reivindicação 291, caracterizado pelo fato de que o antagonista de ligação ao eixo da IL-5 é um antagonista de ligação à IL-5 ou um antagonista de ligação ao receptor da IL-5.
  295. 295. USO, de acordo com a reivindicação 291, caracterizado pelo fato de que o antagonista de ligação ao eixo da IL-33 é um antagonista de ligação à IL-33 ou um antagonista de ligação a ST2.
  296. 296. USO, de acordo com a reivindicação 295, caracterizado pelo fato de que o antagonista de ligação à IL-33 é um anticorpo anti-IL-33.
  297. 297. USO, de acordo com a reivindicação 291, caracterizado pelo fato de que o antagonista de M1 prime é quilizumab.
  298. 298. MÉTODO DE TRATAMENTO DE UM DISTÚRBIO em um sujeito em necessidade, sendo o método caracterizado pelo fato de que compreende a administração, ao sujeito, de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-86.
    Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 376/418
    46/50
  299. 299. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 298, caracterizado pelo fato de que o distúrbio é selecionado do grupo consistindo em um distúrbio pulmonar, um distúrbio autoimune, um distúrbio inflamatório, um distúrbio fibrótico, um distúrbio granulocítico (neutrofílico ou eosinofílico), um distúrbio monocítico, um distúrbio linfocítico, um distúrbio associado a números aumentados ou distribuição de células residentes teciduais aberrantes ou normais ou células estromais, ou mastocitose.
  300. 300. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 299, caracterizado pelo fato de que o distúrbio é um distúrbio pulmonar.
  301. 301. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 300, caracterizado pelo fato de que o distúrbio pulmonar é selecionado do grupo consistindo em asma, hiper-responsividade das vias aéreas e doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC).
  302. 302. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 301, caracterizado pelo fato de que o distúrbio pulmonar é asma.
  303. 303. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 302, caracterizado pelo fato de que a asma é asma com alto nível de Th2 ou asma com baixo nível de Th2.
  304. 304. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 299, caracterizado pelo fato de que o distúrbio autoimune é selecionado do grupo consistindo em artrite reumatoide, psoríase, esofagite eosinofílica, doença inflamatória intestinal (Dll) e doença de Crohn.
  305. 305. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 299, caracterizado pelo fato de que o distúrbio inflamatório é urticária crônica espontânea (UCE), anafilaxia, choque anafilático, dermatite atópica ou rinite alérgica.
  306. 306. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 299, caracterizado pelo fato de que o distúrbio fibrótico é a fibrose pulmonar idiopática (FPI).
  307. 307. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações
    Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 377/418
    47/50
    298-306, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda a administração de um agente terapêutico adicional ao sujeito.
  308. 308. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 307, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico adicional é um antagonista de ligação ao eixo da IL-13, um antagonista de ligação ao eixo da IL-5, um antagonista de ligação ao eixo da IL-33, um antagonista de M1 prime, um antagonista de IgE, um antagonista de TRPA1, um antagonista de CRTH2, um medicamento broncodilatador ou controlador de sintomas da asma, um imunomodulador, um corticosteroide, um inibidor da via de Th2, um inibidor de tirosina quinase, ou um inibidor da fosfodiesterase.
  309. 309. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 308, caracterizado pelo fato de que o antagonista de ligação ao eixo da IL-13 é um anticorpo antiIL-13.
  310. 310. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 309, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-IL-13 é lebrikizumab.
  311. 311. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 308, caracterizado pelo fato de que o antagonista de ligação ao eixo da IL-5 é um antagonista de ligação à IL-5 ou um antagonista de ligação ao receptor da IL-5.
  312. 312. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 308, caracterizado pelo fato de que o antagonista de ligação ao eixo da IL-33 é um antagonista de ligação à IL-33 ou um antagonista de ligação a ST2.
  313. 313. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 312, caracterizado pelo fato de que o antagonista de ligação à IL-33 é um anticorpo anti-lL-33.
  314. 314. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 308, caracterizado pelo fato de que o antagonista de M1 prime é quilizumab.
  315. 315. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 298-314, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é administrado por via subcutânea, intravenosa, intramuscular, tópica, oral, transdérmica,
    Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 378/418
    48/50 intraperitoneal, intraorbital, por implante, por inalação, intratecal, intraventricular ou intranasal.
  316. 316. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 294-315, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um ser humano.
  317. 317. MÉTODO DE TRATAMENTO DE UM DISTÚRBIO em um sujeito em necessidade, sendo o método caracterizado pelo fato de que compreende a administração, ao sujeito, de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 104-223.
  318. 318. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 317, caracterizado pelo fato de que o distúrbio é selecionado do grupo consistindo em um distúrbio pulmonar, um distúrbio autoimune, um distúrbio inflamatório, um distúrbio fibrótico, um distúrbio granulocítico (neutrofílico ou eosinofílico), um distúrbio monocítico, um distúrbio linfocítico, um distúrbio associado a números aumentados ou distribuição de células residentes teciduais aberrantes ou normais ou células estremais, ou mastocitose.
  319. 319. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 318, caracterizado pelo fato de que o distúrbio é um distúrbio pulmonar.
  320. 320. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 319, caracterizado pelo fato de que o distúrbio pulmonar é selecionado do grupo consistindo em asma, hiper-responsividade das vias aéreas e doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC).
  321. 321. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 320, caracterizado pelo fato de que o distúrbio pulmonar é asma.
  322. 322. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 321, caracterizado pelo fato de que a asma é asma com alto nível de Th2 ou asma com baixo nível de Th2.
  323. 323. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 318, caracterizado
    Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 379/418
    49/50 pelo fato de que o distúrbio autoimune é selecionado do grupo consistindo em artrite reumatoide, psoríase, esofagite eosinofílica, doença inflamatória intestinal (Dll) e doença de Crohn.
  324. 324. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 318, caracterizado pelo fato de que o distúrbio inflamatório é urticária crônica espontânea (UCE), anafilaxia, choque anafilático, dermatite atópica ou rinite alérgica.
  325. 325. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 318, caracterizado pelo fato de que o distúrbio fibrótico é a fibrose pulmonar idiopática (FPI).
  326. 326. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 317-325, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda a administração de um agente terapêutico adicional ao sujeito.
  327. 327. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 326, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico adicional é um antagonista de ligação ao eixo da IL-13, um antagonista de ligação ao eixo da IL-5, um antagonista de ligação ao eixo da IL-33, um antagonista de M1 prime, um antagonista de IgE, um antagonista de TRPA1, um antagonista de CRTH2, um medicamento broncodilatador ou controlador de sintomas da asma, um imunomodulador, um corticosteroide, um inibidor da via de Th2, um inibidor de tirosina quinase, ou um inibidor da fosfodiesterase.
  328. 328. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 327, caracterizado pelo fato de que o antagonista de ligação ao eixo da IL-13 é um anticorpo antiIL-13.
  329. 329. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 328, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-IL-13 é lebrikizumab.
  330. 330. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 327, caracterizado pelo fato de que o antagonista de ligação ao eixo da IL-5 é um antagonista de ligação à IL-5 ou um antagonista de ligação ao receptor da IL-5.
  331. 331. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 327, caracterizado
    Petição 870190100375, de 07/10/2019, pág. 380/418
    50/50 pelo fato de que o antagonista de ligação ao eixo da IL-33 é um antagonista de ligação à IL-33 ou um antagonista de ligação a ST2.
  332. 332. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 331, caracterizado pelo fato de que o antagonista de ligação à IL-33 é um anticorpo anti-lL-33.
  333. 333. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 327, caracterizado pelo fato de que o antagonista de M1 prime é quilizumab.
  334. 334. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 317-333, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica é administrada por via subcutânea, intravenosa, intramuscular, tópica, oral, transdérmica, intraperitoneal, infraorbital, por implante, por inalação, intratecal, intraventricular ou intranasal.
  335. 335. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 334, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica é administrada por via subcutânea.
  336. 336. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 317-335, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um ser humano.
BR112019016595-9A 2017-02-10 2018-02-09 Anticorpos isolados, métodos de produção do anticorpo e de tratamento de um distúrbio, ácido nucleico isolado, vetor ou conjunto de vetores, célula hospedeira, composições farmacêuticas e uso BR112019016595A2 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762457722P 2017-02-10 2017-02-10
US62/457,722 2017-02-10
PCT/US2018/017680 WO2018148585A1 (en) 2017-02-10 2018-02-09 Anti-tryptase antibodies, compositions thereof, and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR112019016595A2 true BR112019016595A2 (pt) 2020-03-31

Family

ID=61274365

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112019016595-9A BR112019016595A2 (pt) 2017-02-10 2018-02-09 Anticorpos isolados, métodos de produção do anticorpo e de tratamento de um distúrbio, ácido nucleico isolado, vetor ou conjunto de vetores, célula hospedeira, composições farmacêuticas e uso

Country Status (24)

Country Link
US (3) US10738131B2 (pt)
EP (1) EP3580240A1 (pt)
JP (3) JP6995127B2 (pt)
KR (1) KR102362006B1 (pt)
CN (2) CN110494453B (pt)
AR (1) AR110873A1 (pt)
AU (1) AU2018217816A1 (pt)
BR (1) BR112019016595A2 (pt)
CA (1) CA3051700A1 (pt)
CL (2) CL2019002251A1 (pt)
CO (1) CO2019009787A2 (pt)
CR (1) CR20190387A (pt)
IL (1) IL268249A (pt)
MA (1) MA47459A (pt)
MX (1) MX2019009485A (pt)
MY (1) MY197534A (pt)
PE (1) PE20191548A1 (pt)
PH (1) PH12019501872A1 (pt)
RU (1) RU2771485C2 (pt)
SG (1) SG11201907364WA (pt)
TW (1) TWI778018B (pt)
UA (1) UA126574C2 (pt)
WO (1) WO2018148585A1 (pt)
ZA (1) ZA201905023B (pt)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020527332A (ja) 2017-06-12 2020-09-10 ブルーフィン バイオメディシン， インコーポレイテッド 抗−ｉｌ１ｒａｐ抗体および抗体薬物コンジュゲート
SG11202007564VA (en) 2018-02-09 2020-09-29 Genentech Inc Therapeutic and diagnostic methods for mast cell-mediated inflammatory diseases
CN110006871A (zh) * 2019-02-20 2019-07-12 常州大学 一个基于外源性组胺检测的细胞模型以及应用
WO2021026337A1 (en) * 2019-08-07 2021-02-11 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Method of treating keloids
KR20220066295A (ko) 2019-09-20 2022-05-24 제넨테크, 인크. 항트립타제 항체의 투약
KR20230001168A (ko) * 2021-06-28 2023-01-04 (주) 넥셀 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 폴리펩타이드 및 이를 포함하는 약학 조성물
WO2023019239A1 (en) 2021-08-13 2023-02-16 Genentech, Inc. Dosing for anti-tryptase antibodies
CN114515296B (zh) * 2022-02-25 2024-01-12 和携科技有限公司 一种脂肪间充质干细胞分泌因子的制备方法
WO2024003825A1 (en) * 2022-06-29 2024-01-04 Kashiv Biosciences, Llc An improved assay method of antibody

Family Cites Families (125)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
KR0184860B1 (ko) 1988-11-11 1999-04-01 메디칼 리써어치 카운실 단일영역 리간드와 이를 포함하는 수용체 및 이들의 제조방법과 이용(법)
CA2007238A1 (en) 1989-01-13 1990-07-13 Nobuhiko Katunuma Anti-tryptase antibody and composition for treatment of aids using the same
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
CA2025630A1 (en) 1989-09-22 1991-03-23 Nobuhiko Katunuma Human tryptase-like protein
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ES2113940T3 (es) 1990-12-03 1998-05-16 Genentech Inc Metodo de enriquecimiento para variantes de proteinas con propiedades de union alteradas.
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
ES2206447T3 (es) 1991-06-14 2004-05-16 Genentech, Inc. Anticuerpo humanizado para heregulina.
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
US7018809B1 (en) 1991-09-19 2006-03-28 Genentech, Inc. Expression of functional antibody fragments
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
JPH07501451A (ja) 1991-11-25 1995-02-16 エンゾン・インコーポレイテッド 多価抗原結合タンパク質
AU675929B2 (en) 1992-02-06 1997-02-27 Curis, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
CA2149329C (en) 1992-11-13 2008-07-15 Darrell R. Anderson Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human b lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of b cell lymphoma
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
JPH08511420A (ja) 1993-06-16 1996-12-03 セルテック・セラピューテイクス・リミテッド 抗 体
US5595756A (en) * 1993-12-22 1997-01-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal compositions for enhanced retention of bioactive agents
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
US5594116A (en) * 1995-11-08 1997-01-14 Promega Corporation Tryptase polyclonal antibody and purification method for use in human tryptase immunoassay
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
US5861264A (en) 1996-05-21 1999-01-19 Axys Pharmaceuticals, Inc. Anti-tryptase detection as a diagnostic for inflammatory diseases
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
DE69830315T2 (de) 1997-06-24 2006-02-02 Genentech Inc., San Francisco Galactosylierte glykoproteine enthaltende zusammensetzungen und verfahren zur deren herstellung
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
ATE419009T1 (de) 1997-10-31 2009-01-15 Genentech Inc Methoden und zusammensetzungen bestehend aus glykoprotein-glykoformen
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
ATE531812T1 (de) 1997-12-05 2011-11-15 Scripps Research Inst Humanisierung von nager-antikörpern
ATE375365T1 (de) 1998-04-02 2007-10-15 Genentech Inc Antikörper varianten und fragmente davon
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
AU3657899A (en) 1998-04-20 1999-11-08 James E. Bailey Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
US6998260B1 (en) 1998-05-15 2006-02-14 Promega Corporation Recombinant proteolytic tryptases, active site mutants thereof, and methods of making same
US6274366B1 (en) 1998-05-15 2001-08-14 Promega Corporation Enzymatically-active recombinant human β-tryptase and method of making same
HUP0104865A3 (en) 1999-01-15 2004-07-28 Genentech Inc Polypeptide variants with altered effector function
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
EP2275540B1 (en) 1999-04-09 2016-03-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
AU782626B2 (en) 1999-10-04 2005-08-18 Medicago Inc. Method for regulating transcription of foreign genes
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
EP1229125A4 (en) 1999-10-19 2005-06-01 Kyowa Hakko Kogyo Kk PROCESS FOR PRODUCING A POLYPEPTIDE
AU784983B2 (en) 1999-12-15 2006-08-17 Genentech Inc. Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes
AU767394C (en) 1999-12-29 2005-04-21 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents comprising modified doxorubicins and daunorubicins and their therapeutic use
ES2528794T3 (es) 2000-04-11 2015-02-12 Genentech, Inc. Anticuerpos multivalentes y usos de los mismos
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
CA2424602C (en) 2000-10-06 2012-09-18 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Antibody composition-producing cell
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
JP3523245B1 (ja) 2000-11-30 2004-04-26 メダレックス，インコーポレーテッド ヒト抗体作製用トランスジェニック染色体導入齧歯動物
NZ592087A (en) 2001-08-03 2012-11-30 Roche Glycart Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
ES2326964T3 (es) 2001-10-25 2009-10-22 Genentech, Inc. Composiciones de glicoproteina.
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
ATE503829T1 (de) 2002-04-09 2011-04-15 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Zelle mit erniedrigter oder deletierter aktivität eines am gdp-fucosetransport beteiligten proteins
US20040110704A1 (en) 2002-04-09 2004-06-10 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells of which genome is modified
AU2003236018A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. METHOD OF ENHANCING ACTIVITY OF ANTIBODY COMPOSITION OF BINDING TO FcGamma RECEPTOR IIIa
CA2481837A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Production process for antibody composition
AU2003236019A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Drug containing antibody composition appropriate for patient suffering from Fc Gamma RIIIa polymorphism
US7691568B2 (en) 2002-04-09 2010-04-06 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Antibody composition-containing medicament
EP1513879B1 (en) 2002-06-03 2018-08-22 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
DE60332957D1 (de) 2002-12-16 2010-07-22 Genentech Inc Immunoglobulinvarianten und deren verwendungen
AU2004205631A1 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US20080241884A1 (en) 2003-10-08 2008-10-02 Kenya Shitara Fused Protein Composition
AU2004280065A1 (en) 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Process for producing antibody composition by using RNA inhibiting the function of alpha1,6-fucosyltransferase
EA036531B1 (ru) 2003-11-05 2020-11-19 Роше Гликарт Аг Гуманизированное антитело типа ii к cd20 (варианты), фармацевтическая композиция, содержащая эти варианты антитела, и их применение
KR101520209B1 (ko) 2003-11-06 2015-05-13 시애틀 지네틱스, 인크. 리간드에 접합될 수 있는 모노메틸발린 화합물
JPWO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2007-06-28 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物を含有する医薬
JP4943161B2 (ja) 2003-12-23 2012-05-30 ジェネンテック， インコーポレイテッド 新規抗ｉｌ１３モノクローナル抗体での癌の処置
NZ549040A (en) 2004-02-17 2009-07-31 Schering Corp Use for interleukin-33 (IL33) and the IL-33 receptor complex
DOP2005000039A (es) * 2004-03-26 2005-10-31 Aventis Pharma Inc Hidrocloruro de [4-(5-aminometil-2-fluoro-fenil)- piperidin-1-il]-(4-bomo-3-metil-5-propoxi-tiofen-2-il)-metanona como un inhibidor de la triptasa de mastocitos
MXPA06011199A (es) 2004-03-31 2007-04-16 Genentech Inc Anticuerpos anti-tgf-beta humanizados.
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
CA2885854C (en) 2004-04-13 2017-02-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-p-selectin antibodies
WO2006010492A1 (en) 2004-07-28 2006-02-02 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with tryptase 1 (tps1)
GB0417487D0 (en) 2004-08-05 2004-09-08 Novartis Ag Organic compound
US7655229B2 (en) 2004-09-02 2010-02-02 Chan Andrew C Anti-FC-gamma RIIB receptor antibody and uses therefor
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
EP1791565B1 (en) 2004-09-23 2016-04-20 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
ES2577292T3 (es) 2005-11-07 2016-07-14 Genentech, Inc. Polipéptidos de unión con secuencias hipervariables de VH/VL diversificadas y consenso
US20070237764A1 (en) 2005-12-02 2007-10-11 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
KR101158959B1 (ko) 2005-12-13 2012-07-09 일라이 릴리 앤드 캄파니 항-ｉｌ-17 항체
CA2651567A1 (en) 2006-05-09 2007-11-22 Genentech, Inc. Binding polypeptides with optimized scaffolds
JP2009541275A (ja) 2006-06-22 2009-11-26 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 二重特異性抗体の生産
US7560530B1 (en) 2006-07-20 2009-07-14 Schering Corporation IL-33 receptor
EP2471816A1 (en) 2006-08-30 2012-07-04 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
PT2235064E (pt) 2008-01-07 2016-03-01 Amgen Inc Método de preparação de moléculas heterodiméricas de fc de anticorpos utilizando efeitos de indução eletrostática
KR20110025649A (ko) 2008-05-05 2011-03-10 노비뮨 에스 에이 항-ｉｌ-１７ａ／ｉｌ-１７ｆ 교차-반응성 항체 및 그의 사용 방법
WO2011031600A1 (en) 2009-09-10 2011-03-17 Schering Corporation Use of il-33 antagonists to treat fibrotic disease
ES2617777T5 (es) 2010-04-23 2022-10-13 Hoffmann La Roche Producción de proteínas heteromultiméricas
AU2011343570B2 (en) 2010-12-16 2016-11-03 Genentech, Inc. Diagnosis and treatments relating to TH2 inhibition
UA117218C2 (uk) 2011-05-05 2018-07-10 Мерк Патент Гмбх Поліпептид, спрямований проти il-17a, il-17f та/або il17-a/f
US9212227B2 (en) 2012-04-30 2015-12-15 Janssen Biotech, Inc. ST2L antibody antagonists for the treatment of ST2L-mediated inflammatory pulmonary conditions
JO3623B1 (ar) 2012-05-18 2020-08-27 Amgen Inc البروتينات المرتبطة بمولد المستضاد st2
EP2913062B1 (en) 2012-10-24 2019-05-08 Japan Innovative Therapeutics, Inc. Therapeutic or prophylactic agent for retinopathy of prematurity and method of testing for retinopathy of prematurity
JO3532B1 (ar) 2013-03-13 2020-07-05 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد انترلوكين-33 واستعمالاتها
EA034834B1 (ru) 2013-03-15 2020-03-26 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Антагонисты il-33 и их применение
RU2016119425A (ru) 2013-10-23 2017-11-28 Дженентек, Инк. Способы диагностики и лечения эозинофильных заболеваний
EP4223874A3 (en) 2013-12-26 2023-09-27 Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation Human anti-il-33 neutralizing monoclonal antibody
RU2019118984A (ru) 2014-01-10 2019-08-06 Анаптисбайо, Инк. Антитела, направленные против интерлейкина-33 (il-33)
CR20170240A (es) 2014-11-10 2018-04-03 Genentech Inc Anticuerpos anti-interleucina-33 y sus usos

Also Published As

Publication number Publication date
RU2019127870A (ru) 2021-03-10
SG11201907364WA (en) 2019-09-27
CO2019009787A2 (es) 2019-09-18
US20190367637A1 (en) 2019-12-05
UA126574C2 (uk) 2022-11-02
CA3051700A1 (en) 2018-08-16
RU2771485C2 (ru) 2022-05-04
MY197534A (en) 2023-06-21
JP2020505927A (ja) 2020-02-27
RU2019127870A3 (pt) 2021-06-08
PE20191548A1 (es) 2019-10-24
CN116715775A (zh) 2023-09-08
CN110494453A (zh) 2019-11-22
TW201835105A (zh) 2018-10-01
US11939396B2 (en) 2024-03-26
JP6995127B2 (ja) 2022-02-04
TWI778018B (zh) 2022-09-21
WO2018148585A1 (en) 2018-08-16
MA47459A (fr) 2019-12-18
AR110873A1 (es) 2019-05-08
US20180230233A1 (en) 2018-08-16
PH12019501872A1 (en) 2020-06-29
CN110494453B (zh) 2023-05-26
CL2021002503A1 (es) 2022-04-22
US10738131B2 (en) 2020-08-11
AU2018217816A1 (en) 2019-08-15
ZA201905023B (en) 2023-12-20
MX2019009485A (es) 2019-11-05
JP2023103257A (ja) 2023-07-26
US10752703B2 (en) 2020-08-25
CR20190387A (es) 2019-09-25
KR20190129040A (ko) 2019-11-19
CL2019002251A1 (es) 2019-11-29
EP3580240A1 (en) 2019-12-18
US20200325248A1 (en) 2020-10-15
KR102362006B1 (ko) 2022-02-14
JP2021098699A (ja) 2021-07-01
IL268249A (en) 2019-09-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10752703B2 (en) Anti-tryptase antibodies, compositions thereof, and uses thereof
JP6571115B2 (ja) 抗ｊａｇｇｅｄ１抗体及び使用方法
US20160207995A1 (en) Anti-il-4 antibodies and bispecific antibodies and uses thereof
US20230383008A1 (en) ANTI-HtrA1 ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF
US20170334985A1 (en) Anti-il-13/il-17 bispecific antibodies and uses thereof
JP7422671B2 (ja) 抗ｋｌｋ５抗体及び使用方法

Legal Events

Date Code Title Description
B350 Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette]